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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA INFECÇÃO POR
Hepatozoon spp. ( APICOMPLEXA: HEPATOZOIDAE) EM CÃES
DE ÁREAS RURAIS DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL E
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS
ADRIANO STEFANI RUBINI
Botucatu – SP
Agosto 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA INFECÇÃO POR
Hepatozoon spp. ( APICOMPLEXA: HEPATOZOIDAE) EM CÃES
DE ÁREAS RURAIS DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL E
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS
ADRIANO STEFANI RUBINI
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista, Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre
em Medicina Veterinária, área de Clínica
Médica Veterinária.
Orientadora: Profa. Dra. Lucia Helena O’Dwyer
de Oliveira
Botucatu – SP
Agosto 2006
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ADRIANO STEFANI RUBINI
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA INFECÇÃO POR
Hepatozoon spp. ( APICOMPLEXA: HEPATOZOIDAE) EM CÃES
DE ÁREAS RURAIS DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL E
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS
Aprovada em 04, de agosto de 2006.
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Lucia Helena O’Dwyer de Oliveira
Prof. Dr. Paulo Eduardo Martins Ribolla
Prof. Dr. Marcelo Bahia Labruna
Botucatu – SP
2006
À Deus
Aos meus pais Jofrei e Antonieta pelo amor, dedicação e total apoio
Aos meus irmãos Luciano, Daniele, Ana Lúcia
Ofereço e Dedico
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Lucia minha orientadora, pela orientação,
ensinamentos acadêmicos, amizade, confiança e respeito demonstrados
durante nosso convívio.
À Karina Paduan, meus sinceros agradecimentos pela inestimável
contribuição na realização dos experimentos e na confecção da tese, bem
como pela amizade e incentivo.
À Viviane, pela amizade, e pelos bons e “maus” momentos
compartilhados no laboratório.
À Karina Santos, pela grande amizade e companheirismo, auxiliando
nas coletas de material.
Ao Gustavo, grande amigo e companheiro de baladas, por toda
colaboração nas coletas e nos experimentos de laboratório.
Aos amigos Lilika e Xabi, pela amizade e por tantos bons momentos
compartilhados na nossa “salinha”.
Ao Diego, pela amizade e pelo Abstract.
Ao Prof. Dr. Paulo Ribolla, por disponibilizar os materiais e o
laboratório de sequenciamento necessários para a realização dos
experimentos de biologia molecular. E aos seus orientados Jayme, Letícia,
Bianca, Alberto.
À Profa. Dra. Tereza Cristina, pela inestimável contribuição
disponibilizando seu laboratório para a realização dos meus estudos.
Ao Prof. Dr. Reinaldo, “parceiro de viola”, pelos bons conselhos e
sugestões durante a realização do meu mestrado.
À Profa. Dra. Luciene, pela colaboração e auxílio nas análises
estatísticas dos meus experimentos.
Ao Prof. Dr. Alessandro, pela amizade e bons momentos de
descontração nos churrascos da parasito.
À Patrícia Garcia, minha eterna gratidão pelos anos de convivência.
Aos amigos Felipe, Leonardo, Paulo, Eric, Du, Wilsom pelo
companheirismo, passeios, baladas, por tornarem minha vida muito mais
divertida.
Aos amigos do departamento Marcela, Aruaque, Bruna, Erica, Giane,
Élen, Leticinha, Nelson, Regina Raquel, pelos momentos de convivência.
Às minhas amigas da graduação Rosalva, Fátima, Iolanda e Ana
pelas intermináveis conversas e risadas.
Aos funcionários do Departamento de Parasitologia Márcia, Bixo,
Valdir, Ângela e Nilza pelos cafezinhos, churrascos e festas, meus eternos
amigos.
A todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse
trabalho.
"A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original."
A. Einstein
vi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Subunidades do DNA ribossomal………………………………15
FIGURA 2. Exemplo de residência visitada para exame de cães de áreas
rurais do Estado de São Paulo..........................................................................22
FIGURA 3. Gamonte de Hepatozoon canis observado em lâmina de
esfregaço sanguíneo de sangue periférico corado (Giemsa,
1000x)................................................................................................................29
FIGURA 4. Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA para
Hepatozoon canis em amostras de cães no Brasil pela técnica de PCR:
Amostras 1, 2, 3 e 5 positivas para presença de Hepatozoon canis. Amostra 4
negativa para amplificação. Amostras 6 e 7 utilizadas como controle positivo e
negativo, respectivamente. PM: Padrão de peso molecular de 250pb..............31
FIGURA 5. Alinhamento múltiplo das seqüências realizado pelo programa
CLUSTAL X (1.81). Seqüências de Hepatozoon canis – Fukuoka (AF418558),
Hepatozoon canis – Israel (AF176835), H. americanum (AF176836) e H.
catesbiane (AF176837) obtidas no GenBank, foram utilizadas no
alinhamento.......................................................................................................34
FIGURA 6. Árvore de Neighbor-Joining baseada no gene 18S rDNA de
Hepatozoon spp. isoladas no Brasil. Valores de bootstrap maiores que 50%
estão apresentados na figura. Seqüências de Hepatozoon canis – Fukuoka
(AF418558), Hepatozoon canis – Israel (AF176835), H. americanum
(AF176836) e H. catesbiane (AF176837) obtidas no GenBank, foram utilizadas
como outgroup...................................................................................................37
vii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Comparação dos testes de esfregaços sangüíneos para
detecção de Hepatozoon spp. em cães naturalmente infectados de áreas rurais
do Estado de São Paulo....................................................................................30
TABELA 2. Porcentagem de cães de áreas rurais positivos (N=150) para
Hepatozoo spp. em três municípios do estado de São Saulo...................31
TABELA 3. Distribuição dos carrapatos encontrados em cães (N=150) de
áreas rurais do estado de São Paulo, de acordo com a localidade...................32
TABELA 4. Comparação entre infestação por carrapatos Rhipicephalus
sanguineus e animais positivos para Hepatozoon spp. em cães de áreas rurais
do estado de São Paulo, naturalmente infectados.…........................................33
TABELA 5. Comparação entre infestação por carrapatos Amblyomma
spp. e animais positivos para Hepatozoon spp. em cães de áreas rurais do
estado de São Paulo, naturalmente infectados.….......................................34
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
DNA Ácido desoxirribonucléico
rDNA Ácido desoxirribonucléico ribossomal
dNTP
Desoxirribonucleosídeos Trifosfatos
EDTA
Ácido etileno diamino tetracético
ELISA
Do inglês “Enzyme-Linked Imunosorbent Assay”
IFI Imunofluorescência Indireta
rpm
Rotações por minuto
M
Molar
ml Mililitro
l
Microlitro
mM
Milimolar
pb
Pares de base
PCR
Do inglês “Polimerase Chain Reaction”
pH
Potencial hidrogeniônico
pmol Picomol
RNA
Ácido ribonucléico
rRNA Ácido ribonucléico ribossomal
Taq
Thermophilus aquaticus
U
Unidade internacional de medida
ix
SUMÁRIO
Página
RESUMO..........................................................................................................
xi
ABSTRACT......................................................................................................
xii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................
2
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................
5
2.1 Histórico e Etiologia.........................................................................
5
2.2 Ciclo biológico e transmissão..........................................................
7
2.3 Epidemiologia..................................................................................
9
2.4 Sinais clínicos..................................................................................
11
2.5 Hepatozoon americanum.................................................................
12
2.6 Diagnóstico......................................................................................
13
2.6.1 Diagnóstico clínico.............................................................
13
2.6.2 Diagnóstico laboratorial......................................................
13
2.6.2.1 Técnica de esfregaço sangüíneo...................... 13
2.6.2.2 Técnica post mortem.........................................
13
2.6.2.3 Técnica sorológica.............................................
14
2.6.2.4 Diagnóstico molecular.......................................
15
3. OBJETIVOS.................................................................................................
20
4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................
22
4.1 Seleção dos animais.....................................................................
22
4.2 Coleta de sangue..........................................................................
22
4.3 Acondicionamento das amostras..................................................
23
4.4 Coleta e identificação dos carrapatos...........................................
23
4.5 Processamento das amostras.......................................................
23
4.5.1 Técnica hematológica........................................................
23
4.5.2 Extração de DNA genômico...............................................
23
4.5.3 Reação de amplificação.....................................................
24
4.5.4 Eletroforese em gel de agarose.........................................
24
4.6 Seqüenciamento...........................................................................
25
4.6.1 Purificação dos produtos de PCR......................................
25
4.6.2 Reação de seqüenciamento..............................................
25
4.6.3 Precipitação.......................................................................
26
x
4.6.4 Análise das seqüências.....................................................
26
4.7 Análise estatística.........................................................................
27
5. RESULTADOS....................................................................................
29
5.1 Técnica de esfregaço sangüíneo..................................................
29
5.2 Reação em cadeia pela polimerase..............................................
30
5.3 Carrapatos coletados....................................................................
31
5.4
Relação entre infecção por Hepatozoon canis
e infestação
por carrapatos........
....................................................................
33
5.5 Seqüenciamento...........................................................................
34
5.6 Análise filogenética.......................................................................
37
6. DISCUSSÃO……………………………………………………………………...
40
7. CONCLUSÕES………………………………………………………………......
49
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS………………………………………......
50
xi
RESUMO
Rubini A.R. Aspectos epidemiológicos da infecção por Hepatozoon
spp.(Apicomplexa: Hepatozoidae) em cães de áreas rurais do Estado de São
Paulo, Brasil e caracterização molecular de isolados, 2006. 58f. Mestrado,
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia.
Hepatozoon canis é um protozoário que infecta cães e é transmitido pela
ingestão do carrapato Rhipicephalus sanguineus. Existem duas espécies
distintas de Hepatozoon que infectam cães, H. canis e H. americanum. O
diagnóstico de rotina é realizado pelo encontro de gamontes em esfregaço
sangüíneo corados por Giemsa. O objetivo desse estudo foi verificar a
prevalência de infecção em cães de áreas rurais, comparar a sensibilidade da
técnica de esfregaço sangüíneo com a reação da polimerase em cadeia (PCR),
e caracterizar a espécie de Hepatozoon spp. que infecta cães no Brasil. Foram
realizados esfregaços sangüíneos de sangue periférico e de sangue da veia
jugular. O exame por esfregaço sangüíneo detectou 17 animais positivos
(11,33%), sendo 14/150 (9,3%) em esfregaços de sangue capilar (ponta de
orelha), e 7/150 (4,7%) em esfregaços de sangue da veia jugular. O
diagnóstico pela PCR detectou 80/150 (53,3%) amostras positivas. Carrapatos
das espécies Rhipicephalus sanguineus e Amblyomma sp. foram encontrados
em 36/150 (24%) dos cães, em porcentagens iguais. As espécies identificadas
para o gênero Amblyomma foram: A. cajennense, A. ovale . Análises dos
dados demonstraram que técnica de PCR foi mais sensível do que o exame
por esfregaço sangüíneo. A espécie de Hepatozoon identicada nas amostras
de cães no Brasil foi o H. canis.
xii
ABSTRACT
Rubini A.R., Epidemiological aspects of the infection by Hepatozoon
spp.(Apicomplexa: Hepatozoidae) rural areas dogs of São Paulo state, Brazil
and molecular characterization isolates, 2006. 58f. Mestrado, Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia.
Hepatozoon canis is a protozoan that infects dogs and is transmitted by the
ingestion of the brown dog tick, Rhipicephalus sanguineus. Two distinct species
of Hepatozoon genus can infect dogs, H. canis and H. americanum. Routine
tests to detect the disease are based in direct examination of gametocytes on
Giemsa stained blood smears. The purpose of this study was the investigation
of disease prevalence in rural area dogs, comparison the blood smear
examination to PCR in diagnostic tests, and characterize the Hepatozoon
species implicated in the infection of Brazilian dogs. Blood smear examination
was undertaken with blood collected by puncture of the cephalic vein and ear
margin capillary bed. This technique detected 17 positive animals (11.33%), 14
out 150 (9.3%) in peripherical blood and 7 out 150 (4.7%) in cephalic vein
blood. PCR tests detected 80 out 150 (53.3%) positive animals. Rhipicephalus
sanguineus and Amblyomma sp. were found in 36 out 150 of the dogs (24%), in
equal proportions. The identified species for Amblyomma genus were A.
cajennense, A. ovale. Data analysis showed that PCR was much more sensitive
compared to blood smear examination. Hepatozoon species identified in the
subjects was H. canis.
Introdução
Introdução 2
1. INTRODUÇÃO
Hepatozoon canis é um hemoparasita transmitido por carrapatos que
acomete cães em diversas regiões no mundo (McCully et al.,1975; Craig et al,
1978; Massard, 1979; Murata et al., 1991; Beaufils et al., 1996). A primeira
descrição desse gênero foi relatada na Índia em células polimorfonucleares de
cães (Bentley, 1905). James (1905a, b) observou o protozoário no sangue
periférico de cães e o classificou como Leucocytozoon canis. Wenyon (1910)
sugeriu que o nome genérico Leucocytozoon fosse substituído por Hepatozoon
canis. Christophers (1907) identificou o carrapato marrom, Rhipicephalus
sanguineus, como hospedeiro invertebrado de H. canis.
Até 1997, apenas uma espécie de Hepatozoon havia sido descrita em
cães, entretanto, pesquisas comprovaram haver duas espécies distintas de
Hepatozoon que infectam cães, H. canis e H. americanum (Baneth et al.,
2000). Conseqüentemente, o parasita que infecta cães no sul dos Estados
Unidos foi renomeado para Hepatozoon americanum (Vincent-Johnson et al.,
1997), enquanto que as espécies encontradas em outros países continuaram
denominadas H. canis.
O carrapato Riphicephalus sanguineus é considerado o vetor biológico
responsável pela transmissão de H. canis, principalmente em cães de áreas
urbanas e peri-urbanas (Costas et al., 1962; Flechtmann, 1990). Carrapatos
desta espécie são freqüentes nas infestações dos cães, e muitas vezes são
encontrados em associação com outras espécies, principalmente do gênero
Amblyomma (Labruna & Campos Pereira, 2001).
Estudos epidemiológicos têm evidenciado alta prevalência de infecção
causada por este parasita no Brasil, principalmente em cães de áreas rurais. A
infecção nos cães pode ser caracterizada por febre, anorexia, perda de peso,
anemia, corrimento ocular e fraqueza dos membros posteriores (Elias &
Homans, 1988). A infecção nos cães pode variar de subclínica, com baixa
parasitemia, a uma doença grave com risco à vida do animal, no caso de
filhotes ou animais imunossuprimidos (Hervas et al., 1995).
Contudo a maioria dos estudos tem sido conduzidos utilizando-se como
método de diagnóstico a técnica de esfregaço sangüíneo, que apresenta baixa
sensibilidade principalmente nos casos de baixa parasitemia ou parasitemia
Introdução 3
intermitente (O’Dwyer et al., 2001). Com o advento das técnicas de biologia
molecular, novas ferramentas tornaram-se disponíveis na resolução de
questões filogenéticas, principalmente nos casos em que características
morfológicas e de ciclo de vida produzem resultados conflitantes (Gouy & Li,
1989; Durfy & Willard, 1990; Hillis & Huelsenbeck, 1992). A pequena
subunidade nuclear do gene RNA ribossômico tem sido extensivamente
utilizada para inferir as relações filogenéticas de uma diversidade de
protozoários. Essas seqüências de genes provaram ser particularmente úteis
na diferenciação de parasitas do filo Apicomplexa (Gouy & Li, 1989; Durfy &
Willard, 1990; Hillis & Huelsenbeck, 1992).
O diagnóstico da doença com base em técnicas moleculares tem sido
utilizado em alguns casos, embora no Brasil ainda haja escassez de estudos. A
caracterização genética dos isolados, encontrados em nosso país, possibilitaria
esclarecer as relações entre os casos de H. canis relatados (Paludo et al.
2005). A caracterização genética conduzida com o propósito de identificar a
espécie de Hepatozoon que acomete cães no Brasil comprovou ser H. canis
(Rubini et al., 2005; Paludo et al., 2005).
Revisão de Literatura
Revisão de Literatura
5
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 HISTÓRICO E ETIOLOGIA
O gênero Hepatozoon compreende protozoários pertencentes ao filo
Apicomplexa; classe Sporozoa; sub classe Coccidia; ordem Eucoccidiida; sub
ordem Adeleina e família Hepatozoidae. Hepatozoon canis é um hemoparasita
transmitido por carrapatos que acomete cães na Ásia, África, Sul da Europa, e
Américas do Norte e Sul (McCully et al.,1975; Craig et al., 1978; Massard,
1979; Murata et al., 1991; Beaufils et al., 1996).
A primeira espécie desse gênero foi descrita na Índia em células
polimorfonucleares de cães (Bentley, 1905). No mesmo ano, ainda na Índia,
James (1905a, b) observou o protozoário no citoplasma de leucócitos de
sangue periférico de seis cães e o classificou como Leucocytozoon canis.
Posteriormente, Wenyon (1910) sugeriu que o nome genérico Leucocytozoon
fosse substituído por Hepatozoon, sendo a partir de então, denominado
Hepatozoon canis. Christophers (1907) identificou o carrapato marrom,
Rhipicephalus sanguineus, como hospedeiro invertebrado de H. canis. No inicio
do século XX, esta espécie foi estudada tanto no cão quanto no hospedeiro
invertebrado e foram caracterizados seu ciclo biológico e seu vetor
(Christophers, 1906, 1907, 1912).
As espécies do gênero Hepatozoon são protozoários de ciclo heteroxeno
que apresentam ciclo evolutivo típico dos coccídeos: a fase sexuada e de
esporulação ocorrem nos hospedeiros invertebrados hematófagos, tais como
mosquitos, ácaros e carrapatos; e a esquizogonia e gametogonia, nos
vertebrados. Estão descritas aproximadamente 300 espécies nesse gênero,
tendo sido relatadas em aves, répteis e mamíferos distribuídos em regiões
temperadas, tropicais, e subtropicais de todos os continentes (Smith, 1996).
Contudo, devido à carência de estudos detalhados sobre os ciclos biológicos e
sobre a caracterização genética destes parasitas, a sistemática e a taxonomia
de muitas destas espécies continuam incertas.
Até 1997, apenas uma espécie de Hepatozoon havia sido descrita em
cães, H. canis, que foi relatada na Europa, Ásia, África, Estados Unidos da
América e Brasil (McCully et al., 1975; Ezeokoly et al., 1983; Rajamanickan et
al., 1985; Murata et al., 1991; Hervas et al., 1995). A infecção pela espécie de
Hepatozoon encontrada nos EUA, por produzir características clínicas
diferentes e mais graves, era considerada como uma cepa patogênica de H.
canis (Craig et al., 1978). Entretanto, pesquisas posteriores comprovaram
haver duas espécies distintas de Hepatozoon que infectam cães, H. canis e H.
americanum (Baneth et al., 2000). Estes estudos se basearam na patologia e
sinais clínicos associados com a infecção, nas características antigênicas e
genéticas dos isolados de Hepatozoon, nas espécies de carrapatos vetores e
no ciclo de vida deste protozoário (Vincent-Johnson et al., 1997; Ewing et al.,
2000; Baneth et al., 2000). Consequentemente, o parasita que infecta cães no
sul dos Estados Unidos foi renomeado para Hepatozoon americanum (Vincent-
Johnson et al., 1997), enquanto que as espécies encontradas em outros países
continuaram denominadas H. canis. A caracterização genética conduzida com
o propósito de identificar a espécie de Hepatozoon que acomete cães no Brasil
comprovou ser H. canis (Rubini et al., 2005; Paludo et al., 2005).
2.2 CICLO BIOLÓGICO E TRANSMISSÃO
Rhipicephalus sanguineus é a principal espécie de carrapato que
parasita cães no Brasil, entretanto, ocorre predominantemente em áreas
urbanas (Labruna & Campos Pereira, 2001). A reprodução sexuada de H. canis
ocorre neste vetor e os cães adquirem a infecção pela ingestão de carrapatos
contaminados com oocistos contendo esporozoítos (Ezeokoli et al., 1983).
Estes, quando ingeridos, são liberados no trato intestinal do cão, penetram na
parede do intestino e são transportados via sanguínea ou linfática para o
fígado, baço, linfonodos, rins, medula óssea ou músculos, onde ocorre a
esquizogonia. Os merozoítos são liberados dos esquizontes e penetram nos
leucócitos, onde os gamontes são formados. Quando o carrapato ingere o
sangue do cão infectado, os gamontes são liberados no intestino, onde ocorre
a formação dos gametas, que por um processo de singamia dão origem ao
zigoto. Este atravessa a parede intestinal, indo localizar-se na hemocele do
carrapato onde ocorre a formação do oocisto. Os oocistos, quando maduros,
apresentam vários esporocistos (30-50) contendo aproximadamente 16
esporozoítos, que quando ingeridos darão continuidade ao ciclo. A formação
dos oocistos se completa em dois estágios subseqüentes, isto é, se a ninfa se
infecta, a transmissão ocorre no estágio adulto (Christophers, 1907; 1912;
Baneth et al., 1995; Baneth & Weigler, 1997).
No Brasil, estudos relativos à transmissão demonstraram que cães de
área rural, que compartilham o ambiente com outros hospedeiros domésticos e
selvagens, são infestados principalmente por espécies de Amblyomma
(Labruna & Campos Pereira, 2001), particularmente, A. aureolatum, A. ovale,
A. oblongoguttatum, A. cajennense, A. tigrinum (Kohls, 1956; Ribeiro,
1966/1967; Massard et al., 1981; Vianna & Bittencourt, 1995; Ribeiro et al.,
1997; Evans et al., 2000; Labruna et al., 2000, 2001). Forlano et al. (2005)
realizaram um estudo com o objetivo de investigar a transmissão de H. canis,
em cães de áreas rurais, por diferentes espécies de carrapatos: R. sanguineus,
A. aureolatum, A. ovale e A. cajennense. Os espécimes coletados de cães
naturalmente infestados
e
positivos para H. canis foram utilizados para infecção
de cães livres da infecção e para pesquisa de oocistos. O cão inoculado, por
via oral, com macerado de A. ovale foi positivo para a infecção pelo
hemoparasita, apresentando gamontes no sangue periférico 63 dias após a
inoculação. Dos espécimes coletados para pesquisa de oocistos, apenas um
representante da espécie A. ovale apresentou oocistos similares aos de H.
canis, demonstrando que adultos desta espécie podem estar envolvidos na
transmissão de H. canis em áreas rurais do Brasil.
Além da transmissão horizontal, por carrapatos da espécie R.
sanguineus, foi comprovada também a transmissão congênita em cães. Murata
et al. (1993) relataram a ocorrência da transmissão vertical em seis ninhadas,
com 23 de 29 cães neonatos (79.3%), que apresentaram gamontes (0,02 a
0,4% dos leucócitos) e merontes tissulares, 16 a 60 dias após o nascimento. As
cadelas eram portadoras de H. canis, e os filhotes nasceram e foram mantidos
livres de carrapatos, confirmando assim a transmissão congênita.
2.3 EPIDEMIOLOGIA
Os relatos de H. canis são esporádicos em nosso país, principalmente
como achados casuais em exames de laboratório. Esse diagnóstico pontual
não fornece uma idéia sobre a real ocorrência da infecção, já que animais
cronicamente infectados, aparentemente sadios no momento do exame, podem
desenvolver sintomatologia clínica posteriormente. Estudos epidemiológicos
têm demonstrado
alta
prevalência da infecção em cães de vários Estados,
incluindo Rio de Janeiro, Espírito Santo, Rio Grande do Sul, Minas Gerais e
São Paulo (Massard, 1979; Mundin et al., 1992; O’Dwyer et al., 2001; Rubini et
al., 2005). As principais alterações clínicas observadas nos cães infectados,
nesses casos, foram: anorexia, palidez de mucosa, perda de peso, dor,
diarréia, vômito, febre, poliúria e polidipsia.
Massard (1979) realizou um estudo epidemiológico, com cães de áreas
urbanas e rurais, do Estado do Rio de Janeiro, utilizando diagnóstico por
esfregaços sangüíneos, demonstrando que o parasitismo foi mais freqüente em
cães de áreas rurais: 31,58% (36/ 114), em comparação com cães de áreas
urbanas: 4,48% (3/ 67).
No Hospital Veterinário da Universidade Federal de Uberlândia, em
Minas Gerais, foram relatados dois casos de cães infectados com H. canis
associado a Ehrlichia canis (Mundim et al., 1992). Em São Paulo, Gondim et al.
(1998) diagnosticaram oito casos de cães infectados com H. canis, no Hospital
Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP,
Botucatu, sendo que em todos os casos também foram detectadas infecções
concomitantes com outros agentes.
O’Dwyer et al. (2001) realizaram um estudo com cães de áreas rurais de
diferentes localidades do Estado do Rio de Janeiro, utilizando-se a técnica de
esfregaço sangüíneo, e observaram infecções por diferentes hemoparasitas
identificados como: Babesia canis (5,2%), Ehrlichia canis (4,8%) e H. canis
(39,2%) num total de 250 cães analisados. A prevalência das infecções por H.
canis variou de 9,1% a 59,4% mostrando que pode haver uma diferença
significativa no número de cães infectados nas diferentes regiões. Nesse
mesmo estudo, foram identificadas quatro espécies de carrapatos parasitando
os cães em áreas rurais, sendo A. cajennense encontrada com maior
freqüência. A análise dos resultados demonstrou uma correlação positiva entre
a presença de A. cajennense e a infecção por H. canis, sugerindo que os
carrapatos dessa espécie podem ser vetores potenciais desse hemoparasita no
Brasil.
Em estudo realizado com 222 cães de rua, na região de Botucatu
Estado de São Paulo, a técnica de esfregaço sangüíneo revelou que apenas 13
cães (5.9%) apresentavam-se infectados por H. canis, embora não
apresentassem alterações hematológicas que pudessem ser relacionadas a
este protozoário (O’Dwyer et al., 2004).
Os resultados dos diferentes trabalhos revelaram que pode haver uma
grande variação na freqüência da infecção, dependendo da região estudada e
das condições de criação dos cães. Contudo, os estudos anteriormente citados
foram realizados utilizando o método de esfregaço sangüíneo para o
diagnóstico, e essa é uma técnica de baixa sensibilidade.
2.4 SINAIS CLÍNICOS
No Brasil existem poucos estudos sobre a hepatozoonose canina, sendo
que ainda existem divergências quanto a patogenicidade desse parasita. A
infecção nos cães pode variar de subclínica, com baixa parasitemia, a uma
doença grave com risco à vida do animal, no caso de filhotes ou animais
imunossuprimidos (Elias & Homans, 1988; Hervas et al., 1995). Baneth &
Weigler (1997) associaram a presença de baixa parasitemia a uma forma
branda da doença que nos casos de elevação da parasitemia, poderia evoluir
para uma forma grave, caracterizada por febre, anorexia, perda de peso,
anemia, corrimento ocular e fraqueza dos membros posteriores, sintomas
característicos de doença de caráter crônico debilitante. Os neutrófilos
parasitados tornam-se deficientes em mieloperoxidase e esta deficiência
provavelmente reduz sua função fagocítica, podendo tornar o animal altamente
susceptível às infecções sistêmicas (Ibrahim et al., 1989).
H. canis já foi diagnosticado, em cães, associado a Toxoplasma gondii,
E. canis, B. canis, Haemobartonella canis e Parvovirus (Gossett et al., 1985;
Harmelin et al. 1992; Baneth et al., 1997; Gondim et al., 1998; O´Dwyer et al.,
1997, 2001), ocasionando um quadro clinico mais severo do que quando ocorre
isoladamente. As alterações laboratoriais mais freqüentes encontradas em
cães infectados com H. canis foram leucocitose, anemia e trombocitopenia, e
nos exames bioquímicos foram encontrados hipoalbuminemia,
hiperglobulinemia, aumento das enzimas fosfatase alcalina e creatina quinase
séricas (Baneth et al., 1995, Baneth & Weigler, 1997).
2.5 Hepatozoon americanum
Nos Estados Unidos da América, a espécie de Hepatozoon antes
descrita como H. canis (Craig et al., 1978) agora é descrita como uma nova
espécie, H. americanum (Baneth et al., 2000). Em contraste com a doença
branda normalmente encontrada na infecção por H. canis, a infecção por H.
americanum causa uma doença debilitante e freqüentemente fatal sendo
transmitido pelo Amblyomma maculatum, que é uma espécie de carrapato de
região tropical (Mathew et al., 1998, 1999; Ewing et al., 2002). As
manifestações clínicas mais comuns associadas à infecção por H. americanum
incluem: febre, dor generalizada, atrofia muscular, fraqueza, relutância em se
levantar, causada pelo grande acúmulo de cistos nos músculos esqueléticos e
cardíacos, que podem induzir a uma miosite piogranulomatosa e lesões
proliferativas nos ossos (Panciera et al., 1998, 1999, 2000; Baneth et al., 2003).
2.6 DIAGNÓSTICO
2.6.1 Diagnóstico Clínico
Os sintomas apresentados por cães infectados por H. canis são pouco
específicos. Entretanto, pode-se suspeitar da doença quando os animais
apresentarem febre, anorexia, perda de peso, palidez de mucosas, corrimento
ocular e fraqueza dos membros posteriores (Elias & Homans, 1988; Baneth et
al., 1998). Esses são sintomas inespecíficos e podem ocorrer em outras
doenças, havendo necessidade de confirmação do diagnóstico por intermédio
de exames laboratoriais (O’Dwyer & Massard, 2002).
2.6.2 Diagnóstico laboratorial
2.6.2.1 Técnica de esfregaço sangüíneo
Rotineiramente, a infecção por H. canis é diagnosticada utilizando-se a
técnica de esfregaço sangüíneo, de sangue periférico, para detecção
microscópica de gamontes no interior de neutrófilos e monócitos (Elias &
Homans, 1988; Ibrahim et al., 1989). Os gamontes são grandes (11,4 m x
5,39 m) e têm forma elíptica. Entretanto, a análise morfológica dos mesmos
não possibilita a diferenciação das diferentes espécies de Hepatozoon
existentes, pois a morfologia dos gamontes encontrados pode variar em função
da espécie hospedeira e também da espécie de Hepatozoon encontrada
(Waner et al., 1994). Este método de diagnóstico não é muito sensível, visto
que os gamontes nem sempre são detectáveis, principalmente, quando a
parasitemia é baixa ou intermitente (O’Dwyer et al., 2001).
2.6.2.2 Diagnóstico post mortem
Outra forma de diagnóstico é a visualização dos estágios do parasita em
cortes histológicos e “imprints” de vários órgãos como fígado, medula óssea,
baço e pulmões. Christopher (1906) foi o primeiro a descrever estágios de
desenvolvimento de H. canis em órgãos de hospedeiros vertebrados e estágios
teciduais de H. canis foram caracterizados pela formação de cistos e merontes
no parênquima tecidual, mas raramente em músculo esquelético (Baneth et al.,
1995). Em tecidos, merontes maduros de H. canis contém merozoitas
alongados arranjados em um círculo ao redor de um núcleo central claro
(Baneth et al., 2003).
Recentemente, Baneth & Shkap (2003) encontraram pequenos cistos
monozóicos no baço de cães infectados. Resultados semelhantes foram
descritos por O’Dwyer et al. (2004) que encontraram em dois cães
necropsiados gamontes dentro de células polimorfonucleares e cistos em
vários estágios de desenvolvimento. Os autores relataram que todos os órgãos
estavam infectados, com exceção dos músculos, porém baço e medula óssea
apresentavam-se com mais estágios do parasita.
Nas infecções por H. americanum, como a parasitemia é geralmente
muito baixa, o diagnóstico parasitológico de escolha é a biópsia muscular para
detecção dos cistos “onion skin cysts” característicos (Ewing et al., 2000).
2.6.2.3 Técnicas sorológicas
O uso da sorologia pode ser útil no diagnóstico de cães com baixa
parasitemia ou infecção crônica, nos quais existe dificuldade de detecção do
protozoário por esfregaço sangüíneo ou ainda, em cães em estágio inicial de
infecção, anteriormente ao aparecimento de parasitemia (Baneth et al., 1998).
Shkap et al. (1994) padronizaram um teste de imunofluorescência indireta (IFI),
utilizando como antígeno leucócitos parasitados de um animal com parasitemia
elevada. Este teste, desenvolvido para a detecção de anticorpos específicos
contra gamontes de H. canis, apresentou uma alta sensibilidade quando
comparado com a técnica de esfregaço sangüíneo de sangue periférico
(Baneth et al., 1998). Os resultados obtidos com a técnica de IFI revelaram que
níveis consideráveis de anticorpos são detectados em cães com infecção
aparente e em cães com história de infecção, mas sem gamontes detectáveis
em esfregaços sangüíneos. Esta técnica tem sido utilizada em estudos
epidemiológicos realizados em Israel (Baneth et al., 1996) e no Japão (Inokuma
et al., 1999).
Baneth et al. (2000) utilizaram gamontes purificados de H. canis, para
estudos antigênicos de parasitas livres de células, detectando pela primeira
vez, antígenos de gamontes pela técnica de Western immunoblotting. A análise
de soro anti-H. canis e anti- H. americanum pela técnica citada revelou que
várias bandas foram reconhecidas pelo soro de cães infectados com ambas
espécies de Hepatozoon, porém, algumas bandas foram reconhecidas
somente por uma das espécies. Também ocorreu reação cruzada entre os
soros pela técnica de IFI, entretanto, com marcante diferença na titulação. Em
relação ao Western blot, apesar de haver alguma semelhança na reatividade
nas proteínas de massa molecular mais elevada, três bandas moleculares na
região 32 a 28 kDa detectadas pelo soro anti- H. canis não foram reconhecidas
pelo soro anti- H. americanum. Os achados demonstraram haver relação
antigênica entre H. canis e H. americanum, com um certo grau de reatividade
cruzada, entretanto, com diferenças suficientes para serem caracterizadas
como espécies distintas.
2.6.2.4 Diagnóstico molecular
Com o advento das técnicas de biologia molecular uma grande diversidade de
ferramentas moleculares tornou-se disponível para elucidar várias questões
filogenéticas. Essas, quando determinadas, provaram ser extremamente úteis na
resolução filogenética quando comparadas com características morfológicas e de
ciclo de vida (Gouy & Li, 1989; Durfy & Willard, 1990; Hillis & Huelsenbeck,
1992).
A pequena subunidade nuclear do gene RNA ribossômico (Figura 1) tem
sido extensivamente usada para inferir as relações filogenéticas de uma
diversidade de protozoários (Schligel, 1991). As seqüências do gene RNA
codificado por plasmídeos, sugeriram relações de grupos-irmãos entre
Babesia, Plasmodium e Hepatozoon (Lang-Unnasch et al., 1998). Entretanto,
as características moleculares, quando consideradas em combinação com as
características biológicas, tornam-se uma ferramenta útil na resolução das
relações filogenéticas do filo Apicomplexa.
FIGURA 1. Subunidades do DNA ribossomal: 18S – 18S rDNA; 5.8S – 5.8S
rDNA; 28S – 28S rDNA; ETS – Espaçador Interno Transcrito; ITS – Espaçador
Interno Transcrito
Os primeiros estudos envolvendo Hepatozoon spp. e técnicas
moleculares começaram na década de 90. Espécies de Hepatozoon que
infectam serpentes foram geneticamente caracterizadas. Os oligonucleotídeos
foram desenvolvidos baseadas no locus de DNA ribossomal, de Plasmodium e
Babesia. Os autores obtiveram sucesso na amplificação do rDNA de cinco
diferentes isolados de hemogregarinas de serpentes, com a obtenção de
padrões específicos de bandas em diferentes hospedeiros, demonstrando que
estas espécies podem ser diferenciadas por análise de seqüências do locus
rDNA (Wozniak et al. 1994).
Nos anos seguintes, diferentes estudos filogenéticos foram realizados
com espécies de Hepatozoon que infectam serpentes (Smith et al., 1999;
Perkins & Martin, 1999; Perkins & Keller, 2001). Smith et al. (1999)
investigaram as relações filogenéticas entre sete isolados de Hepatozoon que
infectam serpentes, sapos e mosquitos. As análises foram baseadas em
seqüências do espaçador interno transcrito 1 (ITS-1), em características
morfológicas e morfométricas de gamontes, oocistos e esporocistos, além da
caracterização do ciclo de vida e especificidade ao hospedeiro. Os resultados
revelaram que H. sipedon, que infecta serpentes, é uma espécie polimórfica
com um grupo monofilético de seis isolados da região central de Ontário, e um
grupo irmão localizado ao sul da província.
Somente a partir do ano de 2000 iniciaram-se os estudos filogenéticos
envolvendo a identificação molecular de espécies de Hepatozoon, que infectam
cães. Com o objetivo de avaliar o nível de afinidade das espécies de
Hepatozoon dentro do filo Apicomplexa, Mathew et al. (2000) analisaram
seqüências do gene 18S rRNA de dois parasitas de cães (H. americanum e H.
canis) e um de sapo (H. catesbiane). Análises filogenéticas confirmaram a
relação de grupos irmãos entre H. americanum e H. canis, com similaridade de
96,4%. A taxa de divergência entre as seqüências foi de 3,6% entre H.
americanum e H. canis, de 6,2% entre H. americanum e H. catesbianae, e de
6,9% entre H. canis e H. catesbianae. Os autores sugeriram que a
hepatozoonose canina do Velho Mundo fosse causada por uma espécie
diferente do que no Novo Mundo.
No mesmo ano, Baneth et al. (2000) realizaram a identificação molecular
das espécies H. canis e H. americanum. Análises de seqüências parciais do
gene 18S rRNA revelaram uma diferença pareada, entre H. canis e H.
americanum, de 50 em 368 pares de bases (13,59%). A distância genética
observada entre as duas espécies foi consistente com a separação observada
em estudos anteriores (Vincent-Johnson et al. 1997). Desta forma, ficou
estabelecido que a espécie de Hepatozoon que infecta cães nos Estados
Unidos é o H. americanum e, em outras regiões do mundo é o H. canis.
A partir de então, diferentes estudos têm relatado a identificação
molecular de espécies de Hepatozoon que infectam cães no mundo. Em um
estudo realizado no Japão, Inokuma et al. (2002) analisaram seqüências de
dois cães diagnosticados com infecção por Hepatozoon spp. Análises
filogenéticas demonstraram que os isolados estavam intimamente relacionados
com H. canis de Israel (99%), e menos relacionados com H. americanum (94%)
e H. catasbianae (91%). Os autores concluíram que a amostra de Hepatozoon
encontrada no Japão deve ser uma cepa variante de H. canis. Criado-Fornelio
et al. (2003b) demonstraram que seqüências parciais de H. canis, isoladas em
raposas, estão altamente relacionadas com os isolados de H. canis de cães de
Israel e do Japão. Os autores concluíram que as diferenças entre os isolados
ocorreram devido às pequenas variações entre as cepas.
Também foi realizado o primeiro e único relato da infecção de
Hepatozoon sp. em gatos domésticos, no Brasil. Perez et al. (2004) detectaram
o protozoário no sangue periférico de três animais naturalmente infectados,
provenientes de Vargem Grande do Sul no Estado de São Paulo. A
identificação molecular da espécie de Hepatozoon spp., foi realizada por Rubini
et al. (2006). As análises filogenéticas revelaram que os isolados brasileiros
dos gatos estão intimamente relacionados com isolados brasileiros de cães,
considerados uma variante de H. canis (Rubini et al., 2005). Estes dados são
concordantes com a hipótese sugerida por Wenyon (1926), que considerou o
parasita presente na infecção dos gatos indistinguível de H. canis presente em
cães, chacais e hienas.
Recentemente, Criado-Fornelio et al. (2006) examinaram as relações
filogenéticas entre espécies de Hepatozoon isolados de mamíferos do Brasil e
Espanha. As análises detectaram quatro diferentes genótipos de H. canis, bem
como, um isolado do Brasil (raposa) relacionado a H. americanum (97%);
sendo este o primeiro relato de diagnóstico de uma espécie relacionada a H.
americanum fora dos Estados Unidos. Dois gatos apresentavam-se parasitados
por uma espécie de Hepatozoon, que apresentou 96% de identidade com H.
canis. As espécies de Hepatozoon de roedores apresentaram 95% de
identidade com as espécies de gato. Os resultados obtidos suportam a
hipótese sugerida por estudos anteriores de que Hepatozoon é um gênero
monofilético, no qual espécies de mamíferos carnívoros (Hepatozoon sp. de
gatos, H. americanum e H. canis) aparecem como linhagem irmã de
vertebrados inferiores e roedores.
Objetivos
Objetivos 20
3. OBJETIVOS
1. Caracterizar o gene 18S ribossomal das espécies de Hepatozoon que ocorre
em cães no Brasil.
2. Estudar a ocorrência desta espécie em cães de áreas rurais de São Paulo,
utilizando a técnica de PCR.
3. Comparar as técnicas de diagnóstico por esfregaços sangüíneos de sangue
venoso e sangue capilar, e a técnica de PCR no diagnóstico da hepatozoonose
canina.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção dos animais
Para a realização deste estudo foram coletadas amostras de sangue de 150 cães, de
áreas rurais, sendo Os animais foram escolhidos aleatoriamente, independentes da
raça ou estado de saúde, totalizando 86 machos e 64 fêmeas, sendo 32 deles com
idade inferior a um ano e 118 com idade superior a um ano. As coletas foram
realizadas nas cidades de Botucatu, Rio Claro, e Presidente Prudente, no Estado de
São Paulo, no período de novembro de 2004 a janeiro de 2005, sendo 50 amostras de
cada uma das localidades (Figura 2). Cada animal foi examinado para verificar a
presença de carrapatos.
FIGURA 2. Exemplo de residência visitada para exame de cães de áreas
rurais do Estado de São Paulo.
4.2 Coleta de sangue
Amostras de sangue da veia jugular foram colhidas em tubo “vacutainer”
contendo EDTA 10% para confecção de esfregaços sangüíneos e para a
extração do DNA, respectivamente. Amostras de sangue periférico,
provenientes de vasos auriculares (ponta de orelha), foram colhidas em
lâminas histológicas para confecção de esfregaços sangüíneos e detecção
direta do parasita em microscopia óptica.
4.3 Acondicionamento das amostras
Todas as amostras foram acondicionadas, identificadas e transportadas
sob refrigeração (4°C) para Laboratório de Biologia Molecular do Departamento
de Parasitologia do Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu,
onde foram congeladas em freezer -20°C e processadas posteriormente. Foi
realizada a pesquisa de hemoparasitas no laboratório de hematologia do
Departamento de Parasitologia no Instituto de Biociências, da Universidade
Estadual Paulista.
4.4 Coleta e identificação de carrapatos
Todos os cães foram examinados, principalmente nas orelhas e coxins
plantares e palmares, para detecção da presença de carrapatos. Os
exemplares encontrados foram coletados e armazenados em frascos para
posterior identificação. Os carrapatos adultos coletados foram classificados
segundo Aragão e Fonseca (1961).
4.5 Processamento das amostras
4.5.1 Técnicas hematológicas
Os esfregaços sangüíneos foram fixados com metanol e corados com
solução de May-Gruenwald-Giemsa 10%. A pesquisa parasitária foi realizada
em todo o esfregaço utilizando microscópio óptico e, objetiva de 1000 x, para o
diagnóstico de gamontes no interior de neutrófilos e monócitos.
4.5.2 Extração do DNA genômico
A extração de DNA das amostras de sangue foi realizada utilizando o
QIAamp DNA mini Kit, (QiAGEN, Hilden, Germany), de acordo com as
recomendações do fabricante.
4.5.3 Reações de amplificação
As reações de amplificação foram montadas em um volume total de 25
µl contendo 5 µl de DNA da amostra. O mix das reações foi composto de 2,5 µl
de tampão 10 X (Tris-HCl 10 mM pH 9,0, KCl 50 mM, MgCl
2
2 mM
,
Amersham
Biosciences), 0,5 µl dNTP mix 20 mM (Amersham Biosciences), 1,5 µl de Taq
DNA polimerase (1U/µl) (Amersham Biosciences), 1,5 µl de cada iniciador
HepF (5’ ATA CAT GAG CAA AAT CTC AAC 3) e HepR (5’ CTT ATT ATT CCA
TGC TGC AG3) (Inokuma et al., 2002) na concentração de 1 µM (Invitrogen
®
).
Para prevenir a contaminação das reações de amplificação, o mix foi preparado
em sala previamente esterilizada e, a seguir, o DNA das amostras foi aplicado
em capela de fluxo laminar (Engelab
®
).
As reações de amplificação foram realizadas em termociclador Whatman
Biometra
®
(T Gradient) com os ciclos de temperatura programados para: um
ciclo inicial de 94
o
C por 3 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 1 minuto,
57
o
C por 1 minuto e 72
o
C por 2 minutos, com um ciclo de extensão final de 7
minutos a 72
o
C.
Para verificação de contaminação durante o processo foi utilizado em
todas as reações um controle negativo através da substituição do ácido
nucléico por H
2
O Milli-Q, e um controle positivo de DNA genômico obtido de um
cão naturalmente infectado por H. canis.
4.5.4 Eletroforese em gel de agarose
A eficiência das amplificações foi monitorada utilizando um método
padrão segundo Sambrook et al., (1989). O produto amplificado com volume de
8 µl foi submetido à eletroforese em gel de agarose (GIBCO BRL
) 1% em
solução de TAE 1x (Tris-base 0,4 M; ácido acético 0,2 M e solução de EDTA
0,5 M, pH 8.0) contendo brometo de etídio a 0,5 µg/ml. A corrida eletroforética
foi realizada em cuba horizontal Hoeker HE 33 (Amersham Pharmacia Biotech)
a 100 volts por 1 hora. A banda foi visualizada em um transluminador UV e
fotografada com câmara digital Nikon coolpix 750. Para determinação dos
produtos amplificados foi utilizado o marcador de peso molecular de 100 pares
de base (100bp DNA Ladder, Invitrogen
®
). Foram consideradas positivas as
amostras que apresentaram produtos de amplificação com 625 pares de bases.
4.6 SEQÜENCIAMENTO
4.6.1 Purificação dos produtos de PCR
Para a obtenção da banda específica para o sequenciamento direto, o
produto de PCR de 625 pares de bases foi extraído e purificado utilizando o Kit
Montage™ PCR Centrifugal Filter Devices (Millipore
). Os procedimentos
adotados foram os seguintes:
Completar o volume da reação de PCR para um volume final de 400 µl e
transferir para a coluna de purificação;
Centrifugar por 1.000 x g por 15 minutos;
Adicionar 20 µl de TE (Tris-HCl 10 mM pH 7.4, EDTA 1 mM) estéril à
coluna de purificação, inverter e centrifugar a 1.200 x g por 2 minutos;
Identificar as amostras e acondicionar em freezer -20°C para posterior
utilização.
4.6.2 Reação de seqüenciamento
As seqüências de DNA foram determinadas em seqüenciador automático
ABI 377 (Applied Biosystems
®
) utilizando-se 6 µl de 2,5x Save Money (400 mM
Tris-HCl pH 9,0, 10 mM MgCl
2
), 2 µl BigDye Terminator Cycle Sequencing
Ready Reaction Kit versão 3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA), 3,2 ρmol
dos oligonucleotídeos forward e reverse, e 4 µl do DNA genômico a 5 ng/µl. As
reações de seqüenciamento foram realizadas em termociclador Whatman
Biometra
(T Gradient) com os ciclos de temperatura programados para: 25
ciclos de 95°C por 10 segundos 50°C por 5 segundos, 60°C por 4 minutos, com
rampa de 1°C/segundo, como recomendado pelo fabricante. Após a
amplificação as amostras foram mantidas a 4°C até a precipitação. Para cada
amostra foram utilizadas 2 reações, sendo uma para o primer foward e outra
para o reverse.
4.6.3 Precipitação
Para cada reação de seqüenciamento foram adicionados 80 µl de
isopropanol 65%, incubando a temperatura ambiente por 20 minutos. Em
seguida, as amostras foram centrifugadas a velocidade de 10.000 rpm por 25
minutos, a temperatura ambiente. O isopropanol foi removido invertendo os
tubos e, a seguir, adicionou-se 200 µl de etanol 70% e centrifugou-se a
velocidade de 10.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Removeu-se
todo o etanol com auxílio de micropipeta, pois qualquer etanol residual
resultaria em manchas fluorescentes. As amostras foram secas a temperatura
ambiente e o DNA foi eluído em 2 µl de tampão de amostra contendo
Formamida Hi-Di (Applied Biosystems) + Loading Buffer (25 mM EDTA pH
8,0 contendo 50 mg/ml Blue Dextran) (5:1). No momento da aplicação em
seqüenciador automático ABI PRISM
377 (Applied Biosystems, USA) as
amostras foram aquecidas a 95°C por 5 minutos e rapidamente transferidas
para o gelo.
4.6.4 Análise das seqüências
As seqüências forward e reverse, geradas automaticamente, foram
alinhadas com auxílio dos programas MERGER
(http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/alignment/intro-uk.html) e CLUSTAL W versão
1.8 (Thompson et al., 1994). A seguir foram comparadas com outras
disponíveis no GenBank, e identificadas utilizando-se o BLASTn
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Posteriormente as seqüências foram
utilizadas para construção das árvores filogenéticas utilizando-se o programa
MEGA versão 2.1 (Kumar et al., 2001). Os métodos de máxima parsimônia
(MP) e distância (NJ) foram utilizados na reconstrução filogenética do
fragmento estudado. Taxas de divergência foram conduzidas, utilizando-se o
algorítimo de Kimura-2p. Para se estimar o índice de consistência foram
utilizadas árvores com teste de bootstrap sobre 1000 réplicas (Felseinstein,
1985).
4.7 Análise estatística
Os dados obtidos pela técnica de PCR foram comparados utilizando-se
o Teste do Chi
2
pelo programa Sigma Stat 2.0 (Jandel Corporation) com nível
de significância adotado de 5%.
O estudo das associações entre as variáveis de interesse foi realizado
através do teste de Goodman (1965), para contraste entre e dentro das
proporções multinomiais.
A comparação dos testes de esfregaços sangüíneos para detecção de
Hepatozoon spp.foi utilizado o teste de Kappa,COHEN (1960).
5. RESULTADOS
5.1 Técnica de esfregaço sangüíneo
Na análise realizada utilizando-se a técnica de esfregaço sangüíneo,
foram detectados 17 animais positivos para a presença de Hepatozoon spp.
(11,3%), ou seja, que apresentaram gamontes de Hepatozoon no interior de
monócitos ou neutrófilos (Figura 3). Desses, 5 (8,3%) eram provenientes de
cães de Botucatu, 6 (12%) de Presidente Prudente e 6 (12%) de Rio Claro. A
análise de esfregaços de sangue capilar (ponta de orelha) revelou 14 (9,3%)
animais positivos nas três localidades, enquanto a análise de esfregaços de
sangue da veia jugular revelou 7 (4,7%) positivos, entretanto, a diferença
estatística entre as duas técnicas não foi significativa, com concordância de
91,3% (Tabela 1).
FIGURA 3. Gamonte de Hepatozoon spp. observado em lâmina de esfregaço
sanguíneo de sangue periférico corado (Giemsa, 1000x).
TABELA 1. Comparação dos testes de esfregaços sangüíneos para detecção
de Hepatozoon spp. em cães naturalmente infectados de áreas rurais do
Estado de São Paulo.
Jugular
Ponta de orelha Positivo Negativo Total
Positivo 4 10
Negativo
3 133
Total
7
143 150
Kappa= 0,34
5.2 Reação em cadeia pela polimerase
Produtos de amplificação de DNA extraídos de sangue de cães,
submetidos à técnica de PCR, foram detectados em 80/150 (53,3%) das
amostras analisadas. Desses, 35 (70%) eram provenientes de cães de
Botucatu, 26 (52%) eram de Presidente Prudente e 19 (38%) eram de Rio
Claro. A análise estatística revelou diferença significativa entre os animais
positivos e os animais negativos para Hepatozoon spp., somente em Botucatu,
houve diferença significativa entre o número de animais infectados quando
comparamos Botucatu e Rio Claro (p<0,05) (Tabela 2). Das amostras positivas
pela PCR, 17 (11,3%) eram sabidamente positivas para Hepatozoon spp.,
através da visualização dos gamontes na microscopia óptica. Todas as
amostras positivas em lâminas foram positivas pela técnica de PCR.
Os produtos de amplificação foram compatíveis com o controle positivo
de um cão da cidade de Botucatu positivo para Hepatozoon spp. pelo exame
de esfregaço sangüíneo. Utilizando os iniciadores HEPF e HEPR o produto
visualizado apresentou aproximadamente 650 pb (Figura 4). Comparando-se
as técnicas utilizadas no diagnóstico foram detectados 17 (11,3%) animais
positivos por esfregaço sanguíneo, e 80 (53,3%) pela PCR, sendo essa
diferença estatisticamente significativa (
χ
χχ
χ
2
=58,565
e p<0,001).
TABELA 2. Porcentagem de cães de áreas rurais positivos (N=150) para
Hepatozoo spp. em três municípios do estado de São Paulo.
Hepatozoon spp. Botucatu
Rio Claro
Pres. Prudente
n (%) n (%) n (%)
Positivos 35 (70)
A a
19 (38)
A b
26 (52)
A ab
Negativos 15 (30)
B b
31 (62)
A a
24 (48)
A ab
Total 50 50 50
Letras minúsculas diferentes nas linhas e letras maiúsculas diferentes nas colunas
indicam diferença estatística significativa (p< 0,05). Teste de Goodman.
FIGURA 4. Eletroforese dos produtos de amplificação de DNA para
Hepatozoon spp em amostras de cães no Brasil pela técnica de PCR:
Amostras 1, 2, 3 e 5 positivas para presença de Hepatozoon spp (HEP).
Amostra 4 negativa para amplificação. Amostras 6 e 7 utilizadas como controle
positivo e negativo, respectivamente. PM: Padrão de peso molecular de 250pb.
5.3. Carrrapatos coletados
Carrapatos das espécies R. sanguineus e Amblyomma spp. foram
encontrados em 36 (24%) dos 150 animais do estudo. Do número total de
cães, 19 (52,7%) estavam infestados por carrapatos do gênero Amblyomma.
As espécies foram identificadas como: A. cajennense 9 (25%) e A. ovale 9
1 2 3 4 5 6 7 PM
HEP
1000
750
500
250
(25%). Um exemplar de Amblyomma 1 (2,7%), que se encontrava no estágio
de ninfa, não foi identificado quanto à espécie. Carrapatos R. sanguineus foram
recuperados em 19 cães (52,7%). A maioria dos cães estava infestada por
apenas uma espécie de carrapato, exceto em dois deles (5,5%) que possuíam
uma infestação mista por R. sanguineus e A. cajennense.
As três regiões estudadas apresentavam cães infestados por carrapatos,
sendo 47,2% em Botucatu, 36,1% em Rio Claro, e 16,6% de Presidente
Prudente (Tabela 3). A análise estatística apontou diferença significativa entre
o grau de infestação de carrapatos dos cães de Botucatu em relação à
Presidente Prudente, somente quando analisamos a quantidade de A.
cajennense. Em relação às espécies encontradas em cada cidade, somente
em Presidente Prudente houve diferença em relação ao número de R.
sanguineus e carrapatos do gênero Amblyomma (Tabela 3).
TABELA 3. Distribuição dos carrapatos encontrados em cães (N=150) de
áreas rurais do estado de São Paulo, de acordo com a localidade.
Botucatu
Rio Claro
Pres. Prudente
n (%) n (%) n (%)
Riphicephalus
sanguineus
5 (29,4)
A a
10 (76,9)
A a
4 (80,0)
A a
Amblyomma cajennense 7 (41,1)
A a
2 (15,3)
B ab
0
B b
Amblyomma ovale 6 (35,2)
A a
2 (15,3)
B a
1 (20,0)
AB a
Total
18 (100) 14 (100) 5 (100)
Letras minúsculas diferentes nas linhas e letras maiúsculas diferentes nas colunas
indicam diferença estatística significativa (p< 0,05). Teste de Goodman.
Na região de Botucatu foram encontrados 29,4% dos cães parasitados
por carrapatos da espécie R. sanguineus e 76,4% por espécies do gênero
Amblyomma, sendo 41,1% por A. cajennense e 35,2% por A. ovale. Na região
de Rio Claro, 76,9% dos cães estavam infestados por carrapatos da espécie R.
sanguineus e 30,7% por espécies do gênero Amblyomma, sendo que as
espécies A. cajennense e A. ovale estavam presentes em proporções iguais. A
localidade de Presidente Prudente apresentou menor número de animais
infestados, sendo 80% por carrapatos da espécie R. sanguineus e 20% por
espécies Amblyomma ovale, e as análises dos dados revelaram que não houve
diferença estatística quando comparado à Botucatu e Rio Claro quanto à
proporção de carrapatos recuperados dos cães (p> 0,05).
5.4. Relação entre infecção por Hepatozoon spp. e infestação por
carrapatos
Dos 80 cães que foram positivos para Hepatozoon spp. pelas técnicas
de PCR e/ou esfregaço sangüíneo, 17 cães (21,3%) estavam infestados com
carrapatos no momento da colheita do sangue. Seis destes cães estavam
parasitados por R. sanguineus e 13 por Amblyomma spp., sendo que em dois
deles havia infestação mista com R. sanguineus e A. cajennense. Não houve
associação significativa entre os animais positivos para Hepatozoon spp. e
infestados por R. sanguineus (Tabela 4) e Amblyomma spp. (Tabela 5).
TABELA 4. Comparação entre infestação por carrapatos Rhipicephalus
sanguineus e animais positivos para Hepatozoon spp. em cães de áreas rurais
do estado de São Paulo, naturalmente infectados.
Hepatozoon spp.
Riphicephalus sanguineus
Animais
positivos
Animais
negativos
Total
Cães infestados 6 (7,5%)
B b
13 (18,6%)
B a
19
Cães não infestados
Total
74 (94,5%)
A a
80 (100%)
57 (81,4%)
A b
70 (100%)
131
150
Letras minúsculas diferentes nas linhas e letras maiúsculas diferentes nas colunas
indicam diferença estatística significativa (p< 0,05). Teste de Goodman.
TABELA 5. Comparação entre infestação por carrapatos Amblyomma spp. e
animais positivos para Hepatozoon spp. em cães de áreas rurais do estado de
São Paulo, naturalmente infectados.
Hepatozoon spp.
Amblyomma spp.
Animais
positivos
Animais
negativos
Total
Cães infestados
13 (16,2%)
B a
06 (8,6%)
B a
19
Cães não
infestados
67 (83,8%)
A a
64 (91,4%)
A a
131
Total
80 (100%) 70 (100%) 150
Letras minúsculas diferentes nas linhas e letras maiúsculas diferentes nas colunas
indicam diferença estatística significativa (p< 0,05). Teste de Goodman.
5.5 Seqüenciamento
Das oitenta amostras positivas na reação de PCR oito (HEP 3, 4, 13, 14,
16, 18, 19, 23) foram selecionadas para o seqüenciamento direto. As
seqüências de nucleotídeos obtidas foram alinhadas e comparadas com outras
disponíveis no GenBank. Foram utilizados no alinhamento 562 pares de bases
(Figura 5).
HEP16 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP18 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP19 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP23 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
Fukuoka AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP14 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP13 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP4 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
HEP3 AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTAGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
Hcanis AAAT-TGGTGATTTATAATAACTTGGCAAATCGCAAAGTGAAAACAGGCGATAAATCATT
Hamericanum AAGT-TGGTGATTTACAATAACTTAGGAAATCGCAAAGTGTAAACAGGCGATAAATCATT
Hcatesbiane AAGTGTAATGATATAAAATAACTAAGCAAATCGCACAGTGTAAACTAGCGATAAATCATT
** * * **** ** ******* * ******** **** **** *************
HEP16 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP18 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP19 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP23 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
Fukuoka CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP14 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP13 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP4 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
HEP3 CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
Hcanis CAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
Hamericanum TAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATGGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
Hcatesbiane TAAGTTTCTGACCTATCAGCTTTCGACGGTATAGTATTGGCTTACCGTGGCAGTGACGGT
******************************* ***************************
HEP16 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP18 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP19 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP23 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
Fukuoka TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP14 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP13 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP4 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
HEP3 TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
Hcanis TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
Hamericanum TAACGGGGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
Hcatesbiane TAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCTAA
******** ***************************************************
HEP16 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP18 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP19 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP23 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
Fukuoka GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP14 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP13 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP4 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
HEP3 GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
Hcanis GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGTTTGAGAGAGGTAGTAACAAGA
Hamericanum GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTCTAACAGCATAAGAGAGGTAGTGACAAGA
Hcatesbiane GGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATTTTAACAGCATAAAAGAGGTAGTGACAAGA
******************************* ****** * * ********* ******
HEP16 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP18 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP19 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP23 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
Fukuoka AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP14 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP13 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP4 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
HEP3 AATAACAATACAAGGCAGTTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
Hcanis AATAACAATACAAGGCAATTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACCCTT
Hamericanum AATAACAATACAAGGCAATTAAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACACTT
Hcatesbiane AATAACAGTACAAGGCAGTTTAAATGCTTTGTAATTGGAATGATAGAAATTTAAACAATT
******* ********* ** *********************************** **
HEP16 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP18 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP19 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP23 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
Fukuoka TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP14 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP13 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP4 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
HEP3 TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
Hcanis TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
Hamericanum TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
Hcatesbiane TTTAAAGTATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAA
************************************************************
HEP16 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP18 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP19 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP23 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
Fukuoka TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP14 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP13 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP4 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
HEP3 TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTGAAAGTAA
Hcanis TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAAGTTCTGCTAAAAGTAA
Hamericanum TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGTTAAAAATAA
Hcatesbiane TAGCGTATATTAAAATTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTATGCTAGAAATAG
******************************************** ** ** * ** **
HEP16 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP18 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP19 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP23 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
Fukuoka CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP14 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP13 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP4 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
HEP3 CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTATGTATTTAGCAATGAT-GTC
Hcanis CCGGTCTGCTTTTAATA----AAAGTGGTATCTT--GGTGTGTATTTAGCAATGAT-GTC
Hamericanum CCGGTCTGCTTTTATTATTAAAAGTTGGTATCTTTTGGTGTGKNTKTAGCAATAAYAGTC
Hcatesbiane CCGGTGTGCTTTTAATAATA-AAAGTAATATCTT--AGTGTGTTACTAGCAATAAT-GTC
***** ******** ** ** * ****** ** ** ******* * ***
HEP16 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP18 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP19 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP23 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
Fukuoka CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP14 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP13 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP4 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
HEP3 CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
Hcanis CTTTGAAGTGTTTTTTACTTTATTGTAATAAAGCATA---TTCAGGACTTTTACTTT--G
Hamericanum CTTTGAAATGTTTTTTACTTTATTGTAATAAGTCATTRTTTTGAGGATTTTTACTTTTTG
Hcatesbiane TTTTGAAATGTTTTTTACTTTATTGTAAAAAACAATA---TTCAGGATTTTTACTTT--G
****** ******************** ** ** ** **** ********* *
HEP16 AGAAAATTAGAGTGGTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP18 AGAAAATTAGAGTGGTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP19 AGAAAATTAGAGTGGTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP23 AGAAAATTAGAGTGGTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
Fukuoka AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP14 AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP13 AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP4 AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
HEP3 AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCTGACGCTTT
Hcanis AGAAAATTAGAGTGTTTCTAGCAGGCCGACGCTTT
Hamericanum AGAAAATTAGAGTGTTTTTAGCAG-----------
Hcatesbiane AGAAAATTAGAGTGTTTCAAGCAGGCTAACGCTAT
************** ** *****
FIGURA 5. Alinhamento múltiplo das seqüências realizado pelo programa
CLUSTAL X (1.81). Seqüências de Hepatozoon canis – Fukuoka (AF418558),
Hepatozoon canis – Israel (AF176835), H. americanum (AF176836) e H.
catesbiane (AF176837) obtidas no GenBank, foram utilizadas no alinhamento.
5.6 Análise Filogenética
As análises filogenéticas demonstraram que os isolados do Brasil estão
mais fortemente relacionados com espécies de Hepatozoon, que foram
consideradas uma variante de H. canis, mas diferentes de H. americanum. A
espécie do gênero Hepatozoon sp. que infecta cães brasileiros está mais
relacionada com amostras de Hepatozoon sp. Fukuoka (99%), e mais
distantemente relacionadas com H. americanum (92%) e H. castebiane (91%).
Depois do Hepatozoon sp. Fukuoka (99%), a seqüência mais similar foi de H.
canis (98%) como pode ser visto na Figura 6.
FI
GU
RA
6.
Árv
ore
de
Nei
gh
bor
-
Joi
ning baseada no gene 18S rDNA de Hepatozoon spp. isoladas no Brasil.
Valores de bootstrap maiores que 50% estão apresentados na figura.
Seqüências de Hepatozoon – Fukuoka (AF418558), Hepatozoon canis – Israel
(AF176835), H. americanum (AF176836) e H. catesbiane (AF176837) obtidas
no GenBank, foram utilizadas como outgroup.
Nossas seqüências mostraram a presença de um sítio polimórfico
representado por uma transversão (T G). Estes resultados indicam que a
espécie de Hepatozoon que infecta cães em áreas rurais do estado de São
Paulo, Brasil são H. canis, mas com a possibilidade de ocorrência de cepas
variantes da mesma região geográfica. A partir de agora, passaremos a
nomear a espécie de Hepatozoon em cães de H. canis, até que encontremos
evidências de que existe uma outra espécie parasitando estes animais do
Brasil.
6. DISCUSSÃO
A hepatozoonose canina é uma doença causada por protozoários do
gênero Hepatozoon, sendo transmitida por carrapatos. Desde as primeiras
descrições, a ocorrência desse parasita tem sido relatada em diversos países
do mundo. Atualmente existem duas espécies de Hepatozoon descritas, H.
canis e H. americanum, sendo a diferenciação possível através da utilização de
ferramentas moleculares (Baneth et al., 2000).
No Brasil, existem poucos estudos epidemiológicos, e pouco se conhece
sobre este aspecto do H. canis. Pesquisas demonstram que a prevalência da
infecção causada por esse parasita pode ser bastante elevada, principalmente
em cães de áreas rurais. Porém, a maioria dos diagnósticos foi realizada pelo
método de esfregaços sangüíneos em cães aparentemente saudáveis, ou em
animais com doenças concomitantes, o que não permite ter uma visão real da
infecção (O’Dwyer & Massard, 2001). O diagnóstico da doença com base em
técnicas moleculares tem sido utilizado em alguns casos, embora no Brasil
ainda haja escassez de estudos. A caracterização genética dos isolados,
encontrados em nosso país, possibilitaria esclarecer as relações entre os casos
de H. canis relatados (Paludo et al. 2005).
No presente estudo foram avaliados cães de áreas rurais, para a
presença da infecção por H. canis, pelas técnicas de esfregaços sangüíneos e
PCR. Os resultados da pesquisa demonstraram uma alta prevalência da
infecção por H. canis nos cães examinados, entretanto estes não
apresentavam sinais clínicos característicos da hepatozoonose.
A análise realizada utilizando-se a técnica de esfregaço sangüíneo de
sangue capilar (ponta de orelha) e de sangue da veia jugular, demonstraram
que não houve diferença estatística entre os testes. Apesar da combinação de
dois tipos de esfregaços sangüíneos (sangue circulante e sangue periférico),
que poderia aumentar a probabilidade de encontro de gamontes, o diagnóstico
por microscopia detectou um baixo número de cães positivos para H. canis.
Resultado semelhante foi observado por Paludo et al. (2003) que analisaram
esfregaços sangüíneos de 30 cães de área urbana, na cidade de Brasília, e
encontraram Hepatozoon spp. em 22 animais, sendo cinco em esfregaço
sangüíneo de sangue circulante, sete em esfregaço sangüíneo de sangue
periférico e dez em ambos.
Pesquisas demonstraram que em Israel a prevalência deste agente
diagnosticado por esfregaço sangüíneo variou de 1% (Baneth et al. 1996) a
22% (Ezeokoli et al. 1983). No Brasil, a prevalência de gamontes em esfregaço
sangüíneo variou de 0,5 a 3% (O’Dwyer et al., 2001). Nesse mesmo estudo os
autores analisaram esfregaços sangüíneos de 250 cães que viviam em áreas
rurais, no Estado do Rio de Janeiro, e relataram uma taxa média de infecção
de 39,2%. A prevalência das infecções por H. canis variou de 9,1% a 59,4%
entre as diferentes áreas estudadas.
Massard (1979) relatou que, ao contrário do que acontece nas áreas
rurais, onde a hepatozoonose canina tem sido descrita com alta prevalência,
nas áreas urbanas ela tem se mostrado pouco freqüente. Este autor, em um
estudo epidemiológico realizado com cães de áreas urbanas e rurais, do
Estado do Rio de Janeiro, utilizando diagnóstico por esfregaços sangüíneos,
demonstrou que o parasitismo foi mais freqüente em cães de áreas rurais
(31,58%), do que em cães de áreas urbanas (4,48%).
Em um outro estudo realizado na cidade de Botucatu, Estado de São
Paulo, foram analisados esfregaços sangüíneos de 222 cães de áreas urbanas
e a infecção por H. canis foi detectada em 13 animais (5,9%). Neste caso, a
taxa de infecção encontrada foi baixa, mas similar a resultados observados em
cães de áreas urbanas no Brasil (O’Dwyer et al., 2004).
A técnica de esfregaço sangüíneo é empregada rotineiramente como
método de diagnóstico na maioria dos estudos. Entretanto, esta não é uma
técnica muito sensível, visto que, os gamontes nem sempre são detectáveis,
principalmente, quando a parasitemia é baixa ou intermitente (O’Dwyer et al.,
2001). Existem casos em que os exames por esfregaços sangüíneos podem ter
sua sensibilidade aumentada se realizado a partir da capa leucocitária, quando
comparado com o esfregaço de sangue periférico, uma vez que o parasita
infecta principalmente leucócitos (Mylonakisa et al., 2003).
Autores discutem que apesar das similaridades morfológicas e genéticas
entre as duas espécies de Hepatozoon, que infectam cães, cada uma delas
causa uma doença distinta (Mathew et al., 1998; Baneth et al., 2000). O
Hepatozoon canis é considerado um parasita de baixa patogenicidade, que
causa doença subclínica quando em baixa parasitemia, sendo que a forma
grave da doença ocorre principalmente em cães que exibem alta parasitemia
(Baneth & Weigler, 1997). No presente estudo, apesar da alta taxa de infecção
por H. canis detectada nos cães, nenhum dos animais apresentava sinais
clínicos característicos da mesma. A ausência de sintomatologia observada
nesses cães pode ocorrer devido à baixa patogenicidade do parasita, como foi
relatado por O’Dwyer et al. (2001). Comparando-se este aspecto a outro estudo
realizado por O’Dwyer et al. (2004), cães também foram positivos para H.
canis, embora não apresentassem alterações hematológicas que pudessem
ser relacionadas a este protozoário. Estes estudos sugerem que o H. canis
pode estar melhor adaptado aos hospedeiros caninos, produzindo uma doença
subclínica em muitos casos (Baneth et al. 2003).
O’Dwyer et al. (2001) relataram que a infecção por H. canis tem baixa
patogenicidade quando o parasita é encontrado isoladamente. Entretanto, ele
tem sido freqüentemente relatado em associação com outros hemoparasitas.
Assim, muitas vezes os sinais clínicos observados, na hepatozoonose canina,
podem ser atribuídos a infecções concomitantes por outros patógenos mais
severos tais como: Babesia canis, Ehrlichia canis, Toxoplasma gondii,
Parvovirus, entre outras (Gossett et al., 1985; Harmelin et al. 1992; Baneth et
al., 1997; Gondim et al., 1998; O´Dwyer et al., 1997, 2001).
Recentemente, técnicas moleculares, incluindo a PCR e análise de
seqüências, têm sido utilizadas para o diagnóstico desta infecção e
caracterização dos isolados (Baneth et al., 2000; Inokuma et al., 2002; Rubini
et al., 2005). As principais vantagens das técnicas moleculares são a
especificidade e sensibilidade para detecção dos patógenos tanto em sangue
periférico quanto nos artrópodes vetores (Inokuma et al., 2002), embora seja
uma técnica laboriosa, de fácil contaminação e de alto custo (Farah, 1997).
Comparando-se as técnicas de diagnóstico utilizadas no presente
estudo, a PCR foi mais sensível do que a observação direta do parasita por
esfregaços sangüíneos. Estes resultados demonstram que a presença do
parasita pode não ser detectada pela observação direta do parasita, uma vez
que, este apresenta baixa sensibilidade para os casos em que os cães
apresentam parasitemia intermitente ou baixos níveis de gamontes circulantes.
O baixo parasitismo pode ocorrer em cães com estágio inicial de infecção,
infecção crônica ou nos casos em que os animais apresentam boa imunidade
(Baneth et al., 1998; Vicent-Johnson et al., 1997a). Os resultados observados
no presente estudo confirmam relatos anteriores que demonstraram que a
infecção por H. canis diagnosticada pela PCR é altamente sensível (Criado-
Fornelio et al., 2003a).
Existem ainda evidências de que a observação direta do parasita é
menos sensível que a IFI. Baneth et al. (1996) realizaram um estudo
comparando as duas técnicas e observaram a infecção em apenas 1% dos
exames de esfregaços sangüíneos, enquanto que a porcentagem de animais
positivos detectados por IFI foi de 33,1%. Gonen et al. (2004) padronizaram a
técnica de ELISA, utilizando como antígeno gamontes de H. canis e a
aplicaram para a detecção de anticorpos reativos com H. canis. A avaliação do
ELISA com o soro de cães naturalmente infectados indicou que este foi
sensível (86%) e específico (97%). As amostras submetidas ao diagnóstico por
ELISA foram também submetidas a IFI, e apesar de não haver diferença
estatística significativa entre os testes, os autores afirmaram que existem
muitas vantagens do ELISA sobre a IFI.
Karagenc et al. (2006) realizaram um estudo epidemiológico com 349
cães, na Turquia, e compararam a sensibilidade de diferentes técnicas no
diagnóstico de Hepatozoon spp. O exame parasitológico realizado pela técnica
de esfregaço sangüíneo detectou 10,6% de cães infectados por H. canis,
enquanto que a técnica de PCR detectou 25,8%. Anticorpos reativos para H.
canis foram detectados em 36,8% das amostras de soro. A comparação dos
resultados obtidos pela PCR e IFI indicou que 22,6% das amostras positivas
pela PCR foram também positivas para IFI. Enquanto que 4,7% dos animais
foram positivos apenas pela PCR e 14,1% apenas para IFI. A alta positividade
de cães detectados pela IFI pode ser explicada pela presença de anticorpos
anti-H. canis que podem persistir por meses após a infecção, quando a
parasitemia pode não ser detectada (Baneth et al., 1998; Gonen et al., 2004).
Análises dos dados demonstraram diferença significativa entre os testes
empregados, assim como também foi observado no presente estudo.
Os cães criados em áreas rurais vivem soltos e têm livre acesso às
matas e outros ambientes, onde diferentes espécies de animais silvestres e
domésticos estão presentes. Nestas condições, os cães podem ser infestados
por diferentes espécies de carrapatos, podendo ser infectados por diferentes
agentes. Desta forma, o conhecimento da fauna ixodológica de cães de
determinada região é importante para a adoção de medidas de controle, tanto
das infestações, como das doenças por eles transmitidas (Labruna & Campos
Pereira, 2001).
Em nosso estudo, 24% dos cães estavam infestados por carrapatos,
sendo o número de animais infestados menor do que o esperado. Este dado
provavelmente reflete o tratamento indiscriminado de carrapaticidas realizado
por proprietários de animais, sendo que neste estudo, os mesmos
freqüentemente relataram terem realizado algum tipo de tratamento nos cães.
O carrapato R. sanguineus é considerado o vetor biológico responsável
pela transmissão do H. canis, principalmente em cães de áreas urbanas e peri-
urbanas (Costas et al., 1962; Flechtmann, 1990). Este artrópode é
freqüentemente encontrado parasitando os hospedeiros ou sob formas de vida
livre, escondido em frestras e buracos no ambiente onde o cão vive, já que
possui hábitos nidícolas (Labruna & Campos Pereira, 2001). Soares et al.
(2006) realizaram uma avaliação ectoparasitológica em 101 cães procedentes
de área urbana na cidade de Juíz de Fora, Minas Gerais, sendo que 50 deles
viviam em apartamento na região central e 51 em casas com quintais
gramados. Os autores verificaram que R. sanguineus foi o único carrapato
encontrado nos cães estudados, sendo 2% deles nos cães de apartamento e
35% nos cães que viviam em casas. Apesar dos cães do presente estudo
terem sido provenientes de áreas rurais, 19 animais estavam parasitados por
R. sanguineus, sendo que seis desses eram positivos para H. canis. As
análises dos dados não indicaram uma associação estatística significativa entre
os animais positivos para H. canis e os infestados por esta espécie de
carrapato.
Riphicephalus sanguineus são freqüentes nas infestações dos cães, e
muitas vezes são encontrados em associação com outras espécies,
principalmente do gênero Amblyomma. Dezenove cães do presente estudo
apresentaram infestação por Amblyomma spp., sendo que 13 desses eram
positivos para H. canis. As espécies de Amblyomma encontradas nos cães de
áreas rurais foram: A. cajennense (25%), A. ovale (25%). Esses achados são
semelhantes com Aragão (1936) e Massard et al. (1981), que afirmaram que na
região sudeste as espécies de Amblyomma mais freqüentemente encontradas
em cães de áreas rurais são: A. aureolatum, A. ovale, A. tigrinum e A.
cajennense. Da mesma forma como observado para R. sanguineus, as
análises estatísticas realizadas não demonstraram uma associação significativa
entre os animais positivos para H. canis e a infestação por espécies de
Amblyomma spp.. A não associação entre a infestação por carrapatos e a
infecção por H. canis pode não ter ocorrido, possivelmente, devido ao pequeno
número de carrapatos coletados dos cães nesta pesquisa.
Em um estudo realizado por O’Dwyer et al. (2001) com cães de áreas
rurais, no Estado do Rio de Janeiro, foram observados 37,6% dos cães
infestados por carrapatos das espécies: R. sanguineus, A. cajennense, A. ovale
e A. aureolatum. Diferente do que foi observado no presente trabalho, os dados
obtidos por O’Dwyer et al. (2001) revelaram uma associação positiva entre a
infestação por A. cajennense e as infecções por H. canis, nos cães, levando os
autores a sugerirem que carrapatos dessa espécie podem ser vetores
potenciais do H. canis no Brasil.
Szabó et al. (2001) investigaram a taxa de infestação de carrapatos em
cães, de áreas urbanas e peri-urbanas, na região de Franca, Estado de São
Paulo. Os dados mostraram que 27,5% dos cães de áreas urbanas estavam
infestados exclusivamente por R. sanguineus, e 36,8% dos cães de áreas
rurais estavam infestados por carrapatos de diferentes espécies, sendo que em
50% dos casos, a infestação ocorria também por R. sanguineus. Estes dados
são semelhantes aos do presente estudo, no qual a porcentagem de cães de
áreas rurais parasitados por R. sanguineus e Amblyomma spp. foi igual
(52,7%). Casos como esses podem ocorrer quando cães de áreas rurais vivem
presos ou confinados em áreas cercadas, similares às condições de um
ambiente urbano, o que possibilita o estabelecimento de populações de R.
sanguineus (Labruna & Campos Pereira, 2001).
Forlano et al. (2005) estudaram a transmissão do H. canis por quatro
espécies de carrapatos, coletadas de cães de áreas rurais, no Estado do Rio
de Janeiro. Baseados nos dados obtidos, os autores sugeriram que carrapatos
da espécie A. ovale podem ser considerados vetores potenciais de Hepatozoon
spp. em áreas rurais do Brasil. Contudo, estudos demonstraram que em
algumas regiões do Japão, onde o H. canis ocorre, carrapatos da espécie R.
sanguineus não são os mais freqüentes. Desse modo, sugeriu-se que o
carrapato Haemaphysalis longicornis pudesse também atuar como vetor, por
ser esta uma espécie preponderantemente encontrada em cães portadores de
H. canis (Murata et al., 1993). Essa hipótese foi confirmada com o encontro de
oocistos em adultos de H. longicornis e em ninfas de Haemaphysalis flava,
retirados de cães portadores (Murata et al., 1995).
Baseado nesses estudos pode-se observar que diferentes vetores
podem ser transmissores do Hepatozoon spp. para cães, podendo estar
relacionado às áreas geográficas e às condições de criação dos animais.
Entretanto, no Brasil, existe a necessidade de estudos mais detalhados para se
determinar os vetores dessa espécie, já que nas áreas rurais, onde a
prevalência de H. canis é maior, diferentes espécies de carrapatos têm sido
implicadas como possíveis vetores (O’Dwyer et al., 2001).
Em relação às regiões estudadas, a análise estatística demonstrou
diferença significativa entre as localidades de Botucatu, Rio Claro, quanto ao
número de animais positivos para H. canis. A maior porcentagem de
positividade foi detectada na cidade de Botucatu (70%), que apresentou
também a maior infestação por carrapatos (47,2%). Embora nenhuma das
localidades tenha apresentado associação entre a porcentagem de infecção e
infestação nos cães estudados. As localidades de Presidente Prudente e Rio
Claro apresentaram 52% e 38% de positividade para H. canis,
respectivamente.
Com o objetivo de se identificar à espécie de Hepatozoon, que infecta
cães no Brasil, foi realizado no presente estudo a caracterização molecular de
oito amostras positivas para H. canis. Análises dos dados revelaram que os
isolados brasileiros estão intimamente relacionados com a espécie de
Hepatozoon sp. caracterizada no Japão, que foi considerada uma cepa
variante do H. canis, mas significativamente diferente do H. americanum
(Rubini et al., 2005). No estudo relatado no Japão, os autores analisaram
amostras de dois cães positivos para Hepatozoon sp., e ambas as seqüências
foram idênticas. Análises filogenéticas da seqüência obtida mostraram alta
similaridade (99%) desta com a de H. canis caracterizada em Israel, estando
pouco relacionada à de H. americanum (94%) (Inokuma et al. 2002).
Resultado semelhante foi encontrado por Paludo et al. (2005) que
descreveram três casos de Hepatozoon sp., em cães no Brasil. As amostras
foram submetidas à análise filogenética que demonstraram que o Hepatozoon
sp. isolado destas está mais relacionado com H. canis Fukuoka (99,4%) e
menos relacionado com H. americanum (95,6%) e H. catesbiane (93,5%). As
seqüências desse estudo foram também mais similares com H. canis isolado
de raposas (99,3%), seguido por H. canis (99,1%) de cães da Europa.
Suportando também a hipótese de que a espécie de Hepatozoon sp. que
infecta cães no Brasil é o H. canis.
Alguns outros estudos também realizaram a caracterização de isolados
de Hepatozoon sp. com o objetivo de se esclarecer as relações entre os casos
relatados no mundo. Criado-Fornelio et al. (2003b) realizaram um estudo com
raposas e demonstraram que os isolados de H. canis desses animais estão
altamente relacionados com os isolados de H. canis de cães de Israel e do
Japão. Os autores concluíram que as diferenças entre os isolados ocorreram
devido às pequenas variações entre as cepas.
Recentemente, Criado-Fornelio et al. (2006) examinaram as relações
filogenéticas entre espécies de Hepatozoon isolados de mamíferos do Brasil e
Espanha. As análises filogenéticas demonstraram quatro diferentes genótipos
de H. canis, bem como, um isolado relacionado a H. americanum. Os
resultados corroboram a hipótese sugerida por estudos anteriores de que
Hepatozoon é um gênero monofilético, no qual espécies de mamíferos
carnívoros (Hepatozoon sp. de gatos, H. americanum e H. canis) aparecem
como linhagem irmã de vertebrados inferiores e roedores.
4. CONCLUSÃO
De acordo com as metodologias empregadas e o método de análise, o
estudo realizado em cães de áreas rurais dos municípios de Botucatu, Rio
Claro e Presidente Prudente, no Estado de São Paulo nos permitiu concluir
que:
1. A freqüência da infecção por Hepatozoon canis em cães de áreas rurais do
Estado de São Paulo foi alta;
2. O diagnóstico de Hepatozoon canis pela técnica de PCR foi mais sensível
e mais específico do que o diagnóstico por esfregaço sangüíneo;
3. A espécie de Hepatozoon que infecta cães de áreas rurais no Estado de
São Paulo é H. canis;
4. O número de carrapatos encontrados infestando os cães nas diferentes
localidades foi baixo;
5. Não houve diferença entre o número de cães infestados por carrapatos das
espécies Riphicephalus sangüíneos e Amblyomma spp..
6. Não houve associação entre a infecção por H. canis e a infestação por
carrapatos.
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