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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
CRISTIANE SOUSA NASCIMENTO BAEZ GARCIA
ESTRESSE PULMONAR INDUZIDO PELA VENTILAÇÃO
MECÂNICA COM FLUXO INSPIRATÓRIO ELEVADO
VOLUME I
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Garcia, Cristiane Sousa Nascimento Baez
ESTRESSE PULMONAR INDUZIDO PELA VENTILAÇÃO
MECÂNICA COM FLUXO INSPIRATÓRIO ELEVADO/Cristiane
Sousa Nascimento Baez Garcia. – 2006.
xvii, 116f.: il; 1,5 cm.
Tese (doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas (Fisiologia), Rio de Janeiro, 2006.
Orientador: Patricia Rieken Macedo Rocco
1. Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador. 2. Estresse Mecânico.
2. Fluxo Inspiratório Elevado. 3. Mecânica Respiratória. 4. Histologia. 5.
Procolágeno III. I. Rocco, Patricia Rieken Macedo (Orient.) II.
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
(Fisiologia). III. Título
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i
CRISTIANE SOUSA NASCIMENTO BAEZ GARCIA
ESTRESSE PULMONAR INDUZIDO PELA VENTILAÇÃO
MECÂNICA COM FLUXO INSPIRATÓRIO ELEVADO
I VOLUME
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessários à
obtenção do título de Doutor em Ciências.
ORIENTADORA: PATRICIA RIEKEN MACEDO ROCCO
RIO DE JANEIRO
FEVEREIRO DE 2006
ii
ESTRESSE PULMONAR INDUZIDO PELA VENTILAÇÃO MECÂNICA
COM FLUXO INSPIRATÓRIO ELEVADO
CRISTIANE SOUSA NASCIMENTO BAEZ GARCIA
ORIENTADORA: PATRICIA RIEKEN MACEDO ROCCO
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas
(Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de
Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em
Ciências.
APROVADA POR:
_________________________________________________________________
Prof. Patricia Rieken Macedo Rocco, Ph.D - Orientadora
Prof. Adjunta, IBCCFº, UFRJ
________________________________________________________________
Prof. Patrícia Machado Rodrigues e Silva, Ph.D
Pesquisadora Titular, FIOCRUZ
_________________________________________________________________
Prof. José Rodolfo Rocco, Ph.D
Prof. Adjunto, HUCFF, UFRJ
_________________________________________________________________
Prof. Márcia Alves Marques Capella, Ph.D
Prof. Adjunta, IBCCFº, UFRJ
_________________________________________________________________
Prof. Regina Coeli dos Santos Goldenberg, Ph.D - Revisora
Prof. Adjunta, IBCCFº, UFRJ
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2006
iii
O presente trabalho foi realizado nos Laboratórios de Investigação Pulmonar e Fisiologia da
Respiração do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro na vigência de auxílios concedidos pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à
Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), pela Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico
(CNPq) e pelo Programa de Apoio a Núcleos de Excelência (PRONEX-MCT, PRONEX-
FAPERJ).
iv
A Deus,
por ter iluminado o meu caminho.
Ao meu pai Fred Martins Nascimento,
que sempre esteve presente apesar da maior das distâncias.
A minha mãe Lúcia Helena Sousa Nascimento,
por ter me guiado para o interesse intelectual e profissional.
Ao meu marido Alexandre Andrade Baez Garcia,
por seu amor e sua dedicação à nossa família.
Ao meu filho Bruno Nascimento Baez Garcia,
que, na simplicidade de um sorriso, me fez ver que tudo valeu a pena.
v
AGRADECIMENTOS
Existem algumas pessoas que contribuíram direta ou indiretamente para a
elaboração desta tese e outras, que por sua presença, neste período da minha vida,
contribuíram para o meu crescimento pessoal e profissional. A estas pessoas eu devo os
meus agradecimentos:
- Prof
a
Patricia Rocco, minha orientadora desde a Monitoria de Fisiologia da
Respiração. Meu sincero agradecimento por todos os ensinamentos técnicos,
teóricos e científicos que me permitiram crescer como pessoa e profissional.
- Prof
o
Walter Zin, pelo exemplo de pesquisador e confiança em mim depositada.
Agradeço a oportunidade concedida para elaboração da minha tese e outros
trabalhos científicos.
- Prof
a
Vera Capellozi pela realização da microscopia eletrônica desse estudo.
- Prof
o
Marcelo Morales pela realização da análise da biologia molecular.
- Minhas amigas e madrinhas do meu filho Bruno, Débora Xisto e Danielle Motta.
Agradeço pelo carinho e principalmente pela presença constante, mesmo quando
envolvida com a pesquisa eu me tornava tão distante.
- Todas as pessoas da minha família pelo carinho, apoio, confiança e, principalmente,
pelo reconhecimento de todos os meus esforços.
- A minha dinda Lídice, por seu apoio e, principalmente, tranqüilidade para conseguir
superar uma gestação complicada, um parto difícil e os tortuosos primeiros meses
como mãe inexperiente, o que me tomou 1 ano e meio da tese. Obrigada também por
ter colocado na minha vida esse filho lindo que me enche de alegria todos os dias.
vi
- No laboratório existem ainda muitas pessoas que participaram direta ou
indiretamente deste trabalho, as quais eu devo meu sincero agradecimento:
- Soraia Abreu, aluna de Iniciação Científica e amiga de todas as horas. Obrigada por
sua colaboração direta na elaboração deste trabalho científico, e por dividir comigo
todos os momentos de angústia.
- Rogério que, embora não tenha chegado comigo ao término deste trabalho,
colaborou imensamente no iniciar desta longa caminhada.
- Roberta Lassance e Luís Felipe Prota pelo apoio científico no estudo da biologia
molecular, e por suas amizades.
- Cristina Dias, amiga de verdade, obrigada por fazer parte da minha vida.
- Renata Contador, amiga e companheira, o meu sincero agradecimento pelos
ensinamentos científicos, profissionais e pessoais.
- Alba Fernandes, que trilhou juntamente comigo todos esses anos, obrigada pelo
apoio e carinho dispensados.
- Halina Cidrini que dividiu comigo muitos momentos e me fez voltar a ver o quanto eu
gosto da minha profissão e, como fisioterapeuta, o quanto eu posso ser importante.
- Maria Cristina Ebole, que me ajudou nos primeiros passos na pesquisa, obrigada por
sua amizade.
- Aos demais alunos do laboratório, que de alguma forma estiveram presentes
durante todos estes anos, eu deixo aqui o meu profundo agradecimento.
- Sr. Antônio, técnico do Laboratório de Fisiologia da Respiração, e ao André,
técnico dos Laboratórios de Investigação Pulmonar e de Fisiologia Celular e
Molecular, que me ajudaram sempre com tanta presteza quando precisei.
vii
RESUMO
ESTRESSE PULMONAR INDUZIDO PELA VENTILAÇÃO MECÂNICA COM FLUXO
INSPIRATÓRIO ELEVADO
Cristiane Sousa Nascimento Baez Garcia
Orientadora: Patricia Rieken Macedo Rocco
Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências.
O presente trabalho avaliou se o fluxo inspiratório alto, por si só, acarreta estresse
mecânico pulmonar. Para tal, ratos normais foram ventilados por 2 h com volume corrente
(V
T
) de 10 mL/kg, relação I:E de 1:2, e fluxos (V’) de 10 (F10, n=6) ou 30 mL/s (F30, n=6).
A freqüência respiratória (FR) foi 100 e 200 irpm em F10 e F30, respectivamente. 6 ratos
não foram ventilados (CTRL). Como o V’ alto aumentou a FR e a pressão de pico
inspiratória (PIP=17 cmH
2
O), experimentos adicionais foram realizados para excluir os
efeitos adversos desses parâmetros: a) LRRF30: V’=30 mL/s e FR=100 irpm; b) HPF10:
PIP=17 cmH
2
O e V’=10 mL/s. A mecânica e histologia pulmonares e a expressão de
RNAm para procolágeno tipo III (PCIII) no tecido pulmonar foram analisadas. O grupo F10
apresentou pressão de platô pulmonar (Pplat,L) e fração de colapso alveolar aumentados.
O aspecto ultraestrutural foi similar nos grupos CTRL e F10. O grupo F30 teve aumento
de PIP,L e Pplat,L e do RNAm para PCIII, hiperinsuflação e colapso alveolar e infiltração
neurtrofílica. O grupo LRRF30 apresentou alterações morfofuncionais e expressão de
RNAm para PCIII similares ao F30. Embora o grupo HPF10 tenha apresentado aumento
de PIP,L e Pplat,L e colapso alveolar, a expressão de RNAm para PCIII não sofreu
alteração. Em conclusão, o estresse pulmonar induzido pelo fluxo alto induziu
comprometimento morfofuncional pulmonar e aumento da expressão de RNAm para
PCIII. Limitar o fluxo inspiratório é fundamental para impedir a lesão pulmonar induzida
pela ventilação mecânica.
Palavras-chave: estresse mecânico, lesão pulmonar induzida pelo ventilador, dano
alveolar, expressão de matriz extracelular.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2005
viii
ABSTRACT
LUNG STRESS CAUSED BY MECHANICAL VENTILATION WITH HIGH INSPIRATORY
AIRFLOW.
Cristiane Sousa Nascimento Baez Garcia
Orientadora: Patricia Rieken Macedo Rocco
Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal
do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de
Doutor em Ciências.
The present study tested the hypotheses that high inspiratory airflow per si yields lung
mechanical stress. To that end, rats were ventilated for 2 h with tidal volume of 10 mL/kg,
I:E ratio of 1:2, and a inspiratory flow (V’) of 10 mL/s (F10, n=6) or 30 ml/s (F30, n=6).
Respiratory rate (RR) was 100 and 200 breaths/min in F10 and F30 groups, respectively.
6 rats did not undergo mechanical ventilation (CTRL). Because high flows led to high RR
and peak inspiratory pressure (PIP=17 cmH
2
O), additional experiments were performed to
rule out the side-effects of these parameters: a) LRRF30: V’=30 ml/s, and RR=100
breaths/min, b) HPF10: PIP=17 cmH
2
O, and V’=10 ml/s. Lung mechanics and histology,
and type III procollagen (PCIII) mRNA expression in lung tissue were analyzed. F10 group
presented an increase of lung plateau pressure (Pplat,L), and alveolar collapse.
Ultrastructural lung appearance was similar in F10 and CTRL groups. F30 group showed
an increment of PIP,L, Pplat,L, and PCIII mRNA expression, alveolar hyperinflation and
collapse, and a marked neutrophilic infiltration in lung tissue. LRRF30 group presented
functional and histological changes and PCIII mRNA expression similar to F30. Although
HPF10 group presented an increase in PIP,L and Pplat,L, and alveolar collapse, PCIII
mRNA expression remained unchanged. In conclusion, lung stress induced by high airflow
yielded lung functional and morphological compromise and increased PCIII mRNA
expression. Limiting inspiratory airflow is essential to prevent ventilator-induced to lung
injury.
Keywords: shear stress, ventilator-induced lung injury, alveolar damage, extracellular
matrix expression.
Rio de Janeiro
Fevereiro de 2006
ix
SUMÁRIO
Folha de Rosto ............................................................................................................ i
Ficha Catalográfica ...................................................................................................... verso
Folha de Aprovação .................................................................................................... ii
Agências Financiadoras .............................................................................................. iii
Dedicatórias ................................................................................................................. iv
Agradecimentos ........................................................................................................... v
Resumo ....................................................................................................................... vii
Abstract ........................................................................................................................ viii
Sumário ....................................................................................................................... ix
Índice de Figuras ......................................................................................................... xiii
Índice de Tabelas ........................................................................................................ xv
Abreviaturas ................................................................................................................. xvi
1 Introdução ................................................................................................................. 001
1.1 Caracterização da Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador ..........................
1.1.1 Alterações Morfológicas ............................................................................
1.1.2 Edema Pulmonar ......................................................................................
Alteração da Permeabilidade da Barreira Alvéolo-Capilar .......................
Pressão Transmural Vascular Pulmonar Aumentada ..............................
Depuração do Edema Pulmonar ..............................................................
004
004
005
006
007
008
1.1.3 Sistema de Surfactante ............................................................................. 009
1.2 Principais Determinantes da Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador .......... 010
x
1.2.1 Barotrauma ................................................................................................
1.2.2 Volutrauma ................................................................................................
1.2.3 Atelectrauma .............................................................................................
1.2.4 Distensão Pulmonar Total .........................................................................
010
011
012
013
1.3 Outros Determinantes da Lesão Pulmonar Induzida pelo Ventilador ...............
1.3.1 Freqüência Respiratória ............................................................................
1.3.2 Relação Tempo Inspiratório/Tempo Expiratório (I:E) Invertida ................
1.3.3 Fluxo Aéreo Inspiratório ............................................................................
014
014
015
016
1.4 Disfunção de Múltiplos Órgãos e Sistemas Induzida pelo Ventilador ...............
1.4.1 Biotrauma ..................................................................................................
1.4.2 Translocação de Bactérias .......................................................................
1.4.3 Fatores Solúveis Pró-apoptóticos Circulantes ..........................................
017
018
021
021
1.5 Resposta Celular ao Estresse Mecânico na Lesão Pulmonar Induzida pelo
Ventilador ...........................................................................................................
1.5.1 Caracterização do Estresse Mecânico .....................................................
1.5.2 Mecanismos de Mecanorecepção e Mecanotransdução .........................
1.5.3 Canais Iônicos Ativados Mecanicamente .................................................
1.5.4 Ruptura por Estresse da membrana Plasmática ......................................
1.5.5 Interação Matriz Extracelular-Integrina-Citoesqueleto .............................
1.5.6 Síntese de Mediadores Inflamatórios Induzida por Estímulo Mecânico ..
1.5.7 Expressão da Matriz Extracelular Pulmonar Induzida por Estímulo
Mecânico ..................................................................................................
022
023
023
024
025
026
028
030
2 Justificativas ............................................................................................................. 031
3 Objetivos ................................................................................................................... 034
xi
4 Materiais e Métodos .................................................................................................
4.1 Animais utilizados ..............................................................................................
4.2 Protocolo experimental ......................................................................................
4.3 Caracterização dos Grupos Submetidos à Ventilação Mecânica ................
4.4 Experimentos Adicionais ...................................................................................
4.5 Mecânica Pulmonar .....................................................................................
4.5.1 Método de Oclusão ao Final da Inspiração ........................................
4.6 Remoção dos Pulmões ................................................................................
4.7 Histologia Pulmonar .....................................................................................
4.7.1 Microscopia de Luz .............................................................................
4.7.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão .............................................
4.8 RT-PCR Semiquantitativo ..............................................................................
4.8.1 Extração de RNA Total do Tecido Pulmonar ..........................................
4.8.2 Transcrição Reversa (RT) ........................................................................
4.8.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ...............................................
4.9 Análise Estatística ..............................................................................................
036
037
037
041
041
043
044
046
047
047
050
051
051
052
052
055
5 Resultados ................................................................................................................
5.1 Mecânica Pulmonar ..........................................................................................
5.2 Histologia Pulmonar ..........................................................................................
5.2.1 Microscopia de Luz .................................................................................
5.2.2 Microscopia Eletrônica de Transmissão ................................................
5.3 Correlação entre os Resultados da Mecânica e da Morfometria
Pulmonares .....................................................................................................
5.4 RT-PCR Semiquantitativo ................................................................................
056
057
060
060
065
068
072
xii
6 Discussão ................................................................................................................. 075
7 Conclusões ............................................................................................................... 090
Referências .................................................................................................................. 092
xiii
ÍNDICE DAS FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da via de mecanotransdução mediada
por canais iônicos ativados mecanicamente ........................................................
Figura 2. Representação esquemática da via de mecanotransdução mediada
pela interação matriz extracelular-integrina-citoesqueleto ...................................
025
028
Figura 3. Teste de Oclusão ................................................................................... 040
Figura 4. Representação esquemática do desenho do estudo ........................ 043
Figura 5. Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume,
pressão traqueal e pressão esofagiana em função do tempo, obtidos a partir
da oclusão da via aérea ao final da inspiração ............................................... 045
Figura 6. Montagem experimental ....................................................................... 046
Figura 7. Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para quantificação dos
parâmetros morfométricos .................................................................................... 049
Figura 8. Evolução temporal da pressão de pico inspiratória pulmonar e da
pressão de platô pulmonar dos 4 grupos ventilados mecanicamente ............. 058
Figura 9. Fotomicrografias do parênquima pulmonar, representativas da
arquitetura alveolar ................................................................................................ 062
Figura 10. Fotomicrografias do parênquima pulmonar, representativas do
processo inflamatório ............................................................................................ 064
Figura 11. Fotomicrografia do parênquima pulmonar, representativa do
edema peribroncovascular do grupo F30 ........................................................ 065
Figura 12. Fotomicrografias da via aérea do grupo F30, representativas da
descamação do epitélio ...........................………………………………………… 065
xiv
Figura 13. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do
grupo CTRL ..................................................................................................... 066
Figura 14. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do
grupo F10 .............................................................................................................. 067
Figura 15. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do
grupo F30 ........................................................................................................ 068
Figura 16. Correlações entre os valores de pressão de pico inspiratória
pulmonar e as frações de área de hiperinsuflação e colapso alveolares dos
grupos F10, F30 e LRRF30 ………………………………………………………. 069
Figura 17. Correlações entre os valores de pressão de pico inspiratória
pulmonar e pressão de platô e as frações de área de colapso alveolar dos
grupos F10, F30 e HPF10 ………………………………………………………… 071
Figura 18. Expressão de RNAm para procolágeno tipo III (PCIII) dos 5
grupos (método de RT-PCR semiquantitativo) ............................................... 073
xv
ÍNDICE DAS TABELAS
Tabela 1. Protocolos experimentais ................................................................... 042
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR ............................................ 054
Tabela 3. Descrição das condições da reação de PCR .................................... 054
Tabela 4. Dados da mecânica pulmonar ........................................................ 059
Tabela 5. Parâmetros da morfometria pulmonar ................................................ 061
Tabela 6. Dados das celularidades total e diferencial ....................................... 063
Tabela 7. Correlações entre os valores de mecânica e morfometria
pulmonares ........................................................................................................ 070
Tabela 8. Dados da análise de RNAm para procolágeno tipo III (método de
RT-PCR semiquantitativo) ................................................................................. 074
xvi
ABREVIATURAS
AF = adesão focal
AP-1 = activation protein-1
AT1 = célula alveolar tipo I
AT2 = célula alveolar tipo II
C = capilar
Ca
2+
= cálcio
COL = fibras colágenas
DAG = diacilglecerol
DEPC = dietil pirocarbonato
DNAc = ácido desoxirribonucléico complementar
DNase = desoxirribonuclease
dNTP = desoxinucleotídeo trifosfatado
∆Pes = variação da pressão esofagiana
∆Ptr = variação da pressão traqueal
Egr-1 = early growth response-1
ED = edema
EL = fibras elásticas
ELK-1 = ETS-like protein
ENaC = canal de sódio epitelial
ERK = extracellular-signal-regulated protein kinase
F = fibroblasto
FAC = complexo de adesão focal
FAK = quinase de adesão focal
FiO
2
= fração inspirada de oxigênio
DMOS = disfunção de múltiplos órgãos e sistemas
FR = freqüência respiratória
GA = grandes agregados de surfactante
GAG = glicosaminoglicano
GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
H = membrana hialina
IκB = inibidor de NF-κB
I:E = relação tempo inspiratório/tempo expiratório
IKK = inibidor de NF-κB-quinase
IL = interleucina
IP
3
= inositol 1,4,5-trisfosfato
IRV = ventilação mecânica com relação I:E invertida
JNK = c-Jun aminoterminal kinase
KCl = cloreto de potássio
L = pulmão
LPA = lesão pulmonar aguda
mφ = macrófago alveolar
MAPK = mitogen-activiting protein kinase
MEC = matriz extracelular
xvii
MgCl
2
= cloreto de magnésio
MIP-2 = macrophage inflammatory protein-2
MMP = metaloproteinase da matriz
N = neutrófilo
Na
+
= sódio
NaCl = cloreto de sódio
NF-κB = fator nuclear-κB
PA = pequenos agregados de surfactante
pb = pares de base
PCIII = procolágeno tipo III
PCIRV = ventilação controlada à pressão com relação I:E invertida
PEEP = pressão positiva ao final da expiração
Pel = pressão de retração elástica
Pes = pressão esofagiana
PG = prostaglandina
Pi = ponto de inflexão
PIP = pressão de pico inspiratória
PIP
2
= fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato
PKC = proteíno-quinase C
PLC-γ = fosfolipase C-γ
Ppl = pressão pleural
Pplat = pressão de platô
PTG = proteoglicano
PTK = proteína tirosino-quinase
Ptr = pressão traqueal
Pw = pressão da parede torácica
RNAm = ácido ribonucléico mensageiro
rs = sistema respiratório
RT (-) = controle negativo com ausência de enzima transcriptase reversa
RT-PCR = transcrição reversa da reação em cadeia da polimerase
SDRA = síndrome do desconforto respiratório agudo
SP-1 = specificity protein-1
SRE = elemento de resposta a estiramento
SSRE = elemento de resposta a estresse de cisalhamento
TIMP = inibidor tecidual de metaloproteinase
TNF = fator de necrose tumoral
V’ = fluxo inspiratório
VILI = lesão pulmonar induzida pelo ventilador
VM = ventilação mecânica
V
T
= volume corrente
w = parede torácica
INTRODUÇÃO
2
1 INTRODUÇÃO
A ventilação mecânica (VM) é a técnica fundamental para suporte de vida no
âmbito da terapia intensiva (KAVANAGH & SLUTSKY, 1999; MUTLU & FACTOR, 2000;
LIONETTI et al., 2005). É uma ferramenta indispensável para fornecer troca gasosa
adequada, restabelecendo a oferta necessária de oxigênio aos órgãos periféricos, e para
repouso dos músculos respiratórios (TOBIN, 2001). A era moderna da VM e da terapia
intensiva começou durante a epidemia de poliomielite (SLUTSKY, 2005). A taxa de
mortalidade da poliomielite paralítica era extremamente alta – mais de 80% – e os
pacientes morriam de falência respiratória (LASSEN, 1953). Em 1952, a taxa de
mortalidade da poliomielite paralítica reduziu significativamente (de 80% para cerca de
40%), somente com aplicação da VM (LASSEN, 1953). Atualmente, a doença que é o
foco principal da VM é a Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA)
(SLUTSKY, 2005), a forma mais grave da Lesão Pulmonar Aguda (LPA) (IMAI &
SLUTSKY, 2005; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006), descrita, em 1967, por Ashbaugh et
al.
Hoje, um dos conceitos mais importantes no cuidado dos pacientes na terapia
intensiva é o reconhecimento de que a ventilação mecânica pode agravar, ou mesmo
causar, lesão pulmonar, uma condição referida como lesão pulmonar induzida pelo
ventilador (VILI) (GARCIA et al., 2005b; HALBERTSMA et al., 2005). Pesquisas em
diversas espécies animais mostraram que a ventilação mecânica, por si só, pode resultar
em lesão pulmonar, funcionalmente e histologicamente indistinguível daquela observada
na SDRA (TSUNO et al., 1991; PARKER et al. 1993). O reconhecimento desta
semelhança entre VILI e SDRA levou vários investigadores a sugerirem que a SDRA pode
3
ser, em parte, decorrente do manejo ventilatório inadequado além da progressão da
doença subjacente (RUBENFELD, 2003; HAN et al., 2005; DOS SANTOS & SLUTSKY,
2006). A VILI é determinada pela interação dinâmica e contínua entre as características
mecânicas do pulmão e os parâmetros ventilatórios (GATTO & FLUCK, 2004; CARNEY et
al., 2005). Os pacientes com SDRA freqüentemente têm alterações morfológicas e
funcionais (por exemplo: disfunção de surfactante, doença pulmonar subjacente, má-
nutrição, toxicidade pelo oxigênio, infecção, atelectasias e edema alveolar) que aumentam
a susceptibilidade dos pulmões à lesão por ventilação mecânica, e também prejudicam a
capacidade dos pulmões em se reparar do dano ocorrido (GAMMON et al., 1995; IMAI &
SLUTSKY, 2005).
Muitos estudos tentam identificar os fatores de risco, ou os efeitos adversos
associados às várias formas de ventilação mecânica (DREYFUSS & SAUMON, 1998;
GATTINONI et al., 2003; GARCIA et al., 2005b), e desenvolver estratégias para prevenir a
VILI (COOPER, 2004; MOLONEY & GRIFFITHS, 2004). Os efeitos deletérios da
ventilação mecânica parecem depender de vários fatores, dentre eles: o nível de pressão
de insuflação aplicado (WEBB & TIERNEY, 1974), o volume pulmonar mobilizado
(DREYFUSS et al., 1988), o volume do pulmão ao final da expiração (MUSCEDERE et al.,
1994) e a extensão do processo inflamatório (TREMBLAY & SLUTSKY, 1998).
As pesquisas em lesão pulmonar e ventilação mecânica apresentam controvérsias
acerca da fisiopatologia, fatores de risco, incidência, prognóstico, monitorização e
prevenção da VILI. A orientação atual para a terapêutica de indivíduos com falência
respiratória aguda é a utilização de estratégias ventilatórias que limitem a pressão e/ou
volume oferecido aos pulmões, com o intuito de prevenir o dano alveolar difuso (AMATO
et al., 1998; THE ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME NETWORK, 2000).
4
Entretanto, existem questionamentos quanto à necessidade do controle de outros
parâmetros ventilatórios.
1.1 CARACTERIZAÇÃO DA LESÃO PULMONAR INDUZIDA PELO VENTILADOR
1.1.1 ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS
O dano macroscópico e microscópico descrito na VILI (DREYFUSS et al., 1985,
1988, 1992) é inespecífico, não diferindo substancialmente daquele observado na SDRA
(BACHOFEN & WEIBEL, 1982). Adicionalmente, há uma relação clara entre a duração de
ventilação mecânica, o nível de estímulo prejudicial e a extensão da lesão (DREYFUSS &
SAUMON, 1998).
Macroscopicamente, os pulmões de animais expostos a uma estratégia ventilatória
adversa apresentaram zonas focais de atelectasia, congestão e aumento do volume em
virtude de edema (WEBB & TIERNEY, 1974; KOLOBOW et al., 1987, TSUNO et al.,
1990).
Em estudos de microscopia de luz, edemas intersticial e alveolar foram relatados
após ventilação mecânica com pressão de pico inspiratória (PIP) elevada (WEBB &
TIERNEY, 1974; DREYFUSS et al., 1985). O grau do edema variou com a intensidade da
PIP (WEBB & TIERNEY, 1974) e a duração de ventilação mecânica (DREYFUSS et al.,
1988). Inicialmente, o edema é confinado ao espaço intersticial e visualizado nas regiões
peribroncovasculares (STAUB et al., 1967; STAUB, 1974). Foi constatado dano alveolar
difuso grave semelhante ao estágio inicial da SDRA, caracterizado por membrana hialina,
hemorragia alveolar e infiltração neutrofílica imediatamente após ventilação mecânica
com PIP elevada (TSUNO et al., 1991). Após alguns dias (3 a 6 dias), o exame
5
microscópico dos animais demonstrou danos pulmonares compatíveis com os estágios
mais avançados da SDRA, com colapso alveolar e proliferação de fibroblastos e células
epiteliais alveolares do tipo II (TSUNO et al., 1991).
Os estudos de microscopia eletrônica de modelos animais de VILI mostraram
descontinuidades em células epiteliais alveolares do tipo I (JOHN et al., 1982), alterações
das barreiras epiteliais e endoteliais (DREYFUSS et al., 1985, 1988, 1992),
desacoplamento de células endoteliais da membrana basal, rupturas ocasionais em
células endoteliais favorecendo o contato direto de neutrófilos com a membrana basal,
edema alveolar e dano alveolar difuso (DREYFUSS et al., 1985).
1.1.2 EDEMA PULMONAR
Uma vez que as pressões aplicadas ao espaço aéreo também repercutem nos
capilares pulmonares, a influência das pressões e fluxos dentro de vasos sangüíneos na
evolução e/ou no desenvolvimento da VILI merece ser considerada. A hiperdistensão
alveolar impõe estresse mecânico aos vasos extra-alveolares (HOWEEL et al., 1961;
MEAD et al., 1970; BEJAMIN et al., 1974) e micro-vasos alveolares (WEBB & TIERNEY,
1974; ALBERT et al., 1979), sendo esse estresse exacerbado pela heterogeneidade da
SDRA (NICOLAYSEN et al., 1979; RIPPE et al., 1984; MARINI, 2004). A hemodinâmica
da micro-circulação parece variar em função da ventilação mecânica (MICHARD, 2005) e
da doença pulmonar subjacente (COPE et al., 1992). Na SDRA, tanto as pressões
arteriais pulmonares quanto as alveolares são consideravelmente mais elevadas do que
sob condições normais (BELLINGAN, 2002).
Uma vez que as propriedades da barreira alvéolo-capilar são anormais na SDRA,
foi essencial determinar se as alterações pulmonares induzidas pela ventilação mecânica
6
resultariam somente em um acúmulo de líquido adicional, por agravar danos já existentes,
ou se criariam novas lesões. Em sua contribuição essencial ao reconhecimento de VILI,
Webb e Tierney (1974) demonstraram que a ventilação mecânica, por si só, pode induzir
a formação de edema pulmonar. Eles também observaram que o edema pulmonar
desenvolveu-se mais rapidamente e era mais grave nos animais ventilados com pressão
de pico de 45 cmH
2
O do que naqueles ventilados com 30 cmH
2
O. Estudos subseqüentes
demonstraram, em pequenos animais, a presença de edema intersticial leve após alguns
minutos (2 a 5 min) de ventilação com PIP alta (DREYFUSS et al., 1985, 1992).
Entretanto, a reprodução dessas observações em animais maiores exigiu períodos mais
longos (várias horas) de ventilação (JOHN et al., 1980; KOLOBOW et al., 1987;
CARLTON et al., 1990; PARKER et al., 1990; TSUNO et al., 1990), por razões que
necessitam ser esclarecidas.
Alteração da Permeabilidade da Barreira Alvéolo-Capilar
O aumento da permeabilidade alvéolo-capilar parece ser um mecanismo
importante na fisiopatologia do edema pulmonar induzido pelo ventilador. Alterações nas
permeabilidades das barreiras epitelial e endotelial pulmonares foram relatadas em
pulmões isolados, assim como, em animais com tórax aberto ou íntegro em presença de
volumes pulmonares elevados. Nestes estudos, foram constatadas permeabilidades
epitelial e endotelial a pequenos (NOLOP et al., 1986; O’BRODOVICH et al., 1986,
COOPER et al., 1987; MARKS et al., 1985; LUDWIGS et al., 1996) e grandes solutos
(EGAN et al., 1976; EGAN, 1980; EGAN, 1982; KIM & CRANDALL, 1982) aumentadas.
Vários outros estudos experimentais demonstraram alterações na permeabilidade
microvascular, avaliada por: coeficiente de filtração capilar (PARKER et al., 1984;
7
HERNADEZ et al., 1989), distribuição de Na
+
e peso seco do pulmão (DREYFUSS et al.,
1985), depuração de proteína da linfa e relação entre a proteína da linfa e do plasma
(CARLTON et al., 1990; PARKER et al., 1990), e albumina marcada (DREYFUSS et al.,
1985). Os resultados de microscopia eletrônica mostraram anormalidades epiteliais e
endoteliais graves compatíveis com o incremento da permeabilidade (JOHN et al., 1982;
DREYFUSS et al., 1985, 1988, 1992; BEHNIA et al., 1996).
Pressão Transmural Vascular Pulmonar Aumentada
Durante muito tempo soube-se relativamente pouco acerca da contribuição da
pressão hidrostática para o desenvolvimento do edema pulmonar na VILI. Esta falta de
informação pode ser atribuída à dificuldade em se avaliar a pressão transmural no nível
da micro-circulação. Além disso, não havia nenhum estudo demonstrando um aumento
significativo na pressão transmural vascular média que justificasse um edema de origem
hidrostática. Os estudos experimentais demonstraram apenas uma pequena alteração na
pressão transmural da micro-circulação (CARLTON et al., 1990; PARKER et al., 1990).
Além disso, durante muito tempo, pensou-se que o edema hidrostático não estaria
associado com anormalidade celular ultraestrutural, em qualquer um dos níveis epitelial
e/ou endotelial (COTTRELL et al., 1967; DEFOUW & BERENDSEN, 1978; MONTANER
et al., 1986). Hoje, sabe-se que a pressão hidrostática é um importante parâmetro. Por
exemplo, sob condições de permeabilidade aumentada, como na fase precoce da LPA,
pequenos aumentos na pressão da micro-circulação pulmonar podem levar a formação de
edema (Marini et al., 2004). Diferenças regionais na perfusão pulmonar e atelectasias
também podem gerar forças de filtração maiores em algumas áreas (Marini et al., 2004).
8
Recentemente, o papel da pressão transmural vascular pulmonar na fisiopatologia
do edema da VILI foi melhor elucidado (MARINI et al., 2003; MARINI, 2004). Em
experimentos conduzidos por WEST et al. (WEST et al., 1991; COSTELLO et al., 1992;
FU et al., 1992; MATHIEU-COSTELLO et al., 1995), a microscopia eletrônica da micro-
circulação demonstrou que rupturas por estresse capilar podem ocorrer quando as
pressões da micro-circulação são elevadas. Outros estudos estruturais confirmaram
rupturas epiteliais e endoteliais em pulmões isolados de coelho com pressões vasculares
ao redor de 30 mmHg (MATTHAY, 1985; BACHOFEN et al., 1993a, 1993b). Em virtude
da interdependência, o volume pulmonar elevado pode aumentar a pressão transmural
nos vasos extra-alveolares (HOWELL et al., 1961; MEAD et al., 1970; BENJAMIN et al.,
1974). Já nos micro-vasos alveolares, a filtração aumentada parece ser conseqüente à
inativação do surfactante (WEBB & TIERNEY, 1974; ALBERT et al., 1979).
Depuração do Edema Pulmonar
A depuração de líquido pulmonar é obtida principalmente por transporte ativo de
Na
+
para fora dos alvéolos (MATTHAY et al., 2002; MUTLU & SZNAJDER, 2005). Mesmo
que outros mecanismos possam contribuir, a depuração do edema pulmonar parece ser
realizada principalmente pelos canais de sódio apicais (EnaC) e pelas bombas Na,K-
ATPase basolaterais das células epiteliais alveolares (MATTHAY et al., 2002; SZNAJDER
et al., 2002; DADA et al., 2003). Estes mecanismos geram um gradiente eletrolítico
responsável pelo fluxo de Na
+
, com a água seguindo por osmose (MATTHAY et al., 2002;
MUTLU & SZNAJDER, 2005).
A VILI não só aumenta a permeabilidade pulmonar a pequenos (NOLOP et al.,
1986; O’BRODOVICH et al., 1986, COOPER et al., 1987; MARKS et al., 1985; LUDWIGS
9
et al., 1996) e a grandes solutos (EGAN et al., 1976; EGAN, 1980; EGAN, 1982; KIM &
CRANDALL, 1982) como também afeta a capacidade do pulmão de reabsorver o edema
(LECUONA et al., 1999). A inibição do transporte ativo de Na
+
e diminuição da atividade
da Na,K-ATPase nas células alveolares do tipo II (ATII) foram demonstradas em ratos
submetidos a hiperdistensão pulmonar, em paralelo a redução da depuração do edema
pulmonar (LECUONA et al., 1999). Os resultados indicaram uma redução da atividade da
Na,K-ATPase de 25% e 50% em células ATII de ratos ventilados por 40 min com volumes
correntes (V
T
) moderado e elevado, respectivamente, em relação às células ATII de ratos
ventilados com V
T
baixo e não-ventilados (controles) (LECUONA et al., 1999). A redução
da atividade da Na,K-ATPase ocorreu em virtude da redução do número de bombas
Na,K-ATPase funcionais (LECUONA et al., 1999).
1.1.3 SISTEMA DE SURFACTANTE
A ventilação mecânica tem efeitos significativos na função do surfactante
(GREENFIELD et al., 1964; FARIDY et al., 1966; ITO et al., 1997; TASKAR et al., 1997).
A tensão superficial aumentada na interface ar-líquido dos alvéolos e o conseqüente
aumento do gradiente de pressão transmural capilar acarretam a formação de edema e o
colapso dos espaços aéreos (vias aéreas distais e alvéolos), implicando na necessidade
de pressões de vias aéreas mais altas para reabrir e manter aberto as unidades
pulmonares distais (PARKER et al., 1993).
O surfactante endógeno existe nos espaços aéreos alveolares sob duas formas
estruturais principais: a) grandes agregados (GA), funcionalmente superiores e b)
pequenos agregados (PA), funcionalmente inferiores (GROSS & NARINE, 1989; LEWIS
et al., 1990; LEWIS & JOBE, 1993). Mudanças nas proporções relativas destes agregados
10
dentro dos espaços aéreos foram observadas em modelos animais com LPA (LEWIS &
JOBE, 1990; LEWIS et al., 1994) e em pacientes com SDRA (VELDHUIZEN et al., 1995).
As proporções relativas dos agregados do surfactante também podem ser afetadas pela
ventilação mecânica (VELDHUIZEN et al., 1995; ITO et al., 1997). A taxa de conversão de
GA em PA se eleva com o aumento do V
T
(VELDHUIZEN et al., 1995; ITO et al., 1997).
As alterações no sistema de surfactante podem ser ainda maiores no pulmão com lesão
pulmonar preexistente submetido à ventilação mecânica com V
T
elevado (ITO et al.,
1997). Dois mecanismos devem ser considerados no que tange a conversão dos
agregados de surfactante induzida pela ventilação mecânica com V
T
elevado: (1)
alterações na área de superfície induzida pela ventilação mecânica, e (2) atividade de
protease aumentada dentro dos espaços aéreos (KOLOBOW et al., 1987; DREYFUSS et
al., 1988; BOWTON & KONG, 1989; DREYFUSS & SAUMON, 1993; DREYFUSS et al.
1995).
1.2 PRINCIPAIS DETERMINANTES DA LESÃO PULMONAR INDUZIDA PELO VENTILADOR
Os principais determinantes da VILI serão discutidos nos seguintes subtítulos:
barotrauma, volutrauma, atelectotrauma, e distensão pulmonar total.
1.2.1 BAROTRAUMA
Os clínicos rapidamente reconheceram que a ventilação mecânica poderia causar
ruptura da parede do espaço aéreo e vazamento de ar, o assim chamado barotrauma
(MACKLIN & MACKLIN, 1944). A VILI foi, durante anos, sinônimo de barotrauma. Apesar
dos achados macroscópicos (pneumotórax) terem sido rapidamente evidenciados, as
alterações morfológicas e fisiológicas mais sutis exigiram mais tempo para serem
11
reconhecidas (DREYFUSS & SAUMON, 1998; GARCIA et al., 2005b). Vários estudos
clínicos e experimentais sugeriram que a ventilação mecânica poderia afetar de maneira
adversa a função e a estrutura pulmonares (GREENFIELD et al., 1964; SLADEN et al.,
1968), porém havia controvérsias. Somente em 1974, Webb e Tierney mostraram que a
ventilação mecânica também poderia ser responsável por lesão ultraestrutural,
independentemente de vazamentos de ar (WEBB & TIERNEY, 1974). Este foi o primeiro
estudo em animais intactos a demonstrar que a ventilação mecânica com PIP alta poderia
danificar o pulmão. Inúmeros estudos subseqüentes também demonstraram o dano
alveolar difuso induzido pela PIP elevada (DREYFUSS et al., 1985; KOLOBOW et al.,
1987; DREYFUSS et al., 1988; PARKER et al., 1990).
1.2.2 VOLUTRAUMA
Evidências experimentais indicam que o grau de insuflação pulmonar é mais
importante em determinar lesão pulmonar do que o nível de PIP em si (DREYFUSS et al.,
1988; HERNÁNDEZ et al., 1989; CARLTON et al., 1990). Isto porque tocadores de
trombeta comumente alcançam pressões de via aérea de 150 cmH
2
O sem causar dano
pulmonar (BOUHUYS, 1969). Neste contexto, o termo volutrauma é mais exato do que
barotrauma. A contribuição relativa da pressão e do volume para a lesão pulmonar foi
primeiramente estudada ventilando-se ratos com limitação do movimento tóraco-
abdominal (DREYFUSS et al. 1988). A PIP elevada sem V
T
alto não produziu lesão
pulmonar. Em contraste, os animais ventilados sem restrição tóraco-abdominal
(alcançando V
T
altos), por pressão positiva ou negativa, desenvolveram lesão grave.
Estes resultados foram confirmados em outras espécies (HERNÁNDEZ et al., 1989;
CARLTON et al., 1990).
12
Em pacientes com SDRA, as atelectasias das regiões dependentes do pulmão e o
edema alveolar podem reduzir significativamente a capacidade de ventilação pulmonar
para cerca de 25% do normal (GATTINONI et al., 1986). Conseqüentemente, a ventilação
mecânica com V
T
na faixa de 10 a 12 mL/kg pode resultar em hiperdistensão das regiões
pulmonares ventiladas a um nível equivalente ao de pulmões saudáveis ventilados com
V
T
de 40 a 48 mL/kg (SLUTSKY & TREMBLAY, 1998). Se houver lesão pulmonar onde
somente um terço dos alvéolos possa ser ventilado (GATTINONI et al., 2003), então, 6
mL/kg será equivalente a um V
T
de 18 mL/kg para alvéolos íntegros.
O estudo do Acute Respiratory Distress Syndrome Network demonstrou uma
redução na mortalidade (de 40 para 31%) em uma população mista de pacientes com
LPA e SDRA ventilados com um V
T
equivalente à metade daquele do grupo controle (THE
ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME NETWORK, 2000). É interessante
ressaltar que, os resultados deste estudo não indicam que a ventilação com 6 mL/kg seja
segura; eles simplesmente sugerem que este V
T
implica em um melhor prognóstico do
que 12 mL/kg. Entretanto, 3 anos mais tarde, mesmo nos centros participantes, os
clínicos continuam não usando de rotina uma estratégia com V
T
baixo para pacientes com
falência respiratória grave (WEINERT et al., 2003). Quase quatro décadas após a primeira
descrição de SDRA (ASHBAUGH et al., 1967), muitos investigadores e médicos
(GATTINONI et al., 2001; ESTEBAN et al., 2002; HIRSCHL et al., 2002; WEINERT et al.,
2003) ainda aplicam a mesma estratégia ventilatória (V
T
maior que 10 mL/kg) usada na
descrição original da SDRA.
1.2.3 ATELECTOTRAUMA
13
Há uma ampla evidência indicando que o dano pulmonar também pode ser
causado pela ventilação em volume pulmonar baixo (significando o volume pulmonar ao
final da expiração). Acredita-se que esta lesão esteja relacionada com a abertura e o
fechamento cíclicos de vias aéreas distais, ductos e/ou unidades alveolares (doravante
chamado atelectotrauma). O recrutamento e desrecrutamento repetido das unidades
terminais pode levar a um estresse de cisalhamento local, particularmente se o evento é
repetido a cada ciclo respiratório. Muitos autores (usando várias espécies, diversos
modelos de lesão pulmonar, e diferentes estratégias ventilatórias) demonstraram a
presença de atelectotrauma e/ou o efeito protetor da pressão positiva ao final da
expiração (PEEP) (WEBB & TIERNEY, 1974; KOLTON et al., 1982; HAMILTON et al.,
1983; MCCULLOCH et al., 1988; SANDHAR et al., 1988; CORBRIDGE et al., 1990;
DREYFUSS & SAUMON, 1993; MUSCEDERE et al., 1994; COLMENERO-RUIZ et al.,
1997). A aplicação da PEEP pode prevenir o dano alveolar difuso por estabilizar as
unidades distais e manter o recrutamento por todo o ciclo ventilatório.
O efeito protetor da PEEP foi primeiramente descrito em 1974, num estudo com
animais íntegros, demonstrando que o edema pulmonar induzido por hiperinsuflação (45
cmH
2
O) foi menos grave quando uma PEEP de 10 cmH
2
O foi aplicada (WEBB &
TIERNEY, 1974). Este efeito benéfico da PEEP foi atribuído à redução do estresse
tecidual pulmonar (por reduzir o V
T
efetivo) e da filtração capilar (ao menos em parte por
causa de depressão hemodinâmica), assim como a preservação da atividade do
surfactante. Além do mais, acredita-se que a PEEP possa conservar a integridade da
camada de epitelial (BSHOUTY et al., 1988; SANDHAR et al., 1988).
1.2.4 DISTENSÃO PULMONAR TOTAL
14
O volume do pulmão ao final da inspiração (i.e., o grau total de distensão pulmonar)
também é um importante determinante da VILI (DREYFUSS & SAUMON, 1993;
MUSCEDERE et al., 1994; DREYFUSS & SAUMON, 1998; GARCIA et al., 2005b). A
aplicação de PEEP pode resultar em uma hiperinsuflação pulmonar se for seguida por
uma mudança significativa na capacidade residual funcional resultando no aumento do
volume pulmonar ao final da inspiração (DREYFUSS & SAUMON, 1998; GARCIA et al.,
2005b). Adicionalmente, dependendo da homogeneidade da distribuição de ventilação,
este enchimento excessivo afetará, preferencialmente, as áreas mais complacentes
(DREYFUSS & SAUMON, 1998; GARCIA et al., 2005b). Ratos ventilados com um V
T
baixo e 15 cmH
2
O de PEEP desenvolveram edema pulmonar, ao passo que ratos
ventilados com o mesmo V
T
e 10 cmH
2
O de PEEP não o fizeram (DREYFUSS &
SAUMON, 1993). O importante papel do volume ao final da inspiração na gênese VILI,
quando a capacidade residual funcional é aumentada com a PEEP, foi também
demonstrado por Muscedere et al. (1994).
1.3 OUTROS DETERMINANTES DA LESÃO PULMONAR INDUZIDA PELO VENTILADOR
1.3.1 F
REQÜÊNCIA RESPIRATÓRIA
A indução da lesão pulmonar durante a ventilação mecânica pode ocorrer em
função da freqüência do estresse mecânico cíclico (i.e., da freqüência respiratória) e da
intensidade do estresse tecidual pulmonar aplicado (pressão de insuflação pulmonar e/ou
volume corrente) (CONRAD et al., 2005).
A freqüência respiratória (FR) pode modular o desenvolvimento da VILI
(HOTCHKISS et al., 2000; CONRAD et al., 2005). Tal fato se baseia em modelos teóricos
15
de falência por estresse em materiais biológicos (HASHIN & ROTEM, 1978; PATTIN et
al., 1996; SCHECTMANN & BADER, 1997). Essas teorias podem ser aplicadas ao
parênquima pulmonar, onde parece existir um limiar de estresse acima do qual ocorre
falência tecidual. A FR alta pode exceder o limiar de falência por aumentar a intensidade
do estresse gerado. Logo, em poucos ciclos respiratórios se alcança o limiar de estresse.
(CONRAD et al., 2005). O mecanismo de falência por fadiga caracteriza-se pelo
desenvolvimento de micro-fraturas no parênquima pulmonar que aumentam em número e
se propagam a cada ciclo até que o traço de fratura seja grande o suficiente para
proporcionar falência tecidual (CONRAD et al., 2005).
Em volumes pulmonares normais, a membrana alvéolo-capilar suporta uma certa
carga de estresse devido à habilidade das células epiteliais e endoteliais se adaptarem a
um certo grau de deformação, sem sofrer lesão. Entretanto, em vigência de lesão
pulmonar subjacente e estratégias ventilatórias agressivas, a redução da FR pode
oferecer uma proteção adicional ao desenvolvimento da VILI (HOTCKISS et al., 2000;
CONRAD et al., 2005). Estudos in vitro (TSCHUPERLIN et al., 2000) e ex vivo
(HOTCHKISS et al., 2000; CONRAD et al., 2005) demonstraram a importância da
freqüência de deformação tecidual na indução de lesão pulmonar e morte celular.
1.3.2 RELAÇÃO TEMPO INSPIRATÓRIO/TEMPO EXPIRATÓRIO (I:E) INVERTIDA
A ventilação mecânica com relação I:E invertida (IRV) é uma modalidade
ventilatória utilizada em pacientes com LPA/SDRA (MARCY & MARINI, 1991; CHAN &
ABRAHAM, 1992; EAST et al., 1992; HAMMER, 2001; TRIPATHI, 2002; WANG & WEI,
2002). A IRV é usualmente aplicada com ventilação controlada à pressão (PCIRV) e tem
sido usada por proporcionar a redução da PEEP e/ou da PIP e melhorar a oxigenação
16
arterial (WANG & WEI, 2002). Adicionalmente, acreditava-se que a ventilação controlada
à pressão com fluxo aéreo inspiratório desacelerado e tempo inspiratório aumentado
poderia proporcionar uma distribuição de ar mais homogênea com um menor risco de
hiperdistensão alveolar.
Os estudos experimentais in vivo (LUDWIGS et al., 1996; LUDWIGS & PHILIP,
1998; CASETTI et al., 2002), entretanto, demonstraram que o tempo inspiratório
aumentado pode exacerbar a VILI. Foram observados piora da relação ventilação-
perfusão, redução da complacência pulmonar e aumento do edema pulmonar (CASETTI
et al., 2002). A PCIRV pode causar danos à membrana alvéolo-capilar prejudicando a sua
função de barreira (LUDWIGS et al., 1996). Esses achados seriam conseqüência de um
período maior de exposição a um volume pulmonar mais alto. Permanece ainda por ser
estabelecido a relevância desses achados em indivíduos com LPA ventilados
mecanicamente.
1.3.3 FLUXO AÉREO INSPIRATÓRIO
O fluxo aéreo inspiratório é também um importante determinante de estresse no
pulmão. O fluxo inspiratório elevado aumenta o estresse tensile através das superfícies
alveolares, que age perpendicularmente à superfície resultando em transmissão de
energia cinética para as estruturas subjacentes, e o estresse de cisalhamento, paralelo à
superfície das vias aéreas e das paredes alveolares, distorcendo o parênquima e
deformando a superfície epitelial (KOTANI et al., 2004).
Existem alguns estudos na literatura que tentaram avaliar o papel do fluxo aéreo na
fisiopatologia da VILI, porém os resultados são ainda inconclusivos. Inicialmente, foi
demonstrado que, durante a ventilação mecânica com PIP alta, o fluxo aéreo elevado
17
causou lesão microvascular pulmonar (PEEVY et al., 1990). Subseqüentemente, foi
verificado um efeito protetor da redução do fluxo inspiratório na LPA durante a ventilação
com PIP elevada (RICH et al., 2000). Em 2003, Edibam et al. (2003) ressaltaram a
necessidade de se determinar um fluxo inspiratório protetor, ou seja, que resultasse em
um menor disparo inflamatório e um melhor prognóstico de pacientes com LPA. Ademais,
durante a ventilação mecânica prolongada em ausência de PEEP e tórax aberto, com
abertura e colapso cíclico de unidades distais, o fluxo aéreo inspiratório elevado
exacerbou as alterações morfológicas e funcionais (D’ANGELO et al., 2004). O fluxo
aéreo inspiratório alto também levou a um grave comprometimento da troca gasosa, da
mecânica respiratória, e da estrutura pulmonar, em animais normais ventilados
mecanicamente com um V
T
alto (30 mL/kg) (MAEDA et al., 2004). Recentemente, Kotani
et al. (2004) observaram que o fluxo inspiratório elevado induziu a liberação sistêmica de
IL-8 e a ativação de MAPK em pulmões isolados de coelhos durante um estiramento
pulmonar moderado (12 mL/kg), e que os efeitos principais ocorreram nas células das
vias aéreas centrais. Logo, estudos adicionais são necessários para determinar o
significado morfológico, funcional e biológico do fluxo aéreo na VILI.
1.4 D
ISFUNÇÃO DE MÚLTIPLOS ÓRGÃOS E SISTEMAS INDUZIDA PELO VENTILADOR
Apesar dos avanços da ventilação mecânica, o prognóstico de pacientes com
SDRA é ruim, com uma taxa de mortalidade de pelo menos 30% (REYNOLDS et al.,
1998; POLA et al., 2000; MISSET et al., 2003; BRUN-BUISSON et al., 2004). Tem sido
estimado que a VILI aumente a mortalidade de pacientes com SDRA em cerca de 3.900 a
35.000 pacientes por ano (RUBENFELD, 2003). Esta estimativa é apoiada pelo fato de
que a causa mortis da maioria dos pacientes não é a doença pulmonar, mas sim a
18
disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (DMOS) (SLUTSKY & TREMBLAY, 1998).
Existem vários mecanismos pelos quais a VILI pode levar ao desenvolvimento de DMOS:
biotrauma, translocação de bactérias ou seus produtos do pulmão e fatores pró-
apoptóticos circulantes. A possibilidade de prostaglandinas (EDMONDS et al., 1969),
citocinas (TREMBLAY et al., 1997), endotoxinas (MURPHY et al., 2000) e bactérias
(NAHUM et al., 1997) cruzarem a barreira alvéolo-capilar danificada por um grande
estiramento pulmonar está bem estabelecida.
1.4.1 BIOTRAUMA
A ventilação mecânica acarreta aumento do conteúdo de células inflamatórias nos
pulmões e liberação de mediadores inflamatórios (por exemplo, citocinas) tanto no pulmão
como na circulação sistêmica, um processo denominado biotrauma (TREMBLAY &
SLUTSKY, 1998). Estudos clínicos e experimentais demonstraram que estratégias
ventilatórias lesivas podem iniciar ou perpetuar uma resposta inflamatória local e
sistêmica, que, por sua vez, pode contribuir significativamente para DMOS (TREMBLAY &
SLUTSKY, 1998; RANIERI et al., 1999; UHLIG, 2002). O principal conceito é que
mediadores inflamatórios originados do pulmão cruzam a barreira alvéolo-capilar
danificada e acessam a circulação, onde eles exercem os efeitos potencialmente
deletérios.
A possibilidade de células inflamatórias contribuírem para a gênese da VILI foi
amplamente investigada (WOO & HEDLEY-WHITE, 1972; IMAI et al., 1994;
NARIMANBEKOV & ROZYCKI, 1995; TAKATA et al., 1997; IMAI et al., 1999). O
recrutamento e ativação de células inflamatórias são componentes da resposta
inflamatória pulmonar. Neste contexto, foi demonstrado que a hiperinsuflação pulmonar
19
produz um acúmulo de leucócitos na micro-circulação pulmonar e de macrófagos nos
alvéolos (WOO & HEDLEY-WHITE, 1972). Estes resultados foram posteriormente
confirmados (TSUNO et al., 1991). Adicionalmente, uma estratégia ventilatória adversa
pode induzir ativação e infiltração neutrofílica (TSUNO et al., 1991; SUGIURA et al.,
1994). Moléculas de adesão, tal como ICAM-1 e Mac1, desempenham um papel
importante neste fenômeno durante a VILI (OHTA et al., 1998; IMANAKA et al. 2001).
Além do mais, a ruptura de células endoteliais pode também permitir o contato direto
entre células polimorfonucleares e a membrana basal (DREYFUSS & SAUMON, 1994), o
que pode promover a ativação de leucócitos. O efeito prejudicial da infiltração neutrofílica
no pulmão foi confirmado quando coelhos com depleção neutrofílica apresentaram dano
alveolar menos importante do que o observado em animais sem depleção (KAWANO et
al., 1987).
O papel das citocinas inflamatórias na fisiopatologia da VILI vem sendo abordado
em numerosos estudos (HALBERTSMA et al., 2005; SLUTSKY, 2005; DOS SANTOS &
SLUTSKY, 2006). A ventilação mecânica lesiva, com hiperdistensão alveolar e estresse
de cisalhamento gerados por abertura e colapso cíclicos de regiões atelectasiadas, pode
levar ao aumento nos níveis pulmonar e sistêmico de vários mediadores inflamatórios.
Essas evidências foram comprovadas em estudos in vitro (PUGIN et al., 1998; DUNN &
PUGIN, 1999; VLAHAKIS et al., 1999; YAMAMOTO et al., 2002), ex vivo (TREMBLAY et
al., 1997), in vivo (CHIUMELLO et al., 1999; HAITSMA et al., 2000; COPLAND et al.,
2003; HERRERA et al., 2003; VREUGDENHIl et al., 2003; WILSON et al., 2003) e clínicos
(RANIERI et al., 1999; RANIERI et al., 2000; THE ACUTE RESPIRATORY DISTRESS
SÍNDROME NETWORK, 2000; STUBER et al., 2002). O estiramento de macrófagos
alveolares resultou na liberação de interleucina (IL)-8 (PUGIN et al., 1998; DUNN &
20
PUGIN, 1999), uma quimiocina envolvida no recrutamento de neutrófilos. Células
epiteliais alveolares, quando submetidas a hiperdistensão, também podem contribuir para
a secreção aumentada de IL-8 (VLAHAKIS et al., 1999; YAMAMOTO et al., 2002). IL-8 é
o único mediador que foi constantemente liberado durante a hiperdistensão em modelos
in vitro [PUGIN et al., 1998; DUNN & PUGIN, 1999; VLAHAKIS et al. 1999], ex vivo
(TREMBLAY et al., 1997; RICARD et al., 2001), e in vivo (QUINN et al., 2002). Outros
mediadores inflamatórios, em particular o fator de necrose tumoral (TNF)-α, não são
comumente supra-regulados (VERBRUGGE et al., 1998; RICARD et al., 2001;
DREYFUSS et al., 2003). IL-1 pode ser uma importante citocina no desenvolvimento da
VILI, embora não tenha recebido muita atenção. Antagonista do receptor de IL-1 diminui a
gravidade da lesão pulmonar induzida por hiperóxia e hiperdistensão (NARIMANBEKOV
& ROZYCKI, 1995). Uma outra citocina que merece mais atenção é a IL-6, que foi
sugerida como mediador principal na DMOS induzida por biotrauma. A significância
clínica desta hipótese tornou-se aparente depois que o estudo do Acute Respiratory
Distress Syndrome Network demonstrou que uma abordagem pulmonar protetora –V
T
reduzido de 12 mL/Kg para 6 mL/kg – foi associada com uma redução significativa da
concentração plasmática de IL-6 no sexto dia em pacientes com SDRA (THE ACUTE
RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME NETWORK, 2000). A resposta inflamatória
sistêmica reduzida, secundária à estratégia ventilatória protetora pulmonar, pode ter
contribuído para a menor incidência de DMOS e a mortalidade reduzida no grupo
ventilado com V
T
de 6 mL/kg em relação aquele ventilado com 12 mL/kg. Ranieri et al.
(2000), ao analisarem a relação entre os dados de falência orgânica e da concentração de
citocinas desse estudo, observaram uma correlação entre concentrações aumentadas de
IL-6 no plasma e o desenvolvimento de DMOS.
21
1.4.2 TRANSLOCAÇÃO DE BACTÉRIAS E/OU SEUS PRODUTOS DO PULMÃO
A ventilação mecânica lesiva também pode promover a translocação de bactérias
e/ou seus produtos do pulmão para o sangue, contribuindo para o desenvolvimento de
DMOS (DREYFUSS & SAUMON, 1998; SLUTSKY & TREMBLAY, 1998). A barreira
alvéolo-capilar danificada pela hiperdistensão pulmonar associada a abertura e colapso
cíclico das unidades distais facilitou a translocação de bactérias previamente instiladas
intratraquealmente para o sangue (NAHUM et al., 1997; VERBRUGGE et al., 1998). A
adição de PEEP reduziu a translocação bacteriana (VERBRUGGE et al., 1998).
Estratégias ventilatórias adversas (V
T
alto e PEEP de zero) também podem promover a
translocação de endotoxinas do pulmão para a circulação sistêmica (MURPHY et al.,
2000; LIN et al., 2003). Ressalta-se que os níveis plasmáticos elevados de endotoxinas e
bactérias estão associados com uma taxa de mortalidade aumentada (MURPHY et al.,
2000; LIN et al., 2003).
1.4.3 Fatores Solúveis Pró-apoptóticos Circulantes
Recentemente, foi demonstrado que uma estratégia ventilatória lesiva pode levar a
apoptose de células epiteliais de órgãos distais ao pulmão. Fatores solúveis pró-
apoptóticos circulantes (Fas ligante solúvel) produzidos por estratégias ventilatórias
lesivas podem estar envolvidos neste mecanismo. A apoptose de células epiteliais no rim
e no intestino aumentou nas estratégias ventilatórias lesivas (IMAI et al., 2003). O plasma
desses animais ventilados adversamente induziu apoptose in vitro de células tubulares
renais, que foi reduzida quando uma proteína de fusão bloqueou o Fas ligante solúvel
(IMAI et al., 2003). Por fim, já se sabe que o disparo de vias apoptóticas pode contribuir
22
para a lesão epitelial observada em pacientes com SDRA (MARTIN et al., 2003).
Estratégias para bloquear as vias de apoptose talvez possam oferecer um melhor
prognóstico aos doentes com LPA/SDRA e minimizar a DMOS induzida pela VILI.
1.5 RESPOSTA CELULAR AO ESTRESSE MECÂNICO NA LESÃO PULMONAR INDUZIDA PELO
VENTILADOR
As células do parênquima pulmonar, das vias aéreas, e da circulação pulmonar são
continuamente submetidas a uma variedade de forças físicas, associadas com ventilação
e perfusão pulmonar (WIRTZ & DOBBS, 2000). Forças anormais aplicadas ao tecido
pulmonar desempenham um papel crítico em muitas situações patológicas, tais como
SDRA e VILI. Entretanto, a forma pela qual as forças mecânicas exercem os seus efeitos
deletérios ainda necessita ser elucidada. Estudos in vitro mostraram que o padrão e o
grau de deformação são importantes na determinação da resposta celular (GATTINONI et
al., 2003).
Ao longo dos últimos anos, cresceu o interesse no estímulo mecânico e seu papel
na regulação da estrutura, função, e metabolismo da célula (CHICUREL et al., 1998). As
células submetidas a estímulos mecânicos apresentam uma extensa variedade de
respostas. Proliferação, diferenciação, secreção, movimento, transdução de sinal,
expressão gênica e síntese de proteína são eventos que podem ser modificados sob a
ação de forças mecânicas (CHICUREL et al., 1998). Os mecanismos de percepção e
conversão do estímulo mecânico impróprio em mediadores inflamatórios e no
remodelamento da matriz extracelular (MEC) começaram a ser identificados (DOS
SANTOS & SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a).
23
1.5.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTRESSE MECÂNICO
O estresse apresenta subclassificações de acordo com a incidência da força.
Quando as forças são paralelas ao plano, o estresse é chamado ‘estresse de
cisalhamento'; quando a força é dirigida em direção à parte em que age, o estresse é
chamado ‘estresse compressivo', ao passo que quando a força é dirigida para longe da
parte em que age, o estresse é chamado ‘estresse tensile’ (YOUNG, 1989).
1.5.2 M
ECANISMOS DE MECANORECEPÇÃO E MECANOTRANSDUÇÃO
A mecanotransdução representa a conversão de estímulos mecânicos em
alterações bioquímicas e biomoleculares (DOS SANTOS & SLUTSKY, 2000; GARCIA et
al., 2005a; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006). Forças mecânicas podem ser percebidas
pelas células (sensor mecânico) e convertidas em sinais bioquímicos e biológicos que
causam mudanças na expressão gênica e no metabolismo da célula (WIRTZ & DOBBS,
2000; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a; FREDBERG & KAMM,
2006). O sensor mecânico é definido como o sistema que detecta os estímulos mecânicos
na célula e converte num sinal intracelular. Canais de íons sensíveis à deformação
(SACKIN, 1995; LIU et al., 1999; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2000; GARCIA et al.,
2005a) e a via MEC-integrina-citoesqueleto (WANG et al., 1993; DOS SANTOS &
SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a; FREDBERG & KAMM, 2006) são os sensores
mecânicos que receberam uma maior atenção. Estes mecanismos envolvem a ativação e
interação de vários eventos intracelulares, incluindo: geração de segundo mensageiro;
ativação de quinases protéicas específicas; fosforilação e ativação de moléculas de
sinalização; amplificação por cascatas enzimáticas; e modulação de expressão gênica
(GARCIA et al., 2005a). No núcleo, as forças físicas podem exercer seus efeitos por
24
influenciar a expressão de genes de resposta precoce [c-fos, c-jun, c-myc, JE, ELK-1, AP-
1, SP-1, fator nuclear (NF)-κB e Egr-1] (INGBER, 1997). Os fatores de transcrição são
proteínas que se ligam ao DNA regulando a expressão gênica. Destes, o NF-κB tem
recebido uma atenção especial. Vários estudos in vivo e in vitro mostraram que a
deformação tecidual pulmonar supra-regula o NF-κB (KOMURO et al., 1991; SCHWARTZ
et al., 1996). O NF-κB apresenta no DNA um elemento de resposta ao estresse de
cisalhamento na região promotora, e a proteína NF-κB liga-se a IL-6, IL-8, IL1-β, e TNF-α
(SCHWARTZ et al., 1996).
Em virtude da complexidade da estrutura pulmonar, os possíveis mecanismos de
estímulo mecânico e as respostas celulares podem variar extensamente. Há uma
abundância de tipos celulares e forças físicas às quais as células são expostas. Além
disso, tipos de estímulos diferentes podem usar a mesma via de sinalização para
coordenar a atividade da célula (Dos Santos & Slutsky, 2000; Garcia et al., 2005a).
1.5.3 CANAIS IÔNICOS ATIVADOS MECANICAMENTE
O cálcio representa uma das moléculas mais comuns que mediam a sinalização
intracelular por estímulo mecânico. Forças mecânicas aumentam o influxo de Ca
2+
,
através de um canal de cátion sensível a estímulo mecânico (BIALECKI et al., 1992;
BLACKWELL & CHRISTMAN, 1997). Isso foi demonstrado em células musculares lisas
(BLACKWELL & CHRISTMAN, 1997), células endoteliais arteriais (LIU et al., 1994),
células epiteliais de via aérea (WINSTON et al., 1993; BOITANO et al., 1994), e células
fetais de pulmão de rato (BIALECKI et al., 1992). O estímulo mecânico também comanda
proteína tirosino-quinase (PTK) que ativa fosfolipase C-γ (PLC-γ). PLC-γ media a hidrólise
de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP
2
) para produzir inositol 1,4,5-trisfosfato (IP
3
) e
25
diacilglicerol (DAG). O IP3 mobiliza Ca
2+
de reservas intracelulares. O DAG na presença
de Ca
2+
ativa proteíno-quinase C (PKC). A PKC e outros sinais podem ativar fatores de
transcrição (c-fos) que se unem a elementos de resposta, tal como elementos de resposta
a estiramento (SRE) e elementos de resposta a estresse de cisalhamento (SSRE)
(RESNICK et al., 1993), aumentando expressão gênica (Figura 1).
Figure 1. Representação esquemática da via de mecanotransdução mediada por canais
iônicos ativados mecanicamente (Adaptado de Garcia et al., 2005a).
1.5.4 R
UPTURA POR ESTRESSE DA MEMBRANA PLASMÁTICA
A ruptura da membrana plasmática tem sido demonstrada por diversos
mecanismos (MCNEIL & STEINHARDT, 1997; TERASAKI et al., 1997; WEST, 2000). A
manutenção da integridade da membrana plasmática desempenha sem dúvida um papel
importante nas vias de sinalização intracelular (LIU et al., 1999; DOS SANTOS &
SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a). O dano estrutural celular leva a um aumento da
concentração intracelular de Ca
2+
, por influxo aumentado de Ca
2+
extracelular e pela
26
liberação de Ca
2+
de reservas intracelulares (HINMAN et al., 1997). Alterações na
homeostase de Ca
2+
podem afetar vias de sinalização e induzir a ativação de PKC. As
rupturas traumáticas da membrana plasmática em resposta a estresse mecânico
(GREMBOWICZ et al., 1999) e a alteração da concentração de Ca
2+
intracelular (BAJPAI
et al., 1989) podem induzir um aumento da expressão de c-fos. A ruptura da membrana
por estresse também induz a translocação e ativação de NF-κB no núcleo
(GREMBOWICZ et al., 1999). PKC, NF-κB e c-fos podem induzir a transcrição de genes
de resposta precoce e a ligação a SRE para ativar a transcrição gênica (DOS SANTOS &
SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a).
1.5.5 INTERAÇÃO MATRIZ EXTRACELULAR-INTEGRINA-CITOESQUELETO
As células estão ligadas umas as outras e à MEC através de proteínas de
membrana, caderinas e integrinas, respectivamente (INGBER, 1997; GARCIA et al.,
2005a; FREDBERG et al., 2006). Na face citoplasmática da membrana celular estas
proteínas estão ligadas direta ou indiretamente a um grande número de proteínas e ao
citoesqueleto, formando o complexo de adesão focal (FAC). Este complexo prove uma
conexão estrutural para transmissão de sinal da MEC para as células (JULIANO &
HASKILL, 1993). O modelo proposto por Ingber (1993) prediz que as células são um
sistema de resposta imediata ao estresse mecânico transmitido às proteínas de
membrana que acoplam fisicamente o citoesqueleto a MEC (i.e., integrinas). O FAC
acopla mecanicamente a porção citoplasmática das integrinas ao citoesqueleto de actina,
sendo composto por vários tipos de moléculas, incluindo aquelas associadas a actina (por
exemplo, vinculina, talina, paxilina, e α-actina), quinase de adesão focal (FAK), quinases
da família Src, produtos oncogênicos, moléculas de sinalização (por exemplo, PTK e
27
proteína serino-quinase), e alguns receptores de fatores de crescimento (INGBER, 1993;
GARCIA et al., 2005a; FREDBERG & KAMM, 2006). Estas moléculas representam a
chave para transformação do estímulo mecânico em sinais biomoleculares. O estresse
celular aumenta a atividade total de PTK e induz uma associação de pp60src com o
citoesqueleto (LIU et al., 1996). O estímulo mecânico também pode alterar diretamente a
atividade do receptor de tirosino-quinase, tal como Flk-1, alterando assim a associação de
integrinas com Shc, ativando as vias Ras, ERK e JNK, que levam a ativação da
expressão gênica através de elementos de resposta a AP1 (CHEN et al., 1999). Uma
série de vias não-identificadas ativa os subgrupos de MAPK [p38 quinase, SAPK, JNK, e
ERK 1/2 (QUINN et al., 1999)], e fatores de transcrição, tais como Egr-1 e SP-1
(SILVERMAN et al., 1997). Subseqüentemente, esta diversidade de moléculas pode ativar
NF-κB e/ou outras vias intracelulares, induzindo a transcrição gênica. Membros da família
de integrinas também regulam a ação do NF-κB através da ativação de um inibidor de
NF-κB-quinase (IKK). Isto irá mediar a liberação do NF-κB do inibidor de NF-κB (IκB) por
fosforilação, e subseqüente translocação do NF-κB para o núcleo. A ativação dos
membros da família de MAPK e do NF-κB pode induzir a transcrição de genes de
resposta precoce e a ligação a SRE para ativar transcrição gênica (DOS SANTOS &
SLUTSKY, 2000; GARCIA et al., 2005a) (Figura 2).
Os elementos do citosqueleto também podem ser reorganizados para aumentar a
eficiência de transmissão de sinais da MEC para o interior da célula. A reorganização do
citoesqueleto deforma o núcleo celular (MANIOTIS et al., 1997; INGBER, 1991). Além
disso, a alteração do arranjo estrutural do citoesqueleto e da matriz nuclear pode expor ou
obscurecer sítios internos de ligação molecular, liberar controladores do remodelamento
molecular e alterar a porosidade da rede (INGBER, 1991). Esta interligação MEC-
28
integrina-citoesqueleto parece ser muito importante para a adaptação da célula às
alterações no meio extracelular.
Figure 2. Representação esquemática da via de mecanotransdução mediada pela
interação matriz extracelular-integrina-citoesqueleto (Adaptado de Garcia et al., 2005a).
1.5.6 SÍNTESE DE MEDIADORES INFLAMATÓRIOS INDUZIDA POR ESTÍMULO MECÂNICO
A liberação de mediadores inflamatórios por células pulmonares expostas a ação
de forças mecânicas tem recebido uma considerável atenção. Neste contexto, diversos
grupos utilizaram modelos de cultura de célula para examinar a resposta inflamatória
induzida por estímulo mecânico (PUGIN et al., 1998; TSUDA et al., 1999; VLAHAKIS et
al., 1999; MOURGEON et al., 2000; YAMAMOTO et al., 2001).
Macrófagos humanos, sob um estiramento mecânico de 12% na área de superfície
numa freqüência de 20 ciclos/min, produziram IL-8 via NF-κB (PUGIN et al., 1998).
Entretanto, o mesmo protocolo aplicado a células epiteliais pulmonares de humanos
29
(A549) não elevou o conteúdo de IL-8. Por outro lado, células epiteliais pulmonares A549
submetidas a um estiramento de 30% na freqüência de 20 ou 40 ciclos/min aumentaram o
conteúdo de IL-8 após 12-48 h (VLAHAKIS et al., 1999). O conteúdo de IL-8 também
aumentou quando células epiteliais A549 foram expostas a um estiramento de 40%
(YAMAMOTO et al., 2001). Logo, a liberação de IL-8 parece depender da intensidade do
estiramento cíclico.
Estudos adicionais in vitro enfatizaram a importância da associação de uma lesão
pulmonar subjacente com a deformação mecânica na liberação de citocinas. Neste
contexto, Tsuda et al. (1999) observaram que o estiramento sozinho não afetava a
produção de IL-8 após 8 horas; entretanto, na presença de fibras de vidro ou asbestos, a
deformação aumentou significativamente a produção de IL-8 em células A549.
Similarmente, o estiramento mecânico aplicado a uma cultura primária de células
pulmonares fetais de rato aumentou os níveis de MIP-2, somente após o estímulo com
LPS (MOURGEON et al., 2000).
A síntese de prostaglandinas em resposta a forças mecânicas pode variar com o
tipo celular e o estímulo. Por exemplo, o estiramento cíclico de células epiteliais de vias
aéreas de gato e homem infra-regula a síntese de prostaglandinas (PGs) incluindo PGE2,
PGI2, e tromboxano A2 (SAVLA et al., 1997). Em contraste, o estresse de cisalhamento
aumenta a produção de prostaciclina por células endoteliais pulmonares (REEVES et al.,
1983) e o estiramento mecânico induz a rápida liberação de prostaciclina por células
pulmonares fetais de rato (SKINNER et al., 1992).
1.5.7 EXPRESSÃO DE MATRIZ EXTRACELULAR PULMONAR INDUZIDA POR ESTÍMULO MECÂNICO
30
As forças mecânicas podem alterar a expressão gênica e a síntese protéica de
várias moléculas da MEC pulmonar, incluindo colágeno, glicosaminoglicanos (GAGs) e
proteoglicanos (PTGs). O estiramento mecânico intermitente pode regular a expressão
gênica e protéica da MEC de forma diversa (XU et al., 1999). Diferenças na distribuição
regional do estresse mecânico ou na extensão da lesão geram padrões diferentes de
expressão da MEC (PARKER et al., 1997). Adicionalmente, o aumento do conteúdo de
MEC parece estar relacionado a maior síntese de MEC, e não a infra-regulação de
enzimas de degradação (XU et al., 1999).
Forças mecânicas aumentam a expressão de fibras de colágeno (BREEN, 2000;
XU et al., 1999; PARKER et al., 1997; GARCIA et al., 2004; FARIAS et al., 2005). O papel
das forças físicas na expressão de procolágeno tipo III (PCIII) foi recentemente elucidado
por Garcia et al. (2004) que observaram a existência de um limiar de estresse acima do
qual as células pulmonares expressam RNAm para PCIII. Adicionalmente, Farias et al.
(2005) demonstraram que mesmo um curto período (40 s) de estiramento pulmonar
máximo (40 cmH
2
O de pressão de vias aéreas) aumentou a expressão de PCIII.
O estiramento mecânico intermitente também induz a secreção de GAGs e PTGs.
O estiramento mecânico parece afetar principalmente a parte distal da via de secreção,
isto é, o tráfego de GAGs e PTGs do Golgi para a membrana celular. O estímulo
mecânico para a liberação de GAGs também parece ser via canais de cátion ativados
mecanicamente. O influxo de Ca
2+
, ao invés da mobilização de Ca
2+
de reservas
intracelulares, representa o principal mecanismo de exocitose de GAG mediada por
estiramento mecânico em células pulmonares fetais (XU et al., 1996).
31
JUSTIFICATIVAS
32
2 JUSTIFICATIVAS
Hoje, um dos conceitos mais importantes no cuidado dos pacientes na terapia
intensiva é o reconhecimento de que a ventilação mecânica pode agravar, ou ainda
causar, uma lesão pulmonar, uma condição denominada lesão pulmonar induzida pela
ventilação mecânica (VILI). Os mecanismos associados com o desenvolvimento da VILI
ainda não foram completamente elucidados. Existem quatro mecanismos básicos que
podem levar ao desenvolvimento da VILI: pressões de vias aéreas elevadas (barotrauma)
(WEBB & TIERNEY, 1974; DREYFUSS et al., 1985; KOLOBOW et al., 1987; TSUNO et
al., 1990), hiperdistensão alveolar por volume corrente alto (volutrauma) (DREYFUSS et
al., 1988; HERNÁNDEZ et al., 1989; CARLTON et al., 1990), colapso e abertura cíclicos
de unidades pulmonares distais (atelectotrauma) (DREYFUSS & SAUMON, 1993;
MUSCEDERE et al., 1994), e liberação de mediadores inflamatórios no pulmão e na
circulação sistêmica que, algumas vezes, leva ao desenvolvimento da disfunção de
múltiplos órgãos e sistemas (biotrauma) (PLOTZ et al., 2004; DOS SANTOS et al., 2005;
DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006).
A VILI é o resultado de uma seqüência de eventos, que começa com uma alteração
morfofuncional, devido ao estresse mecânico global e/ou regional excessivo. Durante a
ventilação mecânica, os pulmões são submetidos a uma variedade de forças mecânicas
que podem ser sentidas pelas células e convertidas em alterações bioquímicas e
biomoleculares intracelulares (WIRTZ & DOBBS, 2000; DOS SANTOS & SLUTSKY,
2000; GARCIA et al., 2005a; FREDBERG & KAMM, 2006). Se o estímulo mecânico
alcança o limiar de estresse de ruptura, estruturas pulmonares são destruídas
(GATTINONI et al., 2003). Se a força é inferior a esse limiar, porém não fisiológica,
eventos biológicos intracelulares ocorrem, resultando provavelmente na produção e
33
liberação de mediadores inflamatórios (TREMBLAY et al., 1997; LIU et al., 1999; DOS
SANTOS & SLUTSKY, 2000; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006) e na alteração da
expressão gênica e síntese protéica de várias moléculas da MEC pulmonar (XU et al.,
1996; GARCIA et al., 2004; MASCARENHAS et al., 2004; FARIAS et al., 2005; SUKI et
al., 2005).
O fluxo aéreo é um parâmetro amplamente variável no manejo da ventilação
mecânica (DAVIDSON, 2002). Entretanto, o fluxo inspiratório também pode induzir
estresse mecânico ao parênquima pulmonar e as vias aéreas. Alguns estudos na
literatura avaliaram o papel do fluxo aéreo na fisiopatologia da VILI, porém os resultados
são ainda inconclusivos (PEEVY et al., 1990; RICH et al., 2000; D’ANGELO et al., 2004;
MAEDA et al., 2004; KOTANI et al., 2004). Durante a ventilação mecânica com PIP alta, o
fluxo aéreo elevado causou lesão microvascular pulmonar (PEEVY et al., 1990) e a sua
redução protegeu o pulmão do desenvolvimento da lesão pulmonar (Rich et al., 2000). O
fluxo inspiratório também exacerbou as alterações morfológicas e funcionais em modelos
de VILI por atelectotrauma (D’ANGELO et al., 2004) e volutrauma (MAEDA et al., 2004).
Recentemente, foi demonstrado em pulmões isolados de coelhos normais que o fluxo
inspiratório elevado induz a liberação de IL-8 e a ativação de MAPK, durante a ventilação
mecânica com V
T
de 12 mL/kg, e que os efeitos principais ocorreram nas células dos
grandes brônquios (KOTANI et al., 2004). Logo, estudos adicionais são necessários para
a melhor compreensão do significado do fluxo aéreo inspiratório na fisiopatologia da VILI.
O presente trabalho visa a testar a hipótese de que o fluxo inspiratório elevado, por
si só, pode induzir estresse mecânico pulmonar. Para tal, analisar-se-ão a mecânica
respiratória, histologia pulmonar (microscopia ótica e eletrônica) e a expressão de RNAm
para procolágeno tipo III.
34
OBJETIVOS
35
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Testar a hipótese de que o fluxo inspiratório elevado acarreta estresse mecânico
pulmonar com conseqüentes modificações morfofuncionais.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar os efeitos da ventilação mecânica com fluxo inspiratório elevado sobre:
A mecânica pulmonar (pressão de pico inspiratória e pressão de platô);
A histologia pulmonar (microscopia de luz e eletrônica);
A expressão de RNAm para procolágeno tipo III.
36
MATERIAIS E MÉTODOS
37
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS UTILIZADOS
Foram utilizados trinta ratos Wistar machos normais adultos (180-210 g), oriundos
do biotério do Laboratório de Fisiologia da Respiração do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
Os animais receberam cuidados conforme o guia preparado pelo Comitê de
cuidados e uso dos animais de laboratório do Conselho Nacional de Pesquisas dos
Estados Unidos da América (U.S. Department of Health and Human Care Services, 1985).
O projeto foi aprovado pela comissão interna do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
4.2 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Os animais foram sedados [diazepam 5 mg, intraperitonealmente (i.p.)], pesados
(balança Filizola, modelo BR, fabricado por Indústrias Filizola AS, SP, Brasil) e, em
seguida, anestesiados com pentobarbital sódico [Hypnol®, Cristália, Itapira, SP, Brasil (20
mg/kg, i.p.)]. Essa dose é suficiente para manter o animal em plano anestésico
(supressão do reflexo córneo-palpebral) por 1 hora, quando, então, uma nova dose
(metade da anterior) de pentobarbital sódico [Hypnol
, Cristália, Itapira, SP, Brasil (10
mg/Kg i.p.)] era administrada.
Depois de anestesiados, os animais foram colocados em uma pequena mesa sob
foco cirúrgico em decúbito dorsal, sendo seus membros fixados por esparadrapo. Os
membros superiores foram mantidos em abdução a 90 graus em relação ao corpo e os
membros inferiores estendidos em diagonal. Após o posicionamento cirúrgico, foi
38
realizada uma pequena incisão longitudinal, medial, de aproximadamente 2 cm de
extensão na face ventral no pescoço seguida de divulsão dos tecidos até a exposição
completa do terço inicial da traquéia. A seguir, pela traqueotomia, uma cânula de
polietileno (PE 240, Intramedic®, Clay-Adams Inc., Nova York, EUA) com 1,5 mm
diâmetro interno e 7,5 cm de comprimento foi introduzida na traquéia, sendo esta fixada
na porção proximal por meio de fios de algodão.
A cânula traqueal foi conectada a um pneumotacógrafo para pequenos animais,
como descrito por Mortola & Noworaj (1983), para medida de fluxo aéreo (V’). O
pneumotacógrafo utilizado consiste de uma cânula metálica com duas saídas laterais com
as seguintes características: diâmetro interno = 1,5 mm, comprimento = 4,2 cm e distância
entre as saídas laterais = 2,1 cm. O gradiente de pressão através do pneumotacógrafo foi
determinado utilizando-se um transdutor diferencial de pressão Validyne MP45-2
(Engeneering Corp, Northridge, CA, EUA). Essa forma de medir fluxo aéreo, além de bem
simples, é adequada, visto que, em animais de pequeno porte, os fluxos baixos e as
dimensões traqueais reduzidas são responsáveis pela existência de fluxo laminar e,
portanto, o fluxo aéreo pode ser medido de acordo com a lei de Poiseuille, onde a
diferença de pressão entre as saídas laterais do pneumotacógrafo é proporcional ao V’.
Através de outra saída lateral, a via aérea era conectada a um transdutor diferencial de
pressão Validyne MP45-2 (Engeneering Corp, Northridge, CA, EUA) para medida da
pressão traqueal (Ptr). A inexistência de mudanças abruptas no diâmetro do circuito (da
traquéia até a extremidade da tubulação) evitou erros de medida de resistência ao fluxo
(LORING et al., 1979; CHANG & MORTOLA, 1981). O volume (V
T
) mobilizado foi obtido
por integração digital do sinal de fluxo.
39
No esôfago dos animais, foi introduzido um cateter de polietileno (PE 240) de 20
cm de comprimento e 1,7 mm de diâmetro interno, com pequenos orifícios em sua
extremidade distal, preenchido com água deionizada. O cateter foi introduzido até o
estômago e retrocedido lentamente até atingir o terço inferior do esôfago. Sua
extremidade proximal foi, então, conectada a um transdutor líquido (Statham, PR23-2D-
300 – Hato Rey, Porto Rico) para medida da pressão esofagiana (Pes), já que as
variações da pressão no terço inferior do esôfago refletem as variações da pressão
intrapleural (Ppl) e, portanto, da pressão da parede torácica (Pw) (MILLIC-EMILI et al.,
1964a, 1964b). A medida da pressão esofagiana foi realizada para decompor o sistema
respiratório em pulmão e parede torácica. O correto posicionamento do cateter esofagiano
foi determinado pelo “teste de oclusão” conforme proposto por Baydur et al., em 1982
(BAYDUR et al., 1982). O “teste de oclusão” consiste na oclusão das vias aéreas ao
término de uma expiração espontânea, as quais são mantidas fechadas por um ciclo
respiratório, registrando-se e comparando-se as variações das pressões traqueal e
esofagiana durante o esforço inspiratório subseqüente. Nessas condições, a diferença
entre as variações da pressão traqueal (∆Ptr) e da pressão esofagiana (∆Pes) não devem
exceder 5%. O cateter esofagiano era lavado periodicamente com água deionizada, para
evitar que a presença de secreções na luz do cateter pudesse comprometer as medidas
da pressão (Figura 3).
40
Figura 3. Teste de Oclusão. A. Traçados de volume (V), pressão transpulmonar (PL),
pressão esofagiana (Pes) e pressão traqueal (Ptr) durante o “teste de oclusão”. B.
Variação de Ptr (∆Ptr) por variação de Pes (∆Pes). ∆Pes - ∆Ptr < 5%. (Adaptado de
Baydur et al., 1982)
A calibração dos transdutores de pressão foi realizada com o auxílio de um tubo
em "U" contendo água destilada. A aferição foi realizada antes de cada experimento para
assegurar a confiabilidade do registro.
O espaço morto da montagem foi de 0,4 mL. Para computá-lo, pesou-se o conjunto
de equipamentos utilizados entre a via aérea do animal e o ventilador (cânula traqueal,
tubo em “T”, pneumotacógrafo e conexões de borracha) vazio e cheio de água. A
A
B
41
diferença de peso permitiu saber o volume de água e, portanto, o volume do espaço
morto do sistema. Para fechar as saídas do conjunto e enchê-lo de água foi usada massa
de modelar, que foi também pesada, junto com os demais equipamentos.
Os animais tiveram a sua musculatura paralisada após a administração de brometo
de pancurônio (1 mg/kg, intravenoso), e a ventilação artificial foi instituída por um
ventilador mecânico para pequenos animais (Samay VR15, Universidad de la Republica,
Montevideo, Uruguai) acoplado à outra extremidade do pneumotacógrafo. O modo
ventilatório basal instituído foi uma ventilação controlada a volume com V
T
de 10 mL/kg de
peso corporal, FR de 100 incursões respiratórias por minuto (irpm), relação I:E de 1:2 e
fração inspirada de oxigênio (FiO
2
) de 0,21.
4.3 CARACTERIZAÇÃO DOS GRUPOS SUBMETIDOS À VENTILAÇÃO MECÂNICA.
Após a monitorização da mecânica pulmonar no modo ventilatório basal, doze ratos
foram randomicamente expostos à ventilação mecânica por 2 horas com um V’ normal de
10 mL/s (grupo F10, n = 6) ou um V’ alto de 30 mL/s (grupo F30, n = 6) (Tabela 1). A FR
foi de 100 irpm no grupo F10 e 200 irpm no grupo F30. No grupo controle, os animais não
foram submetidos à ventilação mecânica (CTRL, n = 6).
4.4 EXPERIMENTOS ADICIONAIS
Uma vez que o fluxo alto acarretou o aumento da FR e da pressão de pico
inspiratória (PIP = 17 cmH
2
O), experimentos adicionais foram realizados para excluir os
possíveis efeitos adversos destes parâmetros. Seis animais foram ventilados com V’ alto
de 30 mL/s e FR = 100 irpm (grupo LRRF30); enquanto outros seis ratos foram ventilados
42
com V
T
ajustado para manter uma PIPaw de 17 cmH
2
O e um V’ de 10 mL/s (grupo
HPF10) (Tabela 1). Todos os animais foram ventilados por 2 horas.
Tabela 1. Protocolos experimentais.
Grupos V
T
(mL/kg) V’ (mL/s) FR (irpm) I:E ratio PIP (cmH
2
O)
F10 10 10 100 1:2 12
F30 10 30 200 1:2 17
LRRF30 10 30 100 1:8 17
HPF10
16→8
(IMM→POST)
10
60→120
(IMM→POST)
1:2 17
Definição das abreviações: V
T
= volume corrente; V’ = fluxo aéreo inspiratório; FR =
freqüência respiratória; relação I:E = relação tempos inspiratório/expiratório; PIP =
pressão de pico inspiratória; F10 = animais ventilados com V’ normal; F30 = ratos
ventilados com V’ alto e, conseqüentes, FR e PIP elevadas; LRRF30 = animais ventilados
com V’ alto e FR normal; HPF10 = ratos ventilados com V’ normal e PIP alta; IMM =
imediatamente após o ajuste da PIP; POST = ao término do período de 2 horas de
ventilação que seguiu o ajuste do protocolo ventilatório.
Os animais foram submetidos à análise da mecânica pulmonar in vivo (método de
oclusão ao final da inspiração), e histologia (microscopia de luz e eletrônica) e análise da
biologia molecular (RT-PCR semiquantitativo) do parênquima pulmonar (Figura 4). No
grupo controle, somente a histologia pulmonar e a biologia molecular do parênquima
pulmonar foram analisadas.
43
Figura 4. Representação esquemática do desenho do estudo. CTRL = animais não
submetidos à ventilação mecânica; F10 = animais ventilados com fluxo inspiratório (V’)
normal de 10 mL/s; F30 = ratos ventilados com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes,
freqüência respiratória (FR, 200 irpm) e pressão de pico (PIP, 17 cmH
2
O) elevadas;
LRRF30 = animais ventilados com V’ alto de 30 mL/s e FR normal (100 irpm); HPF10 =
animais ventilados com V’ normal de 10 mL/s e PIP alta de 17 cmH
2
O; PRE = modo
ventilatório basal; IMM = imediatamente após o ajuste do V’ ou da PIP; POST = ao
término do período de 2 horas de ventilação que se seguiu ao ajuste do protocolo
ventilatório.
A medida da mecânica pulmonar e a análise da histologia por microscopia de luz
foram realizadas nos Laboratórios de Investigação Pulmonar e Fisiologia da Respiração, a
análise da biologia molecular do parênquima pulmonar foi realizada no Laboratório de
Biologia e Fisiologia Celular, do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho (UFRJ), e a
análise da histologia por microscopia eletrônica foi realizada no Departamento de
Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP).
4.5 MECÂNICA PULMONAR
Os dados da mecânica pulmonar foram obtidos em três ocasiões: 1) ventilação
basal (PRE), 2) imediatamente após o ajuste do V’ ou PIP (IMM), e 3) ao término do
período de 2 horas de ventilação que seguiu o ajuste do protocolo ventilatório (POST)
(Figura 3). A mecânica pulmonar foi avaliada pelo método de oclusão ao final da
44
inspiração após insuflação com fluxo constante (BATES et al., 1985a, 1985b, 1988a,
1988b, 1989a, 1989b; KOCHI et al., 1988a, 1988b).
4.5.1 MÉTODO DE OCLUSÃO AO FINAL DA INSPIRAÇÃO
Após a oclusão das vias aéreas ao final da inspiração, ocorre uma queda súbita da
Ptr, de um valor máximo (PIP) até um ponto (ponto de inflexão, Pi) a partir do qual o
decaimento da pressão assume caráter mais lento, atingindo um platô em sua porção
terminal. Esta pressão de platô (Pplat) corresponde à pressão de retração elástica do
sistema respiratório (Pel,rs) (Figura 5). A pressão traqueal corresponde ao sistema
respiratório. O mesmo comportamento pode ser observado no traçado de pressão
esofagiana, que, por sua vez, corresponde à parede torácica. As pressões
transpulmonares (PIP,L e Pplat,L) foram calculadas a partir da diferença entre os valores
do sistema respiratório e da parede torácica (Figura 5).
45
Figura 5. Representação esquemática dos traçados de fluxo, volume, pressão traqueal e
pressão esofagiana em função do tempo, obtidos a partir da oclusão da via aérea ao final
da inspiração. V
T
= volume corrente; PIP = pressão de pico inspiratória; Pi = ponto de
inflexão; Pplat = pressão de platô; rs = sistema respiratório; w = parede.
Foram registrados 15 ciclos pelo método de oclusão ao final da inspiração (BATES
et al., 1985a, 1985b, 1988a, 1988b, 1989a, 1989b; KOCHI et al., 1988a, 1988b), em cada
animal. Os transdutores conectados ao pneumotacógrafo, ao tubo traqueal e ao cateter
esofagiano registraram os sinais de V’, Ptr e Pes, respectivamente. As respostas de
freqüências dos sistemas de registro da Ptr e Pes foram estáveis até 20 Hz. Em seguida,
os sinais foram condicionados em um polígrafo de oito canais [Beckman, Type R-
Dynograph (Schiller Park, Illinois, EUA)], filtrados (filtro passa-baixa Bessel de 8 pólos,
LPF902, Frequency Devices, Haverhill, MA, EUA) com freqüência de corte estabelecida
de 100 Hz, convertidos a sinais digitais por um conversor analógico-digital de 12-bitz (DT-
46
2801A, Data Translation, Malboro, MA, EUA), e amostrados a uma freqüência de 200 Hz.
Os sinais foram armazenados em microcomputador, utilizando-se o software LABDAT
(RHT-InfoData, Montreal, Canadá) e gravados em disquetes magnéticos para posterior
análise, que foi realizada pelo programa ANADAT (RHT-InfoData, Montreal, Canadá)
(Figura 6).
Figura 6. Montagem experimental consistindo de: 1 – Cilindro de ar comprimido; 2 –
Rotâmero de agulha; 3 – Ventilador controlado a volume com fluxo inspiratório constante
com duas válvulas solenóides; 4 – Pneumotacógrafo; 5 – Peça T para medida de pressão
nas vias aéreas; 6 – Cânula traqueal; 7 – Cateter Esofagiano; 8 – Mesa cirúrgica; 9 –
Transdutor de pressão esofagiana; 10 – Transdutor de pressão traqueal; 11 – Transdutor
diferencial de pressão para medida de fluxo; 12 – Polígrafo de oito canais com
amplificação dos sinais de V’ e Ptr; 13 – Filtros; 14 – Conversor analógico-digital de 12
bits; 15 – Microcomputador.
4.6 REMOÇÃO DOS PULMÕES
Ao término do experimento, os animais foram imediatamente sacrificados. O terço
inferior do abdômen foi aberto por seção cirúrgica transversal e 1 mL de heparina diluída
(0,5 mL de heparina em 0,5 mL de solução fisiológica) foi injetada na veia cava inferior e,
após 1 minuto, os animais foram exangüinados por seção cirúrgica direta da aorta e veia
47
cava inferior em suas porções abdominais. A traquéia foi, então, ocluída ao final da
expiração com linha de algodão. O tórax foi aberto, a parede torácica anterior foi
removida, a porção abdominal do esôfago foi identificada e isolada, sendo presa por uma
pinça hemostática. As estruturas do pescoço foram dissecadas, permitindo a liberação
das vias aéreas. A pinça que prendia o esôfago foi suavemente tracionada para cima,
permitindo separar o conjunto coração-pulmão das demais estruturas aderidas à parede
torácica posterior. Com todas as estruturas individualizadas, a traquéia foi secionada
acima do local ocluído pelo fio de algodão e, posteriormente, o esôfago e o coração foram
separados dos pulmões e vias aéreas por leve tração. Os brônquios fontes direito e
esquerdo foram ocluídos por um fio de algodão e, após uma seção acima do fio, os
pulmões direito e esquerdo foram separados, sendo mantidos no volume expiratório final.
4.7 HISTOLOGIA PULMONAR
Os pulmões direitos foram fixados para análise por microscopia de luz (NAGASE et
al., 1992). Cortes histológicos (3 µm de espessura) foram corados com hematoxilina-
eosina para análise morfométrica da arquitetura pulmonar. A fração de área ocupada por
alvéolos normais, colapsados e hiperinsuflados, e as celularidades total e diferencial
(células polimorfonucleares e mononucleares) no parênquima pulmonar foram
determinadas pela técnica de contagem de pontos (WEIBEL, 1990; SAKAE et al., 1994).
Três pedaços de 2x2x2 mm foram cortados de diferentes segmentos do pulmão esquerdo
e preparados para análise por microscopia eletrônica de transmissão.
4.7.1 MICROSCOPIA DE LUZ
48
Os pulmões direitos foram resfriados por imersão rápida em nitrogênio líquido
(aproximadamente 3 min), retirados e mantidos em solução de Carnoy (etanol 60%,
clorofórmio 30% e ácido acético 10%) a -70º C por 24 h. Após esse período, o material foi
desidratado progressivamente através de imersão em soluções com concentração
crescente de etanol:
- MC-1: etanol 70%, clorofórmio 22,5% e ácido acético 7,5%, a -20
o
C durante 1h;
- MC-2: etanol 80%, clorofórmio 15% e ácido acético 5%, a -20
o
C durante 1h;
- MC-3: etanol 90%, clorofórmio 7,5% e ácido acético 2,5%, a -20
o
C durante 1h;
- etanol a 100%, a -20
o
C durante 1h e, em seguida, a -4
o
C durante 24h.
Depois da fixação, o material foi embebido em parafina, obtendo-se cortes
histológicos com 3 µm de espessura.
As lâminas contendo os cortes pulmonares foram coradas com hematoxilina e
eosina (H&E) e analisadas por microscopia de luz (Axioplan, Zeiss, Oberkochen,
Alemanha) segundo seus aspectos qualitativos e quantitativos. Para a análise descritiva,
toda a superfície da lâmina foi observada com todas as estruturas pulmonares
representadas, em aumento de 100x e 400x.
A análise quantitativa foi realizada através da técnica convencional de contagem de
pontos (“point-couting”) (WEIBEL, 1990), utilizando-se uma ocular acoplada ao
microscópio, contendo um sistema de referência de 100 pontos e 50 segmentos de reta
dispostos em paralelo (Figura 7).
49
Figura 7 – Retículo com 100 pontos e 50 linhas utilizado para quantificação dos
parâmetros morfométricos.
Em um aumento de 200x, foram avaliados dez campos aleatórios e não
coincidentes por lâmina. Foi quantificada a fração de área ocupada por alvéolos normais,
colapsados e hiperinsuflados (WEIBEL, 1990). O número de pontos que caíram em área
de alvéolo normal, colapsado ou hiperinsuflado foi dividido pelo total de pontos contados
em cada campo analisado (normal + colapsado + hiperinsuflado) e expresso sob a forma
de percentual.
Em um aumento de 1000x, foram avaliados dez campos aleatórios e não
coincidentes, sendo quantificados os seguintes parâmetros: tecido pulmonar, células
polimorfonucleares (neutrófilos) e células mononucleares (macrófagos + linfócitos +
monócitos). Pontos que caíram sobre área somente de tecido foram computados e
divididos pelo número total de pontos do tecido (tecido + células no tecido). O número de
pontos que caíram sobre as células polimorfonucleares ou mononucleares do parênquima
pulmonar foi dividido por essa relação de tecido e expressos sob a forma de percentual.
50
4.7.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Para a análise por microscopia eletrônica foram retirados dois fragmentos de
parênquima pulmonar (2x2x2 mm). Os fragmentos foram colocados em glutaraldeído 2%
em tampão fosfato 0,1M e pH 7,4, por 2 h, sendo posteriormente lavados em solução de
sacarose, constituída de 4,5 g de NaCl e 8,9 g de sacarose diluídos em 500 mL de água
destilada, até a pós-fixação. A seguir, os fragmentos foram imersos em solução de
tetróxido de ósmio (1% em água, contendo 133 mg de sacarose por mL) por 2 h. Após a
lavagem em água bidestilada as preparações foram colocadas na geladeira em acetato
de uranila 0,5% contendo 133 mg de sacarose, por um tempo que variou de 2 a 24 h. O
processo foi continuado, efetuando-se a desidratação em concentrações crescentes de
álcool etílico, progredindo gradativamente até álcool absoluto, sendo, então, o tecido
passado em óxido de propileno por 15 minutos (2 vezes). Iniciando a fase de embebição,
as amostras foram colocadas em misturas de partes iguais de óxido de propileno e resina
(araldite). Os frascos contendo os fragmentos foram colocados para girar (1 rotação a
cada 4 minutos, por 1 hora). Posteriormente, as peças foram colocadas por 16 h em
resina, com a seguinte composição: 10 mL de araldite (Cy-205), 8 mL de endurecedor
DDSA (anidrido de ácido doxecenil succínico), 0,5 mL de acelerador (N-
benzildimetilamina) e 0,1 mL de plastificante (dibutilftaltato). Ao término de 16 h, as
amostras foram colocadas em moldes de silicone com nova resina, para polimerização
em estufa a 60°C, por 5 dias. Concluída a polimerização, os espécimes foram aparados e
cortes semifinos obtidos com o ultramicrótomo Porter Blum MT2 (Reichert ultracult S).
Tais cortes, com 0,5 µm de espessura, foram montados em lâminas de vidro e corados
com uma mistura de azul de metileno a 1% e azur II, em partes iguais e a quente. Nestes
51
cortes, selecionou-se áreas representativas das lesões. De cada espécime, 2 blocos,
contendo aproximadamente 10 fragmentos cada um, foram submetidos à análise para
seleção dos cortes ultrafinos.
Para o estudo ultraestrutural, cortes ultrafinos, com espessura em torno de 90
nanomêtros, foram contrastados pelo acetato de uranila a 2% durante 30 minutos e,
finalmente, pelo citrato de chumbo por 10 minutos. A observação dos cortes e as
eletromicrografias foram realizadas em microscópio eletrônico JEOL (JEOL 1010, Japão).
4.8 RT-PCR SEMIQUANTITATIVO
Uma tira de parênquima subpleural de 3x3x10 mm foi cortada da periferia de cada
pulmão esquerdo. O material foi congelado em nitrogênio líquido e armazenado em
“criotubo” no freezer a −70°C até o processamento. A expressão relativa de RNAm para
procolágeno tipo III (PCIII) foi obtida por Transcrição Reversa da Reação em Cadeia da
Polimerase Semiquantitativa (RT-PCR) do tecido pulmonar de rato em todos os grupos. O
método de RT-PCR semiquantitativo usado para quantificar o conteúdo tecidual de RNAm
para PCIII foi validado em experimentos prévios (GARCIA et al., 2004; FARIAS et al.,
2005).
4.8.1 E
XTRAÇÃO DE RNA TOTAL DO TECIDO PULMONAR
O RNA total foi extraído utilizando-se o reagente Trizol® (Gibco BRL, NY, EUA)
seguindo o protocolo sugerido pelo fabricante. Em seguida, o RNA foi tratado com DNase
I (Gibco BRL, NY, EUA) durante 30 min a 37°C para eliminação da possível contaminação
com DNA genômico. O RNAm precipitado foi solubilizado em 20 µL de água tratada com
DEPC. A concentração das amostras de RNA-total foi determinada por espectrofotometria
52
no comprimento de onda de 260 nanômetros (nm). A integridade do RNA extraído foi
verificada por eletroforese em gel de agarose 1%. O gel foi submerso em tampão TAE 1X
e a eletroforese realizada a 100 Volts por aproximadamente 45 minutos. A integridade é
determinada por uma razão de absorbância 260/280 nm > 1,7.
4.8.2 TRANSCRIÇÃO REVERSA (RT)
Para a obtenção da primeira fita de DNA, o RNA-total extraído foi transcrito
reversamente com SuperScript (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) em 37°C por 60 min.
A primeira fita de DNA complementar (DNAc) foi realizada em 20 mL de reação contendo
1µg do RNA total, 50 U de transcriptase reversa do vírus murino da eritroleucemia, 20 U
de inibidor de Rnase, 2,5 µM de oligo(dT)
16
, 2 µL de 5x o banho da primeira fita (250 mM
Tris-HCl, 375 mM KCl, 15 mM MgCL
2
), 1 mM dNTP e água tratada com dietil
pirocarbonato (DEPC). A reação foi realizada em um banho com água a 37°C por 80 min
e 99°C por 5 min. O controle negativo correspondeu a uma alíquota de 250ng do RNA
total utilizado para a síntese de DNAc na ausência de enzima transcriptase reversa, o que
foi denominado RT (-). O DNAc obtido foi diluído em 10 µL de água tratada com DEPC e
estocado a -20°C até que fosse realizada a reação de PCR.
4.8.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
A seguinte solução foi colocada na reação de PCR: 0,2 µmol/L de cada dNTP, 50
mmol/L de KCl, 10 mmol/L de Tris-Cl (pH 8,3) e 1,5 mmol/L de MgCl
2
mais 2,5 U de DNA
polimerase termoestável (Taq polimerase, Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA) e 0,2
µmol/L de cada oligonucleotídeo iniciador (primer) sense e antisense.
53
Para estes experimentos, foram sintetizados primers específicos para os genes do
PCIII e do gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), utilizado como controle interno
positivo em todas as reações. Estes oligonucleotídeos possuem entre 18 a 30
nucleotídeos e composição de G-C entre 50-60%, sendo confeccionados com base na
seqüência dos genes em estudos já publicados no GeneBank (BETHESDA, MD, EUA),
como pode ser observado na tabela 2. Para evitar a amplificação inespecífica, os primers
sintetizados foram posicionados em diferentes exons. Desta forma, foi possível distinguir,
pelo tamanho, os produtos do PCR provenientes da amplificação do DNAc. As reações de
PCR foram realizadas em um termociclador GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer –
Norwalk. EUA).
Para o RNAm do PCIII de rato, um par de oligonucleotídeos (5’-
CTGCCATTGCTGGAGTTG-3’ e 5’-GCAGCCATCCTCTAGAAC-3’), correspondendo aos
nucleotídeos 903-920 e 1529-1546, respectivamente, foi sintetizado (nº de acesso ao
GeneBank AJ005395) (Tabela 2). A reação de PCR foi realizada com 36 ciclos de
desnaturação, (94°C, 1 min), anelamento (54°C, 1 min) e extensão (72°C, 1 min). O último
ciclo é seguido por uma extensão a 72°C por 10 min (Tabela 3). Na detecção do RNAm
para PCIII por PCR, primers de GAPDH de rato foram adicionados ao mesmo tubo da
reação de PCR e os produtos do GAPDH foram usados como controles internos. Os
primers do GAPDH preditos para amplificar um produto de PCR de 211 pb foram usados:
sense: 5’-GTCTTCACCACCATGGAG-3’; antisense: 5’-CGATGCCAAAGTTGTCATG-3’
(correspondendo, respectivamente, aos nucleotídeos 325–342 e 517–535 do gene de
GAPDH de rato, nº de acesso ao GeneBank M17701) (Tabela 2).
54
Tabela 2. Primers utilizados nas reações de PCR. A posição do primer e o tamanho
esperado dos produtos de amplificação são dados com base na seqüência de DNAc do
gene já clonado para rato (Thiermann 1992).
MOLÉCULA SEQÜÊNCIA DO PRIMER POSIÇÃO TAMANHO
GAPDH
Sense 5’ GTCTTCACCACCATGGAG 3’ 325–342 211 pb
Antisense 5’ CGATGCCAAAGTTGTCATG 3’ 517-535
PCIII
Sense 5’ CTGCCATTGCTGGAGTTG 3’ 903-920 643 pb
Antisense 5’ GCAGCCATCCTCTAGAAC 3’ 1529-1546
Definição das abreviações: GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase; PCIII =
procolágeno III; pb = pares de base.
Tabela 3. Descrição das condições da reação de PCR. As temperaturas e os tempos
utilizados nos 36 ciclos das etapas da reação da amplificação dos genes podem ser
observados.
CONDIÇÕES
PRIMER
Desnaturação Tempo Ligação Tempo Extensão Tempo Extensão Tempo
PCIII 94ºC 1 min 54ºC 1 min 72ºC 1 min 72ºC 10 min
GAPDH 94ºC 1 min 54ºC 1min 72ºC 1 min 72ºC 10 min
Definição das abreviações: GAPDH = gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase; PCIII =
procolágeno III.
Após a reação de PCR, 25 µL de cada amostra, correspondente aos grupos
experimentais, foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5 %. Todas as
reações incluíram um controle RT (-). A identificação da amplificação foi confirmada por
determinação do peso molecular na eletroforese em gel de agarose com 100 pb de
marcador molecular de DNA (Gibco BRL, Grand Island, NY, EUA).
O gene do GAPDH, por ser um gene abundantemente expresso em todas as
células e não sofrer variação da sua expressão com os diferentes estímulos utilizados no
presente trabalho, serviu como controle interno de todos os experimentos de RT-PCR.
55
Pares de oligonucleotídeos correspondentes ao GAPDH foram amplificados
conjuntamente com o PCIII nas reações de PCR realizadas.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos dados obtidos foi realizada no programa SigmaStat® para
Windows® (V 3.0). A normalidade dos dados (teste de Kolmogorov-Smirnov test correção
de Lilliefors) e a igualdade de variância (teste de mediana de Levene) foram testadas.
Quando os dados passaram nos testes acima, foram aplicados testes paramétricos, caso
contrário, testes não-paramétricos foram empregados. Diferenças entre as três situações
do mesmo grupo (PRE, IMM, POST) foram analisadas por Análise de Variância para
Amostras Repetidas seguido do teste Tukey. Para comparação entre duas situações do
mesmo grupo, como por exemplo, entre as situações PRE e POST do grupo F10, ou do
V
T
entre situações IMM e POST do grupo HPF10, o teste t-pareado foi usado. Os
parâmetros histológicos e de biologia molecular dos quatro grupos foram comparados por
Análise de Variância – One Way ANOVA ou One Way ANOVA on Ranks, seguido do
teste Tukey ou Dunn, respectivamente. Os parâmetros apresentados em forma percentual
foram submetidos à transformação arcoseno, a fim de tornar sua distribuição próxima ao
normal, permitindo, assim, a realização dos testes de variância (ZAR, 1996). Para análise
de correlação entre os dados da mecânica pulmonar e da microscopia de luz
(apresentados nos gráficos em forma percentual) utilizamos o teste de correlação de
Spearman. O grau de significância considerado foi de 5% (p<0,05). Os dados
paramétricos e não paramétricos foram expressos como média (desvio padrão) e
mediana (intervalo interquartil, percentil 25 a percentil 75), respectivamente.
56
RESULTADOS
57
5 RESULTADOS
5.1 MECÂNICA PULMONAR
A análise da mecânica pulmonar permitiu avaliar o comportamento funcional dos
animais submetidos à ventilação mecânica {Grupos F10 [V’ normal (10 mL/s)], F30 [V’ alto
(30 mL/s) e, conseqüentes, FR (200 irpm) e PIP (17 cmH
2
O) elevadas], LRRF30 [V’ alto
(30 mL/s) e FR normal (100 irpm)] e HPF10 [V’ normal (10 mL/s) e PIP alta (17 cmH
2
O)]}.
Os parâmetros da mecânica pulmonar basal (PRE) foram similares em todos os
grupos (Figura 8A e 8B e Tabela 4).
No grupo F10, a pressão de pico inspiratória pulmonar (PIP,L) (Figura 8A) não se
modificou após 2 horas de ventilação mecânica (POST), entretanto a pressão de platô
pulmonar (Pplat,L) apresentou um discreto aumento (15%) (Figura 8B).
No grupo F30, imediatamente após o ajuste do fluxo para 30 mL/s (IMM), houve
aumento da PIP,L (65%) (Figura 8A), sem alteração da Pplat,L (Figura 8B). Entretanto, ao
término de 2 h de ventilação mecânica (POST), os animais apresentaram piora da
mecânica pulmonar caracterizada pelo aumento de ambas as pressões, PIP,L (122% e
34% em relação a PRE e IMM, respectivamente) e Pplat,L (56% e 51% em relação a PRE
e IMM, respectivamente) (Figuras 8A e 8B).
O grupo LRRF30 (V’ alto e FR normal) apresentou um comportamento mecânico
pulmonar similar aquele observado no grupo F30, isto é, aumento da PIP,L (57%) (Figura
8A) sem alteração da Pplat,L (Figura 8B), imediatamente após o ajuste do protocolo
experimental (IMM), e um comprometimento da mecânica pulmonar caracterizado pelo
aumento de ambas as pressões, PIP,L (91% e 21% em relação a PRE e IMM,
58
respectivamente) e Pplat,L (60% e 47% em relação a PRE e IMM, respectivamente), ao
término de 2 h de ventilação mecânica (POST, Figuras 8A e 8B).
PIP,L (cmH
2
O)
0
6
12
18
24
30
PRE
IMM
POST
F10 F30 LRRF30 HPF10
*
*
**
*
*
#
#
A
Pplat,L (cmH
2
O)
0
3
6
9
12
15
PRE
IMM
POST
F10 F30 LRRF30 HPF10
*
*
*
*
#
#
B
*
Figura 8. Evolução temporal da pressão de pico inspiratória pulmonar [PIP,L (A)] e da
pressão de platô pulmonar [Pplat,L (B)] dos 4 grupos ventilados mecanicamente. F10 =
ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal (10 mL/s); F30 = ratos ventilados com V’
alto (30 mL/s) e, conseqüentes, freqüência respiratória (FR, 200 irpm) e pressão de pico
inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) elevadas; LRRF30 = ratos ventilados com V’ alto (30 mL/s) e
FR normal (100 irpm); HPF10 = ratos ventilados com V’ normal (10 mL/s) e PIP alta (17
cmH
2
O); PRE = modo ventilatório basal; IMM = imediatamente após o ajuste do protocolo
experimental; POST = ao término do período de 2 h de ventilação que seguiu o ajuste do
protocolo experimental. As barras correspondem às médias de 6 animais por grupo (+DP).
*Significativamente diferente de PRE (p<0,05). #Significativamente diferente de IMM
(p<0,05).
Os animais do grupo HPF10 (PIP alta e V’ normal) também apresentaram prejuízo
da mecânica pulmonar ao término de 2 h de ventilação mecânica, caracterizado por uma
59
redução significativa (p=0,001) do V
T
[de 3,27 ± 0,38 (IMM) para1,72 ± 0,29 mL (POST)]
para o mesmo valor de Pplat,L [10,09 ± 0,59 (IMM) e 10,29 ± 0,59 (POST)] (Tabela 4).
Tabela 4. Dados da mecânica pulmonar
ANIMAIS V’ (mL/s) V
T
(mL) PIP,L (cmH
2
O) Pplat,L (cmH
2
O)
F10 PRE POST PRE POST PRE POST PRE POST
1 9,97 9,98 2,00 2,05 8,99 10,42 5,39 6,87
2 10,00 10,01 2,01 2,06 8,69 8,99 5,86 6,23
3 9,91 10,00 1,92 1,97 9,39 10,50 5,70 7,42
4 10,00 9,99 1,97 1,94 10,24 10,06 6,06 6,49
5 10,00 10,01 2,00 2,02 9,76 10,16 6,44 7,04
6 10,04 10,01 2,10 2,11 9,86 10,12 6,58 6,97
Média
(DP)
9,99
(0,04)
10,00
(0,01)
2,00
(0,05)
2,02
(0,06)
9,49
(0,53)
10,04
(0,50)
6,01
(0,41)
6,84
(0,38)*
F30 PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST
1 10,00 28,00 29,95 1,98 1,96 2,01 9,52 13,60 17,41 6,05 6,23 10,06
2 10,00 29,98 29,83 1,98 2,08 2,11 10,78 16,81 19,27 6,56 5,48 8,85
3 10,01 29,57 29,95 1,99 2,01 2,08 7,99 14,35 18,05 3,71 4,46 9,76
4 10,00 29,94 29,80 2,13 2,18 2,06 9,56 13,56 16,28 6,11 5,80 6,45
5 10,02 30,08 31,32 2,13 2,09 2,18 8,37 15,50 29,60 5,01 5,70 8,50
6 10,00 29,97 29,98 1,87 1,95 1,92 9,02 17,50 22,12 5,58 6,36 7,76
Média
(DP)
10,00
(0,01)
29,59
(0,73)*
30,14
(0,53)*
2,01
(0,09)
2,05
(0,08)
2,06
(0,08)
9,21
(0,90)
15,22
(1,52)*
20,56
(4,48)*#
5,50
(0,94)
5,67
(0,62)
8,56
(1,21)*#
LRRF30 PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST
1 9,99 30,03 30,08 1,96 2,07 2,09 8,39 13,19 15,12 5,54 5,75 7,75
2 9,99 30,02 29,94 2,00 2,07 2,13 10,46 15,63 20,06 6,17 6,08 9,80
3 10,00 30,02 30,01 2,00 2,08 2,04 9,74 15,66 19,00 5,19 5,28 8,18
4 9,97 29,98 30,04 1,95 2,00 2,01 10,38 16,93 21,11 6,01 8,30 11,34
5 10,00 30,08 30,02 1,99 2,09 2,07 9,95 14,92 18,29 6,08 6,26 9,71
6 10,00 30,01 29,96 1,98 2,00 2,06 8,74 14,05 16,28 4,34 4,62 6,61
Média
(DP)
9,99
(0,01)
30,02*
(0,03)
30,01*
(0,05)
1,98
(0,02)
2,05
(0,04)
2,07
(0,04)
9,61
(0,79)
15,06
(1,21)*
18,31
(2,07)*#
5,56
(0,64)
6,05
(1,14)
8,90
(1,55)*#
HPF10 PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST PRE IMM POST
1 10,00 10,00 9,99 2,02 3,69 1,58 9,81 14,66 15,49 5,77 10,74 9,23
2 10,00 10,00 10,00 2,01 3,54 1,80 9,82 14,69 14,87 6,23 10,89 10,08
3 9,99 10,00 10,02 1,99 3,52 1,87 8,54 14,71 15,03 4,96 10,25 10,78
4 10,00 10,01 9,96 2,01 3,12 1,29 10,67 13,89 15,31 6,48 9,36 11,11
5 10,01 10,00 9,99 1,99 2,91 1,58 10,38 15,93 15,34 6,68 9,56 10,29
6 10,01 10,00 10,00 2,03 2,65 2,22 9,18 14,12 14,46 5,45 9,74 10,25
1,58
Média
(DP)
10,00
(0,01)
10,00
(0,00)
9,99
(0,02)
2,01
(0,02)
3,24*
(0,37)
1,72#
(0,29)
9,73
(0,71)
14,67
(0,65)*
15,08
(0,35)*
5,93
(0,60)
10,09
(0,58)*
10,29
(0,59)*
Os valores são a média de 10 ciclos por animal. Definições das abreviaturas: F10 = ratos
ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal (10 mL/s); F30 = ratos ventilados com V’ alto (30
mL/s) e, conseqüentes, freqüência respiratória (FR, 200 irpm) e pressão de pico inspiratória (PIP,
17 cmH
2
O) elevadas; LRRF30 = ratos ventilados com V’ alto (30 mL/s) e FR normal (100 irpm);
HPF10 = ratos ventilados com V’ normal (10 mL/s) e PIP alta (17 cmH
2
O). PRE = modo
ventilatório basal; IMM = imediatamente após o ajuste do protocolo experimental; POST = ao
término do período de 2 h de ventilação que se seguiu ao ajuste do protocolo experimental.
*Significativamente diferente de PRE (p<0,05). #Significativamente diferente de IMM (p<0,05).
60
5.2 HISTOLOGIA PULMONAR
A análise histológica do parênquima pulmonar, realizada através da microscopia de
luz e eletrônica, permitiu caracterizar o comportamento morfológico pulmonar dos cinco
diferentes grupos {CTRL (animais não submetidos à ventilação mecânica), F10 [V’ normal
(10 mL/s)], F30 [V’ alto (30 mL/s) e, conseqüentes, FR (200 irpm) e PIP (17 cmH
2
O)
elevadas], LRRF30 [V’ alto (30 mL/s) e FR normal (100 irpm)] e HPF10 [V’ normal (10
mL/s) e PIP alta (17 cmH
2
O)]}.
5.2.1 M
ICROSCOPIA DE LUZ
O grupo F10 apresentou um discreto aumento do percentual de colapso alveolar,
em relação ao grupo CTRL. Os percentuais das áreas de alvéolos normais e
hiperinsuflados não diferiram significativamente daqueles do grupo CTRL (Tabela 5).
Em contraste, o grupo F30 apresentou uma arquitetura do parênquima pulmonar
bastante inomogênea, caracterizada por aumento do percentual de áreas de
hiperinsuflação e colapso alveolares, em relação aos grupos CTRL e F10 (Tabela 5).
A redução da FR no grupo LRRF30, não evitou as modificações da arquitetura
pulmonar determinadas pelo V’ alto. Logo, os animais ventilados com V’ elevado e FR
normal (grupo LRRF30) também apresentaram aumento do percentual de áreas de
hiperinsuflação e colapso alveolares, em relação aos grupos CTRL e F10 (Tabela 5).
Adicionalmente, PIP elevada (17 cmH
2
O), por si só, acarretou danos ao
parênquima pulmonar. Os animais do grupo HPF10 (PIP alta e V’ normal) apresentaram
aumento significativo da fração de área de colapso alveolar, em relação aos grupos CTRL
e F10 (Tabela 5).
61
Tabela 5. Parâmetros da morfometria pulmonar
Grupos Área Normal
(%)
Hiperinsuflação Alveolar
(%)
Colapso Alveolar
(%)
CTRL 98,9 (98,4-99,5) 0,0 (0,0-0,0) 1,1 (0,5-1,6)
F10 98,2 (97,9-99,0) 0,0 (0,0-0,0) 1,8 (1,0-2,2) *
F30 43,6 (37,6-55,8) * # 23,4 (13,9-36,0) * # 30,1 (26,4-31,0) * #
LRRF30 46,3 (43,8-50,7) * # 16,5 (14,1-18,4) * # 37,2 (36,5-37,8) * # ¥
HPF10 72,4 (66,9-74,7) * # ¥ & 0,0 (0,0-1,43) ¥ & 27,6 (25,3-29,8) * # &
Os valores são a mediana (intervalo interquartil, percentil 25 a percentil 75) de 6 animais
por grupo. Foram analisados 10 campos, não-coincidentes e aleatórios por animal.
Definições das abreviaturas: CTRL = animais não submetidos à ventilação mecânica; F10
= ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de 10 mL/s; F30 = animais ventilados
com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de pico inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) e
freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas; LRRF30 = ratos ventilados com V’ alto de
30 mL/s e FR normal de 100 irpm; HPF10 = animais ventilados com V’ normal de 10 mL/s
e PIP alta de 17 cmH
2
O. *Significativamente diferente do grupo CTRL (p<0,05).
#Significativamente diferente do grupo F10 (p<0,05). ¥Significativamente diferente do
grupo F30 (p<0,05). & Significativamente diferente do grupo LRRF30 (p<0,05).
A figura 9 permite uma visualização da arquitetura geral do parênquima pulmonar
dos grupos experimentais. Pode-se observar nos animais ventilados com fluxo inspiratório
normal (F10) um parênquima muito semelhante aquele dos animais controles, não
submetidos à ventilação mecânica (CTRL), com pequenas áreas de colapso (∗).
Entretanto, os animais ventilados com fluxo aéreo alto (F30) apresentaram um
parênquima pulmonar muito heterogêneo, caracterizado por áreas de colapso (∗) e
hiperinsuflação (#) alveolar. A redução da freqüência respiratória em presença de fluxo
inspiratório elevado (LRRF30), não protegeu os animais do dano histológico, que também
apresentaram colapso (∗) e hiperinsuflação (#) alveolares. A pressão de pico inspiratória
elevada pode ter contribuído em parte para o dano histológico observado, uma vez que os
animais ventilados com PIP alta (HPF10) apresentaram muitas áreas de colapso alveolar
(∗).
62
Figura 9. Fotomicrografias do parênquima pulmonar, representativas da arquitetura
alveolar. Definições das abreviaturas: CTRL = animais não submetidos à ventilação
mecânica; F10 = ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de 10 mL/s; F30 =
animais ventilados com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de pico inspiratória
(PIP, 17 cmH
2
O) e freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas; LRRF30 = ratos
ventilados com V’ alto de 30 mL/s e FR normal de 100 irpm; HPF10 = animais ventilados
com V’ normal de 10 mL/s e PIP alta de 17 cmH
2
O. (∗) colapso alveolar; (#)
hiperinsuflação alveolar. Aumento 200x.
100
µ
m
100
µ
m
100 µm
100
µ
m 100 µm
HPF10
LRRF30 F30
CTRL
F10
∗
∗
∗
∗
∗
∗
∗
∗
∗
∗
#
#
#
#
#
#
63
Complementarmente, a análise histológica do parênquima pulmonar demonstrou
que a celularidade total foi similar nos cinco grupos. Entretanto, constatou-se uma
predominância de células polimorfonucleares no parênquima pulmonar dos animais dos
grupos F30, diferindo significativamente dos grupos CTRL e F10. A redução da FR não
mudou esse comportamento, de forma que o grupo LRRF30 não diferiu significativamente
do grupo F30. Os animais ventilados com PIP alta também apresentaram uma
predominância de células polimorfonucleares (Tabela 6).
Tabela 6. Dados da celularidade total e diferencial
Grupos PMN/Tecido (%) MN/Tecido (%) TOT/Tecido
CTRL 2,4 (2,2-2,6) 26,2 (25,1-28,9) 29,2 (27,1-31,4)
F10 2,5 (1,8-2,8) 28,6 (27,8-29,3) 31,0 (30,6-31,3)
F30 9,9 (6,5-15,4) * # 17,7 (15,8-20,8) * # 30,8 (24,2-31,7)
LRRF30 6,1 (5,5-8,9) * # 20,2 (18,8-21,0) * # 26,9 (25,3-29,6)
HPF10 4,5 (4,2-4,7) * # 24,8 (20,6-27,9) ¥ 29,4 (25,1-31,8)
Os valores são a mediana (intervalo interquartil, percentil 25 a percentil 75) de 6 animais
por grupo. Foram analisados 10 campos, não-coincidentes e aleatórios por animal.
Definições das abreviaturas: CTRL = animais não submetidos à ventilação mecânica; F10
= ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de 10 mL/s; F30 = animais ventilados
com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de pico inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) e
freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas; LRRF30 = ratos ventilados com V’ alto de
30 mL/s e FR normal de 100 irpm; HPF10 = animais ventilados com V’ normal de 10 mL/s
e PIP alta de 17 cmH
2
O. *Significativamente diferente do grupo CTRL (p<0,05).
#Significativamente diferente do grupo F10 (p<0,05). ¥Significativamente diferente do
grupo F30 (p<0,05).
A figura 10 permite uma visualização do comportamento inflamatório do
parênquima pulmonar dos grupos experimentais. Os animais não submetidos à ventilação
mecânica (CTRL) e aqueles ventilados com fluxo inspiratório normal (F10) não
apresentaram processo inflamatório no parênquima pulmonar. Entretanto, os grupos
ventilados com fluxo inspiratório elevado (F30 e LRRF30) e pressão de pico inspiratória
64
alta (HPF10) apresentaram um aumento do conteúdo tecidual de células
polimorfonucleares (PMN).
F10
10 µm
F10
10 µm10 µm
10 µm
F30
10 µm10 µm
F30
10 µm
LRRF30
10 µm10 µm
LRRF30
HPF10
10 µm
HPF10
10 µm
Figura 10. Fotomicrografias do parênquima pulmonar, representativas do processo
inflamatório. Definições das abreviaturas: CTRL = animais não submetidos à ventilação
mecânica; F10 = ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de 10 mL/s; F30 =
animais ventilados com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de pico inspiratória
(PIP, 17 cmH
2
O) e freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas; LRRF30 = ratos
ventilados com V’ alto (30 mL/s) e FR normal (100 irpm); HPF10 = animais ventilados com
V’ normal (10 mL/s) e PIP alta (17 cmH
2
O); PMN = célula polimorfonuclear; MN = célula
mononuclear. Aumento 1000x.
MN
MN
PMN
PMN
PMN
65
A microscopia de luz dos animais ventilados com fluxo alto também possibilitou a
observação de edema intersticial (ED), facilmente visualizado na região
peribroncovascular (Figura 11) e descamação do epitélio das vias aéreas (setas, Figuras
12A e 12B).
Figura 11. Fotomicrografia do parênquima pulmonar, representativa do edema
peribroncovascular (ED) do grupo F30 (animais ventilados com V’ de 30 mL/s). Aumento
200x.
Figura 12. Fotomicrografias da via aérea do grupo F30 (animais ventilados com V’ alto de
30 mL/s), representativa da descamação do epitélio (setas). Aumento 400x (A) e 1000x (B).
5.2.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
∗
ED
A
B
66
As fotomicrografias da microscopia eletrônica de transmissão dos cortes de
parênquima pulmonar do grupo CTRL, animais não submetidos à ventilação mecânica,
revelaram um pulmão normal com estruturas e células alveolares dos tipos I (AT1) e II
(AT2) íntegras (Figuras 13A e 13B), macrófago alveolar residente (mφ, Figura 13A),
fibroblasto (Figura 13C), membrana alvéolo-capilar de espessura normal e membranas
epitelial (EP), endotelial (EN) e basal (MB) preservadas (Figura 13C).
1000 nm1000 nm
←
AT2
AT1
→
B
1 µm1 µm
←
AT2
AT2
↓
AT1
↓
C
A
A
m
φ
A
500 nm500 nm
COL
→
←
MB
←
F
A
EN
→
←
EN
EP
→
EC
←
MB
C
Figura 13. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do grupo CTRL,
isto é, ratos não submetidos à ventilação mecânica. Definições das abreviaturas:
macrófago alveolar (mφ); capilar (C); luz alveolar (A); célula alveolar tipo I (AT1); célula
alveolar tipo II (AT2); epitélio alveolar (EP); endotélio (EN); membrana basal (MB);
eritrócito (EC); fibras colágenas (COL); fibroblastos (F).
Em consonância com o grupo CTRL, as fotomicrografias da microscopia eletrônica
de transmissão dos cortes de parênquima pulmonar do grupo F10 (V’ normal) exibiram
novamente um parênquima pulmonar normal, com célula alveolar do tipo II (AT2) íntegra
67
apresentando microvilos (M) e corpos lamelares (CL) preservados (Figura 14A),
membrana basal intacta (MB, Figuras 14A e 14B) e fibras de colágenas (COL) e elásticas
(EL) intersticiais normais (Figuras 14A e 14B).
500 nm
A
EC
←
MB
COL
↓
AT2
←
EL
500 nm
MB
→
C
A
←
COL
I
B
AT2
EL
→
←
EP
A
Figura 14. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do grupo F10, isto
é, animais ventilados por 2 h com V’ de 10 mL/s. Definições das abreviaturas: luz alveolar
(A); célula alveolar tipo II (AT2); epitélio alveolar (EP); membrana basal (MB); eritrócito
(EC); fibras colágenas (COL); fibras elásticas (EL); capilar (C); microvilos (M); corpo
lamelar (CL).
Entretanto, no grupo F30 (V’ alto), as fotomicrografias da microscopia eletrônica de
transmissão dos cortes de tecido pulmonar demonstraram um parênquima pulmonar
bastante comprometido. Houve perda da integridade estrutural de células alveolares do
tipo II (AT2, Figura 15A), ruptura do epitélio alveolar (REP, Figura 15B), neutrófilo (N) na
luz alveolar (Figura 15B), formação de membrana hialina (HM, Figuras 15B, 15C, 15D),
edema intersticial (ED, Figuras 15B, 15C e15 D) e uma maior presença de fibroblastos (F,
Figuras 15B, 15C e 15D).
← M
↓
← CL
68
500
nm
500
nm
500
nm
500 nm
500
nm
AT2
↓
m
φ
↓
F
↓
←
F
↑
COL
HM
→
ED
N
↓
←
REP
ED
COL
→
←
HM
F
→
↑
F
←
HM
ED
↑
COL
A
B
D
C
Figura 15. Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão do grupo F30, ratos
ventilados por 2 h com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, PIP (17 cmH
2
O) e FR (200
irpm) elevadas. Definições das abreviaturas: célula alveolar tipo II (AT2); macrófago
alveolar (mφ); neutrófilo (N); fibroblasto (F); membrana hialina (HM); ruptura do epitélio
alveolar (REP); edema (ED); fibras de colágeno intersticiais (COL).
Esses resultados demonstraram que a alteração da mecânica pulmonar induzida
pela ventilação mecânica com fluxo inspiratório elevado foi acompanhada de alterações
ultraestruturais do parênquima pulmonar.
5.3 CORRELAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS DA MECÂNICA E DA MORFOMETRIA PULMONARES
Como previamente descrito, a fim de quantificar a correlação entre os achados
funcionais e morfológicos pulmonares foi realizada uma análise estatística utilizando-se o
teste de correlação de Spearman.
69
A figura 16 mostra a correlação entre os parâmetros da mecânica pulmonar e as
frações de colapso e hiperinsuflação alveolares dos grupos F10, F30 e LRRF30. Foi
observada uma correlação significativa entre os valores de PIP,L e as frações de área de
colapso e hiperinsuflação alveolares (Figuras 16A e 16B, respectivamente). Não houve
correlação entre a Pplat,L e as frações de área de colapso e hiperinsuflação (Tabela 7). A
redução da freqüência, não alterou a correlação entres os parâmetros mecânicos e
histológicos (Tabela7 e Figura 16).
Hiperinsuflação Alveolar (%)
-10 0 10 20 30 40
PIP,L (cmH
2
O)
0
10
20
30
40
Colapso Alveolar (%)
-10 0 10 20 30 40
PIP,L (cmH
2
O)
0
10
20
30
40
r = 0,769
p < 0,001
r = 0,600
p = 0,009
A
B
F10
F30
LRRF30
F10
F30
LRRF30
Figura 16. Correlações entre os valores de pressão de pico inspiratória pulmonar (PIP,L)
e as frações de área de hiperinsuflação (A) e colapso alveolares (B) dos grupos F10 [fluxo
inspiratório (V’) normal (10 mL/s) e FR normal (100 irpm)], F30 [V’ alto (30 mL/s) e FR alta
(200 irpm)] e LRRF30 [V’ alto (30 mL/s) e FR normal (100 irpm)].
70
Tabela 7. Correlações entre os valores de mecânica e morfometria pulmonares.
Grupos
Correlacionados
Hiperinsuflação
Alveolar
(%)
Colapso Alveolar
(%)
F10 & F30 & LRRF30 PIP,L (cmH
2
O) r = 0,769
p < 0,001
r = 0,600
p = 0,009
Pplat,L (cmH
2
O) r = 0,432
p = 0,071
r = 0,408
p = 0,091
F10 & F30 & HPF10 PIP,L (cmH
2
O) r = 0,793
p < 0,001
r = 0,701
p < 0,001
Pplat,L (cmH
2
O) r = 0,078
p = 0,754
r = 0,509
p = 0,031
Definições das abreviaturas: F10 = ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de
10 mL/s; F30 = animais ventilados com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de
pico inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) e freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas;
LRRF30 = ratos ventilados com V’ alto (30 mL/s) e FR normal (100 irpm); HPF10 =
animais ventilados com V’ normal (10 mL/s) e PIP alta (17 cmH
2
O).
A figura 17 mostra a correlação entre os parâmetros da mecânica pulmonar e as
frações de área de colapso e hiperinsuflação alveolar dos grupos F10, F30 e HPF10. A
despeito de ter ocorrido correlação significativa entre a PIP,L e a fração de área de
colapso (Figura 17A), observou-se que esta se relacionou ao aumento do fluxo aéreo. No
entanto, com o aumento da PIP para 17 cmH
2
O, em presença do fluxo normal ou elevado,
houve uma correlação significativa dos valores de PIP,L e Pplat,L com a fração de área
de colapso alveolar (Tabela 7 e Figuras 17B e 17C).
71
Hiperinsuflação Alveolar (%)
-10 0 10 20 30 40 50
PIP,L (cmH
2
O)
0
10
20
30
40
Colapso Alveolar (%)
-10 0 10 20 30 40 50
PIP,L (cmH
2
O)
0
10
20
30
40
r = 0,793
p < 0,001
r = 0,701
p = 0,001
A
B
F10
F30
HPF10
F10
F30
HPF10
Colapso Alveolar (%)
-10 0 10 20 30 40 50
Pplat,L (cmH
2
O)
0
4
8
12
16
20
C
r = 0,509
p = 0,031
F10
F30
HPF10
Figura 17. Correlações entre os valores de pressão de pico inspiratória pulmonar (PIP,L)
e pressão de platô pulmonar (Pplat,L) e as frações de área de colapso alveolar (A e B,
respectivamente) dos grupos F10 [fluxo inspiratório (V’) normal (10 mL/s)], F30 [V’ alto (30
mL/s)] e HPF10 [V’ normal (10 mL/s) e pressão de pico inspiratória alta (17 cmH
2
O)].
72
5.4 RT-PCR SEMIQUANTITATIVO
A análise da expressão de RNAm para PCIII no tecido pulmonar dos diferentes
grupos permitiu avaliar se o estímulo mecânico induzido pelo fluxo inspiratório elevado
poderia alterar a expressão gênica da matriz extracelular pulmonar.
O resultados demonstraram que a expressão de RNAm para PCIII foi similar entre
os grupos CTRL e F10 (V’ normal). Entretanto, houve aumento significativo do conteúdo
tecidual de RNAm para PCIII no grupo F30 (V’ alto), em relação aos grupos CTRL e F10.
Em consonância com os dados anteriores, a despeito da redução da FR, o grupo LRRF30
(V’ alto e FR normal) apresentou um conteúdo de RNAm para PCIII aumentado em
relação aos grupos CTRL e F10, não diferindo significativamente do grupo F30. Além
disso, a PIP alta, por si só, também não alterou a expressão de RNAm para PCIII no
parênquima pulmonar (Figura 18 e Tabela 8).
73
Figure 18. Expressão de RNAm para procolágeno tipo III (PCIII) dos 5 grupos (método de
RT-PCR semiquantitativo). CTRL = ratos não submetidos à ventilação mecânica; F10 =
ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal (10 mL/s); F30 = ratos ventilados com V’
alto (30 mL/s) e, conseqüentes, freqüência respiratória (FR, 200 irpm) e pressão de pico
inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) elevadas; LRRF30 = ratos ventilados com FR normal (100
irpm) e V’ alto (30 mL/s); HPF10 = ratos ventilados com PIP alta (17 cmH
2
O) e V’ normal
(10 mL/s). Os valores são a média (+DP) de 3 experimentos independentes. A expressão
de RNAm para PCIII foi representada pela relação entre a intensidade das bandas de
PCIII e gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), ambos originados do mesmo
tubo de reação. Todos as reações incluíram um controle negativo RT(-).
*Significativamente diferente do grupo controle (p<0,001).
74
Tabela 8. Dados da análise de RNAm para procolágeno tipo III (método de RT-PCR
semiquantitativo)
ANIMAIS CTRL F10 F30 LRRF30 HPF10
1 1 0,84 2,21 2,03 0,82
2 1 0,76 1,43 1,66 0,76
3 1 1,03 2,13 1,73 1
Média (DP) 1,00 (0,00) 0,88 (0,14) 1,92 (0,43)* 1,81 (0,20)* 0,86 (0,13)
Os valores correspondem à relação entre a intensidade das bandas de PCIII [PCIII (643
pb)] e gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase [GAPDH (211 pb)], ambos originados do
mesmo tubo de reação. Definições das abreviaturas: CTRL = animais não submetidos à
ventilação mecânica; F10 = ratos ventilados com fluxo inspiratório (V’) normal de 10 mL/s;
F30 = animais ventilados com V’ alto de 30 mL/s e, conseqüentes, pressão de pico
inspiratória (PIP, 17 cmH
2
O) e freqüência respiratória (FR, 200 irpm) elevadas; LRRF30 =
ratos ventilados com V’ alto de 30 mL/s e FR normal de 100 irpm; HPF10 = animais
ventilados com V’ normal de 10 mL/s e PIP alta de 17 cmH
2
O. *Significativamente
diferente do grupo CTRL (p<0,001).
75
DISCUSSÃO
76
6 DISCUSSÃO
O presente estudo demonstrou que a ventilação mecânica com fluxo aéreo
inspiratório elevado pode contribuir para o desenvolvimento da VILI, por acarretar
estresse mecânico ao tecido pulmonar, resultando em comprometimento mecânico e
ultraestrutural pulmonar e alteração da expressão tecidual de RNAm para procolágeno
tipo III.
Uma variedade de estudos experimentais e clínicos tem demonstrado que as
forças geradas pela ventilação mecânica podem ser perigosas para o pulmão, resultando
na propagação da lesão pulmonar subjacente e/ou geração de uma nova lesão, isto é,
VILI (DREYFUSS & SAUMON, 1998; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006). O
reconhecimento da VILI ocorreu a partir de 1974 (WEBB & TIERNEY, 1974), e a sua
significância clínica para o prognóstico dos pacientes tornou-se clara quando o National
Institute of Health - apoiado pelo estudo do Acute Respiratory Distress Syndrome Network
que analisou 861 pacientes e constatou redução da mortalidade de 40% para 31%
quando a pressão de platô foi limitada em 30 cmH
2
O e o volume corrente reduzido de 12
mL/Kg para 6 mL/kg (THE ACUTE RESPIRATORY DISTRESS SYNDROME NETWORK,
2000).
As alterações morfofuncionais descritas na VILI são inespecíficas, não diferindo
substancialmente daquelas encontradas na SDRA (WEBB & TIERNEY, 1974;
DREYFUSS et al., 1985; KOLOBOW et al., 1987; DREYFUSS et al., 1988; TSUNO et al.,
1991; DREYFUSS et al., 1992). Neste contexto, a utilização de animais normais para
determinação do papel de um parâmetro ventilatório na fisiopatologia da VILI faz-se
essencial. O próprio reconhecimento da VILI só ocorreu após o primeiro estudo em
animais intactos submetidos à ventilação mecânica com pressão de pico alta (WEBB &
77
TIERNEY, 1974). Dessa forma, para excluir alterações morfofuncionais de lesões
pulmonares subjacentes, no presente estudo, foram utilizados ratos Wistar machos
normais. Os animais que eventualmente apresentavam secreção nas vias aéreas e/ou
alteração na mecânica respiratória no início do experimento foram excluídos. Os
parâmetros da mecânica respiratória foram similares em todos os grupos antes do início
do protocolo experimental (Tabela 4 e Figura 8). Alguns estudos prévios acerca dos
efeitos adversos da ventilação mecânica com fluxo inspiratório elevado fizeram uso de
estratégias ventilatórias lesivas, não isolando o dano estrutural induzido pelo fluxo das
lesões pulmonares subjacentes (PEEVY et al., 1990; RICH et al., 2000; D’ANGELO et al.,
2004; KOTANI et al., 2004). A significância do fluxo inspiratório foi avaliada em modelos
de VILI por barotrauma (PEEVY et al., 1990; RICH et al., 2000), atelectrauma (D’ANGELO
et al., 2004) e volutrauma (MAEDA et al., 2004).
O estudo do papel do fluxo aéreo inspiratório na fisiopatologia da VILI é um grande
desafio, já que o aumento do fluxo aéreo acarreta alterações de outras variáveis, tais
como freqüência respiratória e pressão de pico inspiratória. O aumento do fluxo
inspiratório, com a relação I:E mantida em 1:2, proporciona um aumento da FR. O fluxo
aéreo alto também acarreta uma PIP elevada (KOTANI et al., 2004; MAEDA et al., 2004).
No presente estudo, o aumento do fluxo aéreo acarretou alterações na FR e na PIP
(Tabelas 1 e 4; Figura 8).
Em 1974, Webb e Tierney, em um estudo com animais intactos, demonstraram que
a ventilação mecânica com pressão de pico alta poderia danificar gravemente o pulmão.
Inúmeros estudos subseqüentes também demonstraram o dano alveolar difuso induzido
pela pressão de pico inspiratória elevada (DREYFUSS et al., 1985; KOLOBOW et al.,
1987; DREYFUSS et al., 1988; PARKER et al., 1990). Na tentativa de isolar as alterações
78
morfofuncionais observadas nos animais ventilados com fluxo inspiratório alto dos efeitos
adversos da conseqüente PIP elevada, experimentos adicionais foram realizados. A idéia
inicial seria ventilar os animais com um fluxo inspiratório alto de 30 mL/s, não permitindo
que a PIP ultrapassasse 12 cmH
2
O. Para isso, foi utilizado um respirador adaptado para
pequenos animais que apresentasse o modo ventilatório com limite de pressão.
Entretanto, na presença de um fluxo inspiratório tão elevado, o equipamento não
conseguiu limitar a PIP. Por conseguinte, foi realizado um grupo experimental ventilado
com a mesma PIP dos animais ventilados com fluxo alto para avaliar as alterações
morfofuncionais e biomoleculares induzidas pela PIP elevada. Ao término de 2 horas de
ventilação mecânica com PIP de 17 cmH
2
O (e um fluxo normal de 10 mL/s), a análise
histológica do parênquima pulmonar do grupo HPF10 confirmou a ocorrência de colapso
alveolar induzido pela ventilação mecânica com pressão de pico elevada. A presença de
colapso alveolar após a ventilação mecânica com PIP alta foi previamente descrita por
Tsuno et al. (1991). Uma vez que os animais estavam sendo ventilados com limite de
pressão, o comprometimento da mecânica pulmonar foi caracterizado por uma redução
significativa do volume corrente para um mesmo valor de pressão de platô pulmonar
(Tabela 4). Nos estudos prévios acerca do papel do fluxo aéreo na fisiopatologia da VILI,
não houve controle da PIP, que também se mostrou elevada com o aumento do fluxo
inspiratório (KOTANI et al., 2004; MAEDA et al., 2004) ou em virtude da estratégia
ventilatória lesiva adotada (PEEVY et al., 1990; RICH et al., 2000).
A VILI ocorre em função, não somente da intensidade do estresse tecidual
pulmonar aplicado (pressão de pico inspiratória e/ou volume corrente), mas também da
freqüência do estresse mecânico cíclico (i.e., da freqüência respiratória) (CONRAD et al.,
2005). De fato, a freqüência respiratória (FR) pode modular a VILI (HOTCHKISS et al.,
79
2000; CONRAD et al., 2005). A FR alta pode induzir lesão pulmonar por elevar a
intensidade do estresse de cisalhamento através de insuflações rápidas, reduzindo o
número de ciclos necessários para que ocorra a falência tecidual (CONRAD et al., 2005).
A relevância da FR faz-se ainda mais evidente em presença de estratégia ventilatória
lesiva (HOTCHKISS et al., 2000; CONRAD et al., 2005). Neste contexto, outros 6 animais
foram ventilados com os mesmos 30 mL/s de V’ e uma FR de 100 irpm, similar ao grupo
ventilado com fluxo aéreo normal (F10). A redução da FR não protegeu o pulmão dos
danos funcionais (Tabela 4 e Figura 8) e morfológicos (Tabela 5 e Figura 9), nem da
ocorrência do processo inflamatório (Tabela 6 e Figura 10) induzido pelo fluxo inspiratório
alto. O mesmo resultado pôde ser observado no estudo de Rich et al. (2000), que avaliou
o efeito da redução da freqüência respiratória e do fluxo inspiratório no desenvolvimento
da lesão pulmonar induzida pela ventilação mecânica com PIP alta (50 cmH
2
O). Neste
estudo, a diminuição da FR também não reduziu a lesão, ao passo que, a limitação do
fluxo aéreo acarretou um menor grau de shunt pulmonar, lesão histológica, infiltração
neutrofílica e edema pulmonar. Esses achados, juntamente com os nossos, levam-nos a
crer que a intensidade do estresse tecidual pulmonar induzido pelo fluxo inspiratório alto,
por si só, é suficiente para determinar a ocorrência da VILI.
Uma das principais alterações morfológicas determinadas pela VILI é o
desenvolvimento do edema pulmonar. Estudos de microscopia de luz demonstraram a
presença de edemas intersticial e alveolar após a ventilação mecânica com pressão de
pico elevada (DREYFUSS et al., 1985; WEBB & TIERNEY, 1974). O grau do edema
variou com a intensidade da pressão de pico (WEBB & TIERNEY, 1974) e a duração de
ventilação mecânica (DREYFUSS et al., 1988). Inicialmente, o edema é confinado ao
espaço intersticial e visualizado nas regiões peribroncovasculares (STAUB et al., 1967;
80
STAUB, 1974). No presente estudo, a microscopia de luz do grupo F30 confirmou a
presença de edema intersticial facilmente visualizado no espaço peribrocovascular (Figura
11). A análise por microscopia eletrônica de transmissão do parênquima pulmonar dos
animais ventilados com fluxo alto mostrou a presença de edema intersticial pulmonar
(Figura 15, B, C e D). O aumento da permeabilidade alvéolo-capilar parece ser um
mecanismo importante na fisiopatologia do edema pulmonar induzido pelo ventilador.
Alterações nas permeabilidades das barreiras epitelial e endotelial foram relatadas por
inúmeros estudos experimentais (PARKER et al., 1984; HERNADEZ et al., 1989;
DREYFUSS et al., 1985; PARKER et al., 1990; CARLTON et al., 1990). Análises
ultraestruturais do parênquima pulmonar por microscopia eletrônica mostraram
anormalidades epiteliais e endoteliais graves compatíveis com o incremento da
permeabilidade (JOHN et al., 1982; DREYFUSS et al., 1985, 1988, 1992; BEHNIA et al.,
1996). No presente estudo, as eletromicrografias confirmaram a presença de lesão da
barreira alvéolo-capilar (Figura 15) após a ventilação mecânica com fluxo aéreo alto (30
mL/s), favorecendo o desenvolvimento do edema intersticial (Figura 15, B, C e D).
Fluxos inspiratórios altos proporcionam níveis elevados de estresse de
cisalhamento (NUCCI et al., 2003). O estresse de cisalhamento acarretado pelo fluxo
aéreo alto nas pequenas vias aéreas pode causar dano as células epiteliais das vias
aéreas (NUCCI et al., 2003). No presente estudo, a análise histológica também
possibilitou a observação da descamação do epitélio das vias aéreas induzida pela
ventilação mecânica com fluxo alto (Figura 12, A e B).
Estratégias ventilatórias lesivas também proporcionam uma desestruturação do
sistema de surfactante (VELDHUIZEN et al., 1995). O surfactante é um líquido de
composição protéica e, principalmente, fosfolipídica, secretado pelas células alveolares do
81
tipo II, responsável pela redução da tensão superficial e manutenção dos alvéolos abertos
e secos. Nestas células, parte do conteúdo de surfactante produzido fica armazenada em
organelas, conhecidas como corpos lamelares. No presente estudo, as células alveolares
do tipo II apresentaram perda da sua integridade naqueles animais submetidos à
ventilação mecânica com fluxo alto, caracterizada pelo desaparecimento das
microvilosidades e pela alteração dos corpos lamelares (Figura 15A).
Dentre os achados histológicos característicos da VILI, está a presença de colapso
alveolar (WEBB & TIERNEY, 1974; KOLOBOW et al., 1987, TSUNO et al., 1990; TSUNO
et al., 1991). Os animais ventilados com fluxo inspiratório elevado apresentaram áreas de
colapso alveolares associadas a áreas de hiperinsuflação (Tabela 5 e Figura 9). Tais
achados podem ser justificados pelo tempo de enchimento pulmonar muito curto
favorecendo a insuflação rápida dos alvéolos mais complacentes, que apresentam uma
constante de tempo mais curta, proporcionando sua hiperdistensão e o colapso de
unidades alveolares adjacentes. Não podemos também descartar uma eventual disfunção
do surfactante por lesão da célula alveolar do tipo II (Figura 15A) aumentando a tensão
superficial e induzindo colapso alveolar. Os animais ventilados com fluxo normal por duas
horas também apresentaram, porém em uma menor proporção, a ocorrência de colapso
alveolar. Isto se justifica pelo longo tempo de ventilação mecânica sem a administração
de uma pressão positiva ao final da expiração. Nesse contexto, estudos prévios
demonstraram que a ventilação mecânica prolongada sem o auxílio de PEEP acarreta
colapso alveolar (GREENFIELD et al., 1964; SQUARTINI & PINGITORE, 1978; CHATILA
& CRINER, 2002).
A ventilação mecânica também apresenta efeitos significativos sobre o conteúdo de
células inflamatórias nos pulmões e de mediadores solúveis (por exemplo, citocinas)
82
pulmonares e sistêmicos, um processo denominado biotrauma (TREMBLAY & SLUTSKY,
1998). As células inflamatórias contribuem para a gênese da VILI (WOO & HEDLEY-
WHITE, 1972; IMAI et al., 1994; NARIMANBEKOV & ROZYCKI, 1995; TAKATA et al.,
1997; IMAI et al., 1999). Woo & Hedley-White demonstraram que a hiperinsuflação
pulmonar produz acúmulo de leucócitos na micro-circulação pulmonar e de macrófagos
nos alvéolos (WOO & HEDLEY-WHITE, 1972). Uma estratégia ventilatória lesiva também
pode induzir ativação e infiltração neutrofílica (TSUNO et al., 1991; SUGIURA et al.,
1994). No presente estudo, foi observado um predomínio de células polimorfonucleares
no parênquima pulmonar dos animais ventilados com fluxo inspiratório elevado (Tabela 6
e Figura 10). A análise do tecido pulmonar dos animais ventilados com fluxo alto por
microscopia eletrônica também demonstrou infiltração neutrofílica na luz do alvéolo
(Figura 15B). Provavelmente, a ruptura da barreira alvéolo-capilar (Figura 15D) favoreceu
a infiltração neutrofílica (Figuras 15B). Previamente, foi demonstrado que a lesão da
barreira endotelial contribuiu para a infiltração neutrofílica após a ventilação mecânica
com PIP elevada (DREYFUSS & SAUMON, 1994). O efeito prejudicial deste evento foi
confirmado pela ocorrência de dano alveolar menos grave em coelhos com depleção
neutrofílica, em relação aos animais sem depleção (KAWANO et al., 1987).
No contexto da resposta celular ao estresse mecânico, faz-se importante ressaltar
que o pulmão é como um balão que requer um estresse de distensão gerado
externamente para manter o seu estado de insuflação (MEAD et al., 1970; LAI-FOOK et
al., 1976; WILSON & BACHOFEN, 1982; KIMMEL et al., 1987; KIMMEL & BUDIANSKY,
1990). Durante a respiração espontânea, este estresse de distensão é gerado pela
parede torácica e músculos respiratórios associados (LORIM & MEAD, 1982; MACKLEM
et al., 1983; SPRUNG et al., 1989; BORIEK et al., 1993; BORIEK et al., 1994). A
83
microestrutura do parênquima funciona como uma treliça suportada por tensão (MEAD et
al., 1970; LAI-FOOK et al., 1976; WILSON & BACHOFEN, 1982; KIMMEL et al., 1987;
KIMMEL & BUDIANSKY, 1990). A força de distensão – a pressão transpulmonar- é
transmitida através do parênquima e distende todas as estruturas intrapulmonares. Este
estresse de distensão confere ao parênquima forças físicas associadas, que são cruciais
na manutenção da forma e da função do órgão, incluindo vaso, via aérea e alvéolo
(FREDBERG & KAMM, 2006). Em cada um desses níveis, este estresse de distensão é
essencial para a função celular (FREDBERG & KAMM, 2006). Os papéis das forças
físicas ao nível celular e sub-celular vêm sendo cada vez mais estabelecidos.
As células captam e respondem a estresses mecânicos gerados internamente ou
aplicados externamente. As conseqüências da estimulação mecânica são muitas e
variadas incluindo reorganização intracelular, alterações na expressão de proteína, e
regulação de proteínas envolvidas no remodelamento da MEC (FREDBERG & KAMM,
2006).
Durante a ventilação mecânica, células brônquicas, alveolares e outras células do
parênquima como fibroblastos e macrófagos, podem ser submetidas a forças e
deformações não-fisiológicas. Essas forças incluem estresse (força por área), estiramento
(alteração de comprimento em um eixo), estresse de cisalhamento (componente de
estresse paralelo a uma dada superfície), e estresse tensile (quando a força é dirigida
para longe da parte em que age).
A conversão da força mecânica em alterações bioquímicas e biomoleculares é
feita, por exemplo, por canais iônicos mecano-sensíveis que alteram a sua condutividade
em resposta a estresses na membrana celular, bem como outras alterações induzidas por
força na conformação da proteína que podem alterar afinidade de ligação ou atividade de
84
proteíno-quinases (DOS SANTOS & SLUTSKY, 2000; HAMILL & MARTINAC, 2001;
GARCIA et al., 2005; FREDBERG & KAMM, 2006). Muitas das sinalizações induzidas por
estresse originam-se em adesões focais (AFs), de forma que estas também representam
locais de mecanotransdução, processo biológico que converte a força mecânica em um
sinal bioquímico (BERSHADSKY et al., 2003; HU et al., 2003). A força transmitida entre a
célula e a MEC não é distribuída de forma contínua através da membrana celular, mas
sim localizada em zonas chamadas AFs (FREDBERG & KAMM, 2006). O complexo de
adesão focal é composto por integrinas acopladas externamente a MEC e no domínio
citoplasmático a vinculina, talina, α-actina, paxilina, tensina, quinase de adesão focal
(FAK) e os microfilamentos terminais (INGBER, 1991; INGBER, 1997; CHICUREL et al.,
1998; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2000; WIRTZ & DOBBS, 2000; GEIGER et al., 2001;
GARCIA et al., 2005a). O complexo de adesão focal serve como um elo de ligação entre a
MEC e o citoesqueleto celular. Os filamentos do citoesqueleto transmitem estresse para o
núcleo celular, que sofre uma reorganização estrutural (MANIOTIS et al., 1997; DAHL et
al., 2005). Especula-se que este comportamento tenha implicações fundamentais na
regulação da expressão gênica. Alterações na integridade da membrana plasmática
também participam do processo de mecanotransdução (DOS SANTOS & SLUTSKY,
2006).
A hipótese do biotrauma propõe que forças biofísicas alteram a fisiologia normal da
célula no pulmão, levando a um aumento do nível de mediadores pró-inflamatórios locais
(TREMBLAY & SLUTSKY, 1998; SLUTSKY & TREMBLAY, 1998) e alterações no reparo
pulmonar, remodelamento, e mecanismos de apoptose (DOS SANTOS & SLUTSKY,
2006). Para demonstrar que as células do parênquima pulmonar, alterando o seu
programa de transcrição de mediadores inflamatórios, podem efetivamente sentir e
85
responder a lesão biofísica gerada pela ventilação mecânica, diversos modelos
experimentais e diferentes estratégias ventilatórias foram aplicados (TREMBLAY et al.,
1998; COPLAND et al., 2003; SLUTSKY, 2005; DOS SANTOS & SLUTSKY, 2006).
Durante a ventilação mecânica com um volume corrente moderado (12 mL/kg), o fluxo
inspiratório elevado alterou a sinalização inflamatória, aumentando a liberação de IL-8, via
MAPK (KOTANI et al., 2004).
A MEC transmite informações essenciais às células pulmonares, regulando a sua
proliferação, diferenciação, e organização (GUZOWSKI et al., 1989). A MEC também
influencia a síntese dos componentes da própria matriz (BREEN, 2000). A importância da
interação célula-MEC foi demonstrada submetendo-se células pulmonares cultivadas em
diferentes substratos de MEC à deformação mecânica (BREEN, 2000). A MEC modificou
a habilidade de adesão da célula à superfície e influenciou a forma celular. O contato com
diferentes proteínas da MEC modulou a alteração da expressão de procolágeno tipo I
induzida por estímulo mecânico (BREEN, 2000). Fibroblastos cultivados com substrato de
laminina ou elastina, mas não com fibronectina, quando estirados expressaram
procolágeno tipo I. Estas três moléculas da MEC formam algumas das estruturas de
suporte de força do pulmão, representando elementos de resistência do tecido à
deformação tecidual.
Os componentes da MEC podem ser divididos em quatro categorias básicas:
colágeno, glicoproteínas não-colagenosas (tais como fibronectina e laminina),
glicosaminoglicanos (GAGs) e proteoglicanos (PGs), e fibras elásticas (REEVES et al.,
1983; ROCCO et al., 2001). As células constantemente remodelam o seu micro-ambiente
alterando os componentes e a estrutura da MEC (ROCCO et al., 2001; MENEZES et al.,
2005). A maioria dos tipos celulares no tecido pulmonar contribui para as alterações
86
dinâmicas da MEC. A dinâmica de regulação da MEC é complexa, envolvendo um
balanço entre síntese e deposição das moléculas da MEC, bem como sua degradação
(SANTOS et al., 2006). Uma família de proteases secretadas, as metaloproteinases da
matriz (MMPs), desempenham um papel no turnover da MEC (MURPHY G & DOCKERY,
1992; SANTOS et al., 2006). A atividade da MMP é regulada por uma variedade de
mecanismos, incluindo síntese, secreção, e inibição por um conjunto de inibidores
teciduais de metaloproteinases (TIMPs) (MURPHY G & DOCKERY, 1992).
As forças mecânicas podem alterar a expressão gênica e a síntese protéica de
várias moléculas da MEC pulmonar, como por exemplo, colágeno, GAGs e PTGs
(PARKER et al., 1997; XU et al., 1999). O estímulo mecânico aumenta a expressão de
fibras de colágeno (BREEN, 2000; XU et al., 1999; PARKER et al., 1997; GARCIA et al.,
2004; FARIAS et al., 2005), de GAGs e de PTGs (XU et al., 1996). Neste contexto, o
presente trabalho avaliou a expressão de RNAm para procolágeno tipo III no parênquima
pulmonar, que é o primeiro tipo de colágeno a ser remodelado na evolução do processo
de fibrose pulmonar (Raghu et al., 1985).
Estudos prévios relataram que o fluxo inspiratório é um importante determinante de
estresse tecidual pulmonar (NUCCI et al., 2003; KOTANI et al., 2004). O fluxo aéreo
elevado aumenta o estresse tensile através das superfícies alveolares, resultando em
uma grande transmissão de energia cinética para as estruturas subjacentes, e o estresse
de cisalhamento paralelo à parede alveolar, distorcendo o parênquima e deformando a
superfície epitelial (KOTANI et al., 2004). No presente estudo, o estresse mecânico
imposto ao tecido pulmonar por altos fluxos inspiratórios estimulou a expressão tecidual
de RNAm para PCIII (Tabela 8 e Figura 18). A redução da FR em presença de fluxo aéreo
elevado não inibiu o disparo da expressão de RNAm para PCIII (Tabela 8 e Figura 18).
87
Esses resultados sugerem que o fluxo elevado, por si só, submete as células do
parênquima pulmonar à ação de forças não-fisiológicas alterando a expressão gênica da
matriz extracelular.
A ventilação mecânica com PIP elevada também acarreta um estresse de
distensão alto ao parênquima pulmonar. Sabendo-se disso, foi realizada em paralelo uma
análise do conteúdo tecidual de RNAm para PCIII dos pulmões dos animais ventilados por
2 horas com uma PIP alta. Surpreendentemente, o estresse tensile determinado pela PIP
de 17 cmH
2
O não foi suficiente para determinar alteração da expressão de PCIII no
parênquima pulmonar (Tabela 8 e Figura 18). De forma que, o fluxo alto por si só foi
capaz de proporcionar o aumento da expressão tecidual de RNAm para PCIII. Entretanto,
faz-se importante ressaltar a ação sinérgica de dois estímulos mecânicos induzidos pelo
fluxo inspiratório alto, o estresse tensile associado ao estresse de cisalhamento. Em um
estudo prévio, Farias et al. observaram que o estresse de cisalhamento por si só não foi
capaz de alterar a expressão de PCIII (FARIAS et al., 2005). Neste estudo, pulmões
atelectasiados não apresentaram alteração da expressão gênica de PCIII após 1 hora de
ventilação mecânica com pressão expiratória final igual a zero, isto é, com estresse de
cisalhamento elevado determinado pelo colapso e abertura cíclicos dos espaços aéreos
(FARIAS et al., 2005).
A pressão de pico inspiratória foi o fator determinante das alterações histológicas,
colapso e hiperinsuflação alveolares, observadas nos animais ventilados com fluxo
inspiratório elevado (Figura 16). A correlação das alterações mecânicas e morfométricas
pulmonares dos grupos ventilados com fluxo aéreo alto (F30 e LRRF30) mostrou que
redução da freqüência respiratória (de 200 para 100 irpm) não influenciou a lesão
pulmonar induzida pela ventilação mecânica (Tabela 7 e Figura 16). Logo, os estresses
88
tensile e de cisalhamento induzidos pelo fluxo aéreo alto em si implicam em uma PIP
elevada, sendo este o principal parâmetro que determina as alterações histológicas. Nos
animais ventilados com fluxo inspiratório normal e a pressão de pico inspiratória alta (17
cmH
2
O), tanto a PIP quanto a Pplat se correlacionaram com o colapso alveolar (Figura
17).
Os estudos experimentais acerca da lesão induzida pela ventilação mecânica com
pressão elevada indicaram que a PIP era um fator determinante de lesão (WEBB &
TIERNEY, 1974; DREYFUSS et al., 1985; KOLOBOW et al., 1987; DREYFUSS et al.,
1988; PARKER et al., 1990; TSUNO et al., 1991). Entretanto, considerando-se que a VILI
depende principalmente do volume pulmonar, tornou-se mais apropriado utilizar a pressão
de platô que melhor reflete o volume pulmonar ao final da inspiração (MOLONEY &
GRIFFITHS, 2004). A importância clinica da pressão de platô foi ressaltada na
Conferência de Consenso em Ventilação Mecânica (SLUTSKY, 1994), de forma que
alguns estudos clínicos subseqüentes acerca das estratégias ventilatórias protetoras
limitaram a pressão de platô (BROCHARD et al., 1998; THE ACUTE RESPIRATORY
DISTRESS SYNDROME NETWORK, 2000). A pressão de pico não é determinada
somente pela pressão alveolar, sendo também influenciada pela resistência respiratória e
pela resistência do circuito do ventilador (MOLONEY & GRIFFITHS, 2004). Mesmo assim,
alguns estudos clínicos limitaram também a PIP (AMATO et al., 1998; STEWART et al.,
1998). No que tange a ventilação mecânica com pressão de pico inspiratória alta (ou
volume ao final da inspiração alto), os resultados do presente estudo mostraram que tanto
a PIP quanto a Pplat correlacionaram-se com o colapso alveolar observado (Figura 17).
Adicionalmente, os resultados encontrados no presente estudo atribuem a PIP um papel
89
importante na determinação das alterações histológicas observadas na ventilação
mecânica com fluxo inspiratório elevado (Figuras 16 e 17).
90
CONCLUSÕES
91
7 CONCLUSÕES
A ventilação mecânica com fluxo aéreo inspiratório elevado acarreta estresse
mecânico tecidual resultando em comprometimento funcional caracterizado pelo aumento
da pressão de pico inspiratória e da pressão de platô, acompanhado pelo dano
ultraestrutural do parênquima pulmonar com áreas de colapso e hiperinsuflação
alveolares, edema intersticial, infiltração neutrofílica, descamação epitelial de vias aéreas,
e lesão de células alveolares do tipo I e II. O fluxo aéreo inspiratório alto, por si só, é
capaz de alterar a expressão gênica de proteínas da matriz extracelular. A ação sinérgica
dos estresses tensile e de cisalhamento supra-regula a expressão de RNAm para
procolágeno do tipo III no parênquima pulmonar. Estratégias ventilatórias que limitem o
fluxo aéreo inspiratório podem oferecer uma proteção adicional contra o desenvolvimento
da lesão pulmonar induzida pelo ventilador.
92
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