( PDF ) Análise da variabilidade genética, susceptibilidade a condições do trato gastrointestinal e fermentação de oligofrutose, inulina e goma acácia por isolados de lactobacilos

Download PDF

ads:

MAGALI SOARES DOS SANTOS POZZA

ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA,

SUSCEPTIBILIDADE A CONDIÇÕES DO TRATO

GASTROINTESTINAL E FERMENTAÇÃO DE

OLIGOFRUTOSE, INULINA E GOMA ACÁCIA POR

ISOLADOS DE LACTOBACILOS

Londrina

2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

AGALI SOARES DOS SANTOS POZZA

ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA,

SUSCEPTIBILIDADE A CONDIÇÕES DO TRATO

GASTROINTESTINAL E FERMENTAÇÃO DE

OLIGOFRUTOSE, INULINA E GOMA ACÁCIA POR

ISOLADOS DE LACTOBACILOS

Tese apresentada ao Programa de Mestrado e

Doutorado em Ciência de Alimentos da

Universidade Estadual de Londrina, como requisito

parcial à obtenção do título de Doutor em Ciência

de Alimentos

Orientadora: Prof. Lúcia Helena da Silva

Miglioranza

Londrina

2006

ads:

MAGALI SOARES DOS SANTOS POZZA

ANÁLISE DA VARIABILIDADE GENÉTICA,

SUSCEPTIBILIDADE A CONDIÇÕES DO TRATO

GASTROINTESTINAL E FERMENTAÇÃO DE

OLIGOFRUTOSE, INULINA E GOMA ACÁCIA POR

ISOLADOS DE LACTOBACILOS

BANCA EXAMINDORA

__________________________________________

Lúcia Helena da Silva Miglioranza

__________________________________________

Lúcio Alberto Forti Antunes

__________________________________________

Sandra Garcia

__________________________________________

Raúl Jorge Hernan Castro Gómez

__________________________________________

Sueli Mayume Obara Dói

Londrina, 04 de julho de 2006.

DEDICATÓRIA

A Deus. Ao meu marido Paulo Cesar Pozza pelo amor,

sacrifício e compreensão. Ao meu filho Pedro, minha vida.

Aos meus pais João Batista dos Santos e Marlene Soares

dos Santos pelo incentivo, pelas oportunidades oferecidas e

pela companhia em Londrina, eternamente grata. Às minhas

irmãs Roberta, Renata e sobrinhos Bruno, Gabriel e

Marcela. Às minhas avós Laurinda Figueira Soares (in

memorian) e Maria das Dores dos Santos.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual de Londrina, por intermédio do Departamento de Tecnologia

de Alimentos e Medicamentos, pela oportunidade de realização do curso.

À professora Lúcia Helena da Silva Miglioranza pela orientação e amizade.

Ao professor José Eduardo Garcia pelos ensinamentos e apoio durante o

desenvolvimento deste trabalho.

À professora Sandra Garcia pelas sugestões e amizade.

À estudante Roberta Merguizo pela amizade e auxílio na condução do experimento.

Á secretária da pós-graduação Sandra Rezende pela ajuda e amizade.

A todos os funcionários e técnicos do Laboratório de Tecnologia de Alimentos e

Medicamentos, em especial à Patrícia e Berenice.

Ao professor Antônio Policarpo da UNIOESTE, pela ajuda nas análises estatísticas.

Ao Sr. Edgar Netzel e Rosecler Baron do UNILAB – Marechal Cândido Rondon, pelo

auxílio no antibiograma.

À amiga Luciana Rennó pelo grande incentivo.

Aos amigos da Pós-graduação Laisiane da Nóbrega, Luciana Mikito, Vanessa,

Caroline, Mírian, Marly, Cláudio, Cristiane, Fabíola, Simone, Ricardo, Leia, Elvis, Viviane e

Daniele (Genética), Luciene (Veterinária) e Flávio (Biotecnologia).

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Deixe o alimento ser teu remédio e o remédio ser teu

alimento.”

Hipócrates, 2500 anos atrás.

POZZA, M.S.S. Análise da variabilidade genética, susceptibilidade a condições do trato

gastrointestinal e fermentação de oligofrutose, inulina e goma acácia por isolados de

lactobacilos. 2006. 104f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos e

Medicamentos) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2006.

RESUMO

O Experimento I foi conduzido para comparar características fenotípicas e genéticas de

lactobacilos isolados de fezes de crianças. Para identificação molecular, utilizou-se o RAPD

(polimorfismo de DNA amplificado ao acaso). Foram isoladas 75 colônias, sendo pré-

selecionados 30 isolados. Na análise de RAPD, verificou-se que os isolados agruparam-se em

quatro clusters, sendo em um deles encontrada alta similaridade. O Experimento 2 foi

conduzido para avaliar “in vitro” a capacidade de resistência dos 30 isolados a condições

específicas do trato gastrointestinal, como resistência aos sais biliares, a acidez e tolerância ao

fenol. Para fins comparativos, duas bactérias probióticas comerciais foram submetidas aos

mesmos testes. Foram selecionados oito isolados resistentes aos sais biliares e que

apresentaram comportamento diferenciado com relação a tolerância à acidez e fenol,

entretanto todos os isolados cresceram na presença de uma concentração de 0,3 % de fenol.

O Experimento 3 teve como objetivo verificar a fermentação de oligossacarídeos como

também a resistência destas cepas a alguns antibióticos comumente utilizados em humanos.

Neste experimento, foi utilizado o caldo MRS, substituindo-se a glicose por 1% de

oligofrutose, inulina ou goma acácia. Para o antibiograma, empregou-se o método de difusão

em placa. Os resultados obtidos evidenciaram que todas as cepas foram capazes de fermentar

oligofrutose, inulina ou goma acácia em caldo MRS, permitindo a utilização em produtos

simbióticos. Seis cepas foram sensíveis ao cloranfenicol e a tetraciclina e todos os isolados

foram resistentes a estreptomicina, porém não foi determinado se tal resistência era intrínseca

ou adquirida.

POZZA, M.S.S. Genetic variability of Isolated Lactobacillus spp , their susceptibility to

the Gastrointestinal conditions; oligofructose, inulin and acacia gum fermentation. 2006.

104f. Tese (Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos e Medicamentos) –

Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2006.

ABSTRACT

Three assays were carried out for this study. The aim of the first assay was to compare by

genetic and phenotypic parameter the Lactobacillus strains isolated from infant feces. The

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) technique was applied for molecular

identification among seventy isolated colonies, and eight isolates were pre-selected. The

RAPD technique results demonstrated that the strains grouped into four clusters, and a high

similarity was verified in one of these clusters. The second assay was carried out to evaluate

“in vitro”, the resistance of 30 strains to the specific gastrointestinal tract barriers, like bile

salts, acidity and phenol tolerance. Two commercial probiotic bacteria were also compared in

the same stress conditions. Eight strains were selected for bile salts resistance; however they

demonstrated different levels of phenol and acidity tolerance, but they were able to grow in

0.3% phenol. The aim of the third assay was to verify the oligossacharides fermentation by

eigth selected strains, as well as the resistance of these strains to antibiotics commonly used in

humans. In this experiment, was used MRS medium, substituting the glucose by 1% of

oligofructose, inulin or acacia gum. For the antibiogram, diffusion test was used. The obtained

results evidenced that all strains were able to use oligofructose, inulin or acacia gum in MRS

broth, allowing the use of those in symbiotic products. Six strains were chloramphenicol and

tetracycline sensitive and all isolated were resistant to streptomycin, however it was not

determined if these characteristics were intrinsic or acquired.

LISTA DE TABELAS

Capítulo 1

Tabela 1: Reagentes do coquetel para amplificação do DNA (quantidade para uma

reação) ................................................................................................................... 23

Tabela 2: Fermentação de carboidratos para caracterização dos isolados de lactobacilos ..... 26

Tabela 3: Crescimento dos isolados em leite desnatado reconstituído a 10% (LDR) em

diferentes temperaturas de incubação.................................................................... 27

Tabela 4: Identificação provável dos isolados segundo a Tabela de identificação API e

Manual de Bergey (1986)...................................................................................... 27

Tabela 5: Dados de similaridade genética entre os isolados ................................................... 29

Capítulo 2

Tabela 1: Resistência aos sais biliares dos isolados após crescimento em cultivos com

0,3% de Oxgall ...................................................................................................... 47

Tabela 2: Valores de médios de absorbância a 620 nm dos isolados selecionados após 10

horas de incubação à 37º em meio contendo 0,3% de sais biliares....................... 48

Tabela 3: Crescimento dos isolados expostos ao ácido clorídrico (HCl 0,1 N) por até 3

horas. .................................................................................................................... 54

Tabela 4: Valores determinados de pH e porcentagem de acidez dos isolados cultivados

em leite desnatado reconstituído (LDR) 10%, sem e com adição de 0,3% de

fenol, incubados por 3 dias a 35ºC ........................................................................ 57

Capítulo 3

Tabela 1: Contagem dos isolados em caldo MRS acrescido de 1% de oligofrutose, inulina

ou goma acácia no Tempo 0 horas ........................................................................ 74

Tabela 2: Contagem dos isolados em caldo MRS acrescido de 1% de oligofrutose, inulina

ou goma acácia no Tempo 24 horas ...................................................................... 75

Tabela 3: Valores, expressos em log, dos plaqueamentos nos tempos 0 e 24 horas (T0 -

T24) utilizando diferentes oligossacarídeos.......................................................... 75

Tabela 4: Diâmetro do halo de inibição resultante da sensibilidade dos isolados a

diferentes antibióticos (mm).................................................................................. 78

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1

Figura 1: Foto da coloração de Gram do isolado L25............................................................. 25

Figura 2: Dendograma de similaridade genética..................................................................... 31

Figura 3: Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso – RAPD de 33 isolados de

Lactobacillus ssp empregando o primer X9............................................................. 32

Capítulo 2

Figura 1: Curva de crescimento do isolado L24 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 49

Figura 2: Curva de crescimento do isolado L4 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 49

Figura 3: Curva de crescimento do isolado L22 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 50

Figura 4: Curva de crescimento do isolado L19 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 50

Figura 5: Curva de crescimento do isolado L23 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 51

Figura 6: Curva de crescimento do isolado L5 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 51

Figura 7: Curva de crescimento do isolado L20 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 52

Figura 8: Curva de crescimento do isolado L12 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3 % de Oxgall ........................................................................................................ 52

Capítulo 3

Figura 1: Antibiograma dos isolados selecionados L24, L5, L12, L23 e L22 ........................ 79

SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 ......................................................................................................................... 11

ISOLAMENTO DE LACTOBACILLUS SSP: MÉTODOS BIOQUÍMICOS E

MOLECULARES................................................................................................... 12

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 13

2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 20

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... 25

4 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 35

REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 36

CAPÍTULO 2 ........................................................................................................................ 41

SUSCEPTIBILIDADE “IN VITRO” À ACIDEZ, SAIS BILIARES E FENOL DE

LACTOBACILOS ISOLADOS DE FEZES DE CRIANÇAS............................ 42

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 43

2 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 45

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... 47

4 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 59

REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 60

CAPÍTULO 3 ......................................................................................................................... 63

UTILIZAÇÃO DE PREBIÓTICOS POR ISOLADOS DE LACTOBACILOS E

RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS DA TERAPIA HUMANA ....................... 64

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 65

2 M

ATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 73

3 R

ESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................... 74

4 CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 82

REFERENCIAS ...................................................................................................................... 83

ANEXOS................................................................................................................................. 88

ANEXO 1: CAPÍTULO 1.............................................................................................................. 89

ANEXO 2: CAPÍTULO 2.............................................................................................................. 100

- 11 –

CAPÍTULO 1

- 12 –

ISOLAMENTO DE LACTOBACILLUS ssp: MÉTODOS BIOQUÍMICOS E

MOLECULARES

RESUMO

Este capítulo aborda o isolamento e identificação de lactobacilos por meio de métodos

bioquímicos e moleculares analisando a variabilidade genética intraespecífica e variação

interespecífica dos isolados com a finalidade de identificar bandas de RAPD que

caracterizem as diferentes espécies. Verificou-se que os isolados agruparam-se em quatro

clusters, sendo em um deles observada alta similaridade o que corrobora com os testes

bioquímicos.

Palavras chave: identificação genética, microflora intestinal, RAPD.

SEARCHING FOR LACTOBACILLUS SSP USING BIOCHEMICAL AND

MOLECULAR TECHNIQUES.

ABSTRACT

This research applied biochemical and molecular techniques for identification of

Lactobacillus recovered from human feces. Among the isolated strains, it was analyzed the

genetic variability, either intra-specific as well as inter-specifically, to identify characteristic

bands by RAPD. The strains were grouped into four clusters, and a high similarity was

verified in one of these clusters, agreeing with the biochemical tests.

Key words: intestinal microflora, genetic identification, RAPD.

- 13 –

1 INTRODUÇÃO

O trato gastrointestinal do ser humano consiste em boca, cavidade oral,

esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso. O intestino grosso pode ser dividido

anatomicamente, em regiões distintas: o ceco, o cólon ascendente, transverso, descendente e

sigmoidal. Os alimentos não digeridos e não absorvidos provenientes do intestino delgado

passam pelo intestino grosso antes de serem eliminados do organismo. As substâncias

produzidas pelo hospedeiro, incluindo glicoproteínas da mucina, células epiteliais esfoliadas e

secreções pancreáticas também são importantes substratos (MACFARLANE, ALLISON e

GIBSON, 1988); sendo o cólon humano considerado o maior sítio de absorção de água e sais

minerais (SULLIVAN, 1996).

Entretanto, outra característica metabólica extremamente importante é

mediada pelas bactérias intestinais (FOOKS et al., 1999). A microbiota gastrointestinal pode

ser considerada como um órgão do corpo humano que é rapidamente renovável e

metabolicamente adaptável (MACKIE; SGHIR; GASKINS, 1999).

Em comparação com outras regiões do trato gastrointestinal, o intestino

grosso humano é complexo, densamente colonizado tendo uma ecologia microbiana altamente

diversificada. Os números bacterianos nesta região são de 10

-10

por grama do conteúdo

intestinal (CUMMINGS; MACFARLANE, 1991), sendo capaz de responder a variações

anatômicas e fisicoquímicas.

Dentre as vantagens associadas à microbiota intestinal podemos citar:

manutenção da homeostase intestinal, prevenção da colonização de patógenos, metabolismo

de procarcinogênicos, estimulação da imunidade intestinal, redução de distensão gasosa,

melhora da produção de energia (geração de ácidos graxos de cadeia curta), metabolismo de

materiais xenobióticos, redução da translocação de patógenos, produção de vitaminas,

redução dos níveis de lipídeos sangüíneos, melhora da motilidade intestinal e produção de

enzimas digestíveis (GIBSON; WILLIAMS, 1999).

A microflora do trato gastrointestinal humano compreende cerca de 400

diferentes espécies bacterianas, embora cerca de 30-40 gêneros estejam relacionados com

99% da microflora. Estas bactérias podem ser divididas em 3 categorias: a) microrganismos

que estão presentes quase sempre em altas contagens, como por exemplo, Bacteroides e

Bifidobacterium, b) microrganismos que fazem parte da microflora, porém estão presentes em

menores proporções, por exemplo, Enterobacteriaceae, Lactobacillus e Streptococcus c)

microrganismos presentes em menores números e que são originados de outras regiões do

- 14 –

corpo, como Staphylococcus e Haemophilus ou do ambiente, como Bacillus e

Corynebacterium (SULLIVAN,1996).

O número de bactérias lácticas no estômago é menor que 3 log ufc/g, no íleo

2-5 log ufc/g e no cólon 4-9 log ufc/g. (ERKKILA; PETAJA, 2000).

Embora lactobacilos e bifidobactérias tenham sido isolados de todas as

porções do trato gastrointestinal, o íleo terminal e o cólon, respectivamente, parecem ser os

sítios preferenciais de colonização destas bactérias. (CHARTERIS; KELLY; MORELLI,

1998).

Arhné et al (2005) verificaram que a freqüência de lactobacilos nas amostras

de fezes de 120 crianças foi de 21% para crianças com uma semana de idade, 45% aos 6

meses de idade, 17% aos 12 meses, aumentando para 31% aos 18 meses de idade. As espécies

mais comumente encontradas foram: nos primeiros dois meses, L. rhamnosus e L. gasseri

além de L. fermentum e L. crispatus e, aos seis meses, L. paracasei, L. plantarum, L.

fermentum, L. gaserri, L. reuteri e L. delbrueckii.

Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais produtos da

fermentação no intestino grosso. Eles são os ânions predominantes no cólon, sendo que

acetato, propionato e butirato produzidos perfazem 85-95% dos AGCC totais em toda região

colônica. Embora os produtos da proteólise intestinal sejam considerados tóxicos à saúde

humana, os produtos da fermentação de carboidratos, (os AGCC) podem, algumas vezes,

contribuir positivamente na digestão e metabolismo do hospedeiro, além de atenuar os efeitos

dos produtos gerados pela degradação das proteínas (MACFARLANE; MACFARLANE,

1997).

Probióticos

Visando potencializar o efeito da microbiota benéfica no intestino, a

produção de alimentos e produtos dietéticos contendo Lactobacillus e Bifidobacterium, tem

aumentado significativamente nos últimos anos, sendo muitas vezes estes produtos

probióticos denominados alimentos funcionais. O termo alimento funcional originou-se no

Japão em 1980, sendo referente a alimentos que contém, em concentrações adequadas, a

combinação de componentes os quais afetam determinadas funções no organismo resultando

em efeitos celulares e fisiológicos positivos (ROBERFROID, 1996).

A palavra probiótico foi inicialmente usada por Parker (1974), para descrever

organismos e substâncias que contribuem para o balanço microbiano no intestino. Havenaar e

- 15 –

Huis In´t Veld (1992) definiram probiótico como “microrganismos viáveis (bactérias ácido

lácticas e outras bactérias ou leveduras empregadas na forma liofilizada ou em produtos

fermentados) que exibem efeitos benéficos na saúde do hospedeiro através da melhora das

propriedades de sua microflora selvagem.

Dentre os efeitos observados devido à colonização das bactérias probióticas

no intestino podem ser citados: redução dos efeitos adversos observados na intolerância à

lactose, controle das infecções intestinais, supressão do câncer, diminuição da concentração

de colesterol e, consequentemente, menor incidência de doenças coronárias, melhor digestão,

efeitos nutricionais e estimulação do sistema imune (FOOKS et al., 1999)

As espécies mais freqüentemente empregadas na produção de produtos

lácteos probióticos são de origem intestinal humana, pois geralmente são mais adequadas às

necessidades fisiológicas do hospedeiro e podem mais facilmente colonizar seu intestino do

que cepas selvagens ou cepas provenientes do cólon de outros animais (GOMES;

MALCATA, 1999).

As bactérias probióticas devem ser capazes de resistir a um baixo pH e

sobreviver à acidez gástrica, tolerar concentrações de sais biliares presentes no trato intestinal,

além de possuírem capacidade de adesão às células da mucosa intestinal, proporcionando

desta forma, benefícios clínicos (MACFARLANE; CUMMINGS,1999).

Vários estudos “in vitro” estimam a sobrevivência de bactérias ingeridas em

relação ao trânsito através do trato gastrointestinal. Charteris, Kelly e Morelli (1998)

verificaram que a máxima taxa de sobrevivência de bifidobactéria tem sido estimada em torno

de 30%. Os autores também constataram que a presença de proteínas do leite, isoladas ou em

combinação, exercem efeitos benéficos em relação à tolerância ao suco gástrico para algumas

cepas como L. casei e L. plantarum.

Os casos de perda de viabilidade em produtos lácteos são mais comumente

relacionados com Bifidobacterium spp e L. acidophilus, freqüentemente durante a estocagem

refrigerada e em baixo pH, refletindo a necessidade de cuidados no critério de seleção das

cepas (GOMES; MALCATA, 1999).

Dentre os microrganismos que podem ser usados em produtos probióticos

podemos citar os Lactobacillus. Como exemplo, temos os L. acidophilus, L. casei, L.

johnsonii e bifidobactérias como Bifidobacterium bifidum e Bifidobacterium longum

(SANDERS, 1999), sendo que a dosagem efetiva de L acidophilus necessária para exercer

efeito benéfico no hospedeiro situa entre 10

-10

ufc/dia. E, segundo Gomes e Malcata

(1999), no momento do consumo, estes bioprodutos fermentados devem conter no mínimo

- 16 –

ufc/ml, pois a dosagem terapêutica é considerada como sendo entre 10

- 10

células

viáveis, o que é garantido através do consumo de 100g do produto contendo entre10

-10

ufc/dia.

Existem situações nas quais a viabilidade não é necessária para a atividade

probiótica, tais como digestão da lactose, modulação da atividade do sistema imune e efeito

anti-hipertensivo. Nestes casos, os efeitos benéficos à saúde têm sido atribuído à células não

viáveis ou seus componentes, atividades enzimáticas ou produtos da fermentação

(VINDEROLA; REINHEIMER, 2003).

Cebeci e Gürakan (2003) verificaram que cepas de L. plantarum também

apresentam algumas propriedades importantes com grande potencial para serem utilizadas

como probióticos, como a capacidade de adesão às células gastrointestinais, resistência à

acidez, ao suco gástrico e a alguns antibióticos, além de produzirem plantaricina, uma

substância antimicrobiana efetiva em relação a certos patógenos.

Johansson, Molin e Jeppsson (1993) isolaram e caracterizaram 250 cepas

provenientes da mucosa do cólon de 75 indivíduos e forneceram o probiótico à base de

lactobacilos para voluntários, e constataram que somente cinco cepas persistiram no jejuno e

cólon 11 dias após o término da administração. Nesse estudo as bactérias mais comumente

encontradas foram L. plantarum (85%), L. rhamnosus (23%) e L. reuteri (23%).

L. rhamnosus and L. plantarum toleram pH mais baixos do que outras

bactérias, e esta propriedade as tornam adequadas para serem usadas como alimentos

funcionais, possibilitando maior vida de prateleira do que quando comparadas às outras

bactérias. Ashenafi e Busse (1989) desenvolveram um produto à base de soja inoculado com 1

× 10

células de L. plantarum e constataram sua eficiência em relação à eliminação de altas

concentrações de Enterobacteriaceae, enterococos e Staphylococcus aureus.

Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso

O gênero Lactobacillus compreende cerca de 60 espécies e subespécies,

sendo sua taxonomia considerada difícil devido a ampla heterogeneidade das espécies

(NIGATU et al., 2001). A caracterização genética e a manipulação de lactobacilos são

essenciais para definir sua contribuição na microbiota intestinal e explorar potencialmente

qualquer propriedade benéfica, pois considerando o enorme significado econômico dos

lactobacilos, este é pouco caracterizado quando comparado a outros microrganismos

considerados importantes industrialmente (KLAENHAMMER, 1998).

- 17 –

A taxonomia bacteriana clássica é baseada em características morfológicas e

fisiológicas, que incluem composição da parede celular, ácidos graxos celulares e outras

características da célula. As características moleculares tornaram-se importante ferramenta

taxonômica, tais como a % G+C do DNA, sendo que o gênero Lactobacillus possui G+C

entre 33 e 55%; propriedades eletroforéticas dos produtos de gene, hibridização DNA:DNA e

seqüência do RNA ribossomal (STILES; HOLZAPFEL, 1997).

Porém, atualmente, a taxonomia não é somente baseada em critérios

fisiológicos como temperatura de crescimento, resistência a diferentes concentrações de NaCl,

a antibióticos ou reações de fermentação, sendo também baseada em características

genotípicas e fenotípicas reveladas à nível molecular. A taxonomia polifásica é a combinação

de várias destas técnicas sendo capaz de diferenciar espécies que são fenotipicamente muito

similares, mas genotipicamente diferentes (KLEIN et al.,1998).

Os referidos autores verificaram que a maioria das culturas usadas em

produtos probióticos não possuem a designação apropriada de espécie, o que ocorre com os

gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, pois a maioria das bactérias definidas como L.

acidophilus pertencem às espécies L. johnsonii ou L. gasseri. Como conseqüência, a

taxonomia (incluindo identificação e classificação) é essencial para garantir a qualidade

estabelecida por leis governamentais e pelo consumidor.

Uma variedade de métodos em biologia molecular estão sendo recentemente

empregados para identificação de espécies probióticas de Lactobacillus, incluindo perfil de

plasmídeos, o RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) e DNA fingerprinting ou

pulseld-field eletroforese (PFGE), sendo os dois últimos métodos mais amplamente usados

para discriminação entre cepas (KLAENHAMMER, 1998).

Na reação de polimerase em cadeia (PCR), a enzima polimerase replica

seqüências de DNA a partir de um par de pequenos fragmentos iniciadores (primers) que

flanqueiam a região que se deseja amplificar. A amplificação desta seqüência em progressão

geométrica, torna possível sua visualização em gel de eletroforese em forma de bandas de

DNA (MULLINS, FERRE e GIBBS, 1994).

No inicio da década de 90 foi proposta uma alternativa para contornar o

problema do conhecimento prévio da seqüência de DNA flanqueadora do fragmento que se

desejava amplificar, possibilitando a utilização da técnica em organismos onde nenhum

conhecimento prévio da seqüência de DNA existia. Neste caso, utiliza-se apenas um primer,

mais curto (10 a 15 bases). A amplificação ao acaso é função da probabilidade de, após a

desnaturação da fita dupla de DNA, existir no genoma uma seqüência complementar ao

- 18 –

primer em uma das fitas, e, a uma distância que possa ser percorrida pela polimerase, uma

outra seqüência complementar ao primer na fita oposta. Portanto, esta reação ocorre devido ao

anelamento do primer único em pontos próximos do genoma, delimitando a região que será

amplificada (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1996).

Os polimorfismos, provenientes de deleções ou inserções, visualizados em

gel de agarose, são denominados marcadores de RAPDs. Estes marcadores são dominantes,

pois são identificados com a presença de um fragmento específico de DNA amplificado de

um genótipo comparada com a ausência do mesmo fragmento de outro genótipo (presença

versus ausência de bandas), os quais são herdados de forma mendeliana (FERREIRA;

GRATTAPAGLIA, 1996).

Dentre as vantagens do uso de RAPD quando comparado a outros métodos

pode-se citar: grupos universais de primers podem ser usados na análise genômica de uma

ampla variedade de espécies; não há necessidade de trabalho preliminar como isolamento de

sonda de DNA clonado, preparação de filtros para hibridização ou sequenciamento de

nucleotídeos e cada marcador de RAPD é equivalente a uma seqüência de sitio alvo

(WILLIAMS et al., 1990). Entretanto deve-se tomar cuidado para se obter resultados

reprodutíveis (BJORKROTH; RIDELL; KORKEALA, 1996).

Reações de polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD) e reação de

polimerase em cadeia (PCR) são técnicas que têm sido empregadas com sucesso para

identificar muitos microrganismos até o nível de estirpe. Em lactobacilos esta técnica é

empregada para distinção principalmente entre espécies de L. acidophilus, L. crispatus, L.

amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri e L. johnsonii (KHALED et al., 1997).

Pesquisas que viabilizem a identificação de bactérias láticas (BAL) tornam-

se necessárias devido a diversidade de aplicação tecnológica de tais bactérias, principalmente

os lactobacilos. Segundo Quere, Deschamps e Uraci (1997) a identificação precisa de

bactérias é ambígua e complicada quando se utilizam métodos fenotípicos como fermentação

de carboidratos, devido ao aumento no número de espécies de BAL que variam nestes

caracteres.

Reuter, Kelin e Goldberg (2002), estudando Lactobacillus e Bifidobacterium

nos últimos 30 anos, compararam bactérias pertencentes aos grupos L. acidophilus , L. casei e

L. reuteri /L. fermentum provenientes de alimentos e de produtos farmacêuticos com espécies

obtidas de banco de culturas. Os autores observaram que os critérios fenotípicos permitiram

identificação do gênero e, na maioria dos casos, identificação correta das espécies. Entretanto,

- 19 –

resultados contraditórios foram observados e para confirmar identificações duvidosas ou

caracterizar cepas dentro das espécies, RADP foi considerado um método eficiente.

Torriane et al. (2001) avaliaram 30 cepas de lactobacilos utilizando nove

primers e verificaram que RAPD e RFLP (polimorfismo no comprimento de fragmentos de

restrição) foram métodos eficientes em discriminar espécies fenotipicamente relacionadas

como L. plantarum, L. paraplantarum e L. pentosus, pois métodos para identificação e

caracterização de cepas pertencentes ao grupo de L. plantarum são de grande interesse na

indústria de alimentos e outros campos da microbiologia. Todas as cepas testadas, com

exceção de uma delas, foram agrupadas segundo suas espécies. Para a diferenciação de

espécie, houve concordância entre estas metodologias, indicando que ambas mostraram ser

poderosas e seguras, permitindo a distribuição de novos isolados destas espécies. Quando

estudadas para caracterização intra-específica, ambas metodologias permitiram distinguir a

maioria das cepas estudadas.

Devido ao fato de que os lactobacilos isolados do trato gastrointestinal não

mostrarem freqüentemente conformidade com a classificação taxonômica baseada em

caracteres fisiológicos e bioquímicos, alternativas para se caracterizar cepas de lactobacilos de

tal origem tornam-se necessárias (KHALED et al., 1997). Desta forma, a tecnologia de RAPD

foi utilizada neste estudo para diferenciar a heterogeneidade genética entre os lactobacilos

provenientes do trato gastrointestinal humano.

O objetivo do presente trabalho foi isolar lactobacilos de fezes humanas e

identificá-los por meio de métodos bioquímicos e moleculares.

- 20 –

2 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido nos Laboratórios de Tecnologia de

Alimentos e no Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Bioquímica e

Biotecnologia, ambos da Universidade Estadual de Londrina.

Microrganismos:

Os isolados foram obtidos de fezes de crianças de ambos os sexos, com até

um ano de idade, durante os meses de novembro e dezembro de 2004 da creche da

Universidade Estadual de Londrina.

Isolamento de Lactobacillus ssp

Foram coletadas amostras de fezes de seis crianças utilizando a técnica de

swab (KONEMAN et al, 1997). O swab foi colocado em 10 ml de caldo Rogosa (LBS) e

incubado a 37ºC por 24 horas. Para o isolamento foi utilizado o ágar MRS (de Man, Rogosa e

Sharpe, 1960), pH 5,4 adicionado de acetato (1,5%) e púrpura de bromocresol (0,045%) com

incubação a 37ºC (LABORATÓRIO, 1981).

As colônias que mostraram características típicas de Lactobacillus ssp, foram

transferidas com alça de platina para tubos contendo caldo MRS (37ºC por 24 horas). Após

turvação do meio os isolados foram submetidos ao teste de coloração de Gram e de esporos e

ao teste de catalase. (HARRIGAN e MCCANCE, 1976). A produção de catalase foi

verificada pela adição de uma gota de peróxido de hidrogênio a 3% em uma lâmina onde

misturou-se o inóculo, observando-se a efervescência. As colônias Gram positivas em forma

de bastonetes e catalase negativas foram cultivadas em caldo MRS modificado (contendo 5%

de glicose e isento de extrato de carne) e incubadas a 37ºC, por 24 horas, em tubos de cultura

contendo um tubo de Durhan invertidos, para verificar a produção de gás. Na coloração de

esporos utilizou-se o corante verde malaquita.

A capacidade dos isolados crescerem em diferentes temperaturas foi

avaliada, utilizando-se culturas ativas inoculadas na proporção de 1% em tubos contendo 5 ml

de LDR (Leite Desnatado Reconstituído) à 10% e incubadas a 15ºC por 3 e 10 dias, a 37ºC

- 21 –

por dois dias e 45ºC por três dias. O crescimento foi observado pela formação do coágulo no

leite no tempo indicado.

Verificou-se a capacidade das culturas em fermentar vários carboidratos,

sendo o caldo MRS modificado, omitindo-se o extrato de carne e adicionado-se 2% do

carboidrato teste (dextrose, frutose, galactose, lactose, maltose, manose, ramnose, sacarose,

sorbitol e xilose). Os carboidratos foram esterilizados separadamente do meio, sendo as

soluções vaporizadas por 20 minutos durante três dias consecutivos. Como indicador utilizou-

se 0,004% de púrpura de bromocresol. Após inoculação das culturas com alça de platina, os

tubos foram incubados a 37ºC por 48 horas. A leitura foi interpretada pela mudança da

coloração do indicador de azul para amarelo, o que indicava resultado positivo (DAVIS,

1955).

Análise de variabilidade genética

Linhagens de Lactobacillus usadas na análise de RAPD

As linhagens de lactobacilos utilizadas para fins comparativos, consideradas

como padrões, foram obtidas do Banco de Culturas (ver detalhes no anexo, com os

respectivos códigos) do Ital (Instituto de Tecnologia de Alimentos- Campinas SP) e são

provenientes do Banco de Culturas da Coréia: Lactobacillus acidophilus (KCTC 3111),

Lactobacillus casei (KCTC 1121), Lactobacillus rhamnosus (KCTC 3237/ ATCC 7469),

Lactobacillus johnsoni (KCTC 3138/ ATCC 332), e Lactobacillus paracasei (KCTC 3510);

da Fiocruz (Fundação Osvaldo Cruz -RJ): Lactobacillus brevis (00221/ATCC 367),

Lactobacillus fermentum (00225/ATCC 9338) e Lactobacillus plantarum (00007/ ATCC

8014) e cedidas pela Christian Hansen: Lactobacillus acidophilus (La-5

) e Lactobacillus

casei (Lc-01

), em envelopes de cultura comercial probiótica liofilizada e Danisco:

Lactobacillus helveticus. Todas as linhagens utilizadas, com exceção das cepas da Chr.

Hansen que eram liofilizadas, foram repicadas e mantidas em caldo MRS e armazenadas a –

20ºC, para serem posteriormente descongeladas e reativadas.

Isolamento de DNA

O DNA proveniente de isolados de Lactobacillus ssp foi extraído de acordo

com a metodologia de Luchansky, Tennant e Klaenhammer (1991) modificada. Após três

- 22 –

ativações consecutivas os isolados foram inoculados em 100 ml de caldo MRS por 24 horas.

Após a centrifugação por 10 minutos a 5000 rpm e duas lavagens em solução tampão TES (50

mM NaCl, 30 mM Tris, pH 8,0 e 5mM de

EDTA), as células foram ressuspensas em 0,5 ml

de tampão de lise (50 mM Tris, pH 8,0, 1 mM

EDTA, 20% de sacarose) contendo 4,0 µg/ml

de mutanolisina, 20 µg/ml de lisozima e RNAse (44µl/18 ml de tampão). As amostras foram

incubadas à 37ºC por 45 minutos.

As amostras foram então tratadas com 200 µl de SDS 20% incubadas à 65ºC,

até tornarem-se claras e menos viscosas (± 2 horas). Após homogeneização em vortex, foi

adicionado 20µl/amostra de proteinase K, seguida de outra homogeneização e incubação a

65ºC por 15 minutos. As amostras foram tratadas com extração por fenol-clorofórmio: fenol

(700µl/amostra) por duas vezes e clorofórmio (500µl/amostra). O DNA foi preciptado em

etanol (95 e 70%), seguido da adição de álcool 70%. As amostras permaneceram em estufa a

37ºC por ± 1 hora. Posteriormente adicionou-se 250µl/ de tampão TE (10mM Tris pH 8,0 e 1

mM de EDTA), sendo o DNA mantido a 37ºC por uma noite.

Quantificação do DNA

Para a quantificação do DNA dos isolados, foi feita a análise comparativa

das amostras coradas com brometo de etídio em géis de agarose. A técnica consiste na

utilização de uma seqüência ascendente de concentrações de solução-padrão de DNA

pipetadas lado a lado em gel de agarose, sendo utilizado neste experimento as concentrações

de 2,5 ng; 5,0 ng; 10 ng e 15 ng , à qual se comparou a uma amostra de concentração

desconhecida de DNA, neste caso, as amostras de DNA dos isolados. A observação da

imagem digitalizada do mesmo gel, proporcionou uma estimativa aproximada da

concentração de DNA das soluções testadas (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1996).

Primers testados

As seqüências de DNA foram amplificadas com primers produzidos pela

Operon Tecnologies, Alameda, USA. Os primers testados foram: W5, X4, W2, W4, W20,

W11, W19, X3, X5, X9, X13, X14, X12, W14, W6, X9, sendo que nos seis últimos

obtiveram-se os melhores resultados de amplificação. Nas reações de amplificação, o volume

total foi de 10µl e os reagentes estão listados na Tabela 1.

- 23 –

Tabela 1: Reagentes do coquetel para amplificação do DNA (quantidade para uma reação).

Reagentes

Volume (µl)

Água “ Milli-Q” esterilizada

5,3 µl

Tampão 10x

1,0 µl

MgCl2 (1,5mM)

0,5 µl

DNTPs (0,4 mM de cada nucleotídeo)

1,0 µl

Primer (10pmol)

1,0 µl

Taq DNA polimerase (1U)

0,2 µl

Amplificação do DNA (RAPD)

Para amplificação do DNA utilizou-se o termociclador , sendo cada reação

submetida a 40 ciclos após desnaturação inicial a 92ºC de 3 minutos. Cada ciclo se constituiu

de 40 segundos a 92ºC, 1 minuto de 30 segundos a 40ºC e 2 minutos a 72ºC. Os ciclos foram

seguidos de uma extensão final de 5 minutos a 72ºC e 10 minutos a 10ºC (FERREIRA;

GRATTAPAGLIA, 1996).

Análise de Polimorfismo

Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em gel de

agarose 2% , utilizando tampão de corrida TBE (Tris base, ácido bórico, EDTA 0,5M pH 8,0),

2 µl de tampão de carregamento e corados por brometo de etídio. O tempo de corrida

eletroforética foi de três horas a uma tensão de 70V. Os fragmentos amplificados e separados

por eletroforese foram comparados com aqueles do DNA de tamanho molecular conhecido,

(“1 Kb Plus DNA Ladder”), evidenciados sob luz UV (SAMBROOK et al., 1989) e

documentados em um fotodocumentador. Cada isolado foi analisado quanto à presença e

ausência de produtos de amplificação.

Análise Estatística

A análise de RAPD foi determinada por comparação dos perfis

eletroforéticos do DNA amplificado dos indivíduos analisados, com cada um dos primers. Os

- 24 –

dados obtidos por amplificação ao acaso de DNA (RAPD) foram analisados pelo programa

computacional NTSYS. PC (Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System)

(ROHLF, 1987). Os dados introduzidos na forma de variáveis binárias, ou seja, o número 1

significa a presença de banda e o número 0 a ausência. Desta forma, o programa construiu

uma matriz de similaridade utilizando-se o coeficiente de Jaccard (SNEATH; SOKAL, 1973).

O valor do coeficiente de similaridade (J) foi calculado pela fórmula: J= a /a + b + c, onde “a”

corresponde ao número de concordâncias positivas e, “b” e “c” correspondem ao número de

discordâncias. Os dados da matriz de similaridade foram então utilizados pelo programa para

construção do dendograma pelo método UPGMA “Unweighted Pair-Group Method With

Arithmetical Averages”.

- 25 –

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Isolamento de Lactobacillus ssp

As 75 colônias isoladas apresentaram-se como Gram positivas, sendo a

maioria bacilos (cocobacilos, bacilos longos e finos) e raramente cocos. A predominância de

bastonetes Gram positivos confirmou a eficácia do meio de cultura utilizado, o LBS. Foram

pré-selecionados 30 isolados, cuja morfologia era de bacilos isolados ou em fileiras, catalase

negativos, não produziram gás em caldo MRS modificado e que não produziam esporos.

Na Figura 1 pode-se observar o isolado L25 que apresenta como

característica morfológica a presença de bastonetes longos.

Figura 1: Foto da coloração de Gram do isolado L25.

- 26 –

Estes isolados foram submetidos aos testes bioquímicos de identificação. No

teste de fermentação de carboidratos (Tabela 2) observaram-se variações nas capacidades

fermentativas dos isolados.

Tabela 2: Fermentação de carboidratos para caracterização dos isolados de lactobacilos.

Isolados Dextros

Frutose Galactos

Lactose Maltose Manose Ramnos

Sacarose Sorbitol Xilose

L1 + + + ( ) + + ( ) ( ) + -

L2 + + + + + + ( ) + - -

L3 + + + + + + ( ) + - -

L4 + + + + + + ( ) + - -

+ + + + + + ( ) + - -

L7 + + + + + + ( ) + - -

L8 + + + + + + ( ) + - -

L9 + + + + + + ( ) + - -

L10 + + + + + + ( ) + - -

L11 + + + + + + ( ) + # -

L12 + + + + + + - - - -

L13 + + + + + + - - - -

L14 + + + + + + - - - -

L15 + + + + + + - - - -

L16 + + + + + + - + - -

L17 + + + + + + - + - -

L18 + + + + + + - # # -

L19 + + + + + + - + + -

L20 + + + + + + - + + -

L21 + + + + + + # + + #

L22 + + + + + + # + + #

L23 + + + + + ( ) # + + -

L24 + + + + + + - + + -

L25 + + + # + + # + + -

L26 + + + ( ) + + ( ) + + -

L27 + + ( ) ( ) + + ( ) + + -

L28 + + + + + + ( ) + + -

L29 + + + + + + + + + ( )

L30 + + + + + + ( ) + + -

+ = reação positiva

- = reação negativa

( ) = reação lenta

# = fraca

Os resultados de crescimento em diferentes temperaturas de incubação estão

na Tabela 3. Os isolados L4 e L5 cresceram a 37ºC e 45ºC, porém não a 15ºC. Estes

resultados estão compatíveis com os critérios estabelecidos inicialmente por Orla Jensen

(1919) e posteriormente por Sharpe (1962) e Manual de Bergey (1986). O não crescimento a

15ºC constitui o critério mais útil para classificação de L. acidophilus, enquanto que o

crescimento a 45ºC não permite tal diferenciação. Entretanto, espécies de lactobacilos

isoladas de fezes, como L casei, L. brevis e L. plantarum crescem a 15ºC.

- 27 –

Tabela 3: Crescimento dos isolados em leite desnatado reconstituído (LDR) a 10% em

diferentes temperaturas de incubação.

Isolado 37ºC/ 48 horas 45ºC/3 dias 15ºC/ 3 dias 15ºC/15 dias

L4 + + - -

L5 + + - -

L12 + + - *

L19 + - - *

L20 + - - *

L22 + - - *

L23 + - - *

L24 + - - *

* coágulo fraco

Xanthopoulos et al. (2000) avaliaram o crescimento de lactobacilos em LDR

10% incubados a 30º, 37º e 40º C por 24 horas e verificaram melhor crescimento dos isolados

a 37º e 40ºC, sendo que o pH do leite foi menor do que 5,0 para a maioria das culturas, sendo

considerado uma importante característica para a produção de leite fermentado.

De acordo com a Tabela de Identificação do API e Manual de Bergey (1986),

os isolados poderiam ser correspondentes às bactérias descritas na Tabela 4.

Tabela 4: Identificação provável dos isolados segundo a Tabela de Identificação API e

Manual de Bergey (1986).

Isolado Espécie provável Isolado Espécie provável

L1 L. gasseri L16 L.reuteri/L. fermentum

L2 L. fermentum L17 L.reuteri/L. fermentum

L3 L. fermentum L18 Nd

L4 L. acidophilus L19 L. casei/L. plantarum

L5 L. acidophilus L20 L. casei/L. plantarum

L6 L.reuteri L21 L. plantarum

L7 L.reuteri L22 L.. plantarum/ L. paracasei

L8 L.reuteri L23* L. brevis

L9 L.reuteri L24 L. salivarius/ L. plantarum/

L. casei

L10 L.reuteri L25 L. casei

L11 L.reuteri L26 L. casei

L12 L casei L27 L. brevis

L13 L.reuteri/ L casei L28 L. acidophilus /L.

salivarius

L14 L.reuteri/ L casei L29 L. rhamnosus/ L. salivarius

L15 L.reuteri/ L casei L30 L. salivarius/L. acidophilus

Nd: não determinado; * porém sorbitol +

- 28 –

Em função dos resultados apresentados nas Tabelas 3 e 4, podemos concluir

que os isolados selecionados apresentaram diferenças no perfil bioquímico e no

comportamento frente às temperaturas de crescimento. Pela interpretação dos resultados de

assimilação de carboidratos (Tabela 2) e aplicando-se a Tabelas de Identificação do API e do

Manual de Bergey, os isolados poderiam ser pertencentes às espécies L.reuteri, L. gasseri, L.

casei, L. plantarum, L. fermentum, L. salivarius, L. rhamnosus, L. brevis e L. paracasei. Em

relação à temperatura de crescimento (Tabela 3) os isolados L4 e L5 poderiam pertencer ao

grupo L. acidophilus.

Análise de variabilidade genética

Na análise de marcadores RAPD, a técnica demonstrou a existência de

diferenças genéticas entre os isolados. Dentre os 16 primers utilizados, seis (OPW 14 e 16,

OPX 9, 12, 13 e 14) proporcionaram eficiência na amplificação das amostras, gerando um

total de 110 bandas polimórficas, demonstrando 100% de polimorfismo. Os primers

selecionados geraram um número apreciável de bandas, onde apenas as bandas mais intensas

foram analisadas.

As bandas geradas foram analisadas e uma matriz correspondente à

distribuição das mesmas foi construída como descrito em Material e Métodos. Estas bandas

foram utilizadas para a construção de uma matriz de similaridade representada na Tabela 5. A

partir dos valores de similaridade genética obteve-se um filograma utilizando-se o algoritmo

UPGMA como metodologia de agrupamento.

- 29 –

Tabela 5: Dados de similaridade genética entre os isolados.

Isolado Lp Lai Lac Lb Lr Lh Lf Lcc Lci Lpl Lj

0,21276 0,13043 0,15217 0,08000 0,26190 0,15384 0,15384 0,30434 0,30232 0,18750 0,20454

L22

0,24074 0,12727 0,14545 0,18518 0,14545 0,12903 0,25000 0,14754 0,22222 0,19642 0,18867

0,18000 0,17391 0,14583 0,14285 0,14583 0,14814 0,24000 0,24000 0,18367 0,07272 0,14583

0,22917 0,12500 0,19565 0,07692 0,27906 0,19231 0,19231 0,31914 0,28889 0,20408 0,19565

0,22222 0,13636 0,13333 0,06122 0,30769 0,18367 0,13725 0,28888 0,22727 0,17021 0,21428

0,18750 0,13043 0,17777 0,05882 0,26190 0,20000 0,15384 0,33333 0,27272 0,21276 0,20454

L7 0,18750 0,13043 0,17777 0,05882 0,26190 0,20000 0,15384 0,33333 0,27272 0,21276 0,20454

L9 0,18750 0,15550 0,17777 0,08000 0,29268 0,20000 0,15384 0,33333 0,27272 0,18750 0,23355

L10 0,11111 0,09756 0,12195 0,02173 0,17948 0,10417 0,12765 0,23255 0,22500 0,16279 0,15000

L11 0,22727 0,19512 0,11111 0,08510 0,31578 0,23913 0,14000 0,29545 0,23255 0,17391 0,25000

L12 0,20930 0,17500 0,06667 0,06521 0,20000 0,14583 0,10000 0,22222 0,18604 0,15556 0,09090

L13 0,17777 0,17073 0,06521 0,06382 0,19512 0,16666 0,07690 0,24444 0,18181 0,20454 0,13953

L14 0,20930 0,14634 0,06667 0,08880 0,23077 0,12244 0,10000 0,22222 0,21428 0,15556 0,09090

L15 0,17777 0,14285 0,06522 0,06382 0,22500 0,16667 0,05660 0,21739 0,18181 0,20454 0,11363

L18 0,18000 0,17391 0,2222 0,19148 0,22222 0,16981 0,26530 0,34782 0,23404 0,22916 0,17021

L17 0,17647 0,17021 0,19149 0,21276 0,24444 0,23529 0,23529 0,18867 0,18000 0,17647 0,12000

L19 0,14583 0,11111 0,18604 0,01960 0,10869 0,11538 0,16000 0,20833 0,17391 0,17021 0,13333

L20 0,11111 0,12500 0,17948 0,02173 0,12195 0,10417 0,08163 0,20454 0,13953 0,13636 0,15000

L21 0,20402 0,17391 0,12245 0,14285 0,19565 0,16981 0,19231 0,29166 0,11538 0,15686 0,17021

L23 0,08620 0,09430 0,15686 0,15384 0,15686 0,13793 0,11864 0,15789 0,19230 0,18867 0,22916

L24 0,11864 0,12962 0,21568 0,16666 0,16981 0,15000 0,16949 0,16949 0,16071 0,17857 0,21568

L25 0,20000 0,17021 0,19148 0,16326 0,14285 0,18867 0,23529 0,28571 0,13461 0,17647 0,19148

L28 0,20833 0,15217 0,14893 0,10000 0,10204 0,19607 0,24489 0,15094 0,14000 0,18367 0,08000

L26 0,22641 0,13207 0,19607 0,24000 0,17307 0,25925 0,17241 0,19298 0,12280 0,20370 0,19607

L27 0,07273 0,05882 0,14583 0,12000 0,10000 0,12727 0,08771 0,12727 0,09434 0,20408 0,17021

L29 0,27083 0,14285 0,14000 0,26086 0,18750 0,20754 0,16363 0,12280 0,13207 0,15094 0,14000

L30 0,13953 0,15789 0,07143 0,24324 0,12500 0,18181 0,18181 0,13043 0,11627 0,19512 0,15384

Lai 0,17500

Lci 0,34883

Lp (L. paracasei), Lai (L. acidophilus), Lac (L. acidophilus), Lb (L. brevis), Lr (L. reuteri), Lh (L. helveticus), Lf

(L. fermentum), Lcc (L. casei) Lci (L. casei), Lpl (L. plantarum) e Lj (L johnsoni).

A porcentagem de similaridade entre as cepas padrões da Chr. Hansen e

ITAL de L. acidophilus foi considerada baixa, sendo de 17,5% e entre os padrões de L. casei

foi de 34,8%.

Sánchez et al. (2006) avaliaram 136 estirpes de lactobacilos isolados de

queijos através de RAPD e verificaram similaridade de 60,65% entre as cepas de L.

plantarum, evidenciando alta diversidade genética, considerando-as selvagens. A diversidade

genética de L. paracasei subsp. paracasei foi demonstrada não somente pelo número de

genótipos obtidos como também pelo baixo nível de similaridade. Os autores também

constataram a separação de dois padrões de L. curvatus em dois clusters diferentes.

A metodologia de RAPD para caracterização de cepas de lactobacilos

isoladas do trato intestinal humano é considerada uma alternativa complementar aos métodos

tradicionais de sistemática, sendo encontrada, neste experimento, uma boa correlação em

ambas metodologias pois o dendrograma obtido (Figura 2) demonstrou a separação clara de

- 30 –

quatro grupos distintos, sendo um deles formado pelas espécies padrão L. paracasei, L.

plantarum, L. acidophilus (ITAL), L. casei (Chr. Hansen- Lc 01

), L. rhamnosus e L. casei

(ITAL), possuindo características comuns, pois possivelmente algumas cepas foram

selecionadas para serem metabolicamente ativas no trato gastrointestinal. Estes resultados

evidenciaram que RAPD foi capaz de diferenciar diversas espécies de lactobacilos, pois

apresentaram baixa similaridade, apesar dos dois padrões de L. casei estarem neste mesmo

cluster.

O outro grupo, apresentando baixa variabilidade, foi formado pelos isolados

L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14 e L15. Estes resultados estão de

acordo com a Tabela 4 de identificação bioquímica, pois alguns destes isolados seriam da

mesma espécie (L. reuteri), sendo os isolados L5, L6 e L8 100% similares, embora L5 tenha

sido anteriormente classificado L. acidophilus. No terceiro grupo pode-se observar claramente

que alguns isolados como L22, L23, L24, L27, L19 e L20 estão todos dentro do mesmo

cluster com similaridade em torno de 27%, sendo que alguns destes isolados foram

posteriormente selecionados (capítulos 2 e 3), pois possuem em comum, a tolerância aos sais

biliares, condições ácidas e ao fenol. O quarto grupo, contendo os padrões L. fermentum, L.

acidophilus (Chr. Hansen – La-5

) e L. helveticus apresentaram também alto polimorfismo.

A Figura 3 mostra o eletroforograma, onde observa-se um grande número de

bandas polimórficas, provenientes da amplificação com o primer X9.

- 31 –

Figura 2: Dendograma de similaridade genética obtido empregando-se coeficiente de Jaccard

e método UPGMA para os isolados de lactobacilos, utilizando os dados obtidos

pela técnica de RAPD. Seqüência: L2, L3, L5, L8, L6, L7, L9, L11, L4, L10,

L12, L13, L15, L14, L. paracasei, L. plantarum, L. acidophilus Ital, L. casei (Chr.

Hansen- Lc 01

), L. reuteri, L. casei- ITAL, L22, L23, L24, L27, L19, L20, L1,

L21, L25, L18, L. fermentum, L17, L. acidophilus (Chr. Hansen- La -5

), L.

helveticus, L28, L30, L26, L29, L. brevis e L. johnsoni.

- 32 –

Figura 3: Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso – RAPD de 33 isolados de

Lactobacillus ssp empregando o primer X9 , linha 2 a 36. Isolados L2, L22, L1,

L3, L4, L5, L8, L6, L7, L9, L10, L11, L12, L13, L14, L15, controle, 1 Kb, L18,

L17, L19, L20, L21, L23, L24, L25, L28, L26, L27, L29, L30, L. paracasei, L.

acidophilus (ITAL), L. acidophilus (Chr.Hansen La-5

), L. brevis. O padrão de

massa molecular (linha 1 e 19) 100 pb ladder (Invitrogen Life Techologies.

Eletroforese em gel de agarose a 2% corada com brometo de etídio).

Nigatu et al. (2001) testaram um total de 41 cepas de lactobacilos, incluindo

àquelas consideradas referências, e verificaram que todas as cepas de L. plantarum foram

claramente discriminadas a 72% de similaridade através de RAPD. As subespécies de L. casei

também foram agrupadas separadamente e parecem ter mais bandas em comum com o mesmo

peso molecular com cepas de outras espécies do que entre elas. Os resultados deste estudo

mostraram que o procedimento de RAPD é capaz de separar espécies distintas e relacionadas

em vários níveis de similaridade.

Khaled et al. (1997) avaliaram 88 cepas de lactobacilos através de RAPD

isoladas de bancos de cultura e algumas delas provenientes do trato gastrointestinal de ratos e

verificaram que algumas cepas eram similares a L. salivarius, L. brevis e L. fermentum. Os

autores constataram também grandes distâncias genéticas entre as cepas de L. acidophilus .

- 33 –

Klein et al. (1998) identificaram lactobacilos isolados de humanos, aves e

bovinos e constataram que esta metodologia é adequada para diferenciação entre espécies do

grupo acidophilus (L. acidophilus, L. gasseri, L. johnsoni e L. amylovorus), pois cada espécie

apresentou um padrão específico de banda.

Ahrné et al. (2006) identificaram lactobacilos provenientes de fezes de

crianças com uma, duas, quatro e oito semanas de idade e aos 6, 12 e 18 meses através de

RAPD. Os autores consideraram que quando os isolados da mesma criança mostravam o

mesmo perfil de bandas na análise de RAPD, estes eram considerados pertencentes a mesma

espécie. Foram identificadas as seguintes espécies de lactobacilos: L. rhamnosus, L.

paracasei, L. gasseri, L. fermentum, L. reuteri , L. plantarum , L. delbrueckii e L. salivarius.

Martín, Langa e Riviriego (2003) isolaram bactérias lácticas do leite materno

e pele de oito mães voluntárias e também das fezes e cavidade oral dos bebês e verificaram

um mesmo perfil entre os isolados dentro de cada par (mãe e bebê) através de RAPD nos três

primers testados, sendo identificados como L. gasseri. As demais bactérias em forma de

bastonetes com perfil diferente de bandas foram identificadas como L. fermentum .

Dal Bello e Hertel (2006) compararam a presença de espécies de lactobacilos

nas fezes e cavidade oral de humanos através de RAPD e constataram que a composição das

espécies era característica cada indivíduo e que algumas espécies idênticas ocorriam em

ambos habitats como L. gasseri, L. sakei, L. vaginalis e grupo L. casei exibindo o mesmo

perfil de RAPD. Verificaram também que cepas da mesma espécie isoladas de diferentes

indivíduos mostraram diferentes perfis de RAPD. Os autores concluíram que RAPD foi

considerada uma técnica apropriada para tipificação molecular de lactobacilos do grupo L.

acidophilus além de L. plantarum e L. rhamnosus.

Drake et al. (1996) utilizaram um único primer para diferenciar 16 cepas de

L. helveticus. Devido ao fato de tratar-se de bactérias da mesma espécie, algumas bandas

similares foram observadas em todas as linhas. Os autores ressaltaram que a identificação e

purificação das bandas consideradas únicas dentro de cada amostra, poderia ser usado para

identificação direta de cada estirpe. Primers específicos poderiam ser gerados para amplificar

as bandas únicas ou uso de marcadores em cada estirpe.

Richard et al. (2001) compararam através de semi-RADP, método que utiliza

dois primers consistindo parte do gene que codifica a enzima malolática (específica para

identificação de bactérias lácticas) e ainda também uma seqüência arbitrária; cepas de L.

rhamnosus isoladas de saliva de crianças com cepas consideradas referência (banco de

- 34 –

culturas ATCC). Foram encontrados diferentes perfis dentro das cepas estudadas gerando

padrões genômicos adequados para caracterização de espécies.

Por outro lado, Nishitani et al. (2004) avaliaram por meio de RAPD 45

lactobacilos isolados de fezes humanas e de produtos fermentados e verificaram resultados

conflitantes quando confrontados com identificação por PCR quando tratavam-se de espécies

relacionadas com L. plantarum como L. paraplantarum e L. pentosus. Os autores agruparam

estes isolados em 4 clusters A, B, C e D e constataram além da baixa similaridade entre eles,

que era de 40%, estes clusters não eram espécie específico. Entretanto, 10 dos 14 isolados de

humanos foram incluídos no mesmo cluster e oito isolados mostravam baixa similaridade com

qualquer um dos demais clusters, concluindo que RAPD é uma ferramenta útil para distinguir

espécies relacionadas de lactobacilos.

- 35 –

4 CONCLUSÃO

Os isolados foram agrupados em quatro clusters, sendo que em um deles,

formado pelas cepas L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8, L9, L10, L11, L12, L13, L14 e L15,

verificou-se alta similaridade havendo correlação com os dados bioquímicos. Os isolados

padrões também apresentaram alto polimorfismo.

- 36 –

REFERÊNCIAS

AHRNÉ, S.; LONNERMARK, E.; WOLD, A.E.; ABERG, N.; HESSELMAR, B.;

SAAALMAN, R.; STRANNEGARD, I.; MOLIN, G.; ADLERBERTH, I. Lactobacilli in the

intestinal microbiota in Swedish infants. Microbes and Infection, Paris, 2006. (no prelo).

ASHENAFI, M.; BUSSE, M. Inhibitory effect of Lactobacillus plantarum on Salmonella

infantis, Enterobacter aerogens and Escherichia coli during Tempeh fermentation. Journal

of Food Protection, Iowa, v. 52, p. 169–172, 1989.

BERGEY, D.H.; SNEATH, P.H.A.; MAIN, S.N.; SHARPE, M.E.; HOLT J.G. Bergey’s

Manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams e Wilkins, 1986. 1599 p.

BJORKROTH, J., RIDELL, J.; KORKEALA, H. Characterization of Lactobacillus sake

strains associating in production of ropy slime by randomly polymorphic DNA (RAPD) and

pulseld-field electroforesis (PFGE). International Journal of Food Microbiology,

Amsterdam, v. 31, p.59-68, 1996.

CHARTERIS, W.P.; KELLY, P. M.; MORELLI, L. Development and application of an in

vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and

Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Journal of Applied

Microbiology, Oxford, v. 84, p.759-768, 1998.

CEBICI, A.; GÜRAKAN, C. Properties of potencial probiotic Lactobacillus plantarum

strains. Food Microbiology, London, v. 20, p.511-518, 2003.

DAL BELLO, F.; HERTEL, C. Oral cavity as natural reservoir for intestinal Lactobacilli.

Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, 2006.(no prelo).

DE MAN, J.C.; ROGOSA, M.; SHARPE, M.E. A medium for the cultivation of lactobacilli.

J. Applied Bacteriology, Oxford, v. 23, nº 1, p. 130-135, 1960.

DAVIS, G.H. The classification of lactobacilli from the human mouth. Journal of General

Microbiology, London, v.13, p.481-93, 1955.

DRAKE, M.A.; SMALL, C.L.; SPENCE, K.D.; SWANSON, B.G. Differentiation of

Lactobacillus helveticus using molecular typing methods. Food Research International,

Barking, GB, v. 29, n: 5-6, p. 451-456, 1996.

- 37 –

ERKKILA, S.; PETAJA, E. Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in

the presence of bile salts for potential probiotic use. Meat Science, Barking, GB, v.55, p. 297-

300, 2000.

FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares

em análise genética. 2. ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN, 1996. 220p.

FOOKS, L.J.; FULLER, R.; GLENN, R.; GIBSON, G.R. Prebiotics, probiotics and human

gut microbiology. International Dairy Journal , Barking, GB,v.9, n.1, p.53-61, 1999.

GIBSON, G.R.; WILLIANS, C.M. Gut fermentation and health advantagens: myth or reality?

British Journal of Nutrition, Cambridge, v.81, p.83-94, 1999.

GOMES, A.M.P.; MALCATA, X. Bifidobacterium ssp. and Lactobacillus acidophilus:

biological, biochemical, technological and therapeutical properties relevant for use as

probiotics. Trends in Food Science and Technology, Cambridge,v.10, p.139-157, 1999.

HAVENAAR, R.; HUIS IN´T VELD, J.H.J. Probiotics; a general review In: Wood, B. (Ed)

The Lactic acid Bacteria in Health and Disease. Barking:Elsevier, 1992. 151-170.

HARRIGAN, W.F.; McCANCE, M.E. Laboratory methods in food and dairy

microbiology. London:Academic Press, 1976. 452p.

JOHANSSON, M.L.; MOLIN, G.; JEPPSSON, B. Administration of different Lactobacillus

strains in fermented oatmeal soup: In vivo colonization of human intestinal mucosa and effect

on the indigenous flora. Applied and Environmental Microbiology, Washington,v. 59, p.

15–20, 1993.

KLAENMHEMMER, T.R. Functional activities of lactobacillus probiotics: genetic mandate.

International Dairy Journal, Barking, v. 8, p.497-505, 1998.

KLEIN, G.; PACK, A.; BONAPARTE, C.; REUTER, G. Taxomony and physiology of

probiotic lactic acid bacteria. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.

41, p.103-125, 1998.

KHALED, A.D.D.; NEILAN, B.A.; HERIKSSON, A.; CONWAY, P.L. Identification and

phylogenetic analysis of Lactobacillus using multiplex RAPD-PCR. FEMS Microbiology

Letters, Amsterdam, v. 153, p. 191-197, 1997.

- 38 –

KONEMAN, E.; ALLENS, S.; DOWELL, V. Color atlas and textbook of diagnostic

microbiology. 5. ed. Nova York: Lippincott, 1997. 321 p.

LABORATÓRIO NACIONAL DE REFERÊNCIA ANIMAL. Métodos Analíticos Oficiais

para Controle de Produtos de Origem Animal e seus ingredientes. Brasília, 1981. v. 1.

LUCHANSKY, J. B.; TENNANT, M. C.; KLAENHAMMER, T. R. Molecular cloning and

DNA polymorphisms in Lactobacillus acidophilus and L. gasseri. Journal of Dairy Science,

Champaign, Ill, v. 74, p. 3293-3302, 1991.

MACFARLANE, G.T.; ALLISON, C.; GIBSON, S.A.W. Comparation of fermentation

reactions in different regions of the human colon. Journal Applied Bacteriology, Oxford, v.

67, p.525-527, 1988.

MACFARLANE, G.T.; MACFARLANE, S. Human colonic microbiota: ecology, physiology

and metabolic potential of intestinal bacteria. Scandinavian Journal of Gastroenterology.,

Olso, v. 222 (Suppl.), p.3-9,1997.

MACFARLANE, G.T.; CUMMINGS, J.H. Probiotics and prebiotics: can regulating the

activities of intestinal bacteria benefit health? British Medical Journal, London, v. 318,

p.999-1003. 1999.

MACKIE, R. I.; SGHIR, A.; GASKINS, H. R. Developmental microbial ecology of neonatal

gastrointestinal tract. American Journal of Clinical Nutrition, New York, v. 69 (suppl),

p.1035s-1045s, 1999.

MARTÍN, R.; LANGA, S.; REVIRIEGO, C. Human milk is a source of lactic acid bacteria

for the infant gut. Journal of Pediatrics, Sait Louis, Mo, v. 143, p.754-758, 2003.

MULLINS, K.B; FERRE F.; GIBBS; R.A. The polymerase chain reaction (Hardcover).

New York:Springer-Verlag, 1994, 550p.

NIGATU, A.; ARHNÉ, S.; MOLIN, G. Randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) for

the distinction of Lactobacillus species. Antonie van Leeuwenhoek, Ámsterdam, v. 79, p.1-

6, 2001.

NISHITANI, Y.; SASAKI, E.; FUJISAWA, T.; OSAWA, R. Genotypic analises of

Lactobacilli with a range of tannase activities isolated from human feces and fermented food.

Systematic and Applied Microbilogy, Stuttgart, v. 27, p. 109-117, 2004.

- 39 –

ORLA JENSEN, S. La classification des bacteries lactiques. Les Ulis, Fr, v. 4, p.468-47,

1919.

PARKER, R. B. Probiotics, the other half of the antibiotics story. Animal Nutrition and

Health, v. 29, p.4-8. 1974.

QUERE, F.; DESCHAMPS, A.; URDACI, M.C. DNA probe and PCR-specific reaction for

Lactobacillus plantarum. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 82, p. 783-790,

1997.

REUTER, G.; KELIN, G.; GOLDBERG, M. Identification of probiotic cultures in food

samples. Food Research International, Barking, v. 35, p. 117-124, 2002.

RICHARD, B.; GROISILLIER, A.; BADET, C.; DORIGNAC, G.; LONVAUD-FUNEL, A.

Identification of salivary Lactobacillus rhamnosus species by DNA profiling and a sepecific

probe. Research Microbiology, Amsterdam, v. 152, p. 157-165, 2001.

ROBERFROID, M.D. Funcional effects of food components and the gastrointestinal system:

chicory fructooligossacharides. Nutrition Reviews , New York,v.54, p. s38-s42, 1996.

ROHLF, F. J. NTSYS, P.C. Micro-computer programs for numerical taxonomy and

multivariate analysis. American Statistician, Washington,v.41, p.330, 1987.

SAMBROOK, J.; FRISTSCH, E.F.; MANIATS, T. Molecular cloning: a laboratory manual.

ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press; Cold Spring Harbor, 1989.

SÁNCHEZ, I.; SESENÃ, S.; POVEDA, J.; CABEZAS, L.; PALOP, L. Phenotypic and

genotypic characterization of lactobacilli isolated from Spanish goat cheese. International

Journal of Food Microbiology, Amsterdan, 2006. (no prelo).

SANDERS, M.E. Probiotics. Food Technology, Chicago, v. 53, p. 67-75, 1999.

SHARPE, E.M. Taxonomy of the lactobacilli. Dairy Science Abstracts, Farnham Royal, GB,

v. 24, n.3,109-19, 1962.

SNEATH, P.H.A.; SOKAL, R.R. (Eds.). Numerical Taxonomy. San Francisco: Freeman,

1973.

- 40 –

STILES, M.E.; HOLZAPFEL, W.H. Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy.

International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 36, p.1-29, 1997.

SULLIVAN, M. G. Metabolism of bifidogenic factors by gut flora: a overview. Bulletin/

International Dairy Federation, Brussels,. p. 23-29. 1996.

TORRIANI, S.; CLEMENTI, F.; VANCANNEYT, HOSTE, B.; DELLAGLIO, F.;

KERSTERS, K. Differentiation of Lactobacillus plantarum, L. pentosus and L.

paraplantarum species by RAPD-PCR and AFLP. Systematic and Applied Microbiology,

Stuttgart, v. 24, p.554-560, 2001.

VINDEROLA, C.G.; REINHEIMER, J.A. Lactic acid starter and probiotic bacteria: a

comparative “ in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistence.

Food Research International, Barking, v. 36, p.895-904, 2003.

WILLIAMS, J. G. K.; KUBELIK, A., R.; LIVAK, K. ; RAFALSKI, J.A.; TINGEY, S.

DNA polymorphims amplified by arbitrary primers are useful as genetics markers. Nucleic

Acids Research, Oxford, v. 18, n. 22, 6531-6535, 1990.

XANTHOPOULOS, V.; LITOPOULOU-TANETAKI, E.; TZANETAKIS, N.

Characterization of Lactobacillus isolates from infant faeces as dietary adjuncts. Food

Microbiology, London, v. 17, p.205-215. 2000.

- 41 –

CAPITULO 2

- 42 –

SUSCEPTIBILIDADE “ IN VITRO” À ACIDEZ, SAIS BILIARES E FENOL DE

LACTOBACILOS ISOLADOS DE FEZES DE CRIANÇAS.

RESUMO

Foi realizado um experimento em que 30 cepas de lactobacilos, isoladas de fezes de crianças

com até um ano de idade, foram avaliadas “in vitro” na sua capacidade de resistir a condições

específicas do trato gastrointestinal, como resistência aos sais biliares (Oxgall), a acidez e

tolerância à concentração de 0,3% de fenol. Cepas de L. casei (Lc 01

) e L. acidophilus (La-

) foram incluídas como controle. Observou-se que oito isolados possuem as

propriedades desejáveis para sobreviverem às condições do trato gastrointestinal e se

caracterizaram como promissoras para serem usadas como probiótico.

Palavras chave: L. casei, L. acidophilus , trato gastrointestinal, propriedades probióticas.

ISOLATED Lactobacillus STRAINS: SUSCEPTIBILITY TO THE

GASTROINTESTINAL CONDITIONS AND ANTIBIOTICS RESISTANCE “IN

VITRO”.

ABSTRACT

An assay was carried out screening 30 strains of Lactobacillus from infants (below one year

old), feces and it was evaluated the bacterial resistance to the bile salts (Oxgall), acidity, and

0.3% phenol concentration. L. casei (Lc 01

) e L. acidophilus (La-05

) commercial strains

were used as control. The results indicated that eight of the investigated strains were able to

survive under gastrointestinal stress condition, allowing their use as probiotics.

Key words: gastrointestinal tract, L. casei, L. acidophilus, probiotic properties.

- 43 –

1 INTRODUÇÃO

Os probióticos, conhecidos como microrganismos viáveis comumente

adicionados aos alimentos, são normalmente administrados oralmente, principalmente em

produtos lácteos (HAMILTON; SHAH; WINKLER, 1999). Para os probióticos utilizados

desta forma, é importante a sua sobrevivência durante o trânsito através do trato

gastrointestinal, o que implica na habilidade destes microrganismos em sobreviverem à acidez

do estômago e à bile, para que possam exercer seus efeitos benéficos no hospedeiro

(COLLINS; THORNTON; O’ SULLIVAN, 1998).

Os microrganismos ingeridos juntamente com o alimento iniciam sua

trajetória no trato intestinal através da boca, sendo expostos durante seu trânsito a sucessivos

fatores estressantes que influenciarão a sua sobrevivência. Logo no início, deverão resistir às

enzimas da cavidade oral, entre elas a lisozima. Posteriormente, outro ambiente hostil, é o

estômago, sendo considerado que o tempo de entrada e liberação do estômago é de

aproximadamente 90 minutos (BERRADA; LEMELAND; LAROCH, 1991).

A sobrevivência das bactérias ao suco gástrico depende da sua habilidade em

tolerar o baixo pH. O pH do ácido clorídrico secretado no estômago é de 0,9, que em presença

de alimento aumenta para 3,0 (ERKKILA; PETAJA, 2000).

Cerca de 2,5 litros de suco gástrico com pH de aproximadamente 2,0 são

secretados por dia no estômago causando a destruição da maioria dos microrganismos. Neste

sentido, a resistência ao trânsito gástrico em humanos é um importante critério de seleção para

microrganismos probióticos, sendo considerado que a habilidade de uma bactéria probiótica

sobreviver a passagem através do estômago é variável e estirpe-dependente (CHARTERIS;

KELLY; MORELLI, 1998).

A bile, secretada no fígado e lançada no intestino delgado, reduz a

sobrevivência das bactérias por destruir sua membrana celular, cujos principais componentes

são os lipídeos e ácidos graxos (GILLILAND; SPECK, 1987). A taxa de secreção pelo fígado

e a concentração da bile depende, principalmente, do tipo de alimento consumido

(LANKAPUTHRA; SHAH, 1995) e, segundo Conway, Gorbach e Golden (1987), a

concentração de bile no trato gastrointestinal humano, em um determinado momento, é

variável e difícil de predizer.

Os sais biliares são sintetizados no fígado a partir do colesterol, armazenados

na vesícula biliar, e liberados no duodeno após a ingestão de alimentos gordurosos, tendo

- 44 –

função detergente (ERKKILA; PETAJA, 2000). Entretanto, alguns microrganismos são

capazes de reduzir este efeito detergente pela habilidade de hidrolisar sais biliares e diminuir

sua solubilidade, através da enzima sais biliares hidrolase (BSH). A atividade BSH tem sido

encontrada em muitos gêneros, incluindo Lactobacillus. A resistência aos sais biliares varia

muito entre as espécies de Lactobacillus e também entre as cepas, sendo este mecanismo

ainda desconhecido (PENNACHIA et al., 2004).

Não existe correlação entre o potencial da bactéria desconjugar sais biliares e

sua habilidade em resistir ao efeito da bile, sendo que ainda não está clara a função fisiológica

desta atividade hidrolítica. Por outro lado, a reabsorção de sais biliares primários/secundários

na circulação entero-hepática é reduzida após sua desconjugação. E, devido ao fato de que o

aumento na concentração de ácido biliar pode afetar a carcinogênese no intestino grosso, a

discussão sobre os riscos e benefícios da desconjugação de sais biliares na saúde, em

humanos, permanece contraditória (HALLER; COLBUS; GANZLE, 2001).

Além dos sais biliares, existe no intestino a presença de compostos tóxicos

como por exemplo, o fenol. Este composto é produzido pela microbiota intestinal pois, como

esta é composta por diferentes espécies bacterianas, há a conversão de várias substâncias em

produtos tanto benéficos como nocivos ao hospedeiro (MITSUOKA, 1996). Bactérias

intestinais como as enterobactérias, peptostreptococos, clostrídios e eubactérias produzem

urease, que hidrolisa a uréia em substâncias potencialmente tóxicas como amônia, fenóis,

aminas farmacologicamente ativas e indol, que normalmente são detoxificadas no fígado

antes da excreção nas fezes e urina (RASIC; KURMANN, 1983).

Diante disto, o objetivo do presente trabalho foi selecionar, através de testes

“in vitro” que simulam as condições do trato gastrointestinal, alguns isolados com

características probióticas.

- 45 –

2 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Tecnologia de

Alimentos da Universidade Estadual de Londrina e no Laboratório de Microbiologia e

Bioquímica da Universidade Estadual do Oeste do Paraná.

Microrganismos:

Os isolados foram obtidos de fezes de crianças de ambos os sexos da creche

da Universidade Estadual de Londrina, com até um ano de idade, durante os meses de

novembro e dezembro de 2004.

Estes isolados foram testados quanto à resistência aos sais biliares, tolerância

às condições ácidas e fenol.

Manutenção dos isolados:

Todos os isolados, com exceção das cepas da Chr. Hansen que eram

liofilizadas, foram repicados em mantidos em caldo MRS adicionado de glicerol e

armazenados a –20ºC para serem oportunamente descongelados e reativados.

Reativação:

A reativação dos isolados foi realizada a partir de 1% (v/v) das culturas

congeladas, inoculadas em caldo MRS e posteriormente incubadas a 37ºC durante 24 horas.

Este procedimento foi repetido três vezes.

Determinação de resistência aos sais biliares:

Para determinação da resistência aos sais biliares, após três reativações em

caldo MRS, os isolados foram inoculados na proporção de 1% (v/v), em caldo MRS e em

caldo MRS adicionado de 0,3% de bile (Oxgall). Procedeu-se a determinação da absorbância

do cultivo em espectrofotômetro a 620 nm, nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10, 12, 15, 18, 21 e

24 horas. Foram feitas também as contagens dos isolados submetidos aos tratamentos com e

- 46 –

sem Oxgall, através do plaqueamento em profundidade em ágar MRS, nos tempos 0 e 24

horas (GILLILAND; STALEY; BUSH, 1984).

As bactérias consideradas resistentes à bile foram selecionadas para os testes

a seguir e comparadas com cepas padrão de L. casei (Lc 01

) e L. acidophilus (La-05

Tolerância às condições ácidas:

Foi realizado um experimento em esquema fatorial 3X4, sendo os fatores

representados pelo pH (caldo MRS ajustado para pH 2,0; 3,0 e 6,5 através da adição de HCl)

e pelo tempo. Determinou-se a contagem das células viáveis através do plaqueamento em ágar

MRS incubados 37ºC por 2 a 3 dias, nos tempos 0, 1, 2 e 3 horas (LIN ; CHEN, 2000).

Determinação de tolerância ao fenol:

A tolerância ao fenol foi verificada inoculando-se 1% v/v da cultura ativa em

100 ml leite desnatado reconstituído (LDR) a 10%, contendo 0,3% de fenol, sendo feitas

determinações de pH e acidez titulável (LABORATÓRIO, 1981). O delineamento

experimental foi o de blocos ao acaso, sendo a unidade experimental representada pelos

isolados, e três repetições.

Os dados obtidos foram analisados por intermédio do Sistema de Análises

Estatísticas – SAEG, UFV (1999). Os tratamentos foram comparados pelo teste Student

Neuman Keuls a 5 % de probabilidade, sendo feitas análises de regressão nos diferentes

tempos para os dados provenientes da tolerância a condições ácidas.

- 47 –

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os 30 isolados pré-selecionados foram testados para verificar sua resistência

a bile. Os resultados de crescimento, em logaritmo das ufc/ml, estão apresentados na Tabela

1. Segundo Gilliland, Staley e Bush (1984), para uma bactéria ser considerada resistente à

bile, esta deverá atingir o valor 0,3 de absorbância após 6 horas de incubação. Comparando-se

os resultados de crescimento (Tabela 1) com os de absorbância obtidos (Tabela 2), verificou-

se que os isolados L4, L24, L20, L23, L19, L22 poderiam ser classificados como resistentes,

apesar de apresentarem valores de absorbância maiores que 0,3 somente após 10 horas de

incubação.

Tabela 1: Resistência aos sais biliares dos isolados após crescimento em cultivos com 0,3%

de Oxgall.

MRS

Normal

MRS +

Oxgall

Isolado Tempo 0 Tempo 24 Crescimento Tempo 0 Tempo 24 Crescimento

L1 6,63 8,56 1,93 6,51 6,70 0,19

L2 6,58 8,79 2,21 6,35 7,14 0,79

L3 6,48 8,85 2,37 6,50 6,35 -0,15

L4 7,40 9,12 1,72 6,88 8,74 1,86

L5 6,82 9,07 2,25 6,77 7,67 0,90

L6 6,52 8,71 2,19 6,22 6,42 0,20

L7 6,60 8,64 2,04 6,54 6,27 -0,27

L8 6,38 8,77 2,39 6,18 6,10 -0,08

L9 6,50 8,93 2,43 6,60 6,68 0,08

L10 6,69 8,97 2,28 6,49 6,51 0,02

L11 6,61 8,81 2,20 6,47 6,72 0,25

L12 6,51 8,56 2,05 6,50 6,99 0,49

L13 6,60 8,82 2,22 6,47 6,41 -0,06

L14 6,83 8,91 2,08 6,77 6,56 -0,21

L15 6,81 8,69 1,88 6,69 6,59 -0,10

L16 6,46 8,42 1,96 6,11 5,61 -0,50

L17 6,64 8,89 2,25 6,61 1,75 -4,86

L18 7,12 9,20 2,08 5,00 3,48 -1,52

L19 7,31 8,52 1,21 7,15 8,15 1,00

L20 7,30 9,12 1,82 7,06 8,57 1,51

L21 7,31 8,90 1,59 5,08 4,95 -0,13

L22 7,35 8,83 1,48 7,10 8,08 0,98

L23 7,22 8,88 1,66 7,07 8,28 1,21

L24 7,25 9,20 1,95 7,17 8,68 1,51

L25 7,47 9,38 1,91 4,93 5,19 0,26

L26 8,67 8,48 0,19 6,18 5,77 -0,41

- 48 –

L27 6,87 8,68 1,81 6,43 6,49 0,06

L28 6,80 9,11 2,31 6,66 7,43 0,77

L29 6,87 8,80 1,93 6,46 6,27 -0,19

L30 6,71 8,76 2,05 6,72 6,45 -0,27

Resultados médios com valores expressos em Logarítmos do número de unidades formadoras de colônias

(UFC/ml).

Crescimento= log

(população final) - log

(população inicial)

Tabela 2: Valores médios de absorbância a 620 nm dos isolados selecionados após 10 horas

de incubação à 37ºC em meio MRS contendo 0,3% de sais biliares.

Cepas Caldo MRS controle Caldo MRS + 0,3% de Oxgall

L4 2,081 1,690

L24 2,260 1,793

L20 2,215 1,644

L23 2,092 0,932

L19 2,102 1,775

L22 2,236 1,674

De acordo com os resultados obtidos, pode-se classificar as bactérias

isoladas, segundo Deschamps et al., (apud SARON 2003), em quatro grupos diferentes, o

primeiro grupo é representado pelas culturas resistentes, ou seja, aquelas que apresentam um

rápido crescimento em meio contendo Oxgall, como os isolados L24, L4, L22, L19, L23, L5 e

L20. As Figuras 1 a 7, apresentadas a seguir, representam o comportamento destes isolados

em meio MRS contendo o agente inibidor, Oxgall, na concentração de 0,3%.

- 49 –

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

024681012141618202224

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L24 normal

L24 Oxgall

Figura 1: Curva de crescimento do isolado L24 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

024681012141618202224

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L4 normal

L4 Oxgall

Figura 2: Curva de crescimento do isolado L4 em caldo MRS normal e MRS contendo 0,3%

de Oxgall.

- 50 –

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L22 normal

L22 Oxgall

Figura 3: Curva de crescimento do isolado L22 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 1012141618202224

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L19 normal

L19 Oxgall

Figura 4: Curva de crescimento do isolado L19 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall.

- 51 –

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

024681012141618202224

Tempo (hs)

Abs 620 n

L23 normal

L23 Oxgall

Figura 5: Curva de crescimento do isolado L23 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L5 normal

L5 Oxgall

Figura 6: Curva de crescimento do isolado L5 em caldo MRS normal e MRS contendo 0,3%

de Oxgall.

- 52 –

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L20 normal

L20 Oxgall

Figura 7: Curva de crescimento do isolado L20 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall.

Verificou-se que as curvas de crescimento mostraram-se semelhantes, com

aumento nos valores de absorbância somente após as 10 horas de incubação, exceto o isolado

L5 que obteve no tempo 10 horas o valor em d.o. de 0,208 e após mais duas horas de

incubação este valor aumentou para 0,434 .

As culturas tolerantes são aquelas que não se desenvolvem rapidamente em

meio MRS contendo bile, como o isolado L12. A Figura 8 representa a curva de crescimento

do isolado selecionado L12 que apresentou valor de densidade óptica de 0,426 após 15 horas

de incubação.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Tempo (hs)

Abs 620 nm

L12 normal

L12 Oxgall

Figura 8: Curva de crescimento do isolado L12 em caldo MRS normal e MRS contendo

0,3% de Oxgall.

- 53 –

As culturas pouco tolerantes são consideradas aquelas que somente

sobrevivem na presença de sais biliares como os isolados L1, L25, L29, L21, L7, L10, L9,

L26, L15, L2, L11, L13, L14, L3, L27 e culturas sensíveis, que não crescem e se degradam na

presença de sais biliares, como os isolados L8, L17, L30 e L16.

A tolerância diferenciada de lactobacilos na presença de sais biliares foi

também constatado por Gardiner et al. (2002) que avaliaram a tolerância de L. fermentum e L.

rhamnosus em diferentes concentrações de Oxgall (0,0; 0,15; 0,3; 0,5; 0,8 e 1,0%) e

verificaram que a viabilidade de ambos não foi reduzida nas concentrações de 0,3 e 0,5 % de

Oxgall, concluindo que tais bactérias poderiam ser consideradas tolerantes a bile, uma vez que

a concentração de 0,3% é considerada fisiologicamente relevante.

Entretanto, Gilliland, Staley e Bush (1984) compararam a habilidade de sete

cepas de lactobacilos em crescer em MRS, com e sem 0,3% de Oxgall, e verificaram que

quando comparadas com o caldo controle, o Oxgall mostrou-se inibitório para todas elas,

selecionando apenas três cepas.

Garcia (1999) observou que das 21 cepas pré-selecionadas, ou seja, 52% das

culturas apresentaram absorbância, em comprimento de onda de 620 nm, maior que 0,3 após

6 horas de incubação, obtendo os valores de densidade óptica que variaram entre 0,6435 a

1,2522 para os isolados considerados mais resistentes.

Os resultados de resistência à acidez dos isolados selecionados estão na

Tabela 3. Foram observadas interações significativas entre pH e tempo, sendo que os

coeficientes de variação oscilaram entre 3,33 e 9,96.

Verificou-se que no tempo 0 não houve diferença significativa nas

contagens, pelo teste de SNK (P<0,05), entre diferentes valores de pH estudados; entretanto

os isolados L4, L12, L19, e L23 apresentaram as contagens em pH 2,0 menores e

estatisticamente diferentes em relação às observadas em pH 3,0 e controle; sendo estes dois

valores de pH estatisticamente semelhantes, exceto o isolado L22, que apresentou médias

semelhantes em pH 2,0 e 3,0.

Após 1 hora de incubação, constatou-se diferença nas médias obtidas em pH

2,0 em relação ao pH 3,0 e controle, exceto para os isolados L22 e L. casei, cujas contagens

diferiram estatisticamente nos três valores de pH. Nos tempos 2 e 3 horas, verificou-se que as

contagens diferiram estatisticamente em pH 2,0; 3,0 e controle em todos os isolados, exceto

L20 e L23 que obtiveram médias estatisticamente semelhantes entre pH 3,0 e controle, sendo,

portanto os isolados que apresentaram menor influência do baixo pH (pH 3,0) nas contagens.

- 54 –

Tabela 3: Crescimento (log ufc/ml) dos isolados expostos ao ácido clorídrico (HCl 0,1 N) por

até 3 horas.

Isolado Tempo (hs)

0 1 2 3

L4 Controle

6,88 ± 0,14

6,95± 0,04

7,11 ±0,16

7,46± 0,10

L4 pH 2,0

6,30 ±0,20

3,78 ±0,01

0,00 ±0,00

L4 pH 3,0

6,84 ±0,11

6,85 ±0,15

6,44 ±0,31

6,28 ±0,22

L5 Controle

6,95 ±0,06

6,90 ±0,10

7,11 ±0,08

7,54 ±0,12

L5 pH 2,0

6,47 ±0,65

0,00 ±0,00

L5 pH 3,0

6,87 ±0,06

6,73 ±0,21

6,08 ±1,00

5,39 ±1,09

L12 Controle

6,59 ±0,08

6,71 ±0,15

6,73 ±0,11

7,35 ±0,31

L12 pH 2,0

5,28 ±1,11

4,88 ±0,05

0,00 ±0,00

L12 pH 3,0

6,41 ±0,15

6,27 ±0,41

4,5 ±1,17

5,05 ±0,02

L19 Controle

7,26 ±0,17

7,30 ±0,20

7,43 ±0,17

7,45 ±0,12

L19 pH 2,0

6,39 ±0,53

0,00 ±0,00

L19 pH 3,0

7,16 ±0,13

7,14 ±0,15

6,36 ±0,40

5,87 ±0,01

L20 Controle

7,22 ±0,38

7,21 ±0,33

7,31 ±0,33

7,38 ±0,35

L20 pH 2,0

6,55 ±0,09

4,45 ±0,03

3,04 ±0,02

0,00 ±0,00

L20 pH 3,0

7,17 ±0,41

6,97 ±0,64

6,86 ±0,78

6,84 ±0,81

L22 Controle

7,36 ±0,25

7,33 ±0,20

7,36 ±0,22

7,49 ±0,26

L22 pH 2,0

6,21 ±0,40

4,63 ±0,01

2,34 ±0,01

0,00 ±0,00

L22 pH 3,0

6,25 ±0,55

6,23 ±0,63

6,05 ±0,36

6,01 ±0,38

L23 Controle

6,99 ±0,07

7,18 ±0,06

7,22 ±0,05

7,38 ±0,10

L23 pH 2,0

6,14 ±1,24

0,00 ±0,00

L23 pH 3,0

7,04 ±0,04

7,04 ±0,05

7,33 ±0,56

6,89 ±0,32

L24 Controle

7,25 ±0,17

7,29 ±0,20

7,33 ±0,14

7,51 ±0,28

L24 pH 2,0

7,17 ±0,15

0,00 ±0,00

L24 pH 3,0

7,00 ±0,09

7,17 ±0,09

7,26 ±0,18

7,09 ±0,39

L.casei Controle

7,23 ±0,31

7,26 ±0,23

7,32 ±0,28

7,42 ±0,27

L. casei pH 2,0

7,08 ±0,42

1,81 ±0,01

0,00 ±0,00

L. casei pH 3,0

7,15 ±0,41

6,18 ±0,06

6,30± 0,01

6,80± 0,04

*Valores médios provenientes de 3 repetições, expressos em Log (UFC/ml).

Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Student Neuman Keuls a 5%

de probabilidade.

Os isolados que apresentaram maior resistência em pH 2,0 foram L20 e L22,

que perderam a viabilidade somente após 3 horas de incubação.

Succi et al. (2005) testaram 63 cepas de L. rhamnosus em relação a sua

habilidade em crescer em baixos valores de pH, sendo utilizado ácido clorídrico ou a

combinação de ácido láctico e clorídrico com diferentes porcentagens de sais biliares (1,0; 1,5

e 2,0%). Dentre os isolados estudados, somente três cepas mostraram maior crescimento em

tais condições. Observaram também redução de 2 a 3 ciclos log após 2 ou 4 horas de

incubação em pH 3,0 e, em pH 2,0, ocorreu diminuição entre 6 a 8 ciclos log . Entretanto,

- 55 –

quando o pH foi ajustado para 7,0 e adicionou-se 2,0% de sais biliares, observaram melhor

sobrevivência para a maioria das cepas testadas, concluindo que os microrganismos foram

mais afetados pela faixa de pH, que pela exposição a diferentes concentrações de sais biliares.

Chou e Weimer (1999) isolaram e caracterizaram cepas de L. acidophilus

ajustando o pH do meio MRS para 4,0; 5,0; 6,0 ou 7,0 acrescentando 0,3% de ácido

glicócolico, glicodesoxicólico, taurocólico ou oxgall .Os autores observaram que em pH 4,0

todos os isolados testados foram inibidos nos ácido glicocólico e oxgall, enquanto que após 24

horas de incubação a maioria das cepas cresceu em pH 5,0 ou 7,0 em presença dos sais

biliares.

Neumann e Ferreira (1995) avaliando três cepas de lactobacilos isoladas de

humanos verificaram sensibilidade após 24 horas em presença de suco gástrico artificial, pois

após 3 horas as contagens obtidas, em log, foram de 1,74; 2,37 e 3,22. Oxgall a 0,3% pareceu

ser inibitório para as três culturas, atingindo absorbância maior que 0,3 somente após 8 horas

de incubação. Os autores ressaltam tais isolados poderiam ser resistentes “in vivo” visto que

este experimento não permitiu a recirculação dos sais biliares, que remove os sais

desconjugados do trato intestinal humano que possui efeito mais inibitório do que os

conjugados.

Ronka et al. (2003) utilizaram duas cepas de L. brevis e avaliaram o efeito do

baixo pH, por meio da adição de ácido clorídrico e também a suplementação de 0,3% de

Oxgall ao caldo MRS. Os autores verificaram que ambas as cepas mantiveram sua viabilidade

no caldo em pH 4,0, entretanto, quando houve diminuição do pH para 2,0, houve uma redução

de 2 a 7 ciclos log no número de células viáveis após 3 horas de incubação. Em presença de

bile as contagens obtidas para o tempo 0 foram de 4,88 X 10

e 3,45 X 10

e no tempo 24

horas 1,22 X 10

e 3,60 X 10

, portanto, L. brevis poderia ser suplementado em iogurte ou

outro produto lácteo.

Xanthopoulos, Litopoulo-Tanetaki e Tzanetakis (2000) determinaram a

resistência de lactobacilos isolados de recém-nascido a condições de baixo pH, utilizando-se

solução tampão salina (PBS) ajustada para pH 3,0 e a sais biliares (0,15 e 0,50 %). A

viabilidade da maioria das bactérias diminuiu rapidamente após 2 horas sob condições ácidas,

sendo L. reuteri considerado menos resistente, apresentando contagem em log, de 1,70 e L.

paracasei subsp. paracasei a cepa mais resistente apresentando contagens de 9,69. Na

presença de Oxgall, ocorreram variações entre os isolados com relação ao crescimento, as

cepas mais resistentes, após 24 horas foram L. paracasei e L. rhamnosus, que apresentaram as

contagens médias de 7,93 e 8,96, respectivamente.

- 56 –

Gupta, Mital e Garg (1996) caracterizaram cepas de Lactobacillus

acidophilus para serem usadas como adjunto dietético e verificaram que na concentração de

0,3% de Oxgall, três cepas foram completamente inibidas, enquanto outras exibiram 44 a 82%

de inibição e que nenhum isolado cresceu em pH 2,0 quando ácido clorídrico era adicionado

ao caldo MRS; dados semelhantes também foram obtidos por Hood e Zottola (1988).

Entretanto, Conway, Gorbach e Golden (1987) observaram melhor taxa de sobrevivência de

L. acidophilus quando comparada a L. bulgaricus e S. thermophilus, em baixo pH.

Saron (2003) avaliou a resistência de Lactobacillus acidophilus La-5 às

condições de acidez (pH 2,5) no meio MRS adicionado de ácido clorídrico, com e sem a

suplementação de 2% lactulose e verificou que a sobrevivência de tal bactéria se manteve

praticamente igual em MRS com e sem suplementação durante as 3 horas de observação. O

número inicial de La-5 foi de 10

UFC/ml, reduzindo-se para 10

UFC/ml após 1 hora e 10

UFC/ml após 2 horas, sendo que, após 3 horas de incubação manteve-se em 10

UFC/ml. A

taxa de sobrevivência do L. acidophilus demonstrou que esta cultura é bastante resistente às

condições de acidez em pH 2,5. A resistência à concentração de 0,3% de sais biliares também

foi testada, sendo constatado que tal resistência aumentou com a presença de lactulose no

meio.

Suscovic et al. (1997) encontraram alta tolerância de L. acidophilus a pH 3,0.

Conway et al (1987) também observaram melhor taxa de sobrevivência de L. acidophilus

quando comparada a L. bulgaricus e S. thermophilus em baixo pH.

Haller, Colbus e Ganzle (2001) verificaram o efeito da fase de crescimento

de L. sakei no seu potencial para tolerar condições ácidas e bile. No início da fase exponencial

de crescimento (5-8 horas) o efeito bactericida do ácido clorídrico em combinação com o

ácido cólico foi máximo (redução > 5 log ), sendo que a tolerância foi aumentada (redução de

2,8 log) no final da fase exponencial (12 horas). A melhor tolerância (redução de 1,4 log) foi

evidenciada no final da fase exponencial (24 horas). No final da fase estacionária (48 horas) o

número de bactérias tolerantes (redução de 1,5 log) permaneceu similar quando comparada

com a fase estacionária, embora densidade celular tenha diminuindo de 8,1 para 7,4 log,

sugerindo que a fase de crescimento da bactéria afeta sua tolerância.

Pennachia et al. (2004) isolaram e identificaram 150 cepas de lactobacilos

verificaram que somente 27 cepas cresceram em presença de 0,3% de sais biliares e pH 2,5

(PBS) sendo completamente inibidas com o aumento do tempo de incubação.

Mainville, Arcand e Farnwoth (2005) estudaram o comportamento de

algumas cepas probióticas e verificaram que apesar de Lactobacillus GG apresentar redução

- 57 –

de 2 ciclos log após 15 minutos em pH 2,0 (utilização de ácido clorídrico); esta cepa pode

alcançar o cólon em número suficiente para apresentar efeitos benéficos a saúde e que,

somente bactérias altamente resistentes a condições ácidas sobreviveriam. Portanto, ao se

empregar critérios convencionais de exclusão, muitas cepas poderiam ser descartadas, apesar

de possuírem propriedades desejáveis à manutenção da saúde.

A baixa sobrevivência de cepas probióticas em condições que simulem a

passagem através do trato gastrointestinal segundo Erkkila e Petaja (2000), depende da estirpe

utilizada, sendo desta forma, necessário uma adequada seleção das cepas na elaboração de

produtos lácteos probióticos (VINDEROLA; REINHEIRMER, 2003).

Os isolados selecionados foram testados para verificar sua tolerância ao

fenol. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Valores determinados de pH e porcentagem de acidez dos isolados cultivados em

LDR (Leite Desnatado Reconstituído) a 10%, sem e com adição de 0,3% de fenol,

incubados por 3 dias a 35ºC.

Isolados pH controle pH com fenol % de Acidez

Controle

% de Acidez

com fenol

% Redução

4,84±0,04 5,86±0,02 0,570±0,02 0,284±0,02

50,17

4,66±0,12 5,49±0,16 0,624±0,09 0,348±0,06

44,23

L12

4,63±0,19 5,16±0,18 0,670±0,09 0,481±0,04

28,20

L19

5,17±0,35 5,73±0,13 0,407±0,08 0,304±0,03

25,31

L20

4,62±0,02 5,72±0,21 0,648±0,07 0,293±0,05

54,78

L22

5,20± 0,45 5,60±0,15 0,422± 0,11 0,321±0,04

23,93

L23

4,80±0,29 5,63±0,32 0,559±0,15 0,338±0,05

39,53

L24

5,25±0,48 5,95±0,10 0,396±0,12 0,268±0,04

32,32

L casei

3,87±0,20 5,91±0,49 1,163±0,15 0,294±0,08

74,72

L. acidophilus

3,54±0,05 4,04±0,07 1,749±0,19 1,039±0,07

40,59

*Valores médios provenientes de 3 repetições.

% Redução= % de acidez sem fenol - % de acidez com fenol/ % de acidez sem fenol.

Médias seguidas pela mesma letra, nas colunas, não diferem entre si pelo teste de Student Neuman Keuls a 5%

de probabilidade.

Os isolados L19, L22 e L24 apresentaram uma baixa acidificação do leite

durante o período de incubação, sendo encontrados os valores de pH de 5,17; 5,20 e 5,25,

respectivamente. Entretanto estes isolados apresentaram menor porcentagem de redução de

- 58 –

acidez. Estes valores de pH estão abaixo do considerado desejado a um produto fermentado,

pois de acordo com Ronka et al. (2003) este deverá oscilar entre 4,4 a 4,6. Da mesma forma,

Arici et al. (2004) verificaram que os valores de pH do leite, de cepas de lactobacilos

provenientes de crianças, foram menores que 5,50. Os isolados de mais acidificaram o leite

foram L5, L12 e L20.

Houve diferença significativa entre os diferentes isolados com relação à

acidez em presença de fenol pelo teste de SNK a 5 % de probabilidade. L. acidophilus e o

isolado L12 obtiveram maiores valores de acidez, sendo estes estatisticamente diferentes entre

si e também diferentes das demais bactérias, que apresentaram valores médios de acidez

estatisticamente semelhantes. Entretanto, deve-se ressaltar que todas os isolados cresceram na

presença de uma concentração de 0,3 % de fenol. PAULO (1991) verificou tolerância à

concentração de 0,3% de fenol e completa inibição de lactobacilos em presença de 0,5% deste

inibidor. Xanthopoulos, Litopoulo-Tanetaki e Tzanetakis (2000) verificaram um efeito

bacteriostático sobre lactobacilos, em presença de 0,4% de fenol.

- 59 –

4 CONCLUSÃO

Os oito isolados selecionados, L4, L5, L12, L19, L20, L22, L23 e L24,

apresentaram potencial de uso como probiótico, em função do comportamento demonstrado

sob condições ácidas, utilizando-se ácido clorídrico e presença de sais biliares, por meio da

adição de Oxgall ao meio MRS sendo também capazes de crescer na presença de fenol.

- 60 –

REFERÊNCIAS

ARICI, M.; BILGIN, B.; SAGDIG, O.; OZDEMIR, C. Some characteristics of Lactobacillus

isolates from infant faeces. Food Microbiology, London, v. 21, p. 19-24, 2004.

BERRADA, N.; LEMELAND, J.F.; LAROCH, G. Bifidobacterium from fermented milks:

survival during gastric transit. Journal of Dairy Science, Champaign, Ill, v. 74, p. 409-413,

1991.

CHARTERIS, W.P.; KELLY, P. M.; MORELLI, L. Development and application of an in

vitro methodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and

Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract. Journal of Applied

Microbiology, Oxford, v. 84, p.759-768, 1998.

CHOU, L.; WEIMER, B. Isolation and characterization of acid- and bile-tolerant isolates

from strains of Lactobacillus acidophilus. Journal of Dairy Science, Champaign, Ill, v. 82,

p.23-31, 1999.

COLLINS, J.K.; THORNTON, G.; O’SULLIVAN, G. Selection of probiotic strains for

human applications. International Dairy Journal, Barking, v. 8, p. 487-490, 1998.

CONWAY, P.L.; GORBACH, S.L.; GOLDEN, B.R. Survival of lactic acid bacteria in the

human stomach and adhesion to intestinal cells. Journal of Dairy Science, Champaign, Ill, v.

70, p.1-12. 1987.

ERKKILA, S.; PETAJA, E. Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in

the presence of bile salts for potential probiotic use. Meat Science, Barking, v.55, p.297-300,

2000.

GARCIA, S. Isolamento e caracterização de bactérias lácticas para uso como probiótico.

1999. 156 p. Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos e Medicamentos) - Universidade

Estadual de Londrina, Londrina.

GARDINER, G.E.; HEINEMANN, C.; BAROJA, M.L.; BRUCE, A.W.; DEE, B.;

MADRENAS, J.; REID, G. Oral administration of the probiotic combination Lactobacillus

rhamnosus GR-1 and L. fermentum RC-14 for human intestinal applications. International

Dairy Journal, Barking, v.12, p. 191-196, 2002.

GILLILAND, S.E.; STALEY, T.E.; BUSH, L.J. Importance of bile tolerance of Lactobacillus

acidophilus used as a dietary adjunct. Journal Dairy Science, Champaign Ill, v. 67, p.3045-

3051, 1984.

- 61 –

GILLILAND, S.E.; SPECK, M.L. Deconjugation of bile acids by intestinal lactobacilli.

Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 33, p. 15-18, 1987.

GUPTA, P.K.; MITAL, B. K.; GARG, S. K. Characterization of Lactobacillus acidophilus

strains for use as dietary adjunct. International Journal of Food Microbiology,

Amsterdam, v. 29, p.105-109. 1996.

HALLER, D.; COLBUS, H.; GANZLE, M.G. Metabolic and functional properties of lactic

acid bacteria in the gastrointestinal ecosystem: a comparativa in vitro study between bacteria

of intestinal and fermented food origin. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart, v.

24, p.218-226, 2001.

HAMILTON, J.M.M.; SHAH, S.; WINKLER, J.T. Public health issues arising from

microbiological and labeling quality of foods and supplements containing probiotic

microorganisms. Public Health and Nutrition, v. 2, n.2, p. 223-229. 1999.

HOOD, S.K.; ZOTTOLA, S.A. Effect of low pH on the abiliy of Lactobacillus acidophilus to

survive and adhere to human intestinal cells. Journal of Food Science, Chicago, v. 53, p.

1514-1516, 1988.

LABORATÓRIO NACIONAL DE REFERÊNCIA ANIMAL. Métodos Analíticos Oficiais

para Controle de Produtos de Origem Animal e seus ingredientes. Brasília, 1981. v. 1.

LANKAPUTHRA, W.E.V.; SHAH, N.P. Survival of Lactobacillus acidophilus and

Bifidobacterium ssp in the presence of acid and bile salts. Cultured Dairy Products Journal,

Washington, v.30, p.2-7, 1995.

LIN, M.; CHEN, T. Reduction of cholesterol by Lactobacillus acidophilus in culture broth.

Journal of Food and Drug Analysis, v. 8, p. 97-102, 2000.

MAINVILLE, I.; ARCAND, Y.; FARNWORTH, E.R. A dynamic model that simulates the

human upper gastrointestinal tract for the study of probiotics. International Journal of Food

Microbiology, Amsterdam, v. 99, p.287-296, 2005.

MITSUOKA, T. Intestinal flora and human health. Asia Pacific Journal of Clinical

Nutrition, v 1, p.2-9, 1996.

NEUMANN, E.; FERREIRA, C.L.L.F. Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct: “in

vitro” susceptibility to gastric juice, bile salts, lysozyme and chemotherapeutic agents.

Revista de Microbiologia, São Paulo, v. 26 , p. 59-65, 1995.

- 62 –

PAULO, E.M. Isolamento e caracterização de Lactobacillus acidophilus de fezes de

suínos para uso como probiótico. 1991. 73 p. Tese (Mestrado em Microbiologia Agrícola) -

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.

PENNACHIA, C.; ERCOLINI, D.; BLAIOTTA, G.; PEPE, O.; MAURIELLO, G.;

VILLANI, F. Selection of lactobacillus strains from fermented sausages for their potential

use as probiotic. Meat Science, Barking, v. 67, p.309-317, 2004.

RASIC, J.L.; KURMANN, J.A. Bifidobacteria and their role. Basel: Birkhauser Verlag,

1983. 295 p.

RONKA, E.; MALINEN, E.; SAARELA, M.; RINTA-KOSKI, M.; AARNIKUNNAS, J.;

PALVA, A. Probiotic and milk technological properties of Lactobacillus brevis.

International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.83, p.63-74. 2003.

SARON, M.L.G. Aproveitamento do permeado de soro de leite bovino através de

transformações da lactose em lactulose e como ingrediente para meios de cultura de

bactérias probióticas. 2003. 107 p. Tese (Mestrado em Alimentos e Nutrição) - Universidade

de Campinas, Campinas.

SUCCI, M.; TREMONTE, P.; REALE, A.; SORRENTINO, E.; GRAZIA, L.; PACIFICO, S.;

COPPOLA, R. Bile salts and acid tolerance of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from

Parmigiano Reggiano cheese. FEMS Microbiology Letters, Amsterdam, v. 244, p. 129-137,

2005.

SUSCOVIC, J., BRKIC, B., MATOSIC, S., MARIC, V. Lactobacillus acidophilus M92 as

potential probiotic strain. Milchwissenschaft, München, v. 52, p.430-435.1997.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA – UFV. Manual de utilização do programa

SAEG (Sistema para Analises Estatísticas e Genéticas). Viçosa: Imprensa Universitária, p.

1999. 59 p.

VINDEROLA, C.G; REINHEIMER, J.A. Lactic acid starter and probiotic bacteria: a

comparative “ in vitro” study of probiotic characteristics and biological barrier resistence.

Food Research International, Barking, v. 36, p.895-904, 2003.

XANTHOPOULOS, V.; LITOPOULOU-TANETAKI, E.; TZANETAKIS, N.

Characterization of Lactobacillus isolates from infant faeces as dietary adjuncts. Food

Microbiology, London, v.17, p.205-215, 2000.

- 63 –

CAPITULO 3

- 64 –

UTILIZAÇÃO DE PREBIÓTICOS POR ISOLADOS DE LACTOBACILOS E SUA

RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS DA TERAPIA HUMANA

RESUMO

O presente trabalho teve como objetivo verificar a fermentação de oligossacarídeos por

lactobacilos isolados e previamente selecionados como também a resistência destes isolados a

alguns antibióticos comumente utilizados em humanos. Foi utilizado o caldo MRS isento de

glicose e extrato de carne adicionado de 1% de oligofrutose, inulina ou goma acácia. Para o

antibiograma, empregou-se o método de difusão em placa. Os resultados obtidos

evidenciaram que todas cepas foram capazes de utilizar os substratos testados. Os isolados

foram resistentes a eritromicina, porém não se determinou se esta característica era intrínseca

ou adquirida.

Palavras-chave: goma acácia, inulina, microflora intestinal, oligofrutose.

ISOLATED Lactobacillus spp RESISTANCE TO ANTIBIOTICS FROM THE

HUMAN THERAPY, AND THE USE OF PREBIOTICS BY THOSE STRAINS

ABSTRACT

The aim of the present work was to verify the oligosaccharides fermentation by eight selected

strains, isolated from infant feces, as well as the resistance of those strains to antibiotics

commonly used in humans. MRS medium was used in this experiment, substituting the

glucose by 1% of oligofructose, inulin or acacia gum. For the antibiogram, it was used the

disk diffusion method. The obtained results evidenced that all strains were able to metabolize

the substrates evaluated. All the isolated ones were resistant to streptomycin, however it was

not determined the plasmids presence for the verification of the resistance transmission.

Key words: Acacia gum, intestinal microflora, inulin, oligofrutose.

- 65 –

1 INTRODUÇÃO

Prebióticos e Simbióticos

As bactérias láticas, tais como os lactobacilos, são pertencentes ao grupo das

bactérias benéficas, e atualmente existe um interesse na manutenção da predominância destes

gêneros na microbiota intestinal humana. Em conseqüência, os probióticos têm sido usados

para esta finalidade. No entanto, estas mudanças podem ser transientes e a implantação destas

bactérias torna-se limitada (GORBACH; GOLDIN, 1992); frente a estas dificuldades

introduziu-se o conceito de prebióticos.

Tem sido sugerido que a habilidade das bactérias probióticas em utilizar

oligossacarídeos pode ser uma importante característica, devido à disponibilidade destes

carboidratos, uma vez que os mesmos não são metabolizados e absorvidos no intestino

delgado, influenciando assim no estabelecimento da microflora no cólon (MACFARLANE;

CUMMINGS,1999).

Os prebióticos são similares a outros carboidratos que alcançam o ceco,

como polissacarídeos não amiláceos, álcoois de açúcares e amido resistente, que são

substratos para a fermentação. Eles diferem no efeito seletivo exercido na microflora e em seu

potencial de causar flatulência (CUMMINGS e MACFARLANE, 2001).

Devido ao fato de que tais carboidratos são utilizados por somente algumas

cepas específicas de Lactobacillus e Bifidobacterium, dietas contendo os então denominados

substratos prebióticos poderiam favorecer tais bactérias.

Prebióticos têm sido definidos como ingredientes alimentares não

digestíveis, que afetam beneficamente o hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento

e/ou atividade de um número limitado de bactérias no cólon. Entretanto, para um ingrediente

ser classificado como prebiótico, o mesmo não deverá ser hidrolisado ou absorvido no

intestino grosso, ser substrato seletivo para uma ou um número limitado de bactérias

benéficas comensais no cólon, as quais são estimuladas a crescer e/ou são metabolicamente

ativadas; sendo desta forma capazes de alterar a flora no cólon a favor de uma composição

saudável e induzir efeitos no lúmen ou sistêmicos que são benéficos para a saúde do

hospedeiro (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

Entretanto, os prebióticos, segundo Ouwehand et al (2005), também podem

ser indicados para promover a saúde no intestino delgado. Neste local, a comunidade

- 66 –

microbiana é pequena em termos numéricos e apresenta menor diversidade quando

comparada ao cólon, sendo assim, diferentes prebióticos que são úteis no cólon poderiam ser

usados. O trato urogenital também pode ser considerado um novo alvo para os prebióticos,

pois abriga uma microbiota diversificada que também está sujeita a distúrbios. Ainda segundo

o referido autor, diferentes estágios da vida requerem variados tipos de prebióticos para

promover a saúde.

Os ingredientes alimentares que atendem a esses requerimentos são

principalmente os frutooligossacarídeos (FOS) e inulina, além de galactooligossacarídeo

(GOS), lactulose, isomalto-oligossacarídeo, xilo-oligossacarídeo, gentio-oligossacarídeos e

oligossacarídeos.

Vários oligossacarídeos aumentam a multiplicação de células epiteliais,

refletindo num aumento da área de superfície do ceco e massa do intestino delgado, ceco e

cólon. Orban, Patterson e Sutton (1997) verificaram que há uma correlação inversa entre o pH

do conteúdo intestinal e peso do ceco, área de superfície e profundidade de cripta do ceco,

sendo estas mudanças morfológicas favoráveis à absorção de nutrientes. Os oligossacarídeos

aumentam a absorção mineral havendo também uma relação inversa entre absorção mineral e

o pH.

As bactérias intestinais capazes de crescer na presença de carboidratos são

espécies sacarolíticas pertencentes aos gêneros Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus e

Clostridium. Entretanto, devido à extrema complexidade do ecossistema do intestino, vários

grupos de bactérias são incapazes de degradar polímeros de carboidratos diretamente, porém

bactérias sacarolíticas são rapidamente adaptadas para crescer em carboidratos complexos,

devido à sua habilidade em produzir uma variedade de polihidrolases e glicosidases

(SALYERS; LEEDLE, 1983). Embora algumas bactérias no cólon possam sintetizar

diferentes tipos de enzimas sacarolíticas, o metabolismo de carboidratos é provavelmente

dependente da cooperação de diferentes enzimas e várias espécies bacterianas fazem parte

deste processo (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

Os mecanismos pelos quais os oligossacarídeos prebióticos são seletivamente

metabolizados pela microflora benéfica ainda não são adequadamente entendidos. Parece

haver dois mecanismos no metabolismo de prebióticos. O mais bem conhecido é estas

bactérias possuírem exoglicosidases. Tais enzimas atuariam pela hidrólise de

monossacarídeos a partir da extremidade não redutora da molécula do oligossacarídeo, sendo

então captados pela célula. Este mecanismo parece ocorrer em B. infantis, que possui

atividade β - frutofuranosidase (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

- 67 –

O outro mecanismo alternativo parece ser a captação de moléculas intactas

de oligossacarídeos seguido pelo metabolismo intracelular, existindo algumas evidências de

que este mecanismo ocorre em algumas espécies. Entretanto, o entendimento de como

ocorrem estes dois mecanismos “in vivo” precisa ser melhor elucidado (RASTALL et al.,

2005).

As análises de carboidratos mostram clara diferença na maneira de

degradação entre as bactérias, pois cada uma utiliza os oligossacarídeos inulina e oligofrutose

por uma via específica, evidenciando que as enzimas são constitutivas. Não se sabe, porém, se

são específicas para cada substrato; pois as cepas mostram similar modo de utilização, sendo

os oligossacarídeos menores os mais rapidamente utilizados (HATERMINK et al., 1997).

Estuda-se também, a possibilidade de manipulação da microflora pelo uso de

simbióticos, que são probióticos e prebióticos usados em combinação. Os microrganismos

vivos (probióticos) podem ser usados em combinação com substratos específicos

(prebióticos), como por exemplo, o fornecimento de frutoligossacarídeo com bifidobactérias e

lactitol com lactobacilos, sendo que esta combinação pode melhorar a sobrevivência das

bactérias probióticas devido ao fato de que seu substrato específico está prontamente

disponível para sua utilização, resultando em vantagens para o hospedeiro, proporcionada pela

colonização destas bactérias (COLLINS; GIBSON, 1999).

Desta forma, o fornecimento de simbióticos afeta beneficamente a saúde do

hospedeiro aumentando a sobrevivência e implantação de microrganismos vivos

(suplementados na dieta) no trato gastrointestinal, através da estimulação seletiva do

crescimento e/ou pela ativação do metabolismo de um ou um número limitado de bactérias

promotoras da saúde melhorando o bem estar no hospedeiro (GIBSON; ROBERFROID,

1995).

Lactobacillus e Bifidobacterium estão entre as bactérias encontradas na

microflora do cólon que exercem efeitos benéficos no hospedeiro, e a administração de

oligossacarídeos não digeríveis como rafinose, frutoligossacarídeos, galactosillactose,

isomaltoligossacarídeo transgalactosil oligossacarídeos (TOS) são responsáveis por aumentos

nas contagens destes microrganismos no intestino (GIBSON; ROBERFROID, 1995).

A administração de bifidobactéria e FOS tem mostrado resultados

promissores na diminuição no número de criptas anormais, embora não exista uma relação

clara entre a presença destas criptas e o número de bifidobactérias e microrganismos

produtores de toxinas (WALKER; DUFFY, 1998).

- 68 –

Um grupo específico de oligossacarídeos que tem atraído interesse comercial

como prebiótico são os frutoligossacarídeos (FOS), que são uma série de unidades de frutose

unidas por ligações à molécula de frutose da sacarose, podendo ainda ser produzidos via

hidrólise da inulina ou via transfrutosilação da sacarose, sendo também encontrados em

muitos cereais, incluindo cevada, trigo e centeio (SULLIVAN, 1996).

Outro prebiótico é a inulina, que é um polissacarídeo não amiláceo que

consiste em cadeias de unidades de frutose unidas por ligações β (2 →1) e que

freqüentemente terminam com uma única molécula de glicose, ocorrendo naturalmente como

carboidrato de reserva em muitas espécies de plantas. Estudos “in vitro” e “in vivo”

utilizando-se animais e humanos comprovam que a inulina pode ser considerada um

prebiótico com fator bifidogênico, pois estimula seletivamente o crescimento de bactérias

como Bifidobacterium, Lactobacillus e Bacteroides em detrimento de microrganismos

potencialmente patogênicos como E. coli e clostrídeos (HAVENAAR et al., 1999).

As plantas comestíveis com maior quantidade de inulina incluem a cebola,

chicória, alho–poró, alho e trigo. Recentemente, o interesse neste oligossacarideo tem

aumentado devido às suas propriedades funcionais como substituto de gordura, seu poder

adoçante, propriedades das fibras solúveis e como intensificador da saúde do trato

gastrointestinal (ROBERFROID e DELENNE, 1998).

Causey et al. (2000) avaliaram a administração diária de 20 gr de inulina para

12 homens com moderada hipercolesterolemia durante três semanas e observaram uma maior

flatulência, como resultado da maior fermentação microbiana, além de redução nos níveis de

triglicerídeos séricos, entretanto, o peso das fezes e pH , trânsito intestinal e níveis de glicose

sanguíneos não foram afetados pelo tratamento.

De acordo com Roberfroid (2000) para justificar as alegações de redução de

risco de doenças, a maioria das informações disponíveis necessitam serem confirmadas em

humanos através de estudos envolvendo nutrição.

Oligofrutose é o nome comum dado apenas a oligômeros de frutose que são

compostos de 1-kestose (GF

), nistose (Gf

)e frutofuranosil nistose (GF

), em que as

unidades de frutosil (F) são ligadas na posição β 1-2, da sacarose, o que os distingue de outros

oligômeros (PASSOS; PARK, 2000).

A utilização de oligofrutose quando fornecida a humanos em baixas

dosagens (5 g/dia) quando comparada ao placebo (sacarose) foi avaliada por Rao (2001)

sendo constatado diferenças significativas nas contagens de bifidobactérias, anaeróbios totais

e bacteróides. Verificou-se maiores contagens no grupo que recebeu oligossacarídeo com

- 69 –

diminuição de coliformes; entretanto não houve diferença nas contagens de aeróbios totais.

Entretanto, Wang e Gibson (1993) encontraram um aumento no crescimento de E. coli na

presença de oligofrutose.

A utilização de carboidratos no cólon resulta na produção de acetato,

propionato e butirato na proporção de 55:20:15. Entretanto, Sghir, Chow e Mackie (1998)

verificaram que o crescimento em cultura contínua com inóculo proveniente de fezes

humanas, utilizando-se FOS como única fonte de carbono e energia, a produção foi quase que

exclusivamente de acetato e lactato, deduzindo que esta cultura poderia consistir basicamente

de bifidobactérias e/ou lactobacilos, os quais produzem preferencialmente estes ácidos

orgânicos.

Neste mesmo experimento, verificou-se somente uma pequena modificação

nas contagens de bifidobactérias devido ao fato de que o pH da cultura contínua ter variado

entre 5,2 e 5,5, pois o pH para o ótimo crescimento destas bactérias deve oscilar entre 6,5 e

7,0, sendo, portanto, incapazes de crescerem em pH menor que 5,0. Bacteróides e

bifidobactérias não foram detectadas três dias após o início do experimento, e lactobacilos

(42% da população total) e provavelmente outras bactérias láticas tornaram-se predominantes.

Entretanto, sob condições controladas, as bifidobactérias crescem mais rapidamente do que

lactobacilos.

McBain e Macfarlane (2001) verificaram que a fermentação de inulina e

GOS, em cultura contínua, ocorre principalmente no cólon proximal, sendo associado com a

estimulação na população de lactobacilos (cerca de 10 vezes) ocorrendo um menor aumento

de bifidobactérias. Entretanto, os níveis populacionais de peptostreptococci, enterococcci e

Clostridium perfringens também aumentaram. A utilização destes carboidratos estava

associada com a síntese de nitroredutase e azoredutase e redução enzimática de α -

glucosidase e β-glucuronidase.

O efeito bifidogênico da inulina não foi comprovado por Tuohy et al (2001)

que verificaram apenas um pequeno aumento na população de bifidobactérias e lactobacilos

quando este prebiótico foi fornecido a humanos durante 14 dias.

Um outro substrato com potencial de uso como prebiótico é a goma acácia,

também conhecida como goma arábica, é originária do exudato da árvore acácia, sendo

comumente usada como aditivo em alimentos. É definida pela farmacopéia como: “exudado

gomoso, que ocorre naturalmente, obtido pela incisão de troncos e galhos da Acácia Senegal e

outras espécies de Acácia de origem africana”.

- 70 –

Historicamente a goma acácia foi primeiramente usada pelos egípcios há

mais 4000 anos atrás como adesivo para pigmentos minerais nas pinturas, cosméticos, tinta

para escrever e nos panos utilizados como envoltórios no processo de mumificação. No uso

terapêutico era empregada para aliviar irritações tópicas e proteger nos casos superficiais de

escoriações, queimaduras e ulcerações (CAIUS; RADHA, 1942). Atualmente ela é

amplamente usada na indústria de alimentos, produtos farmacêuticos, cosméticos, explosivos,

têxteis e nos processos de microencapsulação (Sánchez et al., 2002) de culturas probióticas

visando a proteção destas bactérias durante secagem, armazenamento e trânsito gástrico

(DESMOND et al., 2002).

Existem cerca de 700 tipos de Acácia, das quais poucas produzem gomas em

volumes de interesse industrial. Após a colheita, a goma acácia é purificada por simples

processo físico de centrifugação e filtração, sem que haja qualquer modificação química ou

enzimática; após é esterilizada para garantir padrão microbiológico e finalmente obtém-se,

através de processo de secagem por atomização (“spray-drying”) um produto em pó ou

granulado altamente hidrossolúvel (CNI, 2000).

A goma acácia compreende uma cadeia altamente ramificada de polímeros

de galactanos, com cadeias de galactose e/ou arabinose, possivelmente terminadas por

resíduos de ramnose ou ácido glucurônico. Ela não é digerida no intestino delgado sendo,

portanto, um substrato potencial para microflora do cólon. Esta goma parece ser altamente

fermentada in vivo em humanos e ratos, e in vitro usando flora fecal de humanos e suínos.

Entretanto, em alguns trabalhos observa-se baixa concentração de ácidos graxos voláteis

quando fornecida a ratos. Estas diferenças podem ser devido à composição bioquímica das

gomas e/ou tempo de administração (MICHEL et al., 1998). Tem sido sugerido que a

adaptação da atividade de fermentação ocorre quando a duração da administração da goma é

prolongada. (WYATT; BAYLISS; HOLCROFT, 1987).

Resistência bacteriana a antibióticos

Os critérios a serem levados em consideração para a seleção de

microrganismos probióticos, segundo Saarela et al. (2000), incluem segurança, funcionalidade

e aspectos tecnológicos. Em relação aos aspectos relacionados à segurança, estes incluem as

seguintes especificações:

- as estirpes para uso humano devem ser preferencialmente de mesma origem;

- estas devem ser isoladas do trato gastrointestinal de pessoas saudáveis;

- 71 –

- não devem possuir histórico de patogenicidade;

- não deverão estar associadas a doenças como endocardite infecciosa ou a desordens

do trato gastrointestinal;

- não devem desconjugar sais biliares (a desconjugação ou desidroxilação pode ser

negativa no intestino delgado);

- não devem carrear genes transmissíveis de resistência a antibióticos, havendo a

necessidade de testar cada estirpe.

Recentemente, tem sido dado ênfase ao alimento como sendo um veículo que

pode carrrear genes de resistência a antibióticos. Em geral, acredita-se que culturas starter

possuem potencial para servirem como reservatório de tais genes com risco de transferência

para bactérias patogênicas (BOWER e DAESCHEL, 1999).

Os lactobacilos são comuns em alimentos e são membros da microflora

residente do trato gastrointestinal de humanos e de animais. Devido a sua ampla distribuição,

são consideradas bactérias comensais e podem funcionar como um vetor de disseminação de

resistência a antibióticos via cadeia alimentar para o consumidor (GEVERS; HUYS;

SWINGS, 2003).

Quando uma determinada espécie de microrganismo é inicialmente sensível

a um agente antimicrobiano, esta, pode adquirir resistência através de mutação espontânea ou

através da aquisição de material genético a partir de bactérias resistentes pela transformação,

transdução ou conjugação (TAN; TILLETT; McKAY, 2000).

De acordo com Zhou et al. (2005) muitas bactérias lácticas (LAB) são

resistentes a antibióticos e esta resistência é freqüentemente intrínseca e não transmissível.

Entretanto, algumas LAB que podem possuir genes de resistência codificados por plasmídeos

como estirpes de L. fermentum, L. plantarum e L. reuteri. A transmissão de genes de

resistência para espécies patogênicas ou potencialmente patogênicas no intestino deverá ser

um critério levado em consideração na seleção e segurança de estirpes probióticas. Por outro

lado, a resistência intrínseca de estirpes probióticas pode beneficiar pacientes cuja microbiota

intestinal normal tenha sido desbalanceada ou drasticamente reduzida devido à administração

de vários agentes antimicrobianos.

Entretanto, mudanças drásticas podem afetar a microflora intestinal normal

pela administração de antibióticos terapêuticos, sendo o balanço microbiano alterado. Estas

cepas de lactobacilos resistentes podem proteger efetivamente o equilíbrio natural da

microflora intestinal durante e após a terapia com antibióticos, caso os isolados sejam

comprovadamente resistentes. As cepas também podem ser úteis na produção de produtos

- 72 –

lácteos caso os antibióticos estejam presentes no leite, devido ao uso como promotor de

crescimento ou na terapia de animais domésticos (XANTHOPOULOS; LITOPOULOU-

TZANETAKI ; TZANETAKIS, 2000).

O objetivo deste trabalho foi verificar se os isolados selecionados, L4, L5,

L12, L19, L20, L22, L23 e L24 utilizam alguns substratos considerados prebióticos como

oligofrutose, inulina e goma acácia, assim como determinar sua resistência aos antibióticos

normalmente usados na terapia humana.

- 73 –

2 MATERIAL E MÉTODOS

O presente trabalho foi conduzido no Laboratório de Tecnologia de

Alimentos e no Laboratório de Microbiologia e Bioquímica, da Universidade Estadual de

Londrina e da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, respectivamente. Os isolados

testados foram selecionados de acordo com a capacidade de resistir à presença de sais biliares,

acidez e fenol.

Crescimento “in vitro” de isolados de Lactobacillus spp em inulina, oligofrutose e goma

acácia

Neste experimento, foi utilizado o caldo MRS isento de glicose e extrato de

carne adicionado de 1% de oligofrutose, inulina ou goma arábica. A oligofrutose e inulina são

fabricadas pela Orafti (nome comercial Raftilose ® e Raftiline ®) sendo obtidas

industrialmente por extração com água quente das raízes de chicória frescas. A goma arábica

(Fibregum ®) foi gentilmente doada pela empresa Colloides Naturels Brasil. O caldo foi

distribuído em tubos de ensaio contendo tubos de Durhan invertidos sendo esterilizados a

121ºC por 15 minutos. As culturas a serem testadas foram anteriormente estriadas em ágar

MRS e as colônias isoladas diluídas em água estéril para obtenção de uma suspensão

homogênea. À partir desta solução, os tubos contendo os prebióticos foram inoculados a 1%

(v/v), sendo incubados a 37ºC por 24 horas (HATERMINK et al., 1997 e GARCIA, 1999).

As amostras foram plaqueadas em ágar MRS logo após a inoculação nos respectivos caldos e

também posteriormente ao período de incubação.

Antibiograma

Os isolados foram confrontados com antibióticos comumente utilizados na

terapia em humanos, sendo utilizada a cultura comercial probiótica liofilizada de L.

acidophilus (La-5

) como padrão. Empregou-se o método de difusão em placa, onde após

ativação das culturas foram feitas estrias em ágar MRS, sendo as células removidas da

superfície com solução salina. As suspensões celulares (0,5 na escala McFarland) foram

inoculadas em ágar MRS, sendo adicionado os discos impregnados com os seguintes

antibióticos: penicilina G (10UI), tetraciclina (30 mcg), eritromicina (15 mcg), cloranfenicol

(30 mcg), estreptomicina (10 mcg). Consultou-se a tabela “Laborclin” ® para a interpretação

do halo de inibição, sendo que os testes foram realizados em triplicatas.

- 74 –

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Crescimento “in vitro” de isolados de Lactobacillus spp em inulina, oligofrutose e goma

acácia

Os resultados dos plaqueamentos em ágar MRS dos oito isolados

selecionados nos substratos prebióticos no tempo 0, logo após a inoculação, e no tempo 24

horas estão na Tabela 1 e 2. A Tabela 3 mostra os resultados (em delta) decorrentes deste

intervalo avaliado.

Tabela 1: Contagem dos isolados em caldo MRS acrescido de 1% de oligofrutose, inulina ou

goma acácia no Tempo 0.

Prebióticos

Isolados MRS normal MRS +

oligofrutose

MRS + inulina MRS + Goma

acácia

L4 5,81 5,69 5,78 5,68

L5 5,99 5,97 5,99 5,87

L12 6,89 6,79 6,72 6,71

L22 6,66 6,65 6,55 6,65

L19 5,82 5,95 6,02 5,96

L20 5,46 5,40 5,37 5,29

L23 6,05 5,99 6,04 5,98

L24 5,60 5,58 5,65 5,70

Valores expressos em Log (UFC/ml).

- 75 –

Tabela 2: Contagem dos isolados em caldo MRS acrescido de 1% de oligofrutose, inulina ou

goma acácia no Tempo 24 horas.

Prebióticos

Isolados MRS normal MRS +

oligofrutose

MRS + inulina MRS + Goma

acácia

L4 8,87 8,46 8,50 8,48

L5 8,97 8,54 8,56 8,84

L12 8,91 8,47 8,60 8,60

L22 8,73 8,73 8,66 8,35

L19 9,57 8,80 8,72 8,49

L20 8,56 8,63 8,63 8,41

L23 9,14 8,48 8,48 8,24

L24 9,76 8,81 8,75 8,32

Valores expressos em Log (UFC/ml).

Tabela 3: Valores, expressos em log, dos plaqueamentos nos tempos 0 e 24 horas (T0 - T24)

utilizando diferentes oligossacarídeos.

Isolado MRS normal MRS +

oligofrutose

MRS + inulina MRS + Goma

acácia

L5 2,98

2,57

2,66

L19 4,11

3,23

3,26

3,12

L20 3,77

2,84

2,72

b c

2,53

L22 2,07

2,07

2,11

1,69

L23 3,08

2,49

2,44

2,26

L24 4,15

3,23

3,10

2,60

Médias seguidas pela mesma letra, nas linhas, não diferem entre si pelo teste de Student Neuman Keuls a 5% de

probabilidade.

Através dos resultados obtidos, verificou-se que todos os isolados

apresentaram crescimento nos caldos analisados sem produzir gás.

Houve diferença significativa entre os diferentes isolados com relação a

utilização dos substratos avaliados. Os isolados que apresentaram maior crescimento no caldo

controle foram L5, L19, L20, L23 e L24. Para o isolado L24 os tratamentos, inulina e

oligofrutose, não diferiram estatisticamente. Verificou-se resultado semelhante para o isolado

- 76 –

L20, entretanto, as médias para inulina e goma acácia foram estatisticamente semelhantes.

Para o isolado L22 os tratamentos não diferiram estatisticamente, exceto o tratamento goma

acácia.

Bagatini (2002) avaliando o crescimento de L. acidophilus em caldo MRS

acrescido de Raftilose (oligofrutose), após 24 horas de incubação, obteve uma maior

contagem, que foi de 1,0 X10

ufc/ml, quando comparado aos isolados testados neste

experimento.

Mitchel et al. (1998) avaliaram a fermentabilidade in vitro de goma acácia

sendo utilizada fezes de voluntários humanos saudáveis adicionada de duas fontes de goma

acácia além de frutoligossacarídeos. Os autores constataram que a contagem de bactérias

lácticas aumentou 6,75 vezes, sendo que Lactobacillus ssp apresentou um aumento de 1,8

ciclos logarítmos em pH 6,5 e o número de clostrídios diminuiu (pH 5,8) quando comparado

ao controle.

Ainda segundo os referidos autores, o crescimento de bactérias lácticas foi

favorecido pelo aumento de 1,2 ciclos logarítmos quando foi adicionado FOS, ocorrendo um

aumento similar em Lactobacillus ssp. Observou-se variação na produção de butirato, com

efeito butirogênico de uma das fontes de goma em pH 5,8; sendo que o pH afetou a produção

de butirato somente em presença de FOS, uma vez que este substrato pode ser fermentado por

Bifidobacterium sp, Lactobacillus sp Streptococcus sp, Bacteroides sp, Clostridium sp e

algumas enterobactérias. Em condições ácidas, o desenvolvimento das bactérias lácticas

poderia ser favorecido permitindo estes microrganismos competir com outros fermentadores

de FOS.

Bourquin, Titgemeyer e Faltey (1996) também verificaram que goma acácia

foi extensivamente fermentada “in vitro” por bactérias provenientes de três amostras fecais e

que a produção de ácidos graxos voláteis foi maior neste substrato, quando comparado à

pectina de citrus.

Fooks e Gibson (2002) constataram o crescimento de L. plantarum, L.

pentosus, L reuteri e L. acidophilus em caldo MRS adicionado de 1% de oligofrutose, XOS,

lactulose, lactitol, amido e dextrano, sendo verificado o crescimento através de densidade

óptica por 24 horas. Os autores observaram que a maior taxa de crescimento foi obtida

quando o meio continha glicose como fonte de carbono e energia, oligofrutose, xilo

oligossacarídeos (XOS) e sua combinação, sendo estes fermentados preferencialmente em

relação aos demais substratos. Verificou-se que L. plantarum cresceu mais rapidamente

- 77 –

quando comparado às outras espécies de lactobacilos, independente da fonte de carboidrato

utilizada.

Brink et al. (2003) avaliaram a densidade óptica, após 24 horas, de estirpes

probióticas de lactobacilos que cresceram em raftilose, raftiline e synergy 1 (inulina +

oligofrutose) e verificaram que o melhor substrato foi a combinação de ambos

oligossacarídeos. Entretanto, ao comparamos inulina e oligofrutose foram obtidos os

seguintes valores, em d.o.: L. plantarum (0,058 e 0,048); L. casei 241 (1,287 e 1,033) e L.

pentaceus (1,077 e 0,942) que portanto, cresceram melhor em inulina e L. curvatus (0,918 e

0,922) e L. casei (1,029 e 1,70) cresceram melhor em raftilose.

O estudo do crescimento de lactobacilos na presença de inulina foi verificado

em um sistema simulador do ecossistema microbiano humano (SHIME), adicionando-se 2,5

g do prebiótico. Houve aumento na concentração de lactobacilos e de bifidobactérias no cólon

na primeira semana, sendo estes valores significativos somente após a segunda semana. A

população de lactobacilos foi equivalente a 1,5 ciclo logarítmo mais alta no cólon ascendente

e transversal, quando comparada ao inicio do experimento. Ao se comparar a adição de

inulina ao tratamento controle, foram obtidos os maiores valores, em logarítmo, para o

tratamento contendo inulina no cólon transverso (6,91) quando comparado ao controle que

foi de 6,48. (WIELE ; BOON; POSSEMIERS, 2004).

Antibiograma

Verificou-se, de acordo com a Tabela 4, sensibilidade de todos os isolados ao

cloranfenicol e a tetraciclina (exceto L20 e L24) e resistência à estreptomicina, exceto a

estirpe padrão (L. acidophilus) que se mostrou sensível aos cinco antibióticos testados.

- 78 –

Tabela 4: Diâmetro do halo de inibição resultante da sensibilidade dos isolados a diferentes

antibióticos (mm).

Isolado Antibiótico

Penicilina

(10UI)

Tetraciclina

(30 mcg)

Eritromicina

(15 mcg)

Cloranfenicol

(30 mcg)

Estreptomicina

(10 mcg)

34,0 ± 0,0

33,0 ±2,0

12,0 ± 0,0

30,0 ± 1,0

8,0 ± 2,51

33,0 ± 2,30

35,0 ±1,0

10,0 ± 0,57

30,0 ±0,0

7,0 ± 1,15

L12

27,0 ± 1,52

36,0 ± 0,57

12,0 ± 0,57

28,0 ±1,73

7,0 ± 0,0

L19

23,0 ±2,30

23,0 ± 3,05

35,0± 2,51

34,0 ±1,52

6,0 ±1,0

L20

17,0 ± 5,77

17,0 ±3,6

35,0 ± 1,0

34,0 ±3,21

6,0 ±1,0

L22

25,0 ± 2,3

19,0 ± 3,05

36,0 ± 1,73

33,0 ± 1,15

6,0 ± 1,0

L23

22,0 ±3,46

19,0 ± 2,64

35,0 ± 0,57

30,0 ± 1,0

6,0 ± 1,0

L24

20,0 ± 1,73

17,0 ± 1,0

34,0 ± 2,0

31,0 ± 3,46

6,0 ± 0,0

L. acidophilus

29,0 ± 3,00

27,0 ± 1,15

63,0 ± 4,16

41,0 ± 9,01

23,0 ± 3,05

S- sensível I- Intermediário R- Resistente

Na foto1 está representado o antibiograma dos isolados L24, L5, L12, L23 e

L22.

- 79 –

Figura 1: Antibiograma dos isolados selecionados L24, L5, L12, L23 e L22.

Resultados similares foram obtidos por Paulo (1991) e por Neumann e

Ferreira (1995), que constataram sensibilidade dos lactobacilos isolados ao cloranfenicol.

Cebici e Gurakan (2003) também verificaram que isolados de L. plantarum variaram com

relação à sensibilidade ou resistência aos antibióticos testados, sendo a maioria das estirpes

consideradas de sensibilidade intermediária a penicilina, resistentes a tetraciclina e sensíveis a

eritromicina.

Ronka, Malinen e Saarela (2003) testaram a susceptibilidade de duas estirpes

de L. brevis a antibióticos, constatando que ambas foram resistentes à penicilina e sensíveis ao

cloranfenicol, eritromicina e tetraciclina.

Arici et al. (2004) também constataram a resistência dos lactobacilos

isolados de fezes de crianças à estreptomicina e sensibilidade ao cloranfenicol, eritromicina,

penicilina G e tetraciclina.

Xanthopoulos, Litopoulo-Tanetaki e Tzanetakis (2000) constataram que as

estirpes de lactobacilos isoladas de crianças foram sensíveis à maioria dos antibióticos

testados, como cloranfenicol, eritromicina, penicilina G e tetraciclina; embora as dosagens

- 80 –

dos antibióticos avaliados tenham sido maiores em relação àquelas utilizadas neste

experimento.

A determinação da resistência ou susceptibilidade de estirpes de lactobacilos

a antibióticos é importante, pois, estirpes que mostram resistência a um antibiótico específico,

podem ser fornecidas juntamente com este antibiótico durante uma reposição de flora,

permitindo a obtenção mais rápida de resultados.

Entretanto, segundo Gevers, Geert e Swings (2003), estirpes de lactobacilos

que tenham genes de resistência, podem funcionar como vetores para a disseminação destes

genes via cadeia alimentar para o consumidor. Os referidos autores verificaram que de 14

estirpes de lactobacilos isoladas de salsicha que continham o gene de resistência à tetraciclina

tet (M), sete isolados foram capazes de transmitir, in vitro, via conjugação, esta resistência

para Enterococcus faecalis e Lactococcus lactis subsp. lactis, não sendo evidenciado esta

transferência para Staphylococcus aureus, concluindo que lactobacilos isolados de produtos

contendo carne poderiam se tornar reservatório de tais genes disseminado-os para outras

bactérias lácticas. Embora os plasmídios sejam muito comuns em lactobacilos existem poucos

dados na literatura sobre sua transferência via conjugação.

Zhou et al. (2005) testaram as seguintes estirpes probióticas L. rhamnosus

HN001 e HN067, L. acidophilus HN017 e B. lactis HN019 com relação à susceptibilidade a

vários antibióticos e presença de plasmídeos e verificaram que tais bactérias foram

susceptíveis aos antibióticos β lactâmicos (penicilina, ampicilina e cefalotin) antibióticos de

espectro Gram positivo (eritromicina e novobiocina) e de amplo espectro (cloranfenicol,

rifampicina, espinomicina e tetraciclina) e resistentes a antibióticos de espectro gram negativo

(ácido fusídico, ácido nalidíxo e polimixina B), aos aminoglicosídicos (gentamicina,

canamicina, neomicina e estreptomicina) e a vancomicina. Constatou-se ainda a ausência de

plasmídio nas bactérias testadas, inclusive em Lactobacillus GG, usada como referência.

A ausência de plasmídios em L. rhamnosus GG também foi observada por

Tynkkynen, Savindra e Varmanen (1998) que também verificaram este microrganismo não

foi capaz de transmitir genes de resistência a vancomicina (van) para Enterococcus faecalis e

E. faecium. Os autores ressaltam ainda que muitas espécies de lactobacilos que possuem

resistência intrínseca a vancomicina são utilizadas há muito tempo na indústria e podem ser

consideradas seguras, como por exemplo, L. rhamnosus e L. casei, que são intrinsicamente

resistentes a vancomicina, consideradas seguras, não havendo indícios de transferência de

resistência para outras bactérias.

- 81 –

Danielsen e Wind (2003) avaliaram a susceptibilidade de 62 estirpes de

lactobacilos a 25 agentes antimicrobianos e concluíram que o nível de susceptibilidade a estas

substâncias é espécie dependendente.

Kastner et al. (artigo no prelo) avaliaram a resistência de 200 cepas

probióticas e culturas “starters” como Lactobacillus (74 amostras), Staphylococcus (33

amostras), Bifidobacterium (6 amostras), Pediococcus (5 amostras) e lactococci e

streptococci (82 amostras) a 20 antibióticos. Vinte e sete isolados exibiram resistência; sendo

que em um isolado foi verificada a resistência a 15 antibióticos (L. reuteri SD 2112), porém a

média do número de resistência fenotípica das 74 amostras de lactobacilos foi de 5-6,

incluindo ambos tipos de resistência, intrínseca e adquirida. Foram encontrados também genes

de resistência à tetraciclina em cinco estirpes de Staphylococcus, sendo estas usadas como

cultura starter para carne, além de culturas probióticas como B. lactis DSM 10140 e L. reuteri

SD 2112 (gene presente no plasmídio) e resistência a lincosamida em L. reuteri SD2112.

- 82 –

4 CONCLUSÃO

Os isolados testados podem ser usados em produtos simbióticos contendo

oligofrutose, inulina ou goma arábica, pois são capazes de utilizar estes substratos. Todos os

isolados foram resistentes ao antibiótico estreptomicina, entretanto não se determinou a

presença de plasmídeos para a verificação da transmissão desta resistência.

- 83 –

REFERENCIAS

ARICI, M.; BILGIN, B.; SAGDIG, O.; OZDEMIR, C. Some characteristics of Lactobacillus

isolates from infant faeces. Food Microbiology, London, v. 21, p. 19-24, 2004.

BAGATINI, L. Desenvolvimento de um suplemento alimentar geriátrico. 2002. 66p. Tese

(Mestrado em Tecnologia de Alimentos e Medicamentos) - Universidade Estadual de

Londrina, Londrina.

BOURQUIN, L.D.; TITGEMEYER, E.; FAHEY, G. Fermentation of various dietary fiber

sources by human fecal bacteria. Nutrition Research, Tarrytown, Ny, US, v. 16, n.7, p.1119-

1131, 1996.

BOWER, C.K. e DAESCHEL, M.A. Resistance responses of microorganisms in food

environments. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v.50, p. 33-44,

1999.

BRINK, M.; FRASER, T.; TODOROV, S.D.; VAZ-VELHO, M.; SENEKAL, M.; DICKS,

L.M.T.. A combined use of probiotics and prebiotics in a soymilk based food supplement

aimed at improving the gastrointestinal flora of children with HIV aids. Eletronic Journal of

Environmental Agricultural and Food Chemistry, v. 2, n. 4, p. 504-509, 2003.

CAIUS, J.F.; RADNA, K.S. The gum arabic of the bazaars and shops of Bombay. Journal of

Bombay Natural of Story Society, v. 41, p. 261-271, 1942.

CAUSEY, J.L.; FEIRTAG, J.M.; GALLATUR, D.D.; TUNGLAND, B.C.; SLAVIN, J.L.

Effects of dietary inulin on serum lipids, blood glicose and the gastrointestinal in

hypercholesterolemic men. Nutrition Research, Tarrytown, Ny, US, v. 20, n.2, p. 191-201,

2000.

CEBICI, A.; GÜRAKAN, C. Properties of potencial probiotic Lactobacillus plantarum

strains. Food Microbiology, London, v. 20, p.511-518, 2003.

COLLOIDES NATURELS INTERNATIONAL Fibregum: Uma fibra dietética solúvel. São

Paulo:Colloides Naturels Brasil Comercial, 2000. 13p.

COLLINS, M.D.; GIBSON, G. Probiotics, prebiotics and symbiotics: approaches for

modulating the microbial ecology of the gut. American Journal of Clinical Nutrition, New

York, v. 69 (suppl), p. 1052S-7S, 1999.

- 84 –

CUMMINGS, J.H.; MACFARLANE, G.T. A review the control and consequences of

bacterial fermentation in the human colon. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v.70,

p. 443-459, 2001.

DANIELSEN, M.; WIND, A. Susceptibility of Lactobacillus ssp. to antimicrobial agents.

International Food Microbiology, Amsterdam, v. 82, p. 1-11, 2003.

DESMOND, C.; ROSS, R.P.; O´CALLAGHAN, E.; FITZGERALD, G.; SANTON, C.

Improved survival of L. paracasei NFBC 338 in spray-dried powders containing gum acacia.

Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 93, p. 1003-1011, 2002.

FOOKS, L.J.; GIBSON, G.R. In vitro investigations of the effect of probiotics and prebiotics

on selected human intestinal pathogens. FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v. 39, p.

67-75, 2002.

GARCIA, S. Isolamento e caracterização de bactérias lácticas para uso como probiótico.

1999. 156 p. Tese (Doutorado em Tecnologia de Alimentos e Medicamentos) - Universidade

Estadual de Londrina, Londrina..

GEVERS, D.; GEERT, H.; SWINGS, J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistence

from Lactobacillus isolates to other gram-positive bacteria. FEMS Microbiology Letters,

Amsterdam, 225, p. 125-130, 2003.

GIBSON, G.R.; ROBERFROID, M.B. Dietary modulation of the human colonic microbiota:

introducing the concepts of prebiotics. The Journal of Nutrition, Philadelphia, v.125, n.6,

p.1401-1412, 1995.

GORBACH, S.L.; GOLDIN, B.R. Nutrition and the gastrointestinal microflora. Nutrition

Reviews, New York, v. 50, p.378-381, 1992.

HATERMINK, R.; VAN LAERE; K.M.J.; ROMBOUTS, F.M. Growth of enterobacteria on

fructo-oligosacharides. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 83, p. 367-374, 1997.

HAVENAAR, R.; BONNIN-MAROL, S.; VAN DOKKUM, W.; PETITET, S.;

SCHAAFSMA, G. Inulin: fermentation and microbial ecology in the intestinal tract. Food

Research International, Barking, v. 15, n. 1, p. 109-120, 1999.

KASTNER, S.; PERRETEN, V.; BLEULER, H.; HUNGENSCHIMIDT, G.; LACROIX, C.;

MEILE, L. Antibiotic susceptibility patterns and resistance genes of starter cultures and

probiotic bacteria. Systematic and Applied Microbiology, Stuttgart. 2006. (no prelo).

- 85 –

LABORCLIN. Testes de susceptibilidade a Antibacterianos: Antibiograma. Pinhais,

Paraná: [s.n., 19--]

MACFARLANE, G.T.; CUMMINGS, J.H. Probiotics and prebiotics: can regulating the

activities of intestinal bacteria benefit health? British Medical Journal, London,v. 318,

p.999-1003. 1999.

MCBAIN, A.J.; MACFARLANE, G.T. Modulation of genotoxic enzyme activities by non-

digestible oligossacharide metabolism in in-vitro human gut bacterial ecosytems. Journal of

the Society for General Microbiology, v. 50, p.833-842, 2001.

MICHEL, C.; KRAVTCHENKO, T.P.; DAVID, A. In vitro prebiotic effects of Acacia gums

onto the human intestinal microbiotia depends on both botanical origin and environmental pH.

Anaerobe, v. 4, p.257-266, 1998.

NEUMANN, E.; FERREIRA, C.L.L.F. Lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct: “in

vitro” susceptibility to gastric juice, bile salts, lysozyme and chemotherapeutic agents.

Revista de Microbiologia, São Paulo,v. 26, n.1, p. 59-65, 1995.

ORBAN, J. I.; PATTERSON, J. A.; SUTTON, A., L. Effect of sucrose thermal

oligossacharide caramel, dietary vitamin-mineral level and brooding temperature on growth

and intestinal bacterial population of broiler chickens. Poultry Science, Champaign, Ill, v. 76,

n.3, p. 482-490, 1997.

OUWEHAND, A.C.; DERRIEN, M.; de VOS, W.; TIIHONEM, K.; RAUTONEN, N.

Prebiotics and other microbial substrates for gut functionality. Current Opinion in

Biotechology, London, v.16, p. 212-217, 2005.

PAULO, E.M. Isolamento e caracterização de Lactobacillus acidophilus de fezes de

suínos para uso como probiótico. 1991. 73 p. Tese (Mestrado em Microbiologia Agrícola).

Universidade Federal de Viçosa, Viçosa.

PASSOS, L.M.L.; PARK, Y.K. Frutooligossacarídeos:implicações na saúde humana e

utilização em alimentos. Ciência Rural, Santa Maria, v.33, n.2, p. 385-390, 2000.

RAO, A.V. The probiotic properties of oligofructose at low intake levels. Nutrition

Research, Torrytown, Ny, US, v. 21, p. 843-848, 2001.

- 86 –

RASTALL, R.A.; GIBSON, G.R.; GILL, S.H.; GUARNER, F.; KLAENHAMMER, T.R.;

POT, B.; REID, G.; ROWLAND, I.R.; SANDERS, M.E. Modulation of the microbial

ecology of the human colon by probiotics, prebiotics and symbiotics to enhance human

health: an overview of enabling science and potential applications. FEMS Microbiology

Ecology, Amsterdan, v. 52, p. 145-152, 2005.

RONKA, E.; MALINEN, E.; SAARELA, M. Probiotic and milk technological properties of

Lactobacillus brevis. International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 83, p.63-

74, 2003.

ROBERFROID, M.B.; DELENNE, N.M. Dietary fructans. Annual Review of Nutrition,

Palo Alto, Calif., v. 18, p. 17-43, 1998.

ROBERFROID, M. Prebiotics and Probiotics: are they functional foods? The American

Journal of Clinical Nutrition, New York, v.71, n.6, 2000.

SAARELA, M.; MOGENSEN, G.; FONDÉN, R.; MATTO, J.; MATTILA-SANDHOLM, T.

Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology,

Amsterdam, v.84, p. 197-215, 2000.

SALYERS, A.A.; LEEDLE, J.A.Z. Carbohydrate utilization in the human colon. In: Hentges,

D.J. (Ed.) Human intestinal microflora in health and disease. London:Academic Press,

1983.

SÁNCHEZ, C.; RENARD, D.; ROBERT, P.; SCHIMITT, C.; LEFEBVRE, J. Structure and

rheological properties of acacia gum dispersions. Food Hydrocolloids, Oxford, v. 16, p. 257-

267, 2002.

SGHIR, A, CHOW, J. M.; MACKIE, R. I. Continuous culture selection of bifidobacteria and

lactobacilli from human faecal samples using fructooligossacharides as selective substrate.

Journal of Applied Microbiology, Oxford, v.85, p. 769-777, 1998.

SULLIVAN, M. G. Metabolism of bifidogenic factors by gut flora – na overview. Bulletin of

the International Dairy Federation, Brussels, . p. 23-29, 1996.

TAN, YU-TING; TILLETT, D.; McKAY, I.A. Molecular strategies for overcoming antibiotic

resistence in bacteria. Molecular Medicine Today, v.6, p. 309-341, 2000.

- 87 –

TYNKKYNEN, S.; KAVINDRA, V.S.; VARMANEN, P. Vancomycin resistence factor of

Lactobacillus rhamnosus GG in relation to enterococcal vancomycyn resistence (van) genes.

International Journal of Food Microbiology, Amsterdam, v. 41, p. 195-204, 1998.

TUOHY, K.M.; FINLAY, R.K.; WYNNE, A.G.; GIBSON, G.R. A human volunteer study on

the prebiotic effects of HP-Inulin- faecal bacteria enumerated using fluorescent in situ

hybridization. Anaerobe, v.7, p.113 - 118, 2001.

WALKER, W. A.; DUFFY, L.C. Diet and bacterial colonization: role of probiotics and.

prebiotics. Journal Nutrition Biochem., v.9, p. 668-675, 1998.

WANG, X.; GIBSON, G.R. Effects of the in vitro fermentation of oligofructose and inulin by

bacteria growing in the human large intestine. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v.

75, p. 373-389,1993.

WIELE, T.V.; BOON, N.E.; POSSEMIERS, S. Prebiotic effects of chicory inulin in the

simulator of the human intestinal ecosystem. FEMS Microbiology Ecology, Amsterdam, v.

51, p. 143-153, 2004.

WYATT, G.M.; BAYLISS, C.E.; HOLCROFT. J.D. A change in human faecal flora in

response to inclusion of gum Arabic in the diet. British Journal of Nutrition, Cambridge,

v.117, p.1556-1561, 1987.

XANTHOPOULOS, V.; LITOPOULOU-TANETAKI, E.; TZANETAKIS, N.

Characterization of Lactobacillus isolates from infant faeces as dietary adjuncts. Food

Microbiology, London, v. 17, p.205-215, 2000.

ZHOU, J.S.; PILLIDGE, C.J.; GOPAL, P.K.; GILL, H.S. Antibiotic susceptibility profiles of

new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. International Journal of Food

Microbiology, Amsterdam, v. 98, p.211-217, 2005.

- 88 –

ANEXOS

- 89 –

NEXO 1:

APÍTULO 1

- 90 –

Product Description

Before submitting an order you will be asked to read and accept the terms and conditions

of ATCC's Material Transfer Agreement or, in certain cases, an MTA specified by the

depositing institution.

Customers in Europe, Australia, Hong Kong, India, Japan, Korea, New Zealand,

Singapore and Taiwan, R.O.C. must contact a local distributor for pricing information

and to place an order for ATCC cultures and products.

Bacteria

ATCC

Number:

7469™

Preceptrol

Culture

Organism:

Lactobacillus rhamnosus (Hansen) Collins et al.; deposited as

Lactobacillus casei (Orla-Jensen) Holland

Designations:

[BUCSAV 227; M. Rogosa V300; M.E.

Sharpe H2; NCDO 243; NCIB 6375; NCIB

8010; NCTC 6375; NRC 488; P.A. Hansen

300; R.P. Tittsler 300]

Depositor: FM Strong

Biosafety Level: 1 Shipped:

freeze-

dried

Growth

Conditions:

ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth

Temperature: 37.0C

Permits/Forms:

In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory

permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone

purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information regarding the specific

requirements for shipment to your location.

Related Products

Cross

References:

GenBank: AF192553: Lactobacillus rhamnosus dlt operon, complete

sequence.

GenBank: L08854: Lactobacillus casei valyl-tRNA synthetase gene,

complete cds.

GenBank: J05221: L.carei folylpoly-gamma-glutamate synthetase gene,

complete cds.

GenBank: AF323539: Lactobacillus rhamnosus strain ATCC 7469

glycosyltransferase gene, partial cds.

GenBank: AF323528: Lactobacillus rhamnosus strain ATCC 7469 priming

glycosyltransferase gene, partial cds.

GenBank: U43894

: Lactobacillus casei dlt operon DltA, DltB, and DltC

genes, complete cds, and DltD gene, partial cds.

GenBank: M83993

: Lactobacillus casei D-alanine-activating enzyme gene,

complete cds and a potential basic membrane protein (involved in D-ala-

LTA bios

nthesis

)

ene

5' end.

- 91 –

GenBank: AF015453: Lactobacillus rhamnosus 6-phospho-beta-

glucosidase homolog gene, partial cds; GNTR transcriptional regulator

homolog and surface located protein genes, complete cds.

Type Strain: yes [8852] [11168] [36887]

Comments:

respiratory physiology [8192]

extraction of acidic metabolites [9675]

pyruvate utilization [8287]

Applications:

produces folate transport protein [689]

assay of folic acid [21480] [21498] [45889] [92289] [92291]

assay of niacinamide (nicotinamide)

assay of riboflavin (vitamin B2)

References:

689: Henderson GB, et al. Kinetic evidence for two interconvertible forms

of the folate transport protein from Lactobacillus casei. J. Bacteriol. 163:

1147-1152, 1985. PubMed: 3928596

5417: Colwell RR, Liston J . Taxonomic relationships among the

pseudomonads. J. Bacteriol. 82: 1-14, 1961. PubMed: 13694873

5552: Biochem. J. 69: 403, 1958.

5561: Biochim. Biophys. Acta 54: 614, 1961.

5562: Biochim. Biophys. Acta 59: 273, 1962.

5570: Biochim. Biophys. Acta 71: 454, 1963.

5713: Ikawa M. Nature of the lipids of some lactic acid bacteria. J.

Bacteriol. 85: 772-781, 1963. PubMed: 14044942

5748: Sharpe ME. A serological classification of lactobacilli. J. Gen.

Microbiol. 12: 107-122, 1955. PubMed: 14354139

5749: Davis GH. The classification of Lactobacilli from the human mouth.

J. Gen. Microbiol. 13: 481-493, 1955. PubMed: 13278499

- 92 –

Product Description

Before submitting an order you will be asked to read and accept the terms and conditions

of ATCC's Material Transfer Agreement or, in certain cases, an MTA specified by the

depositing institution.

Customers in Europe, Australia, Hong Kong, India, Japan, Korea, New Zealand,

Singapore and Taiwan, R.O.C. must contact a local distributor for pricing information

and to place an order for ATCC cultures and products.

Bacteria

ATCC

Number:

367™

Organism:

Lactobacillus brevis (Orla-Jensen) Bergey et al.; deposited as Lactobacillus

pentoaceticus Fred et al.

Designations:

[118-8; BUCSAV 252; NCDO 477; NCIB 8169;

NCIB 947; NCTC 947]

Depositor: EB Fred

Biosafety Level: 1 Shipped: freeze-dried

Growth

Conditions:

ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth

Temperature: 30.0C

Permits/Forms:

In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory

permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone

purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information regarding the specific

requirements for shipment to your location.

Related Products

Comments: This is an original strain of L. pentoaceticus

Applications:

assay of cytosine [46017

]

assay of uracil [46017

]

References:

5730: Fred EB, et al. Acid fermentation of xylose. J. Biol. Chem. 39: 347-

384, 1919.

5731: J. Biol. Chem. 42: 175, 1920.

5748: Sharpe ME. A serological classification of lactobacilli. J. Gen.

Microbiol. 12: 107-122, 1955. PubMed: 14354139

5749: Davis GH. The classification of Lactobacilli from the human mouth.

J. Gen. Microbiol. 13: 481-493, 1955. PubMed: 13278499

6072: J. Appl. Bacteriol. 18: 274, 1955.

6413: Davis JG. A comparison on the growth activating effects on

Streptococcus and Lactobacillus of various yeast preparations. J. Pathol.

Bacteriol. 45: 367-376, 1937.

8185: Can. J. Microbiol. 11: 319-324, 1965.

46017: Merrifield RB, Dunn MS . Microbiological determination of

cytosine, uracil and thymine. Arch. Biochem. 16: 339-341, 1948.

Notices and Disclaimers

- 93 –

ATCC products are intended for laboratory research purposes only. They are not intended for

use in humans. While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and up-to-date

information on this site, ATCC makes no warranties or representations as to its accuracy.

Citations from scientific literature and patents are provided for informational purposes only.

ATCC does not warrant that such information has been confirmed to be accurate. All prices

are listed in U.S. dollars and are subject to change without notice. A discount off the current

list price will be applied to most cultures for nonprofit institutions in the United States and

Canada. Cultures that are ordered as test tubes or flasks will carry an additional laboratory fee.

Fees for permits, shipping, and handling may apply.

- 94 –

Product Description

Before submitting an order you will be asked to read and accept the terms and conditions

of ATCC's Material Transfer Agreement or, in certain cases, an MTA specified by the

depositing institution.

Customers in Europe, Australia, Hong Kong, India, Japan, Korea, New Zealand,

Singapore and Taiwan, R.O.C. must contact a local distributor for pricing information

and to place an order for ATCC cultures and products.

Bacteria

ATCC

Number:

9338™

Preceptrol

Culture

Organism: Lactobacillus fermentum Beijerinck

Designations:

36 [BUCSAV 233; NCDO 215; NCIB

6991; NCIB 8028; NCTC 6991]

Depositor: HP Sarett History:

ATCC<<--HP Sarett

<<--W. Peterson

Biosafety Level: 1 Shipped: freeze-dried

Growth

Conditions:

ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth

Temperature: 37.0C

Permits/Forms:

In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory

permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone

purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information regarding the specific

requirements for shipment to your location.

Related Products

Cross

References:

GenBank: X74860

: L.fermentum repA and repB genes.

Applications:

assay of alanine (L-alanine) [58585]

assay of histidine (L-histidine) [45889] [58585]

assay of pyrithiamine [58733

]

assay of thiamine (vitamin B1) [45889] [58585]

5617: Appl. Microbiol. 1: 311, 1959.

5748: Sharpe ME. A serological classification of lactobacilli. J. Gen.

Microbiol. 12: 107-122, 1955. PubMed: 14354139

5749: Davis GH. The classification of Lactobacilli from the human mouth.

J. Gen. Microbiol. 13: 481-493, 1955. PubMed: 13278499

6072: J. Appl. Bacteriol. 18: 274, 1955.

6125: J. Biol. Chem. 155: 153, 1944.

References: 6175: Arch. Biochem. 16: 357-360, 1948.

6770: Zentralbl. Bakteriol., II Abt. 111: 250, 1958.

45889: Girdwood RH. The microbiological assay of vitamins and amino

acids. J. Med. Lab. Technol. 20: 26-33

1963. PubMed: 13948188

- 95 –

58585: Stiles HR, et al.. Fermentation products of certain mannitol-forming

bacteria. J. Biol. Chem. 64: 643-654, 1925.

58733: Hagedorn H, Schmidt OR . Die Wirkung des antivitamins

Pyrithiamin auf den Stoffwechsel der thiaminautotrophen Serratia

marcescens. Arch. Microbiol. 103: 83-88, 1975. PubMed: 1100010

Notices and Disclaimers ATCC products are intended for laboratory

research purposes only. They are not intended for use in humans.

While ATCC uses reasonable efforts to include accurate and up-to-date

information on this site, ATCC makes no warranties or representations as

to its accuracy. Citations from scientific literature and patents are

provided for informational purposes only. ATCC does not warrant that

such information has been confirmed to be accurate. All prices are

listed in U.S. dollars and are subject to change without notice. A discount

off the current list price will be applied to most cultures for nonprofit

institutions in the United States and Canada. Cultures that are ordered as

test tubes or flasks will carry an additional laboratory fee. Fees for

permits, shipping, and handling may apply.

Bacteria

ATCC

Number:

335™

- 96 –

Organism:

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei Collins et al.; deposited as

Lactobacillus casei (Orla-Jensen) Hansen and Lessel

Designations:

[NCDO 242; NCIB 4113;

epsilon]

Depositor: LA Rogers History:

ATCC<<--LA Rogers <<--

Fender

Biosafety Level

: 1 Shipped: freeze-dried

Growth

Conditions:

ATCC medium 416:

Lactobacilli MRS broth

Temperature: 37.0C

Permits/Forms:

In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory

permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone

purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information regarding the specific

requirements for shipment to your location.

Related Products

Applications:

assay of thymine

assay of uracil

References:

46017: Merrifield RB, Dunn MS . Microbiological determination of

cytosine, uracil and thymine. Arch. Biochem. 16: 339-341, 1948.

- 97 –

Product Description

Before submitting an order you will be asked to read and accept the terms and conditions

of ATCC's Material Transfer Agreement or, in certain cases, an MTA specified by the

depositing institution.

Customers in Europe, Australia, Hong Kong, India, Japan, Korea, New Zealand,

Singapore and Taiwan, R.O.C. must contact a local distributor for pricing information

and to place an order for ATCC cultures and products.

Bacteria

ATCC

Number:

8014™

Organism:

Lactobacillus plantarum (Orla-Jensen) Bergey et al.; deposited as

Lactobacillus arabinosus Fred et al.

Designations:

17-5 [BUCSAV 217; BUCSAV 449; Glaxo 664;

ICPB 2080; NCDO 82; NCIB 6376; NCIB 8014;

NCIB 8030]

Depositor: E McCoy

Biosafety Level: 1 Shipped:

freeze-

dried

Growth

Conditions:

ATCC medium 416: Lactobacilli MRS broth

Temperature: 37.0C

Permits/Forms:

In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory

permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone

purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the

permits. Please click here for information regarding the specific

requirements for shipment to your location.

Related Products

Cross

References:

GenBank: X62346

: L.plantarum plasmid 8014-2 DNA (from Bc1I to

HincII site).

GenBank: AF189765: Lactobacillus plantarum alpha-galactosidase (melA)

gene, complete cds.

GenBank: U97139: Lactobacillus plantarum 16S/23S ribosomal RNA large

intergenic spacer region, tRNA-Ile and tRNA-Ala genes, complete

sequence.

GenBank: X99978: Lactobacillus plantarum citrulline biosynthetic gene

cluster (carAB operon and argC, J, B, D, F-ccl operon) and usg and dsg

partial sequences.

Comments:

each NCIB culture from a different depositor

bacteriophage host

accumulation of biotin [6553]

D-biotin conversion and metabolism [10275] [34645] [58634]

biotin transport and accumulation [11064] [34646]

formation of acetylmethylcarbinol [7469]

effect of pantothenate derivatives on growth and coenzyme-A synthesis

[7301]

sulfur nutrition

[

6175

]

[

7482

]

- 98 –

nitrate reduction [6263]

effect of oleic acid on free biotin uptake [7553]

ribitol-5-phosphate dehydrogenase [7316]

synthesis of ribitol teichoic acids [10745]

energy-producing pathways [7540] [10737]

DNA base composition (45.1 moles % GC) [9315]

Applications:

produces lactic acid from coconut water [58392]

assay of amino acids [6665]

assay of biotin [92233]

assay of calcium pantothenate [21607] [92233]

assay of niacinamide (nicotinamide) [21610

]

assay of nicotinic acid (niacin) [5216

] [21480] [21610]

assay of pantothenic acid [21480]

assay of tryptophan (L-tryptophan)

metabolizes mevalonic acid [7531]

produces lactic acid (lactate) [58392]

quality control strain [92408]

References:

5216: AACC. Niacin--microbiological method. St. Paul, MN: AACC

International; AACC Method 86-51, 1999.

6175: Arch. Biochem. 16: 357-360, 1948.

6263: Costilow RN, Humphreys TW . Nitrate reduction by certain strains

of Lactobacillus plantarum. Science 121: 168, 1955. PubMed: 13225760

6553: Lichstein HC, Waller JR . Factors affecting the accumulation of

biotin by Lactobacillus arabinosus. J. Bacteriol. 81: 65-69, 1961. PubMed:

13761907

6665: AOAC International. Amino acids in vitamin preparations.

Gaithersburg, MD: AOAC International; AOAC "Official Methods of

Analysis of the AOAC International" 960.47.

7301: Pierpoint WS, et al. The effect of some pantothenate derivatives on

growth and coenzyme-A synthesis in bacteria. Biochem. J. 61: 190-197,

1955. PubMed: 13260197

7316: Biochim. Biophys. Acta 67: 525-530, 1963.

7469: Moat AG, Lichstein HC . Factors affecting the formation of

acetylmethylcarbinol by lactobacillus arabinosus. J. Bacteriol. 66: 324-327,

1953. PubMed: 13096481

7482: Shiota T, Clark FM . Studies on the sulfur nutrition of Lactobacillus

arabinosus. J. Bacteriol. 70: 339-344, 1955. PubMed: 13263295

7531: Durr IF, Shwayri AN . Metabolism of mevalonic acid by

Lactobacillus plantarum . J. Bacteriol. 88: 361-366, 1964. PubMed:

14203352

7540: Oxenburgh MS, Snoswell AM . Use of molar growth yields for the

evaluation of energy-producing pathways in Lactobacillus plantarum. J.

Bacteriol. 89: 913-914, 1965. PubMed: 14273684

7553: Waller JR, Lichstein HC . Cell permeability: a factor in the biotin-

oleate relationship in Lactobacillus arabinosus. II. Effect of oleic acid and

other surfactants on free biotin uptake. J. Bacteriol. 93: 151-155, 1967.

PubMed: 6020402

9315: Miller A, et al. Deoxyribonucleic acid base composition of

lactobacilli determined b

thermal denaturation. J. Bacteriol. 102: 278-280

- 99 –

1970. PubMed: 5437728

10275: Birnbaum J, Lichstein HC . Conversion of D-

iotin to biotin

vitamers by Lactobacillus arabinosus. J. Bacteriol. 89: 1035-1040, 1965.

PubMed: 14276092

10737: Strittmatter CF. Electron transport to oxygen in lactobacilli. J. Biol.

Chem. 234: 2789-2793, 1959. PubMed: 13856390

10745: Glaser L. The synthesis of teichoic acids. II. Polyribitol phosphate.

J. Biol. Chem. 239: 3178-3186, 1964. PubMed: 14245358

11064: Waller JR, Lichstein HC . Biotin transport and accumulation by

cells of Lactobacillus plantarum. I. General properties of the system. J.

Bacteriol. 90: 843-852, 1965. PubMed: 5847805

21480: AOAC International. Vitamin assays, microbiological method.

Gaithersburg, MD: AOAC International; AOAC "Official Methods of

Analysis of the AOAC International" 960.46.

21607: U.S. Pharmacopeia. General Chapters: <91> CALCIUM

PANTOTHENATE ASSAY. Rockville, MD: U.S. Pharmacopeia; USP

USP28-nf23, 2005.

21610: U.S. Pharmacopeia. General Chapter: <441> NIACIN OR

NIACINAMIDE ASSAY. Rockville, MD: U.S. Pharmacopeia; USP

USP28-NF23, 2005.

27858: Bringel F, et al. Arginine biosynthesis and regulation in

Lactobacillus plantarum: the carA gene and the argCJBDF cluster are

divergently transcribed. J. Bacteriol. 179: 2697-2706, 1997. PubMed:

9098069

28052: Mayo B, et al. Cloning and characterization of cspL and cspP, two

cold-inducible genes from Lactobacillus plantarum. J. Bacteriol. 179: 3039-

3042, 1997. PubMed: 9139925

34645: Birnbaum J, Lichstein HC . Metabolism of biotin and analogues of

biotin by microorganisms. 3. Degradation of oxybiotin and desthiobiotin by

Lactobacillus plantarum. J. Bacteriol. 92: 921-924, 1966. PubMed:

5926759

34646: Waller JR, Lichstein HC . Biotin transport and accumulation by

cells of Lactobacillus plantarum. II. Kinetics of the system. J. Bacteriol. 90:

853-856, 1965. PubMed: 5847806

58392: Bartido SM, et al.. Lactic acid fermentation of concentrated coconut

water. Proc. Asia-Pacific Biotechnol. Congr. 1986: 93-99, 1986.

58634: Birnbaum J, Lichstein HC . Metabolism of biotin and analogues of

biotin by microorganisms. II. Further studies on the conversion of D-

iotin

to biotin vitamers by Lactobacillus plantarum. J. Bacteriol. 92: 913-920,

1966. PubMed: 5926758

92233: Dietary Supplements: Oil-and Water-Soluble Vitamins with

Minerals Tablets. Rockville, MD: U.S. Pharmacopeia; USP USP28-NF23,

2005.

92408: Applied Biosystems MicroSeq Food Panel #1. Applied Biosystems

ABI; MicroSeq

- 100 –

100

NEXO 2:

APÍTULO 2

- 101 –

101

Isolado Equação meio MRS normal Equação MRS + Oxgall

L4 y= - 0,00036x

+ 0,0072x

+ 0,1390x –

0,1919 R

= 0,94

y= -0,00067 x

+ 0,0210x

– 0,0137x –

0,0240 R

= 0,95

L5 y= 0,00019x

– 0,01509x

+ 0,3401x-

0,3421 R

y= -0,0005488x

+ 0,02194 x

–

0,1436x + 0,1875 R

= 0,96

L12 y= 0,000224x

– 0,0151x

+ 0,3236x -

0,3357 R

= 0,98

y= -0,00011 x

+ 0,0061x

– 0,03577x +

0,0576 R

= 0,98

L19 y= - 0,0050x

+ 0,01186 x

+ 0,1045 x –

0,1715 R

= 0,96

y= -0,00068x

+ 0,02068x

- 0,005186x

-0,0466 R

= 0,95

L20 y= - 0,00058x

+ 0,0147 x

+ 0,0911x-

0,1737 R

= 0,95

y= - 0,000645x

+ 0,02039x

– 0,0131x

– 0,0243 R

= 0,96

L22 y= - 0,00045x

+ 0,0090x

+ 0,1532 x –

0,2127 R

= 0,95

y= - 0,00066x

+ 0,02060 x

– 0,0130x

– 0,02763 R

= 0,95

L23 y= - 0,000489x

+0,0119x

+ 0,1031x –

0,1614 R

= 0,95

y= - 0,0064x

+ 0,02178x

- 0,06463x +

0,0430 R

= 0,98

L24 y= - 0,00048x

+ 0,0107x

+ 0,1312x –

0,1959 R

= 0,94

y= - 0,00063x

+ 0,01902x

0,006856x – 0,04748 R

= 0,95

Equações de regressão das curvas de crescimento (ufc/ml) dos isolados selecionados cultivados em meio MRS

normal e MRS contendo 0,3% de Oxgall.

Isolados pH 2,0 pH 3,0 Controle

L12 Y= 5,651-2,0693x

= 0,80

Y= 6,434-0,5843x

= 0,47

Y= 6,498+ 0,231x

= 0,60

L4 Y= 5,9200-2,2263x

=0,90

Y= 6,9120-0,2080x

= 0,60

Y= 6,818+ 0,188x

= 0,75

L19 Y= 4,447-1,914x

=0,60

Y= 7,331-0,465x

=0,81

Não foi possivel

ajustar equação

L20 Y= 6,666-2,1020x

= 0,98

Não foi possível

ajustar equação

Não foi possível

ajustar equação

L22 Y= 6,435-2,0900x

= 0,99

Não foi possível

ajustar equação

Não foi possível

ajustar equação

L23 Y= 4,301-1,839x

0,58

Não foi possível

ajustar equação

Y= 7,0116+0,120x

= 0,79

L23 Y= 5,024-2,149x

= 0,60

Não foi possível

ajustar equação

Não foi possível

ajustar equação

L5 Y= 4,5296-1,937x

= 0,59

Y= 7,0286-0,508x

= 0,45

Y= 6,8323 + 0,1956x

= 0,70

L. casei

Y= 5,678-2,300x

0,79

Não foi possível

ajustar equação

Não foi possível

ajustar equação

1. Anova não significativo a 5% de probabilidade.

Equações de regressão das curvas de crescimento (log ufc/ml) dos isolados expostos ao ácido clorídrico (HCl 0,1

N) por até 3 horas.

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 