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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO HISTOQUÍMICA DO COLÁGENO E
EXPRESSÃO DE MMP-2, MMP-9 E TIMP-1 NAS
ENDOMETRITES CRÔNICAS DAS ÉGUAS
CAMILA DIAS PORTO
BOTUCATU - SP
Março, 2006
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
CARACTERIZAÇÃO HISTOQUÍMICA DO COLÁGENO E
EXPRESSÃO DE MMP-2, MMP-9 E TIMP-1 NAS
ENDOMETRITES CRÔNICAS DAS ÉGUAS
CAMILA DIAS PORTO
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Palista
“Julio de Mesquita Filho” – UNESP, Campus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Medicina
Veterinária, Área de Patologia Veterinária.
Orientador: Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
BOTUCATU - SP
Março, 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Porto, Camila Dias.
Caracterização histoquímica o colágeno e expressão de MMP-2, MMP-9 e
TIMP-1 nas endometrites crônicas das éguas / Camila Dias Porto. – Botucatu :
[s.n.], 2006.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2006.
Orientador: Prof. Dr. Julio Lopes Sequeira
Assunto CAPES: 50503030
1. 1. Patologia animal. 2. Égua. 3. Endométrio. 4. Colágeno.
CDD 636.1089607
Palavras chave: Endométrio; Eqüino; Fibrose; Imunohistoquímica;
Metaloproteinase; Endometrite.
Camila Dias Porto
Botucatu, 03 de março de 2006.
Comissão Examinadora:
Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
Prof. Dr. Alessandre Hataka
Profª. Adj.Drª Noeme Sousa Rocha
A Deus e aos amigos espirituais, pela oportunidade contínua de
aprendizado e crescimento;
À minha Família, parte fundamental da minha formação, por
todo amor concedido e por sempre me apoiar
incondicionalmente na melhoria pessoal e profissional;
Ao meu orientador, Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira, pela
confiança depositada, sobretudo em um momento de
questionamentos e incertezas...
Muito obrigada por me ensinarem a ser uma pessoa melhor a
cada dia e, principalmente, a vislumbrar o futuro, mesmo que
incerto, de maneira otimista, sempre acrescentando o que nós
construímos com nosso trabalho.
iv
AGRADECIMENTOS
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP,
pela outorga da bolsa de mestrado e recursos do auxílio à pesquisa, viabilizando o
desenvolvimento deste trabalho.
À pós-graduanda Louisiane de Carvalho Nunes, pela oportunidade do
trabalho em conjunto, pela demonstração de amizade e humildade durante os
anos de convivência.
Ao Prof. Ass. Dr. Deilson Elgui de Oliveira (Departamento de Patologia,
FMB – UNESP, campus de Botucatu) pelo auxílio com os anticorpos anti-MMP.
Ao técnico de laboratório Marcos Roberto Franchi (Laboratório de
Patologia Molecular, Departamento de Patologia – FMB UNESP, campus de
Botucatu) e ao pós-graduando Luís Antônio Justulin Filho (Departamento de
Morfologia – IBB UNESP, campus de Botucatu), pela ajuda na padronização dos
anticorpos e troca de experiências.
Ao Prof. Adj. Marco Antônio Alvarenga (Departamento de Reprodução
Animal e Radiologia Veterinária – FMVZ UNESP, campus de Botucatu), pelas
biópsias uterinas cedidas para a realização do projeto.
Ao Prof. Adj. Sebastião Martins Filho (Departamento de Engenharia Rural
do Centro de Ciências Agrárias - UFES, campus de Alegre), pela realização da
análise estatística.
À pós-graduanda Sara Maria de Carvalho e Suzano, pelo coleguismo,
solicitude e toda ajuda oferecida durante este trabalho.
À Profª. Adj. Noeme Sousa Rocha, pelo exemplo de força,
profissionalismo e dedicação. Muito obrigada pela amizade, pelo conhecimento e
experiências compartilhados.
À Profª. Ass. Drª. Renée Laufer Amorim, por me fazer acreditar que
podemos melhorar, por maiores que nos pareçam os obstáculos.
v
Ao Prof. Dr. Alessandre Hataka, pelo incentivo aos estudos, por mostrar o
caminho da Patologia e por fazer “me virar” perante as dificuldades. Agradeço sua
amizade sincera de todos os momentos.
Agradeço a Deus pela oportunidade de (re)encontrar amigos, que são a
minha família em Botucatu: os pós-graduandos Anne Santos do Amaral, Luiz
Fernando Jantzen Gaspar, Adriana Wanderley Pinho Pessoa, Celmira Calderón,
Carlos Frederico Gitsio Klier Teixeira da Silva, Sandra Bassani Silva, Edna Tereza
de Lima, e os amigos do Centro Cristão Espírita “Amor e Luz”, Arnold e Neide
Gottschalk, Alice, Cristiana Freire, Leonardo Seito, Cecília Titton, Ivone e João, e
tantos mais, mas torna-se impossível nomear todos pela falta de espaço.
Aos amigos Ana Paula Masseno, Solange Sá e Leonardo Parr, Fabio
Evangelista, Satie Katagiri, Fabiano Sellos, João Ferreira Neto e Victor Hugo
Bernardoni, pela amizade e por oferecerem ajuda sem exigir nada em troca, além
de me fazerem lembrar que temos muitas coisas mais para celebrar nessa vida...
Aos amigos pós-graduandos Marcela Marcondes, Leandro Teixeira e
Rafael Torres Neto, pela amizade e convivência fraterna.
Aos residentes do Serviço de Patologia Veterinária Arlete Benta de
Souza, Ana Paula Baptista Masseno e Rômulo Francis Lot, pela ajuda e
coleguismo.
Ao pós-graduando Danilo (Departamento de Morfologia – IBB UNESP)
pela paciência e sinceras desculpas pela mudança na rotina laboratorial.
Ao técnico de necropsia Maury Raul pela convivência amiga, pelos
ensinamentos de vida e profissionalismo e por saber dividir seu conhecimento.
Ao técnico do Laboratório de Histologia Noel Almeida Melo, pela
paciência e por compartilhar sua experiência nas técnicas de coloração.
A todos os estagiários do Serviço de Patologia Veterinária que de alguma
forma mostraram-se solícitos e sempre dispostos a ajudar.
Às funcionárias da Pós-Graduação Denise, Regina e Maria, por toda
ajuda, compreensão e pela paciência com que atendem aos alunos.
Às funcionárias da Biblioteca, especialmente do Posto de Atendimento da
FAPESP, por toda ajuda oferecida.
vi
“Em relação a todos os atos de iniciativa e de criação existe uma verdade
elementar: no momento em que nos comprometemos, a Providência também se
põe em movimento. Todo um fluir de acontecimentos surge a nosso favor. Como
resultado da decisão, seguem-se todas as formas de coincidências, encontros e
ajuda, que nenhum homem jamais poderia ter sonhado encontrar. Qualquer coisa
que você possa fazer ou sonhar, você pode começar. A coragem contém, em si
mesma, o poder, o gênio e a magia.”
(Goethe)
vii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1. Classificação histopatológica das endometrites crônicas das
éguas segundo KENNEY & DOIG, 1986........................................................
26
QUADRO 2. Classificação das endometrites eqüinas segundo RICKETTS
& ALONSO, 1991............................................................................................
27
viii
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Anticorpos primários utilizados para marcação
imunoistoquímica no endométrio de éguas portadoras de
Endométrio......................................................................................................
23
TABELA 2. Distribuição das biópsias de endométrio eqüino classificadas
de acordo com Kenney & Doig (1986)............................................................
30
TABELA 3. Distribuição das biópsias de endométrio eqüino classificadas
de acordo com Ricketts & Alonso (1991)........................................................
32
TABELA 4. Valores medianos do percentual de fibrose periglandular de
acordo com as categorias de endometrite segundo Kenney & Doig
(1986)..............................................................................................................
50
TABELA 5. Valores medianos do percentual de fibrose periglandular nos
endométrios classificados segundo Ricketts & Alonso (1991)......................
50
TABELA 6. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de MMP-2 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986)....................
53
TABELA 7. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a
enzima MMP-2................................................................................................
53
TABELA 8. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de MMP-2 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991)...........
55
TABELA 9. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a
enzima MMP-2................................................................................................
55
TABELA 10. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de MMP-9 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986)....................
59
TABELA 11. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a
enzima MMP-9...............................................................................................
59
TABELA 12. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de MMP-9 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991)...........
60
ix
TABELA 13. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a
enzima MMP-9................................................................................................
61
TABELA 14. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de TIMP-1 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986)....................
62
TABELA 15. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a
enzima TIMP-1................................................................................................
63
TABELA 16. Valores medianos da intensidade da marcação
imunoistoquímica de TIMP-1 nas diferentes estruturas do endométrio de
biópsias classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991)...........
64
TABELA 17. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a
enzima TIMP-1................................................................................................
64
x
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Endométrio categoria I. Ausência de alterações inflamatórias e
fibróticas. Epitélio luminal alto (seta), estrato compacto (EC) e alta
densidade glandular no estrato esponjoso (EE) Hematoxilina e Eosina.
Barra: 100 µm.................................................................................................
35
FIGURA 2.
Endométrio categoria I. Distribuição normal do colágeno.
Tricrômico de Masson. Barra: 100 µm............................................................
35
FIGURA 3. Endométrio categoria III. Fibrose periglandular intensa (seta),
ninhos glandulares (N), lacuna linfática (ponta de seta). Hematoxilina e
Eosina. Barra: 100 µm....................................................................................
36
FIGURA 4. Endométrio categoria III. Fibrose periglandular intensa, ninhos
fibróticos e lacuna linfática. Tricrômico de Masson. Barra: 100 µm................
36
FIGURA 5. Endometrite crônica infiltrativa. Infiltrado inflamatório moderado
focal no estrato compacto (seta) e discreto e difuso no estrato esponjoso.
Hematoxilina e Eosina. Barra: 100 µm............................................................
37
FIGURA 6. Endometrite crônica infiltrativa. Infiltrado inflamatório e fibrose
discreta multifocal no estrato esponjoso. Tricrômico de Masson. Barra: 100
µm....................................................................................................................
37
FIGURA 7. Endometrose. Alterações degenerativas difusas: fibrose
instersticial acentuada, dilatações e cistos glandulares associados à fibrose
periglandular. Hematoxilina e Eosina. Barra: 100 µm.....................................
38
FIGURA 8. Endometrose. Alterações degenerativas difusas: fibrose
instersticial e periglandular acentuadas. Tricrômico de Masson. Barra: 100
µm...................................................................................................................
38
FIGURA 9. Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Hematoxilina e Eosina. Barra: 50 µm.............................................................
39
FIGURA 10. Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Tricrômico de Masson. Barra: 50 µm..............................................................
39
FIGURA 11. Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular acentuada.
Hematoxilina e Eosina. Barra: 50 µm.............................................................
40
FIGURA 12. Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular acentuada. Tricrômico
de Masson. Barra: 50 µm...............................................................................
40
xi
FIGURA 13. Endométrio categoria I. Distribuição de colágeno do tipo III –
negro (seta) na membrana basal das glândulas e no estrato compacto, e do
tipo I (castanho) na região profunda do estrato esponjoso. Reticulina. Barra:
100 µm.............................................................................................................
44
FIGURA 14. Endométrio categoria III. Colágeno tipo I-III (castanho-negro)
na fibrose periglandular (seta) e predominância do colágeno do tipo I
(castanho) nos ninhos glandulares. Reticulina. Barra: 100 µm.......................
44
FIGURA 15. Endométrio categoria I. Distribuição reticular do colágeno do
tipo III (verde) e presença do colágeno do tipo I (amarelo) em menor
proporção. Picrosirius Red – Polarização. Barra: 100 µm..............................
45
FIGURA 16. Endométrio categoria III. Colágeno tipo I-III (amarelo-verde) na
fibrose periglandular (seta) e predominância do colágeno do tipo I (amarelo
e vermelho) nos ninhos fibróticos. Picrosirius Red – Polarização. Barra: 100
µm....................................................................................................................
45
FIGURA 17. Endometrite crônica infiltrativa. Colágeno do tipo III (negro)
predominante do estrato compacto e do tipo I (castanho) predominante no
estrato esponjoso. Reticulina. Barra: 100 µm.................................................
46
FIGURA 18. Endometrose. Colágeno do tipo I (castanho) predominante na
fibrose intersticial e periglandular. Reticulina. Barra: 100 µm.........................
46
FIGURA 19. Endometrite crônica infiltrativa. Colágeno do tipo III (verde)
predominante no estrato compacto e do tipo I (amarelo e vermelho)
predominante no estrato esponjoso. Picrosirius Red – Polarização. Barra:
100 µm.............................................................................................................
47
FIGURA 20. Endometrose. Colágeno do tipo I (amarelo e vermelho)
predominante na fibrose intersticial e periglandular. Barra: 100 µm...............
47
FIGURA 21. Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Distribuição de colágeno do tipo III (negro) e do tipo I (castanho) na parede
vascular. Reticulina. Barra: 50 µm...................................................................
48
FIGURA 22. Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular. Predominância do
colágeno do tipo I (castanho). Reticulina. Barra: 50 µm.................................
48
FIGURA 23. Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Distribuição de colágeno do tipo III (verde) e do tipo I (amarelo e vermelho)
na parede vascular. Picrosirius Red – Polarização. Barra: 100 µm................
49
FIGURA 24. Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular. Predominância do
colágeno do tipo I (amarelo e vermelho). Picrosirius Red - Polarização.
Barra: 100 µm..................................................................................................
49
xii
FIGURA 25. Marcação imunoistoquímica para MMP-2. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva na região
apical das células do epitélio luminal (seta). Presença de hemossiderófagos
no estrato esponjoso (*). Barra: 50 µm...........................................................
56
FIGURA 26. Marcação imunoistoquímica para MMP-2. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva intensa no
epitélio de glândulas fibróticas e dilatadas. Notar marcação heterogênea no
epitélio de algumas glândulas. Barra: 100 µm................................................
56
FIGURA 27. Marcação imunoistoquímica para MMP-2. Endométrio
categoria I. Marcação positiva em células estromais do estrato compacto
(seta). Barra: 50 µm.........................................................................................
57
FIGURA 28. Marcação imunoistoquímica para MMP-2. Endométrio
categoria IIB – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva na parede
vascular e células estromais (seta). Barra: 50 µm..........................................
57
FIGURA 29. Marcação imunoistoquímica para MMP-9. Endométrio
categoria III – endometrose. Marcação positiva no epitélio luminal e
glandular, células estromais (seta) e endotélio (*). Barra: 50 µm...................
65
FIGURA 30. Marcação imunoistoquímica para MMP-9. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva intensa em
células estromais ao redor da glândula dilatada (seta). Barra: 50 µm............
65
FIGURA 31. Marcação imunoistoquímica para MMP-9. Endométrio
categoria I. Marcação positiva nas células do infiltrado inflamatório no
estrato esponjoso (seta). Barra: 50 µm...........................................................
66
FIGURA 32. Marcação imunoistoquímica para MMP-9. Endométrio
categoria I. Marcação positiva nas células endoteliais. Barra: 50 µm.............
66
FIGURA 33. Marcação imunoistoquímica para MMP-9. Endométrio
categoria I. Marcação positiva no endotélio e parede vascular do estrato
esponjoso. Barra: 50 µm.................................................................................
67
FIGURA 34. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1. Endométrio
categoria III – endometrose. Marcação intensa no epitélio luminal e nas
células estromais do estrato compacto (seta), e fraca ou moderada no
epitélio glandular. Barra: 50 µm......................................................................
67
FIGURA 35. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva nas células
epiteliais de ninhos glandulares no estrato compacto. Presença de
hemossiderófagos (seta). Barra: 50 µm..........................................................
68
xiii
FIGURA 36. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva em células
do infiltrado inflamatório ao redor de ninhos glandulares (seta). Barra: 50
µm....................................................................................................................
68
FIGURA 37. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1. Endométrio
categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação positiva em células
endoteliais do estrato compacto (seta). Barra: 50 µm.....................................
69
FIGURA 38. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1. Endométrio
categoria III – endometrose. Marcação positiva na parede vascular. Barra:
50 µm...............................................................................................................
69
xiv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................
3
2. REVISÃO DE LITERATURA......................................................................
5
3. MATERIAL DE MÉTODOS........................................................................
19
3.1. Procedência do material.....................................................................
19
3.2. Processamento histopatológico........................................................
19
3.2.1. Técnicas histoquímicas.............................................................
20
3.2.1.1. Tricrômico de masson....................................................
20
3.2.1.2. Reticulina..........................................................................
20
3.2.1.3. Picrosirius Red................................................................
21
3.2.2. Técnica imunoistoquímica.........................................................
22
3.3. Avaliação histopatológica..................................................................
25
3.3.1. Aplicação da classificação das endometrites crônicas
eqüinas..........................................................................................
25
3.3.2. Avaliação do colágeno...............................................................
27
3.3.2.1. Análise qualitativa...........................................................
27
3.3.2.2. Análise morfométrica......................................................
28
3.3.3. Avaliação imunoistoquímica.............................................
28
3.4. Análise estatística...............................................................................
28
4. RESULTADOS...........................................................................................
30
4.1. Avaliação histopatológica..................................................................
30
4.1.1. Classificação das endometrites crônicas................................
30
4.1.2. Avaliação histoquímica do colágeno........................................
41
4.1.2.1. Reticulina..........................................................................
41
4.1.2.2. Picrosirius Red – Polarização........................................
43
xv
4.2. Morfometria do colágeno periglandular ..................................
50
4.3. Avaliação imunoistoquímica......................................................
51
4.3.1. MMP-2..................................................................................
51
4.3.2. MMP-9..................................................................................
58
4.3.3. TIMP-1..................................................................................
61
5. DISCUSSÃO...............................................................................................
70
5.1. Avaliação histopatológica..................................................................
70
5.1.1. Classificação das endometrites crônicas................................
70
5.1.2. Avaliação histoquímica do colágeno........................................
71
5.2. Morfometria do colágeno periglandular...........................................
73
5.3. Avaliação imunoistoquímica..............................................................
74
6. CONCLUSÕES...........................................................................................
79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................
80
8. TRABALHO CIENTÍFICO..........................................................................
89
RESUMO
PORTO, C.D. Caracterização histoquímica do colágeno e expressão de MMP-
2, MMP-9 e TIMP-1 nas endometrites crônicas das éguas. Botucatu, 2006. 101
p. Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia.
O presente trabalho teve por objetivos avaliar os graus de fibrose endometrial das
éguas, especificando por técnicas histoquímicas os tipos de colágeno e sua
proporção nas lesões crônicas, além de verificar por método imunoistoquímico a
expressão e distribuição das metaloproteinases (MMP) 2 e 9 e um dos seus
inibidores - TIMP-1 - nos processos crônicos endometriais. Foram utilizadas 82
biópsias endometriais classificadas histologicamente de acordo com Kenney e
Doig (1986) e segundo as definições de Ricketts & Alonso (1991) para endometrite
crônica infiltrativa e endometrose. A avaliação do colágeno foi realizada pelos
métodos histoquímicos Tricrômico de Masson, Reticulina e Picrosirius Red.
Estudo morfométrico da fibrose periglandular foi realizado utilizando-se a técnica
histoquímica do Picrosirius Red. Os resultados mostraram que nos endométrios
portadores de endometrite severa há deposição de colágeno do tipo III e do tipo I,
sendo este predominante. Não houve diferença significativa na extensão da
fibrose periglandular entre as endometrites crônicas infiltrativas e endometroses.
Tanto no endométrio hígido como nas endometrites crônicas foi observada imuno-
reatividade para as enzimas estudadas. A reação imunoistoquímica para MMP-2
foi localizada no epitélio luminal, glandular, parede vascular e células estromais.
MMP-9 e TIMP-1 mostraram marcação mais difusa, sendo também observadas
nas células inflamatórias e endoteliais.
ABSTRACT
PORTO, C.D. Histochemical features of collagen and MMP-2, MMP-9 and
TIMP-1 expression in chronic endometritis of horse mares. Botucatu, 2006.
101 p. Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia.
The aim of this study was to evaluate the degrees of endometrial fibrosis in mares,
specifying the types of collagen in the chronical lesions and its ratio by
histochemical analysis and, the expression and distribution of matrix
metalloproteinases (MMP) 2, -9 and one of its inhibitors - TIMP-1 - in the
endometrial chronic processes by means of immunohistochemistry. Eighty-two
biopsies of chronic endometritis were classified according to Kenney and Doig
(1986) and definitions of Ricketts & Alonso (1991) for chronic infiltrative
endometritis and endometrosis. The collagen evaluation was made by Masson´s
trichrome, Reticulin and Picrosirius Red staining methods. The endometrial
periglandular fibrosis morfometric analysis was carried out by using Picrosirius Red
stained slides. Deposition of type III collagen and type I collagen was seen in
severe endometritis with type I predominance. The chronic infiltrative endometritis
and endometrosis didn’t show significant difference in the extension of
periglandular fibrosis. Immunoreactivity of MMP-2, MMP-9 and TIMP-1 was
detected in healthy endometrium as in severe chronic endometritis. The luminal
epithelium, glandular epithelium, vascular wall and stromal cells expressed MMP-2.
MMP-9 and TIMP-1 had shown diffuser marking, and were as well observed in the
inflammatory cells and the endothelium.
3
1. INTRODUÇÃO
Os eqüinos apresentam um dos menores índices de fertilidade entre
os animais domésticos. Isso é agravado pelo tipo de seleção empregado nesta
espécie, na qual são preconizados a habilidade para o trabalho e alto
desempenho esportivo.
Mesmo com essas considerações, é citado que a meta na criação de
eqüinos é a produção de um potro por égua a cada ano (AMARAL, 2002).
Portanto, problemas de subfertilidade e infertilidade levam a perdas
econômicas significativas.
A endometrite é a principal causa de redução da fertilidade em éguas
sendo considerada o problema de maior importância clínica nos eqüinos depois
da cólica e das enfermidades do trato respiratório (TRAUB-DARGATZ et al.,
1991; TROEDSSON, 1999).
A biópsia endometrial é o método mais preciso para o diagnóstico e
estabelecimento do prognóstico da fertilidade em éguas, já que permite a
avaliação da situação morfofuncional do endométrio (DOIG et al., 1981).
Por serem os padrões de distribuição da fibrose e do infiltrado
inflamatório as principais características para o diagnóstico das endometrites,
KENNEY (1978) propôs um sistema de classificação para esta enfermidade,
posteriormente modificado por KENNEY & DOIG (1986). Outras classificações
também são utilizadas, como a descrita por RICKETTS & ALONSO (1991), que
procura separar entidades distintas de acordo com o padrão morfológico da
doença.
Estudos recentes sobre a classificação dos tipos de colágeno e
tipificação do infiltrado inflamatório procuram caracterizar o processo (NUNES,
2003), enquanto pesquisas mais recentes envolvendo enzimas que degradam
a matriz extracelular buscam elucidar parte de sua patogênese ainda não
totalmente compreendida (PORTO et al., 2005).
Diante do exposto, o presente trabalho teve como principais objetivos:
4
Avaliar os graus de fibrose endometrial, especificando os tipos de colágeno
presentes nas lesões crônicas e sua proporção, por meio da utilização das
colorações específicas Tricrômico de Masson, Reticulina e Picrosirius Red;
Estabelecer as características histoquímicas do processo fibrótico nas
endometrites crônicas degenerativas (endometroses) e infiltrativas;
Verificar por meio de método imunoistoquímico a expressão e distribuição
das metaloproteinases 2 e 9 e um dos seus inibidores (TIMP-1) nos processos
crônicos endometriais;
Estabelecer o grau de expressão das metaloproteinases e do TIMP nas
endometroses e endometrites crônicas infiltrativas.
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
É indispensável para a fertilidade das éguas a manutenção da
integridade uterina, especialmente a do endométrio. As glândulas endometriais
sintetizam e secretam ou transportam substâncias histotróficas que nutrem o
concepto no período de pré-implantação - placentação (KENNEY, 1978; GRAY
et al., 2001).
Microscopicamente, o útero das éguas é composto por três camadas:
a interna é a mucosa ou endométrio, a segunda ou média é o miométrio e a
camada externa é o perimétrio. Por sua vez, o endométrio é formado por
epitélio luminal e lâmina própria. Esta última se estende desde a membrana
basal até a camada muscular interna do miométrio e é dividida em dois
estratos, de acordo com a densidade de células estromais. A lâmina própria é
caracterizada pela presença de numerosas glândulas uterinas, derivadas do
epitélio luminal.
No estrato compacto a densidade de células estromais é alta e há uma
delicada rede de fibras reticulares. Essas células normalmente não produzem
colágeno detectável por microscopia de luz. O estrato esponjoso apresenta
uma baixa densidade celular com muitas fibras conectando as células, o que
lhe confere aspecto de esponja (KENNEY, 1978).
O epitélio de revestimento do endométrio apresenta-se composto por
células ciliadas, células secretoras não-ciliadas, e, eventualmente, leucócitos
(KENNEY, 1978). Observando sob microscópio eletrônico de varredura e
transmissão, Amaral (2002) sugere a presença de ao menos sete tipos
celulares ou estágios distintos no epitélio luminal do útero das éguas: entre as
secretórias encontrou células íntegras repletas de microvilosidades, células
com vesículas apicais e outras em degeneração; entre as ciliadas, notou a
presença de células jovens com microvilosidades, células maduras com cílios
longos e íntegros e em degeneração, além de leucócitos intra-epiteliais.
Observou também a presença de aberturas glandulares durante o estro,
repletas de secreção sendo lançada para o lúmen uterino. Relata ainda que
nas éguas acima de 12 anos, a abertura dessas glândulas encontrava-se
6
obstruída, o que poderia estar correlacionado com o processo fibrótico
endometrial.
A infecção e inflamação transitórias do endométrio são conseqüências
inevitáveis da cobertura, ocorrendo tanto por inseminação artificial como monta
natural. A instalação dessa reação inflamatória aguda é induzida pela
deposição de sêmen e pela contaminação bacteriana que ocorre durante o
coito (KATILA, 1996). Éguas consideradas normais do ponto de vista
reprodutivo debelam eficientemente essa inflamação, e o ambiente intra-uterino
estará adequado para a sobrevivência do embrião em aproximadamente seis
dias após a ovulação (RIGBY et al., 2001). Se o animal não for competente
para eliminar o agente nesse período, desenvolve-se a endometrite persistente.
Os mecanismos de defesa uterinos são complexos, havendo interação
das barreiras anatômicas, componentes celulares, imunoglobulinas,
substâncias bactericidas e fatores mecânicos. Éguas jovens são mais
resistentes à enfermidade. A inflamação persistente freqüentemente resulta em
luteólise prematura e subseqüente perda embrionária (KATILA, 1996;
TROEDSSON, 1999).
As principais causas de endometrite na égua são defeitos anatômicos,
partos distócicos, retenção de placenta, processos iatrogênicos e, em animais
suscetíveis, pode ocorrer após a monta (YOUNGQUIST, 1993). Troedsson
(1999) classifica as endometrites persistentes conforme a patogênese em
quatro grupos, a saber: doenças sexualmente transmissíveis, infecção uterina
persistente, endometrite persistente induzida pelo coito e endometrite crônica
degenerativa, também denominada endometrose.
O diagnóstico das endometrites é realizado utilizando-se exames
microbiológicos, citológicos e histopatológicos. No entanto, a biópsia
endometrial é o método definitivo para a determinação dessa enfermidade
(MEDICE et al., 1991). Além disso, é o tipo de exame mais preciso para o
estabelecimento do prognóstico da fertilidade em éguas, visto que a fibrose é o
principal critério utilizado na avaliação do comprometimento do endométrio
(DOIG et al., 1981). Esta técnica evidencia a situação morfológica do
endométrio e fornece dados sobre a sua situação funcional (DOIG et al., 1981;
SILVA et al.,1987), além de ser um procedimento econômico e simples
(CONCHA-BERMEJILLO & KENNEDY, 1982).
7
Dessa forma, Kenney (1978) propôs um sistema de classificação das
endometrites crônicas em três categorias, considerando a possibilidade da
égua levar o concepto a termo. Essas categorias foram divididas com base na
incidência e extensão das alterações histopatológicas. Na categoria I não há
alterações patológicas ou se estas existem são discretas e esparsas, e não há
interferência com a habilidade de levar o feto a termo. Na categoria II é
encontrado infiltrado inflamatório difuso moderado no estrato compacto,
podendo estar presentes alterações fibróticas e lacunas linfáticas discretas.
Alterações inflamatórias podem regredir se tratadas devidamente. As
endometrites classificadas como categoria III impossibilitam a égua de levar um
feto a termo e não regridem com tratamento. Há fibrose periglandular intensa,
sendo proporcional a quantidade de fibrose à gravidade do prognóstico. Podem
ser observados também grandes lacunas linfáticas e infiltrado inflamatório
moderado a intenso.
Por ser a fibrose o fator mais importante para a determinação
prognóstica da fertilidade, houve a necessidade da reclassificação dos tipos de
endometrite em quatro categorias (VAN CAMP, 1988). Kenney & Doig (1986)
modificaram essa classificação, subdividindo a categoria II em IIA e IIB, de
acordo com a quantidade de fibrose endometrial, sua correlação em manter a
prenhez e resposta à terapia. Na categoria IIA estão incluídas as biópsias que
apresentam infiltrado difuso no estrato compacto, ou disperso, em focos, nos
estratos compacto e esponjoso; a fibrose encontra-se esparsa envolvendo
ramos glandulares individuais, em qualquer grau de severidade, ou raros
agrupamentos de glândulas. As alterações presentes na categoria IIB são
difusas ou multifocais, sendo mais severas e extensas.
Ricketts & Alonso (1991) observaram que as endometrites poderiam
estar ou não acompanhadas por infiltrado mononuclear, denominando de
endometrite crônica infiltrativa as que apresentavam essa característica e de
doença endometrial degenerativa crônica aquelas em que estavam presentes
ninhos ou cistos glandulares associados à fibrose periglandular ou difusa. A
endometrite infiltrativa crônica caracteriza-se por células mononucleares
infiltrando o estroma. A doença endometrial degenerativa crônica, por sua vez,
caracteriza-se por alterações degenerativas: ninhos e/ou cistos associados à
fibrose periglandular e/ou estromal difusa.
8
A fibrose é um dos principais elementos da reação tecidual, sendo
portanto importante a determinação de seu arranjo, localização e composição
para se avaliar o grau de comprometimento do endométrio e as chances de
regressão da lesão já estabelecida (NUNES, 2003).
A avaliação do grau de fibrose endometrial é importante, pois, ao
contrário das alterações inflamatórias, é permanente. Nestas lesões a
deposição de colágeno ocorre mais comumente ao redor das glândulas ou
associada à membrana basal (KENNEY & DOIG, 1986). Essa alteração
compromete a integridade e a função das glândulas endometriais, estruturas
necessárias desde o período de pré-implantação embrionária até o
desenvolvimento placentário completo. Nas glândulas fibróticas, o epitélio se
diferencia irregularmente, além de haver modificação das secreções
glandulares. Portanto, nos casos mais severos, mesmo que ocorra implantação
embrionária, a redução ou alteração dessas secreções podem causar a
nutrição inadequada do feto, podendo resultar em aborto (WALTER et al., 2001
b).
Nunes (2003), estudando o padrão de distribuição e tipos de colágeno,
observou maior concentração de colágeno nas endometrites crônicas na região
periglandular e perivascular e no estrato esponjoso. Ao correlacionar a
gravidade da endometrite com a distribuição do colágeno concluiu que quanto
mais grave o grau, mais acentuado o acúmulo de colágeno ao redor das
glândulas. Verificou também que o colágeno do tipo I foi mais freqüente nas
lesões fibróticas periglandulares nas endometrites incluídas nas categorias IIB
e III.
O tipo de colágeno presente expressa a cronologia da lesão, já que o
colágeno tipo III é o primeiro a ser depositado durante os processos reparativos
e fibróticos em geral, sendo posteriormente substituído pelo do tipo I
(MARTINEZ-HERNANDES, 1999). Um método histoquímico utilizado para essa
tipificação é o Picrosirius Red, o qual diferencia os colágenos através da
intensidade da birrefringência das fibras em microscópio óptico de luz
polarizada. Dessa forma, diferentes tonalidades são observadas conforme o
tipo de arranjo molecular presente (JUNQUEIRA et al., 1978; MONTES &
JUNQUEIRA, 1991).
9
Há evidências de que em lesões granulomatosas com fibrose
persistente ocorre formação progressiva de pontes de ligação de colágeno e
conseqüente bloqueio de sítios de reação com as enzimas colagenolíticas, o
que impede a degradação das moléculas de colágeno (ANDRADE et al., 1999).
Evans et al. (1998) asseguram que a morfometria computadorizada de
biópsias uterinas pode ser incorporada ao diagnóstico e avaliação da fibrose
endometrial das éguas. Em conjunto com a avaliação histopatológica a
determinação da porcentagem de colágeno periglandular endometrial permite
conhecer com maior precisão a fibrose periglandular no endométrio a despeito
de sua distribuição, tamanho do ninho fibrótico, camadas de fibrose ou grau de
fibrose periglandular individual.
Utilizando análise morfométrica associada à técnica do Picrosirius Red
– Polarização, Nunes (2003) observou que à medida que a lesão endometrial
evolui há substituição progressiva do colágeno tipo III em tipo I na região
periglandular. Entretanto, ao realizar a classificação das endometrites no
sistema proposto por Kenney & Doig (1986), notou que amostras apresentando
fibrose intensa e infiltrado inflamatório discreto ou ausente foram englobadas
com outras em que o infiltrado acompanha a fibrose de forma conspícua. Esses
achados levam à suposição da ocorrência de diferentes processos, devido à
diferentes causas e, no entanto, sendo classificados como fenômenos iguais.
Troedsson (1999) denomina a fibrose periglandular associada à
dilatação glandular como endometrose ou endometrite degenerativa crônica,
sendo esta uma condição observada não só em éguas suscetíveis a
endometrite persistente, mas também naquelas mais idosas sem histórico
conhecido de inflamação. Isto sugere um processo fibroplásico degenerativo do
endométrio sendo muito mais uma conseqüência do envelhecimento do que da
inflamação uterina.
Em um estudo mais recente, Nunes et al. (2005), classificando 125
casos de endometrite crônica segundo Kenney & Doig (1986), descrevem que
18 casos (14,4%) foram incluídos na categoria I, 46 casos (36,8%) na categoria
IIA, 23 casos (18,4%) na categoria IIB e 38 casos (30,4%) na categoria III.
Esses dados permitiram concluir que 48,8% das biópsias apresentavam
elevado grau de fibrose endometrial associada ou não a infiltrado inflamatório.
No mesmo estudo
, com o objetivo de segregar alterações endometriais
10
associadas à inflamação e doença degenerativa crônica aplicou-se também a
classificação segundo Ricketts & Alonso (1991), na qual verificou-se que as
alterações de caráter inflamatório predominavam, totalizando 56,8% dos casos.
Walter et al. (2001a) citam que a endometrose é uma das razões mais
freqüentes da infertilidade em éguas, levando a alterações graves do tecido
conjuntivo uterino e das glândulas.
Outros processos que estão relacionados a fibrose endometrial
também podem afetar a função das estruturas endometriais. É relatada na
literatura especializada no assunto a presença de depósitos contendo fosfato
de cálcio ou carbonato de cálcio no lúmen das glândulas uterinas de éguas
portadoras de alterações endometriais degenerativas. Isso poderia ser causado
pela deposição de sais de cálcio em um núcleo formado por debris celulares
presentes nessas glândulas. Este processo seria análogo a sialolitíase que, por
sua vez, é mais comum em eqüinos do que nas outras espécies. A formação
desses cálculos no útero ocorrem predominantemente nas glândulas pouco ou
moderadamente dilatadas e nas fibróticas. Esse processo pode levar à
dilatação cística dessas estruturas e poderia explicar a diferenciação
miofibroblástica periglandular. Os miofibroblastos podem estar relacionados
com a estimulação da produção da matriz extracelular e sua degradação, já
que são aptos a produzir citocinas (WALTER et al., 2001a; WALTER et al.,
2003).
Inoue et al. (2000) constataram que há relação entre as endometroses
e a esclerose vascular da íntima e adventícia de pequenas artérias observadas
sob o endométrio através de exame histeroscópico, sendo o grau de
comprometimento dos vasos proporcional a gravidade da lesão uterina. Esta
afecção pode ser conseqüência da idade avançada, de inflamação crônica e
possivelmente de fatores endócrinos. Porém, outros estudos obtiveram
resultados conflitantes, nos quais houve diferenças individuais entre a
progressão da alteração esclerótica e o grau da endometrose, não podendo ser
aquela diretamente atribuída à causa da enfermidade. Sabe-se, no entanto,
que alterações no ambiente uterino produzidas pela esclerose das artérias
podem contribuir para a progressão da endometrose ou esta pode ocorrer
como resultado da idade. Entretanto, a patogênese deste processo ainda
permanece desconhecida (WALTER et al., 2001a).
11
Ainda, há relatos de que as alterações vasculares relacionadas à idade
são caracterizadas pela esclerose da camada média e perivascular. A
ocorrência de angiose moderada a severa, atingindo todas as camadas da
parede vascular, é mais freqüente quanto maior o número de partos. Ela é
freqüentemente observada combinada com alterações degenerativas de vasos
linfáticos e no endométrio. É citado que as lacunas linfáticas tem sido
interpretadas como um sinal de má perfusão uterina. Portanto, a endometrose
representaria mais uma seqüela da congestão endometrial crônica
(GRÜNINGER et al., 1998; SCHOON & SCHOON, 2003).
Atrofia endometrial, eventualmente resultando em senilidade
endometrial, pode ser conseqüência importante da endometrose. A interação
entre a endometrite e a endometrose ainda não é completamente
compreendida. A reversão depende de vários fatores como idade, número de
parições, status reprodutivo, aspectos clínicos e anormalidades
endocrinológicas (SCHOON & SCHOON, 2003).
Para que se entenda o mecanismo patológico da fibrose é necessário
que, primeiramente, se compreenda o funcionamento normal dos mecanismos
de interação da matriz extracelular.
A regulação da composição desta matriz promove a integridade dos
tecidos e fornece sinais bioativos que podem afetar o comportamento celular
(BRUNER et al., 1995).
A matriz extracelular representa um complexo dinâmico de
macromoléculas no qual se incluem o colágeno, elastina, glicoproteínas e
proteoglicanas. Alterações fisiológicas ou patológicas nessa matriz resultam no
desequilíbrio da degradação e síntese desses componentes da matriz (UENO
et al., 1996).
As proteinases que modificam a matriz extracelular e as moléculas da
superfície celular são importantes em vários processos fisiológicos e
patológicos. Estas enzimas estão envolvidas, por exemplo, nos processos de
fertilização, implantação embrionária, embriogênese, morfogênese e
diferenciação, e também na inflamação, cicatrização, artrite, fibrose hepática,
enfisema, aterosclerose e câncer. As proteínas são degradadas por
exopeptidases ou endopeptidases. As endopeptidases subclassificam-se em
quatro principais grupos, conforme seu mecanismo de ação e grupo catalítico,
12
assim como na sensibilidade a inibidores específicos. As metaloproteinases
incluem-se entre essas endopeptidases (STERNLICHT & WERB, 1999).
As metaloproteinases (MMP) são as mais importantes nesse processo,
e a interação das MMP ativas e seus inibidores (inibidor tecidual de
metaloproteinase - TIMP) é regulada de tal forma que evita o dano tecidual
desnecessário (ARTHUR, 2000; LENHART et al., 2002). A proteólise pode
afetar a aderência das células com a matriz extracelular bem como liberar
fragmentos bioativos, induzir fatores de crescimento e citocinas (MOTT &
WERB, 2004).
As metaloproteinases são uma família de enzimas que degradam
alguns componentes da matriz extracelular como proteoglicanos, glicoproteínas
e colágenos da membrana basal. Acredita-se que esse grupo de enzimas
desempenha papel fundamental no remodelamento e reparo em vários
processos (OSTEEN et al, 1994; YOKOTA et al., 2002).
Existem mais de 30 famílias de metalopeptidases dependentes de
zinco, que podem ser divididas em cinco grupos de acordo com a maneira que
interagem com esse metal. As que ligam o sítio ativo de zinco usando três
resíduos de histidina na seqüência HEXXHXXGXXH, onde H é uma histidina, E
corresponde ao ácido glutâmico e X representa um aminoácido variável, são
todas endopeptidases, que têm sido denominadas metzincinas (MURPHY &
KNÄUPER, 1997). As metaloproteinases (MMP) são endopeptidases, da
família das metzincinas, dependentes de zinco e cálcio, com extensa
homologia entre as seqüências gênicas. Elas subdividem-se em cinco grupos,
baseados na especificidade ao substrato ou semelhança estrutural, sendo elas
as colagenases (MMP-1, MMP-8 e MMP-13, -18), gelatinases (MMP-2 e MMP-
9), estromalisinas (MMP-3, MMP-7, MMP-10 e MMP-11), MMP-tipo membrana
(MT-MMP-1 a MT-MMP-6) e outras metaloproteinases (MMP-12, MMP-18,
MMP-19 até MMP-26) (STERNLICHT & WERB, 1999; GIANNELLI et al., 2003;
GOFFIN et al., 2003).
Estruturalmente, as metaloproteinases são constituídas basicamente
por um pró-domínio, com cerca de 80 aminoácidos, responsável por manter a
latência enzimática das pró-MMPs, um domínio catalítico, composto de
aproximadamente 170 aminoácidos, e um domínio C-terminal semelhante a
hemopexina – domínio hemopexina - com cerca de 210 aminoácidos. Além
13
desses, as metaloproteinases tipo-membrana possuem um domínio
transmembrana. (NAGASE & WOESSNER, 1999; POLETTE et al., 2004)
Estudos demonstram a habilidade das metaloproteinases em degradar
componentes individuais da matriz extracelular, mas a atividade precisa dessas
enzimas in vivo ainda não é completamente estabelecida. Inicialmente, essa
propriedade foi associada à patogenia de doenças degenerativas, da
cicatrização e da gênese de tumores. Nos últimos anos, as MMPs têm sido
correlacionadas à modulação sutil das interações célula-matriz comandando
processos diversos como diferenciação celular, migração e apoptose, bem
como a regulação da atividade de muitos fatores de crescimento (MURPHY &
KNÄUPER, 1997).
Menon & Fortunato (2004), em um trabalho de revisão, afirmam que as
metaloproteinases estão envolvidas com processo colagenolítico programado
que existe no amniocórion humano durante a gestação para que haja o
acomodamento das membranas no útero, devido ao constante aumento de
pressão e volume do processo gestacional.
As colagenases iniciam a quebra de vários componentes fibrilares do
colágeno, incluindo colágenos do tipo I, II, III e VII. Entre as colagenases, a
MMP-13 apresenta expressão focal próxima às regiões com perda de
membrana basal de carcinomas. Os produtos resultantes dessa clivagem são
rapidamente desnaturados em gelatinas, que posteriormente serão degradadas
pelas gelatinases. Estas últimas são também conhecidas como colagenases do
tipo IV, e degradam preferencialmente colágeno desnaturado e componentes
da membrana basal. As metaloproteinases-tipo membrana, reconhecidas por
serem os principais ativadores fisiológicos da pró-MMP-2, também quebram
colágenos do tipo I, II e III, fibronectina, lamininas, fibrina, gelatina, “nidogen”, e
proteoglicanas da cartilagem (POLETTE et al., 2004). Juntas, as MMP têm
capacidade de digerir todos os componentes da matriz extracelular (MOTT &
WERB, 2004).
Em equilíbrio com as metaloproteinases, os inibidores tissulares de
metaloproteinases - TIMPs - são importantes reguladores do metabolismo da
matriz extracelular, principalmente nas atividades primárias como inibidores
das MMPs.
14
Esses inibidores são glicoproteínas com peso molecular próximo de
28500. Eles interagem com as metaloproteinases ativas na relação
estequiométrica de 1:1 (UENO et al., 1996). Os TIMPs dos mamíferos
pertencem a uma família com quatro membros (TIMP-1 à TIMP-4) com cerca
de 40% de identidade seqüencial. Embora existam somente quatro dessas
enzimas, a atividade enzimática atinge diferentes MMPs sem especificidade. A
TIMP-1 é uma exceção, pois é fraca inibidora das metaloproteinases do tipo
membrana, enquanto a TIMP-2 e TIMP-3 são muito mais efetivas nesses casos
(WEI et al., 2003).
Todas as metaloproteinases são sintetizadas como pré-pró-enzimas e
secretadas como pró-MMPs inativas na maior parte das vezes. A ativação
enzimática da pró-enzima ocorre pelo deslocamento do resíduo de cisteína
(chave-cisteína) presente no pró-domínio, mediante clivagem proteolítica ou
quebra química, esta produzida experimentalmente por oxidação ou tratamento
com compostos mercuriais (NAGASE & WOESSNER, 1999; LEE &
LAMMERDING, 2002; PARDO & SELMAN, 2005). Podem ser produzidas por
leucócitos e por várias células dos diferentes tipos de epitélio, tecido conjuntivo,
além das células neoplásicas. Nas células inflamatórias pode ser observada a
MMP-8, ou colagenase neutrofílica, que além dos neutrófilos está presente
também nos eosinófilos; a MMP-9 é encontrada nos neutrófilos e macrófagos.
Nos macrófagos situam-se outras metaloproteinases como a MMP-2 (presente
também no eosinófilo), estromalisinas (MMP-3, MMP-10 e MMP-11), a
matrilisina (MMP-7), e a metaloelastase, ou MMP-12 (BOCHSLER &
SLAUSON, 2002).
Da mesma maneira, os TIMPs podem ser observados nos tecidos em
diferentes células. Estudando a presença dos TIMPs na fibrose oral
submucosa, CHANG et al. (2002) descreveram que esses inibidores
encontravam-se amplamente distribuídos nos tecidos e nos fluidos e estavam
expressos em vários tipos celulares, dentre eles os fibroblastos.
A expressão da maioria das metaloproteinases é regulada por fatores
de crescimento, hormônios, citocinas, interações célula-matriz e célula-célula e
transformação celular (BREW et al., 2000). A estromalisina-3 e todas as MT-
MMPs podem ser ativadas no ambiente intracelular. Todas as outras
metaloproteinases são ativadas fora da célula. Entre as enzimas que
15
promovem a ativação extracelular estão a plasmina, a catepsina G e
proteinases bacterianas (BOCHSLER & SLAUSON, 2002)
Durante os processos inflamatórios e fibróticos, proteases, entre elas
as MMP, são sintetizadas e liberadas para o meio. Recentemente, vários
estudos têm sido realizados relacionando a presença das metaloproteinases
com essas enfermidades.
Garland et al. (2002) descrevem que nos casos de corioamnionite em
humanos há aumento significativo do nível de MMP-9, e que a pesquisa da
quantidade dessa metaloproteinase no líquido amniótico é um indicador
confiável para o diagnóstico de infecção intra-uterina com 83% de
sensibilidade, 95% de especificidade, 71% e 97% de valor prognóstico positivo
e negativo respectivamente.
Recentemente, foi observada atividade aumentada da MMP-2 e da
MMP-9 associada à presença dos macrófagos nas inflamações gástricas
(JAMES et al., 2005).
Os TIMPs desempenham papel importante na implantação embrionária
e placentação, assim como em muitos outros processos de remodelamento
tecidual relacionados à reprodução, tais como ovulação, angiogênese,
crescimento embrionário e desenvolvimento da glândula mamária. No entanto,
a função primordial dessas enzimas é promover a homeostasia da matriz
extracelular e manter sua integridade (LENHART et al., 2002).
Goffin et al. (2003) relatam que em humanos as MMP são
responsáveis pelo remodelamento do colágeno uterino nas fases
perimenstruais. Especificamente no trato reprodutivo feminino, estão
relacionadas ao remodelamento e reparo tecidual em eventos como ovulação,
implantação embrionária, útero pós-parto e involução da glândula mamária
(BRUNER et al., 1995).
Em outros órgãos, as MMPs também desempenham papel importante
nos processos fibróticos.
Nos processos patológicos progressivos, como a fibrose hepática, há
excesso de deposição de proteínas da matriz no espaço extracelular podendo
resultar em cirrose. Esse processo está relacionado à regulação da síntese e
degradação de matriz. Nestas lesões, ocorre deposição de uma rede de matriz
fibrilar, constituída principalmente por colágenos tipo I e III, relativamente
16
resistentes à atividade das proteases. As células estreladas hepáticas quando
ativadas, exibindo fenótipo de miofibroblastos, secretam pró-MMP-2, induzidas
pela presença de colágeno do tipo I, o principal no fígado fibrótico. A pró-MMP-
9, no fígado, tem como principal fonte as células de Kupffer ativadas. O
aumento da atividade colagenolítica está associado à diminuição rápida e
significativa do nível de TIMP (ARTHUR, 2000).
A MMP-9 está envolvida na inflamação crônica pulmonar. Acredita-se
que seja produzida por macrófagos alveolares e esteja diretamente envolvida
com o remodelamento tecidual na fibrose pulmonar idiopática em humanos.
Nesta enfermidade, edema e alterações na permeabilidade alvéolo-capilar não
são observadas, sugerindo-se então que a expressão aumentada da MMP-9
por macrófagos alveolares está correlacionada mais à fibrose do que a
degradação extensa do parênquima (LEMJABBAR et al., 1999; SWEET et al.,
2002).
No útero humano, a MMP-2 é a que se encontra mais amplamente
distribuída. É detectada na maioria das células endometriais, sejam epiteliais,
estromais, vasculares, mas não nos leucócitos, porém observada em maior
intensidade no tecido menstrual em degeneração. Já a MMP-9 é encontrada no
epitélio somente durante a fase secretória precoce e durante a menstruação
está presente predominantemente em leucócitos (ZHANG & SALAMONSEN,
2002). Kaitu’u et al. (2005), observaram a expressão de MMP-9 em leucócitos
e células em degeneração no endométrio de camundongas modelo para
simulação do ciclo menstrual.
A presença de MMPs e TIMPs nos vasos do endométrio humano foi
relacionada à angiogênese e proteção vascular respectivamente (FREITAS et
al., 1999; SEVAL et al., 2004). Sabe-se que a MMP-2 desempenha papel
crucial na angiogênese e que, embora tenha participação nesse fenômeno, a
função da MMP-9 ainda não é bem definida (FODA & ZUCKER, 2001).
Lenhart et al. (2002) demonstraram que em útero de suíno a
expressão dos inibidores das metaloproteinases está relacionada ao aumento
da expressão de relaxina durante a fase precoce da prenhez, sugerindo que
esta estimula o crescimento uterino durante a placentação.
Em eqüinos, estudos sobre metaloproteinases foram realizados em
doenças articulares e oculares no sentido de se obter dados sobre a ação
17
deletéria dessas enzimas em quadros degenerativos e o possível efeito
favorável de sua inibição (HOLLANDER, 1997; HAFFNER et al., 2003).
Nesta espécie, os níveis de MMP-2 e MMP-9 estão significantemente
aumentados nas artropatias, sejam elas sépticas ou não. A MMP-2 é secretada
pelos fibroblastos sinoviais e condrócitos, enquanto a MMP-9 pelos
condrócitos, monócitos e neutrófilos. O desequilíbrio na atividade dessas
enzimas, leva à destruição excessiva da matriz extracelular. Esses dados
podem representar um caminho para o tratamento das doenças articulares
(CLEGG et al., 1997; HOLLANDER, 1997).
Nas éguas, também foi verificada a presença das MMP-2 e MMP–9 no
fluido folicular em todos os estágios de desenvolvimento dos folículos
ovarianos, indicando sua necessidade durante o remodelamento tecidual no
crescimento e desenvolvimento folicular (RILEY et al., 2001).
Foi demonstrado por Vagnoni et al. (1995) que no útero das éguas a
invasão de uma subpopulação de células trofoblásticas (chorionic girdle cells),
durante a formação da cinta coriônica é dependente da ação de
metaloproteinases.
Nas éguas, há evidências de que a MMP-2 e a MMP-9 participem do
processo fibrótico que ocorre na endometrite crônica. PORTO et al. (2005)
observaram marcação imunoistoquímica para essas enzimas em diferentes
tipos celulares no endométrio de égua portadora de endometrite crônica. A
imuno-reatividade para MMP-2 foi constatada nas células do epitélio luminal e
glandular, além da parede vascular. A expressão da MMP-9 foi detectada nas
células do infiltrado inflamatório presentes na periferia de glândulas fibróticas.
Walter et al. (2005) também observaram imuno-reatividade para MMP-2 na
fibrose periglandular de éguas com endometrose.
Diante do exposto, nota-se que como a patogênese da fibrose
endometrial eqüina ainda permanece obscura, estudos sobre seus
mecanismos devem ser desenvolvidos. Esta alteração compromete a função
uterina, impedindo a fêmea de manter o feto até o final da gestação, o que leva
a grandes perdas econômicas. O estudo dos tipos de colágeno que se
acumulam na fibrose endometrial é necessário para que seja realizada a
correlação cronológica com as alterações encontradas na histopatologia
(NUNES, 2003). Investigações a respeito das metaloproteinases e seus
18
inibidores nesse tipo de processo ainda são escassos. A observação desses
dados auxilia a compreensão da enfermidade, pois tais enzimas participam
ativamente do remodelamento tecidual nos processos fibróticos. Novos
caminhos na terapia anti-fibrótica podem se abrir a partir da determinação do
papel das metaloproteinases nas afecções endometriais crônicas.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. PROCEDÊNCIA DO MATERIAL
No presente estudo, foram utilizadas 82 biópsias endometriais. O
material foi proveniente do Serviço de Patologia Veterinária e do Serviço de
Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
UNESP – Campus de Botucatu, SP, oriundo da rotina do Hospital Veterinário
desta instituição, de clínicas particulares e de profissionais autônomos,
abrangendo o período entre 1987 e 2005.
O estudo foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na
Experimentação Animal, sendo aprovado pela Câmara de Ética em
Experimentação Animal (protocolo nº 002/2004).
3.2. PROCESSAMENTO HISTOPATOLÓGICO
Todas as biópsias sofreram o mesmo tipo de processamento
laboratorial. A fixação foi realizada em Bouin, substituído após 24 horas por
solução de álcool a 70%. Posteriormente, os fragmentos foram lavados em
água corrente, deixados em solução de álcool amoniacal a 10% overnight e,
novamente, lavados em água corrente por quatro horas. Após processamento
histológico foi realizada inclusão em parafina.
Os blocos selecionados foram submetidos à microtomia em micrótomo
rotativo. Os cortes histológicos foram obtidos com três micrômetros de
espessura.
Inicialmente, uma lâmina correspondente a cada caso foi corada pelo
método de Hematoxilina e Eosina – H.E. (LUNA, 1968), para posterior análise e
classificação histológica da endometrite.
20
3.2.1. TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS
3.2.1.1. TRICRÔMICO DE MASSON
A técnica utilizada foi descrita por Luna (1968) e segue o roteiro da
Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de
Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP.
Depois da confecção, as lâminas permaneceram em estufa a 60°C por
12 horas, após o que foram posicionadas em berços de coloração e
submetidas ao processo de desparafinização e hidratação.
As lâminas ficaram submersas em solução de Bouin em estufa a 60°C
por uma hora, que seguiu-se por resfriamento até a temperatura ambiente.
Depois deste procedimento, foram lavadas em água corrente por 15 minutos e
rapidamente em água destilada. Após esta etapa, as lâminas foram
posicionadas em suporte de coloração e os corante aplicados sobre as
mesmas na seguinte ordem: hematoxilina férrica por cinco minutos, lavagem
em água corrente por cinco minutos e depois em água destilada; fucsina ácida
adicionada de ponceau por dez minutos, lavagem em água corrente por um
minuto e depois em água destilada; ácido fosfomolíbdico a 5% por cinco
minutos até o clareamento dos cortes, lavagem em água corrente e água
destilada rapidamente; azul de anilina a 0,5% por cinco minutos, lavagem em
água corrente e água destilada rapidamente; ácido acético por um minuto.
Após a passagem nessas soluções, as lâminas foram novamente
postas em berço de coloração e submetidas aos processos de desidratação,
diafanização e montagem com resina sintética.
3.2.1.2. RETICULINA
A técnica utilizada, descrita por Caldini (1992), segue o roteiro da
Apostila de Técnicas de Colorações Específicas do Laboratório de
Histopatologia do Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ – UNESP
Botucatu.
Os blocos de parafina foram submetidos à microtomia com três
micrômetros de espessura.
21
Depois da confecção, as lâminas permaneceram em estufa a 60°C por
12 horas e posteriormente foram posicionadas em berços de coloração e
submetidas ao processo de desparafinização e hidratação.
As lâminas foram posicionadas em suporte de coloração e os corantes
aplicados sobre as mesmas na seguinte ordem: permanganato de potássio a
0,3% por dois minutos, lavagem em água destilada; ácido oxálico a 5% por 1
minuto, lavagem em água destilada; sulfato férrico amoniacal a 3% por dois
minutos, lavagem em água destilada; prata amoniacal, preparada e filtrada na
hora do uso, por cinco minutos, seguida de três trocas de água destilada;
formol neutro a 5% por cinco minutos, lavagem em água destilada; cloreto de
ouro a 0,1% por 10 minutos, lavagem em água destilada; tiossulfato de sódio a
3%, lavagem em água corrente por um minuto e passagem em água destilada;
solução de Van Gieson por cinco minutos.
Na composição da prata amoniacal, preparada no momento do uso,
foram empregados cinco mililitros de nitrato de prata a 5%, cinco gotas de
hidróxido de sódio a 10% e cinco gotas de amônia, esta última podendo ser
adicionada em menor quantidade, para que a solução tomasse aspecto quase
translúcido, com precipitado enegrecido.
Após a passagem nessas soluções, as lâminas foram novamente
postas em berço de coloração e submetidas aos processos de desidratação,
diafanização e montagem em resina sintética.
3.2.1.3. PICROSIRIUS RED
A utilização desta técnica, descrita por Junqueira et al. (1978), seguiu
o roteiro de Técnicas de Colorações Específicas do Departamento de Cirurgia
Experimental da Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP.
De 67 biópsias, foram obtidos cortes com cinco micrômetros de
espessura de 67 biópsias. Após sua confecção, as lâminas foram posicionadas
em berço de coloração e submetidas aos processos de desparafinização e
hidratação.
O material então foi imerso em solução de ácido fosfomolíbdico a 0,2%
por dois minutos e posteriormente lavado em água corrente e água destilada.
Após este processo, permaneceu imerso em solução a 0,1% de Direct Red
(Direct Red 36554-8, Sigma Chemical CO., St. Louis MO, EUA) dissolvido em
22
ácido pícrico a 1,5% (aquoso saturado) por 110 minutos. Em seguida, as
lâminas foram mergulhadas em solução de ácido clorídrico a 0,1 N por dois
minutos. Depois destas etapas, o material foi lavado em solução de álcool a
70% durante 45 segundos e submetido aos processos de desidratação,
diafanização e montagem em resina sintética.
3.2.2. TÉCNICA IMUNOSTOQUÍMICA
A padronização da técnica imunoistoquímica foi realizada no
Laboratório de Pesquisa do Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, em cooperação com o
Laboratório de Patologia Molecular da Faculdade de Medicina de Botucatu –
UNESP, e Laboratório de Imunoistoquímica do Departamento de Morfologia do
Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP.
Os anticorpos primários utilizados neste trabalho foram:
MMP-2 (RDI-MMP2abm-5D) – Anticorpo monoclonal produzido em
camundongo contra a enzima MMP-2 de origem humana (Research
Diagnostics Inc.).
MMP-9 (C-20) (sc-6840) – Anticorpo policlonal produzido na espécie caprina
contra a porção C-terminal da enzima MMP-9 de origem humana (Santa Cruz
Biotechnology, Inc.).
TIMP-1 (C-20) (sc-6832) – Anticorpo policlonal produzido na espécie caprina
contra a porção C-terminal da enzima TIMP-1 de origem humana (Santa Cruz
Biotechnology, Inc.).
A Tabela 1 demonstra os anticorpos e suas respectivas diluições no
endométrio eqüino.
23
TABELA 1. Anticorpos primários utilizados para marcação imunoistoquímica no
endométrio de éguas portadoras de endometrite crônica.
ANTICORPO CLONE PRODUÇÃO DILUIÇÃO FABRICANTE
MMP-2 42-5D11 camundongo 1:200
Research
Diagnostics Inc.
MMP-9 (C-20) policlonal cabra 1:100
Santa Cruz
Biotechnology, Inc
TIMP-1 (C-20) policlonal cabra 1:100
Santa Cruz
Biotechnology, Inc
Durante a padronização da técnica, foram utilizados como controle
positivo placenta humana, para os anticorpos MMP-2 e MMP-9, e carcinoma
mamário humano, para o anticorpo TIMP-1. Tecido de granulação eqüino
também foi utilizado com essa finalidade, já que na literatura médica é relatada
a marcação positiva para esse inibidor das MMPs no estudo dos processos
reparativos e fibróticos (ARTHUR, 2000; VAILLANT et al., 2001; CHANG et al.,
2002; GONZÁLEZ et al., 2002; YOSHIJI et al., 2002).
Cortes com três micrômetros de espessura foram posicionados sobre
lâminas silanizadas e mantidos em estufa a 60ºC por 18 horas.
Posteriormente, as lâminas foram submetidas à desparafinização em
duas passagens, cada uma de dez minutos, em xilol à temperatura ambiente,
reidratação em álcool etílico absoluto e três banhos de água destilada.
Seguiu-se o bloqueio da peroxidase endógena utilizando-se solução
de peróxido de hidrogênio a 30% em metanol na proporção 1:9, por 15
minutos, para os anticorpos MMP-9 e TIMP-1. Este procedimento para o
anticorpo MMP-2 foi realizado com solução de peróxido de hidrogênio a 3%.
Para a remoção do peróxido do tecido, as lâminas foram lavadas em água
destilada.
A recuperação antigênica foi executada em solução de ácido cítrico a
10 mM, pH 6,0, no forno de microondas a 750 watts (potência máxima). Os
tempos de radiação para os anticorpos foram: para MMP-9 e TIMP-1, um ciclo
de 5 minutos; para MMP-2, quatro ciclos de 5 minutos cada, totalizando 20
minutos. O material foi então submetido a resfriamento por 20 minutos em
24
temperatura ambiente. Por conseguinte, as lâminas foram lavadas em água
destilada e imersas em tampão TRIS-HCl pH 7,4 por cinco minutos.
Com a finalidade de evitar reações inespecíficas com proteínas
teciduais, os cortes foram imersos em solução de leite em pó desnatado a 3%
em tampão TRIS-HCl por uma hora, para os anticorpos MMP-9 e TIMP-1.
A incubação com os anticorpos primários por 18 horas a 4°C,
conforme as diluições descritas na Tabela 1, foi efetuada em bandeja com
tampa e lacrada com fita adesiva, precedida da remoção do excesso de leite
das lâminas no caso dos anticorpos MMP-9 e TIMP-1. A diluição foi feita em
solução de BSA a 1% para os anticorpos MMP-9 e TIMP-1 e em BSA a 0,1%
contendo azida sódica para o anticorpo MMP-2.
Os cortes foram lavados com tampão TRIS-HCl e submetidos à reação
com anticorpo secundário biotinilado anti-imunoglobulina de cabra (sc-2347,
Santa Cruz Biotechnology, Inc.) na diluição 1:100, por uma hora, para os
anticorpos primários anti-MMP-9 e anti-TIMP-1, e anti-imunoglobulina de
camundongo (BA-2000, Vector Laboratories, Inc.) na diluição 1:200, por 30
minutos, para o anticorpo primário anti-MMP-2, ambos em temperatura
ambiente.
Após a reação com o anticorpo secundário, o material foi lavado com
TRIS-HCl e as lâminas incubadas com o complexo avidina-biotina-peroxidase
(VECTASTAIN Elite ABC Kit, PK–6100, Vector Laboratories, Inc.), à
temperatura ambiente por 30 minutos. O complexo era preparado 30 minutos
antes do uso.
Para visualização da reação, as lâminas foram tratadas com solução
de 3,3´diaminobenzidina (Liquid DAB – K3466, DakoCytomation) durante cinco
minutos à temperatura ambiente. Os cortes foram contra-corados com
hematoxilina de Harris, por 20 segundos. Em seguida, procederam a
desidratação, diafanização e montagem em resina sintética.
Em cada bateria de reação, controles positivos e negativos foram
incluídos. O controle positivo baseou-se em biópsias endometriais de égua que
apresentaram positividade para os anticorpos durante a padronização da
técnica. O controle negativo consistiu na omissão do anticorpo primário em
corte de endométrio eqüino, sendo incubado somente o diluente.
25
3.3. AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
3.3.1. APLICAÇÃO DA CLASSIFICAÇÃO DAS
ENDOMETRITES CRÔNICAS EQÜINAS
Para cada caso, utilizou-se a classificação histopatológica conforme
proposto por Kenney & Doig (1986) e Ricketts & Alonso (1991) para as
endometrites crônicas.
Os Quadros 1 e 2 descrevem as classificações de Kenney & Doig
(1996) e Ricketts & Alonso (1991), respectivamente.
26
QUADRO 1. Classificação histopatológica das biópsias endometriais das éguas
segundo Kenney & Doig, 1986.
ALTERAÇÕES
CATEGORIA
I
CATEGORIA
IIA
CATEGORIA
IIB
CATEGORIA
III
considerações Endométrio
sem alterações
patológicas, ou
são discretas e
bem dispersas.
Alterações
discretas.
Alterações
moderadas.
Alterações
severas.
infiltrado
inflamatório
discreto a
moderado no
estrato
compacto ou
focos discretos
e freqüentes no
estrato
compacto e
esponjoso
difuso e em
focos
moderadamente
severos
difuso e severo
alterações
fibróticas
discretas e
freqüentes de
glândulas
individuais em
qualquer grau
de severidade
ou menos de 2
ninhos por
campo linear de
5,5 mm (média
de 4 campos)
difusa com
distribuição
uniforme e 4 ou
mais camadas
(2 ou 4 ninhos
por campo
linear de 5,5
mm em média
de 4 campos)
difusa e
uniforme de
glândulas com
5 ou mais
ninhos por
campo linear de
5,5 mm
lacunas linfáticas extensas extensas severas
outras alterações éguas com
atrofia
endometrial
parcial no fim da
estação de
monta são
incluídas nesta
categoria
éguas com
atrofia
endometrial
severa na
estação de
monta estão
incluídas
27
QUADRO 2. Classificação das endometrites eqüinas segundo Ricketts &
Alonso, 1991.
DIAGNÓSTICO
HISTOPATOLÓGICO
CARACTERÍSTICAS
Endometrite crônica infiltrativa células mononucleares, incluindo histiócitos e
plasmócitos, infiltrando o estroma
Doença endometrial degenerativa
crônica (endometrose)
alterações degenerativas glandulares (ninhos e/ou
cistos) associadas à fibrose periglandular e/ou
fibrose estromal difusa
Os cortes corados pelo método do Tricrômico de Masson foram
utilizados para determinar a localização e o grau de fibrose, permitindo a
categorização da lesão endometrial.
3.3.2. AVALIAÇÃO DO COLÁGENO
As lâminas coradas com Reticulina e Picrosirius Red foram utilizadas
para a avaliação do tipo de colágeno endometrial. Para o material corado pelo
método do Picrosirius Red, utilizou-se microscópio de luz polarizada, modelo
Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Alemanha), do Serviço de Patologia Veterinária da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP.
3.3.2.1. ANÁLISE QUALITATIVA
A análise do colágeno presente nas biópsias foi feita considerando-se
a sua distribuição nas diferentes regiões do endométrio, que compreenderam:
região subepitelial (membrana basal), estratos compacto e esponjoso, e
regiões periglandular e perivascular.
Foi realizada a classificação qualitativa do colágeno presente na
fibrose endometrial. Pelo método da Reticulina, as fibras que apresentam
afinidade pela prata, corando-se em negro, correspondem ao colágeno do tipo
III, e as que apresentam coloração acastanhada correspondem ao colágeno do
tipo I. Pelo método do Picrosirius Red-Polarização, foi possível a identificação
do colágeno do tipo III, com refringência verde, e do colágeno do tipo I, que
apresenta refringência amarelada a avermelhada.
28
3.3.2.2. ANÁLISE MORFOMÉTRICA
Para a análise morfométrica do colágeno as lâminas coradas pelo
método de Picrosirius Red foram observadas em microscópio de luz polarizada
dispondo de câmara digital modelo Axiocam MRc (Zeiss Vision, Alemanha)
acoplado a um microcomputador. As imagens foram processadas pelo
programa computacional Axiovision Software Rel. versão 4.3 (Zeiss Vision,
Alemanha).
A análise morfométrica da fibrose periglandular foi realizada conforme
descrito por Evans et al. (1998).
Foi avaliado o acúmulo de colágeno ao redor de glândulas individuais
e de ninhos fibróticos, em cinco campos diferentes em objetiva de 10x. A área
da fibrose foi calculada subtraindo-se a área ocupada pelo colágeno pela área
ocupada pelo lúmen glandular. O resultado foi dividido pela área total da
amostra e multiplicado por 100. Assim, o valor resultante correspondeu ao
percentual total do colágeno presente na região periglandular.
3.3.3. AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA
A avaliação descritiva para a imuno-reatividade foi realizada
considerando-se os tipos celulares positivos entre as diferentes estruturas
marcadas e sua freqüência sendo avaliada como ausente, discreta, moderada
ou acentuada. A intensidade da marcação foi avaliada como fraca, moderada
ou acentuada.
Foi também estabelecido um escore acumulativo para cada biópsia,
atribuindo-se pontos a cada elemento marcado: epitélio luminal, epitélio
glandular, célula endotelial, parede vascular, célula inflamatória e célula
estromal, de maneira que houvesse variação entre 0 e 6.
3.4. ANÁLISE ESTATÍSTICA
O percentual de fibrose encontrado nas diferentes categorias de
endometrite será avaliado utilizando-se o teste estatístico não paramétrico de
Kruskal-Wallis (ZAR, 1996), adotando-se o nível de 5% de significância.
29
Este mesmo método foi empregado para o estudo da associação entre
o grau de expressão das metaloproteinases 2 e 9 e do TIMP-1 e as categorias
de endometrite.
30
4. RESULTADOS
4.1. AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
4.1.1. CLASSIFICAÇÃO DAS ENDOMETRITES
CRÔNICAS
Aplicando-se a classificação de Kenney & Doig (1986) nas 82 biópsias,
15 éguas foram incluídas na categoria I, 18 na categoria IIB e 49 na categoria
III.
Os resultados da classificação histopatológica dos 82 casos estão
apresentados na Tabela 2, quando classificados de acordo com Kenney & Doig
(1986).
TABELA 2. Distribuição das biópsias de endométrio eqüino classificadas de
acordo com Kenney & Doig (1986).
CARACTERÍSTICA NÚMERO DE CASOS PERCENTUAL
Categoria I 15 18,29
Categoria IIB 18 21,95
Categoria III 49 59,76
Total 82 100
Os endométrios considerados saudáveis são os mesmos nas duas
classificações, representados pela categoria I de Kenney & Doig (1986) e o
grupo hígido de Ricketts & Alonso (1991).
Histopatologicamente, os endométrios saudáveis (Figuras 1 e 2)
caracterizaram-se por apresentar epitélio luminal cilíndrico baixo com áreas
compostas por epitélio cilíndrico alto e pseudoestratificado. As alterações
observadas foram predominantemente de origem circulatória: congestão,
edema, dilatação de vasos linfáticos, hemorragia e hemossiderose. Nove casos
apresentaram infiltrado inflamatório discreto focal predominantemente
mononuclear, representando 60% das amostras, e cinco casos (33,3%)
apresentaram alterações fibróticas, caracterizadas por acúmulo do colágeno na
31
região perivascular (três casos) e intersticial de forma discreta e focal (dois
casos). As Figuras 9 e 10 demonstram vasos normais.
As biópsias classificadas como IIB segundo Kenney & Doig (1986)
apresentaram epitélio luminal cilíndrico podendo ter áreas de epitélio
pseudoestratificado. Entre as alterações fibróticas, a fibrose periglandular foi
encontrada em 77,7% dos casos e caracterizou-se por deposição moderada de
colágeno e média de 5 ninhos fibróticos por campo de cinco milímetros
lineares. Fibrose intersticial (66,7%) e perivascular (55,5%) também foram
observadas com freqüência nessas amostras. Lacunas linfáticas bem como
dilatações glandulares estavam presentes em 33,3% e 27,7% dos casos
respectivamente. O infiltrado inflamatório foi encontrado em 88,8% dos casos,
sendo distribuído principalmente de forma difusa e constituído
predominantemente por mononucleares.
Na categoria III (Figuras 3 e 4) o epitélio luminal apresentou-se
cilíndrico alto ou baixo, com áreas de epitélio pseudoestratificado. Assim como
nas biópsias da categoria IIB, os principais achados foram as alterações
fibróticas, mas com intensidade maior, sobretudo na região periglandular.
Nesta região, a fibrose caracterizou-se pela deposição acentuada de colágeno
(mais de cinco camadas) e alta freqüência de ninhos fibróticos (mais de 10
ninhos por campo). 61,3% dos casos apresentaram fibrose perivascular
(Figuras 11 e 12) e 57,1% apresentaram fibrose intersticial. 81,6% das biópsias
apresentaram infiltrado inflamatório mononuclear, sendo que desses casos,
40% das biópsias apresentaram distribuição difusa, intensidade moderada ou
acentuada.
Ao ser aplicada a classificação de Ricketts & Alonso (1991), 15
biópsias foram consideradas livres de lesões para o diagnóstico de
endometrite, 50 casos foram classificados como endometrite crônica infiltrativa
e 17 foram diagnosticados como endometrose.
Na Tabela 3 são apresentados os casos quando classificados
conforme Ricketts & Alonso (1991).
32
TABELA 3. Distribuição das biópsias de endométrio eqüino classificadas de
acordo com Ricketts & Alonso (1991).
CARACTERÍSTICA NÚMERO DE CASOS PERCENTUAL
Endométrio hígido 15 18,29
Endometrite infiltrativa 50 60,98
Endometrose 17 20,73
Total 82 100
As amostras classificadas como endometrite crônica infiltrativa
(Figuras 5 e 6) apresentaram epitélio luminal cilíndrico com áreas de epitélio
pseudoestratificado. O infiltrado inflamatório apresentou distribuição difusa,
mas em um algumas amostras (34%) o aspecto foi focal. O grau de intensidade
do infiltrado nesta categoria variou de moderado a severo. A fibrose
periglandular caracterizou-se por deposição moderada ou severa de colágeno,
em 48% e 42% dos casos respectivamente, levando freqüentemente à
formação de ninhos fibróticos. A fibrose perivascular foi observada em 64% dos
casos, da mesma forma a fibrose intersticial esteve presente em 60% das
biópsias.
Nos casos diagnosticados como endometrose (Figuras 7 e 8) o tipo de
epitélio luminal mais freqüentemente observado foi semelhante ao das
endometrites infiltrativas. A fibrose intersticial, sobretudo de forma difusa, e a
fibrose perivascular foram observadas em 67,7% e 41,2% dos casos
respectivamente. Houve alta incidência de ninhos fibróticos em 70,6% dos
casos com deposição moderada (35,3%) ou severa (58,8%).
Foi observado que nas endometrites mais severas, em ambas as
classificações, a densidade glandular foi relativamente menor.
33
FIGURA 1.
Endométrio categoria I. Ausência de alterações inflamatórias e
fibróticas. Epitélio luminal alto (seta), estrato compacto (EC) e alta
densidade glandular no estrato esponjoso (EE) Hematoxilina e Eosina.
Barra: 100 µm.
FIGURA 2.
Endométrio categoria I. Distribuição normal do colágeno.
Tricrômico de Masson. Barra: 100 µm.
EC
EE
34
FIGURA 3.
Endométrio categoria III. Fibrose periglandular intensa (seta),
ninhos glandulares (N), lacuna linfática (ponta de seta), na região profunda
do estrato esponjoso. Hematoxilina e Eosina. Barra: 100 µm.
FIGURA 4.
Endométrio categoria III. Fibrose periglandular intensa, ninhos
fibróticos e lacuna linfática. Tricrômico de Masson. Barra: 100 µm.
N
N
N
L
35
FIGURA 5.
Endometrite crônica infiltrativa. Infiltrado inflamatório moderado
focal no estrato compacto (seta) e discreto e difuso no estrato esponjoso.
Hematoxilina e Eosina. Barra: 100 µm.
FIGURA 6.
Endometrite crônica infiltrativa. Infiltrado inflamatório e fibrose
discreta multifocal no estrato esponjoso. Tricrômico de Masson. Barra: 100
µm.
36
FIGURA 7.
Endometrose. Alterações degenerativas difusas: fibrose
instersticial acentuada, dilatações e cistos glandulares associados à
fibrose periglandular. Hematoxilina e Eosina. Barra: 100 µm.
FIGURA 8.
Endometrose. Alterações degenerativas difusas: fibrose
instersticial e periglandular acentuadas. Tricrômico de Masson. Barra: 100
µm.
37
FIGURA 9.
Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais, na .
Hematoxilina e Eosina. Barra: 50 µm.
FIGURA 10.
Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Tricrômico de Masson. Barra: 50 µm.
38
FIGURA 11.
Endométrio categoria III – infiltrativa. Vasos endometriais.
Fibrose vascular e perivascular acentuada. Hematoxilina e Eosina. Barra:
50 µm.
FIGURA 12.
Endométrio categoria III – infiltrativa. Vasos endometriais.
Fibrose vascular e perivascular acentuada. Tricrômico de Masson. Barra:
50 µm.
39
4.1.2. AVALIAÇÃO HISTOQUÍMICA DO COLÁGENO
4.1.2.1. RETICULINA
Por esse método foi possível distinguir a membrana basal tanto na
região subeptelial como das glândulas endometriais, sendo nítida a
diferenciação dos tipos de colágeno devido a sua característica argirófila (tipo
III) e não argirófila (tipo I).
Os endométrios saudáveis (Figura 13) [categoria I de Kenney & Doig
(1986) e hígidos de Ricketts & Alonso (1991)], de maneira geral, notou-se que
houve predominância do colágeno tipo III, distribuído uniformemente pelo
endométrio. O estrato esponjoso caracterizou-se por apresentar colágenos do
tipo I e III, sem haver predominância de um dos tipos (I-III), em 66,7% das
amostras. Na região periglandular, o colágeno mais observado foi do tipo III,
correspondendo à membrana basal (66,7%); em alguns casos (26,7%) houve
predominância do colágeno do tipo I e em 6,7% foram notados os dois tipos de
colágeno simultaneamente sem prevalência de um deles (I-III). A região
perivascular, por sua vez, apresentou predominância do colágeno do tipo I
(60%). Nesta região, foi possível observar que quanto maior a deposição de
colágeno, maior a proporção de colágeno do tipo I em relação ao do tipo III. A
Figura 21 demonstra vasos normais em lâmina corada pelo método da
Reticulina.
Na categoria IIB de Kenney & Doig (1986), 50% das biópsias
apresentou predominância do colágeno III na região subepitelial, sendo em
alguns casos notada uma deposição maior, resultando no espessamento da
membrana basal. O colágeno do tipo I predominou em 33,3% dos casos e o
tipo I-III foi prevalente em 11,1% das amostras. Em um caso a visualização
dessa região não foi possível devido a focos de hemorragia. No estrato
compacto houve prevalência do colágeno do tipo I em 61,1% dos casos; nessa
região, o colágeno do tipo III esteve presente em maior quantidade em 22,2%
das biópsias e o tipo I-III foi notado em 16,7% dos casos. O estrato esponjoso
mostrou deposição moderada e acentuada em 55,5% e 33,3% dos casos
respectivamente, e em 88,9% o colágeno do tipo I foi predominante. A região
periglandular caracterizou-se pela deposição moderada de colágeno (72,2%),
sendo o colágeno do tipo I predominante em 83,3% das amostras. A região
40
perivascular demonstrou deposição moderada a acentuada do colágeno
(27,8% e 33,3%) sendo o tipo I predominante em 77,8% das biópsias.
Nos casos classificados como categoria III (Figura 14), o colágeno I
prevaleceu em todas as regiões estudadas, exceto na região subepitelial.
Neste segmento do endométrio, em 63,3% das amostras o colágeno do tipo III
foi predominante, não havendo indícios de fibrose, ou esta foi discreta. O
acúmulo do colágeno do tipo I no estrato compacto variou de moderado a
intenso, ambos em 38,8% dos casos. No estrato esponjoso houve deposição
moderada e acentuada em 36,7% e 61,2% dos casos respectivamente, com
predominância do colágeno I. A região periglandular caracterizou-se pelo
acúmulo acentuado de colágeno, sendo o tipo I prevalente em 73,5% dos
casos. Na região perivascular (Figura 22) a deposição do colágeno foi
moderada (32,6%) ou acentuada (61,2%), sendo o colágeno do tipo I o mais
encontrado em 91,8% das amostras.
Quando aplicada a classificação de Ricketts & Alonso (1991), nos
casos diagnosticados como endometrite crônica infiltrativa (Figura 17) houve
prevalência do colágeno I, exceto nas regiões subepitelial, na qual o colágeno
III predominou em 60% das amostras, e estrato esponjoso, onde 56% das
biópsias apresentaram o tipo I-III. A região perivascular apresentou deposição
moderada (40%) e acentuada (58%) de colágeno, sendo o do tipo I
predominante em 94% das amostras. Na região periglandular, foi constatada
deposição discreta em 14% das amostras, e de forma moderada e acentuada
em 30% e 54% das biópsias respectivamente. Nessa região, o colágeno do tipo
I foi prevalente em 88% desses casos.
Nas endometroses (Figura 18), notou-se maior deposição do colágeno
em todas as regiões analisadas, com predominância do colágeno do tipo I: no
estrato esponjoso em 94,1% das amostras, na região periglandular em 88,2%,
sendo o mesmo valor encontrado na região perivascular, e no estrato compacto
em 58,8% das biópsias. Somente na região subepitelial colágeno do tipo III
prevaleceu (58,8%).
41
4.1.2.2. PICROSIRIUS RED – POLARIZAÇÃO
Nos endométrios saudáveis (Figura 15), houve predominância de
colágeno do tipo III, com distribuição reticular pelo endométrio. A região que
apresentou maior deposição de colágeno do tipo I foi a perivascular, em 33,3%
das amostras. A Figura 23 mostra a distribuição dos colágenos I e III em vasos
normais do endométrio.
Na categoria IIB de Kenney & Doig (1986), os estratos compacto e
esponjoso, além da região periglandular, mostraram deposição de colágeno
moderada (69,2%, 53,8% e 84,6% respectivamente), e na região perivascular
ocorreu de forma acentuada (61,5%). Todas as regiões avaliadas
apresentaram predominância do colágeno do tipo I, com exceção da região
subepitelial, onde o tipo I-III foi observado em 38,5% das amostras.
A categoria III (Figura 16) caracterizou-se pela deposição acentuada
de colágeno em todas as regiões, sendo observada a predominância do tipo I.
A região que apresentou maior acúmulo de colágeno foi a periglandular
(92,3%). A Figura 24 mostra a distribuição de colágeno do tipo I e do tipo III em
vaso fibrótico.
Quando empregada a classificação de Ricketts & Alonso (1991), nas
endometrites crônicas infiltrativas (Figura 19), as regiões onde a deposição de
colágeno foi mais intensa foram a perivascular (64,9%), o estrato esponjoso
(62,2%) e periglandular (56,8%). Houve predomínio do colágeno I em todas as
regiões estudadas.
Nas endometroses (Figura 20) houve deposição intensa de colágeno
em todas as regiões analisadas, exceto na região subepitelial, onde foi
moderada. Os locais de maior deposição de colágeno foram as regiões
periglandular e perivascular em 73,3% e 66,6% das biópsias. Nesse processo,
o colágeno do tipo I predominou em todas as amostras, e nas regiões
periglandular e do estrato esponjoso somente este tipo de colágeno foi
observado.
Utilizando-se esta técnica histoquímica, ficou evidenciada a diminuição
da quantidade de glândulas no endométrio fíbrótico, mormente as biópsias que
apresentaram fibrose intersticial acentuada.
42
FIGURA 13.
Endométrio categoria I. Distribuição de colágeno do tipo III –
negro (seta) na membrana basal das glândulas e no estrato compacto, e
do tipo I (castanho) na região profunda do estrato esponjoso. Reticulina.
Barra: 100 µm.
FIGURA 14.
. Endométrio categoria III. Colágeno tipo I-III (castanho-negro)
na fibrose periglandular (seta) e predominância do colágeno do tipo I
(castanho) nos ninhos glandulares. Reticulina. Barra: 100 µm.
43
FIGURA 16.
Endométrio categoria III. Colágeno tipo I-III (amarelo-verde)
na fibrose periglandular (seta) e predominância do colágeno do tipo I
(amarelo e vermelho) nos ninhos fibróticos. Picrosirius Red – Polarização.
Barra: 100 µm.
FIGURA 15.
. Endométrio categoria I. Distribuição reticular do colágeno do
tipo III (verde) e presença do colágeno do tipo I (amarelo) em menor
proporção. Picrosirius Red – Polarização. Barra: 100 µm.
44
FIGURA 17.
Endometrite crônica infiltrativa. Colágeno do tipo III (negro)
predominante do estrato compacto e do tipo I (castanho) predominante no
estrato esponjoso. Reticulina. Barra: 100 µm.
FIGURA 18.
Endometrose. Colágeno do tipo I (castanho) predominante na
fibrose intersticial e periglandular. Reticulina. Barra: 100 µm.
45
FIGURA 20.
Endometrose. Colágeno do tipo I (amarelo e vermelho)
predominante na fibrose intersticial e periglandular. Barra: 100 µm.
FIGURA 19.
Endometrite crônica infiltrativa. Colágeno do tipo III (verde)
predominante no estrato compacto e do tipo I (amarelo e vermelho)
predominante no estrato esponjoso. Picrosirius Red – Polarização. Barra:
100 µm.
46
FIGURA 21.
Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Distribuição de colágeno do tipo III (negro) e do tipo I (castanho) na parede
vascular. Reticulina. Barra: 50 µm.
FIGURA 22.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular. Predominância do
colágeno do tipo I (castanho). Reticulina. Barra: 50 µm.
47
FIGURA 24.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa.
Vasos endometriais. Fibrose vascular e perivascular. Predominância do
colágeno do tipo I (amarelo e vermelho). Picrosirius Red - Polarização.
Barra: 100 µm.
FIGURA 23.
Endométrio categoria I. Vasos endometriais normais.
Distribuição de colágeno do tipo III (verde) e do tipo I (amarelo e vermelho)
na parede vascular. Picrosirius Red – Polarização. Barra: 100 µm.
48
4.2. MORFOMETRIA DO COLÁGENO
PERIGLANDULAR
A avaliação morfométrica da fibrose periglandular revelou que,
independente da classificação utilizada, não houve diferença significativa do
percentual de fibrose entre as endometrites crônicas mais graves, categorias
IIB e III (KENNEY & DOIG, 1986) e endometrite crônica infiltrativa e
endometrose (RICKETTS & ALONSO, 1991). A diferença foi notada apenas
entre os endométrios saudáveis e aqueles com diagnóstico de endometrite.
As Tabelas 5 e 6 mostram os resultados da análise estatística.
TABELA 4. Valores medianos do percentual de fibrose periglandular de acordo
com as categorias de endometrite segundo Kenney & Doig (1986).
CATEGORIA FIBROSE PERIGLANDULAR %
I
0,8a
1
IIB
3,8b
III
4,3b
1
Medianas seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, a 5% de
probabilidade, pelo teste de Kruskal-Wallis.
TABELA 5. Valores medianos do percentual de fibrose periglandular nos
endométrios classificados segundo Ricketts & Alonso (1991).
CATEGORIA FIBROSE PERIGLANDULAR %
Endométrio hígido
0,8a
1
Endometrite crônica infiltrativa
4,4b
Endometrose
3,8b
1
Medianas seguidas pela mesma letra não diferem significativamente, a 5% de
probabilidade, pelo teste de Kruskal-Wallis.
49
4.3. AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA
4.3.1. MMP-2
A expressão de MMP-2 foi observada em 88,7% das amostras de
endométrio eqüino. Entre os elementos considerados neste estudo, não houve
imuno-reatividade em células inflamatórias, tampouco em células endoteliais.
A marcação imunoistoquímica foi observada nas células estromais do
estrato compacto (Figura 27), sobretudo nas biópsias de endométrio saudável.
Essas células também mostraram-se reativas ao redor das glândulas fibróticas
e/ou dilatadas, nas quais o epitélio também mostrou-se reativo para esse
anticorpo. No entanto, a marcação positiva nas células do epitélio glandular
não foi limitada às glândulas com esse tipo de alteração (Figura 26). A região
da parede vascular, excluindo-se o endotélio (Figura 28), mostrou intensa
marcação para MMP-2, principalmente na região mais profunda do estrato
esponjoso.
Nos endométrios saudáveis, a região da parede vascular e as células
estromais foram as estruturas que apresentaram maior intensidade de
marcação, seguidas pelo epitélio glandular. A análise estatística revelou não
haver diferença significativa na intensidade da expressão da MMP-2 entre
essas estruturas citadas na presente categoria, mas houve diferença
significativamente maior entre o grau de intensidade dessas estruturas e o do
epitélio luminal, células endoteliais e do infiltrado inflamatório. As estruturas
mais freqüentemente marcadas nas biópsias foram as células estromais em
73,3% dos casos e a região da parede vascular, observada em 53,3% das
amostras.
Na categoria IIB, marcação mais intensa ocorreu nas células
estromais. A análise estatística demonstrou não haver diferença significativa na
intensidade da expressão da MMP-2 entre as células estromais, parede
vascular e epitélio glandular nesta categoria, mas houve diferença
significativamente maior entre o grau de intensidade dessas estruturas e o do
epitélio luminal, células endoteliais e do infiltrado inflamatório. As estruturas
marcadas com maior freqüência nas biópsias foram as células estromais em
52,9% dos casos, seguidas pela região da parede vascular em 47,1%.
50
Na categoria III, o epitélio glandular e as células estromais foram as
que apresentaram maior intensidade de marcação. A análise estatística
mostrou não haver diferença significativa na intensidade da expressão da
MMP-2 entre epitélio glandular, células estromais e parede vascular, no entanto
houve diferença significativamente maior entre o grau de intensidade dessas
estruturas e o do epitélio luminal (Figura 25), células endoteliais e do infiltrado
inflamatório. As estruturas mais freqüentemente marcadas nas biópsias foram
o epitélio glandular em 60,4% dos casos, células estromais em 52,1% e parede
vascular, observada em 47,9% das amostras.
As medianas dos escores acumulativos das categorias I, IIB e III foram
3,0, 2,5 e 3,0 respectivamente, o que não expressou diferença significativa.
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação de Kenney & Doig (1986) revelou que o epitélio
glandular das amostras de endométrio da categoria III mostraram valores
significativamente maiores que os do epitélio glandular das amostras da
categoria I.
No que diz respeito ainda a este parâmetro, a parede vascular mostrou
valores significativamente maiores nas amostras de endométrio da categoria I.
As demais estruturas não apresentaram diferença significativa para a
expressão de MMP-2.
Os resultados do estudo estatístico para a variável MMP-2 na
classificação de KENNEY & DOIG (1986) estão demonstrados nas Tabelas 7 e
8.
51
TABELA 6. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de MMP-2 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com KENNEY & DOIG (1986).
ESTRUTURA CATEGORIA I CATEGORIA IIB
CATEGORIA III
epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
epitélio glandular 1abA 1bAB 2bB
célula endotelial 0aA 0aA 0aA
parede vascular 2bA 1bB 1bB
célula inflamatória 0aA 0aA 0aA
célula estromal 2bA 1,5bA 2bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
TABELA 7. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias uterinas
classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a enzima MMP-2.
CATEGORIA MEDIANA
I 3,0a
1
IIB 2,5a
III 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
Quando aplicada a classificação de Ricketts & Alonso (1991), nas
endometrites crônicas infiltrativas a marcação mais intensa ocorreu no epitélio
glandular e nas células estromais. A análise estatística demonstrou não haver
diferença significativa na intensidade da expressão da MMP-2 no epitélio
glandular, parede vascular e células estromais desta categoria, porém estas
estruturas mostraram intensidade de marcação significativamente maior do que
o epitélio glandular, as células endoteliais e inflamatórias. As estruturas
marcadas com maior freqüência nas biópsias foram epitélio glandular em
52
57,1% dos casos, seguidas pelas células estromais em 51% e parede vascular
em 49%.
Nas endometroses as células estromais foram as que apresentaram
maior intensidade de marcação, mas sem diferença significativa em relação à
marcação do epitélio glandular e parede vascular. No entanto, as células
estromais mostraram intensidade de marcação significativamente maior do que
o epitélio luminal, as células endoteliais e inflamatórias. As estruturas mais
freqüentemente marcadas nas biópsias foram as células estromais em 62,5%
dos casos.
As medianas dos escores acumulativos para as diferentes categorias -
endométrio hígido, endometrite crônica infiltrativa e endometrose - foram 3,0.
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação Ricketts & Alonso (1991) revelou que o epitélio
glandular das amostras de endometrite crônica infiltrativa mostraram valores
significativamente maiores que os do epitélio glandular das amostras das de
endométrio hígido e com endometrose.
No que diz respeito ainda a este parâmetro, a parede vascular mostrou
valores significativamente maiores nas amostras de endométrio hígido.
As demais estruturas não apresentaram diferença significativa para a
expressão de MMP-2.
Os resultados do estudo estatístico para a variável MMP-2 na
classificação de RICKETTS & ALONSO (1991) estão demonstrados nas
Tabelas 9 e 10.
53
TABELA 8. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de MMP-2 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com RICKETTS & ALONSO (1991).
ESTRUTURA ENDOMÉTRIO
HÍGIDO
ENDOMETRITE
CRÔNICA
INFILTRATIVA
ENDOMETROSE
epitélio luminal 0aA
1
0aA 0aA
epitélio glandular 1abA 2bB 1abA
célula endotelial 0aA 0aA 0aA
parede vascular 2bA 1bB 1abB
célula inflamatória 0aA 0aA 0aA
célula estromal 2bA 2bA 2bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
TABELA 9. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias uterinas
classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a enzima
MMP-2.
CATEGORIA MEDIANA
Endométrio hígido 3,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 3,0a
Endometrose 3,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
54
FIGURA 25.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-2.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva na região apical das células do epitélio luminal (seta). Presença de
hemossiderófagos no estrato esponjoso (*). Barra: 50 µm.
*
*
FIGURA 26.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-2.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva intensa no epitélio de glândulas fibróticas e dilatadas. Notar
marcação heterogênea no epitélio de algumas glândulas. Barra: 100 µm.
55
FIGURA 27.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-2.
Endométrio categoria I. Marcação positiva em células estromais do estrato
compacto (seta). Barra: 50 µm.
FIGURA 28.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-2.
Endométrio categoria IIB – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva na parede vascular e células estromais (seta). Barra: 50 µm.
56
4.3.2. MMP-9
A expressão de MMP-9 foi constatada em todas as amostras de
endométrio eqüino, sendo que em 91,5% houve intensidade acentuada.
A marcação imunoistoquímica para este anticorpo mostrou ser difusa
por todo o endométrio. Todos os elementos considerados neste estudo
apresentaram imuno-reatividade (Figuras 29 a 33), e pôde ser notada
positividade também no plasma, linfa e secreção glandular. O miométrio
também foi reativo. As células estromais marcaram intensamente em grande
parte das biópsias, sobretudo no estrato compacto e região superficial do
estrato esponjoso. Nos locais onde constatou-se erosão do endométrio houve
maior intensidade na marcação de MMP-9.
Nos endométrios saudáveis, 93,3% dos casos apresentaram
imunomarcação acentuada para MMP-9 e em 6,7% foi moderada. Células
endoteliais e do infiltrado inflamatório foram as que apresentaram maior
intensidade de marcação em 86,7% e 80% das amostras respectivamente, mas
não houve diferença significativa entre os diferentes elementos estudados. As
estruturas mais freqüentemente marcadas nas biópsias foram as células
estromais e o epitélio glandular em 86,7% das biópsias.
Na categoria IIB de Kenney & Doig (1986) as estruturas que
apresentaram maior intensidade de marcação para MMP-9 foram as células do
epitélio luminal e as células endoteliais e do infiltrado inflamatório, entretanto
não foi observada diferença significativa entre os diferentes elementos
estudados. O componente mais freqüentemente marcado nas biópsias foi o
epitélio glandular em 83,3% dos casos.
Na categoria III, células do epitélio luminal, endoteliais, do infiltrado
inflamatório e estromais foram as que apresentaram maior intensidade de
marcação, sendo esta significativamente maior do que a apresentada pelo
epitélio glandular e pela parede vascular. A estrutura mais freqüentemente
marcada nas biópsias foi o epitélio glandular em 75,5% das biópsias.
A mediana dos escores acumulativos para a categoria I foi 6, a mesma
observada para as endometrites da categoria III. Na categoria IIB, a mediana
desses escores foi 5. Não houve diferença significativa entre as categorias.
57
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação de Kenney & Doig (1986) revelou que não houve
diferença significativa em nenhum dos elementos para MMP-9.
Os resultados do estudo estatístico para a variável MMP-9 na
classificação de KENNEY & DOIG (1986) estão demonstrados nas tabelas 11 e
12.
TABELA 10. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de MMP-9 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com KENNEY & DOIG (1986).
ESTRUTURA CATEGORIA I CATEGORIA IIB
CATEGORIA III
epitélio luminal 3aA
1
3aA 3aA
epitélio glandular 2aA 2aA 2bA
célula endotelial 3aA 3aA 3aA
parede vascular 2aA 1aA 2bA
célula inflamatória 3aA 3aA 3aA
célula estromal 3aA 2aA 3aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
TABELA 11. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a enzima
MMP-9.
CATEGORIA MEDIANA
I 6,0a
1
IIB 5,0a
III 6,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
58
As endometrites crônicas infiltrativas da classificação de Ricketts &
Alonso (1991) mostrou reação imunoistoquímica para MMP-9
significativamente menos intensa na parede vascular. A estrutura mais
freqüentemente marcada foi o epitélio glandular (78%).
As endometroses apresentaram reação mais intensa no epitélio
luminal, nas células endoteliais e estromais, mas não houve diferença
significativa entre os diferentes elementos do endométrio. A estrutura mais
freqüentemente marcada foi o epitélio glandular (76,5%).
As medianas dos escores acumulativos para MMP-9 nos endométrios
hígidos e endometrites crônicas infiltrativas foram maiores (6), entretanto, sem
diferença significativa com a endometrose.
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação de Ricketts & Alonso (1991), revelou que não houve
diferença significativa em nenhum dos elementos para MMP-9.
Os resultados do estudo estatístico para a variável MMP-9 na
classificação de RICKETTS & ALONSO (1991) estão demonstrados nas
Tabelas 13 e 14.
TABELA 12. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de MMP-9 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com RICKETTS & ALONSO (1991).
ESTRUTURA ENDOMÉTRIO
HÍGIDO
ENDOMETRITE
CRÔNICA
INFILTRATIVA
ENDOMETROSE
epitélio luminal 3aA
1
3aA 3aA
epitélio glandular 2aA 2abA 2aA
célula endotelial 3aA 3aA 3aA
parede vascular 2aA 1,5bA 2aA
célula inflamatória 3aA 3aA 2aA
célula estromal 3aA 3aA 3aA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
59
TABELA 13. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a
variável MMP-9.
CATEGORIA MEDIANA
Endométrio hígido 6,0a
1
Endometrite crônica infiltrativa 6,0a
Endometrose 5,0a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
4.3.3. TIMP-1
A expressão de TIMP-1 foi constatada em todas as amostras de
endométrio eqüino, sendo que em 97,6% houve intensidade acentuada.
Foi observada marcação imunoistoquímica difusa por todo o
endométrio. Todos os elementos considerados neste estudo apresentaram
imuno-reatividade (Figuras 34 a 38). As células endoteliais apresentaram
intensa imunomarcação, sobretudo no estrato compacto. A parede vascular foi
positiva, em expressão menos intensa, nos vasos de maior calibre. A
expressão também pôde ser verificada no plasma. Células estromais
apresentaram marcação variável, sendo marcante no estrato compacto; a
reatividade dessas células nas glândulas fibróticas e na fibrose perivascular
pôde ser notada.
Nos endométrios saudáveis as células endoteliais e estromais
mostraram intensidade de marcação significativamente maior do que o epitélio
luminal, o epitélio glandular, a parede vascular e as células inflamatórias. O
segmento que demonstrou menor intensidade de marcação foi a região da
parede vascular. As estruturas mais freqüentemente marcadas nas biópsias
foram as células endoteliais (93,3%), seguidas pelas células inflamatórias
(33,3%).
Na categoria IIB de Kenney & Doig (1986), os maiores valores de
expressão do TIMP-1 foram verificados no epitélio luminal, nas células
endoteliais e estromais, havendo diferença significativa da expressão
observada nestas células quando comparadas com a expressão da parede
60
vascular. Os componentes mais freqüentemente marcados nas biópsias foram
as células endoteliais (88,9%) e leucócitos (55,5%).
Na categoria III, o epitélio luminal, as células endoteliais, as células
inflamatórias e as estromais foram as que apresentaram maior intensidade de
marcação. As estruturas mais freqüentemente marcadas corresponderam
àquelas cuja marcação foi mais intensa.
As medianas dos escores acumulativos para TIMP-1 nas categorias IIB
e III foram maiores (5), entretanto, sem diferença significativa com a categoria I.
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação de Kenney & Doig (1986), revelou que não houve
diferença significativa em nenhum dos elementos para TIMP-1.
Os resultados do estudo estatístico para a variável TIMP-1 na
classificação de KENNEY & DOIG (1986) estão demonstrados nas Tabelas 15
e 16.
TABELA 14. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de TIMP-1 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com KENNEY & DOIG (1986).
ESTRUTURA CATEGORIA I CATEGORIA IIB
CATEGORIA III
epitélio luminal 2aA
1
3bA 3bA
epitélio glandular 2aA 2abA 2aA
célula endotelial 3bA 3bA 3bA
parede vascular 1aA 0,5aA 1aA
célula inflamatória 2aA 2abA 3bA
célula estromal 3bA 3bA 3bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
61
TABELA 15. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com KENNEY & DOIG (1986) para a variável
TIMP-1.
CATEGORIA MEDIANA
I 4a
1
IIB 5a
III 5a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
Nas endometrites crônicas infiltrativas de Ricketts & Alonso (1991) o
epitélio luminal, as células endoteliais, inflamatórias e estromais mostraram
maior intensidade de marcação. As estruturas mais freqüentemente marcadas
foram as células endoteliais (94%), leucócitos (40%) e epitélio glandular (26%).
Nas endometroses, o epitélio luminal, as células endoteliais e as
estromais apresentaram maior intensidade para TIMP-1. As estruturas mais
freqüentemente marcadas foram endotélio em 82,3% dos casos e leucócitos
(41,2%).
As medianas dos escores acumulativos para TIMP-1 nas endometrites
crônicas infiltrativas e endometroses foram maiores (5), entretanto, sem
diferença significativa com os endométrios hígidos.
A avaliação da intensidade da marcação imunoistoquímica entre as
categorias da classificação de Ricketts & Alonso (1991), revelou que não houve
diferença significativa em nenhum dos elementos para TIMP-1.
Os resultados do estudo estatístico para a variável TIMP-1 na
classificação de RICKETTS & ALONSO (1991) estão demonstrados nas
Tabelas 17 e 18.
62
TABELA 16. Valores medianos da intensidade da marcação imunoistoquímica
de TIMP-1 nas diferentes estruturas do endométrio de biópsias classificadas de
acordo com RICKETTS & ALONSO (1991).
ESTRUTURA ENDOMÉTRIO
HÍGIDO
ENDOMETRITE
CRÔNICA
INFILTRATIVA
ENDOMETROSE
epitélio luminal 2aA
1
3bA 3bA
epitélio glandular 2aA 2aA 2abA
célula endotelial 3bA 3bA 3bA
parede vascular 1aA 1aA 0aA
célula inflamatória 2aA 3bA 2abA
célula estromal 3bA 3bA 3bA
1
Medianas seguidas pela mesma letra minúscula na coluna e maiúscula na
linha não diferem significativamente, a 5% de probabilidade, pelo teste de
Kruskal-Wallis.
TABELA 17. Medianas dos escores acumulativos atribuídos às biópsias
uterinas classificadas de acordo com RICKETTS & ALONSO (1991) para a
variável TIMP-1.
CATEGORIA MEDIANA
Endométrio hígido 4a
1
Endometrite crônica infiltrativa 5a
Endometrose 5a
1
Não significativo a 5% de probabilidade pelo teste de Kruskal-Wallis.
63
FIGURA 29.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-9.
Endométrio categoria III – endometrose. Marcação positiva no epitélio
luminal e glandular, células estromais (seta) e endotélio (*). Barra: 50 µm.
*
FIGURA 30.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-9.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva intensa em células estromais ao redor da glândula dilatada (seta).
Barra: 50 µm.
64
FIGURA 31.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-9.
Endométrio categoria I. Marcação positiva nas células do infiltrado
inflamatório no estrato esponjoso (seta). Barra: 50 µm.
FIGURA 32.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-9.
Endométrio categoria I. Marcação positiva nas células endoteliais. Barra:
50 µm.
65
FIGURA 33.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para MMP-9.
Endométrio categoria I. Marcação positiva no endotélio e parede vascular
do estrato esponjoso. Barra: 50 µm.
FIGURA 34.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1.
Endométrio categoria III – endometrose. Marcação intensa no epitélio
luminal e nas células estromais do estrato compacto (seta), e fraca ou
moderada no epitélio glandular. Barra: 50 µm.
66
FIGURA 35.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva nas células epiteliais de ninhos glandulares no estrato compacto.
Presença de hemossiderófagos (seta). Barra: 50 µm.
FIGURA 3
6.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva em células do infiltrado inflamatório ao redor de ninhos
glandulares (seta). Barra: 50 µm.
67
FIGURA 37.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1.
Endométrio categoria III – endometrite crônica infiltrativa. Marcação
positiva em células endoteliais do estrato compacto (seta). Barra: 50 µm.
FIGURA 38.
Endométrio eqüino. Marcação imunoistoquímica para TIMP-1.
Endométrio categoria III – endometrose. Marcação positiva na parede
vascular. Barra: 50 µm.
68
5. DISCUSSÃO
5.1. AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
5.1.1. CLASSIFICAÇÃO DAS ENDOMETRITES
CRÔNICAS
Para este estudo, foram selecionados os casos que apresentavam
lesões endometriais mais severas. Este procedimento objetivou a correlação
entre a presença das diferentes metaloproteinases e um dos seus inibidores
específicos com o processo fibrótico já estabelecido. Assim, também foram
utilizados como controle endométrios hígidos segundo os critérios das duas
classificações utilizadas (KENNEY & DOIG, 1986; RICKETTS & ALONSO,
1991).
Utilizando-se a classificação de Kenney & Doig (1986), a maior parte
das biópsias (59,8%) pertenceram a categoria III, na qual são incluídas as
lesões mais graves. Como o material utilizado neste trabalho foi proveniente de
arquivo, é natural que predominem amostras de animais que apresentem
problemas reprodutivos persistentes, que se devem a lesões crônicas
endometriais.
Mesmo nos casos classificados como categoria I, alterações fibróticas
como fibrose perivascular e intersticial foram notadas em um número
expressivo de amostras (33,3%), sendo a fibrose perivascular, observada em
20% dessas biópsias, uma das alterações mais observadas nas endometrites
crônicas. Esses critérios não são considerados na classificação de Kenney &
Doig (1986). Este tipo de comprometimento vascular precisa ser estudado de
forma mais aprofundada, para que possa ser esclarecida a sua real
participação nos problemas reprodutivos das éguas, já que a sua freqüência é
relativamente alta, mesmo nos animais considerados normais (NUNES, 2003).
As biópsias incluídas na categoria III de Kenney & Doig (1986)
apresentaram fibrose periglandular bastante intensa, com deposição acentuada
de colágeno e freqüentes ninhos fibróticos. No entanto, conforme observado
por Nunes (2003), houve casos em que a fibrose esteve presente de maneira
69
inconspícua, acompanhada de infiltrado inflamatório proeminente. Isto sugere
que processos diferentes estão incluídos na mesma categoria quando se utiliza
este tipo de classificação.
Para a melhor avaliação dos diferentes processos endometriais, a
tipificação do colágeno e a verificação da expressão das enzimas
colagenolíticas estudadas, também foram empregadas as definições de
Ricketts & Alonso (1991), baseadas na classificação de Ricketts datada em
1975 apud Ricketts & Alonso (1991), que define a enfermidade endometrial
segundo sua origem inflamatória ou degenerativa. No entanto, como foram
selecionados os casos mais severos de endometrite crônica, fibrose
periglandular importante foi observada numa grande porcentagem das biópsias
mesmo quando classificadas como endometrite infiltrativa.
Na classificação de Ricketts & Alonso (1991) houve predomínio das
endometrites crônicas infiltrativas em relação às endometroses. Dessa forma,
segundo nossos dados, estas lesões endometriais mais graves parecem ter
como causa primária principalmente os processos de origem inflamatória, e
aqueles de origem degenerativa seriam responsáveis pela enfermidade
endometrial menos freqüentemente. Assim, neste trabalho também puderam
ser identificados dois processos distintos morfologicamente e que
provavelmente possuem causas diferentes, conforme proposto por Nunes
(2003).
5.1.2. AVALIAÇÃO HISTOQUÍMICA DO COLÁGENO
A utilização dos métodos histoquímicos para identificação de colágeno,
como Tricrômico de Masson, Reticulina e Picrosirius-Polarização, permitiu a
identificação dos focos de fibrose, bem como sua distribuição e quantificação,
além da identificação dos tipos de colágeno presentes na fibrose.
No processo fibrótico, há a substituição dos depósitos de ácido
hialurônico e fibronectina, que ocorrem desde o início do processo inflamatório,
por colágeno tipo I e III principalmente. Outros tipos de colágeno também são
encontrados nesses processos, porém em menor quantidade. É a deposição
desses dois tipos de colágeno estruturalmente rígidos que gradualmente
70
promovem o desenvolvimento do tecido cicatricial com maior força tensora
(BOCHSLER & SLAUSON, 2002).
Nas endometrites severas, foi observada neste trabalho a substituição
do colágeno do tipo III pelo colágeno do tipo I, fenômeno também descrito por
Nunes (2003), Evans et al. (1998) e Caldini (1992). Caldini (1992) notou
correlação entre a quantidade de fibras com birrefringência amarelada e
avermelhada, observada na técnica do Picrosisirius-Polarização, e as fibras
não argirófilas, correspondentes ao colágeno I, visualizadas quando coradas
pela técnica da Reticulina. A mesma correlação foi observada no presente
estudo. Além disso, Caldini (1992) notou que essas fibras, por observação
ultra-estrutural, demonstraram ser compatíveis com o colágeno I após estudo
morfométrico.
Contudo, Walter et al. (2000) obtiveram resultados diferentes ao
realizarem estudo imunoistoquímico dos colágenos I, III e IV, pois observaram
que o colágeno do tipo I não está aumentado na fibrose endometrial severa das
éguas, e a sua proporção é semelhante à dos endométrios incluídos na
categoria I de Kenney & Doig (1986), mas houve o aumento do colágeno do
tipo IV, que em situação fisiológica encontra-se limitado à membrana basal.
Esses pesquisadores descreveram a presença do colágeno IV nos fibroblastos
que circundam as glândulas fibróticas.
O colágeno do tipo III forma uma delicada rede de fibras, constituindo
o estroma de vários órgãos, e é parte integrante da membrana basal,
juntamente com o colágeno do tipo IV e do tipo V. Sua afinidade pela prata
deve-se à maior quantidade de carboidratos, que revestem suas fibras
(BANKS, 1991).
Com esses resultados divergentes, entende-se que tanto a técnica do
Picrosirius Red-Polarização quanto a da Reticulina não diferenciam os
colágenos do tipo I e do tipo III do colágeno do tipo IV, mas é possível
reconhecer o colágeno mais denso, resultado de interações químicas entre as
fibras de colágeno, e que é refratário ou, no mínimo, menos responsivo à ação
das enzimas colagenolíticas, porque os sítios de ligação dessas enzimas com o
colágeno são bloqueados (ANDRADE et al., 1999). Talvez, nas amostras de
endométrios saudáveis do nosso estudo, a não distinção dos colágenos do tipo
III e do tipo IV na membrana basal, observada por Walter et al. (2000) por
71
método imunoistoquímico, deva-se ao fato do colágeno do tipo IV também ser
rico em açúcares, que compõem 10% da sua estrutura (BANKS, 1991), o que
não permitiria a sua diferenciação por método histoquímico de impregnação
argêntica.
Por fim, os métodos histoquímicos empregados neste trabalho
demonstraram no mesmo corte histológico o colágeno mais denso e o mais
delicado, possibilitando a obtenção da proporção relativa desses colágenos.
Além disso, tais métodos são de fácil execução e têm menor custo, podendo
ser empregados rotineiramente, como tem sido verificado por diversos autores
(CALDINI, 1992; EVANS et al., 1998; NUNES, 2003).
Mais estudos nesse sentido são necessários para que se encontrem
dados consistentes que levem a determinção do tipo de colágeno presente na
fibrose uterina das éguas, principalmente aqueles em que associem métodos
histoquímicos e imunoistoquímicos.
5.2. MORFOMETRIA DO COLÁGENO
PERIGLANDULAR
Os resultados da análise morfométrica da fibrose periglandular
corroboraram os achados de Nunes (2003), e foram parcialmente semelhantes
aos descritos por Evans et al. (1998). Nos endométrios considerados hígidos, a
fibrose periglandular foi ausente ou inconspícua. Já nas endometrites severas
(graus IIB e III de Kenney & Doig, 1986) houve aumento significativo do
colágeno periglandular, sendo predominante o do tipo I.
A porcentagem da fibrose periglandular nas endometrites crônicas
severas, quando classificadas de acordo com Kenney & Doig (1986), não
revelou diferença significativa entre as categorias IIB e III neste trabalho. O
mesmo achado foi relatado por Nunes (2003). Entretanto, Evans et al. (1998),
encontraram resultados diferentes. Estes autores relatam que há aumento
significativo da quantidade de fibrose entre as categorias IIB e III.
Quando classificadas de acordo com Ricketts & Alonso (1991), não
houve diferença significativa na deposição de colágeno periglandular entre as
endometrites infiltrativas severas e as endometroses. Talvez, isso possa ser
72
explicado pela maior deposição de colágeno intersticial nas endometroses, o
que levou à rarefação das glândulas endometriais.
5.3. AVALIAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA
As metaloproteinases são as principais enzimas envolvidas no
remodelamento tecidual fisiológico e patológico (STERNLICHT & WERB, 1999;
ARTHUR, 2000).
Zhang & Salamonsen (2002) relataram que a MMP-2 se expressa
amplamente pelo endométrio, sendo detectada na maior parte das células do
endométrio, sejam elas epiteliais, estromais ou vasculares, mas não são
expressas nos leucócitos. Goffin et al. (2003) constataram que nas mulheres,
esta enzima é expressa durante todo o ciclo menstrual, auxiliando na
manutenção do endométrio.
O presente estudo revelou que, assim como acontece no endométrio
humano, as células estromais e epiteliais, além da parede vascular também
expressaram MMP-2. Houve predominância da marcação nas células
estromais e parede vascular tanto no endométrio normal quanto nas
endometrities crônicas severas. Achado semelhante foi relatado por Freitas et
al. (1999) no endométrio de mulheres. Estes autores sugeriram o envolvimento
da MMP-2 no remodelamento vascular durante o ciclo menstrual.
A análise entre as categorias das biópsias classificadas de acordo com
Kenney & Doig (1986) indica que a intensidade da imunomarcação para a
enzima MMP-2 tende a aumentar no epitélio glandular conforme aumenta a
gravidade da lesão endometrial e, por conseguinte, a deposição de colágeno.
Esse fenômeno talvez contribua para a modificação da secreção glandular no
endométrio das éguas, que já foi constatada a partir do uso da técnica de
lectinaistoquímica (WALTER et al., 2001b).
Fenômeno inverso foi observado na parede vascular, quando
consideradas as duas classificações. Nesta região, a intensidade da
imunomarcação para a enzima MMP-2 diminui conforme aumenta a lesão
endometrial e conseqüentemente a deposição de colágeno.
A MMP-2 tem papel preponderante na angiogênese, componente
indispensável do mecanismo de reparação tecidual por tecido conjuntivo. A
73
marcação intensa da MMP-2 na região da parede vascular, onde encontram-se
os pericitos, e ausência da expressão no endotélio, pode sugerir que, nas
éguas, a degradação do colágeno vascular pela MMP-2 é primariamente
induzida na região perivascular. Isso pode estar associado à presença de
mediadores químicos liberados por células perivasculares, fonte de
interleucinas, e outros mediadores químicos. Investigações a respeito da inter-
relação entre citocinas e outros fatores pró-flamatórios com metaloproteinases
(KIM et al., 2004) são necessárias para que se entenda melhor o papel das
MMP na região da parede vascular do endométrio eqüino.
Considerando-se a classificação de Ricketts & Alonso (1991), observa-
se que nas endometrites crônicas infiltrativas, as células estromais e a parede
vascular mostraram maior intensidade de reação imunoistoquímica, embora
não tenha ocorrido diferença significativa em relação à parede vascular e ao
epitélio glandular. Nas endometroses, a maior intensidade de reação ocorreu
nas células estromais. Nota-se ainda que o epitélo glandular mostrou maior
reatividade nas endometrites crônicas infiltrativas e intensidade menor nas
endometroses. A maior intensidade da reação nessas células nas endometrites
crônicas infiltrativas pode estar relacionada ao processo inflamatório ativo, já
que nas endometroses este aumento não foi detectado. Walter et al. (2005)
estudando as endometroses, encontraram imunoreatividade para MMP-2, nos
mesmos sítios, e verificaram que nas regiões do endométrio em que ocorria a
infiltração leucocitária a expressão da enzima era mais acentuada.
A marcação imunoistoquímica para MMP-2 nas células estromais
manteve-se estável, quando comparadas as endometrites graves com o
endométrio hígido, nas duas classificações empregadas.
A expressão da MMP-2 em células estromais ao redor das glândulas
fibróticas, também observada por Walter et al. (2005), pode estar associada à
presença de miofibroblastos. Estas células são observadas em grande
quantidade nas glândulas fibróticas (WALTER et al., 2001). Arthur (2000)
relatou que, no fígado fibrótico, os miofibrobastos na presença de colágeno do
tipo I são induzidos à ativação da pro-MMP-2.
Foi relatado que no início da gestação a MMP-2 é expressa em
maiores quantidades em pequenos vasos do que a MMP-9, e que essa forte
74
marcação do endotélio pode ter papel importante na degradação da matriz
extracelular e na angiogênese (SEVAL et al., 2004).
A MMP-9 também está envolvida na degradação da matriz extracelular
e na angiogênese, porém com funções ainda não bem estabelecidas (FODA &
ZUCKER, 2001).
A marcação de MMP-9 neste trabalho foi intensa no epitélio luminal,
nas células endoteliais e leucócitos, mas outras estruturas também mostraram-
se positivas para essa metaloproteinase, como o epitélio glandular, parede
vascular e células estromais.
A parede vascular mostrou menor intensidade de reação para MMP-9
nas endometrites crônicas infiltrativas. Por sua vez, as células inflamatórias
apresentaram intensidade de reação maior nas amostras de endométrio hígido
e de endometrite crônica infiltrativa, do que nas endometroses, embora não
tenha havido significância estatística. Esses achados sugerem que os
processos endometriais degenerativos são mais graves por haver a tendência
na diminuição das enzimas colagenolíticas e, conseqüentemente, maior
deposição de colágeno. Deve-se destacar que a MMP-9 é produzida
principalmente por leucócitos, entre eles linfócitos e macrófagos, que a
secretam após estímulos pró-inflamatórios (JAMES et al., 2005). Estes
elementos estão ausentes ou em quantidades discretas nos processos
degenerativos do endométrio.
Kaitu’u et al. (2005) estudando o útero de camundongas em modelo
que simula o ciclo menstrual da mulher, observaram a expressão da MMP-9
em células inflamatórias localizadas na porção basal da região decídua,
estando a redução do número de células positivas relacionada à evolução da
reparação tecidual. Isso permitiu atribuir o envolvimento da MMP-9 na
destruição da matriz extracelular que envolve o tecido decíduo. Deve-se
ressaltar que no presente trabalho constatou-se maior intensidade de
marcação em áreas de erosão que comprometiam o endométrio. Freitas et al.
(1999) relataram que no endométrio humano a secreção de MMP-9 nos
macrófagos pode ser aumentada por citocinas pró-inflamatórias. Neste
trabalho, a imunomarcação para MMP-9 nas éguas mostrou-se mais difusa e
de intensidade moderada ou acentuada tanto no endométrio hígido como nas
75
endometrites crônicas. Dessa forma, não foi possível determinar uma função
específica para a MMP-9 no endométrio eqüino.
A expressão de MMP-9 por células epiteliais e leucócitos observada no
endométrio eqüino neste estudo, já foi identificada em outras espécies. A
positividade para MMP-9 no epitélio glandular na fase secretória do ciclo
menstrual em mulheres já foi descrita por Freitas et al., 1999. Nesta mesma
fase, estes autores detectaram forte marcação para MMP-9 em células
arredondadas ou alongadas distribuídas pelo estroma. As primeiras
encontravam-se freqüentemente agrupadas e próximas ao epitélio glandular,
sendo a maioria delas positivas para CD68, marcador específico de
macrófagos.
O tipo de placentação epiteliocorial na égua é o menos invasivo de
todas as formas de placentação. No entanto, há uma diferenciação de células
trofoblásticas do concepto, que dão origem a uma população celular muito
invasiva, que formam a cinta coriônica. Essas células começam a se aderir e
invadir o epitélio uterino migrando posteriormente para o estroma endometrial,
onde formam nódulos distintos de tecido altamente diferenciado, chamados
cálices endometriais. Esse processo de invasão destrói o epitélio endometrial
(LUNN et al., 1997), e é dependente de metaloproteinases (VAGNONI et al.,
1995). A presença da MMP-9 no endométrio eqüino durante o diestro pode
estar relacionada com o processo de aderência e migração do concepto no
endométrio após a fertilização.
Os TIMPs são inibidores específicos das metaloproteinases, podendo
ser encontrados em vários tipos celulares. Durante a inflamação e
remodelamento do colágeno nas vias respiratórias, é produzido de forma
ubiqüitária pelo tecido conjuntivo e macrófagos, e com freqüência, é expresso
simultaneamente à MMP-9 (CHANG et al., 2002; SWEET et al., 2002; WEI et
al., 2003).
Da mesma forma, relatos anteriores descreveram a presença do TIMP-
1 em todos os compartimentos celulares do endométrio da mulher, durante
todo o ciclo menstrual (FREITAS et al.,1999), com pequena variação na
expressão da enzima entre as fases hormonais, mas que não são significativas
(GOFFIN et al., 2003; SEVAL et al., 2004).
76
Os resultados do presente estudo revelaram que, assim como nas
situações supracitadas, houve marcação difusa no endométrio das éguas,
fenômeno semelhante ao da enzima MMP-9. As endometrites severas
mostraram escores acumulativos maiores do que os endométrios saudáveis,
entretanto, sem significância.
De maneira geral, não houve diferença na intensidade da expressão
do TIMP-1 entre os grupos estudados nas duas classificações utilizadas.
As células endoteliais mostraram intensidade de marcação acentuada
para TIMP-1 em todos os grupos analisados, achado semelhante ao de Freitas
et al. (1999). Tais pesquisadores associaram essa característica a um efeito
vasoprotetor.
A avaliação dos escores acumulativos da expressão de MMP-2, MMP-
9 e TIMP-1 não revelou diferença significativa entre as categorias, em cada
classificação utilizada. Porém, pôde-se observar pelos resultados obtidos que
os escores mais altos foram aqueles relacionados à MMP-9 e TIMP-1, o que
demonstra a distribuição difusa no endométrio hígido e fibrótico.
Nota-se pelo que foi apresentado que os processos crônicos
endometriais, sejam eles inflamatórios ou fibróticos, mostram grande
complexidade. A metodologia aqui empregada teve por objetivo avaliar estes
fenômenos utilizando diferentes métodos de análise morfológica que se
complementassem.
Os resultados indicam as características das lesões fibróticas no que
diz respeito a sua composição e distribuição, além da expressão de enzimas
importantes no remodelamento do colágeno. Diferentes técnicas para avaliação
dos tipos de colágeno envolvidos na fibrose endometrial das éguas ainda
devem ser exploradas para que se conheça com maior precisão a composição
desse fenômeno e suas interações bioquímicas, uma vez que este ainda não é
bem compreendido, para que no futuro novas terapias com o objetivo de se
inibir a deposição excessiva de colágeno sejam desenvolvidas.
O mesmo ocorre quando se busca conhecer as enzimas envolvidas no
processo colagenolítico, como as metaloproteinases. Com a mesma finalidade,
também é interessante estabelecer a correlação dessas enzimas com agentes
pró-inflamatórios.
77
A técnica imunoistoquímica foi adequada para a determinação dos
locais da expressão das enzimas estudadas, permitindo que se reconheça qual
o tipo de célula envolvido diretamente no processo colagenolítico nas
endometrites crônicas.
A detecção da interação entre estes diversos elementos abre novas
perspectivas para a compreensão do processo e, conseqüentemente, para a
possibilidade de sua interrupção ou regressão.
78
6. CONCLUSÕES
Os resultados desta pesquisa permitiram concluir que:
• Fibrose perivascular e intersticial é encontrada em grande parte dos
endométrios considerados hígidos;
• Nas endometrites crônicas severas a fibrose periglandular, bem como a
perivascular, é intensa, composta predominantemente por colágeno do
tipo I;
• Não há diferença na porcentagem da fibrose periglandular entre as
endometroses e as endometrites crônicas infiltrativas severas;
• Endométrios hígidos e portadores de endometrite crônica expressam
MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, sem diferenças importantes entre os graus de
severidade;
• MMP-2 é expressa pelas células do epitélio luminal e glandular,
estromais e na região da parede vascular, mas não nas células
endoteliais e do infiltrado inflamatório;
• MMP-9 e TIMP-1 são expressos pelas células do epitélio luminal e
glandular, estromais, endoteliais e do infiltrado inflamatório;
• A MMP-9 e o TIMP-1 estão expressos de forma mais difusa do que a
MMP-2.
79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
AMARAL, D. Estudo morfológico e histoquímico do endométrio de éguas PSI.
Belo Horizonte, 2002. 65p. Tese (Doutorado) – Escola de Veterinária,
Universidade Federal de Minas Gerais.
ANDRADE, G.B., MONTES, G.S., CONCEIÇÃO, G.M.S., SALDIVA, P.H.N.
Use of the Picrosirius-polarization method to age fibrotic lesions in the
hepatic granulomas produced in experimental murine schistosomiasis. Ann.
Trop. Med. Parasitol., v.93, p.265-72, 1999.
ARTHUR, M.J.P. MMPs and TIMPs in liver fibrosis. Am. J. Physiol.
Gastrointest. Liver Physiol., v.279, G245-G249, 2000.
BANKS, W.J. Matriz extracelular. In: ______. Histologia Veterinária Aplicada. 2
ed., São Paulo: Manole, 1991. p.87-105.
BOCHSLER, P.N., SLAUSON, D.O. Inflammation and repair of tissue. In:
SLAUSON, D.O., COOPER, B.J. Mechanisms of disease: a textbook of
comparative general pathology. 3 ed,. St. Louis: Mosby, 2002. p.140-245.
BREW, K., DINAKARPANDIAN, D., NAGASE, H. Tissue inhibitors of
metalloproteinases: evolution, structure and function. Biochim. Biophys.
Acta, v.1477, p.267-83, 2000.
BRUNER, K.L., RODGERS, W.H., GOLD, L.I., KORC, M., HARGROVE, J.T.,
MATRISIAN, L.M., OSTEEN, K.G. Transforming growth factor β mediates
the progesterone suppression of an epithelial metalloproteinase by adjacent
stroma in the human endometrium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., v.92,
p.7362-6, 1995.
1
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA. Coordenadoria Geral de Bibliotecas. Normas para
publicações da UNESP. São Paulo: Editora UNESP, 1994. v.2: Referências Bibliográficas.
NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE. List of journals indexed in Index Medicus. Washington,
1997. 240p.
80
CALDINI, E.T.E.G. Estudo histoquímico e ultra-estrutural do colágeno na
fibrose periglandular do endométrio eqüino. São Paulo, 1992. 123p. Tese
(Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade
de São Paulo.
CHANG, Y.-C., YANG, S.-F., TAI, W.-W, CHOU, M.-Y., HSIEH, Y.-S. Increased
tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression and inhibitor of gelatinase
A activity in buccal mucosal fibroblasts by arecoline as possible mechanisms
for oral submucous fibrosis. Oral Oncol., v.38, p.195-200, 2002.
CLEGG, P.D., COUGHLAN, A.R., RIGGS, C.M., CARTER, S.D. Matrix
metalloproteinases 2 and 9 in equine synovial fluids. Equine Vet. J., v.29,
n.5, p.343-8, 1997.
CONCHA-BERMEJILLO, A., KENNEDY, P.C. Prognostic value of endometrial
biopsy in the mare: a retrospective analysis. JAVMA, v.181, n.7, p.680-1,
1982.
DOIG, P.A., MCKNIGHT, J.D., MILLER, R.B. The use of endometrial biopsy in
the infertile mare. Can. Vet. J., v.22, p.72-6, 1981.
EVANS, T.J., MILLER, M.A., GANJAM, V.K., NISWENDER, K.D.,
ELLERSIECK, M.R., FRAUSE, W.J., YOUNGQUIST, R.S. Morfometric
analysis of endometrial periglandular fibrosis in mares. AJVR, v.59, n.10,
p.1209-14, 1998.
FODA, H., ZUCKER, S. Matrix metalloproteinases in cancer invasion,
metastasis and angiogenesis. DDT, v.6, n.9, p.478-82, 2001.
FREITAS, S., MEDURI, G., NESTOUR, E. L., BAUSERO, P., PERROT-
APPLANAT, M. Expression of metalloproteinases and their inhibitors in
blood vessels in human endometrium. Biol. Reprod., v.61, p.1070-82, 1999.
GARLAND, S.M., CHUILEANNÁIN, F.N., SATZKE, C., ROBINS-BROWNE, R.
Mechanisms, organisms and markers of infection in pregnancy. J. Reprod.
Immunol., v.57, p.169-83, 2002.
81
GIANNELLI, G., QUARANTA, V., ANTONACI, S. Tissue remodelling in liver
diseases. Hist. Histopath., v.18, p.1267-74, 2003.
GOFFIN, F., MUNAUT, C., FRANKENNE, F., D´HAUTERIVE, S.P., BÉLIARD,
A., FRIDMAN, V., NERVO, P., COLIGE, A., FOIDART, J.-M. Expression
pattern of metalloproteinases and TIMPs in cycling human endometrium.
Biol. Reprod., v.69, p.976-84, 2003.
GONZÁLEZ, A.A., SEGURA, A.M., HORIBA, K., QIAN, S., YU, Z.-X.,
STETLER-STEVENSON, W., WILLERSON, J.T., McALLISTER JR, H.A.,
FERRANS, V.J. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in the
lesions of cardiac and pulmonary sarcoidosis: an immunohistochemical
study. Human Pathol., v.33, p.1158-64, 2002.
GRAY, C. A., BARTOL, F.F., TARLETON, B.J., WILEY, A.A., JOHNSON, G.A.,
BAZER, F.W., SPENCER, T.E. Developmental biology of uterine glands.
Biol. Reprod., v.65, p.1311-23, 2001.
GRÜNINGER, B., SCHOON, H.-A., SCHOON, D., MENGER, S., KLUG, E.
Incidence and morphology of endometrial angiopathies in mares in
relationship to age and parity. J. Comp. Pathol., v.119, p.293-309, 1998.
HAFFNER, J.C., FECTEAU, K.A., EILER, H. Inhibition of collagenase
breakdown of equine corneas by tetanus antitoxin, equine serum and
acetylcysteine. Veterinary Ophtalmology, v. 6, n.1, p.67-72, 2003.
HOLLANDER, A.P. Matrix metalloproteinases as targets for therapy in equine
joint diseases. Equine Vet. J., v.29, n.5, p.329-30, 1997.
INOUE, Y., ITO, K., TERADA, T., NISHIMURA, N., HATAZOE, T., SATO, K.
Degenerative changes in the endometrial vasculature of the mare detected
by videoendoscopic examination. AAEP Proceedings, v.46, p.325-9, 2000.
JAMES, B.P., SICHENG, W., QIANG, P.-H., MARIANNE, Q.J. Secretion of
matrix metalloproteinase-9 by macrophages, in vitro, in response to
Helicobacter pylori. Fems Immunol. Med. Microbiol., v.45, n.2, p.159-69,
2005.
82
JUNQUEIRA, L.C.U., COSSERMELLI, W., BRENTANI, R.R. Diferencial
staining of collagens typé I, II and III by Sirius Red and polarization
microscopy. Arch. Histol. Jpn., v.41, p.267-74, 1978.
KAITU’U, T.J., SHEN, J., ZHANG, J., MORISON, N.B., SALAMONSEN, L.A.
Matrix metalloproteinases in endometrial breakdown and repair: functional
significance in a mouse model. Biol. Reprod., v.73, p.672-80, 2005.
KATILA, T. Uterine defence mechanisms in the mare. Anim. Reprod. Sci., v.42,
p.197-204, 1996.
KENNEY, R.M. Cyclic and pathologic changes of the mare endometrium as
detected by biopsy, with a note on early embryonic death. JAVMA, v.172,
n.3, p.241-62, 1978.
KENNEY, R.M., DOIG, P.A. Equine endometrial biopsy. In: MORROW, D.A.
(ed.). Current therapy in theriogenology. Philadelphia: WB Saunders, 1986.
p.723-9.
KIM, H.-S., SHANG, T., CHEN, Z., PFLUGFELDER, S.C., LI, D.-Q. TGF-1
stimulates production of gelatinase (MMP-9), collagenases (MMP-1, -13)
and stromelysins (MMP-3, -10, -11) by human corneal epithelial cells. Exp.
Eye Res., v. 79, p. 263-74, 2004.
LEE, R.T., LAMMERDING, J. Signaling pathways that influence etracellular
remodeling. Journal of Cardiac Failure, v.8, n.6, suppl, p.S339-43, 2002.
LEMJABBAR, H., GOSSET, P. LECHAPT-ZALCMAN, E., FRANCO-
MONTOYA, M-L., WALLAERT, B., HARF, A., LAFUMA, C. Overexpression
of alveolar macrophage gelatinase B (MMP-9) in patients with idiopathic
pulmonary fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., v.20, p.903-13, 1999.
LENHART, J.A., RYAN, P.L., OHLETH, K.M., PALMER, S.S. Relaxin increases
secretion of tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 and –2 during
uterine and cervical growth and remodeling in the pig. Endocrinology, v.143,
p.91-8, 2002.
83
LUNA, L.G. Manual of Histologic Staining Methods of Armed Forces Institute of
Pathology. Washington: McGraw Hill, 1968. 258p.
LUNN, P., VAGNONI, K.E., GINTHER, O.J. The equine immune response to
endometrial cups. J. Reprod. Immunol., v.34, p.203-16, 1997.
MARTINEZ-HERNANDEZ, A. Repair, regeneration and fibrosis. in: RUBIN, E.,
FABER, J.L. Pathology. 3 ed. Philadelphia: Lippincot-Raven, 1999, 1664p.
MEDICE, E.B., MERKT, H., POLHENS, J.F., BRUNKHORST, D.
Considerations on the use of ancillary diagnostic aids in the diagnosis of
endometritis due to infection in mares. J. Reprod. Fertil., Suppl., v.44, p.700-
3, 1991.
MENON, R, FORTUNATO, S.J. The role of matrix degrading enzymes and
apoptosis in rupture of membranes. Journal of Society for Gynecologic
Investigation, v. 11, p. 427-37, 2004.
MONTES, G.S., JUNQUEIRA, L.C.U. The use of the picrosirius-polarization
method for the study of the biopathology of collagen. Mem. Inst. Oswaldo
Cruz, v.86, p.1-11, 1991.
MOTT. J.D., WERB, Z. Regulation of matrix biology by matrix
metalloproteinases. Curr. Opin. Cell Biol., v.16, p.558-64, 2004.
MURPHY, G., KNÄUPER, V. Relating matrix metalloproteinase structure to
function: why the “hemopexin” domain? Matrix Biol., v.15, p.511-8, 1997.
NAGASE, H., WOESSNER, J.F. Minireview: Matrix Metalloproteinases. J. Biol.
Chem., v.274, n.31. p.2191-4, 1999.
NUNES, L.C. Avaliação histopatológica, histoquímica, imunoistoquímica e
morfométrica das endometrites crônicas em éguas. Botucatu, 2003. 108p.
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estatual Paulista.
NUNES, L.C., PORTO, C.D., SEQUEIRA, J.L., ALVARENGA, M.A.
Classificação histopatológica das endometrites crônicas das éguas: estudo
84
retrospectivo e prospectivo. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.57, supl.1, p.75,
2005.
OSTEEN, K.G., RODGERS, W.H., GAIRE, M., HARGROVE, J.T., GORSTEIN,
F. Stromal-epithelial interaction mediates steroidal regulation of
metalloproteinase expression in human endometrium. Proc. Natl. Acad. ScI.
USA, v.91, p.10129-33, 1994.
PARDO, A., SELMAN, M. MMP-1: the elder of the family. The International
Journal of Biochemistry & Cell Biology, v.37, p.283-8, 2005.
POLETTE, M., NAWROCKI-RABY, B., GILLES, C., CLAVEL, C., BIREMBOUT,
P. Tumor invasion and matrix metalloproteinases. Crit. Rev.
Oncol./Hematol., v.49, p.179-86, 2004.
PORTO, C.D., NUNES, L.C., SEQUEIRA, J.L., OLIVEIRA, D.E., ALVARENGA,
M.A.. Expressão de MMP-2 e MMP-9 no processo fibrótico endometrial das
éguas. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.57, supl.1, p.105-6, 2005.
RICKETTS, S.W., ALONSO, S. The effect of age and parity on the development
of equine chronic endometrial disease. Equine Vet. J., v.23, p.189-92, 1991.
RIGBY, S.L., BARHOUMI, R., BURGHARDTR.C., COLLERAN, P.,
THOMPSON, J.A., VERNER, D.D., BLANCHARD, T.L., BRINSKO, S.P.,
TAYLOR, T., WILKERSON, M.K., DELP, M.D. Mares with delayed uterine
clearance have an intrinsic defect in myometrial function. Biol. Reprod.,
v.65, p.740-7, 2001.
RILEY, S.C., GIBSON, A.H., LEASK, R., MAUCHLINE, D.J.W., PEDERSEN,
H.G., WATSON, E.D. Secretion of matrix metalloproteinases 2 and 9 and
tissue inhibitor of metalloproteinases into follicular fluid during follicle
development in equine ovaries. Reproduction, v.121, p.553-60, 2001.
SEVAL, Y., AKKOYUNLU, G., DEMIR, A., ASAR, M. Distribution patterns of
matrix metalloproteinase (MMP)-2 and –9 and their inhibitors (TIMP-1 and
TIMP-2) in the human decidua during early pregnancy. Acta histochem.,
v.106, p.353-62, 2004.
85
SHOON, H.-A., SCHOON, D. The category I mare (Kenney and Doig 1986):
expected foaling rate 80-90% - fact or fiction? Pferdeheilkunde, v.19, n.6,
p.698-701, 2003.
SILVA, C.A.M., BARROS, S.S., ESQUERRE, R.A. A biópsia endometrial na
avaliação da fertilidade da égua. Pesq. Vet. Bras., v.7, p.131-3, 1987.
STERNLICHT, M.D., WERB, Z. ECM proteinases. In: KREIS, T., VALE, R.
Guidedbok to the extracellular matrix, anchor, and adhesions proteins.
Oxford: Oxford University Press, 1999. p.505-63.
SWEET, D.G., HALLIDAY, H.L., WARNER, J.A. Airway remodelling in chronic
lung disease of prematurity. Paediatric Respiratory Reviews, v.3, p.140-6,
2002.
TRAUB-DARGATZ, J.L., SALMAN, M.D., VOSS, J.L. Medical problems of adult
horses, as ranked by equine practioners. JAVMA, v.198, n.10, p.1745-7,
1991.
TROEDSSON, M.H.T. Uterine clearance and resistance to persistent
endometritis in the mare. Theriogenology, v.52, p.461-71, 1999.
UENO, T., TAMAKI, S., SUGAWARA, H., INUZUKA, S., TORIMURA, T., SATA,
M., TANIKAWA, K. Significance of serum tissue inhibitor of
metalloproteinases-1 in various liver diseases. J. Hepatol., v.24, p.177-84,
1996.
VAGNONI, K.E., GINTHER, O.J., LUNN, D.P. Metalloproteinase activity has a
role in equine chorionic girdle cell invasion. Biol. Reprod., v.53, p.800-5,
1995.
VAILLANT, B., GHIARAMONTE, M.G., CHEEVER, A.W., SOLOWAY, P.D.,
WYNN, T.A. Regulation of hepatic fibrosis and extracellular matrix genes by
the Th response: new insight into the role of Tissue Inhibitors of Matrix
Metalloproteinases. The Journal of Immunology, v.167, p. 7017-26, 2001.
86
VAN CAMP, S.D. Endometrial biopsy of the mare: a review and update.
Reproduction, v.4, n.2, p.229-45, 1988.
WALTER, I., HANDLER, J., MILLER, I., AURICH, C. Matrix metalloproteinase 2
(MMP-2) and tissue transglutaminase (TG 2) are expressed in periglandular
fibrosis in horse mares with endometrosis. Histol. Histopathol., v.20, p.1105-
13, 2005.
WALTER, I., HANDLER, J., REIFINGER, M., AURICH, C. Association of
endometrosis in horses with differentiation of periglandular myofibroblasts
and changes of extracellular matrix proteins. Reproduction, v.121, p.581-6,
2001a.
WALTER, I, HELMREICH, M., HANDLER, J., AURICH, C. Mineralised deposits
in the uterine glands of mares with chronic endometrial degeneration. Vet.
Rec., v.153, n.23, p.708-10, 2003.
WALTER, I., KLEIN, M., HANDLER, J., AURICH, J, REIFINGER, M., AURICH,
C. Lectin binding patterns of uterine glands in mares with chronic
endometrial degeneration. AVJR, v.62, n.6, p.840-5, 2001b.
WEI, S., CHEN, Y., CHUNG, L., NAGASE, H., BREW, K. Protein engineering of
the tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1) inhibitory domain. J. Biol.
Chem., v.278, n.11, p.9831-4, 2003.
YOKOTA, T., DENHAM, W., MURAYAMA, K., PELHAM, C., JOEHL, R., BELL,
R.H. Pancreatic stellate cell activation and MMP production in experimental
pancreatic fibrosis. J. Surg. Res., v.104, p.106-11, 2002.
YOSHIJI, H., KURYAMA, S., YOSHII, J., IKENAKA, Y., NOGUCHI, N.,
NAKATANI, T., TSUJINOUE, H., YANASE, K., NAMISAKI, T., IMAZU, H.,
FUKUI, H. Tissue inhibitor of metalloproteinases-1 attenuates spontaneous
liver fibrosis resolution in the transgenic mouse. Hepatology, v.36, p.850-60,
2001.
87
YOUNGQUIST, R.S. Moléstias do sistema reprodutivo. In: SMITH, B.P. Tratado
de medicina veterinária interna de grandes animais: moléstias de eqüinos,
bovinos, ovinos e caprinos. São Paulo: Manole, 1993. p.1351-1426.
ZHANG, J., SALAMONSEN, L.A. In vivo evidence for active matrix
metalloproteinases in human endometrium supports their role in tissue
breakdown at menstruation. J. Clin. Endocrinol. Metab., v.87, p.2346-51,
2002.
ZAR, J.H. Biostatistical analysis. New Jersey: Prentice-Hall, 1996. 718p.
88
8. TRABALHO CIENTÍFICO
Trabalho a ser enviado para a revista Brazilian Journal
Of Veterinary Research And Animal Science.
ENDOMETRITE CRÔNICA DAS ÉGUAS: REVISÃO DE LITERATURA
(EQUINE CHRONIC ENDOMETRITIS: A REVIEW)
Camila Dias PORTO
1
, Louisiane de Carvalho NUNES
2
, Julio Lopes SEQUEIRA
3
, Marco Antônio
ALVARENGA
3
1 Pós-graduanda da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Campus de Botucatu, SP.
2 Docente do Centro de Ciências Agrárias – UFES, Campus de Alegre, ES.
3 Docentes da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP, Campus de Botucatu, SP.
Prof. Ass. Dr. Julio Lopes Sequeira
FMVZ – UNESP Deptº. Clínica Veterinária
Distrito de Rubião Jr, s/n
CEP 18618-000 Botucatu - SP
[email protected]nesp.br
89
ENDOMETRITE CRÔNICA DAS ÉGUAS: REVISÃO DE LITERATURA
(EQUINE CHRONIC ENDOMETRITIS: A REVIEW)
É indispensável para a fertilidade das éguas a manutenção da integridade uterina, especialmente a
do endométrio. As glândulas endometriais sintetizam, secretam e transportam substâncias histotróficas
que nutrem o concepto no período de pré-implantação e de placentação
8, 13
.
Microscopicamente, o útero das éguas é composto por três camadas: a interna é a mucosa ou
endométrio, a segunda ou média é o miométrio e a camada externa é o perimétrio. Por sua vez, o
endométrio é formado por epitélio luminal e lâmina própria, que se estende desde a membrana basal até a
camada muscular interna do miométrio. De acordo com a densidade de células estromais a lâmina própria
é dividida em dois estratos. No estrato compacto, mais superficial, a densidade de células estromais é alta
e há uma delicada rede de fibras reticulares. O estrato esponjoso apresenta uma baixa densidade celular
com muitas fibras conectando as células, o que confere aspecto de esponja. Esta região é caracterizada
pela presença de numerosas glândulas uterinas, derivadas do epitélio luminal
13
.
O epitélio de revestimento do endométrio apresenta-se composto por células ciliadas, células
secretoras não-ciliadas, além da presença eventual de leucócitos
13
. Utilizando a microscopia eletrônica de
varredura e transmissão, Amaral
1
sugeriu a presença de ao menos sete tipos celulares ou estágios distintos
no epitélio luminal do útero das éguas: entre as células secretórias encontrou células íntegras com
microvilosidades, células com vesículas apicais e outras em degeneração; entre as células ciliadas, notou
a presença de células jovens com microvilosidades, células maduras com cílios longos e íntegros e em
degeneração. Nesta camada foram observados também leucócitos intra-epiteliais. Durante o estro
constatou a presença de aberturas glandulares, repletas de secreção sendo lançada para o lúmen uterino.
Relatou ainda que nas éguas acima de 12 anos a abertura dessas glândulas encontrava-se obstruída, o que
poderia estar correlacionado com o processo fibrótico endometrial.
A infecção e inflamação transitórias do endométrio são conseqüências inevitáveis do contato com
o sêmen, seja pela inseminação artificial ou mesmo na monta natural. A instalação dessa reação
inflamatória aguda é induzida pela deposição de sêmen e pela contaminação bacteriana que ocorre
durante o coito
12
. Éguas consideradas normais do ponto de vista reprodutivo debelam eficientemente essa
inflamação, mantendo o ambiente intra-uterino adequado para a sobrevivência do embrião até a sua
implantação
24
. Se o animal não for competente para eliminar qualquer possível agente nocivo nesse
período, desenvolve-se a endometrite persistente.
90
Os mecanismos de defesa uterinos são complexos, havendo interação das barreiras anatômicas,
componentes celulares, imunoglobulinas, substâncias bactericidas e fatores mecânicos. Éguas jovens são
mais resistentes à enfermidade. A inflamação persistente freqüentemente resulta em luteólise prematura e
subseqüente perda embrionária
12, 28
.
As principais causas de endometrite na égua são defeitos anatômicos, partos distócicos, retenção de
placenta, processos iatrogênicos e, em animais suscetíveis, como já foi dito, a própria monta pode
permitir a contaminação uterina
32
. Troedsson
27
classifica as endometrites persistentes conforme a
patogênese em quatro grupos, a saber: doenças sexualmente transmissíveis, infecção uterina persistente,
endometrite persistente induzida pelo coito e endometrite crônica degenerativa, também denominada
endometrose.
Para o diagnóstico das endometrites, exames microbiológicos, citológicos e histopatológicos
podem ser realizados. No entanto, a biópsia endometrial é o método definitivo para a determinação dessa
enfermidade
17
.
A biópsia endometrial é o método mais preciso para o diagnóstico e o estabelecimento do
prognóstico da fertilidade em éguas, visto que a fibrose é um dos principais critérios utilizados na
avaliação do comprometimento do útero
5
. Esta técnica evidencia a situação morfológica do endométrio e
fornece dados sobre a sua situação funcional
5, 26
, além de ser um procedimento econômico e simples
4
.
Dessa forma, Kenney
13
propôs um sistema de classificação das endometrites crônicas em três
categorias, considerando a possibilidade da égua levar o concepto a termo. Essas categorias foram
divididas com base na incidência e extensão das alterações histopatológicas. Na categoria I não há
alterações patológicas ou se existem são discretas e esparsas, e também não há interferência com a
habilidade de levar o feto a termo. Na categoria II é encontrado infiltrado inflamatório difuso moderado
no estrato compacto, podendo estar presentes alterações fibróticas e lacunas linfáticas discretas. As
alterações inflamatórias desta categoria podem regredir se tratadas devidamente. As endometrites
classificadas como categoria III impossibilitam a égua de levar a gestação a termo e não regridem com
tratamento. Há fibrose periglandular difusa que se correlaciona com a gravidade do prognóstico. Podem
ser observados também grandes lacunas linfáticas e infiltrado inflamatório moderado a intenso.
Por ser a fibrose endometrial o fator mais importante para a determinação prognóstica da
fertilidade, houve a necessidade da reclassificação dos tipos de endometrite em quatro categorias
28
.
Kenney & Doig
14
modificaram essa classificação, subdividindo a categoria II em IIA e IIB, de acordo
91
com a quantidade de fibrose endometrial, a correlação da fibrose com a capacidade da égua em manter a
prenhez e sua resposta à terapia. Na categoria IIA foram incluídas as biópsias que apresentavam infiltrado
difuso no estrato compacto, ou disperso, em focos, nos estratos compacto e esponjoso; a fibrose encontra-
se esparsa envolvendo ramos glandulares individuais, em qualquer grau de severidade, ou raros
agrupamentos de glândulas. As alterações encontradas na categoria IIB são difusas ou multifocais, sendo
mais severas e extensas. A Fig. 1 descreve a classificação das endometrites crônicas segundo Kenney &
Doig
14
.
Outros autores como Ricketts & Alonso
22
, baseados na tese de Ricketts datada de 1975, apud
Ricketts & Alonso
22
, observaram que as lesões endometriais poderiam estar ou não acompanhadas por
infiltrado mononuclear, denominando de endometrite crônica infiltrativa as que apresentavam
características inflamatórias e de doença endometrial degenerativa crônica aquelas em que estavam
presentes ninhos ou cistos glandulares associados à fibrose periglandular ou difusa. Segundo estes autores
a endometrite infiltrativa crônica caracteriza-se por células mononucleares infiltrando o estroma,
enquanto que na doença endometrial degenerativa crônica predominam as alterações degenerativas:
ninhos e/ou cistos associados à fibrose periglandular e/ou estromal difusa. A Fig. 2 demonstra a
classificação das endometrites eqüinas segundo Ricketts, apud Ricketts & Alonso
22
e Ricketts &
Barrelet
23
.
A fibrose é um dos principais elementos da reação tecidual, sendo portanto importante a
determinação de seu arranjo, localização e composição para se avaliar o grau de comprometimento do
endométrio e as chances de regressão da lesão já estabelecida
19
.
A avaliação do grau de fibrose endometrial é importante, pois, ao contrário das alterações
inflamatórias, é permanente. Nestas lesões a deposição de colágeno ocorre mais comumente ao redor das
glândulas ou associada à membrana basal
14
. Essa alteração compromete a integridade e a função das
glândulas endometriais, estruturas necessárias desde o período de pré-implantação embrionária até o
desenvolvimento placentário completo. Nas glândulas fibróticas, o epitélio se diferencia irregularmente,
além de haver modificação das secreções glandulares. Portanto, nos casos mais severos, mesmo que
ocorra implantação embrionária, a redução ou alteração dessas secreções podem causar a nutrição
inadequada do feto, podendo resultar em aborto
30
.
Nunes
19
, estudando o padrão de distribuição e tipos de colágeno, observou maior concentração de
colágeno nas endometrites crônicas nas regiões periglandular e perivascular, e no estrato esponjoso. Ao
92
correlacionar a gravidade da endometrite com a distribuição do colágeno, concluiu que quanto mais grave
o grau, mais acentuado o acúmulo de colágeno ao redor das glândulas. Verificou também que o colágeno
do tipo I foi mais freqüente nas lesões fibróticas periglandulares nas endometrites incluídas nas categorias
II B e III.
O tipo de colágeno presente expressa a cronologia da lesão, já que o colágeno tipo III é o primeiro
a ser depositado durante os processos reparativos e fibróticos em geral, sendo posteriormente substituído
pelo do tipo I
16
. Um método utilizado para essa tipificação é o Picrosirius Red, o qual diferencia os tipos
de colágenos detectando a diferença de intensidade da birrefringência das fibras em microscópico óptico
de luz polarizada. Dessa forma, diferentes tonalidades de cor são observadas conforme o tipo de arranjo
molecular presente
11, 18
.
Há evidências de que em lesões granulomatosas com fibrose persistente ocorre formação
progressiva de pontes de ligação de colágeno e conseqüente bloqueio de sítios de reação com as enzimas
colagenolíticas, o que impede a degradação das moléculas de colágeno
2
.
Evans et al.
6
asseguram que a morfometria auxiliada por computação de biópsias uterinas podem
ser incorporadas ao diagnóstico e avaliação da fibrose endometrial das éguas. Em conjunto com a
avaliação histopatológica a determinação da porcentagem de colágeno periglandular endometrial permite
estabelecer com maior precisão a fibrose periglandular no endométrio a despeito de sua distribuição,
tamanho do ninho fibrótico, camadas de fibrose ou grau de fibrose individual glandular.
Utilizando análise morfométrica associada à técnica do picrosirius red – polarização, Nunes
19
observou que à medida que a lesão endometrial evolui há substituição progressiva do colágeno tipo III
por colágeno tipo I na região periglandular. Entretanto, ao realizar a classificação das endometrites no
sistema proposto por Kenney & Doig
14
, notou que amostras apresentando fibrose intensa e infiltrado
inflamatório discreto ou ausente foram englobadas na mesma categoria de outras em que o infiltrado
acompanha a fibrose de forma conspícua. Esses achados permitem supor que processos diferentes,
ocorrendo por diferentes causas, podem estar sendo incluídos na mesma categoria. Troedsson
27
denomina
a fibrose periglandular associada à dilatação glandular como endometrose ou endometrite degenerativa
crônica, sendo esta uma condição observada não só em éguas suscetíveis a endometrite persistente, mas
também naquelas mais idosas sem histórico conhecido de inflamação. Isto sugere um processo
fibroplásico degenerativo do endométrio sendo muito mais uma conseqüência do envelhecimento do que
da inflamação uterina.
93
Walter et al.
29
citam que a endometrose é uma das razões mais freqüentes da infertilidade em
éguas, levando a alterações graves do tecido conjuntivo uterino e das glândulas.
Em um estudo mais recente, Nunes et al.
20
, classificando 125 casos de endometrite crônica
segundo Kenney & Doig
14
, descrevem que 18 casos (14,4%) foram incluídos na categoria I, 46 casos
(36,8%) na categoria IIA, 23 casos (18,4%) na categoria IIB e 38 casos (30,4%) na categoria III. Esses
dados permitiram concluir que 48,8% das biópsias apresentavam elevado grau de fibrose endometrial
associada ou não a infiltrado inflamatório. No mesmo trabalho, utilizando-se a classificação de Ricketts &
Alonso
22
, verificou-se que as alterações de caráter inflamatório predominavam, totalizando 56,8% dos
casos.
Outros achados morfológicos podem ter relação com a fibrose endometrial. É relatada na literatura
a presença de depósitos contendo fosfato de cálcio ou carbonato de cálcio no lúmen das glândulas
uterinas de éguas portadoras de alterações endometriais degenerativas. Isso poderia ser causado pela
deposição de sais de cálcio em um núcleo formado por debris celulares presentes nessas glândulas. Este
mecanismo seria análogo à sialolitíase que, por sua vez, é mais comum em eqüinos do que nas outras
espécies. A formação desses cálculos no útero ocorrem predominantemente nas glândulas pouco ou
moderadamente dilatadas e nas fibróticas. Esse processo pode levar à dilatação cística dessas estruturas e
poderia explicar a diferenciação miofibroblástica periglandular. Os miofibroblastos podem estar
relacionados com a estimulação da produção da matriz extracelular e sua degradação, já que são aptos a
produzir citocinas
29, 31
.
Inoue et al.
10
constataram que há relação entre as endometroses e a esclerose vascular da íntima e
adventícia de pequenas artérias observadas sob o endométrio através de exame histeroscópico, e o grau de
comprometimento dos vasos acompanha a gravidade da lesão uterina. Este processo vascular pode ser
conseqüência da idade, de inflamação crônica e possivelmente de fatores endócrinos. Porém, outros
estudos obtiveram resultados conflitantes, nos quais houve diferenças individuais entre a progressão da
alteração esclerótica e o grau da endometrose, não podendo ser aquela diretamente atribuída à causa da
enfermidade. Sabe-se que alterações no ambiente uterino produzidas pela esclerose das artérias podem
contribuir para a progressão da endometrose, mas ou esta pode ocorrer como resultado do avanço da
idade. Portanto, a patogênese deste processo ainda gera dúvidas e necessita de estudos mais
aprofundados
29
.
94
Ainda há relatos de que as alterações vasculares relacionadas à idade são caracterizadas pela
esclerose da camada média e perivascular. O termo angiose é designado como lesão degenerativa de
artérias ou veias. Este processo em grau moderado ou grave, atingindo todas as camadas da parede
vascular é mais freqüente nas éguas com maior número de partos. A angiose é freqüentemente observada
em combinação com as alterações degenerativas de vasos linfáticos e do endométrio. É citado que as
lacunas linfáticas têm sido interpretadas como um sinal de má perfusão uterina. Desta forma, a
endometrose representaria mais uma seqüela da congestão endometrial crônica
9, 25
.
A atrofia endometrial, eventualmente resultando em senilidade endometrial, pode ser uma
conseqüência importante da endometrose. A interação entre a endometrite e endometrose ainda não é
completamente compreendida. A reversão do processo depende de vários fatores como idade, número de
parições, status reprodutivo, aspectos clínicos e anormalidades endocrinológicas
25
.
Para que se entenda o mecanismo patológico da fibrose é necessário que, primeiramente, se
compreenda o funcionamento normal dos mecanismos de interação da matriz extracelular.
A degradação da matriz extracelular envolve muitas enzimas, mas as metaloproteinases (MMP)
são as mais importantes nesse processo
3, 15
.
A relação entre as MMPs e alterações uterinas tem sido estudada nas mulheres
7
. Nas éguas, há
evidências de que a MMP-2 e a MMP-9 participem do processo fibrótico que ocorre na endometrite
crônica
21
. O estudo destas enzimas e de seus inibidores no processo fibrótico endometrial das éguas abre
novas perspectivas na compreensão da patogênese das endometrites crônicas.
Diante do exposto, nota-se que como a patogênese da fibrose endometrial eqüina ainda permanece
obscura, estudos sobre seus mecanismos devem ser desenvolvidos. Esta alteração compromete a função
uterina, impedindo a fêmea de manter o feto até o final da gestação, o que leva a grandes perdas
econômicas. O estudo dos tipos de colágeno que se acumulam na fibrose endometrial é necessário para
que seja realizada a correlação entre a cronologia do processo e as alterações encontradas na
histopatologia
19
. Investigações a respeito das metaloproteinases e de seus inibidores nesse tipo de
processo ainda são escassos. Novos caminhos na terapia antifibrótica podem se abrir a partir da
determinação do papel das metaloproteinases nas afecções endometriais crônicas.
95
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 AMARAL, D. Estudo morfológico e histoquímico do endométrio de éguas PSI, 2002. 65 f. Tese
(doutorado) – Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte.
2 ANDRADE, G.B., MONTES, G.S., CONCEIÇÃO, G.M.S., SALDIVA, P.H.N. Use of the Picrosirius-
polarization method to age fibrotic lesions in the hepatic granulomas produced in experimental murine
schistosomiasis. Annals of Tropical Medicine and Parasitology, v. 93, p. 265-72, 1999.
3 ARTHUR, M.J.P. MMPs and TIMPs in liver fibrosis. American Journal of Physiology .
Gastrointestinal and Liver Physiology, v. 279, G245-G249, 2000.
4 CONCHA-BERMEJILLO, A., KENNEDY, P.C. Prognostic value of endometrial biopsy in the mare: a
retrospective analysis. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 181, n. 7, p. 680-1, 1982.
5 DOIG, P.A., MCKNIGHT, J.D., MILLER, R.B. The use of endometrial biopsy in the infertile mare.
Canadian Veterinary Journal, v. 22, p. 72-6, 1981.
6 EVANS, T.J., MILLER, M.A., GANJAM, V.K., NISWENDER, K.D., ELLERSIECK, M.R., FRAUSE,
W.J., YOUNGQUIST, R.S. Morfometric analysis of endometrial periglandular fibrosis in mares.
American Journal of Veterinary Research, v. 59, n. 10, p. 1209-14, 1998.
7 GOFFIN, F., MUNAUT, C., FRANKENNE, F., D´HAUTERIVE, S.P., BÉLIARD, A., FRIDMAN, V.,
NERVO, P., COLIGE, A., FOIDART, J.-M. Expression pattern of metalloproteinases and TIMPs in
cycling human endometrium. Biology of Reproduction, v. 69, p. 976-84, 2003.
8 GRAY, C. A., BARTOL, F.F., TARLETON, B.J., WILEY, A.A., JOHNSON, G.A., BAZER, F.W.,
SPENCER, T.E. Developmental biology of uterine glands. Biology of Reproduction, v. 65, p. 1311-23,
2001.
9 GRÜNINGER, B., SCHOON, H.-A, SCHOON, D., MENGER, S., KLUG, E. Incidence and
morphology of endometrial angiopathies in mares in relationship to age and parity. Journal of
Comparative Pathology, v. 119, p. 293-309, 1998.
10 INOUE, Y., ITO, K., TERADA, T., NISHIMURA, N., HATAZOE, T., SATO, K. Degenerative
changes in the endometrial vasculature of the mare detected by videoendoscopic examination. AAEP
Proceedings, v. 46, p. 325-9, 2000.
11 JUNQUEIRA, L.C.U., COSSERMELLI, W., BRENTANI, R.R. Diferencial staining of collagens typé
I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum Histologicum Japonicum, v. 41, p. 267-
74, 1978.
96
12 KATILA, T. Uterine defence mechanisms in the mare. Animal Reproduction Science, v. 42, p. 197-
204, 1996.
13 KENNEY, R.M. Cyclic and pathologic changes of the mare endometrium as detected by biopsy, with
a note on early embryonic death. Journal of American Veterinary Medical Association, v. 172, n. 3, p.
241-62, 1978.
14 KENNEY, R.M., DOIG, P.A. Equine endometrial biopsy. In: MORROW, D.A. (ed.). Current therapy
in theriogenology. Philadelphia: WB Saunders, 1986. p. 723-9.
15 LENHART, J.A., RYAN, P.L., OHLETH, K.M., PALMER, S.S. Relaxin increases secretion of tissue
inhibitor of matrix metalloproteinase-1 and –2 during uterine and cervical growth and remodeling in the
pig. Endocrinology, v. 143, p. 91-8, 2002.
16 MARTINEZ-HERNANDEZ, A. Repair, regeneration and fibrosis. in: RUBIN, E., FABER, J.L.
Pathology. 3 ed. Philadelphia: Lippincot-Raven, 1999, 1664 p.
17 MEDICE, E.B., MERKT, H., POLHENS, J.F., BRUNKHORST, D. Considerations on the use of
ancillary diagnostic aids in the diagnosis of endometritis due to infection in mares. Journal of
Reproduction and Fertility, Suppl., v. 44, p. 700-3, 1991.
18 MONTES, G.S., JUNQUEIRA, L.C.U. The use of the picrosirius-polarization method for the study of
the biopathology of collagen. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v.86, p. 1-11, 1991.
19 NUNES, L.C. Avaliação histopatológica, histoquímica, imunoistoquímica e morfométrica das
endometrites crônicas em éguas, 2003. 108 f. Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade Estatual Paulista, Botucatu.
20 NUNES, L.C., PORTO, C.D., SEQUEIRA, J.L., ALVARENGA, M.A. Classificação histopatológica
das endometrites crônicas das éguas: estudo retrospectivo e prospectivo. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, v.57, supl.1, p. 75.
21 PORTO, C.D., NUNES, L.C., SEQUEIRA, J.L., OLIVEIRA, D.E., ALVARENGA, M.A.. Expressão
de MMP-2 e MMP-9 no processo fibrótico endometrial das éguas Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, v.57, supl.1, p. 105-6.
22 RICKETTS, S.W., ALONSO, S. The effect of age and parity on the development of equine chronic
endometrial disease. Equine Veterinary Journal, v. 23, 189-92, 1991.
97
23 RICKETTS, S.W., BARRELET, A. A retrospective review of the histopathological features seen in a
series of 4241 endometrial biopsy samples collected form UK thoroughbred mares over a 25 year period.
Pferdeheilkunde, v. 13, n. 5, p. 525-30, 1997.
24 RIGBY, S.L., BARHOUMI, R., BURGHARDTR.C., COLLERAN, P., THOMPSON, J.A., VERNER,
D.D., BLANCHARD, T.L., BRINSKO, S.P., TAYLOR, T., WILKERSON, M.K., DELP, M.D. Mares
with delayed uterine clearance have an intrinsic defect in myometrial function. Biology of Reproduction,
v. 65, p. 740-7, 2001.
25 SHOON, H.-A., SCHOON, D. The category I mare (Kenney and Doig 1986): expected foaling rate
80-90% - fact or fiction? Pferdeheilkunde, v. 19, n. 6, p. 698-701, 2003.
26 SILVA, C.A.M., BARROS, S.S., ESQUERRE, R.A. A biópsia endometrial na avaliação da fertilidade
da égua. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 7, p. 131-3, 1987.
27 TROEDSSON, M.H.T. Uterine clearance and resistance to persistent endometritis in the mare.
Theriogenology, v. 52, p. 461-71, 1999.
28 VAN CAMP, S.D. Endometrial biopsy of the mare: a review and update. Reproduction, v. 4, n. 2, p.
229-45, 1988.
29 WALTER, I., HANDLER, J., REIFINGER, M., AURICH, C. Association of endometrosis in horses
with differentiation of periglandular myofibroblasts and changes of extracellular matrix proteins.
Reproduction, v.121, p. 581-6, 2001a.
30 WALTER, I., KLEIN, M., HANDLER, J., AURICH, J, REIFINGER, M., AURICH, C. Lectin binding
patterns of uterine glands in mares with chronic endometrial degeneration. American Journal of
Veterinary Research, v. 62, n. 6, p. 840-5, 2001b.
31 WALTER, I, HELMREICH, M., HANDLER, J., AURICH, C. Mineralised deposits in the uterine
glands of mares with chronic endometrial degeneration. Veterinary Record, v. 153, n. 23, p. 708-10,
2003.
32 YOUNGQUIST, R.S. Moléstias do sistema reprodutivo. In: SMITH, B.P. Tratado de medicina
veterinária interna de grandes animais: moléstias de eqüinos, bovinos, ovinos e caprinos. São Paulo:
Manole, 1993. p. 1351-1426.
98
RESUMO
A endometrite é a principal causa de redução da fertilidade em éguas sendo considerada o problema de
maior importância clínica nos eqüinos depois da cólica e das enfermidades do trato respiratório. A biópsia
endometrial é o método mais preciso para o diagnóstico e estabelecimento do prognóstico da fertilidade
em éguas, já que permite a avaliação da situação morfofuncional do endométrio. Por serem os padrões de
distribuição da fibrose e do infiltrado inflamatório as principais características para o diagnóstico das
endometrites, Kenney propôs um sistema de classificação para esta enfermidade, posteriormente
modificado por Kenney & Doig. Outras classificações também são utilizadas, como a descrita por
Ricketts & Alonso, que procura separar entidades distintas de acordo com o padrão morfológico da lesão
endometrial. Estes estudos iniciais permitiram o aprofundamento das pesquisas dos possíveis mecanismos
envolvidos nas endometrites crônicas das éguas. Estudos recentes sobre a classificação dos tipos de
colágeno e tipificação do infiltrado inflamatório procuram caracterizar o processo, enquanto pesquisas
mais recentes envolvendo enzimas que degradam a matriz extracelular buscam elucidar parte de sua
patogênese ainda não totalmente compreendida.
Unitermos: Eqüino, Endometrite, Útero, Inflamação crônica, Fibrose.
ABSTRACT
Endometritis is the main cause of fertility reduction in mares and is considered the problem of bigger
clinical importance in the equine after the colic syndrome and respiratory system diseases. The
endometrial biopsy is the most necessary approach for the diagnosis and establishment of the prognostic
of fertility in mares, since it permits the morphofunctional evaluation of the endometrium. Because the
main characteristics for the diagnosis of endometritis are the standards of distribution of fibrosis and the
infiltrated inflammatory, Kenney proposed a system of classification for this illness, modified later by
Kenney & Doig. Other classifications also are utilized, as the one described by Ricketts & Alonso, which
seeks to separate different entities according to the morphological standard of the endometrial wound.
These initial studies permitted the deepening of the researches on the possible mechanisms involved in
the chronic endometritis of the mares. Recent studies about the classification of the kinds of collagen and
determination of types of the infiltrated inflammatory try to characterize the trial, while more recent
researches involving enzymes that degrade the extra cellular matrix try to explain part of its pathogen not
yet completely understood.
Uniterms: Equine, Endometritis, Uterus, Chronic inflammation, Fibrosis.
99
Figura 1. Classificação histopatológica das endometrites crônicas das éguas segundo Kenney & Doig
14
.
CARACTERÍSTICAS CATEGORIA
I
CATEGORIA
IIA
CATEGORIA
IIB
CATEGORIA
III
considerações Endométrio sem
alterações
patológicas, ou
são discretas e
bem dispersas.
Probabilidade
de levar a
gestação a
termo de 80 a
90%.
Alterações
discretas.
Probabilidade de
levar a gestação a
termo de 50 a
80%.
Alterações
moderadas.
Probabilidade de
levar a gestação a
termo de 10 a
50%.
Alterações
severas.
Probabilidade de
levar a gestação
a termo de 10%
ou menos.
infiltrado inflamatório discreto a
moderado no
estrato compacto
ou focos discretos
e freqüentes no
estrato compacto
e esponjoso
difuso e em focos
moderadamente
severos
difuso e severo
alterações fibróticas discretas e
freqüentes de
glândulas
individuais em
qualquer grau de
severidade ou
menos de 2
ninhos por campo
linear de 5,5 mm
(média de 4
campos)
difusa com
distribuição
uniforme e 4 ou
mais camadas (2
ou 4 ninhos por
campo linear de
5,5 mm em média
de 4 campos)
difusa e
uniforme de
glândulas com 5
ou mais ninhos
por campo linear
de 5,5 mm
lacunas linfáticas extensas o
suficiente para
serem palpáveis
extensas e
palpáveis
severas, dando
ao útero aspecto
de gel
outras alterações éguas com atrofia
endometrial
parcial no fim da
estação de monta
são incluídas
nesta categoria
éguas com
atrofia
endometrial
severa na estação
de monta estão
incluídas
resposta ao tratamento alterações
inflamatórias e
linfáticas podem
melhorar, com
reclassificação
para categoria I
alterações
inflama-tórias e
linfáticas podem
reduzir, com
reclassificação
para IIA ou
menor, mas as
éguas devem ser
submetidas à
inseminação
artificial
alterações
inflamatórias e
linfáticas podem
melhorar, mas
devido à fibrose,
não há
reclassificação
da categoria
100
Figura 2. Classificação das endometrites eqüinas segundo Ricketts & Barrelet
23
.
DIAGNÓSTICO
HISTOPATOLÓGICO
CARACTERÍSTICAS
Endometrite aguda leucócitos polimorfonucleares infiltrando o epitélio luminal e
estroma, algumas biópsias apresentam eosinófilos
Endometrite crônica infiltrativa células mononucleares, incluindo histiócitos e plasmócitos,
infiltrando o estroma
Doença endometrial degenerativa crônica
(endometrose)
alterações degenerativas glandulares (ninhos e/ou cistos)
associadas à fibrose periglandular e/ou fibrose estromal difusa
Atrofia endometrial atrofia glandular
Hipoplasia endometrial hipoplasia glandular
Hiperplasia endometrial hiperplasia glandular
•
•
•
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Disponível no site: http://www.scielo.br/revistas/bjvras/pinstruc.htm
(acessado em 08/02/2006)
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