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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO
DA CISTICERCOSE BOVINA
VALERIA APARECIDA MENOSSO
Botucatu – SP
Março 2006
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AMPLIFICAÇÃO DE DNA CIRCULANTE PARA O DIAGNÓSTICO
DA CISTICERCOSE BOVINA
VALERIA APARECIDA MENOSSO
Dissertação apresentada junto ao Programa
de Pós-Graduação em Medicina Veterinária,
para obtenção do Título de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi
Botucatu – SP
Março 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Menosso, Valeria Aparecida.
Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da cisticercose bovina /
Valeria Aparecida Menosso. – Botucatu : [s.n.], 2006.
Dissertação (mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de
Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2006.
Orientador: Prof. Dr. Germano Francisco Biondi.
Assunto CAPES: 50502050
1. Saúde animal. 2. Cisticercose. 3. Bovino. 4. Reação em Cadeia pela
Polimerase. 5. Taenia. 6. Imunodiagnóstico.
CDD 636.0894
Palavras chave: Bovinos; DNA; Cisticercose; PCR; Taenia.
Dedico,
À minha mãe, Diva (in memoriam),
por me ensinar que nenhum
obstáculo é grande o suficiente
para nos impedir de lutar pelo que
desejamos;
Ao meu pai, Gastão, por despertar
em mim meu amor e respeito pela
“arte” da pesquisa.
AGRADEÇO,
À minha mãe, por tudo o que foi e representa na minha vida, por todo amor,
carinho e cafuné, por todos os conselhos, os que eu segui e os que não segui,
pelas confissões, pela torcida nas minhas conquistas e afago nas minhas
derrotas...Te levo para onde vou, dentro do meu coração!
Ao meu pai, por todo amor e carinho, pelo exemplo de força, pela
compreensão, por me entender, encorajar e apoiar incondicionalmente, por
me ensinar a sempre tirar o melhor de tudo. Te amo muito pai!
Ao meu irmão, pelas conversas e conselhos: - “Mano, aqui não cabe só um
abraço!Cabem muitos abraços, daqueles aconchegantes, demorados, em
que ficamos sem dizer nada, mas sabemos tudo que o outro está sentindo.”
Sentimentos compartilhados...
A toda minha família. Devo a vocês minha vida, tudo o que sou, meus valores.
Me ensinaram o significado de uma família unida, de bons sentimentos e de
prosseguir batalhando. Amo vocês!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Germano Francisco Biondi, pela confiança
depositada em mim, pelo incentivo, pela compreensão, por ser além de
orientador, mas meu amigo!
À prof. Dr. Cáris Maroni Nunes, do Dep. de Apoio, Produção e Saúde Animal,
da Faculdade de Odontologia de Araçatuba (FOA), pelos desafios, por todo
ensinamento compartilhado, pela paciência e por me deixar partilhar da sua
família, pela amizade!
Ao meu namorado Anoros, pelo amor, dedicação, por me compreender e
sempre me apoiar!
À amiga Daniela, minha irmã de coração, pelas risadas, pelos devaneios,
pelos desabafos, por todos os momentos divididos e vividos juntas, bons e ruins,
pela cumplicidade...Por sempre poder contar com você!
Ao amigo Otávio, pela amizade dedicada, pela sensatez necessária nas horas
certas e pelos momentos de descontração durante a residência e o mestrado.
Aos amigos do Laboratório de Inspeção de Alimentos – FMVZ, Botucatu, pela
convivência, pela torcida e pelo auxílio nesta caminhada.
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal – FOA,
Laércio, Sérgio, Gustavo, Zanon, Alexéia, Sílvia, Fabiane, Pedro, Lúcia, Erica,
Heleno, Valquíria, Henrique, por me receberem tão bem, por todo empenho
em me ajudar durante a realização da pesquisa, pelas risadas, pela amizade
sincera!
Aos amigos pós-graduandos, Kate, Charli e Karina, por dividirmos alegrias,
dúvidas e angústias, por caminharmos juntas.
A todos vocês: “amigos são anjos sem asas”.
Ao prof. Dr. José Fernando Garcia, pela ajuda e considerações pertinentes
para a realização do trabalho.
Ao prof. Dr. Francisco Leydson Feitosa e à residente Rita, do Dep. de Clínica,
Cirurgia e Reprodução Animal, FOA, pela ajuda e empenho no decorrer da
pesquisa.
Ao prof. Dr. Emmanuel Dias-Neto, do Instituto de Psiquiatria, Faculdade de
Medicina – USP, pelas considerações técnicas.
Aos funcionários e responsáveis do Frigorífico Vangélio Mondelli Ltda. e
Frigorífico Bertin Ltda.; da Fazenda Milk-Mel e da Agropecuária Katayama, e
ao médico veterinário Samuel Carvalho de Aragão, pelo auxílio
disponibilizando material para a realização da pesquisa.
A CAPES, que através do auxílio-bolsa, ajudou na viabilização deste estudo.
A Deus, pela minha vida, mas neste caminho, principalmente, por atender
meus constantes pedidos por força e me fazer entender que tudo o que
acontece em nossa vida faz parte do nosso aprendizado!
A todos os que me ajudaram, tornando possível a realização desta pesquisa!
“Todo o nosso conhecimento
se inicia com sentimentos.”
Leonardo da Vinci
LISTA DE QUADROS
Página
QUADRO 1:
Oligonucleotídeos iniciadores segundo a
seqüência e sentido.
29
QUADRO 2:
Reagentes da PCR para oligonucleotídeos
iniciadores HDP2.
31
QUADRO 3:
Reagentes da PCR para oligonucleotídeos
iniciadores TAE.
31
QUADRO 4:
Reagentes da PCR para oligonucleotídeos
iniciadores SCAR K e SCAR G.
32
LISTA DE TABELAS
Página
TABELA 1: Resultados da avaliação do limiar de detecç
ão da
técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores
testado e o parasita avaliado em Tampão Tris – EDTA (TE).
38
TABELA 2:
Resultados da avaliação do limiar de detecção da
técnica de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores
te
stado e a fração de amostra de sangue experimentalmente
contaminada com DNA de Taenia saginata.
45
LISTA DE FIGURAS
Página
FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata
em bovinos e
humanos.
(Fonte: www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Taenia_sag.htm)
12
FIGURA 2:
Fluxograma da colheita e separação das amostras
avaliadas.
24
FIGURA 3:
Eletroforese em gel de agarose 2% corado com
brometo de etídeo, sob luz ultravioleta. DNA genômi
co de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
PM = marcador “Low DNA Mass Ladder” (Invitrogen
Life
Tecnologies, CA, USA).
34
FIGURA 4:
Produtos de amplificação, por PCR, de DNA de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2)
em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM =
padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
),
1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
;
6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
35
FIGURA 5:
Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2)
e
m gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM =
padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
),
1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
;
6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
36
FIGURA 6:
Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE em gel
de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 =
diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 =
1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
36
FIGURA 7:
Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K em
gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM =
padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
),
1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
;
6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
37
FIGURA 8:
Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de
forma metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium
(B),
com a utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G em
g
el de acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM =
padrão de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
),
1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
;
6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
37
FIGURA 9:
Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com
nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de
DNA de forma metacestóide de Taenia saginata
com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2), n
as
frações de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet
(C) e plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada
de 100 pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de DNA de forma
metacestóide de T. saginata
; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição
1:10
; 4 = 1:10
; 5 = 1:10
; 6 = 1:10
; 7 = 1:10
;
8 = 1:10
; 9 = 1:10
.
1:10
2
; 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
.
10 = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO =
sem DNA.
40
FIGURA 10:
Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com
nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de
DNA de forma metacestóide de T. saginata
com a utilização
de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2),
nas frações de
sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet
(C) e
plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100
pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de DNA de forma
metacestóide
de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10
2
, 4 =
1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
, 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
, 9 = 1:10
8
. 10 = DNA
de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.
41
FIGURA 11: Eletroforese em gel de
acrilamida a 8%, corado com
nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de
DNA de forma metacestóide de Taenia saginata
com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE, das frações de
sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet
(C) e
plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100
pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide
de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10, 3 = diluição 1:10
2
, 4 =
1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
, 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
, 9 = 1:10
8
. 10 = D
NA
de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.
42
FIGURA 12:
Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com
nitrato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de
DNA de forma metacestóide de Taenia saginata
com a
utiliz
ação de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, das frações
de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet
(C) e
plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100
plasma (D). PM = padrão de peso molecular em escada de 100
pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide
de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10
2
; 4 =
1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
. 10 = DNA
de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.
43
FIGURA 13:
Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com
nit
rato de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de
DNA de forma metacestóide de Taenia saginata
com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G, das frações
de sangue: série vermelha (A), sobrenadante (B), pellet
(C) e
plasma (D). PM = padrã
o de peso molecular em escada de 100
pb (Invitrogen
), 1 = 22,66 ng de DNA de forma metacestóide
de Taenia saginata; 2 = diluição 1:10; 3 = diluição 1:10
2
; 4 =
1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
. 10 = DNA
de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA.
44
FIGURA 14:
Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de
produtos de amplificação, por PCR, de DNA de
Taenia
saginata em amostras de soro bovino, fração pellet
(A) e
sobrenadante (B). PM = padrão de peso mol
ecular em escada
de 100 pb (Invitrogen
); 1 = DNA genômico de forma
metacestóide de T. saginata, 2 –
17 = amostras de bovinos
positivos para cisticercose, à inspeção post-mortem
. Em C, de 2
– 9 = fração pellet e 10 –
17 = fração sobrenadante, NO = sem
DNA.
46
FIGURA 15:
Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de
produtos de amplificação, por PCR, de DNA de
Taenia
saginata em amostras de soro bovino, fração pellet
(A) e
sobrenadante (B). PM = padrão de peso molecular em escada
de 100 pb (Invitro
gen
); 1 = DNA genômico de forma
de 100 pb (Invitrogen
); 1 = DNA genômico de forma
metacestóide de T. saginata, 2 –
17 = amostras de bovinos
negativos para cisticercose, à inspeção post-mortem
. Em C, de
2 – 9 = fração pellet e 10 –
17 = fração sobrenadante, NO = sem
DNA.
47
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µl: microlitro
ρmol: picomol
C. bovis: Cysticercus bovis
C. cellulosae: Cysticercus cellulosae
C. longicollis: Taenia longicollis
D.I.F.: Departamento de Inspeção Final
DNA: Desoxiribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)
dNTP: deoxinucleotídeos
EDTA: Ethylene diaminetetracetic Acid (Ácido Etileno Diaminotetracético)
ELISA: Enzyme-linked Immunosorbent Assay
g: gramas
M.A.P.A.: Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
M: molar
mg: miligrama
MgCl
2
: cloreto de magnésio
ml: mililitro
mM: milimolar
N
2
: nitrogênio líquido
NaCl: cloreto de sódio
ng: nanograma
pb: pares de base
PCR: Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia pela Polimerase)
PCR-RAPD: PCR - Randon Amplified Polymorphic DNA
PCR-REA: PCR - Restriction Enzymes Analysis
PCR-RFLP: PCR - Restriction Fragment Length Polymorphism
pg: picogramas
R.I.I.S.P.O.A.:
Regulamento de Inspeção Industrial e Sanitária de Produtos
de Origem Animal
S.I.F.: Serviço de Inspeção Federal
T. asiatica: Taenia asiatica
T. saginata : Taenia saginata
T. solium: Taenia solium
Taq Pol: enzima isolada do organismo Termophylus aquati
cus (Taq
Polimerase)
U: unidade
SUMÁRIO
Página
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO....................................................................................
05
2. REVISÃO DE LITERATURA...................................................................
08
3. OBJETIVOS..........................................................................................
21
3.1 Objetivo geral.............................................................................
21
3.2 Objetivos específicos.................................................................
21
4. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................
23
4.1 Amostras......................................................................................
23
4.2 Extração de DNA........................................................................
25
4.2.1 De formas metacestóides de T. saginata e T. solium.....
25
4.2.2 De amostras de sangue negativas para cisticercose
experimentalmente contaminadas com DNA de formas
metacestóides de T. saginata.....................................................
26
4.2.3 De amostras de soro de bovinos naturalmente
infectados com T. saginata.........................................................
28
4.3 Amplificação de DNA através da Reação em Cadeia
pela Polimerase (PCR)......................................................................
28
4.3.1 Oligonucleotídeos iniciadores.........................................
28
4.3.2 Condições do teste............................................................
30
4.3.3 Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR)...........................................................................
32
5. RESULTADOS......................................................................................
34
5.1 Concentração de DNA genômico extraído de formas
metacestóides de T. saginata e T. solium.....................................
34
5.2 Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR) com DNA de formas metacestóides de
T.
saginata e T. solium diluídos em tampão TE..................................
35
5.3 Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR) em amostras de sangue negativas para
cisticercose e experimentalmente contaminadas co
m DNA
de forma metacestóide de T. saginata.........................................
39
5.4 Amostras de soro de bovinos positivos e negativos para
cisticercose ao exame post-mortem.............................................
45
6. DISCUSSÃO........................................................................................
49
7. CONCLUSÕES....................................................................................
53
8. REFERÊNCIAS.....................................................................................
56
RESUMO / ABSTRACT
RESUMO
MENOSSO, V. A. Amplificação de DNA circulante para o diagnóstico da
cisticercose bovina. 2006. 65f. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu.
A cisticercose bovina é resultante da ingestão de ovos de T.
saginata proveniente de pastagens e águas contaminadas fornecidas
aos animais. É causa de preocupações na área de saúde pública por
ocasionar a teníase em humanos, mas causa sérios prejuízos na indústria
agropecuária e aos pecuaristas, devido às condenações ou
tratamentos de frio ou salga pelas quais as carcaças consideradas
positivas são submetidas. O método de diagnóstico rotineiramente
utilizado para a cisticercose bovina tem sido a inspeção post-mortem.
Muitos pesquisadores têm desenvolvido métodos de diagnóstico ante-
mortem, com especificidade e sensibilidade variadas. O presente
estudo teve como objetivo avaliar a aplicação da amplificação de
DNA circulante de T. saginata, através da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR), como ferramenta diagnóstica para cisticercose
bovina. Para a realização da pesquisa foram utilizadas amostras de
sangue de bovinos abatidos em frigoríficos sob S.I.F., segundo
apresentarem ou não cisticercose. Inicialmente avaliaram-se cinco
pares de oligonucleotídeos iniciadores através da determinação do
limiar de detecção da PCR de cada um deles. Objetivou-se ainda
estabelecer qual a fração do sangue experimentalmente contaminado
resultaria em amplificação de fragmentos de DNA através da PCR, para
posteriormente avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue
de bovinos naturalmente infectados com T. saginata. O melhor limiar de
detecção foi observado com o uso do par de oligonucleotídeos
iniciadores SCAR K, nas frações de sangue denominadas pellet e
sobrenadante. As amostras de sangue de animais positivos para
cisticercose na inspeção de rotina e submetidos a PCR não resultaram
em amplificação do fragmento de DNA desejado, sugerindo que a
baixa carga parasitária possa ter influenciado os resultados.
Palavras-chaves: Cisticercose bovina; Taenia saginata; PCR; DNA.
ABSTRACT
MENOSSO, V. A. Amplification of circulating DNA to the diagnosis of
bovine cysticercosis. 2006. 65f. Dissertation (Master) - University of
Veterinary Medicine and Zootechinie of Botucatu, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu.
Bovine cysticercosis is caused by the ingestion of T. saginata eggs
from contaminated pastures and water provided to animals. It is a public
health problem by causing the taeniasis in human beings, but it also
causes serious damages in the agro-cattle industry and to the cattle
raisers by de condemnation or treatment by coldness or salting of
carcass detected as positive. Routinely bovine cysticercosis diagnosis
has been the post-mortem inspection. Several researchers have
developed ante-mortem diagnosis methods, with variable specificity
and sensitivity. The present study aimed at evaluating the amplification
of circulating DNA of T. saginata, by the Polymerase Chain Reaction
(PCR), as a diagnostic tool to bovine cysticercosis. Blood samples from
bovines slaughtered under Federal Meat Inspection abattoirs were taken
according to the presence or absence of cyst forms. Initially, we
evaluated five primers and established which blood fraction
experimentally contaminated resulted in DNA fragment amplification by
PCR. The best detection limit was observed with the use of the SCAR K
primers, in the blood fractions denominated “pellet” and “supernatant”.
Blood samples of naturally infected animals considered positive in the
routine inspection didn’t result in the desired DNA fragment amplification
by PCR.
Key words: Bovine cysticercosis; Taenia saginata; PCR; DNA.
INTRODUÇÃO
5
1. INTRODUÇÃO
O complexo teníase-cisticercose, causado pelos cestóides Taenia
saginata (T. saginata) e Taenia solium (T. solium), tem distribuição
cosmopolita e ocorre mais freqüentemente em países em
desenvolvimento. O homem adquire a teníase quando ingere carne
crua ou mal cozida contendo formas metacestóides viáveis de Taenia
sp. e pode desenvolver a cisticercose quando ingere ovos de T. solium
presentes, principalmente, em alimentos ou água contaminados. O
bovino desenvolve cisticercose ao ingerir ovos de T. saginata eliminados
pelo homem. A cisticercose bovina causa prejuízos econômicos devido
ao tratamento ou condenação de carcaças contaminadas. A única
fonte de dados sobre a ocorrência desta zoonose tem se baseado nas
informações obtidas junto ao Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) através
dos registros constantes dos mapas de abate, a partir do exame post-
mortem realizado rotineiramente em frigoríficos e matadouros. Deste
modo, o S.I.F. desempenha papel fundamental no controle do
complexo teníase-cisticercose, com a inspeção sanitária e destinação
adequada das carcaças contaminadas. Muitos autores têm
desenvolvido testes sorológicos para a detecção de antígenos e
anticorpos circulantes que possam ser utilizados antes do abate dos
animais. Alguns pesquisadores têm obtido bons resultados, embora os
animais naturalmente infectados apresentem carga parasitária baixa, o
que diminui a sensibilidade e especificidade do teste. Nos últimos anos,
técnicas moleculares baseadas na PCR têm demonstrado serem boas
ferramentas diagnósticas permitindo ainda a diferenciação
interespécies. A aplicação das técnicas de PCR pode ser útil não só na
inspeção da teníase e da cisticercose, mas também para o controle
epidemiológico destas infecções. Alguns autores têm demonstrado a
presença de fragmentos de DNA de Taenia sp. em fluidos biológicos,
6
sugerindo ser esta uma possibilidade para a cisticercose bovina. Assim
sendo, embasados nestes fatores e vislumbrando a necessidade do
desenvolvimento de um método diagnóstico ante-mortem para a
cisticercose bovina, esta pesquisa foi realizada, com o intuito de testar a
PCR como ferramenta para o diagnóstico da cisticercose bovina.
REVISÃO DA LITERATURA
8
2. REVISÃO DA LITERATURA
O complexo teníase-cisticercose representa um importante
problema para a saúde pública, pela possibilidade de infecção do
homem, e para o setor agropecuário, pelas perdas econômicas. A
teníase e a cisticercose são duas entidades distintas causadas pela
mesma espécie de cestóide, em diferentes fases do seu ciclo de vida
(PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986).
O ciclo da tênia implica em dois hospedeiros e uma fase de vida
livre. Com relação à população de parasitas há três fases: adulto no
hospedeiro definitivo, ovos no ambiente e metacestóides (fase larvar)
no hospedeiro intermediário (GEMMEL & LAWSON, 1982). O homem é o
único hospedeiro definitivo da forma adulta tanto da T. saginata como
da T. solium, enquanto os bovinos domésticos e os suínos,
respectivamente, são os hospedeiros intermediários, apresentando a
forma metacestóide em seus tecidos. O estágio larvar ou metacestóide
da T. saginata é usualmente encontrado em músculos e vísceras dos
animais, representando problemas econômicos para a indústria da
carne e risco para a saúde pública (SOULSBY, 1968; PAWLOWSKI, 1982;
FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998).
A problemática na pecuária envolve a condenação ou
tratamento das carcaças levando à diminuição do valor da carne,
além da perda de peso dos animais infectados. Países que têm alta
prevalência de cisticercose são afetados indiretamente, pois há uma
inibição no desenvolvimento desta lucrativa indústria (PAWLOWSKI &
SCHULTZ, 1972).
De suma importância para a saúde pública é quando o homem,
além de hospedeiro definitivo, se torna o hospedeiro intermediário
desenvolvendo, principalmente no sistema nervoso central, a forma
metacestóide da T. solium. A cisticercose humana é adquirida pela
9
ingestão de ovos viáveis de T. solium através da auto-infecção interna,
auto-infecção externa ou hetero-infecção, sendo a forma mais comum
a neurocisticercose, cuja sintomatologia mais freqüente é a epilepsia
(ACHA & SZYFRES, 1986; NASCIMENTO, 2000).
A Taenia saginata (Goeze, 1782) pertence ao Filo Platyhelminthes, à
classe Cestoidea (Southwell, 1930), à ordem Ciclophillidea (Wardle et al.,
1974), à família Taeniidae (Ludwig, 1866) e ao gênero Taenia (Linnaeus,
1758) (SOULSBY, 1968; FORTES, 1997; URQUHART et al., 1998). Nos séculos
XVIII e XIX, Goeze e Leuckart, fizeram a distinção entre T. solium e T.
saginata. Em 1861, Leuckart, elucidou o ciclo de vida da T. saginata
administrando a bezerros proglotes por via oral, obtendo
experimentalmente a forma metacestóide de T. saginata. Mais tarde,
em 1869, Oliver obteve a forma adulta do parasita ao infectar homens
com metacestóides de bovinos (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LLOYD,
1998).
O parasita adulto da T. saginata habita o intestino delgado do
homem e tem comprimento médio de 6 a 8 metros, podendo alcançar
15 metros (URQUHART et al., 1998) e persistir por 25 a 30 anos, mas
geralmente vive em média de 10 a 15 anos (PESSOA, 1982).
A longevidade da T. saginata e sua grande produção e resistência
de ovos são características importantes na epidemiologia da doença.
Um único hospedeiro pode eliminar até mais de 500 mil ovos
diariamente, sejam nas proglotes ou livres nas fezes. A transmissão
indireta é a mais característica da doença e as vias de transmissão
abrangem a água, o solo, as pastagens, a silagem, o feno, os vetores
mecânicos e os portadores. Os ovos podem ser encontrados
contaminando mãos, região perianal e roupas pessoais e de cama de
indivíduos parasitados (PAWLOWSKI, 1982).
A resistência dos ovos ao meio externo é bastante grande,
dependendo da umidade relativa do ar e da temperatura ambiente,
suportando, inclusive, a maioria dos processos de tratamento de águas
residuárias. Efluentes de esgoto, mesmo previamente tratados podem,
10
portanto, conter ovos viáveis que se disseminam pelos rios e campos,
quando há inundações ou quando são usadas para a irrigação. Porém,
o tratamento convencional da água de abastecimento como
floculação, sedimentação e filtração são suficientes para eliminar os
ovos. De uma forma geral, os ovos podem permanecer viáveis durante
semanas e até meses (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972; LAWSON &
GEMMELL,1983; REY, 1992; REIFF, 1994).
A transmissão também pode ocorrer pela ordenha manual, através
das mãos contaminadas com matéria fecal do ordenhador. A
contaminação direta do feno ou das manjedouras, que é incomum e a
qual pode ocorrer quando um carreador humano manuseia ou
alimenta bovinos com as mãos contaminadas, tem dado origem a
pequenas epidemias de cisticercose bovina (PAWLOWSKI, 1982; REY,
1992).
A infecção do homem pela teníase é condicionada pelo consumo
de carne bovina e pelo hábito de comê-la crua ou mal cozida. O
homem infecta-se pela ingestão de metacestóides viáveis, os quais vão
desinvaginar seu escólex ao longo do aparelho digestivo, se fixar na
mucosa intestinal e desenvolver o parasita adulto (PESSOA, 1982; REY,
1992; SCHANTZ et al., 1994).
Fatores como o modo de preparo da comida, hábitos alimentares
e preferências por consumir carne crua ou insuficientemente cozida ou
assada, contendo metacestóides viáveis, contribuem para aumentar a
prevalência de portadores de T. saginata (ACHA & SZYFRES, 1986;
LLOYD, 1998).
Entretanto, os fatores que levam à ingestão destas carnes
englobam fatores ecológicos, econômicos e etnológicos. Os fatores
ecológicos são mais importantes na transmissão da T. saginata do
homem para os animais, já que as únicas limitações geográficas da
infecção são as regiões não habitadas pelo homem. Do ponto de vista
econômico, a produção mundial de carne tem aumentado muito e em
muitas áreas há um contato grande entre animais e homem. A
11
transmissão entre animal e homem depende de fatores etnológicos isto
é, hábitos humanos, religião e crença (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972).
Deste modo, fatores econômicos, culturais e religiosos tendem a expor
menos ou mais certas classes, grupos sociais ou até mesmo
determinadas populações (REY, 1992).
Dentre os fatores determinantes do complexo teníase-cisticercose
pode-se citar: baixa condição sócio-econômica; saneamento básico
precário; deficiente educação em saúde, hábitos alimentares e de
higiene pessoal; criação anti-higiênica de animais; precariedade dos
serviços de vigilância sanitária de alimentos e o comércio clandestino
de carnes em elevação (GERMANO, 1991).
Quando os bovinos ingerem ovos infectantes presentes no meio, as
oncosferas dos embriões são ativadas e liberadas através da ação de
sucos digestivos, como a pepsina e sais biliares e caminham em direção
à mucosa intestinal onde penetram e chegam às vênulas, para em
seguida atingirem a corrente sanguínea (ACHA & SZYFRES, 1986; REY,
1992; NASCIMENTO, 2000). As oncosferas fixam-se então, e
desenvolvem-se para a forma metacestóide em qualquer tecido mole
do organismo, com predileção para o tecido conjuntivo de músculos
esqueléticos e cardíacos, principalmente àqueles de maior
movimentação e oxigenação como masseter, língua, coração,
diafragma e cérebro (REY, 1992; LLOYD, 1998; NASCIMENTO, 2000). A
Figura 1 representa o ciclo de vida da T. saginata em bovinos e em
humanos.
12
FIGURA 1: Ciclo de vida da Taenia saginata em bovinos e humanos.
(Fonte: http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/hidrica/Taenia_sag.htm)
A forma metacestóide de T. saginata apresenta-se como uma
vesícula translúcida, de aspecto perláceo, ovóide ou alongada,
medindo de sete a doze milímetros de comprimento por quatro a seis
milímetros de largura (REY, 1992). Em oito a dez semanas os
metacestóides se tornam infectantes para o homem e, em até nove
meses, a maior parte deles começa a se degenerar, morrem e se
calcificam (ACHA & SZYFRES, 1986; LLOYD, 1998).
A presença de formas metacestóides na musculatura de bovinos
não tem sido associada a nenhuma sintomatologia clínica (ACHA &
SZYFRES, 1986; URQUHART et al., 1998). Entretanto, a infecção
experimental de bovinos com altas doses de ovos de T. saginata pode
resultar em quadros de miosite e miocardite degenerativa, podendo
13
levar até à morte ou à manifestação de alguns sintomas tais como
hipertermia, sialorréia, anorexia, debilidade e rigidez muscular
(PAWLOWSKI, 1982; ACHA & SZYFRES, 1986). Blazek & Schramlová (1980)
e Sterba & Dykova (1978) em pesquisas sobre a patogenia das formas
metacestóides de T. saginata em tecido muscular observaram uma
reação inflamatória elevada no primeiro mês pós-infecção.
O complexo teníase-cisticercose é cosmopolita tendo uma maior
prevalência nas zonas rurais de países da América Latina, Ásia e África
(SCHANTZ et al., 1994). Devido a sua importância para pecuária e para
a saúde pública, esta zoonose deve ter determinadas sua freqüência
nas diferentes regiões do país, bem como a procedência dos animais
abatidos, para a adoção de medidas de controle e profilaxia (SCHANTZ
et al., 1994; REIS et al., 1996).
Os dados da literatura sobre cisticercose bovina baseiam-se
principalmente em anotações da inspeção, a qual é realizada de
modo diferente em alguns países, ou até não é realizada, tornando
impraticável a adoção de uma padronização (PAWLOWSKI & SCHULTZ,
1972; THAKUR, 1979).
No Brasil, o Serviço de Inspeção Federal (S.I.F.) tem atuado como a
única fonte de dados sobre a ocorrência e a quantificação da
enfermidade, assim como a procedência dos animais abatidos (SOUZA
et al., 1997).
Em termos práticos é freqüente encontrarmos poucos
metacestóides em uma carcaça, diferente do que acontece nas
infecções experimentais, nas quais os animais são infectados
maciçamente. As pesquisas que discorrem sobre os locais de
predileção refletem bovinos com grandes infecções, o que pode não
corresponder à realidade (McCOOL, 1979).
Minozzo et al. (2002) com o objetivo de avaliar a distribuição
anatômica dos metacestóides nas carcaças de bovinos, realizou
infecção experimental com ovos de T. saginata em quatro animais,
abatendo-os 90 dias pós-infecção. A maioria dos metacestóides
14
(85,19%) foi recuperada da musculatura esquelética, enquanto somente
14,81% foram recuperados de órgãos como coração, língua e
diafragma. A distribuição variou de animal para animal, mas a maior
parte foi encontrada na musculatura anterior, o que sugere que a
inspeção post-mortem realizada como rotina nos frigoríficos, embora
único método de diagnóstico aplicado na prática, seja ineficiente.
A adoção da inspeção somente não é suficiente para eliminação
da T. saginata, uma vez que apresenta um limiar de detecção limitado
quando os animais são levemente infectados (PAWLOWSKI & SCHULTZ,
1972; KYVSGAARD et al., 1990).
Várias pesquisas realizadas em regiões ou estados no Brasil têm
demonstrado uma prevalência da cisticercose bovina de 2,7% no
Paraná (ZAMPINI, 1994), 1,87% em Uberlândia – MG (REIS et al., 1996),
11,6% em Tupã – SP (MANHOSO, 1996), 1,4% no estado do Mato Grosso
do Sul (CARMO et al., 1997) e 3,2% na região do Triângulo Mineiro (REIS &
RAGHIANTE, 2000). Freitas & Palermo (1996) observaram índices inferiores
aos publicados por outros autores, atribuindo esta situação a sub-
registros no Pará de teníase humana e cisticercose bovina.
No estado de São Paulo já foram relatadas prevalências de 5,5%
de cisticercose bovina em frigoríficos sob S.I.F. (UNGAR & GERMANO,
1992) e de 4,28% (FUKUDA et al., 2003).
O aumento na freqüência da cisticercose bovina, além de prejuízos
econômicos para o produtor e para o frigorífico com a condenação ou
seqüestro da carcaça para congelamento, reflete a presença de
indivíduos com teníase nas populações das áreas analisadas. O
conhecimento da procedência dos animais infectados possibilita a
adoção de medidas de controle e profilaxia na área de saúde pública
(REIS et al., 1996).
Além da inspeção de carnes, devem fazer parte de um programa
de profilaxia e controle do complexo teníase-cisticercose o tratamento
em massa de indivíduos portadores de T. saginata e a melhoria nos
serviços de água, esgoto ou fossa sanitária. É de vital importância a
15
educação sanitária das populações, principalmente no se refere a boas
condições de higiene humana, além da orientação para não consumir
carnes cruas ou insuficientemente cozidas. A educação sanitária é
peça-chave no desenvolvimento de um programa de controle, mas na
prática é realmente difícil obter mudanças em costumes de
determinadas populações (SASAKI & BRIOSHI, 1996; LLOYD, 1998;
NASCIMENTO, 2000).
Como medidas de controle são também propostas de alguns
autores o desenvolvimento de novas drogas medicamentosas, a
imunização de animais e ainda métodos de diagnóstico ante-mortem
(PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972). Um anti-helmíntico que seja eficaz e
econômico contra a forma metacestóide de T. saginata pode ser uma
ferramenta valiosa no controle da cisticercose bovina em rebanhos de
áreas endêmicas (STEVENSON et al., 1981). Algumas drogas têm sido
estudadas como o mebendazol (PAWLOWSKI & SCHULTZ, 1972) e o
praziquantel (ACHA & SZYFRES, 1986; URQUHART et al., 1998). O
praziquantel demonstrou ser um anti-helmíntico eficaz, com boa
resposta, no tratamento contra formas metacestóides em infecções
experimentais, enquanto o mebendazol tem sido sugerido para o
tratamento em massa do rebanho, como um método eficiente na
prevenção da transmissão de T. saginata.
Mais recentemente, o sulfóxido de albendazol nas concentrações
de 10 e 17% demonstrou provocar a degeneração e/ou calcificação
de metacestóides de T. saginata, tanto em rebanhos artificial quanto
naturalmente infectados (PRICHARD et al., 1985; BIONDI et al., 1999;
BARBOSA et al., 2003). Biondi (2000) sugere o uso de sulfóxido de
albendazol 17% como medida profilática no controle da cisticercose
bovina.
Alguns autores têm desenvolvido vacinas a partir de antígenos
recombinantes contra a infecção de bovinos e suínos por T. saginata e
T. solium, respectivamente. As vacinas são embasadas na identificação
e expressão, em Escherichia coli, de antígenos derivados de oncosferas
16
contendo ovos das espécies de tênias e demonstraram produzir altos
níveis de proteção, principalmente as vacinas contra T. solium. São
propostas promissoras para o controle da cisticercose animal e até da
cisticercose humana (LIGHTOWLERS, 2003; LIGHTOWLERS et al., 2003;
HARRISON et al., 2005).
A maioria das pesquisas com técnicas de imunodiagnóstico
sugerem sua aplicação para estudos epidemiológicos, principalmente
em áreas endêmicas, e para o monitoramento de tratamento,
diminuindo, deste modo, as perdas econômicas. Na busca por um
método que forneça o diagnóstico ante-mortem confiável, com alta
sensibilidade e especificidade, as primeiras técnicas descritas foram
para a detecção de anticorpos para cisticercose como o teste de
fixação de complemento, a hemaglutinação, o radioimunoensaio, o
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbente Assay) e técnicas de imunoblot
(DORNY et al., 2003).
O ELISA indireto não difere infecções recentes com metacestóides
viáveis de infecções antigas com metacestóides degenerados
(HARRISON & SEWEL,1981). Kyvsgaard et al. (1991) sugere a aplicação
do ELISA indireto para detecção de anticorpos na ocorrência de surtos,
somente para determinar a extensão e padrão da infecção. Apesar das
limitações, o ELISA e o Western Blot estão entre os métodos sorológicos
mais pesquisados, obtendo resultados semelhantes (SCIUTTO et al.,
2000).
Minozzo et al. (2004) testaram, em bezerros experimentalmente
infectados, três diferentes extratos antigênicos para pesquisa de
anticorpos através de ELISA indireto. Em relação à intensidade da
reação as melhores respostas foram do extrato antigênico de antígeno
parcial de C. cellulosae, seguido do antígeno total de C. bovis e
antígeno total de C. longicollis. Este método não detecta animais na
fase crônica da enfermidade, quando os níveis de anticorpos estão
baixos, mas pode fornecer dados em pesquisas sobre o
comportamento imunológico dos bovinos frente a cisticercose.
17
Na tentativa de estabelecer um método mais sensível e específico
para cisticercose bovina, foram desenvolvidas metodologias para a
detecção de antígenos circulantes, os quais podem diferenciar melhor
infecção crônica de recente (DORNY et al., 2000).
A detecção de antígeno circulante baseado no uso de anticorpo
monoclonal apresenta a limitação da intensidade da infecção. Harrison
et al. (1989) testaram um ELISA sanduíche usando um anticorpo
monoclonal que reconhece antígeno específico de T. saginata, e
observaram nível mínimo de detecção quando da presença de 200
metacestóides vivos, após 4 a 5 semanas pós-infecção. Brandt et al.
(1992) testando outros anticorpos monoclonais, observaram que o
número mínimo de metacestóides vivos para detecção de antígeno
pelo teste foi menor (88); nesta pesquisa demonstraram que os animais
com metacestóides calcificados apresentaram a mesma reação dos
controles negativos, mas relataram problemas de reação cruzada com
outros tenídeos.
Vários pesquisadores (HAYUNGA et al., 1991; DRAELANTS et al., 1995;
B∅GH et al., 1996; VAN KERCKHOVEN et al., 1998; FERRER et al., 2003)
têm proposto variações nas técnicas para detecção de antígeno
circulante com o intuito de aumentar a sensibilidade e especificidade
do diagnóstico ante-mortem.
Alguns autores têm utilizado o diagnóstico baseado na detecção
de DNA como alternativa particularmente para a diferenciação entre
as espécies de tênias, principalmente T. solium e T. saginata.
A amplificação de DNA fornece um método de diagnóstico
altamente sensível, específico e de fácil realização para proglótides,
ovos e formas metacestóides de T. saginata e tem sido sugerido como
rotina de diagnóstico laboratorial e no auxílio de programas de controle
(GOTTSTEIN et al., 1991), embora ainda seja uma técnica de custo
relativamente alto.
18
Seqüências específicas para Taenia sp. e T. saginata já foram
descritas originando oligonucleotídeos iniciadores capazes de
diferenciação entre as espécies (HARRISON et al. 1990; GONZÁLEZ et al.
2000) e capazes até de identificar proglotes e ovos de Taenia sp. de
espécimes provenientes de diferentes regiões geográficas, como
Colômbia, Espanha e México (GONZÁLEZ et al. 2002).
Mayta et al. (2000) realizaram uma pesquisa para comparar o
método histológico corado com hematoxilina-eosina e a PCR - REA
(Restriction Enzymes Analysis) na diferenciação de proglotes. Apesar de
mais barato e facilmente acessível, o método histológico só conseguiu
ser efetivo em 60% das amostras que se apresentavam em condições
de serem recuperadas e identificadas, enquanto a PCR identificou 100%
destas.
Em amostras clínicas, Nunes et al. (2003) utilizando os
oligonucleotídeos iniciadores propostos por González et al. (2000),
obtiveram a diferenciação entre T. solium e T. saginata em amostras de
fezes de pacientes humanos.
Um Multiplex - PCR utilizando como gene alvo a citocromo c
oxidase, sub-unidade 1, foi desenvolvido por Yamasaki et al. (2004),
podendo ser aplicado para fins epidemiológicos uma vez que é capaz
de diferenciar entre T. saginata, T. solium e T. asiatica.
Dias (2004) pelo estudo da análise de fragmentos através da
técnica PCR – RAPD (Randon Amplified Polymorphic DNA), descreveu os
oligonucleotídeos SCAR K e SCAR G que são específicos para T.
saginata e Taenia sp., respectivamente.
Também em amostras de fezes de pacientes humanos, Nunes et al.
(2005) desenvolveram oligonucleotídeos que permitem a diferenciação
entre T. solium e T. saginata através de PCR – RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism).
A possibilidade de que pode ocorrer a liberação de componentes
genéticos e até fragmentos celulares do parasita na corrente sanguínea
e em fluidos biológicos tem sido base para diagnósticos como o da
19
neurocisticercose em líquido cefalorraquidiano (BUENO et al., 2000;
PARDINI et al., 2001).
A pesquisa pela presença de material genético do parasita na
circulação sanguínea é respaldada por alguns autores que
confirmaram a detecção de DNA em fluidos biológicos e sistema
linfático, apesar de serem pesquisas com outras espécies de parasitas e
de material de amostra de origens diferentes (PONTES et al., 2002;
OGUMREMI et al., 2004).
Almeida (2005) observou a amplificação de DNA de T. solium em
soro e liquor de pacientes portadores de neurocisticercose, e
identificaram a presença de DNA em amostras de liquor. A
amplificação de fragmento de DNA em amostras de soro deste
pacientes não revelou resultados consistentes pela baixa concentração
de DNA circulante.
OBJETIVOS
21
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
ü Avaliar a amplificação de DNA circulante de T. saginata, através
da PCR, como ferramenta diagnóstica para cisticercose bovina.
3.2 Objetivos específicos
ü Avaliar, através da PCR, os oligonucleotídeos iniciadores já
descritos na literatura para amplificação de fragmento de DNA
de T. saginata;
ü Determinar o limiar de detecção da PCR para cada par de
oligonucleotídeos iniciadores testado;
ü Estabelecer qual fração do sangue experimentalmente
contaminado com DNA de T. saginata resulta em amplificação
de fragmento de DNA através da PCR;
ü Avaliar a aplicabilidade da PCR em amostras de sangue de
bovinos naturalmente infectados com T. saginata.
MATERIAL E MÉTODOS
23
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Amostras
Foram colhidas amostras provenientes de bovinos abatidos em
frigoríficos que seguem as normas vigentes do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (M.A.P.A.). Os bovinos foram selecionados
segundo apresentarem ou não formas metacestóides de T. saginata em
qualquer tecido ou órgão durante a realização do exame post-mortem,
exame este realizado segundo as normas do Regulamento de Inspeção
Industrial e Sanitária de Produtos de Origem Animal – R.I.I.S.P.O.A.
(BRASIL, 1980). Dos animais detectados pela inspeção como positivos e
negativos para cisticercose foram colhidas amostras de sangue total e
de soro, bem como as respectivas formas metacestóides identificadas
nas carcaças. A colheita de sangue das carcaças nos frigoríficos foi
realizada através do levantamento do membro anterior, na altura no
corte da artéria braquial, o qual ocorre no momento da separação das
hemi-carcaças. As amostras negativas foram colhidas no final do toillet,
e as positivas foram colhidas de carcaças desviadas para o
Departamento de Inspeção Final (D.I.F.).
Foram colhidas 40 amostras, sendo 20 amostras de animais
detectados como positivos pela inspeção de rotina e outras 20 de
animais negativos. As amostras de sangue total foram colhidas em tubos
contendo citrato de sódio e mantidas a -20ºC até o processamento.
As amostras de soro foram obtidas após centrifugação do sangue
(3000 g X 10 minutos), sendo posteriormente conservadas a -20ºC, até o
processamento. As amostras de formas metacestóides foram colhidas
no D.I.F. e preservadas em etanol a 95%.
A Figura 2 representa o fluxograma da colheita e fracionamento
das amostras de sangue total e soro avaliadas.
24
Fração
PLASMA
SEM
extração
de DNA
Centrifug
a 14000 g
X 60 minutos
PELLET
SOBRENADANTE
SORO
PLASMA
SÉRIE VERMELHA
Centrifuga 3000
g x 10 minutos
Centrifuga 3000
g x 10 minutos
Sangue total
com
anticoagulante
Sangue total
sem
anticoagulante
Extração
de DNA
da fração
SÉRIE
VERMELHA
Extração
de DNA
da fração
PELLET
Extração
de DNA
da fração
SOBRENA
DANTE
FIGURA 2: Fluxograma da colheita e separação das amostras avaliadas.
25
Como controle negativo para cisticercose foram colhidas amostras
de sangue total com anticoagulante e de sangue para obtenção do
soro de bezerros recém-nascidos de 1-2 dias de idade, oriundos de
fazendas de gado de corte localizadas no município de Guararapes e
Araçatuba.
Formas metacestóides de T. solium foram colhidas de um suíno
procedente de Dourados - MS, o qual apresentava cisticercose
generalizada, gentilmente cedidas pelo médico veterinário Samuel
Carvalho de Aragão.
Todas as análises foram realizadas no Laboratório de Bioquímica e
Biologia Molecular Animal do curso de Medicina Veterinária da
Universidade Estadual Paulista/UNESP, “campus” de Araçatuba.
4.2 Extração de DNA
4.2.1 De formas metacestóides de T. saginata e T. solium
Em uma placa contendo solução salina 0,9% os metacestóides
foram lavados e foi retirado, com o auxílio de um bisturi, qualquer tecido
que não pertencesse ao metacestóide, principalmente tecido do
animal hospedeiro. A membrana vesicular foi perfurada com auxílio de
uma agulha para a retirada do líquido vesicular e, em seguida, o
metacestóide foi isolado, separado da membrana, sendo novamente
lavado em solução salina. Para a extração do DNA foi utilizado um pool
de 05 (cinco) metacestóides que foram colocados em tubo de
polipropileno (0,5 ml) sendo macerado, com pistilo, em nitrigênio líquido
(N
2
), até a completa destruição da estrutura.
Após a maceração, a extração do DNA foi realizada segundo o
protocolo “Salting Out” (REGITANO, 2001) com modificações descritas a
seguir: após a maceração foram adicionados 400 µl de solução de lise
(Sucrose, EDTA 0,5M, Tris-Cl 1M e SDS 10% - 0,10mg/ml) contendo 15 µl de
proteinase k (20 mg/ml) e a solução foi incubada por 18 horas em
26
banho-maria à 58
O
C; após este período 200 µl de NaCl 4,5M foram
adicionados, com subseqüente homogeneização vigorosa.
Para a extração de DNA 400 µl de clorofórmio foram adicionadas,
as soluções foi agitada vigorosamente e centrifugada (14000 g x 11
minutos). A fase superior foi cuidadosamente transferida para um
microtubo de 1,5 ml e 400 µl de isopropanol foram adicionados para a
precipitação do DNA extraído. Após a centrifugação (14000 g x 15
minutos) o sobrenadante foi descartado, o sedimento foi lavado com
álcool 70%, incubado a temperatura ambiente por 15 minutos e
centrifugado (14000 g x 11 minutos). O sobrenadante foi descartado e
ao sedimento obtido foram adicionados 50 µl de tampão Tris - EDTA
(EDTA 0,5M, Tris-Cl 1M). O DNA obtido foi incubado a 37
O
C, por 18 horas,
antes de ser conservado a –20
O
C.
O DNA genômico extraído foi submetido à eletroforese em gel de
agarose a 2%, a 100 volts, durante 30 minutos (Eletrophoresis Power
Supply Model 250 EX/Gibco BRL
, MD, EUA). O gel foi então fotografado
(Kodak
Digital Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging Systems,
NY, EUA) e o DNA de metacestóide teve sua concentração
determinada através de comparação com a utilização do marcador
“Low DNA Mass Ladder” (Invitrogen
Life Tecnologies, CA, USA).
4.2.2 De amostras de sangue negativas para cisticercose
experimentalmente contaminadas com DNA de formas metacestóides
de T. saginata
Com o objetivo de se avaliar em qual fração do sangue o DNA de
T. saginata estaria presente, bem como o de avaliar o limiar de
detecção da reação de PCR, amostras de sangue de bezerros recém-
nascidos (de 1 - 2 dias de vida) foram colhidas para a contaminação
experimental com DNA de formas metacestóides de T. saginata. As
diluições seriadas foram feitas em volume de 700 µl, na base 10 (10–10
-8
),
em duplicata. Após a contaminação, as amostras de sangue com o
27
DNA foram incubadas por 2 horas a 38°C em banho-maria (Modelo 146,
FANEM
, São Paulo, Brasil) com a finalidade de simular o organismo do
bezerro.
Todas as amostras, incluindo os controles negativos, foram
delicadamente homogeneizadas e posteriormente foram centrifugadas
a 3000 g durante 10 minutos para a separação em duas frações: série
vermelha e plasma. Em seguida foram congeladas a –20
O
C até o
processamento.
Após o descongelamento, foi separada uma alíquota de 30 µl da
fração plasma, que foi utilizada diretamente na PCR, sem que fosse
feita a extração do DNA da amostra. O restante da amostra de plasma
foi submetido a uma nova centrifugação, a 14000 g por 60 minutos a
4
O
C. Desta fração obtiveram-se outras duas frações: pellet e
sobrenadante, com aproximadamente 450µl (Figura 2).
Com exceção da fração plasma, que foi utilizado direto na
reação (2 µl como amostra de DNA), todas tiveram o DNA extraído pelo
método “Salting Out” (REGITANO, 2001) com adaptações conforme
abaixo descritas.
A extração de DNA das frações série vermelha e pellet, foi
realizada seguindo o mesmo protocolo, com exceção da fase inicial na
qual à série vermelha foram adicionados 800 µl de solução SSC (NaCl
0,9M, citrato de sódio 89mM) centrifugados a 14000 g por 2 minutos e o
sobrenadante foi retirado. Todo o restante do protocolo seguiu a
mesma seqüência utilizada na extração de DNA de formas
metacestóides, porém os volumes de alguns reagentes diferiram. O
volume da solução de lise foi de 200 µl, da proteinase K foi de 3 µl, do
NaCl 4,5M foi de 100 µl, do clorofórmio foi de 225 µl e do isopropanol foi
de 200µl. Para a extração do DNA da fração sobrenadante, o que
difere da extração de DNA de formas metacestóides, além do volume
da proteinase K (3 µl) foi que após a adição do NaCl 4,5M, cada
amostra foi dividida em duas partes, que seguiram independentes toda
28
a reação, até serem unidas na fase final, quando da adição do
tampão TE.
O DNA genômico das diferentes frações foi ressuspendido em
volume final de 30 µl em tampão TE. Antes da PCR, todas as amostras
foram testadas para verificação da extração de DNA. Para isso, foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2% (110 volts durante 45
minutos) e fotografadas.
4.2.3 De amostras de soro de bovinos naturalmente infectados com
T. saginata
Esta etapa teve como objetivo testar a aplicabilidade da PCR em
amostras de bovinos naturalmente infectados.
Foram utilizados 500 µl de soro, os quais foram submetidos à
centrifugação (14000 g, 1 hora, 4
º
C), para a separação do soro nas
frações pellet e sobrenadante, anteriormente mencionadas. A extração
de DNA destas frações foi realizada seguindo a metodologia descrita no
item 4.2.2 para a fração plasma.
4.3 Amplificação de DNA através da Reação em Cadeia pela
Polimerase (PCR)
4.3.1 Oligonucleotídeos Iniciadores
Com o intuito de avaliar a amplificação de DNA de T. saginata e T.
solium foram selecionados cinco pares de oligonucleotídeos iniciadores,
descritos no Quadro 1.
29
QUADRO 1: Oligonucleotídeos iniciadores segundo a seqüência e
sentido.
Oligonucleotídeos
inciadores
Sequência (5’ – 3’) Sentido
F1 - HDP2 CAGTGGCATAGCAGAGGAGGAA sense
R1 - HDP2 GGACGAAGAATGGAGTTGAAGGT anti-sense
F2 - HDP2 CTTCTCAATTCTAGTCGCTGTGGT sense
TAE TGGGTTAGATGTTAAGACGGC sense
TAE AAAACACCCACTAAAAGCAGA anti-sense
SCAR K GTCTCCGCAACTGTAATGTATC sense
SCAR K GTCTCCGCAATAATAATCTTTC anti-sense
SCAR G GGATGAGACCGTACTAGCATG sense
SCAR G GGATGAGACCCTTGTAACAAATG anti-sense
Os oligonucleotídeos F1 e R1 resultam em uma amplificação de 600
pares de base (pb), específica para T. saginata, e os oligonucleotídeos
F2 e R1 resultam em uma amplificação de 170 pb, específico para
Taenia sp. Estes oligonucleotídeos foram originados da seqüência não-
repetitiva HDP2 (3954 pb), descrita por GONZÁLEZ et al. (2000),
depositada no GenBank
com número de acesso AJ133740.
Os oligonucleotídeos TAE foram descritos por NUNES et al. (2005), e
o fragmento de DNA resultante é de 521 pb, específico para Taenia sp.
Foram originados a partir de seqüências de DNA mitocondrial
depositada no GenBank
com número de acesso AB066488 e
AB066495.
DIAS (2004) descreveu os oligonucleotídeos SCAR K e SCAR G,
através da análise de fragmentos de DNA originadas por PCR-RAPD
(Randon Amplified Polymorphic DNA), técnica esta que se baseia na
30
amplificação de sequências repetitivas. Os oligonucleotídeos SCAR K
amplificam fragmentos de 532 pb, específico para T. saginata;
enquanto os SCAR G resultam em produtos de PCR com 357 pb
específico para Taenia sp.
Em todas as reações foram incluídos um controle positivo (o DNA
de metacestóide original de concentração conhecida) e um controle
negativo (sem DNA).
Após as PCRs, seus produtos foram submetidos a eletroforese em
gel de agarose a 2%, a 110 volts por 45 minutos, e em gel de
poliacrilamida a 8%, a 110 volts por 210 minutos (Eletrophoresis Power
Supply Model 250 EX/Gibco BRL
, MD, EUA) para se observar possíveis
diferenças entre os dois métodos de visualização dos fragmentos
amplificados de DNA. O gel foi fotografado utilizando-se uma câmara
digital (Kodak
Digital Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging
Systems, NY, EUA).
4.3.2 Condições do teste
As PCRs foram realizadas em termociclador (PTC-100
TM
Programmable Thermal Controller, MJ Research, Inc., MA, EUA) em tubos
de 200 µl, com volume final de 25 µl. Foram desenvolvidas segundo os
protocolos testados propostos para cada par de oligonucleotídeos
iniciadores, conforme os Quadros 2, 3 e 4.
As condições de reação para os testes com oligonucleotídeos F1,
F2 e R1 foram as seguintes: desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos,
seguido de 34 ciclos de desnaturação a 94°C pó 1 minuto, anelamento
a 56°C durante 30 segundos, extensão a 72°C por 30 segundos e uma
extensão final a 72°C por 10 minutos.
31
QUADRO 2: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores HDP2.
Reagente
Volume 1X em µl
Água 14,88
Tampão 10 X (Invitrogen
)
2,5
MgCl
2
50 mM (Invitrogen
)
0,62
dNTPs 12,5 mM (Invitrogen
)
2,5
Primer sense 10 ρmol
1,0
Primer anti-sense 10 ρmol
1,0
Taq Pol 5 U/µl (Invitrogen
)
0,5
DNA 2,0
Volume Total 25,0
Para os oligonucleotídeos TAE a reação seguiu o seguinte
protocolo: desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, seguidos de 34
ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 65°C por
1minuto e trinta segundos, extensão a 72°C por 1 minuto, mais uma
extensão final a 72°C por 5 minutos.
QUADRO 3: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores TAE.
Reagente
Volume 1X em µl
Água 14,25
Tampão 10 X (Invitrogen
)
2,5
MgCl
2
50 mM (Invitrogen
)
1,25
dNTPs 12,5 mM (Invitrogen
)
1,5
Primer sense 10 ρmol
1,5
Primer anti-sense 10 ρmol
1,5
Taq Pol 5 U/µl (Invitrogen
)
0,5
DNA 2,0
Volume Total 25,0
32
Com uma desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos, 34 ciclos de
desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 60°C por 1 minuto e
extensão a 72°C por 1 minuto e trinta segundos, com extensão final a
72°C durante 8 minutos, foram realizados as reações com os
oligononucleotídeos SCAR K e SCAR G.
QUADRO 4: Reagentes da PCR para oligonucleotídeos iniciadores SCAR
K e SCAR G.
Reagente
Volume 1X em µl
Água 14,05
Tampão 10 X (Invitrogen
)
2,5
MgCl
2
50 mM (Invitrogen
)
0,75
dNTPs 12,5 mM (Invitrogen
)
1,5
Primer sense 10 ρmol
2,0
Primer anti-sense 10 ρmol
2,0
Taq Pol 5 U/µl (Invitrogen
)
0,2
DNA 2,0
Volume Total 25,0
4.3.3 Limiar de detecção da Reação em Cadeia pela Polimerase
(PCR)
Com o intuito de avaliar o limiar de detecção da PCR utilizou-se o DNA
genômico (11,33 ng/µl) de T. saginata e T. solium diluídos em tampão TE,
bem como de DNA de T. saginata em 630 µl de sangue de bezerros
recém-nascidos e negativos para cisticercose, em escalas na base 10
(10 -10
-8
).
RESULTADOS
34
5. RESULTADOS
5.1 Concentração de DNA genômico extraído de formas
metacestóides de T. saginata e T. solium
Após análise realizada pelo programa Kodak
(Kodak
Digital
Science, SP 700 Color Printer, Scientific Imaging Systems, NY, EUA), a
concentração de DNA de T. saginata foi avaliada em 11,33 ng/µl de
solução e a de T. solium em 32,66 ng/µl. A Figura 3 apresenta a
visualização do DNA genômico extraído, após eletroforese em gel de
agarose a 2%.
FIGURA 3: Eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de
etídeo, sob luz ultravioleta. DNA genômico de forma metacestóide de
Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), PM = marcador “Low DNA Mass
Ladder” (Invitrogen
Life Tecnologies, CA, USA).
PM B
PM A
60 ng
40 ng
20 ng
10 ng
5 ng
100 ng
60 ng
40 ng
20 ng
10 ng
5 ng
100 ng
35
5.2 Limiar de detecção da Reação de Cadeia de Polimerase (PCR)
com DNA de formas metacestóides de T. saginata e T. solium diluídos
em Tampão Tris - EDTA (TE)
As Figuras 4, 5, 6, 7 e 8 apresentam os produtos de
amplificação, por PCR, de DNA de formas metacestóides de T. saginata
e T. solium diluídos em tampão TE e utilizando-se diferentes pares de
oligonucleotídeos iniciadores. Foi possível a amplificação de fragmento
de DNA de T. saginata, por PCR, utilizando-se todos os oligonucleotídeos
iniciadores testados. A amplificação de fragmento de DNA de T. solium
não foi observada quando do uso do par de oligonucleotídeos F1R1
(HDP2) e SCAR K.
FIGURA 4: Produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2) em gel de
acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso
molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = diluição 1:10; 2 =
diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e
NO = sem DNA.
170 pb
A B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 NO
36
FIGURA 5: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma
metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2) em gel de
acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso
molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = diluição 1:10; 2 =
diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e
NO = sem DNA.
FIGURA 6: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma
metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores TAE em gel de acrilamida a
8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em
escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 =
1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
A B
600 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 NO
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 NO
A B
521 pb
37
FIGURA 7: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma
metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR K em gel de acrilamida
a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso molecular em
escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = diluição 1:10; 2 = diluição 1:10
2
; 3 =
1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e NO = sem DNA.
FIGURA 8: Produtos de amplificação de DNA, por PCR, de forma
metacestóide de Taenia saginata (A) e Taenia solium (B), com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores SCAR G em gel de
acrilamida a 8%, corado com nitrato de prata. PM = padrão de peso
molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = diluição 1:10; 2 =
diluição 1:10
2
; 3 = 1:10
3
; 4 = 1:10
4
; 5 = 1:10
5
; 6 = 1:10
6
; 7 = 1:10
7
; 8 = 1:10
8
e
NO = sem DNA.
PM 1 2 3 4 5 6 7
8 1 2 3 4 5 6 7 8 NO
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 NO
A B
A B
532 pb
357 pb
38
Na Tabela 1 estão disponíveis os limiares de detecção da técnica
de PCR, observados segundo os oligonucleotídeos iniciadores testados.
Para as diluições realizadas com DNA diluído em tampão TE, o par de
oligonucleotídeos que apresentou melhores limiares de detecção de
DNA de T. saginata foi o F2R1 (HDP2), e para a detecção de T. solium foi
o par de oligonucleotídeos TAE.
TABELA 1: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica
de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testados e o
parasita avaliado em tampão Tris - EDTA (TE).
Oligonucleotídeos
Inciciadores – tamanho
do fragmento
Formas
metacestóides
Limiar de detecção
no gel de
Poliacrilamida
T. saginata 1:10
7
F2R1 (HDP2)– 170 pb
T. solium 1:10
5
F1R1 (HDP2) – 600 pb T. saginata 1:10
5
T. saginata 1:10
5
TAE – 521 pb
T. solium 1:10
7
SCAR K – 532 pb T. saginata 1:10
4
T. saginata 1:10
4
SCAR G – 357 pb
T. solium 1:10
2
39
5.3 Limiar de detecção da Reação de Cadeia pela Polimerase
(PCR) em amostras de sangue negativo para cisticercose e
experimentalmente contaminadas com DNA de forma metacestóide de
T. saginata
As Figuras 9, 10, 11, 12 e 13 apresentam os produtos de
amplificação, por PCR, das frações de sangue série vermelha,
sobrenadante, pellet e plasma com os diferentes oligonucleotídeos
iniciadores testados. Em todas os géis estão presentes como controle
positivo o DNA genômico extraído de metacestóides de T. saginata e,
como controle negativo, uma amostra do mesmo sangue utilizado na
realização da escala, sem contaminação com DNA de T. saginata.
40
FIGURA 9: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato
de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata com a utilização de
oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2), nas frações de sangue: série
vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de
DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 =
diluição 1:10
2
; 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
.
10 = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem
DNA.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NO
170 pb
A
B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
170 pb
C
PM 1 2
3 4 5 6 7 8 9 10
170 pb
D
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
170 pb
41
FIGURA 10: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato
de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata com a utilização de
oligonucleotídeos iniciadores F1R1 (HDP2), nas frações de sangue: série
vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de
DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10, 3 =
diluição 1:10
2
, 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
, 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
, 9 = 1:10
8
.10
= DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem DNA
A
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NO
600 pb
B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
600 pb
C
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
600 pb
D
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
600 pb
42
FIGURA 11: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato
de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata com a utilização de
oligonucleotídeos iniciadores TAE, das frações de sangue: série
vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de
DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10, 3 =
diluição 1:10
2
, 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
, 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
, 9 = 1:10
8
.
10 = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem
DNA.
A
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
521 pb
B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
521 pb
C
PM 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 NO
521 pb
D
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
521 pb
43
FIGURA 12: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato
de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata com a utilização de
oligonucleotídeos iniciadores SCAR K, das frações de sangue: série
vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = 22,66 ng de
DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 =
diluição 1:10
2
; 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
.
10 = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem
DNA.
A
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
532 pb
B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
532 pb
C
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
532 pb
D
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NO
532 pb
44
FIGURA 13: Eletroforese em gel de acrilamida a 8%, corado com nitrato
de prata, dos produtos de amplificação, por PCR, de DNA de forma
metacestóide de Taenia saginata com a utilização de
oligonucleotídeos iniciadores SCAR G, das frações de sangue: série
vermelha (A), sobrenadante (B), pellet (C) e plasma (D). PM = padrão
de peso molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
), 1 = 22,66 ng de
DNA de forma metacestóide de T. saginata; 2 = diluição 1:10; 3 =
diluição 1:10
2
; 4 = 1:10
3
; 5 = 1:10
4
; 6 = 1:10
5
; 7 = 1:10
6
; 8 = 1:10
7
; 9 = 1:10
8
.
10 = DNA de sangue bovino negativo para cisticercose e NO = sem
DNA.
A
PM 1 2 3 4 5 6 7
8 9 10 NO
357 pb
B
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
357 pb
C
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
357 pb
D
PM 1
2 3 4 5 6 7 8 9 10
357 pb
45
Na Tabela 2 são apresentados os limiares de detecção da técnica
de PCR, segundo a fração do sangue testada e os oligonucleotídeos
iniciadores avaliados. O par de oligonucleotídeos que resultou em
melhor limiar de detecção foi o SCAR K, com ausência de produtos de
amplificação nas amostras negativas.
TABELA 2: Resultados da avaliação do limiar de detecção da técnica
de PCR segundo o par de oligonucleotídeos iniciadores testado e a
fração de amostra de sangue experimentalmente contaminada com
DNA de Taenia saginata.
Fração
Olig. inic.
Série
vermelha
Sobrenadante
Pellet
Plasma
F2R1 (HDP2) 1:10
8
1:10
8
1:10
8
1:10
2
F1R1 (HDP2) 1:10
3
1:10
8
1:10
5
X
TAE 1:10
8
1:10
8
1:10
5
X
SCAR K 1:10
2
1:10
5
1:10
7
X
SCAR G 1:10
3
1:10
8
1:10
8
X
X= ausência de amplificação.
5.4 Amostras de soro de bovinos positivos e negativos para cisticercose
ao exame post-mortem
As Figuras 14 e 15 apresentam os resultados obtidos após amplificação
de DNA, por PCR, com o uso dos oligonucleotídeos SCAR K em amostras
de soro de bovinos provenientes de frigoríficos. Em nenhuma das
amostras classificadas como positivas à inspeção post-mortem foi
possível a amplificação de fragmento de DNA desejado. Dentre as
amostras negativas, uma amostra apresentou amplificação de
fragmento de DNA de 532 pb.
46
FIGURA 14: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de
amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de
soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso
molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = DNA genômico de
forma metacestóide de T. saginata, 2 – 17 = amostras de bovinos
positivos para cisticercose, à inspeção post-mortem. Em C, de 2 – 9 =
fração pellet e 10 – 17 = fração sobrenadante, NO = sem DNA.
A
532 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
B
532 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
C
532 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 NO
47
FIGURA 15: Eletroforese em gel de poliacrilimida a 8% de produtos de
amplificação, por PCR, de DNA de Taenia saginata em amostras de
soro bovino, fração pellet (A) e sobrenadante (B). PM = padrão de peso
molecular em escada de 100 pb (Invitrogen
); 1 = DNA genômico de
forma metacestóide de T. saginata, 2 – 17 = amostras de bovinos
negativos para cisticercose, à inspeção post-mortem. Em C, de 2 – 9 =
fração pellet e 10 – 17 = fração sobrenadante, NO = sem DNA.
A
532 pb
B
C
532 pb
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 NO
532 pb
DISCUSSÃO
49
6. DISCUSSÃO
A cisticercose bovina causa prejuízos econômicos para o setor
agropecuário e problemas para a saúde pública, mas não tem
recebido a devida atenção possivelmente por ter subestimados os
danos que ocasiona. O método diagnóstico utilizado para a detecção
de cisticercose baseia-se no exame post-mortem realizado em
frigoríficos que atuam sob S.I.F., mas ainda há uma parcela grande de
consumidores que mantém o comércio clandestino de carne. O
desenvolvimento de um método de diagnóstico ante-mortem para a
cisticercose seria de grande valia, permitindo que fosse possível, com a
identificação de animais positivos, um tratamento adequado e
monitoramento dos resultados obtidos. A maioria das pesquisas para o
desenvolvimento de testes ante-mortem utiliza métodos que se baseiam
na identificação de anticorpos ou antígenos circulantes. A
disponibilidade de dados para análises moleculares a cerca da Taenia
sp., o número de seqüências estudadas, identificadas e depositadas no
banco de dados (GenBAnk
) ainda é pequena, correspondendo a
uma fração mínima do seu genoma total. Além disto, a identificação de
DNA de T. saginata circulante ainda não foi descrita na literatura. Assim,
objetivou-se a amplificação de DNA de T. saginata em sangue com o
intuito de utilizar tal ferramenta para o diagnóstico da cisticercose
bovina.
Em relação à pesquisa para determinar o limiar de detecção da
PCR em escala realizada com o DNA diluído em tampão Tris-EDTA, os
limiares mais baixos para T. saginata e T. solium foram observados com a
utilização dos pares de oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2) e TAE,
respectivamente. A quantificação de DNA genômico utilizado no
presente trabalho não foi realizada por espectrofotometria o que
dificulta a comparação do limiar de detecção com os resultados
50
observados por outros autores como González et al. (2000) e Nunes et
al. (2003 e 2005), além do fato do material utilizado para extração serem
diferentes.
Através da pesquisa realizada com as frações de sangue,
objetivou-se identificar a fração que melhor analisaria a condição do
animal frente a cisticercose. Os resultados observados não foram
consistentes o suficiente para a padronização desta etapa, sendo que
quase todos os oligonucleotídeos testados nas PCRs amplificaram
bandas inespecíficas em alguma das frações do sangue, não
apresentando comportamentos similares. Os melhores resultados, com
ausência de formação de bandas inespecíficas, foram observados nas
amplificações realizadas com a utilização dos oligonucleotídeos
iniciadores SCAR K nas frações pellet e sobrenadante.
Outros autores também indicam a possibilidade de se encontrar
fragmentos de material genético de parasitas em fluidos biológicos.
Pontes et al. (2002) através da utilização de PCR detectaram a
presença de DNA de Schistossoma mansoni em amostras fecais e de
soro de humanos, observando bandas fracas nos amostras de soro,
sugerindo quantidade limitada de DNA circulante livre. Apesar da
relação parasita-hospedeiro ser diferente, pode-se interferir na
eliminação de DNA para a corrente sanguínea. Em estudo sobre a
identificação de antígenos de formas metacestóides de T. saginata
através de técnicas imunohistoquímicas em linfonodos, Ogunremi et al.
(2004) observaram que a reação ao teste sugere a presença do
metacestóide em sistema linfático, assim, os metacestóides poderiam
ter migrado para os lifonodos após sair do trato gastrointestinal ou,
antígenos, ou até fragmentos do parasita, poderiam ter sido drenados
do local de origem.
A aplicação da PCR com os oligonucleotídeos SCAR K em amostras
de soro de bovinos provenientes de frigoríficos revelou ausência de
amplificação em animais considerados positivos ao exame post-mortem
com amplificação de fragmentos de DNA de T. saginata de um animal
51
considerado negativo. A não amplificação de fragmento de DNA de T.
saginata em amostras de animais positivos pode ser resultante de
quantidade insuficiente de DNA circulante de Taenia sp. para ser
detectado na PCR. Sterba & Dykova (1978) e Blazek & Schramlová
(1980) observaram que o período de maior intensidade na reação pelo
hospedeiro quando da implantação da forma metacestóide, em
parênquima muscular, ocorre no primeiro mês pós-infecção, que pode
indicar que a amostra que resultou em amplificação de fragmento
possa ser de um animal positivo não detectado pela inspeção.
Almeida (2005) em estudo sobre a detecção de DNA de T. solium
em soro de pacientes com neurocisticercose, observou que as bandas
amplificadas eram muito mais fracas do que aquelas apresentadas no
líquido cefalorraquidiano, sugerindo uma possível interferência ou
inibição dos componentes do soro nas reações.
Para um melhor esclarecimento sobre as hipóteses levantadas,
sugere-se a realização de infecção experimental em bovinos para
acompanhamento da relação hospedeiro-parasita-DNA circulante bem
como o desenho de outros oligonucleotídeos iniciadores mais
específicos.
CONCLUSÕES
53
7. CONCLUSÕES
Com base nos resultados observados com a pesquisa realizada
pode-se concluir que:
ü É possível a amplificação de fragmento de DNA de T. saginata,
por PCR, utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores F2R1
(HDP2), F1R1(HDP2), TAE, SCAR G e SCAR K;
ü É possível a amplificação de fragmento de DNA de T. solium, por
PCR, utilizando-se os oligonucleotídeos iniciadores F2R1 (HDP2),
TAE e SCAR G;
ü O limiar de detecção da PCR mais baixo foi observado com a
utilização dos oligonucleotídeos F2R1 (HDP2) e TAE, tanto para
amplificação de DNA, diluído em tampão TE, de T. saginata
quanto de T. solium;
ü O limiar de detecção da PCR em amostra de sangue de bovino
negativa e artificialmente contaminada com DNA de forma
metacestóide de T. saginata foi mais baixo com a utilização dos
oligonucleotídeos SCAR K, nas frações pellet e sobrenadante;
ü Não houve amplificação de fragmento de DNA de T. saginata em
amostras de soro de bovinos considerados positivos para
cisticercose ao exame post-mortem.
Considerações futuras
ü A técnica de PCR para o diagnóstico da cisticercose bovina
pode ser uma ferramenta importante, porém, há a necessidade
54
de outros estudos para se avaliar, por exemplo, a influência da
carga parasitária na detecção de DNA circulante.
REFERÊNCIAS
56
8. REFERÊNCIAS
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