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AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO ENDOTELIAL EM CAMUNDONGOS
ATEROSCLERÓTICOS (ApoE KNOCKOUT) COM HIPERTENSÃO RENOVASCULAR
Robéria Maria Mendes Pontes de Arruda
Doutorado em Ciências Fisiológicas
Centro de Ciências da Saúde
Universidade Federal do Espírito Santo
Vitória – ES
25 de Setembro de 2006
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ROBÉRIA MARIA MENDES PONTES ARRUDA
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO ENDOTELIAL EM CAMUNDONGOS
ATEROSCLERÓTICOS (ApoE KNOCKOUT) COM HIPERTENSÃO RENOVASCULAR
Vitória
2006
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Federal do Espírito Santo, como
requisito parcial para a obtenção do Grau de Doutora
em Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof. Dr. Elisardo Corral Vasquez
Co-orientadora: Profa. Dra. Silvana dos Santos
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Arruda, Robéria Maria Mendes Pontes
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO ENDOTELIAL EM CAMUNDONGOS
ATEROSCLERÓTICOS (ApoE KNOCKOUT) COM HIPERTENSÃO
RENOVASCULAR / Robéria M. Mendes Pontes Arruda – Vitória, 2006.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas – Centro de Ciências da Saúde – Universidade
Federal do Espírito Santo
Orientador: Prof. Dr. Elisardo Corral Vasquez
1. Aterosclerose 2. Hipertensão renovascular 3. Camundongo ApoE
knockout 4. Função endotelial 5. Reatividade vascular 6. EDHF
ROBÉRIA MARIA MENDES PONTES ARRUDA
AVALIAÇÃO DA FUNÇÃO ENDOTELIAL EM CAMUNDONGOS
ATEROSCLERÓTICOS ( ApoE KNOCKOUT) COM HIPERTENSÃO RENOVASCULAR
COMISSÃO EXAMINADORA
__________________________________
Dr. Valdo José Dias da Silva – Universidade do Triângulo Mineiro
___________________________________
Dra. Maria do Carmo Pinho Franco - USP
__________________________________
Dra. Nazaré Souza Bissoli – UFES
___________________________________
Dr. Elisardo Corral Vasquez – UFES
__________________________________
Dra. Silvana dos Santos Meyrelles – UFES
__________________________________
Dr. José Geraldo Mill
Coordenador do PPGCF - UFES
Vitória, 25 de Setembro de 2006.
Às minhas filhas:
Isabella, minha amada primogênita que, desde pequenina, participou dos
meus momentos de alegrias e ansiedades me dando força com uma
maturidade que já não mais me surpreende...
Julia, nossa doçura que teve que dividir com a produção desta tese, as
mamadas e toda a atenção que um bebê necessita...
Ao meu amado esposo Airton:
Que sempre foi o meu maior incentivador, desde antes do vestibular,
durante a graduação, a especialização, mestrado e doutorado.
Ofereço-lhes esta vitória por tudo que vocês sempre foram e são para
mim.
Ao Meu pai, Antônio de Lisboa Pontes (in memoriam), por ter sempre
vibrado a cada conquista na minha vida, por mais simples que fosse... À
minha mãe, Maria José Mendes Pontes, guerreira e grande educadora,
cujo principal objetivo foi oferecer meios para preparar seus seis filhos
para a vida, sobretudo a espiritual e
profissional. Aos meus amados
irmãos Socorro, Rossano, Ana, George e Teonas por sempre me
apoiarem e torcerem por mim.
Agradecimentos Especiais:
Ao Professor Vasquez,
Por ter me dado a oportunidade de trabalharmos
juntos e por tantos ensinamentos. Por termos
partilhado os prêmios que esse trabalho recebeu. E
pela confiança que sinto que deposita em mim.
Guardarei o seu nome em meu coração como meu
grande mestre científico.
À Silvana Meyrelles,
Obrigada pelas sugestões sempre pertinentes e por
me receber em seu laboratório e a compartilhar
comigo animais tão preciosos.
Agradecimentos
Aos amigos do Labotatório de Transgenes e Controle Cardiovascular: Adriana, amiga
sincera, Ágata, obrigada pelas medidas de P.A, Breno, obrigada pela sua amizade e
por ter sido sempre como um irmão para mim, Clarisse, obrigada por estar sempre
pronta a ajudar, Camile, Débora, Giovana, Lídia, Maíne, Michely, Thiago e Verônica
pela amizade e pelas discussões (científicas ou não) que sempre nos faz crescer.
À professora Nazaré Bissoli, por discutir meus dados com tanta paciência sempre que a
procurei.
À amiga Raquel Binda, por ter estado pronta a ajudar me ensinando a usar o programa
Prisma quando tanto precisei.
À amiga Simone Bazzarela, pela amizade verdadeira e pelos bebedouros dos nossos
animais.
Aos professores Dalton, Ivanita e Ian por estarem sempre dispostos a ajudar no que
precisei.
Aos colegas, professores e aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em
Ciências Fisiológicas.
À Profa. Dra. Jacqueline Isaura Alvarez Leite, do Departamento de Bioquímica e
Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade do Estado de Minas
Gerais (UFMG), a qual contribuiu com as ferramentas principais deste estudo, os
camundongos ApoE Knockout.
O segredo é não correr atrás das borboletas...
É cuidar do jardim para que elas venham até você.
Mário Quintana
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 1-
Mecanismos angiotensina-dependentes ativados pela estenose
da artéria renal unilateral (rim clipado).
25
Figura 2- Fotografia da aorta, coração e rins de um camundongo C57
28 dias após o implante do clipe na artéria renal
32
Figura 3- Fotografia do clipe de aço inox e dos rins clipado e não clipado
isolados
32
Figura 4- Em (A) fotografia de um camundongo C57BL/6 canulado. Em
(B), observa-se o registro da PAM
34
Figura 5- Em (A), camundongo laparotomizado. Em (B), visualiza-se a
artéria mesentérica superior em maior aumento e em (C),
fotografia da artéria mesentérica canulada
37
Figura 6-
Representação esquemática dos protocolos para as Curvas
Concentração Efeito à NE, à ACh e ao NPS
37
Tabela 1- Peso corporal, PAM e níveis de Colesterol plasmático nos
grupos de camundongos C57 e ApoE
50
Figura 7-
Representação dos registros típicos de pressão de perfusão
obtidos das CCE ao vasoconstritor NE dos camundongos
Sham e 2R1C das duas linhagens estudadas
50
Figura 8-
Curvas concentração efeito à NE, mostrando a variação da
pressão de perfusão em mmHg, em artérias mesentéricas de
camundongos C57 e ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal
51
(2R1C) ou sham operado (Sham).
Figura 9- Representação dos registros típicos de pressão de perfusão
obtidos das CCE ao vasodilatador dependente do endotélio
ACh dos camundongos Sham e 2R1C das duas linhagens
estudadas
52
Figura 10-
Curvas concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) ou Sham operado (Sham)
53
Figura 11-
Representação dos registros típicos de pressão de perfusão
obtidos das CCE ao vasodilatador independente do endotélio
NPS dos camundongos Sham e 2R1C das duas linhagens
estudadas
54
Figura 12-
Curva concentração efeito ao NPS em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) ou sham operado (Sham)
55
Figura 13-
Curvas concentração efeito à NE, mostrando a pressão de
perfusão em mmHg, em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) ou sham operado (Sham) tratadas com tempol
56
Figura 14-
Curva concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de
camundongos C57 e ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) ou sham operado (Sham) tratadas com tempol
57
Figura 15-
Curvas concentração efeito à NE em artérias mesentéricas de 58
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) tratadas com L-NAME + Indo
Figura 16-
Curva concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de
camundongos C57 e ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) tratadas com L-NAME + Indo
59
Figura 17-
O gráfico acima representa a média das respostas máximas de
mesentéricas de camundongos C57 28 dias após o clipe da
artéria renal (2R1C) ou sham operado (Sham) e C57 2R1C
tratado com tempol ou com L-NAME + Indo
60
Figura 18-
O gráfico acima representa a média das respostas máximas ao
vasodilatador ACh em artérias mesentéricas de camundongos
C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham
operado (Sham) e C57 2R1C tratado com tempol ou com L-
NAME + Indo
61
Figura 19-
O gráfico acima representa a média das respostas máximas de
pressão de perfusão ao vasoconstritor NE em artérias
mesentéricas de camundongos ApoE 28 dias após o clipe da
artéria renal (2R1C) ou sham operado (Sham) e C57 2R1C
tratado com tempol ou com L-NAME + Indo
62
Figura 20-
O gráfico acima representa a média das respostas máximas ao
vasodilatador ACh em artérias mesentéricas de camundongos
ApoE tratados com tempol ou com L-NAME + Indometacina.
63
Lista de Abreviaturas
ApoE – Apolipoproteína E
C57 – Linhagem de camundongos isogênicos (C57BL/6)
ApoE
-/-
- Camundongo Knokout para a apoE
EDRF – Fator relaxante derivado do endotélio
EDHF - Fator hiperpolarizante derivado do endotélio
PGI2 - Prostaciclina
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido nítrico sintase
SOD – Superóxido dismutase
NE - Norepinefrina
NPS – Nitroprussiato de sódio
ACh - Acetilcolina
Log - Logarítmo
2R1C – 2 rins e 1 clipe
ECA – Enzima conversora de angiotensina
ANG II – Angiotensina II
AT1 – Receptor AT1 da angiotensina
HDL – Lipoproteína de alta densidade
LDL – Lipoproteína de baixa densidade
L- NAME – N
w
-nitro-L-arginina metil ester
EDTA - Etileno diamino tetracético
mmHg – Milímetros de mercúrio
CCE – Curva concentração efeito
M - Molaridade
O
2
-
- Radical superóxido
INDO - Indometacina
EC
50
– Concentração na qual se obtém a metade da resposta máxima
RM – Resposta máxima
EPM – Erro Padrão da média
PAM – Pressão arterial média
PAP – Pressão arterial pulsátil
∆ - Variação
FC – Freqüência cardíaca
I.P – Intraperitoneal
I.M. – Intra muscular
AVC – Acidente vascular cerebral
SUMÁRIO
Dedicatória
Agradecimentos
Lista de Figuras
Lista de Abreviaturas
RESUMO
ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO 20
1.1. Camundongos ApoE Knockout e Aterosclerose 21
1.2. Apolipoproteína E (ApoE) 22
1.3. Fisiopatologia da Hipertensão Renovascular (2R1C) 22
1.4. Correlação Entre Hipertensão Arterial, Aterosclerose e Endotélio
Vascular
25
1.5. Endotélio e Estresse Oxidativo 28
2. OBJETIVOS 32
2.1. Objetivos Gerais 32
2.2. Objetivos Específicos 32
3. METODOLOGIA 33
3.1. Animais 33
3.2. Grupos Experimentais 33
3.3. Hipertensão Renovascular 33
3.4. Medidas Hemodinâmicas 36
3.5. Medida dos Níveis de Colesterol Plasmático 38
3.6. Preparação do Leito Arteriolar Mesentérico 38
3.7. Curvas Concentração Efeito (CCE) 41
3.7.1. Protocolos do Estudo de Reatividade Vascular 41
3.8. Avaliação das alterações de sensibilidade 46
3.9. Avaliação das alterações de resposta máxima 46
3.10. Drogas Utilizadas 46
3.11. Análise Estatística 46
4. RESULTADOS 48
4.1. Pressão Arterial Média e Colesterol Plasmático 48
4.2. Reatividade Vascular 48
5. DISCUSSÃO 66
6. CONCLUSÕES 74
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÄFICAS 77
8. ANEXOS
8.1. Artigos Publicados
8.2. Prêmios
Resumo
Evidências na literatura demonstram que a função endotelial vascular está
comprometida na aterosclerose e na hipertensão arterial e que a angiotensina é um
importante fator que está implicado na fisiopatologia de ambas. O objetivo deste estudo
foi avaliar a função vascular em modelo de hipercolesterolemia/aterosclerose e de
hipertensão dependente de angiotensina II, 2-rins 1-clipe (2R1C). Neste trabalho
também foi estudada a associação destas duas condições e os possíveis mecanismos
envolvidos. Camundongos knockout para a apolipoprotein E (ApoE, n=20) de 8
semanas de idade e C57BL/6 (C57, n=20) submetidos a hipertensão 2R1C ou falso
operados (sham) foram estudados após 28 dias de cirurgia para implantação do clipe
para obtenção de estenose da artéria renal. A pressão arterial média foi maior nos
ApoE-2R1C comparada aos controles ApoE-Sham (126±3 vs. 103±2 mmHg, p<0.05) e
também maior nos C57-2R1C comparados aos C57-Sham (128±3 vs. 104±2 mmHg,
p<0.05). A reatividade vascular à norepinefrina (NE), acetilcolina (ACh) e ao
nitroprussiato de sódio (NPS) foram avaliadas no leito arteriolar mesentérico. NE
causou hiperreatividade vascular em ApoE-Sham, ApoE-2R1C e C57-2R1C que
apresentaram respostas máximas: (146±5, 144±5 e 159±4 mmHg, respectivamente)
comparado aos C57-Sham (122±7 mmHg, p< 0.05). O relaxamento máximo induzido
pela ACh foi menor (p<0.05) em ApoE-2R1C e C57-2R1C (53±3% e 46±3%)
comparado aos controles ApoE-Sham and C57-Sham (78±5% and 73±4%). O
relaxamento vascular máximo ao NPS foi menor (p<0.05) em ApoE-2R1C and C57-
2R1C (84±2% e 83±3%) comparado ao grupo sham (91±1% e 94±1%). O tratamento
dos camundongos 2R1C com tempol não resultou em melhora na vasodilatação
induzida pela acetilcolina, por outro lado, este mimetico da SOD restaurou a resposta à
NE em camundongos ApoE Sham ao nível comparado aos C57 Sham. Um aumento na
reatividade à NE e redução da sensibilidade à ACh foram observadas em microvasos
dos ApoE 2R1C (L-NAME + INDOMETACINA) comparados aos ApoE 2R1C cujos
mesentérios foram tratados com inibidor da NOS (L-NAME) juntamente com
indometacina, um inibidor da cicloxigenase. Podemos concluir, com os presentes dados
que a hipereatividade à NE e a diminuição do relaxamento dependente do endotélio
podem estar contribuindo para a manutenção da hipertensão. Os camundongos ApoE,
na fase inicial da aterosclerose, apresentam hipereatividade à NE, mas não
apresentam ainda disfunção endotelial. Entretanto, a associação de aterosclerose e
hipertensão não resulta em efeito aditivo sobre a função vascular. Nossos dados
também sugerem que a resposta endotelial à ACh, em ambas linhagens estudadas é
dependente de outro fator endotelial diferente do NO e PGI
2
. Este fator pode ser o
EDHF, uma vez que bloqueando-se o efeito desses, permanece havendo resposta
relaxante. Podemos sugerir ainda que a resposta ao vasoconstritor NE, em animais
ApoE hipertensos é também mediada por NO e/ou PGI
2
, já que ao bloqueá-los,
observamos aumento da responsividade a este agente
.
Abstract
It is well known that endothelial function is compromised in atherosclerosis and arterial
hypertension and that angiotensin is an important factor contributing to both
pathophysiologies. The aim of this study was to evaluate the vascular function in a
model of hypercholesterolemia/atherosclerosis, in the angiotensin II-dependent 2-kidney
1-clip (2K1C) model of hypertension, and when both conditions are associated and
which mechanisms could involved. Eight weeks old apolipoprotein E knockout (ApoE,
n=20) and C57BL/6 (C57, n=20) mice underwent 2K1C or sham-operation and were
studied 28 days later. Mean arterial pressure was higher in ApoE-2K1C than in ApoE-
Sham (126±3 vs. 103±2 mmHg, p<0.05) and also higher in C57-2K1C than in C57-
Sham (128±3 vs. 104±2 mmHg, p<0.05). The vascular reactivity to norepinephrine (NE),
acetylcholine (ACh) and sodium nitroprusside (SNP) was evaluated in the mesenteric
arteriolar bed. NE caused vascular hyperreactivity in ApoE-Sham, ApoE-2K1C and C57-
2K1C (146±5, 144±5 and 159±4 mmHg, respectively) compared to C57-Sham (122±7
mmHg, p< 0.05). The maximum relaxation induced by ACh was smaller (p<0.05) in
ApoE-2K1C and C57-2K1C (53±3% and 46±3%) than in ApoE-Sham and C57-Sham
mice (78±5% and 73±4%). The maximal vascular relaxation to SNP was smaller
(p<0.05) in ApoE-2K1C and C57-2K1C (84±2% and 83±3%) than in the sham groups
(91±1% and 94±1%). Treatment of 2K1C mice with tempol did not improve the
acetylcholine-induced vasodilation. On the other hand, this SOD mimetic decreased the
response to NE in ApoE Sham mice to a level comparable to C57 Sham mice. An
increased reactivity to NE and reduced sensitivity to ACh were observed in microvessels
from ApoE 2K1C mice compared to ApoE 2K1C mice treated with NOS inhibitor L-
NAME and indometacine, a cycloxygenase inhibitor. We conclude that the increased
reactivity to NE and the decreased endothelium-dependent relaxation to ACh contribute
to the maintenance of hypertension. The ApoE mouse, at early stages of
atherosclerosis, show hyperreactivity to NE but not endothelium dysfunction yet.
However, the association of atherosclerosis and hypertension does not result in additive
effects on the vascular function. Our data also suggest that endothelial response to ACh
in both strains is dependent of other endothelial factor than NO and PGI
2
. This factor
could be the EDHF. The hyperesponsiviness to NE in ApoE hypertensive mice seems to
be mediate by NO and/or PGI
2.
1 – Introdução
A aterosclerose é uma doença progressiva caracterizada por acúmulo de lipídios e
elementos fibrosos na camada íntima das artérias. Nas últimas décadas numerosos
estudos têm sido feitos em diferentes modelos animais de aterosclerose. Grande
número desses estudos se utiliza da engenharia genética para a produção de modelos
de camundongos geneticamente modificados para a pesquisa da aterosclerose e de
outras doenças. O uso de camundongos oferece vantagens pela disponibilidade de
linhagens híbridas, novas informações genéticas, novos recursos e ferramentas
biológicas e também pelo pequeno tamanho, o que facilita o uso de grande número de
animais ao mesmo tempo
1
.
As investigações sobre como os genes controlam o desenvolvimento e a função das
células dos vários sistemas data do início deste século. Com os avanços da biologia
molecular o camundongo tornou-se poderoso instrumento de investigação. Embora os
genes também possam ser manipulados em ratos, as particularidades metodológicas
que permitem interferir nas células embrionárias pluripotentes (embrionic stem cells),
conferem ao camundongo propriedades exclusivas
2
. As células embrionárias
pluripotentes são originárias da massa celular do blastocisto do camundongo,
participando da formação do embrião quando injetadas em mórulas, permitindo a
formação de embriões contendo o transgenes desejado. Para a obtenção de um alelo
nulo (knockout), o gene endógeno de interesse e trocado por uma construção com uma
mutação específica, interrompendo assim a expressão do gene
2
.
1.1. Camundongos ApoE Knockout e Aterosclerose
Por várias décadas, a disponibilidade de novas ferramentas de investigação foram
desenvolvidas, incluindo modelos de camundongos modificados geneticamente,
resultando em aparente entendimento do processo aterosclerótico. O modelo murino
para a deficiência da apolipoproteína E (ApoE
-/-
) foi desenvolvido por Piedrahita et al
(1992) e Zhang et al (1992), com o objetivo de aumentar o entendimento da
hipercolesterolemia e aterosclerose humana. Camundongos homozigóticos knockout
para a apolipoproteina E (ApoE
-/-
) desenvolvem acentuada hipercolesterolemia e
aterosclerose espontânea
2, 3
. A apolipoproteína E (ApoE) é uma lipoproteína
constitutiva de muito baixa densidade sintetizada pelo fígado que medeia ligação de
alta afinidade com os receptores das lipoproteínas de baixa densidade (LDL), sendo
então responsável pela captação celular dessas partículas
3
. Neste modelo
experimental, a disfunção endotelial tem sido reportada sob uma dieta rica em
colesterol (Western-type cholesterol rich diet)
4-6
, mas não sob uma dieta normal
(normal chow diet)
7
.
O camundongo ApoE knockout já nasce hipercolesterolêmico, apresentando níveis de
colesterol plasmático 5 a 6 vezes maior que os camundongos isogênicos controles
C57BL/6, mesmo sob dieta normal
2, 3, 8
. Esses animais desenvolvem um tipo de
aterosclerose genética muito semelhante à hiperlipidemia tipo III que ocorre em
humanos, tornando esse modelo experimental o mais utilizado atualmente nos estudos
da evolução do processo aterosclerótico, assim como na aterosclerose estabelecida
3
.
1.2. Apolipoproteína E
A ApoE é uma proteína carreadora que se combina com lipídios para formar partículas
de lipoproteínas. São várias as classes de lipoproteínas, numa faixa que varia com a
densidade, desde lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), a lipoproteína de
muito alta densidade (VHDL). Existem nove tipos diferentes de apolipoproteínas que
são encontradas no plasma sanguíneo em humanos e podem atuar como sinalizadores
em tecidos ou ativando enzimas
9
.
A ApoE tem muitas funções no organismo. Quando esta é sintetizada pelo fígado como
parte do VLDL, funciona no transporte de triglicérides para o fígado. Ela também é
incorporada ao HDL (como HDL-E), cumprindo importante papel na distribuição de
colesterol entre as células, além de ser incorporada aos quilomícrons intestinais,
atuando no transporte dos triglicérides e colesterol da dieta. Trata-se, portanto, de uma
proteína diretamente envolvida com o metabolismo lipídico por mediar a ligação do LDL
ao seu receptor.
10
É bem estabelecido que a ApoE seja uma molécula ateroprotetora. Também foi
demonstrado que a ApoE apresenta função protetora no rim de camundongos
regulando de maneira autócrina a expansão ou proliferação mesangial e a função renal,
com isto, a falta de ApoE contribui para o aumento da proliferação mesangial e acúmulo
de matriz
11
.
1.3. Fisiopatologia da Hipertensão Renovascular (2R1C)
A hipertensão, no modelo experimental dois rins, um clipe (2R1C), é obtida pela
produção de estenose unilateral da artéria renal através do implante de um clipe
12
. A
estenose não é tão significante a ponto de causar isquemia, entretanto a pressão de
perfusão renal é reduzida, aumentando a síntese e liberação de renina pelo rim clipado.
A renina cliva a angiotesina I a partir do angiotensinogênio e a enzima de conversão da
angiotensina atua sobre a angiotensina I para produzir a angiotensina II. A ANG II via
seus efeitos vasculares diretos, agudamente aumenta a resistência periférica total e
aumenta a pressão sanguínea, além de atuar em vários sistemas orgânicos. Muitas
dessas ações contribuem para aumento da resistência vascular periférica e da pressão
arterial, bem como respostas proliferativas em longo prazo. Com o aumento progressivo
na pressão sanguínea, a pressão de perfusão e o fluxo para o rim clipado são
restaurados. No rim contralateral não clipado, submetido a elevações progressivas de
pressão arterial, passa a não mais liberar renina
13
e seria esperado um aumento da
excreção de sódio devido ao fenômeno de natriurese pressórica. Como um rim normal é
suficiente para manter o balanço hidro salino e a pressão arterial normais, o mistério da
hipertensão no modelo 2R1C reside na inabilidade do rim presumivelmente normal inibir
o desenvolvimento de hipertensão. Nesse contexto fica patente que o rim normal não
clipado claramente não é o fator causal, já que ele falha em reagir com a resposta
natriurética apropriada para inibir a hipertensão. A cascata de eventos iniciada pelo
aumento da secreção de renina a partir do rim clipado levando ao aumento de
angiotensina II circulante é responsável pela inibição da produção de renina pelo rim
não clipado. A redução da habilidade de sintetizar renina é claramente refletida pela
redução dos níveis de RNAm para renina
14
encontrados no rim não clipado. Em adição,
a depleção de renina e a redução do RNAm para renina no rim não clipado tem sido
geralmente interpretado como indicador de que a atividade do sistema renina
angiotensina intra renal é bastante diminuída no rim não clipado. Os efeitos diretos e
indiretos do aumento da concentração de angiotensina II circulante resultam em maior
produção de aldosterona no córtex adrenal, aumentando mais ainda a atividade do
sistema nervoso simpático e contribuindo para o prejuízo da excreção do rim não
clipado
15
,
16, 17
. O nível elevado de angiotensina II intrarenal no rim não clipado mostra
que há acúmulo de angiotensina II circulante no rim e/ou mecanismos de produção de
angiotensina II alternativos e que não dependem de renina, como por exemplo, as
quimases, catepsina A, G e D e tonina
13
.
Portanto, a hipertensão renovascular 2R1C é sustentada por valores elevados de
angiotensina II, não a circulante, mas sim a angiotensina II intrarenal no rim não
clipado. E como conseqüência funcional, é a angiotensina II intrarenal elevada que vai
ser a responsável por alterar a reabsorção tubular, que se apresenta aumentada, e a
função hemodinâmica, nesse modelo experimental, sustentando assim a hipertensão
arterial
13
. Além disso, não podemos esquecer dos sistemas renina-angiotensina locais,
os quais atuam diretamente no sistema cardiovascular como coração e vasos
sanguíneos
18
, aumentando ainda mais os efeitos da angiotensina II.
O desenvolvimento da hipertensão renovascular (2R1C) tem sido amplamente
estudada em ratos
19-21
. Recentemente, tem-se estudado em camundongos
22-28
. Além
disto, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e
manutenção da hipertensão renovascular em modelos hipercolesterolêmicos.
1.4. Correlação Entre Hipertensão Arterial, Aterosclerose e Endotélio Vascular
A hipertensão arterial e a aterosclerose são doenças multifatoriais conhecidas como
causas importantes de eventos cardiovasculares. Essas condições fisiopatológicas são
caracterizadas por disfunção endotelial
29, 30
e a Ang II é vista como um importante fator
contribuidor.
31
Somado a isto, a literatura tem mostrado comprometimento da função
endotelial em humanos e modelos animais de hipertensão e aterosclerose, porém
pouco se sabe sobre a função endotelial de microvasos no modelo hipercolesterolêmico
ApoE
-/-
. Por outro lado, não há relatos na literatura de estudos da função endotelial em
microvasos de camundongos hipercolesterolêmicos com hipertensão renovascular.
A hipertensão arterial tem sido associada com alterações da função endotelial e da
reatividade das células do músculo liso vascular a agentes contráteis.
32
Por outro lado,
a hipertensão arterial induzida por Ang II endógena ou administrada agrava o processo
aterosclerótico em camundongos ApoE knockout.
27, 33, 34
Além disso, há verificações de
que o sistema renina-angiotensina está implicado na patogênese da aterosclerose
35-37
e
também tem importante papel no desenvolvimento e manutenção da hipertensão
renovascular (2R1C),
13
justificando a avaliação da função vascular em um modelo de
aterosclerose associada com hipertensão renovascular
38
.
A aterosclerose é uma das causas mais importantes e comuns de morte e incapacidade
no mundo cujas manifestações são decorrentes de significantes eventos
cardiovasculares. Trata-se de uma doença sistêmica com importantes taxas de morbi -
mortalidade, atribuídas principalmente ao infarto agudo do miocárdio e acidentes
vasculares cerebrais. A redução no suprimento sanguíneo também pode ocorrer nos
rins, mesentério e membros inferiores, causando distúrbios importantes nesses
territórios
39
.
O desenvolvimento da aterosclerose envolve vários processos altamente inter-
relacionados, incluindo distúrbios lipídicos, ativação plaquetária, trombose, disfunção
endotelial, inflamação, estresse oxidativo, ativação das células do músculo liso
vascular, alteração do metabolismo de matriz, remodelamento e fatores genéticos
30
.
Esses processos são os mesmos na doença aterosclerótica periférica e em todos os
leitos vasculares, o que a caracteriza como uma doença sistêmica. No entanto, a taxa
de desenvolvimento e progressão da doença são variáveis e a ativação plaquetária e a
trombose são reconhecidas como importantes componentes das manifestações clínicas
da aterosclerose. A trombose ocorre em sítios de ruptura de placa, sendo considerada
um dos principais eventos nas síndromes coronárias agudas e nos eventos cérebro-
vasculares
39
.
A vasodilatação dependente do endotélio está prejudicada em humanos e também é
observada em animais com hipertensão
38
. Os mecanismos propostos incluem:
alteração da atividade da óxido nítrico sintase (NOS)
40
, aumento da produção de
prostanóides vasoconstritores derivados do endotélio e endotelinas
41
, aumento da
geração/disponibilidade de ânions superóxido
42
e diminuição da influência do fator
hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF)
43
. Observa-se também que ocorre
diminuição do relaxamento dependente do endotélio na hipercolesterolemia e na
aterosclerose
44
. Numerosos estudos têm demonstrado que a hipercolesterolemia está
associada com defeitos da função endotelial via NO, incluindo o modelo animal
geneticamente dislipidêmico ApoE
-/-
que é deficiente em apolipoproteína E
45
, porém
pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nesta disfunção e não há relatos
na literatura em microvasos destes animais.
O óxido nítrico (NO) é um potente vasodilatador e tem um papel chave no controle do
sistema cardiovascular
46
. O NO é formado nas células endoteliais a partir da L-arginina
por oxidação do seu nitrogênio-guanidina terminal
47
e requer NADPH, (6R)-5,6,7,8-
tetrahidrobiopterina (BH4) e outros como cofatores. A formação do NO ocorre via NO-
sintase endotelial (NOSe), a qual é expressada constitutivamente
48, 49
. O relaxamento
em resposta à liberação do NO derivado do endotélio está associado com estímulo da
guanilato ciclase solúvel (GCs) e a formação de monofosfato de guanosina cíclico
(GMPc) nas células do músculo liso vascular
49
. A enzima NOS induzível (NOSi) pode
ser expressada nas células do músculo liso vascular, endotélio e macrófagos. A
atividade desta enzima é Ca
++
-independente e ela produz grandes quantidades de NO;
esta enzima é induzida por citocinas tais como a interleucina e o fator de necrose
tumoral (TNF) que são ativados na aterosclerose e no processo inflamatório
50-53
. O
BH4 é um cofator essencial requerido para a atividade de todas as isoformas de NOS
48-56
.
Durante a ativação da NOS, o BH4 é necessário para a ativação alostérica e redox
50-53
.
O BH4 é um cofator essencial requerido para a atividade de todas as isoformas de NOS
48-57
. Evidências sugerem que alterações na via do NO, tais como aumento da sua
decomposição por ânions superóxido (O
2
-
) ou alterações na expressão da NOS têm um
papel importante na disfunção endotelial induzida por hipercolesterolemia
58
. Estas
evidências são de grande importância porque o NO pode inibir vários componentes do
processo aterogênico, tais como a contração e proliferação das células do músculo liso
vascular, a agregação plaquetária e a adesão de monócitos
59, 60
.
Pouco se conhece sobre os efeitos da associação da hipertensão renovascular com a
hipercolesterolemia no modelo ApoE
-/-
e menos ainda são conhecidos os mecanismos
envolvidos numa posssível alteração da função vascular nestes animais.
1.5. Endotélio e Estresse Oxidativo
O endotélio vascular apresenta importante papel no controle do tônus do músculo liso
vascular via síntese e liberação de várias substâncias vasodilatadoras, incluindo o fator
relaxante derivado do endotélio (EDRF), EDHF e prostaciclina. EDRF, identificado como
NO
61-63
, induz relaxamento do músculo liso vascular por ativação da guanilato ciclase
solúvel
64-71
e a produção do monofosfato de guanosina (cGMP)
55, 72
. Os efeitos
vasculares do NO podem também ser mediados por ativação direta dos canais de
potássio
72-75
.
A identidade química do EDHF permanece ainda não bem definida e este fator
hiperpolariza o músculo liso vascular por abertura dos canais de K+ mediando
vasodilatação
76-80
. O EDHF tem importante papel em modular o tonus do músculo liso
vascular, especialmente em microvasos
80
. Nenhum estudo foi feito para investigar a
participação do EDHF em microvasos de camundongos ApoE
-/-
. Vários candidatos a
EDHF têm sido propostos, incluindo os metabólitos de citocromo P450
81, 82
íons
potássio
83, 84
e junções “gap” de comunicações elétricas
85, 86
. A prostaciclina, derivada
do ácido araquidônico, através da cicloxigenase
87, 88
, induz vasodilatação por aumento
da produção de monofosfato de adenosina cíclico
64
(cAMP)
89
levando a
hiperpolarização da membrana. Em adição aos fatores relaxantes, o endotélio vascular
também libera fatores contráteis dependentes da cicloxigenase tais como
prostaglandina H2 e tromboxano A2
87, 90
. O endotélio também modula a resposta
contrátil através da liberação de fatores relaxantes. Vários estudos têm mostrado que a
remoção endotelial aumenta a resposta a vários agentes contráteis, indicando que este
tem um papel inibidor na função contrátil do músculo liso vascular
91-94
.
A disfunção endotelial é preditiva de risco cardiovascular e tem papel importante na
fisiopatologia da aterosclerose e suas complicações
71
. Muitas evidências mostram que
o estresse oxidativo desempenha papel chave na fisiopatologia de várias doenças
cardiovasculares. Tanto na aterosclerose como na hipertensão, a expressão de ânions
superóxido está aumentada nos vasos sanguíneos e a função vasomotora está
prejudicada, causada principalmente pela inativação do NO por superóxido. Vários
estudos, têm demonstrado em camundongos hipercolesterolêmicos e em humanos
idosos, altos níveis de radicais superóxido na aorta. Enzimas antioxidantes,
especialmente as três isoformas da superóxido dismutase (SOD), modulam os níveis
basais de superóxido e protegem contra a disfunção vasomotora
71
. Tem sido
demonstrado que na infusão de ANG II, assim como na hipertensão renovascular a
disfunção endotelial é mantida pela produção aumentada de radicais superóxido por
meio da ativação da NADPH oxidase
17, 95
.
Tem sido mostrado em vários estudos que antioxidantes, vitamina C ou vitamina E,
reduziram o estresse oxidativo
11, 96, 97
e aumentaram o vasorelaxamento mediado pelo
NO derivado do endotélio
98, 99
. Em adição, a vitamina C aumentou a vasodilatação de
artérias de resistência do antebraço em humanos com hipercolesterolemia
100
, fumantes
crônicos,
95
hipertensão essencial,
101
e com doença arterial coronária
102, 103
. Os
mecanismos moleculares que explicam os efeitos antioxidantes da vitamina C in vivo
não são completamente entendidos, mas recentes verificações em cultura de células
endoteliais indicam que a vitamina C pode aumentar a atividade enzimática por
estabilização química do BH4
104-106
.
O óxido nítrico tem sido implicado na proteção contra a aterosclerose através da
redução do estresse oxidativo, inflamação, proliferação e agregação plaquetária.
107, 108
.
Embora o camundongo ApoE
-/-
seja um modelo genético muito semelhante à
hiperlipidemia tipo III que ocorre em humanos e apesar de ter se tornado o modelo mais
utilizado atualmente nos estudos da evolução do processo aterosclerótico
3
, ainda são
poucos os estudos que demonstram os efeitos da hipercolesterolemia e da
aterosclerose sobre os mecanismos envolvidos na regulação vascular, além de não ter
nenhum estudo em microvasos desses animais, sobretudo quando associados com a
hipertensão renovascular 2R1C. Portanto, o principal questionamento do presente
trabalho é:
Como estaria funcionando a reatividade vascular e principalmente o endotélio vascular
quando há a combinação de duas fisiopatologias tais como a aterosclerose e a
hipertensão arterial?
2. Objetivos
2.1. Geral
Avaliar a reatividade vascular e a função endotelial em camundongos
ateroscleróticos ApoE knockout e isogênicos C57, assim como nestes animais
com hipertensão renovascular.
2.2. Específicos
Avaliar os mecanismos envolvidos nas alterações de reatividade vascular e na
função endotelial destes animais através:
Da investigação do envolvimento dos radicais superóxido na disfunção
endotelial;
Da participação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) na
resposta endotelial de camundongos ateroscleróticos e hipertensos;
Da investigação do envolvimento dos radicais superóxido na resposta ao
vasoconstritor NE e doador de NO (NPS) em ambas fisiopatologias.
3. Metodologia
3.1. Animais
Todos os experimentos foram realizados em camundongos jovens de 8 semanas de
idade, de aproximadamente 23 g, machos C57BL/6 (C57) and ApoE obtidos do
Laboratório de transgenes e Controle Cardiovascular do Programa de Ciências
Fisiológicas da Universidade Federal do Espírito Santo. Os animais foram alimentados
com dieta normal e água ad libitum. Todos os procedimentos foram usados de acordo
com as diretrizes nacionais e internacionais para o uso de animais em laboratório.
3.2. Grupos Experimentais
Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais:
C57BL/6 – Controles
ApoE knockout (ApoE
-/-
) – Hipercolesterolêmicos
E estes foram ainda subdivididos em:
Normotensos – Controles sham
Hipertensos – 2R1C
3.3. Obtenção da Hipertensão Renovascular Experimental (2 Rins – 1 Clipe)
Os animais foram anestesiados com uma mistura de Ketamina (91 mg/Kg) e xilasina
(9,1 mg/Kg) i.p. Após laparotomia e com o auxílio de uma lupa cirúrgica (Opto eletrônica
S/A Sn – 2002, São Carlos, SP), o rim esquerdo era exposto. A artéria renal esquerda
era cuidadosamente isolada, e um clipe de aço inox de 0,12 mm de abertura (3x2x1
mm com 2 mm de comprimento e 0.12 mm de abertura, Exidel Suiça), desenvolvido
especificamente para camundongos, era implantado, próximo à aorta abdominal
provocando estenose arterial semelhante àquela observada em humanos com
hipertensão renovascular. Nestes animais era administrada uma dose do antibiótico
penicilina (100 UI, Eurofarma LTDA, São Paulo, SP), após a reacomodação do rim na
cavidade retroperitoneal e sutura da incisão lateral. A hipertensão renovascular (2R1C)
foi produzida em camundongos C57 (9) e ApoE (10). Estes animais eram estudados 28
dias após a cirurgia. O grupo Sham operado C57 (9) e ApoE (10), animais
normotensos, foram submetidos aos mesmos procedimentos cirúrgicos acima, exceto
pela não colocação do clipe na artéria renal.
A temperatura corporal era controlada por uma manta térmica regulada para manter a
temperatura em torno de 37ºC. Os animais eram mantidos em gaiolas individuais , com
livre acesso a água e ração, ciclo de 12 horas claro/escuro, temperatura e umidade
controladas em 22±2ºC e 70%, respectivamente.
A
B
Figura 2 – Fotografia da aorta,
coração e rins de um
camundongo C57 28 dias após o
implante do clipe na artéria renal.
A seta indica o clipe de aço inox
na artéria renal esquerda.
Observa-se também o rim
esquerdo isquêmico e
contralateralmente o rim direito
hipertrofiado.
Figura 3 – Em (A) Fotografia do clipe
usado para camundongos, à direita,
comparado com o clipe usado em
ratos, à esquerda. Em (B), fotografia
dos rins clipado, à direita e não
clipado, à esquerda, isolados, após 28
dias do procedimento cirúrgico.
↓
3.4. Medidas Hemodinâmicas
Vinte e oito dias após as cirurgias, os camundongos eram anestesiados com
ketamina/xilasina (91.0/9.1 mg/kg, i.p) e cateteres de 4cm de comprimento (Micro-
Renathane, Braintree Science USA) e .040mm de diâmetro externo x .025mm de
diâmetro interno, submetidos à redução do diâmetro para aproximadamente 0,22 a
0,25mm por meio de aquecimento, foram inseridos na artéria carótida direita para
registros de pressão arterial pulsátil (PAP) e pressão arterial média (PAM). Previamente
aos implantes dos cateteres, esses foram preenchidos com solução de NaCl 0,9%
heparinizada (50 UI) e obstruídos com pinos de metal. Os cateteres foram
exteriorizados na nuca dos animais com auxílio de um trocater (figura 3A).
Posteriormente a incisão era suturada e o antibiótico penicilina (100 UI) era
administrado i.m. As medidas foram realizados nos animais acordados, movimentando-
se livremente 48 h após a canulação. Para o registro da pressão arterial, o catéter
arterial foi acoplado a um transdutor de pressão (Cobe Laboratories, Lakewood, CO,
USA) conectado a um pré-amplificador de um sitema de aquisição de dados (Biopac
Systems, Santa Barbara, CA, USA) e depois os dados eram processados através do
Acknoledgent V.3.7. (figura 3B).
A
B
Figura
4
- Mostra em (A) fotografia de um camundongo C57BL/6 canulado com
cateter arterial exteriorizado na nuca para o registro da pressão arterial. Em (B),
observa-se o registro da pressão arterial e frequência cardíaca.
3.5. Medida dos Níveis de Colesterol Plasmático
Amostras de sangue foram coletadas da artéria carótida de todos os grupos
experimentais ao final das medidas hemodinâmicas e o colesterol plasmático total foi
medido usando-se um kit colorimétrico obtido comercialmente (Bioclin, Brazil).
3.6. Preparação do Leito Arteriolar Mesentérico
As preparações foram isoladas segundo a técnica descrita por McGREGOR em 1965.
Os animais foram anestesiados com tiopental sódico (40mg/Kg) por via I.p. Após
laparotomia, a artéria mesentérica superior foi canulada com cateter (Micro-Renathane,
Braintree Science USA) e o mesentério foi dissecado das alças intestinais, evitando-se
estiramento excessivo, para evitar qualquer tipo de lesão, e imediatamente perfundido
em solução nutridora de Krebs modificado numa perfusão constante de 2 ml/min,
gaseificada com mistura carbogênica (95% O
2 e 5% CO
2
), mantida a 37 ± 0,5°C usando
uma bomba de perfusão peristáltica (Harvard Apparatus, USA). A solução era composta
dos seguintes componentes em mM: NaCl, 130; KCl, 4.7; CaCl
2.2H2O,1.6; KH2PO
4
,
1.18; MgSO, 4.7; H
2O, 1.17; NaHCO3, 14.9; EDTA, 0.026 e glicose, 11.1. As variações
na pressão de perfusão foram medidas por meio de um transdutor de pressão (Cobe
Laboratories, Lakewood, CO, USA) conectado a um pré-amplificador que processa a
pressão e a envia a um sistema de aquisição de daos (BioPac Systems). Em primeiro
lugar foi realizada a Curva Concentração Efeito ao agente vasoconstritor noradrenalina
(NE; Sigma, St. Louis, MO, USA). Em seguida era feito o estudo da função endotelial,
usando-se a ferramenta farmacológica acetilcolina (ACh; Sigma) vasodilator
dependente do endotélio e posteriomente era feita a avaliação da integridade do
músculo liso vascular através do uso do nitroprussiato de sódio (SNP, Sigma),
vasodilatador independente do endotélio por doação de óxido nítrico. O percentual de
relaxamento vascular às drogas vasodilatadoras era obtido através do decréscimo na
pré-contração induzida pela concentração de 8 x 10
-6
M de NE.
A
B
C
Figura 5 - Mostra em (A), camundongo anestesiado sendo
laparotomizado. Em (B), visualiza-se a artéria mesentérica superior em
maior aumento. Em (C), fotografia da artéria mesentérica superior
canulada.
3.7. Curvas Concentração Efeito (CCE)
Foram realizadas CCE ao vasoconstritor Norepinefrina (NE – 10
-9
a 2x10
-3
M). As
contrações induzidas pela NE foram expressas em pressão de perfusão (mmHg).
Em preparações pré-contraídas com NE (5 x 10
-6
M) foram obtidas CCE à ACh no
intervalo de concentrações (10
-10
a 10
-3
M) e ao NPS no mesmo intervalo de
concentrações (10
-10
a 10
-3
M). A resposta vasodilatadora foi expressa como
percentagem de relaxamento em relação à pressão de perfusão desenvolvida pela NE.
A contração obtida pela ação da NE corresponde a 60 – 80% da resposta máxima
provocada pela NE na CCE a este vasoconstritor.
Para avaliar a influência dos ânions superóxidos (O
-
) na reatividade vascular dos
grupos experimentais, neste estudo, as preparações foram tratadas com o mimético da
superóxido dismutase, tempol (10
-3
M). O tempol foi adicionado separadamente à
solução de Krebs modificada 30 minutos antes da realização das CCEs e mantido
durante todo o experimento.
Em outro protocolo, foi estudada a participação do fator hiperpolarizante derivado do
endotélio (EDHF). Para isto, as preparações foram incubadas ao mesmo tempo com L-
NAME 10
-4
M e Indometacina (10
-5
M) durante 30 minutos antes de cada CCE.
3.7.1. Protocolos do Estudo de Reatividade Vascular
3.7.1.1. Estudo 1 (Reatividade vascular ao vasoconstritor NE)
Em primeiro lugar, o leito mesentérico era perfundido durante 30 min com Krebs
modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em seguida, concentrações
molares crescentes de norepinefrina eram administradas in bolus de acordo com o
registro típico abaixo.
Estabilização 30min
10
-9
M 10
-3
M
Pré-contração NE
(8 x 10
-6
M)
10
-7
M 10
-5
M
15 minutos
Nitroprussiato de sódio
Estabilização 30min
10
-9
M 10
-3
M
Pré-contração NE
(8 x 10
-6
M)
10
-7
M 10
-5
M
15 minutos
Nitroprussiato de sódio
Estabilização 30min
10
-
9
M 2x10
-
6
M 10
-
4
M
Norepinefrina
Figura 6 – Os esquemas acima representam os protocolos para as CCE à NE (A),
ACh (B) e NPS (C). Para a obtenção das CCE foram utilizadas 9 concentrações
variando-se para (NE -10
-10
M a 2 x 10
-3
), (ACh - 10
-10
M a 10
-2
M), (NPS - 10
-10
M
a 10
-2
M), administradas in bolus em ordem crescente.
2x10
-
3
M
A
B
C
Estabilização 30min
10
-9
M 10
-3
M
Pré-contração
NE (8 x 10
-6
M)
10
-7
M 10
-5
M
15 minutos
Acetilcolina
Estabilização 30min
10
-9
M 10
-3
M
Pré-contração
NE (8 x 10
-6
M)
10
-7
M 10
-5
M
15 minutos
Acetilcolina
(5 x 10
-
6
M)
NE
(5 x 10
-
6
M)
3.7.1.2. Estudo 2 (Avaliação da função endotelial usando o vasodilatador dependente
do endotélio ACh)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com Krebs modificado para a
obtenção de estabilização do registro. Em seguida, era aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após a alcançado o platô de contração,
concentrações crescentes de ACh eram administradas para se obter a CCE a esse
agente vasodilatador usado como ferramenta farmacológica para determinação da
integridade endotelial.
3.7.1.3. Estudo 3 (Avaliação da função endotelial usando o vasodilatador independente
do endotélio NPS)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com Krebs modificado para a
obtenção de estabilização do registro. Em seguida, era aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após a alcançado o platô de contração,
concentrações crescentes de NPS eram administradas para se obter a CCE a esse
agente vasodilatador usado para o estudo da função do músculo liso vascular.
3.7.1.4. Estudo 4 (Avaliação do envolvimento dos ânions superóxido na reatividade
vascular ao vasoconstritor NE)
Em primeiro lugar, o leito mesentérico era perfundido durante 30 min com o antioxidante
tempol diluído em Krebs modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em
seguida, concentrações molares crescentes de norepinefrina eram administradas in
bolus.
3.7.1.5. Estudo 5 (Avaliação do envolvimento dos ânions superóxido sobre a função
endotelial)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com o antioxidante tempol diluído em
Krebs modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em seguida, era
aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após atingir o platô
de contração, concentrações crescentes de NPS eram administradas para se obter a
CCE a esse agente vasodilatador usado para o estudo da função endotelial.
3.7.1.6. Estudo 6 (Avaliação do envolvimento dos ânions superóxido sobre a função do
músculo liso vascular)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com o antioxidante tempol diluído em
Krebs modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em seguida, era
aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após atingir o platô
de contração, concentrações crescentes de NPS eram administradas para se obter a
CCE a esse agente vasodilatador usado para o estudo da função do músculo liso
vascular.
3.7.1.7. Estudo 7 (Avaliação da participação do EDHF na reatividade vascular ao
vasoconstritor NE)
Em primeiro lugar, o leito mesentérico era perfundido durante 30 min com o duplo
bloqueio da síntese do NO e da PGI2 (L-NAME + INDOMETACINA) diluídos em Krebs
modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em seguida, concentrações
molares crescentes de norepinefrina eram administradas in bolus.
3.7.1.8. Estudo 8 (Avaliação da participação do EDHF na função endotelial)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com o L-NAME + INDOMETACINA
diluídos em Krebs modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em
seguida, era aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após
atingir o platô de contração, concentrações crescentes de ACh eram administradas
para se obter a CCE a esse agente vasodilatador usado para o estudo da função
endotelial.
3.7.1.6. Estudo 9 (Avaliação da participação do EDHF na função do músculo liso
vascular)
O leito mesentérico era perfundido durante 30 min com L-NAME + INDOMETACINA
diluídos em Krebs modificado para a obtenção de estabilização do registro. Em
seguida, era aplicada norepinefrina (5 x 10
-6
M) para obtenção da pré-contração. Após
atingir o platô de contração, concentrações crescentes de NPS eram administradas
para se obter a CCE a esse agente vasodilatador usado para o estudo da função do
músculo liso vascular.
3.8. Avaliação das alterações de sensibilidade
A sensibilidade das preparações às drogas estudadas foi avaliada pela medida gráfica
da concentração efetiva 50 (EC
50
), que é a concentração molar que induz 50% do efeito
máximo de um agonista, em experimentos individuais. A média das EC
50
é apresentada
como o antilogarítmo da média aritmética dos log EC
50
de cada experimento, com
intervalo de confiança de 95%.
3.9. Avaliação das alterações de resposta máxima
A reatividade das preparações foi determinada pelas respostas máximas (RM) aos
agentes vasoativos e estão expressas como a média aritmética e seus respectivos
erros padrão do efeito máximo, obtido em experimentos individuais.
3.10. Drogas Utilizadas
As seguintes drogas foram utilizadas: bitartarato de norepinefrina, cloridrato de
acetilcolina, nitroprussiato de sódio, L-NAME (Sigma Chemical Co.) e indometacina
(Alquimia, Brasil). Todas as drogas usadas nas CCEs foram diluídas em solução de
Krebs modificada.
3.11. Análise Estatística
Os dados são expressos como média ± EPM. A análise estatística foi feita com ANOVA
2 vias seguida pelo teste de Fisher para múltiplas comparações ou ANOVA 1 via
seguida pelo teste Tukey. Para comparações de valores de médias entre dois grupos
independentes foi usado o teste t Student’s não pareado quando necessário. O nível de
significância foi estabelecido como p<0.05.
4 - Resultados
4.1 – Pressão Arterial Média e Colesterol Plasmático
A pressão arterial média (PAM) e os níveis de colesterol plasmático total encontram-se
sumarizados na Tabela 1. A PAM foi significativamente maior nos camundongos C57-
2R1C e ApoE-2R1C quando comparada a seus respectivos controles C57-Sham e
ApoE-Sham. Como esperado, o nível de colesterol plasmático foi significativamente
maior em camundongos ApoE Sham e 2R1C do que em C57 Sham e 2R1C, porém o
grupo ApoE 2R1C apresentou valores de colesterol plasmático significativamente
menor do que o grupo ApoE Sham.
4.2 - Reatividade Vascular
A Figura 7 representa os registros típicos de pressão de perfusão, obtidos das CCE
individuais dos camundongos Sham e 2R1C das duas linhagens estudadas ao
vasoconstritor NE. Pode-se observar os picos de respostas crescentes de acordo com o
aumento da concentração daquele vasoconstritor.
A Figura 8 sumariza a CCE à NE nos quatro grupos estudados. Clara
hiperresponsividade vascular à NE foi observada em ambos os grupos ApoE-Sham e
C57-2R1C comparado ao grupo C57-Sham (painéis A e C). A hipertensão renovascular
em ApoE não causou efeitos significantes na reatividade vascular à NE comparada ao
ApoE-Sham (painel B). Também, não se observou diferença entre ApoE-2R1C e C57-
2R1C (painel D).
A Figura 9 representa os registros típicos de diminuição da pressão de perfusão ao
vasodilatador ACh, obtidos das CCE individuais dos camundongos Sham e 2R1C das
duas linhagens estudadas. Pode-se observar os picos de respostas crescentes de
acordo com o aumento da concentração daquele vasodilatador para todos os grupos.
A Figura 10 representa as curvas concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas
de camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou Sham
operado (Sham).
A responsividade vascular à ACh foi significativamente prejudicada
(diminuída) nos animais C57-2R1C, mas não nos ApoE-Sham comparados ao grupo
C57-Sham (painéis A e C). A hipertensão renovascular causou um significante prejuízo
da reatividade vascular à ACh em camundongos ApoE
-/-
, comparados aos ApoE-Sham
(painel B). Não foi observada diferença significante na resposta à ACh entre os grupos
hipertensos (painel D).
A Figura 11 representa os registros típicos individuais de pressão de perfusão, das
CCE ao vasodilatador NPS obtidos dos camundongos Sham e 2R1C das duas
linhagens estudadas. Pode-se observar os picos de respostas crescentes de acordo
com o aumento da concentração daquele vasodilatador, mediante a diminuição da
pressão de perfusão determinada pelo NPS.
A Figura 12 representa as curvas concentração efeito ao NPS, vasodilatador
independente do endotélio. Não houve diferença estatisticamente significante em
nenhum dos grupos (p>0,05). Também não foi observada diferença estatística nas EC
50
dos grupos estudados.
A Figura 13 sumariza as CCE à NE comparando vários grupos tratados com tempol. O
painel A mostra que o tratamento com tempol não alterou de modo significante a
resposta à NE na linhagem ApoE
-/-
com hipertensão renovascular comparada à
resposta do ApoE 2R1C sem tratamento. Porém podemos observar no painel B que o
tempol reverteu a hiperresponsividade à NE na linhagem C57 com hipertensão
renovascular. No painel C observa-se que não houve diferença significante entre as
duas linhagens hipertensas tratadas com tempol. O tratamento com tempol reverte
significativamente a hiperresponsividade do ApoE sham aos níveis do C57 sham (painel
D).
Na Figura 14 encontram-se representadas as CCE à ACh, cujos grupos foram tratados
com tempol. Nos painéis A,B, C e D não foi observada reversão da disfunção endotelial
pelo tempol.
Na Figura 15 estão representadas as CCE à NE, cujos grupos foram tratados com L-
NAME + Indo. Observa-se que este tratamento não alterou a resposta à NE na
linhagem C57 com hipertensão 2R1C (painel A). Por outro lado, observa-se que este
mesmo tratamento, aumenta a resposta ao vasoconstritor NE em ApoE 2R1C.
Na Figura 16 estão representadas as CCE à ACh, cujos grupos foram tratados com L-
NAME + Indo. Os C57 2R1C demonstraram nítida diminuição da resposta máxima
frente a este tratamento, porém não houve diferença da EC
50
(painel A). Também
observamos redução da resposta máxima no grupo ApoE 2R1C tratados com L-NAME
+ Indo e aumento da EC
50
, ou seja, os ApoE 2R1C tratados com L-NAME + Indo,
tornaram-se menos sensíveis à ACh (painel B).
Na Figura 17 encontra-se representado o gráfico das respostas máximas (RM) ao
vasoconstritor NE. É observado aumento ou melhora da RM a este vasoconstritor em
animais C57 2R1C tratados com tempol ao compararmos com o C57 2R1C.
Verificamos também que o tratamento com L-NAME + Indo exacerbou ainda mais a
hiperresponsividade a NE nestes animais.
Na Figura 18 observamos que o tratamento com tempol não influenciou a resposta
máxima diminuída à ACh em C57 2R1C. Por outro lado, o tratamento com L-NAME +
Indo piorou ainda mais esta resposta vasodilatadora dependente do endotélio à ACh.
Na Figura 19 está representado o gráfico das RM à NE em animais ApoE. Observa-se
que o tratamento com tempol não alterou a RM a este agente vasoconstritor. O
tratamento com L-NAME + Indo exacerbou ainda mais a hiperresponsividade à NE
nestes animais.
Na Figura 20 observamos que o tratamento com tempol não influenciou a resposta
máxima diminuída à ACh em ApoE 2R1C. Por outro lado, o tratamento com L-NAME +
Indo piorou ainda mais a resposta vasodilatadora dependente do endotélio à ACh.
Tabela 1 - Peso corporal, PAM e níveis de Colesterol plasmático nos grupos de
camundongos C57 e ApoE.
Grupos
C57 ApoE
Parâmetros Sham 2R1C Sham 2R1C
Peso (g) 25,6±0,2 26,9±0,3 25,6±0,5 24,5±0,4
PAM (mmHg) 104±2 128±3* 103±2 126±3†
Colesterol (mg/dL) 131±9 112±10 623±74*# 471±22†*#
PAM – Pressão arterial média
Valores em media ± EPM
*P<0,05 vs C57–Sham; †P<0,05 vs ApoE–Sham; # P<0,05 vs C57 2R1C (ANOVA).
C57-Sham
70
150
230
70
150
C57-2R1C
230
70
150
230
70
150
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
mmHg
230
C57-Sham
70
150
230
70
150
C57-2R1C
230
70
150
230
70
150
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
mmHg
230
Figura 7 – Acima estão representados os registros típicos de pressão de
perfusão obtidos das CCE ao vasoconstritor NE dos camundongos
Sham e 2R1C das duas linhagens estudadas.
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
150
200
C57 Sham
ApoE Sham
*
NE (log mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
150
200
C57 Sham
C57 2R1C
*
NE (log mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
A
B
C
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
150
200
ApoE 2R1C
C57 2R1C
NE (log mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
D
-10 -8 -6 -4 -2
0
50
100
150
200
ApoE Sham
ApoE 2R1C
NE (log mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
Figura 8
–
Curvas concentração efeito à NE, mostrando a variação da pressão de
perfusão em mmHg, em artérias mesentéricas de camundongos C57 e ApoE 28 dias
após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham operado (Sham). A e B, representam os
efeitos da hipertensão renovascular em camundongos C57 e ApoE, respectivamente.
C, representa a comparação entre ApoE e C57 normotensos. D, compara ApoE e C57
hipertensos. Os valores são expressos em média ± EPM (n=6 a 9 por grupo), em
relação aos aumentos da pressão de perfusão (PP). *P<0,05 vs o grupo C57 Sham
(ANOVA).
70
230
150
230
70
150
230
70
150
230
70
150
C57-Sham C57-2R1C
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
mmHg
70
230
150
230
70
150
230
70
150
230
70
150
C57-Sham C57-2R1C
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
mmHg
Figura 9 – Acima estão representados os registros típicos de pressão de
perfusão obtidos das CCE ao vasodilatador dependente do endotélio ACh
dos camundongos Sham e 2R1C das duas linhagens estudadas.
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C
ApoE Sham
*
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 Sham
C57 2R1C
*
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 Sham
ApoE Sham
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
A
B
D
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C
C57 2R1C
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
C
Figura 10
–
Curvas concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de camundongos
ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou Sham operado (Sham). As
respostas são expressas como percentual de relaxamento (diminuição da pressão de
perfusão) relativas à pré-contração induzida pela NE. A e B, representam os efeitos da
hipertensão renovascular em camundongos C57 e ApoE, respectivamente. C, representa a
comparação entre ApoE e C57 normotensos. D, compara ApoE e C57 hipertensos. Os
valores são expressos em média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo). *P<0,05 vs o grupo C57
Sham (A) ou vs ApoE Sham (B) (ANOVA).
230
70
150
230
150
70
mm Hg
70
230
150
230
150
70
C57-Sham C57-2R1C
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
230
70
150
230
150
70
mm Hg
70
230
150
230
150
70
C57-Sham C57-2R1C
ApoE-Sham
ApoE-2R1C
Figura 11 – Acima estão representados os registros típicos de pressão de
perfusão obtidos das CCE ao vasodilatador independente do endotélio NPS
dos camundongos Sham e 2R1C das duas linhagens estudadas.
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 Sham
C57 2R1C
*
NPS (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C
ApoE Sham
NPS (log mol/L)
(%) Relaxamento
A
B
C
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C
C57 2R1C
NPS (log mol/L)
(%) Relaxamento
D
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE Sham
C57 Sham
NPS (log mol/L)
(%) Relaxamento
Figura 1
2
–
Curva concentração efeito ao NPS em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham
operado (Sham). As respostas são expressas como percentual de relaxamento relativo
à pré-contração induzida pela NE. A e B, representam os efeitos da hipertensão
renovascular em camundongos C57 e ApoE, respectivamente. C, representa a
comparação entre ApoE e C57 normotensos. D, compara ApoE e C57 hipertensos. Os
valores são expressos como média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo), e as respostas são
expressas como diminuição da pressão de perfusão. *P<0,05 vs o grupo C57 Sham (A)
ou vs ApoE Sham (B).
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
ApoE 2R1C
ApoE 2R1C (Tempol)
NE (log mol/L)
D PP (mmHg)
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
C57 2R1C (Tempol)
C57 2R1C
NE (log mol/L)
D PP (mmHg)
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
ApoE 2R1C (Tempol)
C57 2R1C (Tempol)
NE (log mol/L)
D PP (mmHg)
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
C57 Sham (Tempol)
ApoE Sham (Tempol)
NE (log mol/L)
D PP (mmHg)
*
A
B
C
D
Figura 1
3
–
Curvas concentração efeito à NE, mostrando a pressão de perfusão em
mmHg, em artérias mesentéricas de camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da
artéria renal (2R1C) ou sham operado (Sham) tratadas com tempol. A e B, representam
os efeitos do tratamento com antioxidante nos camundongos ApoE e C57 com
hipertensão renovascular, respectivamente. C, representa a comparação entre C57 e
ApoE tratados com antioxidante. D, compara ApoE e C57 normotensos, ambos
tratados. Os valores são expressos como média ± EPM (n = 6 por grupo). *P<0,05 vs o
grupo C57 2R1C que não foi tratado com tempol (ANOVA).
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C
ApoE 2R1C (Tempol)
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 2R1C (Tempol)
C57 2R1C
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C (Tempol)
C57 2R1C (Tempol)
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 Sham (Tempol)
ApoE Sham (Tempol)
ACh (log mol/L)
(%) Relaxamento
A
B
C
D
Figura 1
4
–
Curva concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de
camundongos C57 e ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham
operado (Sham) tratadas com tempol. As respostas são expressas como percentual de
relaxamento relativo à pré-contração induzida pela NE. A e B, representam os efeitos
da hipertensão renovascular em camundongos C57 e ApoE tratados com tempol,
respectivamente. C, representa a comparação entre ApoE e C57 normotensos tratados
com tempol. D, compara C57 e ApoE hipertensos, ambos tratados com tempol. Os
valores são expressos como média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo). *P<0,05 vs o grupo
C57 Sham (A) ou vs ApoE Sham (B) (ANOVA).
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
C57 2R1C L-NAME + Indo
C57 2R1C
NE (mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
A
B
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
125
150
175
200
ApoE 2R1C L-NAME + Indo
ApoE 2R1C
NE (log mol/L)
∆
∆
∆
∆
PP (mm Hg)
Figura
15
–
Curvas concentração efeito à NE em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE e C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) tratadas com
L-NAME + Indo. A e B, representam os efeitos do tratamento com o duplo bloqueio da
síntese do NO e da PGI2 nos camundongos C57 e ApoE com hipertensão
renovascular. Os valores são expressos em média ± EPM (n=6 por grupo), e as
concentracões são expressas como aumento da pressão de perfusão (PP). *P<0,05
vs o grupo ApoE 2R1C L-NAME + Indo (ANOVA).
*
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
ApoE 2R1C L-NAME + Indo
ApoE 2R1C
ACh (mol/L)
(%) Relaxamento
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
0
25
50
75
100
C57 2R1C L-NAME + Indo
C57 2R1C
ACh (mol/L)
(%) Relaxamento
A
B
Figura
16
–
Curva concentração efeito à ACh em artérias mesentéricas de
camundongos C57 e ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) tratadas com L-
NAME + Indo. As respostas são expressas como percentual de relaxamento relativo à
pré-contração induzida pela NE. A e B, representam os efeitos da hipertensão
renovascular em camundongos C57 e ApoE tratados com L-NAME + Indo,
respectivamente. Os valores são expressos em média ± EPM (n=6 por grupo). *p<0,05
vs o grupo C57 2R1C (A) ou vs ApoE 2R1C (B) (ANOVA). A EC
50
apresentou diferença
entre os grupos ApoE 2R1C vs ApoE 2R1C L-NAME + Indo. p<0,05
*
*
Figura
17
–
O gráfico acima representa a média das respostas máximas
de pressão de perfusão ao vasoconstritor NE, em artérias mesentéricas
de camundongos C57 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou
sham operado (Sham) e C57 2R1C tratado com tempol ou com L-NAME
+ Indo. Os valores são expressos como média ± EPM (n = 6 a 9 por
grupo). P<0,05 (*) comparado ao controle Sham, (#) comparado ao C57
2R1C tratado com L-NAME + Indo, (†) comparado com C57 2R1C
tratado com tempol (ANOVA).
1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
(5)
(9)
(7)
(7)
Respostas máximas (NE)
C57 Sham
C57 2R1C
C57 2R1C Tempol
C57 L-NAME + Indo
*
* †
#
1
0
20
40
60
80
100
(%) Relaxamento máximo ACh
C57 Sham
C57 2R1C
C57 2R1C Tempol
C57 2R1C L-NAME + Indo
Figura
18
–
O gráfico acima representa a média das respostas máximas ao
vasodilatador ACh em artérias mesentéricas de camundongos C57 28 dias
após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham operado (Sham) e C57 2R1C
tratado com tempol ou com L-NAME + Indo. Os valores são expressos
como média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo). P<0,05 (*) comparado ao
controle Sham, (†) comparado ao C57 2R1C tratado com tempol, (#)
comparado ao C57 2R1C tratado com L-NAME + Indo (ANOVA).
* †
*
* #
Figura
19
–
O gráfico acima representa a média das respostas máximas de
pressão de perfusão ao vasoconstritor NE em artérias mesentéricas de
camundongos ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal (2R1C) ou sham operado
(Sham) e C57 2R1C tratado com tempol ou com L-NAME + Indo. Os valores são
expressos como média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo). P<0,05 (*) comparado ao
controle Sham, (#) comparado ao C57 2R1C, (†) comparado com C57 2R1C
tratado com tempol (ANOVA).
1
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Resposta máxima (NE)
ApoE Sham
ApoE 2R1C
ApoE 2R1C Tempol
ApoE 2R1C L-NAME + Indo
* # †
1
0
20
40
60
80
100
(%) Relaxamento máximo ACh
ApoE Sham
ApoE 2R1C
ApoE 2R1C Tempol
ApoE 2R1C L-NAME + Indo
Figura
20
–
O gráfico acima representa a média das respostas máximas ao vasodilatador
ACh em artérias mesentéricas de camundongos ApoE 28 dias após o clipe da artéria renal
(2R1C) ou sham operado (Sham) e C57 2R1C tratado com tempol ou com L-NAME + Indo.
Os valores são expressos como média ± EPM (n = 6 a 9 por grupo). P<0,05 (*) comparado ao
controle Sham, (#) comparado ao ApoE 2R1C e (†) comparado ao ApoE 2R1C tratado com
tempol (ANOVA).
* *
* # †
5 - Discussão
No presente trabalho foi observado que a hipertensão renovascular resultou em: 1)
elevação dos níveis pressóricos dos animais submetidos ao modelo experimental 2R1C
nas duas linhagens em estudo; 2) aumento da resposta vasoconstritora à NE em
animais ApoE Sham, ApoE 2R1C e em C57 2R1C em relação aos animais C57 Sham;
3) diminuição da resposta vasodilatadora à ACh nos animais ApoE
-/-
e C57 hipertensos
2R1C comparados aos seus controles Sham; 4) diminuição dos níveis
hipercolesterolêmicos nos animais ApoE 2R1C comparados aos ApoE Sham;
O tratamento das preparações do LAM com o antioxidante tempol resultou em: 1)
reversão da hiperresponsividade vascular à NE no modelo C57 2R1C ao nível dos
controles C57 Sham, porém não modificou esta resposta na linhagem ApoE
-/-
; 2) não
apresentou melhora da disfunção endotelial através da CCE à ACh em nenhuma das
duas linhagens estudadas, porém apresentou aumento da média das respostas
máximas a este agente vasodilatador nos C57 2R1C;
O tratamento das preparações do LAM com L-NAME + Indometacina resultaram em: 1)
exacerbação da resposta vasoconstritora à NE no grupo ApoE 2R1C, sem modificação
desta resposta nos C57 2R1C; 2) redução significativa da resposta relaxante
dependente do endotélio à ACh, porém com persistência desta resposta relaxante,
mesmo após o duplo bloqueio da síntese do NO e da PGI
2
.
Este é o primeiro estudo a demonstrar em camundongos que a aterosclerose
espontânea no modelo ApoE
-/-
assim como a hipertensão renovascular 2R1C, nestes
mesmos animais, causaram hiperresponsividade à NE em leito arteriolar mesentérico
sem efeitos adicionais quando estas duas fisiopatologias coexistem no mesmo animal.
Este aumento da resposta vasoconstritora ao agonista NE nos estágios iniciais da
aterosclerose, sem disfunção endotelial foi também observado em modelos de
aterosclerose em coelhos
109
. Com base em análises morfológicas de vasos sanguíneos
de camundongos ApoE
-/-
em nosso laboratório (Nogueira et al, 2006) e nos dados de
outros
110
em coelhos jovens ateroscleróticos, nós especulamos que esta
hiperresponsividade à NE, pode estar relacionada ao espessamento íntima-média.
Por outro lado, foi observado, no presente estudo, em animais ApoE
-/-
com hipertensão
2R1C diminuição do relaxamento vascular dependente do endotélio à ACh, mas este
não foi alterado em animais com aterosclerose apenas. Uma das principais
características da aterosclerose é o prejuízo da função endotelial, a qual está presente
mesmo antes da existência das alterações estruturais
29
. Esta característica tem sido
baseada em estudos realizados em seres humanos
41-43
e em modelos experimentais
de aterosclerose acelerada por dieta enriquecida com colesterol
4, 5, 7, 44
. Os
camundongos ApoE
-/-
são considerados um dos mais relevantes modelos para o estudo
da aterosclerose por serem hipercolesterolêmicos e desenvolverem lesões arteriais
espontâneas
2, 3
. A disfunção endotelial tem sido considerada um dos primeiros passos
que levam à aterosclerose
29
, entretanto, função endotelial normal em anéis de aorta foi
recentemente reportado em camundongos ApoE
-/-
de 35 semanas de idade
7
,
resultando em modelo atípico de aterosclerose
7
. No presente estudo, um dos nossos
objetivos foi avaliar a função endotelial de vasos de resistência em camundongos ApoE
-
/-
jovens (10 a 12 semanas de idade) que também demonstraram função endotelial
normal. A literatura aponta muitos caminhos levando à manutenção da disfunção
endotelial, porém em microvasos de camundongos ApoE
-/-
e isogênicos C57, poucos
dados têm sido mostrados, especialmente quando a estes animais está associada a
hipertensão renovascular. Podemos especular alguns mecanismos que poderiam
explicar a função endotelial normal em camundongos ApoE
-/-
(ateroscleróticos)
alimentados com dieta normal: superexpressão da NO sintase ou aumento da produção
da enzima superóxido dismutase. Entretanto, nenhum desses mecanismos foram
alterados em camundongos ApoE
-/-
, com 35 semanas de idade
7
.
Outro objetivo deste estudo foi avaliar a função vascular em camundongos C57 jovens
com hipertensão renovascular 2R1C, sendo este o primeiro estudo a avaliar a função
de vasos de resistência em camundongos C57 neste modelo de hipertensão. A
hipertensão renovascular é caracterizada por hipertrofia vascular e aumento dos níveis
de renina plasmática,
38
e tem sido mostrado que o desenvolvimento da hipertensão
pode ser prevenido por deleção do gene para o receptor AT1
66
. No presente trabalho,
nós observamos aumento da resposta vasoconstritora à NE associada com prejuízo do
vasorelaxamento dependente do endotélio. Esses achados eram esperados, pelas
ações da ANG II com o seu papel na hipertensão 2R1C, potente efeito vasoconstritor
em adição à sua contribuição na disfunção endotelial
28
, pelo aumento do stress
oxidativo, causando a perda da biodisponibilidade de NO levando à produção de
peroxinitrito, um potente oxidante que contribui para a vasoconstrição e para a injúria
vascular
37, 111
. A verificação de maior capacidade para contração e menor capacidade
para relaxamento dos vasos de resistência observado por nós em camundongos C57
hipertensos 2R1C e por outros em ratos hipertensos 2R1C
20
sugere que esta resposta
esteja contribuindo para a manutenção da hipertensão renovascular. Outra hipótese
que poderia explicar a diminuição do relaxamento vascular dependente do endotélio
nos animais C57 2R1C, seria uma menor atividade da enzima óxido nítrico sintase
(NOS) no leito arteriolar mesentérico desses animais. A NOS é a enzima responsável
pela síntese de NO, portanto, a diminuição de sua atividade explicaria o relaxamento
diminuído à ACh e até mesmo estaria contribuindo para o aumento da pressão arterial
nesses animais. Outro mecanismo que poderia ser proposto seria um defeito na
hiperpolarização do músculo liso vascular destes animais. Em ratos hipertensos 2R1C
foi demonstrado defeito seletivo da hiperpolarização no músculo liso vascular
112
, o que
explicaria a diminuição do relaxamento à acetilcolina no modelo em camundongos no
presente estudo.
A observação de que a coexistência da hipertensão angiotensina II dependente em
camundongos ApoE
-/-
2R1C não exacerba o aumento da responsividade vascular à NE
poderia ser atribuída à reserva vasoconstritora do camundongos ApoE
-/-
já está no seu
máximo. Por outro lado, a função endotelial preservada dos ApoE
-/-
, é alterada pela
indução da hipertensão 2R1C na mesma magnitude observada em camundongos C57–
2R1C, provavelmente pelos mesmos mecanismos que foram especulados acima para
os animais hipertensos C57. Como a vasodilatação induzida pela acetilcolina é
totalmente dependente da presença e da integridade do endotélio, ela funciona como
marcador da função endotelial. Considerando que o NO é o principal mediador dessa
vasodilatação, a diminuição da resposta à ACh observada em leitos mesentéricos
isolados dos animais hipertensos de ambas as linhagens no presente estudo, pode ser
decorrente ainda de menor sensibilidade do músculo liso vascular ao NO. Para avaliar
esta capacidade de resposta do músculo liso, foram realizadas curvas concentração
efeito ao NPS (doador de NO). Como as preparações isoladas dos animais ApoE 2R1C
e C57 2R1C não apresentaram diferença de resposta comparadas aos ApoE Sham e
C57 Sham, respectivamente, podemos descartar a possibilidade de que a resposta
diminuída à ACh seja devida à diminuição de resposta do músculo liso vascular ao NO.
Consistente com resultados prévios
3
,
38
,
113
observamos, neste estudo que os níveis
plasmáticos de colesterol foram marcadamente elevados em camundongos ApoE
-/-
. E
também é conhecido, ainda que não por unanimidade, que nesses animais com 10
semanas de idade, já há o desenvolvimento de lesões ateroscleróticas vasculares
3
,
também confirmadas em nosso laboratório (Nogueira et al, 2006). Ressaltamos que
este é o primeiro estudo que mostra diminuição da hipercolesterolemia em
camundongos ApoE
-/-
com hipertensão 2R1C comparados aos seus controles ApoE
Sham. Este resultado poderia ser explicado, pelo menos em parte, pelas ações da ANG
II aumentando a captação do LDL oxidado da circulação à parede vascular via
receptores “scavengers”
33
. Entretanto, a magnitude da redução da hipercolesterolemia
observada em ApoE–2R1C não alterou a responsividade vascular à NE comparada
com os ApoE–Sham.
No presente trabalho foram investigados alguns possíves mecanismos que poderiam
estar envolvidos na disfunção endotelial observada nos animais ApoE
-/-
e C57 com
hipertensão renovascular.
Inicialmente, estudamos a participação dos ânions superóxido. Estes últimos não
parecem ser responsáveis pela disfunção endotelial observada nestes animais, uma
vez que o tratamento, in vitro, do leito arterial mesentérico (LAM), com o mimético da
superóxido dismutase, tempol, não restaurou o relaxamento vascular à ACh em
nenhuma das duas linhagens estudadas com hipertensão renovascular, apenas
aumentou a média das respostas máximas a este vasodilatador na linhagem C57
2R2C, sem melhora desta resposta em ApoE 2R1C. Diferente dos nossos resultados
usando vasos de resistência, em anéis de aorta de ApoE
-/-
tratados com dieta
hiperlipidêmica, apresentando hiperlipidemia e aterosclerose a incubação de tais anéis
com M40403, mimético da SOD, suprimiu significativamente a produção de superóxido
e melhorou o vasorelaxamento dependente do endotélio ao nível dos controles
114
.
A seguir, avaliamos a participação e ou contribuição do fator hiperpolarizante
dependente do endotélio (EDHF) como outro possível mecanismo envolvido na função
endotelial dos animais ApoE
-/-
e C57 com hipertensão renovascular.
Para isto, tratamos o LAM com L-NAME + Indometacina. Este tratamento, demonstrou
que mesmo bloqueando-se os efeitos do NO e da PGI2, continuou existindo resposta
relaxante dependente do endotélio. Este resultado sugere que, em ambas as linhagens
estudadas, há a participação de outro fator relaxante além do NO e PGI2 e este pode
ser o EDHF. Vários estudos demonstram a importante participação do EDHF no
relaxamento dependente do endotélio, por abertura de canais de K
+
em artérias
mesentéricas de ratos hipertensos e a diminuição deste relaxamento causada por
diminuição da hiperpolarização
43, 115
. A ACh causa dilatação do leito arterial
mesentérico em ratos através da liberação de dois fatores distintos e não
prostanóides
116
. O primeiro descrito como EDHF, é insensível a inibidores da NOS e
vasodilata por abertura de canais de K
+
dependentes de cálcio e o segundo pode ser
inibido por inibidores da NOS, este é o NO.
No presente trabalho, também foram investigados alguns dos possíveis mecanismos
envolvidos na hiperresponsividade ao vasoconstritor NE. Primeiro, foi estudado o
envolvimento dos radicais superóxido. Observou-se que o tempol, reverteu a
hiperresponsividade à NE nos animais ApoE Sham, cuja resposta igualou-se àquela
observada no grupo C57 Sham. Este mimético da SOD, restaurou a resposta máxima à
NE na linhagem C57 com hipertensão renovascular, sem alterar esta resposta na
linhagem ApoE
-/-
hipertensa.
No segundo protocolo incubamos o LAM dos camundongos ApoE 2R1C com L-NAME +
Indometacina. Foi observado aumento da resposta à NE, além daquela já descrita
anteriormente em comparação aos controles C57 Sham. Ou seja, mesmo partindo-se
de valores de resposta máxima elevada, estes animais demonstraram ainda apresentar
reserva para aumento adicional da resposta à NE. Este resultado sugere que a
resposta vasoconstritora à NE é contrabalançada pelo NO e/ou PGI2, já que
bloqueando-se estes dois fatores relaxantes, observou-se aumento da resposta
vasoconstritora. Outra hipótese seria via as ações da ANG II, uma vez que o estado
hipercolesterolêmico aumenta a sensibilidade vascular à ANG II
117
. Além disto, recentes
estudos sugerem que a ANG II, sinaliza negativamente o NO endotelial, levando a
disfunção endotelial
65
. Outros relatam o papel dos receptores AT
1A
mediando a
hipertensão 2R1C e ainda o aumento da produção de NO para contrabalançar a
pressão neste modelo
66
. Alterações na produção de fatores vasoativos derivados do
endotélio podem também estar envolvidos na hiperreatividade à NE induzida pela
hipertensão renovascular, uma vez que a NE, assim como a ACh, são capazes de
liberar simultaneamente EDRFs e EDCFs
20, 118
.
Podemos ainda sugerir que outro mecanismo, diferente poderia estar atuando na
linhagem C57 2R1C, uma vez que não foi observada a resposta que ocorreu com a
linhagem ApoE
-/-
com hipertensão. Por outro lado, recente estudo demonstrou a
participação da endotelina na resposta vasoconstritora através do bloqueio do seu
receptor ET
A
. Com esse bloqueio houve normalização da disfunção endotelial, redução
da formação do ateroma, independente do colesterol plasmático, e pressão arterial em
ApoE
-/-
, sugerindo um potencial terapêutico desses inibidores no tratamento da
aterosclerose
64
.
Os resultados observados neste trabalho podem ajudar a explicar a contribuição do
endotélio na manutenção da hipertensão renovascular.
Tanto a aterosclerose, ainda que na fase inicial, como a hipertensão renovascular,
causaram aumento de resposta à noradrenalina, porém a coexistência destas
fisiopatologias não agrava a resposta a este vasoconstritor no presente estudo.
Em suma, os resultados deste trabalho mostram que nos estados iniciais da
aterosclerose, estado hipercolesterolêmico, o modelo ApoE
-/-
demonstra alteração de
reatividade vascular à norepinefrina, podendo este ser um dos mecanismos
preliminares no desenvolvimento da aterosclerose. Entretanto, este trabalho demonstra
que o ApoE
-/-
é um modelo atípico para o estudo da função endotelial. Foi visto ainda
que a indução do modelo experimental de hipertensão 2R1C, promoveu elevação dos
níveis pressóricos de camundongos C57 e ApoE
-/-
a as alterações na reatividade
vascular podem estar contribuindo para a manutenção deste tipo de hipertensão arterial
somada às ações já conhecidas da ANG II no modelo estudado.
Limitação do estudo
Uma das limitações do nosso estudo é que a hipercolesterolemia e a hipertensão
renovascular foram investigadas em animais jovens e nós não podemos descartar a
possibilidade de diferentes resultados em camundongos mais velhos ou mesmo nesta
idade alimentados com dieta rica em colesterol. Faz-se necessário outros estudos para
elucidar completamente os mecanismos envolvidos na disfunção vascular em
camundongos ateroscleróticos e/ou com hipertensão renovascular.
6 - Conclusões
Os dados obtidos neste estudo são os primeiros a mostrar que os camundongos
ApoE
-/-
, na fase inicial do processo aterosclerótico, porém com
hipercolesterolemia, ainda não apresentam alterações na função endotelial de
microvasos mesentéricos, quando comparados com animais isogênicos.
Os camundongos C57 e ApoE
-/-
2R1C apresentaram hipertensão arterial, porém
a hipertensão renovascular, mas não a aterosclerose, causou disfunção
endotelial. Podemos sugerir que a hipertensão arterial nas linhagens estudadas
pode ter sido mantida pela alteração da função moduladora do endotélio sobre a
reatividade vascular, somada às alterações do sistema renina-angiotensina. Nos
ApoE-2R1C, além dos mecanismos acima, também pode estar havendo a
contribuição da ação deletéria da hipercolesterolemia.
A disfunção endotelial não foi revertida pelo scavenger de ânions superóxido,
em nenhuma das linhagens estudadas com hipertensão renovascular, indicando
que a disfunção endotelial pode estar sendo mantida por outros mecanismos que
não necessariamente dependem da produção exagerada de superóxido e
conseqüente inativação do NO.
Podemos sugerir que a resposta vasoconstritora à NE no grupo ApoE
hipertenso, assim como a resposta relaxante dependente do endotélio nas duas
linhagens com hipertensão são reguladas pelo NO e/ou PGI
2,
uma vez que a
inibição destes fatores relaxantes exacerbou a resposta vasoconstritora em ApoE
hipertensos e reduziu a resposta relaxante dependente do endotélio à ACh nas
linhagens do presente estudo com hipertensão renovascular.
Podemos sugerir que a resposta endotelial à ACh, nas duas linhagens, conta
com a participação de outro fator relaxante além do NO e PGI2, uma vez que
inibindo-se o efeito desses, permanece havendo resposta relaxante dependente
do endotélio. Ou seja, esses resultados sugerem que o EDHF seria este outro
fator que medeia a vasodilatação de artérias mesentéricas destes camundongos
e poderia ser o principal fator endotelial envolvido nesta resposta.
Tanto a hipercolesterolemia e/ou a aterosclerose, na fase inicial, como a
hipertensão renovascular, causam aumento de resposta à noradrenalina, porém
a coexistência destas fisiopatologias não agrava a resposta a este vasoconstritor.
Podemos sugerir que esta resposta pode ser devida a um maior estímulo de
liberação de fatores contráteis e menor de fatores relaxantes, frente ao agente
vasoconstritor NE ou ainda esta hiperreatividade pode ser devida ao
engrossamento das camadas íntima/média vascular.
As alterações na função endotelial, causadas pela hipertensão renovascular,
parecem ocorrer independente da linhagem estudada.
A hipertensão renovascular leva à diminuição da hipercolesterolemia em
camundongos ApoE
-/-
com hipertensão 2R1C. Entretanto, a severidade reduzida
da hipercolesterolemia observada em ApoE–2R1C não altera a responsividade
vascular à NE comparada com os ApoE–Sham.
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