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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
FATORES DE ESTRESSE NA GERMINAÇÃO DE
SEMENTES E NA PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
Passiflora edulis SIMS f. flavicarpa DEGENER
Rodrigo Sobreira Alexandre
Doctor Scientiae
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
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i
RODRIGO SOBREIRA ALEXANDRE
FATORES DE ESTRESSE NA GERMINAÇÃO DE
SEMENTES E NA PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
Passiflora edulis SIMS f. flavicarpa DEGENER
VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
Tese apresentada à
Universidade Federal de Viçosa
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fitotecnia, para a obtenção do
título de Doctor Scientiae.
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ii
RODRIGO SOBREIRA ALEXANDRE
FATORES DE ESTRESSE NA GERMINAÇÃO DE
SEMENTES E NA PROPAGAÇÃO IN VITRO DE
Passiflora edulis SIMS f. flavicarpa DEGENER
APROVADO: 08 de agosto de 2006.
Prof. José Maria Moreira Dias Prof. Wagner Campos Otoni
(Conselheiro) (Conselheiro)
Prof. Mário Puiatti Prof. José Carlos Lopes
Prof. Claudio Horst Bruckner
(Orientador)
Tese apresentada à
Universidade Federal de Viçosa
como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Fitotecnia, para a obtenção do
título de Doctor Scientiae.
iii
Aos meus pais Otacílio (in memorian) e Ivone,
Dedico.
A minha esposa, Cristiane
A meu filho Gabriel
Ofereço.
iv
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Viçosa e, em particular, ao Departamento de
Fitotecnia, pela oportunidade de realizar o curso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa de estudos.
Ao Professor Claudio Horst Bruckner, pela orientação científica, profissional e
pela confiança em mim depositada.
Ao Professor José Maria Moreira Dias, pelas sugestões, disponibilidade nas
correções da tese e amizade durante todo o curso de Pós-Graduação.
Ao Professor Wagner Campos Otoni, pelas sugestões, pela ajuda constante, e
amizade durante todo o curso de Pós-Graduação.
Ao Prof. Paulo César Stringheta pelas sugestões, pela ajuda nas análises de
pigmentos.
Aos funcionários Valério e Dona Lídia, pela ajuda constante no Laboratório de
Pigmentos.
À Priscíla pela ajuda nas análises de pigmentos.
À Professora Renata Maria Strozi Alves Meira, pela disponibilidade e auxílio nas
análises de microscopia.
Ao Professor José Carlos Lopes, pela orientação científica e profissional,
amizade durante todo o curso de Graduação em Agronomia e Pós-Graduação.
A todos os professores envolvidos direta ou indiretamente na minha formação.
Aos colegas do Laboratório de Cultura de Células e Tecidos Vegetais, Rita de
Cássia Mendes, Gizella Machado Ventura, Virginia Silva Carvalho, Delcio de Castro
Felismino, Victor Hugo, Edson, pela alegre convivência, pela amizade, carinho e
disponibilidade em ajudar.
À Renata Vianna Lima, do Laboratório de Análises e Tecnologia de Sementes,
pela ajuda nas análises de sementes.
Ao Rogério (“Rogerinho”), do Laboratório de Ecofisiologia Vegetal, pela ajuda
nas análises de fluorescência.
v
Ao amigo Alan, do Laboratório de Ecofisiologia Vegetal, pela ajuda nas análises
de trocas gasosas.
À Letícia, do Laboratório de Cultura de Tecidos II, pela ajuda nas análises
enzimáticas.
À Raquel, do Laboratório de Anatomia Vegetal, pela ajuda constante nas análises
anatômicas.
Aos colegas do Laboratório de Pós-Colheita, pelos ensinamentos e
disponibilidade em ajudar.
Aos professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Fitotecnia.
Aos meus colegas de curso, em especial, Alexandre Parizotto, Américo Wagner
Junior, Leonarda, Leonardo pela paciência, pelos ensinamentos e pelos momentos de
alegria e de mau-humor compartilhados.
Aos meus amigos Fábio Ribeiro Pires, Victor Martins Maia, Jacson Rondinelle
da Silva Negreiros, Virgínia de Souza Álvares, Rita de Cássia Mendes, Alan Carlos
Costa, aos amigos técnicos, aqui representados por Márcio Antônio Rocha de Oliveira,
Cenira Silva Fialho, Robson, Mara Rodrigues, José Roberto, Vicente e Juca por todos os
momentos felizes compartilhados.
À minha esposa, Cristiane e o meu filho Gabriel, pelo amor, incentivo, dedicação
e enorme contribuição em todos os momentos.
À minha família, pela confiança, apoio e compreensão durante toda a minha
vida.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
BIOGRAFIA
RODRIGO SOBREIRA ALEXANDRE, filho de Otacílio Antônio Alexandre e
Ivone Sobreira Alexandre, nasceu no dia 06 de abril de 1972 em Alegre, no Estado do
Espírito Santo.
No ano de 1999, graduou-se em Agronomia, pela Universidade Federal do
Espírito Santo (UFES), Alegre, Espírito Santo.
Em março de 2002, concluiu o curso de Mestrado em Fitotecnia na Universidade
Federal de Viçosa (UFV), Viçosa, Minas Gerais.
Em setembro de 2002 iniciou, na Universidade Federal de Viçosa (UFV), o
Curso de Doutorado em Fitotecnia, submetendo-se à defesa de tese em agosto de 2006.
vii
ÍNDICE
RESUMO ....................................................................................................... xi
ABSTRACT ................................................................................................... xiii
INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................... 1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 2
REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................... 5
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 7
CAPÍTULO I
Germinação de sementes de progênies de Passiflora edulis Sims f.
flavicarpa Degener submetidas a tratamentos físicos no tegumento e ao
armazenamento
RESUMO ....................................................................................................... 11
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 12
2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 13
2.1. Características avaliadas ...................................................................... 15
2.1.1. Teor de água das sementes ................................................................ 15
2.1.2. Germinação ....................................................................................... 15
2.1.3. Condutividade elétrica ...................................................................... 16
2.1.4. Determinação do teor de malondialdeído (MDA) ............................ 16
2.1.5. Padrões isoenzimáticos ..................................................................... 17
2.2. Delineamento experimental ................................................................. 18
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 19
3.1. Teor de água das sementes ................................................................... 19
3.2. Vigor .................................................................................................... 20
3.3. Germinação .......................................................................................... 25
3.4. Condutividade elétrica ......................................................................... 30
3.5. Peroxidação de lipídios ........................................................................ 32
3.6. Isoenzimas ............................................................................................ 33
3.6.1. Álcool desidrogenase (ADH) ............................................................ 33
viii
3.6.2. Malato desidrogenase (MDH) ........................................................... 34
4. CONCLUSÕES ......................................................................................... 35
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 35
CAPÍTULO II
Efeito da benzilaminopurina (BAP) na organogênese in vitro e na absorção
de nutrientes em Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener
RESUMO ....................................................................................................... 40
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 41
2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 42
2.1. Fase de obtenção de plântulas axênicas ............................................... 42
2.2. Fase de cultivo dos segmentos de hipocótilo ....................................... 43
2.3. Características avaliadas ...................................................................... 44
2.4. Delineamento experimental ................................................................. 44
3. RESULTADOS .......................................................................................... 44
3.1. Experimento I ....................................................................................... 44
3.2. Experimento II ..................................................................................... 46
4. DISCUSSÃO ............................................................................................. 51
5. CONCLUSÕES ......................................................................................... 55
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 56
CAPÍTULO III
Estresse foto-oxidativo durante a morfogênese in vitro de Passiflora edulis
Sims f. flavicarpa Degener mediado por diferentes irradiâncias
RESUMO ....................................................................................................... 59
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 60
2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 61
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas .............................................. 61
2.2. Fase de cultivo dos segmentos de hipocótilo ....................................... 63
2.3. Características avaliadas ...................................................................... 65
2.3.1. Organogênese in vitro .................................................................. 65
ix
2.3.2. Determinação da atividade das enzimas peroxidase (POD);
catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) .........................
67
2.3.2.1. Peroxidase (POD) ............................................................ 67
2.3.2.2. Catalase (CAT) ................................................................. 67
2.3.2.3. Superóxido dismutase (SOD) ........................................... 68
2.3.2.4. Quantificação de proteínas ................................................ 68
2.3.3. Determinação do teor de malondialdeído (MDA) ..................... 68
2.3.4. Produção de etileno (C
2
H
4
) e dióxido de carbono (CO
2
) ........... 69
2.3.5. Determinação dos pigmentos foliares ........................................ 70
2.3.6. Análise de cor ............................................................................ 70
2.4. Delineamento experimental .................................................................. 71
3. RESULTADOS .......................................................................................... 71
4. DISCUSSÃO ............................................................................................. 83
5 CONCLUSÕES .......................................................................................... 89
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 89
CAPÍTULO IV
Estresse foto-oxidativo durante o crescimento in vitro de ápices caulinares
de Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener, sob diferentes irradiâncias
RESUMO ....................................................................................................... 100
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 101
2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 102
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas .............................................. 102
2.2. Fase de cultivo dos ápices caulinares ................................................... 103
2.3. Características avaliadas ...................................................................... 104
2.3.1. Análise de crescimento ................................................................ 104
2.3.2. Determinação da atividade das enzimas peroxidase (POD);
catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) .........................
104
2.3.2.1. Peroxidase (POD) ............................................................ 105
2.3.2.2. Catalase (CAT) ................................................................. 105
2.3.2.3. Superóxido dismutase (SOD) ........................................... 105
x
2.3.2.4. Quantificação de proteínas ................................................ 106
2.3.3. Determinação do teor de malondialdeído (MDA) ..................... 106
2.3.4. Produção de etileno (C
2
H
4
) e dióxido de carbono (CO
2
) ........... 107
2.3.5. Determinação dos pigmentos foliares ........................................ 107
2.3.6. Análise de cor ............................................................................ 108
2.4. Delineamento experimental .................................................................. 108
3. RESULTADOS .......................................................................................... 108
4. DISCUSSÃO ............................................................................................. 121
5 CONCLUSÕES .......................................................................................... 128
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 128
CAPÍTULO V
Atividade fotossintética e fluorescência da clorofila em plântulas de
Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener, cultivadas in vitro, sob
diferentes irradiâncias
RESUMO ....................................................................................................... 135
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 136
2. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 137
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas .............................................. 137
2.2. Fase de cultivo dos ápices caulinares ................................................... 138
2.3. Características avaliadas ...................................................................... 139
2.3.1. Determinação das trocas gasosas ................................................. 139
2.3.2. Determinação da fluorescência da clorofila ................................. 140
2.4. Delineamento experimental .................................................................. 140
3. RESULTADOS .......................................................................................... 142
4. DISCUSSÃO ............................................................................................. 150
5 CONCLUSÕES .......................................................................................... 156
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 157
CONCLUSÕES GERAIS .............................................................................. 163
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
AIA – ácido indolacético
BAP – 6-benzilaminopurina
CAT – catalase
ETR – taxa de transporte de elétrons
F
m
– fluorescência máxima
F
o
– fluorescência inicial
F
v
– fluorescência variável
F
v
/Fm – fluorescência variável/fluorescência máxima (rendimento quântico
potencial
MDA – malondialdeído
MS – meio de cultivo (Murashige & Skoog, 1962)
MSM – meio de cultivo MS modificado
POD – peroxidase
q
N
e NPQ – dissipação não fotoquímica
q
P
– dissipação fotoquímica
ROS – espécies reativas do oxigênio
SOD – superóxido dismutase
ΔF/F
m
’ – rendimento quântico efetivo
xii
RESUMO
ALEXANDRE, Rodrigo Sobreira Alexandre, Universidade Federal de Viçosa, agosto de
2006. Fatores de estresse na germinação de sementes e na propagação in vitro de
Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener. Orientador: Claudio Horst Bruckner.
Co-orientadores: José Maria Moreira Dias, Wagner Campos Otoni e Paulo César
Stringheta.
O estresse oxidativo resulta em uma série de reações de espécies reativas do
oxigênio (ROS) que são consideradas prejudiciais às membranas biológicas. Além disso,
em condições estressantes, os tecidos podem produzir e liberar gases, como o etileno e o
CO
2
, sendo o primeiro, um dos responsáveis pela clorose, senescência e abiscisão foliar.
Elevadas irradiâncias sobre os tecidos fotossintetizantes resulta em uma série de reações
de estresse denominadas de fotoinibição. O uso de fitorreguladores, também pode alterar
a fisiologia da planta e conduzi-la a uma condição estressante. Em condições fisiológicas
normais, a produção desses radicais é controlada adequadamente por agentes
desintoxicadores. Na espécie P. edulis f. flavicarpa, a germinação das sementes é
genótipo-dependente, e o armazenamento beneficia a germinação das mesmas. O BAP
influencia a absorção de nutrientes minerais pelos segmentos hipocotiledonares e o
tempo de imersão nesta citocinina está relacionado com a formação de estruturas
organogênicas. A irradiância incidida sobre os segmentos hipocotiledonares e ápices
caulinares influencia a taxa de emissão de etileno e CO
2
. Há uma relação entre produção
de etileno e biossíntese ou degradação de pigmentos foliares. No processo organogênico
a uma relação direta entre a formação de brotos, nas maiores irradiâncias, com a
elevação da atividade da POD. O crescimento dos ápices caulinares está relacionado
com a inativação das enzimas SOD e CAT. E ainda, que os níveis crescentes de MDA
indicam que apenas o aumento na atividade da CAT não é suficiente para remover as
ROS. A elevação dos níveis de irradiância afeta o rendimento quântico potencial do
FSII, e este, por apresentar comportamento semelhante ao da atividade fotossintética é
indicado para mensurar os níveis de estresse nas plântulas. O sistema de avaliação da
atividade fotossintética, contribuiu para analisar plântulas do maracujazeiro cultivadas in
vitro. Neste trabalho, os segmentos hipocotiledonares e as plântulas de P. edulis f.
flavicarpa adaptaram-se melhor às menores irradiâncias.
xiii
ABSTRACT
ALEXANDRE, Rodrigo Sobreira, D.S., Universidade Federal de Viçosa, August, 2006.
Stressful factors in seed germination and in vitro propagation of Passiflora
edulis Sims f. flavicarpa Degener. Adviser: Claudio Horst Bruckner. Co-advisor:
José Maria Moreira Dias, Wagner Campos Otoni and Paulo César Stringheta.
The oxidative stress results into reaction series of the reactive oxygen species
(ROS) that are considered as detrimental to biological membranes. In addition, the
tissues can produce and liberate gases such as the ethylene and CO
2
, as being the first
one responsible for the chlorosis, senescence and leaf abscission. High irradiance on the
photosynthesizing tissues results into a stress reaction series so-called photoinhibition.
Using the phytoregulators can also change the physiology of the plant, therefore
inducing it to stressful condition. Under normal physiologic conditions, the production
of those radicals is appropriately controlled by deintoxicant agents. In the species P.
edulis f. flavicarpa, the germination of the seeds is genotype-dependent, whereas storage
is beneficial to their germination. BAP affects the absorption of mineral nutrients
through the hypocotyledonous segments, whereas the soaking time in this cytocinin is
related to the formation of organogenetic structures. The irradiance incidence on the
hypocotyledonous segments and stem apexes affects the ethylene emission rate and CO
2
.
There is a relationship between the ethylene production and biosynthesis or leaf pigment
degradations. In the organogenetic process, a direct relationship occurs between the
sprout formations at the highest irradiances and the increase in POD activity. The
growth of the stem apexes is related to inactivation of the enzymes SOD and CAT. Yet,
increasing MDA levels indicate that only the increased CAT activity is not enough to
remove ROS. The increase in the irradiance levels affects the potential quantum
production of FSII, whereas this one is indicated for measuring the plantlet stress levels
because it shows a behavior similar to photosynthetic activity’. The photosynthetic
activity evaluation system contributed to the analysis of the passion fruit plant plantlets
cropped in vitro. In this study, hypocotyledonous segments and the P. edulis f.
flavicarpa plantlets showed a better adaptation to the lowest irradiances.
1
INTRODUÇÃO GERAL
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá, com produção aproximada de
448.000 toneladas anuais, seguido do Equador e Colômbia com 85.000 e 30.000
toneladas, respectivamente. Os maiores exportadores mundiais são Equador, Colômbia e
Peru (ITI Tropicals, 2005). Apesar de o Brasil ser considerado o maior produtor
mundial, ele não está incluído no grupo dos maiores exportadores mundiais, tendo em
vista que o consumo interno é maior que sua produção. Para alterar essa situação, são
necessários avanços tecnológicos, como a manutenção de bancos de germoplasma em
programas de melhoramento genético, para a obtenção de indivíduos com características
agronômicas desejáveis, atingindo, assim, índices mais elevados de produção.
Dentre essas perpectivas tecnológicas, a cultura de células e tecidos vegetais
aplicada à cultura do maracujazeiro consiste numa estratégia que vem contribuir com
avanços na propagação in vitro, por meio, principalmente, da organogênese direta, a
partir de diversos tipos de explantes como em entrenós (Moran Robles, 1979);
segmentos de folhas (Kawata et al., 1995); endosperma (Mohamed et al., 1996); ápices
de brotos (Faria & Segura, 1997); ápices caulinares (Barbosa et al., 2001; Alexandre,
2002); cotilédones (Hall et al., 2000); discos foliares (Appezzato-da-Glória et al., 1999;
Monteiro-Hara et al., 2000); segmentos internodais (Biasi et al., 2000); folhas
cotiledonares (Ribas et al., 2000); segmentos de hipocótilo (Koch et al., 2001;
Alexandre, 2002; Couceiro, 2002; Reis, 2003; Felismino, 2005; Dias, 2005) e
organogênese indireta, como em microcalos (Dornelas & Vieira, 1993; D' Utra Vaz et
al., 1993; Otoni et al., 1995; Felismino, 2005).
Apesar de haver inúmeros trabalhos com Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener, pouco ainda se conhece do comportamento morfofisiológico dessa espécie in
vitro. Diante disso, o trabalho teve o propósito de estudar:
a) Germinação de sementes de progênies de P. edulis f. flavicarpa submetidas a
tratamentos físicos no tegumento e ao armazenamento;
b) Efeito da benzilaminopurina (BAP) na organogênese in vitro e na absorção de
nutrientes em P. edulis f. flavicarpa;
2
c) Estresse foto-oxidativo durante a morfogênese in vitro de P. edulis f.
flavicarpa mediado por diferentes irradiâncias;
d) Estresse foto-oxidativo durante o crescimento in vitro de ápices caulinares de
P. edulis f. flavicarpa, sob diferentes irradiâncias;
e) Atividade fotossintética e fluorescência da clorofila em plântulas de P. edulis
f. flavicarpa, cultivadas in vitro, sob diferentes irradiâncias.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALEXANDRE, R.S. Germinação in vitro e organogênese em explantes do
maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) influenciada pela irradiância e
sacarose. Viçosa:UFV, 2002. 103p. Tese de Mestrado.
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BARBOSA, W.M.; OTONI, W.C.; CARNELOSSI, M.; SILVA, E.; AZEVEDO, A.A.;
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flavicarpa Deg.) is affected by ethylene precursor and by inhibitors. International
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BIASI, L.A.; FALCO, M.C.; RODRIGUEZ, A.P.M.; MENDES, B.M.J. Organogenesis
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maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.). Viçosa:UFV, 2002. 95p.
Tese de Mestrado.
3
DIAS, L.L.C. Influência do etileno e poliaminas sobre a morfogênese in vitro de
maracujá (Passiflora sp.). Viçosa:UFV, 2005. 76p. Tese de Mestrado.
DORNELAS, M.C.; VIEIRA, M.L.C. Plant regeneration from protoplast cultures of
Passiflora edulis var. flavicarpa Deg., P. amethystina Mikan. and P. cincinnata Mast.
Plant Cell Reports, v.13, p.103-106, 1993.
D'UTRA VAZ, F.B.; SANTOS A.V.P. dos; MANDERS, G.; COCKING, E.C.;
DAVEY, M.R.; POWER, J.B. Plant regeneration from leaf mesophyll protoplasts of the
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v.12, p.220-225, 1993.
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KAWATA, K.; USHIDA, C.; KAWAI, F.; KANAMORI, M.; KURIYAMA, A.
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4
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MONTEIRO-HARA, A.C.B. de A.; HIGASHI, E.N.; GONÇALVES, A.N.;
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OTONI, W.C.; CASALI, V.W.D.; CECON, P.R.; DAVEY, M.R.; POWER, J.B.
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REIS, L.B.; PAIVA NETO, V.B.; PICOLI, E.A.T.; COSTA, M.G.C.; RÊGO, M.M.;
CARVALHO, C.R.; FINGER, F.L.; OTONI, W.C. Axillary bud development of passion
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Developmental Biology-Plant, v.39, p.618-622, 2003.
RIBAS, A.F.; DENIS, F.; QUOIRIN, M.; AYUB, R.A. Misturas vitamínicas na
regeneração do maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.). Ciência
Rural, v.32, n.2, p.237-241, 2002.
5
REVISÃO DE LITERATURA
Alguns dos trabalhos desenvolvidos até o momento, referentes à organogênese in
vitro em maracujazeiro P. edulis Sims. f. flavicarpa Degener, tiveram como fonte de
explantes, segmentos hipocotiledonares (Barbosa, 1999; Reis, 2001; Alexandre, 2002;
Couceiro, 2002; Dias, 2005; Felismino, 2005; Reis, 2005) extraídos de plântulas
axênicas e estioladas, provenientes de germinação in vitro no escuro, em consonância
com o relato de Maciel & Bautista (1997), de que as sementes de P. edulis f. flavicarpa
são fotoblásticas negativas.
Outros pesquisadores utilizam também materiais juvenis, como cotilédones,
hipocótilos e folhas de plântulas na propagação in vitro (Scorza & Janick, 1980;
Kantarajah & Dodd, 1990; Dornela & Vierira, 1993). Kawata et al. (1995), enfocando a
propagação de plantas lenhosas, mencionam a dificuldade da capacidade morfogênica de
explantes adultos. Drew (1991) já havia verificado também, a dificuldade de se cultivar
explantes in vitro, provenientes de plantas adultas de Passifloras. Couceiro (2002)
menciona que segmentos hipocotiledonares de P. edulis Sims f. flavicarpa Degener
proporcionam maior resposta organogênica.
Dentre estes trabalhos, especificamente os de Rêgo (2001), Reis (2001),
Alexandre (2002) e Couceiro (2002) deemonstraram que as sementes provenientes de
frutos maduros, extraídas e colocadas imediatamente para germinar in vitro,
proporcionaram plântulas vigorosas, com tamanho e diâmetro suficientes para a extração
de cinco segmentos de hipocótilo de aproximadamente 1 cm cada. Dos três trabalhos
citados acima, apenas Alexandre (2002) utilizou como explante ápices caulinares com
2,0 cm de comprimento, e que continha folhas cotiledonares envolvidas por restos do
rudimento seminal.
Visto que os segmentos hipocotiledonares são explantes que proporcionam
melhores respostas organogênicas em P. edulis f. flavicarpa, a maneira mais prática e
eficiente de consegui-los é a partir de plântulas axênicas, germinadas e crescidas in vitro.
Entretanto isso acarreta um problema: é que para evitar a elevada variabilidade da
espécie, as sementes necessitam ser extraídas de frutos colhidos de uma única planta
matriz e serem armazenadas em quantidade, de modo a cobrir a demanda de sementes
6
para todos os experimentos planejados. Assim, estas ao serem armazenadas, podiam
apresentar baixo vigor e com isso, afetar o crescimento das plântulas in vitro. Alexandre,
Couceiro e Felismino (comunicação pessoal), ao utilizarem sementes armazenadas, por
mais de 6 meses, em geladeira à 4 ºC, acondicionadas em sacos de papel permeável,
quando colocadas para germinar, originavam plântulas anormais, com diâmetro pequeno
(muito finas) e raquíticas; e, em muitos casos, quando germinavam, apresentavam
características de anormalidade, não atingindo o estádio de plântula. O uso de sementes
armazenadas pode causar, além dessas pertubações fisiológicas, outras, tais como a de
comprometer a capacidade morfogênica dos explantes, em função da idade dos mesmos.
Schroeder & Stimart (1999) ao trabalharem com explantes de hipocótilos envelhecidos
de Antirrhinum majus L. verificaram redução do número de brotos, influenciada,
possivelmente, por níveis reduzidos de citocininas endógenas, redução da sensibilidade à
citocinina exógena e redução da totipotência.
É importante ter em conta que os problemas que se apresentam no cultivo in vitro
de P. edulis f. flavicarpa iniciam com as sementes e é necessário estudá-los. Esta
dificuldade com as sementes armazenadas passou a ser preocupação para os
pesquisadores, já que tinham que fazer uso destas, tendo em vista que os cultivos eram
contínuos. Havia então de estudar não apenas a espécie nesta condição, senão também
de diferentes materiais genéticos para verificar se este fato ocorria com a espécie, ou se
era devido à diferença entre genótipos.
Nos cultivos in vitro do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, alguns trabalhos
fazem menção a sintomas de clorose encontrada em diferentes tipos de explantes
(Barbosa, 1999; Reis, 2001; Alexandre, 2002; Couceiro, 2002 e Felismino, 2005).
Apenas alguns destes trabalhos relacionam esse problema com determinados fatores,
porém não a sua causa, como o de Barbosa et al. (2001), Reis et al. (2003) e Dias (2005)
que atribuem a clorose nos tecidos, ao aumento na produção de etileno. E, ao estudarem
o efeito de inibidores como o AVG (aminoetóxi-vinil-glicina), STS (tiossulfato de
prata), e do seqüestrador PM (perclorato de mercúrio) na biossíntese de etileno,
verificaram redução na produção desse gás. Segundo estes autores, o uso dessas
substâncias (AVG e STS) foi providencial para retardar ou inibir a senescência foliar e
abscisão do pecíolo (Faria & Segura, 1997; Reis et al., 2003). Em outro trabalho,
7
Kantharajah & Dodd (1990) observaram que a permanência de explantes nodais de P.
edulis no meio MS contendo BAP por mais de 4 semanas, levou a ficarem cloróticos e
eventualmente morriam. Esses autores supõem que o acúmulo de BAP nos tecidos pode
promover sintomas de toxicidade.
Apenas dois autores estudando a espécie P. edulis f. flavicarpa mostram as
causas de sintomas de clorose em explantes cultivados nas condições in vitro. O
primeiro foi o trabalho desenvolvido por Monteiro-Hara (2000), no qual, observaram
aspecto clorótico dos explantes de P. edulis f. flavicarpa, e relacionaram esta
característica com sintomas de deficiência mineral, quando as plantas desta espécie
foram cultivadas em meio MS. Entretanto, aquelas cultivadas em meio MSM (MS
modificado), as folhas eram verdes e as plantas apresentaram maior tamanho. O segundo
trabalho, desenvolvido por Alexandre (2002), relacionou os sintomas de clorose, tanto
em estruturas organogênicas (gemas e brotos), quanto em plântulas de P. edulis f.
flavicarpa cultivadas in vitro, a níveis elevados de irradiância e sua associação com
baixas concentrações de sacarose no meio de cultivo. Segundo o autor, o
amarelecimento do limbo foliar foi bastante evidenciado, principalmente com o aumento
dos níveis de irradiância, a partir de 50 µmol m
-2
s
-1
, com a clorose sendo mais
perceptível em 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
. O autor verificou ainda, nos valores mais altos de
irradiância, fotoinibição da fotossíntese, sendo mais perceptível, quando cultivou os
ápices caulinares em meio com ausência de sacarose e os incubou à irradiância de 150
µmol m
-2
s
-1
. A fotoinibição, detectada a partir de 50 µmol m
-2
s
-1
, sinaliza prejuízos
para o desenvolvimento normal dos ápices caulinares.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) influenciada pela irradiância e
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11
Capítulo I
Germinação de sementes de progênies de
Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener,
submetidas a tratamentos físicos no tegumento e
ao armazenamento
RESUMO
Este trabalho teve por objetivo avaliar a germinação de sementes de progênies de
Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener, submetidas a tratamentos físicos no
tegumento e ao armazenamento. O delineamento experimental foi o inteiramente
casualizado, em esquema fatorial 12x3x5 (progênies: 2, 6, 8, 14, 15, 16, 18, 22, 23, 33,
36 e 38 x tratamentos físicos no tegumento: intacto, escarificado e trincado x tempo de
armazenamento: 0, 3, 6, 9 e 12 meses), com 4 repetições de 25 sementes. Avaliou-se a
primeira contagem do teste de germinação (aos 14 dias), teste de germinação (aos 28
dias), condutividade elétrica, peroxidação de lipídios, padrões isoenzimáticos, da álcool
desidrogenase (ADH) e da malato desidrogenase (MDH). Foram identificadas as
progênies 22 e 2 como sendo as mais vigorosas no tempo zero e aos 12 meses de
armazenamento, respectivamente. A progênie 2 atingiu a maior porcentagem de
germinação (61,0%) sem a necessidade de tratamentos físicos no tegumento das
sementes aos 12 meses de armazenamento. A progênie 2, que faz parte do grupo das
sementes que apresentaram a melhor qualidade fisiológica, apresentou um dos menores
valores de condutividade elétrica, conteúdo de MDA e intensidade de bandas para a
MDH e maior para ADH. Com esse estudo foi possível verificar que, dentre as
progênies estudadas, existe grande variabilidade quanto à qualidade fisiológica das
sementes.
12
1. INTRODUÇÃO
Nos programas de melhoramento genético, que visam a obtenção de genótipos
com alta qualidade de sementes, a diversidade genética é de fundamental importância,
podendo por meios de testes de vigor, selecionar indivíduos que apresentem sementes
com elevada qualidade fisiológica (Kryzanowski & França Neto, 2001).
A dureza tegumentar, descrita por Maciel et al. (1997), está relacionada ao
episperma duro com evaginações internas e invaginações externas, e é um dos interesses
de estudos para as espécies de maracujazeiro. Tratamentos aplicados a esta estrutura
podem reduzir o tempo e até mesmo aumentar a taxa de germinação. Assim, Morley-
Bunker (1974) já recomendava o uso de processos mecânicos para a remoção
tegumentar e a melhoria das condições ambientais para promover germinação rápida e
uniforme.
Na propagação seminífera, as sementes podem ser utilizadas tão logo sejam
extraídas dos frutos ou após o armazenamento. A longevidade dessas sementes é o
período no qual mantém-se vivas, isto é, capazes de germinar, quando colocadas em
condições favoráveis (Toledo & Marcos Filho, 1977). Condições ideais de
armazenamento podem manter a viabilidade, ou seja, o efetivo período de vida das
sementes. Becwar et al. (1983) determinaram 2 % como sendo o limite mínimo de
umidade para que sementes do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa mantivessem sua
viabilidade inalterada, correlacionando tal limite às características das sementes
ortodoxas.
Segundo Berjak et al. (1990), as sementes ortodoxas apresentam teor de água
variável durante a vida. Para essas sementes, o período de viabilidade aumenta à medida
que decrescem a temperatura e a umidade do ambiente de armazenamento (Roberts,
1972). Espécies ortodoxas, ao passarem por processo de desidratação, podem
permanecer por muitos anos armazenadas em temperaturas ambiente ou baixas (Roberts,
1973). Em contraste, embriões recalcitrantes não sobrevivem, quando as sementes são
desidratadas ou passando por desidratação ou armazenadas a baixas temperaturas.
13
Hidalgo & Taveira (1996) mostraram que a manutenção das sementes de P.
nitida, por um período de armazenamento foi benéfica, eliminando as substâncias
inibidoras da germinação.
Não existe ainda no Brasil, um comércio regular de sementes selecionadas de
maracujá. Isso põe em relevo a importância de se conservar as sementes em boas
condições durante o armazenamento.
Coleções de plantas de distintas espécies vêm sendo mantidas na forma de
sementes em câmaras frias e secas, constituindo-se, assim, bancos de germoplasma, os
quais se revestem de fundamental valor para programas de melhoramento. Essa
metodologia é muito interessante, já que são encontradas várias dificuldades de manter
plantas no campo, como por exemplo, sob condições climáticas adversas e incidência de
fitoparasitas. Utilizando-se esta forma de conservação de germoplasma, os campos são
reinstalados, quando há necessidade de rejuvenecimento dos estoques (Meletti &
Bruckner, 2001). Para espécies de maracujazeiro P. edulis e P. edulis f. flavicarpa, há
necessidade de maiores estudos, para que o tempo de preservação das sementes com a
manutenção de sua viabilidade possa ultrapassar os 12 meses.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a germinação de sementes de progênies do
maracujazeiro submetidas a tratamentos físicos no tegumento e ao armazenamento.
2. MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Tecnologia e Análise de
Sementes do Departamento de Fitotecnia, no Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Espírito Santo, em Alegre-ES.
Frutos maduros do maracujazeiro Passiflora edulis Sims. f. flavicarpa Degener
foram coletados de 12 progênies de meios-irmãos (Tabela 1) no pomar do Setor de
Fruticultura da Fazenda Experimental do Departamento de Fitotecnia, da Universidade
Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais.
Foram coletados frutos de uma única planta, dentro de cada progênie; as
sementes foram extraídas seccionando os frutos pela metade, retirando-se de sua
cavidade interna, a mucilagem contendo as sementes. A mucilagem foi separada das
14
sementes em peneira de malha fina, acrescida de cal virgem (CaO) e submetida a fricção
com as mãos, de forma a remover o arilo. Executada esta operação, as sementes foram
lavadas em água corrente para retirada final dos restos placentários. Depois de
completamente limpas e enxaguadas, foram dispostas em folhas de papel toalha, e
deixadas para secar à sombra por três dias.
Após secagem à sombra, as sementes foram submetidas aos seguintes
tratamentos físicos no tegumento: intacto (controle, neste caso, o tegumento das
sementes não foi submetido a tratamentos físicos); escarificado (em que o lado oposto à
região afilada das sementes foi friccionado em lixa d' água nº 220) e trincado (em que a
região equatorial ou de sutura das sementes foi colocada entre os braços de uma mini-
morsa e submetida a determinada força até que ocorresse o rompimento do tegumento).
Tabela 1. Ascendência e procedência das doze progênies de meio-irmãos do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa.
Progênies Caracterização Ascendência Procedência
2 Progênie de meios-irmãos (CS9 x P3) Viçosa-MG
6 Progênie de meios-irmãos Planta 1 Campos dos Goytacazes-RJ
8 Progênie de meios-irmãos (CY6 x Sul Brasil) Viçosa-MG
14 Progênie de meios-irmãos (CT8 x Sul Brasil) Viçosa-MG
15 Progênie de meios-irmãos (CT8 x P2) Viçosa-MG
16 Progênie de meios-irmãos (CT8 x P3) Viçosa-MG
18 Progênie de meios-irmãos (CT8 x P1) Viçosa-MG
22 Progênie de meios-irmãos P1 Viçosa-MG
23 Progênie de meios-irmãos P3 Viçosa-MG
33 Progênie de meios-irmãos T16 Viçosa-MG
36 Progênie de meios-irmãos T28 Viçosa-MG
38 Progênie de meios-irmãos Norte do Rio de Janeiro
Executados os tratamentos físicos no tegumento, as sementes das progênies, em
separado, foram usadas para formar dois lotes. O primeiro deles continha 300 sementes
de cada progênie, as quais foram tratadas com imersão por dois minutos em hipoclorito
15
de sódio a 3%, seguida da imersão em Benlate (Benomyl 500
®
) na concentração de 2,0 g
L
-1
, por dois minutos. Após cada um dos tratamentos, as sementes foram lavadas em
água destilada. Em seguida, foram distribuídas em rolos de papel Germitest
®
e
incubadas em câmara de germinação tipo BOD, equipada com tubos fluorescentes
OSRAM
®
, com potência de 40 W m
-2
, luz do dia, promovendo o conjunto de 4 lâmpadas
irradiância de 30 µmol m
-2
s
-1
e fotoperíodo de 12/12 horas (luz/escuro), sob temperatura
alternada de 20-30 ºC.
O segundo lote constituiu-se de 1000 sementes para cada progênie. As sementes
de cada progênie foram, acondicionadas em sacos de papel permeável e armazenadas em
câmara seca regulada à temperatura de 4º C e 30% de UR. O período de armazenamento
teve duração de 12 meses.
2.1. Características avaliadas
No início e a cada três meses foi determinado o teor de água das sementes (U,
%), primeira contagem do teste de germinação (germinação aos 14 dias), teste de
germinação (germinação aos 28 dias), condutividade elétrica, peroxidação de lipídios e
padrões izoenzimáticos.
2.1.1. Teor de água das sementes
O teor de água das sementes foi determinado, pesando-se quatro subamostras de
25 sementes e transferindo-as para estufa regulada a 105 ± 3 ºC, por 24 horas (Brasil,
1992). Os resultados foram calculados com base no peso úmido (Bu) e expressos em
porcentagem.
2.1.2. Germinação
Este teste foi realizado com quatro subamostras de 25 sementes, para cada
repetição/tratamento, distribuídas em rolos de papel Germitest®, umedecido com água
destilada, na proporção de 2,5 vezes o peso do papel, que foram mantidos em câmaras
16
de germinação tipo BOD, regulada à temperatura alternada de 20-30 ºC e fotoperíodo de
12/12 horas. As avaliações do teste foram feitas após 14 e 28 dias do início do teste,
computando-se as plântulas normais germinadas (Brasil, 1992) e os resultados expressos
em porcentagem de germinação e o vigor avaliado através da primeira contagem de
germinação, realizada conjuntamente com o teste de germinação, contabilizando-se as
plântulas normais presentes após 14 dias da semeadura e os resultados expressos em
porcentagem de plântulas normais.
2.1.3. Condutividade elétrica
Foram utilizadas quatro subamostras de 25 sementes intactas e armazenadas por
12 meses para cada tratamento, pesadas em balanças de precisão de 0,01g e colocadas
em copos plásticos (6 cm de base) contendo 75 mL de água desionizada, mantidas em
câmara tipo BOD regulada à temperatura constante de 25 ºC, onde permaneceram
incubadas por um período de 24 horas. Decorrido este período, a condutividade elétrica
da solução foi determinada através da leitura em condutivímetro de bancada Digimed
Cd-20 conforme metodologia descrita por Krzyzanowski et al. (1991) e os valores
médios obtidos foram expressos em µS cm
-1
g
-1
de semente.
2.1.4. Determinação do teor de malondialdeído (MDA)
A peroxidação lipídica das sementes foi expressa como teor de malondialdeído
(MDA), determinado pelo método de TBARS (Buege & Aust, 1978). Amostras de
sementes dentro de cada progênie (100 mg de matéria fresca) foram homogeneizadas em
5,0 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0,1% (p/v), na presença de
polivinilpolipirrolidona (PVPP) na proporção de 1:1,5 (PMF:PVPP). O homogenato foi
centrifugado por 30 minutos a 4000 g. Todas as etapas necessárias ao processo de
extração foram conduzidas a 4 ºC. Retirou-se do sobrenadante uma alíquota de 1,0 mL,
adicionando-lhe 4,0 mL da mistura contendo 10% (p/v) de TCA e 0,5 % de TBA,
contendo 0,01% de BHT (butilhidroxitolueno). Em seguida, os tubos de ensaio contendo
a mistura foram fechados e incubados em banho-maria por 15 minutos a 95 ºC, sob
17
agitação. A reação foi interrompida pela transferência dos tubos de ensaio para banho de
gelo. O “branco” foi preparado sem a amostra, porém seguindo todas as outras etapas. A
absorvância do sobrenadante foi lida a 535 nm e 600 nm. A quantidade formada do
complexo MDA-TBA foi determinada, utilizando-se a metodologia descrita por Dhindsa
et al. (1981), conforme a seguinte equação: [MDA] = (A
535
-A
600
)/(ζ . b), onde, ζ
(coeficiente de extinção) = 1,56 x 10
-5
mol
-1
cm
-1
e b (comprimento ótico) = 1 cm.
2.1.5. Padrões izoenzimáticos
Utilizou-se para análise isoenzimática amostras de sementes congeladas em
nitrogênio líquido e mantidas a –80 ºC. Para a extração, cerca de 100 mg de sementes
para cada mL de solução-tampão foram macerados, utilizando almofariz e pistilo,
previamente congelados e mantidos sobre barras de gelo (Arimura, 1997).
Os sistemas isoenzimáticos foram caracterizados pela técnica de eletroforese
horizontal em géis de amido de milho a 12% em solução tampão (Conkle et al., 1982).
No preparo do gel, foram empregados 350 mL de solução-tampão, dos quais 80
mL foram vertidos em um balão volumétrico de 1000 mL e levados à fervura em fogo
brando. Imediatamente após a fervura, o conteúdo do balão volumétrico foi vertido no
erlenmeyer e este retomado à chama, para o cozimento do amido. Em seguida, o
conteúdo do Erlenmeyer foi vertido em uma forma de acrílico (17,0 x 14,0 x 1,0 cm)
sobre a qual se colocou uma placa de vidro pré-aquecida a 60 ºC, com a finalidade de se
uniformizar a superfície do gel. Os géis foram preparados à tarde e deixados à
temperatura ambiente até a manhã do dia seguinte. Em seguida, foram resfriados a 4 ºC
por uma hora em câmara fria, antes da condução da eletroforese.
Para a aplicação das amostras e corrida eletroforética, retirou-se a placa de vidro
e, a cerca de 2,5 cm da extremidade, fez-se um corte perpendicular, afastando a menor
porção do gel. As sementes maceradas em solução tampão foram aplicadas em uma tira
de papel cromatográfico Whatman 3 MM (12 x 5 mm), com auxílio de uma pinça, para
absorção do filtrado. As amostras absorvidas pelas tiras de papel foram colocadas ao
longo da face cortada do gel maior, cobrindo completamente a espessura do gel.
Aplicou-se a solução de azul de bromofenol em tira própria, para monitorar a migração.
18
Em seguida, foi apoiado o suporte do gel sobre as cubas, conectando-se o gel às cubas
dos eletrodos, mediante uma ponte de pano fino Perfex previamente embebida na
solução tampão específica para cada sistema enzimático.
Fez-se uma pré-corrida eletroforética durante 15 minutos a 150 volts, a fim de
que as proteínas fossem liberadas das tiras de papel Whatman para o gel. Desligou-se o
aparelho, retirou-se o gel das cubas e, em seguida, removeram-se as tiras com auxílio de
pinça cirúrgica. Após este procedimento, conectou-se novamente o gel às cubas e ligou-
se o aparelho a 200 volts, segundo metodologia utilizada por Arimura (1997). Após a
corrida eletroforética, o gel foi cortado horizontalmente em quatro fatias, com auxílio de
guias e mediante o uso de um fio de nylon. As fatias dos géis foram, então, colocadas
sobre bandejas refratárias tipo Pyrex e sobre elas foram vertidas as soluções com os
substratos específicos para cada sistema enzimático, conforme Borsol Filho (1995).
Para os sistemas enzimáticos álcool desidrogenase (ADH) e malato
desidrogenase (MDH), as bandejas refratárias foram colocadas em estufa à temperatura
de 37 ºC, no escuro, até o aparecimento das bandas isoenzimáticas. Em seguida, as
soluções reveladoras foram descartadas pela passagem de água corrente e os padrões nos
géis foram fixados, durante 12 horas em câmara fria a 4 ºC, com uma solução com 10%
de glicerina. Após este período, a solução de glicerina foi removida e substituída por
uma solução com 65% (v/v) de álcool etílico, 30% (v/v) de água e 5% (v/v) de glicerina,
durante 5 minutos, com o objetivo de desidratarem os géis. Imediatamente após, os géis
foram secados pelo método do bastidor e armazenados em papel-toalha. A avaliação das
bandas foi feita de acordo com a sua intensidade.
2.2. Delineamento experimental
Utilizou-se delineamento experimental inteiramente casualizado, em esquema
fatorial 12 x 3 x 5 (progênies: 2, 6, 8, 14, 15, 16, 18, 22, 23, 33, 36 e 38 x tratamentos
físicos no tegumento: intacto, escarificado e trincado x tempo de armazenamento: 0, 3,
6, 9 e 12 meses), com quatro repetições de 25 sementes.
19
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Teor de água das sementes
Após a extração e secagem por três dias, as sementes das doze progênies (2, 6, 8,
14, 15, 16, 18, 22, 23, 33, 36 e 38) avaliadas apresentaram 10,45; 9,97; 10,59; 9,84;
10,0; 10,48; 9,63; 10,08; 10,20; 10,36; 9,71 e 10,33% de umidade, respectivamente. A
variação, portanto, entre a maior (10,59%, progênie 8) e a menor (9,63%, progênie 18)
umidade foi de 0,96%. Ao longo do período de armazenamento (3, 6, 9 e 12 meses), em
média, as progênies, na ordem anteriormente citada, apresentaram 8,95; 9,22; 9,22; 8,45;
8,57; 8,84; 8,33; 9,17; 9,24; 9,05; 8,97 e 9,49% de umidade, respectivamente. Isso
sugere que houve redução no teor de água das sementes, sendo superior a 1 %, nas
progênies 2 (1,5%), 8 (1,37%), 14 (1,39%), 15 (1,43%), 16 (1,64%), 18 (1,1%) e 33
(1,31%). As demais progênies apresentaram redução no teor de água abaixo deste índice
(Figura 1).
20
Figura 1. Grau de umidade (%) das sementes de doze progênies do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa, durante 12 meses de armazenamento.
3.2. Vigor
Nas sementes com tegumento intacto e não armazenadas (0 meses), a progênie
22 apresentou maior germinação de suas sementes, atingindo valores de 65,0% (Figura
2A). As demais progênies apresentaram baixa germinação, com valores inferiores a
28,0% e inclusive em algumas destas progênies (6; 8; 15 e 16), não houve germinação
alguma. Quando se procedeu a escarificação no tegumento, novamente, foram as
sementes da progênie 22, aquelas que mostraram-se mais vigorosas. O acréscimo na
0
2
4
6
8
10
12
036912
Tempo (meses)
0
2
4
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036912
Tempo (meses)
0
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036912
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036912
0
2
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036912
0
2
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036912
0
2
4
6
8
10
12
036912
Umidade (%)
0
2
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6
8
10
12
036912
Umidade (%)
0
2
4
6
8
10
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036912
Umidade (%)
0
2
4
6
8
10
12
036912
Tempo (meses)
Umidade (%)
Progênie 2
Progênie 6
Progênie 8
Progênie 14
Progênie 15
Progênie 16
Progênie 18
Progênie 22
Progênie 23
Progênie 33
Progênie 36
Progênie 38
21
germinação das sementes, ao escarificá-las, foi baixo e as progênies cujas sementes
responderam a este tratamento foram as 6 (10,0%), 8 (11,5%); 15 (18,5%); 16 (14,5%);
22 (5,5%), 23 (2,0 %); 33 (12,5%) e 38 (9,5%). Nas demais progênies, a escarificação
do tegumento reduziu a germinação. Não obstante, quando se empregou, como
tratamento, o trincamento do tegumento, foi a progênie 23 a que apresentou a maior
germinação das sementes, atingindo valores de 75,0%. Isso se traduziu em elevação 62,0
e 60,0% na germinação, se comparado às sementes intactas e escarificadas que não
diferiram estatisticamente entre si. O aumento na germinação foi mais expressivo,
quando as sementes foram trincadas, pois elevou a germinação das sementes de todas as
progênies.
Aos 3 meses de armazenamento, as sementes com tegumento intacto da progênie
22 foram consideradas as que resultaram em maior porcentagem de germinação (84,0%)
(Figura 2B). Essa germinação foi aumentada em 25%, quando se compara estas
sementes com aquelas que não foram armazenadas (65,0%). Embora tenha sido
considerada a progênie com sementes mais vigorosas, não foi observado ganho
representativo ao promover tratamentos físicos no tegumento. Porém, as progênies 8, 14,
15 e 18 lograram ganhos consideráveis de 21,5; 29,0; 23,0 e 39,0%, respectivamente,
quando as sementes foram escarificadas. Ao trincar o tegumento das sementes, a
germinação aumentou em relação ao controle, aumentando também o número de
progênies que mais se beneficiaram com esse tratamento (6 - 23,0%; 8 - 51,5%; 14 -
37,0%; 15 - 23,0%; 16 - 44,0%; 17 - 37,0%; 23 - 29,0% e 33 - 30,5%).
Aos 6 meses de armazenamento, altos índices de germinação foram obtidos com
as progênies 15 (78,0%) e 23 (85,0%) (Figura 2C). E aos 9 meses, as progênies 2, 22, 23
e 36 atingiram valores de aproximadamente 50,0 % de germinação (Figura 2D).
22
Figura 2. Vigor (%) de sementes de doze progênies do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa, submetidas a tratamentos físicos no tegumento e ao
armazenamento (A: 0 ; B: 3; C: 6; D: 9 e E: 12 meses). Médias seguidas pela
mesma letra minúscula dentro de cada tratamento físico no tegumento, entre
as progênies, não diferem entre si, pelo Teste de Tukey, a 5% de
probabilidade.
A
Progênies
b
b
b
c
c
d
c
c
c
b
c
c
c
b
d
c
b
c
b
c
d
a
a
b
b
b
a
c
b
d
b
c
c
b
b
d
0
20
40
60
80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
2 6 8 14 15 16 18 22 23 33 36 38
b
b
a
d
d
c
e
c
b
d
b
b
c
bb
e
d
b
c
a
a
a
a
a
c
b
a
c
c
b
c
c
b
c
b
b
0
20
40
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80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
b
c
b
b
e
d
b
e
f
b
d
e
b
b
a
b
e
f
a
c
c
a
a
b
a
a
a
bc
b
a
c
b
a
c
d
0
20
40
60
80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
a
a
a
a
b
c
a
d
d
b
c
c
a
e
d
b
e
d
a
b
b
b
e
a
b
a
a
b
c
b
b
c
a
b
d
d
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Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
a
a
a
c
c
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c
d
a
c
c
a
c
c
a
cd
a
b
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a
b
a
a
b
a
b
c
a
a
c
a
b
d
a
0
20
40
60
80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
B
C
D
E
23
Apenas a progênie 2, aos 12 meses de armazenamento, foi estatisticamente
superior as demais, mostrando ser mais vigorosa (58,0%) (Figura 2E). Esta identificação
é marcadamente importante para a caracterização de indivíduos que toleram mais ao
processo de armazenamento. Observa-se também aos 12 meses de armazenamento, que
a escarificação das sementes das progênies 18, 22, 23 e 36 resultou em pequeno aumento
para esta característica (Figura 2E). Entretanto, neste período, o trincamento foi muito
prejudicial ao processo germinativo em todas as progênies avaliadas.
A identificação das progênies 22 e 2, como sendo as mais vigorosas no tempo
zero (Figura 2A) e aos 12 meses de armazenamento (Figura 2E), respectivamente,
permitiu, com base na primeira contagem do teste de germinação, antecipar o
reconhecimento de determinados indivíduos, quanto ao vigor das sementes. Esse teste
fisiológico é de fundamental importância, por exemplo, para a propagação seminífera,
no que diz respeito à produção de mudas destinadas a porta-enxertos originando, dessa
forma, lotes uniformes e bem como para a manutenção de bancos de germoplasma.
Entre as progênies estudadas, verifica-se diferentes respostas quanto ao vigor e à
germinação das sementes (Figuras 2 e 4). Entretanto, a capacidade germinativa das
progênies não é influenciada apenas pela herança genética, cromossômica,
extracromossômica, mas também pela movimentação de substâncias químicas, como
inibidores de crescimento, dos tecidos maternos para as sementes em desenvolvimento
(Cardoso, 2004). A transmissão de genes pode ser feita pela via não-nuclear ou
maternal, por exemplo, em mitocôndrias e cloroplastos, como também por meio de
tecidos da semente de origem materna, por exemplo a casca, testa e o pericarpo que
podem afetar a germinabilidade das sementes (Foley & Fennimore, 1998).
Na Figura 3, observa-se que a germinação das sementes intactas se elevou em
58,33 e 25,0% das progênies, respectivamente com aumento no período de
armazenamento até 6 e 9 meses. O maior vigor nas progênies 2 e 38 foi observado aos 3
meses, nas 2, 6, 15, 18, 23, 33 e 36, aos 6 meses e nas 8 e 14, aos 9 meses de
armazenamento (Figura 3). Isto é indicativo de que as progênies requerem diferentes
tempos de armazenamento para aumentar a germinação de suas sementes. Conforme
relatado por Alexandre et al. (2004) essa diferença na germinação é causada pela
genótipo.
24
A utilização de tratamentos físicos no tegumento das sementes, como a
escarificação, elevou a germinação das sementes nas progênies 8, 14 e 16 (até 9 meses) e
18, 22 e 38 (até 12 meses), em relação ao controle (Figura 3). Por outro lado, quando o
tegumento das sementes foi trincado, o aumento foi apenas até o 6º mês de
armazenamento, nas progênies 6, 8, 14, 16, 18, 22, 36 e 38, em comparação ao controle.
Figura 3. Germinação (%) primeira contagem de sementes de doze progênies do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, submetidas a tratamentos físicos no
tegumento e ao armazenamento. As barras correspondem ao desvio-padrão da
média.
0
20
40
60
80
100
036912
0
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036912
Tempo (meses)
0
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0
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036912
Vigor (%)
Intacto
Escarificado
Trincado
0
20
40
60
80
100
036912
Tempo (meses)
0
20
40
60
80
100
036912
Tempo (meses)
Vigor (%)
0
20
40
60
80
100
036912
0
20
40
60
80
100
036912
Vigor (%)
0
20
40
60
80
100
036912
0
20
40
60
80
100
036912
Vigor (%)
Progênie 38
Progênie 36
Progênie 33
Progênie 18
Progênie 22
Progênie 23
Progênie 14
Progênie 15
Progênie 16
Progênie 2
Progênie 6 Progênie 8
25
3.3. Germinação
Independente do tratamento aplicado às sementes, a progênie 22 foi a que
apresentou os maiores valores de germinação, até aos 6 meses de armazenamento
(Figuras 4A, B e C). Para esta progênie, as sementes intactas, com 10,0% de umidade,
apresentaram 65,5%; as escarificadas 72,5% e as trincadas 75,5% de germinação (Figura
4A). Quando se procedeu o trincamento do tegumento de suas sementes, não houve
diferença estatística entre as progênies 2 (80,5%), 6 (69,5%), 23 (85,5%) e 33 (80,0%)
(Figura 4A). Martins et al. (2005) obtiveram praticamente a mesma porcentagem de
germinação (69,0%) em sementes de P. edulis f. flavicarpa com 10,0% de umidade.
Segundo estes autores, a dessecação das sementes não afetou inicialmente sua qualidade
fisiológica. Antes do armazenamento das sementes, verificou-se, neste trabalho, que a
maioria das progênies requer tratamentos físicos no tegumento fato este observado,
principalmente, ao trincar o tegumento, promovendo rachaduras nesta estrutura. O efeito
de tratamentos físicos no tegumento das sementes das progênies elevou a germinação,
principalmente quando este foi trincado (Figura 4A), revelando assim a barreira física
imposta por esta estrutura. Segundo Morley-Bunker (1980), a dormência das sementes
encontrada na família Passifloracea é considerada física, de ordem tegumentar,
controlando a entrada de água para o interior da sementes.
Alexandre et al. (2004), ao estudarem a germinação de 24 genótipos do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa em casa de vegetação, observaram que a progênie
33 apresentou os melhores resultados de germinação (84,0%) e vigor das plântulas.
Entretanto no presente trabalho, os melhores resultados de germinação de semente
intacta (65,5%) e vigor foram encontrados na progênie 22, ao passo que a progênie 33
apresentou baixa germinação (10,0%) e vigor. Apesar das 12 progênies estudadas neste
trabalho serem as mesmas avaliadas por Alexandre et al. (2004), esta diferença deve-se
provavelmente a dois fatores distintos, ou seja, primeiramente a utilização de dois
ambientes diferentes (casa de vegetação x câmara de germinação) que, neste caso, o
fator limitante seria as condições ambientais e o segundo, ao tipo de substrato
empregado (terra vermelha + areia, 1:1 v/v x rolo de papel).
26
Com 3 e 6 meses de armazenadas, as sementes da progênie 22, em todos os
tratamentos físicos no tegumento, foram consideradas as que apresentaram o maior
poder germinativo, com valores de 84,0% (intacto) e 85,0% (escarificado e trincado) aos
3 meses (Figura 4B) e 83,0% (intacto e escarificado) e 88,0% (trincado) aos 6 meses de
armazenamento (Figura 4C). Esta progênie diferiu estatisticamente das demais, quando
suas sementes permaneceram intactas, aos 3 meses de armazenamento (Figura 4B).
Porém, aos 6 meses, não diferiu estatisticamente das progênies 15 (85,0%) e 23 (86,0%)
(Figura 4C). A progênie 22, aos 3 meses de armazenamento, não diferiu estatisticamente
da progênie 18 (85,0%), quando escarificadas, e das progênies 2 (77,0%), 18 (88,5%) e
23 (83,5%), quando trincadas (Figura 4B). Da mesma forma, aos 6 meses, não diferiu
em relação as progênies 15 (78,0%) e 23 (85,0%), quando escarificadas e 2 (79,0%), 6
(88,0%), 18 (80,0%), 23 (83,0%), 36 (78,0%) e 38 (78,0%), quando trincadas (Figura
4C).
Aos 9 meses de armazenamento, as maiores porcentagens de germinação foram
obtidas com as progênies 6 (88,0%), 22 (98,0%) e 33 (91,0%), não diferindo
estatisticamente entre si. Valores altos de germinação também foram encontrados nas
progênies 2, 14, 18, 23 e 36, variando entre 71,0 e 85,0%. Neste período, ficou bastante
evidente o efeito negativo dos tratamentos físicos no tegumento, na metade das
progênies avaliadas (16, 18, 22, 23, 33 e 36), quando estas foram escarificadas, e para
todas as progênies, quando foram trincadas (Figura 4D).
27
Figura 4. Germinação (%) de sementes de doze progênies do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa, submetidas a tratamentos físicos no tegumento e ao
armazenamento (A: 0 ; B: 3; C: 6; D: 9 e E: 12 meses). Médias seguidas pela
mesma letra minúscula dentro de cada tratamento físico no tegumento, entre
as progênies, não diferem entre si, pelo Teste de Tukey, a 5 % de
probabilidade.
Progênies
b
b
a
d
c
a
d
c
b
b
c
b
d
b
c
d
c
c
c
c
b
a
a
a
c
c
a
d
b
a
c
c
b
c
b
c
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20
40
60
80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%)
2 6 8 14 15 16 18 22 23 33 36 38
A
B
C
D
E
a
b
bb
d
d
b
d
e
b
b
d
b
b
c
b
d
e
a
a
c
aa
a
a
b
c
b
c
c
b
c
c
b
b
c
0
20
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Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
a
b
b
a
c
d
b
c
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b
b
d
b
a
a
b
c
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a
b
c
a
aaa
a
a
b
b
b
a
b
b
a
b
c
0
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100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
a
a
b
a
a
a
a
b
d
b
a
b
c
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c
c
c
d
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b
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a
c
a
a
c
a
a
d
b
b
d
b
c
0
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80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%)
a
a
a
b
c
a
c
c
a
b
c
a
b
c
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cc
a
b
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a
a
b
a
a
b
a
b
c
a
a
c
a
b
c
a
0
20
40
60
80
100
Intacto Escarificado Trincado
Tratamento físico no tegumento
Germinação (%
)
28
Em todas as progênies que tiveram o tegumento das sementes trincado, aos 12
meses de armazenamento, a germinação foi inferior a 17,0%, não diferindo
estatisticamente entre si (Figura 4E). Entretanto, as progênies 2, 22, 23 e 36
responderam à escarificação, apresentando 48,0; 58,9; 53,0 e 43,0% de germinação,
respectivamente. O mais importante foi identificar, dentre as doze progênies, aquela ou
aquelas que apresentassem o melhor poder germinativo ao final de 12 meses de
armazenamento. Nas condições estudadas, a progênie 2 alcançou a maior porcentagem
de germinação (61,0%) das sementes com 8,0% de umidade e sem a necessidade de
tratamentos físicos no tegumento das sementes (Figura 4E). Martins et al. (2005)
verificaram que a conservação das sementes do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa é
favorecida pela combinação do grau de umidade de 10,0% com a temperatura de
armazenamento de 20 ºC. Nesta condição obtiveram 81,5% de germinação após 315 dias
de armazenamento. Esses autores verificaram também que nas sementes com 8,0% de
umidade a germinação foi de 75,0%, diferença de 14,0% menos do obtido no presente
trabalho. Não obstante, há que considerar a diferença de 50 dias no armazenamento
(aproximadamente 2 meses) entre os dois trabalhos. Catunda et al. (2003) verificaram
que a melhor forma para preservar o vigor das sementes após 10 meses de
armazenamento seria acondicioná-las em embalagens permeáveis e mantê-las em
refrigerador. Nesta condição, não houve diferenças entre os teores de 8 e 10% de
umidade, apesar das sementes com 10% mostrarem pequena superioridade em relação às
sementes com 8% de umidade, a partir do quarto mês de armazenamento. Fonseca &
Silva (2005) também verificaram que a secagem não afetou o desempenho fisiológico
das sementes dessa espécie antes do armazenamento, já que os valores de germinação e
vigor não foram afetados. Os valores médios da germinação das sementes em função dos
diferentes graus de umidade foram de 98,0% (31,3% U); 97,0% (26,8 e 20,9% U);
95,0% (16,6% U); 93,0% (10,8% U); 94,0% (7,3% U).
Verificou-se, com exceção da progênie 15, que as demais progênies aumentaram a
porcentagem de germinação das sementes intactas, até 9 meses do armazenamento
(Figura 5). Dentre estas, as que apresentaram germinação acima de 50,0% no tempo zero
de armazenamento, foram as progênies 2 (51,0%), 6 (86,0%), 18 (64,0%), 23 (66,5%),
33 (81,0%) e 36 (55,0%).
29
Em comparação às sementes intactas, o processo de escarificação foi benéfico à
germinação apenas da progênie 8 até 9 meses de armazenamento. O ganho em
comparação às sementes intactas foi de 25,0% (aos 3 meses), 28,0% (aos 6 meses) e
12,0% (aos 9 meses) (Figura 5).
Antes do armazenamento, observou-se o efeito positivo do rompimento da
estrutura tegumentar, quando as sementes de todas as progênies foram trincadas. (Figura
5). Entretanto, para as sementes armazenadas acima de 6 meses, este método não deve
ser empregado, visto que aos 9 e 12 meses de armazenamento, reduziu marcadamente o
processo germinativo para todas as progênies (Figura 5).
Segundo Almeida et al. (1988), os melhores resultados de germinação das
sementes de P. edulis f. flavicarpa foram obtidos aos 70 e 77 dias de idade dos frutos
nas condições de armazenamento em câmara seca e fria. Verificou-se ainda, que o
armazenamento nestas condições foi benéfico para a germinação das sementes,
concordando com o presente trabalho, no qual o aumento no tempo de armazenamento
em câmara seca até 9 meses foi benéfico para todas as progênies, com exceção da
progênie 15 (Figura 5). Becwer et al. (1983) já se referiam às sementes de P. edulis f.
flavicarpa como ortodoxas, fato corroborado por Nakagawa (1991). Entretanto, o que
provavelmente explica a perda do poder germinativo das sementes que tiveram o
tegumento trincado após 12 meses de armazenamento, seria que, ao promover este
processo mecânico, as células próximas ao embrião se encontrariam desorganizadas
devido ao armazenamento, não mais atuando de forma protetiva, facilitando, assim, o
efeito do dano diretamente ao embrião.
30
Figura 5. Germinação (%) de sementes de doze progênies do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa, submetidas a tratamentos físicos no tegumento e ao
armazenamento. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
3.4. Condutividade elétrica
As sementes das progênies 8, 14, 16 e 38 foram as que apresentaram maior valor
de condutividade elétrica, aos doze meses de armazenamento (Figura 6). Esses maiores
valores de condutividade elétrica foram referentes às progênies cuja germinação, ao final
dos doze meses de armazenamento, foi inferior a 20,0%. O aumento do vazamento de
0
20
40
60
80
100
036912
Tempo (meses)
0
20
40
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0
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036912
0
20
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036912
0
20
40
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100
036912
Tempo (meses)
0
20
40
60
80
100
036912
0
20
40
60
80
100
036912
0
20
40
60
80
100
036912
0
20
40
60
80
100
036912
Tempo (meses)
Germinação (%)
0
20
40
60
80
100
036912
Germinação (%)
0
20
40
60
80
100
036912
Germinação (%)
0
20
40
60
80
100
036912
Germinação (%)
In t a c t o
Escarificado
Trincado
Progênie 38
Progênie 36
Progênie 33
Progênie 18
Progênie 22
Progênie 23
Progênie 14
Progênie 15 Progênie 16
Progênie 2
Progênie 6
Progênie 8
31
eletrólitos durante a germinação de sementes reflete a perda da integridade da
membrana. Isto é indicativo de uma inabilidade para manter as membranas organizadas,
resultando finalmente em perdas na germinação, conforme verificado com as progênies
acima mencionadas. A desestruturação dos sistemas de membranas a nível celular tem
sido relatada como a consequência inicial da deterioração (Abdel Samad & Pearce,
1978).
Reações oxidativas são mediadoras do processo deteriorativo das sementes
(Flood & Sinclair, 1981) por auto-oxidação ou peroxidação em processo não enzimático
(Harrington, 1973). Entretanto, o envelhecimento das sementes pode ser mediado por
reações oxidativas envolvendo enzimas como as lipoxigenases; e também a deterioração
das sementes armazenadas pode ser induzida por processos enzimáticos (Pearce &
Abdel Samad, 1980). A oxidação de ácidos graxos insaturados é considerada a primeira
reação do processo de envelhecimento, produzindo radicais livres que atacam lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos, com reações em cadeia (Harrington, 1973).
Figura 6. Condutividade elétrica em sementes de doze progênies do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa, aos doze meses de armazenamento. As barras
correspondem ao desvio-padrão da média.
0
10
20
30
40
50
2 6 8 14 15 16 18 22 23 33 36 38
Progênies
Condutividade
elétrica (µS.cm
-1
.g
-1
)
32
3.5. Peroxidação de lipídios
As sementes das progênies 6, 8, 14, 15, 16, 18 e 38 foram as que apresentaram
maior concentração de malondialdeído (MDA), aos doze meses de armazenamento
(Figura 7). O aumento na permeabilidade da membrana, promovido pelo estresse no
armazenamento, corresponde bem com a peroxidação de lipídios, determinado pelo
aumento na concentração de MDA. Estes dados apoiam a idéia de que a perda de
viabilidade da semente está associada com o aumento da peroxidação de lipídios. A
ativação de um sistema antioxidante é fundamental na regulação do metabolismo celular
de forma a atuar como mecanismo protetor contra processos oxidativos que venham a
promover danos à integridade da membrana.
Figura 7. Peroxidação de lipídios (teor de MDA) em sementes de doze progênies do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, aos doze meses de armazenamento. As
barras correspondem ao desvio-padrão da média.
O processo de dessecação, bem como outros estresses bióticos e abióticos,
causam perdas em mecanismos de controle que mantêm baixas as concentrações de ROS
(“espécies reativas do oxigênio”) (Kranner et al., 2002). O aumento em ERMO, conduz
a processos deteriorativos com o envelhecimento e eventualmente à morte (Beckmann &
Ames, 1998). ROS como o radical superóxido (O
2
˙¯) é menos reativo, tendo meia-vida
de 2-4 μs, e baixa concentração celular (<10
-11
M) para causar peroxidação e ainda não
pode ultrapassar as membranas biológicas (Vronová et al., 2002). O O
2
˙¯ pode reagir
0
2
4
6
8
2 6 8 141516182223333638
Progênies
MDA (nmol.gMF
-1
)
33
com outro radical superóxido, por meio de reação não-enzimática ou por reação
enzimática (catalizada pela enzima superóxido dismutase, SOD), para formar o peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
). Uma vez formado, o H
2
O
2
, pode dar origem ao radical hidroxila
(OH˙) catalisado pelo íon ferro, através da reação de Haber-Weiss (Kranner & Birtic,
2005). Esse radical hidroxila é considerado a ROS mais reativa, sendo que uma de suas
características é a de iniciar a oxidação de ácidos graxos poli-insaturados das
membranas celulares (lipoperoxidação) (Ferreira & Matusubara, 1997). Segundo Wilson
& McDonald (1986), a peroxidação de lipídios promove a destruição de lipídios da
membrana; co-oxidação de componentes celulares pela transferência de radicais livres
no processo oxidativo; e também a formação de aldeídos citotóxicos. De acordo com
esses autores, por exemplo, os radicais livres vão dar origem a hidroperóxidos, que
podem sofrer desarranjos estruturais promovidos pela ação de calor, enzimas, citocromo,
metais de transição e hidrogênio, e formar os aldeídos, que reagem com grupos sulfidril,
conduzindo à inativação de proteínas e diminuição da atividade mitótica das células, por
inibir uma importante proteína dos microtúbulos chamada tubulina, que é necessária
para a formação do fuso mitótico.
3.6. Isoenzimas
3.6.1. Álcool desidrogenase (ADH)
As sementes das progênies 2, 22, 23, 33 e 36 foram as que apresentaram nos
padrões izoenzimáticos revelados para álcool desidrogenase (ADH), maior coloração de
bandas, se comparado aos das progênies 6, 8, 14, 15, 16, 18 e 38 (Figura 8).
Segundo Vantoai et al. (1987), à medida que ocorre redução na qualidade
fisiológica das sementes, provavelmente reduz a concentração de ADH e,
consequentemente, aumenta a concentração de acetaldeído.
A enzima álcool desidrogenase (ADH) atua no metabolismo anaeróbico de
plantas, reduzindo o acetaldeído a etanol (Vantoai et al., 1987). A produção de
acetaldeído durante o armazenamento acelerou a deterioração das sementes de beterraba
(Zhang et al., 1994)
34
3.6.2. Malato desidrogenase (MDH)
As sementes das progênies 6, 8, 14, 15, 16, 18, 33 e 38 foram as que
apresentaram nos padrões izoenzimáticos revelados para malato desidrogenase (MDH),
maior coloração de bandas, se comparado aos das progênies 2, 22, 23 e 33 (Figura 8).
A enzima malato desidrogenase é importante na respiração celular. A maior
intensidade de coloração de bandas dessa enzima pode estar relacionada com o aumento
da respiração que ocorre em sementes durante o processo deteriorativo avançado, uma
vez que enzimas envolvidas na respiração podem ser ativadas em sementes de qualidade
reduzida (Shatters et al., 1994).
A enzima malato desidrogenase catalisa a reação do malato à oxalacelato, tendo
importante função no ciclo de Krebs, além de participar do transporte de malato através
da membrana mitocondrial e da fixação de CO
2
nas plantas (Taiz & Zeiger, 2004).
Figura 8. Padrões isoenzimáticos em sementes de doze progênies do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa, revelados para álcool desidrogenase (ADH) e malato
desidrogenase (MDH), aos doze meses de armazenamento.
MDH
ADH
26 814 1516 182223333638
Progênies
35
4. CONCLUSÕES
٠ Há grande variabilidade genética dentre as progênies estudadas, quanto à qualidade
fisiológica das sementes;
٠ Por meio do teste de vigor é possível antecipar o reconhecimento de indivíduos mais
vigorosos;
٠ O armazenamento é benefico para a germinação das sementes dessa espécie;
٠ O trincamento das sementes armazenadas é prejudicial à germinação.
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40
Capítulo II
Efeito da benzilaminopurina (BAP) na
organogênese in vitro e na absorção de nutrientes
em Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener
RESUMO
O trabalho teve por objetivo avaliar a morfogênese e absorção de nutrientes pelos
segmentos de hipocótilo do maracujazeiro (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener), cultivados in vitro, na presença ou ausência de BAP (experimento I) e
submetidos previamente a imersão em meio de MS líquido contendo 0,7 mg L
-1
de BAP
(experimento II). Os segmentos de hipocótilo foram cultivados na ausência ou presença
de BAP (experimento I) e imersos em meio MS líquido com 0,7 mg L
-1
de BAP
(experimento II), onde permaneceram sob agitação a 60 rpm em agitador orbital em
tempos de 0, 1, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Em seguida foram plantados verticalmente
em meio MS sólido isento de regulador de crescimento. No experimento I, verificou-se
que o BAP está relacionado com a formação de maior número de gemas, em detrimento
da formação e alongamento de brotos. Nesse experimento, a presença de BAP inibiu por
completo a rizogênese. Além disso, esta citocinina influenciou negativamente a absorção
de nutrientes. E no experimento II, a exposição dos explantes por 36 horas ao BAP foi a
que resultou no maior número de gemas formadas. A não imersão dos explantes no
BAP, além de ter permitido a formação de brotos, foi a condição que proporcionou o
maior desenvolvimento destes. A imersão prévia dos segmentos hipocotiledonares em
BAP não inibiu a rizogênese, independentemente do tempo dessa imersão. Houve
formação de uma única raiz por explante, sendo pouco desenvolvida.
41
1. INTRODUÇÃO
Entre os reguladores de crescimento, o BAP (6-benzilaminopurina) parece ser a
citocinina mais adequada para a multiplicação de parte aérea, indução de gemas
adventícias e formação de brotos (Grattaplaglia & Machado, 1998) e é a mais utilizada
na cultura de tecidos, pois induz maior atividade morfogênica, se comporado à zeatina e
à cinetina (Marino & Bertazza, 1990).
Na literatura revisada, existem trabalhos nos quais se investigaram a resposta de
diferentes concentrações de BAP no cultivo in vitro de distintas espécies de
maracujazeiros. Dentre estes, o trabalho desenvolvido por Couceiro (2002) mostrou que
o cultivo de segmentos hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa na orientação vertical
em meio MS, contendo 0,7 mg L
-1
de BAP, foi a condição que auferiu maior êxito
quanto à resposta morfogênica. Entretanto, verificou-se neste e em outros trabalhos,
como o de Alexandre (2002) e Bento et al. (2004), formação de numerosas gemas,
porém com poucas delas alcançando a categoria de brotos. Alexandre (2002) e
Felismino (2005) observaram que as folhas dos brotos formados tornavam-se
acentuadamente cloróticas e, em alguns casos, quase brancas, sendo esta a possível razão
das brotações lograrem reduzido alongamento, impróprio para o transplantio e
aclimatização.
Kantharajah & Dodd (1990) observaram que a permanência de explantes nodais
de P. edulis no meio MS contendo BAP, por períodos de tempo superiores a quatro
semanas, resultou em baixa resposta organogênica e os brotos formados tornavam-se
cloróticos e eventualmente morriam. Esses autores explicam tal anomalia como sendo
conseqüência de uma possível toxidez resultante do acúmulo de BAP no tecido dos
explantes. Essa clorose em tecidos de P. edulis f. flavicarpa in vitro é descrita como
sério problema para o desenvolvimento das estruturas organogênicas (Alexandre, 2002;
Couceiro, 2002; Felismino, 2005). Em outras espécies, como urucuzeiro, morangueiro e
videira, também, se têm verificado clorose nos tecidos de plantas cultivadas in vitro
(Rodríguez Ortíz, 2004; Barbosa, 2006), e esse sintoma foi abribuído às citocininas.
Pitman (1977) aponta o ácido abiscísico e citocininas, como sendo fitoinibidores do
fluxo de íons do citoplasma para o xilema.
42
O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta morfogênica de segmentos de
hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa submetidos a diferentes tempos de
imersão em BAP e seu efeito na absorção de nutrientes.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas
As sementes foram extraídas de frutos maduros e colhidos de uma única planta
de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, procedente do pomar do Setor de Fruticultura,
da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais.
Em condições laboratoriais e mediante o uso de uma peneira de malha fina, o
arilo das sementes foi removido, pressionando-as cuidadosamente, depois de envolvê-las
em cal extinta. Em seguida, as sementes foram lavadas em água de torneira até completa
remoção da cal e restos placentários. Posteriormente, foram submetidas à secagem à
sombra, sobre papel toalha, por três dias. Após o processo de secagem, procedeu-se o
preparo das sementes. Com auxílio de uma mini-morsa, realizou-se a remoção por
completo do tegumento externo (episperma).
As sementes, sem o episperma, foram desinfestadas sob condições de câmara de
fluxo laminar. Inicialmente, foram submetidas por 1 minuto em solução de etanol a 70%
(v/v), seguido de três enxaguaduras e, logo após, imersas em solução de hipoclorito de
sódio com 2,4% de cloro ativo do produto comercial Candura
®
durante 20 minutos e,
posteriormente, enxaguadas por três vezes em tempos de 1 minuto, sob agitação
constante, em água desionizada e autoclavada.
O meio de cultivo das sementes foi constituído dos minerais nutrientes de MS
(Murashige & Skoog, 1962), vitaminas de White (1951), 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30
g L
-1
de sacarose e 8,0 g L
-1
de ágar (Isofar
®
), como agente solidificante. O pH do meio
foi ajustado a 5,7 ± 0,1, antes da adição do ágar. Alíquotas de 10 mL deste meio foram
distribuídas por tubo de ensaio (25 x 150 mm). Os tubos, contendo o meio foram
fechados com tampas de propileno transparentes e autoclavados a 121 ºC e pressão de
1,05 kgf cm
-2
, durante 20 minutos.
43
As sementes foram semeadas no meio de cultivo, uma por tubo de ensaio. Após o
semeio, os tubos foram fechados como já descrito anteriormente, acondicionados em
grades que foram envolvidas com papel alumínio e transferidos para a sala de cultivo
com temperatura de 27 ± 2 ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%. O papel
alumínio foi utilizado para proteger as sementes contra luz, já que são classificadas,
como fotoblásticas negativas por Maciel & Bautista (1997).
O período de incubação foi de 12 dias, tempo suficiente para obter as plântulas
axênicas, com hipocótilo de 10 cm de comprimento e 1,3-1,5 mm de diâmetro.
2.2. Fase de cultivo dos segmentos de hipocótilo
Obtidas as plântulas axênicas por meio da germinação in vitro, estas foram
excisadas separando de cada plântula 5 segmentos de hipocótilo de aproximadamente
1,0 cm de comprimento. O trabalho foi dividido em dois experimentos.
No primeiro experimento, os segmentos de hipocótilo foram cultivados na
ausência ou presença de 0,7 mg L
-1
de BAP.
No segundo experimento, os segmentos de hipocótilo, após sua individualização,
tiveram o extremo proximal (mais próximo ao sistema radicular) cortado em bisel
simples, de forma a identificar a polaridade do segmento. Em ato contínuo, os explantes
eram preparados e deixados em repouso dentro de uma placa de Petri contendo água
desionizada e autoclavada, de forma a conservá-los túrgidos. Após preparar os 50
segmentos que constituíram cada tratamento, estes foram introduzidos em Erlemeyer de
25 mL, contendo 8 mL do meio MS (apresenta a mesma constituição mineral e modo de
preparo já descrito para a semente) líquido, contendo 0,7 mg L
-1
de BAP. Estes
segmentos permaneceram sob agitação de 60 rpm em agitador orbital, na sala de cultivo,
à temperatura de 27 ± 2 ºC, no escuro, por tempos de 0, 1, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas.
Após os tempos de imersão em BAP, os segmentos de hipocótilo, em número de 5,
foram plantados em frascos de cultivo com capidade volumétrica de 320 mL, altura de
12,5 cm, diâmetro externo de 6,8 cm e interno de 6,5 cm, contendo aproximadamente 30
mL de meio MS, na orientação vertical, introduzindo a região cortada em bisel no meio
44
MS descrito para a imersão dos explantes, porém solidificado com 8 g L
-1
de agar
(Isofar
®
) e isento de regulador de crescimento.
Na sala de crescimento, os frascos contendo os segmentos de hipocótilo
permaneceram incubados por 42 dias, à temperatura de 27 ± 2 ºC, fotoperíodo 16/8 h
(luz/escuro) e irradiância de 30 ± 5 µmol m
-2
s
-1
, fornecida por tubos fluorescentes
OSRAM
®
, com potência de 40 W, luz do dia.
2.3. Características avaliadas
No experimento I, foram avaliados o número de gemas, brotos, raízes,
comprimento de brotos, raízes e teores de macro e micronutrientes na parte aérea, calo e
raízes. E no experimento II, o número de gemas, brotos, raízes, comprimento de brotos e
raízes.
2.4. Delineamento experimental
Os experimentos foram instalados em delineamento inteiramente casualizado,
com 10 repetições. O experimento I foi constituído de apenas dois tratamentos, ou seja,
ausência e presença de BAP. No experimento II, os tratamentos foram os tempos de
imersão (0; 1; 6; 12; 24; 36; 48 e 72 horas) dos segmentos de hipocótilo em BAP.
3. RESULTADOS
3.1. Experimento I
Na Figura 1A, observa-se que em meio de cultivo contendo BAP, a formação de
gemas foi maior (8,0), se comparado ao meio sem a citocinina (4,8). A presença de BAP
(0,7 mg L
-1
), no meio de cultura, estimulou os segmentos de hipocótilo do maracujazeiro
a produzirem 60,0% a mais de gemas, em relação ao meio com ausência desta
citocinina.
45
Entretanto, independentemente da presença ou da ausência do BAP no meio de
cultivo, a formação de brotos foi a mesma (Figura 1B). Todavia, o comprimento destes
em meio sem a citocinina foi acima do dobro (8,7 mm), comparado ao meio contendo a
citocinina (4,0 mm) (Figura 1C).
Nas Figuras 2A e B, observa-se a formação e o crescimento de raízes em meio de
cultivo com ausência de BAP. Em meio de cultivo contendo esta citocinina, o processo
rizogênico foi completamente inibido, dando lugar à formação de calos compactos e de
grande tamanho (Figura 3A).
Figura 1. Influência da ausência ou presença de BAP (0,7 mg L
-1
) na formação de gemas
(A), brotos (B) e comprimento de brotos (C) do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
0
2
4
6
8
10
Ausência Presença
BAP
Número de gemas
0
1
2
Ausência Presença
BAP
Número de brotos
0
2
4
6
8
10
Ausência Presença
BAP
Brotos (mm)
A
B
C
46
Figura 2. Influência da ausência ou presença de BAP (0,7 mg L
-1
) na formação (A) e no
comprimento médio de raízes (B) do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa. As
barras correspondem ao desvio-padrão da média.
Figura 3. Efeito do BAP no aparecimento de clorose internerval, sintomas de deficiência
mineral em folhas de plantas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa. (A)
ausência de BAP; (B) presença de BAP (0,7 mg L
-1
) no meio de cultivo.
0
1
2
Ausência Presença
BAP
Número de raízes
0
3
6
9
12
15
Ausência Presença
BAP
Raízes (cm)
A
B
A B
47
Nas análises, foi verificado efeito significativo do BAP no teor de nutrientes nas
diferentes partes da planta. Na parte aérea, maior acúmulo de macro e micronutrientes
ocorreu quando as plantas foram cultivadas em meio com ausência de BAP. Na presença
deste fitorregulador, as plantas apresentaram menor acúmulo na parte aérea,
principalmente de N, P, S, B, Cu, Fe e Zn (Tabela 1). Isto pode ser percebido na Figura
3B, pelo sintoma característico de clorose nas folhas, que está relacionado com a
deficiência principalmente de N, Fe e Zn.
Como já mencionado anteriormente, raízes se formaram somente na ausência de
BAP no meio de cultivo; e pela Tabela 1, pode-se observar que o acúmulo de macro e
micronutrientes nas raízes seguem o mesmo padrão da parte aérea, porém apresentando,
no geral, níveis ligeiramente menores. Considerando-se a planta como um todo, o
acúmulo de macro e micronutrientes foi maior nos tecidos daquelas cultivadas na
ausência de BAP, se comparado às cultivadas em meio com 0,7 mg L
-1
de BAP.
Tabela 1. Teores de macro e micronutrientes na parte aérea, calos e raízes de plantas de
maracujazeiro cultivadas in vitro na ausência ou presença de BAP (0,7 mg L
-
1
).
Teores nutricionais em diferentes posições na planta
Minerais
Ausência de BAP Presença de BAP
Parte aérea Raiz Parte aérea Calo
Macronutrientes (g kg
-1
) (g kg
-1
)
Nitrogênio (N) 55,36 A 52,61 A 43,98 B 42,19 B
Fósforo (P) 6,78 A 6,18 A 4,62 B 5,13 AB
Potássio (K) 59,62 A 57,02 AB 53,75 B 45,93 C
Cálcio (Ca) 5,90 A 5,23 A 5,93 A 5,64 A
Magnésio (Mg) 2,29 A 1,74 A 1,82 A 1,64 A
Enxofre (S) 3,19 A 3,19 A 2,45 B 2,36 B
Micronutrientes (mg kg
-1
) (mg kg
-1
)
Boro (B) 47,37 A 23,25 BC 21,25 C 26,87 B
Cobre (Cu) 6,30 A 5,07 AB 3,37 C 4,87 B
Ferro (Fé) 141,18 A 113,52 AB 118,47 AB 103,75 B
Manganês (Mn) 146,90 AB 163,57 A 136,78 B 109,79 C
Zinco (Zn) 35,70 A 25,65 AB 19,55 B 19,60 B
Médias seguidas pela mesma letra na linha não diferem entre si pelo teste de
Tukey, a 5% de probabilidade.
48
3.2. Experimento II
Houve acréscimo no número de gemas com o aumento no tempo de imersão dos
segmentos de hipocótilo em BAP, atingindo a maior emissão (10,7) com 36 h de
imersão dos explantes. Após esse tempo, observou-se queda no número de gemas
formadas, com menor produção de gemas verificada com a imersão dos explantes por 72
h (Figura 4A).
Todavia, a maior emissão de gemas nos tempos de imersão de 6, 12, 24, 36 e 48 h
não se traduziu em formação de brotos, visto que nos tempos de imersão de 1 a 48 h no
BAP (0,7 mg L
-1
) ocorreu inibição do processo de formação e o crescimento dos brotos
(Figura 4B e C, respectivamente). Como no processo organogênico é importante haver
equilíbrio entre o número de gemas que se formam e o número delas que resulta na
formação e crescimento de brotos, os tratamentos com 0 e 72 h de imersão em BAP
foram os mais eficientes (Figura 4C).
Nos maiores tempos de exposição ao BAP (48 e 72 horas), nos quais houve
expansão das folhas, foram verificados sintomas de clorose (Figura 5). O mesmo, não
foi verificado quando os segmentos de hipocótilo foram cultivados em meio com
ausência da citocinina, no qual, inclusive, observou-se folhas com coloração verde
intensa (Figura 5).
49
Figura 4. Influência do tempo de imersão em BAP na formação de gemas (A), brotos (B)
e no comprimento de brotos (C) de P. edulis f. flavicarpa. As barras
correspondem ao desvio-padrão da média.
Figura 5. Influência do tempo de imersão em BAP na formação de brotos do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa.
0
1 6
12
24
36
48 72
Tempo de imersão em BAP (horas)
0 horas
72 horas
*
0
2
4
6
8
10
12
0 1 6 1224364872
Tempo de imersão (horas)
Número de gemas
0
1
2
0 1 6 12 24 36 48 72
Tempo de imersão (horas)
Número de brotos
0
2
4
6
8
10
0 1 6 1224364872
Tempo de imersão (horas)
Broto (mm)
A
B
C
50
O tempo de imersão em BAP não afetou o número de raízes formadas no
extremo proximal dos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro. Em todos os tempos
de imersão, o processo rizogênico foi desencadeado, formando, porém, uma única raiz
por explante, inclusive nos segmentos de hipocótilo que não foram tratados com a
citocinina (Figuras 5 e 6A). Com relação ao comprimento de raízes, maiores valores
ocorreram nos menores tempos de imersão (até 12 horas) e com especial relevo para
quando os segmentos de hipocótilo não tiveram contato com a citocinina (Figuras 5 e
6B).
É interessante verificar que a presença permanente dos segmentos
hipocotiledonares em contato com o BAP (experimento I) inibiu por completo a
rizogênese, enquanto que o contato destes explantes por tempos curtos de imersão
seguido do plantio dos mesmos em meio desprovido de BAP, não inibiu o processo
rizogênico, embora a única raiz formada tenha alcançado pequeno desenvolvimento.
Figura 6. Influência do tempo de imersão em BAP na formação (A) e comprimento de
raízes (B) do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa. As barras correspondem ao
desvio-padrão da média.
0
2
4
6
8
10
12
0 1 6 1224364872
Tempo de imersão (horas)
Raiz (cm)
0
1
2
0 1 6 12 24 36 48 72
Tempo de imersão (horas)
Número de raízes
A
B
51
4. DISCUSSÃO
A presença de BAP no meio de cultivo mostrou beneficiar diretamente o número
de gemas formadas por explante (Figura 1A), porém não a formação e alongamento de
brotos (Figuras 1B e C, respectivamente). Vários trabalhos relatam que na espécie P.
edulis f. flavicarpa, há grande produção de gemas por explante, e que poucas dessas
evoluem a brotos (Alexandre, 2002; Couceiro, 2002; Bento et al., 2004; Felismino,
2005). Segundo Appezzato-da-Glória et al. (2005) e Felismino (2005), o processo
organogênico em P. edulis f. flavicarpa é assincrônico, isto é, gemas, estruturas foliares
e protuberâncias podem ser observadas em diferentes etapas de desenvolvimento no
mesmo explante. Appezzato-da-Glória et al. (2005) relatam que isso é motivo de
preocupação, já que observaram grande determinação dos explantes para a formação de
primórdios foliares ao invés de gemas caulinares. No presente trabalho, ficou bastante
claro que as folhas se formam em brotos e que muitas delas se expandem de modo
apreciável. Embora, quando os explantes foram cultivados em meio com BAP (Figura
5), houve formação de grande número de gemas, apenas uma delas evoluiu para broto
(Figura 1B), de reduzido tamanho (4,0 mm, Figura 1C).
A não formação de raízes no extremo proximal dos segmentos de hipocótilo do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, cultivados na presença de BAP (Figura 2A) pode
ter contribuído para a menor absorção de nutrientes minerais e isso ter proporcionado o
aparecimento de clorose internerval, representando sintomas de deficiência mineral nas
folhas das plantas (Figura 3B). Felismino (2005) observou no extremo proximal dos
segmentos hipocotiledonares, cultivados sob 0,7 mg L
-1
de BAP, uma fina camada
cicatricial, constituída de células pequenas; e que esses explantes permitiram uma maior
formação de calos em ambos os extremos (proximal e distal) se comparado àqueles que
não tiveram contato com essa citocinina.
Monteiro-Hara et al. (2000), ao estudarem o efeito da composição mineral do
meio de cultivo na propagação in vitro do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa,
encontraram nas folhas desta espécie maiores níveis de Ca, Mg, Cu e principalmente de
Fe, quando os explantes foram cultivados em meio MS modificado (MSM, que contêm
62,0% de P; 54,0% de Ca; 60,0% de Mg; 59,0% de S; 50,0% de Fe; 43,0% de Mn;
52
1,89% de Ca e 50,0% de Na, a mais e 85,0% de N; 84,8% de K; 33,0% de Zn e 70,0%
de B, a menos que o meio MS), se comparado ao meio MS. Entretanto, no presente
trabalho, o teor de Fe (118,47 mg kg
-1
) encontrado na parte aérea das plantas cultivadas
no meio MS com presença de BAP foi praticamente o dobro do observado por aqueles
autores, que foi de 62 mg kg
-1
. Se se descartar a possibilidade da influência do meio MS,
na carência de determinados nutrientes minerais nas plantas, possivelmente poderia
atribuir-se esta diferença à concentração de BAP utilizada, a qual no trabalho de
Monteiro-Hara et al. (2000) foi de 3,0 mg L
-1
e no presente trabalho de 0,7 mg L
-1
.
Portanto, a maior concentração de BAP (3,0 mg L
-1
) empregada por Monteiro-Hara et al.
(2000) parece ter influenciado negativamente a absorção de Fe e de outros nutrientes,
confirmado pela menor concentração desse elemento na parte aérea das plantas. Os
explantes cultivados em meio sem a presença da citocinina, apresentaram maior
conteúdo de Fe (141,18 mg kg
-1
) na parte aérea (Tabela 1). Em estudos anatômicos
desenvolvidos por Morales Abanto & Muller (1997) em folhas de P. edulis Sims,
deficientes em Fe, verificaram que o mesófilo apresentava poucos cloroplastos, de
tamanho reduzido e localizados na parte externa das células cloroplastídicas. Segundo
Taiz & Zeiger (2004), um sintoma característico da deficiência de Fe é a clorose
internerval e, as folhas tornam-se cloróticas porque o Fe é necessário para a síntese de
alguns dos complexos clorofila-proteína nos cloroplastos, além de ser muito importante
como componente de enzimas envolvidas na transferência de elétrons, como os
citocromos.
Outro elemento mineral extremamente importante para a planta é o Zinco (Zn).
No presente trabalho, nos segmentos hipocotiledonares cultivados em meio com
ausência de BAP, o Zn foi encontrado em quantidades quase que o dobro (35,7 mg kg
-1
),
do observado em plantas cultivadas em meio com presença de BAP (19,6 mg kg
-1
)
(Tabela 1). Morales Abanto & Muller (1977) constataram, em plantas de P. edulis
deficientes em Zn, na porção inferior do caule, estrangulamento dos elementos do
xilema primário; e nas folhas, no mesofilo, muitos dos cloroplastos mostraram-se
parcialmente fragmentados. Segundo Taiz & Zeiger (2004), esse elemento pode ser
exigido para a síntese de clorofila e auxinas. Como esse nutriente é requerido para a
síntese de auxinas, e a auxina natural é o ácido indolacético (AIA), cuja principal função
53
é promover o relaxamento da parede celular que governa a absorção de água e o
alongamento celular, esse maior conteúdo de Zn, encontrado na parte aérea de plantas
cultivadas em meio sem o BAP (Tabela 1), pode ser a explicação para o maior
crescimento de brotos (Figura 3C), onde tal elemento, provavelmente estimulou a síntese
de AIA, que promoveu o alongamento destes. Segundo Taiz & Zeiger (2004) outra
grande importância da auxina é a de induzir a diferenciação vascular, por exemplo, as
quantidades relativas de xilema e floema formados são reguladas por auxinas. Este fato é
motivo de relacionarmos altas concentrações de Zn com o aumento dos níveis de AIA e,
dessa forma, tem-se maior xilogênese e, conseqüentemente, maior capacidade de
absorção de nutrientes, conforme foi observado nos segmentos hipocotiledonares
cultivados na ausência de BAP (Tabela 1).
Para os demais nutrientes, houve pouca variação média entre os resultados dos
dois estudos, inclusive Ca, Mg e Cu. Nos estudos sobre organogênese in vitro do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, tem-se observado que o uso desta citocinina tem
promovido formação intensa de calo na base dos explantes hipocotiledonares, cultivados
principalmente na orientação vertical. Esta divisão desorganizada dos tecidos na região
proximal dos explantes pode interferir na absorção dos nutrientes. Segundo Sugiyama &
Komamine (1990), a adição de citocinina e/ou auxina ao meio de cultura promove a
transdiferenciação de células parenquimáticas em elementos traqueais. De acordo com
Scatena & Nunes (1996), esses elementos traqueais apresentam paredes espessas e
lignificadas, estando associadas à retenção de água e ao suporte mecânico.
Vidor et al. (1999) observaram que a maior parte do BAP adicionado ao meio de
cultivo foi absorvido nas primeiras 36 horas de cultivo dos explantes de Hyacinthus
amethystina cv. Albus (jacinto pirenárico). Esses autores verificaram que a resposta
morfogênica para os explantes desta espécie está diretamente relacionada com a
orientação desses explantes no meio de cultivo, com o metabolismo do regulador de
crescimento e conteúdo de supostas formas ativas de BAP (BA e [9R] BA). O exposto
acima pelos autores, no referente ao tempo de absorção do BAP, pode ser a explicação
do encontrado no presente trabalho, onde também, o maior número de gemas formadas
ocorreu, quando o tempo de imersão dos explantes em BAP foi de 36 horas (Figura 4A).
Isto, possivelmente, está relacionado com a maior absorção da citocinina. No presente
54
trabalho, provavelmente a exposição dos segmentos de hipocótilo por mais de 36 horas
(48 e 72 h) resultou em bloqueio no processo de divisão celular, interrompendo, assim, a
formação de áreas meristemáticas, que culminam em grupos de células meristemáticas,
formando os meristemóides, estando isto de acordo com Appezzato-da-Glória et al.
2005; Felismino, 2005). Conforme mencionado pelos autores acima, isto explica o
porque dos explantes imersos por 72 h em BAP terem originado um broto por segmento
hipocotiledonar. O fato desse maior tempo de exposição ter promovido menor emissão
de gemas contribuiu para que estas não competissem entre si e, dentre aquelas que se
formaram, alguma se alongasse, evoluindo a broto (Figura 4B).
A clorose verificada nos tecidos expostos por maiores tempos de exposição ao
BAP (Figura 5) pode estar relacionada com sintomas de toxidez, promovido pelo
acúmulo de BAP nos tecidos (Kantharajah & Dodd, 1990). Este acúmulo pode ter
estimulado a produção de etileno nos frascos de cultivo, segundo Reis (2003) e
Alexandre (2006). Rodriguez Ortíz (2004), ao cultivar epicótilos de urucuzeiro em meio
de cultivo provido de zeatina, observou redução nos teores de pigmentos
cloroplastídicos em quaisquer que fossem as densidades de fluxo de luz empregadas.
Segundo a autora, a explicação para o ocorrido seria que a citocinina não estimulou a
rizogênese, o que pode ter comprometido a translocação de nutrientes e sua partição,
além de ter havido proliferação de calo na extremidade proximal dos explantes. Isto
certamente poderia ter causado os sintomas de clorose nos tecidos. Felismino (2005)
observou grande proliferação de calos no extremo proximal dos explantes, e isto se
deveu a maior atividade mitótica, que culminou em uma região com maior proliferação
celular, sendo, por isso, mais desenvolvida. No presente trabalho, foi verificado na
região proximal dos explantes, em contato com o meio de cultivo, uma camada
cicatricial, conforme descrito por Felismino (2005) em explantes cultivados na
orientação vertical normal que não formaram calos. Essas duas características
morfológicas, formação de calos e tecido cicatricial, podem, por exemplo, constituir uma
barreira física à absorção de nutrientes. Segundo Pitman (1977), os fitorreguladores
ácido abiscísico e citocininas atuam como inibidores do fluxo de íons do citoplasma para
o xilema, e isto pode ser uma das explicações da clorose em P. edulis f. flavicarpa.
Segundo Barbosa (2006), durante o desenvolvimento in vitro das variedades ‘Dover’ e
55
‘Burkley’ de morangueiro (Fragraria x ananassa) e da videira (Vitis vinifera x Vitis
rotundifolia) ‘VR 043-43’, o aumento na concentração de BAP conduziu ao
desenvolvimento de hiperidricidade, resultando em tecidos com drástica redução no
conteúdo de clorofila.
No presente trabalho, apesar dos tempos em que os segmentos hipocotiledonares
ficaram imersos em BAP, este não inibiu a emissão de raízes. O crescimento destas foi
influenciado por esse fitorregulador, e isto mostra o efeito negativo do BAP no
desenvolvimento dessa estrutura, principalmente quando o tecido fica mais tempo
exposto a este regulador de crescimento (Figuras 5 e 6B). Faria & Segura (1997)
verificaram em Passifloráceas que o uso de citocininas no meio de cultivo proporciona
efeito residual, afetando a capacidade rizogênica dos explantes, mesmo sendo juvenis.
No presente trabalho e nos trabalhos de Alexandre (2002), Couceiro (2002) e Felismino
(2005), todos avaliando a resposta morfogênica in vitro de P. edulis f. flavicarpa,
também foi verificado no extremo proximal de explantes hipocotiledonares que raízes se
formaram em meios com ausência de citocininas. Segundo Felismino (2005), meios de
cultivo contendo citocininas parecem interferir na polaridade fisiológica para a
rizogênese, mas não para a calogênese, nesse extremo. Este comportamento sugere que a
adição de citocininas rompe a relação citocinina/auxina favorável ao enraizamento
adventício. Isto estaria de acordo com o postulado de Skoog & Miller (1957). Contudo,
no presente trabalho, a explicação do processo rizogênico não ter sido afetado quando
apenas os segmentos hipocotiledonares foram imersos em meio MS líquido por
diferentes tempos em BAP, seria porque o tempo de contato com esta citocinina não foi
suficiente para afetar a polaridade fisiológica.
5. CONCLUSÕES
٠ O BAP (0,7 mg L
-1
) influencia a absorção de nutrientes pelos explantes
hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa.
٠ O tempo de imersão dos explantes em BAP está relacionado com a formação de
estruturas organogênicas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa.
56
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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59
Capítulo III
Estresse foto-oxidativo durante a morfogênese in
vitro de Passiflora edulis Sims f. flavicarpa
Degener, mediado por diferentes irradiâncias
RESUMO
O objetivo deste experimento foi avaliar o estresse foto-oxidativo durante o
processo organogênico em segmentos de hipocótilo do maracujazeiro Passiflora edulis
Sims f. flavicarpa Degener. O experimento foi instalado em delineamento inteiramente
casualizado, totalizando cinco tratamentos, com dez repetições. Os tratamentos foram os
cinco níveis de irradiância (12, 25, 50, 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
). Observou-se grande
determinação dos explantes para a formação de gemas, independentemente dos níveis de
irradiância empregados. A irradiância de 12 µmol m
-2
s
-1
foi a que menos contribuiu
para a formação de gemas, entretanto, foi a condição que estimulou a produção de 1
broto/explante e este apresentou em média 3,46 mm de comprimento. A irradiância de
25 µmol m
-2
s
-1
produziu 2 brotos/explante e estes apresentaram 2,0 mm de
comprimento. As demais irradiâncias não foram capazes de estimular a produção de
brotos. A atividade das enzimas SOD e CAT aumentou com a elevação dos níveis de
irradiância até 50 µmol m
-2
s
-1
. Entretanto, nas irradiâncias de 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
houve declínio na atividade dessas enzimas. A POD aumentou com a elevação dos
níveis de irradiância. Foi possível identificar também que a quantidade de fluxo fotônico
influencia a taxa de produção de etileno e CO
2
pelos explantes hipocotiledonares dessa
espécie, e que há uma relação entre produção de etileno e degradação de pigmentos
foliares. Verificou-se que as duas menores irradiâncias (12 e 25 µmol m
-2
s
-1
) foram as
mais eficientes no processo organogênico do maracujazeiro.
60
1. INTRODUÇÃO
No cultivo in vitro de células e tecidos vegetais, as irradiâncias utilizadas têm
apresentado os mais variados espectros. Por exemplo, a propagação in vitro do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa normalmente é realizada sob exposições a uma
faixa variada de irradiâncias, dependendo da finalidade do estudo. A maioria dos
trabalhos indica o nível de irradiância no qual se cultivam os explantes, entretanto é
digno de menção que em alguns trabalhos é citado, apenas, o fotoperíodo utilizado no
processo propagativo. A faixa de irradiância normalmente utilizada nos trabalhos de
propagação in vitro de P. edulis f. flavicarpa, com vistas a distintas finalidades, pode ser
assim exemplificada: multiplicação vegetativa de brotos axilares (3000 lux; Moran
Robles, 1978); propagação in vitro de segmentos internodais (3000 lux; Moran Robles,
1979); atividade morfogênica de microcalos oriundos do cultivo de protoplastos (22 µE
m
-2
s
-1
, Dornelas & Vieira, 1993); atividade morfogênica de calos oriundos do cultivo de
protoplastos (1,5 W m
-2
, D' Utra Vaz et al., 1993); microenxertia (180 µmol m
-2
s
-1
,
Biricolti & Chiari, 1994); propagação in vitro (90 µmol m
-2
s
-1
, Faria & Segura, 1997);
adequação de componentes do meio inorgânico na calogênese em segmentos de
hipocótilo e folhas (80 µmol m
-2
s
-1
, Faria & Segura, 1997); atividade morfogênica em
segmentos de folha (23 µmol m
-2
s
-1
, Appezzato-da-Glória et al., 1999); adequação de
meio de cultivo para a propagação in vitro de segmentos nodais (40 µmol m
-2
s
-1
,
Monteiro-Hara et al., 2000); rizogênese de brotos (24 µmol m
-2
s
-1
, Barbosa et al., 2001);
organogênese em segmentos de folhas cotiledonares (9,7 µmol m
-2
s
-1
, Ribas et al.,
2002); organogênese em segmentos hipocotiledonares (30 µmol m
-2
s
-1
, Couceiro, 2002;
25, 50, 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
, Alexandre, 2002; 54 µmol m
-2
s
-1
, Felismino, 2005);
organogênese em gemas apicais, gavinhas, segmentos nodais e internodais (fotoperíodo
de 16/8 h (luz/escuro), Cantanhêde & Rodrigues, 2004); cultivo de ápices caulinares (22
µE m
-2
s
-1
, Junghans et al., 2002); desenvolvimento de brotos axilares (36 µmol m
-2
s
-1
,
Reis et al., 2003); desenvolvimento de calos (fotoperíodo de 16 h de luz, Lopes et al.,
2004); desenvolvimento de segmentos nodais (22 µE m
-2
s
-1
, Gonçalves et al., 2004).
A luz em excesso promove a produção de espécies reativas do oxigênio (ROS),
que conduzem a peroxidação de lipídios de membrana (Parkin et al., 1989). Cao et al.
61
(2006) relatam que o aumento nas concentrações de malondialdeído (MDA), produto da
peroxidação de lipídios, pode ser verificado em condições de altas irradiâncias,
indicando estresse oxidativo. Segundo estes autores, em condições de altas irradiâncias,
níveis crescentes de MDA acompanham o aumento na atividade de enzimas
antioxidantes, tais como a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase
(POD), o que pode estar relacionado com a habilidade dessas enzimas em remover as
espécies reativas do metabolismo do oxigênio durante o estresse foto-oxidativo
(Seppanen & Fagerstedt, 2000).
A biossíntese de etileno é estimulada por alguns fatores, dentre eles as condições
ambientais. Portanto, sob estresse, tem-se elevada produção de etileno, que está
associada à perda de clorofila e ao desaparecimento gradual da cor, que são aspectos
característicos da senescência das folhas (Taiz & Zeiger, 2004).
A degradação dos pigmentos foliares envolve, por um lado, a degeneração das
membranas tilacoidais e, por outro, o efeito do etileno na senescência, como fator
desencadeador do processo (Heaton & Marangoni, 1996; Matile et al., 1996). Powles
(1984) verificou que prolongadas exposições dos tecidos vegetais a condições de alta
radiação refletem-se na destruição dos pigmentos fotossintéticos, principalmente as
clorofilas.
O presente trabalho teve por objetivo investigar o estresse foto-oxidativo em
estruturas organogênicas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob
diferentes níveis de irradiância.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas
As sementes foram extraídas de frutos maduros e colhidos de uma única planta
de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, procedente do pomar do Setor de Fruticultura,
da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais.
Em condições laboratoriais e mediante o uso de uma peneira de malha fina, o
arilo das sementes foi removido, pressionando-as cuidadosamente, depois de envolvê-las
62
em cal extinta. Em seguida, as sementes foram lavadas em água de torneira até a
completa remoção da cal e restos placentários. Depois, foram submetidas a secagem à
sombra, sobre papel toalha, por três dias. Após o processo de secagem, procedeu-se o
preparo das sementes. O tegumento externo (episperma) foi completamente removido
com auxílio de uma mini-morsa.
As sementes, assim preparadas, foram desinfestadas, sob condições de câmara de
fluxo laminar. Inicialmente, foram submetidas por 1 minuto a solução de etanol a 70%
(v/v), seguido de três enxaguaduras; e logo após, imersas em solução de hipoclorito de
sódio com 2,4% de cloro ativo do produto comercial Candura
®
, durante 20 minutos e,
posteriormente, enxaguadas por três vezes, em tempos de 1 minuto, sob agitação
constante em água desionizada e autoclavada.
O meio de cultivo das sementes foi constituído dos minerais nutrientes de MS
(Murashige & Skoog, 1962), vitaminas de White (1951), 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30
g L
-1
de sacarose e 8,0 g L
-1
de ágar (Isofar
®
), como agente solidificante. O pH do meio
foi ajustado a 5,7 ± 0,1, antes da adição do ágar. Alíquotas de 10 mL deste meio foram
distribuídas por tubo de ensaio (25 x 150 mm). Os tubos, contendo o meio foram
fechados com tampas de propileno transparentes e autoclavados a 121 ºC e pressão de
1,05 kgf cm
-2
, durante 20 minutos.
As sementes foram semeadas no meio de cultivo, uma por tubo de ensaio. Após o
semeio, os tubos foram fechados como já descrito anteriormente, acondicionados em
grades que foram envolvidas com papel alumínio e transferidos para a sala de cultivo
com temperatura de 27 ± 2 ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%. O papel
alumínio foi utilizado para proteger as sementes contra luz, já que são classificadas,
como fotoblásticas negativas por Maciel & Bautista (1997).
O período de incubação foi de 12 dias, tempo suficiente para obter as plântulas
axênicas e com tamanho adequado para se extrair cinco segmentos hipocotiledonares
com comprimento de aproximadamente 1,0 cm.
63
2.2. Fase de cultivo dos segmentos de hipocótilo
Segmentos de hipocótilo, oriundos de plântulas germinadas e crescidas in vitro
foram cultivados em frascos de vidro com capidade volumétrica de 320 mL, altura de
12,5 cm, diâmetro externo de 6,8 cm e interno de 6,5 cm, contendo aproximadamente 30
mL de meio de cultura constituído pelo sais nutrientes de MS, vitaminas de White
(1951), 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30 g L
-1
de sacarose e 8,0 g L
-1
de ágar (Isofar
®
)
como agente geleificante. O pH do meio foi ajustado em 5,7 ± 0,1, antes da adição do
ágar, o qual foi fundido em forno microondas e a esterelizado em autoclave a 121 ºC e
pressão de 1,05 kgf cm
-2
, durante 20 minutos. Após a esterelização e sob condições de
câmara de fluxo laminar, o meio de cultivo foi resfriado o suficiente para não interferir
na atividade da 6-benzilaminopurina (BAP), porém permanecendo fluído para ser
distribuído nos frascos de cultivo, quando então foi adicionado ao meio 0,7 mg L
-1
de
BAP, previamente esterilizado em filtro-esterilização (MILLEX-GS
®
, 0,22µ, Millipore,
US). Após a adição do fitorregulador, o meio foi agitado por aproximadamente dois
minutos, visando a homogeinização, para ser, posteriormente, distribuído nos frascos de
cultivo até alcançar 30 mL por frasco. Estes frascos vazios, anteriormente à distribuição
do meio, foram fechados com tampa de polipropileno transparente, protegida com filme
transparente de PVC (Rolopac
®
), e autoclavados a 121 ºC e pressão de 1,05 kgf cm
-2
,
durante 30 minutos.
Os segmentos de hipocótilo, em número de cinco e extraídos de uma mesma
plântula, foram plantados verticalmente no meio de cultivo, em condições de câmara de
fluxo laminar, de modo a ficarem aproximadamente 2 mm do extremo proximal
inseridos no meio, e o extremo distal voltado para a boca dos frascos, que foram
fechados com duas camadas de filme transparente de PVC (Rolopac
®
).
Os frascos, contendo os explantes, foram incubados em sala de crescimento,
distribuídos nas prateleiras das estantes, à distância de aproximadamente 5 cm entre si,
de forma a não proporcionar sombra nos mesmos, com controle de temperatura de 27 ±
2 ºC, fotoperíodo de 16/8 h (luz/escuro) e irradiâncias de 12; 25; 50; 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
, fornecidas por tubos fluorescentes OSRAM
®
, com potência de 40 W, luz do dia.
O período de incubação foi de 42 dias.
64
Para a adequação dos ambientes espectrais, as estantes da sala de crescimento,
tiveram que passar por algumas alterações, já que os níveis de irradiância previamente
encontrados não atendiam às necessidades do referido estudo. A iluminação nas
prateleiras das estantes da sala de cultivo foi fornecida por conjuntos de tubos
fluorescentes, OSRAM
®
, com potência de 40 W, luz do dia. Cada conjunto constituiu-se
de cinco tubos, distribuídos paralelamente e separados um do outro em 5,0 cm. Cada
conjunto de tubos fluorescentes estava separado do outro por 5,0 cm, de modo que a
irradiância pudesse ser a mais uniforme possível ao longo de toda a superfície da
prateleira. Na superfície de abrangência de cada conjunto de tubos fluorescentes, foi
necessário medir a intensidade de fluxo em 65 pontos para se identificar a superfície da
estante que apresentasse aproximadamente a mesma irradiância. Esta foi de 55 ± 5 µmol
m
-2
s
-1
, medida mediante uso do irradiômetro LI-COR, inc. MODELO LI-185B
QUANTUM/RADIOMETER/PHOTOMETER, cujo sensor é o LI-COR, inc. SS-3
SENSOR SELETOR. Cada um dos cinco ambientes espectrais foi projetado utilizando-
se dois conjuntos de 5 tubos fluorescentes. Na superfície de todas as prateleiras, foram
afixadas placas de isopor, que serviram de isolante térmico, de forma a evitar
aquecimento no fundo dos frascos de cultivo.
Os cinco distintos níveis de irradiâncias foram conseguidos, como descrito a
seguir: a) Para o ambiente espectral de 12 µmol m
-2
s
-1
, os dois conjuntos de tubos
fluorescentes receberam uma proteção dada por um anteparo constituído de duas
camadas de tela sombrite esticada em quadro de madeira, onde a tela superior
apresentava malha capaz de interceptar 70% de luz e a tela voltada para a base da
prateleira, tendo malha capaz de interceptar 50% de luz; b) No ambiente de 25 µmol m
-2
s
-1
, os dois conjuntos de tubos fluorescentes receberam uma proteção dada por um
anteparo constituído por uma única camada de tela sombrite com capacidade para
interceptar 70% da luz, esticada em quadro de madeira, apresentando ainda, proteção na
face frontal da prateleira, mediante uso de tela com capacidade de interceptação de 50%
da luz; c) No ambiente de 50 µmol m
-2
s
-1
, os dois conjuntos de tubos fluorescentes
receberam uma proteção dada por um anteparo constituído por uma única camada de tela
sombrite com capacidade de interceptar 30%; e, além disso procedeu-se, ainda, o
revestimento com papel alumínio da face inferior da prateleira superior, onde se
65
prendem os tubos fluorescentes; d) No ambiente de 100 µmol m
-2
s
-1
, procedeu-se uma
proteção na face frontal da prateleira, mediante uso de tela, cuja capacidade de
interceptação de luz é de 50%, acompanhado do revestimento com papel alumínio da
face inferior da prateleira superior, onde se que prendem os tubos fluorescentes; e) O
ambiente de 150 µmol m
-2
s
-1
foi conseguido, protegendo, frontal e lateralmente as
prateleiras, na abrangência dos dois conjuntos de tubos fluorescentes, com placas de
isopor, tendo estas suas faces voltadas para o interior da estante revestida com papel
alumínio. A face da estante voltada para a parede, não recebeu qualquer proteção.
Utilizou-se ainda, revestimento com papel alumínio na face inferior da prateleira
superior, onde se prendem os tubos fluorescentes. Esse nível de irradiância, por se tratar
de um ambiente quase hermético, exigiu a instalação de um exaustor para dissipação do
calor, mantendo nesse ambiente a mesma temperatura da sala de cultivo (27 ± 2 ºC)
(Figura 1).
2.3. Características avaliadas
2.3.1. Organogênese in vitro
Em cada extremo distal dos segmentos de hipocótilo foi avaliado o número de
gemas e brotos, comprimento dos brotos, massa da matéria fresca (MMFPA) e seca da
parte aérea (MMSPA).
66
A
B
C
D
F
E
G
H
Figura 1. Ambientes espectrais: A. 12 µmol m
-2
s
-1
; B. 25 µmol m
-2
s
-1
; C. 50 µmol m
-2
s
-1
; D. 100 µmol m
-2
s
-1
; E. 150 µmol m
-2
s
-1
; Detalhes: F. Anteparo constituído
de uma ou mais camadas de tela sombrite esticada em quadro de madeira, G.
motor de geladeira com hélice de rotação invertida; H. Idem G, com detalhe da
implantação de placa de isopor
67
2.3.2. Determinação da atividade das enzimas peroxidase (POD
EC1.11.1.7), catalase (CAT EC1.11.1.6) e superóxido dismutase
(SOD EC1.15.1.1)
O extrato enzimático bruto para a determinação da atividade da peroxidase,
catalase e superóxido dismutase foi obtido pela homogeneização de 0,5 g das estruturas
(gemas e brotos) formadas na região distal dos segmentos de hipocótilo (congelados em
nitrogênio líquido e mantidos a –80 ºC) com 4 mL de solução de extração (EDTA 0,1
mM em tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 6,8), em almofariz de porcelana. Os
fragmentos de células foram removidos por centrifugação a 12000 g por 20 minutos,
utilizando o sobrenadante, de acordo com metodologia descrita por Saher et al. (2004).
Todas as etapas necessárias ao processo foram executadas a 4 ºC.
2.3.2.1. Peroxidase (POD EC1.11.1.7)
A atividade de PODs nas estruturas (gemas e brotos) foi determinada
espectrofotometricamente a 25 ºC, pelo aumento da absorvância a 470 nm, a partir da
reação de 100 μL do extrato enzimático bruto diluído a 1:4 (v/v) com água desionizada
em uma mistura de reação contendo 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 0,2 M, pH
6,5, 0,5 mL de guaiacol e 0,4 mL de H
2
O
2
0,59 M, em um volume total de 3 mL
(Chance & Maehley, 1955). Os resultados foram expressos em ΔA
470
min
-1
mg
-1
de
proteína.
2.3.2.2. Catalase (CAT EC1.11.1.6)
A atividade das CATs nas estruturas (gemas e brotos) foi determinada após a
adição de 100 μL do extrato enzimático bruto a 2,9 mL do meio de reação constituído de
500 μL de H
2
O
2
59 mM, 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 0,05 M, pH 7,0 e 400 μL
de água desionizada a 30 ºC (Havir & McHale, 1987). A atividade da enzima foi
68
determinada pelo decréscimo na absorvância a 240 nm e expressa em μmol H
2
O
2
min
-1
mg
-1
de proteína.
2.3.2.3. Superóxido dismutase (SOD EC1.15.1.1)
A mistura de reação, constituída de 0,3 mL de metionina 130 μM, 0,1 mL de azul
de p-nitrotetrazólio (NBT) 2250 μM, 0,1 mL de EDTA 3 μM, 0,2 mL de riboflavina,
0,75 mL de água desionizada e 1,5 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM em pH 7,8
(Del Longo et al., 1993), adicionaram-se 100 μL do extrato enzimático bruto. A reação
foi conduzida a 25 ºC, em tubos de ensaio dispostos em orifício eqüidistantes de tubo
fluorescente de 15 W, colocado no centro de uma câmara de incubação circular e foi
iniciada pela ligação da lâmpada fluorescente. Após 15 min, o desligamento do tubo
fluorescente interrompeu a reação, sendo a produção de formazana azul medida pela
determinação do incremento na absorvância a 560 nm, que foi subtraído de um
“branco”, no qual não havia extrato enzimático. Nestas condições, uma unidade de SOD
foi definida como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a fotorredução
do NBT (Giannopolitis & Ries, 1977; Totola, 1998).
2.3.2.4. Quantificação de proteínas
As determinações da quantidade de proteína presente nos referidos extratos
foram feitas pelo método de Bradford (1976), usando Soroalbumina Bovina (BSA)
como padrão.
2.3.3. Determinação do teor de malondialdeído (MDA)
A peroxidação lipídica nas estruturas (gemas e brotos) foi expressa como teor de
malondialdeído (MDA), determinado pelo método de TBARS (Buege & Aust, 1978).
Amostras de tecidos dessas estruturas (100 mg de matéria fresca) foram homogeneizadas
em 5,0 mL de ácido tricloroacético (TCA) 0,1% (p/v), na presença de
polivinilpolipirrolidona (PVPP) na proporção de 1:1,5 (PMF:PVPP). O homogenato foi
69
centrifugado por 30 minutos a 4000 g. Todas as etapas necessárias ao processo de
extração foram conduzidas a 4 ºC. Retirou-se do sobrenadante uma alíquota de 1,0 mL, à
qual adicionou-se 4,0 mL da mistura contendo 10% (p/v) de TCA e 0,5% de TBA,
contendo 0,01% de BHT (butilhidroxitolueno). Em seguida, os tubos de ensaio contendo
a mistura, foram fechados e incubados em banho-maria por 15 minutos a 95 ºC, sob
agitação. A reação foi interrompida pela transferência dos tubos de ensaio para banho de
gelo. O “branco” foi preparado sem a amostra, porém seguindo todas as outras etapas. A
absorvância do sobrenadante foi lida a 535 nm e 600 nm. A quantidade formada do
complexo MDA-TBA foi determinada utilizando-se a metodologia descrita por Dhindsa
et al. (1981), conforme a seguinte equação: [MDA] = (A
535
-A
600
)/(ζ . b), onde, ζ
(coeficiente de extinção) = 1,56 x 10
-5
mol
-1
cm
-1
e b (comprimento ótico) = 1 cm.
2.3.4. Produção de etileno (C
2
H
4
) e dióxido de carbono (CO
2
)
Para a avaliação do acúmulo de etileno e CO
2
, cada tratamento constitui-se de 40
frascos contendo cada frasco 5 segmentos de hipocótilo que, de 7 em 7 dias, 6 destes
frascos de cada tratamento foram tomados, para a determinação dos gases. Os frascos
foram abertos em câmara de fluxo laminar por 30 minutos e novamente vedados com
duas camadas de filme plástico. As leituras foram realizadas após 24 horas para cálculo
da taxa de produção dos gases. Retirou-se dos frascos duas amostras dos gases liberados
pelos tecidos, com auxílio de seringas, de 1 mL cada; a alíquota amostrada foi injetada
em cromatógrafo a gás (Modelo GC – 1413, Shimadzu Kyoto), equipado com detector
TCD e FID para determinação das concentrações de etileno e CO
2
. As temperaturas da
coluna (porapak-Q), do injetor e do detector foram de, respectivamente, 50, 100 e 135
ºC.
A taxa de produção de etileno e CO
2
foi expressa em nL C
2
H
4
g MF
-1
h
-1
e mmol
CO
2
g MF
-1
h
-1
, respectivamente, segundo as equações: TX = C. V. t
-1
. p
-1
e TX = C . V.
10. t
-1
. p
-1
, respectivamente, onde C = concentração do etileno e/ou de CO
2
no frasco (nL
mL
-1
e/ou mmol mL
-1
, respectivamente); V = volume da fase gasosa (mL); t = tempo de
acúmulo (horas); p = massa da matéria fresca (g).
70
2.3.5. Determinação dos pigmentos foliares
Para a análise dos pigmentos foliares, foram removidas todas as estruturas
(gemas e folhas) formadas durante o processo organogênico e pesadas individualmente
até atingirem 0,1 g. Em seguida, as amostras foram incubadas em solução de 20 mL de
dietil éster por 24 horas, em frascos envolvidos com papel alumínio, como forma de
proteção contra luz. O extrato foi colocado em uma cubeta de quartzo, realizando-se as
leituras em espectrofotômetro UV/VIS digital, marca HITACHI, modelo U-2001, cuja
densidade ótica das amostras foram lidas a 660,6; 642,2 e 470 nm. Foram determinados
os teores de clorofilas a, b e totais e de carotenóides, além das relações clorofila a/b e
carotenóides/clorofilas.
2.3.6. Análise de cor
Para a avaliação da cor utilizou-se colorímetro de triestímulos COLOR QUEST
II e o software Universe da Hurterlab, Reston, VA, sob o iluminante D nos sistemas de
cor de Hunter com os parâmetros L, a, b; onde L representa a luminosidade, que
caracteriza o grau de claridade da cor; +a, o vermelho; -a, o verde; +b, o amarelo; –b, o
azul.
Nas medições de cor, o material organogênico (gemas e brotos, 0,1 g), foi
incubado em solução de 20 mL de dietil éster por 24 horas, em frascos envolvidos com
papel alumínio, como forma de proteção contra luz. O extrato foi colocado em uma
cubeta de quartzo de 80:60:15 mm, realizando-se as leituras. Com os valores obtidos nas
leituras das coordenadas a e b, foram calculados os valores da tonalidade ou nuança, h =
arctg (b/a) e da saturação da cor ou croma, C =
22
ba +
. A saturação ou cromaticidade
da cor é a qualidade que caracteriza a quantidade de cor, indicando os níveis em que está
misturada com o branco, o preto ou o cinza. A tonalidade da cor ou matiz é a grandeza
que caracteriza a qualidade da cor, o que possibilita a diferenciação das cores.
71
2.4. Delineamento experimental
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado, com 6
repetições (6 frascos de cultivo), onde os tratamentos foram os 5 níveis de irradiância,
sendo a parcela experimental constituída de 5 segmentos de hipocótilo (1 frasco de
cultivo) cultivados na orientação vertical normal.
3. RESULTADOS
Foi verificado nos diferentes níveis de irradiância que os explantes apresentavam
grande determinação para a formação de numerosas gemas em toda a superfície cortada
do extremo distal dos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa.
Essa profusão de gemas formadas diretamente na base do tecido (organogênese direta)
possivelmente tenha provocado uma competição entre elas, de sorte que ao final de 42
dias de incubação dos explantes, constatou-se reduzido crescimento dessas gemas
(Figura 2A) e, conseqüentemente, de brotos formados (Figura 2B).
Os níveis de irradiância de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
foram os mais eficientes em
estimular a atividade morfogênica nos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa. Nestes ambientes espectrais, formaram-se 8 gemas,
respectivamente, após a exposição por 42 dias às referidas irradiâncias (Figura 2A). A
irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
foi a que contribuiu menos na formação de gemas (ao
redor de cinco gemas).
Os segmentos de hipocótilo cultivados nos ambientes de menor irradiância (12 e
25 μmol m
-2
s
-1
) foram os únicos cujas gemas evoluíram para formarem brotos, pois
aqueles cultivados sob as irradiâncias de 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, as estruturas
formadas permaneceram no estádio de gemas, ao cabo dos 42 dias de incubação. Dentre
as, aproximadamente, cinco gemas formadas sob a irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
, apenas
uma, por segmento de hipocótilo, alcançou a categoria de broto, ao passo que no
ambiente de 25 μmol m
-2
s
-1
, das quase 6 gemas formadas, 2 lograram o status de broto
(2 brotos/explante, Figura 2B).
72
Apesar dos segmentos de hipocótilo cultivados sob 12 μmol m
-2
s
-1
terem
originado apenas 1 broto por explante, estes foram os que atingiram o maior crescimento
(3,46 mm). A irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
contribuiu para a formação de brotos com
menor tamanho (2,0 mm, Figura 2C).
A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT) nos
tecidos dos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa aumentou
com a elevação dos níveis de irradiância até 50 μmol m
-2
s
-1
. Entretanto, nas irradiâncias
de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
houve marcado declínio na atividade dessas enzimas (Figura
3).
Figura 2. Número de gemas (A), de brotos (B) e comprimento de brotos (C)
provenientes de segmentos hipocotiledonares do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa cultivados in vitro, sob diferentes níveis de irradiância. As barras
correspondem ao desvio-padrão da média.
0
1
2
3
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Número de brotos
0
2
4
6
8
10
12
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Número de gemas
A
B
0
1
2
3
4
5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Comprimento de brotos (mm)
C
73
O acréscimo na atividade das enzimas SOD e CAT foi muito semelhante nas
irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
(85,0 e 87,0%, respectivamente), se comparado ao
ambiente de 12 μmol m
-2
s
-1
(Figura 2). Todavia, em relação à irradiância de 25 μmol m
-
2
s
-1
, a atividade dessas duas enzimas foi superior 15,0% (SOD) e 7,5% (CAT) em
relação a mais baixa irradiância estudada (Figura 3).
Figura 3. Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e
peroxidase (POD) em segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa cultivados in vitro, sob diferentes níveis de irradiância. As barras
correspondem ao desvio-padrão da média.
0
50
100
150
200
250
300
350
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
UNID SOD mg
-1
de proteína
0
100
200
300
400
500
600
700
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μmol H
2
O
2
min
-1
mg
-1
de proteína
SOD
CAT
POD
0
10
20
30
40
50
60
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
ΔA
470
min
-1
mg
-1
de proteína
74
O aumento da atividade da peroxidase (POD) nos tecidos de segmentos de
hipocótilo do maracujazeiro foi de 5,6% (25 μmol m
-2
s
-1
), 52,0% (50 μmol m
-2
s
-1
),
75,0% (100 μmol m
-2
s
-1
) e 89,0% (150 μmol m
-2
s
-1
), em comparação àqueles
segmentos cultivados sob irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3). Com isso, é possível
inferir que a irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
contribuiu pouco no aumento da atividade da
enzima CAT. Entretanto, aqueles segmentos cultivados em ambientes espectrais acima
de 25 μmol m
-2
s
-1
tiveram aumento da atividade dessa enzima superior a 50,0%.
O aumento dos níveis de irradiância até 150 μmol m
-2
s
-1
fez elevar
proporcionalmente a produção de MDA (malondialdeído), que é um produto da
peroxidação de lipídios (Figura 4). O maior teor de MDA foi encontrado nos tecidos dos
segmentos de hipocótilo do maracujazeiro cultivados sob 150 μmol m
-2
s
-1
, teor este que
correspondeu a 31,0% a mais daquele obtido nos segmentos hipocotiledonares
cultivados no menor nível de irradiância (12 μmol m
-2
s
-1
). O acréscimo desse produto
da peroxidação nos tecidos dos explantes cultivados nos demais níveis de irradiância foi
de 22,39 % (100 μmol m
-2
s
-1
), 17,69% (50 μmol m
-2
s
-1
), e de apenas 8,72% (25 μmol
m
-2
s
-1
).
Figura 4. Peroxidação de lipídios (teor de MDA) em segmentos de hipocótilo do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivados in vitro, sob diferentes níveis
de irradiância. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
A atividade peroxidativa nos segmentos de hipocótilo acentuou-se com os níveis
crescentes de irradiância (Figura 4) e esse efeito acompanhou o aumento da atividade
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
MDA (nmol gMF
-1
)
75
das enzimas SOD e CAT até o nível de 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3), possivelmente pelo
aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, culminando com a ativação de
um sistema antioxidante para a captura desses radicais livres. Entretanto, nos ambientes
espectrais acima de 50 μmol m
-2
s
-1
o metabolismo celular, em relação à ativação dessas
enzimas, pareceu estar entrando em inativação, já que houve queda na atividade dessas
enzimas (Figura 4). No entanto, a lipoperoxidação teve comportamento crescente com a
elevação dos níveis de irradiância (Figura 4), bem como a atividade da enzima POD
(Figura 3).
Nas irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
observa-se, inicialmente, o processo de
enverdecimento dos explantes e a atividade morfogênica com a formação de gemas aos
21 dias (Figuras 5Ca e Cb) e sua evolução para brotos aos 35 dias (Figuras 5Ea e Eb).
O aspecto clorótico das gemas formadas na região distal dos segmentos de
hipocótilo é facilmente vizualizado nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, aos 7 dias
de cultivo. Observa-se até ao longo do segmento, dificuldade de enverdecimento do
tecido (Figuras 5Aa e Ab, respectivamente). Aos 21 dias, as estruturas formadas nos
segmentos de hipocótilo cultivados sob irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
adquiriram
aspecto esbranquiçado (Figuras 5Cc). Mesmo assim, houve desenvolvimento, porém
lento dos órgãos formados (Figuras 5Dc, Ec e Fc). Nas irradiâncias de 100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
, observou-se mudanças marcantes de coloração das estruturas formadas. Estas
passaram de amarelas (7 dias, Figuras 5Ad e Ae, respectivamente) para brancas (14 dias,
Figuras 4Bd e Be, respectivamente). Essa coloração branca dos tecidos permaneceu até
os 35 dias (Figuras 5Ed e Ee, respectivamente), que finalizaram com a tonalidade
bronzeada, aos 42 dias, nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
(Figuras 5Fd e Fe,
respectivamente), aspecto este relacionado ao processo oxidativo. Esse aspecto de
bronzeamento dos tecidos ficou mais evidente em folhas originadas de segmentos de
hipocótilos cultivados no ambiente com 150 μmol m
-2
s
-1
(Figura 5Fe).
Nos segmentos de hipocótilos cultivados sob as irradiâncias de 100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
, observou-se grande determinação para a formação de gemas, caracterizando um
emaranhado dessas estruturas, as quais não conseguiram evoluir em função do grande
número produzido. Esse talvez seja o motivo pelo qual não houve formação de brotos ao
final de 42 dias do cultivo dos segmentos de hipocótilo.
76
Figura 5. Segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis Sims. f. flavicarpa Deg.
aos 7 (A), 14 (B) 21 (C), 28 (D), 35 (E), 42 (F) dias do cultivo in vitro nas
irradiâncias de 12 (a), 25 (b), 50 (c), 100 (d), 150 (e) µmol m
-2
s
-1
.
a b c
d
e
a b c
d
e
a b c
d
e
a b c
d
e
a b c
d
e
a
b
c
d
e
A
B
C
D
E
F
77
No início da atividade morfogênica (formação de gemas) nos segmentos de
hipocótilo do maracujazeiro foi possível identificar, nos ambientes de 50 e 100 µmol m
-2
s
-1
, regiões com coloração arroxeada (Figuras 6A e 6B, respectivamente). Essa
tonalidade parece estar relacionada com produção de antocianinas. Com as análises
feitas até o momento, não foi possível identificar se essas manchas arroxeadas são
realmente antocianinas.
Figura 6. Detalhes de pigmentos púrpuros presentes em folhas durante a atividade
morfogênica em segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa cultivados nos ambientes de 50 (A) e 100 (B) µmol m
-2
s
-1
, aos 7
dias do cultivo in vitro.
Aos 7 dias de cultivo in vitro dos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa, verificou-se produção de etileno na ordem de 99,81; 457,33; 753,75;
852,00 e 942,20 nL C
2
H
4
gMF
-1
h
-1
nos ambientes de 12, 25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
de irradiância, respectivamente (Figura 7). Aos 14 dias de cultivo, a produção de etileno
pelos segmentos de hipocótilo reduziu-se nas respectivas irradiâncias, cerca de 98,24%
(12); 99,68% (25); 99,44% (50); 99,40% (100) e 99,46% (150 μmol m
-2
s
-1
) (Figura 7).
A B
78
Figura 7. Produção de etileno pelos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis
f. flavicarpa aos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias do cultivo nas irradiâncias de 12,
25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
. As barras correspondem ao desvio-padrão da
média.
Como ocorrido para o etileno, também para o CO
2
as maiores concentrações
deste gás produzidas pelos segmentos hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa foram
observadas aos 7 dias de cultivo. Neste tempo, a maior taxa de produção de CO
2
foi
encontrada naqueles explantes cultivados sob irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
, e a menor
na irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
(Figura 8).
Aos 14 dias, o comportamento dos explantes quanto a produção de CO
2
foi muito
semelhante aos 7 dias, porém, atingindo valores menores da concentração de CO
2
.
Também aos 14 dias, foi na maior irradiância (150 μmol m
-2
s
-1
) que se verificou a maior
concentração de CO
2
(Figura 8).
A partir do 21º dia de cultivo, houve grande limitação dos segmentos de
hipocótilo, quanto à produção de CO
2
, se comparado aos 7 e 14 dias de cultivo (Figura
8).
Irradiância
(
μ
mol
m
-2
s
-1
)
0
200
400
600
800
1000
1200
7 1421283542
Tempo (dias)
Etileno produzido
(nL C
2
H
4
gMF
-1
h
-1
)
12 25 50 100 150
79
Figura 8. Produção de CO
2
pelos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa aos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias do cultivo nas irradiâncias de 12, 25,
50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
. As barras correspondem ao desvio-padrão da
média.
O aumento dos níveis de irradiância promoveu redução no conteúdo de clorofila
a (Figura 9A), clorofila b (Figura 9B), clorofila total (Figura 9C), relação clorofila a/b
(Figura 9E) e carotenóides (Figura 9D). Entretanto, o aumento dos níveis de irradiância
resultou, proporcionalmente em maiores valores da relação carotenóides/clorofilas
(Figura 9F), devido à queda nos valores de carotenóides ter sido proporcionalmente
inferior à dos valores de clorofila.
Irradiância
(
μ
mol
m
-2
s
-1
)
0
2
4
6
8
10
12
7 1421283542
Tempo (dias)
CO
2
produzido
(mmol CO
2
gMF
-1
h
-1
)
12 25 50 10
0
150
80
Figura 9. Teores de clorofilas a (A), b (B), total (C) e carotenóides (D) e as relações
clorofila a/b (E) e carotenóides/clorofilas (F), em estruturas organogênicas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, obtidas nas irradiâncias de 12, 25, 50,
100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, aos 42 dias de cultivo dos segmentos de hipocótilo.
**
e
***
Significativo ao nível de 1% e 0,1% de probabilidade, respectivamente
pelo teste de F.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
μgCar gMF
-1
0
2
4
6
8
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCLa gMF
-1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
μgCLb gMF
-1
0
2
4
6
8
10
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCLt gMF
-1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Carotenóides/Clorofila
93,0
0348489,060206,5
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
90,0
0122686,009046,2
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
93,0
0471175,069252,7
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
98,0
00166615,0242256,0
ˆ
2
***
=
+=
R
IY
A
C
97,0
0104108,008789,2
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
D
B
83,0
00476281,081778,2
ˆ
2
**
=
−=
R
IY
E
F
0
1
2
3
4
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Clorofila a/b
81
Observou-se, na irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
, menor valor da coordenada “L”
(62,59) e na irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
o maior valor (63,93). Nos ambientes
espectrais estudados, verificou-se aumento linear crescente nos valores de “L” com a
elevação dos níveis de irradiância (Figura 10A).
Os valores da coordenada “a” foram negativos em todos os níveis de irradiância
estudados. O menor valor de “a” correspondeu ao menor nível de irradiância (12 μmol
m
-2
s
-1
), havendo aumento linear com o auemento da irradiância, aproximando-se de
zero na irradiância (150 μmol m
-2
s
-1
) (Figura 10B).
Em relação à coordenada “b”, em todos os tratamentos, observou-se valores
positivos. O maior valor encontrado foi de 12,04 na irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
,
reduzindo-se linearmente até o menor valor (3,55), obtido na irradiância de 150 μmol m
-
2
s
-1
(Figura 10C).
Todos os valores da tonalidade foram negativos. O menor foi observado na
irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
(-1,07), aumentando linearmente até a irradiância de 150
μmol m
-2
s
-1
(-0,91) (Figura 10D).
Verificou-se maior saturação na irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
(13,75), e o menor
valor (4,55) na de 150 μmol m
-2
s
-1
. Houve decréscimo linear nos valores de saturação à
medida que aumentou-se os níveis de irradiância (Figura 10E).
82
Figura 10. Medidas das coordenadas L (A), a (B), b (C), tonalidade (h, D) e saturação da
cor (C, E) pelo sistema de cor de Hunter em extratos de tecidos de
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa provenientes do processo organogênico,
em diferentes irradiâncias.
**
e
***
Significativo ao nível de 1% e 0,1% de probabilidade, respectivamente
pelo teste de F.
61,0
61,5
62,0
62,5
63,0
63,5
64,0
64,5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
L
-8
-6
-4
-2
0
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
a
0
5
10
15
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
b
74,0
00974042,04745,62
ˆ
2
**
=
+=
R
IY
97,0
0272648,098415,6
ˆ
2
***
=
+−=
R
IY
97,0
061561,07872,12
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
A
B
C
-1,15
-1,10
-1,05
-1,00
-0,95
-0,90
-0,85
-0,80
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
h
0
5
10
15
20
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
C
97,0
0665901,05567,14
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
97,0
00112263,008719,1
ˆ
2
***
=
+−=
R
IY
D
E
83
4. DISCUSSÃO
No presente trabalho, verificou-se formação de gemas, por organogênese direta,
ao longo de toda a região excisada do extremo distal dos segmentos de hipocótilo do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, independente dos níveis de irradiância a que foram
cultivados.
Com base em análises histológicas, Felismino (2005), verificou no extremo distal
de segmentos de hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, cultivados na
orientação vertical normal, a formação de gemas pela via direta. Essa via organogênica,
nesse mesmo tipo de explante de P. edulis f. flavicarpa, já havia sido descrita
anteriormente por Alexandre (2002) e Couceiro (2002). O presente trabalho está de
acordo com o exposto acima pelos autores, que verificaram apenas a formação de gemas
a partir de explantes hipocotiledonares e que a atividade morfogênica nesse tecido
ocorre de forma direta. Os autores acima citados também detectaram grande dificuldade
da conversão das gemas em brotos nesta espécie.
Como mencionado anteriormente, a não brotação das gemas pode-se dever a
competição entre elas, pelo seu elevado número. Entretanto, somente isso não constitui
explicação cabal, visto que o número de gemas por explante nas irradiâncias de 12 e 25
μmol m
-2
s
-1
não difere muito, e na irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
o número de gemas
que formaram brotos foi o dobro. Entretanto, verificou-se menor tamanho dos brotos sob
a irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
, em comparação àqueles formados a partir de segmentos
submetidos a 12 μmol m
-2
s
-1
. Isso pode dever-se à competição estabelecida entre os dois
brotos que se formam na irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
, enquanto na irradiância de 12
μmol m
-2
s
-1
, apenas um broto se desenvolveu.
Entretanto, Appezzato-da-Glória et al. (2005), ao promoverem análises
anatômicas do processo organogênico in vitro nas espécies P. edulis f. flavicarpa e P.
cincinnata constataram grande determinação dos explantes foliares e hipocotiledonares
para a formação direta de primórdios foliares. Isto contrasta com os trabalhos obtidos
por Alexandre (2002), Couceiro (2002) e Felismino (2005) no referente à organogênese
em segmentos hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa, onde os três autores
verificaram que os primórdios foliares sempre se formavam com o alongamento das
84
gemas. Todavia, observaram maior freqüência de gemas obtidas a partir de explantes
hipocotiledonares, de que de discos foliares. Conforme relatado por Appezzato-da-
Glória et al. (2005), esse caminho organogênico é preocupante, pois a presença do
meristema apical caulinar é essencial para a produção de brotos. Esses autores,
mostraram ainda que, as estruturas foliares isoladas têm a sua base inserida diretamente
no explante, enquanto as gemas caulinares apresentam os primórdios foliares saindo de
um eixo comum. Neste caso, os autores verificaram que o processo organogênico é
assincrônico; gemas, estruturas foliares e protuberâncias podem ser observadas em
diferentes etapas de desenvolvimento em um mesmo explante. Biasi et al. (2000), ao
estudarem o processo organogênico em segmentos internodais de plantas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, também constataram a formação de primórdios
foliares. Segundo esses autores, o efeito residual do BAP promoveu maior número de
brotos por explante em detrimento de seu alongamento.
Fernando et al. (2005) mostraram que a maioria das gemas de P. edulis f.
flavicarpa formaram-se a partir de meristemóides originados nas camadas periféricas
das protuberâncias (estruturas de 0,5 a 2,0 mm de diâmetro, formadas a partir de
meristemóides). As protuberâncias formadas a partir de discos foliares produziram mais
de uma estrutura na sua superfície, e estas eram folhas, enquanto nos explantes
hipocotiledonares as protuberâncias apresentaram-se individualizadas e com as camadas
epidérmicas e subepidérmicas definidas. Segundo os autores, a possível falha na
determinação dos meristemóides que levam à formação das protuberâncias pode ser
conseqüência do período em que os explantes permaneceram em meio de indução,
contendo BAP. Gahan et al. (2003) informaram que a superexposição das células às
citocininas leva à morte celular, o que possivelmente explica a falha no desenvolvimento
de algumas células ou explantes quando expostos por períodos prolongados ao regulador
de crescimento.
Appezzato-da-Glória et al. (1999) observaram que explantes foliares cultivados
em meio MS contendo BAP (1,0 mg L
-1
), sob luz (23 μmol m
-2
s
-1
), apresentaram
alterações na região do bordo foliar e que, no 14º dia de cultivo, as divisões nas camadas
mais periféricas conduziram à formação de áreas meristemáticas, chamadas
“meristemóides”. A presença de alguns brotos em fases distintas de desenvolvimento foi
85
observada no 28º dia, confirmando a origem meristemática dos brotos. Assim, os brotos
adventícios foram desenvolvidos de áreas que continham os meristemóides depois da
segunda semana de cultivo, como resultado da atividade mitótica de células
parenquimáticas. A identificação desse centro meristemático ou “meristemóide” de
forma continuada já havia sido constatado por Moran Robles (1979) nas espécies P.
edulis f. flavicarpa e P. molissima, durante os vinte primeiros dias de cultivo dos
explantes.
O decréscimo da atividade da SOD nos tecidos dos segmentos de hipocótilo do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivados in vitro, nas irradiâncias de 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
(Figura 3) significa baixa conversão do radical superóxido (O
2
˙¯) a peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
). Isso implica acúmulo do radical superóxido, favorecendo
subseqüentemente a formação do radical hidroperoxila (HO˙
2
) que é a forma protonada
do radical superóxido. O hidroperoxila tem como característica ser mais reativa que o
superóxido e apresentar maior facilidade em iniciar a destruição de membranas
biológicas (Ferreira & Matsubara, 1997). Este fato pode ser confirmado pelo aumento do
conteúdo de malondialdeído (MDA) com a elevação dos níveis de irradiância a que
foram submetidos os segmentos hipocotiledonares (Figura 4). Segundo Shimizu et al.
(1984), o radical HO˙
2
é considerado o mais reativo para a catalase (CAT), podendo
difundir-se facilmente em membranas, representando, por conseguinte, o principal
agente inativador dessa enzima. O declínio na atividade da enzima CAT, observado em
segmentos de hipocótilo do maracujazeiro cultivados nos ambientes de 100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
, se deve, provavelmente, à sua inativação promovida por ROS, como por
exemplo, o radical hidroperoxila (HO˙
2
). Ye et al. (2000) observaram, em plantas de
feijoeiro, diminuição da atividade da CAT sob altas irradiâncias. Verificaram ainda que,
a re-síntese da CAT compensa a sua perda e mantém o seu nível constante, quando as
plantas dessa espécie são transferidas para ambientes cuja irradiância não conduz ao
estresse.
Shang & Feierabend (1999) verificaram que existe uma relação entre a
dependência da inativação da catalase com os diferentes comprimentos de onda. Dessa
forma, sob luz azul a extensão da inativação da catalase aumenta continuamente com a
elevação dos níveis de irradiância, enquanto, sob luz vermelha, a inativação somente
86
ocorreu a partir de 500 μmol m
-2
s
-1
, e com menor intensidade, se comparado à luz azul.
Na faixa do vermelho-distante não ocorreu inativação dessa enzima.
De acordo com Arora et al. (2002), o nível da enzima catalase (CAT), presente
nos peroxissomos é ineficiente na remoção de baixas concentrações de H
2
O
2
, sendo
estas moléculas reduzidas pela ação da glutationa e das peroxidases. Portanto, a atuação
da CAT torna-se mais importante quando a concentração de H
2
O
2
está em níveis mais
elevados.
Na Figura 3, é possível observar o exposto acima pelo autor, isto é, aumento da
atividade da peroxidase (POD) com os níveis crescentes de irradiância, já que o papel da
referida enzima é o de aumentar sua atividade, principalmente em condições de baixas
concentrações de H
2
O
2
. Esse aumento da atividade da POD, verificado principalmente a
partir da irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3), pode ser a explicação da não
formação de brotos nos segmentos de hipocótilo do maracujazeiro, pois segundo Sitbon
et al. (1999), esta enzima promove, por um lado, a oxidação do AIA, e
conseqüentemente está envolvida com a biossíntese da lignina, e, por outro, a modulação
das propriedades da parede celular durante o crescimento da planta (Bacon, 1997). Sofo
et al. (2005) também relacionaram alta atividade da POD com o aumento da lignificação
e oxidação, e com a conseqüente inativação do AIA. Portanto, o aumento da atividade da
POD contribuiu para a restrição da expansão da célula, que, em troca, causa limitação no
crescimento de brotos (Dichio et al., 2002). Assim, o aumento na atividade da
peroxidase significa menos auxina para o crescimento (Arezki et al. 2001). A POD tem
maior afinidade pelo H
2
O
2
, se comparado a CAT, porém requer algum componente
fenólico (por exemplo, o guaiacol) como substrato (Mehlhorn et al., 1996).
A maior produção de etileno, verificada aos 7 dias de cultivo dos segmentos de
hipocótilo do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, nas maiores irradiâncias (50, 100 e
150 μmol m
-2
s
-1
) (Figura 7), promoveu clorose nos órgãos formados (gemas e brotos),
nas fases iniciais do desenvolvimento, aos 14 dias (Figuras 5Bc, Bd e Be,
respectivamente). Faria & Segura (1997) relataram que a capacidade morfogênica de
explantes de P. edulis f. flavicarpa foi limitada pelo acúmulo de etileno in vitro. Nestes
ambientes de maior irradiânicia, os valores mais elevados da coordenada “L” (Figura
10A), indicam tecidos mais claros, possivelmente devido à maior produção e acúmulo
87
de etileno nos frascos de cultivo. Concomitantemente, por intermédio da coordenada “a”
(Figura 10B), foi possível também identificar nesses ambientes de maior irradiância,
tecidos menos verdes. Na região distal dos segmentos de hipocótilo cultivados por 42
dias, sob a irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
, verificou-se aumento da senescência,
evoluindo para tecidos com aspecto dourado, típico de processo oxidativo (Figura 5Fe).
Verificou-se também que os ambientes de maior irradiância (50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
)
(Figura 8) estimulam a produção de CO
2
pelos segmentos hipocotiledonares dessa
espécie. Essa maior produção de CO
2
in vitro, aos 7 dias, independentemente dos níveis
de irradiância estudados, pode, em parte, dever-se ao aumento da produção de etileno,
promovido pelos ferimentos nos tecidos causado pela individualização dos 5 segmentos
de hipocótilo. Em função dessa injúria nos tecidos, os explantes sob estresse produziram
etileno que foi possivelmente catabolizado, tendo como produto da quebra metabólica, o
dióxido de carbono (Raskin & Beyer Junior, 1989). Segundo Taiz & Zeiger (2004), a
biossíntese de etileno é estimulada por vários fatores, incluindo os ambientais, lesões
físicas e químicas, ao passo que ferimentos químicos estimulam a atvidade da enzima
ACC sintase e os físicos a ACC oxidase (Fluhr & Mattoo, 1996). Considerando que, em
geral, as regiões meristemáticas e de nós são ativas na biossíntese de etileno, e
consequentemente, as folhas jovens produzem mais etileno que as folhas totalmente
expandindas, esta pode ser uma das explicações para o aumento na produção de CO
2
onde o etileno pode ser completamente oxidado a CO
2
(Buchanan et al., 2000; Taiz &
Zeiger, 2004).
Na espécie Carica papaya L., Magdalita et al. (1997) observaram o contrário,
menor produção de etileno quando segmentos nodais foram cultivados in vitro, sob 150
μmol m
-2
s
-1
, se comparado à irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
. Magdalita et al. (1997)
observaram redução na senescência dos tecidos do mamoeiro. Durante a formação de
brotos axilares do mamoeiro in vitro, os referidos autores constataram acúmulo de
etileno e com os brotos mostrando-se epinásticos e com abiscisão foliar, após 3 semanas
de cultivo; porém, aqueles cultivados por 1 semana e submetidos, subsequentemente, à
aeração por 5 semanas, exibiram crescimento vigoroso com folhas maiores e verdes.
Portanto, o etileno pode ser fundamental no período de iniciação do broto axilar, mas
sua presença por períodos mais prolongados inibe o crescimento subsequente do broto
88
(Lai et al., 1998). A baixa produção de etileno em irradiâncias menores, pode juntamente
com alterações no balanço de giberelinas e auxinas, promover aumento no crescimento
de plantas (Kurepin et al., 2006).
Jona et al. (2002) verificaram que o etileno, inicialmente, estimula a síntese de
clorofila em plantas in vitro e que a presença desse gás em período curto de tempo, não
excedente a 6 dias, é benéfico à planta. Como o etileno é antagonista à auxina, supõem-
se que o efeito inicial do etileno é de diminuir a concentração de auxinas nos tecidos do
explante, aumentando a relação citocinina/auxina (Abeles, 1972).
Observa-se, com o decréscimo nos teores de clorofila a, b, total, carotenóides e
da relação clorofila a/b (Figuras 9A, B, C, D e E), que a elevação dos níveis de
irradiância afetou a biossíntese ou degradação dos pigmentos cloroplastídicos. Segundo
Lu et al. (2003), a perda de clorofila é um fenômeno típico de senescência foliar. Os
autores definiram nesse trabalho, como folhas normais, aquelas que apresentaram cerca
de 690 μmol clorofila m
-2
, enquanto aquelas com 350 e 170 μmol clorofila m
-2
foram
classificadas como moderadamente e severamente senescentes. Em relação ao presente
trabalho, em termos proporcionais, podemos considerar, pelo teor de clorofila total,
obtidos nos ambientes de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
que os tecidos são considerados
moderadamente e severamente senescentes, respectivamente, de acordo com o modelo
comparativo de Lu et al. (2003). Nestes ambientes, a perda do conteúdo de clorofila foi
de 58 e 93% nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, respectivamente, se comparado
ao menor nível de irradiância estudado (12 μmol m
-2
s
-1
) (Figura 9C). Por outro lado,
verificou-se aumento na relação carotenóides/clorofilas (Figura 9F), à medida que
elevou-se os níveis de irradiância. Isto indica que, nas maiores irradiâncias, os tecidos
apresentam mais carotenóides, se comparado àqueles nas menores irradiâncias. Quiles &
López (2004), ao isolarem cloroplastos de folhas de aveia, verificaram aumento, porém
pequeno, da relação carotenóides/clorofilas em plantas expostas à irradiânicias mais
altas. Segundo Behera & Choudhury (2001), baixa relação clorofila total/carotenóides
indica mais carotenóides nas folhas. Segundo Taiz & Zeiger (2004), as folhas de sombra
apresentam mais clorofila por centro de reação, a razão clorofila b/a é mais alta e são
geralmente mais finas do que as folhas de sol. Martinez et al. (2005) verificaram
aumento na relação carotenóides/clorofilas em folhas de plantas crescidas a pleno sol, se
89
comparado à condições de sombra. Segundo Choudhury & Behera (2001), os
carotenóides atuam como pigmentos fotoprotetivos, protegendo as clorofilas do excesso
de radiação, neutralizando a clorofila triplete e oxigênio singleto.
Na região verde das folhas, os carotenóides são muito importantes na proteção
cloroplastídica (Bartley & Scolnik, 1995). No complexo pigmento-proteína, os
carotenóides associados às clorofilas desativam a clorofila excitada e assim pode
dissipar o excesso de energia (Matile, 2000). Os carotenóides convertem as formas
potencialmente tóxicas de clorofila (triplete) e oxigênio (singleto), em formas não
tóxicas (clorofila singleto e oxigênio triplete). Após as transformações, os carotenóides
ficam num estado triplete, retornando ao estado fundamental, liberando o excesso de
energia (Goodwin & Mercer, 1983).
A membrana dos tilacóides contém uma gama de carotenóides fotoprotetivos. A
violaxantina tem essa função protetora, devido a sua localização e ação, quando há
alterações no ambiente luminoso. Altas irradiâncias provocam mudanças nas membranas
tilacóidais e causa ancoragem do complexo coletor de luz do fotossistema II (LCH II).
Há evidências de que essa ancoragem da proteína LCH II está associada com alterações
na conformação e orientação dos pigmentos, como a torção de algumas moléculas do
ciclo das xantofilas durante a ancoragem. Como a transferência de energia dos
carotenóides para as clorofilas requer aproximação maior dos pigmentos, essa
modificação da orientação, distancia os pigmentos na antena, podendo impedir a
transferência de energia. Isso foi observado in vivo, após iluminação de folhas com
intensidades altas, na qual provocou diminuição no rendimento quântico da evolução do
O
2
. Embora pouca atenção foi dada à possível função protetora dos carotenóides, é
concebível que esta mudança conformacional nos complexos coletores de luz assegura à
violaxantina liberdade necessária de movimento para operar o ciclo das xantofilas
(Havaux, 2001).
5. CONCLUSÕES
٠ As menores irradiâncias (12 e 25 µmol m
-2
s
-1
) são as mais eficientes no processo
morfogênico em segmentos hipocotiledonares do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa;
90
٠ Há uma relação direta entre a não formação de brotos, nas maiores irradiâncias (100 e
150 µmol m
-2
s
-1
), com a elevação da atividade da peroxidase;
٠ O avanço na peroxidação de lipídios de membrana é determinado pela queda na
atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase, nas irradiâncias de 100 e 150
µmol m
-2
s
-1
.
٠ A quantidade de irradiância incidida sobre os segmentos hipocotiledonares influencia a
emissão de etileno e CO
2
e existe uma relação entre produção de etileno e biossíntese
ou degradação de pigmentos foliares
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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100
Capítulo IV
Estresse foto-oxidativo durante o crescimento in
vitro de ápices caulinares de Passiflora edulis Sims
f. flavicarpa Degener, sob diferentes irradiâncias
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo avaliar o crescimento in vitro de ápices
caulinares do maracujazeiro Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener, bem como a
atividade da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), peroxidase (POD) e o nível
de malondialdeído (MDA) em plântulas crescidas sob diferentes irradiâncias. O
experimento foi instalado em delinamento inteiramente casualizado, totalizando cinco
tratamentos, com dez repetições. Os tratamentos foram os cinco níveis de irradiância
(12, 25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
). Verificou-se, com o aumento dos níveis de
irradiância, redução no crescimento dos ápices caulinares e também no número de
folhas, massa da matéria fresca e seca da parte aérea. Os ápices caulinares tiveram
maiores porcentagens de enraizamento nas irradiâncias de 12, 25, 50 e 100 μmol m
-2
s
-1
(em torno de 90,0%) se comparado à de 150 μmol m
-2
s
-1
(75,0%). A elevação dos níveis
de irradiância fez aumentar a atividade das enzimas SOD e POD até 50 μmol m
-2
s
-1
,
enquanto acima desse nível, houve queda da atividade. O contrário foi observado com a
CAT, cuja elevação dos níveis de irradiância fez aumentar a atividade dessa enzima. O
mesmo foi observado com o conteúdo de MDA. As maiores irradiâncias favoreceram a
elevação nas taxas de etileno e CO
2
. Esse aumento nos teores de etileno in vitro
contribuiu para a redução nos teores dos pigmentos cloroplastídicos. Portanto, os ápices
caulinares do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa desenvolveram-se melhor debaixo
das menores irradiâncias (12 e 25 μmol m
-2
s
-1
).
101
1. INTRODUÇÃO
Nos trabalhos realizados por Alexandre (2002), Couceiro (2002) e Felismino
(2005) sobre propagação in vitro do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, observou-se
que sementes dessa espécie, quando colocadas para germinar in vitro, no escuro,
produziram plântulas axênicas apresentando inicialmente ápices caulinares do hipocótilo
em forma de gancho e estando os primórdios foliares envolvidos por restos do
endosperma. Esta condição foi observada como persistente por até 30 dias após a
germinação, dificultando a emergência ou abertura das folhas cotiledonares, fator de
fundamental importância para o desenvolvimento das plântulas. No entanto, vale realçar
que as plântulas, entre 12 e 21 dias, são utilizadas para extração de explantes do tipo
ápices caulinares (epicótilo) e segmentos hipocotiledonares.
Supõe-se que tal anomalia possa estar relacionada a algum tipo de estresse, como
por exemplo, estresse foto-oxidativo.
A fotoinibição é um conjunto complexo de processos moleculares, definidos
como a inibição da fotossíntese por excesso de luz (Taiz & Zeiger, 2004). Em plantas de
milho fotoinibidas, observaram que, sob alta irradiância, ocorreu perda parcial da
atividade de algumas enzimas envolvidas no metabolismo do carbono e que são ativadas
por luz (Powles et al., 1982).
Existe uma série de produtos fototóxidos resultantes do excesso de fótons que
não são utilizados durante a fotossíntese, como a clorofila no estado triplete (
3
Ch
*
),
oxigênio singleto (
1
O
2
*
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), radical hidroxila (.OH) e o
superóxido (O
2
-
). O superóxido é uma das espécies reativas do oxigênio (ROS),
consideradas muito prejudiciais às membranas biológicas. Os superóxidos, assim
formados, são passíveis de eliminação pela ação de uma série de enzimas, incluindo a
superóxido dismutase e ascorbato peroxidase (Asada, 1999).
Em condições fisiológicas normais (não estressantes) a produção de ROS (H
2
O
2
e O
2
.-
) pelos peroxissomos, deveria ser controlada adequadamente por catalase e
ascorbato peroxidase. A catalase é uma enzima inativada por luz e outras condições
estressantes (Schfer & Feierabend, 2000), podendo conduzir aumento na geração de
H
2
O
2
e O
2
.-
pelos peroxissomos (del Rio et al., 1992, 1996). Radicais superóxidos
102
inibem a atividade da catalase (Kono & Fridovich, 1982). Em plantas de tabaco o ON e
peroxinitrito (ONOO
-
, espécie reativa de nitrogênio), além de inibir a atividade da
catalase, também promove a inibição da ascorbato peroxidase (APX), que são enzimas
responsáveis pela remoção de H
2
O
2
nos peroxissomos (Clark et al., 2000). Em células
animais, observaram que o aumento na síntese de ON promoveu aumento na β-oxidação
peroxissomal, resultando na produção de H
2
O
2
. Esses resultados indicam que,
dependendo do estresse a que as plantas estejam submetidas, ou seja, abiótico ou biótico,
ocorre indução na produção peroxissomal de O
2
.-
e ON. Isto pode conduzir à inibição da
atividade da catalase e APX e aumento de H
2
O
2
pelo aumento da β-oxidação. Esse
desarranjo das defesas antioxidantes dos peroxissomos originaria uma superprodução de
H
2
O
2
nos peroxissomos, resultando em efeito tóxico para a célula.
O presente trabalho teve por objetivo avaliar o efeito de alguns fatores do
estresse foto-oxidativo durante o crescimento de ápices caulinares de P. edulis f.
flavicarpa cultivados in vitro.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas
As sementes foram extraídas de frutos maduros e colhidos de uma única planta
de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, procedente do pomar do Setor de Fruticultura,
da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais.
Em condições laboratoriais e mediante uso de uma peneira de malha fina, o arilo
das sementes foi removido, pressionando-as cuidadosamente, depois de envolvê-las em
cal extinta. Em seguida, as sementes foram lavadas em água de torneira até completa
remoção da cal e restos placentários. À continuação, foram submetidas a secagem à
sombra, sobre papel toalha, por três dias. Após o processo de secagem, procedeu-se o
preparo das sementes. O tegumento externo (episperma) foi completamente removido
com auxílio de uma mini-morsa.
As sementes, assim preparadas, foram desinfestadas sob condições de câmara de
fluxo laminar. Inicialmente, foram submetidas por 1 minuto em solução de etanol a 70%
103
(v/v), seguido de três enxaguaduras; e logo após, imersas em solução de hipoclorito de
sódio com 2,4% de cloro ativo do produto comercial Candura
®
, durante 20 minutos e,
posteriormente, enxaguadas por três vezes em tempos de 1 minuto, sob agitação
constante em água desionizada e autoclavada.
O meio de cultivo das sementes foi constituído dos minerais nutrientes de MS
(Murashige & Skoog, 1962), vitaminas de White (1951), 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30
g L
-1
de sacarose e 8,0 g L
-1
de ágar (Isofar
®
), como agente solidificante. O pH do meio
foi ajustado a 5,7 ± 0,1, antes da adição do ágar. Alíquotas de 10 mL deste meio foram
distribuídas por tubo de ensaio (25 x 150 mm). Os tubos, contendo o meio foram
fechados com tampas de propileno transparentes e autoclavados a 121 ºC e pressão de
1,5 kgf cm
-2
, durante 20 minutos.
As sementes foram semeadas no meio de cultivo, uma por tubo de ensaio. Após o
semeio, os tubos foram fechados como já descrito anteriormente, acondicionados em
grades que foram envolvidas com papel alumínio e transferidos para a sala de cultivo
com temperatura de 27 ± 2 ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%. O papel
alumínio foi utilizado para proteger as sementes contra luz, já que são classificadas,
como fotoblásticas negativas por Maciel & Bautista (1997).
O período de incubação foi de 12 dias, tempo suficiente para obter as plântulas
axênicas e com tamanho suficiente para obtenção dos ápices caulinares.
2.2. Fase de cultivo dos ápices caulinares
O meio de cultivo para ápices caulinares apresentou a mesma constituição química
e o mesmo modo de preparação daquele já descrito para a germinação de sementes.
Utilizou-se inclusive, o mesmo tipo de frasco de cultivo e que recebeu a mesma alíquota
de 10 mL de meio de cultura. A exceção foi o agente geleificante, que para o cultivo de
ápices caulinares foi o Gelrite (Merck
®
) a 2,5 g L
-1
de meio.
Os ápices caulinares, excisados com aproximadamente 2,0 cm de comprimento,
foram plantados em condições de câmara de fluxo laminar, na orientação vertical em
tubos de ensaio, que foram fechados com duas camadas de filme transparente de PVC
(Rolopac
®
).
104
Os tubos de ensaio, contendo os explantes, foram incubados em sala de crescimento,
distribuídos nas prateleiras das estantes, à distância de aproximadamente 5 cm entre si,
de forma a não proporcionar sombra nos mesmos, com controle de temperatura de 27 ±
2 ºC, fotoperíodo de 16/8 h (luz/escuro) e irradiâncias de 12; 25; 50; 100 e 150 µmol m
-2
s
-1
, fornecidas por tubos fluorescentes OSRAM
®
, com potência de 40 W, luz do dia. O
modo pelo qual os ambientes espectrais foram conseguidos acha-se descrito no Capítulo
III.
O período de incubação foi de 42 dias.
2.3. Características avaliadas
2.3.1. Análise de crescimento
A partir de cada ápice caulinar, foi avaliado o índice de velocidade de
emergência (IVE) e porcentagem de emergência dos cotilédones; porcentagem de
abscisão do nó e da folha cotiledonar; altura de plantas (cm); área foliar (cm
2
); número
de folhas; número e comprimento de raiz; porcentagem de enraizamento; massa da
matéria fresca e seca de parte aérea (mg).
2.3.2. Determinação da atividade das enzimas peroxidase (POD
EC1.11.1.7), catalase (CAT EC1.11.1.6) e superóxido dismutase
(SOD EC1.15.1.1)
O extrato enzimático bruto para a determinação da atividade da peroxidase,
catalase e superóxido dismutase foi obtido pela homogeneização de 0,5 g da parte aérea
de plântulas do maracujazeiro (congeladas em nitrogênio líquido e mantidos a –80 ºC)
com 4 mL de solução de extração (EDTA 0,1 mM em tampão de fosfato de potássio 0,1
M, pH 6,8), em almofariz de porcelana. Os fragmentos de células foram removidos por
centrifugação a 12000 g por 20 minutos, utilizando o sobrenadante como fonte de
proteínas, de acordo com metodologia descrita por Saher et al. (2004). Todas as etapas
necessárias ao processo foram executadas a 4 ºC.
105
2.3.2.1. Peroxidase (POD EC1.11.1.7)
A atividade de PODs nas partes aéreas foi determinada espectrofotometricamente
a 25 ºC, pelo aumento da absorvância a 470 nm, a partir da reação de 100 μL do extrato
enzimático bruto diluído a 1:4 (v/v) com água desionizada em uma mistura de reação
contendo 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 0,2 M, pH 6,5; 0,5 mL de guaiacol e 0,4
mL de H
2
O
2
0,59 M, em um volume total de 3 mL (Chance & Maehley, 1955). Os
resultados foram expressos em ΔA
470
min
-1
mg
-1
de proteína.
2.3.2.2. Catalase (CAT EC1.11.1.6)
A atividade das CATs nas partes aéreas foi determinada após a adição de 100 μL
do extrato enzimático bruto a 2,9 mL do meio de reação, constituído de 500 μL de H
2
O
2
59 mM; 1,5 mL de tampão fosfato de potássio 0,05 M, pH 7,0 e 400 μL de água
desionizada a 30 ºC (Havir & McHale, 1987). A atividade da enzima foi determinada
pelo decréscimo na absorvância a 240 nm e expressa em μmol H
2
O
2
min
-1
mg
-1
de
proteína.
2.3.2.3. Superóxido dismutase (SOD EC1.15.1.1)
À mistura de reação, constituída de 0,3 mL de metionina 130 μM; 0,1 mL de azul
de p-nitrotetrazólio (NBT) 2250 μM; 0,1 mL de EDTA 3 μM; 0,2 mL de riboflavina;
0,75 mL de água desionizada e 1,5 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM em pH 7,8
(Del Longo et al., 1993), adicionaram-se 100 μL do extrato enzimático bruto. A reação
foi conduzida a 25 ºC, em tubos de ensaio dispostos em orifícios eqüidistantes de um
tubo fluorescente de 15 W, colocado no centro de uma câmara de incubação circular e
foi iniciada pela ligação da lâmpada fluorescente. Após 15 min, o desligamento do tubo
fluorescente interrompeu a reação, sendo a produção de formazana azul medida pela
determinação do incremento na absorvância a 560 nm, que foi subtraído de um
“branco”, no qual não havia extrato enzimático. Nestas condições, uma unidade de SOD
106
foi definida como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a fotoredução
do NBT (Giannopolitis & Ries, 1977; Totola, 1998).
2.3.2.4. Quantificação de proteínas
As determinações da quantidade de proteína presente nos referidos extratos
foram feitas pelo método de Bradford (1976), usando Soroalbumina Bovina (BSA)
como padrão.
2.3.3. Determinação do teor de malondialdeído (MDA)
A peroxidação lipídica nas plântulas foi expressa como teor de malondialdeído
(MDA), determinado pelo método de TBARS (Buege & Aust, 1978). Amostras de
tecidos dessas estruturas (100 mg de matéria fresca) foram homogeneizadas em 5,0 mL
de ácido tricloroacético (TCA) 0,1% (p/v), na presença de polivinilpolipirrolidona
(PVPP) na proporção de 1:1,5 (PMF:PVPP). O homogenato foi centrifugado por 30
minutos a 4000 g. Todas as etapas necessárias ao processo de extração foram conduzidas
a 4 ºC. Retirou-se do sobrenadante uma alíquota de 1,0 mL adicionando 4,0 mL da
mistura contendo 10% (p/v) de TCA e 0,5% de TBA, contendo 0,01% de BHT
(butilhidroxitolueno). Em seguida, os tubos de ensaio contendo a mistura foram
fechados e incubados em banho-maria por 15 minutos a 95 ºC, sob agitação. A reação
foi interrompida pela transferência dos tubos de ensaio para banho de gelo. O “branco”
foi preparado sem a amostra, porém seguindo todas as outras etapas. A absorvância do
sobrenadante foi lida a 535 nm e 600 nm. A quantidade formada do complexo MDA-
TBA foi determinada utilizando-se a metodologia descrita por Dhindsa et al. (1981),
conforme a seguinte equação: [MDA] = (A
535
-A
600
)/(ζ . b), onde, ζ (coeficiente de
extinção) = 1,56 x 10
-5
mol
-1
cm
-1
e b (comprimento ótico) = 1 cm.
107
2.3.4. Produção de etileno (C
2
H
4
) e dióxido de carbono (CO
2
)
Para a avaliação do acúmulo de etileno e CO
2
, cada tratamento constituiu-se de
36 tubos de ensaio, contendo cada uma plântula, que de 7 em 7 dias, 6 destes tubos de
cada tratamento foram tomados, para a determinação dos gases. Os tubos de ensaio
foram abertos em câmara de fluxo laminar por 30 minutos e novamente vedados com
duas camadas de filme plástico transparente de PVC Rolo-pack
®
. As leituras foram
realizadas após 24 horas para cálculo da taxa de produção. Retirou-se dos tubos de
ensaio duas amostras dos gases liberados pelos tecidos, com auxílio de seringas, de 1
mL cada; a alíquota amostrada foi injetada em cromatógrafo a gás (Modelo GC – 1413,
Shimadzu Kyoto), equipado com detector TCD e FID para determinação das
concentrações de etileno e CO
2
. As temperaturas da coluna (porapak-Q), do injetor e do
detector foram de, respectivamente, 50, 100 e 135 ºC.
A taxa de produção de etileno e CO
2
foi expressa em nL C
2
H
4
g MF
-1
h
-1
e mmol
CO
2
g MF
-1
h
-1
, respectivamente, segundo as equações: TX = C . V. t
-1
. p
-1
e TX = C . V.
10. t
-1
. p
-1
, respectivamente, onde C = concentração do etileno e/ou de CO
2
no frasco (nL
mL
-1
e/ou mmol mL
-1
, respectivamente); V = volume da fase gasosa (mL); t = tempo de
acúmulo (horas); p = massa da matéria fresca (g).
2.3.5. Determinação dos pigmentos foliares
Para a análise dos pigmentos foliares, foram removidas folhas das plântulas
formadas e pesadas individualmente até atingirem 0,1 g. Em seguida, as amostras foram
incubadas em solução de 20 mL de dietil éster por 24 horas, em frascos envolvidos com
papel alumínio, como forma de proteção contra luz. O extrato foi colocado em uma
cubeta de quartzo, realizando-se as leituras em espectrofotômetro UV/VIS digital, marca
HITACHI, modelo U-2001, cuja densidade ótica das amostras foi lida a 660,6; 642,2 e
470 nm. Foram determinados os teores de clorofilas a, b e totais e de carotenóides, das
relações clorofila a/b e carotenóides/clorofilas.
108
2.3.6. Análise de cor
Para a avaliação da cor utilizou-se colorímetro de triestímulos COLOR QUEST
II e o software Universe da Hurterlab, Reston, VA, sob o iluminante D nos sistemas de
cor de Hunter com os parâmetros L, a, b; onde L representa a luminosidade, que
caracteriza o grau de claridade da cor; +a, o vermelho; -a, o verde; +b, o amarelo; –b, o
azul.
Nas medições de cor, o material organogênico (gemas e brotos, 0,1 g), foi
incubado em solução de 20 mL de dietil éster por 24 horas, em frascos envolvidos com
papel alumínio, como forma de proteção contra luz. O extrato foi colocado em uma
cubeta de quartzo de 80:60:15 mm, realizando-se as leituras. Com os valores obtidos nas
leituras das coordenadas a e b, foram calculados os valores da tonalidade ou nuança, h =
arctg (b/a) e da saturação da cor ou croma, C =
22
ba + . A saturação ou cromaticidade
da cor é a qualidade que caracteriza a quantidade de cor, indicando os níveis em que está
misturada com o branco, o preto ou o cinza. A tonalidade da cor ou matiz é a grandeza
que caracteriza a qualidade da cor, o que possibilita a diferenciação das cores.
2.4. Delineamento experimental
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado, com 16
repetições (16 tubos de ensaio), onde os tratamentos foram os 5 níveis de irradiância,
sendo a parcela experimental constituída de um ápice caulinar cultivados na posição
vertical.
3. RESULTADOS
Os resultados da avaliação do índice de velocidade de emergência (IVE) e
porcentagem de emergência dos cotilédones de sementes do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa podem ser vistos na Figura 1A.
109
As maiores velocidades de emergência dos cotilédones de dentro dos restos do
endosperma ocorreram nas irradiâncias de 100, 50 e 150 μmol m
-2
s
-1
, nesta ordem
(Figura 1Aa). E as maiores porcentagens de emergência aconteceram nas irradiâncias de
50 (48,43%), 100 (46,87%) e 150 (43,75%) μmol m
-2
s
-1
(Figura 1Ab).
Os aspectos morfológicos do ápice caulinar, caracterizado como sendo o extremo
distal do hipocótilo, podem ser vistos na Figura 1B.
Figura 1. (A) Índice de velocidade de emergência (IVE, a) e emergência (%, b) dos
cotilédones de sementes de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa plantados in
vitro, sob diferentes níveis de irradiância; (B) Ápice caulinar mostrando a
abertura do nó cotiledonar, indicado pela seta e detalhe do nó cotiledonar,
mostrando o início da emergência das folhas cotiledonares, através do
rompimento dos restos do endosperma (asterisco); (C) Detalhe do nó
cotiledonar mostrando a abertura do nó cotiledonar. As barras correspondem
ao desvio-padrão da média.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
IVE
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Emergência (%)
A
a
b
B
*
*
C
110
Sinais de estresse, como abscisão do nó e das folhas cotiledonares, bem como
clorose das folhas e do ápice caulinar podem ser visualizados nos explantes cultivados
nas irradiâncias de 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
(Figuras 2 Ba, Bb e Bc, respectivamente).
Nessa ordem de ambiente espectral, se estabeleceu um gradiente crescente no nível de
clorose das folhas. Na irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
, foi identificado, ainda, ao longo
do ápice caulinar, enrugamento do tecido, característico de perda da turgescência
celular, sinalizando uma senescência precoce.
Figura 2. (A) Abscisão do nó cotiledonar (%, a) e das folhas cotiledonares (%, b) dos
ápices caulinares do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivados in vitro,
sob diferentes níveis de irradiância; (B) Sinais de estresse, como abscisão do
nó e das folhas cotiledonares e clorose das folhas (seta) e do ápice caulinar. O
asterisco (*) representa a emissão de novas folhas. Legenda: a) 50; b) 100; c)
150 μmol m
-2
s
-1
. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Abscisão da folha cotiledonar
(%)
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Abscisão do nó cotiledonar
(%)
*
B
*
*
*
*
a
b
c
A
a
b
111
As maiores porcentagens de abscisão do nó cotiledonar aconteceram nas
irradiâncias de 50 (51,5%), 100 (56,2%) e 150 (64,0%) μmol m
-2
s
-1
(Figura 2Aa).
Comportamento semelhante foi observado para a porcentagem de abscisão das folhas
cotiledonares, sendo esta de 17,0%, 20,0% e 23,0% nas respectivas irradiâncias de 50,
100 e 150 μmol m
-2
s
-1
(Figura 2 Ab). A abscisão do nó cotiledonar não comprometeu,
inicialmente, a sobrevivência do ápice caulinar, pois em seguida houve a emergência de
folhas, indicando o restabelecimento do explante. Entretanto, essas novas folhas, em fase
de crescimento, quando expostas a maiores níveis de irradiância, tornaram-se cloróticas
e, em alguns casos, com alos translúcidos, comprometendo, o crescimento do ápice
caulinar, por influenciar inúmeros processos fisiológicos dentre eles, a fotossíntese.
Observa-se pela Figura 3A que os ápices caulinares do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa apresentaram maior crescimento quando cultivados nas duas menores
irradiâncias (12 e 25 μmol m
-2
s
-1
), com valores médios de 4,5 e 4,0 cm,
respectivamente, para comprimento de parte aérea. Na irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
, os
ápices caulinares alcançaram, em média, 3,8 cm de comprimento. Nos ambientes de 100
e 150 μmol m
-2
s
-1
, houve limitação no crescimento dos ápices caulinares. Estes
alcançaram valores abaixo de 3 cm de comprimento.
O maior número de folhas formadas foi observado nas plântulas cultivadas sob
12, 25 e 50 μmol m
-2
s
-1
. Nestes níveis de irradiância, verificou-se, em média, 4 folhas
por plântula. Entretanto, nos ambientes de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, esse número reduziu-
se para aproximadamente 3 e 2 folhas por plântula, respectivamente (Figura 3B). A
maior área foliar foi encontrada em folhas de plântulas cultivadas nas irradiâncias de 25
e 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3C).
Nas Figuras 3D e E, pode-se observar que tanto a massa da matéria fresca
(MMFPA), quanto seca da parte aérea (MMSPA), diminuiu com o aumento dos níveis
de irradiância. Esse comportamento da MMFPA e da MMSPA acompanhou o
crescimento das plântulas, portanto, o maior crescimento da parte aérea implicou maior
biomassa da mesma.
112
Figura 3. Comprimento da parte aérea (A), número de folhas (B), área foliar (C) massa
da matéria fresca (MMFPA, D) e seca (MMSPA, E) da parte aérea de
plântulas de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob
diferentes níveis de irradiância. As barras correspondem ao desvio-padrão da
média.
A porcentagem de ápices caulinares de maracujazeiro que formaram raízes foi de
90,0% nas irradiâncias de 12 e 100 μmol m
-2
s
-1
e de 94,6% e 92,18% nas irradiâncias de
25 e 50 μmol m
-2
s
-1
, respectivamente (Figura 4A). Embora para esta variável, a
irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
tenha apresentado menor resposta (75,0% de ápices
enraizados), foi nesse ambiente espectral que os ápices caulinares formaram, em média,
maior número de raízes por explante, apesar da elevada variação do número de raízes
formadas, observado no desvio-padrão da média desse tratamento (Figura 4B). Esta
0
100
200
300
400
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
MMFPA (mg)
0
1
2
3
4
5
6
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Número de folhas
0
1
2
3
4
5
6
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Parte aérea (cm)
0
1
2
3
4
5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Área foliar (cm
2
)
0
10
20
30
40
50
60
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
MMSPA (mg)
A
B
D
E
C
113
resposta se correlaciona com a menor porcentagem (75,0%) de ápices enraizados (Figura
4A). A diferença, quanto a porcentagem de ápices enraizados entre o maior (150 μmol
m
-2
s
-1
) e o menor (12 μmol m
-2
s
-1
) nível de irradiância foi de, aproximadamente,
20,0%.
Figura 4. Porcentagem de ápices enraizados (A), número (B) e comprimento de raiz (C)
de plântulas de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob
diferentes níveis de irradiância. As barras correspondem ao desvio-padrão da
média.
Em relação à formação e crescimento das raízes (Figuras 4B e C,
respectivamente), verificou-se que o nível de irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
possibilitou
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Ápices enraizados (%)
0
1
2
3
4
5
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Número de raiz
A
B
0
2
4
6
8
10
12
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
Raiz (cm)
C
114
a emissão, mas não o alongamento das raízes, ou seja, neste ambiente as raízes formadas
se quer atingiram 0,5 cm de comprimento. Apesar de nesse ambiente espectral o número
de raízes, por ápice caulinar, em média, ter sido maior, em todos os outros níveis de
irradiância estudados, esse número foi em torno de duas (Figura 4B). Tanto a menor (12
μmol m
-2
s
-1
), quanto a maior (150 μmol m
-2
s
-1
) irradiância, tiveram baixa eficiência
quanto a capacidade de estimular o alongamento radicular, principalmente a maior
irradiância (Figura 4C).
A atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD) e peroxidase (POD)
aumentou nos tecidos das plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, após 42
dias de cultivo dos ápices caulinares, com a elevação dos níveis de irradiância até 50
μmol m
-2
s
-1
. Entretanto, nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, a atividade dessas
enzimas foi menor (Figura 5).
Comportamento contrário foi observado para com a enzima catalase (CAT). A
atividade dessa aumentou com a elevação dos níveis de irradiância (Figura 5). Isto
demonstrou haver requerimento desta enzima em tecidos dessa espécie, quando os
ápices caulinares foram expostos à irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
. A atividade da CAT
em plântulas cultivadas neste ambiente foi 44,0% superior à sua atividade, quando estas
plântulas foram expostas a 12 μmol m
-2
s
-1
de irradiância. Nos demais ambientes
espectrais, a atividade da CAT foi 36,0% (100 μmol m
-2
s
-1
), 29,23% (50 μmol m
-2
s
-1
) e
16,53% (25 μmol m
-2
s
-1
) superior, se comparado à menor irradiância (12 μmol m
-2
s
-1
).
Nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, as plântulas cultivadas apresentaram
atividade da SOD e POD abaixo do observado nas demais irradiâncias. A queda na
atividade da enzima SOD foi da ordem de 12,5 e 34,7% e da enzima POD, da ordem de
12,8 e 25,6%, ambas respectivamente nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, quando
comparado aos ápices caulinares cultivados sob 12 μmol m
-2
s
-1
(Figura 5).
115
Figura 5. Atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e
peroxidase (POD) em plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa
cultivadas in vitro, sob diferentes níveis de irradiância. As barras
correspondem ao desvio-padrão da média.
Na Figura 6, verifica-se com a elevação dos níveis de irradiância, aumento do
conteúdo de malondialdeído (MDA) nos tecidos das plântulas do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro. A nível celular, a formação de maiores
0
200
400
600
800
1000
1200
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
UNID SOD mg
-1
de proteína
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μmol H
2
O
2
min
-1
mg
-1
de proteína
0
5
10
15
20
25
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
ΔA
470
min
-1
mg
-1
de proteína
SOD
CAT
POD
116
quantidades dessa substância é decorrência da peroxidação de lipídios (lipoperoxidação),
reação esta em cadeia e que inicia-se com o seqüestro do hidrogênio do ácido graxo
polinsaturado da membrana celular, culminando com a formação de radicais altamente
reativos, dentre eles o radical hidroxila (OH˙), considerado o principal agente causador
da lipoperoxidação.
Ápices caulinares cultivados sob a irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
sintetizaram os
maiores teores de MDA (78,3 nmoles gMF
-1
), que àqueles produzidos nos ápices
caulinares cultivados sob 12 μmol m
-2
s
-1
(38,52 nmol gMF
-1
) (Figura 6). Nas
irradiâncias de 50 e de 100 μmol m
-2
s
-1
, os teores de MDA produzidos pelos ápices
caulinares foram, respectivamente, de 44,22% e 68,0 nmol gMF
-1
(Figura 6). Por outro
lado, a diferença do conteúdo de MDA produzido na irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
para
a de 12 μmol m
-2
s
-1
foi de apenas 0,98 nmol gMF
-1
para mais (Figura 6).
Figura 6. Peroxidação de lipídios (teor de MDA) em plântulas do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob diferentes níveis de irradiância. As
barras correspondem ao desvio-padrão da média.
A maior produção de etileno foi verificada aos 7 dias de cultivo independente do
ambiente lumínico em que os explantes foram expostos. A produção desse gás foi
aumentada, à medida que elevou-se os níveis de irradiância. As taxas de emissão do
etileno foram de 83,96; 94,85; 148,13; 228,20 e 235,27 nL C
2
H
4
gMF
-1
h
-1
nas
0
20
40
60
80
100
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
MDA (nmol gMF
-1
)
117
irradiâncias de 12, 25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, respectivamente (Figura 7). O
acréscimo na produção de etileno foi de 27,7% (50), 61,73% (100) e 64,74% (150 μmol
m
-2
s
-1
) em relação à irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
.
Aos 14 dias, o comportamento dos explantes com relação à produção de etileno
foi o contrário do observado aos 7 dias de cultivo. A menor produção de etileno pelos
explantes foi verificada no ambiente de 150 μmol m
-2
s
-1
. Por exemplo, os explantes
cultivados por 14 dias nessa irradiância, apresentaram taxa de produção desse gás um
sexto menor, quando comparado a produção aos 7 dias. A partir do 21º dia não houve
praticamente produção considerável desse gás (Figura 7).
Figura 7. Produção de etileno pelas plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa
aos 7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias do cultivo nas irradiâncias de 12, 25, 50, 100 e
150 μmol m
-2
s
-1
. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
A produção de CO
2
também foi influenciada pelos diferentes níveis de
irradiância estudados. As irradiâncias mais elevadas como a de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
estimularam a maior produção de CO
2
, aos 7 e 14 dias de cultivo desses explantes. Aos
21 dias de cultivo dos segmentos hipocotiledonares, houve queda substancial na
Irradiância
(
μ
mol
m
-2
s
-1
)
0
50
100
150
200
250
300
7 1421283542
Tempo (dias)
Etileno produzido
(nL C
2
H
4
gMF
-1
h
-1
)
12 25 50 100 150
118
produção desse gás em todos os níveis de irradiância, de forma que aos 28, 35 e 42 dias
a produção decresceu a níveis baixos (Figura 8).
Figura 8. Produção de CO
2
pelas plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa aos
7, 14, 21, 28, 35 e 42 dias do cultivo nas irradiâncias de 12, 25, 50, 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
. As barras correspondem ao desvio-padrão da média.
Na Figura 9, observa-se comportamento decrescente dos pigmentos de clorofila
a, b, total e carotenóides com a elevação dos níveis de irradiância. O maior teor de
clorofila a, b, total e carotenóides foi encontrado na irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
(Figuras 9A, B, C e D, respectivamente). Na irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
, os valores
de clorofila a, b, total e carotenóides se aproximaram muito do valor zero, indicativo de
degradação desses pigmentos cloroplastídicos (Figuras 9A, B, C e D, respectivamente).
Irradiância
(
μ
mol
m
-2
s
-1
)
0
1
2
3
4
5
7 1421283542
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
CO
2
produzido
(mmol CO
2
gMF
-1
h
-1
)
12 25 50 100 150
119
Figura 9. Teores de clorofilas a (A), b (B), total (C) e carotenóides (D) e as relações
clorofila a/b (E) e carotenóides/clorofilas (F), em estruturas organogênicas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, obtidas nas irradiâncias de 12, 25, 50,
100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, aos 42 dias de cultivo dos segmentos de hipocótilo.
***
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
Na Figura 10A, B e C, respectivamente, tem-se a estimativa do comportamento
das coordenadas “L”, “a” e “b” nas folhas das plântulas de P. edulis f. flavicarpa
cultivadas in vitro nas irradiâncias de 12, 25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
.
Os valores da coordenada “L” aumentaram proporcionalmente com a elevação
dos níveis de irradiância. Com isso, observou-se maior brillho, ou maior, reflexão da luz,
em folhas de plântulas cultivadas sob as maiores irradiâncias (Figura 10A).
Menores valores da coordenada “a” indicam folhas mais verdes. Neste caso, as
folhas das plântulas cultivadas nas irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
apresentaram
folhas mais verdes que aquelas cultivadas nas demais irradiâncias (Figura 10B).
O maior valor encontrado para a coordenada “b” foi na irradiância de 12 μmol m
-
2
s
-1
e o menor na irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
(Figura 10C).
0
20
40
60
80
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCLt gMF
-1
0
5
10
15
20
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCar gMF
-1
0
10
20
30
40
50
60
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCLa gMF
-1
0
5
10
15
20
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
μgCLb gMF
-1
99,0
296322,02343,47
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
97,0
0965073,03279,15
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
99,0
398789,03335,63
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
95,0
112762,04843,18
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
A
C
B
D
120
O menor valor de tonalidade encontrado foi na irradiância de 25 μmol m
-2
s
-1
e o
maior valor de saturação na irradiância de 19,97 μmol m
-2
s
-1
(Figura 10 D e E,
respectivamente.
Figura 10. Medidas das coordenadas L (A), a (B), b (C), tonalidade (h, D) e saturação da
cor (C, E) pelo sistema de cor de Hunter em extratos de tecidos da parte
aérea de plântulas de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, após 42 dias de
cultivo.
ns, **
e
***
Não significativo e significativo a 1% e 0,1% de probabilidade pelo
teste de F.
0
10
20
30
40
50
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
C
-1,20
-1,15
-1,10
-1,05
-1,00
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
h
0
10
20
30
40
50
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
b
52
54
56
58
60
62
64
66
12 25 50 100 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
L
-25
-20
-15
-10
-5
0
12 25 50 100 150
Irradiância (μmo l m
-2
s
-1
)
a
99,0
0505983,09842,55
ˆ
2
***
=
+=
R
IY
93,0
0931852,04767,20
ˆ
2
***
=
+−=
R
IY
91,0
209713,02052,44
ˆ
2
***
=
−=
R
IY
A
B
C
99,0
00188841,00754292,06798,41
ˆ
2
**
2
=
−+=
R
IIY
ns
98,0
0000928215,000103278,011539,1
ˆ
2
****
2**
=
+−−=
R
IIY
E
D
121
4. DISCUSSÃO
O limiar do desenvolvimento dos ápices caulinares se daria pela emergência das
folhas cotiledonares (Figuras 1Ba e 1Bb). Diante dessa hipótese, o nível de irradiância
que, por exemplo, aumentasse a velocidade de emergência das folhas cotiledonares,
anteciparia o desenvolvimento dos ápices caulinares, encurtando, o tempo para a
obtenção das plântulas. Não foi isso que ocorreu, muito embora as maiores irradiâncias
tenham proporcionado as maiores velocidades (Figura 1A) e porcentagens de
emergência (Figura 1B), aos 42 dias da exposição das folhas a essas irradiâncias. Essas
maiores irradiâncias acabaram por induzir a clorose do limbo foliar, seguido da abscisão
das folhas (Figura 2B). O menor crescimento dos ápices nos dois maiores níveis de
irradiância (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
) pode estar relacionado a dois fatores ligados ao
estresse fotooxidativo: primeiro, com a abscisão do nó e das folhas cotiledonares, e
segundo, que as novas folhas, ao se desenvolverem sob essas maiores irradiâncias,
proporcionam a emergência de folhas cloróticas, culminando com o desprendimento
fácil do eixo caulinar, característica esta própria de senescência foliar precoce. Não
foram identificados, na literatura revisada, trabalhos nesta linha, para confrontar com os
dados aqui obtidos.
Nos ambientes espectrais de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
, verificou-se que, em grande
número de ápices caulinares, o nó cotiledonar, ao invés de promover a abertura ou
desprender-se com a abscisão, ele simplesmente fissurou-se lateralmente e permitiu a
emergência de outras novas folhas, contidas no ápice meristemático.
Ápices caulinares cultivados nos menores níveis de irradiância, como 12 e 25
μmol m
-2
s
-1
, deram origem a plântulas mais alongadas, atingindo 4,0 e 4,5 cm de
comprimento (Figura 3A). Além disso, nesses dois ambientes, as plântulas produziram
mais folhas (Figura 3B) e estas apresentaram maior massa da matéria fresca e seca da
parte aérea (Figuras 3D e E, respectivamente). Alexandre (2002) também verificou que
os maiores valores de comprimento da parte aérea em ápices caulinares cultivados sob
25 μmol m
-2
s
-1
. Entretanto, esse autor obteve menor número de folhas formadas (6) e
maior área foliar nessa irradiância, enquanto o maior número de folhas formadas (29) e
122
menor área foliar foi observado naquelas plantas cultivadas no ambiente de 150 μmol m
-
2
s
-1
.
Neste trabalho, ficou evidente que a quantidade de luz incidida sobre os
explantes influenciou a porcentagem de ápices caulinares que enraizaram. Isto foi
identificado, ao se comparar o comportamento dos explantes cultivados sob 150 μmol m
-
2
s
-1
com os demais níveis de irradiância estudados (Figura 4A). Moran Robles (1978),
cultivando brotos axilares de P. edulis f. flavicarpa no escuro, observou maior
porcentagem de enraizamento (11,0%) do que sob luz (7,8%).
O aumento da atividade da SOD até o nível espectral de 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura
5), é indicativo de que a exposição dos ápices caulinares do maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa ao excesso de energia de excitação pode ser prejudicial ao FSII (Fotossistema
II). Isto devido à redução do centro de reação e à produção aumentada das espécies
reativas do oxigênio (ROS) nos cloroplastos, dentre elas a geração de radicais
superóxidos (O
2
˙¯). Por exemplo, del Río et al. (2002) relatam que a produção do radical
superóxido nos peroxissomos ocorre na matrix, mediada pela enzima xantina oxidase
(XOD) ou na membrana dos peroxissomos pela ação da enzima monodehidroascorbato
redutase (MDHAR), sendo neste caso, dependente de NADPH.
Se as reações não específicas de agentes óxido-redutores (como as ROS) não
forem controladas por meio de sistemas protetores, como as enzimas que atuam como
desintoxicadoras, poderão danificar as biomoléculas, como aquelas produto da
peroxidação de lipídios, bem como inativar enzimas e outras proteínas funcionais, além
de modificações no DNA da planta (Bartosz, 1997). A atividade das enzimas SOD e
POD nas duas maiores irradiâncias (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, Figura 5) pode ser a
explicação do exposto acima, relacionando a queda na atividade das enzimas, ao
processo de fotoinativação ou degradação das mesmas pelo período prolongado (42 dias)
de exposição dos ápices caulinares do maracujazeiro a esses níveis de irradiância.
As SODs catalizam a dismutação do radical superóxido (O
2
˙¯) a peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) (Scandalios, 2005). O H
2
O
2
é um metabólito do oxigênio tido como
altamente deletério, por participar da reação que produz o radical hidroxila (OH˙), o qual
é considerado mais reativo em sistemas biológicos. A combinação extremamente rápida
do OH˙com metais ou outros radicais no próprio sítio onde foi produzido confirma sua
123
alta reatividade. Assim, se o hidroxila for produzido próximo ao DNA e a este DNA
estiver fixado um metal, poderão ocorrer modificações de bases purínicas e
pirimidínicas, levando à inativação ou mutação do DNA. Além disso, a hidroxila pode
inativar várias proteínas, ao oxidar seus grupos sulfidrilas (-SH) a pontes de dissulfetos
(-SS). Também pode iniciar a oxidação dos ácidos graxos polinsaturados das membranas
celulares (lipoperoxidação) (Ferreira & Matsubara, 1997).
Altas irradiâncias poderiam estar envolvidas com a indução da transcrição, que
codifica enzimas antioxidantes, H
2
O
2
e o estado redox da ascorbato peroxidase
(Hernández et al., 2004). Parece que sob altas irradiâncias a produção de ROS é elevada,
e assim regula o acúmulo de mRNAs que codificam enzimas antioxidantes (Hernández
et al., 2006).
É necessário que ocorra aumento da atividade da CAT, como o observado na
Figura 5, com a elevação dos níveis de irradiância, para que a mesma promova a redução
do H
2
O
2
à H
2
O e O
2
, impedindo, dessa forma, sua ação tóxica à bicamada lipídica das
membranas celulares (Scandalios, 2005).
Como verificado na Figura 6, o aumento dos níveis de irradiância fez elevar o
conteúdo citosólico de MDA, produto este proveniente da peroxidação de lipídios. Cao
et al. (2006) verificaram sob elevadas irradiâncias, altas produções de MDA, indicativo
de estresse oxidativo. Segundo os autores, plantas que não se mostraram fotoinibidas de
forma crônica, apresentaram baixa concentração de MDA e atividades mais altas de
enzimas antioxidantes (SOD, CAT e POD). Talvez essa seria a explicação para os
menores valores de MDA, sugestionando a habilidade dessas enzimas em metabolizar as
espécies reativas de oxigênio. A peroxidação de lipídios e ruptura da membrana
plasmática acontece quando a taxa de produção das ROS exceder a capacidade da célula
de mebabolizar as ROS (Beligni et al., 2002). Segundo Behera & Choudhury (2002), a
tranferência de plantas para condições de alta irradiância fez elevar o grau de
peroxidação de lipídios, principalmente de plantas inicialmente cultivadas sob baixa
irradiância. Segundo Mello Filho et al. (1983), os componentes celulares são
susceptíveis à ação das ROS, porém a membrana é um dos mais atingidos, em
decorrência da peroxidação lipídica, que acarreta alterações na estrutura e na
permeabilidade das membranas celulares. Conseqüentemente, há perda da seletividade
124
na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas hidrolíticas e
formação de produtos citotóxicos (como o malondialdeído), conduzindo a morte celular
(Ferreira & Matsubara, 1997).
Sintomas como clorose, abscisão foliar, epinastia e hiperhidricidade já haviam
sido atribuidos ao acúmulo excessivo de etileno in vitro pela espécie P. mollissima,
sintomas esses que conduziram a necrose e morte do tecido (Bartolo & Macey, 1989).
Jona et al. (2002), ao estudarem o comportamento in vitro de algumas espécies
quanto ao etileno e sua relação com o padrão climatérico de seus frutos, verificaram que
plantas de macieira e pessegueiro são muito sensíveis ao etileno. Isto significa que
ambas apresentam comportamento semelhante a de seus frutos. As plantas de videira
apresentam comportamento semelhante ao de seus frutos, os quais apresentam padrão
não climatérico e, portanto não sensíveis ao etileno. O mesmo foi observado em
cerejeira. Entretanto, plantas de morangueiro cultivadas in vitro aumentam a biossíntese
de clorofilas com o auemento da síntese de etileno. Segundo os autores, isto significa
que em determinadas espécies a sensibilidade ao etileno é maior que em outras.
Reis et al. (2003) verificaram maior taxa de produção de etileno (0,049 nmol mL
-
1
C
2
H
4
gMF
-1
h
-1
) aos 7 dias do cultivo de explantes nodais do maracujazeiro P. edulis f.
flavicapa sob 36 μmol m
-2
s
-1
de irradiância. Em relação ao controle (0 dias), a produção
de etileno, aos 7 dias, foi 51,0% superior. Aos 14 dias, não verificaram emissão de
etileno pelos segmentos nodais. Entretanto, aos 21 dias, houve retomada na produção de
etileno (0,011 nmol). Barbosa et al. (2001) verificaram maior produção de etileno
(aproximadamente de 80 nL), aos 6 dias de cultivo de ápices caulinares de P. edulis f.
flavicarpa, sob irradiância de 24 μmol m
-2
s
-1
. Aos 12, 24 e 30 dias, a produção foi
abaixo de 50 nL, e aos 18 dias, foi aproximadamente de 50 nL. Entretanto, Crespo et al.
(2003) verificaram aos 3 dias de cultivo de ápices caulinares de P. edulis f. flavicarpa,
maior taxa de emissão de etileno, 2,343 ppm, apresentando nas outras leituras tendência
de queda.
No presente trabalho, observou-se também maior produção de etileno aos 7 dias
de cultivo dos ápices caulinares do maracujazeiro, independentemente do nível de
irradiância empregado. Nas irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
, a produção foi de 82,96
e 94,85 nL, respectivamente. Todavia, nas irradiâncias de 50 (148,13 nL), 100 (228,20
125
nL) e 150 μmol m
-2
s
-1
(235,27 nL), verificou-se maiores taxas de emissão do gás. Foram
verificadas ainda, aos 14 dias de cultivo, menores taxas de produção de etileno e essa
redução acompanhou a elevação dos níveis de irradiância. Os valores obtidos foram de
74,20 nL (12); 74,02 (25); 64,34 nL (50); 64,96 nL (100) e 32,04 nL (150 μmol m
-2
s
-1
)
(Figura 7). Esses resultados indicam que a luz influencia a taxa de emissão de etileno
pelos tecidos das plântulas dessa espécie, e que os ápices caulinares, nos primeiros 7
dias de cultivo (Figura 7), produzem mais etileno quando cultivados sob irradiâncias
mais elevadas. Por outro lado, essa maior produção de etileno, inicialmente nas maiores
irradiâncias, comprometeu subseqüentemente a emissão do próprio gás, possivelmente
pelo seu acúmulo, que influencia negativamente a sua produção. Kurepin et al. (2006)
verificaram que a redução no crescimento de brotos do genótipo 1D da espécie Stellaria
longipes (L.), cultivada sob irradiância de 611 μmol m
-2
s
-1
, acompanhou a evolução no
aumento da produção de etileno, de 34,0% em 7 dias e 41,0% em 21 dias. Em contraste,
sob irradiância de 115 μmol m
-2
s
-1
, correlacionaram o aumento no crescimento de
brotos com as reduções na evolução do etileno. Emery et al. (1994) concluíram que
fenótipos de baixa estatura em uma população de plantas desta espécie é produto de
seleção, pelo aumento na produção de etileno, em ambientes com níveis altos de
irradiância. Kurepin et al. (2006) perceberam em genótipos 7B, certa tendência em
aumentar a produção de etileno (embora não-significativa) em ambientes enriquecidos
por luz vermelho-distante, enquanto no genótipo 1D o aumento na produção de etileno
ocorreu em ambientes enriquecidos com luz vermelha. Pierik et al. (2004) também
verificaram aumento na evolução do etileno em ambientes enriquecidos por luz
vermelho-distante, em plantas de tabaco.
Os ambientes de maior irradiância (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
) também estimularam
os segmentos hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa a produzirem mais CO
2
.
Crespo et al. (2003) verificaram altas concentrações de CO
2
produzidas por plântulas de
P. edulis f. flavicarpa in vitro. Segundo esses autores, a produção elevada desse gás
prejudicou as leituras de etileno.
Ambientes enriquecidos com CO
2
, por longos períodos, podem regular
negativamente a fotossíntese de plantas e esta característica pode ser uma conseqüência
da diminuição da densidade estomatal e fechamento parcial de estômatos que reduzem o
126
transporte de CO
2
para os locais de carboxilação; produção rápida de fotossintetatos que
conduz a uma quantidade em excesso de amido nos cloroplastos e inibição da
regeneração da fotossíntese; redução na quantidade ou atividade da ribulose 1,5-
bisfosfato carboxilase/oxigenase (Pospíšilová et al., 1999). Kwa et al. (1997) verificaram
também que a atividade da Rubisco decresce em calos de samambaia (Platycerium
coronarium) até 42 dias de cultivo in vitro, em ambientes ricos em CO
2
.
Morini & Melai (2005) verificaram em irradiâncias de 210 μmol m
-2
s
-1
que a
taxa de emissão de CO
2
por explantes de Prunus cerasifera foi maior, se comparado a
irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
. E que nessa maior irradiância (210 μmol m
-2
s
-1
), a taxa
de CO
2
assimilado pelos explantes foi menor que a produzida pela respiração. Neste
caso, o CO
2
alcançou o ponto de compensação aproximadamente 305 horas na maior
irradiância e 55 horas na menor irradiância. O exposto acima pelos autores pode ajudar
na compreensão do presente trabalho, já que nas maiores irradiâncias (100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
) verificou-se os maiores níveis de estresse fotooxidativo.
Como relatado pelos autores acima mencionados, apesar de na irradiância de 210
μmol m
-2
s
-1
demorar um pouco mais para que seja atingido o ponto de compensação de
CO
2
, o problema seria após o equilíbrio entre o CO
2
fixado pela fotossíntese e o
produzido pela respiração, com o excesso de irradiância. Segundo Taiz & Zeiger (2004),
em fluxos fotônicos mais altos, a resposta fotossintética começa a estabilizar-se e
alcançar a saturação. Aumentos posteriores no fluxo fotônico não afetam mais as taxas
fotossintéticas, indicando que outros fatores que não a luz incidente, tais como a taxa de
transporte de elétrons; atividade da rubisco ou o metabolismo de trioses fosfato tornam-
se limitantes à fotossíntese.
A senescência é um evento programado geneticamente, que afeta todos os
tecidos vegetais. Várias evidências fisiológicas suportam o papel da ação do etileno e
das citocininas no controle da senescência das folhas. O aumento na produção de etileno
está associado à perda de clorofila e à descoloração, que são características de
senescência foliar (Taiz & Zeiger, 2004). Isso pode ser a explicação da redução dos
teores de clorofila a, b, total e carotenóides à medida que elevou-se os níveis de
irradiância (Figura 3). Behera & Choudhury (2003) observaram que plantas de trigo
apresentaram maior conteúdo de clorofila a e b na irradiância de 15 W m
-2
, se
127
comparado as irradiâncias de 30 e 45 W m
-2
. Plantas cultivadas inicialmente sob
irradiância de 15 W m
-2
apresentaram maior perda de pigmentos do ciclo das xantofilas
(16,4%) se comparado àquelas expostas às irradiâncias de 30 W m
-2
(8,4%) e 45 W m
-2
(6,7%) e, posteriormente, transferidas para irradiâncias de 250 W m
-2
. Isto indica que as
plantas crescidas sob irradiâncias mais altas, quando submetidas a estresse luminoso
sofrem menos com a degradação de pigmentos, quando comparadas com aquelas
crescidas em ambientes com baixas irradiâncias. Kadleček et al. (2001) observaram em
plantas de tabaco (Nicotiana tabacum L.) cultivadas in vitro, sob irradiância de 200
μmol m
-2
s
-1
, que os conteúdos de clorofila e a relação clorofila a/b foram reduzidos.
Kadleček et al. (2003), cultivando essa mesma espécie in vitro, porém sob 380 μmol m
-2
s
-1
, verificaram também redução no conteúdo de clorofila a+b, relação clorofila a/b e
aumento no conteúdo dos pigmentos do ciclo das xantofilas.
A perda de clorofila de 60,0 e 94,0% em folhas de plântulas do maracujazeiro
cultivadas sob irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, em comparação à irradiância de 12
μmol m
-2
s
-1
(Figura 3C), pode definir o estádio de desenvolvimento das folhas como
moderadamente e severamente senescentes, respectivamente, conforme a relação
designada por Lu et al. (2003). Segundo esses autores, folhas senescentes apresentaram
consistentemente baixa capacidade fotossintética, se comparado às folhas normais, não
senescentes. Outro aspecto importante verificado pelos autores, foi que nas folhas
moderada e severamente senescentes, os níveis de irradiância nos quais houve saturação
da fotossíntese, a perda de clorofila foi, 50,0 e 75,0% inferior, respectivamente, em
relação aquelas ocorrida em folhas normais. O estádio de desenvolvimento de um órgão
como a folha, é determinado por seu conteúdo de pigmento. O aumento da idade da
folha promove declínio no conteúdo de clorofilas (Behera & Choudhury, 2001). Nina
Junior et al. (2005) verificaram em altas irradiâncias, que a degradação de clorofilas
tende a ser mais intensa, resultando em menores concentrações de clorofila total. E que,
o conteúdo de clorofila em ambiente sombreado foi cerca de seis vezes maior, quando
comparado à pleno sol.
128
5. CONCLUSÕES
٠ Há uma relação entre o comportamento do crescimento dos ápices caulinares do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa com a inativação das enzimas SOD e POD nas
maiores irradiâncias (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
);
٠ A capacidade rizogênica dos ápices caulinares é influenciada pelo nível de estresse
foto-oxidativo;
٠ Os níveis crescentes de MDA indicam que apenas o aumento na atividade da catalase
não é suficiente para remover as espécies reativas do metabolismo do oxigênio,
principalmente nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
e que a atividade da
superóxido dismutase e peroxidase foi diminuída;
٠ As maiores irradiâncias contribuem para elevar as taxas de etileno e CO
2
. E o aumento
nos teores de etileno reduzem os teores dos pigmentos cloroplastídicos.
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135
Capítulo V
Atividade fotossintética e fluorescência da
clorofila em plântulas de Passiflora edulis Sims f.
flavicarpa Degener cultivadas in vitro, sob
diferentes irradiâncias
RESUMO
Ápices caulinares do maracujazeiro Passiflora edulis Sims f. flavicarpa Degener
foram cultivados in vitro em diferentes níveis de irradiância, com o objetivo de avaliar
as trocas gasosas e identificar o dano fotoinibitório nas plântulas dessa espécie. O
experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado, totalizando cinco
tratamentos, com dez repetições. Os tratamentos foram os cinco níveis de irradiância
(12, 25, 50, 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
). Por meio de um analisador de gás no infravermelho
modelo Qubt System avaliou-se a taxa fotossintética (A), a condutância estomática (g
S
)
e a taxa transpiratória (E). E através do fluorômetro modulado, modelo MINI-PAM,
avaliou-se a fluorescência inicial (F
o
), a fluorescência máxima (F
m
), o rendimento
quântico potencial (F
v
/F
m
) e efetivo (ΔF/F
m
’), a dissipação fotoquímica (q
P
) e não-
fotoquímica (q
N
e NPQ) e a taxa de transporte de elétrons (ETR). O aumento dos níveis
de irradiância promoveu elevação da Fo, redução da relação F
v
/F
m
, ΔF/F
m
’, q
P
e ETR,
indicando a ocorrência do dano fotoinibitório. Entretanto, com a elevação dos níveis de
irradiância, principalmente sob 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, observou-se uma crescente
dissipação não-fotoquímica (NPQ), que representa a dissipação térmica do excesso de
energia que é prejudicial ao processo fotossintético. As plântulas de maracujazeiro-
amarelo adaptaram-se melhor às menores irradiâncias (12 e 25 μmol m
-2
s
-1
), sendo
assim indicadas no cultivo in vitro desta espécie.
136
1. INTRODUÇÃO
O aspecto clorótico nas estruturas organogênicas (gemas e brotos) formadas em
segmentos hipocotiledonares e em tecidos foliares de plântulas que evoluíram de ápices
caulinares do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro (Alexandre, 2002;
Couceiro, 2002; Felismino, 2005) é, definitivamente o motivo pelo qual pensou-se em
investigar a causa de tal anomalia.
Essa característica na planta pode manifestar-se impulsionada por diversos
fatores bióticos e abióticos, conduzindo a inúmeros prejuízos aos explantes, dentre eles
até mesmo causar a morte. Alguns desses fatores constituem partes integrantes do
ambiente da sala de cultivo do laboratório, como luz, temperatura, umidade relativa do
ar e gases diversos; e outros fatores são mais específicos do ambiente interno dos frascos
de cultivo, tais como o meio de cultura e gases, como o etileno e o CO
2
. Os frascos de
cultivo por não permitirem trocas gasosas com o ambiente externo, acumulam no seu
imterior gases como o etileno e o CO
2
(Chen, 2003).
O cultivo de plantas sob irradiâncias altas pode conduzir a distúrbios fisiológicos
de natureza variada, como a senescência foliar e/ou de toda a planta, que nestes casos é
iniciada por influências ambientais e regulada por hormônios (Taiz & Zeiger, 2004).
A energia radiante é um fator ambiental que pode limitar o crescimento e a
reprodução das plantas. As propriedades fotossintéticas da folha fornecem valiosa
informação sobre as adaptações da planta ao seu ambiente luminoso. Quando as folhas
das plantas são expostas a irradiâncias maiores do que podem utilizar, o centro de reação
do fotossistema II (FS II) é danificado e inativado (Taiz & Zeiger, 2004).
Uma iluminação de alta intensidade sobre os tecidos fotossintetizantes resulta em
uma série de reações de estresse, conhecidas como fotoinibição. Segundo Baker et al.
(1994), Choudhury & Behera (2001) e Štroch et al. (2004), a fotoinibição é a
incapacidade dos tecidos fotossintetizantes em dissipar o excesso de energia radiante.
Nas plantas, o dano fotoinibitório pode ser verificado por meio da redução do
rendimento quântico, redução da capacidade de fixar CO
2
, alterações nas características
da fluorescência e do transporte de elétrons entre os fotossistemas.
137
Uma forma eficiente de monitorar danos fotooxidativos causados pelo estresse
tem sido o uso de medidas da fluorescência da clorofila associada ao fotossistema II (PS
II) (Baker, 1993; Bolhàr-Nordenkampf & Öquist, 1993; Newton & McBeath, 1996).
Dentre os parâmetros de fluorescência, a relação F
v
/F
m
que representa a eficiência
quântica potencial do fotossistema II (PS II), é um indicador sensível do desempenho
fotossintético de plantas (Björkman & Demmig, 1987; Johnson et al., 1993). Alguns
trabalhos relatam a utilização dessa relação (Kadleček et al., 2001; Alexandre, 2002;
Kadleček et al., 2003; Rodriguez Ortiz, 2004; Fuentes et al., 2005), bem como da
fotossíntese (Kadleček et al., 2001; Kadleček et al., 2003; Fuentes et al., 2005) como
forma de avaliar o dano fotooxidativo em explantes cultivados in vitro. Os dois
primeiros autores avaliaram a taxa fotossintética dos explantes utilizando Eletrodo de
Clark, que mede a evolução do teor de oxigênio, e os últimos autores o fazem
diretamente em folhas expandidas e crescidas in vitro.
Este trabalho teve como objetivo avaliar as trocas gasosas e identificar o dano
fotoinibitório em plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, cultivadas in vitro,
sob diferentes níveis de irradiância.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Fase de obtenção das plântulas axênicas
As sementes foram extraídas de frutos maduros e colhidos de uma única planta
de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, procedente do pomar do Setor de Fruticultura,
da Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa, Minas Gerais.
Em condições laboratoriais e mediante uso de uma peneira de malha fina, o arilo
das sementes foi removido, pressionando-as cuidadosamente, depois de envolvê-las em
cal extinta. Em seguida, as sementes foram lavadas em água de torneira até completa
remoção da cal e restos placentários. À continuação, foram submetidas a secagem à
sombra, sobre papel toalha, por três dias. Após o processo de secagem, procedeu-se o
138
preparo das sementes. O tegumento externo (episperma) foi completamente removido
com auxílio de uma mini-morsa.
As sementes, assim preparadas, foram desinfestadas, sob condições de câmara de
fluxo laminar. Inicialmente, foram submetidas por 1 minuto em solução de etanol a 70%
(v/v), seguido de três enxaguaduras; e logo após, imersas em solução de hipoclorito de
sódio com 2,4% de cloro ativo do produto comercial Candura
®
, durante 20 minutos e,
posteriormente, enxaguadas por três vezes em tempos de 1 minuto, sob agitação
constante em água desionizada e autoclavada.
O meio de cultivo das sementes foi constituído dos minerais nutrientes de MS
(Murashige & Skoog, 1962), vitaminas de White (1951), 100 mg L
-1
de mio-inositol, 30
g L
-1
de sacarose e 8,0 g L
-1
de ágar (Isofar
®
), como agente solidificante. O pH do meio
foi ajustado a 5,7 ± 0,1, antes da adição do ágar. Alíquotas de 10 mL deste meio foram
distribuídas por tubo de ensaio (25 x 150 mm). Os tubos, contendo o meio, foram
fechados com tampas de propileno transparentes e autoclavados a 121 ºC e pressão de
1,5 kgf cm
-2
, durante 20 minutos.
As sementes foram semeadas no meio de cultivo, uma por tubo de ensaio. Após o
semeio, os tubos foram fechados como já descrito anteriormente, acondicionados em
grades que foram envolvidas com papel alumínio e transferidos para a sala de cultivo
com temperatura de 27 ± 2 ºC e umidade relativa de aproximadamente 60%. O papel
alumínio foi utilizado para proteger as sementes contra luz, já que são classificadas,
como fotoblásticas negativas por Maciel & Bautista (1997).
O período de incubação foi de 12 dias, tempo suficiente para obter as plântulas
axênicas e com tamanho adequado para a obtenção dos ápices caulinares.
2.2. Fase de cultivo dos ápices caulinares
O meio de cultivo para ápices caulinares apresentou a mesma constituição química e
o mesmo modo de preparação daquele já descrito para a germinação de sementes.
Utilizou-se, inclusive, o mesmo tipo de frasco de cultivo que recebeu a mesma alíquota
de 10 mL de meio de cultura. A exceção foi o agente geleificante, que para o cultivo de
ápices caulinares foi o Gelrite (Merck
®
)
a 2,5 g L
-1
de meio.
139
Os ápices caulinares individualizados foram plantados em condições de câmara de
fluxo laminar, na orientação vertical em tubos de ensaio, que foram fechados com duas
camadas de filme transparente de PVC (Rolopac
®
).
Os tubos de ensaio, contendo um ápice caulinar cada, foram incubados em sala de
crescimento, distribuídos nas prateleiras das estantes, à distância de aproximadamente 5
cm entre si, de forma a não proporcionar sombra nos mesmos, com controle de
temperatura de 27 ± 2 ºC, fotoperíodo de 16/8 h (luz/escuro) e irradiâncias de 12; 25; 50;
100 e 150 µmol m
-2
s
-1
, fornecidas por tubos fluorescentes OSRAM
®
, com potência de
40 W, luz do dia. O modo pelo qual os ambientes espectrais foram conseguidos acha-se
descrito no Capítulo III.
O período de incubação foi de 42 dias.
2.3. Características avaliadas
2.3.1. Determinação das trocas gasosas
Para a avaliação das trocas gasosas nas plântulas in vitro, inicialmente o ar de
referência foi bombeado de uma sacola com concentração de CO
2
conhecida (300 mL m
-
3
) para a câmara úmida, confeccionada utilizando um tubo de ensaio, onde no seu
interior foi colocado um chumaço de algodão e papel Germiteste
®
, ambos umedecidos
de forma a promover a elevação da umidade do ar circulante. Após o ar ter circulado por
toda a câmara úmida, este foi succionado e injetado no tubo de ensaio onde a plântula de
maracujazeiro foi cultivada (Figura 1). Desta forma, o ar que sai apresenta as suas
características originais modificadas. A plântula, no momento das análises, é submetida
a um feixe de luz infravermelho (150 μmol m
-2
s
-1
). O ar de saída ou ar de análise segue
dois caminhos: no primeiro, o ar passa pelo sensor de temperatura e umidade, resultando
em leituras que são armazenadas no computador; e, no segundo, por outro lado, o ar de
referência segue por um tubo contendo dryrite, onde é retirado toda sua umidade para
então passar para o IRGA, onde é medida a concentração de CO
2
. A diferença entre a
concentração de CO
2
do ar de entrada e do ar de saída do tubo de ensaio contendo a
140
plântula é utilizada para o cálculo da taxa fotossintética, ou da taxa respiratória se a
concentração de CO
2
do ar de saída for maior.
Dessa forma, por meio de um analisador de gás no infravermelho, modelo Qubt
System, adaptado à medição das trocas gasosa, avaliou-se a taxa fotossintética (A),
condutância estomática (g
s
) e transpiração (E), feitas no próprio tubo de cultivo que
continha a plântula.
2.3.2. Determinação da fluorescência da clorofila
Através do fluorômetro modulado, modelo MINI-PAM, avaliou-se a
fluorescência inicial (F
o
), a fluorescência máxima (F
m
), rendimento quântico potencial
(F
v
/F
m
= Fluorescência variável/Fluorescência máxima), rendimento quântico efetivo
(ΔF/F
m
’), a dissipação fotoquímica (q
P
), a dissipação não-fotoquímica (q
N
e NPQ) e a
taxa de transporte de elétrons (ETR).
2.4. Delineamento experimental
O experimento foi montado em delineamento inteiramente casualizado, com 8
repetições (8 tubos de ensaio), onde os tratamentos foram os 5 níveis de irradiância,
sendo a parcela experimental constituída de um ápice caulinar cultivado na orientação
vertical.
141
c
1
c
2
CO
2
D
Figura 1. A. Fotografia mostrando
os instrumentos utilizados na
avaliação das trocas gasosas: sacola
de ar; bomba de fluxo; câmara
úmida; tubo de análise que contém a
plântula de maracujazeiro-amarelo;
sensor de temperatura e umidade;
drierite; sensor de luz e IRGA. B.
Aumento do conjunto composto
pelo sensor de tempertura e
umidade; câmara úmida; tubo de
análise e dryrite. C. Fotografia
mostrando o interface e o
computador. D. Desenho
esquemático: a. sacola com ar de
concentração de CO
2
conhecida
(300 ml min
-1
); b. bomba de fluxo;
c
1
. câmara úmida; c
2
. tubo de
análise; d. sensor de temperatura e
umidade; e. tubo com dryrite; f.
sensor de luz; g. IRGA; h.
computador; i. interface. (*) papel
alumínio para aumentar a reflexão
da luz.
A
B
*
C
a
d
b
i
h
g
e
f
142
3. RESULTADOS
Nas Figuras 2 e 3, tem-se o desempenho fotossintético das plântulas de
maracujazeiro (P. edulis f. flavicarpa), avaliado em folhas completamente expandidas,
que não as cotiledonares, cultivadas in vitro por 35 e 42 dias, respectivamente, sob
diferentes níveis de irradiância.
A elevação dos níveis de irradiância reduziu a capacidade fotossintética das
plântulas de maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro no período de 35
dias de incubação (Figura 2). As irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
permitiram que as
plântulas desta espécie utilizassem a energia proveniente dos tubos fluorescentes, de
forma a beneficiar o processo fotossintético. Entretanto, irradiâncias superiores a 25
μmol m
-2
s
-1
resultaram em menor taxa fotossintética, com quedas mais drásticas quando
as plântulas foram cultivadas nos ambientes com 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
de irradiância.
A taxa fotossintética de plântulas cultivadas sob 12 μmol m
-2
s
-1
foi ligeiramente
superior ao dobro daquelas cultivadas no ambiente de 150 μmol m
-2
s
-1
de irradiância
(Figura 2). Isto implica dizer que o aumento dos níveis de irradiâncias nem sempre
favorece a atividade fotossintética; ao contrário, as irradiâncias de 50, 100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
, no presente trabalho, causaram prejuízos às plântulas dessa espécie. A baixa
eficiência fotossintética dessas plântulas nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
pode
acarretar prejuízos irreversíveis às mesmas, conduzindo-as à morte. Como o objetivo é
consolidar o processo de propagação in vitro, de forma a obter plantas aptas ao processo
de aclimatização, o cultivo dessas em irradiâncias acima de 50 μmol m
-2
s
-1
pode ser
prejudicial, tornando-se inviável a sua utilização, em função da não recuperação do
estado fisiológico normal da planta.
143
Figura 2. Atividade fotossintética (A,
94,0;03498,099773,8
2
=−=
•
RIY
)
) condutância
estomática (g
S,
90,0;13547,065457,26213,26
2
=+−=
•
•
RIIY
)
) e transpiração (E,
90,0;0220581,045774,089762,5
2
=+−=
•
•
RIIY
)
) em plântulas do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob diferentes níveis de irradiância,
por 35 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
A condutância estomática (g
S
), que é considerada a medida do fluxo de água e
dióxido de carbono através dos estômatos, para dentro e para fora da célula, foi superior
nas menores irradiâncias (12 e 25 μmol m
-2
s
-1
), acompanhando o comportamento da
taxa fotossintética até a irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura 2). Acima desse valor,
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
A (µmol m
-2
s
-1
)
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
g
S
(mmol m
-2
s
-1
)
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
E (mmol m
-2
s
-1
)
144
observou-se uma quase estabilidade na curva de g
S
, isto é, nos ambientes de 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
.
O comportamento da g
S
foi semelhante ao da transpiração (E), com queda até a
irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
, e a partir desse nível, houve constância entre as
irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
(Figura 2).
Aos 42 dias de cultivo das plântulas in vitro, observou-se aumento na atividade
fotossintética para as irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3), se comparado a
avaliação feita aos 35 dias (Figura 2). O comportamento da curva da taxa fotossintética
indicou na irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
o valor de 2,36 μmol m
-2
s
-1
, com tendência
para zero, ou seja, condição esta em que a assimilação fotossintética de CO
2
se iguala à
liberação de CO
2
pela respiração. Nos ambientes de maior irradiância (100 e 150 μmol
m
-2
s
-1
), as plântulas foram incapazes de desempenhar a atividade fotossintética,
registrando-se, especificamente nesses dois níveis de irradiância, o processo respiratório
(Figura 3). Devido a absorção da radiação ter-se reduzido por motivos de altas
irradiâncias (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, Figura 3), não foi verificada a fixação de CO
2
pela
fotossíntese, porém, sim, sua liberação pela respiração. Portanto, observa-se que a faixa
ideal de irradiância em que as plântulas de P. edulis f. flavicarpa podem ser cultivadas
sem que torne-se prejudicial a elas, encontra-se entre 12-25 μmol m
-2
s
-1
e aqueles
limitantes a taxa fotossintética, a partir de 50 μmol m
-2
s
-1
(Figura 3).
Verificou-se com o aumento do tempo de cultivo in vitro das plântulas de
maracujazeiro nas maiores irradiâncias, a intensificação do nível de estresse, pela
comparação entre a taxa fotossintética aos 35 e 42 dias (Figuras 2 e 3, respectivamente).
Como o fotoperíodo mantém-se em 16/8 h (luz/escuro), no período de luz a intensidade
dos feixes luminosos é constante, diferentemente de ambientes naturais, que pode sofrer
variações ao longo do dia, com isso as plântulas não param de receber luz, ficando
expostas a níveis de irradiâncias que caracterizam a condição de estresse, assim a
fotoinibição é praticamente inevitável.
145
Figura 3. Atividade fotossintética (A,
97,0;19063,08924,11
2
=−=
•
RIY
)
) em plântulas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob diferentes níveis
de irradiância, por 42 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
Observa-se na Figura 4, maiores valores de fluorescência inicial (F
o
) e menores
de fluorescência máxima (F
m
) com a elevação dos níveis de irradiância. A fluorescência
inicial detectada nas folhas de plântulas cultivadas sob irradiância de 12 μmol m
-2
s
-1
foi
de 280,7 e na irradiância de 150 μmol m
-2
s
-1
de 378, uma diferença expressiva para uma
característica indicadora dos estágios iniciais do dano fotoinibitório (Figura 4). Maiores
valores de F
m
e menores de F
o
(Figura 4) nos níveis de irradiância de 12 e 25 μmol m
-2
s
-
1
contribuíram para a elevação da relação F
v
/F
m
. Entretanto, o contrário traduz em
decréscimo na relação F
v
/F
m
e indicando a tendência para a fotoinibição da fotossíntese.
-20,0
-15,0
-10,0
-5,0
0,0
5,0
10,0
15,0
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
A (µmol m
-2
s
-1
)
146
Figura 4. Fluorescência inicial (F
o
,
98,0;57541,04346,19845,222
2
=++=
•
•
RIIY
)
) e
fluorescência máxima (F
m
,
99,0;47169,05937,5789,1815
2
=++=
•
•
RIIY
)
), em
plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob
diferentes níveis de irradiância, por 42 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
As variações na F
o
e F
m
contribuíram para a redução do rendimento quântico
potencial do FSII, ou melhor, da relação F
v
/F
m
(Figura 5). A elevação dos níveis de
irradiância reduziu a relação F
v
/F
m
, com menores valores nas irradiâncias de 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
. A relação F
v
/F
m
apresentou comportamento semelhante ao da atividade
fotossintética, sendo portanto indicado para mensurar os níveis de estresse nas plântulas.
Na Figura 5, observa-se queda no rendimento quântico efetivo (ΔF/F
m
’) com o
aumento dos níveis de irradiância. As plântulas cultivadas nos ambientes de 12 e 25
μmol m
-2
s
-1
apresentaram valores de ΔF/F
m
’ de 0,756 e 0,718, respectivamente.
Verificou-se principalmente nas maiores irradiâncias, clorose intensa nas folhas e no
epicótilo como um todo, inclusive apresentado aspecto de enrugamento destes órgãos,
sintomas estes de perda da turgescência celular. Neste caso, o estado fisiológico das
260
280
300
320
340
360
380
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
Fo
1100
1200
1300
1400
1500
1600
1700
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
F
m
147
plântulas cultivadas sob as maiores irradiâncias, possivelmente contribuiu negativamente
para os valores tão baixos de ΔF/F
m
’, em torno de 0,588 e 0,325 para as irradiâncias de
100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, respectivamente (Figura 5).
Figura 5. Rendimento quântico potencial (F
v
/F
m,
96,0;00047,002551,092387,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
) e
rendimento quântico efetivo (ΔF/F
m
’,
96,0;00646,005713,061557,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
)
do PS II, em plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in
vitro, sob diferentes níveis de irradiância, por 42 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
Pela Figura 6, observa-se que a elevação dos níveis de irradiância reduziu a
dissipação fotoquímica (q
P
), ou o “quenching” fotoquímico. Nesse processo, a energia
armazenada em clorofilas excitadas pela luz é rapidamente dissipada, principalmente
pela transferência de excitação. A curva da taxa de transporte de elétrons (ETR) teve
comportamento muito semelhante com a de q
P
(Figura 6), confirmando que os níveis
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
F
v
/F
m
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (μmol m
-2
s
-1
)
ΔF/Fm'
148
mais elevados de irradiância (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
) foram prejudiciais à cadeia de
transporte de elétrons.
Figura 6. Dissipação fotoquímica (q
P
,
97,0;00269,000322,098643,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
) e taxa de
transporte de elétrons (ETR,
97,0;00222,001835,026875,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
), em
plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro, sob
diferentes níveis de irradiância, por 42 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
Observa-se prejuízos ao aparato fotossintético detectado precocemente com a F
o
(Figura 4), em seguida na relação F
v
/F
m
(Figura 5) e finalmente na ETR (Figura 6),
naquelas plantas cujo ambiente de cultivo apresentava valores mais elevados de
irradiância. Isto implica dizer, que se tratando de efeitos mediados por luz, os valores
mais elevados de F
o
, baixa relação F
v
/F
m
e baixa ETR, indicam fotoinibição da
fotossíntese.
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0,85
0,90
0,95
1,00
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
q
P
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
ETR
149
Na Figura 7, observa-se para as irradiâncias de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
baixos
valores de q
N
, ao contrário das maiores irradiâncias (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
), onde esses
valores são muito superiores ao observado na mais baixa irradiância (12 μmol m
-2
s
-1
).
Observa-se, também, que tanto a q
N,
quanto NPQ apresentam comportamentos
semelhantes, em que, nas maiores irradiâncias (100 e 150 μmol m
-2
s
-1
) encontrou-se
valores mais elevados de NPQ, ao contrário principalmente das menores irradiâncias (12
e 25 μmol m
-2
s
-1
).
Figura 7. Dissipação não-fotoquímica (q
N
,
97,0;0006,0029,006903,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
e NPQ,
99,0;00208,000974,002147,0
2
=−+=
•
•
RIIY
)
), em plântulas do maracujazeiro P.
edulis f. flavicarpa cultivadas in vitro sob diferentes níveis de irradiância, por
42 dias.
•
Significativo a 0,1% de probabilidade pelo teste de F.
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
q
N
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0 25 50 75 100 125 150
Irradiância (µmol m
-2
s
-1
)
NPQ
150
4. DISCUSSÃO
A baixa atividade fotossintética e sua limitação nas irradiâncias de 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
(Figuras 2 e 3, respectivamente) são indicativos de que essa espécie, nas
condições in vitro, não possui mecanismos eficientes em assimilar carbono sob
condições de alta irradiância. Entretanto, Fuentes et al. (2005) verificaram aumentos na
taxa fotossintética líquida em plantas de coco in vitro, com a elevação dos níveis de
irradiância. Estes autores observaram que, sob baixa irradiância (40 μmol m
-2
s
-1
) e em
concentrações de sacarose extremas (0 e 90 g dm
-3
), as plantas apresentaram
concentração de CO
2
de compensação (Г) um quarto daquelas cultivadas sob alta
irradiância (400 μmol m
-2
s
-1
). Segundo Navarro et al. (1994), baixos níveis de
irradiância limitam o crescimento normal das plantas cultivadas in vitro pela redução na
taxa fotossintética líquida, porém sob níveis de irradiância mais elevados a
disponibilidade de carbono torna-se o fator limitante para a fotossíntese. Essa idéia não
está de acordo com os resultados encontrados no presente trabalho, já que vários fatores
podem influenciar na taxa fotossintética inclusive a própria planta. Alexandre (2002)
verificou no comportamento in vitro de ápices caulinares de maracujazeiro P. edulis f.
flavicarpa que a afinidade pela fixação de CO
2
é reduzida, requerendo, a adição de uma
fonte de carbono ao meio de cultivo, o que é próprio de plantas C
3
.
Nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
, observou-se menor condutância
estomática (g
S
) e transpiração (E) (Figura 2) das folhas das plântulas de maracujazeiro-
amarelo, possivelmente como resultado da elevação das taxas de fotorespiração e, ou de
algum dano à maquinaria fotossintética (Araus & Hogan, 1994). A fotoinibição é o
principal dreno alternativo de elétrons, sendo responsável pelo consumo de ATP e
NADPH gerados pelas reações fotoquímicas e colaborando para a manutenção da
concentração de CO
2
no interior das folhas (Kozai & Takeba, 1996). Valores baixos de
condutância estomática (g
S
) indicam maior resistência ao transporte de CO
2
entre o poro
estomático e os espaços intercelulares, acarretando com isso, redução na taxa
fotossintética. Dessa forma, pode-se supor que a inibição da carboxilação, ao invés do
fechamento estomático, foi a principal limitação da fotossíntese (Parkhurst, 1994).
Segundo Nina Júnior et al. (2005b), a fotossíntese deixa de ser limitada pela luz em
151
condições de alta irradiância, passando a ser pela taxa de carboxilação, que reflete a
difusão de CO
2
para o interior da folha e a capacidade de carboxilação da rubisco.
As folhas das plântulas do maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivadas a
partir da irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
apresentaram sintomas típicos de clorose
internerval, sendo muito mais pronunciada nas irradiâncias de 100 e 150 μmol m
-2
s
-1
,
inclusive nestes dois últimos níveis, observou-se maior facilidade quanto à abscisão das
folhas, caracterizando o processo de senescência, iniciado pela perda de clorofila das
folhas. Lu et al. (2003) verificaram que a fotossíntese foi saturada aproximadamente à
2000, 1500 e 500 μmol m
-2
s
-1
em folhas de trigo não senescentes (690 μmol m
-2
s
-1
de
clorofila m
-2
de folha), moderadamente (350 μmol m
-2
s
-1
de clorofila m
-2
de folha) e
severamente (170 μmol m
-2
s
-1
de clorofila m
-2
de folha) senescentes, respectivamente.
Além disso, observaram também que a taxa de assimilação de CO
2
apresentou reduções
de 0,047, 0,039 e 0,030 μmol de CO
2
μmol
-1
de fótons em folhas não senescentes,
moderadamente e severamente senescentes, respectivamente.
A fluorescência inicial (F
o
) reflete o estado da clorofila a da antena, antes da
excitação migrar para o centro de reação (P
680
) do fotossistema II (FSII) (Oliveira,
2005). Sob condições fotoinibitórias, ocorre rápida diminuição da fluorescência variável
(F
v
), resultado do rápido declínio da fluorescência máxima (F
m
) e da pouca variação da
relação (F
v
/F
m
) (Martinez et al., 2005). A fluorescência inicial (F
o
) nem sempre é
constante. O seu valor pode aumentar, caso os centros de excitação da antena para os
centros de reação estejam prejudicados (Bolhár-Nordenkampf & Öquist, 1993).
Mediante essas informações, verifica-se que os valores da F
o
auxiliam, prevendo
quantitativamente o estado fisiológico da planta no que se refere ao dano fotoinibitório
mediado por luz, no complexo antena. Essa elevação dos valores de F
o
com o aumento
dos níveis de irradiância (Figura 4), é um indicativo de que as maiores irradiâncias
podem ser consideradas fotoinibitórias e, portanto, inadequadas para o cultivo in vitro
desta espécie.
A identificação da redução da relação F
v
/F
m
com o aumento dos níveis de
irradiância (Figura 5) demonstra que houve fotoinibição e que plântulas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa, em condições in vitro, apresentam sensibilidade
aumentada, quando expostas a altas irradiâncias. Ohira et al. (2005) também verificaram
152
reduções na relação F
v
/F
m
em folhas de espinafre com o aumento dos níveis de
irradiância, sendo estas mais drásticas com a elevação da temperatura. Segundo os
autores, há um grande sinergismo entre o estresse mediado por luz e temperatura, onde a
elevação da temperatura e da luz induziu a fragmentação da proteína D1, demonstrando
que os locais de rompimento dessa proteína, mediados por calor e luz, são próximos ou
possivelmente o mesmo. Quiles & López (2004) verificaram queda no rendimento
quântico do FSII com a crescente densidade de fluxo fotônico, em conseqüência de os
elétrons acumularem-se no lado aceptor do FSII. Bjorkman & Demmig (1987)
verificaram em situações normais (não estressantes), que a relação F
v
/F
m
, para a maioria
das espécies, tem valor aproximado de 0,832 ± 0,004. Estes autores investigaram
distintas espécies, dentre elas plantas cultivadas de grande expressão como a soja
(Glycine max (L.) Merrill), feijão (Phaseolus vulgaris L.), milho (Zea mays L.) e
inclusive fruteiras, como o mamoeiro Carica papaya L. Não obstante, Critchley (1998)
verificou que valores abaixo de 0,725 certamente caracterizam a fotoinibição da
fotossíntese, ou seja, situação em que a taxa de fotodano excede a de reparo do FSII, isto
quer dizer, quando a degradação do polipeptídio D1 for maior que sua síntese de novo
(Melis, 1999). Dessa forma, o processo de danificação e reparo do FSII segue a
separação parcial do FSII; exposição do FSII ao fotodano no centro do estroma do
cloroplasto; degradação da D1 pelo fotodano; síntese de novo da D1, sua inserção na
membrana do tilacóide e reorganização do FSII e finalmente a ativação do processo de
transporte de elétrons pela reconstituição do heterodímero D1/D2 (Melis, 1999). Jiao et
al. (2004) mostraram que o FSI pode ser fotoinibido sob luz moderadamente alta e que o
mesmo não é fotoquimicamente estável como previamente se pensava (Sonoike et al.,
1996). Neste estudo, Jiao et al. (2004) detectaram o fotodano pela degradação das
proteínas PsaA e PsaB do centro de reação do FSI. No presente trabalho, nas menores
irradiâncias (12 e 25 μmol m
-2
s
-1
), as plântulas, por atingirem valores da relação F
v
/F
m
próximos de 0,836, significa que as mesmas, encontraram-se sob condições normais de
cultivo. Entretanto, a partir da irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
as plântulas encontraram-se
sob condições fotoinibitórias, ainda mais pronunciadas nas maiores irradiâncias (100 e
150 μmol m
-2
s
-1
) (Figura 5). Fuentes et al. (2005) encontraram maiores valores para a
153
relação F
v
/F
m
(em torno de 0,80) em plantas de coco cultivadas in vitro sob irradiância
de 40 μmol m
-2
s
-1
, se comparado àquelas sob irradiância de 400 μmol m
-2
s
-1
.
Alexandre (2002), ao trabalhar com ápices caulinares de plântulas do
maracujazeiro P. edulis f. flavicarpa cultivados in vitro, já havia detectado fotoinibição
da fotossíntese a partir de 50 μmol m
-2
s
-1
em todas as concentrações de sacarose
estudadas (0, 10, 20 e 30 g L
-1
). Sendo a fotoinibição mais perceptível, quando os
explantes foram cultivados em meio com ausência de sacarose e incubado à irradiância
de 150 μmol m
-2
s
-1
. Entretanto, Kadleček et al. (2001), ao estudarem a influência de
pré-tratamentos no cultivo in vitro com tabaco (Nicotiana tabacum), pela combinação
entre ausência e presença (30 g L
-1
) de sacarose no meio de cultivo com baixa (60 μmol
m
-2
s
-1
) e alta (200 μmol m
-2
s
-1
) irradiâncias, o valor máximo encontrado para a relação
F
v
/F
m
foi aproximadamente de 0,8 ao cultivá-las em meio com 30 g L
-1
de sacarose,
independente da irradiância utilizada. No crescimento das plantas de tabaco durante a
fase de aclimatização, observaram que aquelas plantas cultivadas em meio com sacarose
e incubadas à maior irradiância apresentaram maior valor na relação F
v
/F
m
, maior
conteúdo de clorofila a+b, carotenóides, carboidratos e amido na parte aérea. Kadleček
et al. (2003) verificaram em folhas de plantas de tabaco cultivadas in vitro, que a
eficiência fotoquímica do FSII (F
v
/F
m
) foi de 0,70-0,75, independentemte dos níveis de
irradiância (80 e 380 μmol m
-2
s
-1
) e concentrações de sacarose (0, 30 e 50 g L
-1
), com
exceção de quando as cultivou em meio com ausência de sacarose e sob irradiância de
380 μmol m
-2
s
-1
, onde a relação F
v
/F
m
foi de 0,49.
Behera & Choudhury (2003) verificaram maior redução na relação F
v
/F
m
, ou
seja, cerca de 42,7% em plantas de trigo cultivadas a irradiância de 15 W m
-2
e depois
transferidas para um ambiente de 250 W m
-2
por 5 dias, se comparado às reduções de
40,4% (30 W m
-2
) e 8,2% (45 W m
-2
), indicando que as plantas crescidas nos ambientes
com 30 e 45 W m
-2
são relativamente menos susceptíveis a fotoinibição, principalmente
sob 45 W m
-2
.
As maiores reduções da relação F
v
/F
m
encontradas nas irradiâncias de 100 e 150
μmol m
-2
s
-1
(Figura 5) foi em decorrência de maiores incrementos da F
o
(Figura 4),
indicando danos em maior extensão nos centros de reação do FSII, provavelmente
porque a taxa de substituição do polipeptídio D1 fotodegradado ser baixa (Da Matta,
154
1995). Segundo Kadleček et al. (2001), o processo de aclimatização de plantas de
tabaco, cultivadas em meio com ausência de sacarose e expostas à maior irradiância,
resultou em reduções no conteúdo de clorofila, relação clorofila a/b e D1/LCH II
(polipeptídio/complexo coletor de luz do FSII). De acordo com Baker (1991), o excesso
de radiação provoca a degradação da mais importante proteína do centro de reação do
FSII, o polipeptídio D1. A degradação dessa proteína é consequência aparente da ação
tóxica de radicais oxidantes e espécies tóxicas de oxigênio. A destruição do D1, mediado
pelo oxigênio singleto, representa bloqueio completo no fluxo de elétrons através do
FSII (Baker, 1991). Segudo Genty et al. (1989), o rendimento quântico efetivo (ΔF/F
m
’)
representa melhor as variações no rendimento quântico do fotossistema do que a relação
F
v
/F
m
. O ΔF/F
m
’ pode ser utilizado para estimar a taxa de transporte de elétrons em
tecidos fotossintetizantes, se o fluxo de fótons fotossintéticos incidente for conhecido.
Este parâmetro representa a proporção destes elétrons que são usados na fase
fotoquímica (redução do NAD), indica a quantidade de luz absorvida pela P680 utilizada
na atividade fotoquímica, além de predizer a quantidade de elétrons transportados, sendo
um indicador da fotossíntese (Baker & Rosenqvst, 2004). O principal fator determinante
desta eficiência é a habilidade com que os elétrons são removidos da quinona receptora
do FSII, que está diretamente relacionado com a taxa de consumo dos produtos do
transporte fotossintético de elétrons (ATP e NADPH). Diante das informações citadas
acima, os ambientes espectrais de 12 e 25 μmol m
-2
s
-1
podem ser considerados os que
melhor condicionaram o funcionamento do aparato fotossintético das plântulas de P.
edulis f. flavicarpa.
O cultivo de plantas sob irradiâncias altas pode conduzir a distúrbios fisiológicos
de natureza variada, como a senescência foliar e/ou de toda a planta, que nestes casos, é
iniciada por influências ambientais e regulada por hormônios (Taiz & Zeiger, 2004).
Folhas moderada e severamente senescentes, apresentaram baixo rendimento da
fluorescência do FSII (Ф
FSII
), se comparado às folhas não senescentes. Esta redução em
ФFSII reflete na diminuição da eficiência de captura de energia de excitação pelos
centros de reação abertos do FSII, indicado pela relação F
v
’/F
m
’ (Lu et al., 2003).
Dissipação fotoquímica (q
P
) é a utilização da energia luminosa pelos processos
fotoquímicos da fotossíntese (doação de elétrons provenientes da molécula de água para
155
um aceptor denominado NADP (nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato)).
Representa a energia dissipada que é usada para a formação do poder redutor (NADPH)
e da molécula de ATP, os quais serão utilizados na fase bioquímica do processo
fotossintético. Este processo é a base da fotossíntese. O decréscimo de q
P
, conforme se
elevam os níveis de irradiâncias (Figura 6), é um indicativo de dano na cadeia de
transporte de elétrons, já que q
P
está relacionado com a conservação da energia
fotoquímica (Turchetto et al., 2005). Jackowski et al. (2003) observaram que plantas de
ervilha cultivadas sob 50 μmol m
-2
s
-1
apresentaram q
P
entre 0,92-0,93, valores estes
indicativos de centros de reação do FSII com baixo estado de energia, com Q
A
mantendo-se oxidado. Quando essas plantas foram aclimatizadas sob irradiâncias de
150, 300 e 450 μmol m
-2
s
-1
, nenhuma mudança significativa foi observada. Entretanto,
após 3 dias na condição de 600 μmol m
-2
s
-1
verificou-se o início da fotoinibição com q
P
reduzido para 0,6.
Segundo Taiz & Zeiger (2004), a fotossíntese é limitada pela capacidade do ciclo
de Calvin em regenerar a molécula aceptora ribulose-1,5-bisfosfato, que depende das
taxas de transporte de elétrons. Quiles & López (2004) verificaram que as taxas de
transporte de elétrons relativas foram mais baixas em plantas crescidas sob irradiâncias
altas (300 W m
-2
), que naquelas crescidas sob irradiâncias baixas (13 W m
-2
). Segundo
os autores, sob irradiâncias altas, a taxa de transporte de elétrons diminui e, como
conseqüência, tem-se forte dissipação não-radiativa da energia de excitação (q
N
e NPQ).
Isto reflete na redução da capacidade de transporte de elétrons em plantas crescidas sob
irradiâncias altas, como resultado da fotoinibição crônica do FSII, causado pelo excesso
de luz. Isto pode ser observado na Figura 7, ou seja, maiores valores de q
N
e NPQ foram
encontrados nos ambientes de maior irradiância, representando a maneira pela qual as
clorofilas dissipam o excesso de energia, de modo a não ser prejudicial aos
fotossistemas. Segundo Behera & Choudhury (2003), o NPQ representa a dissipação
térmica do excesso de energia que é prejudicial ao processo fotossintético. A dissipação
não-fotoquímica (NPQ) expressa a fração da energia dissipada como energia térmica,
estando relacionada com fotoproteção (Maxwell & Johnson, 2000). A dissipação não-
fotoquímica (q
N
e NPQ) é a dissipação da fluorescência da clorofila por outros processos
que não o fotoquímico, por exemplo, conversão do excesso de excitação em calor.
156
Segundo Nina Júnior et al. (2005a), sob condições saturantes de luz, há maior
necessidade de dissipar o excesso de energia, de forma a evitar a fotoinibição; por outro
lado, sob condições de baixa luminosidade, faz-se necessário maximizar a absorção de
luz e a eficiência fotoquímica.
Kadleček et al. (2003), ao cultivarem plantas de tabaco in vitro em meio com
ausência de sacarose e irradiância de 380 μmol m
-2
s
-1
, verificaram também aumento da
dissipação não-fotoquímica (NPQ). Behera & Choudhury (2003) observaram que o NPQ
aumentou nas folhas de mudas que foram expostas à condição de estresse luminoso, ou
seja, crescidas inicialmente sob 15, 30 e 45 W m
-2
e transferidas por 5 dias para
irradiância de 250 W m
-2
, se comparado àquelas sem estresse.
Dentre os mecanismos relacionados com a fotoinibição está o envolvimento dos
carotenóides. Estas desativam diretamente o oxigênio singleto (
1
O
2
.
) e extinguem as
clorofilas triplete (
3
Chl
.
), reduzindo indiretamente a formação de
1
O
2
.
. Também se tem a
dissipação térmica do excesso de energia (NPQ) no FSII, processo que requer zeaxantina
e que está associado com a deepoxidação da violaxantina para zeaxantina e com o
desenvolvimento de um pH trans-tilacoidal (Demmig-Adams & Adams, 1992).
Demmig-Adams & Adams (2000) identificaram em um mutante de Arabidopsis thaliana
que continha um conteúdo normal de zeaxantina, falha no processo de dissipação
térmica do excesso de energia. Segundo Li et al. (2000) nesse mutante não foi
encontrada a proteína CP22/PsbS, requerida para a mudança conformacional na
membrana tilacoidal que participa da dissipação térmica dessa energia.
5. CONCLUSÕES
٠ A elevação dos níveis de irradiância afeta o rendimento potencial do fotossistema II,
pelo decréscimo na relação F
v
/F
m
;
٠ A relação F
v
/F
m
apresenta comportamento semelhante ao da atividade fotossintética,
sendo, portanto, indicada para mensurar os níveis de estresse nas plântulas;
157
٠ As plântulas de P. edulis f. flavicarpa adaptam-se melhor às menores irradiâncias (12
e 25 μmol m
-2
s
-1
), sendo assim indicadas para o cultivo in vitro desta espécie.
٠ O sistema de avaliação da atividade fotossintética contribui para analisar plântulas
cultivadas in vitro.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg.) influenciada pela irradiância e
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CONCLUSÕES GERAIS
٠ A germinação de sementes de P. edulis f. flavicarpa é variável de acordo com o
genótipo;
٠ O armazenamento aumenta o poder germinativo das sementes de P. edulis f.
flavicarpa;
٠ O BAP (0,7 mg L
-1
) influencia negativamente na absorção de nutrientes pelos
segmentos de hipocótilo;
٠ Os maiores níveis de estresse nem sempre correspondem à maior atividade de enzimas
antioxidantes; ocorre também queda ou inatividade das mesmas;
٠ Aumentos crescentes ocorrido na peroxidação de lipídios são indicativos de que a
atividade das enzimas antioxidantes não é suficiente para a remoção de espécies
reativas de oxigênio;
٠ No processo organogênico e no desenvolvimento de ápices caulinares in vitro,
verificou-se que a biossíntese de etileno e CO
2
aumenta com os níveis crescentes de
irradiância, e que existe uma relação entre produção de etileno e biossíntese ou
degradação de pigmentos cloroplastídicos;
٠ Na morfogênese in vitro de segmentos hipocotiledonares de P. edulis f. flavicarpa, a
irradiância de 50 μmol m
-2
s
-1
é a que delimita os níveis de irradiância para mais ou
para menos, entre as condições que propiciam aumento e declínio da atividade das
enzimas superóxido dismutase e catalase;
٠ A atividade fotossintética e a fluorescência da clorofila contribuem para identificar o
nível de estresse fotooxidativo nas plântulas de P. edulis f. flavicarpa, cultivadas in
vitro.
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