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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM EDUCAÇÃO FÍSICA
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS NO
GENE RECEPTOR DE VITAMINA D E MASSA LIVRE DE
GORDURA EM BRASILEIRAS PÓS-MENOPAUSADAS
Ricardo Moreno Lima
BRASÍLIA
2006
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ii
RICARDO MORENO LIMA
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS NO
GENE RECEPTOR DE VITAMINA D E MASSA LIVRE DE
GORDURA EM BRASILEIRAS PÓS-MENOPAUSADAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação Stricto Sensu em Educação Física
(UCB), como parte dos requisitos para a obtenção
do título de Mestre em Educação Física.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira
Co-Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson
Pereira
BRASÍLIA
2006
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iii
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado a uma pessoa que além
de ter concebido a semente que tornou possível o
meu nascimento, me apoiou nos momentos mais
difíceis da minha vida e certamente continua
iluminando meu caminho de onde quer que ele
esteja. Seu incomparável caráter é algo raramente
encontrado nos dias de hoje, e que me influenciou
e influenciará nas decisões mais importantes da
minha vida. Infelizmente, não será possível
contar com a presença física deste ser no
desfecho do Mestrado, pois ele partiu para outra
dimensão no decorrer da construção desta
Dissertação. Indubitavelmente, este trabalho é
dedicado ao meu maravilhoso Pai, Silton Barreto
Lima (in memorian).
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço:
A Deus por: me conceber uma família maravilhosa; me aproximar sempre de seres humanos
fantásticos; me dar força para vencer os obstáculos; e pela ótima vida com a qual fui premiado;
Aos meus pais Silton Barreto Lima (in memorian) e Augusta Maria Moreno Lima pelo amor,
educação, confiança, apoio e tudo mais que não me faltou desde o primeiro dia de vida. Não
precisava nem comentar que se não fosse o auxílio financeiro deles esse Mestrado seria
impossível. Ao meu irmão e padrinho Eduardo Moreno Lima por me ajudar, sem sequer ser
requisitado, em todos os aspectos da minha vida, inclusive no decorrer desse Mestrado. Amo
vocês;
Ao meu professor, orientador e amigo Dr. Ricardo Jacó de Oliveira por inúmeras razões: pelo
incomensurável apoio pessoal que me deu desde a minha chegada a Brasília até os dias de hoje,
pela sábia orientação, visão de futuro e potencial que tornou possível o desenvolvimento e
conclusão deste trabalho, pela confiança em mim depositada e pelo grande aprendizado obtido
ao seu lado. Professor, você foi muito mais do que orientador no decorrer desses dois últimos
anos, meu sincero Muito Obrigado! Agradeço também a sua adorável esposa, Profª. Ms.
Adriana Cardoso Furtado Jacó de Oliveira, por ter me recebido excepcionalmente bem nas
vezes que fui convidado a visitá-los. Agradeço ainda a ambos por terem sido meus fiadores na
locação do imóvel no qual resido atualmente;
Ao meu Co-orientador professor Dr. Rinaldo Wellerson Pereira por receber um estudante de
Educação Física de braços abertos no laboratório de genética, pela brilhante orientação e
paciência. Sem ele este trabalho jamais seria desenvolvido;
Ao amigo e professor Esp. Valter Abrantes Pereira da Silva, por ter me dado oportunidade de
estagiar em sua academia voltada para cardiopatas em Salvador, por ter me incentivado sempre
com os estudos e, sobretudo, por ter aberto as portas do Mestrado em Brasília para mim. Se não
fosse ele, eu até poderia estar cursando algum Mestrado em algum lugar, entretanto, com
certeza, este trabalho não existiria;
v
À Universidade Católica de Brasília por fornecer os equipamentos necessários para o
desenvolvimento dessa pesquisa e pelo auxílio financeiro que foi dado ao projeto como parte de
um trabalho mais amplo dirigido pelo Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira. É com muito orgulho
que atualmente sou colaborador da instituição, a qual considero centro de excelência na área de
pesquisa em Educação Física;
Aos funcionários da secretaria do Mestrado em Educação Física, mais especificamente: A Cida,
pela vontade gratuita de ajudar, pela preocupação, pela amizade e pela pessoa maravilhosa que
ela é; Ao Weslen (Neneco), pela amizade, prestatividade, companheirismo e por ter muito
ajudado na formatação da Dissertação; Ao Lauro, pelo coleguismo, tranqüilidade e auxílio
direto no desenvolvimento deste projeto. Vocês são nota 10!
À todas as idosas que voluntariamente participaram da pesquisa, sem as quais seria impossível
a realização da mesma;
Ao “irmão” de orientação Paulo Gentil, por ter em conjunto desenvolvido o presente trabalho e
por nos ajudarmos mutuamente para transpor os obstáculos encontrados durante o processo;
Ao Centro de Aperfeiçoamento em Pessoal de Ensino Superior (CAPES) pelo apoio financeiro
concedido no segundo semestre de 2004;
Ao professor Dr. Herbert Gustavo Simões, que embora não tenha participado diretamente deste
trabalho, foi um exemplo de profissional e com ele muito aprendi sobre Fisiologia do Exercício
e pesquisa;
A todo o corpo docente e aos colegas do Mestrado em Educação Física da Universidade
Católica de Brasília;
Ao professor Roberto Landwehr, por ter me recebido na disciplina Fisiologia do Exercício
como seu estagiário, pela oportunidade de lecionar esta envolvente matéria, colaborando assim
muito para formação do meu conhecimento;
vi
Ao colega de Mestrado Sérgio Rodrigues Moreira, pela parceria durante esses dois anos de
estudo árduo, por ter dividido a moradia comigo por um ano e meio, e pelo exemplo de
profissional que ele é;
Á colega de laboratório Luciana Rollemberg que, com sua prestatividade e paciência, muito
ajudou durante o processo de extração e amplificação do DNA, bem como na genotipagem.
Obrigado Lu!;
Ao professor Dário Grattapaglia que possibilitou a utilização de equipamentos indispensáveis
para o desenvolvimento do trabalho;
Aos colegas do Futevôlei da AABB e ao professor Betola, pela saudável amizade construída
nesse último ano e pelos divertidos momentos que juntos desfrutamos, o que com certeza
amenizou a saudade dos familiares e amigos de Salvador, deixando assim minha mente mais
tranqüila para desenvolver o presente estudo;
À Manuela Lacerda (Manu), pelo companheirismo, pelos agradáveis momentos vividos na reta
final do Mestrado, e por ter me ajudado na conferência das Referencias Bibliográficas;
Por fim, agradeço a todos aqueles que porventura não foram aqui mencionados, mas que de
alguma forma me ajudaram nessa árdua, porém gratificante, jornada que foi esse Mestrado.
Muito Obrigado e um forte abraço a todos!
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................................... x
LISTA DE TABELAS..................................................................................................................... xi
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................................................ xii
RESUMO ...................................................................................................................................... xiii
ABSTRACT .................................................................................................................................. xiv
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 4
2.1. Objetivo geral.......................................................................................................................... 4
2.2. Objetivos específicos............................................................................................................... 4
3. REVISÃO DE LITERATURA................................................................................................... 5
3.1. Dados epidemiológicos do envelhecimento ............................................................................. 5
3.2. Sistema músculo-esquelético em indivíduos idosos ................................................................. 6
3.3. Sarcopenia............................................................................................................................... 7
3.3.1. Fatores que se relacionam a sarcopenia ................................................................................ 9
3.3.1.1. Influência do treinamento resistido na progressão da Sarcopenia......................................11
3.3.2. Implicações da sarcopenia...................................................................................................14
3.3.2.1. Atividades de vida diária..................................................................................................14
3.3.2.2. Sarcopenia e densidade mineral óssea (DMO)..................................................................15
3.3.2.3. Efeitos na temperatura corporal........................................................................................16
3.3.2.4. Tolerância à glicose .........................................................................................................16
3.3.2.5. Taxa metabólica basal......................................................................................................17
3.3.2.6. Efeitos sobre a capacidade funcional................................................................................18
3.3.3. Fatores genéticos e sarcopenia.............................................................................................19
3.4. Genes relacionados à massa muscular e força.........................................................................21
3.5. Gene receptor de vitamina D (VDR) e suas relações com fenótipos musculares......................22
3.5.1. Vitamina D, massa e força muscular ...................................................................................22
3.5.2. Gene VDR e alguns dos seus polimorfismos .......................................................................23
3.5.3. Associações entre polimorfismos no gene VDR com fenótipos musculares .........................25
4. METODOLOGIA .....................................................................................................................29
4.1. Tipo de estudo........................................................................................................................29
4.2. Amostra populacional.............................................................................................................29
4.3. Cuidados Éticos......................................................................................................................30
viii
4.4. Caracterização dos níveis de atividade física dos participantes ...............................................31
4.5. Estudo dos polimorfismos no gene VDR ................................................................................31
4.5.1. Extração de DNA................................................................................................................32
4.5.2. Quantificação do DNA........................................................................................................33
4.5.3. Polimorfismos estudados no gene VDR...............................................................................33
4.5.4. Amplificação do DNA – Polimerase Chain Reaction (PCR)................................................34
4.5.5. Genotipagem.......................................................................................................................35
4.6. Composição corporal..............................................................................................................37
4.7. Tratamento estatístico.............................................................................................................39
5. RESULTADOS.........................................................................................................................40
5.1. Caracterização da amostra......................................................................................................40
5.2. Extração e quantificação das amostras de DNA......................................................................43
5.3. Amplificação pela PCR ..........................................................................................................44
5.4. Genotipagem por minisequenciamento...................................................................................45
5.5. Genótipos do VDR e associação com massa livre de gordura .................................................46
5.5.1. Polimorfismo ApaI..............................................................................................................46
5.5.2. Polimorfismo BsmI .............................................................................................................48
5.5.3. Polimorfismo Cdx - 2..........................................................................................................50
5.5.4. Polimorfismo FokI..............................................................................................................52
5.5.5. Polimorfismo TaqI..............................................................................................................54
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................................56
6.1. Características da amostra ......................................................................................................56
6.2. Genótipos do VDR e associação com massa livre de gordura .................................................59
6.2.1. Polimorfismo ApaI..............................................................................................................60
6.2.2. Polimorfismo BsmI .............................................................................................................62
6.2.3. Polimorfismo Cdx-2............................................................................................................64
6.2.4. Polimorfismo FokI..............................................................................................................65
6.2.5. Polimorfismo TaqI..............................................................................................................68
6.3. Mecanismos envolvidos entre o gene VDR e fenótipos musculares ........................................70
6.4. Estudos de associação com polimorfismos .............................................................................72
7. CONCLUSÕES.........................................................................................................................74
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................75
9. ANEXOS ..................................................................................................................................88
Anexo A: Ato de Designação do Orientador.....................................................................................88
ix
Anexo B: Carta de Encaminhamento ao Comitê de Ética em Pesquisa .............................................89
Anexo C: Declaração de propriedade dos dados coletados................................................................90
Anexo D Carta de Aprovação do Comitê de Ética............................................................................91
Anexo E: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido...................................................................92
Anexo F: Questionário de Caracterização da Amostra......................................................................94
Anexo G: IPAQ ...............................................................................................................................96
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Representação esquemática da estrutura de Exons e Introns do gene VDR e o
posicionamento dos polimorfismos estudados na presente investigação............................................25
Figura 02. Representação esquemática dos passos seguidos desde a amplificação pela PCR
até a realização e análise da eletroforese...........................................................................................36
Figura 03. Eletroforese em gel de agarose (1%) corado com brometo de etídeo. Os quatro
primeiros poços na parte superior e inferior do gel representam os padrões de concentração de
DNA, respectivamente, com 20, 100, 200 e 400 ng/ul. Os demais poços são amostras de DNA
genômico extraído de amostras de sangue. .......................................................................................43
Figura 04. Eletroforese em gel de agarose (2%) corado com brometo de etídeo. Produtos de
amplificação pela PCR com iniciadores para ApaI e TaqI em 4a; BsmI em 4b; Cdx-2 em 4c; e
FokI em 4d.......................................................................................................................................44
Figura 05. Eletroforegrama de produtos de miniseqüenciamento para os locos Cdx-2, TaqI,
ApaI, BsmI e FokI. Neste eletroforegrama todos os locos são heterozigotos. ....................................45
Figura 06. Distribuição dos genótipos observada para o polimorfismo ApaI no gene VDR..............46
Figura 07. Distribuição dos genótipos observada para o polimorfismo BsmI no gene VDR. ............48
Figura 08. Distribuição dos genótipos observada para o polimorfismo Cdx-2 no gene VDR............50
Figura 09. Distribuição dos genótipos observada para o polimorfismo FokI no gene VDR..............52
Figura 10. Distribuição dos genótipos observada para o polimorfismo TaqI no gene VDR..............54
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 01. Estatística descritiva (média +/- Desvio padrão) das variáveis estudadas........................40
Tabela 02. Características de tabagismo, obesidade, reposição hormonal, auto-definição de
cor da pele, presença de doenças crônicas e nível de atividade física da amostra. .............................42
Tabela 03. Características físicas da amostra em relação aos genótipos do polimorfismo ApaI. .......47
Tabela 04. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo ApaI...........................................................................................................................47
Tabela 05. Características físicas da amostra em relação aos genótipos do polimorfismo
BsmI. ...............................................................................................................................................49
Tabela 06. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo BsmI ..........................................................................................................................49
Tabela 07. Características físicas da amostra em relação aos genótipos do polimorfismo Cdx-
2. .....................................................................................................................................................51
Tabela 08. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo Cdx-2.........................................................................................................................51
Tabela 09. Características físicas da amostra em relação aos genótipos do polimorfismo FokI ........53
Tabela 10. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo FokI ...........................................................................................................................53
Tabela 11. Características físicas da amostra em relação aos genótipos do polimorfismo TaqI ........55
Tabela 12. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo TaqI...........................................................................................................................55
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
ANCOVA = Análise de Covariância;
ANOVA = Análise de Variância;
DMO = Densidade Mineral Óssea;
DXA = Absortometria por Raios-X de Dupla Energia (do inglês, Dual-energy X-ray
Absorptiometry);
Gene VDR = Gene Receptor de Vitamina D (do inglês, Vitamin D Receptor gene);
IMC = Índice de Massa Corporal;
IPAQ = Questionário Internacional de Atividade Física (do inglês, International Physical
Activity Questionaire);
MGLA = Massa Livre de Gordura Apendicular;
MLG = Massa Livre de Gordura;
PCR = Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês, Polymerase Chain Reaction);
RM = Repetição Máxima;
VDR = Receptor de Vitamina D (do inglês, Vitamin D Receptor).
xiii
RESUMO
Estudo de associação entre polimorfismos no gene receptor de vitamina D e massa livre
de gordura em brasileiras pós-menopausadas
O processo de envelhecimento é caracterizado por uma progressiva perda de massa magra,
particularmente massa muscular. Em 1989, Rosenberg denominou esse processo de
sarcopenia, e esse termo atualmente é amplamente empregado para se referir ao declínio na
massa muscular e força que ocorre com o avançar da idade. Massa e força muscular estão sob
importante regulação genética, porém, os genes que contribuem para a variação
interindividual são pouco conhecidos. Roth et al. (2004) demonstraram uma associação
significativa entre o polimorfismo FokI do gene receptor de vitamina D (VDR) com massa
livre de gordura (MLG) em idosos caucasianos, entretanto, os autores enfatizaram a
necessidade de avaliar outras variações alélicas, bem como examinar os resultados em outras
populações e em mulheres. O presente estudo investigou a associação entre os polimorfismos
ApaI, Cdx-2, BsmI, FokI e TaqI do gene VDR em 191 brasileiras pós-menopausadas (idade
média de 67.87 ±5.22 anos), as quais tiveram a MLG não óssea analisada através da
absortometria por raios-X de dupla energia (DXA), e responderam questionários sobre o nível
de atividade física, co-morbidades e reposição hormonal. O DNA genômico extraído de
amostra sanguínea foi genotipado para os polimorfismos ApaI, Cdx-2, BsmI, FokI e TaqI do
gene VDR através de minisequeciamento. Modelos de análise de covariância foram utilizados
para testar associação entre os genótipos do VDR com MLG. A distribuição de cada um dos
cinco alelos estava dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Nenhuma das variações alélicas
do VDR investigadas foi associada com os fenótipos de MLG. Em conclusão, os
polimorfismos do VDR examinados no presente estudo não estão associados com fenótipos
de MLG, avaliado através do DXA, em brasileiras pós-menopausadas. Entretanto, os dados
precisam ser confirmados em futuros estudos levando-se em consideração a natureza
heterogênea da população brasileira.
xiv
ABSTRACT
Association study among vitamin D receptor gene polymorphisms and fat-free mass in
postmenopausal Brazilian women
The aging process is associated with a progressive loss of lean mass, particularly skeletal
muscle mass. In 1989, Rosenberg referred to this process as sarcopenia, and this term is now
broadly used to refer to the decline in muscle mass and strength that occurs with advancing
age. Muscle mass and strength are under a major genetic regulation, however, the genes
contributing to the interindividual variation are poorly known. Roth et al. (2004)
demonstrated a significant association between the vitamin D receptor (VDR) FokI
polymorphism with fat-free mass (FFM) in elderly Caucasian men, however, the authors
emphasized the necessity of evaluate other allelic variation, as well as, in additional
populations and in woman. The present study investigated the association between ApaI, Cdx-
2, BsmI, FokI and TaqI polymorphims of the VDR gene in 191 postmenopausal Brazilian
women (mean age 67.87 ±5.22 yrs), who underwent nonosseous FFM analysis by dual-energy
X-ray absorptiometry (DXA), and completed questionnaires addressing level of physical
activity, comorbities, and hormonal replacement. Genomic DNA samples extracted from
whole blood were genotyped to ApaI, Cdx-2, BsmI, FokI and TaqI polymorphims through
minisequecing. Analysis of covariance models were used to test associations between VDR
genotypes with FFM. The distribution of each of the five alleles was in Hardy-Weinberg
equilibrium. None of the VDR allelic variations investigated was associated with the FFM
phenotypes. In conclusion, the VDR polymorphisms examined in the present study are not
related to FFM phenotypes, evaluated by DXA, in postmenopausal Brazilian women.
However, these data should be confirmed in future studies taking in account the admixed
nature of Brazilian population.
1
INTRODUÇÃO
De acordo com a literatura, a baixa capacidade funcional verificada nos idosos tem
como importante causa a fraqueza muscular. É bem estabelecido que o processo de
envelhecimento, da maturidade a senescência, é associado à perda significativa da função
neuromuscular e performance (GRIMBY & SALTIN, 1983; DOHERTY et al., 1993; ROOS
et al., 1997; VANDERVOORT, 2002). Este declínio é acompanhado de redução na massa
muscular e força, sendo este fenômeno observado mesmo em idosos considerados saudáveis
(JANSSEN, 2002).
O declínio da massa muscular é uma das mais notáveis alterações anatômicas
decorrentes do avançar da idade. Roubenoff et al. (1997) denominaram essas mudanças na
quantidade e qualidade muscular de sarcopenia. Essa terminologia se refere à perda de massa
e função muscular observado durante o envelhecimento (ROSEMBERG, 1989). Esse declínio
tem início na terceira década da vida, se tornado mais significante após os 65 anos de idade.
Sendo assim, aos 80 anos, o indivíduo apresenta em média 30 por cento menos massa
muscular quando comparado a um adulto jovem (BAUMGARTNER et al., 1995; EVANS,
1995). Este processo implica também na redução da força muscular e da performance de
endurance (COGGAN, 1993; EVANS, 1995), que por sua vez, se associam significativamente
com a autonomia dos idosos em realizar as atividades de vida diária (CARMELI &
REZNICK, 1994; BAUMGARTNER et al., 1998). Embora os mecanismos não sejam claros,
a etiologia da sarcopenia parece ser multifatorial, envolvendo fatores hormonais,
neurogênicos, genéticos e ambientais (ROTH et al., 2000; ROUBENOFF et al., 2000).
Sabe-se atualmente que o “background” genético contribui de maneira significativa
para a variabilidade de massa muscular e força (ARDEN & SPECTOR, 1997), bem como
para o decréscimo de força decorrente do envelhecimento (CARMELLI & REED, 2000).
Estudos baseados em dados de núcleos familiares e de irmãos gêmeos apresentam em seus
resultados evidências sólidas de um significativo componente genético para fenótipos
musculares. É observado que, devido a influência genética, alguns indivíduos estão mais
propensos a apresentarem menores níveis de força e de massa muscular como efeito do
envelhecimento (TIAINEN et al., 2004). A descoberta de genes que desempenhem relevante
função relacionada a características musculares está sob investigação, e sua detecção, por
exemplo, permitirá a identificação precoce de indivíduos predispostos à sarcopenia,
possibilitando a intervenção antecipada com o objetivo de prevenir ou pelo menos retardar o
aparecimento desse quadro indesejável. Estudos dessa natureza podem ter importante
2
repercussão no sentido de melhorar a qualidade de vida dos idosos e reduzir custos
assistenciais de saúde.
Um dos fatores ambientais associados ao declínio da função muscular dos idosos é o
status de vitamina D, de forma que baixo nível plasmático dessa vitamina está associado à
fraqueza e atrofia das fibras musculares do tipo II (JANSSEN, 2002; PFEIFER, 2002).
Geusens et al. (1997) demonstraram significativa associação entre os genótipos do receptor de
vitamina D e força de preensão manual e do quadríceps ao estudar mulheres com 70 anos de
idade ou mais. Grunberg et al. (2004) demonstraram que variações genéticas no gene VDR
estão significativamente associadas à força muscular e peso corporal em mulheres na fase pré-
menopausa. Há também evidências da presença de associação entre polimorfismos no gene
VDR e a resposta dos fenótipos densidade mineral óssea, composição corporal e distribuição
da gordura corporal frente ao exercício físico regular (JARVINEN et al., 1998; TAJIMA et
al., 2000).
Zmuda et al. (2000) relataram que o polimorfismo da transição T/C no exon 2 do VDR
altera o local de início da tradução. Arai et al. (1997) demonstraram que os indivíduos com o
alelo C (designados “F”) apresentam início da tradução num local diferente dos indivíduos
com o alelo T (designados “f”). Assim, indivíduos “f” sintetizam a proteína VDR completa
(427 aminoácidos), enquanto que os indivíduos “F” sintetizam a proteína VDR numa versão
com 3 aminoácidos a menos (424 aminoácidos) (ARAI et al., 1997).
Roth et al. (2004) estudaram a associação da massa corporal total, massa magra e força
com polimorfismos no gene VDR. Entre os genótipos do polimorfismo FokI não foram
observadas diferenças significativas para idade, estatura, atividade física diária, consumo
calórico total, ou percentual de gordura corporal; entretanto, massa corporal total e índice de
massa corporal foram significativamente menores no subgrupo do genótipo FF quando
comparados aos genótipos Ff e ff. O grupo FF exibiu significativamente menos massa livre de
gordura que os grupos Ff e ff. Os autores demonstraram uma significativa associação entre o
polimorfismo FokI e a presença de sarcopenia. Independente da idade, homens com o
genótipo FF apresentaram um risco 2,17 vezes maior para sarcopenia (95%CI: 1.19 – 3.85)
quando foram comparados aos do genótipo ff. Adicionalmente, o genótipo FokI foi associado
significativamente com força média e de pico do quadríceps. O polimorfismo BsmI, nesse
estudo, não foi associado com a presença de sarcopenia Baseado em seus resultados, Roth et
al. (2004) sugerem que os resultados precisam ser constatados em outras populações para que
a informação genética adquira uma maior robustez, inclusive diferentes grupos raciais e
étnicos.
3
A população brasileira apresenta uma ampla heterogeneidade étnica (HAUACHE et al.,
1998), diferindo das amostras utilizadas em nos estudos de associações com fenótipos
musculares, como por exemplo, os caucasianos, os japoneses, belgas e chineses, as quais
apresentam homogeneidade. Nesse sentido, uma amostra representativa da população de
idosos Brasileiros é considerada interessante para compor estudos de associação em genética.
Investigações dessa natureza vão permitir confrontar resultados com os dados observados em
outras populações e possibilitarão a implantação de uma linha de pesquisa ainda inexplorada
nacionalmente.
4
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
- Verificar associação entre polimorfismos ApaI, BsmI, Cdx-2, FokI e TaqI no gene
receptor de vitamina D com massa livre de gordura, em brasileiras pós-menopausadas.
2.2. Objetivos específicos
- Caracterizar a composição corporal da amostra utilizando como método de avaliação
a absortometria por raios X de dupla energia;
- Realizar a genotipagem dos polimorfismos no gene VDR através de
minisequenciamento;
- Identificar a freqüência alélica nos locos polimórficos estudados;
- Verificar se as freqüências dos genótipos encontram-se de acordo com o equilíbrio de
Hardy Winberg;
- Investigar a contribuição de cada loco para o fenótipo massa livre de gordura em
mulheres pós menopausadas;
5
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Dados epidemiológicos do envelhecimento
Com o advento da indústria farmacêutica permitindo um tratamento mais eficaz das
doenças infecto-contagiosas e crônico-degenerativas, aliado aos avançados métodos
diagnósticos e ao desenvolvimento de técnicas cirúrgicas cada vez mais sofisticadas, houve
um significativo aumento da expectativa de vida do homem moderno. Hoje, o tempo de vida
médio do ser humano se situa em torno dos 66 anos, o equivalente a 20 anos mais do que se
observava em 1950 (Sociedade Brasileira de Geriatria e Gerontologia – SBGG, 1999). Este
aumento da expectativa de vida apresenta característica progressiva, e trata-se de uma
tendência mundial (RAMOS, 1993). Atualmente, estima-se que a cada dez indivíduos no
mundo, um tenha mais de sessenta anos, idade acima da qual é considerado idoso segundo a
Organização Mundial de Saúde (WHO, 1993).
Os dados epidemiológicos encontrados no Brasil demonstram que o país apresenta
uma tendência similar. Conforme a Pesquisa Nacional por Amostra de Domicílio
(PNAD/2002), em que se baseia a síntese do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
(IBGE), o número de crianças, jovens e adolescentes, na faixa etária de zero a 24 anos, vem
caindo em termos percentuais ao longo dos anos. Em contrapartida, no período compreendido
entre 1950 e 2025, segundo as projeções estatísticas da OMS, o grupo de idosos em nosso
país deverá ter aumentado em quinze vezes, enquanto que a população total em cinco. Assim,
segundo dados do IBGE, no ano de 2030 nosso país terá a sexta população mundial em
números absolutos de idosos. Esta tendência determina um processo de transição demográfico
no Brasil, caracterizada pela rapidez com que o aumento absoluto e relativo da população
idosa modifica a pirâmide populacional, no sentido de uma explosão demográfica da terceira
idade (RAMOS, 1993).
O aumento da expectativa de vida despertou o interesse dos estudiosos com relação às
alterações fisiológicas decorrentes do avançar da idade. O envelhecimento é caracterizado por
um processo contínuo, durante o qual ocorre redução de diversas funções orgânicas. Estes
declínios se associam de forma negativa e significativa com a autonomia dos idosos em
realizar as atividades de vida diária (CARMELI E REZNICK, 1994; BAUMGARTNER et al,
1998;), e também a altos índices de doenças observados nesta população (PAFFENBARGER,
1991; BLAIR et al., 1995;), tendo como resultado um dramático aumento dos custos
assistenciais de saúde, além de importante repercussão social e grande impacto na economia.
6
3.2. Sistema músculo-esquelético em indivíduos idosos
Um dos sistemas orgânicos afetados com o envelhecimento é o músculo-esquelético, o
qual é envolvido em importantes funções corporais, tais como, capacidade de realizar
movimentos, contração muscular e locomoção. De fato, uma alteração que vem sendo cada
vez mais reconhecida em ter importantes conseqüências entre os idosos é a perda de massa
magra, particularmente a massa muscular esquelética.
Em 1960, Allen et al. publicaram um dos primeiros estudos demonstrando a redução
de massa muscular associada ao envelhecimento. Neste trabalho, os autores utilizaram a
quantidade total de potássio para estimar a quantidade de músculo. Atualmente, com a
introdução de novas técnicas, o tecido muscular pode ser mensurado mais diretamente e
estudos mais recentes evidenciam tendências similares. Young et al. (1985), utilizando a
técnica de ultra-sonografia encontraram redução de aproximadamente 35% na área de secção
transversa do músculo quadríceps em homens e mulheres idosos, quando comparados a
indivíduos adultos jovens. Outros estudos, utilizando a técnica de tomografia
computadorizada, demonstraram semelhantes reduções na área de seção transversa do
músculo psoas maior (IMAMURA et al, 1983), do quadríceps (OVERAND et al., 1992) e dos
flexores plantar (RICE, 1989). Em um estudo longitudinal, Frontera et al. (2000)
acompanharam por 12 anos indivíduos com idade média inicial de 65 anos, objetivando
avaliar as alterações no tamanho do músculo esquelético durante esse período. Os autores
verificaram, através de tomografia computadorizada, que a área de secção transversa de todos
os músculos da coxa juntos sofreram redução média de 14,7%, o músculo quadríceps femoral
de 16,1%, e os flexores do joelho apresentando um declínio de 14,9%, todos estatisticamente
significativos.
Utilizando tomografia computadorizada, foi evidenciado que, no decorrer do processo
de envelhecimento, além da de redução na área de secção transversa em um músculo da coxa
foi percebido também aumento no tecido adiposo intramuscular, caracterizando uma menor
“densidade” muscular (IMAMURA et al, 1983). Com relação aos efeitos do envelhecimento
sobre os diferentes tipos de fibra, é postulado que as fibras do tipo II sofrem um declínio mais
pronunciado, as quais perfazem uma média de 60% do tecido muscular de adultos jovens e
apenas 30 % em indivíduos que alcançaram 80 anos de idade, sendo esse declínio
significativamente associado à redução dos níveis de força muscular. De acordo com Kamel
(2002), as alterações no tecido muscular que acompanham o envelhecimento incluem:
7
- Decréscimo da massa muscular e da área de secção transversa;
- Infiltração de tecido gorduroso e conectivo no músculo;
- Decréscimo do tamanho e do número de fibras do tipo II;
- Decréscimo do número de fibras do tipo I;
- Desarranjo dos miofilamentos e das linhas Z dos sarcomeros;
- Decréscimo do número de unidades motoras.
Roubenoff et al. (1997) denominam as alterações na quantidade e qualidade muscular
que acompanham o envelhecimento de sarcopenia, terminologia essa que vem sendo
extensamente utilizada no campo científico especializado e trata-se de um foco de estudo que
encontra-se em evidência.
3.3. Sarcopenia
Em 1989, Rosenberg focalizou sua atenção em estudar o fenômeno da perda de massa
muscular que acompanha o avançar da idade e denominou esse processo de Sarcopenia.
“Sarco” vem do grego e denota músculo enquanto que “penia” indica deficiência, dessa
forma, Sarcopenia seria traduzida como “deficiência de músculo”, sendo atualmente essa
terminologia amplamente utilizada para se referir à perda gradual de massa muscular
esquelética e força que ocorre como decorrência do envelhecimento. A sarcopenia tem sido
associada a inúmeros problemas de saúde tais como, aumento do número de quedas, declínio
da capacidade funcional, osteoporose, disfunção da termorregulação e intolerância à glicose
(FIATARONE et al., 1994; KENNEY et al, 1995), e se não prevenida e/ou tratada, pode
tornar alterações fisiológicas do envelhecimento em uma condição patológica, com impacto
negativo na qualidade de vida e autonomia dos indivíduos afetados.
A transição da redução do tecido muscular fisiológica para a patológica não tem um
ponto de corte bem determinado, pois os dados disponíveis na literatura não são suficientes
para uma afirmação mais precisa. Entretanto, Baumgartner et al. (1998) definiram a
significância clínica da sarcopenia (patológica) como a massa muscular apendicular relativa
mais do que dois desvios padrões abaixo da média de um grupo referencial de indivíduos
jovens. A massa muscular apendicular corresponde ao somatório da massa muscular dos
braços e das pernas, e sua relativização se faz dividindo pela estatura (em metros) elevada ao
quadrado. A estatura ao quadrado no denominador do índice em questão elimina diferenças na
massa muscular apendicular absoluta sejam oriundas de diferenças na estatura. O ponto de
8
corte reportado no estudo de Baumgartner et al. (1998) foi uma massa muscular apendicular
relativa menor que 7,26 Kg/m
2
e menor que 5,45 Kg/m
2
para homens e mulheres,
respectivamente. Utilizando essa categorização, os autores relataram uma prevalência maior
que 50% em uma amostra de indivíduos com 80 anos de idade ou mais. A presença de
sarcopenia neste estudo se associou a um risco relativo aumentado em 3 a 4 vezes para o
desenvolvimento algum tipo de incapacidade, mesmo após ajuste para idade, sexo, obesidade,
etnia, status sócio-econômico e estilo de vida saudável.
Melton et al. (2000) utilizaram absotometria por raios x de dupla energia para estimar
a massa muscular de 669 indivíduos com idade superior a 65 anos, e relataram uma
prevalência de sarcopenia variando de 6 a 15%, adicionalmente, foi observado que os sujeitos
acometidos apresentavam mais limitações físicas e funcional quando comparados aos
indivíduos que não estavam acometidos. Embora a validade de uma abordagem para definir a
sarcopenia patológica ainda não tenha sido bem determinada, as evidências citadas por esses
autores demonstram o fato de que o fenômeno constitui uma ameaça à independência
funcional e a qualidade de vida de indivíduos idosos.
Uma vez que força muscular é estritamente relacionada à massa muscular, a
sarcopenia caracteriza-se também por uma concomitante redução na força (LINDLE, 1997).
Larsson et al. (1979) estudaram 114 homens com idade entre 11 e 70 anos e encontraram que
a força do quadríceps aumenta até aproximadamente os 30 anos de idade e decrescem mais
notadamente após os 50. Os autores concluíram que a perda de força foi devido a atrofia das
fibras musculares do tipo II. De fato, embora existam indicações de que a função muscular
reduz com o avançar da idade, grande parte da redução de força observada nos idosos se deve
a um decréscimo da massa muscular (EVANS, 1995). Muitos estudos, a maioria em cortes
transversais, demonstram o declínio de força tanto isométrica quanto dinâmica e a principal
causa direta desse fenômeno tem sido atribuída à perda de massa muscular decorrente do
envelhecimento (EVANS, 1996). Os dados mostram que a força muscular atinge o pico entre
a segunda e a terceira década de vida, e continuam relativamente estáveis até
aproximadamente os quarenta e cinco anos de idade no homem, e a partir deste momento as
perdas começam a acontecer de maneira consistente. Estima-se que após os cinqüenta anos de
idade ocorre redução no pico de força muscular dos membros inferiores em aproximadamente
10% a cada década (CAULEY, 1987). A média de perda de força muscular associada ao
envelhecimento varia de 20 a 40% (LARSON et al, 1979; MURRAY et al, 1985), e podem
atingir valores ainda mais altos (50% ou mais) em nonagenários (MURRAY, 1985).
9
Os poucos estudos longitudinais disponíveis relacionados a esta temática, confirmam a
alta taxa de perda da força muscular apresentada pelos idosos. Por exemplo, Bassey & Harries
(1993) relataram redução de 3% e 5% ao ano para homens e mulheres, respectivamente, no
que concerne a força de preensão manual no decorrer de quatro anos de acompanhamento.
Similarmente, Aniansson et al. (1986) demonstraram um declínio de 3,2% ao ano na força do
quadríceps, ao acompanhar 23 homens, com idade entre 73 e 86 anos, durante um período de
sete anos. Frontera et al. (2000) reexaminaram 9 dos 12 homens que participaram de um
estudo 12 anos mais cedo, e foi verificada redução na força isocinética variando de 9% para
extensão de cotovelo a 180 graus por segundo, e 30% para extensão de joelhos a 240 graus
por segundo. Essas mudanças foram acompanhadas por significativo decréscimo da área de
seção transversa do músculo, isto avaliado por tomografia computadorizada. Hughes et al.
(2001) estudaram longitudinalmente homens e mulheres que haviam participado de uma
pesquisa transversal dez anos antes. Os autores reexaminaram 64% dos indivíduos (68
mulheres e 52 homens) no que se refere à força dos músculos extensores e flexores dos
joelhos e dos cotovelos. Os declínios para os flexores e extensores do joelho foram
estatisticamente similares para ambos os sexos (11,8 vs 17,6% a cada década), entretanto, as
mulheres demonstraram substancialmente menores taxas de declínios para flexores e
extensores do cotovelo (2% a cada década) quando comparadas aos homens (12% a cada
década). Particularmente, esse estudo evidencia que pode haver diferenças entre homens e
mulheres quanto ao declínio de força muscular dos membros superiores. De fato, a maioria
absoluta dos estudos evidencia que o envelhecimento é acompanhado por uma redução
gradual e significativa de massa muscular e força (sarcopenia).
3.3.1. Fatores que se relacionam a sarcopenia
Múltiplos e inter-relacionados fatores contribuem para o desenvolvimento e
progressão da sarcopenia. Alterações na estrutura e na composição muscular estão ligadas ao
processo de declínio de força observado nos indivíduos idosos. Com o envelhecimento
observa-se uma perda de proteína contrátil e um aumento de tecido conjuntivo e gorduroso na
estrutura do músculo (RICE, 1989), o que confere uma menor qualidade contrátil e reduzida
produção de força para um mesmo tamanho de músculo. Estudos que realizaram biópsia do
músculo mostram que ocorre um decréscimo no número total de fibras, no tamanho das fibras
do tipo II (fibras rápidas) e atrofia muscular total (LEXELL, 1995). Em contrapartida, as
fibras do tipo I (fibras lentas) são menos afetadas durante o processo do envelhecimento
10
(DOHERTY et al, 1993; LEXELL, 1995; ROOS et al, 1997). A maioria desses estudos tomou
como amostra o músculo vasto lateral, e os resultados foram razoavelmente consistentes, com
as fibras do tipo II sofrendo reduções entre 20 e 50% a as fibras do tipo I entre 1 e 25%.
Entretanto, a determinação da taxa de declínio dos tipos de fibra é ainda uma dúvida, pois é
difícil neutralizar as variações existentes entre os indivíduos com relação à proporção de
fibras tipo I e II, adicionada a necessidade de avaliação em outros grupos musculares.
Um fator que contribui para o declínio do número de fibras musculares e redução da
massa muscular é a perda de motoneurônios. (DOHERTY et al., 1993). Estudos que
utilizaram eletromiografia (STALBERG, 1980) ou técnicas para estimar o número de
unidades motoras (DOHERTY, 1995) demonstraram perdas substanciais das unidades
motoras ativas em músculos das extremidades superiores e inferiores (DE KONING et al.,
1988; DOHERTY E BROWN, 2002). Essas diminuições relatadas são da ordem de 50% para
músculos da região tênar - hipotênar, e bíceps braquial (DOHERTY et al, 1993; BROWN et
al., 1988). Nenhum estudo longitudinal examinou este processo, mas estudos transversais
sugerem que o número de unidades motoras se mantém relativamente estáveis até os setenta
anos de idade, e em seguida começam a declinar consistentemente (CAMPBELL et al., 1973;
McCOMAS, 1991). Parece que as reduções são mais significativas nas unidades motoras
compostas por fibras rápidas (tipo II) quando comparadas às fibras lentas. Especula-se que
com o avançar da idade as fibras musculares vão continuamente sofrendo desenervação e
reenervação, levando a uma perda de motoneurônios (KAMEL, 2002). Este processo parece
ser um dos mais importantes em contribuir para a redução do volume muscular verificado no
envelhecimento, porém, o que causa esse declínio de unidades motoras é ainda uma questão
que precisa ser mais estudada.
O relacionamento entre sarcopenia e hormônios mediadores tem sido tema de algumas
pesquisas recentes (BRODSKY et al., 1996; SHORT & NAIR, 1999; KAMELL et al., 2002).
Os níveis séricos de testosterona e andrógenos adrenais declinam com a idade (TENOVER et
al., 1987), e existem dados epidemiológicos que dão suporte à relação existente entre a queda
da testosterona e o declínio da massa e força muscular (BAUMGARTNER et al., 1998).
Nesse sentido, a reposição de testosterona tem demonstrado aumentar a massa muscular e a
força de homens idosos (URBAN et al., 1995). O declínio do estrógeno verificado em
mulheres após a menopausa é bem estabelecido, e este hormônio pode ter importante efeito
anabólico no músculo esquelético, possivelmente como resultado de sua conversão em
testosterona (ROUBENOFF & HUGHES, 2000).
11
É evidenciado na literatura que o envelhecimento é associado a uma diminuição
ingestão total de alimentos, e este processo é considerado um importante fator no
desenvolvimento e progressão da sarcopenia (MORLEY, 2001). Os complexos mecanismos
que levam ao declínio no consumo de alimentos com o avançar da idade foi recentemente
revisado (MORLEY, 2001), sendo apontado como prováveis mecanismos sensação de
saciedade precoce, aumento nos níveis de leptina, e possíveis efeitos de neurotransmissores
como os opióides e neuropeptideos. Permanece obscuro o quanto esta redução de apetite
contribui para o desenvolvimento da sarcopenia.
Inatividade física é outro fator importante em contribuir para o desenvolvimento da
sarcopenia. A reduzida massa muscular verificada nos idosos tem sido atribuída, em parte, aos
menores níveis de atividade física observados nessa população (HASKELL, 1985). De fato, é
bem constatado na literatura que indivíduos idosos menos ativos apresentam menor massa
muscular e maior incapacidade de realizar atividades da vida diária quando comparados a seus
congêneres mais ativos (PORTER et al., 1995; EVANS, 2002). Resultados de inúmeros
estudos demonstraram que os exercícios resistidos podem prevenir, amenizar e até reverter a
sarcopenia, provendo evidências de que existe uma relação importante e positiva entre
atividade física, massa muscular e força (FIATARONE et al., 1990; PORTER et al, 1995;
EVANS, 2002).
3.3.1.1. Influência do treinamento resistido na progressão da Sarcopenia
Estudos demonstram expressivos aumentos de força como decorrência do treinamento
resistido aplicado em idosos (FRONTERA et al., 1988; FIATARONE et al., 1990; PORTER
et al, 1995; EVANS, 2002). Por exemplo, em um grupo de indivíduos idosos (idade variando
entre 60 e 72 anos) foram observados os efeitos do treinamento resistido realizado três vezes
por semana e com duração de 12 semanas (FRONTERA et al., 1988). A intensidade adotada
pelos autores foi de 80% de uma repetição máxima (RM), sendo esta sobrecarga ajustada no
decorrer do treinamento para que o estímulo se mantivesse adequado durante o estudo. Todos
os grupos musculares exercitados sofreram significativo aumento de força dinâmica
mensurado através de 1RM, sendo esse da ordem de 116,7% para os músculos extensores do
joelho e 226,7% para os flexores do joelho. Os autores relataram um aumento variando entre
3,4 a 6,7 % (a depender do grupo muscular analisado) para cada dia de treinamento realizado.
Adicionalmente, foi evidenciado aumento significativo de força quando a mensuração foi
realizada através de um dinamômetro isocinético.
12
Brown et al. (1990) realizaram um estudo com o objetivo de averiguar achados
similares ao de Frontera et al. (1988), aplicando treinamento resistido em 14 indivíduos
saudáveis com idade entre 60 e 70 anos, e sem experiência previa nesse tipo de exercício.
Nesse estudo, os indivíduos treinaram apenas um dos braços, dessa forma tornando
desnecessária a presença de um grupo controle. O treinamento era realizado em três dias
semanais de forma alternada durante 12 semanas, e com intensidade progressiva, iniciando
com 50% de 1 (RM) e evoluindo para entre 70 a 90% no decorrer do estudo. Ao final do
estudo, Brown et al. (1990) evidenciaram que o braço treinado demonstrou um significativo
aumento de força muscular (mensurado através de 1RM), quando comparado ao braço não
treinado (controle). Em adição, os autores verificaram quantas repetições era possível fazer
com a mesma carga absoluta em que os indivíduos conseguiram fazer apenas uma (1RM)
antes do treinamento, e observaram que após a intervenção, a amostra estava apta para
realizar entre 7 a 19 repetições, demonstrando assim um importante aumento da resistência
muscular.
As pesquisas apresentadas nos parágrafos anteriores e inúmeras outras (FIATARONE
et al., 1990; PORTER et al, 1995; EVANS, 2002) demonstram a efetividade do treinamento
resistido em aumentar os níveis de força dos indivíduos com idade avançada, entretanto, a
intensidade adequada para que essas adaptações ocorram ainda não é totalmente conhecida.
Nesse sentido, Kalapotharakos et al. (2004) delinearam um estudo com o objetivo de
determinar os efeitos de diferentes intensidades de treinamento resistido sobre a força
muscular de indivíduos idosos. A amostra desse experimento foi composta por 33 homens e
mulheres que se encontravam fisicamente inativos, e com idade compreendida entre 60 e 74
anos. Esses voluntários foram direcionados, de forma randomizada, a um de três grupos
possíveis: treinamento em alta intensidade, moderada intensidade ou grupo controle (sem
exercícios). As cargas prescritas foram de 80% e 60% de 1RM, respectivamente, para os
grupos de alta e baixa intensidade, e a intervenção teve duração de 12 semanas e com uma
freqüência semanal de três vezes. Os autores evidenciaram que ambos os grupos que
realizaram os exercícios (alta e moderada intensidade) sofreram significativos aumentos de
força muscular mesurado através de 1RM como também através de um dinamômetro
isocinético, entretanto, os que realizaram o treinamento em alta intensidade demonstraram
aumentos significativamente maiores quando comparado ao grupo que realizou o treinamento
em moderada intensidade.
Embora a segurança e os resultados do treinamento resistido em idosos aparentemente
saudáveis tenha sido demonstrada (FRONTERA et al., 1988; KALAPOTHARAKOS et al.
13
2004), intervenções similares em idosos frágeis e pertencentes a uma faixa etária mais velha
ainda precisa ser melhor estudada. Fiatarone et al. (1990) recrutaram dez voluntários de um
centro de reabilitação, os quais apresentavam uma média de idade situada em 90,2 anos e
foram submetidos a oito semanas de treinamento resistido de intensidade alta (iniciando em
50% e evoluindo para 80% de 1RM). Nove dos 10 voluntários completaram o programa de
treinamento, sendo um indivíduo excluído por sugestão dos pesquisadores, devido a uma
sensação de estar sobrecarregando a região inguinal a qual tinha sido operada anteriormente.
Ganhos de força foram altamente significativos para todos os sujeitos, apresentando um
incremento médio (avaliado por 1RM) de 174% para extensão do joelho. Dessa forma,
Frontera et al. (1990) concluíram que o treinamento resistido se mostrou seguro e eficaz para
ganhos de força, mesmo em se tratando de indivíduos nonagenários.
O fato de o treinamento resistido aprimorar a força muscular de indivíduos idosos é
bem estabelecido na literatura, entretanto, os fatores que explicam esse processo apresentam
alguma controvérsia. Segundo Moritani & DeVries (1980), os aumentos de força decorrentes
do treinamento resistido em indivíduos jovens se dão inicialmente devido a uma ativação
neural mais eficiente (adaptações neurais), com a hipertrofia muscular respondendo a partir da
quarta semana de treinamento. De acordo com os citados autores, o efeito do treinamento
resistido em aumentar a força muscular nos idosos são inteiramente explicado por adaptações
neurais, enquanto que a hipertrofia não acontece nessa população. Porém, outros estudos mais
recentes (FRONTERA et al., 1988; FIATARONE et al., 1990; BROWN et al.,1990;
KALAPOTHARAKOS et al. 2004) demonstram a possibilidade da hipertrofia muscular
acontecer em idosos como efeito do treinamento resistido. Por exemplo, Frontera et al. (1988)
evidenciaram aumento de 10 a 11% na área muscular total após 12 semanas de treinamento
resistido, sendo a avaliação realizada através da Tomografia Computadorizada. Em 1990,
Fiatarone et al. evidenciaram que a hipertrofia muscular acontece mesmo em nonagenários
que foram submetidos ao treinamento resistido. A idéia de os ganhos de força em idosos se
dever essencialmente a adaptações neurais são oriundos de dados baseados em estimativas de
mensurações antropométricas, entretanto, ao se utilizar técnicas mais sensíveis para avaliar
massa muscular (tomografia computadorizada), a hipertrofia muscular aparece como
explicação de parte dos ganhos de força que ocorrem como resultado do treinamento resistido
em idosos.
O treinamento resistido tem sido apontado como a mais efetiva intervenção no sentido
de restaurar a redução de massa muscular e força características de um quadro de sarcopenia,
14
e tem sido proposto que idosos constituem o grupo de indivíduos mais beneficiado pela
prática regular dessa modalidade de exercícios (EVANS, 2002).
3.3.2. Implicações da sarcopenia
O quadro da Sarcopenia deve ser observado como uma problemática a ser prevenida
ou tratada, pois tem efeito negativo sobre funções fisiológicas dos idosos. Algumas das
funções orgânicas que sofrem declínio com o avançar da idade se relacionam direta ou
indiretamente com a perda de massa muscular e força, sendo as principais discutidas nas
próximas seções dessa revisão.
3.3.2.1. Atividades de vida diária
Os níveis reduzidos de força muscular característico do quadro de sarcopenia parecem
ter impacto na mobilidade e na eficiência em realizar as atividades de vida diária dos idosos.
De fato, estudos demonstram que a sarcopenia tem efeito negativo na execução das atividades
de vida diária dos indivíduos idosos. Dados do estudo de Framingham (JETTE & BRANCH,
1981) indicam que 65% das mulheres com idade situada entre 75 e 84 anos não foram aptas a
levantar um peso de 4,5Kg. Adicionalmente, um alto percentual dessa população relatou que
não eram capazes de realizar algumas das atividades domésticas usuais. Por outro lado,
Bendall et al. (1989) relataram associação significativa entre força de panturrilha e velocidade
de caminhada, demonstrando que ambos declinam com o avançar da idade, enquanto Bassey
et al. (1992) encontraram uma relação positiva e significativa entre a força do quadríceps e as
funções de levantar de uma cadeira, subir um lance de escadas e também à velocidade de
caminhada, atividades essas comuns na rotina dos idosos. Corroborando com esses achados,
Alexander et al. (1992) demonstraram que mulheres idosas com baixos níveis de força
muscular dos membros inferiores apresentam dificuldade em levantar de uma cadeira.
O risco de quedas é uma preocupação constante no dia a dia dos indivíduos mais
velhos, sendo associado positivamente com os níveis de força dessa população. Nesse sentido,
Whipple et al. (1987) compararam a da força da musculatura dos membros inferiores de
idosos com histórico de quedas com um grupo controle de idade similar, evidenciando que a
força dos músculos avaliados se mostrou significativamente menor nos indivíduos com
histórico de quedas comparado aos que não apresentavam esse histórico. Nesse mesmo
sentido, foi evidenciado que níveis reduzidos de força de membros inferiores foi associado a
15
uma necessidade de acompanhamento residencial em indivíduos idosos (HUBERT et al.,
1993), significando que os idosos com baixa força muscular tendem a perder autonomia para
realização das tarefas diárias.
Como o treinamento resistido parece preservar ou mesmo restaurar a força muscular
dos idosos, tem sido proposto como intervenção capaz de afetar positivamente nas atividades
rotineiras desses indivíduos. Dessa forma, Rabelo et al. (2004) buscaram examinar os efeitos
de 10 semanas de treinamento resistido na habilidade de mulheres idosas (entre 60 e 76 anos
de idade) em realizar tarefas que simulam atividades da vida diária e observaram que ocorreu
significativo aprimoramento na maioria dessas atividades, sugerindo que o tratamento adotado
é capaz de afetar positivamente na autonomia dos idosos, colaborando para uma menor
morbidade dessa população.
3.3.2.2. Sarcopenia e densidade mineral óssea (DMO)
Evidências indicam uma possível relação entre massa muscular e DMO, com
resultados de estudos transversais demonstrando correlações positivas e significantes entre
força muscular e densidade mineral óssea de variadas regiões corporais (JACOBSON et al.,
1984; SILVERSTAIN & CONNOR, 1994). Silverstain & Connor examinaram associações
entre a força muscular de preensão manual e DMO em 649 mulheres em condição pós-
menopausa e com idade maior ou igual a 65 anos, as quais tiveram a DMO mensurada através
do DXA (do inglês, dual-energy x-ray absorptiometry). Com base nos resultados obtidos, foi
evidenciado que a força de preensão manual associou-se não só a DMO do punho, estrutura
óssea adjacente aos músculos envolvidos nessa contração, como também com a DMO de
regiões mais distantes como, por exemplo, o quadril. Mesmo após ajuste para diferentes co-
variáveis (tempo em menopausa, nível de atividade física, reposição de estrógeno), a
significativa associação entre força e DMO não foi eliminada, demonstrando tratar-se de um
fator independente em predizer a DMO de determinadas regiões corporais.
Dessa forma, percebe-se que é muito provável que os baixos níveis de massa muscular
e força presente no quadro da sarcopenia refletem em diminuição da densidade mineral óssea.
Entretanto, há necessidade de mais estudos no sentido de verificar se os efeitos são devidos
aos níveis de atividade física, ou se são provenientes da força muscular propriamente dita.
16
3.3.2.3. Efeitos na temperatura corporal
Outra conseqüência da sarcopenia é o efeito na temperatura corporal e no processo da
termorregulação. Há evidências de que o declínio de massa muscular influencia a temperatura
corporal frente a ambientes frios e quentes (TONER et al., 1986). Em ambientes de
temperatura elevada, o decréscimo da massa muscular é associado a um aumento da
temperatura interna, proporcionando uma maior sobrecarga orgânica no intuito de manter a
homeostase (DAVY E SEALS, 1994). Em ambientes frios, a pouca massa muscular resulta
em um deficiente isolamento periférico, tornando os idosos mais sensíveis à baixa
temperatura (TONER et al., 1986).
3.3.2.4. Tolerância à glicose
Dados do National Health Interview Survey (NHIS, 1991) mostraram que a
prevalência de Diabetes foi de 1,3% em indivíduos com idade situada entre 18 e 44 e maior
que 10% naqueles com 65 anos de idade ou mais, evidenciando claramente uma maior taxa
entre os idosos. Com relação ao Diabetes tipo II, a incidência entre 1990 e 1992 foi de 1,79 e
8,63 por 1000 habitantes dos Estados Unidos para indivíduos com idade entre 25 e 44 e entre
65 e 74, respectivamente, reforçando a existência de risco aumentado entre as pessoas com
idade avançada.
O músculo esquelético é o tecido que responde primariamente pelo “turn over” da
glicose sanguínea, e nesse sentido, é sugerido que a perda de massa muscular resultante do
envelhecimento apresente alguma associação com a intolerância a glicose e/ou Diabetes tipo
II. Pelo menos teoricamente, a sarcopenia tem efeitos na habilidade da insulina em transportar
a glicose do sangue para o interior das células, uma vez que menor quantidade de músculo
está disponível para consumir e armazenar (em forma de glicogênio) essa glicose. Nesse
sentido, Bloesch et al. (1988) investigaram associações entre alterações da composição
corporal decorrente do envelhecimento com tolerância a glicose em 24 indivíduos, sendo 12
jovens (25 +/-1 anos de idade) e 12 idosos (73 +/-1 anos de idade). Entre jovens e idosos foi
observado similaridade no que concerne à massa corporal, entretanto, com os idosos
apresentando percentual de gordura corporal significativamente maior que seus congêneres
mais jovens. Adicionalmente, os idosos foram classificados como intolerantes a glicose grau
leve, com o valor de glicemia após ingestão de 75 gramas de carboidrato significativamente
17
maior que o grupo dos jovens. Os autores atribuíram essa deterioração do metabolismo
glicídico, em parte, à menor massa livre de gordura verificada nos idosos.
Baseados nessas relações, estudos têm sido conduzidos com intuito de verificar se, em
pessoas idosas, o treinamento resistido e o subseqüente aumento de massa livre de gordura
pode aprimorar a tolerância a glicose. Nesse sentido, Craig et al. (1989) demonstraram que 12
semanas de treinamento resistido não produziram melhora significativa na tolerância a glicose
em idosos, entretanto, induziram uma liberação de insulina frente a carga de glicose
significativamente menor após o treinamento. Nessa mesma linha de pesquisa, Miller et al.
(1984) relataram que a tolerância a glicose não se mostrou alterada após um programa de
treinamento resistido, porém, a concentração basal de insulina plasmática se mostrou
significativamente mais baixa (37,5 %) bem como a área abaixo da curva de insulina (outro
parâmetro de resposta à glicose), sendo esses aprimoramentos significativamente
correlacionados ao aumento de massa muscular resultante da intervenção.
O processo de envelhecimento está associado a maior risco para complicações no
metabolismo da glicose e Diabetes tipo II, e a redução da massa muscular parece estar
evolvida nessa relação. Entretanto, futuras pesquisas são necessárias para melhor estabelecer
tais associações, bem como melhor entender a possível prevenção e tratamento através do
treinamento resistido, uma vez que essa intervenção parece reverter parcialmente a redução da
massa muscular.
3.3.2.5. Taxa metabólica basal
A massa livre de gordura responde por grande parte da taxa metabólica em situação de
repouso (TATARANI & RAVUSSIN, 1995). Por outro lado, durante o processo de
envelhecimento, observa-se um declínio gradual na energia necessária para sustentar as
atividades basais (i.e. taxa metabólica basal), dessa forma, levantando a hipótese de que a
perda do tecido metabolicamente ativo, ou seja, tecido muscular, seja um dos fatores
determinantes desse processo. Nesse sentido, Tzankoff & Norris (1978) constataram que a
excreção de creatinina durante o período de 24 horas (um índice de massa muscular) foi
estritamente relacionada à taxa metabólica de repouso. Mais recentemente, com o intuito de
observar essa possível relação, Poehlman et al. (1993) avaliaram taxa metabólica e massa
magra em 183 mulheres saudáveis (idade entre 18 e 81 anos) demonstrando que ambos
declinam com o avançar da idade. Adicionalmente, os autores relataram que o declínio da
taxa metabólica foi explicado primariamente pela perda de massa livre de gordura,
18
confirmando assim uma relação positiva entre ambos. Além do efeito termogênico da
alimentação e da atividade física, o gasto energético diário é diretamente influenciado pela
taxa metabólicas basal, sendo assim, as reduções descritas anteriormente terão efeitos diretos
no gasto calórico, o que pode induzir a um acúmulo de tecido adiposo nos idosos
(POEHLMAN et al., 1993), aumentando o risco para o desenvolvimento de doenças crônicas
como o Diabetes tipo II, a Hipertensão Arterial e a Doença Arterial Coronariana.
Os dados indicam que a preservação da massa muscular e prevenção da sarcopenia
podem ajudar a minimizar o declínio da taxa metabólica de repouso, enfatizando a
importância de intervenções que minimizem esses declínios por afetarem positivamente a
saúde e a qualidade de vida dessa população.
3.3.2.6. Efeitos sobre a capacidade funcional
O consumo máximo de oxigênio (VO
2
max) é tradicionalmente aceito como um bom
indicador da capacidade funcional (COSTILL et al., 1973). Esta variável, geralmente expressa
de forma relativa à massa corporal (ml.Kg.min
-1
), declina com o avanço da idade a partir da
segunda década de vida, sendo sua magnitude dependente de fatores genéticos, bem como dos
níveis de atividade física realizado pelo indivíduo (FLEG & LAKATA., 1988).
Esse processo é em parte atribuído a limitada capacidade do coração senescente em
gerar altos valores de débito cardíaco máximo, bem como à reduzida extração de oxigênio por
parte da musculatura esquelética (reduzida diferença arteriovenosa de oxigênio) (HAGBERG
et al., 1985). Por outro lado, Fleg & Lakata (1988) demonstraram que a redução do VO
2
max
decorrente do envelhecimento é também explicada pela perda de tecido metabolicamente
ativo (i.e. massa muscular) observado na Sarcopenia. Os citados autores determinaram a
massa muscular através da excreção urinária de creatinina, e encontraram uma correlação
positiva e significativa entre esse índice e o VO
2
max tanto nos homens como nas mulheres.
Proctor & Joyner (1997) estudaram possíveis relações entre a redução da capacidade aeróbia e
massa muscular esquelética em idosos, e foi observado que, quando o VO
2
max era expresso
em função da massa corporal total havia uma diferença de 26% quando se comparava idosos a
jovens, entretanto, essa diferença diminuía para apenas 13% quando o consumo máximo de
oxigênio era expresso relativo à massa muscular apendicular, e para 11% quando expresso
relativo à massa muscular dos membros inferiores. Dessa forma, os autores evidenciaram que
os reduzidos níveis de VO
2
max observados nos idosos sofrem influência de alterações da
composição corporal, as quais são caracterizadas por perda de massa muscular. Dados
19
encontrados na literatura demonstram a possibilidade da sarcopenia afetar negativamente a
capacidade funcional dos indivíduos idosos, porém, para um melhor entendimento e
confirmação dessa relação, novas pesquisas são necessárias.Embora os estudos sejam
consistentes em mostrar que o envelhecimento é acompanhado por reduções na massa
muscular e força, e que este processo traz uma série de implicações negativas à qualidade de
vida do idoso, a etiologia da sarcopenia permanece obscura. Sabe-se hoje que fatores
genéticos contribuem de maneira significativa para a variabilidade de massa muscular e força
(ARDEN E SPECTOR, 1997), bem como força de preensão manual em idosos
(FREDERIKSEN et al., 2002) e ao decréscimo de força decorrente do envelhecimento
(CARMELLI, 2000).
3.3.3. Fatores genéticos e sarcopenia
Foi relatado nas seções anteriores dessa revisão que a etiologia da sarcopenia ainda
não é totalmente conhecida, mas parece não depender de apenas uma variável e sim de uma
influência multifatorial e da inter-relação desses fatores. Sabe-se atualmente que o
componente genético contribui de maneira significativa para a variabilidade de massa
muscular e força (ARDEN & SPECTOR, 1997), e para o decréscimo de força decorrente do
envelhecimento (CARMELLI & REED, 2000).
A maioria dos estudos que analisou a contribuição genética da variação individual dos
fenótipos massa e força muscular é baseada em dados de núcleos familiares e de irmãos
gêmeos, apresentando em seus resultados evidências sólidas de um significativo componente
genético. Nesse sentido, Arden e Spector (1997) delinearam um estudo objetivando examinar
a hereditariedade das variáveis massa magra e força muscular em mulheres pós-
menopausadas e aparentemente saudáveis. A amostra foi composta por 353 pares de gêmeas
com idade situada entre 45 e 70 anos, dos quais 227 pares eram de gêmeas univitelíneas e 126
pares de gêmeas bivitelíneas. Foi mensurada a massa magra total desses voluntários através
do DXA, e, força de preensão manual e do quadríceps utilizando técnicas que apresentara
reprodutibilidade satisfatória. De acordo com as análises realizadas, as variáveis apresentaram
uma correlação significativamente mais alta para as gêmeas univitelíneas quando comparadas
às bivitelíneas. Os resultados mostraram um componente genético significativo, com a
hereditariedade estimada em 0.52 para massa magra, 0,46 para força de quadríceps, e 0,30
para força de preensão manual (todos com P < 0,05). A estimativa hereditária não demonstrou
alteração após ajuste para idade, estatura, peso corporal, ou nível de atividade física habitual,
20
o que implica em um componente genético independente para as variáveis estudadas. Com
base nos dados obtidos, os autores demonstraram que fatores genéticos explicam 50% da
variação de massa magra total das participantes, que vale salientar, eram de origem
Caucasiana. Finalmente, esse clássico estudo concluiu que fatores genéticos explicam, em
parte, a variação existente na massa magra e na força muscular da amostra estudada.
Em um estudo longitudinal, Carmelli e Reed (2000) buscaram investigar a influência
de fatores genéticos no decréscimo da força de preensão manual. A amostra foi composta por
152 pares de gêmeos saudáveis (77 univitelíneos e 75 bivitelíneos), dos quais força manual foi
mensurada no início do estudo e aproximadamente 10 anos depois, através de um
dinamômetro mecânico ajustável, e tomando como resultado para análise o maior valor
decorrente de três tentativas. No início da pesquisa, em 1985/86, a força absoluta média foi de
40,8 +/- 8,8 Kg, e no final do acompanhamento, em 1995/97, foi de 39.8 +/- 8.8 Kg, o que
representa um declínio absoluto de 1.05 +/- 6.8 Kg no decorrer dos 10 anos, sendo esse valor
bastante significativo (P = 0.003). Fazendo uma análise em termos percentuais, o declínio
médio da força foi de 0.26% a cada ano, e observando por faixa etária, foi evidenciado que os
indivíduos mais velhos apresentaram os menores níveis de força. Os dados examinados em
conjunto reforçam a existência do declínio de força como decorrência do avançar da idade.
Corroborando com os achados de Arden e Spector (1997), esse estudo identificou que os
fatores genéticos contribuem com uma influência de 35% na redução de força de preensão
manual apresentado pelos participantes, evidenciando que a manutenção da força durante o
envelhecimento de fato apresenta um significativo componente genético.
Recentemente foi publicado mais um artigo que também teve como propósito
investigar a contribuição genética na variável força muscular em indivíduos idosos (TIAINEN
et al., 2004). A variável dependente (força muscular) foi mensurada em 97 pares de gêmeas
univitelíneas e em 102 pares de bivitelíneas, as quais apresentavam idade variando entre 63 e
76 anos. O grupo das univitelíneas não demonstraram diferenças significativas com relação a
idade, peso corporal, e estatura quando comparadas às bivitelíneas. As análises realizadas
evidenciaram um significativo componente genético para força manual e de extensão do
joelho, explicando 14% da variação de força manual, e 31% da força de extensão do joelho.
De acordo com os estudos citados nos parágrafos anteriores, o artigo em questão demonstra
que força muscular é uma variável que está sob regulação genética.
Dessa forma, é observado na literatura que, devido a influência genética, alguns
indivíduos estão mais propensos a apresentarem menores níveis de força e de massa muscular
como efeito do envelhecimento, fato esse que potencializa o risco de complicações de saúde,
21
e de dependência na realização das atividades diárias. A descoberta de genes que
desempenhem relevante função relacionada a características musculares está sob investigação.
A detecção de genes associados ao desenvolvimento da sarcopenia, por exemplo, permitirá a
identificação precoce de indivíduos com predisposição, possibilitando a intervenção
antecipada com o objetivo de prevenir ou pelo menos retardar o aparecimento desse quadro
indesejável. Estudos dessa natureza podem ter importante repercussão no sentido de melhorar
a qualidade de vida dos idosos e reduzir custos assistenciais de saúde.
3.4. Genes relacionados à massa muscular e força
Embora o significativo componente genético dos fenótipos força e massa muscular
sejam bem aceito pela comunidade científica, a contribuição de genes específicos é algo mais
complexo e que ainda precisa de estudos futuros para melhores esclarecimentos. Atualmente
essa temática atrai a atenção de números cada vez maiores de pesquisadores, mas os dados
disponíveis são ainda escassos. Os primeiros trabalhos relacionados à detecção de um gene
candidato dizem respeito a estudos de associação para testar genes com proteínas codificadas
que apresentam relevância fisiológica nos mecanismos que levam ao quadro de sarcopenia.
O polimorfismo do marcador ApaI (G/A) no gene IGF2 (do inglês, insuline-like
growth factor 2) e sua associação à força de preensão manual foi o tema do estudo de Sayer et
al.(2002), que contou com uma amostra composta por 397 homens e 296 mulheres com idade
entre 64 e 74 anos, que tiveram força de preensão manual mensurada. Amostras de sangue dos
indivíduos foram coletadas para que a extração do DNA e genotipagem fossem realizadas. Os
alelos foram codificados em G ou A, dando origem a três grupos: GG, GA e AA. O genótipo
GG apresentou força de preensão manual significativamente menor que nos homens de
genótipo AA, entretanto, resultados similares não foram encontrados com relação às
mulheres.
Folland et al. (2000) estudaram a influência do gene da enzima conversora de
angiotensina (ACE) sobre a resposta do músculo quadríceps a um programa de treinamento de
força em 33 homens com idade entre 18 e 30 anos. Indivíduos portadores da deleção (D)
mostraram resposta ao treinamento significativamente maior que os homozigotos II
(inserção).
Roth et al. (2001) examinaram a associação entre os genótipos no gene CNTF (do
inglês, ciliary neutrophic factor) e fenótipo força muscular em 494 indivíduos saudáveis. Os
sujeitos portadores do genótipo G/A apresentaram significativamente mais força que os
22
indivíduos G/G. Em indivíduos idosos, o polimorfismo no colágeno tipo I alfa1 Sp1
(COL1A1), num estudo conduzido por Van Pottelbergh et al. (2001), se associou a força
muscular dos membros superiores. A presença do alelo “s” foi relacionada a menor força de
preensão manual e do bíceps. Algumas variações polimórficas do gene da myostatina foram
observadas e testadas para o fenótipo força em 286 mulheres, e o alelo R153 foi associado a
menor força muscular (SEIBERT et al., 2001).
3.5. Gene receptor de vitamina D (VDR) e suas relações com fenótipos musculares
3.5.1. Vitamina D, massa e força muscular
Um fator que está associado ao declínio da função muscular em decorrência do
avançar da idade é o status de vitamina D, com baixos níveis plasmáticos associados à
fraqueza muscular e atrofia das fibras musculares do tipo II (JANSSEN et al., 2002; PFEIFER
et al., 2002).
Indivíduos idosos estão propensos a desenvolver deficiência de vitamina D devido a
alguns fatores de risco evidenciados durante o envelhecimento, como por exemplo, redução
da ingestão alimentar, diminuição da exposição ao sol, menor espessura da pele, absorção
intestinal reduzida e comprometimento da hidroxilação no fígado e nos rins (JANSSEN et al.,
2002). Exemplificando, Vander Wielen et al. (1995) avaliaram 824 indivíduos com idade
superior a 70 anos, e identificaram que 36% dos homens e 47% das mulheres apresentaram
níveis séricos de 25-hydroxyvitamin D
3
[25(OH)D
3
] menor que 30 mmol/L.
Por outro lado, a deficiência de vitamina D é associada à fraqueza muscular,
manifestada por sensação de cansaço precoce, dificuldades em subir escadas e em levantar da
cadeira (MINGORNE et al., 1999; PRABHALA et al., 2000). O status de vitamina D
relaciona-se também a atrofia muscular, especialmente das fibras tipo II (JANSSEN et al.,
2002). Rimaniol et al. (1994) acompanharam o tratamento de uma mulher de 72 anos de
idade, que chegou ao hospital com fraqueza muscular geral e hipotonia, e apresentava baixo
nível sérico de vitamina D3. A intervenção foi a base de infusão de 25-hydroxyvitamin D
3
[25(OH)D
3
] (vitamina D3), 50 microgramas por dia. Dois meses depois os níveis séricos de
vitamina D3 estavam normais e a paciente podia andar sem ajuda, o que não era possível no
início do acompanhamento. Os autores concluíram que o status de vitamina D deve ser
monitorado em pacientes idosos com sintomas musculares. Bischoff et al. (1999) tiveram
como objetivo identificar a relação entre a perda de força muscular apresentada pelos idosos e
a deficiência de vitamina D. Os autores contaram com uma amostra de 319 indivíduos (103
23
mulheres e 216 homens), onde os homens apresentavam idade média de 76.7 anos e as
mulheres 74.2. Foram mensurados dos voluntários: potência dos músculos extensores do
joelho e metabólitos da vitamina D (25-hydroxivitamina D e 1,25-hydroxivitamina D). Foi
identificado que 12% dos homens e 18% das mulheres apresentaram valores de 25-
hydroxivitamina D abaixo do normal (< 12ng/ml). Em homens, esse metabólito da vitamina D
foi significativamente correlacionado com a potência dos músculos extensores do joelho
(P=0.004), enquanto que o 1,25-hydroxyvitamina D associou-se a potência muscular em
ambos os sexos (homens P = 0.045; e mulheres P = 0.034). Os autores do citado estudo
concluíram que a deficiência de vitamina D parece contribuir para a redução de força
muscular observada durante o processo de envelhecimento, e juntamente com resultados
citados anteriormente, retratam evidencias nítidas da importância da vitamina D no tecido
muscular. A atividade biológica da forma hormonal ativa da vitamina D (1,25-
dihydroxyvitamin D
3
) é mediada em grande parte, se não inteiramente, pelo receptor de
vitamina D (VDR), um membro da superfamília de receptores hormonais nucleares
(WHITFIELD et al., 2001).
3.5.2. Gene VDR e alguns dos seus polimorfismos
O gene responsável pela síntese da proteína VDR está localizado no cromossomo 12,
foi clonado inicialmente por Baker et al. (1988), e teve sua estrutura organizacional melhor
descrita mais recentemente por Miyamoto et al. (1997). O citado gene possui uma longa
região não traduzida 3’, onde algumas variações genéticas comuns vem sendo identificadas
em humanos. A maioria dos polimorfismos estudados até o momento são mutações e/ou
deleções ocorridas dentro de introns desta região, como por exemplo, os polimorfismos BsmI
(MORRISON et al., 1992) e o ApaI (FARACO et al., 1989), detectadas pelas enzimas de
restrição BsmI e ApaI, respectivamente. Essas variações genéticas parecem não alterar a
seqüência de aminoácidos da proteína prevista, entretanto, existe a possibilidade de estarem
em desequilíbrio de ligação com algum outro fator genético ou alterarem a estabilidade do
RNAm (MORRISON et al., 1992; GOMEZ ALONSO et al., 1998; VAN DEN OORD et al.,
2004).
Ao contrário dos polimorfismos acima (BsmI e ApaI), o polimorfismo TaqI é
resultante de uma mutação em uma região transcritora, caracterizada pela troca da Timina por
Citosina (polimorfismo T/C) localizado no exon IX do gene VDR. No entanto, a troca dessas
bases nitrogenadas não altera o aminoácido a ser sintetizado, pois tanto os códons ATT
24
quanto ATC são relativos à Isoleucina (MORRISSON et al., 1992), gerando uma mutação
silenciosa, sem alterações funcionais aparentes na proteína prevista.
Um polimorfismo resultante da transição T-C dentro do exon 2 do gene VDR altera o
local de início da tradução e causa uma modificação na seqüência da proteína prevista
(GROSS et al., 1996). Esse polimorfismo cria um códon de iniciação (ATG) três códons
acima, e pode ser definido utilizando-se a enzima de restrição endonuclease FokI. A presença
do local FokI, definido como “f”, faz com que a proteína VDR seja produzida de forma
completa (427 aminoácidos), enquanto que a ausência do local FokI, definido como “F”,
inicia a tradução de outro local e sintetiza uma versão levemente truncada da proteína VDR,
com três aminoácidos a menos (424 aminoácidos) (GROSS et al., 1996). Whitfield et al.
(2001) avaliaram a significância funcional dos genótipos relacionados ao local de restrição
FokI, e demonstraram evidências de que os indivíduos com ausência desse local (“F”) tinham
uma ativação de transcrição mais eficiente. Similarmente, Jurutka et al. (2000) encontraram
em seus resultados que os indivíduos “F” (ausência do local de restrição FokI) apresentam
maior atividade de transcrição quando comparados aos indivíduos que produzem a proteína
em sua versão mais longa (presença do local FokI – “f”), e, em adição, propuseram que a
ausência do local FokI mostrou uma maior interação com o fator chave de transcrição
(TFIIB).
Um outro polimorfismo existente no gene VDR que tem sido bem caracterizado é o
Cdx2 (ARAI et al., 2001). O polimorfismo de Guanina para Adenina (G/A), denominado
Cdx-G ou Cdx-A, é localizado na região promotora (5’) do gene VDR, e tem sido sugerido
em ter relevante papel na transcrição intestinal do gene VDR. Como o intestino é uma área
predominante com relação a absorção de cálcio, é possível que o Cdx2 exerça alguma
influencia sobre esse processo. Tem sido demonstrado que o alelo A é mais ativo quando
comparado ao alelo G, por realizar a ligação do fator de transcrição Cdx2 de forma mais
consistente e por ter uma maior atividade transcricional (ARAI et al., 2001). Dessa forma,
acredita-se que o alelo A possua uma maior expressão do VDR no intestino gerando um
aumento da transcrição das proteínas transportadoras do cálcio quando comparado ao alelo G.
A figura 01 demonstra alguns dos polimorfismos conhecidos no gene VDR.
25
1
5’ Região Promotora
EXONS CODIFICANTES
3’Região Reguladora
Cdx-2
G\A
FokI
C/T
2
4 5 6 7 8 9
BsmI ApaI
G\A G\T
TaqI
T\C
f e
3
b g d a
3’ UTR
Figura 01. Representação esquemática da estrutura de Exons e Introns do gene VDR e o
posicionamento dos polimorfismos estudados na presente investigação.
3.5.3. Associações entre polimorfismos no gene VDR com fenótipos musculares
A influência genética no desenvolvimento e manutenção da massa óssea tem sido
demonstrada em estudos envolvendo núcleos familiares e irmãos gêmeos (FLICKER et al.,
1995; ARDEN et al., 1996). Estudos em gêmeos trazem a oportunidade de investigar a
influência de fatores genéticos e ambientais na determinação de fenótipos específicos, através
da comparação entre gêmeos univitelinos e bivitelinos. Trabalhos recentes demonstram que
variações alélicas no gene codificador do VDR estão associadas com a perda de massa óssea.
Entretanto, a evidência do efeito de polimorfismos no gene VDR sobre a densidade mineral
ainda é uma temática a ser debatida, uma vez que associações foram encontradas em alguns
estudos (GROSS et al., 1996; VANDEVYVER et al., 1997; GENNARI et al., 1998; GOMEZ
ALONSO et al., 1998), porém não em todos (GEUSENS et al., 1997; ZMUDA et al., 1997;
BROWN et al., 2001).
Quedas e outros riscos para fraturas, por exemplo, habilidade para levantar de uma
cadeira, são influenciados pela força muscular (WHIPPLE et al., 1987; BASSEY et al.,
1992), a qual apresenta correlação significativa e positiva com densidade mineral óssea
(SILVERSTEIN & CONNER, 1994). Esses dados sugerem a possibilidade de variações no
gene VDR ter algum papel relevante na etiologia genética de massa e força muscular, uma
26
vez que tais fenótipos apresentam relação com características ósseas, as quais, embora ainda
controverso, apresentam associação com polimorfismos no citado gene.
A proteína VDR é encontrada em tecidos que apresentam algum papel na homeostase
do Cálcio e também em outros tecidos nos quais regula uma série de processos, inclusive
proliferação e diferenciação celular (WHITFIELD et al., 2001). O músculo esquelético é um
tecido no qual o VDR tem expressão, sendo importante mediador da forma hormonal da
vitamina D durante o processo de contração muscular. Capiati et al. (2002) relataram que
células musculoesqueléticas de aves embrionárias respondem genomicamente e não
genomicamente ao hormônio vitamina D, e sugerem que o VDR nuclear pode ser o receptor
responsável por seus efeitos não genômicos nos mioblastos.
Para determinar o papel fisiológico da ação da vitamina D, via VDR, no
desenvolvimento músculo esquelético, Endo et al. (2003) compararam ratos íntegros com
ratos cujo gene VDR fora espontaneamente deletado. Os autores evidenciaram que os ratos
com ausência do gene VDR apresentaram diâmetro das fibras do músculo quadríceps femoral,
em média, 20 % menores quando comparado aos ratos normais. Os autores observaram que
essa alteração morfológica demonstrou uma natureza progressiva, ou seja, quanto maior a
idade dos ratos sem o gene VDR, maior era a diferença com relação aos ratos normais.
Resultados similares foram evidenciados para os músculos bíceps femoral, gastrocnêmio
medial, tibial anterior e solear, indicando que as anormalidades ocorrem de maneira
generalizada. Tais resultados demonstram que o VDR está envolvido na regulação fisiológica
do desenvolvimento muscular. Adicionalmente, os autores examinaram a expressão
miogênica de fatores de diferenciação. Análises do quadríceps femoral revelaram aumentada
expressão do “myf5”, “E2A” e “miogenina”, os quais se mostraram expressos de forma
mínima nos ratos normais. Os achados são coerentes com a noção de que a ausência do gene
VDR causa um distúrbio no padrão de expressão dos fatores de transcrição miogênica.
Entretanto, os mecanismos moleculares pelo qual os fatores de transcrição miogênica se
apresentaram, de forma aberrante e persistene, “up regulated” ainda não são conhecidos.
Coletivamente, os dados sugerem que o VDR seja um potencial gene candidato em
explicar, pelo menos em parte, o componente genético de fenótipos musculares como força e
massa muscular. Estudos têm sugerido uma relação entre fenótipos musculares com
polimorfismos no gene VDR (GEUSENS et al., 1997; GRUNDBERG et al., 2004; ROTH et
al., 2004; WOLFARTH et al. 2005), entretanto, as informações são ainda limitadas acerca
dessa possível associação.
27
Em um dos poucos trabalhos referentes à temática em questão, Geusens et al. (1997)
estudaram a associação entre o polimorfismo BsmI do gene VDR com força muscular do
quadríceps e de preensão manual em 501 mulheres com idade superior a 70 anos e
aparentemente saudáveis. Os fenótipos musculares foram correlacionados negativamente com
a idade, confirmando a redução de força muscular que acompanha o envelhecimento. Em
adição, tais fenótipos apresentaram relação positiva e significativa com o Índice de Massa
Corporal das voluntárias. Associação significante foi encontrada entre o polimorfismo BsmI e
força do quadríceps, com indivíduos bb e BB apresentando valor médio de 35,0 +/- 1,3 e 31,1
+/- 1,5, respectivamente (P = 0,04). A freqüência do genótipo BB foi significativamente
maior dentre as mulheres com força de quadríceps menor que a média. Em mulheres não
obesas, a força do quadríceps se mostrou 23% maior nos indivíduos com genótipo bb quando
comparados ao genótipo BB (p < 0,01) e 12% maior em Bb comparado a BB (p<0,05). A
diferença permaneceu mesmo após exclusão dos pacientes portadores de osteoartrite, e
correção para idade e consumo de cálcio. Com relação a força de preensão manual, foi
observada uma diferença de 7% entre os genótipos bb e BB, a qual foi significante após
correção das variáveis de confundimento. Após correção para o índice de massa corpórea, a
associação foi também significativa força de preensão manual. Os achados de menor força
muscular em mulheres portadoras do genótipo BB pode implicar em um importante papel do
gene VDR em determinar esse fenótipo, entretanto, o fato precisa ser confirmado em outros
estudos.
Grundberg et al. (2001) investigaram associações entre os polimorfismos poly A e
BsmI do VDR com força muscular, massa magra, peso corporal e Índice de Massa Corporal,
em 175 mulheres saudáveis com idade entre 20 e 39 anos. Uma significante associação foi
encontrada entre força muscular e os genótipos. Os genótipos ss e BB apresentaram maior
força muscular quando comparados aos genótipos LL (P = 0,02) e bb (P = 0,03),
respectivamente. Após ajuste dos fatores de confundimento, os resultados demonstraram
correlações menos significantes (para BsmI, P = 0,05; e para Poly A P = 0,06). Vale ressaltar
que, com relação ao polimorfismo BsmI, o estudo em questão observou resultados contrários
aos de Geusens et al. (1997). Em adição, os genótipos ss e BB apresentaram valores
significativamente mais altos de massa corporal total e massa gorda quando comparados aos
genótipos LL e bb, respectivamente. A mesma tendência foi observada para Índice de Massa
Corporal. Os autores concluíram que variações genéticas no VDR se correlacionam com força
muscular, massa gorda, e massa corporal total em mulheres na fase pós-menopausa.
28
Roth et al. (2004) estudaram a associação da massa corporal total, massa magra e força
com dois polimorfismos no gene VDR (o polimorfismo FokI e o polimorfismo BsmI) em 302
homens idosos. Com relação ao polimorfismo BsmI não houve associação com nenhum dos
fenótipos estudados, e os dados se mostraram relativos ao polimorfismo FokI. No grupo do
polimorfismo FokI não foram observadas diferenças significativas para idade, estatura,
atividade física diária, consumo calórico total, ou percentual de gordura corporal; entretanto,
massa corporal total e índice de massa corporal foram significativamente menores no
subgrupo do genótipo FF quando comparados aos genótipos Ff e ff. A influencia de variações
no gene VDR sobre massa corporal e índice de massa corporal já haviam sido descrita por
Grundberg et al. (2001). Ademais, o grupo do genótipo FF exibiu menor massa livre de
gordura que os grupos Ff e ff, sendo os resultados significativos para massa muscular
apendicular, massa muscular apendicular relativa (massa muscular/estatura
2
) e massa
muscular total. Os autores ainda demonstraram uma significativa associação entre o
polimorfismo FokI com a presença de sarcopenia, de forma que, independente da idade,
homens com o genótipo FF apresentaram um risco 2,17 vezes maior para sarcopenia (95%CI:
1,19 – 3,85) quando foram comparados aos do genótipo ff. O polimorfismo BsmI não foi
associado com a presença de sarcopenia. Com relação a força muscular, o polimorfismo FokI
foi associado significativamente com força média e de pico do quadríceps, tendo o grupo
representado pelos indivíduos FF apresentado os valores mais baixos. Com base nesses
resultados, Roth et al. (2004) sugerem que existe uma associação significativa entre o
polimorfismo FokI do VDR com a presença de sarcopenia, sendo o alelo F de risco para o
desenvolvimento desse quadro. Os resultados, entretanto, precisam ser constatados em outras
populações para serem melhor aceitos na comunidade científica, inclusive em diferentes
grupos raciais e étnicos, e em mulheres.
29
4. METODOLOGIA
4.1. Tipo de estudo
Estudo em corte transversal, no qual as variáveis dependentes são os fenótipos
musculares, e as variáveis independentes são os polimorfismos no gene receptor de vitamina
D.
4.2. Amostra populacional
A amostra do presente estudo foi recrutada do Projeto Geração de Ouro, sendo este
executado pela Universidade Católica de Brasília – UCB. O recrutamento das voluntárias se
deu através de ligações telefônicas, nas quais as convidadas recebiam um breve panorama do
estudo. O processo de recrutamento e coleta de dados durou de fevereiro de 2005 a fevereiro
de 2006. Foram participantes da pesquisa 191 mulheres em fase pós-menopausa e com idade
média de 67.87 ±5.22 anos, as quais não apresentavam significativos problemas de saúde e/ou
incapacidade que pudesse ser agravado com o protocolo. A presente investigação adotou em
seu delineamento os seguintes critérios de exclusão:
- Mulheres que não tinham nacionalidade brasileira;
- As que eram incapazes de caminhar sem a assistência de uma outra pessoa;
- Possuíam prótese unilateral ou bilateral de quadril;
- Apresentar massa corporal, estatura ou área corporal incompatível com os limites
superiores da balança e/ou DXA;
- Possuir algum tipo de prótese ou pino metálico.
Todas as participantes responderam um questionário para obtenção de informações
concernentes a histórico médico, tratamento de reposição hormonal, tabagismo, cor de pele
referida e cidade de nascimento.
30
4.3. Cuidados Éticos
Sabe-se que a perda de massa muscular verificada como decorrência do
envelhecimento sofre influência genética, entretanto, a determinação de genes específicos
associados a esse processo ainda não é bem constatada. A detecção de um gene candidato
possibilita a identificação dos indivíduos propensos a desenvolver esses quadros, e sendo
assim, o conhecimento cientifico buscado nesse projeto permitirá aliviar o sofrimento e
melhorar a qualidade de vida dos indivíduos com idade avançada, por possibilitar o
direcionamento de práticas preventivas precocemente, diminuindo assim o risco de
desenvolvimento de sarcopenia, distúrbio que está associado a altos índices de morbidade e
mortalidade na população idosa, e repercute num aumento do custo assistencial em saúde.
Dadas as características funcionais e fisiológicas do gene estudado, avalia-se que os
dados obtidos não terão impacto negativo sobre o indivíduo, a família, ou meio em que ele
vive. Entretanto, os dados coletados têm caráter confidencial, com acesso restrito aos
pesquisadores responsáveis a ao próprio indivíduo, podendo este retirar seus dados dos bancos
de armazenamento a qualquer momento.
Antes do início da coleta de dados, foi dada entrada na solicitação de aprovação do
projeto junto ao comitê de ética em pesquisa da Universidade Católica de Brasília.
Aproximadamente quatro meses mais tarde, após alguns ajustes no projeto, o comitê de ética
aprovou o protocolo utilizado na metodologia, e foi iniciado o recrutamento dos voluntários.
Cada voluntário foi convidado a assinar um termo de consentimento livre e
esclarecido, o qual continha todas as informações sobre o estudo, tais como vantagens e
desvantagens do protocolo, o seu significado, e o possível uso dos resultados. Aos sujeitos,
coube autorizar ou não o armazenamento e utilização dos dados e materiais coletados para
finalidade de pesquisa. A autorização se deu através de uma assinatura no termo de
consentimento livre e esclarecido. Os dados estão mantidos em propriedade do pesquisador,
na Universidade Católica de Brasília.
As informações obtidas neste experimento, por meio dos resultados de todos os testes,
poderão ser utilizadas como dados de pesquisa científica, podendo ser publicados e
divulgados em revistas científicas especializadas, sendo resguardada a identidade de todos os
participantes.
31
4.4. Caracterização dos níveis de atividade física dos participantes
Para verificar diferenças entre os grupos com relação aos níveis habituais e atividade
física foi utilizado a versão curta do IPAQ (do inglês, International Physical Activity
Questionaire). O IPAQ foi desenvolvido como um instrumento para monitorar, de forma
padronizada, a atividade e inatividade física em diversos países do Mundo (CRAIG et al.,
2003). O modelo usado no presente estudo foi a tradução oficial em português da versão curta
(disponível no site www.celafiscs.com.br), previamente validada para a população brasileira
(MATSUDO et al., 2001; PARDINI et al., 2001). A avaliação leva em consideração a duração
e freqüência das atividades físicas realizadas em uma semana, considerando-se apenas sessões
superiores a 10 minutos contínuos. Os resultados do questionário possibilitam a divisão em
cinco categorias: sedentários, insuficientemente ativos "B", insuficientemente ativos "A",
ativos e muito ativos.
4.5. Estudo dos polimorfismos no gene VDR
Todo o procedimento de genotipagem foi realizado pelos próprios pesquisadores. As
participantes foram convidadas a comparecer ao Laboratório de Estudos em Educação Física
e Saúde (LEEFS), localizado no Campus I da Universidade Católica de Brasília, para que
fosse realizada a coleta sanguínea. O material biológico foi sendo armazenado na geladeira
local até que ocorresse a coleta de todas as voluntárias. Essa etapa teve uma duração
aproximada de 02 meses, pois as visitas aconteciam numa freqüência semanal de duas a três
vezes, com uma média de 15 voluntárias por visita. Em seguida, as amostras foram levadas ao
Laboratório de Ciências Genômicas e Biotecnologia, localizado no Campus II da
Universidade Católica de Brasília, onde todo o procedimento de extração do DNA até a
obtenção dos genótipos foi realizado.
32
4.5.1. Extração de DNA
Foi realizada coleta de amostra sanguínea de todas as participantes através da veia
antecubital, procedimento que foi realizado por um técnico devidamente treinado. O material
biológico foi colhido em tubos vacutainer estéreis contendo anticoagulante EDTA, sendo
extraído um volume de 3 a 5 ml de sangue. O DNA genômico de alto peso molecular foi
extraído dos leucócitos periféricos utilizando-se o método “salting out” (MILLER et al.,
1988).
Os procedimentos de extração envolveram basicamente três passos:
a) Quebra das células com remoção das membranas lipídicas por meio da adição de
um tampão com detergente. A solução usado no procedimento foi denominado Tampão A,
composto por sacarose (0.32 M), Tris-HCl (10 mM, pH 7.6), MgCl
2
(5 mM) e o detergente
não iônico Triton X 100 (1 %). Após a homogeneização do sangue, um volume inicial de 750
µl foi depositado em um microtubo de 1,5 ml. Adicionou-se 750 µl do Tampão A, sendo o
material centrifugado a 2.500 rpm por 20 minutos para condensação do pellet, com descarte
posterior do sobrenadante.
b) Remoção das proteínas celulares e histonas ligadas ao DNA por meio da adição de
uma protease, precipitação com sódio e procedimento de extração com fenol - o pellet foi
suspenso em um composto denominado Tampão B (25mM de EDTA com pH 8.0 e 75mM de
NaCl), sendo adicionados o SDS (sodium dodecul sulfate) a 10% e proteinase K (10 mg/ml).
Em seguida, os tubos foram incubados a 37ºC durante uma hora para ativação das enzimas.
Após a incubação foi adicionado NaCl (6 M) para precipitar o DNA, seguido de uma nova
centrifugação da mistura com a finalidade de precipitar impurezas no fundo dos tubos.
c) Precipitação do DNA em álcool – transferiu-se o sobrenadante obtido no item
anterior e foi adicionado etanol absoluto, na proporção de duas vezes o volume contido no
tubo. Misturou-se por inversões cuidadosas, sendo nesse momento possível a visualização da
precipitação do DNA. Foi realizada outra centrifugação com a finalidade de aderir o DNA no
fundo dos microtubos, descartando-se em seguida o sobrenadante com cuidado para não
perder o pellet. Após a evaporação completa do etanol, foram adicionados 300 µl de TE para
conservação do DNA.
33
4.5.2. Quantificação do DNA
A concentração do DNA extraído previamente foi estimada por meio de gel de agarose
a 1%, corado com brometo de etídeo. Em cada poço do gel foi aplicado um volume de 8 µl,
dos quis 4 µl era tampão de carregamento e 4 µl do DNA extraído e conservado em TE. Foi
utilizado como padrão para quantificação o lambda DNA em concentrações de 20, 100, 200 e
400ng/µl. Após aproximadamente 15 minutos de eletroforese a 80 V, o gel foi fotografado em
luz ultravioleta, sendo as “bandas” formadas pelo DNA comparadas com as dos marcadores,
e, através da inspeção visual, foi realizada a quantificação do DNA. Após a quantificação,
todas as amostras de DNA foram diluídas em TE, de forma que ficassem numa concentração
final de 5 ng/µl e prontas para seguir para o processo de amplificação.
4.5.3. Polimorfismos estudados no gene VDR
Os polimorfismos no gene VDR comumente investigados em estudos de associação
são, de maneira geral, nomeados pelas enzimas de restrição utilizadas para sua genotipagem
através de PCR-RFLP (polimorfimos de tamanho em fragmentos de restrição). Os
polimorfismos utilizados neste trabalho são amplamente citados na literatura como ApaI,
BsmI, Cdx, FokI e TaqI. Todos estes polimorfismos estão depositados no banco de dados
dbSNP no NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/) com as respectivas
denominações rs7975232, rs1544410, rs17883968, rs2228570 e rs731236. Ao longo deste
trabalho os alelos e consequentemente os genótipos para os locos ApaI, BsmI, FokI e TaqI
serão denominados utilizando a letra inicial da enzima de restrição em maiúscula e minúscula.
Para facilitar o entendimento, segue a abaixo a relação dos alelos em termos de nucleotídeos
com os alelos representados pelas letras das enzimas de restrição.
a) rs7975232 (Polimorfismo ApaI) - será usado A para identificar o alelo com a
presença de Timina (T) e a para o alelo com a presença de Guanina (C). Conseqüentemente,
AA = TT, Aa = GA e aa = GG;
b) rs1544410 (Polimorfismo BsmI) - será usado B para designar o alelo com a
presença de Adenina (A), e b para a presença de Guanina (G). Portanto, BB= AA, Bb = AG e
bb = GG;
c) rs17883968 (polimorfismo Cdx-2). As siglas usadas para os polimorfismos Cdx-2
serão equivalentes às mesmas empregadas anteriormente (ARAI et al., 2001; FANG et al.,
2003). Será usado Cdx-G para designar o alelo com a presença de Guanina (G) e Cdx-A para
34
o alelo com a presença de Adenina (A). Deste modo, Cdx-G = GG, Cdx-G/A = GA e Cdx-A
= AA.
d) rs2228570 (Polimorfismo FokI) - será usado "F" para designar o alelo com ausência
do primeiro códon de iniciação devido à troca de Timina (T) por Citosina (C) e "f" para o
alelo que possui o primeiro códon de iniciação. Portanto, FF = CC, Ff = CT e ff = CC;
e) rs731236 (Polimorfismo TaqI) - será usado T para designar o alelo com a presença
de Timina (T) e t para o alelo com a presença de Cistina (C). Deste modo, TT = TT, Tt = TC e
tt = CC;
Após a identificação do alelo presente, cada uma das amostras pode ser classificada
em um de três possíveis grupos: dois de homozigotos e um heterozigoto; isso para cada um
dos polimorfismos.
4.5.4. Amplificação do DNA – Polimerase Chain Reaction (PCR)
Os sítios polimórficos foram amplificados através da técnica da reação em cadeia da
polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction). Essa técnica permite que um
fragmento específico da molécula de DNA seja amplificado milhares de vezes em poucas
horas. A técnica implica na utilização de fragmentos de DNA fita simples (iniciadores) que
delimitam a região a ser amplificada. A técnica de PCR é baseada na capacidade da enzima
Taq polimerase não ser inativada em temperaturas elevadas que promovem normalmente a
desnaturação do DNA. O fato ocorre, pois a enzima é extraída de uma bactéria que vive em
altas temperaturas denominada Thermus Aquáticus, tem característica termoestável, sendo de
grande importância uma vez que a reação se processa em diferentes ciclos de temperaturas. O
MgCl
2
favorece o estímulo da Taq polimerase e os dNTPs conferem maior reprodutibilidade à
reação.
Os iniciadores para a PCR e a metodologia de genotipagem utilizados neste trabalho
seguiram os procedimentos adotados em Pereira et. al., (2006). Para amplificação pela PCR
novos iniciadores foram desenhados. Para os polimorfismos ApaI e TaqI, os iniciadores para
PCR foram os mesmos, já que os polimorfismo encontram-se em regiões próximas do gene
VDR (Exon 9 e Intron entre Exons 8 e 9 o Taq I e o Apa I, respectivamente).
A PCR foi realizada em um volume final de 10 µl, seguindo o seguinte protocolo: Tampão 1x,
MgCl
2
1,5 µM, dNTPs 250 µM, iniciadores 1 µM, Taq DNA Polimerase 1 U e 10-20 ng de
DNA.
35
Após o preparo, a reação foi colocada em um termociclador (GeneAmp PCR System
9700, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), alternando temperaturas de 95º, 63º e 72º
com o intuito de promover a desnaturação do DNA (separação da fitas devido ao rompimento
das pontes de hidrogênio), anelamento dos iniciadores às fitas simples de DNA e ligação dos
dNTPs às fitas, respectivamente. O programa utilizado seguiu a seguinte variação de
temperatura: 05 minutos a 95º; 14 ciclos (01 minuto 95º - 01 minuto a 63º - 01 minuto a 72º);
25 ciclos (01 minuto a 95º - 01 minuto a 56º - 01 minuto a 72º); 10 minutos a 72º; e mantido
em 10º até a reação ser retirada do termociclador.
4.5.5. Genotipagem
A genotipagem dos polimorfismos foi realizada por meio de minisequenciamento
(SYVÄNEN, 1999) utilizando o SNaPshot™ Multiplex System (Applied Biosystems, Foster
City, CA, EUA). No minisequenciamento, a reação de síntese de DNA catalisada por uma
DNA polimerase é usada para distinguir diferentes alelos. O princípio da reação é anelar um
iniciador exatamente adjacente ao nucleotídeo polimórfico e permitir a extensão de um único
nucleotídeo. Isto é possível graças à inclusão de desoxiribonucleotídeos na reação. No caso
específico do sistema SNaPshot™ os desoxiribonucleotídeos são marcados com moléculas
fluorescentes, especificamente o ddATP (verde), o ddTTP (vermelho), ddGTP (azul) e o
ddCTP (preto). .Para diferenciação dos locos a serem genotipados caudas de poli C foram
adicionados nos iniciadores de minisequenciamento.
O protocolo de miniseqüenciamento através do sistema SNaPshot™ foi desenvolvido
para genotipagem simultânea de até 10 polimorfismos de uma única base. Neste trabalho os
fragmentos foram amplificados individualmente através da PCR e em seguida misturados em
quantidades equimolares (1µl do produto de cada fragmento, totalizando 4µl). A partir de
então os conjuntos de fragmentos foram submetidos ao protocolo de miniseqüenciamento. O
passo inicial foi a eliminação dos iniciadores da PCR e dos dNTPs. O processo de purificação,
envolveu a adição de 0,25 U da enzima SAP e 0,15 U da enzima ExoI para cada µl de produto
de PCR. Um volume de 4 ul de produto de PCR foi purificado. Para ação das enzimas a
mistura foi incubada em termociclador de acordo com a seguinte programação: 90 minutos a
37ºC e 20 minutos a 80ºC. Com os produtos de PCR purificados, foi então dado início ao
preparo das reações de extensão. Os reagentes desse processo foram a mistura de reação do
sistema SNaPshot™ (Snapshot Ready Reaction Mix, Applied Biosystems, Foster City, CA,
EUA ), os iniciadores de extensão e água Milli-Q para completar um volume final de 5µl. A
mistura de reação do sistema contem a AmpliTaq DNA polimerase, os ddNTPs fluorescentes
36
e o tampão da reação. A reação foi então colocada no termociclador de acordo com a seguinte
programação: 25 ciclos de variações de temperaturas (10 segundos a 96º, 5 segundos a 50º e
30 segundos a 60º) e mantida a 4º até que o produto fosse retirado. Em seguida, foi realizada
uma nova purificação com a finalidade de remoção dos ddNTPs não incorporados com 0.15 U
da enzima SAP para cada µl do produto e levado para o termociclador (60 minutos a 37º e 15
minutos a 75º).
Com os produtos de extensão já purificados, foi procedida a preparação das placas
para realização da eletroforese. Para cada uma das amostras, foi conduzida uma mistura com
volume final de 10µl, onde 1µl era composto pelo produto. Os demais componentes da
mistura foram um padrão de tamanho molecular (GS120 Liz, Applied Biosystems, Foster
City, CA, EUA) (0.2µl) e formamida altamente deionizada (8,8µl), para desnaturação do
produto. A Eletroforese foi em seguida realizada em seqüenciador automático de DNA (ABI
Prism 3100 Genetic Analizer, Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), com subseqüente
análise dos eletroferogramas através dos softwares Genescan 3.7 e Genotyper 3.7 para
obtenção dos genótipos referentes a cada uma das amostras. O procedimento descrito acima é
mostrado de maneira esquemática na figura 02.
Figura 02. Representação esquemática dos passos seguidos desde a amplificação
pela PCR até a realização e análise da eletroforese.
37
4.6. Composição corporal
As mensurações de composição corporal foram realizadas no laboratório de imagens
da Universidade Católica de Brasília (UCB-DF). Inicialmente, foram detectados os valores de
massa corporal e estatura de cada uma das voluntárias, sendo em seguida calculado o Índice
de Massa Corporal (IMC) através da seguinte fórmula: IMC = Massa Corporal / Estatura
2
. A
Massa Corporal foi mensurada através de uma balança digital marca Filizzola, com
capacidade máxima de 150 quilogramas (Kg) e uma resolução de 50 gramas (g). Um
estadiômetro acoplado à balança foi utilizado para mensurar a estatura das participantes,
sendo o resultado expresso em metros (m), e com resolução de 0,1 centímetros (cm).
A composição corporal foi mensurada através da absortometria por raios-x de dupla
energia (DXA), utilizando o equipamento da marca Lunnar, modelo DPX-IQ (Lunar
Corporation, Madison, WI, USA). Este método expõe o avaliado a mínima quantidade de
radiação, e os exames são realizados em um período de tempo relativamente curto
(aproximadamente 25 minutos). Segundo Hansen et al. (1999), o método é considerado válido
para avaliar a composição corporal de mulheres idosas, podendo ser aplicado para mensurar a
Massa Livre de Gordura (MLG) dessa população. Adicionalmente, Wang et al. (1996)
validaram mensuração de massa muscular através do DXA contra valores obtidos com a
tomografia computadorizada e relataram diferença inferior a 5%.
Para o procedimento, as voluntárias deitaram em decúbito dorsal sobre a mesa do
equipamento, sendo em seguida cuidadosamente posicionadas de forma que ficassem
totalmente centralizadas em relação às laterais da mesa. As voluntárias se dispuseram com os
membros inferiores estendidos, sendo utilizado uma fita de velcro para manter os membros
inferiores próximos e dar suporte aos pés de forma que ficassem numa angulação de 45º com
relação ao plano vertical. Os membros superiores foram dispostos estendidos e posicionados
ao longo do corpo, sem que houvesse contato com o tronco. Todas as avaliações foram
realizadas pelo mesmo técnico, o qual foi treinado para realização desses exames e possui
uma experiência no procedimento. Após análise de toda a área corporal, o DXA possibilita a
determinação da densidade mineral óssea e dos tecidos. Os tecidos são ainda fracionados em
Massa de gordura e Massa Livre de Gordura (MLG). Os apêndices (membros superiores e
inferiores) foram isolados do tronco e da cabeça utilizando linhas geradas pelo programa, as
quais, em seguida, foram manualmente ajustadas com precisão. Linhas verticais nas
articulações dos ombros separaram os membros inferiores do corpo, enquanto que linhas
38
anguladas nas articulações coxo-femorais foram utilizadas para separar os membros
superiores do tronco.
Dessa forma, além do equipamento fornecer valores de MLG e massa de gordura do
corpo inteiro, é possível também identificar valores de MLG e massa de gordura para as
seguintes regiões corporais: membros superiores, membros inferiores e tronco. Com base
nesses resultados, é possível ainda se chegar ao valor da Massa Livre de Gordura Apendicular
(MLGA), a qual é representada pelo somatório da MLG dos membros inferiores e superiores.
A importância em analisar a MLGA de pessoas idosas foi previamente demonstrada
(BAUMGARTNER et al., 1998). Como previamente descrito por Baumgartner et al. (1998),
MLG total e MLGA foram estudadas relativas ao quadrado da estatura (Kg/m
2
). Dessa forma,
as seguintes variáveis foram utilizadas nas análises posteriores:
- Massa Livre de Gordura Total (MLG total): Tecido não ósseo livre de gordura de
corpo inteiro expresso em Kg;
- Massa Livre de Gordura Total relativa (MLG total relativa): Tecido não ósseo livre
de gordura de corpo inteiro dividido pela estatura ao quadrado, expresso em
Kg/m
2
. Trata-se de uma fórmula análoga ao IMC, que elimina diferenças na MLG
total decorrentes de diferenças de estatura;
- Massa Livre de Gordura Apendicular (MLGA): Tecido não ósseo livre de gordura
apendicular. Refere-se ao somatório da massa livre de gordura dos membros
inferiores e dos membros superiores expresso em Kg;
- Massa Livre de Gordura Apendicular relativa (MLGA relativa): Tecido não ósseo
livre de gordura apendicular dividido pela estatura ao quadrado, expresso em
Kg/m
2
. Trata-se de uma fórmula análoga ao IMC, que elimina diferenças na
MLGA decorrentes de diferenças de estatura.
O percentual de gordura obtido através do DXA foi utilizado com a finalidade de
melhor caracterizar a amostra.
39
4.7. Tratamento estatístico
Para verificar a normalidade da distribuição dos dados foi utilizado o teste de
Kolmogorov-Smirnov. Os dados são apresentados através da estatística descritiva, utilizando-
se os procedimentos de média e desvio padrão. Para verificar se a freqüência alélica das
voluntárias encontrava-se de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi utilizado o teste
chi-quadrado. Esse procedimento foi realizado para cada um dos polimorfismos. Foi utilizada
a análise de variância multifatorial (ANOVA) para testar a existência de diferença entre os
genótipos nas seguintes variáveis: idade, massa corporal, estatura, IMC, percentual de
gordura, nível de atividade física, tabagismo, reposição hormonal e cor de pele referida. Neste
caso, os genótipos entraram como fator fixo e todas as variáveis acima citadas como
dependentes. A análise foi feita separadamente para cada um dos cinco polimorfismos.
Para testar a associação entre os genótipos do VDR e os fenótipos musculares (MLG
total, MLG relativa, MLGA e MGLA relativa) foi adotada a seguinte estratégia: um modelo
de regressão múltipla incluindo todas as potenciais covariantes foi analisado. Neste caso, as
variáveis dependentes foram os fenótipos musculares (separadamente), e as potenciais
covariantes as variáveis independentes, sendo essas: idade, massa corporal, estatura, IMC,
percentual de gordura, nível de atividade física, tabagismo, reposição hormonal e cor de pele
referida pela voluntária. O método utilizado na regressão foi o stepwise. Covariantes com um
valor de P > 0.10 foram então removidas das análises. Em seguida, uma análise de
covariância (ANCOVA) foi realizada para verificar diferenças entre os genótipos. As
covariantes com valor de P < 0.10 foram incluídas no modelo, sendo essas:
- Para MLG total: massa corporal, percentual de gordura e estatura;
- Para MLG total relativa: IMC e percentual de gordura;
- Para MGLA: massa corporal, percentual de gordura e estatura;
- Para MLGA relativa: IMC e percentual de gordura.
A significância estatística adotada para as análises de variância e covariância foi de um
valor de P < 0,05. Ocorrendo diferença significativa em alguma das variáveis, testes de
comparações múltiplas Bonferroni foram adotados para identificação de contrastes relevantes
entre as médias. O softaware SPSS versão 10,0 foi utilizado para realização de todas as
análises.
40
5. RESULTADOS
5.1. Caracterização da amostra
Os resultados da caracterização da amostra são apresentados de forma descritiva,
considerando-se médias e desvios-padrão de todas as variáveis. A Tabela 1 apresenta as
características antropométricas das voluntárias participantes do presente estudo. Um total de
191 mulheres em fase pós-menopausa (idade média 67,87) participaram do estudo, sendo
realizada de todas elas medidas da massa corporal total e estatura, bem como mensurações
para avaliação da composição corporal. Adicionalmente, foi coletada de todas elas amostra
sanguínea para posterior análise dos genótipos do VDR.
Tabela 1. Estatística descritiva (média +/-
Desvio padrão) das
variáveis estudadas.
Variáveis
N 191
Idade (anos) 67,87 ±5,22
Massa corporal total (Kg) 64,55 ±11,73
Estatura (m) 1,52 ±0,06
IMC (Kg/m
2
) 27,91 ±4,49
MLGA (Kg) 15,85 ±2,65
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,85 ±0,95
MLG total (Kg) 38,20 ±5,23
MLG total relativa (Kg/m
2
) 16,52 ±1,82
Percentual de gordura corporal (%) 38,29 ±6,35
IMC = Índice de Massa Corporal; MLGA = Massa Livre de Gordura
Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
41
A Tabela 2 apresenta as características referentes a tabagismo, obesidade, reposição
hormonal, autodefinição de cor da pele, presença de doenças crônicas e o nível atividade
física da amostra. Fazendo-se uma classificação de obesidade baseada no IMC, na qual
valores > 30 Kg/m
2
são considerados como acometidos (GEUSENS et al., 1997), observou-se
a ocorrência de obesidade em 55 (28,80%) das voluntárias. A grande maioria da amostra não
apresentava o hábito de fumar, com apenas 4 (2,1%) das voluntárias sendo tabagistas. As
doenças crônicas mais prevalentes foram hipertensão arterial, osteoporose e diabetes mellitus
tipo II, acometendo 127 (66,49%), 58 (30,37%) e 32 (16,75) das voluntárias, respectivamente.
Foi observado que 17,28% das mulheres estavam fazendo tratamento de reposição hormonal.
A cor de pele referida pelas voluntárias pode ser também notada na Tabela 2. Os resultados do
IPAQ revelaram que 4,19% da amostra foram classificadas como sedentárias, 10,47%
insuficientemente ativas “B”, 24,61% insuficientemente ativas “A”, 59,16% ativas e 1,57%
muito ativas.
42
Tabela 2.
Características de tabagismo, obesidade, reposição hormonal,
auto-
definição de cor da pele, presença de doenças crônicas e nível de
atividade física da amostra.
Característica N (%)
Fumante
Sim 4 (2,1)
Não 187 (97,9)
Obesidade
Sim (IMC > 30Kg/m
2
) 55 (21,2)
Não (IMC < 30Kg/m
2
) 136 (78,8)
Reposição Hormonal
Sim 33 (17,28)
Não 158 (82,72)
Auto definição de cor da pele
Branca 79 (41,36)
Morena 78 (40,84)
Negra 31 (16,23)
Vermelha 3 (1,57)
Doenças Crônicas
Hipertensão arterial 127 (66,49)
Osteoporose 58 (30,37)
Diabetes tipo II 32 (16,75)
Nível de Atividade Física (IPAQ)
Sedentárias 8 (4,19)
Insuficientemente ativas B 20 (10,47)
Insuficientemente ativas A 47 (24,61)
Ativas 113 (59,16)
Muito Ativas 3 (1,57)
43
5.2. Extração e quantificação das amostras de DNA
A figura 03 apresenta o exemplo de uma foto de gel de agarose realizado para quantificar
as amostras de DNA extraídas. Os quatro primeiros poços de cada uma das duas linhas
correspondem ao padrão para quantificação (lambda DNA) em concentrações de 20, 100, 200 e
400ng/µl, da esquerda para a direita. Foi observado que as amostras exemplificadas
apresentaram uma concentração variando entre 300 e 600 ng/µl de DNA de alto peso
molecular.
Figura 03. Eletroforese em gel de agarose
(1%) corado com brometo de etídeo. Os
quatro primeiros poços na parte superior e
inferior do gel representam os padrões de
concentração de DNA, respectivamente,
com 20, 100, 200 e 400 ng/ul. Os demais
poços são amostras de DNA genômico
extraído de amostras de sangue.
44
5.3. Amplificação pela PCR
Os polimorfismos presentes ao longo do gene VDR adotados para fazer parte da
presente investigação foram os seguintes: ApaI, BsmI, Cdx-2, FokI e TaqI. A figura 04
exemplifica uma fotografia de gel de agarose correspondente a amplificação dos fragmentos
contendo os sítios polimórficos estudados. O primeiro poço da esquerda para a direita contém
o padrão (1Kb plus) para estimativa do comprimento do fragmento. Como esperado com base
nos iniciadores desenhados, os fragmentos amplificados possuem em torno de 200 pares de
bases. Os fragmentos onde estão localizados os polimorfismos ApaI e TaqI, BsmI, Cdx-2 e
FokI, correspondem às fotografias ilustradas nas figuras 04A,
04B, 04C e 4D,
respectivamente.
Cdx-2
Fok
I
Bsm
I
Apa
I /
Taq
I
4a.
4b.
4c.
4d.
Figura 04. Eletroforese em gel de agarose (2%) corado com brometo de etídeo.
Produtos de amplificação pela PCR com iniciadores para ApaI e TaqI em 4a; BsmI em
4b; Cdx-2 em 4c; e FokI em 4d.
45
5.4. Genotipagem por minisequenciamento
Foi coletada amostra de sangue de todas as participantes, entretanto, devido a
inconsistências durante procedimento de extração do DNA e genotipagem, algumas amostras
foram descartadas. Dessa forma, ocorreu pequena diferença na quantidade de indivíduos entre
os polimorfismos. Por exemplo, das 191 voluntárias, foi possível genotipar 189 para o
polimorfismo FokI enquanto que para o BsmI o procedimento foi viável em 183 mulheres.
Adicionalmente, em cerca de 50 amostras o processo de genotipagem foi realizado em
duplicidade com a finalidade de verificar a igualdade dos resultados, sendo observado uma
congruência em 100% dos casos.
A figura 05 ilustra um exemplo da genotipagem de uma amostra como aparece no
software. Observando a figura da esquerda para a direita, nota-se que: o primeiro loco refere-
se ao Cdx-2 com tamanho de pico em torno de 21 pares de base; o segundo loco corresponde
ao TaqI com tamanho de pico em torno de 28 pares de base; o terceiro refere-se ao
polimorfismo ApaI cujo tamanho do pico situa-se em torno de 35 pares de base; o quarto loco
corresponde ao BsmI cujo pico apresenta um tamanho médio de 44 pares de base; e o quinto e
último pico refere-se ao polimorfismo FokI e apresenta um tamanho situado em torno de 44
pares de base. No caso da amostra exemplificada na figura, o genótipo apresentado foi o
heterozigoto para todos os locos.
Figura 05. Eletroferograma de produtos de minisequenciamento para os locos Cdx2, TaqI, ApaI, BsmI e FokI. Neste
eletroferograma todos os locos são heterozigotos.
Cdx
-
2
Taq
I
Apa
I
Bsm
I
Fok
I
46
5.5. Genótipos do VDR e associação com massa livre de gordura
Para uma melhor visualização, os resultados da distribuição dos genótipos,
características e associações com os fenótipos musculares serão apresentadas separadamente
para cada polimorfismos.
5.5.1. Polimorfismo ApaI
Um total de 187 mulheres em fase pós-menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo ApaI no gene VDR. A freqüência alélica observada na amostra é ilustrada na
Figura 6. Foram identificados 29 portadores do genótipo aa, 97 do Aa e 61 do AA, o que
representou 15,51%, 51,87% e 32,62%, respectivamente, da amostra (n = 187) estudada. A
freqüência do alelo a foi de 0,414 e do A foi 0,586. O teste de chi-quadrado revelou que a
freqüência dos genótipos não diferiu daquela esperada pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Figura 06. Distribuição dos genótipos observada
para o polimorfismo ApaI no gene VDR.
A Tabela 3 apresenta as características das participantes separadas por grupos de
genótipo. Não foi observada diferença significativa entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC ou percentual de gordura. Foi identificado que 17,11% das
voluntárias estavam fazendo tratamento de reposição hormonal e essa proporção não diferiu
significativamente entre os genótipos. Adicionalmente, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos com relação ao nível de atividade física
praticado, tabagismo e cor referida de pele.
47
Tabela 3.
Características físicas (Média ± Desvio Padrão) da amostra em relação aos
genótipos do polimorfismo ApaI.
Genótipo do ApaI aa Aa AA Valor de P
N 29 97 61
Idade (anos) 67,86 ± 5,37 67,69 ± 5,12 68,21 ± 5,34
,829
Massa Corporal (Kg) 62,69 ± 11,49 65,54 ± 11,68
63,85 ± 12,21
,450
Estatura (cm) 151,93 ± 5,99 152,15 ± 6,26 151,65 ± 6,75
,878
IMC (Kg/m
2
) 27,09 ± 4,17 28,32 ± 4,86 27,63 ± 3,99
,374
Percentual de gordura corporal (%)
38,64 ± 6,25 38,16 ± 6,31 38,47 ± 6,41
,882
IMC = Índice de Massa Corporal.
Os dados referentes aos fenótipos de massa livre de gordura estão apresentados na
Tabela 4. Para nenhuma das variáveis de tecido livre de gordura o modelo de ANCOVA
utilizado não detectou diferença significativa entre os grupos genotípicos (AA, Aa e aa).
Tabela 4.
Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo ApaI.
Genótipo do ApaI aa Aa AA Valor de P
MLGA (Kg) 15,37 ± 2,48 16,03 ± 2,92
15,78 ± 2,35 ,829
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,64 ± 0,85 6,92 ± 1,10 6,84 ± 0,71 ,778
MLG Total (Kg) 36,91 ± 5,33 38,65 ± 5,15
37,95 ± 5,37 ,412
MLG Total relativa (Kg/m
2
) 15,96 ± 1,86 16,69 ± 1,93
16,46 ± 1,59 ,285
MLGA = Massa Livre de Gordura Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
48
5.5.2. Polimorfismo BsmI
Um total de 183 mulheres em fase pós-menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo BsmI no gene VDR. A freqüência alélica observada na amostra é ilustrada na
Figura 7. Foram identificados 90 portadores do genótipo bb, 70 do Bb e 23 do BB, o que
representou 49,18%, 38,25% e 12,57%, respectivamente, da amostra (n = 183) estudada. A
freqüência do alelo b foi 0,683 e a do alelo B 0,317. O teste de chi-quadrado revelou que a
freqüência dos genótipos não diferiu daquela esperada pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Figura 07. Distribuição dos genótipos observada para o
polimorfismo BsmI no gene VDR.
A Tabela 5 apresenta as características das participantes separadas por grupos de
genótipo. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC ou percentual de gordura. Foi encontrado que 16,39% das voluntárias
estavam fazendo tratamento de reposição hormonal e essa proporção não diferiu
significativamente entre os genótipos. Adicionalmente, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos com relação ao nível de atividade física
praticado, tabagismo e cor referida de pele.
49
Tabela 5. Características físicas (Média ± Desvio Padrão) da amostra em relação aos
genótipos do polimorfismo BsmI.
Genótipo do BsmI bb Bb BB Valor de P
N 90 70 23
Idade (anos) 68,02 ± 5,27 67,50 ± 5,33 67,13 ± 4,30
,695
Massa Corporal (Kg) 64,59 ± 11,42 65,74 ± 13,00
62,13 ± 10,08
,447
Estatura (cm) 151,43 ± 6,09 153,03 ± 6,89 151,00 ± 5,33
,210
IMC (Kg/m
2
) 28,18 ± 4,76 27,94 ± 4,47 27,17 ± 3,55
,635
Percentual de gordura corporal (%)
38,71 ± 6,12 38,36 ± 6,24 37,31 ± 6,22
,623
IMC = Índice de Massa Corporal
Os dados referentes aos fenótipos de massa livre de gordura estão apresentados na
Tabela 6. Para nenhuma das variáveis de tecido livre de gordura o modelo de ANCOVA
utilizado não detectou diferença significativa entre os grupos genotípicos (BB, Bb e bb).
Tabela 6.
Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo BsmI.
Genótipo do BsmI
bb Bb BB Valor de P
MLGA (Kg) 15,67 ± 2,04 16,20 ± 3,53
15,71 ± 1,89 ,707
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,81 ± 0,76 6,88 ± 1,22 6,89 ± 0,76 ,607
MLG Total (Kg) 37,78 ± 5,07 38,93 ± 5,95
37,71 ± 3,79 ,418
MLG Total relativa (Kg/m
2
) 16,48 ± 2,00 16,56 ± 1,79
16,52 ± 1,22 ,322
MLGA = Massa Livre de Gordura Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
50
5.5.3. Polimorfismo Cdx - 2
Um total de 189 mulheres em fase pós-menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo Cdx - 2 no gene VDR. A freqüência alélica observada na amostra é ilustrada na
Figura 8. Foram identificados 79 portadores do genótipo Cdx-G, 86 do Cdx-G/A e 24 do Cdx-
A, o que representou 41,80%, 45,50% e 12,70%, respectivamente, da amostra (n = 189)
estudada. A freqüência do alelo Cdx-G foi 0,646, e a do alelo Cdx-A foi 0,354.O teste de chi-
quadrado revelou que a freqüência dos genótipos não diferiu daquela esperada pelo equilíbrio
de Hardy-Weinberg.
Figura 08. Distribuição dos genótipos observada para
o polimorfismo Cdx-2 no gene VDR.
A Tabela 7 apresenta as características das participantes separadas por grupos de
genótipo. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC ou percentual de gordura. Foi observado que 16,93% das voluntárias
estavam fazendo tratamento de reposição hormonal e essa proporção não diferiu
significativamente entre os genótipos. Adicionalmente, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos com relação ao nível de atividade física
praticado, tabagismo e cor referida de pele.
51
Tabela 7.
Características físicas (Média ± Desvio Padrão) da amostra em relação aos genótipos
do polimorfismo Cdx-2.
Genótipo do Cdx-2 Cdx-G Cdx G/A Cdx-A Valor de P
N 79 86 24
Idade (anos) 67,65 ± 4,89 67,91 ± 5,86 68,38 ± 3,94
,832
Massa Corporal (Kg) 63,56 ± 11,21 66,06 ± 11,72
62,88 ± 13,53
,294
Estatura (cm) 151,66 ± 7,00 152,48 ± 5,53 150,63 ± 6,85
,410
IMC (Kg/m
2
) 27,58 ± 4,23 28,39 ± 4,57 27,60 ± 5,07
,474
Percentual de gordura corporal (%)
38,56 ± 5,88 38,32 ± 6,11 37,96 ± 8,26
,915
IMC = Índice de Massa Corporal
Os dados referentes aos fenótipos de massa livre de gordura estão apresentados na
Tabela 8. Para nenhuma das variáveis de tecido livre de gordura o modelo de ANCOVA
utilizado não detectou diferença significativa entre os grupos genotípicos (Cdx-G, Cdx-G/A e
Cdx-A).
Tabela 8.
Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo Cdx-2.
Genótipo do Cdx-2 Cdx-G Cdx-G/A Cdx-A Valor de P
MLGA (Kg) 15,63 ± 2,33 16,17 ± 3,06
15,38 ± 2,01 ,914
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,78 ± 0,78 6,94 ± 1,14 6,76 ± 0,65 ,911
MLG Total (Kg) 37,50 ± 5,41 39,12 ± 5,17
37,05 ± 4,61 ,523
MLG Total relativa (Kg/m
2
) 16,28 ± 1,85 16,81 ± 1,87
16,31 ± 1,53 ,660
MLGA = Massa Livre de Gordura Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
52
5.5.4. Polimorfismo FokI
Um total de 189 mulheres em fase pós-menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo Fok I no gene VDR. A freqüência alélica observada na amostra é ilustrada na
Figura 9. Foram identificados 79 portadores do genótipo FF, 87 do Ff e 23 do ff, o que
representou 41,80%, 46,03% e 12,17%, respectivamente, da amostra (n = 189) estudada. A
freqüência do alelo C foi de 0,648 e a do alelo T foi de 0,352.O teste de chi-quadrado revelou
que a freqüência dos genótipos não diferiu daquela esperada pelo equilíbrio de Hardy-
Weinberg.
Figura 09. Distribuição dos genótipos
observada para o polimorfismo FokI no gene
VDR.
A Tabela 9 apresenta as características das participantes separadas por grupos de
genótipo. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC ou percentual de gordura. Foi observado que 16,93% das voluntárias
estavam fazendo tratamento de reposição hormonal e essa proporção não diferiu
significativamente entre os genótipos. Adicionalmente, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos com relação ao nível de atividade física
praticado, tabagismo e cor referida de pele.
53
Tabela 9.
Características físicas (Média ± Desvio Padrão) da amostra em relação aos
genótipos do polimorfismo FokI.
Genótipo do FokI FF Ff ff Valor de P
N 79 87 23
Idade (anos) 67,94 ± 5,33 67,68 ± 5,02 68,48 ± 5,95
,805
Massa Corporal (Kg) 63,77 ± 10,94 65,25 ± 12,01
64,65 ± 13,81
,721
Estatura (cm) 152,38 ± 5,54 151,37 ± 6,72 152,00 ± 7,29
,556
IMC (Kg/m
2
) 27,43 ± 4,27 28,41 ± 4,51 27,94 ± 5,17
,380
Percentual de gordura corporal (%)
37,94 ± 6,62 39,06 ± 5,99 37,20 ± 6,23
,332
IMC = Índice de Massa Corporal
Os dados referentes aos fenótipos de massa livre de gordura estão apresentados na
Tabela 10. Para nenhuma das variáveis de tecido livre de gordura o modelo de ANCOVA
utilizado não detectou diferença significativa entre os grupos genotípicos (FF, Ff e ff).
Tabela 10.
Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordura com os genótipos do
polimorfismo FokI.
Genótipo do FokI FF Ff ff Valor de P
MLGA(Kg) 15,99 ± 2,97 15,76 ± 2,44
15,67 ± 2,40 ,303
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,87 ± 1,13 6,86 ± 0,80 6,77 ± 0,83 ,287
MLG Total (Kg) 38,02 ± 4,36 38,11 ± 5,77
38,92 ± 6,05 ,957
MLG Total relativa (Kg/m
2
) 16,36 ± 1,56 16,60 ± 1,98
16,83 ± 2,14 ,943
MLGA = Massa Livre de Gordura Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
54
5.5.5. Polimorfismo TaqI
Um total de 184 mulheres em fase pós-menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo Taq I no gene VDR. A freqüência alélica observada na amostra é ilustrada na
Figura 10. Foram identificados 28 portadores do genótipo tt, 66 do Tt e 90 do TT, o que
representou 15,22%, 35,87% e 48,91%, respectivamente, da amostra (n = 184) estudada. A
freqüência do alelo t foi 0,332; a do alelo T foi 0,668. O teste de chi-quadrado revelou que a
freqüência dos genótipos não diferiu daquela esperada pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Figura 10. Distribuição dos genótipos observada
para o polimorfismo TaqI no gene VDR.
A Tabela 11 apresenta as características das participantes separadas por grupos de
genótipo. Nenhuma diferença significativa foi observada entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC ou percentual de gordura. Foi observado que 17,39 das voluntárias
estavam fazendo tratamento de reposição hormonal e essa proporção não diferiu
significativamente entre os genótipos. Adicionalmente, não foram observadas diferenças
estatisticamente significativas entre os grupos com relação ao nível de atividade física
praticado, tabagismo e cor referida de pele.
55
Tabela 11. Características físicas (Média ± Desvio Padrão) da amostra em relação aos
genótipos
do polimorfismo TaqI.
Genótipo do TaqI tt Tt TT Valor de P
N 28 66 90
Idade (anos) 67,54 ± 5,66 67,44 ± 5,14 68,32 ± 5,17
,542
Massa Corporal (Kg) 62,89 ± 10,04 65,03 ± 11,26
64,52 ± 12,42
,718
Estatura (cm) 151,25 ± 6,26 153,29 ± 6,21 151,28 ± 6,44
,120
IMC (Kg/m
2
) 27,38 ± 3,17 27,58 ± 3,85 28,19 ± 5,12
,582
Percentual de gordura corporal (%)
38,75 ± 5,49 37,36 ± 6,02 38,67 ± 6,67
,388
IMC = Índice de Massa Corporal.
Os dados referentes aos fenótipos de massa livre de gordura estão apresentados na
Tabela 12. Para nenhuma das variáveis de tecido livre de gordura o modelo de ANCOVA
utilizado não detectou diferença significativa entre os grupos genotípicos (TT, Tt e tt).
Tabela 12. Associação entre os fenótipos de Massa Livre de Gordu
ra com os genótipos do
polimorfismo TaqI.
Genótipo do TaqI
tt Tt TT
Valor de P
MLGA (Kg) 15,41 ± 1,89 16,08 ± 2,37
15,85 ± 3,06 ,649
MLGA relativa (Kg/m
2
) 6,72 ± 0,59 6,82 ± 0,70 6,92 ± 1,18 ,746
MLG Total (Kg) 37,62 ± 4,07 39,07 ± 5,37
37,71 ± 5,32 ,108
MLG Total relativa (Kg/m
2
) 16,43 ± 1,34 16,58 ± 1,59
16,48 ± 2,07 ,640
MLGA = Massa Livre de Gordura Apendicular; MLG = Massa Livre de Gordura.
56
6. DISCUSSÃO
6.1. Características da amostra
Todas as participantes tiveram a Massa livre de gordura (MLG) identificada através do
método do DXA, procedimento que tem sido amplamente utilizado em adultos jovens e
idosos de ambos os sexos (HEYMSFIELD et al., 1990; GALLAGHER et al., 1997;
BAUMGARTNER et al., 1998; BAUMGARTNER et al., 1999; KYLE et al., 2001; ROTH et
al., 2004). Adicionalmente, em outro estudo, a MLG avaliada pelo DXA apresentou
associação com diversas limitações funcionais, incluindo dificuldade de caminhada,
mobilidade e atividades básicas da vida diária (MELTON et al., 2000). A análise da MLG
através de um software automático com ajuste fino manual pode ser expressa por diferentes
regiões corporais, mais especificamente membros superiores, membros inferiores e tronco. O
método permitiu ainda a estimativa da Massa Gorda dos indivíduos.
A MLG total (corpo inteiro) observada na amostra foi, em média, 38,20 Kg. Esses
valores, fazendo-se uma comparação descritiva, diferem discretamente do estudo de KYLE et
al. (2001), no qual uma amostra de 100 mulheres caucasianas com idade situada entre 60 e 94
anos apresentou uma MLG média de 41,4 Kg. Essa análise nos faria concluir que mulheres
caucasianas idosas apresentam maior MLG quando comparadas às brasileiras, entretanto,
existe a necessidade de se levar em consideração a estatura desses indivíduos. Nesse sentido,
ao se derivar a MLG pela estatura ao quadrado, de forma análoga a formula do IMC,
diferenças associadas à maior ou menor estatura são eliminadas de forma eficiente, como
proposto por Baumgartner at al. (1998). De fato, no estudo de Kyle et al. (2001) as idosas
caucasianas apresentaram estatura consideravelmente maior quando comparadas às
participantes do presente estudo (159,8cm vs. 151,9cm). Portanto, fazendo a comparação
entre os estudos da MLG total relativa à estatura, observa-se que a amostra do presente estudo
e o de Kyle et al.(2001) apresentaram valores mais próximos: 16,52Kg/m
2
e 16,23Kg/m
2
,
respectivamente. Por outro lado, LAU et al. (2005), em um estudo composto por uma amostra
de idosas chinesas, observaram MLG relativa média de 17,53 Kg/m
2
, fato que pode sugerir
uma diferença étnica no citado fenótipo muscular. Dessa forma, outros estudos precisam ser
conduzidos com o objetivo de esclarecer essas possíveis diferenças. Como já era esperado, a
MLG total e a relativa das mulheres brasileiras envolvidas na presente investigação foram
consideravelmente inferiores aos valores observados em homens idosos Afro-Americanos
57
(GALAGHER et al.,1997) e Caucasianos (BAUMGARTNER et al., 1998; ROTH et al.,
2004).
Ao se estudar MLG, a importância de se levar em consideração a MLGA, ou seja, o
somatório da MLG dos membros superiores e dos membros inferiores, tem sido demonstrada
(HEYMSFIELD et al., 1990; BAUMGARTNER et al., 1998; ROTH et al., 2004). Nesse
sentido, foi observado que a amostra apresentou MLGA absoluta e relativa à estatura de, em
média, 15,85Kg e 6,85 Kg/m
2
, respectivamente. Confrontando com dados evidenciados em
outros estudos, o valor médio de MLGA relativa do presente estudo se mostrou similar ao
observado em idosas chinesas (LAU et al., 2005) e em Caucasianas (KYLE et al., 2001),
entretanto, superior ao apresentado por idosas do Novo México (BAUMGARTNER et al.,
1998) e inferior ao de idosas Afro-Americanas (GALLAGHER et al., 1997). É difícil tirar
alguma conclusão dessas diferenças observadas entre alguns dos citados estudos, pois, além
de etnias distintas, a multifatoriedade, tais como, os hábitos nutricionais, reposição hormonal
e a prática de atividade física, que permeiam o fenótipo, podem estar explicando parte das
diferenças. Os valores de MLG total, a MLGA das voluntárias se mostrou inferior quando
comparados a dados oriundos de diferentes grupos étnicos formados por homens idosos
(GALAGHER et.,1997; BAUMGARTNER et al., 1998; ROTH et al., 2004).
O fenômeno da perda de massa muscular que acompanha o avançar da idade é
atualmente denominado de Sarcopenia. Esse processo tem sido associado a indesejáveis
conseqüências à saúde tais como, aumento do número de quedas, declínio da capacidade
funcional, osteoporose, disfunção da termorregulação e intolerância à glicose (FIATARONE
et al., 1994; KENNEY et al, 1995). A sarcopenia na população Brasileira ainda não tem um
ponto de corte determinado, pois, os dados disponíveis na literatura não são suficientes para
uma afirmação precisa. Baumgartner et al. (1998), em um dos poucos estudos
epidemiológicos sobre essa temática, definiram a significância clínica da sarcopenia
(patológica) como a massa muscular apendicular relativa mais do que dois desvios padrões
abaixo da média de um grupo referencial de indivíduos jovens. No citado estudo, a amostra
foi composta idosos de ambos os sexos, entretanto, de um grupo demográfico distinto da
amostra do presente estudo. Dessa forma, não é possível classificar as participantes do
presente estudo como acometidas ou não pela sarcopenia, conseqüentemente, inviável de
expressar valores de prevalência nessa população. O ponto de corte identificado no estudo de
Baumgartner foi uma massa muscular apendicular relativa menor que 7,26 Kg/m
2
e menor que
5,45 Kg/m
2
para homens e mulheres, respectivamente. Caso essa abordagem fosse utilizada
para o presente estudo, 4,71% (resultados não apresentados) das voluntárias estariam
58
acometidas, dado contrastante aos resultados obtido por Baumgartner et al. (1998) e Melton et
al. (2000), os quais, adotando uma abordagem similar, relataram prevalência 33,78% e 27%,
respectivamente, em mulheres idosas. Claramente, futuros estudos compostos por amostra
adequada da população brasileira precisam ser conduzidos para se definir um ponto de corte
robusto para especificação da sarcopenia. A despeito desses conceitos, tem sido demonstrado
que a MLG avaliada pelo DXA apresenta associação com diversas limitações funcionais,
incluindo dificuldade de caminhada, mobilidade e atividades básicas da vida diária
(MELTON et al., 2000). O método (DXA) vem sendo apontado como um meio prático e
preciso para se quantificar um parâmetro de grande importância clínica que é a massa
corporal livre de gordura (KIM et al., 2002).
Foi observado que as participantes do estudo apresentaram um percentual de gordura
médio de 38,29%. Utilizando o mesmo método para estimar a gordura corporal (DXA),
alguns estudos apresentam dados de mulheres idosas de diferentes grupos étnicos. Em idosas
Caucasianas foi evidenciado um valor médio de 34,6% (KYLE et al., 2001) e de 33,3%
(GALLAGHER et al., 1997), em Afro-americanas uma média de 36,0% (GALLAGHER et
al., 1997), em idosas do Novo México 38,7% (BAUMGARTNER et al., 1998), em Chinesas
34,9% (LAU et al., 2005) e em mulheres idosas da Dinamarca um percentual de gordura
corporal médio de 42,5% (SORENSEN et al., 2001).
Tem sido demonstrado que o percentual de gordura corporal se correlaciona positiva e
significativamente com a idade (DOUCHI et al., 2002). De fato, a menopausa está relacionada
a um aumento da gordura corporal, o que possivelmente está ligado à menor produção de
esteróides ovarianos, sobretudo o estrógeno (SORENSEN et al., 2001). Esse processo tem
sido apontado como uma das explicações para a maior incidência de doenças em mulheres
pós-menopausa quando comparadas às pré-menopausa, sendo inclusive o percentual de
gordura corporal correlacionado positivamente com a pressão arterial sistólica e diastólica
(VAN PELT et al., 2002). A prevalência de hipertensão arterial observada entre as voluntárias
da presente investigação foi bastante elevada, apresentando um valor de 66,49% do total. De
fato, a prevalência da hipertensão se eleva com o avançar da idade, atingindo cerca de metade
da população com idade entre 60 e 69 anos, e três quartos daqueles com idade acima dos 70
anos (The Joint National Comittee 7, 2003), dados que são congruentes com os achados do
presente estudo. Dessa forma, fica obvio a necessidade de implantação de intervenções
objetivando o controle da gordura corporal em mulheres idosas. Nesse sentido, a combinação
da dieta com o exercício físico regular vem sendo apontada como uma conduta eficaz na
59
redução de peso e conseqüente risco metabólico em mulheres obesas (TONACIO et al.,
2006).
6.2. Genótipos do VDR e associação com massa livre de gordura
Após consultas na literatura, não foi encontrado nenhum estudo que tenha examinado
a associação entre fenótipos relacionados à massa muscular com polimorfismos presentes ao
longo do gene VDR em indivíduos brasileiros. Em se tratando de uma amostra de brasileiras
em fase pós-menopausa, ou seja, um subgrupo específico da população, os dados são ainda
mais escassos. Por outro lado, a detecção de variações genéticas que apresentem papel no
processo de perda de massa magra que acompanha o envelhecimento ajudará a identificar
indivíduos que são suscetíveis, possibilitando a implantação antecipada de intervenções
capazes de preservar a função muscular, o que propiciará a manutenção da autonomia e
melhora da qualidade de vida dos indivíduos idosos.
Possivelmente, diversos são os genes que contribuem para fenótipos como tamanho
muscular e força muscular. A identificação desses genes é uma tarefa desafiadora,
particularmente devido ao fato de que um polimorfismo pode ser uma variável de
confundimento para aquele polimorfismo que está sendo estudado e a diversidade de
populações que está sendo estudada faz com que a freqüência alélica varie em função da etnia
(THOMPSON et al., 2004). Fica nítida a importância de se conduzir investigações dessa
natureza na população brasileira, a qual apresenta, indubitavelmente, uma ampla
heterogeneidade étnica (HAUACHE et al., 1998), diferindo das amostras mais utilizadas em
estudos de associações com fenótipos musculares, como por exemplo, os caucasianos, os
japoneses, belgas e chineses, os quais apresentam características mais homogêneas. A idéia de
heterogeneidade fica latente com os resultados do presente estudo, no qual foi observado cor
referida de pele branca em 41.36% das voluntárias, morena em 40,84%, negra em 16,23% e
vermelha em 1,57% da amostra.
Por razões já descritas no capítulo de revisão de literatura, o gene VDR apresenta um
potencial de gene candidato a contribuir para os fenótipos musculares em humanos, e para a
perda de massa muscular decorrente do envelhecimento, entretanto, estudos objetivando essas
associações são bastante escassos. Anualmente o periódico oficial do Colégio Americano de
Medicina Desportiva publica uma atualização acerca de genes associados a fenótipos de saúde
e performance (inclusive musculares), cujo título é “The Human Gene Map for Performance
and Health-Related Fitness Phenotypes”. Somente na atualização mais recente (publicada em
60
2005) o gene VDR entrou no “hall” daqueles associados a fenótipos musculares, sendo
referenciados 03 estudos: Geusens et al.(1997), Grundberg et al. (2004) e Roth et al. (2004).
O presente estudo teve em seu escopo a proposta de colaborar com o preenchimento dessa
lacuna existente na literatura e dar início a realização de estudos de associação entre fenótipos
musculares com genes candidatos, tendo em vista tratar-se de uma tendência mundial.
A realização da genotipagem dos polimorfimos adotados nessa investigação teve uma
duração aproximada de 06 meses e, o êxito do processo ficou evidente obtendo-se resultados
idênticos ao se refazer todo o procedimento com aproximadamente 50 amostras escolhidas
aleatoriamente. Talvez o aspecto mais relevante da genotipagem realizada tenha sido a
aplicação de um método prático e pouco utilizado nos estudos envolvendo o gene VDR.
Enquanto a grande maioria dos estudos revisados (GROSS et al., 1996; GEUSENS et
al.,1997; TAJIMA et al., 2000; GRUNDBERG et al. 2004; ROTH et al., 2004) empregaram o
uso de enzimas de restrição para identificação dos genótipos, a presente investigação utilizou
o minisequenciamento. A utilização satisfatória desse método o torna uma opção prática para
ser utilizada em futuros estudos que tenham em sua metodologia a necessidade de genotipar
polimorfismos no gene VDR (detalhes vide materiais e métodos).
Dessa forma, após a genotipagem e a coleta dos valores de MLG, foi então verificada
a associação entre os genótipos com os fenótipos musculares. Para melhor organização e
visualização, a discussão dos resultados dessas associações será exposta separadamente para
cada polimorfismo.
6.2.1. Polimorfismo ApaI
Um total de 187 mulheres em fase pós menopausa foram genotipadas para o
polimorfismo ApaI através da metodologia utilizada. A freqüência do alelo a foi 0,414
enquanto que a do alelo A foi 0,586, ficando os genótipos AA, Aa e aa representados por
32,62%, 51,87% e 15,51% da amostra, respectivamente. Essa distribuição não se encontrou
dentro do equilíbrio de Hardy-Weinberg, fato que minimiza a possibilidade de viés na seleção
da amostra. Com relação aos demais polimorfismos estudados na presente pesquisa, a
freqüência alélica do ApaI foi o que apresentou maior variação na literatura. Por exemplo, a
freqüência do genótipo AA foi relatada em ser 9% em asiáticos (TOKITA et al., 1996), 28%
em caucasianos (JORENSEN et al., 1996) e 44% em afro-americanos (ZMUDA et al., 1997),
valores que são menor, similar e maior, respectivamente, quando comparados aos resultados
desse estudo. Em homens jovens, Bell et al. (2001) relataram prevalência de 42,2%, 42,2% e
61
15,4% para os genótipos AA, Aa e aa, respectivamente, dados que se aproximam dos achados
desse estudo. Van Pottelbergh et al. (2002) observaram, em homens belgas, que os alelos A e
a apresentaram freqüência de 0,537 e 0,463, respectivamente, o que foi semelhante ao
encontrado entre as brasileiras. Adicionalmente, 99% das participantes com o genótipo AA
eram também portadoras do genótipo BB, dados que são idênticos aos achados em idosas
caucasianas (GARNERO et al., 2005). Com relação às portadoras do genótipo aa, 60% eram
também bb, resultados congruentes aos achados de Garnero et al. (2005).
Entre os genótipos não foi observada diferença significativa para idade, massa
corporal, estatura, IMC, percentual de gordura, nível de atividade física ou reposição
hormonal. O fato de não haver diferenças de idade, nível de atividade física e reposição
hormonal minimiza a possibilidade de fatores ambientais estarem interferindo nos fenótipos.
Os resultados do presente estudo são corroborados pelos achados de Garnero et al. (2005), os
quais relataram não haver diferença entre os genótipos para massa corporal ou estatura em
mulheres caucasianas na fase pós menopausa. Em mulheres dinamarquesas, Jorgesen et al.
(1996) não evidenciaram qualquer associação entre o polimorfismo ApaI ao examinar as
mesmas variáveis dependentes. Os resultados desse estudo se encontram coerentes com os
dados disponíveis na literatura, os quais sugerem que esse polimorfismo não interfere
significativamente nas variáveis massa corporal ou estatura.
A presente investigação examinou a associação entre o polimorfismo ApaI com
parâmetros de MLG. A análise de covariância não revelou nenhuma diferença entre os
genótipos para MLG total, MLG total relativa, MLG apendicular ou MLG apendicular
relativa. Nesse sentido, não foi encontrado nenhum estudo que tenha abordado a associação
isolada do polimorfismo ApaI com parâmetros de MLG. Os dados disponíveis desse sítio
polimórfico com relação a fenótipos musculares são oriundos de um estudo que examinou a
associação com índices de força (IKI et al., 2002), no qual foi relatado não haver associação
entre o polimorfismo com força de preensão manual e nem com força dos flexores e
extensores dos joelhos e do tronco. Essa homogeneidade na força muscular entre os genótipos
não se alterou após ajuste para o efeito da estatura e tamanho corporal. Uma vez que força
muscular se relaciona positivamente com MLG (LINDLE, 1997), os resultados de Iki et al.
(2002) apresentam congruência com os do presente estudo.
O polimorfismo ApaI não altera a estrutura da proteína VDR, o que despertou o
interesse dos estudiosos para realizar estudos de associação envolvendo grupos haplotípicos.
Nesse sentido, Van Pottelbergh et al. (2002) examinaram a associação de haplótipos do VDR
com índices de força muscular e massa magra em homens belgas, e evidenciaram que, apenas
62
nos idosos, o haplótipo At-At apresentou maior massa corporal e massa magra quando
comparado aos demais grupos, entretanto, a massa magra foi avaliada através da impedância
bioelétrica, método diferente do adotado em nosso delineamento. Adicionalmente, o mesmo
estudo investigou também associação com diversos índices de força muscular, entretanto, não
foi observada qualquer diferença entre os haplótipos. Em conjunto com os dados disponíveis
na literatura, os resultados do presente estudo sugerem que, isoladamente, o polimorfismo
ApaI no gene VDR não interfere significativamente na MLG de mulheres em fase pós
menopausa. Futuros estudos são necessários para tornar mais robustos esses achados, e devem
adicionar em seu escopo a análise de haplótipos.
6.2.2. Polimorfismo BsmI
Foi possível identificar os genótipos do polimorfismo Bsm I em 183 voluntárias
através da metodologia empregada. A freqüência do alelo G (b) foi 0,683 enquanto que a do
alelo A (B) foi 0,317, ficando os genótipos bb, Bb e BB representados por 49,18%, 38,25% e
12,57% da amostra, respectivamente. Essa distribuição não apresentou diferença significativa
do equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Pode ser observado que o genótipo representado pelos alelos BB é o menos freqüente,
o que é corroborado por achados prévios, os quais são baseados tanto em população brasileira
como em outros grupos étnicos. Em uma amostra de negros dos Estados Unidos, Bell at al.
(2001) relataram que esse genótipo mais raro (BB) foi encontrado 6,2% da amostra, enquanto
que entre os brancos 10,8% dos indivíduos eram portadores desses alelos. Os autores
utilizaram uma amostra de 83 indivíduos, o que representa um modesto número, com idade
compreendida entre 20 e 40 anos e não foi observada diferença na distribuição dos genótipos
do VDR entre os homens brancos e negros. Roth et al. (2004) evidenciaram resultados
semelhantes em idosos caucasianos, no qual o genótipo menos comum foi o BB. A freqüência
alélica foi a seguinte: BB 24,9%, Bb 37,7% e bb 37,4%, o que diferiu do equilíbrio de Hardy-
Weinberg. Em adolescentes caucasianos, Lorentzon et al. (2000) observaram a freqüência de
variações alélicas Bsm I de 14%, 44% e 41% para os genótipos BB, Bb e bb, respectivamente,
o que segue tendência similar ao presente estudo, aos citados nesse parágrafo, e também aos
achados de outros autores (GEUSENS et al., 1997; GRUNDBERG et al., 2004; XIONG et al.,
2005).
Estudos que realizaram a genotipagem do polimorfismo Bsm I em brasileiros são ainda
bastante escassos, entretanto, os dados disponíveis corroboram o fato de o genótipo BB ser o
63
mais raro. Hauche et al. (1998) observaram freqüência desse genótipo de 12,8% e 16,7% em
jovens brasileiros saudáveis e portadores de diabetes mellitus insulino-dependente,
respectivamente. Castro et al. (1997) evidenciaram, em 127 mulheres brasileiras com idade
média de 31 anos, uma distribuição alélica de 41% classificados como bb, 48,8% como Bb, e
10,2% como BB. Em resumo, os estudos são unânimes ao encontrar o genótipo BB como o
mais raro, com prevalência variando de 6,2% a 16,7% em indivíduos de diversas etnias, faixa
em que se encontra o resultado do presente estudo, que foi de uma prevalência de 12,57%.
Não foi observada diferença significativa entre os genótipos para idade, massa
corporal, estatura, IMC, percentual de gordura, nível de atividade física ou reposição
hormonal. Uma vez que o principal objetivo do estudo foi verificar associação entre os
genótipos com fenótipos musculares, essa igualdade entre os grupos favorece a possibilidade
das possíveis diferenças entre os fenótipos serem atribuídas ao polimorfismo. Os achados do
presente estudo são congruentes com o trabalho de Castro et al. (1997), no qual não foi
evidenciada diferença massa corporal, estatura ou IMC entre os grupos, embora a amostra
tenha sido composta por brasileiras jovens. Por outro lado, Hauche et al. (1998) não
encontraram diferença de IMC entre os genótipos, entretanto, o grupo formado pelo Bb
apresentou massa corporal significativamente maior que o BB. Porém, esse achado foi
observado apenas nos portadores de Diabetes tipo 1, e são baseados em uma amostra
relativamente pequena (78 indivíduos), a qual foi composta por indivíduos de ambos os sexos.
Em mulheres suecas jovens também não foi observada diferença significativa entre os alelos
do Bsm I para massa corporal, estatura ou IMC (GRUNDBERG et al., 2004).
Com relação aos fenótipos de massa livre de gordura, não houve qualquer diferença
significativa entre os genótipos. O achado é corroborado por estudos que abordaram essa
mesma temática (isso tá mal explicado). Grundberg et al. (2004) não evidenciaram diferenças
entre os genótipos do Bsm I para MLG total (mensurada através do DXA) em mulheres suecas
com idade média de 29.6 anos. Adicionalmente, os achados desse estudos são similares ao de
Roth et al. (2004) em caucasianos idosos, no qual não foi observada diferença significativa
entre os grupos do Bsm I para nenhum dos fenótipos musculares, ou seja, MLG total, MLG
total relativa, MLGA ou MLGA relativa. Entretanto, são necessários outros estudos para
verificar a associação entre o polimorfismo Bsm I do VDR com MLG, porém, os dados
disponíveis não apontam esse loco gênico como importante modulador do tecido não ósseo
livre de gordura.
Tem sido postulado que o tecido muscular está positivamente relacionado à força
muscular (LINDLE, 1997). Nesse sentido, alguns estudos buscaram associação entre o
64
polimorfismo Bsm I com o fenótipo força. Seguindo a mesma associação observada com
massa livre de gordura, Roth et al. (2004) não encontraram diferença significativa entre os
genótipos em relação a força do quadríceps nem força de preensão manual utilizando na
amostra idosos caucasianos. Por outro lado, Grundberg et al. (2004) demonstraram que, em
mulheres suecas jovens, o grupo formado pelo BB apresentou força da musculatura posterior
da coxa significativamente maior quando comparado aos portadores do genótipo bb, sendo o
fenótipo mensurado através de um dinamômetro isocinético. Entretanto, não foi observado
diferença de MLG entre os grupos. O achado de Grunberg et al. (2004) foram controversos
aos resultados descritos anteriormente por Geusens et al. (1997), os quais evidenciaram que,
em mulheres idosas, os portadores do genótipo bb é que apresentaram força do quadríceps
maior quando comparadas as BB. Dessa forma, fica nítida a necessidade de mais estudos para
verificar a possibilidade de associação entre as variantes genéticas nesse loco do gene VDR
com o fenótipo força muscular.
6.2.3. Polimorfismo Cdx-2
A genotipagem do polimorfismo Cdx-2 foi realizada em um total de 189 mulheres em
fase pós-menopausa. A freqüência do alelo G (Cdx-G) foi 0,646 enquanto que a do alelo A
(Cdx-A) foi 0,354, ficando os genótipos Cdx-G, Cdx-G/A e Cdx A representados por 41,80%,
45,50% e 12,70% da amostra, respectivamente. Essa distribuição não apresentou diferença
significativa do equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Em referência a esse polimorfismo também não foram encontrados estudos brasileiros.
A presente investigação foi a primeira a genotipar indivíduos brasileiros em relação ao
polimorfismo Cdx-2. Poucos trabalhos conduziram a genotipagem desse fragmento, mesmo
em outras populações. De fato, Fang et al. (2003) relataram que dados referentes à ocorrência
desse polimorfismo em outro grupo étnico que não os japoneses são ainda desconhecidos. A
maioria dos estudos envolvendo polimorfismos no gene VDR enfocam as variantes
localizadas na região 3’, como por exemplo, o Bsm I, o ApaI e o Taq I. Um outro
polimorfismo comumente estudado no gene VDR é o Fok I, o qual altera a estrutura prevista
da proteína VDR (GROSS et al., 1996).
Em um dos poucos trabalhos envolvendo o Cdx-2, Arai et al. (2001) tiveram como
amostra 261 mulheres japonesas com idade variando entre 19 e 71 anos, das quais 48 eram
portadoras do genótipo Cdx-A (18,39%), 131 eram heterozigotos Cdx-G/A (50,19%) e 82
Cdx-G (31,42%). Em congruência com os resultados do presente estudo, o alelo A foi o
65
menos freqüente, apresentando valores de 0,43 e 0,354 nos estudo de Arai et al. (2001) e
neste, respectivamente. A freqüência do alelo A foi ainda menor no estudo conduzido por
Fang et al. (2003), apresentando um valor de 0,19.
Entre os grupos genotípicos formados (Cdx-G, Cdx-G/A e Cdx-A), não foram
observadas diferenças para idade, massa corporal, estatura, IMC, percentual de gordura, nível
de atividade física ou reposição hormonal. Tais resultados corroboram o estudo de Arai et al.
(2001), no qual não houve diferenças significativas entre os grupos para massa corporal,
estatura, IMC ou percentual de gordura, sendo esse resultado valido para as mulheres em fase
pré e pós menopausa.
Com relação aos fenótipos de MLG, também não se identificou diferença significativa
entre os genótipos. Até a presente data, temos conhecimento de apenas um estudo (ARAI et
al., 2001) que verificou associação entre o polimorfismo Cdx-2 com massa magra,
apresentando em seus resultados congruência com os nossos achados. Analisando mulheres
japonesas, Arai et al. (2001) não demonstraram qualquer associação entre o polimorfismo
Cdx-2 com MLG em mulheres jovens nem em idosas.
As associações entre os alelos do Cdx-2 com fenótipos de composição corporal
apontam para um melhor perfil de densidade mineral óssea para os portadores do alelo A
(ARAI et al., 2001; FANG et al., 2003). Baseado nessas observações e, no fato de que força
muscular é um indicador da densidade mineral óssea (KRITZ-SILVERSTEIN & BARRET-
CONNER, 1994), teve-se o interesse em estudar a associação desse lócus gênico com
fenótipos relacionados à MLG, entretanto, os resultados não sinalizaram significância
estatística. Pesquisas futuras se fazem necessárias para estabelecer a ocorrência desse
polimorfismo em indivíduos brasileiros para confirmar a falta de associação com fenótipos
musculares observada na presente investigação.
Polimorfismo FokI
A distribuição dos genótipos do polimorfismo Fok I do VDR está de acordo com o
equilíbrio de Hardy-Weinberg, com os alelos FF, Ff e ff representados por 41,80%, 46,03% e
12,17% da amostra, respectivamente. A freqüência do alelo F foi de 0,648 e do f 0,352. Esses
achados se mostraram bastantes similares aos dados de uma grande amostra de sujeitos com
origem americana, no qual a freqüência dos alelos F e f foi de 0,627 e 0,373, respectivamente
(XIONG et al., 2005). Em idosos caucasianos, a freqüência do alelo menos comum (f) foi
descrita em ser 0,380 (ROTH et al., 2004), valor que apresenta similaridade com os nossos
66
resultados. A distribuição dos genótipos da amostra de Roth et al. (2004) apresentou-se dentro
do equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo 37,7% dos indivíduos portadores do genótipo FF,
48,4% Ff, e 13,9% ff. Em idosas afro-americanas, a freqüência dos alelos F e f foi de 0,784 e
0,216, respectivamente (ZMUDA et al., 1999). Harris et al. (1997) relataram que, em 154
mulheres americanas jovens, o alelo f foi o menos comum, mesmo dividindo sua amostra em
brancas e negras. Os autores observaram prevalência do genótipo ff de 12% para toda a
amostra, 4% entre as negras e 18% entre as brancas. De acordo com a revisão de literatura
realizada, nenhum trabalho apresentou dados de genotipagem do polimorfismo Fok I em uma
amostra de indivíduos brasileiros. Os resultados do presente estudo são inéditos em
brasileiros, permitindo apenas comparações com estudos compostos por amostras de
diferentes grupos étnicos. Nesse sentido, os dados foram de acordo com os autores citados
acima, nos quais o alelo menos freqüente é o f, fato que foi também relatado para idosas
caucasianas (GROSS et al., 1996), em jovens americanos (BELL et al., 2001) e em idosos
belgas (VAN POTTELBERGH et al., 2002).
Entre os genótipos do Fok I, a análise de variância não detectou diferença significativa
para idade, massa corporal, estatura, IMC, percentual de gordura, nível de atividade física ou
reposição hormonal. Essa igualdade entre os grupos favorece a possibilidade das possíveis
diferenças entre os fenótipos serem atribuídas ao polimorfismo. Com relação ao IMC, os
dados estão de acordo com os resultados de Gross et al. (1996), os quais não observaram em
100 idosas caucasianas diferenças entre os grupos genotípicos. Zmuda et al. (1999), em um
estudo cuja amostra foi composta por 104 idosas afro-americanas, também não observaram
diferenças entre os genótipos do Fok I para os fenótipos massa corporal, estatura ou IMC. Em
154 jovens americanas, Harris et al. (1997) não identificaram qualquer diferença entre os
grupos para massa corporal ou estatura, entretanto, ao estratificar as participantes em brancas
e negras, foi evidenciado que, apenas nas brancas, o genótipo ff apresentou massa corporal
significativamente maior que os demais grupos. Essa discrepância com os estudos citados e
com o presente resultado, pode estar relacionado às características distintas da amostra, uma
vez que Harris at al. (1997) estudou americanas brancas jovens, e, adicionalmente, o número
de participantes foi relativamente pequeno (n = 81). Por outro lado, os achados de Harris et al.
(1997) apresentaram uma tendência similar aos de Roth et al. (2004), os quais evidenciaram
que idosos caucasianos portadores do genótipo FF demonstraram menor massa corporal e
IMC quando comparados aos demais grupos. Os estudos envolvendo mulheres idosas estão de
acordo com os achados do presente estudo, entretanto, em populações distintas (idosos
caucasianos e americanas jovens de cor branca) foi relatado diferenças entre os genótipos.
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Estudos futuros precisam averiguar a possibilidade de associação entre o polimorfismo Fok I
com massa corporal, estatura e IMC.
O presente estudo examinou a associação entre o polimorfismo no códon de início da
translação (Fok I) do gene VDR com fenótipos de massa livre de gordura em brasileiras em
fase pós-menopausa. Não foram encontradas nenhuma associação desse polimorfismo com
MLG total, MGL total relativa, MGLA ou MGLA relativa.
Poucos estudos examinaram a associação entre o polimorfismo Fok I e MLG. Roth et
al. (2004) evidenciaram, em idosos caucasianos, significativa diferença entre os genótipos
para os fenótipos de massa livre de gordura. Para MLG total, MGL total relativa, MGLA e
MGLA relativa, o grupo formado pelo FF exibiu valores significativamente menores quando
comparado aos grupos Ff e ff. Adicionalmente, os grupos foram significativamente associados
com força do músculo quadríceps, entretanto, após ajuste para MLG, a significância não foi
mais observada. O estudo Roth et al. (2004) foi o primeiro e único a demonstrar associação
entre o polimorfismo no local de início translação do gene VDR com tecido livre de gordura,
porém, como os próprios autores concluíram, os resultados requerem validação em outras
populações e em mulheres, exatamente o que foi verificado no presente estudo, entretanto, os
resultados não foram concordantes. A divergência entre os resultados precisa de futuros
estudos para ser melhor explicada, entretanto, deve ser levado em consideração a diferença de
etnia e de gênero entre as amostras. Nesse sentido, uma pesquisa conduzida pelo mesmo
grupo demonstrou que um polimorfismo no gene da interleucina-6 está associado com MLG
em homens, mas não em mulheres (ROTH et al., 2003).
Embora alguns estudos tenham sido conduzidos com o objetivo de examinar
associações entre genótipos do VDR com fenótipos musculares, apenas um outro trabalho
examinou o Fok I, o qual é o único polimorfismo conhecido em influenciar a estrutura da
proteína VDR. Van Pottelberg et al. (2002) não observaram qualquer associação entre os
alelos do Fok I com força de preensão manual ou do músculo bíceps em jovens nem em
idosos. A única associação identificada no estudo foi com o tempo mínimo necessário para
levantar cinco vezes da posição sentada, a qual só ocorreu nos indivíduos jovens. Entretanto,
o menor tempo foi verificado nos portadores do genótipo FF quando comparados aos Ff e ff,
resultados que seguem uma tendência contraria aos achados de Roth et al. (2004).
Claramente, os dados disponíveis acerca da temática são controversos, formando uma lacuna
de conhecimento que deverá ser preenchida com futuros estudos.
68
6.2.5. Polimorfismo TaqI
Os genótipos do polimorfismo Taq I do VDR (TT 48,91%, Tt 35,87%, tt 15,22%) e a
freqüência alélica (T = 0,668, t = 0,332) está de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg,
sugerindo que não houve viés de seleção. Os resultados mostraram similaridade com a
freqüência alélica observada em idosos belgas, onde a do alelo T foi 0,643 e do t 0,357 (VAN
POTTELBERGH et al., 2002). Bell et al. (2001) relataram achados semelhantes ao do
presente estudo, onde o genótipo tt esteve presente em 15,68% de uma amostra composta por
australianos jovens. Observações concordantes foram também descritas em mulheres na
Dinamarca, dentre as quais 16,6% eram portadoras do genótipo tt, enquanto os grupos
formados pelos alelos TT e Tt representaram 35,41% e 47,99% da amostra, respectivamente.
(JORGENSEN et al., 1996). Outros estudos relataram distribuição dos genótipos similar aos
presentes resultados em idosas inglesas (KEEN et al., 1997) e japonesas (IKI et al., 2002).
Nossas observações seguiram a mesma direção das de Garnero et al. (2005), no qual a maioria
dos indivíduos com genótipo TT eram também bb (referente ao polomorfismo Bsm I) e a
maioria dos indivíduos tt eram BB (Bsm I). Exemplificando, as voluntárias do genótipo TT
portavam também o bb em 80% dos casos e o genótipo tt foi associado ao genótipo BB em
72% das participantes. Os resultados sugerem que, mesmo na população caracterizada por
uma extensa miscigenação racial como é o caso dos brasileiros, a freqüência alélica do
polimorfismo Taq I no gene VDR segue a mesma tendência observada em outros grupos
étnicos. De fato, Bell et al. (2001) relataram que não houve diferença na distribuição dos
genótipos do VDR quando comparados homens brancos e negros.
Entre os grupos TT, Tt e tt, a análise de variância não identificou diferença
significativa para nenhuma das seguintes características: idade, massa corporal, estatura, IMC,
percentual de gordura, nível de atividade física ou reposição hormonal. Essa igualdade
minimiza a interferência de fatores de confundimento nos fenótipos estudados. Os achados
confirmam os resultados de Keen et al. (1997), os quais demonstraram que não houve
diferença entre os genótipos do Taq I para massa corporal nem para estatura, em idosas
inglesas. Garnero et al. (2005) apresentaram dados concordantes, nos quais não foi observada
diferença de massa corporal ou estatura entre os grupos genotípicos numa amostra de
mulheres caucasianas. Em mulheres da Dinamarca, Jorgesen et al. (1996) não verificaram
associação entre os genótipos com massa corporal ou estatura. Os achados do presente estudo
estão de acordo com o observado na literatura, os quais em conjunto sugerem que o
polimorfismo Taq I do VDR não interfere nos fenótipos relacionados a massa corporal ou
69
estatura. Adicionalmente, os achados foram similares para percentual de gordura, entretanto,
não foi identificado um outro estudo que tenha examinado associação com esse fenótipo,
tornando inviável a comparação com outros resultados.
O modelo de analise de variância ajustado para as potenciais covariantes não
identificou diferença entre os grupos genotípicos do polimorfismo Taq I para nenhum dos
fenótipos musculares examinados (MLG total, MLG total relativa, MLGA e MLGA relativa).
De acordo com a extensa revisão realizada, nenhum estudo investigou a associação do
polimorfismo Taq I isoladamente com MLG. Os dados disponíveis desse sítio com relação a
fenótipos musculares são oriundos de um estudo que examinou a associação com diversos
índices de força (IKI et al., 2002). Os autores mensuraram, através de equipamentos
validados, força de preensão manual e de flexores e extensores dos joelhos e do tronco, e
observaram que entre os genótipos TT, Tt e tt não houve diferença significativa para nenhum
dos índices. Essa homogeneidade na força muscular entre os genótipos não se alterou após
ajuste para o efeito da estatura e tamanho corporal. Uma vez que força muscular se relaciona
positivamente com MLG (LINDLE, 1997), os resultados de Iki et al. (2002) apresentam
congruência com os do presente estudo.
O polimorfismo TaqI é resultante de uma mutação em uma região transcritora,
caracterizada pela troca da Timina por Citosina, e está localizado no exon IX do gene VDR.
No entanto, a troca dessas bases nitrogenadas não altera o aminoácido a ser sintetizado, pois
tanto os códons ATT quanto ATC são relativos a Isoleucina (MORRISSON et al., 1992),
portanto, sem alterações funcionais aparentes na proteína prevista. Entretanto, ao se examinar
a associação entre haplotipos com a função do VDR, foi demonstrado diferença entre os
genótipos (MORRISON et al., 1994). Nesse sentido, Van Pottelbergh et al. (2002)
examinaram a associação de haplotipos do VDR com índices de força muscular e MLG em
homens belgas, e evidenciaram que, nos idosos, o genótipo At-At apresentou maior massa
corporal e MLG quando comparado aos demais grupos. Não foi observada associação similar
para massa corporal ou MLG no grupo formado pelos homens jovens. Por outro lado,
nenhuma associação entre os haplótipos com os diversos índices de força muscular
mensurados foi notada.
Até o presente momento a literatura não apresenta resultados suficientes para inferir
associação entre o polimorfismo Taq I isoladamente com fenótipos musculares como MLG ou
força. Futuros estudos precisam examinar melhor essa relação, os quais devem incluir em seu
escopo a análise dos haplótipos.
70
6.3. Mecanismos envolvidos entre o gene VDR e fenótipos musculares
Desde seu descobrimento em 1923, o conhecimento sobre a vitamina D passou de um
elemento meramente calciotrópico para um fator mais complexo, com importante papel em
diversos sistemas fisiológicos inclusive função e diferenciação celular (HOLICK, 2002). Esse
hormônio é produzido na pele após exposição a radiação ultravioleta e seu efeito é mediado
pelo receptor de vitamina D (VDR), o qual foi descoberto em 1969 (HAUSSLER &
NORMAN, 1969). O papel da ativação do VDR na função celular e desenvolvimento tecidual
tem sido demonstrado de forma importante nos ossos e nos músculos (DE LUCA et al.,
1988). Capiati et al. (2002) relataram que células musculoesqueléticas de aves embrionárias
respondem genomicamente (expressão do gene) e não genomicamente (translocação do
receptor para a membrana) ao hormônio vitamina D, e sugerem que o VDR nuclear pode ser o
receptor responsável por seus efeitos nos mioblastos. A deleção do gene VDR em ratos
induziu a falta de desenvolvimento muscular, o que sugere a importância da vitamina D no
crescimento e desenvolvimento muscular (ENDO et al., 2003).
Os efeitos da vitamina D no sistema muscular incluem a ativação da proteína kinase C
e a liberação de Cálcio para dentro do sarcoplasma, e esse processo interfere na síntese
protéica das células musculares (MONTEIRO-ODASSO & DUQUE, 2005). É postulado que
a vitamina D desempenhe importantes funções vitais para a manutenção da integridade e
função das células musculares, sendo necessário níveis normais desse hormônio e do seu
receptor (VDR), fato que não acontece em indivíduos idosos (MONTEIRO-ODASSO &
DUQUE, 2005). De fato, a expressão reduzida do VDR durante o envelhecimento tam sido
documentada no tecido muscular (BISCHOFF et al., 2004).
O gene responsável pela síntese da proteína está localizado no cromossomo 12 e,
algumas variações genéticas comuns vêm sendo identificadas em humanos. Dos
polimorfismos examinados no presente estudo, o ApaI e o Bsm I se encontram em introns da
região não traduzida 3’, e parecem não alterar a estrutura da proteína prevista (MORRISON et
al., 1992). O polimorfismo TaqI é resultante de uma mutação em uma região transcritora
(polimorfismo T/C) localizado no exon IX do gene VDR, entretanto, a troca dessas bases
nitrogenadas não altera o aminoácido a ser sintetizado, pois, tanto os códons ATT quanto
ATC são relativos à Isoleucina (MORRISSON et al., 1992), gerando uma mutação silenciosa,
sem alterações funcionais aparentes na proteína prevista. Por outro lado, esses polimorfismos
foram associados a fenótipos ósseos e musculares, porém, com resultados bastante
controversos, o que despertou o interesse de estudá-los em relação a MLG na presente
71
investigação. Os resultados sugerem que os polimorfismos presentes na região 3’ não estão
associados a MLG na amostra composta por brasileiras em fase pós-menopausa, o que pode
estar sendo explicado, pelo menos em parte, pelo fato dos genótipos não alterarem a estrutura
da proteína VDR.
O polimorfismo Fok I, resultante da transição T-C no exon 2 do gene VDR altera o
local de início da tradução e causa uma modificação na seqüência da proteína prevista
(GROSS et al., 1996). Para GROSS et al. (1996), o alelo f faz com que a proteína VDR seja
produzida de forma completa (427 aminoácidos), enquanto que o alelo F sintetiza uma versão
levemente truncada da proteína VDR, com três aminoácidos a menos (424 aminoácidos). Tem
sido demonstrado que os indivíduos portadores do alelo F apresentem uma atividade de
transcrição mais eficiente (JURUTKA et al., 2000; WHITFIELD et al., 2001) e, alguns
estudos têm demonstrado que o genótipo FF apresenta maior densidade mineral óssea
(GROSS et al., 1996; HARRIS et al., 1997; TAJIMA et al., 2000), embora outros não
(ZMUDA et al., 1997; BELL et al., 2001). Baseado nesses achados, Roth et al. (2004)
levantaram a hipótese de que o alelo f fosse associado com reduzida massa muscular,
entretanto, os autores observaram uma associação oposta, nos quais os indivíduos F é que
apresentaram menor MLG. A base molecular para o resultado observado não pode ser
esclarecida no estudo. Já os achados do presente estudo não apresentaram associação entre os
genótipos do Fok I com fenótipos de MLG em mulheres brasileiras, sugerindo que, pelo
menos na população estudada, a diferença funcional entre as variantes da proteína VDR não
interfere nos parâmetros de MLG avaliados através do DXA.
O outro polimorfismo examinado na presente investigação foi o Cdx2 o qual é
localizado na região promotora (5’) do gene VDR e tem sido sugerido em ter relevante papel
na transcrição intestinal do gene VDR. Tem sido demonstrado que o alelo A é mais ativo
quando comparado ao alelo G por realizar a ligação do fator de transcrição Cdx2 de forma
mais consistente e por ter uma maior atividade transcricional (ARAI et al., 2001). De fato,
portadores do genótipo Cdx A apresentaram maior densidade mineral óssea (ARAI et al.,
2001; FANG et al., 2003), entretanto, no único estudo que examinou associação com massa
magra não foi observada diferença significante (ARAI et al., 2001). Os resultados observados
no presente estudo corroboram os achados de Arai et al. (2001), pois, não se observou
diferença entre os genótipos para nenhum dos índices de MLG avaliados. Os dados
disponíveis na literatura não indicam associação entre o polimorfismo Cdx-2 com MLG.
Portanto, devem ser realizados estudos que examinem a associação de polimorfismos
no gene VDR com fenótipos musculares para que as controvérsias existentes na literatura
72
sejam esclarecidas. Esses estudos devem envolver diferentes populações, e a análise de blocos
de haplótipos também devem ser incluídas.
6.4. Estudos de associação com polimorfismos
Possivelmente, diversos são os genes que contribuem para fenótipos musculares. Por
exemplo, algumas variações alélicas em genes como o ciliary neurotrophic factor (ROTH et
al., 2001), miostatina (SEIBERT et al., 2001), colágeno tipo I (VAN POTTELBERGH et al.,
2001), fator de crescimento semelhante a insulina II (SAYER et al., 2002) e o próprio VDR
(GEUSENS et al., 1997; ROTH et al., 2004) têm sido associado com força ou massa
muscular. A identificação de polimorfismos funcionais que contribuam para fenótipos
musculares vai aumentar o conhecimento dos mecanismos fisiológicos que permeiam a
sarcopenia. A combinação da informação genética com os fatores de risco ambientais pode
ser utilizada para identificar aqueles com risco aumentado e encaminhá-los a programas de
prevenção e tratamento.
Por outro lado, a identificação desses genes é uma tarefa desafiadora, particularmente
devido ao fato de que um outro polimorfismo pode ser uma variável de confundimento para
aquele polimorfismo que está sendo estudado (THOMPSON et al., 2004). Resultados
conflitantes não são inesperados em estudos de associação, podendo estar relacionado a
diferenças de etnia, interações com outros genes ou a definição do fenótipo (ZMUDA et al.,
2000). Outros fatores de confundimento incluem diferenças entre os genótipos para idade e
hábitos que interfiram no fenótipo estudado, bem como o método utilizado para avaliar a
variável de estudo. O presente estudo examinou se havia diferenças entre os genótipos para
idade e hábitos que interferem na MLG como, por exemplo, nível de atividade física e
reposição hormonal, sendo verificado homogeneidade entre os grupos. Adicionalmente, a
presente metodologia utilizou o DXA para mensurar a MLG, método que foi validado para ser
aplicado em idosas (WANG et al., 1996; HANSEN et al., 1999) e foi utilizado em outros
estudos que verificaram associação com variações genéticas (ROTH et al., 2001; ROTH et al.,
2004; WALSH et al., 2005).
Desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg é um outro fato que pode ser viés em estudos
de associação, de forma que a chance uma associação falso-positiva aumenta
substancialmente se a proporção de homozigotos é mais comum do que o predito pelo
equilíbrio de Hardy-Weinberg. No presente estudo, a distribuição dos genótipos se mostrou
dentro do esperado do equilíbrio, descartando esse viés de seleção inadequada de amostra
73
(ZMUDA et al., 2000). Em resumo, na presente investigação foram realizados esforços para
minimizar a interferência de variáveis de confundimento na associação genótipo/fenótipo,
embora a natureza multifatorial da variável massa muscular e a heterogeneidade étnica da
população brasileira torne importante a realização de futuros estudos para confirmar os
resultados observados.
74
7. CONCLUSÕES
Com base no perfil de composição corporal observado na amostra estudada, foi
possível identificar que as mulheres em fase pós menopausadas participantes do estudo
apresentaram valores de MLG similar ao observado na literatura. Como já esperado, esses
valores são inferiores ao relatado para homens da mesma faixa etária. Ficou evidente a
necessidade de um ponto de corte para a definição de sarcopenia, o que vai tornar viável a
descrição da prevalência e a significância clínica do quadro. Adicionalmente, foi verificado
que as voluntárias apresentaram elevado percentual de gordura corporal, o que suporta a
hipótese de que a disfunção ovariana está ligada ao aumento da massa gordurosa e
conseqüente risco metabólico.
O procedimento de genotipagem através do minisequenciamento se mostrou um
método prático e eficaz na identificação dos polimorfismos estudados, portanto, consiste em
uma opção para futuros estudos. A freqüência alélica dos locos estudados encontrou-se no
equilíbrio de Hardy-Weinberg e foi semelhante ao relatado em para outras etnias.
De acordo com a revisão de literatura realizada, o presente estudo foi o primeiro a
buscar associação entre cinco polimorfismos no gene VDR (ApaI, BsmI, Cdx-2, FokI e TaqI)
com MLG em mulheres brasileiras na fase pós menopausa. Em síntese, os resultados
demonstram não haver associação entre os genótipos do VDR com os índices de MLG na
amostra estudada, entretanto, os achados devem ser confirmados em futuros estudos levando-
se em consideração a natureza heterogênea da população brasileira. O desenvolvimento do
conhecimento acerca da contribuição do gene VDR e de outros genes para fenótipos
musculares será útil na identificação de indivíduos suscetíveis a sarcopenia, possibilitando
maior eficácia na intervenção preventiva e/ou terapêutica e conseqüente preservação da
autonomia e qualidade de vida dos indivíduos idosos.
75
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9. ANEXOS
Anexo A: Ato de Designação do Orientador
89
Anexo B: Carta de Encaminhamento ao Comitê de Ética em Pesquisa
Ao Ilmo Sr. Secretário Executivo
Prof. MSc MARCELO SILVEIRA DE ALCÂNTARA
Comitê de Ética em Pesquisa
Universidade Católica de Brasília
Brasília, 05 de outubro de 2004.
Sr. Secretário Executivo
Encaminho, para apreciação e aprovação, o Projeto de Pesquisa “Polimorfismo do
gene receptor de vitamina D (VDR) em idosos Brasileiros e associação com massa muscular,
força e densidade mineral óssea”.
Informo que o referido projeto foi submetido à aprovação do Conselho de Pesquisa da
Universidade Católica de Brasília.
Atenciosamente,
_______________________________________
Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira
Universidade Católica de Brasília
90
Anexo C: Declaração de propriedade dos dados coletados
DECLARAÇÃO
Assunto: Material coletado em pesquisa – “Polimorfismo do gene receptor de vitamina D
(VDR) em idosos Brasileiros e associação com massa muscular, força e densidade mineral
óssea”.
Declaro, para os devido fins, que o material coletado na pesquisa “Polimorfismo do
gene receptor de vitamina D (VDR) em idosos Brasileiros e associação com massa muscular,
força e densidade mineral óssea”, será mantido em propriedade do pesquisador, armazenado
no Laboratório de Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, e será utilizado para
fins do presente estudo e para publicações em revistas científicas especializadas, com base
nos resultados deste.
Comprometo-me em tornar público os resultados da referida pesquisa, sejam eles
favoráveis ou não, salvaguardando todos os dados que possibilitem a identificação dos
participantes, conforme estabelecido no termo de consentimento para participação.
Brasília, 05 de outubro de 2004.
_______________________________________
Prof. Dr. Ricardo Jacó de Oliveira
Universidade Católica de Brasília
91
Anexo D Carta de Aprovação do Comitê de Ética
92
Anexo E: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
UNIVERSIDADE CATÓLICA DE BRASÍLIA – UCB
Nome:______________________________________________________________
1. ESCLARECIMENTO DAS AVALIAÇÕES
Você estará participando de um grupo experimental de estudo com o objetivo
de verificar a associação de variações genéticas, com a densidade mineral óssea, força
muscular e massa muscular. Para tanto, você será submetido(a) a algumas avaliações.
Você poderá a qualquer momento desligar-se da presente pesquisa sem nenhum
constrangimento. Para que você possa decidir sobre sua participação, descrevemos a
seguir os testes:
1.1. Avaliação da composição corporal:
Serão avaliadas a densidade mineral óssea e massa muscular através do DXA. Durante
o DXA você permanecerá deitada em uma mesa, por volta de 30 minutos, enquanto
seu corpo será percorrido por um scanner a uma distância de aproximadamente 60
centímetros. Ainda que seja um aparelho similar ao de raio X, a quantidade de
radiação a que a pessoa é exposta equivale a 1/20 de uma radiografia dental. Este
método é seguro para crianças, adolescentes e adultos.
Além da composição corporal medida pelo DXA, os dados antropométricos avaliados
serão a estatura (altura) e peso corporal.
O pesquisador principal, assim que possível entrará em contato para entregar o
resultado destes exames, que estarão junto a secretária do projeto “Geração de Ouro”.
1.2. Avaliação genética
A avaliação será feita através de uma amostra sangüínea retirada da veia situada
em seu antebraço. Todos os equipamentos utilizados serão esterilizados e/ou
descartáveis e a coleta será realizada por um técnico devidamente treinado. Este
procedimento é comumente adotado em pesquisas deste gênero e, de uma forma geral,
é bem tolerado pelos voluntários.
2. RISCOS E DESCONFORTOS POSSÍVEIS
Durante a realização dos testes, poderão surgir alguns desconfortos. No caso
específico da coleta de sangue, semelhante a uma coleta laboratorial rotineira, será
necessário realizar a inserção de uma agulha no antebraço, o que pode trazer algum
tipo de desconforto. O procedimento é relativamente simples e bem aceito por
93
indivíduos de todas as idades, e, em adição, todo esforço será feito para minimizar
estes desconfortos.
3. BENEFÍCIOS ESPERADOS
Os participantes deste projeto serão informados sobre seu status atual de massa
muscular e densidade mineral óssea, avaliados em equipamentos internacionalmente
reconhecidos como instrumentos válidos e precisos. Em adição, serão fornecidas
informações sobre as características genéticas atuais e aconselhamento de condutas
adequadas a perfil obtido nos resultados.
O benefício possível dessa pesquisa diz respeito à busca pela identificação de
uma variável genética que seja fator de risco para o desenvolvimento de sarcopenia
e/ou osteoporose. Caso seja observada essa variação, futuramente, será possível
identificar indivíduos propensos a desenvolver as citadas patologias, o que
possibilitará a intervenção apropriada de forma precoce, consequentemente,
minimizando os efeitos deletérios desses quadros indesejáveis. Pesquisas dessa
natureza certamente beneficiarão as futuras gerações de idosos.
4. RESPONSABILIDADE DO PESQUISADOR E DA INSTITUIÇÃO
O pesquisador responsável suspenderá a pesquisa imediatamente ao perceber
algum risco ou dano à saúde do participante, mesmo riscos não previstos neste termo
de consentimento. O pesquisador assumirá a responsabilidade de dar assistência
integral e indenização às complicações e danos decorrentes dos riscos. Caso constatada
a superioridade de um método em estudo sobre outro, o pesquisador será responsável
por oferecer a todos os sujeitos os benefícios do melhor regime.
5. RESPONSABILIDADE DAS PARTICIPANTES
Estar presente no local dos testes nos dias e horários marcados. Informar ao
professor pesquisador qualquer desconforto que por acaso venha a perceber.
6. RESULTADOS OBTIDOS
As informações obtidas neste experimento, por meio dos resultados de todos os testes,
poderão ser utilizadas como dados de pesquisa científica, podendo ser publicados e
divulgados, sendo resguardada a identidade das participantes.
LIBERDADE DE CONSENTIMENTO
A sua permissão para participar desta pesquisa é voluntária. Você estará livre
para negá-la ou para em qualquer momento desistir da mesma se assim desejar.
Declaro ter lido este termo de consentimento e compreendido os procedimentos nele
descritos. Informo também que todas as minhas dúvidas foram respondidas de forma
clara e de fácil compreensão. Estou de acordo em participar da referida pesquisa.
_____________________________ __________________________
Assinatura – RG Participante Assinatura – RG Testemunha
94
Anexo F: Questionário de Caracterização da Amostra
Muito obrigado por participar de nosso estudo. Por favor, preencha a ficha abaixo para
podermos conhecê-la melhor.
Nome:______________________________________________________________________
Data de nascimento:_____/_____/_____
Cidade/Estadodenascimento:_______________________
Em que pais você nasceu?
___________________________________________________________________________
Em que país seus pais nasceram?
___________________________________________________________________________
Em que país seus avós nasceram?
___________________________________________________________________________
Você fuma?
( ) Não ( ) Sim. Há quanto
tempo?________________________________________________
Qual a cor de sua pele?
( ) Branca ( ) Negra
( ) Morena ( ) Vermelho (indígena)
Você faz terapia de reposição hormonal
( ) Não ( ) Sim. Há quanto
tempo?________________________________________________
Marque um “X” caso você tenha alguma das patologias abaixo
( ) Hipertensão ( ) Diabetes ( ) Osteoporose
( ) Outros:____________________________________________
Você está tomando algum medicamento?
95
( ) Não ( ) Sim.
Qual (is)?______________________________________________________
Muito Obrigado!
96
Anexo G: IPAQ
QUESTIONÁRIO INTERNACIONAL DE ATIVIDADE FÍSICA –
VERSÃO CURTA -
Nome:____________________________________________________
Data: ______/ _______ / ______ Idade : ______ Sexo: F ( ) M ( )
Nós estamos interessados em saber que tipos de atividade física as
pessoas fazem como parte do seu dia a dia. Este projeto faz parte de
um grande estudo que está sendo feito em diferentes países ao redor do
mundo. Suas respostas nos ajudarão a entender que tão ativos nós
somos em relação à pessoas de outros países. As perguntas estão
relacionadas ao tempo que você gasta fazendo atividade física na
ÚLTIMA semana. As perguntas incluem as atividades que você faz no
trabalho, para ir de um lugar a outro, por lazer, por esporte, por exercício
ou como parte das suas atividades em casa ou no jardim. Suas
respostas são MUITO importantes. Por favor responda cada questão
mesmo que considere que não seja ativo. Obrigado pela sua
participação !
Para responder as questões lembre que:
atividades físicas VIGOROSAS são aquelas que precisam de um
grande esforço físico e que fazem respirar MUITO mais forte que o
normal
atividades físicas MODERADAS são aquelas que precisam de algum
esforço físico e que fazem respirar UM POUCO mais forte que o
normal
Para responder as perguntas pense somente nas atividades que você
realiza por pelo menos 10 minutos contínuos de cada vez:
1a Em quantos dias da última semana você caminhou por pelo menos
10 minutos contínuos em casa ou no trabalho, como forma de transporte
para ir de um lugar para outro, por lazer, por prazer ou como forma de
exercício?
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
97
1b Nos dias em que você caminhou por pelo menos 10 minutos
contínuos quanto tempo no total você gastou caminhando por dia?
horas: ______ Minutos: _____
2a. Em quantos dias da última semana, você realizou atividades
MODERADAS por pelo menos 10 minutos contínuos, como por exemplo
pedalar leve na bicicleta, nadar, dançar, fazer ginástica aeróbica leve,
jogar vôlei recreativo, carregar pesos leves, fazer serviços domésticos
na casa, no quintal ou no jardim como varrer, aspirar, cuidar do jardim,
ou qualquer atividade que fez aumentar moderadamente sua
respiração ou batimentos do coração (POR FAVOR NÃO INCLUA
CAMINHADA)
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
2b. Nos dias em que você fez essas atividades moderadas por pelo
menos 10 minutos contínuos, quanto tempo no total você gastou
fazendo essas atividades por dia?
horas: ______ Minutos: _____
3a Em quantos dias da última semana, você realizou atividades
VIGOROSAS por pelo menos 10 minutos contínuos, como por exemplo
correr, fazer ginástica aeróbica, jogar futebol, pedalar rápido na bicicleta,
jogar basquete, fazer serviços domésticos pesados em casa, no quintal
ou cavoucar no jardim, carregar pesos elevados ou qualquer atividade
que fez aumentar MUITO sua respiração ou batimentos do coração.
dias _____ por SEMANA ( ) Nenhum
3b Nos dias em que você fez essas atividades vigorosas por pelo menos
10 minutos contínuos quanto tempo no total você gastou fazendo essas
atividades por dia?
horas: ______ Minutos: _____
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