( PDF ) Estudo comparativo da composição química das folhas e cascas da Trichilia catigua A. Juss., meliaceae

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JESSÉ BOQUETT LAGOS

ESTUDO COMPARATIVO DA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DAS FOLHAS E CASCAS

DA Trichilia catigua A. JUSS., MELIACEAE

Dissertação apresentada como requisito parcial à

obtenção do grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas, Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas, Setor de Ciências da

Saúde, Universidade Federal do Paraná.

Orientador: Prof. Dr. Obdúlio Gomes Miguel

CURITIBA

2006

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AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Paraná.

Ao Professor Dr. Obdúlio Gomes Miguel pela paciência, confiança e

ensinamentos dedicados muitas vezes à distância.

Ao Laboratório Catarinense, em especial ao Carlos Eduardo de Carvalho e a

Andréa Birckholz Lobo, por tornarem possível a realização deste estudo, e a todos

os demais amigos desta.

Ao João Luiz de Souza Carvalho pela amizade e treinamento desde o início

da minha carreira profissional.

À Professora Dra. Márcia do Rocio Duarte pelos ensinamentos e

disponibilidade para a realização do estudo anatômico da droga vegetal.

Aos demais Professores do Curso de Pós Graduação.

Aos meus pais e irmãs pelo constante amor e suporte incomensuráveis.

À Carolina pelo amor, companhia e ajuda durante todos esses anos.

Aos colegas do Curso de Pós Graduação.

À Janice Valmórbida pela ajuda na coleta do material vegetal.

Ao Nilson, do Departamento de Botânica pela ajuda na confecção das

lâminas permanentes.

À Regina, secretária do Curso de Pós Graduação pela ajuda constante.

À todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho.

À Deus por nos proporcionar o convívio com esta natureza maravilhosa.

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iii

RESUMO

A Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae é uma espécie arbórea nativa do Brasil

comumente conhecida como catuaba. Suas cascas são utilizadas na medicina

popular como tônico físico e mental e como estimulante sexual. Apesar da sua

crescente utilização pelas indústrias farmacêuticas e de alimentos existem poucas

publicações sobre a composição química das suas cascas e nenhuma sobre suas

folhas. Tendo em vista a falta de estudos que determinem parâmetros para o

controle da qualidade dessa espécie, foram realizados estudos botânicos e químicos

das cascas e folhas da planta através de técnicas cromatográficas. Os estudos

botânicos realizados possibilitaram a caracterização anatômica das cascas e folhas

da espécie Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae. Foi identificada a presença dos

compostos fenólicos ácido clorogênico, catequina e epi-catequina nas cascas e

folhas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Foi identificada a presença

dos esteróides beta sitosterol e estigmasterol nas cascas e folhas por cromatografia

gasosa (CG). Os métodos cromatográficos para a quantificação de ácido clorogênico

por CLAE e beta sitosterol por CG foram validados. Foram estudados os métodos

extrativos de maceração, sonicação, turbólise, refluxo e soxhlet com etanol 50 % e

96 %. Dentre estes, a turbólise com etanol 50 % foi mais eficiente para a extração de

ácido clorogênico e a extração por soxhlet com etanol 50 % foi mais eficiente para a

extração de beta sitosterol. O ácido clorogênico está presente em maior

concentração nas cascas (2046 µg/g) do que nas folhas (1702 µg/g). Já o beta

sitosterol está presente em maior quantidade nas folhas (777 µg/g) do que nas

cascas (396 µg/g). As metodologias analíticas desenvolvidas neste estudo

demonstraram eficiência, segurança e reprodutibilidade, caracterizando-se como

propostas viáveis para rotinas de controle da qualidade da espécie.

PALAVRAS CHAVE: Trichilia catigua, catuaba, ácido clorogênico, beta sitosterol,

fitoquímica.

ABSTRACT

Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae is a native tree widely distributed in Brazil

commonly known as "catuaba". Its bark has been used in popular medicine as

physical and mental tonic and as a sexual stimulant. Despite of its increasing use by

the pharmaceutical and food industries there is a lack of publications concerning the

chemical composition of its bark and none about the leaves. Because of the lack of

studies that determine parameters for the quality control of this species, the

phytochemical constitution of the bark and leaves of the plant was investigated

through chromatographic techniques. The accomplished botanical studies made

possible the anatomical characterization of the bark and leaves of the species. It was

identified by HPLC the presence of chlorogenic acid, catechin and epi-catechin in the

bark and leaves. It was identified by GC the presence of the steroids beta sitosterol

and stigmasterol in the bark and leaves. The chromatografic methods for the

quantification of chlorogenic acid by HPLC and beta sitosterol by GC were validated.

The extractive methods of maceration, sonication, turbolisys, reflux and soxhlet with

50% and 96% ethanol were evaluated. Among these, the turbolisys with 50% ethanol

was more efficient for the extraction of chlorogenic acid and the soxhlet extraction

with 50% ethanol was more efficient for the extraction of beta sitosterol. The

chlorogenic acid is present in larger concentration in the bark (2046 µg/g) that in the

leaves (1702 µg/g). The beta sitosterol is present in larger amount in the leaves (777

µg/g) that in the peels (396 µg/g). The analytical methodologies developed in this

study demonstrated efficiency, safety and reproducibility, being characterized as

viable proposals for routines for the quality control of the species.

KEY WORDS: Trichilia catigua, catuaba, chlorogenic acid, beta sitosterol,

phytochemistry.

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...............................................................................................

2 OBJETIVOS...................................................................................................

2.1 OBJETIVO GERAL......................................................................................

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................

3 REVISÃO DA LITERATURA.........................................................................

3.1 ASPECTOS BOTÂNICOS...........................................................................

3.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA......................................................................... 7

3.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS............................................................

4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 12

4.1 ANÁLISES DA DROGA...............................................................................

4.1.1 Coleta e Identificação...............................................................................

4.1.2 Secagem e Moagem................................................................................

4.1.3 Determinação Granulométrica..................................................................

4.1.4 Ensaios de Pureza...................................................................................

4.1.4.1 Cinzas totais..........................................................................................

4.1.4.2 Cinzas insolúveis em HCl......................................................................

4.1.4.2 Perda por dessecação...........................................................................

4.1.5 Determinação do Perfil Fitoquímico Preliminar........................................

4.1.5.1 Preparo dos extratos para o perfil fitoquímico preliminar......................

4.1.5.1.1 Ensaios com o extrato aquoso...........................................................

4.1.5.1.2 Ensaios com o extrato hidroalcoólico.................................................

4.1.6 Estudo Anatômico....................................................................................

4.2 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS.............................................................

4.2.1 Preparo dos Extratos Brutos....................................................................

4.2.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.................................................

4.2.3 Cromatografia Gasosa.............................................................................

4.2.4 Cromatografia em Camada Delgada........................................................

4.2.5 Validação analítica...................................................................................

4.2.5.1 Validação analítica do doseamento do ácido clorogênico por CLAE....

4.2.5.1.1 Linearidade.........................................................................................

4.2.5.1.2 Exatidão..............................................................................................

4.2.5.1.3 Especificidade................................................................................... 27

4.2.5.1.4 Precisão por repetibilidade.................................................................

4.2.5.1.5 Precisão intermediária........................................................................

4.2.5.1.5 Robustez............................................................................................

4.2.5.1.6 Intervalo..............................................................................................

4.2.5.2 Validação analítica do doseamento do beta sitosterol por CG..............

4.2.5.2.1 Linearidade.........................................................................................

4.2.5.2.2 Exatidão..............................................................................................

4.2.5.2.3 Especificidade....................................................................................

4.2.5.2.4 Precisão por repetibilidade.................................................................

4.2.5.2.5 Precisão intermediária........................................................................

4.2.5.2.5 Robustez............................................................................................

4.2.5.2.6 Intervalo..............................................................................................

4.3 ANÁLISES DE EFICIÊNCIA EXTRATIVA...................................................

4.3.1 Extração por Maceração..........................................................................

4.3.2 Extração por Sonicação...........................................................................

4.3.3 Extração por Turbólise.............................................................................

4.3.4 Extração por Refluxo................................................................................

4.3.5 Extração por Soxhlet................................................................................

4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS........................................................................

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................

5.1 ANÁLISES DA DROGA...............................................................................

5.1.1 Ensaios de Pureza...................................................................................

5.1.2 Perfil Fitoquímico Preliminar.....................................................................

5.1.3 Anatomia Botânica...................................................................................

5.1.3.1 Folhas....................................................................................................

5.1.3.2 Cascas...................................................................................................

5.2 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS.............................................................

5.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência.................................................

5.2.2 Cromatografia Gasosa.............................................................................

5.2.3 Cromatografia em Camada Delgada........................................................

5.2.4 Validação dos Métodos Analíticos Quantitativos......................................

5.2.4.1 Validação do método de doseamento de ácido clorogênico por CLAE

5.2.4.1.1 Linearidade.........................................................................................

5.2.4.1.2 Exatidão..............................................................................................

vii

5.2.4.1.3 Especificidade....................................................................................

5.2.4.1.4 Precisão por repetibilidade.................................................................

5.2.4.1.5 Precisão intermediária........................................................................

5.2.4.1.6 Intervalo..............................................................................................

5.2.4.1.7 Robustez............................................................................................

5.2.4.2 Validação do método de doseamento de beta sitosterol por CG..........

5.2.4.2.1 Linearidade.........................................................................................

5.2.4.2.2 Exatidão..............................................................................................

5.2.4.2.3 Especificidade....................................................................................

5.2.4.2.4 Precisão por Repetibilidade................................................................

5.2.4.2.5 Precisão Intermediária........................................................................

5.2.4.2.6 Intervalo..............................................................................................

5.2.4.2.7 Robustez............................................................................................

5.3 ANÁLISES DE EFICIÊNCIA EXTRATIVA...................................................

5.3.1 Quantificação do ácido clorogênico..........................................................

5.3.2 Quantificação do beta sitosterol...............................................................

6 CONCLUSÕES..............................................................................................

REFERÊNCIAS.................................................................................................

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

FIGURA 1 ASPECTOS DAS FOLHAS E CASCAS SECAS ANTES DA

MOAGEM...........................................................................................

FIGURA 2 PREPARO DOS EXTRATOS POR MACERAÇÃO............................

FIGURA 3 PREPARO DOS EXTRATOS POR SONICAÇÃO............................. 34

FIGURA 4 PREPARO DOS EXTRATOS POR TURBÓLISE...............................

FIGURA 5 PREPARO DOS EXTRATOS POR REFLUXO..................................

FIGURA 6 PREPARO DOS EXTRATOS POR SOXHLET..................................

FIGURA 7 VISTA FRONTAL DA FACE EPIDÉRMICA ABAXIAL ...................... 44

FIGURA 8 VISTA FRONTAL DA FACE EPIDÉRMICA ADAXIAL.......................

FIGURA 9 VISTA TRANSVERSAL DO MESOFILO DORSIVENTRAL...............

FIGURA 10 VISTA TRANSVERSAL DA NERVURA CENTRAL........................... 44

FIGURA 11 VISTA TRANSVERSAL DA CASCA.................................................. 45

FIGURA 12 VISTA TRANSVERSAL DA CASCA.................................................. 45

FIGURA 13 VISTA LONGITUDINAL DA CASCA..................................................

FIGURA 14 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DOS PADRÕES

DE FENÓLICOS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE................

FIGURA 15 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

GÁLICO..............................................................................................

FIGURA 16 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA

CATEQUINA.......................................................................................

FIGURA 17 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO.................................................................................

FIGURA 18 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CAFEICO............................................................................................

FIGURA 19 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI-

CATEQUINA.......................................................................................

FIGURA 20 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA

CUMARINA........................................................................................

FIGURA 21 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO P-

CUMÁRICO........................................................................................

FIGURA 22 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

FERULICO.........................................................................................

FIGURA 23 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA RUTINA...

FIGURA 24 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS CASCAS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE......

FIGURA 25 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE.......

FIGURA 26 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 27 ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA CATEQUINA

APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO BRUTO DAS

CASCAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO

QUALITATIVO DA CLAE...................................................................

FIGURA 28 ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO

BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 29 ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI

CATEQUINA APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO

BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 30 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 31 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA

CATEQUINA APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 32 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 33 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI

CATEQUINA APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO

MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE...................................................

FIGURA 34 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE....

FIGURA 35 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE................................................

FIGURA 36 ESPECTROGRAMA E (A) CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE....

FIGURA 37 ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE................................................

FIGURA 38 CROMATOGRAMA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES E

TRITERPENOS DO MÉTODO QUALITATIVO DA CG......................

FIGURA 39 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS DO

MÉTODO QUALITATIVO DA CG.......................................................

FIGURA 40 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DO

MÉTODO QUALITATIVO DA CG.......................................................

FIGURA 41 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS

ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA

CG......................................................................................................

FIGURA 42 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS

ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA

CG......................................................................................................

FIGURA 43 CROMATOGRAMA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES E

TRITERPENOS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CG...................

FIGURA 44 CROMATOGRAMA EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG....................................................

FIGURA 45 CROMATOGRAMA EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG....................................................

FIGURA 46 PERFIL CROMATOGRÁFICO EM CCD PARA VISUALIZAÇÃO DE

COMPOSTOS FENÓLICOS..............................................................

FIGURA 47 PERFIL CROMATOGRÁFICO EM CCD PARA VISUALIZAÇÃO DE

ESTERÓIDES....................................................................................

FIGURA 48 CURVA DE LINEARIDADE DO ÁCIDO CLOROGÊNICO.................

FIGURA 49 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO PLACEBO

DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE.................

FIGURA 50 ESPECTROGRAMA E CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS

FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE..........................

FIGURA 51 ESPECTROGRAMA E CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO

DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE.................

FIGURA 52 ANÁLISE DE PUREZA (A) E ESPECTRO DE UV (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO DO CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO

DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE.................

FIGURA 53 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO

BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 54 ANÁLISE DE PUREZA (A) E ESPECTRO DE UV (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO DO CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO

DAS FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE..................

FIGURA 55 ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO PADRÃO

DE ÁCIDO CLOROGÊNICO NO MÉTODO QUANTITATIVO DA

CLAE..................................................................................................

FIGURA 56 ANÁLISE DE PUREZA E ESPECTRO UV DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO DO PADRÃO DE ÁCIDO CLOROGÊNICO NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE ...............................................

FIGURA 57 CURVA DE LINEARIDADE DO BETA SITOSTEROL....................... 84

FIGURA 58 CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS CASCAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG.....................................................................

FIGURA 59 CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS FOLHAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG.....................................................................

FIGURA 60 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG....................................................

FIGURA 61 CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG....................................................

FIGURA 62 CROMATOGRAMA DO PADRÃO DE BETA SITOSTEROL NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG....................................................

FIGURA 63 TEORES DE ÁCIDO CLOROGÊNICO DOS MÉTODOS

EXTRATIVOS REALIZADOS.............................................................

FIGURA 64 TEORES DE BETA SITOSTEROL DOS MÉTODOS EXTRATIVOS

REALIZADOS.....................................................................................

xii

ÍNDICE DE TABELAS

TABELA 1 PROGRAMAÇÃO DA MUFLA PARA A ANÁLISE DE CINZAS.........

TABELA 2 GRADIENTE DE ELUIÇÃO DAS FASES MÓVEIS DO MÉTODO

QUALITATIVO DA CLAE...................................................................

TABELA 3 GRADIENTE DE ELUIÇÃO DAS FASES MÓVEIS DO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CLAE.................................................................

TABELA 4 DADOS PARA O PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO............

TABELA 5 PREPARO DAS AMOSTRAS DE PLACEBO FORTALECIDO

PARA O TESTE DE EXATIDÃO........................................................

TABELA 6 DADOS PARA O PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO............

TABELA 7 PREPARO DAS AMOSTRAS FORTALECIDAS PARA O TESTE

DE EXATIDÃO...................................................................................

TABELA 8 TEOR DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM HCl DAS CASCAS

DA CATUABA....................................................................................

TABELA 9 TEOR DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM HCl DAS FOLHAS

DA CATUABA.....................................................................................

TABELA 10 PERDA POR DESSECAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL SECO......

TABELA 11 RESULTADO DO PERFIL FITOQUÍMICO PARA OS EXTRATOS

AQUOSOS DAS DROGAS................................................................

TABELA 12 RESULTADO DO PERFIL FITOQUÍMICO PARA O EXTRATO

HIDROALCOÓLICO DAS DROGAS..................................................

TABELA 13 RETENÇÃO RELATIVA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES E

TRITERPENOS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CG......................

TABELA 14 RESULTADO DO TESTE DE EXATIDÃO PARA O ÁCIDO

CLOROGÊNICO.................................................................................

TABELA 15 RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO POR

REPETIBILIDADE DO ÁCIDO CLOROGÊNICO...............................

TABELA 16 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE PRECISÃO POR REPETIBILIDADE DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO.................................................................................

TABELA 17 RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

DO ÁCIDO CLOROGÊNICO..............................................................

TABELA 18 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DO ÁCIDO CLOROGÊNICO.......

TABELA 19 RESULTADO DAS ANÁLISES DE ROBUSTEZ DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO.................................................................................

TABELA 20 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE ROBUSTEZ DO ÁCIDO CLOROGÊNICO...................................

TABELA 21 RESULTADO DO TESTE DE EXATIDÃO PARA O BETA

SITOSTEROL.....................................................................................

xiii

TABELA 22 RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO POR

REPETIBILIDADE DO BETA SITOSTEROL......................................

TABELA 23 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE PRECISÃO POR REPETIBILIDADE DO BETA SITOSTEROL...

TABELA 24 RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

DO BETA SITOSTEROL....................................................................

TABELA 25 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DO BETA SITOSTEROL.............

TABELA 26 RESULTADO DAS ANÁLISES DE ROBUSTEZ DO BETA

SITOSTEROL.....................................................................................

TABELA 27 AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES

DE ROBUSTEZ DO BETA SITOSTEROL.........................................

TABELA 28 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TEOR DE ÁCIDO CLOROGÊNICO

DOS MÉTODOS EXTRATIVOS REALIZADOS.................................

TABELA 29 ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TEOR DE BETA SITOSTEROL DOS

MÉTODOS EXTRATIVOS REALIZADOS..........................................

xiv

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

CCD Cromatografia em Camada Delgada

CG Cromatografia Gasosa

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CV Coeficiente de Variação

DAD Detector de Arranjo de Diodos

DIC Detector de Ionização de Chamas

DP Desvio Padrão da Média

EM Espectrômetro de Massas

EtOH Etanol

fig Figura

figs Figuras

g Grama

°C Grau Celsius

IC Intervalo de Confiança

kPa Kilo Pascal

µg Micrograma

µL Microlitro

m massa

M molar

min minuto

mm milímetro

nm Nanômetro

N Normal

p. Página

p Peso

pa Para Análise

pH Potencial de Hidrogênio

UV Ultravioleta

RE Resolução

Rf Mobilidade Relativa ao Fronte

RNM Ressonância Nuclear Magnética

rpm Rotações por minuto

Coeficiente de Correlação

Vis Visível

v volume

1 INTRODUÇÃO

Cerca de 25 % dos fármacos disponíveis para a terapêutica atualmente são

derivados de produtos naturais, especialmente de plantas superiores. Apesar disso,

nas últimas décadas, devido principalmente ao avanço da química combinatória,

estudos em produtos naturais pela indústria farmacêutica experimentou um leve

declínio. Entretanto as atuais pesquisas nas companhias farmacêuticas

demonstraram que para doenças complexas, os produtos naturais ainda

representam uma fonte valiosa para a produção de novos compostos químicos, já

que eles possuem estruturas privilegiadas selecionadas pelos mecanismos

evolucionários em um período de milhões de anos (CALIXTO, 2005).

A maior parte da biodiversidade mundial está presente nos países da

América Latina. O Brasil possui cerca de 20 % de todas as plantas e

microorganismos existentes no planeta. Em decorrência da exploração

descontrolada, uma grande parte desta biodiversidade está sendo reduzida ano a

ano (CALIXTO, 2005).

Dentre as várias espécies nativas, a Catuaba - Trichilia catigua A. Juss.,

Meliaceae é uma espécie bioativa muito requisitada como matéria-prima industrial e

de exportação. Não obstante, poucos estudos têm sido publicados sobre a espécie,

especialmente quando se tratam de marcadores químicos, em identidade e

concentração adequadas para rotinas de controle da qualidade. A utilização

tradicional desta espécie preconiza o uso das cascas da planta. Este fato pode levar

a espécie à extinção se não foram tomadas ações para o cultivo e manejo racional

das árvores.

O conhecimento da composição química da planta pode contribuir

positivamente no controle da qualidade de fitoterápicos, pois somente com estas

informações pode-se avaliar tecnicamente desde o início do processo, na

elaboração do extrato vegetal, até a obtenção do produto final. Deve ser priorizado o

desenvolvimento de análises rápidas, de baixo custo e alta especificidade para a

garantia de segurança e eficácia do medicamento.

A legislação vigente que trata do registro de medicamentos fitoterápicos a

Resolução - RDC 48 de 16 de março de 2004, entre várias exigências, determinou a

obrigatoriedade da análise de marcadores e/ou princípios ativos para o controle da

qualidade dos produtos e suas respectivas matérias primas vegetais. Essa resolução

privilegia as plantas importadas, tendo-se em vista a quantidade de estudos já

realizados nos países de primeiro mundo, em detrimento a enorme biodiversidade

da flora brasileira, onde ainda predomina a falta de estudos.

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Através de técnicas cromatográficas pretende-se investigar a constituição

química das cascas e folhas da Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae e comparar os

teores dos marcadores químicos identificados entre estas partes da planta.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Realizar análises de controle da qualidade físico-químico das cascas e folhas da

planta;

 Descrever a anatomia botânica das cascas e folhas da espécie;

 Identificar e selecionar marcadores químicos comuns das cascas e folhas da

planta presentes em quantidade satisfatória para sua quantificação;

 Desenvolver metodologias cromatográficas para quantificação dos marcadores

químicos das cascas e folhas da planta por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE) e cromatografia gasosa (CG);

 Validar os métodos cromatográficos quantitativos;

 Realizar testes extrativos de maceração, turbólise, Soxhlet, ultra-som e refluxo

visando a maior obtenção dos marcadores químicos identificados.

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 ASPECTOS BOTÂNICOS

Rodolfo Albino Dias da Silva, elaborador da primeira edição da Farmacopéia

Brasileira, incluiu a monografia das raízes de uma Bignoniaceae, denominada

Anemopaegma arvense (Vell.) Stellf. conhecida como catuaba, que era amplamente

comercializada na região Sul do Brasil, tornando desta forma tal espécie oficial, ou a

“catuaba verdadeira”. Com a utilização progressiva das raízes dessa espécie e pelo

fato de serem colhidas as partes subterrâneas, o que prejudica a reposição da

planta no seu habitat natural, bem como a falta de iniciativa de cultivo, o seu preço

de mercado aumentou gradativamente e o seu fornecimento começou a rarear.

Assim, houve uma substituição gradual da planta por várias “novas catuabas”,

envolvendo mais de dez espécies de diferentes famílias presentes na medicina

popular de várias regiões do país, dentre as quais destacaram-se as cascas de

Erythroxylum catuaba A. J. Silva, Erythroxylaceae (MARQUES, 1998). No entanto

confirmou-se que e espécie Erythroxylum catuaba não existe, apesar da tese de

doutoramento de A. J. da Silva, que em 1906 identificou botanicamente a espécie

fornecedora das cascas de uso popular como tal. Avaliações posteriores

demonstraram que a figura constante na tese como documento original apresenta as

características da família Meliaceae, levando a crer não se tratar de uma

Erythroxylaceae. Tal erro comum na botânica caracteriza o chamado “nomem

nudum”, isto é, um nome botânico errado que não corresponde à respectiva espécie

vegetal real. Mais tarde o material que é mais utilizado no mercado foi avaliado pela

taxonomista Doutora Inez Cordeiro, do Instituto Botânico de São Paulo, e

identificado como Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae (MARQUES, 1998).

A família Meliaceae é composta por 51 gêneros com aproximadamente 1400

espécies em grande parte pantropicais, sendo poucas as subtropicais e as de

regiões temperadas. Diversas espécies da família Meliaceae destacam-se por

apresentarem grande potencial de utilização, tanto no fornecimento de madeiras,

como de óleos essenciais (MOSQUETA, 1995).

Várias espécies da família Meliaceae têm merecido a atenção de

pesquisadores que buscam a identificação de diversos compostos químicos,

principalmente dos limonóides, geralmente relacionados direta e indiretamente a

uma aplicação econômica ou medicinal. Segundo CHAMPAGNE et al. (1992), os

limonóides são metabólicos secundários, triterpenos modificados, característicos da

ordem Rutales e a maioria das pesquisas realizadas para identificar sua ação, têm

sido motivadas pelo interesse de encontrar compostos que possam ser usados para

aplicações específicas na agricultura e na medicina. Segundo CORTEZ (1993), os

limonóides recebem especial atenção por serem considerados os principais

marcadores quimiossistemáticos da família Meliaceae.

A Trichilia catigua é popularmente conhecida como catuaba, catiguá,

cataguá, angelim-rosa, mangalto-catinga (KLEIN, 1984).

A catuaba é uma árvore de 3 a 5 m de altura no sul do Brasil. Possui ramos

jovens curta e eretamente pubescentes até densamente seríceos, cedo tornando-se

glabros até marrons, lenticelados. As folhas são compostas, imparipinadas ou

pinadas com um folíolo do último par orientado no sentido de simular um folíolo

terminal, pecíolo semicilíndrico, ráquis mais ou menos cilíndrica, vilosa até

subglabra. Folíolos são alternos até opostos, oblanceolados, elípticos ou oblongos

raramente lanceolados, ápice ordinariamente atenuado muitas vezes com a ponta

um pouco emarginada, menos freqüentemente acuminada ou obtusamente

cuspidada, base quase sempre assimétrica, um lado agudo ou atenuado ou outro

agudo até arredondado, obtuso ou truncado, raramente ambos os lados agudos,

mais ou menos cartáceos, os pares inferiores muitas vezes menores; venação

eucamptódroma, nervura central quase sempre saliente, raramente plana; nervura

secundárias em cada lado da nervura central, ascendentes, ordinariamente mais ou

menos retas e mais ou menos paralelas, menos freqüentemente ligeiramente

convergentes; intersecundárias obscuras ou ausentes. Flores são unissexuais,

plantas dióicas; Inflorescência é axilar ou diversas reunidas em cachos num curto

rebento axilar, desde um pequeno fascículo até um delgado tirso piramidal,

pubescente ou pubérulo. Cálice é geralmente pateliforine, raramente rotado ou

ciatiforme. Possuía 4 a 5 pétalas, concrescidas até 3/4 do seu comprimento, eretas

ou ligeiramente patentes, valvadas, ovadas até lanceoladas, ápice agudo,

miudamente apresso-pubérulos na parte externa, glabros por dentro. Tubo estaminal

urceolado até curtamente cilíndrico; filetes completamente concrescidos, parte

externa glabra ou raramente com esparsos pêlos crespos ao redor do ápice, por

dentro com pêlos longos esparsos até densos. Anteras glabras, estaminódios com

anteras delgadas, indeiscentes, sem pólen. Nectário ausente. Ovário ovóide, 3-

locular, lóculos com 2 óvulos colaterais; estilete quase sempre glabro; estigma

capitado ou tenuemente discóide, às vezes apiculado, igualando ou debaixo das

anteras; pistilódio mais ou menos cônico contendo óvulos não funcionais bem

formados. Cápsula estreitamente ovóide ou oblonga, lisa, apresso-pubescente até

densamente serícea, 3-valvada;. Sementes 1-2, colaterais em cada fruto, obovóides,

completamente envolvidas por um arilóide fino, carnoso, que também se envolve ao

redor dos óvulos abortados; tegumento da semente membranáceo. Embrião com

cotilédones colaterais plano-convexos; radícula apical, inclusa. Endosperma ausente

(KLEIN, 1984).

Macroscopicamente as cascas da Trichilia catigua têm forma plana a

levemente encurvada. A superfície externa é acinzentada, variando de tons claros a

escuros, com aspecto grosseiramente granuloso; ocorre a presença de lenticelas

circulares pequenas e fendas longitudinais curtas e superficiais; a superfície externa

é avermelhada, com fibras finamente estriadas no sentido longitudinal; a fratura é

externamente granulosa e internamente fibrosa, o odor não é característico e o

sabor é fortemente amargo (MARQUES, 1998).

Aspectos morfológicos e estruturais das flores de Trichilia catigua A. Juss.,

T. elegans A. Juss. e T. pallida Sw., Meliaceae foram descritas por SOUZA et al

(2001). A antese ocorreu de abril a agosto na Trichilia catigua. Sépalas e pétalas

apresentaram epiderme papilosa e pilosa e um mesofilo parenquimático. Flores

masculinas apresentaram pistilos com óvulos abortivos e um tubo estaminal com

anteras tetrasporangiaceas. A parede da antera possui uma epiderme papilosa e um

endotécio fibroso.

As plântulas e tirodendros de Trichilia catigua A. Juss., T. elegans A. Juss. e

T. pallida Sw., Meliaceae foram estudados morfológica e anatomicamente por

MOURÃO et al (2002). Os autores determinaram que as plântulas de T. catigua são

fanerocotiledonares, os cotilédones são espessos, com epiderme glabra e o mesofilo

é parenquimático. A raiz é axial e tetrarca. O primeiro eofilo é simples e varia em

espessura entre as espécies. O metafilo é composto. O eofilo e o metafilo não

diferem significamente e estruturalmente entre si caracterizando-se como

dorsiventrais, hipoestomáticos e de venação tipo broquidódroma.

A distribuição geográfica de ocorrência da T. catigua no estado do Paraná

compreende uma região vasta, mas bem definida. Esta faixa localiza-se acima da

latitude 25° nas regiões central e leste e acima da latitude 26° no sudoeste do

Paraná. A caracterização dos ambientes associados demonstrou que a espécie

ocorre em solos férteis, ricos em matéria orgânica e protegida pela floresta

(CORREA JUNIOR & MING 2000).

Já no estado de Santa Catarina a T. catigua ocorre predominantemente em

floresta semidecidual estacional, além de na transição das florestas de Araucária e

Atlântica. Ocorre em solos férteis e ricos em matéria orgânica. A formação

geomorfológica predominante é basáltica e os tipos predominantes de solos variam

de latossolo vermelho até latossolo vermelho-amarelado além de cambissolo de

origem basáltica e granítica (MING & CORREA JUNIOR 2000).

3.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA

Uma mistura de duas flavalignanas epiméricas (cinchonainas 1b e 2b) foi

isolada da fração extraída com acetato de etila das cascas de T. catigua. Estas

flavalignanas exibiram atividade bactericida contra Bacillus cereus, Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa e Staphylococus aureus (PIZZOLATTI et al, 2002).

O estudo de outras espécies de Trichilia descreve o isolamento de três

novos sesquiterpenóides do extrato metanólico dos galhos de Trichilia claussenii: 14-

hidroxielemol, germacra-10(14)-en-9,11,15-triol e germacra-3,10(14)-dien-9,11-diol-

4-carbaldeído. Também foram isolados os sesquiterpenos β-eudesmol,

criptomeridiol e o triterpeno 22,25-diidroxi-9β,19-ciclolanost-23-en-3-ona. Do extrato

diclorometânico das folhas de T. lepidota foram isolados mistura de hidrocarbonetos

, C

e C

), mistura dos sesquiterpenos epóxido de cariofileno e

epóxido de humuleno, espatulenol e os esteróides 24-metileno-12β-hidroxicolesterol,

24-metil-12β-hidroxicolest-4-en-3-ona, 3-palmitato de 24-metil-12β-hidroxicolest-5-

eno, mistura de 24-metilenocolesterol, campesterol, estigmasterol e β-sitosterol,

além de α-tocoferol e fitol. O extrato metanólico forneceu a N-metil-4-hidroxiprolina.

As estruturas das substâncias isoladas foram estabelecidas com base em dados

espectroscópicos (PUPO et al, 2002).

Realizou-se a caracterização farmacognóstica das cascas da T. catigua de

amostras coletadas em Caitié (BA) e Maringá (PR). Os dados obtidos confirmaram a

presença dos grupos de flavonóides, antracênicos livres, taninos e saponinas, bem

como a ausência de alcalóides, mucilagens, cumarinas e óleos essenciais; a reação

de Stiasny confirmou que os taninos presentes são do tipo condensados.

Determinou-se que as duas amostras possuem composição parecida, com teor de

taninos 10,3 % (PR) e 12,5 % (BA) e teor de saponinas 21,4 % (PR) e 17,4 % (BA)

(OLIVEIRA et al, 2003).

Foi desenvolvido um método qualitativo através de CLAE para avaliação de

amostras comerciais de cascas de catuaba. Utilizou-se uma tintura hidroetanólica

(34:66 %, v/v) da Trichilia catigua padrão para a obtenção de um perfil

cromatográfico em coluna Hyperisil C

(15 x 0,45 cm) com gradiente de eluição

Água:Metanol e detecção UV a 232 nm. As análises quimiométricas dos

cromatogramas de três amostras comerciais demonstraram que estas se

assemelham ao cromatograma usado como impressão digital da Trichilia catigua

padrão (BELTRAME et al, 2003).

Quatorze amostras comerciais de cascas de catuabas comercializadas como

espécies de Anemopaegma, Erythroxilum e Trichilia foram examinadas quanto sua

pureza e identidade. Somente uma minoria das amostras de catuaba testada

continha a droga descrita nos rótulos. Mais da metade dos produtos estava

adulterado com diferentes drogas. A maioria das amostras continha cascas de

Trichilia catigua. Os perfis por CCD confirmaram a heterogeneidade, em 50 % das

amostras alcalóides tropânicos em várias concentrações foram detectados. Foram

desenvolvidos métodos de CCD e CLAE para a separação e identificação dos

alcalóides tropânicos. Determinou-se a estrutura dos dois principais alcalóides

encontrados, catuabina D e seu derivado hidroximetil. Os extratos aquosos e

metanólicos de Trichilia catigua e suas frações ricas em alcalóides das amostras

comerciais não mostraram nenhuma atividade em teste in vitro no corpo cavernoso

de coelho (KLETTER et al, 2004).

Gama lactonas de Trichilia catigua e seus precursores foram identificados

por CG-EM. Análises das frações clorofórmicas do extrato das cascas desta espécie

foram realizadas por ressonância nuclear magnética (RNM) e CG acoplado a

espectrômetro de massa (EM) e levaram à identificação de três ômega-fenil-ácidos

alcanóides, cinco ômega-fenil-gama lactonas, duas alquil-gama lactona, uma

alquenil-gama lactona, além de uma mistura de ácidos graxos de C

a C

. Também

foram identificados o beta-sitosterol, estigmasterol e campesterol como álcoois livres

(PIZZOLLATTI et al, 2004).

Utilizando a técnica de CLAE-ultravioleta (UV)-EM foi desenvolvido um

método para a distinção dos extratos das espécies Trichilia catigua e Anemopaega

arvense, ambas comercializadas no Brasil como catuaba. O acoplamento CLAE-UV-

EM permitiu determinar os íons moleculares das principais bandas cromatográficas

da impressão digital (fingerprint) das amostras de Trichilia catigua e Anemopaega

arvense. O método se demonstrou útil para análises de fitoterápicos contendo

catuaba, podendo ser empregado no controle da qualidade. A interpretação dos

dados permitiu demonstrar que as três amostras testadas são da espécie Trichilia

catigua, apesar de duas destas serem comercializadas como Anemopaega arvense

e Erithroxylum catuaba (BELTRAME, 2004).

Um método espectrométrico em UV foi validado para a quantificação de

flavonóides totais, equivalentes em rutina, para extratos comerciais de Trichilia

catigua e Ptycopetalum olacoides. O método foi validado segundo os seguintes

resultados experimentais: coeficiente de correlação, intervalo, exatidão,

especificidade à quantificação de flavonóides totais, equivalentes em rutina, ao

comprimento de onda 361,0 nm, limite de detecção, limite de quantificação, precisão

por repetibilidade, precisão intermediária e exatidão por repetibilidade e intermediária

(ROLIM et al, 2005).

3.3 ATIVIDADES FARMACOLÓGICAS

A mobilização do ácido araquidônico (AA) pela enzima fosfolipase A

(PLA

)

e síntese das prostaglandinas subseqüentes é considerado um evento primordial no

processo inflamatório. Desta forma, drogas que inibem a PLA

, bloqueando assim as

vias metabólicas das enzimas ciclooxigenases na cascata do AA, podem ser efetivas

no tratamento dos processos inflamatórios. Neste sentido, novas estratégias para o

tratamento de processos inflamatórios podem ser atingidas na pesquisa de

princípios ativos de origem vegetal que controlem a produção dos mediadores

lipídicos pela inibição da PLA

. Uma vasta investigação exploratória dos efeitos da

Trichilia catigua demonstrou que a atividade da PLA

foi totalmente inibida pelo

extrato hidroetanólico das cascas desta planta na concentração de 120 µg/mL

sugerindo que esta planta possa produzir substâncias com atividade antiinflamatória

(BARBOSA et al, 2004).

Foram investigados os possíveis efeitos anti-depressivos em abordagens in

vivo em duas espécies de roedores (ratos e camundongos) e também in vitro. O

extrato hidroetanólico das cascas de Trichilia catigua produziu efeitos

antidepressivos no teste de nado forçado tanto em ratos quanto em camundongos. A

atividade antidepressiva do extrato no modelo anti-imobilizantes foi inibida de forma

significativa pelo haloperidol ou cloropromasina, mas não pela pimozida,

cetanserina, siproxatrina ou p-clorofenilalanina. In vitro, o extrato hidroetanólico de

Trichilia catigua inibiu de forma dose dependente a recaptação de noradrenalina e e

principalmente de serotonina e de dopamina, em preparações sinaptosomais em

cérebro de ratos. Este estudo demonstrou a convicta evidência de um efeito

antidepressivo mediado por monoaminas e pelos princípios ativos deste extrato em

ratos e camundongos empregando-se estudos farmacológicos e bioquímicos. Desta

forma, um extrato padronizado de Trichilia catigua ou suas substâncias purificadas

podem possuir interesse potencial do tratamento de distúrbios depressivos

(CAMPOS et al, 2005).

Diversos estudos farmacológicos foram realizados para o esclarecimento

das atividades farmacológicas do fitoterápico Catuama ®, compreendendo testes

com a mistura de seus extratos e também dos extratos de forma individual. A seguir

serão descritas as atividades do extrato da Trichilia catigua isoladamente,

resgatados destes estudos.

A ação vasodilatadora do extrato hidroetanólico de Trichilia catigua foi

investigada e comparada com a ação da acetilcolina. O experimento foi realizado em

anéis da aorta torácica de ratos com e sem endotélio, em artéria pulmonar de

cobaias, artéria pulmonar de coelhos e artéria mesentérica de coelhos pré-

contraídas com noradrenalina ou fenilefrina. O extrato hidroetanólico de Trichilia

catigua causou efeito vasorelaxante em aorta de rato com endotélio de 1 a 3000

µg/mL (CALIXTO et al, 1997).

O efeito antinociceptivo do extrato hidroetanólico das cascas de Trichilia

catigua foi investigado em modelos químicos e térmicos de nocicepção em

camundongos. O extrato administrado na dose de 200 mg/kg via oral, seis horas

antes do experimento inibiu em 82 ± 2 % a nocicepção induzida por ácido acético

avaliada no número de contrações abdominais. Utilizando a mesma forma de

admistração, o extrato também foi capaz de inibir a dor em ambas as fases do teste

da formalina, indicando que o mesmo possa ter efeitos antinociceptivos relacionados

ao sistema opióide (VAZ et al, 1997).

A ação de relaxamento do corpo cavernoso isolado de coelho foi investigada

para o extrato hidroetanólico das cascas de Trichilia catigua. Este extrato provocou

de forma dose dependente um efeito relaxante de longa duração. O relaxamento

produzido não foi significativamente inibido pela infusão de 10 µM de N-nitro-L-

arginina metil éster, o inibidor da síntese de óxido nítrico. A infusão de 10 µM de

inibidor solúvel da guanilatociclase reduziu em mais de 50 % o relaxamento induzido

pelo extrato. O extrato hidroetanólico de Trichilia catigua (1-100 mg) não causou

aumento da liberação do nucleotídeo AMP cíclico de forma significativa acima dos

níveis basais. Portanto o efeito relaxante do extrato em corpo cavernoso isolado de

coelho não parece ter relação com a liberação de óxido nítrico (ANTUNES et al,

2001).

Um estudo clínico de fase I investigou a administração crônica de 25 mL de

Catuama® duas vezes por dia por 28 dias, em voluntários saudáveis de ambos os

sexos. Objetivou-se a observação de quaisquer efeitos tóxicos do fitoterápico.

Nenhuma reação adversa tóxica foi relatada ou mudanças hematopoiéticas e

bioquímicas foram detectadas (OLIVEIRA et al, 2005). Por conseguinte, o extrato

hidroetanólico das cascas de Trichilia catigua na concentração presente no

fitoterápico Catuama® pode ser considerado seguro e bem tolerado.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 ANÁLISES DA DROGA

4.1.1 Coleta e Identificação

A coleta das amostras utilizadas para este estudo foi realizada em uma

região de ocorrência natural da espécie no estado de Santa Catarina em janeiro de

2005. Coletaram-se amostras de cascas e folhas de uma população de cerca de 20

árvores de T. catigua na cidade de São Miguel do Oeste - SC, com altitude entre 522

a 536 metros, latitude 26º 46' 950" a 26º 47' 006" e longitude 53º 30' 612" a 53º 30'

910".

Realizou-se uma exsicata do material, a qual foi identificada pelo botânico

Dr. Gerdt Hatchbach e depositada no herbário da Prefeitura Municipal de Curitiba

sob o registro número 306253.

4.1.2- Secagem e Moagem

Após a coleta, as amostras das folhas e das cascas, Figura 1, foram secas

em estufa a 50 °C por 24 h. Separou-se uma parte para a realização do estudo

anatômico e o restante do material foi moído em moinho de martelos IKA modelo

MFC com tela de 3 mm e armazenadas em frasco âmbar até o momento das

análises.

FIGURA 1 – ASPECTOS DAS FOLHAS E CASCAS SECAS ANTES DA MOAGEM.

4.1.3 Determinação Granulométrica

A determinação da granulometria da droga moída foi realizada no

granulômetro Produtest modelo T, segundo a Farmacopéia Brasileira IV ed. 1988,

utilizando-se exatamente cerca de 50 g de amostra. A análise foi realizada em

triplicata.

4.1.4 Ensaios de Pureza

4.1.4.1 Determinação das cinzas totais

Pesou-se exatamente cerca de 3 g da droga moída em um cadinho de

porcelana previamente calcinado a 800 °C em mufla EDG modelo 1800, resfriado

em dessecador e pesado. A amostra foi então incinerada aumentando-se a

temperatura gradativamente até 450 °C como pode ser observado na Tabela 1. O

cadinho foi então resfriado em dessecador e o peso final foi anotado.

A relação das cinzas totais se dá pela subtração do peso final do cadinho

com a amostra e o peso do cadinho vazio, dividido pelo total de amostra. A análise

foi realizada em triplicata.

TABELA 1- PROGRAMAÇÃO DA MUFLA PARA A ANÁLISE DE CINZAS

Patamar de aquecimento 1 2 3

Temperatura (°C) 105 250 450

Rampa de aquecimento (°C/min) 5 10 25

Tempo de estabilização no patamar (min) 60 60 180

4.1.4.2 Determinação das cinzas insolúveis em HCl

O resíduo obtido da determinação de cinzas totais foi fervido durante 5

minutos com uma solução de ácido clorídrico 0,2 M. O resíduo insolúvel no ácido

clorídrico foi recolhido em papel de filtro com cinzas conhecidas e lavado com água

quente até o filtrado tornar-se neutro. O papel de filtro foi transferido para o cadinho

original e incinerado paulatinamente a cerca de 450 °C, com a mesma programação

de aquecimento da mufla da análise de cinzas totais, até peso constante.

A relação das cinzas insolúveis se dá pela diferença entre o peso do cadinho

incinerado com a amostra e do cadinho vazio, dividido pela quantidade de amostra.

A análise foi realizada em triplicata.

4.1.4.2 Determinação da perda por dessecação

Foi realizada em balança de infravermelho Sartorius modelo MA 30,

segundo a Farmacopéia Brasileira 4 ed. (1988) modificada pelo departamento de

Garantia da Qualidade do Laboratório Catarinense. Pesou-se exatamente cerca de 2

g de droga em um prato de alumínio específico para determinação de perda e

dessecou-se a 105 °C por 60 minutos.

A perda por dessecação se dá pela diferença do prato de alumínio com a

amostra antes da dessecação e após a dessecação, dividido pelo peso da amostra,

cálculo realizado automaticamente pelo equipamento. A análise foi realizada em

triplicata.

4.1.5 Determinação do Perfil Fitoquímico Preliminar

Determinou-se o perfil fitoquímico do extrato aquoso e hidroalcoólico das

cascas e folhas da espécie segundo método descrito por MOREIRA (1979).

4.1.5.1 Preparo dos extratos para a determinação do perfil fitoquímico preliminar

O extrato aquoso foi produzido a 20 % (40 g da droga moída macerada por

24 horas com 200 mL de água purificada) e o extrato hidroalcoólico foi produzido e

também a 20 % (40 g da droga moída macerada por 24 horas com 200 mL etanol a

70 % v/v). Após a maceração, os extratos foram filtrados por papel de filtro e

armazenados em frascos âmbar mantidos sob refrigeração. Com os mesmos

procedeu-se a análise fitoquímica preliminar.

4.1.5.1.1 Ensaios com o extrato aquoso

a) Heterosídeos antociânicos: Separaram-se 3 porções de 5 mL do

extrato aquoso em três tubos de ensaio e levou-se um ao pH ácido, um ao pH neutro

e outro ao pH básico (com solução aquosa de hidróxido de potássio a 5 % e solução

aquosa de ácido clorídrico 1 M), obtendo os respectivos pHs: 5,5 (pH ácido) ; 7,0 (pH

neutro) e 9,5 (pH básico). Mudança de coloração nas três porções indica a presença

de heterosídeos antociânicos.

b) Heterosídeos saponínicos: Os três tubos obtidos no ensaio anterior

foram agitados energicamente durante 5 minutos. Espuma persistente em um dos

tubos indica a presença de saponinas, que é confirmada pela adição de solução

aquosa de ácido clorídrico a 1 %.

c) Heterosídeos cianogenéticos: Foram transferidos 15 mL do extrato

aquoso para um tubo de ensaio, com o cuidado de não umedecer as paredes

superiores. Adicionou-se 1 mL de ácido sulfúrico 1 N. Uma tira de papel picro-sódico

foi suspensa no tubo com o auxílio de uma tampa. O tubo de ensaio foi deixado em

um banho-maria à temperatura de 60 °C, durante 30 minutos. O papel adquirindo

coloração vermelha indica a presença de heterosídeos cianogenéticos.

d) Taninos: Em 5 mL do extrato adicionaram-se 5 gotas de cloreto férrico

a 1 %. Havendo a formação de um precipitado escuro o seguinte ensaio é efetuado:

5 mL do extrato aquoso é transferido para um balão de fundo chato de 100 mL. Nele

acrescenta-se 5 gotas de formaldeído a 37 % e 4 mL de ácido clorídrico. A mistura é

aquecida sob refluxo durante 1 hora. Após seu resfriamento, a solução é filtrada e o

insolúvel é lavado com água purificada e com álcool. Se no insolúvel houver

formação de coloração pela adição de algumas gotas de solução aquosa de

hidróxido de potássio a 5 %, significa a presença de taninos condensados. Se no

filtrado, pelo excesso de acetato de sódio e a adição de 10 gotas de cloreto férrico a

1 %, houver formação de precipitado escuro ou azul, indica a presença de taninos

hidrolisáveis.

e) Amino-grupos: Foram concentrados 10 mL do extrato aquoso à 50 °C

até o volume de 5 mL. Em um papel de filtro, 5 gotas deste extrato foram

depositadas. Após secos, foram nebulizados com solução butanólica de ninhidrina.

Depois do aquecimento em estufa a 90-100 °C durante 15 minutos, o aparecimento

de coloração azul-violácea indica a presença de amino-grupos.

4.1.5.1.2 Ensaios com o extrato hidroalcoólico

a) Esteróides e triterpenos: Foram evaporados à secura 20 mL do extrato

alcoólico e extraído com 3 vezes sucessivas de 5 mL de diclorometano. O extrato

diclorometânico foi concentrado a um volume de 3 mL e transferido para um tubo de

ensaio, onde juntou-se 2 mL de anidrido acético. Cautelosamente adicionaram-se 3

gotas de ácido sulfúrico. O desenvolvimento de coloração azul a verde indica a

provável presença de núcleo esteroidal e o aparecimento de coloração vermelha,

rósea, púrpura ou violácea indica a provável presença de policíclicos triterpênicos.

b) Alcalóides: Foram evaporados 50 mL do extrato alcoólico em banho-

maria a 60 °C. O resíduo foi dissolvido em 1 mL de etanol e 20 mL de solução de

ácido clorídrico 1 %. A mistura foi transferida para um funil de separação e

alcalinizada com solução de hidróxido de amônio 6 N até pH 9-10. O extrato

alcalinizado foi extraído três vezes sucessivas de 15 mL com uma mistura de éter

etílico e diclorometano (3:1). O extrato éter-diclorometano-amoniacal foi evaporado à

secura em banho-maria a 50 ºC, e dissolvido em 0,5 mL de etanol e 5 mL de solução

de ácido clorídrico 1 %. A mistura foi dividida em 5 tubos de ensaio. Após

resfriamento gotejam-se os reativos de Mayer, Bertrand, Bouchardat e Dragendorff.

Turvação nos tubos quando comparados ao tubo branco indica a presença de

alcalóides.

c) Cumarinas: Depositou-se em um papel de filtro 15 gotas do extrato

etéreo obtido no teste b, dividido em 3 pontos. Dois pontos foram tratados com uma

gota de hidróxido de sódio 1 N e então o papel foi levado a uma câmara de luz UV

em ondas longas durante 3 minutos. O desenvolvimento de fluorescência azul ou

verde-amarelada nas manchas tratadas com o hidróxido de sódio revela a presença

de cumarinas.

d) Ácidos orgânicos: o restante do extrato etéreo obtido no teste b foi

levado à secura e dissolvido em 5 mL de água purificada. O pH ácido desta solução

indica a presença de ácidos orgânicos.

e) Hidroxiantraquinonas: Foram fervidos 20 mL do extrato alcoólico

adicionado de 3 mL de ácido sulfúrico 10 % sob refluxo durante 15 minutos. O

líquido foi filtrado ainda quente e após o resfriamento foi transferido para um funil de

separação junto com 30 mL de água purificada e extraído por 3 vezes de 10 mL de

tolueno. O extrato toluênico foi concentrado a 10 mL e transferido para um tubo de

ensaio. Então foi agitado com 10 mL de solução reagente de hidróxido de sódio. O

aparecimento de coloração rósea ou avermelhada indica a presença de

hidroxiantraquinonas.

f) Flavonóides: Em um tubo de ensaio mantido sob gelo, adicionou-se 5

mL do extrato alcoólico, 2 g de limalhas de magnésio e 2 mL de ácido clorídrico

concentrado. Deixou-se reagir 15 minutos e observou-se. Desenvolvimento de

coloração rósea ou vermelha indica a presença de heterosídeos flavônicos.

4.1.6 Estudo Anatômico

As análises dos caracteres anatômicos foram efetuadas em folhas adultas e

cascas de caule secas re-hidratadas em água destilada antes da realização dos

cortes.

Prepararam-se lâminas semipermanentes, a partir de secções paradérmicas

à mão livre do limbo das folhas, incluindo a nervura central. Os cortes foram

submetidos à coloração com azul de astra e fuccina básica (ROESER, 1962). As

lâminas foram montadas com glicerina diluída a 50 % (BERLYN, MISCHE, 1976) e

para a lutagem foi utilizado esmalte incolor (BEÇAK, PAULETE, 1976).

As lâminas permanentes foram obtidas a partir de secções transversais do

limbo das folhas, incluindo a nervura central. Para as cascas foram realizados cortes

transversais e longitudinais. O material foi desidratado em série etanólica e incluído

em glicol-metacrilato (Leica Historesine ®) (KRAUSS, ADUIN, 1997). O material

incluído foi então seccionado no micrótomo Olympus CUT 4055, obtendo-se cortes

de 7 µm de espessura corados com azul de astra e fuccina básica (ROESER, 1962)

ou azul de toluidina (O’BRIEN, FEDER MCCULLY, 1965).

Os resultados foram registrados por meio de fotomicrografias no microscópio

fotônico Olympus BX 40, acoplado à unidade de controle PM-20.

4.2 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

4.2.1 Preparo dos Extratos Brutos

Para o desenvolvimento das análises cromatográficas foram utilizados

extratos brutos das cascas e folhas da catuaba. Os extratos foram preparados em

extrator tipo Soxhlet com solvente etanol a 96 % (v/v). Adicionaram-se exatamente

cerca de 5 gramas de droga em um tubo de Falcon de polipropileno perfurado na

parte cônica com algodão nas extremidades. Colocou-se o tubo na parte extratora

do aparelho de Soxhlet acoplado a um balão de fundo chato contendo 120 mL de

solvente e pérolas de vidro. Verteram-se 80 mL de solvente sobre o tubo com a

amostra, conectou-se o conjunto ao condensador de bolas e deixou-se o sistema

sob refluxo em chapa de aquecimento por 5 horas. Decorrido o tempo, filtrou-se o

extrato em papel de filtro e concentrou-se em rotavapor a 50 °C até 50 mL,

constituindo-se assim os extratos brutos das cascas e folhas.

4.2.2 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

As análises de CLAE foram desenvolvidas em aparelho Merck-Hitachi

LaChrom Elite equipado com detector DAD L-2450, forno de coluna L-2300, bomba

quaternária L-2130 e amostrador automático L-2200. O programa de aquisição de

dados utilizado foi o EZChrom Elite.

As separações foram realizadas em coluna Waters X-Terra com fase reversa

octadecilsílica (RP-18) de 250 mm comprimento, 4,6 mm diâmetro interno,

preenchida com partículas esféricas de 5 µm e associada a uma pré-coluna. O forno

da coluna operou a temperatura de 25 °C. As fases móveis constituíram-se de ácido

fosfórico a 0,2 % em ácido sulfúrico 0,01 M – fase móvel ácida (Bomba A), e

acetonitrila grau CLAE 90 % em água purificada (Bomba B). Estas soluções foram

filtradas a vácuo por membrana de 0,45 µm de celulose modificada antes de serem

submetidas ao gradiente da análise. O gradiente de eluição das fases móveis

utilizado no método qualitativo da CLAE foi o descrito na Tabela 2.

TABELA 2- GRADIENTE DE ELUIÇÃO DAS FASES MÓVEIS DO MÉTODO QUALITATIVO

DA CLAE

Tempo (min) A (%) B (%) Fluxo (mL/min)

0 90 10 0,7

25 88 12 0,7

75 63 37 0,7

77 10 90 0,7

81 10 90 1,0

82 10 90 0,9

83 90 10 0,8

85 90 10 0,7

90 90 10 0,7

O detector de arranjo de diodos (DAD) foi configurado para realizar a

varredura de 200 a 400 nm e integrar o cromatograma a 280 nm.

Foram feitas soluções estoque dos padrões de referência de ácido gálico,

epi-catequina, ácido clorogênico, ácido cafêico, catequina, cumarina, ácido p-

cumárico, ácido ferúlico e rutina em metanol na concentração de 1 mg/mL (p/v). Foi

realizada uma mistura dos padrões diluídos para 0,1 mg/mL na fase móvel ácida.

Após o preparo a solução padrão foi homogeneizada em vortex, centrifugada,

filtrada por membrana de 45 µm e 20 µL da solução foi injetada no equipamento.

Na análise das amostras, os extratos brutos das cascas e das folhas foram

diluídos 4 vezes na fase móvel ácida. Após o preparo as amostras foram

homogeneizadas em vortex, centrifugadas, filtradas por membrana de 45 µm e 20 µL

da solução foi injetada no equipamento.

A presença dos compostos fenólicos identificados foi confirmada pela adição

de 0,1 mg/mL do padrão de referência nas amostras dos extratos brutos diluídos na

fase móvel ácida. Após o preparo as amostras foram homogeneizadas em vortex,

centrifugadas, filtradas por membrana de 45 µm e 20 µL da solução foi injetada no

equipamento.

Para a quantificação do ácido clorogênico utilizou-se a mesma coluna e

fases móveis do método do perfil de fenólicos. O gradiente de eluição das fases

móveis utilizado no método quantitativo foi o descrito na Tabela 3.

TABELA 3- GRADIENTE DE ELUIÇÃO DAS FASES MÓVEIS DO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CLAE

Tempo (min) A (%) B (%) Fluxo (mL/min)

0 80 20 0,7

9 77 23 0,7

10 10 90 0,7

11 10 90 0,7

13 10 90 0,8

14 80 20 0,9

15 80 20 0,7

16 80 20 0,7

20 80 20 0,7

O DAD foi configurado para realizar a varredura de 230 a 400 nm e integrar

o cromatograma a 326 nm. Foram feitas soluções estoque do padrão de referência

de ácido clorogênico em metanol na concentração de 0,5 mg/mL (p/v). Foi realizada

uma diluição do padrão para 0,1 mg/mL na fase móvel ácida e 20 µL da solução

foram injetados no equipamento.

Realizaram-se análises espectrais da resposta do DAD, onde o perfil

espectral determinando o comprimento de onda máximo e a pureza do pico do

padrão de ácido clorogênico foi avaliada.

Para a análise das amostras os extratos brutos das cascas e das folhas

foram diluídos adicionando-se 750 µL do extrato em um balão volumétrico de 5 mL e

completando-se o volume com fase ácida. Para confirmar a presença dos fenólicos

identificados foi realizada análise por adição de padrão de referência nas amostras

dos extratos brutos diluídos na fase móvel ácida. Após o preparo as amostras foram

homogeneizadas, centrifugadas, filtradas por membrana de 45 µm e 20 µL da

solução foi injetada no equipamento. Foram realizadas análises espectrais onde a

pureza do pico de ácido clorogênico antes e após a adição do padrão de referência

foi avaliada.

4.2.3 Cromatografia Gasosa

As análises de CG foram realizadas em aparelho Shimadzu 14-B equipado

com detector de ionização de chama (DIC), forno de colunas com rampas de

aquecimento programáveis e interface CBM-101. O programa de aquisição de dados

utilizado foi o Class GC.

As separações foram realizadas em coluna J&W Scientific DB-17, com 0,53

mm de diâmetro interno, 30 m de comprimento, 1 µm de filme da fase estacionária

50 % fenil e 50 % dimetilpolisiloxano. Utilizou-se como gás de arraste hidrogênio a

30 kPa. O gradiente de temperatura utilizado foi: temperatura inicial 100 °C com

patamar de 1 minuto e rampa de aquecimento a 7 °C por minuto até 260 °C com

patamar de 66 minutos. A temperatura do injetor foi de 260 °C e do detector foi de

280 °C. As amostras foram injetadas em modo de divisão de amostra (split mode) à

razão de 1:10 e o volume de injeção foi de 4 µL. A análise dos dados obtidos foi

realizada utilizando o programa Class-CG.

Foram feitas soluções estoque dos padrões de referência dos esteróides

estigmasterol e beta-sitosterol, e os triterpenos lupeol, alfa-amirina e beta-amirina. O

padrão interno utilizado foi o acetato de tocoferol. Todos os padrões foram diluídos

em etanol na concentração de 1 mg/mL (p/v). Foi realizada uma solução padrão da

mistura dos padrões diluídos para 0,1 mg/mL em etanol. Após o preparo a solução

padrão foi homogeneizada em vortex, centrifugada e 4 µL da solução foram

injetados no equipamento.

O preparo das soluções amostra foi realizado adicionando 25 mL do extrato

bruto adicionado de 5 mL de água em um tubo de Falcon. Extraiu-se a solução com

cinco porções de 20 mL de éter de petróleo por agitação da solução em vortex. Após

cada extração a solução foi centrifugada e as porções etéreas foram reunidas e

evaporadas à secura em rotavapor a 50 °C. Em seguida adicionou-se 500 µL da

solução de padrão interno de acetato de tocoferol 1 mg/mL em um balão volumétrico

de 5 mL e completou-se o volume ressuspendendo o resíduo do balão de

evaporação com porções de 1 mL de etanol absoluto. Centrifugou-se uma porção da

solução do balão volumétrico e 4 µL foram injetados no equipamento.

A presença dos compostos identificados foi confirmada pela adição de 0,1

mg/mL do padrão de referência nas amostras dos extratos brutos extraídos. Após o

preparo as amostras foram homogeneizadas em vortex, centrifugadas e 4 µL da

solução foi injetada no equipamento.

Para a quantificação do beta-sitosterol foi desenvolvido um método na

coluna Phenomenex ZB-1, com 0,53 mm de diâmetro interno, 30 m de comprimento

0,5 µm de filme da fase estacionária 100 % dimetilpolisiloxano. Utilizou-se como gás

de arraste hidrogênio a 30 kPa. O gradiente de temperatura utilizado foi: temperatura

inicial 100 °C com patamar de 1 minuto, rampa de aquecimento a 8 °C por minuto

até 270 °C com patamar de 35 minutos e rampa de aquecimento a 40 °C por minuto

até 300 °C com patamar de 5 minutos. A temperatura do injetor foi de 280 °C e do

detector foi de 300 °C. As amostras foram injetadas em modo de divisão de amostra

(split mode) à razão de 1:10 e o volume de injeção foi de 4 µL. A análise dos dados

obtidos foi realizada utilizando o programa Class-CG.

4.2.4 Cromatografia em Camada Delgada

A análise de compostos fenólicos foi realizada em cromatoplacas Merck

recobertas com Sílica gel 60 F

254

. Esta análise compreendeu o desenvolvimento de

um sistema de fase móvel, o qual constituiu-se da mistura de acetato de etila, ácido

fórmico, ácido acético e água na proporção 68:7:7:18 volumes respectivamente. A

corrida cromatográfica ascendente foi desenvolvida em cuba de vidro previamente

saturada com a fase móvel.

Com o auxílio de uma micropipeta aplicaram-se na placa bandas de 10 µL

dos extratos brutos e dos padrões de referência. A confirmação da presença dos

compostos foi realizada aplicando os extratos brutos adicionados da solução do

padrão de referência. A visualização do perfil de fenólicos foi realizada através da

revelação com o reativo de NEU (éster-β-etilamina do ácido difenilborônico a 1 % em

etanol seguido de polietilenoglicol-4000 a 5 % em etanol) e observadas sob luz UV a

366 nm (WAGNER,1996).

A análise de esteróides e triterpenos foi realizada em cromatoplacas Merck

recobertas com Sílica gel 60 F

254

. A fase móvel utilizada constituiu-se da mistura de

clorofórmio e etanol na proporção 95:5 respectivamente. A corrida cromatográfica foi

desenvolvida em cuba de vidro previamente saturada com a fase móvel.

Com o auxílio de uma micropipeta aplicaram-se na placa bandas de 10 µL

dos extratos brutos e dos padrões de referência. A confirmação da presença dos

compostos foi realizada aplicando os extratos brutos adicionados da solução do

padrão de referência. A visualização do perfil de esteróides e triterpenos foi realizada

através da revelação com vanilina fosfórica (1 g de vanilina em 100 mL de ácido

fosfórico a 50 %). Em seguida a placa foi colocada em estufa a 100 °C por 10

minutos e observada sob luz visível (WAGNER,1996).

4.2.5 Validação analítica

As análises cromatográficas quantitativas por CLAE e CG foram validadas

segundo o Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos (RE-899 de 29

de maio de 2003) da ANVISA.

Segundo esta resolução, as metodologias se classificam, segundo sua

finalidade, na categoria I – Testes quantitativos para a determinação do princípio

ativo em produtos farmacêuticos ou matérias-primas. Esta categoria exige a

realização dos seguintes ensaios: especificidade, linearidade, intervalo, precisão por

repetibilidade e intermediária, exatidão e robustez.

4.2.5.1 Validação analítica do doseamento do ácido clorogênico por CLAE

A descrição detalhada da execução do ensaio analítico para fins de

validação do método de doseamento de ácido clorogênico no extrato bruto de

catuaba cascas e folhas apresenta-se a seguir.

As análises foram realizadas utilizando o extrato bruto das cascas, somente

a análise de especificidade utilizará a amostra do placebo das folhas no intuito de

demonstrar a aplicabilidade do método aos dois extratos. As condições da análise

cromatográfica bem como o modo de preparo da amostra encontram-se descritas no

item 4.2.2. Os resultados são demonstrados em micrograma de analito por grama de

droga (µg/g).

4.2.5.1.1 Linearidade

Para a realização da curva de calibração foram preparadas cinco

concentrações diferentes a partir da solução padrão de referência de ácido

clorogênico [0,5 mg/mL]. Para cada concentração foram realizadas 5 corridas (5

pontos por concentração). Prepararam-se as soluções em balões volumétricos

calibrados de 5 mL conforme Tabela 4. Apesar da RE 899 da ANVISA (2003)

preconizar um intervalo entre 80 a 120 % para análises de determinação quantitativa

do analito em matérias-primas resolveu-se estender este intervalo para 50 a 150 %,

visando a obtenção mais precisa dos resultados de eficiência extrativa, os quais

podem demonstrar variações maiores que 20 %. A condição de análise é que o

coeficiente de correlação (r

) deve resultar no mínimo 0,99.

TABELA 4 - DADOS PARA O PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO

Concentração do padrão

de referência (%)

Volume da solução de referência

ácido clorogênico [0,5 mg/mL] (µL)

Volume de

fase ácida

50 67

75 100

100 133

125 167

150 200

Q.s.p. 5 mL

4.2.5.1.2 Exatidão

O placebo do extrato bruto foi considerado o resíduo da droga que já passou

pelo processo de extração por soxhlet. Amostras dos placebos das cascas e folhas

fortalecidas com o padrão de referência foram analisadas em triplicata em três níveis

de concentrações determinando a porcentagem de recuperação da quantidade

conhecida do padrão adicionada na amostra. Para os cálculos serão utilizadas no

mínimo três leituras.

Foi utilizado o padrão de referência de ácido clorogênico para preparo da

amostra placebo fortalecido nas concentrações de 50 %, 100 % e 150 %. As

extrações foram feitas com o mesmo processo do preparo dos extratos brutos,

substituindo a droga pelo resíduo de extração adicionado do padrão de referência.

As amostras de placebo fortalecido foram preparadas em três replicatas

conforme a Tabela 5.

TABELA 5 – PREPARO DAS AMOSTRAS DE PLACEBO FORTALECIDO PARA O TESTE

DE EXATIDÃO

Amostra

(%)

Concentração

esperada (µg/mL)

Resíduo de

extração (g)

Padrão de referência ácido

clorogênico (mg)

50 6,70 5 2,23

100 13,30 5 4,43

150 20,00 5 6,67

A exatidão é expressa em porcentagem de recuperação através do ensaio

do ativo adicionado em quantidade conhecida. Esta porcentagem é calculada

determinando-se a razão da quantidade encontrada dividida pela quantidade

adicionada e multiplicando-se por 100. O valor de recuperação deve ficar entre 95 a

105 %.

Recuperação (%) = Concentração prática do padrão adicionado x 100

Concentração teórica padrão adicionado

4.2.5.1.3 Especificidade

Foram analisadas as soluções do padrão de referência e as soluções

placebo das cascas e folhas, para a determinação da interferência de cada amostra

nas análises. A solução placebo foi preparada da mesma forma que a amostra,

substituindo a droga pelo resíduo da extração.

Os cromatogramas resultantes foram analisados por sobreposição, não

podendo haver resposta maior que 2 % nas soluções placebo, no mesmo tempo de

retenção do ácido clorogênico obtido nas soluções padrão e placebo fortalecido.

4.2.5.1.4 Precisão por repetibilidade

A precisão é a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas

de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A precisão por repetibilidade

(intra- corrida) é a concordância entre os resultados dentro de um curto período de

tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. Foram realizadas três

análises da amostra com seis repetições no mesmo dia, com o mesmo analista e

mesmo equipamento.

4.2.5.1.5 Precisão intermediária

A precisão por intermediária (inter-corridas) é a concordância entre os

resultados dentro de um mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com

analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Foram realizadas três análises da

amostra com seis repetições em dias diferentes e com analistas diferentes.

4.2.5.1.5 Robustez

É a medida da capacidade de um método analítico resistir a pequenas e

deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso

normal. Para a CLAE serão considerados como fatores de variação do método:

- Uso de outra coluna cromatográfica com lote diferente da utilizada para

as análises anteriores;

- Variação do pH da fase móvel ácida em menos 0,2 pontos (de 2,20

para 2,00) adicionando ácido fosfórico concentrado à fase móvel;

- Aumento da temperatura do forno de colunas em 2 °C, ou seja, de 25

°C para 27 °C.

4.2.5.1.6 Intervalo

O intervalo de utilização do método foi considerado aquele compreendido

entre os valores utilizados no teste da linearidade. Todas as amostras testadas

foram diluídas de modo que sua concentração de ácido clorogênico ficasse dentro

destes parâmetros.

4.2.5.2 Validação analítica do doseamento do beta sitosterol por CG

Descrição detalhada da execução do ensaio analítico para fins de validação

do teste de doseamento de beta sitosterol no extrato bruto de catuaba cascas

apresenta-se a seguir.

As análises serão realizadas utilizando o extrato bruto das cascas. Somente

a análise de especificidade utilizará a amostra do placebo das folhas no intuito de

demonstrar a aplicabilidade do método a ambos os extratos. As condições da

análise cromatográfica bem como o modo de preparo da amostra encontram-se

descritas no item 4.2.2. Os resultados são demonstrados em micrograma de analito

por grama de droga (µg/g).

4.2.5.2.1 Linearidade

Para a realização da curva de calibração foram preparadas cinco

concentrações diferentes a partir da solução padrão de referência de beta sitosterol

[1 mg/mL]. Para cada concentração foram realizadas 5 corridas (5 pontos por

concentração). Prepararam-se as soluções em balões volumétricos calibrados de 5

mL conforme Tabela 6. Apesar da RE 899 da ANVISA (2003) preconizar um

intervalo entre 80 a 120 % para análises de determinação quantitativa do analito em

matérias-primas resolveu-se estender este intervalo para 50 % a 150 %, visando a

obtenção mais precisa dos resultados de eficiência extrativa, os quais podem

demonstrar variações maiores que 20 %. A condição de análise é que o coeficiente

de correlação (r

) resulte no mínimo 0,99.

TABELA 6 - DADOS PARA O PREPARO DA CURVA DE CALIBRAÇÃO.

Concentração

do padrão de

referência (%)

Volume do padrão

interno acetato de

tocoferol [1 mg/mL] (µL)

Volume do padrão de

referência beta

sitosterol [1 mg/mL] (µL)

Volume de

etanol

50 500 250

75 500 375

100 500 500

125 500 625

150 500 750

Q.s.p. 5 mL

4.2.5.2.2 Exatidão

O placebo para extração do extrato bruto foi considerado o resíduo das

drogas que já passaram pelo processo de extração por soxhlet. Foi utilizado o

padrão de referência beta sitosterol para preparo da amostra placebo fortalecido nas

concentrações de 50 %, 100 % e 150 %. As extrações foram feitas com o mesmo

processo do preparo dos extratos brutos, substituindo a droga pelo resíduo de

extração adicionado do padrão de referência.

As amostras fortalecidas foram preparadas em três replicatas conforme a

Tabela 7.

TABELA 7 – PREPARO DAS AMOSTRAS FORTALECIDAS PARA O TESTE DE

EXATIDÃO.

Amostra

(%)

Concentração

esperada (µg/mL)

Resíduo de

extração (g)

Padrão de referência beta

sitosterol (mg)

50 50 5 0,50

100 100 5 1,00

150 150 5 1,50

A exatidão é expressa em porcentagem de recuperação através do ensaio

do ativo adicionado em quantidade conhecida. Esta porcentagem é calculada

determinando-se a razão da quantidade encontrada dividida pela quantidade

adicionada e multiplicando-se por 100. O valor de recuperação deve ficar entre 95 a

105 %.

Recuperação (%) = Concentração prática do padrão adicionado x 100

Concentração teórica padrão adicionado

4.2.5.2.3 Especificidade

Foram analisadas as soluções do padrão de referência e as soluções

placebo das cascas e folhas, para a determinação da interferência de cada amostra

nas análises. A solução placebo foi preparada da mesma forma que a amostra,

substituindo a droga pelo resíduo da extração.

Os cromatogramas resultantes foram analisados por sobreposição, não

podendo haver resposta maior que 2 % na solução placebo, no mesmo tempo de

retenção do beta sitosterol obtido nas soluções padrão e placebo fortalecido.

4.2.5.2.4 Precisão por repetibilidade

A precisão é a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas

de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A precisão por repetibilidade

(intra- corrida) é a concordância entre os resultados dentro de um curto período de

tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação. Foram realizadas três

análises da amostra com seis repetições no mesmo dia, com o mesmo analista e

mesmo equipamento.

4.2.5.2.5 Precisão intermediária

A precisão por intermediária (inter-corridas) é a concordância entre os

resultados dentro de um mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com

analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Foram realizadas três análises da

amostra com seis repetições em dias diferentes e com analistas diferentes.

4.2.5.2.5 Robustez

É a medida da capacidade de um método analítico resistir a pequenas e

deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança durante o uso

normal. Para a CG serão considerados como fatores de variação do método:

- Uso de outra coluna cromatográfica com lote diferente da utilizada para

as análises anteriores;

- Variação da vazão do gás de arraste, de 30 para 32 Kpa;

- Aumento da temperatura do forno de colunas em 2 °C, ou seja, de 280

°C para 282°C.

4.2.5.2.6 Intervalo

O intervalo de utilização do método foi considerado aquele compreendido

entre os valores utilizados no teste da linearidade. Todas as amostras testadas

foram diluídas de modo que sua concentração de beta sitosterol ficasse dentro

destes parâmetros.

4.3 ANÁLISES DE EFICIÊNCIA EXTRATIVA

Realizaram-se análises de eficiência extrativa pelos métodos descritos a

seguir. As extrações das cascas e folhas foram realizadas em paralelo e utilizaram

como solvente extrator o etanol a 96 % (v/v) e etanol 50 % (v/v), constituindo

extratos a 10 % (p/v).

Após a confecção dos extratos, foi realizado o perfil cromatográfico por

CLAE de cada extrato, conforme metodologia descrita no item 4.2.2. As

quantificações de ácido clorogênico e beta-sitosterol foram realizadas conforme as

metodologias validadas.

4.3.1 Extração por Maceração

Adicionaram-se exatamente cerca de 5 g de droga em um erlenmeyer de

125 mL e verteu-se 50 mL de solvente extrator. Tampou-se o erlenmeyer e o

sistema permaneceu em repouso por 24 horas, Figura 2. Decorrido o tempo filtrou-

se o extrato sobre algodão para um balão volumétrico de 50 mL e lavou-se a droga

com o solvente extrator até completar o volume do balão volumétrico.

FIGURA 2 – PREPARO DOS EXTRATOS POR MACERAÇÃO

4.3.2 Extração por Sonicação

Adicionaram-se exatamente cerca de 5 g de droga em um erlenmeyer de

125 mL e verteu-se 50 mL de solvente extrator. Tampou-se o erlenmeyer e o

sistema foi colocado em um banho de ultra-som Bransom modelo 2210 por uma

hora, Figura 3. Decorrido o tempo filtrou-se o extrato sobre algodão para um balão

volumétrico de 50 mL e lavou-se a droga com o solvente extrator até completar o

volume do balão volumétrico.

FIGURA 3 – PREPARO DOS EXTRATOS POR SONICAÇÃO

4.3.3 Extração por Turbólise

Adicionaram-se exatamente cerca de 5 g de droga em um tubo de

polipropileno de 50 mL e verteu-se 15 mL de solvente extrator. Realizou-se a

extração em Ultra Turrax IKA modelo T25 basic a 24000 rpm por 5 minutos, Figura

4. Após a extração, centrifugou-se o tubo de polipropileno e o sobrenadante foi

filtrado sobre algodão para um balão volumétrico de 50 mL. Repetiu-se o processo

extrativo com mais quatro porções de 10 mL de solvente extrator até completar o

volume do balão volumétrico.

FIGURA 4 – PREPARO DOS EXTRATOS POR TURBÓLISE

4.3.4 Extração por Refluxo

Adicionaram-se exatamente cerca de 5 g de droga em um balão de fundo

chato de 250 mL e verteu-se 50 mL de solvente extrator. Acoplou-se o balão em um

condensador de bolas e o sistema foi colocado sobre uma chapa de aquecimento

onde permaneceu em refluxo por uma hora, Figura 5. Decorrido o tempo filtrou-se o

extrato sobre algodão para um balão volumétrico de 50 mL e lavou-se a droga com o

solvente extrator até completar o volume do balão volumétrico.

FIGURA 5 – PREPARO DOS EXTRATOS POR REFLUXO

4.3.5 Extração por Soxhlet

Adicionaram-se exatamente cerca de 5 gramas de droga em um tubo de

Falcon de polipropileno perfurado na parte cônica com algodão nas extremidades.

Colocou-se o tubo na parte extratora do aparelho de Soxhlet acoplado a um balão

de fundo chato contendo 120 mL de solvente extrator e pérolas de vidro, Figura 6.

Verteram-se 80 mL de solvente extrator sobre o tubo com a amostra, conectou-se o

conjunto ao condensador de bolas e deixou-se o sistema sob refluxo em chapa de

aquecimento por cinco horas. Decorrido o tempo, filtrou-se o extrato em algodão e

concentrou-se em rotavapor a 50 °C até 50 mL, constituindo-se assim os extratos

brutos das cascas e folhas.

FIGURA 6 – PREPARO DOS EXTRATOS POR SOXHLET

4.4- ANÁLISES ESTATÍSTICAS

Foi realizada análise de variância ANOVA ao nível de 5 % de significância

utilizando um delineamento inteiramente casualizado. O teste foi aplicado para

comparar os teores de marcadores químicos nas cascas e folhas dos diferentes

processos extrativos. Para a comparação entre médias foi realizado o teste de Tukey

ao nível de 95 % de probabilidade.

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 ANÁLISES DA DROGA

5.1.1 Ensaios de Pureza

Os resultados para a análise de cinzas totais e insolúveis em ácido clorídrico

podem ser observados nas Tabelas 8 e 9.

TABELA 8 - TEOR DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM HCl DAS CASCAS DA

CATUABA

Cadinho Cinzas totais (%) Cinzas insolúveis em HCl (%)

1 7.56 0.87

2 7.49 1.07

3 7.41 1.41

Média 7.52 1.11

DP 0.04 0.27

TABELA 9 - TEOR DE CINZAS TOTAIS E INSOLÚVEIS EM HCl DAS FOLHAS DA

CATUABA.

Cadinho Cinzas totais (%) Cinzas insolúveis em HCl (%)

4 8.23 1.43

5 8.13 0.91

6 8.21 1.01

Média 8.19 1.12

DP 0.05 0.27

Observou-se que o teor de cinzas totais das cascas é 0,67 % menor que o

das folhas, mas as cinzas insolúveis em HCl das duas partes da planta estudadas

são praticamente iguais variando em apenas 0,01 %.

Os resultados das análises de perda por dessecação podem ser observados

na Tabela 10.

TABELA 10- PERDA POR DESSECAÇÃO DA CATUABA

Análise Cascas (%) Folhas (%)

1 10,64 11,52

2 10,67 11,90

3 10,60 11,75

Média 10,64 11,72

DP 0,04 0,19

Observou-se que a perda por dessecação das cascas é de 1,08 % menor

que o das folhas. Os resultados demonstram que as análises de ensaio de pureza

possuem repetibilidade pelo baixo desvio padrão da média encontrado.

5.1.2 Perfil Fitoquímico Preliminar

Os resultados do perfil fitoquímico dos extratos aquoso e hidroalcoólico das

cascas e folhas da catuaba podem ser observados nas Tabelas 11 e 12.

TABELA 11 - RESULTADO DO PERFIL FITOQUÍMICO PARA OS EXTRATOS AQUOSOS DAS

DROGAS.

Grupo Reação positiva Folhas Cascas

Heterosídeos Antociânicos Coloração diferente + +

Saponinas Espuma persistente

- +

Heterosídeos Cianogenéticos Papel vermelho - -

Taninos com FeCl

1 % Marrom + +

Taninos com acetato de chumbo Precipitado + +

Condensados

azul

Taninos com formol-clorídrico

Hidrolisáveis - azul + +

Amino-grupos Azul-violácea - -

O resultado do perfil fitoquímico dos extratos aquosos das cascas e folhas

foi praticamente igual sendo observada a presença de heterosídeos antociânicos,

taninos condensados e hidrolisáveis. A exceção foi a presença de saponinas que

somente foram detectadas nas cascas da planta.

TABELA 12 - RESULTADO DO PERFIL FITOQUÍMICO PARA O EXTRATO HIDROALCOÓLICO

DAS DROGAS.

Grupo Reação positiva Folhas Cascas

Alcalóides Fomação de precipitado - -

Flavonóides Coloração vermelha + +

Cumarinas Fluorescência azul-amarelada - -

Antraquinonas Coloração vermelha - -

Esteróides Coloração Azul-esverdeada + +

Triterpenos Coloração Vermelha-violácea - -

O resultado do perfil fitoquímico do extrato hidroalcoólico das cascas e

folhas foi igual sendo observada a presença de flavonóides e esteróides

demonstrando a similaridade da composição das duas partes da planta nesse

extrato.

5.1.3 Anatomia Botânica

5.1.3.1 Folhas

Na vista frontal do limbo, as células epidérmicas da face adaxial apresentam

contorno praticamente poligonal (fig 8) e as da abaxial levemente ondulada (fig7),

com campos primários de pontoação visíveis (figs. 7 e 8). A epiderme é

uniestratificada, apresenta células alongadas periclinalmente e são revestidas por

uma cutícula espessa e estriada. Os estômatos, do tipo anomocítico, estão inseridos

no mesmo nível em relação às demais células da epiderme, sendo encontrados

exclusivamente na face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática. As

células-guarda possuem formato reniforme e apresentam crista externa evidente (fig

7). Observa-se também a presença de tricomas tectores uni e pluricelulares com

parede espessada, cutícula granulosa e ápice agudo em ambas as faces.

O mesofilo é dorsiventral, composto por um estrato de parênquima

paliçádico junto à face adaxial e por parênquima esponjoso composto por cerca de

seis camadas de células com espaços intercelulares evidentes. Neste, distribuem-se

feixes vasculares de pequeno porte do tipo colateral, envoltos por uma bainha

parenquimática (fig 9).

A nervura central apresenta secção biconvexa, com uma leve curvatura na

face adaxial e maior proeminência na abaxial. A epiderme é uniestratificada,

revestida por cutícula estriada e espessada, com presença significativa de tricomas

tectores principalmente na face abaxial. O parênquima paliçádico gradualmente se

interrompe e é substituído por colênquima do tipo anelar composto por cerca de

cinco camadas na face adaxial e cerca de três camadas na abaxial. Observa-se

também a presença de idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio pelo

parênquima fundamental. Percorrendo o parênquima fundamental observa-se um

único feixe vascular concêntrico anficrival, sendo que a região central é ocupada por

células parenquimáticas. Este feixe é completamente envolto por uma bainha

esclerenquimática. O xilema é completamente lignificado, os elementos traqueais

estão dispostos em fileiras e a zona cambial é nítida. O floema consiste de uma faixa

contínua e estreita envolvendo todo o xilema (fig 10).

Numerosos idioblastos cristalíferos com drusas de oxalato de cálcio são

observados no mesofilo e no parênquima fundamental da nervura central (figs 9 e

10). Idioblastos constituídos por células aproximadamente isodiamétricas e

comparativamente maiores que as células adjacentes com conteúdo mucilaginoso

que se coram de azul são encontrados no mesofilo (fig 9).

5.1.3.2 Cascas

Morfologicamente as cascas são todos os tecidos e sistemas externos ao

câmbio vascular, periderme, cortex e floema. Portanto, o xilema não faz parte das

cascas, mas eventualmente na coleta deste material, parte do caule pode ser

retirado junto. Este fato justifica a presença de xilema na droga popularmente

chamada de casca.

Em secção transversal, a casca do caule apresenta periderme sendo o

súber formado por cerca de 10 camadas de células tabulares de paredes

espessadas. O feloderme evidente é formado por uma camada de cerca de 7 células

(fig. 12).

A região cortical é formada por 20 a 30 camadas de células parenquimáticas

alongadas tangencialmente. O floema, comparativamente bem desenvolvido, é

formado por células parenquimáticas, elementos crivados e por fibras dispostas

isoladamente, ou na sua maioria, em pequenas faixas. Ambas as regiões cortical e

floemática são repletas de células isodiamétricas contendo cristais de oxalato de

cálcio no formato de drusas e prismas (figs. 12 e 13).

O sistema vascular é percorrido por raios estreitos sendo as células destes

lignificadas no xilema. O xilema é totalmente lignificado, formado de elementos

traqueais dispostos em fileiras (fig. 11).

25 µm25 µm

25 µm

50 µm

Figuras 7-10: T. catigua limbo: 7,8. Vista Frontal das faces epidérmicas abaxial e

adaxial, respectivamente, mostrando cutícula estriada, estômatos anomocíticos e

campos primários de pontoação (setas); 9. Vista transversal do mesofilo dorsiventral

mostrando a epiderme uniestratificada (Ep), parênquima paliçádico (Pp), parênquima

esponjoso (Pe), feixe vascular (Fv), idioblasto (Id), estômato (Es) e cristal de oxalato

de cálcio (Cr); 10. Nervura central mostrando parênquima anelar (Pa), feixe vascular

(Fv) e bainha esclerenquimática (Be).

25 µm

100 µm

Figuras 11-13. T. catigua cascas: 11,12. Vista transversal das cascas mostrando

suber (Su), feloderme (Fé), região cortical (Co), floema (Fl) e drusas (Dr); 13. Vista

longitudinal mostrando prismas (Pr).

5.2 ANÁLISES CROMATOGRÁFICAS

O conceito de “fitoequivalência” foi desenvolvido na Alemanha para

assegurar a consistência das plantas medicinais. De acordo com este conceito, um

perfil químico, como o perfil cromatográfico, para uma planta medicinal deve ser

construído e comparado com o perfil de um produto de referência aprovado

clinicamente. Por definição, um perfil fitoquímico é, na prática, um padrão

cromatográfico do extrato da planta com componentes químicos farmacologicamente

ativos e ou característicos quimicamente. Sugere-se que com a ajuda de perfis

cromatográficos obtidos, a autenticação e identificação de plantas medicinais podem

ser conduzidas com maior precisão, ou perfis cromatográficos podem demonstrar

com sucesso ambas “semelhanças” e “diferenças“ entre várias amostras. Então,

deve-se considerar globalmente múltiplos constituintes nos extratos de plantas

medicinais e não considerar individualmente um e/ou dois marcadores químicos para

a avaliação da qualidade dos produtos das plantas medicinais (LIANG et al, 2004).

Entretanto, em qualquer planta medicinal e seu extrato, existem centenas de

componentes desconhecidos e muitos deles estão em baixa quantidade. Além disso,

usualmente existe variabilidade no mesmo material vegetal. Conseqüentemente,

para obter perfis cromatográficos que representem componentes farmacolo-

gicamente ativos ou compostos químicos característicos não é tarefa fácil. A

cromatografia oferece uma capacidade de separação muito poderosa, de modo que

o complexo de componentes químicos de um extrato de planta medicinal pode ser

separado em várias sub frações relativamente simples. Além disso, os recentes

avanços na aplicação de cromatografia conjugada com espectrometria tais como

CLAE-DAD, CLAE-EM e CG-EM, podem prover informação espectral adicional, a

qual será muito útil para a análise qualitativa e até mesmo para a elucidação

estrutural on-line (LIANG et al, 2004).

5.2.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

A CLAE é um método popular para a análise de plantas medicinais, pois é

fácil de aprender e seu uso não é limitado pela volatilidade ou estabilidade dos

compostos da amostra. Geralmente, CLAE pode ser utilizada para analisar quase

todos os compostos das plantas medicinais. Assim, nas últimas décadas, CLAE é o

método mais aplicado na análise das plantas medicinais. As colunas de fase reversa

são as mais populares utilizadas na separação analítica de plantas medicinais

(LIANG et al, 2004).

A CLAE-DAD tornou-se uma técnica comum na maioria dos laboratórios

analíticos do mundo atualmente. Com a informação espectral adicional, a análise

qualitativa de amostras complexas em plantas medicinais torna-se muito mais fácil

que antigamente. Por exemplo, pode-se checar a pureza do pico e comparar o

espectro do padrão conhecido com o da amostra investigada. Perfis cromatográficos

por CLAE podem ser aplicados para a documentação de extratos vegetais

completos com informações importantes (LIANG et al, 2004).

Existem diversos métodos para a quantificação de compostos fenólicos nas

plantas. O método de Folin-Denis é o procedimento mais utilizado para a

quantificação de fenólicos totais em plantas. A redução do reagente ácido

fosfomolibdico-fosfotungico (Folin-Denis) para um complexo azul em solução alcalina

ocorre na presença de compostos fenólicos detectados por espectrofotometria. O

método de Folin-Ciocalteau também é utilizado para a determinação do conteúdo

total de fenólicos nas plantas. Ambos os reagentes de Folin-Denis e Folin-Ciocalteu

não são específicos e detectam todos os grupos de compostos fenólicos nos

extratos, incluindo aqueles das proteínas extraíveis. Outra desvantagem destes

métodos é a interferência de substâncias redutoras como o ácido ascórbico (NACZK

et al, 2004). Além disso, já foi publicada a validação de um método de análise de

flavonóides totais da Trichilia catigua por espectrofotometria (ROLIM et al, 2005). Por

estas razões, resolveu-se não quantificar os compostos fenólicos da catuaba por

espectrofotometria e sim desenvolver uma metodologia por CLAE para este fim.

Primeiramente desenvolveu-se um método capaz de separar alguns padrões

de compostos fenólicos de interesse, tendo em vista a revisão bibliográfica realizada.

Submeteram-se também os extratos brutos a este método proporcionando um perfil

cromatográfico de fenólicos dos extratos e a possibilidade de identificação de

marcadores químicos.

Compostos fenólicos são considerados metabólicos secundários que são

sintetizados pelas plantas durante o desenvolvimento normal e em resposta a

condições de stress como infecções, lesões e radiação UV, entre outros. Estes

compostos são onipresentes nas plantas e são um grupo muito diversificado de

fitoquímicos derivados da fenilalanina e tirosina. Compostos fenólicos das plantas

incluem fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de ambos ácido benzóico e ácido

cinâmico), cumarinas, flavonóides, taninos hidrolisáveis e condensados, lignanas e

ligninas. Nas plantas, os fenólicos podem atuar como fitoalexinas, atratores de

polinizadores, contribuintes da pigmentação da planta, antioxidantes e agentes

protetores contra a radiação UV, entre outros. Nos alimentos, os compostos

fenólicos podem contribuir para o amargor, adstringência, cor, sabor, odor e

estabilidade oxidativa dos produtos. Além disso, a capacidade da proteção da saúde

de alguns e propriedades antinutricionais de outros fenólicos das plantas são de

grande importância para os produtores, processadores e consumidores (NACZK et

al, 2004).

Considerando outros antioxidantes dietéticos, a medida da capacidade

antioxidante total do plasma após a injestão de polifenóis sugere que metabólitos

formados em nossos tecidos e/ou pela microflora do cólon contribui

significativamente para a capacidade antioxidante, para a prevenção do estresse

oxidativo e suas influências na prevenção de doenças (TAPIERO et al, 2002).

Técnicas de CLAE são atualmente as mais utilizadas para ambas separação

e quantificação de compostos fenólicos. Vários suportes e fases móveis estão

disponíveis para a análise de antocianinas, procianidinas, flavononas e flavonóis,

flavan-3-ols, flavonas, ácidos fenólicos e secoiridóides. A introdução de colunas de

fase reversa aumentou consideravelmente a separação por CLAE de diferentes

classes de compostos fenólicos. Muitas revisões foram publicadas sobre a aplicação

de metodologias por CLAE para a análise de fenólicos. Compostos fenólicos são

comumente detectados utilizando detectores UV-vis, detector de arranjo de

fotodiodos (DAD) e detectores de fluorescência. Recentemente foram comparados

procedimentos eletroquímicos (voltametria diferencial de pulso e biosensor

amperométrico) e CLAE-DAD para a análise de fenólicos em matrizes naturais.

Dentre estes, a técnica CLAE-DAD demonstrou-se a mais exata (NACZK et al,

2004).

O método desenvolvido para a detecção dos padrões dos compostos

fenólicos mostrou-se eficiente para a separação dos compostos estudados. Como

estes compostos possuem estruturas de polaridade semelhante foi preciso utilizar

um método com tempo longo de análise e com gradiente de eluição. Obteve-se

assim o cromatograma padrão integrado em 280 nm de ácido gálico, epi-catequina,

ácido clorogênico, ácido cafêico, catequina, cumarina, ácido p-cumárico, ácido

ferúlico e rutina. Foi também realizada a análise espectral destes compostos pelo

detector de DAD onde se verificaram os comprimentos de onda máximos entre 200 e

400 nm e a pureza dos picos dos padrões. Estes dados podem ser observados nas

figuras 14 e 15.

FIGURA 14 – ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DOS PADRÕES DE

FENÓLICOS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 15 – ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO GÁLICO

FIGURA 16– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA CATEQUINA

FIGURA 17– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO

FIGURA 18– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO CAFEICO

FIGURA 19– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI-CATEQUINA

FIGURA 20– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA CUMARINA

FIGURA 21– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO P-

CUMÁRICO

FIGURA 22– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO FERULICO

FIGURA 23– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA RUTINA

Utilizando estas mesmas condições cromatográficas foram injetados os

extratos brutos das cascas e folhas na intenção da possível identificação de algum

dos compostos fenólicos injetados. Obteve-se assim o perfil cromatográfico de

compostos fenólicos dos extratos brutos das cascas e folhas da espécie. Após as

análises dos cromatogramas dos extratos brutos, verificou-se a coincidência de

picos nos mesmos tempos de retenção da catequina, ácido clorogênico e epi-

catequina. Além do mesmo tempo de retenção estes picos também apresentaram

espectros de UV idênticos aos dos padrões correspondentes. A presença de ácido

clorogênico ainda não havia sido reportada na espécie. Os cromatogramas dos

extratos brutos das cascas e folhas podem ser observados nas figuras 24 e 25.

FIGURA 24– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS CASCAS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 25– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS FOLHAS NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

A presença de catequina, ácido clorogênico e epi-catequina nos extratos

brutos foi confirmada pela adição destes padrões aos extratos. Os extratos

adicionados dos padrões foram cromatografados e observou-se que a área dos

picos correspondentes aumentou sem o aparecimento de novos picos no

cromatograma. Este fato aliado à análise espectral dos picos pelo DAD demonstrou

a presença dos mesmos nos extratos brutos. Os cromatogramas dessas análises

podem ser observados nas figuras 26 a 33.

FIGURA 26– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS CASCAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 27– ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA CATEQUINA APÓS A

ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 28– ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 29– ESPECTRO UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI CATEQUINA APÓS

A ADIÇÃO DO PADRÃO DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 30– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS FOLHAS ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 31– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA CATEQUINA APÓS

A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 32– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS

ADICIONADO DOS PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

FIGURA 33– ESPECTRO DE UV (A) E ANÁLISE DE PUREZA (B) DA EPI CATEQUINA

APÓS A ADIÇÃO DO PADRÃO NO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CLAE

Uma grande classe de compostos fenólicos é a dos ácidos hidroxicinâmicos,

os quais são encontrados em praticamente todas as plantas. O principal

representante dos ácidos hidroxicinâmicos é o ácido cafêico, o qual é encontrado

nas plantas principalmente como um éster com o ácido quínico chamado de ácido

clorogênico (ácido 5-cafeoilquínico). A maior parte do ácido clorogênico ingerido

chega ao cólon e parte deste entra na circulação sanguínea. O ácido clorogênico e o

ácido cafêico são antioxidantes in vitro e eles podem inibir a formação dos

compostos N-nitrosos mutagênicos e carcinogênicos, pois eles são inibidores da

reação de N-nitrosação in vitro. Além disso, o ácido clorogênico pode inibir danos ao

DNA in vitro (TAPIERO et al, 2002). In vivo, o ácido clorogênico aumentou a

tolerância à glicose, diminuiu alguns lipídeos do plasma e do fígado e melhorou a

distribuição de minerais em ratos nas condições do estudo de SOTILLO et al, (2002).

O ácido clorogênico também se demonstrou eficiente na prevenção in vivo de

diversos tipos de cânceres, como o de fígado e cólon em hamsters (MORI et al,

1986), de cólon em ratos (MORISHITA et al, 1997) e de língua em ratos (TANAKA et

al, 1993). Abaixo se observa a estrutura do ácido clorogênico.

Os flavonóides são os polifenóis mais abundantes da dieta humana e

representam uma subclasse de polifenóis com estrutura C

-C

. Eles podem ser

divididos em várias classes dependendo do grau de oxidação do oxigênico

heterocíclico. As principais classes são flavonóis, isoflavonas, flavanonas, flavonas e

flavanóis. As catequinas são os principais flavanóis e são encontrados no chá verde,

vinho e chocolate (TAPIERO et al, 2002).

As catequinas do chá verde podem aliviar a inflamação pela inibição das

enzimas COX 1 e COX 2 e diminuição da produção das prostaglandinas. A

propriedade mais importante das catequinas é a sua habilidade antioxidativa para

impedir radicais livres de danificar biomoléculas, quelar íons metálicos catalíticos da

formação de radicais livres e impedir oxigênios singletes da ativação de moléculas

orgânicas para formar peróxidos e radicais livres. Tais propriedades previnem danos

ao DNA por espécies reativas do oxigênio. Catequinas são, portanto,

antimutagênicas e anticarcinogênicas. As catequinas também se demonstraram

úteis na proteção de neurônios e células hepáticas contra danos de radicais livres

gerados durante isquemia, aumento da resistência de células vermelhas do sangue

ao estresse oxidativo, retardo da progressão de cataratas, inibir o estresse oxidativo

na pele causado por radiação ultravioleta e reduzir o nível de colesterol, por

proteção da oxidação das lipoproteínas de baixa densidade (CHU et al, 2004).

Abaixo podem ser observadas as estruturas da catequina e da epi-catequina.

Após a análise mais criteriosa dos perfis cromatográficos obtidos com os

extratos brutos das cascas e folhas, observou-se que os extratos possuem vários

outros compostos com perfil espectral de UV parecido com os da catequina e epi-

catequina. Este fato é devido à planta sintetizar outros compostos com os mesmos

cromóforos da catequina e epi-catequina, provavelmente outras substâncias que

possuem o núcleo fundamental flavan-3-ol na sua estrutura. A polimerização deste

núcleo é a responsável pela formação dos taninos condensados, compostos que

foram detectados no perfil fitoquímico. Estes compostos estão presentes em maior

concentração nas cascas que nas folhas da planta. Além disso, PIZZOLATTI et al,

(2002) já demonstraram a presença de compostos com este núcleo fundamental nas

cascas da Trichilia catigua.

Observando a grande quantidade de compostos com núcleo flavan-3-ol nos

extratos e a falta de destes padrões disponíveis comercialmente, optou-se em

realizar a análise quantitativa apenas do ácido clorogênico nos extratos. O ácido

clorogênico é um cafeoilquínico relativamente comum no reino vegetal, já

considerado marcador químico de outras plantas medicinais como a alcachofra,

além de estar disponível comercialmente e ser relativamente barato, fato

imprescindível para rotinas de controle da qualidade.

Tendo isto em vista, otimizou-se o gradiente de eluição da CLAE visando a

simplificação da análise quantitativa do ácido clorogênico. Desenvolveu-se um

método capaz de separar convenientemente o ácido clorogênico dos outros

compostos do extrato em 20 minutos, diminuindo significativamente o tempo da

análise e o custo operacional. Esta metodologia foi então validada para ser utilizada

na quantificação do ácido clorogênico nos testes de eficiência extrativa. Os

cromatogramas dos extratos brutos e suas análises espectrais de pureza podem ser

observados nas figuras 34 a 37.

FIGURA 34– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 35– ESPECTRO DE UV (B) E ANÁLISE DE PUREZA (A) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA

CLAE

FIGURA 36– ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO

DAS FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 37– ESPECTRO DE UV (B) E ANÁLISE DE PUREZA (A) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA

CLAE

5.2.2 Cromatografia Gasosa

A vantagem da cromatografia gasosa claramente está em sua alta

sensibilidade para a detecção de quase todos os componentes químicos voláteis.

Isto é especialmente verdadeiro para a detecção usual de ionização de chama (DIC).

Além disso, a alta seletividade das colunas capilares proporciona a separação de

muitos compostos voláteis simultaneamente em tempo relativamente curto. Assim,

nas últimas décadas, CG tornou-se uma ferramenta analítica popular e útil no campo

de pesquisa das plantas medicinais (LIANG 2004).

Entretanto, a mais séria desvantagem da CG é que ela não é conveniente

para a análise de amostras que contenham compostos polares ou não voláteis. Por

isso, é necessário trabalhar no preparo da amostra, onde pode incluir derivatização

(LIANG 2004). Este fato foi levado em consideração no presente estudo, pois no

preparo da amostra os extratos brutos foram extraídos com éter de petróleo,

portanto somente os compostos apolares solúveis neste solvente foram injetados no

CG.

Primeiramente utilizaram-se as condições cromatográficas descritas por

CARVALHO (2002) para a análise de perfil de esteróides e triterpenos dos extratos e

a possibilidade de identificação de marcadores químicos.

Esteróides são um grupo de substâncias que ocorrem naturalmente

derivadas de isopentenóides hidroxilados policíclicos contendo a estrutura 1,2

ciclopentanofenantreno. Estes compostos contêm um total de 27 a 30 átomos de

carbono (o número de átomos de carbono no precursor biosintético óxido de

esqualeno) nos quais uma cadeia lateral com número de átomos de carbono maior

ou igual a 7 ligada no carbono de posição 17. Suas estruturas estão intimamente

relacionadas e variam dependendo da extensão das modificações do sistema anelar

e modificações da cadeia lateral. Assim, o número e posições das duplas ligações

em ambos sistemas policíclicos e cadeia lateral dos esteróides podem ser diferentes

(ABIDI et al, 2001).

Os esteróides possuem um amplo espectro de atividades biológicas e

propriedades físicas. Esteróides de plantas (por exemplo fitoesteróis), em particular

são importantes produtos agrícolas para indústrias farmacêuticas e alimentícias.

Eles são emulsificantes úteis para a indústria de cosméticos e suprem a maior parte

de intermediários esteroidais e precursores para a produção de hormônios

farmacêuticos. Alguns esteróis de plantas com estruturas específicas inibem a

deterioração oxidativa de óleos servindo como potentes agentes antipolimerizantes

para óleos de fritura. Atividades hipocolesterolêmicas de alguns fitoesteróis (por

exemplo, esteróides da soja, componentes de óleos vegetais e sitosterol) foram

documentadas. Os análogos saturados dos fitoesteróis e seus ésteres foram

sugeridos como agentes efetivos para baixar o nível de colesterol do sangue

oferecendo benefícios cardiológicos (ABIDI et al, 2001). A mistura dos triterpenos

alfa e beta amirina produziram atividade antinociceptiva periférica, espinhal e

supraespinhal em roedores provavelmente por mecanismos que envolvem a inibição

das vias metabólicas das proteínas quinase A e quinase C (OTUKI et al, 2005).

A avaliação de fitoesteróis misturados com uma diversidade de compostos

não saponificáveis em lipídeos de plantas de matriz complexa é uma tarefa

formidável e requer técnicas analíticas confiáveis para a extração, isolamento,

separação, purificação, detecção de análises quantitativas. Dados da literatura

revelam que a maioria dos pesquisadores prefere técnicas de CG capilar como

métodos de escolha para a análise de esteróides e compostos relacionados. Em

alguns casos a CG parece prover maior seletividade para certos isômeros que a

CLAE (ABIDI, 2001).

Colunas capilares de sílica fundida contêm fases estacionárias

quimicamente ligadas de diferentes polaridades. Quando colunas capilares de alta

temperatura são utilizadas, análises de amostras com esteróis podem ser realizadas

com alto grau de detecção, sensitividade e resolução dos componentes. Em análises

típicas, o detector de ionização de chama é utilizado para monitorar as análises.

Outros detectores (por exemplo detectores de captura de elétrons ou de

condutividade térmica) são menos utilizados porque o detector de ionização de

chama tem melhores respostas em termos de sensitividade, linearidade de resposta

e generalidade de resposta (ABIDI, 2001).

O método utilizado para a detecção dos padrões de esteróides e triterpenos

mostrou-se eficiente para a separação dos compostos estudados. Como estes

compostos possuem estruturas de polaridade semelhante foi preciso utilizar um

método com tempo longo de análise e com um gradiente de temperatura brando.

Obteve-se assim o cromatograma dos padrões dos esteróides estigmasterol e beta

sitosterol, e dos triterpenos lupeol, alfa-amirina e beta-amirina. Este cromatograma

pode ser observado na figura 38.

FIGURA 38– CROMATOGRAMA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES DO MÉTODO

QUALITATIVO DA CG.

Com a realização desta análise foi possível calcular os tempos de retenção

relativa dos padrões de referência de esteróides e triterpenos em relação ao padrão

interno de acetato de tocoferol. A retenção relativa (RR) é dada pela razão do tempo

de retenção do padrão de referência pelo tempo de retenção do padrão interno.

Estes dados são importantes para a identificação destes compostos nos extratos

brutos, onde os tempos de retenção relativa devem ser muito parecidos com os do

cromatograma padrão. A Tabela 13 mostra esses dados.

TABELA 13– RETENÇÃO RELATIVA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES NO MÉTODO

QUALITATIVO DA CG.

Padrão Tempo de retenção (min) Retenção relativa

Acetato de tocoferol 53,532 1,000

Estigmasterol 62,165 1,161

Beta sitosterol 67,588 1,263

Beta amirina 77,192 1,442

Alfa amirina 85,252 1,593

Lupeol 88,263 1,649

Utilizando estas mesmas condições cromatográficas foram injetados os

extratos brutos das cascas e folhas na intenção da possível identificação de algum

dos compostos injetados. Obteve-se assim o perfil cromatográfico de esteróides e

triterpenos dos extratos brutos das cascas e folhas da espécie. Após as análises dos

cromatogramas dos extratos brutos, verificou-se a coincidência de picos nos

mesmos tempos de retenção do estigmasterol com RR = 1,163 nas cascas e RR =

1,165 nas folhas. Também se verificou a presença do beta sitosterol com RR =

1,262 nas cascas e RR = 1,268 nas folhas. Esta pequena variação na retenção

relativa obtida com o cromatograma dos padrões e dos extratos brutos se deve ao

fato das amostras dos extratos brutos possuírem número de compostos muito

superior à amostra dos padrões, diminuindo o número de pratos teóricos da coluna,

além do fato do equipamento não possuir injetor automático. A presença de

esteróides e ausência de triterpenos havia sido observada na realização do perfil

fitoquímico confirmando os resultados obtidos na CG. Os cromatogramas dos

extratos brutos das cascas e folhas podem ser observados nas figuras 39 e 40.

FIGURA 39– CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS DO MÉTODO

QUALITATIVO DA CG

FIGURA 40– CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS DO MÉTODO

QUALITATIVO DA CG

A presença de estigmasterol e beta sitosterol nos extratos brutos foi

confirmada pela adição destes padrões aos extratos. Os extratos adicionados dos

padrões foram cromatografados e observou-se que a área dos picos

correspondentes aumentou sem o aparecimento de novos picos no cromatograma.

Estes dados condizem com a pesquisa bibliográfica realizada, pois PIZZOLLATTI et

al, (2004) também demonstraram a presença destes compostos nas cascas da

Trichilia catigua. Os cromatogramas dessas análises podem ser observados nas

figuras 41 e 42.

FIGURA 41– CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CG

FIGURA 42– CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS ADICIONADO DOS

PADRÕES NO MÉTODO QUALITATIVO DA CG

Observando os cromatogramas dos extratos brutos observa-se que o

esteróide beta sitosterol é o composto presente em maior quantidade, portanto

optou-se para a análise quantitativa apenas deste composto nos extratos. O beta

sitosterol é um esteróide comum no reino vegetal, já identificado em outras plantas

medicinais, além de estar disponível comercialmente e ser relativamente barato, fato

imprescindível para rotinas de controle da qualidade.

Estudos in vitro demonstraram a atividade preventiva de câncer do beta

sitosterol em células de cólon (CHOI et al, 2003). Estudos in vivo em amimais

demonstraram que o beta sitosterol livre e glicosilado exibiram atividades

antiinflamatória, antineoplásica, antipirética e imuno modulatória (BOUIC et al, 1999).

Abaixo observam-se as estruturas do beta siosterol e do estigmasterol.

Portanto, resolveu-se desenvolver outro método visando a simplificação da

análise do beta sitosterol. Utilizou-se para isto outra coluna cromatográfica mais

polar (ZB-1), fato que permitiu separar convenientemente o beta sitosterol (RR =

1,159) dos outros compostos do extrato em 60 minutos, diminuindo

significativamente o tempo da análise e o custo operacional. Apesar de separar bem

o beta sitosterol dos outros padrões, esta coluna não teve resolução para a

separação do lupeol da alfa amirina, os quais foram eluídos juntos da coluna

cromatográfica resultando no último pico do cromatograma dos padrões com área

maior que o dos outros padrões bem resolvidos. Como estes compostos não estão

presentes nos extratos estudados este fato foi ignorado. Esta metodologia foi então

validada para ser utilizada na quantificação do beta sitosterol nos testes de eficiência

extrativa. Os cromatogramas dos padrões e dos extratos brutos no método

quantitativo podem ser observados nas figuras 43 a 45.

FIGURA 43– CROMATOGRAMA DOS PADRÕES DE ESTERÓIDES E TRITERPENOS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG

FIGURA 44– CROMATOGRAMA EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG

FIGURA 45– CROMATOGRAMA EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG

5.2.3 Cromatografia em Camada Delgada

CCD foi o método de escolha para a análise de plantas medicinais antes que

os métodos cromatográficos de CG ou CLAE fossem estabelecidos. Hoje em dia a

CCD é ainda freqüentemente utilizada para a análise de plantas medicinais, pois

várias farmacopéias utilizam esta técnica para providenciar os primeiros perfis

cromatográficos das plantas. Usualmente, a CCD é utilizada como um método fácil

para a pesquisa inicial, com uma avaliação semiquantitativa aliada outra forma de

cromatografia (LIANG et al, 2004).

A CCD tem a vantagem de inúmeras possibilidades de detecção na análise

de plantas medicinais. Além disso, CCD é uma metodologia simples e pode ser

empregada para a análise de múltiplas amostras. Para cada placa, mais de 30

pontos de amostras podem ser estudados simultaneamente. Por isso o uso da CCD

é ainda muito popular na análise de plantas medicinais. Em suma, as vantagens da

utilização da CCD para a construção de perfis cromatográficos de plantas medicinais

são sua simplicidade, versatilidade, alta velocidade, sensitividade específica e

simples preparo da amostra. Assim, CCD é um método conveniente de

determinação da qualidade e possível adulteração de plantas medicinais (LIANG et

al, 2004).

Foram efetuadas análises qualitativas por CCD com o propósito da avaliação

da presença dos marcadores químicos identificados e do estabelecimento de perfis

cromatográficos de compostos fenólicos e esteróides para a espécie.

O perfil cromatográfico obtido para a análise de fenólicos demonstrou-se

muito parecido para as duas partes estudadas da planta. O ácido clorogênico foi

convenientemente resolvido dos outros fenólicos da planta nas condições utilizadas

apresentando fluorescência amarelada e Rf de 0,48.

Ambos os extratos brutos das cascas e das folhas demonstraram a presença

do ácido clorogênico. Esta presença foi confirmada pela adição do padrão nas

amostras, fato que provocou o aumento da fluorescência no Rf característico do

ácido clorogênico, sem provocar o aparecimento de novas manchas no

cromatograma. Na figura 46 pode-se conferir o resultado do perfil cromatográfico da

análise de CCD para a visualização de compostos fenólicos.

FIGURA 46- PERFIL CROMATOGRÁFICO EM CCD PARA VISUALIZAÇÃO DE

COMPOSTOS FENÓLICOS

1- Extrato bruto das cascas, 2- Extrato bruto das folhas, 3- Padrão de ácido clorogênico, 4- Extrato

bruto das cascas adicionado do padrão de ácido clorogênico e 5- Extrato bruto das folhas adicionado

do padrão de ácido clorogênico.

Da mesma forma o perfil cromatográfico obtido para a análise de esteróides

demonstrou-se muito parecido para as duas partes da planta estudadas. O beta

sitosterol pode ser convenientemente resolvido dos outros esteróides da planta nas

condições utilizadas apresentando coloração marrom e Rf de 0,57.

Ambos os extratos brutos das cascas e das folhas demonstraram a presença

do beta sitosterol. Esta presença foi confirmada pela adição do padrão nas

amostras, fato que provocou o aumento da intensidade de cor no Rf característico do

beta-sitosterol, sem provocar o aparecimento de novas manchas no cromatograma.

Na figura 47 se confere o resultado do perfil cromatográfico da análise de

CCD para a visualização de esteróides e triterpenos.

FIGURA 47- PERFIL CROMATOGRÁFICO EM CCD PARA VISUALIZAÇÃO DE

ESTERÓIDES

1- Extrato bruto das cascas, 2- Extrato bruto das folhas, 3- Padrão de beta-sitosterol, 4- Extrato bruto

das cascas adicionado do padrão de beta-sitosterol e 5- Extrato bruto das folhas adicionado do

padrão de beta-sitosterol.

Ambas as análises de CCD desenvolvidas demonstraram-se satisfatórias

para a detecção dos compostos estudados e podem ser utilizadas na identificação

qualitativa destes compostos para o controle da qualidade desta planta.

5.2.4 Validação dos Métodos Analíticos Quantitativos

Validar é estar com o objetivo voltado para a confiabilidade analítica do

laboratório e do método desenvolvido para se obter o resultado desejado. Validação

100 % é utopia, sempre haverá um critério pessoal, ou seja, aceitar sempre gerará

um conflito. É importante lembrar que não existe modelo pronto para sistemas de

validação, portanto deve-se fazer adaptações, adequando as recomendações às

suas necessidades (LEITE, 2002).

5.2.4.1 Validação do método de doseamento de ácido clorogênico por CLAE

5.2.4.1.1 Linearidade

Linearidade é a capacidade de uma metodologia analítica demonstrar que os

resultados analíticos são diretamente proporcionais à concentração do analito na

amostra, dentro de um intervalo especificado. Recomenda-se que a linearidade seja

determinada pela análise de, no mínimo, 5 concentrações diferentes. Estas

concentrações devem seguir os limites do intervalo de trabalho (ANVISA, 2003).

De acordo com o coeficiente de correlação obtido para o ácido clorogênico,

0.999442, a curva de calibração mostra relação linear entre a concentração e a área

integrada nos intervalos de concentrações analisados para o analito em pesquisa. A

figura 48 mostra o resultado da análise de linearidade do ácido clorogênico.

FIGURA 48– CURVA DE LINEARIDADE DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

5.2.4.1.2 Exatidão

A exatidão de um método analítico é a proximidade dos resultados obtidos

pelo método em estudo em relação ao valor verdadeiro (ANVISA, 2003). A Tabela

14 demonstra os resultados da análise de exatidão realizada.

TABELA 14 – RESULTADO DO TESTE DE EXATIDÃO PARA ÁCIDO CLOROGÊNICO.

Amostra

Concentração de

ácido clorogênico

adicionada (µg/mL)

Concentração de ácido

clorogênico encontrada

(µg/mL)

Recuperação

(%)

50 %.1 6,77 101,04

50 %.2 6,75 100,75

50 %.3

6,70

6,73 100,45

Média 6,75 100,75

DP 0,02 0,30

CV% 0,30 0,30

IC 6,75 ± 0,02 100,75 ± 0,34

100 %.1 13,20 99,25

100 %.2 13,38 100,60

100 %.3

13,30

13,39 100,68

Média 13,32 100,18

DP 0,11 0,80

CV% 0,80 0,80

IC 13,32 ± 0,12 100,18 ± 0,91

150 %.1 20,14 100,70

150 %.2 19,82 99,10

150 %.3

20,00

19,99 99,95

Média 19,98 99,92

DP 0,16 0,80

CV% 0,80 0,80

IC 19,98 ± 0,18 99,92 ± 0,91

Analisando os resultados, percebe-se que o método em análise apresenta

exatidão, pois as porcentagens de recuperação 100,75 %, 100,18 % e 99,92 %,

respectivamente para as análises de 50 %, 100 % e 150 %, estão dentro do limite

esperado, ou seja, entre 95 % e 105 %. Além disso, o intervalo de confiança (IC)

indica que o valor verdadeiro encontrado está dentro da faixa de valores associados

aos valores obtidos.

5.2.4.1.3 Especificidade

É a capacidade que o método possui de medir exatamente um composto em

presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação e

componentes da matriz. Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções

necessárias para garantir a pureza dos picos cromatográficos. A utilização de testes

de pureza de pico (por exemplo, com auxilio de detector de arranjo de fotodiodos ou

espectrometria de massas) são interessantes para demonstrar que o pico

cromatográfico é atribuído a um só componente (ANVISA, 2003).

Demonstrou-se que o método proposto apresenta especificidade, pois o

cromatograma do placebo das cascas e folhas indica a ausência de resposta do

analito ao método, não havendo interferência da matriz nem do solvente extrator na

análise quantitativa. Além disso, a análise espectral realizada pelo detector de DAD

evidenciou que o pico correspondente ao ácido clorogênico no extrato bruto das

cascas da catuaba está puro, com índice de pureza igual a 0,9972, ou seja, pureza

99,72 %. Da mesma forma o pico correspondente ao ácido clorogênico no extrato

bruto das folhas também está puro, com índice de pureza igual a 0,9986, ou seja,

pureza 99,86 %. Estes dados garantem a especificidade de quantificação do analito

livre de outras impurezas do extrato. Os cromatogramas, espectrogramas e dados

de pureza de pico da análise de especificidade podem ser observados nas figuras

49 a 56.

FIGURA 49- ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO PLACEBO DAS

CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 50- ESPECTROGRAMA E CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS FOLHAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 51- ESPECTROGRAMA E CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS

CASCAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 52- ANÁLISE DE PUREZA (A) E ESPECTRO DE UV (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO DO CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 53- ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO EXTRATO BRUTO DAS

FOLHAS NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 54- ANÁLISE DE PUREZA (A) E ESPECTRO DE UV (B) DO ÁCIDO

CLOROGÊNICO DO CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO

MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 55- ESPECTROGRAMA (A) E CROMATOGRAMA (B) DO PADRÃO DE ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

FIGURA 56- ANÁLISE DE PUREZA E ESPECTRO UV DO PADRÃO DE ÁCIDO

CLOROGÊNICO NO MÉTODO QUANTITATIVO DA CLAE

5.2.4.1.4- Precisão por repetibilidade

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma

série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A precisão

por repetibilidade é a concordância entre os resultados dentro de um curto período

de tempo com o mesmo analista e mesma instrumentação (ANVISA, 2003). As

Tabelas 15 e 16 demonstram os resultados desta análise.

TABELA 15- RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO POR REPETIBILIDADE

Concentração de Ácido Clorogênico encontrada (µg/g)

Replicatas

Primeira análise Segunda análise Terceira análise

1 945,59 950,321 946,259

2 947,99 951,235 946,321

3 946,02 950,236 947,929

4 945,09 951,475 947,524

5 947,74 950,952 946,746

6 947,03 951,067 948,249

Média 946,58 950,88 947,17

DP 1,19 0,50 0,85

CV % 0,13 0,05 0,09

TABELA 16– AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

PRECISÃO POR REPETIBILIDADE DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

Análise Média da concentração de ácido clorogênico encontrada (µg/g)

Primeira 946,58

Segunda 950,88

Terceira 947,17

Média 948,21

DP 2,33

CV % 0,25

O método proposto apresenta precisão por repetibilidade, pois os

coeficientes de variação (CV %) encontrados entre as três determinações realizadas

para este fim encontram-se dentro do limite esperado, isto é, menor ou igual a 5 %.

5.2.4.1.5 Precisão intermediária

A precisão intermediária é a concordância entre os resultados do mesmo

laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou

equipamentos diferentes. Para a determinação da precisão intermediária

recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas diferentes (ANVISA,

2003). As Tabelas 17 e 18 demonstram os resultados desta análise.

TABELA 17- RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA

Concentração de Ácido Clorogênico encontrada (µg/g)

Replicatas

Primeiro analista Segundo analista Terceiro analista

1 951,241 956,658 949,958

2 952,325 957,524 948,921

3 954,325 956,958 950,365

4 952,958 958,326 951,322

5 953,254 957,741 949,635

6 951,247 959,339 947,682

Média 952,56 957,76 949,65

DP 1,21 0,97 1,25

CV % 0,13 0,10 0,13

TABELA 18- AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

Análise Média da concentração de ácido clorogênico

encontrada (µg/g)

Primeiro analista 952,56

Segundo analista 957,76

Terceiro analista 949,65

Média 953,32

DP 4,11

CV % 0,43

O método proposto apresenta precisão intermediária, pois os coeficientes de

variação (CV %) encontrados entre as três determinações realizadas neste teste

estão dentro do limite esperado, isto é, menor ou igual a 5 %;

5.2.4.1.6- Intervalo

O intervalo de aplicação do método foi considerado a concentração

compreendida entre 6,7 e 20 µg/mL de ácido clorogênico na solução amostra.

5.2.4.1.7 Robustez

A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir

a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança

durante o uso normal. Durante o desenvolvimento da metodologia, deve-se

considerar a avaliação da robustez. Constatando-se a susceptibilidade do método à

variações nas condições analíticas, estas deverão ser controladas e precauções

devem ser incluídas no procedimento. Para a CLAE os fatores que podem ser

considerados na determinação da robustez do método analítico são: variação do pH

da fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou

fabricantes de colunas, temperatura e fluxo da fase móvel (ANVISA, 2003). As

Tabelas 19 e 20 demonstram os resultados desta análise.

TABELA 19 – RESULTADO DAS ANÁLISES DE ROBUSTEZ DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

Concentração de Ácido Clorogênico encontrada (µg/g)

Replicatas

Troca de coluna

cromatográfica

Alteração de pH da

fase móvel

Alteração da

temperatura do forno

1 951,958 946,58 951,362

2 951,254 946,53 952,147

3 949,325 947,25 953,849

4 952,475 946,98 954,024

5 949,697 946,87 952,541

6 950,625 946,36 953,693

Média 950,89 946,76 952,94

Desvio 1,24 0,33 1,08

CV % 0,13 0,03 0,11

TABELA 20 - AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

ROBUSTEZ DO ÁCIDO CLOROGÊNICO

Análise Média da concentração de ácido

clorogênico encontrada (µg/g)

Troca de coluna cromatográfica 950,89

Alteração de pH da fase móvel 946,76

Alteração da temperatura do forno 952,94

Média 950,20

Desvio 3,15

CV % 0,33

As leituras do teor de ácido clorogênico com outra coluna analítica de lote

diferente da usada para as análises anteriores demonstraram desvio padrão relativo

(CV) de 0,13 % indicando assim a robustez do método para esta alteração. Da

mesma forma a alteração do pH da fase móvel em menos 0,2 pontos (de 2,20 para

2,00) resultou em um CV de 0,03 % indicando que o método permanece estável

para esta alteração. Finalmente, o aumento da temperatura do forno de colunas de

25 para 27 °C também não promoveu mudanças significativas no teor de ácido

clorogênico dosado, demonstrando um CV de 0,11 %.

Com os resultados obtidos na série de análises realizadas de acordo com os

parâmetros exigidos pela Resolução - RE n° 899, de 29 de maio de 2003 da Anvisa,

conclui-se que o método utilizado para o doseamento de ácido clorogênico no

extrato soxhlet de catuaba cascas e folhas por CLAE pode ser considerado validado.

5.2.4.2 Validação do método de doseamento de beta sitosterol por CG

5.2.4.2.1 Linearidade

De acordo com o coeficiente de correlação obtido para o beta sitosterol,

0.99832, a curva de calibração mostra relação linear entre a concentração e a área

integrada nos intervalos de concentrações analisados para o analito em pesquisa. A

figura 57 mostra o resultado da análise de linearidade do beta sitosterol.

FIGURA 57– CURVA DE LINEARIDADE DO BETA SITOSTEROL

5.2.4.2.2 Exatidão

A Tabela 21 demonstra os resultados da análise de exatidão realizada.

TABELA 21 – RESULTADO DO TESTE DE EXATIDÃO PARA O BETA SITOSTEROL

Amostra

Concentração de Beta

sitosterol adicionada

(µg/mL)

Concentração de Beta

sitosterol encontrada

(µg/mL)

Recuperação

(%)

50 % - 1 49,52 99,04

50 % - 2 50,01 100,02

50 % - 3

50,00

49,97 99,94

Média 49,83 99,67

DP 0,27 0,54

CV% 0,55 0,55

IC 0,31 0,62

100 % - 1 100,15 100,15

100 % - 2 100,51 100,51

100 % - 3

100,00

100,04 100,04

Média 100,23 100,23

DP 0,25 0,25

CV% 0,25 0,25

IC 0,28 0,28

150 % - 1 150,28 100,19

150 % - 2 150,26 100,17

150 % - 3

150,00

149,93 99,95

Média 150,16 100,10

DP 0,20 0,13

CV% 0,13 0,13

IC 0,22 0,15

Analisando os resultados, percebe-se que o método em análise apresenta

exatidão, pois as porcentagens de recuperação 100,10 %, 100,24 % e 100,08 %

respectivamente para as análises de 50 %, 100 % e 150 % estão dentro do limite

esperado, ou seja, entre 95 % e 105 %. Além disso, o intervalo de confiança (IC)

indica que o valor verdadeiro encontrado está dentro da faixa de valores associados

com os valores obtidos.

5.2.4.2.3 Especificidade

Demonstrou-se que o método proposto apresenta especificidade, pois os

cromatogramas dos placebos das cascas e folhas indicam a ausência de resposta

do analito ao método, não havendo interferência da matriz nem do solvente extrator

na análise quantitativa. Os cromatogramas da análise de especificidade podem ser

observados nas figuras 58 a 62.

FIGURA 58- CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS CASCAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG.

FIGURA 59- CROMATOGRAMA DO PLACEBO DAS FOLHAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG.

FIGURA 60- CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS CASCAS DA CATUABA

MÉTODO QUANTITATIVO DA CG

FIGURA 61- CROMATOGRAMA DO EXTRATO BRUTO DAS FOLHAS NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG

FIGURA 62- CROMATOGRAMA DO PADRÃO DE BETA SITOSTEROL NO MÉTODO

QUANTITATIVO DA CG

5.2.4.2.4 Precisão por Repetibilidade

As Tabelas 22 e 23 demonstram os resultados da precisão por

repetibilidade.

TABELA 22 - RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO POR REPETIBILIDADE DO

BETA SITOSTEROL

Concentração de beta sitosterol encontrada (µg/g)

Replicatas

Primeira análise Segunda análise Terceira análise

1 250,45 251,32 255,36

2 251,19 251,01 254,21

3 251,42 252,68 255,98

4 251,32 252,95 255,42

5 251,89 251,35 256,24

6 249,33 251,84 256,85

Média 250,93 251,86 255,68

DP 0,92 0,79 0,91

CV % 0,36 0,31 0,35

TABELA 23 - AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

PRECISÃO POR REPETIBILIDADE DO BETA SITOSTEROL

Análise Média da concentração de beta sitosterol encontrada (µg/g)

Primeira 250,93

Segunda 251,86

Terceira 255,68

Média 252,82

DP 2,52

CV % 1,00

O método proposto apresenta precisão por repetibilidade, pois os

coeficientes de variação (CV %) encontrados entre as três determinações realizadas

para este fim encontram-se dentro do limite esperado, isto é, menor ou igual a 5 %.

5.2.4.2.5 Precisão Intermediária

As Tabelas 24 e 25 demonstram os resultados da precisão intermediária.

TABELA 24 - RESULTADOS DAS ANÁLISES DE PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DO BETA

SITOSTEROL

Concentração de beta sitosterol encontrada (µg/g)

Replicatas

Primeira análise Segunda análise Terceira análise

1 253,65 251,12 258,21

2 254,21 250,14 258,34

3 253,32 251,24 257,54

4 253,98 250,58 257,98

5 254,69 252,31 258,32

6 255,32 251,36 257,49

Média 254,20 251,13 257,98

DP 0,72 0,74 0,38

CV % 0,28 0,29 0,15

TABELA 25 - AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

PRECISÃO INTERMEDIÁRIA DO BETA SITOSTEROL

Análise Média da concentração de beta sitosterol encontrada (µg/g)

Primeira 254,20

Segunda 251,13

Terceira 257,98

Média 254,44

Desvio 3,43

CV % 1,35

O método proposto apresenta precisão intermediária, pois os coeficientes de

variação (CV %) encontrados entre as três determinações realizadas neste teste

estão dentro do limite esperado, isto é, menor ou igual a 5 %;

5.2.4.2.6 Intervalo

O intervalo de aplicação do método foi considerado a concentração

compreendida entre 50 e 150 µg/mL de beta sitosterol na solução amostra.

5.2.4.2.7 Robustez

Para a CG os fatores que podem ser considerados na determinação da

robustez do método analítico são: diferentes lotes ou fabricantes de colunas,

temperatura e a velocidade do gás de arraste (ANVISA 2003). As Tabelas 26 e 27

demonstram os resultados desta análise.

TABELA 26 – RESULTADO DAS ANÁLISES DE ROBUSTEZ DO BETA SITOSTEROL

Concentração de Beta sitosterol encontrada (µg/g)

Replicatas

Troca de coluna

cromatográfica

Alteração da vazão

do gás de arraste

Alteração da

temperatura do forno

1 251,64 252,38 255,21

2 250,69 253,62 255,47

3 251,74 252,14 255,28

4 251,31 252,59 256,39

5 250,84 252,18 254,37

6 250,39 251,39 255,51

Média 251,10 252,38 255,37

Desvio 0,54 0,73 0,65

CV % 0,22 0,29 0,25

TABELA 27 - AVALIAÇÃO DAS MÉDIAS DOS RESULTADOS DAS ANÁLISES DE

ROBUSTEZ DO BETA SITOSTEROL

Análise Média da concentração de beta sitosterol encontrada (µg/g)

Coluna 251,10

Vazão 252,38

Temperatura 255,37

Média 252,95

Desvio 2,19

CV % 0,87

As leituras do teor de beta sitosterol com outra coluna analítica de lote

diferente da usada para as análises anteriores demonstraram coeficiente de variação

(CV) de 0,22 % indicando assim a robustez do método para esta alteração. Da

mesma forma a alteração da vazão do gás de arraste resultou em um CV de 0,29 %

indicando que o método permanece estável para esta alteração. Finalmente, o

aumento da temperatura do forno de colunas de 270 para 272 °C no patamar de

temperatura em que é detectado o analito, também não promoveu mudanças

significativas no teor de beta sitosterol dosado demonstrando CV de 0,25 %.

Com os resultados obtidos na série de análises realizadas de acordo com os

parâmetros exigidos pela Resolução - RE n° 899, de 29 de maio de 2003, conclui-se

que o método utilizado para o doseamento de beta sitosterol no extrato soxhlet de

catuaba cascas por CG pode ser considerado validado.

5.3 ANÁLISES DE EFICIÊNCIA EXTRATIVA

5.3.1 Quantificação do ácido clorogênico

A extração de compostos fenólicos nas plantas é influenciada pela sua

natureza química, método extrativo empregado, tamanho da partícula da amostra,

tempo e condições de armazenamento, assim como a presença de substâncias

interferentes. A natureza química dos fenólicos das plantas varia de substâncias

simples até altamente polimerizadas que incluem proporções variadas de ácidos

fenólicos, fenilpropanóides, antocianinas e taninos, entre outros. Eles podem

também existir como complexos com carboidratos, proteínas e outros componentes

das plantas; alguns fenólicos de alto peso molecular e seus complexos podem ser

muito insolúveis. Por isso, extratos fenólicos de plantas sempre são uma mistura de

diferentes classes de fenólicos que são solúveis no sistema de solventes usado.

Procedimentos adicionais podem ser necessários para a remoção de fenólicos

indesejados e substâncias não fenólicas como ceras, gorduras, terpenos e clorofilas.

Técnicas de extração em fase sólida e fracionamentos baseados na acidez são

comumente utilizados para remover fenólicos indesejados e substâncias não

fenólicas (NACZK et al, 2004).

A solubilidade de compostos fenólicos é governada pelo tipo de solvente

(polaridade) utilizado, grau de polimerização dos fenólicos, assim como interação

dos fenólicos com outros constituintes da planta e formação de complexos

insolúveis. Por isso, não há procedimento uniforme ou completamente satisfatório

que seja adequado para a extração de todos os fenólicos ou uma classe específica

de compostos fenólicos nas plantas. Metanol, etanol, acetona, água, acetato de etila

e, em menor extensão, propanol e dimetilformamida, e suas combinações são

freqüentemente utilizadas para a extração de fenólicos (NACZK et al, 2004).

O doseamento de ácido clorogênico por CLAE nos extratos das cascas e

folhas da T. catigua dos métodos de extração realizados podem ser verificados na

figura 63.

FIGURA 63– TEORES DE ÁCIDO CLOROGÊNICO DOS MÉTODOS EXTRATIVOS

REALIZADOS

1933

1823

2046

1592

1645

1566 1561

1702

1199

1437

951

551

476

424 427

927

535

278

195

274

500

1000

1500

2000

2500

SOXHLET REFLUXO TURBÓLISE MACERAÇÃO SONICAÇÃO

mcg/g de Ácido Clorogênico

Cascas EtOH 50 % Folhas EtOH 50 % Cascas EtOH 96 % Folhas EtOH 96 %

De acordo com a figura 63 pode-se observar que o método de turbólise com

etanol 50 % apresentou o maior rendimento de ácido clorogênico para a extração

das cascas e folhas, com teores de 2046 µg/g e 1702 µg/g respectivamente. Já o

método de maceração foi o menos eficiente na extração deste composto com

rendimento de 1592 µg/g e 1199 µg/g das cascas e folhas respectivamente, cerca de

25 % menos que o método de turbólise.

Observa-se também que o segundo melhor método extrativo foi o soxhlet

com etanol 50 %, então a renovação do solvente no processo extrativo ajuda a

extração do ácido clorogênico, pois estas duas metodologias possuem renovação do

solvente em seu processo extrativo. A pequena diferença, cerca de 6 % menor, da

quantidade de ácido clorogênico extraída pelo processo de refluxo contínuo do

soxhlet pode ter acontecido pela granulometria da droga. Este parâmetro não foi

variado, mas futuras pesquisas podem esclarecer se a diminuição da granulometria

aumentaria a quantidade de ácido clorogênico extraído. A eficiência superior da

turbólise pode ser devida a pulverização das partículas da droga durante o processo

extrativo, expondo assim a maior parte do conteúdo interno das células, facilitando a

ação do solvente. A presença de água no solvente provoca o amolecimento dos

tecidos da droga facilitando a extração do composto pelo etanol. A Tabela 28

demonstra a análise estatística das médias dos teores de ácido clorogênico nos

métodos extrativos realizados.

TABELA 28 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TEOR DE ÁCIDO CLOROGÊNICO DOS

MÉTODOS EXTRATIVOS REALIZADOS.

Método Droga e Solvente

Média do teor de ácido

clorogênico (µg/g)

Desvio

Padrão Variância

Cascas EtOH 50% 1932,908

1,970 3,882

Folhas EtOH 50% 1565,77

1,782 3,175

Cascas EtOH 96% 951,24

2,061 4,248

Soxhlet

Folhas EtOH 96% 927,25

0,655 0,429

Cascas EtOH 50% 1823,40

3,593 12,912

Folhas EtOH 50% 1560,92

2,203 4,851

Cascas EtOH 96% 551,20

1,754 3,078

Refluxo

Folhas EtOH 96% 534,70

2,324 5,399

Cascas EtOH 50% 2046,41

1,357 1,842

Folhas EtOH 50% 1702,37

1,800 3,238

Cascas EtOH 96% 475,87

0,514 0,264

Turbólise

Folhas EtOH 96% 278,07

0,250 0,063

Cascas EtOH 50% 1592,02

1,674 2,803

Folhas EtOH 50% 1199,14

1,881 3,539

Cascas EtOH 96% 424,07

1,344 1,807

Maceração

Folhas EtOH 96% 195,14

0,406 0,164

Cascas EtOH 50% 1645,22

2,561 6,558

Folhas EtOH 50% 1436,60

0,878 0,771

Cascas EtOH 96% 426,83

1,647 2,714

Sonicação

Folhas EtOH 96% 274,16

0,774 0,600

* Letras diferentes significam teores diferentes ao nível de 5 % de significância.

De acordo com as análises estatísticas realizadas, a maioria os métodos de

extração e concentrações de solvente foram diferentes a 5 % de significância, com

exceção da extração das folhas com etanol 50 % por refluxo e soxhlet, extração das

folhas com etanol 96 % por turbólise e sonicação e extração das cascas com etanol

96 % por maceração e sonicação.

As cascas apresentaram maior teor de ácido clorogênico que as folhas em

todos os métodos extrativos testados.

5.3.2 Quantificação do beta sitosterol

O doseamento de beta sitosterol por CG nos extratos das cascas e folhas da

T. catigua dos métodos de extração realizados podem ser verificados a figura 64.

FIGURA 64- TEORES DE BETA SITOSTEROL DOS MÉTODOS EXTRATIVOS

REALIZADOS

396

191

777

295

252

230

313

222

170

582

399

535

366

289

100

200

300

400

500

600

700

800

900

SOXHLET REFLUXO TURBÓLISE MACERAÇÃO SONICAÇÃO

mcg/g de Beta-Sitosterol

Cascas EtOH 50 % Folhas EtOH 50 % Cascas EtOH 96 % Folhas EtOH 96 %

De acordo com a figura 64 pode-se observar que o método de soxhlet com

etanol 50 % apresentou o maior rendimento de beta sitosterol para a extração das

cascas e folhas, com teores de 396 µg/g e 777 µg/g respectivamente. Já o método

de maceração foi o menos eficiente na extração deste composto com rendimento de

37 µg/g e 38 µg/g das cascas e folhas respectivamente. Todos os outros métodos

extrativos apresentaram maior rendimento com o etanol a 96 %.

Observa-se também que o segundo melhor método extrativo foi a turbólise

com etanol 96 %, então a renovação do solvente no processo extrativo ajuda a

extração do beta sitosterol, pois estas duas metodologias possuem renovação do

solvente em seu processo extrativo. A temperatura influencia a extração de modo

positivo, pois o método de soxhlet foi mais eficiente que de turbólise, mesmo com a

exposição do conteúdo interno das células da droga por este método. O beta

sitosterol é mais solúvel em etanol que em água, justificando seu maior rendimento

em média nas extrações com etanol 96 % comparado às com etanol 50 %. Porém a

extração em soxhlet com etanol 50 % foi maior que a com etanol 96 %. Este fato

pode ser devido à presença de água no solvente provocar o amolecimento dos

tecidos da droga, facilitando a perfusão do etanol nos tecidos da droga. Este fato

aliado ao aumento da temperatura facilitaram a extração do composto pelo etanol.

Estes resultados estão de acordo com SHEN & SHAO (2005) que também

demonstraram a eficiência superior da extração por soxhlet de terpenóides e

esteróides nas folhas do tabaco pelo etanol. A Tabela 29 demonstra a análise

estatística das médias dos teores de beta sitosterol nos métodos extrativos

realizados.

TABELA 29 – ANÁLISE ESTATÍSTICA DO TEOR DE BETA SITOSTEROL DOS MÉTODOS

EXTRATIVOS REALIZADOS

Método Droga e Solvente

Média do teor de

beta sitosterol (µg/g)

Desvio

Padrão Variância

Cascas EtOH 50% 396,31

4,803 23,066

Folhas EtOH 50% 777,14

1,786 3,191

Cascas EtOH 96% 252,33

3,940 15,526

Soxhlet

Folhas EtOH 96% 581,65

1,320 1,743

Cascas EtOH 50% 57,44

2,194 4,814

Folhas EtOH 50% 64,17

0,345 0,119

Cascas EtOH 96% 230,49

1,980 3,920

Refluxo

Folhas EtOH 96% 399,193

2,217 4,913

Cascas EtOH 50% 190,62

1,263 1,595

Folhas EtOH 50% 294,7

4,081 16,654

Cascas EtOH 96% 313,33

2,229 4,967

Turbólise

Folhas EtOH 96% 534,03

3,846 14,788

Cascas EtOH 50% 37,38

1,596 2,548

Folhas EtOH 50% 28,29

1,955 3,821

Cascas EtOH 96% 221,58

0,621 0,385

Maceração

Folhas EtOH 96% 366,11

4,699 22,084

Cascas EtOH 50% 51,92

0,542 0,294

Folhas EtOH 50% 53,32

3,419 11,692

Cascas EtOH 96% 170,34

0,613 0,376

Sonicação

Folhas EtOH 96% 288,74

2,451 6,005

* Letras diferentes significam teores diferentes ao nível de 5 % de significância.

De acordo com as análises estatísticas realizadas a maioria os métodos de

extração e concentrações de solvente foram diferentes a 5 % de significância, com

exceção da extração das cascas e folhas com etanol 50 % por refluxo e extração

das folhas e cascas com etanol 50 % por sonicação e extração das cascas com

etanol 96 % por refluxo.

As folhas apresentaram maior teor de beta sitosterol que as cascas em todos

os métodos extrativos testados.

6 CONCLUSÕES

Este estudo demonstrou-se útil para caracterização fitoquímica da espécie

nativa Trichilia catigua A. Juss., Meliaceae. Em detrimento à enorme biodiversidade

brasileira, ainda faltam estudos nacionais bem conduzidos que forneçam os

subsídios necessários para o registro de fitoterápicos oriundos de plantas nativas. A

atual legislação brasileira que trata do registro de fitoterápicos, a RDC 48 de março

de 2003 da ANVISA – uma das mais rigorosas do mundo, dentre várias exigências

determinou a obrigatoriedade da análise de marcadores químicos para o controle da

qualidade de matérias primas vegetais. Os resultados deste estudo cumprem esta

exigência, pois identificam possíveis marcadores químicos e demonstram

alternativas viáveis para sua quantificação em ambas as partes da planta estudadas.

Os perfis cromatográficos desenvolvidos pelas tecnologias de CCD, CG e

CLAE aliados ao estudo botânico anatômico fornecem os subsídios necessários

para a caracterização da espécie. Esta é a primeira etapa do controle da qualidade

de matérias-primas vegetais, pois garante a utilização da espécie correta, fato

imprescindível para proporcionar a segurança e eficácia dos efeitos farmacológicos

esperados do fitoterápico.

Análises cromatográficas mais específicas de CLAE puderam demonstrar

pela primeira vez a presença dos compostos fenólicos ácido clorogênico, catequina

e epi-catequina nas cascas e folhas da espécie. Já os ensaios de CG confirmaram a

presença dos esteróides beta sitosterol e estigmasterol nas cascas da planta já

citadas na literatura anteriormente (PIZZOLLATTI et al, 2004). Além disso,

demonstrou-se que as folhas além de também possuírem estes compostos, os

produzem em maior quantidade que as cascas.

Os métodos quantitativos desenvolvidos para a análise do ácido clorogênico

por CLAE e beta sitosterol por CG demonstraram eficiência, sensibilidade e

reprodutibilidade, caracterizando-se como propostas viáveis para rotinas de controle

da qualidade das cascas e folhas da espécie.

Os testes de eficiência extrativa realizados para avaliação das melhores

condições de extração dos marcadores químicos estudados. Avaliaram-se as

técnicas de maceração, sonicação, turbólise, refluxo e soxhlet, todas com etanol 50

% e 96 % e foram doseados os marcadores químicos. Nas condições estudadas

demonstrou-se que a melhor técnica para a extração do ácido clorogênico é a de

turbólise com etanol 50 % e a melhor técnica para a extração do beta sitosterol é a

de soxhlet com etanol a 50 %. Estas análises são de extrema valia para nortear

futuros testes para o processo produtivo de extração em escala industrial da droga.

Os resultados das análises de eficiência extrativa demonstraram que as

cascas possuem maior teor de compostos fenólicos e as folhas possuem maior teor

de esteróides. Como a catuaba possui diversas ações farmacológicas já

comprovadas, pode-se propor a utilização de extratos das folhas para ações

farmacológicas características de esteróides e a utilização de extratos das cascas

para ações farmacológicas características de compostos fenólicos.

Com a análise mais criteriosa dos dados apresentados neste estudo verificou-

se que as cascas e folhas possuem composição química semelhantes, mas que

diferem nas concentrações percentuais dos metabólicos secundários. Tendo isto em

vista pode-se propor a formulação de um extrato das folhas com composição

química próxima ao das cascas e submetê-lo a testes farmacológicos para as ações

já comprovadas das cascas. Este fato poderia diminuir a chance de extinção da

espécie, pois poderia-se substituir o uso das cascas pelas folhas. Assim poderia ser

proposto o manejo do cultivo das árvores voltado para a produção de folhas,

facilitando o processo de coleta da planta e tornando o processo ecologicamente

correto.

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