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FERNANDA FERREIRA LOPES
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA
E-CADERINA E DA β-CATENINA EM
CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
COM E SEM METÁSTASE NODAL
Natal/RN
2006
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA E-CADERINA E DA
β-CATENINA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL
COM E SEM METÁSTASE NODAL
Natal / RN
2006
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de
Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Doutor em
Patolo
g
ia Oral.
Doutoranda: Fernanda Ferreira Lopes
Orientadora: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza
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2
Catalogação da publicação. UFRN/Biblioteca Setorial de Odontologia
Lopes, Fernanda Ferreira.
Expressão imuno-histoquímica da E-caderina e da β-catenina em carcinoma
epidermóide oral com e sem metástase nodal /Fernanda Ferreira Lopes. – Natal,
RN, 2006.
119f. : il.
Orientadora: Lélia Batista de Souza.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de
Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Carcionoma epidermóide – Tese. 2. Câncer oral - Tese. 3. E-caderina –
Tese. 4. Beta-catenina - Tese. 5. Imuno-histoquímica - Tese. I Souza, Lélia Batista.
II. Título.
RN/UF/BSO/2006 BLACK D65
3
DEDICAT
Ó
RIA
4
Dedico a presente tese de Doutorado
Ao Deus Pai, que aos cansados Ele dá novas forças e enche de energia os fracos. No
sofrimento eu fui consolada, porque a sua promessa me deu forças. Pois, o Eterno é bom; o
seu amor dura para sempre e a sua felicidade não tem fim (Is 40.29; Sl 119.50; Sl 100.5).
À tia Rosinha (in memoriam), pela presença ausente, cujo ensinamento inicial
transmitido a mim e meus irmãos, serviu de base para a construção de nossa formação
profissional e construção pessoal.
5
AGRADECIMENTOS
6
AGRADECIMENTOS
A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta ou indireta de
muitas pessoas, sob a benção concedida por Deus. Muito Obrigada, Pai Eterno! Assim,
manifestamos nossa gratidão a todos e de forma particular:
À Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, minha orientadora, por ter permitido a execução
desta pesquisa, assim como pela orientação de todos os estudos realizados no decorrer do
curso, transmitindo as diretrizes indispensáveis para a minha formação.
Aos meus pais, Bernardo e Antonia Lopes, que me ensinaram que a maior herança que
os pais podem dar a seus filhos é o estudo, pois dele provém a fonte da sabedoria.
À vovó Maria e tia Rosinha (in memoriam), que sempre se esforçaram para dar o
melhor de si na minha educação e dos meus irmãos. Obrigada por todo amor, carinho e
compreensão.
Aos meus irmãos, Flávia e Fabiano, por toda a trajetória de vida compartilhada, risos,
alegrias, divergências e dificuldades superadas com amor e união.
Aos meus sobrinhos, Gabriela, Graziela e Luiz Antonio, pelo carinho, repleto de
abraços e beijos, mostrando que a vida é simples, pois a felicidade está nos momentos mais
comuns do dia-a-dia.
Ao meu esposo Maurício, pelo companheirismo, compreensão, amor e solidariedade
demonstrados durante estes anos. Obrigada por ter me fornecido o alicerce emocional que
precisei em diversos momentos durante o curso, ajudando a me tornar forte quando estava
fraca. Agradeço a Deus por você ter estado ao meu lado!
Ao meu cunhado Hélio, que sempre me incentivou nas conquistas profissionais,
estando presente ao ajudar a superar as dificuldades advindas, com sua calma e serenidade.
À minha cunhada Helayne, que através do nascimento de Luiz Antonio, mostrou que a
vida segue o seu curso natural.
Ao Filó, pelos anos de serviço prestado à minha família, ajudando mamãe em seu
cotidiano, principalmente nos momentos críticos vividos.
A todo o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN,
em especial ao Dr. Leão, Dra. Roseana, Dra. Lélia Maria, Dra. Hébel e Dr. Costa, pelos
ensinamentos transmitidos.
7
À CAPES pela criação do Programa de Qualificação Institucional - PQI, efetivado
entre a UFRN e a UFMA, que viabilizou a realização da presente pesquisa e por ter me
proporcionado o curso de doutorado.
À Profa. Dra. Roseana Freitas, pelo apoio na concretização do Programa de
Qualificação Institucional - PQI em Patologia Oral/UFRN/UFMA, ao procurar viabilizar
todas as etapas desta jornada.
À Profa. Dra. Márcia Miguel, pelo auxílio na realização desta pesquisa, através de suas
sugestões, que foram muito valiosas.
Ao Prof. Dr. Kenio, por todo o carinho e pela análise estatística do presente trabalho.
Aos companheiros do PQI/UFRN/UFMA, Maria Carmen e Antonio Luiz, pela
amizade alicerçada durante estes anos de jornada, através das experiências compartilhadas.
A todos os docentes da UFMA e, em especial, às amigas: Adriana Vasconcelos, Ana
Emília, Cláudia Maria e Maria Inez, pelo apoio e incentivo.
A todos os oficiais dentistas da PMMA e, em especial, ao Ten.Cel. Carlyle, Cap.
Omar, Cap. Bitencourt, Cap. Teresa e Ten. Scheylla, pelo apoio individual.
A todos os colegas do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, em
especial aos amigos Éricka, Gustavo, Karuza, Manuel, Roberta e Simone, pelos momentos
compartilhados durante toda a trajetória do curso. Vocês trouxeram alegria. Em particular,
agradeço ao Manuel, pela ajuda nos momentos finais de elaboração da tese.
Aos funcionários do Laboratório do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da
UFRN, Canidé e Hévio, pelo apoio na execução de todos os trabalhos realizados e, em
especial, a tese.
À Gracinha, que sempre se mostrou uma secretária solícita a todos os meus apelos, à
funcionária Sandrinha e à secretária Idelzuite, pelos momentos alegres no cafezinho. Obrigada
pelo carinho!
Às patologistas do Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello-IMOAB, Dra.
Raimunda e Dra. Siliomar, pelo auxílio na liberação do material utilizado como amostra da
presente pesquisa.
À Dona Hígea e Seu Paulo, assim como seus filhos Karina e Ricardo, seu genro
Alisson, sua nora Patrícia, e às suas netas Natália e Laura, pelo convívio familiar fornecido
durante minha estadia em Natal.
Meus sinceros agradecimentos.
8
RESUMO
9
RESUMO
As moléculas de adesão E-caderina e β-catenina têm sido estudadas como possíveis
marcadores para distinguir carcinomas com e sem potencial metastático. O objetivo desta
pesquisa foi estudar a expressão imuno-histoquímica da E-caderina e β-catenina em
carcinoma epidermóide oral (CEO), visando contribuir para uma melhor compreensão do
comportamento biológico desta lesão. A amostra constou de 30 casos de CEO, sendo 15 de
língua e 15 de lábio inferior. O padrão e intensidade de marcação e a análise semiquantitativa
do percentual de células tumorais imunopositivas em membrana para E-caderina e β-catenina
foram relacionados com a localização anatômica da lesão, a presença ou não de metástase
nodal e a gradação histológica de malignidade no front de invasão tumoral. Também foi
registrada a presença ou não de imunomarcação citoplasmática e nuclear da β-catenina. Os
resultados foram submetidos à análise estatística, sendo utilizados o Teste de Mann-Whitney,
o Teste Exato de Fisher e o Coeficiente de correlação de Spearman (α=0,05). Os resultados
mostraram que a expressão em membrana para E-caderina e β-catenina exibiram,
predominantemente, o padrão heterogêneo nos carcinomas de lábio inferior e nos de língua,
assim como nos casos com e sem metástase nodal. Aplicados os testes estatísticos, observou-
se que não houve diferença significativa entre o padrão de expressão e a quantidade de células
imunopositivas para E-caderina e β-catenina e a localização anatômica da lesão e para a
presença ou não de metástase nodal. Porém, verificou-se diferença estatisticamente
significativa da expressão reduzida destas proteínas com o alto escore de malignidade.
Observou-se que a expressão da β-catenina em citoplasma estava presente em 22 (73,33%)
dos 30 casos analisados, sendo que em 6 casos (20%) houve a expressão em núcleo. Após a
análise estatística, foi detectada uma associação significativa entre a expressão da β-catenina
no citoplasma com a gradação histológica de malignidade, estando esta molécula mais
freqüentemente presente no citoplasma nos casos de alto escore de malignidade. Conclui-se
que a imunoexpressão reduzida destas proteínas em membrana pode estar relacionada com o
menor grau de diferenciação celular, bem como com o padrão de invasão em ninhos e em
células isoladas, demonstrados nos casos de CEO de alto escore.
Palavras-chave: Carcinoma epidermóide. Câncer oral. Caderinas. Beta Catenina.
Imunohistoquímica.
10
ABSTRACT
11
ABSTRACT
The adhesion molecules E-cadherin and β-catenin have been studied as possible markers to
distinguish carcinomas with and without metastatic potential. The objective of this research
was to study the imunohistochemistry expression of the E-cadherin and β-catenin in oral
squamous cell carcinoma (OSCC), aiming to contribute for the better understanding of the
biological behavior of this lesion. The sample consisted of 30 cases of OSCC, being 15 of
tongue and 15 of lower lip. The profile and intensity of labeling and semi quantitative analysis
of the percentage of immunopositive tumoral cells in membrane for E-cadherin and β-catenin
had been related with the anatomical localization of the lesion, the presence or not of nodal
metastasis and the histological grade of malignancy in the invasive front area of the tumor. It
was registered the presence or not of cytoplasmic and nuclear labeling of the β-catenin. The
results had been submitted to the statistical analysis, being used the Mann-Whitney Test, the
Fisher Test and the Spearman Correlation Coefficient (α=0, 05). The results showed that the
expression in membrane for E-cadherin and β-catenin was, predominantly, the heterogeneous
profile in the lower lip and tongue carcinomas, as well as in the cases with and without nodal
metastasis. It was not observed significant statistical difference between expression profile
and amount of immunopositive cells for E-cadherin, β-catenin and the anatomical localization
of the lesion and for the presence or not of nodal metastasis. However, there was significant
difference of the reduced expression of these proteins with the high score of malignancy. It
was verified that the expression of the β-catenin in cytoplasm was present in 22 (73.33%) of
the 30 analyzed cases, and 6 cases (20%) showed nuclear expression. The statistical analysis
detected significant association between the expression of the β-catenin in the cytoplasm with
the histological grade of malignancy, being this molecule more frequently present in the
cytoplasm in the cases of high score of malignancy. It was concluded that the reduced
immunoexpression of these proteins in membrane can be related with the lowest cellular
differentiation, as well as with the pattern of invasion in nests and isolated cells, demonstrated
in the cases of OSCC with high histological grade of malignancy.
Key-words: Squamous cell carcinoma. Oral cancer. Cadherins. Beta Catenin.
Immunohistochemistry.
12
LISTA DE ILUSTRA
Ç
ÕES
13
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
QUADRO/
FIGURA
Página
Quadro 1
Sistema de gradação de malignidade “Modo de invasão”
recomendado por Bryne (1998).......... ..............................................
63
Quadro 2
Especificações sobre os anticorpos utilizados................................... 64
Figura 1
Carcinoma epidermóide oral (A) Visão geral ilustrando o front
invasivo tumoral; (B e C) Diferentes padrões de invasão (H/E-
100x) .................................................................................................
74
Figura 2
Carcinoma epidermóide oral – (A, B e C) – Parâmetros analisados:
grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e intensidade de
infiltrado inflamatório (H/E-200x) ...................................................
75
Figura 3
Imunomarcação da E-caderina em carcinoma epidermóide oral.
Padrão de expressão heterogêneo: (A): < 25% de células positivas
(SABC-200x), (B): 26 a 50% de células positivas (SABC-200x),
(C): > 75% de células positivas (SABC-100x) ................................
77
Figura 4
Imunomarcação da ß-catenina em carcinoma epidermóide oral.
(A): Padrão de expressão homogêneo reduzido (SABC-200x). (B):
Padrão de expressão heterogêneo focal. Detalhe da marcação
citoplasmática e nuclear (SABC-100x). (C): Padrão de expressão
homogêneo forte (SABC-200x) .......................................................
78
14
LISTA DE TABELAS
15
LISTA DE TABELAS
TABELA
Página
Tabela 1
Características dos casos de carcinoma epidermóide oral,
segundo a localização anatômica da lesão, idade e sexo dos
pacientes, presença ou não de metástase nodal. Natal, RN-2006
69
Tabela 2
Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo
a localização anatômica e presença de metástase nodal. Natal,
RN-2006 ........................................................................................
70
Tabela 3
Análise morfológica dos casos de carcinoma epidermóide de
lábio inferior, segundo os critérios propostos por Bryne (1998) e
modificação recomendada por Miranda (2002). Natal, RN-2006 .
70
Tabela 4
Análise morfológica dos casos de carcinoma epidermóide de
língua, segundo os critérios propostos por Bryne (1998) e
modificação recomendada por Miranda (2002). Natal, RN-2006 .
71
Tabela 5
Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo
a localização anatômica e a gradação histológica de malignidade
proposta por Bryne (1998) e modificada por Miranda (2002).
Natal, RN-2006 .............................................................................
72
Tabela 6
Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo
a presença ou não de metástase nodal e a gradação histológica de
malignidade proposta por Bryne (1998) e modificada por
Miranda (2002). Natal, RN-2006 ..................................................
72
Tabela 7
Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância
estatística (p) entre o escore total de malignidade e os
parâmetros de gradação histológica de malignidade dos casos de
carcinoma epidermóide oral. Natal, RN-2006 ..............................
73
16
Tabela 8
Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao
padrão de expressão e à quantidade de células imunopositivas
para a E-caderina e a β-catenina, segundo a localização da lesão.
Natal, RN-2006 .............................................................................
79
Tabela 9
Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos
postos, estatística U e sua significância entre o padrão de
expressão e a quantidade de células imunopositivas para a E-
caderina e a β-catenina em carcinoma epidermóide oral, quanto à
localização da lesão. Natal, RN-2006........................................
80
Tabela 10
Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao
padrão de expressão e à quantidade de células imunopositivas
para a E-caderina e a β-catenina, segundo a presença e ausência
de metástase nodal. Natal, RN-2006 .............................................
81
Tabela 11
Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos
postos, estatística U e sua significância entre o padrão de
expressão e a quantidade de células imunopositivas para a E-
caderina e a β-catenina dos casos de carcinoma epidermóide
oral, em relação à metástase da lesão. Natal, RN-2006 ................
82
Tabela 12
Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao
padrão de expressão e à quantidade de células imunopositivas
para a E-caderina e a β-catenina, segundo o escore de
malignidade. Natal, RN-2006 .....................................................
83
Tabela 13
Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos
postos, estatística U e sua significância entre o padrão de
expressão e a quantidade de células imunopositivas para a E-
caderina e a β-catenina dos casos de carcinoma epidermóide
oral, em relação à gradação histológica de malignidade da lesão.
Natal, RN-2006 .............................................................................
84
17
Tabela 14
Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância
estatística (p) entre o escore total de malignidade e o padrão e a
quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-
catenina em carcinomas epidermóides orais. Natal, RN-2006 ......
84
Tabela 15
Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância
estatística (p) entre o padrão e a quantidade de células
imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina em carcinomas
epidermóides orais. Natal, RN-2006 .............................................
85
Tabela 16
Valores absolutos, percentuais e significância estatística entre a
expressão da β-catenina em citoplasma e em núcleo e
localização anatômica da lesão, metástase nodal e gradação
histológica de malignidade em carcinomas epidermóides orais.
Natal, RN-2006 .............................................................................
86
18
SUM
Á
RIO
19
SUMÁRIO
Página
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
LISTA DE TABELAS
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 21
2 REVISÃO DA LITERATURA ..................................................................... 24
2.1 Carcinoma epidermóide oral (CEO) ........................................................ 25
2.1.1 Considerações gerais ........................................................................... 25
2.1.2 Fatores prognósticos ............................................................................ 28
2.1.3 Front de invasão tumoral ..................................................................... 31
2.1.4 Gradação histológica de malignidade ................................................. 32
2.1.5 Invasão e metástase .............................................................................. 33
2.2 Adesão celular ............................................................................................. 34
2.3 E-Caderina .................................................................................................. 35
2.4 β-Catenina ................................................................................................... 40
2.5 Complexo E-caderina/ β-catenina em carcinomas .................................. 43
2.6 Complexo E-caderina/ β-catenina em carcinoma epidermóide oral ..... 48
3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................... 58
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 60
4.1 Caracterização do estudo ........................................................................... 61
4.2 População .................................................................................................... 61
4.3 Amostra ....................................................................................................... 61
4.4 Critérios de seleção da amostra ................................................................ 61
4.4.1 Critérios de inclusão ............................................................................. 61
4.4.2 Critérios de exclusão ............................................................................ 62
4.5 Estudo clínicopatológico ............................................................................ 62
4.6 Estudo morfológico .................................................................................... 62
4.7 Método imuno-histoquímico ...................................................................... 64
4.8 Análise imuno-histoquímica ...................................................................... 66
4.9 Análise estatística ....................................................................................... 67
20
4.10 Considerações Éticas ................................................................................ 67
5 RESULTADOS ............................................................................................... 68
5.1 Caracterização da amostra ........................................................................ 69
5.2 Resultados morfológicos ............................................................................ 70
5.3 Resultados imuno-histoquímicos .............................................................. 76
5.3.1 Quanto à localização anatômica da lesão ........................................... 79
5.3.2 Quanto à presença ou não de metástase nodal .................................. 80
5.3.3 Quanto ao escore de malignidade ....................................................... 82
5.3.4 Complexo E-caderina/β-catenina ........................................................
85
5.3.5 Expressão da β-catenina em citoplasma e em núcleo ........................
85
6 DISCUSSÃO ................................................................................................... 87
7 CONCLUSÕES .............................................................................................. 101
REFERÊNCIAS
APÊNDICES
ANEXO
21
INTRODU
Ç
ÃO
22
1 INTRODUÇÃO
Estimativas de incidência de câncer para 2005 no Brasil apontaram ser o câncer de
boca o 8º mais freqüente entre os homens (com 9.985 casos estimados) e o 9º entre as
mulheres (com 3.895 casos estimados). O câncer de boca compreende os carcinomas de lábio
e cavidade oral. O câncer de lábio é mais freqüente em pessoas brancas, tendo maior
ocorrência no lábio inferior em relação ao superior (INCA, 2005). Dentre os carcinomas
epidermóides de cavidade oral, o de língua é uma neoplasia que freqüentemente desenvolve
metástase nodal em tumores iniciais, estando associado com pobre prognóstico e baixa taxa
de sobrevida (AL-RAJHI et al, 2000; HYAM et al, 2003).
Segundo Wunsch-Filho (2002), o prognóstico do câncer de lábio é o mais favorável,
com uma taxa de sobrevida de 5 anos em 79% dos casos. Os casos localizados em língua
apresentam a referida taxa em somente 15% dos casos, enquanto os cânceres em outros sítios
da boca, a taxa de sobrevida de 5 anos é de 28%. Dessa forma, os tumores de língua são os
que apresentam piores taxas de sobrevida.
Como aproximadamente 90% dos cânceres humanos se originam da proliferação
celular epitelial anormal, Nollet, Geert e van Roy (1999) enfatizam que é bastante apropriado
investigar as interações célula-célula nesses tipos de tumores, dando ênfase às possíveis
alterações na expressão da E-caderina.
O gene de E-cadherina (CDH1) consiste em um supressor de invasão, pois a perda de
expressão e/ou sua função anormal leva ao dano na polaridade celular e desarranjo da
arquitetura tecidual normal. Assim, a perda desta molécula pode permitir ou aumentar a
invasão tumoral aos tecidos adjacentes e a formação de metástase à distância. (HARINGTON;
SYRIGOS, 2000).
A expressão da E-caderina pode ser um marcador para distinguir carcinomas com e
sem potencial metastático. Por isso, estudos imuno-histoquímicos com o anticorpo
monoclonal anti-E-caderina têm sido realizados, no intuito de entender o significado da
expressão reduzida da E-caderina em cânceres humanos (EL-BAHRAWY et al, 2001;
HIROHASHI; KANAI, 2003).
A função adesiva das caderinas depende da associação com proteínas citoplasmáticas,
denominadas cateninas (α-, β-, γ-catenina), que ligam o domínio terminal citoplasmático da
caderina ao citoesqueleto de actina (BÀNKFALVI et al, 2002b). A β-catenina é uma proteína
multifuncional aparentemente envolvida em dois processos independentes: adesão celular e
23
transdução de sinal. A interrupção desses dois mecanismos da β-catenina pode ser importante
no desenvolvimento e progressão tumoral (CASTRO et al, 2000).
Frente ao exposto, nos propomos, através desta pesquisa, estudar a expressão imuno-
histoquímica da E-caderina e da β-catenina em carcinoma epidermóide oral (CEO), visando
contribuir para a compreensão do comportamento biológico desta lesão associado à metástase.
24
REVISÃO DA LITERATURA
25
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Carcinoma Epidermóide Oral (CEO)
2.1.1 Considerações gerais
Embora conhecido há muitos séculos, somente nas últimas décadas o câncer vem
ganhando uma dimensão maior, convertendo-se em um evidente problema de saúde pública
mundial. No Brasil, o cenário não tem sido diferente. Observa-se, a partir dos anos 60, que as
doenças infecciosas e parasitárias deixaram de ser a principal causa de morte, sendo
substituídas pelas doenças do aparelho circulatório e pelas neoplasias. Entre os brasileiros, o
câncer é a terceira maior causa de mortes por doença, representando 11,84% do total dos
óbitos registrados no país (KLIGERMAN, 2000).
No Brasil, excluindo o câncer de pele, o câncer oral e de faringe representam a 5ª
incidência de câncer entre homens e a 6ª, entre as mulheres. Hoje, o câncer de modo geral é a
terceira causa de morte entre homens, após as doenças cardiovasculares e traumas e, a
segunda, entre as mulheres, somente superada pelas doenças cardiovasculares (WUNSCH-
FILHO, 2002).
A Classificação Internacional de Doenças (CID) considera o câncer oral como as
neoplasias malignas dos lábios, de sítios intra-orais e da orofaringe. Os carcinomas
representam 96% dos canceres orais, sendo que 91% destes são carcinomas epidermóides
(INCA, 2005; NEVILLE et al, 2004; WONG et al, 1996).
Segundo Scully, Flint e Porter (1997), o carcinoma oral contribui com menos de 3%
dos óbitos por câncer nos países ocidentais, mas, em alguns países em desenvolvimento, o
câncer oral contribui com mais de 1/3 das internações em hospitais de câncer.
Com uma considerável freqüência entre os tumores malignos da cavidade oral, o
carcinoma epidermóide é caracterizado por uma desordem proliferativa de células da camada
espinhosa do epitélio, que expressam graus variados de similaridade com suas células de
origem (DANTAS et al, 2003); tendo sido preconizado, pela Organização Mundial de Saúde
(OMS) a gradação histológica de malignidade idealizada por Wahi em 1971, como recurso
microscópico que visa classificar a lesão de acordo com padrões morfológicos, numa
gradação que varia de bem diferenciado a indiferenciado. (NEVILLE et al, 2004).
26
No intuito de analisar o perfil do carcinoma epidermóide na cavidade oral, vários
autores realizaram estudos epidemiológicos em diversas localidades do Brasil, dentre esses
citam-se Gervásio et al (2001), na cidade de Belo Horizonte-MG, Carvalho et al (2001) e
Perussi et al (2002), em São Paulo-SP, Silva et al (2001), em São Luís-MA e Anjos Hora et al
(2003), na cidade de Aracajú-SE. Todos esses levantamentos mostraram que a língua foi a
região anatômica de maior freqüência, seguida por lábio e assoalho bucal, com maior
acometimento em indivíduos do sexo masculino, principalmente acima dos cinqüenta anos de
idade. No entanto, no estudo realizado em Natal-RN por Costa et al (2002), as regiões
anatômicas mais acometidas foram o lábio inferior, seguido por língua, assoalho bucal e
palato mole.
O desenvolvimento do carcinoma epidermóide oral envolve vários fatores, tanto
extrínsecos (dentre os quais o fumo, álcool, luz solar), quanto intrínsecos (tais como
alterações genéticas, deficiências nutricionais e imunossupressão) que podem estar em
atividade, sendo necessária a ação de mais de um destes carcinógenos para a produção de
malignidade (ABDO; GARROCHO; AGUIAR, 2002; MASSANO et al, 2006; NEVILLE et
al, 2004).
Dedivitis et al (2004) detectaram que pacientes com carcinoma epidermóide de boca e
orofaringe tiveram significativa exposição ao tabagismo e etilismo, em uma casuística onde os
pacientes tinham idade acima dos 40 anos. Observaram que o hábito do tababismo estava
presente em 77% dos pacientes com carcinoma epidermóide de boca, sendo que 35%
fumavam até 40 cigarros por dia, enquanto o hábito do etilismo foi registrado em 74% dos
pacientes.
Amorim Filho et al (2003a) observaram que o hábito mais comum em pacientes
portadores de carcinoma epidermóide de base de língua foi o uso isolado do tabaco, seguido
do consumo associado de tabaco e de bebida alcoólica. A grande maioria dos tumores
encontrava-se em estágio avançado e linfonodo clinicamente positivo no pescoço, à primeira
consulta.
No estudo clínico-epidemiológico retrospectivo de 290 pacientes portadores de
carcinoma epidermóide (CE) de base de língua, do Hospital de Heliópolis em São Paulo,
Amorim Filho et al (2003b) verificaram predomínio no sexo masculino e na 5ª a 6ª décadas de
vida, tendo com fatores de risco o álcool e o fumo. Ainda analisando os dados desses 290
pacientes portadores de carcinoma epidermóide da base de língua, Amorim Filho et al (2004)
acrescentaram que a maioria dos pacientes (83,8%) fumava e bebia, havendo poucos casos
27
(13 pacientes) em que estes hábitos estavam ausentes. A larga maioria dos pacientes
apresentava-se com tumores em estágio avançado, com metástase em linfondos ou à distância.
Choi et al (2006) investigaram o valor prognóstico dos dados clínicos e demográficos
em um grupo de 861 casos de carcinoma epidermóide oral. Observaram que o consumo de
álcool e o fumo foram os maiores fatores de risco. A análise de multivariância mostrou
diferença significativa no prognóstico dos pacientes de acordo com o tamanho da massa
tumoral e a existência de metástase nodal.
Scully et al (2002) mencionaram que o vírus herpes simples (HSV) pode ser um vírus
oncogênico ao atuar sinergicamente com carcinógenos químicos, ressaltando que ainda
existem controvérsias quanto ao papel do papiloma vírus humano (HPV) na etiologia dessa
lesão. Acrescentaram ainda que apesar desses dois vírus estarem associados a alguns tumores
malignos, eles não estão presentes em todos os carcinomas epidermóides orais.
De acordo com Regezi e Sciubba (2000), o denominador comum para todos os fatores
etiológicos do carcinoma é a sua habilidade de alterar, permanentemente, o genoma dos
ceratinócitos da mucosa. Estes fatores levam a ativação de oncogênes e repressão de genes
supressores de tumor. A maioria das moléculas que estão envolvidas no fenótipo do câncer
são produtos de genes constitutivamente presentes, mas, com expressão alterada, funcionando
como moléculas promotoras ou supressoras tumorais (AKEN et al, 2001).
A carcinogênese oral consiste em um processo com diversas etapas, onde eventos
genéticos levam a distúrbios nos mecanismos regulatórios normais que controlam as funções
celulares básicas, incluindo a divisão celular, diferenciação e morte celular. As alterações
genéticas já conhecidas durante a carcinogênese incluem mutações puntiformes,
amplificações gênicas, rearranjos cromossômicos e deleções (LINE et al, 1995; SCULLY,
1992; WILLIAMS, 2000).
As alterações que promovem o desenvolvimento de células neoplásicas apresentam
duas funções básicas: mutações que aumentam a atividade de proteínas (classe de genes
chamados oncogenes) ou mutações que inativam a função de genes, classificados como genes
supressores tumorais (BERTRAM, 2001). Nos oncogenes ou genes promotores de tumor, um
alelo é ativado gerando eventos de ganho de função. Nos genes supressores tumorais ou
antioncogenes, ambos os alelos são inativados gerando eventos de perda de função
(MAREEL; LEROY, 2003). Os oncogenes estão envolvidos nos mecanismos de sinalização,
que estimulam a proliferação, enquanto a maioria dos genes supressores tumorais,
normalmente atua conferindo a proliferação celular e a apoptose (BERTRAM, 2001).
28
Williams (2000) acrescenta que embora somente os oncogenes não sejam suficientes
para a transformação das células epiteliais, eles são iniciadores importantes do processo. O
evento crucial na transformação de uma célula pré-maligna em célula maligna consiste na
inativação de reguladores celulares negativos – genes supressores tumorais – levando ao
desenvolvimento de malignidade. Os genes supressores tumorais são geralmente inativados
por mutações puntiformes, deleções e rearranjos em ambos os alelos do gene.
Segundo Mareel e Leroy (2003), a metilação elevada de DNA é observada em regiões
geneticamente silenciadas de cromossomos e a hipermetilação da ilha CpG na região do
promotor de um gene leva ao silêncio transcricional. Este mecanismo de metilação é
observado em vários genes supressores tumorais, consistindo em uma modificação
epigenética, controlada pela adição de grupos metil às citosinas específicas do DNA,
convertendo a citosina em metilcitosina (AUERKARI, 2006).
2.1.2 Fatores prognósticos
De acordo com Carter (1993) e Odell et al (1994), a patogênese dos carcinomas
epidermóides de cabeça e pescoço tem sido bastante estudada com particular relevância aos
métodos de identificação dos fatores prognósticos e metástase nodal. Os pacientes com
tumores de cavidade oral e faringe, geralmente são diagnosticados em estágios
significativamente mais avançados da doença do que os de outras áreas de cabeça e pescoço
(TROMP et al, 2005).
O carcinoma epidermóide pode infiltrar para os tecidos adjacentes e promover
metástase em sítios distantes. O carcinoma epidermóide oral geralmente sofre metástase para
linfonodos do pescoço e para sítios distantes como o pulmão e fígado. A característica
microscópica essencial do carcinoma epidermóide é a invasão de células tumorais, através da
membrana basal, para o tecido conjuntivo subjacente. Para o carcinoma epidermóide oral, a
determinação do tamanho do tumor e a presença ou ausência de envolvimento dos linfonodos
cervicais e metástases à distância são importantes no prognóstico do paciente (IBSEN;
PHELAN, 2000).
Beltrami, Desinan e Rubibi (1992) realizaram um estudo com 80 casos de carcinoma
epidermóide oral, objetivando avaliar seus fatores prognósticos. Durante o período de
proservação, os autores observaram que a localização do tumor primário apresentava valor
29
prognóstico significativo. Por fim, ressaltaram que as neoplasias de lábio revelaram
comportamento biológico mais favorável do que os carcinomas de cavidade oral.
Dib et al (1994) analisaram cinqüenta e nove casos de CEO dos arquivos do Hospital
A. C. Camargo, e observaram que as variáveis histológicas, infiltração perineural e
embolização linfática, embora não tenham apresentado correlação significativa com a
sobrevida geral, apresentaram relação importante com a presença de metástase regional,
tornando-se um indicador prognóstico indireto. Ratificaram que a presença de metástase
regional, no momento do diagnóstico inicial, reduz significativamente as taxas de sobrevida
global. Assim, sugeriram que o patologista deve buscar na análise histopatológica, as
características que determinem o estágio de invasão da neoplasia.
Preocupados com a elevada propensão para metástase regional e pobre prognóstico do
carcinoma epidermóide de língua, Yuen et al (1998) analisaram a invasão local em 50 casos.
Observaram que a infiltração perineural foi o único fator de risco significativo para
recorrência local e que não houve correlação entre esta variável com tamanho e diferenciação
do tumor, ressaltando a importância de uma análise tumoral cuidadosa nos casos de
carcinoma epidermóide de língua.
Cernea e Hojay (2000) acrescentam que quanto maior for o tamanho da lesão pior o
prognóstico, assim como a microcirculação peritumoral. O comprometimento da
microcirculação (vascular ou linfática) é acompanhado de aumento na freqüência de
metástases linfáticas locorregionais e, consequentemente, piora do prognóstico.
Okamoto et al (2002) observaram que, dentre 59 pacientes com carcinoma
epidermóide de língua em estágios I/II tratados, 3 desenvolveram recorrência local e 14
apresentaram metástase tardia em pescoço. Assim, investigaram os fatores prognósticos para
metástase tardia em pescoço e observaram que as variáveis com valor significativo foram o
padrão de crescimento (lesões com crescimento endofítico apresentaram significativamente
mais metástases do que as exofíticas) e a espessura tumoral (> 4 mm).
Ao analisarem os fatores prognósticos e a distribuição de metástases linfonodais em
pacientes com carcinoma epidermóide de lábio, Vartanian et al (2004) detectaram que a
maioria dos pacientes foram diagnosticados em estágios iniciais (T1/T2 em 81% dos casos).
Quanto ao estágio clínico N, 79% dos pacientes foram cN0, ratificando que os pacientes com
câncer de lábio, geralmente, apresentam bom prognóstico. Ressaltaram que os tumores T3 e
T4 envolviam a comissura labial e estavam associados com uma taxa de metástase em
pescoço de 22,3% e 18,1%, respectivamente.
30
Em um estudo sobre a incidência de metástase nodal em pacientes com câncer de lábio
inferior, Bucur e Stefanescu (2004) observaram que somente 15 (7,5%) dos 200 casos
revelaram linfonodo positivo no momento do diagnóstico. Sendo que, após o período de 2
anos, 99 (64%) dos 185 pacientes linfonodos negativos desenvolveram metástase nodal. Os
autores concluíram que, no momento do diagnóstico, os pacientes com carcinoma de lábio
inferior geralmente são linfonodos negativos, com a maioria dos casos desenvolvendo
metástase nodal dentro do período de dois anos.
No intuito de identificar os fatores que podem afetar a sobrevida dos pacientes com
CEO, Kademani et al (2005) analisaram 215 casos, excluindo os localizados em lábio.
Observaram que, após cinco anos, 56% dos pacientes estavam vivos, sendo que 58% estavam
livres da doença. O estadiamento clínico e a gradação histológica foram os fatores que,
significativamente, influenciaram na sobrevida desses pacientes. Os fatores idade, sexo, raça e
sítio tumoral não demonstraram afetar, significativamente, na sobrevida de cinco anos dos
pacientes com CEO.
Costa, Araújo Júnior e Ramos (2005) analisaram 38 casos de carcinoma epidermóide
oral, quanto à classificação clínica TNM e às características histológicas nas áreas mais
profundas da lesão como descrito por Bryne em 1998. Encontraram correlação
estatisticamente significativa entre o estadiamento clínico TNM e os escores histológicos de
malignidade e com os parâmetros histológicos isolados (pleomorfismo nuclear e grau de
ceratinização). Houve também uma correlação significativa entre infiltrado linfoplasmocitário
e pleomorfismo nuclear com a classificação TNM, quando agrupada em duas séries: com e
sem metástase. Concluíram que as áreas invasivas podem ser primariamente responsáveis
pelo comportamento clínico do tumor e isso pode ser imprescindível para a escolha da terapia
para o carcinoma epidermóide oral.
Em um trabalho de revisão de literatura, Woolgar (2006) ressaltou a importância dos
dados histopatólógicos do tumor primário e da metástase como fatores indicativos do
prognóstico de carcinoma epidermóide oral e de orofaringe. O autor recomenda a
padronização na avaliação histopatológica e na cuidadosa documentação dos dados. Ainda
revelou que, geralmente, a metástase nodal é diagnosticada histologicamente em 59-64% dos
tumores de língua.
Com o objetivo de determinar os fatores indicativos para metástase nodal e
prognóstico, Kurokawa et al (2005) realizaram um estudo retrospectivo sobre os dados
clínicos e patológicos dos carcinomas de língua. Observaram que as taxas de sobrevida de 5
anos diferiram significativamente conforme os seguintes fatores clínco-patológicos: tamanho
31
do tumor, estadiamento clínico, profundidade tumoral, aspecto macroscópico, metástase
nodal, invasão micro vascular e escore total de malignidade no front de invasão (GFI). A
análise de multivarância revelou que a profundidade tumoral ≥ 4 mm, GFI ≥ 8 e a presença de
metástase nodal diminuíam a sobrevida dos pacientes, sendo que o GFI ≥ 11 apresentava
valor indicativo para a metástase nodal em carcinoma epidermóide de língua. Concluíram que
o alto escore de malignidade do front de invasão apresenta elevado valor prognóstico para os
carcinomas de células escamosas de língua.
2.1.3 Front de invasão tumoral
As células do front de invasão tumoral (FIT) são menos diferenciadas (BRYNE et al,
1989) e apresentam elevado grau de dissociação celular quando comparadas com as de outras
áreas do tumor (BRYNE et al, 1992). Assim, o FIT consiste no caminho para melhor entender
o comportamento biológico do tumor, fornecendo informações adicionais na escolha das
estratégicas terapêuticas aos pacientes com câncer oral (NOGUCHI et al, 2002), pois a chave
para melhor entender o comportamento invasivo e metastático das células neoplásicas reside
na análise das margens invasivas (BRYNE et al, 1989).
Sabe-se que vários eventos moleculares de importância para o crescimento tumoral
como ganho e perda de moléculas de adesão, secreção de enzimas proteolíticas, aumento da
proliferação celular e angiogênese, ocorrem na interação tumor-hospedeiro (front de invasão).
As características moleculares e morfológicas do front de invasão tumoral de carcinomas
podem melhor refletir o prognóstico do que em outras partes do tumor (BRYNE, 1998).
Noguchi et al (2002) comprovaram a importância do front de invasão no entendimento
do comportamento biológico tumoral, através da análise comparativa do DNA de células do
front de invasão em 195 pacientes com carcinoma epidermóide oral. Os autores
determinaram, por meio de análise de multivariância, que o conteúdo do DNA anormal no
front de invasão, o estadiamento clínico e o tipo de crescimento tumoral são fatores
prognósticos independentes que significativamente influenciam na sobrevida desses pacientes.
O padrão de invasão, a espessura do tumor e o infiltrado inflamatório presente na lesão
podem ser indicadores importantes da agressividade tumoral, considerando que essas
variáveis refletem a relação da população celular com o hospedeiro, ratificando a importância
da visualização histopatológica do front de invasão e bordas tumorais (DANTAS et al, 2003).
32
2.1.4 Gradação histológica de malignidade
Existem diversos sistemas de gradação histológica de malignidade dos carcinomas
epidermóides, cuja finalidade é fornecer subsídios que possibilitem a interpretação da
agressividade tumoral. O primeiro trabalho com este objetivo foi o de Broders em 1920. Em
1971, Wahi propôs um sistema de gradação de malignidade, que foi publicado pela
Organização Mundial de Saúde, baseado somente nos aspectos morfológicos das células
neoplásicas, que classificam o carcinoma epidermóide em bem, moderado ou pobremente
diferenciado (MARTINS NETO, 1999).
Anneroth, Batsakis e Luna, em 1987, idealizaram um sistema de gradação para
carcinoma epidermóide, no qual foram avaliados os aspectos da população celular do tumor
(grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, números de mitoses) e da relação tumor-
hospedeiro (modo de invasão, estágio de invasão e infiltrado linfoplasmocitário). Todos esses
seis parâmetros morfológicos são graduados de 1 a 4, sendo registrados nas áreas mais
anaplásicas dos sítios tumorais mais invasivos. O elevado escore de malignidade indica um
tumor pobremente diferenciado.
Em 1989, Bryne et al propuseram um sistema de gradação de malignidade para o
carcinoma epidermóide oral, onde as células mais profundas das margens invasivas foram
analisadas. Foram seguidos os critérios de Anneroth, Batsakis e Luna (1987), exceto o
parâmetro morfológico estágio de invasão. Os resultados obtidos dos 68 casos estudados
mostraram que esta gradação de malignidade e o estágio da doença (casos com metástase e/ou
infiltração aos tecidos adjacentes) foram os únicos fatores prognósticos, enquanto a gradação
de Borders e o tamanho do tumor não apresentaram valor prognóstico. Esses resultados
significativos indicaram que as características histopatológicas das células do front de invasão
tumoral podem ser cruciais para a metástase e prognóstico, sendo responsáveis pelo
comportamento clínico do tumor e importantes na escolha da terapia para o carcinoma
epidermóide oral (CEO).
Ao analisarem 79 casos de CEO, Bryne et al (1992) observaram que, nas áreas mais
invasivas, as células estavam menos diferenciadas quando comparadas com a parte central do
tumor. As células do front de invasão tumoral foram avaliadas quanto aos cinco parâmetros
morfológicos (grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, modo de
invasão e infiltrado linfoplasmocitário), que provaram possuir valor prognóstico significativo
para a sobrevida dos pacientes. Após a exclusão do parâmetro número de mitoses, o valor
prognóstico da gradação das células invasivas (GCI) continuou significativo e a capacidade de
33
reprodutibilidade do teste foi levemente elevada (kappa), sugerindo que o parâmetro número
de mitoses poderia ser omitido da GCI.
Em 1998, Bryne recomendou um sistema de gradação histológica de malignidade, a
ser empregado somente no front de invasão tumoral, baseado na análise semiquantitativa dos
seguintes parâmetros morfológicos: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de
invasão e resposta inflamatória do hospedeiro. O escore para cada parâmetro deve ser somado
para obtenção do escore total de malignidade, onde o elevado escore corresponde ao alto grau
de malignidade, representando pobre prognóstico. A autora acrescentou que esta gradação no
front de invasão é uma simplificação e modificação do sistema de gradação multifatorial para
os cânceres de cabeça e pescoço, proposto por Anneroth, Batsakis e Luna em 1987.
Segundo Bànkfalvi e Piffkò (2000), as características morfológicas e funcionais do
front de invasão destacam a agressividade biológica do câncer oral, podendo ser considerado
o sistema prognóstico que melhor reflete a sua diversidade biológica. Acrescentaram ainda
que o front de invasão tumoral pode se constituir no sistema modelo para analisar a
agressividade biológica não só do carcinoma epidermóide oral, mas também em outras
regiões anatômicas (faringe, esôfago), além de melanoma maligno e adenocarcinomas de
estômago, colorretal e mama.
No intuito de investigar a reprodutibilidade do sistema de gradação do front de
invasão, Sawair et al (2003) analisaram 102 casos de CEO e avaliaram o valor prognóstico
desse sistema de gradação. Observaram que a concordância dos escores inter-observadores foi
de 75,5% (kappa = 0.505) e intra-observadores foi de 80,4% (kappa = 0.602) dos casos. O
padrão de invasão tumoral estava significativamente associado com a presença de metástase,
sendo classificados como casos de maior risco aqueles com padrão de invasão em pequenos
grupos de células e com células dissociadas. Assim, os autores confirmaram o potencial valor
prognóstico do sistema de gradação do front de invasão para os pacientes com CEO,
sugerindo que o padrão de invasão parece ser importante no planejamento terapêutico, ao
auxiliar na identificação dos pacientes com maior risco à metástase.
2.1.5 Invasão e metástase
As células neoplásicas são capazes de invadir os tecidos vizinhos e sobreviverem em
sítios ectópicos. O termo invasão indica a penetração em território vizinho e sua ocupação. A
invasão de células neoplásicas permite que estas entrem na circulação de onde podem
34
procurar órgãos distantes e eventualmente formar tumores secundários, chamados metástases
(HIROHASHI, 1998; MAREEL; LEROY, 2003).
O câncer ainda é uma das principais causas de morbidade e mortalidade humana, e
90% de todos os casos de morte são devido a formação de metástase. De todos os processos
envolvidos na progressão tumoral, a invasão local e a formação de tumores metastáticos são
clinicamente mais relevantes. No entanto, pouco se sabe a respeito da invasão tumoral a nível
molecular, representando um dos maiores desafios em pesquisa oncológica (CHRISTOFORI,
2003).
A adesão de uma célula à outra serve principalmente para formar e permitir a função
coordenada de grupos ou linhagens de células e para prevenir ou impedir o movimento
celular. As moléculas de adesão (ou seus ligantes) nos processos patológicos podem atuar em
duas situações: como parte de resposta fisiológica para situações patológicas (como nas
inflamações) ou como parte de processo patológico (FREEMONT, 1998).
O papel das moléculas de adesão célula-substrato é ambíguo, porque, teoricamente,
elas podem agir como âncoras para estabilizar a posição das células ou como prendedores
para mover células cancerosas. Conseqüentemente, elas podem ser interpretadas tanto como
moléculas supressoras de invasão e/ou como promotoras de invasão. As moléculas de adesão
célula-célula homotípica (que envolvem células do mesmo tipo) podem ser divididas em dois
grandes grupos: (1) a superfamílias das imunoglobulinas, realizando adesão célula-célula
cálcio-independente e (2) a família das caderinas cálcio-dependente. (BRACKE; VAN ROY;
MAREEL, 1996).
A perda de adesão celular permite que as células malignas escapem do seu sítio de
origem, degradem a matriz extracelular (MEC), adquiram mais motilidade e fenótipo
invasivo, para invadir os tecidos circunvizinhos e promover a metástase. (HARINGTON;
SYRIGOS, 2000).
2.2 Adesão celular
A adesão celular está envolvida nos quatros eventos mais importantes da célula:
proliferação, migração, diferenciação e morte (THIERY, 2003). Proteínas de superfície
celular estão envolvidas na adesão de uma célula a outra e entre célula e matriz extracelular
(MEC). Suas estruturas e funções levaram à classificação dessas moléculas de adesão em
diversos grupos: integrinas, caderinas, selectinas e membros da superfamília das
imunoglobulinas (PETRUZZELLI; TAKAMI; HUMES, 1999).
35
As caderinas clássicas são uma grande família de moléculas de adesão célula-célula,
através de interações homofílicas, cálcio dependente (RAMBURAN; GOVENDER, 2002).
Estas moléculas de adesão desempenham papel crucial em diversos processos, tais como
desenvolvimento embrionário, formação de axions no sistema nervoso e de camadas
epiteliais, mantendo sua integridade e correta formação arquitetural (PETRUZZELLI;
TAKAMI; HUMES, 1999). Outros membros da superfamília das caderinas incluem as
caderinas demossomais (componentes de proteínas transmembrana de desmossomos), sendo
as principais as desmogleinas e desmocolinas, cujos domínios citoplasmáticos se ligam a
desmoplaquina, placoglobina e placofilina que estão associadas aos filamentos intermediários
de citoqueratina. Diferentemente das caderinas clássicas, interações heterofílicas entre
desmocolinas e desmogleinas foram demostradas em ensaios de adesão celular (THIERY,
2003).
Foram identificadas 23 caderinas clássicas, sendo que as mais representativas e
estudadas são E-, N- e P-caderinas (RAMBURAN; GOVENDER, 2002). A função adesiva
das caderinas depende da associação com proteínas citoplasmáticas, denominadas cateninas
(α-, β-, γ-catenina), que ligam o domínio terminal citoplasmático da caderina ao citoesqueleto
de actina (BÀNKFALVI et al, 2002b).
Conexões de junções celulares e junções adesivas ao citoesqueleto de actina permitem
a manutenção da polaridade celular e arquitetura celular (HARINGTON; SYRIGOS, 2000;
JAWHARI; PIGNATELLI; FARTHING, 1997). A ligação entre as caderinas e os filamentos
de actina do citoesqueleto é necessária para constituir forte adesão, localizada em junções
aderentes célula-célula, sendo mediada pelas cateninas (SHIOZAKI et al, 1996).
2.3 E-Caderina
As caderinas compõem a família de moléculas de superfície celular, intimamente
relacionadas, que necessitam de cálcio e temperaturas fisiológicas para estabelecer a adesão
célula-célula. A E-caderina é uma glicoproteína transmembrana, responsável pela polaridade
celular epitelial, diferenciação glandular e estratificação epitelial. O gene CDH1, localizado
no cromossomo 16q22.1, codifica a E-caderina, que é sintetizada por um RNAm 4.5-kb,
encontrando-se madura na forma de uma glicoproteína de membrana com 120kDa.
(BRACKE; VAN ROY; MAREEL, 1996; MAREEL; BRACKE; VAN ROY, 1995).
36
As moléculas de E-caderina formam dímeros na superfície celular, que se ligam a
outras moléculas de E-caderina nas células epiteliais adjacentes resultando na formação de
adesão celular com uma conformação de “zippers” (JAWHARI; PIGNATELLI; FARTHING,
1997; HARINGTON; SYRIGOS, 2000). O domínio extracelular da E-caderina, localizado na
parte N-terminal da molécula, é composto por cinco domínios - EC1 a EC5 (ALATTIA;
KURAKAWA; IKURA, 1999; CAILLIEZ; LAVERY, 2005; HIROHASHI; KANAI, 2003).
As conexões entre esses domínios são estabilizadas por pontos específicos de íons Ca+ entre
pares de domínios consecutivos (PATEL et al, 2003). As ligações através de íons Ca
protegem as caderinas contra proteólise, podendo haver colapso da estrutura das caderinas na
ausência de Ca
2+
(CAILLIEZ; LAVERY, 2005; KOCH; MANZUR; SHAN, 2004).
Enquanto os domínios extracelulares da E-caderina estão ocupados por interações
homofílicas, os domínios citoplasmáticos servem como encaixes para a ligação intracelular e,
também de elo entre caderinas e o citoesqueleto da célula (KOCH MANZUR; SHANAL,
2004). O domínio intracelular encontra-se ligado aos filamentos de actina, via β-catenina ou
placoglobina, que interage diretamente com uma região de 30 aminoácidos na parte C-
terminal do domínio citoplasmático da caderina, sendo dependente de catenina p120, a qual
parece não ter um papel estrutural no complexo juncional (WHEELOCK; JOHNSON, 2003).
A E-caderina interage de maneira homofílica (com uma segunda molécula de E-
caderina) e homotípica (com uma célula do mesmo tipo) (MAREEL; BRACKE; VAN ROY,
1995). Aken et al (2001) esclarecem que as interações homofílicas da parte extracelular da E-
caderina medeiam adesão célula-célula, principalmente homotípicas, mas também acontecem
de maneira heterotípica (melanócitos ou células dendríticas a ceratinócitos). Interações
heterofílicas-heterotípicas ocorrem entre a E-caderina das células epiteliais e a integrina α
E
β
7
na superfície de linfócitos T, mediando a retenção de linfócitos no epitélio (CROSS; BURY,
2003; FARMER et al, 2001; MAREEL; LEROY, 2003).
A expressão da E-caderina é essencial na organização precoce do desenvolvimento
embrionário e, consequentemente, é uma das primeiras moléculas de adesão que os seres
humanos expressam (FREEMONT, 1998). Essa proteína não está somente envolvida em
processos de reconhecimento e adesão célula-célula, mas também na indução da polaridade
celular (BRACKE; VAN ROY; MAREEL, 1996).
A expressão normal e função da E-caderina são essenciais para a indução e
manutenção de epitélio polarizado e diferenciado, durante o desenvolvimento embrionário e
manutenção do epitélio (RAMBURAN; GOVENDER, 2002). A perda da E-caderina causa
distúrbio na polaridade e adesão celular facilitando a metástase de células tumorais,
37
favorecendo então a translocação da β-catenina para dentro do núcleo, evento necessário para
induzir a expressão de genes que promovem a proliferação celular (CONACCI-SORRELL;
ZHURINSKY; BEM-ZE’EV, 2002). O complexo E-caderina/β-catenina intacto é necessário
para a manutenção da adesão intercelular normal (BÁNKFALVI et al, 2002a).
Ao estudarem a expressão da E-caderina em mucosa oral normal obtida da região de
terceiro molar permanente submetido à remoção cirúrgica ou de palato adjacente a tumor
benigno, Downer e Speight (1993) observaram o seu padrão de imunopositividade em
distribuição pericelular através das camadas basal, suprabasal e espinhosa. Houve forte
marcação pericelular nas camadas basal, suprabasal e espinhosa, estando a expressão leve ou
ausente em ceratinócitos basais e ausentes nas camadas ceratinizantes superficiais. Embora o
padrão na distribuição de marcação fosse o mesmo em todos os cortes examinados, houve
variação em intensidade.
Geralmente, a análise imuno-histoquímica utilizando-se anticorpos específicos para E-
caderina, mostra uma positividade homogênea em tecido epitelial normal e em tumores
benignos, no entanto em tumores malignos, a expressão é heterogênea, com alterações
quantitativas e qualitativas de marcação (MAREEL; BRACKE; VAN ROY, 1995).
Segundo Cavallaro e Christofori (2001), a perda da E-caderina é suficiente para
promover às células tumorais a capacidade de atravessar a lâmina basal e invadir os tecidos
circunvizinhos, favorecendo a invasão tumoral. Existem múltiplos mecanismos onde a
redução na expressão da E-caderina leva à invasão tumoral aumentada (WONG;
GUMBINER, 2003).
Após extensa revisão de literatura, Shiozaki et al (1996) concluíram que há três
mecanismos propostos sobre a inativação do sistema de adesão mediado por caderina em
cânceres humanos. O primeiro consiste na baixa regulação da expressão da E-caderina e em
sua mutação gênica; o segundo está associado com a anormalidade ou deleção de cateninas,
inclusive a ausência de α-catenina e, o terceiro, relaciona-se com modificações bioquímicas,
tal como a fosforilação de β-catenina. Hirohashi (1998) acrecenta que a inativação do sistema
de adesão celular mediado por E-caderina pode ser resultado de múltiplos mecanismos,
incluindo eventos genéticos e epigenéticos, que desempenham papel significativo desde os
estágios inicias até os avançados da carcinogênese. Assim, a inativação do sistema de adesão
mediado pela E-caderina pode ocorrer devido à expressão reduzida, como resultado de
alteração genética e por fosforilação de β-catenina (AKEN et al, 2001).
Alterações genéticas do gene E-caderina estão envolvidas não somente em eventos
carcinógenos tardios de invasão e metástase, mas também ocorrem em estágios iniciais do
38
desenvolvimento tumoral. A disfunção do gene E-caderina resultam em dois mecanismos: a
combinação de perda de um alelo e a mutação do alelo remanescente, como acontece nos
genes supressores tumorais (HIROHASHI, 1998). Dentre os processos genéticos, Harington e
Syrigos (2000) incluem a supressão ou mutação do gene E-caderina, translocação e perda de
alelo no cromossomo 16q. Além disso, Graziano et al (2004) mencionam que a
hipermetilação na região promotora do gene de E-caderina parece ser o segundo evento que
inativa o CDH1.
Metilalação da ilha CpG ao redor da região promotora foi considerado o possível
mecanismo de inativação do gene E-caderina em cânceres humanos. A hipermetilação do
DNA consiste no mecanismo epigenético acompanhado pelo aumento da expressão de DNA
metiltransferase, que leva a redução de expressão da E-caderina e consequentemente, dano na
adesão celular e destruição da morfologia tecidual (HIROHASHI, 1998).
Em tecidos normais, a metilação da ilha CpG está limitada a situações excepcionais,
durante a embriogênese (GRAZIANO et al, 2004). O DNA metilado é, geralmente,
encontrado em regiões silenciosas dos cromossomos e a hipermetilação das ilhas CpG na
região promotora dos genes levam ao silêncio transcricional. Esse mecanismo da baixa
expressão ocorre em vários genes supressores tumorais tais como o CDH1. Mutações em
CDH1, sem perda de heterozigosidade no lócus CDH1, são sugestivos de hipermetilação.
Com a mutação em um alelo CDH1, a hipermetilação se constitui na segunda etapa
eliminando a expressão da E-caderina (AKEN et al, 2001).
Outro processo que contribui para inativação do sistema E-caderina é a aberrante
fosforilação envolvendo membros do complexo caderina-catenina. A fosforilação de
cateninas inicia-se pelo fator de crescimento epidérmico (EGF), o qual induz interações
indiretas entre a β-catenina e o produto do gene c-erbB-2. Esta aberrante fosforilação consiste
em um mecanismo não-mutacional do sistema E-caderina, onde β-catenina se liga à proteína
c-erbB-2 ou outro receptor-tipo tirosina quinase, e não à caderina (HIROHASHI, 1998).
Segundo Davis, Ireton e Reynolds (2003), a perda da E-caderina ocorre,
freqüentemente, através de mutação e por mecanismos epigenéticos, que provavelmente não
envolvem p120. A molécula p120, com homologia estrutural a β- e γ-catenina, se liga
diretamente ao domínio citoplasmático da E-caderina e pode ser fosforilada em resposta a
estimulação de vários fatores de crescimento, tais como EGFR e c-erbB-2 (HARINGTON e
SYRIGOS, 2000) A catenina p120 (p120
CTN
) é um membro da grande sub-família da
proteínas Armadillo codificadas pelo gene CTNND1 no cromossomo 11q11. (AKEN et al,
2001).
39
Nos relatos de Aken et al (2001) constata-se que, a perda de expressão da E-caderina
em células malignas pode estar associada com o ganho de expressão de N-caderina, levando
ao fenótipo fibroblástico com motilidade e potencial invasivo aumentados in vitro e in vivo. A
expressão de E- e N-caderina está inversamente regulada em células de carcinoma
epidermóide. Quando N-caderina foi transferida para células malignas, a expressão da E-
caderina diminuiu, enquanto a expressão de N-caderina foi diminuída através da introdução
de um antídoto, que aumenta a expressão da E-caderina. A expressão de N-caderina em
células malignas as tornam fusiformes e com mais motilidade, invadindo mais facilmente a
matriz extracelular, além de aderir dinamicamente a outras células que expressam N-caderina,
tais como os miofibroblastos e células endoteliais.
Segundo Cavallaro, Schaffhauser e Christofori (2002), a progressão da malignidade
tumoral envolve alterações na capacidade da célula tumoral aderir e comunicar-se com as
células vizinhas bem como com o meio extracelular, estando à perda da molécula de adesão
E-caderina ocasionalmente envolvida na formação de cânceres de origem epitelial. Os autores
acrescentam que a função da E-caderina durante a progressão tumoral é substituída ou até
superregulada pela expressão de caderinas mesenquimais, tais como N-caderina, sugerindo
que a alteração na expressão das caderinas pode não somente modular a adesão celular
tumoral, mas também afetar o fenótipo de malignidade.
Christofori e Semb (1999) evidenciam que embora já tenha sido demonstrado o papel
da E-caderina na supressão da invasão tumoral, ainda não está esclarecido se a perda desta
molécula de adesão é um pré-requisito para a invasão tumoral ou se é uma conseqüência da
desdiferenciação durante a progressão do tumor.
Alberts et al (1997) esclarecem que a perda de adesão às células vizinhas de um
epitélio depende da perda de expressão da molécula de E-caderina. No entanto, a capacidade
de invasão, através dos tecidos, parece estar associada à produção de enzimas proteolíticas,
que podem digerir a matriz extracelular.
Snail, um membro da família de proteína multi-zinco de fatores de transcrição, é um
forte repressor de CDH1, interagindo especificamente com E-boxes no promotor de E-
caderina e, então, reprimindo a transcrição de CDH1. A Snail é expressa em fibroblastos, em
algumas linhagens de células E-caderina deficientes e em regiões invasivas de carcinomas,
causando a transição de um fenótipo epitelial para um fenótico fibroblástico. (MAREEL;
LEROY, 2003). A transfecção de RNAm snail antisense foi capaz de restaurar a expressão da
E-caderina em cultura de células tumorais pancreáticas. (WHEELOCK; JOHNSON, 2003).
40
O receptor transcricional snail também está associado na transição de epitélio para
mesênquima (EMT) durante o desenvolvimento embrionário. Consistindo em um forte
repressor que interage especialmente na região promotora de E-caderina, reprimindo a
transcrição de E-caderina, causando EMT e invasão. Enquanto, durante a transição
mesenquinal para epitélio (MET), ocorre o ganho de expressão da E-caderina. (AKEN et al,
2001).
2.4 β-Catenina
O complexo das cateninas consiste na α-catenina (102kDa, cromossomo 5q), β-
catenina (92 kDa, cromossomo 3p) e γ-catenina (83 kDa, cromossomo 17q). (Harington;
Syrigos, 2000). O gene CTNNB1 codifica a β-catenina, estando localizado no cromossomo
3p21 (AKEN et al, 2001).
As cateninas incluem quatro membros: alfa-, beta-, gama-catenina e p120. Há dois
distintos complexos de E-caderina que podem ser encontrados na mesma célula: um composto
por E-caderina, α- e β-catenina e outro por E-caderina, α- e γ-catenina. A p120 não interage
com a α-catenina e não ocupa o lugar da β- e γ-catenina na ligação entre E-caderina e α-
catenina. Provavelmente, a E-caderina apresenta dois distintos epítopos de ligação no domínio
citoplamático, um associado a β- ou γ-catenina e outro associado a p120 (BRACKE; VAN
ROY; MAREEL, 1996, LO MUZIO et al, 2002; THORESON; REYNOLDS, 2002). A
catenina p120 estabiliza a E-caderina através de mecanismo ainda não estabelecido (DAVIS;
IRETON. REYNOLDS, 2003).
A β-catenina foi originalmente descrita como um elemento do complexo
caderina/catenina. Todavia, agora é também descrito como elemento da via da sinalização
Wnt (wingless/wnt). Em células normais, a β-catenina está associada não somente com
caderinas, mas também com um complexo multi-proteína APC (adenomatous polyposis coli),
que normalmente é fosforilada por proteína quinase tirosina serina GSK (quinase sintase
glicogênio)- 3β e degradada por mecanismo de protease (AKEN et al, 2001; CHRISTOFORI;
SEMB, 1999; GEORGE; DWIVEDI, 2004).
A estrutura da β-catenina é composta por duas regiões terminais: N- e C-. A primeira
região contém sítios de fosforilação para GSK-3β, enquanto a segunda região possui a função
de transativador de genes alvo. A região central contém 12 sequências de 42 aminoácidos
conhecidos como repetições armadillo, que são necessários para a interação com várias
41
proteínas, incluindo caderinas, APC e fator linfóide/LEF e fator de célula T/ TCF
(AKIYAMA, 2000).
A estrutura da β-catenina é similar a proteína Armadillo de Drosophila, um elemento
importante no mecanismo de sinalização Wnt-Wingless. Wingless é uma via de sinalização
célula-célula em Drosophila, que está associado a processos de desenvolvimento e Wnt
consiste na molécula análoga em vertebrados (HIROHASHI, 1998; HIROHASHI; KANAI,
2003; JAWHARI; PIGNATELLI; FARTHING, 1997). Wnt é um fator de crescimento
extracelular associado à matriz, que interage com seu receptor, um membro da família
frizzled, para iniciar o mecanismo de transdução de sinal que estimula a síntese de proteínas
envolvidas no crescimento celular. O papel da β-catenina nesse mecanismo é de se ligar a
membros da família TCF/LEF de fatores de transcrição, funcionando como um co-ativador
(WHEELOCK; JOHNSON, 2003). Receptores para as proteínas Wnt são membros da família
frizzled de proteínas transmembrana e a sinalização Wnt é emitida para as proteínas
citoplasmáticas Dishevelled (Dvl), que inibem a fosforilação da β-catenina no citoplasma
(AKIYAMA, 2000). No núcleo a β-catenina se liga a membros da família TCF/LEF de
fatores de transcrição e ativa a expressão de genes TCF/LEF alvo, que incluem os proto-
oncogenes c-Myc e ciclina D1 (AKIYAMA, 2000; CAVALLARO; CHRISTOFORI, 2001;
CLAPPER; COUDRY; CHANG, 2004; JANKOWSKI et al,1997;).
As cateninas podem formar um complexo com outras moléculas além da E-caderina:
no citoplasma, com o complexo adenomatous poloposis coli (APC), e na membrana
plasmática, com o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR). Acredita-se que esta
última interação seja uma ligação entre os sinais induzidos pelo EGF e a função da E-caderina
(BRACKE; VAN ROY; MAREEL, 1996).
A β-catenina exerce um duplo papel, sendo importante para a adesão celular mediada
por caderina, desempenhando também função chave na transdução de sinal mediada por Wnt.
A β-catenina é geralmente seqüestrada em complexos adesivos com E-caderina. Não
sequestrada, a β-catenina livre é rapidamente fosforilada por quinase sintase glicogênio 3β
(GSK-3β) no complexo adenomatous poloposis coli (APC)/GSK-3β/axin e,
subsequentemente, degradada pelo mecanismo ubiquitina-proteassomo. (CAVALLARO;
CHRISTOFORI, 2001; CLAPPER; COUDRY; CHANG, 2004). A proteína Axin interage
com Armadillo e APC, facilitando a interação da β-catenina com o GSK-3β para induzir a
ação da ligase ubiquitina (AKIYAMA, 2000).
De acordo com Mareel e Leroy (2003), mutações na β-catenina estão limitadas a
certos tipos de cânceres, ainda não tendo sido detectada mutação puntiforme do gene
42
CTNNB1 em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço e esôfago. Em lesões orais pré-
malignas, evidências sugerem que o gene APC pode estar alterado (WONG et al, 1996),
comprometendo as interações diretas entre as β- e γ- cateninas e o produto do gene supressor
tumoral APC (JAWHARI; PIGNATELLI; FARTHING, 1997).
A proteína APC mutante eleva a expressão de β-catenina no citoplasma, que
translocada para o núcleo, gera a superregulação da atividade transcricional do complexo β-
catenina-TCF e do mecanismo APC-β-catenina-TCF, críticos para a carcinogênese. O APC
desempenha papel essencial retirando a β-catenina desnecessária do citoplasma e a β-catenina
adquire atividade oncogênica quando está mutada ou quando está sobre-regulada como
resultado da inativação do APC (HIROHASHI, 1998). Existe um equilíbrio dinâmico entre o
complexo E-caderina/ β-catenina, β-catenina livre e complexos APC/β-catenina (JAWHARI;
PIGNATELLI; FARTHING, 1997).
A β-catenina pode ser submetida à fosforilação, em resposta a ligação com receptores
de fatores de crescimento tipo 1, tais como receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR) e produtos de oncogene c-erbB-2, ambos com atividade tirosina quinase.
(HARINGTON; SYRIGOS, 2000). Hirohashi e Kanai (2003) acrescentam que tanto β-
catenina quanto placoglobina interagem diretamente com o produto de gene c-erbB-2,
constituindo na primeira evidência da direta interação entre produtos oncogênicos e moléculas
de adesão celular. Essa interação permite que a β-catenina se ligue ao c-erbB-2 e não à
caderina, desempenhando um papel importante na invasão, metástase e morfogênese nas
células malignas.
Tamura et al (2003) demonstraram que a fosforilação da β-catenina altera a adesão
célula-célula em células epiteliais. Através de Western blotting, os autores mostraram que, em
estágios iniciais do câncer, a expressão de β-catenina é um marcador para malignidade
epitelial precoce e, por imuno-histoquímica, evidenciaram que a expressão elevada da β-
catenina nos compartimentos nuclear e citoplasmático está associada com a carcinogênese.
Uma vez no núcleo, a β-catenina se associa com membros da família de fatores de
transcrição de célula T/ fator linfóide (TCF/LEF) e resultam na ativação de uma série de
genes alvo, como os envolvidos na proliferação celular (ciclina D e c-myc), migração
(fibronectina) e proteólise (metaloproteinases – MMP7 e MT1-MMP) (GEORGE; DWIVEDI,
2004).
O promotor de c-Myc possui dois potentes sítios de ligação a TCF-4, sendo que os
complexos β-catenina/TCF-4 podem mediar a superexpressão de c-Myc. Os complexos β-
catenina/TCF interagem diretamente com regiões promotoras de c-jun e fra-1 causando a
43
superexpressão desses dois genes. O acúmulo de β-catenina também causa a superexpressão
de uPAR, que está envolvida na proteólise da matriz extracelular, processo importante na
invasão e metástase (LO MUZIO et al, 2002).
A β-catenina ativa a transcrição do promotor de cilina D1. As células caracterizadas
por β-catenina mutante produzem elevados níveis de RNAm de ciclina D1 e proteínas de
maneira constitutiva. Assim, a β-catenina é uma proteína multifuncional, que é importante na
formação de junções adesivas, migração celular e transdução de sinais (LO MUZIO et al,
2002).
Dessa forma, a β-catenina está envolvida em dois processos aparentemente
independentes: adesão celular e transdução de sinal. Além de seu papel na adesão celular
mediada por E-caderina, a β-catenina constitui um co-fator na via de sinalização Wnt
(wingless) e em alvo para produto do gene adenomatous polyposis coli (APC), que está
envolvido na iniciação de diversos cânceres humanos (BÁNKFALVI et al, 2002a).
2.5 Complexo E-caderina/β-catenina em carcinomas
Segundo Nollet, Geert e van Roy (1999), a redução na expressão da E-caderina está
relacionado a vários tipos de cânceres, sendo considerada como um dos eventos moleculares
envolvidos na disfunção do sistema de adesão celular, provocando invasão e metástase
(PEÉINA-ŠLAUS, 2003).
Ghadimi et al (1999) analisaram a expressão da E-caderina, α-, β- e γ-catenina em
diferentes estágios clínicos de tumores colorretais, através da imuno-histoquímica.
Verificaram redução na expressão da E-caderina em 44% dos tumores (40/91) e α-catenina
em 36% dos casos (33/91), sendo essa alteração simultânea em 21% dos casos (19/91). A
expressão de γ-catenina estava reduzida em 15% dos casos (14/91), enquanto a β-catenina
estava mais estável, com alteração em somente 4% dos tumores investigados (4/91). Também
não encontraram correlação entre a expressão da E-caderina e das cateninas com a
profundidade de invasão. Entretanto, correlação significativa foi encontrada entre gradação
tumoral e perda da E-caderina ou de α-catenina. Em contraste, a expressão de β- e γ-catenina
estava normal na maioria dos casos, sem correlação significativa entre expressão reduzida e
gradação tumoral. Os autores defenderam que os níveis elevados de β-catenina podem ser
importantes no mecanismo de sinalização em células neoplásicas, no entanto, recomendaram
mais estudos sobre a interação da β-catenina mediando a adesão celular e os mecanismos de
sinalização.
44
Castro et al (2000) realizaram estudo imuno-histoquímico e análise de DNA das
proteínas β-catenina, p53, E-caderina, bcl-2 e Ki-67 em 39 carcinomas epidermóides de
esôfago e observaram reduzida expressão em membrana para β-catenina em 20 casos (51%) e
para E-caderina em 30 casos (77%) casos, havendo somente 8 casos apresentando expressão
de ambas as proteínas preservada em membrana. Concluíram que o papel da β-catenina em
carcinoma epidermóide ainda não está esclarecido, no entanto, evidenciaram que os resultados
sugeriram possível envolvimento da β-catenina na carcinogênese nos tumores estudados.
Tendo por objetivo entender melhor o envolvimento das alterações da E-caderina e β-
catenina na carcinogênese em câncer gástrico, Huiping et al (2001) estudaram 50 tumores,
através de análise de perda de heterozigosidade (LOH), detecção de transcrição aberrante,
mutação genética e pela imuno-histoquímica. Detectaram elevada freqüência de LOH no
locus de E-caderina (75%), mutação A592T do exon 12 em 6% dos casos e RNAm aberrante
em 18% dos casos. Ainda verificaram redução na expressão da E-caderina em 42% dos casos
e da β-catenina em 28%, sendo encontrada associação significativa entre a expressão reduzida
ou negativa da E-caderina e da β-catenina, assim como entre a expressão reduzida da E-
caderina e o histotipo difuso. Assim, os autores concluíram que as alterações da E-caderina e
da β-catenina participam na iniciação e progressão do câncer gástrico, sendo que a expressão
de ambos os genes estão reduzidos nestes casos, no entanto, o mecanismo de sub-regulação
não está esclarecido.
Pukkila et al (2001) estudaram a expressão imuno-histoquímica da α-catenina, β-
catenina e γ-catenina em 138 carcinomas epidermóides da orofaringe e hipofaringe, sendo
também registrada a presença de imunomarcação nuclear para a β-catenina. Os resultados
mostraram expressão reduzida para a α -catenina em 57 (49%) casos, em 32 (28%) para β-
catenina e em 30 (26%) para γ-catenina. A expressão nuclear da β-catenina foi evidenciada
em 27 (23%) dos carcinomas. A análise de variância mostrou que os pacientes com expressão
nuclear apresentaram menor sobrevida do que os com a ausência da referida imunomarcação.
Os autores sugeriram que a expressão nuclear da β-catenina como indicador de menor
sobrevida dos pacientes com carcinoma de faringe, podendo ser utilizada como um marcador
prognóstico.
A expressão imuno-histoquímica da E-caderina e cateninas em carcinoma colorretal
foi estuda por El-Baharawy et al (2001) em uma amostra de 30 casos. Os autores observaram
considerável heterogeneidade na intensidade de marcação das moléculas entre os tumores e
dentro do mesmo tumor, havendo correlação positiva entre a sua expressão membrana e a
diferenciação tumoral. A E-caderina em membrana estava reduzida em somente 2 (7%) dos
45
30 carcinomas, enquanto a β-catenina em 9 casos (30%). Todos os carcinomas mostraram
aumento na expressão citoplasmática para β-catenina, enquanto a expressão nuclear da β-
catenina foi observada em 28 casos (93%), estando mais evidente no front invasivo.
No intuito de determinar se as mutações em E-caderina desempenham algum papel no
desenvolvimento tumoral, Kremer et al (2003) investigaram, através de células
carcinomatosas em camundongos imunodeficientes, a expressão da E-caderina mutada
(deleções nos exons 8 e 9 e mutação puntiforme no exon 8 - del 8, del 9 e p8) e selvagem
(wt) na formação tumoral e metástase. Os autores observaram que as células que expressaram
E-caderina del 8 induziram tumores de tamanho similar às células que expressaram E-
caderina selvagem, no entanto, as células E-caderina del 9 e p8 induziram tumores maiores. A
incidência de metástase em fígado foi de 60% dos casos del 8 e del 9 e em 100% dos casos
p8, sendo que todos os tumores metastáticos foram negativos para E-caderina. Concluíram
que os tumores apresentaram padrão de expressão heterogêneo para E-caderina, o que indica
perda ou sub-regulação da E-caderina durante o desenvolvimento tumoral, podendo promover
a disseminação e metástase, quando as células perdem todas as características epiteliais.
Kowalski, Rubin e Kleer (2003) investigaram a expressão da E-caderina em
carcinomas primários de mama e suas metástases distantes, não nodais, de 30 pacientes, no
intuito de determinar e comparar o padrão de expressão. Em tumores primários, 55% dos
carcinomas apresentaram expressão normal da E-caderina e aberrante em 45% dos casos. Em
metástases distantes, a expressão da E-caderina foi normal em 70% dos casos e aberrante em
30%. Quando comparada a intensidade de marcação, todas as células malignas metastáticas
mostraram expressão da E-caderina com intensidade igual ou maior do que em seus
correspondentes tumores primários. Os resultados deram suporte a hipótese de que a re-
expressão da E-caderina pode desempenhar um papel no estabelecimento de células
metastáticas em sítios distantes.
Lee et al (2003) analisaram a expressão de β-catenina em neoplasias ovarianas e
correlacionaram sua expressão nuclear com gradação histológica e sobrevida dos pacientes. A
amostra constou de 47 carcinomas de baixo grau e 48 de alto grau, além de linhagens de
células, que foram utilizadas para avaliar o papel funcional da β-catenina “in vitro”. Os
resultados mostraram expressão nuclear de β-catenina em 23% dos tumores de alto grau e em
2,1% dos de baixo grau de malignidade, havendo diferença significativa para a expressão
nuclear, enquanto para marcação em membrana ou citoplasma não foi detectada diferença
estatística. Os autores defendem que um dos mecanismos para a tumorigênese consiste na
46
ativação do mecanismo β-catenina/TCF, como demonstrado através da significativa
correlação entre a localização nuclear da β-catenina e a elevada gradação histológica tumoral.
Rocha et al (2003) avaliaram o perfil de expressão de E-, P- e N-caderinas com α-, β- e
γ-cateninas em uma série de carcinomas pobremente diferenciados de tireóide, no intuito de
compreender a sua patogênese. A amostra constou de 17 casos que foram analisados
conforme a intensidade e localização da imunopositividade. Nenhum dos casos de carcinomas
indiferenciados apresentou expressão em membrana para E-caderina, com expressão
citoplasmática em somente 02 casos. Quanto à β-catenina, na maioria dos casos houve forte
expressão, com padrão heterogêneo e ausência de marcação nuclear. Mutações nos genes da
β-catenina e da E-caderina não foram detectados. Para os autores, esses achados indicam que
a perda progressiva da E-caderina parece ser um evento mais importante na determinação do
grau de diferenciação de carcinoma tireoideanos do que as alterações na β-catenina.
Objetivando determinar se o polimorfismo é um biomarcador para o risco e
agressividade em neoplasias malignas, Tsukino et al (2003) estudaram o efeito do
polimorfismo do gene E-caderina na susceptibilidade a cânceres uroteliais (bexiga, rins e
ureter), através de um estudo caso-controle envolvendo 314 pacientes teste e 314 controle.
Observaram que a freqüência de pacientes com o genótipo E-caderina A/A estava
significativamente mais elevado nos casos de cânceres uroteliais do que nos saudáveis. No
entanto, não encontraram associação do polimorfismo com desdiferenciação e invasão
tumorais, assim como entre polimorfismo e recorrência. Concluíram que o genótipo E-
caderina A/A pode estar associado com a susceptibilidade à doença, mas, não à sua
progressão, ratificando que o gene de E-caderina atua como um gene supressor tumoral.
Julkunen et al (2003) analisaram a expressão imuno-histoquímica das α-, β-, e γ-
cateninas e compararam com os aspectos clínico-patológicos e a sobrevida de pacientes com
câncer pancreático. Observaram que a expressão da α-catenina e β-catenina estava
correlacionada com a gradação histológica tumoral. Evidente tendência entre a reduzida
expressão de todas as cateninas e a pobre sobrevida também foi detectada, embora sem
significância estatística. A análise de multivariância revelou que os fatores presença de
metástase nodal e expressão anormal da β-catenina são fatores prognósticos independentes
para a sobrevida desses pacientes. Concluíram que a expressão reduzida das cateninas parece
estar relacionada à pobre sobrevida dos pacientes com câncer pancreático e, especialmente, a
expressão da β-catenina pode apresentar valor prognóstico.
Graziano et al (2004) investigaram a hipermetilação do promotor do gene CDH1 e sua
correlação com a expressão da proteína E-caderina em 70 casos de carcinomas gástricos.
47
Observaram esta hipermetilação em 20 casos, tendo esta alteração epigenética ocorrido em 19
dos 24 casos com expressão alterada da proteína E-caderina, tanto em estágios iniciais bem
como nos casos avançados da doença. Concluíram que a hipermetilação do promotor do gene
CDH1 ocorre em carcinomas gástricos, estando significativamente associada com a baixa
expressão da E-caderina. Dessa forma, os autores sugeriram que o conhecimento sobre
hipermetilação de genes supressores tumorias pode ser relevante para o desenvolvimento de
drogas dimetilizantes, como modelo de estratégias quimiopreventivas em tumores sólidos.
No intuito de avaliar a localização da proteína β-catenina e a expressão de RNA-m de
β-catenina e c-Myc, Seidler et al (2004) estudaram 101 casos de adenocarcinomas,
correlacionando seu padrão de expressão com a idade do paciente e características patológicas
de carcinoma colorretais. Observaram que o tecido neoplásico apresentou padrão de
expressão heterogêneo para a β-catenina, com diminuição de expressão em membrana em
55% das lesões, enquanto a expressão citoplasmática estava presente em todas os casos,
embora, com intensidade variável. A expressão nuclear foi detectada em 80% das lesões,
sendo mais freqüente em pacientes com mais de 70 anos, havendo correlação entre a
expressão nuclear e a idade do paciente, a qual não foi observada quanto à localização
citoplasmática e em membrana. A expressão de RNAm c-Myc estava fortemente
correlacionada com a expressão nuclear da β-catenina, havendo significativa correlação entre
a expressão de RNAm de β-catenina e c-Myc. Os autores defenderam que existe um padrão
variável de expressão de β-catenina nuclear e RNA-m de c-myc como a idade elevada (70-85
anos) e estes componentes podem influenciar no comportamento biológico dos carcinomas
colorretais.
Van de Putte et al (2004) descreveram a expressão das proteínas E-caderina, α-, β- e γ-
catenina em 219 casos de carcinoma epidermóide de colo uterino, no intuito de determinar o
seu valor prognóstico. Observaram que em epitélio escamoso normal, a expressão dessas
proteínas em membrana estava em mais de 50% das células, enquanto a marcação
citoplasmática foi detectada em 5-50% das células. Nos tumores, a expressão em membrana
da E-caderina estava reduzida em 90% dos casos (198/219), enquanto para α-catenina em
70% (154/219), β-catenina em 72% (157/219) e γ-catenina em 83% dos casos (181/219). A
expressão citoplasmática de α-catenina estava elevada em 94% dos tumores (206/219), de β-
catenina em 75% dos casos (165/219) e de α-catenina em 94% dos casos (205/219). Todas as
cateninas estavam significativamente relacionadas à expressão da E-caderina em membrana,
entretanto, não encontraram relação entre os dados imuno-histoquímicos e os
clinicopatológicos, tais como recidiva, metástase e sobrevida. Concluíram que as moléculas
48
de adesão E-caderina, α-, β- e γ-catenina estão subexpressas em carcinomas epidermóides, no
entanto, nenhuma das proteínas investigadas estava associada com o prognóstico.
Com o objetivo de avaliar a expressão da E-caderina e da β-catenina na evolução do
carcinoma de células escamosas, Lyakhovitsky et al (2004) realizaram um estudo imuno-
histoquímico com essas moléculas de adesão em carcinomas epidermóides cutâneos e seus
precursores: elastose solar e queratose solar, dentre este último grupo estavam os carcinomas
in situ. Os resultados mostraram haver associação entre a morfologia e a expressão da E-
caderina e da β-catenina, havendo contínua diminuição na expressão destas moléculas de
adesão indo da pele para o carcinoma epidermóide, sendo mais elevado o percentual de
células imunopositivas nos casos bem diferenciados comparado com os moderados e os
pobremente diferenciados. A expressão citoplasmática da β-catenina foi detectada em 63%
dos carcinomas (19/30). Concluíram que o carcinoma epidermóide cutâneo é um processo
contínuo, não somente na morfologia, mas também a nível molecular, estando o complexo E-
caderina/β-catenina envolvido na carcinogênese dos tumores epiteliais.
Rakha et al (2005) observaram, em 1516 casos de carcinomas de mama, que a redução
de expressão da E-caderina estava associada com o tamanho do tumor primário, a gradação
histológica, a recorrência local e regional e com o desenvolvimento de metástases distantes.
Não encontraram associação entre a expressão da E-caderina com a idade do paciente nem
com a metástase nodal. Segundo esses autores, a reduzida expressão da E-caderina estava
fortemente relacionada com o desenvolvimento de metástases distantes, o qual estava
significativamente associado com a sobrevida do paciente. Concluíram que esses achados
mostraram evidências que a E-caderina é um biomarcador potencial no prognóstico da
recorrência, do desenvolvimento de metástases distantes e da sobrevida do paciente.
2.6 Complexo E-caderina/β-catenina em carcinoma epidermóide oral
Schipper et al (1991) investigaram a expressão da E-caderina em 32 carcinomas
epidermóides de cabeça e pescoço, comparando tal expressão com a diferenciação
histolopatológica e metástase em linfonodos. Foi verificado que a expressão da E-caderina
estava inversamente relacionada com a perda de diferenciação do tumor e com metástase em
linfonodos. Os carcinomas bem diferenciados expressaram E-caderina de forma similar ao
epitélio normal, enquanto os moderadamente diferenciados mostraram uma baixa e
heterogênea expressão e nos casos pobremente diferenciados, ausência de expressão. Nos
linfonodos metastáticos, 7 dos 8 casos foram E-caderina negativos. Esses dados mostraram
49
que a perda da molécula de adesão E-caderina desempenha papel importante na progressão
dos carcinomas epidermóides humanos, estando sua baixa expressão associada com
indiferenciação e metástase de células tumorais in vivo.
Dower e Speight (1993) analisaram a expressão da E-caderina em epitélio oral normal
e neoplásico, visando relacionar sua expressão com o grau de diferenciação tumoral. A
amostra constou de 10 espécimes de mucosa normal, 5 de epitélio hiperproliferativo e 15
carcinomas epidermóides orais, cujos cortes foram submetidos à técnica da estreptoavidina-
biotina peroxidase e analisados subjetivamente quanto à expressão da E-caderina. A
distribuição da expressão da E-caderina em epitélio oral normal e hiperplásico foi similar em
todos os espécimes, independentemente se era orto ou paraceratinizado. No entanto, nos
carcinomas epidermóides orais examinados houve uma expressão com padrão heterogêneo
com áreas de perda da E-caderina. Não foi observada correlação entre o padrão de expressão e
a gradação histológica do tumor, sugerindo que a perda da E-caderina não é necessária para a
aquisição do fenótipo maligno, porém pode estar envolvido no processo infiltrativo.
Bowie et al (1993) realizaram um estudo em 28 pacientes com carcinoma de cabeça e
pescoço, no intuito de avaliar o papel da E-caderina na metástase. Para tanto, foram utilizados
23 tumores primários, sendo 4 metástases nodais correspondentes e 5 nódulos metastáticos,
cuja expressão da E-caderina foi correlacionada com o hospedeiro, tumor ou fatores de
tratamento (idade, sexo, condição sistêmica, localização, gradação histológica, estadiamento
clínico e sobrevida). Dentre os 32 espécimes, 16 foram positivos e 16 mostraram redução na
marcação para E-caderina, sendo que em quatro casos onde o tumor primário e
correspondente metástase foram analisados, não houve diferenças quantitativa ou qualitativa
na expressão da E-caderina. Por fim, sugeriram que a expressão da E-caderina não fornece
informações com valor clínico para tumores primários de cabeça e pescoço.
A expressão da molécula de adesão E-caderina foi estudada, imuno-
histoquimicamente, por Sato (1996) em 59 pacientes com carcinoma epidermóide oral, no
intuito de verificar se esse marcador pode apresentar valor indicativo para metástase em
linfonodos. Foi observado envolvimento de múltiplos linfonodos em 55,3% dos casos com
fraca expressão da E-caderina e em 83,3% no grupo E-caderina negativo. A expressão da E-
caderina não estava associada com o tamanho do tumor, no entanto a fraca expressão foi mais
observada nos casos pouco e moderadamente diferenciados e em tumores com invasão difusa.
Assim, concluíram que a análise da expressão da E-caderina é importante para predizer o
potencial metastático de carcinoma epidermóide oral.
50
No intuito de determinar a relação entre diferenciação patológica, classificação clínica
TNM e grau de expressão da E-caderina em carcinoma epidermóide oral, Yamada et al (1997)
analisaram seis casos de mucosa normal, 18 carcinomas e 2 linfonodos metastáticos. Os
resultados mostraram que nos carcinomas bem diferenciados (n=3) as células ceratinizantes
no centro dos ninhos tumorais não mostraram reação, mas as células periféricas foram E-
caderina imunorreativas. Os carcinomas moderadamente diferenciados (n=11) mostraram um
padrão variável de imunorreação, enquanto os poucos diferenciados (n=4) foram negativos,
demonstrando uma correlação estatisticamente significativa entre a perda da E-caderina e o
grau de diferenciação tumoral. Os linfonodos metastáticos mostraram ninhos tumorais com
células centrais E-caderinas reativas, apesar da ausência de expressão da E-caderina nos
tumores primários. Assim, os autores concluíram que a baixa regulação da E-caderina pode
estar associada com a lesão tumoral avançada e com a pobre diferenciação do carcinoma
epidermóide oral.
Bagutti, Speight e Watt (1998) investigaram a distribuição de integrinas, caderinas e
cateninas em carcinomas epidermóides orais com o intuito de comparar as alterações na
expressão das diferentes proteínas. Foram analisados 22 casos de carcinoma epidermóide oral,
sendo 19 tumores primários e 03 recorrências, cujos resultados mostraram uma correlação
entre a expressão da E-caderina e o grau de diferenciação tumoral, havendo redução da E-
caderina mais evidente nos tumores indiferenciados. A redução na expressão das cateninas
estava presente em todos os tumores, mas não havia evidência de regulação da expressão da
α-, β- e γ-catenina. Assim, a expressão reduzida de caderinas e integrinas constitui uma
característica de tumores pobremente diferenciados, enquanto a redução na expressão da
catenina foi observada em todos os tumores, independente do grau de diferenciação.
Lo Muzio et al (1999) avaliaram a expressão de β- e γ-catenina em 30 carcinomas
epidermóides orais com diversos graus de diferenciação celular, no intuito de analisar o papel
dessas proteínas no processo carcinogênico. Os resultados demonstraram elevada
percentagem de células tumorais com expressão para ambas as moléculas em 8 dos 12 casos
classificados como bem diferenciado. Nos casos enquadrados como moderadamente
diferenciado, nenhum caso mostrou expressão em membrana para β-catenina e em 8 dos 10
casos houve expressão em citoplasma para essa proteína, estando a expressão em membrana
totalmente ausente nos casos indiferenciados. Foi encontrada diferença significativa para a
perda de catenina em membrana, estando correlacionada com a diferenciação celular. De
acordo com os autores, a ausência de expressão de β- e γ-catenina poderia servir como um
marcador de comportamento biológico agressivo em tumores ainda bem ou moderadamente
51
diferenciados, especialmente no front de invasão, que é constituído por células tumorais
menos diferenciadas.
No intuito de avaliar se a expressão alterada de p53, pRb, ciclina D1, myc, bcl-2,
EGFR, neu, E-caderina, Ep-CAM e nm23 é relevante no fenótipo metastático, Takes et al
(2001) analisaram 54 tumores primários de cabeça e pescoço e seus respectivos nódulos
metastáticos. Os autores observaram que a maioria das proteínas mostrou padrão de expressão
similar em tumores primários e em suas metástases, havendo somente em poucos casos
discordância no padrão de expressão. Em 5 casos foi observada expressão reduzida da E-
caderina em metástases, quando comparadas com os respectivos tumores primários, enquanto,
9 casos metastáticos foram E-caderina positivos, sendo negativos nos tumores primários. Os
autores concluíram que não havia uma relação bem estabelecida entre a expressão da E-
caderina em tumores primários e em suas respectivas metástases nodais.
Chow et al (2001) realizaram um estudo com o objetivo de avaliar a expressão do
complexo de moléculas de adesão E-caderina-cateninas em carcinomas orais primários,
metástases e recorrência. A amostra constou de 85 espécimes cirúrgicos de carcinomas
epidermóides de língua, 09 linfonodos metastáticos e 07 tumores recorrentes, que foram
classificados pela gradação de Broders em bem (33%), moderadamente (59%) e pobremente
(8%) diferenciados, estando os pacientes em proservação mínima de 21 meses. Os resultados
mostraram baixa expressão da E-caderina, α-catenina, β-catenina e γ-catenina em,
respectivamente, 85%, 94%, 89% e 83% dos tumores primários. Não foi encontrada
correlação entre a expressão da E-caderina/cateninas com sexo, idade, estágio e diferenciação
tumoral, assim com entre E-caderina, α-catenina e β-catenina com metástase nodal. No
entanto, nos casos com fraca expressão de γ-catenina houve significativa ocorrência de
metástases nodais quando comparados aos de forte expressão. A análise de regressão múltipla
mostrou que somente o estadiamento TNM e a expressão da E-caderina eram fatores
prognósticos independentes para sobrevida. Assim, os autores concluíram que E-caderina e
cateninas apresentaram baixa expressão em carcinomas de língua e metástases nodais, sendo
que a γ-catenina possui valor indicativo para metástase nodal, enquanto E-caderina constitui
importante fator prognóstico para recorrência e sobrevida.
Yokoyama et al (2001) observaram, em linhagens de células de carcinoma
epidermóide oral, que a expressão da E-caderina estava correlacionada com a morfologia
celular. Os clones E-caderina positivos exibiam formato cuboidal, enquanto os clones E-
caderina negativos mostravam-se fusiformes e com maior capacidade invasiva, observados
52
através de ensaio de invasão e cultura tridimensional. Através do RT-PCR, detectaram baixa
regulação transcricional da E-caderina e expressão positiva de mRNA snail nas células E-
caderina negativas. A expressão de snail não foi detecta em ceratinócitos orais normais, sendo
considerado um repressor da E-caderina. Concluíram que a expressão de snail desempenha
um dos mais importantes papéis na aquisição de características invasivas e metastáticas em
CEO, alterando o fenótipo epitelial dessas células para mesenquimal.
No intuito de investigar o valor prognóstico da expressão imuno-histoquímica da E-
caderina, β-catenina e do receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR), Bànkfalvi et al
(2002a) analisaram 75 casos de carcinomas epidermóides orais primários e compararam com
a expressão em mucosa normal e/ou displásica adjacente ao tumor, metástase nodal (n=30) e
recorrência (n=12) dos mesmos casos. O estadiamento TNM, a sobrevida dos pacientes
(proservação média de 68 meses), a gradação histológica tumoral e do front de invasão foram
analisados. Os autores encontraram forte correlação entre a expressão da E-caderina e β-
catenina, mas não entre os dois e EGFR. No entanto, quando comparadas à mucosa adjacente
ao tumor, houve significativa baixa expressão da E-caderina e β-catenina e elevada de EGFR
nos carcinomas. Em relação à metástase nodal, houve significativa perda da E-caderina e
ausência de diferença do padrão de expressão da β-catenina, quando comparada ao tumor
primário. Porém, nas recorrências, houve predominante perda da E-caderina com expressão
heterogênea da β-catenina, sendo que a análise de multivariância mostrou que nenhuma das
moléculas de adesão estudadas apresentou valor prognóstico independente à sobrevida do
paciente, embora a E-caderina e a β-catenina pareçam inibir EGFR para conter a progressão
do carcinoma epidermóide oral.
Bànkfalvi et al (2002b) realizaram um estudo imuno-histoquímico comparativo
analisando CD44, E-caderina e β-catenina em carcinomas epidermóides orais primários,
mucosa adjacente não-neoplásica e/ou displásica, linfonodos metastáticos e recorrência.
Dados como estádio clínico TNM, gradação histológica do tumor e do front de invasão
tumoral e sobrevida livre de doença foram coletados de 93 pacientes com carcinoma
epídermóide de assoalho e/ou língua, sendo também estudados 30 casos de metástases e 12
recorrências. Os resultados mostraram diminuição estatisticamente significativa na expressão
das moléculas de adesão CD44v4, -v9, E-caderina e β-catenina nos tumores primários quando
comparados à mucosa normal. Houve perda da E-caderina e da β-catenina nas células
tumorais no front de invasão, sendo que em alguns carcinomas indiferenciados a E-caderina
estava negativa na membrana. A baixa expressão da β-catenina estava correlacionada de
53
forma significativa com metástase nodal, enquanto a diminuição da expressão do CD44v3 e
da E-caderina em tumores primários estavam correlacionados com um prognóstico
desfavorável. Assim, os autores sugeriram que existem alterações na expressão de moléculas
de adesão durante a carcinogênese oral e progressão tumoral, sendo que distintos fenótipos
indicam pobre prognóstico, enquanto outros predizem metástase.
Gasparoni et al (2002) analisaram a localização da β-catenina (membrana, citoplasma
ou núcleo) em cultura de ceratinócitos orais e de células malignas (SCC15 e SCC25) e
verificaram que a β-catenina estava localizada na membrana plasmática de células normais e
nas SCC15, estando ausente nas SCC25, com principal localização em áreas nuclear e
perinuclear. Nos cortes dos 24 casos de carcinoma epidermóide oral, a β-catenina mostrou-se
presente em membrana, citoplasma e núcleo, sendo que em somente dois carcinomas houve
expressão nuclear em pequenas ilhas epiteliais invasivas. Os autores concluíram que a β-
catenina intranuclear não parece ser um achado comum em carcinoma epidermóide oral, não
sendo possível estabelecer a relação entre a β-catenina intranuclear e a gradação
histopatológica de malignidade.
Com o objetivo de identificar marcadores prognósticos relevantes de metástases
nodais em carcinoma epidermóides de cabeça e pescoço, Takes et al (2002) analisaram a
expressão de diversas moléculas, dentre elas a E-caderina, em tumores primários de 121
pacientes. Observaram que a metástase nodal estava correlacionada com a perda de expressão
da E-caderina, próximo à significância estatística (p=0,06). Quando analisados os sítios
anatômicos, os autores não encontraram correlação nos cânceres de faringe, e nos localizados
em cavidade oral a expressão reduzida da E-caderina estava significativamente correlacionada
com a metástase nodal. Concluíram que a expressão de marcadores imuno-histoquímicos em
tumores primários fornece informações limitadas sobre o comportamento metastático do
tumor.
Tanaka et al (2003) realizaram um estudo imuno-histoquímico em 159 carcinomas
epidermóides orais primários, com o objetivo de esclarecer se a expressão da E-caderina, α-
catenina e β-catenina estava correlacionada com a existência de metástase em linfonodos. Os
autores observaram redução na expressão da E-caderina, α-catenina e β-catenina em
92(57,9%), 115(72,3%) e 114(71,7%) tumores, respectivamente. Não houve associação
significativa entre idade, sexo, sítio tumoral ou diferenciação histológica com a existência de
metástase em linfonodos, mas sim com o modo de invasão. Quanto à expressão imuno-
histoquímica, foi detectada significativa redução da E-caderina, α-catenina e β-catenina em
pacientes com metástase, os quais também apresentaram menor sobrevida do que os pacientes
54
com expressões preservadas. Por fim, concluíram que nos casos de carcinoma epidermóide
oral que desenvolveram metástases regionais, a expressão da E-caderina, α-catenina e β-
catenina estava reduzida, sugerindo a análise imuno-histoquímica destas proteínas para
predizer a presença de metástase.
Uma vez que não há recurso capaz de detectar micrometástases em linfonodos
cervicais e a sua detecção precoce aumenta a sobrevida do paciente, Lim et al (2004)
realizaram um estudo com o objetivo de encontrar marcadores capazes de predizer metástases
cervicais tardias em pacientes com carcinoma epidermóide oral (CEO). Para tanto, espécimes
emblocados em parafina de 56 pacientes com CE invasivo classe I e II localizados em língua
(T
1-2
N
0
M
0
) foram submetidos a análises histopatológica e imuno-histoquímica para diversos
biomarcadores moleculares, dentre estes E-caderina e β-catenina. Os autores encontraram
uma associação significativa entre a metástase cervical e a expressão da E-caderina, e entre
este e a gradação de Broders. A análise de regressão múltipla dos fatores clinicopatológicos e
biomarcadores moleculares revelaram que o modo de invasão, espessura tumoral e expressão
da E-caderina possuem valor prognóstico para metástase cervical tardia, sendo este último o
único fator independente para a sobrevida do paciente. Assim, sugeriram classificar os
pacientes em grupos de alto e baixo risco, estando aqueles com espessura tumoral maior que 4
mm, modo de invasão graus 3 e 4 e baixa expressão da E-caderina no grupo de alto risco para
o desenvolvimento de metástases cervicais tardias.
Chen et al (2004) estudaram 14 linhagens de células de CEO com o objetivo de
identificar o possível mecanismo responsável pela perda de expressão da E-caderina e
determinar se o promotor de metilação pode regular as trocas de caderinas. O imunoblotting
revelou que somente duas linhagens celulares (HOC-313 e HA-376) apresentaram elevada
expressão de N-caderina e nenhuma expressão da E-caderina, resultado confirmado pelo PCR.
A análise do DNA genômico mostrou que a perda de expressão da E-caderina nas duas
linhagens celulares não era devido à deleção do gene, no entanto, a técnica metilação-
específica PCR indicou extensa metilação da ilha 5’CpG no promotor do gene da E-caderina.
Após o tratamento com um inibidor de metilação de DNA (5-Aza-2-deoxycytidine), tanto no
imunoblotting quanto na imunofluorescência as células HA-376 expressaram E-caderina com
decréscimo na expressão de N-caderina, resultado também confirmado em RT-PCR
Multiplex. Desse modo, os autores concluíram que a metilação da ilha 5’CpG do promotor de
E-caderina regula a expressão deste receptor de adesão em CEO, estando a expressão de N-
caderina aparentemente superregulada após a perda de expressão da E-caderina através de um
mecanismo ainda desconhecido.
55
Kudo et al (2004) isolaram os clones altamente invasivos (MSCC-Inv1 e MSCC-Inv2)
de células de carcinoma epidermóide oral, usando ensaio de invasão in vitro, que mostraram
reduzida expressão da E-caderina e β-catenina em comparação com as células-mãe MSCC-1,
indicando que a perda da E-caderina desempenha papel importante na invasão tumoral.
Aberrante metilação do promotor de E-caderina foi demonstrada em células MSCC-Inv1 e
MSCC-Inv2, mas não em células mãe MSCC-1 através da técnica metilação-específica PCR
para E-caderina. A imuno-histoquímica revelou reduzida expressão da E-caderina em áreas
invasivas e elevada expressão em áreas não invasivas. Todos os 18 carcinomas metastáticos
mostraram redução da E-caderina em lesões nodais, de modo heterogêneo, sendo que a
metilação foi detectada em 13 dos 18 casos com expressão reduzida. Foi observada reduzida
expressão da β-catenina na membrana celular em áreas invasivas, não ocorrendo marcação
nuclear e somente três casos metastáticos demonstraram marcação citoplasmática da β-
catenina. Concluíram que a perda da E-caderina e β-catenina pode estar envolvida na invasão
e metástase de células de carcinoma epidermóide oral, sendo as células com metilação de E-
caderina e/ou com degradação da β-catenina, capazes de invadir e promover metástase.
Gasparoni et al (2004) realizaram um estudo sobre marcadores de diferenciação
celular, dentre esses, as moléculas E-caderina e β-catenina, em linhagem de células da
cavidade oral: normais e carcinomatosas (SCC15 e SCC25), empregando diversos métodos,
tais como a imuno-histoquímica e a análise de Western blot. Foi observado que a expressão da
E-caderina em células normais estava localizada na membrana plasmática, estendendo-se da
camada basal para as camadas superiores. No entanto, houve diminuição de intensidade em
linhagem de células de carcinoma epidermóide oral, com alguma marcação citoplasmática.
Expressão semelhante foi detectada para a molécula de β-catenina, ressaltando que as células
SCC25 mostraram fraca marcação membranosa ao contrário da expressão citoplasmática. Na
análise de Western blot, as células normais apresentaram níveis de E-caderina mais elevados
do que em células carcinomatosas, enquanto para β-catenina, não houve grande variações
entre os grupos estudados. Porém, as células SCC25 apresentaram níveis de β-catenina
levemente diminuídos. Sugerem os autores que a expressão da E-caderina se correlaciona com
alterações fenotípicas de diferenciação terminal em ceratinócitos, e que, quando comparados a
linhagem de células de carcinoma epidermóide oral, somente as células mais diferenciadas
mostraram níveis elevados de E-caderina.
Objetivando determinar o valor prognóstico das cateninas, Fillies et al (2005)
avaliaram a expressão imuno-histoquímica das α-, β- e γ-cateninas em 85 casos de carcinoma
de assoalho de boca. Observaram que de todos os tumores, 14 foram negativos e 71 positivos
56
para a expressão da β-catenina. A análise estatística mostrou que a expressão da β-catenina
estava associada com a ausência de metástase nodal. Correlação positiva entre a expressão da
β-catenina com a taxa de sobrevida elevada também foi detectada, refletindo um valor
prognóstico positivo, no entanto, sem relevância significativa. Concluíram que a expressão
das cateninas em carcinoma de assoalho de boca parece servir como um parâmetro no
prognóstico desses casos.
Diniz-Freitas et al (2006) avaliaram a expressão da E-caderina em 47 casos de
carcinoma epidermóide oral e investigaram a possível relação com a histologia tumoral, o
curso clínico e a sobrevida. Verificaram que a expressão da E-caderina não estava
significativamente associada com a localização do tumor primário, bem como com a presença
de metástase nodal no momento do diagnóstico e com o grau de diferenciação tumoral. Fraca
ou ausente expressão da E-caderina estava significativamente associada com a elevada
agressividade detectada no front de invasão tumoral. Concluíram que a reduzida expressão da
E-caderina em carcinoma epidermóide oral está associada com o comportamento tumoral
mais agressivo e com pior prognóstico.
Com o objetivo de investigar a imunomarcação em membrana para E-caderina, α-, β-,
e γ-cateninas em carcinoma epidermóide oral, Ueda et al (2006) realizaram a proservação de
135 pacientes por um período que variou de 4 a 14 anos. Observaram que a expressão
reduzida ou ausente para E-caderina, α-, e γ-catenina estava significativamente mais freqüente
nos casos pobremente diferenciados do que nos bem diferenciados. Os pacientes com a
expressão preservada da E-caderina, α-, β-, e γ-catenina mostraram melhor taxa de sobrevida
de 5 anos do que os com a expressão reduzida ou ausente destas moléculas. Ainda verificaram
que a expressão nuclear destas proteínas é raramente observada, sendo que não detectaram
relação entre a expressão citoplasmática e/ou nuclear da β-, ou γ-catenina com a sobrevida dos
pacientes com carcinoma epidermóide oral. Sugeriram que os casos com a expressão reduzida
ou ausente da β-, ou da γ-catenina deveriam ser selecionados para um tratamento mais
agressivo.
Kurtz et al (2006) avaliaram 45 casos de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
através do estudo imuno-histoquímico com os anticorpos para E-caderina e β-catenina. As
variáveis estudadas foram: sítio tumoral, estadiamento clínico, condição dos linfonodos
cervicais, diferenciação tumoral, invasão perineural e vascular. Observaram que a baixa
expressão da E-caderina estava significativamente associada com a baixa sobrevida e a
invasão vascular, não havendo associação com as demais variáveis clínicopatológicas. A
expressão da β-catenina não estava significativamente associada com nenhuma das variáveis
57
estudadas. Os autores sugeriram que a alteração na expressão da E-caderina pode contribuir
no prognóstico dos pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
58
PROPOSI
Ç
ÃO
59
3 PROPOSIÇÃO
Frente ao exposto na literatura, o objetivo dessa pesquisa foi analisar o padrão de
expressão imuno-histoquímica das proteínas E-caderina e β-catenina em carcinoma
epidermóide de lábio inferior e língua, correlacionando a expressão desses marcadores com a
localização anatômica da lesão, a presença de metástase nodal no momento do diagnóstico e a
gradação histológica de malignidade proposta por Bryne em 1998, visando contribuir para um
melhor entendimento do comportamento biológico dessa lesão.
60
MATERIAL E M
É
TODOS
61
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Caracterização do estudo
O presente trabalho consistiu numa pesquisa descritiva composta por estudo das
características clínico-morfológicas dos carcinomas epidermóides de língua e lábio inferior,
bem como, da análise imuno-histoquímica das moléculas E-caderina e β-catenina, a fim de
observar a existência de correlação entre o padrão de expressão dessas proteínas com a
localização anatômica tumoral, com a presença ou não de metástase nodal e com a gradação
histológica de malignidade proposta por Bryne em 1998.
4.2 População
A população utilizada consistiu do material histológico diagnosticado como carcinoma
epidermóide incluído em blocos de parafina, arquivado no Serviço de Citologia e Anatomia
Patológica do Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello.
4.3 Amostra
Para constituir a amostra desta pesquisa, foram selecionados 30 casos diagnosticados
como carcinoma epidermóide oral, sendo 15 casos de lábio inferior e 15 de língua, dos
arquivos do Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello, São Luís/MA.
4.4 Critérios de seleção da amostra
4.4.1.Critérios de inclusão
Foram incluídos na amostra os casos de carcinoma epidermóide localizados em lábio
inferior e língua, resultantes de tratamento cirúrgico, sem quimioterapia ou radioterapia
prévia, cujo material emblocado em parafina encontrava-se em quantidade suficiente para a
realização do estudo imuno-histoquímico e com a presença do front de invasão tumoral.
62
4.4.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos da amostra todos os casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior
e língua que não foram resultados de tratamento cirúrgico, bem como espécimes com pouco
material ou com extensas áreas de necrose.
4.5 Estudo clínicopatológico
Foram obtidos os dados clínicos a partir de informações contidas nos prontuários dos
pacientes atendidos no hospital anteriormente citado, sendo estes dados concernentes ao sexo,
idade e evolução clínica (presença e ausência de metástase nodal no momento do
diagnóstico). Todos os dados foram anotados em uma ficha previamente elaborada, onde
também foi registrada a localização anatômica tumoral (Apêndice A).
4.6 Estudo morfológico
Do material incluído em blocos de parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5μm
de espessura e corados pela técnica da Hematoxilina / Eosina, para obtenção da gradação
histológica de malignidade de acordo com Bryne (1998). A seqüência de coloração utilizada
consistiu nas seguintes etapas:
Xilol 1 (15 minutos)
Xilol 2 (15 minutos)
Álcool etílico absoluto (3 minutos)
Álcool etílico 95ºGL (3 minutos)
Álcool etílico 70ºGL (3 minutos)
Passagem em água corrente (5 minutos)
Hematoxilina de Harris (5 minutos)
Passagem em água corrente (5 minutos)
Rápida passagem em solução álcool-ácida
Passagem em água corrente (5 minutos)
Eosina (30 segundos)
Álcool etílico 70ºGL (3 minutos)
Álcool etílico 95ºGL (3 minutos)
Álcool etílico absoluto (3 minutos)
63
Xilol 1 (3minutos)
Xilol 2 (3minutos)
Xilol 3 (3minutos)
Montagem da lamínula em Permount (Fischer Scientific, USA).
Os cortes histológicos foram observados, em microscopia de luz, e realizada a
avaliação das áreas mais profundas de invasão tumoral com base nos critérios de malignidade,
conforme o sistema de gradação histológico recomendado por Bryne em 1998, denominado
Modo de Invasão (Quadro 1).
Quadro 1 - Sistema de gradação de malignidade “Modo de invasão” recomendado por Bryne
(1998).
Escore de malignidade Aspecto
morfológico
1 2 3 4
Grau de
ceratinização
Altamente
ceratinizado (>50%
das células)
Moderadamente
ceratinizado (20-50%
das células)
Mínima
ceratinização (5-
20% das células)
Nenhuma
ceratinização (0-5%
das células)
Pleomorfismo
nuclear
Pouco
pleomorfismo
nuclear (>75% de
células maduras)
Moderado
pleomorfismo
nuclear (50-75% de
células maduras)
Abundante
pleomorfismo
nuclear (25-50%
de células
maduras)
Pleomorfismo
nuclear extremo (0-
25% de células
maduras)
Padrão de invasão
Bordas infiltrativas
bem delimitadas
Cordões, bandas e/ou
trabéculas sólidas
infiltrativas
Pequenos grupos
ou cordões de
células infiltrativas
(n>15)
Dissociação celular
espraiada e
pronunciada, em
pequenos grupos e/ou
células individuais
(n<15)
Infiltrado
inflamatório
Intenso Moderado Escasso Ausente
Esta análise foi feita por um examinador, quando foram emitidos escores de 1 a 4 para
cada parâmetro. Através da somatória dos escores obtidos em cada parâmetro, foi calculada a
pontuação final de cada caso, sendo que os espécimes que obtiveram de 4 a 8 pontos foram
classificados em baixo grau de malignidade, enquanto aqueles com mais de 8 pontos foram de
alto grau de malignidade. Essa classificação foi proposta por Miranda (2002), consistindo em
uma modificação da classificação de Bryne et al. (1989).
64
Os dados obtidos por essa análise foram anotados em ficha de coleta de dados
elaborada para esse fim (Apêndice B).
4.7 Método imuno-histoquímico
O método imuno-histoquímico foi realizado em lâminas coradas pela técnica da
estreptoavidina-biotina (SABC, do inglês Streptavidin-Biotin Complex), utilizando-se
anticorpos monoclonais específicos para E-caderina e β-catenina (Quadro 2).
Quadro 2 – Especificações sobre os anticorpos utilizados.
Especificidade Clone Fabricante Diluição Recuperação antigênica Incubação
E-caderina
NCH-38 Dako
Cytomation
1:50 Steamer, 10 minutos
em ácido cítrico
(pH 6,0)
Overnight
β-catenina
Ab-1 Labvision/
Neomarkers
1:500 Steamer, 25 minutos em
ácido cítrico
(pH 6,0)
120 minutos
Do material incluído em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 3µm de
espessura que foram estendidos em lâminas de vidro previamente preparadas com adesivo à
base de organosilano (3-aminopropyltriethoxy-silano, Sigma Chemical Co, CA, USA,
diluição 1:150). A técnica empregada consistiu nos seguintes passos:
Desparafinização em dois banhos de xilol:
- xilol 1 (30 minutos) - 59° C
- xilol 2 (20 minutos) – Temperatura Ambiente (TA)
Hidratação em cadeia descendente de etanóis
- Etanol absoluto I (5 minutos)- TA
- Etanol absoluto II (5 minutos)- TA
- Etanol absoluto III (5 minutos)- TA
- Etanol 95° (5 minutos)- TA
- Etanol 80° (5 minutos)- TA
Remoção do pigmento formólico com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95° (10
minutos)- TA
Lavagem em água corrente (10 minutos)
Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
65
Recuperação antigênica (Quadro 2)
Lavagem em água corrente (10 minutos)
Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) 10 volumes- 2
passagens (15 minutos cada)
Lavagem em água corrente (10 minutos)
Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada)
Incubação dos anticorpos primários conforme determinação dos fabricantes (Quadro2)
diluídos em solução de BSAC a 1% (Albumina de soro bovino a 1% conservada) em
TRIS-HCl, pH 7,4.
Duas passagens em solução Tween 20 a 1 % em solução tampão de TRIS-HCL – pH 7,4 –
(Tris-hidroxi-metil-aminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada)
Incubação do anticorpo secundário (Biotinlylated link universal- Dako Corporation,
Denmark), por um período de 30 minutos – TA
Duas passagens em solução Tween 20 a 1 % em solução tampão de TRIS-HCL – pH 7,4 –
(Tris-hidroxi-metil-aminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada)
Incubação do complexo Estreptoavidina-Biotina (Dako A/S, Glostrup, Denmark)/ 30
minutos- TA
Imersão em TRIS-HCL, duas trocas (5 minutos cada)
Revelação em solução contendo agente cromógeno diaminobenzidina a 0,03% (3,3-
diaminobenzina, Sigma Chemical CO, USA), diluída em TRIS-HCL pH 7,4 e acrescida
de peróxido de hidrogênio 10 volumes, aplicada por um período de 3 minutos, em câmara
escura.
Lavagem em água corrente (10 minutos)
Passagem em água destilada
Contra-coloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA
Lavagem em água corrente ( 10 minutos)
Passagem dupla em água destilada ( 5 minutos cada)
Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
- tanol 80° (2 minutos)- TA
- Etanol 95° (2 minutos)- TA
- Etanol absoluto I (2 minutos)- TA
- Etanol absoluto I I (2 minutos)- TA
- Etanol absoluto III (2 minutos)- TA
66
Diafanização em dois banhos de xilol:
- Xilol 1 (2minutos)
- Xilol 2 (2minutos)
Montagem da lamínula em resina Permount (Fischer Scientific, USA).
4.8 Análise imuno-histoquímica
A expressão imuno-histoquímica da E-caderina e da β-catenina foi analisada em cada
caso, por meio de microscopia de luz, identificando-se o front de invasão tumoral, conforme:
padrão e intensidade de expressão em membrana e porcentagem de células imunopositivas, de
acordo com o proposto por Lyakhovitsky et al. (2004).
O padrão e intensidade de marcação em membrana para E-caderina e β-catenina
foram classificados em quatro escores:
(1) ausente;
(2) heterogêneo focal;
(3) homogêneo reduzido;
(4) homogêneo forte.
As células imunopositivas foram contadas a partir da análise realizada em um
aumento final de 400X. Foi realizada análise semiquantitativa do percentual de células
tumorais positivas para E-caderina e β-catenina com expressão em membrana, que foi
classificado em quatro escores:
Escore Porcentagem das células imunopositivas
1 < 25%
2 26 a 50%
3 51 a 75%
4 > 75%
Para a análise da β-catenina ainda foi avaliada a presença de marcação citoplasmática
e nuclear nas células do front de invasão tumoral, sendo registrada a presença ou ausência da
mesma, seguindo as recomendações propostas por El-Bahrawa et al. (2001).
Como controle negativo, o anticorpo primário foi substituído por albumina de soro
bovino a 1% (BSA – bovine serum albumin) em uma solução tampão e, subsequentemente,
foram submetidos a todos os passos descritos na técnica. Como controle positivo interno, foi
utilizado o epitélio oral normal, presente nas áreas circunjacentes à lesão, semelhante ao
realizado por Lyakhovitsky et al. (2004).
67
Todos os dados coletados da análise imuno-histoquímica foram registrados em ficha
elaborada para este fim (Apêndice C).
4.9 Análise estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística, com o objetivo de confirmar
ou refutar as hipóteses levantadas na presente pesquisa. Para tanto, os dados foram digitados
no programa Statistical Package SPSS
®
versão 10.0 para ambiente windows (SPSS Inc.
Chicago, Illinois, 1999), onde foram realizadas as referidas análises.
Com a finalidade de verificar diferenças significativas entre as variáveis
independentes (localização anatômica, metástase nodal e gradação histológica de
malignidade) e as variáveis dependentes (padrão e intensidade de expressão e quantidade de
células imunopositivas para E-caderina e β-catenina), utilizou-se o teste de Mann-Whitney.
As correlações entre as variáveis: parâmetros de gradação histológica de
malignidade, escore total de malignidade, padrão e quantidade de células imunopositivas para
a E-caderina e a β-catenina, foram observadas através do Coeficiente de correlação de
Spearman (r), cujo valor varia entre -1 a +1 (-1≤ r ≤+1). O sinal que precede o valor do r
indica se as variáveis caminham no mesmo sentido (correlação positiva), ou sem sentidos
opostos (correlação negativa). Considera-se uma correlação boa a forte para o r > 0,7;
moderada para o r entre 0,3 e 0,6 e correlação fraca para o r < 0,3.
O Teste Exato de Fisher foi utilizado para investigar a associação entre a expressão
imuno-histoquímica citoplasmática e nuclear da β-catenina com as variáveis: localização
anatômica, metástase nodal e gradação histológica de malignidade. O mesmo teste também
foi aplicado quando se buscou associação entre as variáveis independentes (localização
anatômica, metástase nodal e gradação histológica de malignidade).
Para todos os testes estatísticos utilizados neste estudo considerou-se um nível de
significância de 5%.
4.10 Considerações Éticas
Este projeto foi encaminhado ao Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário da Universidade Federal do Maranhão, através do Processo n° 33104-
1102/2005, o qual foi classificado aprovado, com o Parecer n° 148/2005, favorável à
realização do mesmo (Anexo A).
68
RESULTADOS
69
5 RESULTADOS
5.1 Caracterização da amostra
Os dados clínicopatológicos presentes nos prontuários dos 30 casos de carcinoma
epidermóide oral demonstraram que os pacientes apresentaram, no momento do diagnóstico,
idade variando de 34 a 91 anos (média de 64,2 anos) e maior freqüência no sexo masculino do
que no feminino (Tabela 1).
Tabela 1 – Características dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo a localização
anatômica da lesão, idade e sexo dos pacientes, presença ou não de metástase nodal. Natal,
RN-2006.
Caso Localização Idade (anos) Sexo Metástase nodal
01 Lábio inferior 61 masculino Ausente
02 Lábio inferior 54 masculino Ausente
03 Lábio inferior 91 feminino Ausente
04 Lábio inferior 73 feminino Presente
05 Lábio inferior 77 masculino Presente
06 Lábio inferior 84 masculino Ausente
07 Lábio inferior 48 masculino Ausente
08 Lábio inferior 51 feminino Ausente
09 Lábio inferior 75 masculino Ausente
10 Lábio inferior 69 masculino Ausente
11 Lábio inferior 46 feminino Presente
12 Lábio inferior 91 masculino Ausente
13 Lábio inferior 34 masculino Ausente
14 Lábio inferior 68 masculino Ausente
15 Lábio inferior 56 feminino Ausente
16 Língua 78 masculino Ausente
17 Língua 77 masculino Presente
18 Língua 59 Masculino Presente
19 Língua 43 Masculino Presente
20 Língua 66 Masculino Presente
21 Língua 74 Feminino Presente
22 Língua 68 Feminino Presente
23 Língua 74 Masculino Ausente
24 Língua 78 Masculino Presente
25 Língua 41 Feminino Ausente
26 Língua 77 Masculino Presente
27 Língua 37 Masculino Ausente
28 Língua 45 Masculino Presente
29 Língua 59 Feminino Presente
30 Língua 72 Feminino Presente
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Os carcinomas de língua mostraram metástase nodal no momento do diagnóstico em
11 (73,33%) dos 15 casos e em somente 03 (20%) dos 15 casos localizados em lábio inferior
foi registrada a presença de metástase nodal, havendo associação estatisticamente significativa
70
entre a localização da lesão e metástase nodal, sendo esta significativamente mais presente na
língua (Tabela 2).
Tabela 2 - Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo a localização
anatômica e presença de metástase nodal. Natal, RN-2006.
Metástase nodal Localização
presente Ausente
p*
Lábio inferior 03 (20%) 12 (80%) 0,009
Língua 11 (73,33%) 04 (26,67%)
* Teste Exato de Fisher
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
5.2 Resultados morfológicos
Os aspectos morfológicos dos casos de carcinoma epidermóide estudados localizados
em lábio inferior, conforme os critérios propostos por Bryne (1998) e a análise modificada por
Miranda (2002) estão expressos na Tabela 3.
Tabela 3 - Análise morfológica dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior,
segundo os critérios propostos por Bryne (1998) e modificação recomendada por Miranda
(2002). Natal, RN-2006.
Aspectos morfológicos Caso
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Padrão
invasão
Infiltrado
inflamatório
Escore
final
Escore de
malignidade
01 2 2 2 1 7 Baixo
02 3 2 3 1 9 Alto
03 2 2 3 1 8 Baixo
04 2 2 4 1 9 Alto
05 2 2 2 1 7 Baixo
06 4 4 2 2 12 Alto
07 4 2 3 2 11 Alto
08 2 2 2 1 7 Baixo
09 3 3 3 1 10 Alto
10 4 4 3 2 13 Alto
11 4 4 4 1 13 Alto
12 3 3 3 2 11 Alto
13 4 2 2 1 9 Alto
14 1 2 3 1 7 Baixo
15 1 2 3 1 7 Baixo
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
71
Após a análise morfológica, foi observado que 06 (40%) dos 15 casos de carcinoma
epidermóide de lábio inferior foram classificados como de baixo escore e 09 (60%) como de
alto escore de malignidade.
Quanto aos carcinomas localizados em língua, a Tabela 4 demonstra os escores dos
aspectos morfológicos, o escore final e de malignidade para cada um dos casos analisados,
segundo os critérios propostos por Bryne (1998) e a classificação modificada por Miranda
(2002).
.
Tabela 4 - Análise morfológica dos casos de carcinoma epidermóide de língua, segundo os
critérios propostos por Bryne (1998) e modificação recomendada por Miranda (2002). Natal,
RN-2006.
Aspectos morfológicos Caso
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Padrão
invasão
Infiltrado
inflamatório
Escore
final
Escore de
malignidade
01 2 2 1 1 6 Baixo
02 4 4 3 3 14 Alto
03 4 3 3 2 12 Alto
04 3 4 1 3 11 Alto
05 1 2 3 1 7 Baixo
06 4 3 4 4 15 Alto
07 4 2 4 2 12 Alto
08 4 4 1 1 10 Alto
09 4 3 4 4 15 Alto
10 4 3 3 2 12 Alto
11 2 3 2 3 10 Alto
12 3 3 2 1 9 Alto
13 1 2 3 1 7 Baixo
14 2 2 1 1 6 Baixo
15 3 4 4 1 12 Alto
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Observou-se que 11 (73,33%) dos 15 casos dos carcinomas epidermóides de língua
enquadraram-se no grupo de alto escore de malignidade e apenas 04 (26,67%) foram
classificados como baixo escore de malignidade.
No intuito de investigar a existência de associação entre as variáveis, localização
anatômica da lesão e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998) e
modificada por Miranda (2002), foi aplicado o Teste Exato de Fisher, conforme demonstrado
na Tabela 5.
72
Tabela 5 - Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo a localização
anatômica e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998) e modificada
por Miranda (2002). Natal, RN-2006.
Gradação histológica de malignidade Localização
Baixo escore Alto escore
p*
Lábio inferior 6 (40%) 9 (60%) 0,700
Língua 4 (26,67%) 11 (73,33%)
* Teste exato de Fisher
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Não foi detectada associação estatisticamente significativa entre a localização dos
carcinomas epidermóides orais (lábio inferior e língua) e os escores de malignidade (baixo e
alto escore).
Observou-se que 16 dos 30 casos dos carcinomas epidermóides orais não
apresentaram metástase nodal no momento do diagnóstico, enquanto em 14 casos foi
detectada a presença da referida metástase.
Foi empregado o Teste Exato de Fisher, objetivando pesquisar a existência de
associação entre as variáveis, metástase nodal e a gradação histológica de malignidade
proposta por Bryne (1998) e adaptada por Miranda (2002), conforme demonstrado na
Tabela 6.
Tabela 6 - Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide oral, segundo a presença ou não
de metástase nodal e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998) e
modificada por Miranda (2002). Natal, RN-2006.
Gradação histológica de malignidade Metástase Nodal
Baixo escore Alto escore
p*
Ausente 6 (37,5%) 10 (62,5%) 0,709
Presente 4 (28,57%) 10 (71,43%)
* Teste exato de Fisher
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Os resultados mostraram que não houve associação estatisticamente significativa entre
a presença ou não de metástase nodal e os escores de malignidade (baixo e alto escores).
Foi aplicado o Coeficiente de correlação de Spearman entre o escore total de
malignidade e os parâmetros de gradação histológica de malignidade com o intuito de detectar
a sua significância estatística, cujos resultados são evidenciados na Tabela 7.
73
Tabela 7 - Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística (p) entre o
escore total de malignidade e os parâmetros de gradação histológica de malignidade dos casos
de carcinoma epidermóide oral. Natal, RN-2006.
Parâmetros de gradação histológica de malignidade
Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Padrão de
invasão
Infiltrado
inflamatório
Gradação
histológica
de
malignidade
r p r p r p r p
Escore total 0,844 <0,0001 0,748 <0,0001 0,533 0,002 0,742 <0,0001
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Após a análise dos parâmetros utilizados na gradação histológica de malignidade
proposta por Bryne (1998) e o escore total de malignidade, pôde-se observar que houve uma
correlação significativa entre os mesmos, aplicando-se o Coeficiente de correlação de
Spearman. Na presente amostra, os parâmetros grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e
infiltrado inflamatório apresentaram boa correlação (r>0,7), e o parâmetro padrão de invasão
mostrou correlação moderada (r=0,533).
A Figura 1A ilustra uma visão geral do front invasivo tumoral, enquanto as Figuras 1B
e 1C mostram diferentes padrões de invasão. Os demais parâmetros morfológicos analisados
foram: grau de ceratinização (Figura 2A), pleomorfismo nuclear (Figura 2B) e intensidade do
infiltrado inflamatório (Figura 2C).
74
75
76
5. 3 Resultados imuno-histoquímicos
As características da expressão das proteínas E-caderina e β-catenina estão descritas
abaixo e correspondem àquelas observadas no front de invasão tumoral dos 30 casos de
carcinoma epidermóide oral, conforme citado previamente na metodologia proposta para esta
investigação.
A imunoexpressão da E-caderina exibiu, predominantemente, um padrão de marcação
heterogêneo focal (escore 2) para 12 (40%) dos 30 carcinomas epidermóides orais estudados.
O padrão ausente (escore 1) foi observado em 9 casos (30%), enquanto a expressão
homogênea reduzida (escore 3) esteve presente em 5 casos (16,67%) e o padrão homogêneo
forte (escore 4) em 4 casos (13,33%).
Quanto à análise semi-quantitativa de células imunopositivas para a E-caderina, 15
(50%) dentre os 30 casos de carcinoma epidermóide oral exibiram menos de 25% de células
positivas (escore 1) e 6 casos (20%) com 26-50% de células positivas (escore 2). Observou-se
ainda que 4 casos (13,33%) apresentaram entre 51-75% de células positivas (escore 3) e 5
casos (16,67%) com mais de 75% de células positivas (escore 4) (Figuras 3A, 3B, 3C).
A β-catenina também exibiu, predominantemente, um padrão de marcação
heterogêneo focal em 16 (53,33%) dos 30 casos de carcinoma epidermóide oral, sendo
seguido pelo padrão homogêneo forte (escore 4) com 6 casos (20%). O padrão homogêneo
reduzido (escore 3) esteve presente em 5 casos (16,67%) e a ausência de marcação foi
observada em 3 (10%) dos 30 carcinomas epidermóides orais (Figuras 4A, 4B, 4C).
Em relação à análise semi-quantitativa de células tumorais positivas para a β-catenina,
8 (26,67%) dentre os 30 carcinomas epidermóides orais exibiram mais de 75% de células
positivas (escore 4) e 4 casos (13,33%) evidenciaram 51-75% de células positivas (escore 3).
Em 9 casos (30%) foi demonstrado o escore 2 (26-50% de células positivas), assim como para
o escore 1 (<25% de células positivas), que foi observado em 9 casos (30%).
A análise da expressão imuno-histoquímica da E-caderina e da β-catenina foi efetuada,
com o objetivo de observar se existe correlação entre o padrão de expressão dessas proteínas
com a localização anatômica tumoral, com a presença de metástase nodal e com a gradação
histológica de malignidade, conforme a metodologia previamente descrita, e cujos resultados
estão mencionados a seguir.
77
78
79
5.3.1 Quanto à localização anatômica da lesão
A expressão em membrana celular para a E-caderina mostrou-se com padrão
heterogêneo focal (escore 2) em 7 dos 15 casos de carcinomas de lábio inferior e em 5 dos 15
casos de língua. A expressão em membrana celular para a β-catenina mostrou-se,
predominantemente, com padrão heterogêneo focal tanto nos carcinomas de lábio inferior
(8/15) quanto nos de língua (8/15).
Em relação à análise semi-quantitativa de células tumorais positivas, 8 dos 15 casos de
língua e 7 dos 15 casos de lábio inferior, apresentaram menos de 25% destas células positivas
(escore 1) para E-caderina. Enquanto, a imunoexpressão da β-catenina em membrana
evidenciou que em 6 dos 15 casos de língua houve 26-50% de células positivas (escore 2).
A distribuição de todos os casos de carcinoma epidemóide de língua e lábio inferior,
segundo o padrão de expressão e quantidade de células imunopositivas para os marcadores
E-caderina e β-catenina, está demonstrada na Tabela 8.
Tabela 8 – Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao padrão de expressão e
à quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina, segundo a
localização da lesão. Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Quantidade de casos em valores absolutos Marcadores Localização
da lesão
N Ausente Heterogêneo
focal
Homogêneo
reduzido
Homogêneo
forte
Lábio inferior 15 4 7 3 1 E-caderina
Língua 15 5 5 2 3
Lábio inferior 15 1 8 3 3 β-catenina
Língua 15 2 8 2 3
Quantidade de células imunopositivas
Quantidade de casos em valores absolutos
Localização
da lesão
N < 25% células
positivas
26-50%
células
positivas
51- 75%
células
positivas
>75%
células
positivas
Lábio inferior 15 7 4 2 2 E-caderina
Língua 15 8 2 2 3
Lábio inferior 15 5 3 2 5 β-catenina
Língua 15 4 6 2 3
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
A Tabela 9 apresenta o tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos
postos, estatística U e sua significância entre o padrão de expressão e a quantidade de células
imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina, nos casos de carcinoma epidermóide de lábio
inferior e de língua.
80
Tabela 9 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos postos, estatística U e
sua significância entre o padrão de expressão e a quantidade de células imunopositivas para a
E-caderina e a β-catenina em carcinoma epidermóide oral, quanto à localização da lesão.
Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Marcadores Localização
da lesão
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Lábio inferior 15 2 1-3 15,27 229,00 E-caderina
Língua 15 2 1-3 15,73 236,00
109,00 0,879
Lábio inferior 15 2 2-3 16,17 242,50 β-catenina
Língua 15 2 2-3 14,83 222,50
102,50 0,650
Quantidade de células imunopositivas
Localização
da lesão
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Lábio inferior 15 2 1-3 15,53 233,00 E-caderina
Língua 15 1 1-3 15,47 232,00
112,00 0,982
Lábio inferior 15 2 1-4 16,03 240,50 β-catenina
Língua 15 2 1-3 14,97 224,50
104,50 0,730
* Teste de Mann-Whitney.
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
O Teste de Mann-Whitney demonstrou que não houve diferença significativa entre as
medianas para o padrão de expressão e para a quantidade de células imunopositivas para os
anticorpos analisados, segundo a localização anatômica da lesão em lábio inferior e língua.
5.3.2 Quanto à presença ou não de metástase nodal
Dentre os 14 casos de carcinoma epidermóide oral com metástase nodal, 10
apresentaram menos de 25 % de células positivas para a E-caderina (escore 1) e apenas 1 caso
exibiu entre 26-50% de células positivas (escore 2). Quanto aos 16 casos sem metástase
nodal, 5 casos exibiram o escore 1, bem como 5 casos apresentaram o escore 2. Em relação ao
padrão de expressão imuno-histoquímica da E-caderina, 4 dentre os 14 casos com metástase
nodal, e 8 dentre os 16 casos sem metástase nodal, exibiram o padrão de expressão
heterogêneo focal (escore 2).
A expressão em membrana para β-catenina exibiu padrão heterogêneo focal (escore 2)
em 8 dos 16 casos de carcinoma epidermóide oral sem metástase nodal, assim como em 8 dos
14 casos com metástase nodal. O percentual semi-quantitativo de células tumorais positivas
para β-catenina apresentou 26-50% de células imunopostivas (escore 2) em 5 dos 14 casos de
81
carcinoma com metástase nodal, sendo que 4 casos mostraram menos de 25% de células
positivas (escore 1), enquanto que dentre os 16 casos sem metástase nodal, 5 exibiram o
escore 1 e 4 evidenciaram o escore 2.
A distribuição de todos os 30 casos de carcinoma epidemóide oral, de acordo com o
padrão de expressão para os marcadores E-caderina e β-catenina e segundo a presença ou não
de metástase nodal, está expressa na Tabela 10.
Tabela 10 - Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao padrão de expressão
e à quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina, segundo a presença
e ausência de metástase nodal. Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Quantidade de casos em valores absolutos Marcadores Metástase
nodal
N Ausente Heterogêneo
focal
Homogêneo
reduzido
Homogêneo
forte
Ausente 16 4 8 2 2 E-caderina
Presente 14 5 4 3 2
Ausente 16 2 8 3 3 β-catenina
Presente 14 1 8 2 3
Quantidade de células imunopositivas
Quantidade de casos em valores absolutos
Metástase
nodal
N < 25% células
positivas
26-50%
células
positivas
51- 75%
células
positivas
>75%
células
positivas
Ausente 16 10 1 2 3 E-caderina
Presente 14 5 5 2 2
Ausente 16 5 4 2 5 β-catenina
Presente 14 4 5 2 3
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
A Tabela 11 apresenta os valores da imunoexpressão em membrana celular para a E-
caderina e para a β-catenina nos casos com e sem metástase nodal, que foram submetidos à
análise estatística.
82
Tabela 11 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos postos, estatística U e
sua significância entre o padrão de expressão e a quantidade de células imunopositivas para a
E-caderina e a β-catenina dos casos de carcinoma epidermóide oral, em relação à metástase da
lesão. Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Marcadores Metástase
nodal
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Ausente 16 2 1,25-2,75 15,56 249,00 E-caderina
Presente 14 2 1-3 15,43 216,00
111,00 0,965
Ausente 16 2 2-3 15,28 244,50 β-catenina
Presente 14 2 2-3,25 15,75 220,50
108,50 0,874
Quantidade de células imunopositivas
Metástase
nodal
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Ausente 16 2 1-2,75 15,72 251,50 E-caderina
Presente 14 1 1-3,25 15,25 213,50
108,50 0,875
Ausente 16 2 1-4 15,91 254,50 β-catenina
Presente 14 2 1-3,25 15,04 210,50
105,50 0,779
* Teste de Mann-Whitney.
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Quando analisamos a variável metástase nodal e aplicado o Teste de Mann-Whitney,
observou-se que não houve diferença significativa entre as medianas para o padrão de
expressão e a quantidade de células imunopositivas tanto para a E-caderina quanto para a β-
catenina.
5.3.3 Quanto ao escore de malignidade
Em 4 dentre os 10 casos de carcinoma epidermóide oral classificados como de baixo
escore de malignidade, foi evidenciado o padrão homogêneo reduzido de expressão para E-
caderina (escore 3) assim como para o padrão heterogêneo (escore 2), com nenhum caso com
ausência de imunomarcação (escore 1). Enquanto nos 20 casos classificados como alto grau
de malignidade, o escore 1 foi o mais comum com 9 casos. Quanto ao percentual semi-
quantitiavo de células tumorais positivas para E-caderina, 14 dentre os 20 casos de alto escore
de maligninadade exibiram menos de 25% de células positivas (escore 1) e somente 2 casos
mostraram mais de 75% de células positivas para E-caderina (escore 4). Já o escore 4 esteve
presente em 3 dos 10 casos com baixo escore de malignidade e houve somente em 1 caso com
menos de 25% de células positivas (escore 1).
Dentre os 20 casos de carcinoma epidermóide oral com alto escore de malignidade, 13
exigiram o padrão heterogêneo (escore 2) de marcação em membrana celular para a β-
catenina, sendo que dentre os 10 casos de baixo escore de malignidade predominou o escore 4
83
(homogêneo forte) com 4 casos. Em relação ao percentual semi-quantitativo de células
tumorais positivas em membrana celular para a β-catenina, 6 dentre os 10 casos classificados
com baixo escore de malignidade apresentaram mais de 75% de células tumorais positivas
(escore 4), enquanto nos casos de alto grau de malignidade, 9 receberam o escore 1 (< 25% de
células positivas) e para 7 casos foi atribuído o escore 2 (26-50% de células positivas).
Os resultados da análise dos 30 casos de carcinoma epidemóide oral, segundo o padrão
de expressão e quantidade de células tumorais imunopositivas para os marcadores E-caderina
e β-catenina, conforme os escores de malignidade estão demonstrados na Tabela 12.
Tabela 12 - Número de casos de carcinoma epidermóide oral, quanto ao padrão de expressão
e à quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina, segundo o escore
de malignidade. Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Quantidade de casos em valores absolutos Marcadores Escore de
malignidade
N Ausente Heterogêneo
focal
Homogêneo
fraco
Homogêneo
forte
Baixo 10 0 4 4 2 E-caderina
Alto 20 9 8 1 2
Baixo 10 0 3 3 4 β-catenina
Alto 20 3 13 2 2
Quantidade de células imunopositivas
Quantidade de casos em valores absolutos
Escore de
malignidade
N < 25% células
positivas
26-50%
células
positivas
51- 75%
células
positivas
>75%
células
positivas
Baixo 10 1 3 3 3 E-caderina
Alto 20 14 3 1 2
Baixo 10 0 2 2 6 β-catenina
Alto 20 9 7 2 2
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
A tabela 13 apresenta os valores da imunoexpressão da E-caderina e da β-catenina em
membrana celular, em relação à gradação histológica de malignidade da lesão, segundo a
gradação histológica de malignidade proposta por Bryne em 1998 e modificada por Miranda
(2002).
84
Tabela 13 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média e soma dos postos, estatística U e
sua significância entre o padrão de expressão e a quantidade de células imunopositivas para a
E-caderina e a β-catenina dos casos de carcinoma epidermóide oral, em relação à gradação
histológica de malignidade da lesão. Natal, RN-2006.
Padrão de expressão
Marcadores Escore de
malignidade
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Baixo 10 3 2-3,25 21,50 215,00 E-caderina
Alto 20 2 1-2 12,50 250,00
40,00 0,005
Baixo 10 3 2-4 21,05 210,50 β-catenina
Alto 20 2 2-2 12,73 254,50
44,50 0,008
Quantidade de células imunopositivas
Escore de
malignidade
n Mediana Q
25
-Q
75
Média dos
postos
Soma dos
postos
U p*
Baixo 10 3 2-4 21,80 218,00 E-caderina
Alto 20 1 1-2 12,35 247,00
37,00 0,003
Baixo 10 4 2,75-4 22,80 228,00 β-catenina
Alto 20 2 1-2 11,85 237,00
27,00 0,001
* Teste de Mann-Whitney.
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Foi observada diferença estatisticamente significativa quanto à expressão em
membrana celular das proteínas E-caderina e β-catenina em relação aos escores de
malignidade. Os casos com baixo escore de malignidade apresentaram significativamente
maiores medianas tanto para o padrão de expressão quanto para a quantidade de células
imunopositivas para as proteínas estudadas.
Na Tabela 14 evidenciamos o Coeficiente de correlação de Spearman e sua
significância estatística entre o escore total de malignidade e o padrão e a quantidade de
células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina.
Tabela 14 - Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística (p) entre
o escore total de malignidade e o padrão e a quantidade de células imunopositivas para a E-
caderina e a β-catenina em carcinomas epidermóides orais. Natal, RN-2006.
Escore total de malignidade Marcadores
r p
Padrão de marcação - 0,434 0,017 E-caderina
Quantidade de células positivas - 0,438 0,015
Padrão de marcação - 0,456 0,011 Beta-catenina
Quantidade de células positivas - 0,498 0,005
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Pôde-se observar, após a aplicação do Coeficiente de correlação de Spearman, uma
correlação negativa moderada estatisticamente significativa entre as medianas para o padrão
85
de expressão e da quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina e o
escore total de malignidade.
5.3.4 Complexo E-caderina / β-catenina
Com o objetivo de observar uma correlação entre o padrão de expressão e a
quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina aplicou-se o
Coeficiente de correlação de Spearman conforme os resultados evidenciados na Tabela 15.
Tabela 15 - Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística (p) entre
o padrão e a quantidade de células imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina em
carcinomas epidermóides orais. Natal, RN-2006.
Marcadores
E-caderina Beta-catenina
Padrão de marcação Padrão de
marcação
Quantidade de
células positivas
Marcadores
r p r p r p
Padrão de
marcação
- - 0,856 <0,0001 0,847 <0,0001 E-caderina
Quantidade de
células positivas
0,877 <0,0001 0,869 <0,0001 0,835 <0,0001
β-catenina Padrão de
marcação
0,856 <0,0001 - - 0,882 <0,0001
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Evidenciamos que houve correlação positiva significativa, variando de boa a forte,
entre a imunoexpressão das proteínas E-caderina e β-catenina, tanto no critério padrão de
expressão quanto na análise semi-quantitativa de células imunopostivas.
5.3.5 Expressão da β-catenina em citoplasma e em núcleo
Observou-se que a expressão da β-catenina em citoplasma esteve presente em 22
(73,33%) dos 30 casos de carcinoma epidermóide oral analisados, sendo que em 6 casos
(20%) houve a expressão em núcleo (Figura 4B).
A Tabela 16 apresenta os valores absolutos, percentuais e significância estatística entre
a expressão da β-catenina em citoplasma e em núcleo e localização anatômica da lesão,
metástase nodal e gradação histológica de malignidade nos casos de carcinoma epidermóide
oral.
86
Tabela 16 - Valores absolutos, percentuais e significância estatística entre a expressão da β-
catenina em citoplasma e em núcleo e localização anatômica da lesão, metástase nodal e
gradação histológica de malignidade em carcinomas epidermóides orais. Natal, RN-2006.
* Teste Exato de Fisher.
Fonte: Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello - IMOAB.
Foi observado que não houve associação significativa entre a expressão da β-catenina
em núcleo com a localização anatômica da lesão, metástase nodal e gradação histológica de
malignidade. Também não foi evidenciada a existência de associação significativa entre a
expressão da β-catenina em citoplasma com a localização da lesão e a metástase nodal. No
entanto, foi detectada uma associação significativa entre a expressão da β-catenina no
citoplasma com a gradação histológica de malignidade, estando a β-catenina mais
freqüentemente presente no citoplasma nos casos de alto escore de malignidade.
Expressão da β-catenina
Citoplasma Núcleo
Variáveis independentes
Ausente
n (%)
Presente
n (%)
p* Ausente
n (%)
Presente
n (%)
p*
Lábio
Inferior
05
(33,3)
10
(66,7)
0,682 14
(93,3)
01
(6,7)
0,169
Localização
da lesão
Língua 03
(20,0)
12
(80,0)
10
(66,7)
05
(33,3)
Ausente 05
(31,3)
11
(68,7)
0,689 14
(87,5)
02
(12,5)
0,378 Metástase
Presente 03
(21,4)
11
(78,6)
10
(71,4)
04
(28,6)
Baixo 06
(60,0)
04
(40,0)
0,007 09
(90,0)
01
(10,0)
0,633 Gradação
Histológica
Alto 02
(10,0)
18
(90,0)
15
(75,0)
05
(25,0)
87
DISCUSSÃO
88
6 DISCUSSÃO
O câncer consiste em um problema de saúde pública mundial (KLIGERMAN, 2000),
destacando-se atualmente como a terceira causa de morte por doenças (KLIGERMAN, 2000;
WUNSCH-FILHO, 2002). Dentre as neoplasias malignas que acometem a cavidade oral, o
carcinoma epidermóide tem sido registrado como o mais freqüente, correspondendo a mais de
90% dos casos. (INCA, 2005; NEVILLE et al, 2004; NOLLET, GEERT, VAN ROY, 1999;
WONG et al, 1996).
As regiões anatômicas mais acometidas pelos carcinomas epidermóides orais são
língua e lábio inferior (ANJOS HORA et al, 2003; CARVALHO et al, 2001; COSTA,
ARAÚJO JÚNIOR; RAMOS, 2005; GERVÁSIO et al, 2001; PERUSSI et al, 2002; SILVA et
al, 2001). Os tumores de língua apresentam elevada propensão para metástase regional e
pobre prognóstico (YUEN et al, 1998), com piores taxas de sobrevida (WUNSCH-FILHO,
2002), enquanto que as neoplasias em lábio inferior têm melhor comportamento biológico que
os tumores em outros sítios anatômicos (CHOI et al, 2006; VARTANIAN et al, 2004).
Convém ressaltar que desde 1993, Carter menciona sobre a importância de se estudar
os métodos de identificação dos fatores prognósticos e da metástase nodal, pois, segundo
Christofori (2003), de todos os processos envolvidos na progressão tumoral, a invasão e a
metástase são clinicamente as mais relevantes. Recentemente, Choi et al (2006) confirmaram
que a existência de metástase nodal apresenta valor indicativo significativo de pobre
prognóstico para os pacientes com carcinoma epidermóide oral (CEO).
O nosso trabalho visou contribuir para uma melhor compreensão do comportamento
biológico do carcinoma epidermóide oral. Para tanto, foram selecionados casos localizados
em língua e em lábio inferior, sendo registrada a presença ou não de metástase nodal como
uma das variáveis de estudo.
No presente estudo, observou-se que 73,33% dos casos de carcinomas de língua
apresentaram metástase nodal no momento do diagnóstico e, em somente 20% dos casos
localizados em lábio inferior foi registrada a presença da mesma. Quando os resultados foram
submetidos ao teste estatístico, foi encontrada associação significativa entre a localização da
lesão e a presença da metástase nodal, estando na língua significativamente mais presente.
Resultados similares aos nossos também foram encontrados por Amorim Filho et al
(2003a), que detectaram uma incidência de metástase nodal em carcinoma epidermóide de
língua em 71% dos casos e por Amorim Filho et al (2003b), ao registrarem metástase
ipislateral em 79% da sua casuística, porém, valores menos alarmantes foram os apresentados
89
por Chow et al (2001) e Hyam et al (2003), que detectaram a presença da mesma em 41,18%
e 65,90% de suas respectivas amostras também em carcinoma epidermóide de língua.
Entretanto, Woolgar et al (2006) citaram, através de uma revisão de literatura, que a metástase
nodal foi diagnosticada em 59-64% dos casos de carcinoma epidermóide de língua.
Os carcinomas epidermóides de lábio inferior com metástase nodal foram,
significativamente, menos freqüentes que os localizados em língua, corroborando com os
resultados de Vartanian et al (2004) que detectaram 79% de pacientes com carcinoma
epidermóide de lábio sem metástase nodal, concordando com Choi et al (2006) ao
mencionarem que as neoplasias em lábio têm melhor comportamento biológico que os
tumores em outros sítios anatômicos, possivelmente, decorrente da baixa taxa de metástase
nodal e do diagnóstico precoce devido à localização do tumor.
Os achados do nosso estudo ratificam os já mencionados por Amorim Filho et al
(2003a) e Amorim Filho et al (2003b) de que os carcinomas epidermóides de língua são
diagnosticados em estágios mais avançados, caracterizados pelo avanço insidioso do tumor
primário e comprometimento linfonodal. Segundo Amorim Filho et al (2004), a topografia de
difícil acesso à propedêutica médica favorece o tumor a crescer na obscuridade, invadindo a
musculatura profunda da base da língua e a sua rica rede de drenagem linfática facilita a
disseminação de células neoplásicas para as cadeias linfáticas do pescoço.
Este fato pode ser justificado baseando-se nas afirmações de Massano et al (2006), ao
mencionarem que a rede vascular e linfática, que varia entre sítios anatômicos distintos, pode
influenciar no desenvolvimento tumoral. Sabe-se que o lábio inferior se encontra,
anatomicamente, mais distante dos linfonodos que a língua localizada na porção posterior da
cavidade oral, onde possui um acúmulo de tecido linfático, o qual forma alguns órgãos
linfáticos isolados, tais como as amídalas linguais, acrescido pela presença dos linfonodos
acessórios.
A menor vascularização linfática da região de lábio inferior parece contribuir para a
baixa taxa de metástase nodal nos casos de carcinoma epidermóide nesta região no momento
do diagnóstico, como observado no presente trabalho. No entanto, Bucur e Stefanescu (2004)
ressaltaram que o carcinoma de lábio inferior, com linfonodo negativo no momento do
diagnóstico, desenvolve metástase nodal, na maioria dos casos, dentro do período de 2 anos,
sendo a mesma um evento tardio, portanto, essa baixa freqüência de metástase nodal em
carcinoma epidermóide de lábio inferior parece estar mais associada a um diagnóstico
precoce.
90
As características histológicas do carcinoma epidermóide oral podem diferir de uma
área para outra dentro do mesmo tumor, devido a sua heterogeneidade, podendo os dados
coletados no front de invasão tumoral ser mais significativos, segundo os achados de Bryne et
al (1989), Odell et al (1994) e Sawair et al (2003). Assim, diversos trabalhos optaram por
empregar sistemas de gradação histológica de malignidade no front tumoral (BÀNKFALVI et
al, 2002a; BÀNKFALVI et al, 2002b; COSTA; ARAÚJO JÚNIOR; RAMOS, 2005;
DANTAS et al, 2003; DINIZ-FREITAS et al, 2006). Estes trabalhos estão fundamentados na
afirmativa de Bryne (1998), de que existe uma grande necessidade de novos marcadores
prognósticos que possam elevar o entendimento da biologia do carcinoma epidermóide,
através da invasão e metástase do tumor.
A metodologia empregada no presente trabalho utilizou o sistema de gradação
histológica de malignidade no front de invasão tumoral, tendo sido empregado o sistema
proposto por Bryne em 1998. Esta escolha foi alicerçada nas características histopatológicas
das áreas mais invasivas do carcinoma epidermóide oral, que são melhores que o sistema de
Broders para predizer o prognóstico (BRYNE et al, 1989); na agressividade biológica
revelada pelas células invasivas do câncer oral (BÀNKFALVI; FIFFKÒ, 2000), além da
possibilidade maior de reprodutibilidade deste sistema de gradação histológica de
malignidade, confirmada através da elevada concordância dos escores inter- e intra-
observadores (SAWAIR et al, 2003).
Ao se realizar o estudo histopatológico da amostra do presente trabalho, observou-se
predomínio de carcinomas epidermóides orais classificados como de alto escore de
malignidade, de acordo com a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998)
e adaptada por Miranda (2002), tanto para os casos localizados em língua (73,33%), como
para os casos localizados em lábio inferior (60%), não sendo detectada associação
estatisticamente significativa entre estes sítios anatômicos e a gradação histológica de
malignidade.
Em relação ao carcinoma epidermóide de língua, o presente resultado encontra
similaridade com os achados de Dantas et al (2003) e de Lim et al (2004), que realizaram a
análise histopatológica do front de invasão tumoral em carcinomas epidermóides de língua, e
também observaram o predomínio de casos com escores elevados. Entretanto, no trabalho de
Miranda (2002), todos os 12 casos de carcinoma de língua (100%) enquadraram-se no grupo
de alto escore de malignidade, porém dentre os 12 casos de lábio inferior, somente 8,33%
foram classificados como alto escore, contra 91,67% com baixo escore de malignidade,
discordando dos nossos achados para lábio inferior.
91
O comportamento biológico diferente do carcinoma epidermóide oral, quando se
analisa a localização anatômica do tumor primário, é defendido por diversos autores
(AMORIM FILHO et al, 2004; CHOI et al, 2006; VARTANIAN et al, 2004). No presente
trabalho, houve associação entre localização anatômica e a formação de metástase nodal, o
que reflete as diferenças do comportamento biológico entre neoplasias em regiões anatômicas
distintas, em acordo aos achados de Dib et al (1994) e Gervásio et al (2001) e, ratificando o
anteriormente mencionado por Beltrami, Desinan e Rubini (1992), que as neoplasias em lábio
apresentam melhor prognóstico do que os carcinomas de cavidade oral. No entanto, não foi
encontrada associação entre a localização tumoral e a gradação histológica de malignidade,
assim como entre a mesma e a metástase nodal, o que corrobora com os achados de Okamoto
et al (2002) e diverge dos de Odell et al (1994), no tocante à relação entre metástase nodal e
gradação histológica de malignidade.
Ao se analisar os escores atribuídos para os parâmetros isolados do sistema de
gradação histológica de malignidade utilizado na presente pesquisa, observou-se que nos
casos localizados em lábio inferior houve somente os escores 1 e 2 para o critério infiltrado
inflamatório (Tabela 3), ou seja, maior infiltrado inflamatório, enquanto os escores 3 e 4,
condizentes com pouco infiltrado inflamatório, foram aferidos a alguns casos localizados em
língua (Tabela 4). Este achado pode estar relacionado ao aumento de metástase nodal nos
carcinomas epidermóides em língua, uma vez que, sabe-se da importante função da resposta
inflamatória como um mecanismo de defesa do hospedeiro, cuja escassez ou ausência, pode
ter influenciado no freqüente aparecimento da metástase nodal. Este posicionamento também
foi defendido por Dantas et al (2003), ao mencionarem que o infiltrado inflamatório pode ser
um dos indicadores histológicos importantes do grau de agressividade tumoral, considerando
que ele reflete a relação da população celular com o hospedeiro.
A variável histológica infiltrado linfoplasmocitário foi de grande relevância na
pesquisa de Costa, Araújo Júnior e Ramos (2005), ao observarem correlação significativa do
referido parâmetro e do pleomorfismo nuclear com o aparecimento de metástase nodal (TNM
III/IV). No trabalho destes autores, nos casos que apresentaram comportamento biológico
mais sombrio, houve predomínio de discreto infiltrado inflamatório e pleomorfismo nuclear
abundante, sendo estes parâmetros importantes no comportamento clínico da entidade, como
o risco de desenvolver metástases.
No presente trabalho, fez-se a análise dos parâmetros utilizados na gradação
histológica de malignidade proposta por Bryne (1998) e o escore total de malignidade, quando
se observou que houve uma correlação significativa entre os mesmos, onde os parâmetros
92
grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear e infiltrado inflamatório apresentaram uma boa
correlação, enquanto o parâmetro padrão de invasão mostrou uma correlação moderada.
Na análise do presente estudo, o parâmetro que apresentou maior influência na
amostra, demonstrada pela correlação significativa com o escore total de malignidade, foi o
grau de ceratinização (r = 0,844). Estes resultados talvez possam ser explicados pelos achados
de Sawair et al (2003), os quais observaram que o grau de ceratinização foi o parâmetro com
maior reprodutibilidade tanto entre observadores quanto intra observadores, sendo o
parâmetro padrão de invasão, o que apresentou maior divergência entre observadores.
Em 1994, Odell et al mencionaram que o padrão de invasão e a ceratinização são os
parâmetros do sistema com maior valor prognóstico, pois estão correlacionados com o
aparecimento de metástase. Porém, no trabalho de Costa, Araújo Júnior e Ramos (2005), o
padrão de invasão foi o único parâmetro que não teve relação significativa com o estágio
clínico TNM, no entanto o grau de ceratinização e o pleomorfismo nuclear estavam
correlacionados com o estadiamento clínico TNM.
A metástase pode ser descrita como um processo de invasão com múltiplas etapas:
invasão do câncer primário para os tecidos circunvizinhos; intravasão e extravasão em
linfonodos e metástase visceral (MAREEL; BRACKE; VAN ROY, 1995). A adesão de uma
célula a outra serve para prevenir ou impedir o movimento celular (FREEEMONT, 1998).
Dentre as moléculas que atuam na adesão celular, pode-se citar a E-caderina, que é uma
glicoproteína transmembrana, que está relacionada com a polaridade celular, estratificação
epitelial, diferenciação, morfogênese, embriogênese e também no comportamento tumoral
(BRACKE; VAN ROY; MEREEL, 1996; HARINGTON; SYRIGOS, 2000; MAREEL;
BRACKE; VAN ROY, 1995).
Eventos moleculares de importância para o crescimento tumoral, como o ganho e
perda de moléculas de adesão, ocorrem na interação tumor-hospedeiro, ou seja, no front de
invasão (BRYNE, 1998). Por isso, estudos imuno-histoquímicos com o anticorpo monoclonal
anti-Ecaderina têm sido realizados, no intuito de entender o significado da expressão desta
proteína em cânceres humanos (HIROHASHI;KANAI, 2003).
A função adesiva da E-caderina depende da associação com as cateninas (α-, β-, γ-
catenina), que intermedeiam a ligação entre o domínio citoplasmático da E-caderina ao
citoesqueleto de actina (BÀNKFALVI et al, 2002b). Acredita-se que a redução destas
moléculas esteja envolvida na disfunção do sistema de adesão celular, propiciando invasão e
metástase (PEÉINA-SLAUS, 2003), uma vez que, as caderinas clássicas mantêm a
integridade das camadas epiteliais (PETRUZZELLI; TAKAMI; HUMES, 1999), a polaridade
93
celular e a arquitetura celular e epitelial (HARINGTON; SYRIGOS, 2000; JAWHARI;
PIGNATELLI; FARTHING,1997). A E-caderina se liga diretamente com a proteína β-
catenina formando o complexo E-caderina/β-catenina, sendo que a β-catenina pode atuar não
somente na adesão celular como também na via de sinalização Wnt, por também ser regulada
pelo APC (AKEN et al, 2001, UEDA et al, 2006).
Quanto a expressão imuno-histoquímica das moléculas E-caderina e β-catenina, os
nossos resultados comprovaram o que foi descrito por Lo Muzio et al (1999) e Yokoyama et
al (2001), os quais observaram que as células E-caderina e β-catenina positivas apresentavam
formato cuboidal, enquanto as células negativas mostravam-se fusiformes e com maior perda
de diferenciação. Na presente pesquisa, as células tumorais, quando se apresentavam em
pequenas ilhas infiltrativas ou isoladas, se mostraram predominantemente negativas, enquanto
que as células centrais de massas tumorais foram comumente imunopositivas; embora, com
um padrão variável de imunomarcação, conforme já descrito por Yamada et al (1997).
No presente trabalho também foi analisado o padrão de expressão imuno-histoquímica
da E-caderina e da β-catenina em carcinoma epidermóide de lábio inferior e língua,
correlacionando a expressão destas duas proteínas com a localização anatômica da lesão, a
presença de metástase nodal e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne em
1998.
Os resultados mostraram que o padrão heterogêneo focal para a E-caderina foi o que
predominou no presente trabalho, tanto nos casos localizados em lábio inferior, quanto nos de
língua. Estes resultados corroboram com a citação de Mareel, Bracke e van Roy (1995), ao
afirmarem que nos tumores malignos, a imunoexpressão da E-caderina mostra-se
heterogênea, com alterações quantitativas e qualitativas de marcação. No presente estudo,
também se observou que em mucosa oral normal, a molécula da E-caderina apresentava uma
forte imunopositividade pericelular nas camadas basal, suprabasal e espinhosa, com variação
de intensidade, confirmando o que foi anteriormente descrito por Dower e Speight (1993) e
Chow et al (2001).
O Teste de Mann-Whitney demonstrou não haver diferença significativa no padrão de
expressão e na quantidade de células imunopositivas para os anticorpos analisados na presente
pesquisa, entre as localizações anatômicas da lesão em lábio inferior e língua. Este resultado
corrobora com os de Bowie et al (1993), que não encontraram associação entre a expressão
da E-caderina e a localização anatômica tumoral em uma amostra de 28 casos de carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço. No entanto, observa-se na literatura, escassez de trabalhos
confrontando as variáveis expressão da E-caderina e da β-catenina com a localização tumoral,
94
sendo a maioria dos estudos com estas proteínas mais correlacionadas com a gradação
histológica tumoral e o aparecimento de metástase.
Para o carcinoma epidermóide oral, a presença ou ausência de envolvimento dos
linfonodos cervicais e metástases à distância são importantes no prognóstico do paciente
(CERNEA; HOJAY, 2000; IBSEN; PHELAN, 2000). Sendo, portanto, relevante que o
patologista busque na análise histopatológica, características que possam determinar o estágio
de invasão da neoplasia (DIB et al, 1994).
No presente estudo, aplicado o Teste de Mann-Whitney, este demonstrou que não
houve diferença significativa entre o padrão de expressão e a quantidade de células
imunopositivas tanto para a E-caderina quanto para a β-catenina e a variável metástase nodal.
Estes resultados foram semelhantes aos de Van de Putte et al (2004), que não encontraram
relação entre a expressão da E-caderina e da β-catenina com os dados clínicopatológicos, tais
como recidiva, metástase e sobrevida, em carcinomas de colo uterino. Assim como também
foi similar ao trabalho de Chow et al (2001), que não encontraram correlação entre a
expressão da E-caderina e da β-catenina com metástase nodal em 85 carcinomas epidermóides
de língua. Entretanto, estes mesmos autores, através da análise de variância, mostraram que a
expressão da E-caderina apresentava valor prognóstico independente para a sobrevida de
pacientes com carcinoma epidermóide de língua.
Divergindo dos nossos resultados, os trabalhos de Schipper et al (1991), realizado com
carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço, Tanaka et al (2003), em carcinomas orais, e
Lim et al (2004), que estudaram carcinomas de língua, mostraram associação significativa
entre a expressão da E-caderina e a metástase em linfonodos, considerando a baixa expressão
desta proteína com valor indicativo para a metástase cervical. No entanto, Takes et al (2002),
apesar de terem encontrado significativa correlação entre a presença de metástase nodal e a
baixa expressão da E-caderina em carcinomas epidermóides orais, os mesmos não observaram
a referida relação nos casos localizados em faringe.
Com relação à expressão da β-catenina em membrana, os resultados do nosso trabalho
corroboram com os de Kurtz et al (2006), que não encontraram associação significativa entre
a expressão da β-catenina em membrana com a variável metástase nodal em carcinoma de
cabeça e pescoço. Entretanto, divergem dos resultados de Bànkfalvi et al (2002b), Tanaka et
al (2003) e Filies et al (2005), pois estes autores encontraram que a baixa expressão da β-
catenina estava significativamente correlacionada com a metástase nodal em carcinomas
epidermóides orais.
95
Acredita-se, de forma geral, que a perda de expressão das moléculas E-caderina e β-
catenina pode comprometer a adesão celular epitelial, o que pode refletir em uma lesão com
fenótipo invasivo e perda da diferenciação celular. Porém, dependendo do momento do
diagnóstico, a neoplasia pode ainda não apresentar sinais clínicos de elevada agressividade,
como a presença de metástase nodal. Vale ressaltar que no nosso estudo, a maioria dos casos
localizados em lábio inferior apresentaram baixa expressão da E-caderina e da β-catenina, alto
escore de malignidade e menor freqüência de metástase nodal no momento do diagnóstico.
Apesar de não ter sido possível obter informações sobre a proservação dos pacientes da
presente pesquisa, acredita-se que a ausência de metástase nodal no momento do diagnóstico
pode não refletir sua ausência com o passar dos anos, podendo ser somente mais tardia a
ocorrência da mesma.
Concordamos com Takes et al (2002) ao mencionarem que o processo de
desenvolvimento do tumor e da metástase é complexo, sendo improvável que um único
parâmetro molecular seja capaz de predizer o comportamento metastático tumoral. Considera-
se ainda relevante a afirmação de Kurtz et al (2006), ao chamarem atenção para a existência
de outros fatores envolvidos na formação de metástase nodal que ainda não estão
esclarecidos.
A complexidade dos mecanismos moleculares envolvidos na formação da metástase
nodal foi demonstrada por Kurtz et al (2006), que não encontraram correlação entre a
presença de metástase nodal com a baixa expressão da E-caderina, apesar de terem detectado
significativa associação desta última variável com a invasão vascular e menor sobrevida dos
pacientes com carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço. Talvez, a perda de adesão
celular seja um evento inicial para a invasão tumoral, sendo necessárias outras moléculas, tais
como as metaloproteinases da matriz (MMPs) e as integrinas, que atuam na interação célula-
matriz extracelular, para consolidar a invasão e promover a formação da metástase nodal.
Concordando também com os nossos achados, Auerkari (2006) menciona que a perda
da expressão da E-caderina, ou das suas contrapartes, cateninas, na adesão celular, resultará
no aumento do potencial metastático e invasivo das células neoplásicas, porém, devido à
existência de vários mecanismos alternativos para o mesmo efeito, modestas são as evidências
da correlação entre a perda da E-caderina e da β-catenina com a metástase nodal.
No presente estudo, detectou-se diferença estatisticamente significativa quanto à
expressão em membrana das proteínas E-caderina e β-catenina em relação à gradação
histológica de malignidade. Pôde-se observar a presença de uma correlação negativa
96
moderada estatisticamente significativa entre o padrão de expressão e a quantidade de células
imunopositivas para a E-caderina e a β-catenina e o escore total de malignidade.
Esses resultados são semelhantes aos estudos de Bagutti, Speight e Watt (1998),
Gasparoni et al (2004), Ghadimi et al (1999), Lim et al (2004), Schipper et al(1991), Sato et al
(1996), Ueda et al (2006), Yamada et al (1997) e Yokoyama et al (2001), ao demostrarem
que a expressão da E-caderina estava inversamente proporcional à gradação histológica de
malignidade tumoral; no entanto, divergentes dos estudos de Bowie et al (1993) e Chow et al
(2001), que não encontraram esta correlação.
A significativa correlação entre a expressão reduzida da β-catenina em membrana e o
alto escore de malignidade, observada no presente trabalho, diverge dos achados de Castro et
al (2000), que não encontraram esta relação em carcinomas esofagianos. No entanto, os
nossos resultados e os de Bànkfalvi et al (2002a) suportam a hipótese de que a E-caderina e a
β-catenina estão envolvidas na polaridade e arquitetura tecidual, estando significativamente
correlacionada com a gradação histológica do front de invasão tumoral em carcinoma
epidermóide oral.
Semelhante aos nossos resultados, Julkunen et al (2003) observaram que a expressão
da β-catenina estava significativamente correlacionada com a gradação tumoral, não havendo
associação da imunoexpressão desta proteína com a metástase nodal em câncer pancreático.
Estes autores ainda detectaram que as variáveis presença de metástase nodal e expressão
reduzida da β-catenina foram fatores prognósticos independentes para a sobrevida dos
pacientes.
Ghadimi et al (1999) e Huiping et al (2001) também encontraram correlação entre a
gradação tumoral e a perda de expressão da E-caderina; entretanto, estes autores não
observaram correlação com a expressão da β-catenina em câncer colorretal e gástrico,
respectivamente. Em nosso estudo, ambas as proteínas estavam significativamente
correlacionadas com a gradação histológica, embora, dentre os 20 casos classificados como
alto grau de malignidade, 14 mostraram menos de 25% de células positivas para E-caderina
(escore 1), enquanto para a expressão da β-catenina em membrana, 7 casos apresentaram de
26-50% de células positivas (escore 2). Deste modo, os nossos resultados nos induzem a
concordar com Rocha et al (2003) ao afirmarem que a perda progressiva da E-caderina parece
ser um evento mais predominante na determinação do grau de diferenciação dos carcinomas
do que as alterações na β-catenina. Desta forma, os achados da presente pesquisa ratificam a
hipótese de Laykhovistky et al (2004), de que a E-caderina está mais precocemente sub
97
expressa do que a β-catenina nas transformações malignas, constituindo um indicador mais
sensível da tumorigênese.
A maior vulnerabilidade na expressão da E-caderina em carcinomas epidermóides
também foi defendida por Kurtz et al (2006) ao encontrarem que a diminuição da expressão
da E-caderina e não da β-catenina estava associada com a sobrevida diminuída e com o
aumento do risco de invasão vascular nos pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço.
Destaca-se que, no presente trabalho, foi observada uma correlação positiva
significativa, porém não perfeita, entre a imunoexpressão das proteínas E-caderina e β-
catenina, tanto no critério padrão de expressão quanto na análise semi-quantitativa de células
imunopositivas. Estes resultados ratificam o anteriormente encontrado por Bànkfalvi et al
(2002a), Huiping et al (2001) e Van de Putte et al (2004), quando observaram correlação entre
a expressão da E-caderina e da β-catenina em membrana celular de carcinomas orais,
gástricos e de colo uterino, respectivamente.
Convém ressaltar que metodologias diferentes geram resultados divergentes, como já
mencionado por Woolgar (2006) ao afirmar que a evidência científica tende a ser
contraditória, possivelmente, devido ao uso de diferentes métodos estatísticos e inter-relações
complexas. De acordo com Takes et al (2002), a escolha de pontos cutoff para separar
negativo de positivo carece de fundamentação básica, podendo influenciar nos resultados.
Inúmeros trabalhos sobre a expressão imuno-histoquímica da E-caderina e da β-
catenina realizaram metodologias com a escolha do ponto cutoff. Ghadimi et al (1999)
determinaram o ponto cutoff de 80%; Kowalski, Rubin e Kleer (2003), Seidler et al (2004)
estabeleceram um cutoff de 70%; para Bànkfalvi et al (2002a), Bànkfalvi et al (2002b) e
Tanaka et al (2003) foi 75%; nos trabalhos de Chow et al (2001), Kurtz et al (2006), Lee et al
(2003), Van de Putte et al (2004) e Yamada et al (1997) foi 50%; enquanto em outros estudos
apenas mencionaram presença e ausência de expressão (TAKES et al, 2001; TAKES et al,
2002).
No presente estudo, optou-se por uma metodologia com escores sem escolha de um
ponto cutoff para a análise estatística dos resultados. Foram adotados os critérios de
Lyakhovitsky et al (2004), que analisaram semiquantitativamente o percentual de células
tumorais positivas para E-caderina e β-catenina em membrana celular, assim como o padrão e
intensidade de marcação destas proteínas através de quatro escores. Deste modo, utilizou-se o
Teste de Mann-Whitney, cuja análise estatística testa a igualdade das medianas, ao avaliar o
grau de entrelaçamento dos dados após a ordenação.
98
Como se sabe a β-catenina exerce um duplo papel, sendo importante para a adesão
celular mediada por caderina e desempenhando também função chave na transdução de sinal
mediada pela via de sinalização Wnt (CAVALLARO; CHRISTOFORI, 2001; CLAPPER;
COUDRY; CHANG, 2004). Na ausência da sinalização Wnt, a β-catenina rapidamente sofre
fosforilação e degradação, entretanto, com a ativação deste mecanismo de sinalização, a
concentração da β-catenina no citoplasma se eleva, facilitando sua translocação para o núcleo
(CAVALLARO; CHRISTOFORI, 2001; JANKOWSKI et al, 1997). No núcleo, a β-catenina
se liga a membros da família TCF/LEF de fatores de transcrição e ativa a expressão de genes
TCF/LEF alvo, que incluem os proto-oncogenes c-Myc e ciclina D1 (AKIYAMA, 2000;
CLAPPER; COUDRY; CHANG, 2004).
Baseado no exposto anteriormente, nesse trabalho, procurou-se verificar a expressão
imuno-histoquímica da β-catenina não só em membrana, mas também no citoplasma e no
núcleo. Observou-se que a expressão da β-catenina em citoplasma foi mais freqüente do que
em núcleo, pois, dentre os 30 casos de carcinoma epidermóide oral do presente trabalho, 22
casos (73,33%) exibiram expressão citoplasmática e 06 (20%) apresentaram expressão em
núcleo, confirmando que a β-catenina nuclear parece não ser um achado comum em
carcinoma epidermóide oral, conforme evidenciado por Gasparoni et al (2002), Kudo et al
(2004) e Ueda et al. (2006).
Quanto à expressão da β-catenina em citoplasma, os resultados da presente pesquisa
foram similares aos de Lo Muzio et al (1999), que detectaram esta marcação em mais de 18
dos 30 casos de carcinomas epidermóides orais. No entanto, nos trabalhos de El-Bahrawy et
al (2001) e Seidler et al (2004), houve a marcação citoplasmática da β-catenina em todos os
casos, embora estas pesquisas tenham sido realizadas com carcinomas colorretais.
Gasparoni et al (2002) chamaram a atenção para a relação inversa entre a expressão da
β-catenina em membrana e a marcação citoplasmática nas células carcinomatosas. Fato
semelhante também foi constatado em nossa pesquisa, pois os resultados mostraram que a
expressão citoplasmática estava presente em 22 casos, sendo que dentre estes, 15
apresentaram perda na expressão da β-catenina em membrana, através do padrão heterogêneo
ou ausente. Entretanto, divergindo dos nossos resultados, Huiping et al (2001) observaram
expressão citoplasmática da β-catenina em 11 de 50 carcinomas gástricos, sendo que 9 dentre
os 11 tumores exibiam, concomitantemente, expressão forte ou moderada em membrana e
expressão positiva em citoplasma, sugerindo que a degradação normal da β-catenina livre no
citoplasma está inibida.
99
Observou-se, na presente pesquisa, significativa associação entre a marcação
citoplasmática para β-catenina e a gradação histológica de malignidade, sendo a mesma mais
freqüente nos casos de alto escore de malignidade. Contrariamente, Lee et al (2003) não
encontraram associação entre a expressão da β-catenina em membrana e em citoplasma com a
gradação histológica de malignidade em carcinomas ovarianos. Esta diferença nos resultados
pode encontrar explicação no tipo de tumor, na diversidade de subtipos histológicos dos
carcinomas ovarianos e nas diferenças na escolha do tipo de análise dos dados.
Convém ressaltar que Laykhovitsky et al (2004) observaram a presença da β-catenina
em citoplasma somente nos carcinomas epidermóides cutâneos, não tendo sido detectada sua
presença em lesões precursoras, sugerindo que a β-catenina citoplasmática pode refletir o
potencial invasivo das células. Considera-se a localização da β-catenina importante, pois
segundo El-Bahrawy et al (2001), a elevada freqüência da β-catenina citoplasmática foi o
fator que predispôs a transferência desta molécula para o núcleo nos carcinomas colorretais.
O presente estudo detectou 06 casos (20%) com expressão da β-catenina em núcleo,
não tendo sido encontrada associação com localização da lesão, metástase nodal e gradação
histológica. No trabalho de Gasparoni et al (2002), dentro de uma amostra de 24 carcinomas
epidermóides orais, somente 02 casos (8,33%) apresentaram expressão nuclear, estando
localizada somente em células invasivas. Já, Kudo et al (2004) não encontraram marcação
nuclear nos 18 carcinomas epidermóides orais metastáticos estudados, resultados também
verificados por Bagutti, Speight e Watt (1998), que não detectaram acúmulo de β-catenina no
núcleo de 22 carcinomas epidermóides orais. Entretanto, El-Bahrawy et al (2001) e Seidler et
al (2004) observaram expressão nuclear para β-catenina em 93% e 80% dos carcinomas
colorretais, respectivamente por eles estudados.
A freqüência de 20% dos casos do nosso estudo com expressão da β-catenina em
núcleo foi semelhante à detectada por Pukkila et al (2001), que encontraram 23%, pois 27 dos
138 casos de carcinoma epidermóide de faringe mostraram expressão nuclear da β-catenina.
No nosso trabalho, porém, não foi evidenciada nenhuma correlação, enquanto estes autores
encontraram correlação entre a expressão nuclear da β-catenina com a sobrevida dos
pacientes. Castro et al (2000) também observaram que os pacientes com carcinoma
epidermóide de esôfago, que mostraram expressão nuclear da β-catenina apresentaram
sobrevida média em meses inferior aos que não apresentaram, ratificando que ainda há
necessidade de estudos sobre a β-catenina em carcinomas.
Estes dados nos levam a concordar com Fillies et al (2005) e Pukkila et al (2001) ao
mencionarem que o papel da β-catenina no desenvolvimento e progressão do câncer na região
100
de cabeça e pescoço ainda não está esclarecido, possivelmente devido à pequena quantidade
de estudos, à combinação de diferentes regiões anatômicas com diversos comportamentos na
mesma amostra, às diferenças no registro e análise da imunoexpressão, além das diferenças
nos procedimentos de preparação dos espécimes, fator anteriormente citado por Bagutti,
Speight e Watt (1998). Ainda, concordamos com Takes et al (2002) ao afirmarem que os
estudos sobre a expressão de marcadores imuno-histoquímicos mostram resultados
conflitantes devido a inúmeros fatores que vão desde diferenças nas técnicas e nos anticorpos
utilizados até fatores relacionados à heterogeneidade tumoral.
Assim, verificamos a necessidade de que sejam realizadas mais pesquisas sobre a
expressão imuno-histoquímica da E-caderina e da β-catenina com amostras maiores e
envolvendo carcinomas epidermóides localizados em uma única região anatômica, sendo
investigada a presença ou não de metástase nodal, como também o tempo de sobrevida dos
pacientes. Na presente pesquisa, não nos foi possível obter uma amostra maior, assim como
coletar as informações sobre a sobrevida dos pacientes, elementos que podem ter influenciado
nos resultados aqui apresentados. Ao se estudar a β-catenina, constatamos também que os
achados sobre a sua imunoexpressão citoplasmática e nuclear estão omitidos em diversos
trabalhos citados na literatura, porém, em nosso estudo, estas informações foram analisadas e
relatadas. Por fim, verificamos que a alteração na expressão imuno-histoquímica da
E-caderina e da β-catenina em membrana e a presença da β-catenina em citoplasma e em
núcleo de células de carcinomas epidermóides orais observados neste trabalho, podem indicar
que estas proteínas, possivelmente, estão envolvidas no comportamento biológico desta
neoplasia, principalmente, nas áreas tumorais invasivas com maior perda de diferenciação
celular, onde esta associação torna-se mais evidente.
101
CONCLUSÕES
102
7 CONCLUSÕES
Frente aos nossos resultados, podemos concluir que:
1. O padrão de expressão imuno-histoquímica das proteínas E-caderina e β-catenina em
carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua apresenta-se, predominantemente
heterogêneo, havendo variação na intensidade de imunomarcação.
2. Não existe diferença estatisticamente significativa entre a expressão imuno-
histoquímica da E-caderina e da β-catenina em carcinoma epidermóide oral e a
localização anatômica tumoral (lábio inferior e língua).
3. Não existe diferença estatisticamente significativa entre a expressão imuno-
histoquímica da E-caderina e da β-catenina em carcinoma epidermóide oral e a
presença ou não de metástase nodal no momento do diagnóstico.
4. Existe diferença estatisticamente significativa entre a expressão imuno-histoquímica
da E-caderina e da β-catenina em carcinoma epidermóide oral e o sistema de gradação
histológica de malignidade proposto por Bryne (1998).
5. Existe uma correlação negativa estatisticamente significativa entre a expressão imuno-
histoquímica da E-caderina e da β-catenina e o escore total de malignidade em
carcinomas epidermóides orais.
103
REFER
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113
AP
Ê
NDICES
114
APÊNDICE A - Dados clínicos dos casos de carcinoma epidermóide oral, quanto à
localização anatômica, sexo, idade e metástase nodal.
Caso n˚ Localização do tumor Sexo Idade Metástase nodal
115
APÊNDICE B - Gradação histológica de malignidade dos casos de carcinoma
epidermóide oral, segundo o sistema proposto e revisado por Bryne (1998).
Caso n˚ Grau de
ceratinização
Pleomorfismo
nuclear
Padrão de
invasão
Infiltrado
inflamatório
Escore
total
Gradação
histológica
116
APÊNDICE C - Dados da análise imuno-histoquímica dos casos de carcinoma
epidermóide oral.
E-caderina
membrana
β- catenina
membrana
β- catenina
citoplasma / núcleo
Caso n˚
padrão % cels + Padrão % cels +
117
ANEXO
118
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
119
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