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SIMONE SOUZA LOBÃO VERAS BARROS
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE
METALOPROTEINASES EM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR E LÍNGUA
Natal / RN
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CURSO DE DOUTORADO EM PATOLOGIA ORAL
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE
METALOPROTEINASES EM CARCINOMA
EPIDERMÓIDE DE LÁBIO INFERIOR E LÍNGUA
Doutoranda: Simone Souza Lobão Veras Barros
Orientadora: Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas
Natal / RN
2006
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-
Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para
obtenção do grau de doutor em Patologia Oral.
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Ao meu pai, Ruy (in memoriam), que sinto sempre
próximo de mim e sei que está intercedendo por nós
junto a Deus, por sua imensa capacidade de amar e
sua contagiante alegria;
À minha mãe, Mara, por quem tenho grande admiração e
cuja presença me dá extrema segurança e paz de espírito,
por seu amor, apoio e desprendimento;
Ao Robério, por seu amor, companheirismo, colaboração e por
sua disponibilidade em me acompanhar, o que foi essencial para
que eu pudesse cursar este doutorado;
A Robério Filho, Sérgio, Ruy e Juliana, verdadeiros e
preciosos presentes de Deus, por serem filhos tão carinhosos
e encherem minha vida de alegria,
dedico este trabalho.
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Agradecimentos
A Deus, meu sustentáculo em todos os reveses da vida, por sempre
sentir sua força e seu amor que me impulsionam e dão coragem para
enfrentar todos os desafios.
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À minha família, especialmente meus irmãos Ruy Júnior e Eduardo e minhas
cunhadas Adriana e Andréa, mas também tios e primos, pelo apoio, incentivo e auxílio
em tudo o que eu precisei, além do carinho e atenção dispensados aos meus filhos. À
minha tia-avó Miriam, pelas inúmeras viagens que fez a Natal, para estar perto de nós.
Ter uma família tão unida e presente me proporciona tranqüilidade e segurança para
superar todos os obstáculos.
À Dra.Roseana de Almeida Freitas, minha orientadora desde o mestrado, por
ter partilhado comigo, de maneira tão generosa, seus vastos conhecimentos científicos,
pela confiança em mim depositada e por incentivar e nortear meu desenvolvimento
como patologista e pesquisadora.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Dra. Lélia
Batista de Souza, Dr. Leão Pereira Pinto, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Dra. Lélia
Maria Guedes Queiroz e Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, que sempre serão
referências profissionais para mim, pelos ensinamentos transmitidos, pela dedicação ao
curso e pelo respeito e carinho que constantemente me dedicaram, minha admiração e
reconhecimento.
À minha grande amiga Carmen, que se alegra com minhas conquistas e me
apóia nos momentos difíceis, por sua amizade sólida e verdadeira. À Éricka, com sua
impressionante disponibilidade em ajudar os outros, pelas inúmeras vezes que recebi
seu auxílio, sua atenção e seu carinho.
Aos colegas da minha turma de doutorado Manuel, Flávio e Sormani, além de
Fernandinha e Antônio Luiz, pelas experiências e conhecimentos compartilhados e
pela convivência agradável. O respeito e cooperação entre nós nos proporcionaram
oportunidade de desenvolvimento e amadurecimento profissional e pessoal.
Aos demais colegas da Pós-graduação, com os quais tive oportunidade de
participar de discussões de lâminas, trabalhos de pesquisa ou cursar algumas
disciplinas: Claudine, Gustavo, Márcio, Márcia, Rivadávio, Rosilene, Roberta,
Andréa, Marta, Janaína, Karuzinha, Dani, Cassiano, George, João, Igor,
Jamille,Tarsila, Francielle e Leonardo. Agradeço o convívio edificante e a troca de
conhecimentos.
Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral, Canindé e Hévio, que de
modo tão competente me auxiliaram realizando as etapas laboratoriais de diversos
trabalhos de pesquisa ao longo do curso e a Gracinha, Sandrinha e Idel, pela
dedicação à Pós-graduação, pela amizade e pela simpatia.
À professora Helena Jina, pela revisão ortográfica deste trabalho e por ser
uma tia tão querida e presente. Ao professor Kênio Costa Lima, pela análise estatística
dos dados coletados neste estudo e à professora Clarissa Carvalho, que me ajudou na
elaboração do summary.
À Associação Piauiense de Combate ao Câncer - Hospital São Marcos, em
Teresina-PI, por ter permitido a utilização de espécimes teciduais armazenados nos
arquivos do seu Serviço de Anatomia Patológica para a obtenção da amostra
investigada neste trabalho. Agradeço de modo especial à Dra. Teresinha Castello
Branco Carvalho e a toda a equipe da patologia.
À Universidade Federal do Piauí, instituição da qual sou professora, por ter
viabilizado meu afastamento a fim de cursar este doutorado e aos colegas do
Departamento de Patologia e Clínica Odontológica que me incentivaram,
principalmente minha amiga e colega de disciplina, professora Divana Parente lira.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, que pela segunda vez me
recebeu, pela oportunidade de ampliar meus conhecimentos através do Programa de
Pós-graduação em Patologia Oral.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pelo apoio financeiro ao longo do curso e em todas as etapas do desenvolvimento desta
tese.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização
deste trabalho,
meus sinceros agradecimentos.
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SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
RESUMO
1 - INTRODUÇÃO............................................................................................. 21
2 - REVISÃO DA LITERATURA.................................................................... 24
2.1- CARCINOMA EPIDERMÓIDE ............................................................ 24
2.2- MATRIZ EXTRACELULAR ................................................................ 32
2.3- METALOPROTEINASES DE MATRIZ ............................................. 34
2.4- COLAGENASE-1 (MMP-1) ................................................................. 38
2.5- GELATINASES (MMP-2 E MMP-9) ................................................... 40
2.6- MATRILISINAS (MMP-7 E MMP-26) ................................................ 44
3 – PROPOSIÇÃO............................................................................................. 50
4 - MATERIAL E MÉTODOS......................................................................... 52
4.1- CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO.................................................... 52
4.2- POPULAÇÃO........................................................................................ 52
4.3- AMOSTRA............................................................................................. 52
4.4- CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA........................................ 54
4.5- ANÁLISE MORFOLÓGICA E GRADAÇÃO DE MALIGNIDADE... 54
4.6- ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO................................................... 56
4.7- ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................... 59
4.8- IMPLICAÇÕES ÉTICAS....................................................................... 60
5 - RESULTADOS............................................................................................. 62
5.1- DADOS CLÍNICOS................................................................................. 62
5.2- RESULTADOS MORFOLÓGICOS........................................................ 63
5.3- RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS......................................... 65
5.4- RESULTADOS ESTATÍSTICOS............................................................ 80
6 - DISCUSSÃO................................................................................................. 92
7 - CONCLUSÕES............................................................................................ 111
SUMMARY.........................................................................................................113
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................115
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
QUADROS
Quadro 1 – Dados clínicos de 30 pacientes portadores de carcinoma epidermóide de lábio
inferior e língua, atendidos no Hospital São Marcos em Teresina – PI.
53
Quadro 2 – Sistema de gradação de malignidade “modo de invasão” recomendado por
Bryne (1998).
55
Quadro 3 – Especificidade, clone, diluição, fabricante, recuperação antigênica e
tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo imuno-
histoquímico.
58
TABELAS
Tabela 1 – Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior e língua,
segundo o gênero e idade dos pacientes e presença de metástase. Natal / RN –
2006.
62
Tabela 2 – Escores de malignidade estabelecidos de acordo com o método de Bryne
(1998), por meio da avaliação morfológica de carcinomas epidermóides de
lábio inferior e língua. Natal/RN-2006
63
Tabela 3 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9 e 26),
nas células neoplásicas localizadas no front de invasão tumoral de carcinomas
epidermóides localizados em lábio inferior e língua. Natal/RN-2006
66
Tabela 4 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases (MMPs -1, 2, 7, 9 e 26),
nas células neoplásicas localizadas no front de invasão tumoral de carcinomas
epidermóides de baixo e alto graus de malignidade. Natal/RN-2006
67
Tabela 5- Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9 e 26),
nas células estromais adjacentes ao front de invasão tumoral de carcinomas
epidermóides localizados em lábio inferior e língua. Natal/RN-2006
68
Tabela 6- Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9 e 26),
nas células estromais adjacentes ao front de invasão tumoral de carcinomas
epidermóides de baixo e alto graus de malignidade. Natal/RN-2006
69
Tabela 7 – Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior e língua
segundo o grau histológico de malignidade e presença de metástase. Natal / RN-
2006.
80
Tabela 8 - Significância estatística entre a reatividade imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma tumoral e a localização anatômica
de carcinomas epidermóides orais. Natal/RN-2006.
84
Tabela 9 - Significância estatística entre a reatividade imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma tumoral e a gradação histológica
de malignidade de carcinomas epidermóides orais. Natal/RN-2006.
84
Tabela 10 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e significância
estatística para a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9
e 26 no parênquima de carcinomas epidermóides de lábio inferior em relação
ao grau histológico de malignidade. Natal / RN-2006.
85
Tabela 11 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
lábio inferior e seu grau histológico de malignidade. Natal/RN-2006.
86
Tabela 12 - Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e significância
estatística para a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9
e 26 no parênquima de carcinomas epidermóides de língua em relação ao grau
histológico de malignidade. Natal / RN-2006.
87
Tabela 13 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
língua e seu grau histológico de malignidade. Natal/RN-2006.
87
Tabela 14 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e significância
estatística para a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9
e 26 no parênquima de carcinomas epidermóides de língua em relação à
presença de metástase. Natal / RN-2006.
88
Tabela 15 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
língua e a presença de metástase. Natal / RN-2006.
88
Tabela 16 – Coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) entre
expressão das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 e os escores morfológicos
estabelecidos de acordo como método de Bryne (1998), em carcinomas
epidermóides de lábio inferior e língua. Natal/RN-2006
90
FIGURAS
Figura 1- Carcinoma epidermóide de baixo grau de malignidade, exibindo pleomorfismo
nuclear e ceratinizaação moderados, borda de invasão tumoral bem delimitada
e intenso infiltrado inflamatório (HE / 400X).
64
Figura 2- Carcinoma epidermóide de alto grau de malignidade, com intenso pleomorfismo
nuclear, invasão tumoral em pequenos grupos celulares e escasso infiltrado
inflamatório (HE / 400X).
64
Figura 3- Expressão imuno-histoquímica moderada da MMP-1 em carcinoma epidermóide
de baixo grau de malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-
biotina 400X).
70
Figura 4- Moderada imunorreatividade da MMP-1 em carcinoma epidermóide de alto grau
de malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
70
Figura 5- Expressão imuno-histoquímica de intensidade moderada da MMP-1 em
carcinoma epidermóide de baixo grau de malignidade localizado em língua
(Estreptoavidina-biotina 400X).
71
Figura 6- Moderada marcação imuno-histoquímica da MMP-1 em cordões celulares de
carcinoma epidermóide de língua exibindo alto grau de malignidade
(Estreptoavidina-biotina 400X).
71
Figura 7- Marcação inexpressiv de MMP-2 em carcinoma epidermóide de baixo grau de
malignidade localizado em lábio infeior (Estreptoavidina-biotina 400X).
72
Figura 8- Ausência de expressão da MMP-2 em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
72
Figura 9- Ausência de expressão da MMP-2 em carcinoma epidermóide de baixo grau de
malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
73
Figura 10- Marcação inexpressiva da MMP-2 em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
73
Figura 11- MMP-7 moderadamente expressa em carcinoma epidermóide de baixo grau de
malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
74
Figura 12- Expressão imuno-histoquímica moderada da MMP-7 em carcinoma
epidermóide de alto grau de malignidade localizado em lábio inferior
(Estreptoavidina-biotina 400X).
74
Figura 13- Moderada imunorreatividade da MMP-7 em carcinoma epidermóide de baixo
grau de malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
75
Figura 14- MMP-7 intensamente expressa em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
75
Figura 15- Marcação inexpressiva da MMP-9 em carcinoma epidermóide de baixo grau de
malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
76
Figura 16- Ausência de expressão da MMP-9 em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
76
Figura 17- Marcação inexpressiva da MMP-9 em carcinoma epidermóide de baixo grau
de malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
77
Figura 18- MMP-9 moderadamente expressa em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
77
Figura 19- Moderada imunorreatividade da MMP-26 em carcinoma epidermóide de baixo
grau de malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina
400X).
78
Figura 20- MMP-26 intensamente expressa em carcinoma epidermóide de alto grau de
malignidade localizado em lábio inferior (Estreptoavidina-biotina 400X).
78
Figura 21- Expressão imuno-histoquímica da MMP-26 em carcinoma epidermóide de
baixo grau de malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina
400X).
79
Figura 22- Intensa imunoexpressão da MMP-26 em carcinoma epidermóide de alto grau
de malignidade localizado em língua (Estreptoavidina-biotina 400X).
79
Figura 23 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no
parênquima de carcinomas epidermóides localizados em lábio inferior e língua.
81
Figura 24 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no
parênquima de carcinomas epidermóides de baixo e alto graus de malignidade.
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RESUMO
O carcinoma epidermóide oral é uma neoplasia maligna de alta incidência e uma
importante causa de morbidade e mortalidade, que exibe, entretanto, variável
comportamento biológico, em função de diversos fatores. O objetivo do presente estudo
consistiu em avaliar a expressão imuno-histoquímica de MMP-1, MMP-2, MMP-7,
MMP-9 e MMP-26 em carcinomas epidermóides, em relação à localização da lesão e ao
seu grau histológico de malignidade. Foram selecionados 15 carcinomas epidermóides
de lábio inferior e 15 de língua, que, após avaliação morfológica, foram classificados
em neoplasias de baixo grau de malignidade (n=17) e alto grau (n=13), e
subseqüentemente submetidos à marcação imuno-histoquímica para as MMPs. Todos os
espécimes investigados expressaram pelo menos duas das metaloproteinases
pesquisadas, que foram mais evidentes no citoplasma das células tumorais localizadas
no front de invasão. Os carcinomas epidermóides de língua exibiram maior marcação
imuno-histoquímica de MMPs pelas células neoplásicas que aqueles de lábio inferior,
com diferença significativa estatisticamente para a MMP-9 (p=0,030). Os carcinomas
epidermóides de alto grau demonstraram maior expressão de metaloproteinases, exceto
para MMP-2, em comparação às lesões de baixo grau, com diferença significativa
estatisticamente para MMP-7 (p=0,0001) e MMP-26 (p=0,016). Adicionalmente foi
evidenciada uma relação direta entre os escores morfológicos de malignidade e a
imunopositividade às MMPs, com significância estatística para MMP-7 e MMP-26.
Com base nestes resultados, pode-se concluir que a maior expressão de MMPs pelas
células tumorais, especialmente MMP-9, pode contribuir para o maior potencial
invasivo dos carcinomas de língua em comparação aos labiais. Além disso, a gravidade
histológica dos carcinomas epidermóides parece estar relacionada à marcação imuno-
histoquímica de metaloproteinases, especialmente matrilisinas, o que sugere que a
capacidade de degradar membrana basal parece ser determinante no padrão de
diferenciação histológica das neoplasias pesquisadas. Os altos índices de positividade às
MMPs encontrados nos espécimes estudados refletem a marcante participação destas
enzimas no desenvolvimento dos carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua.
Palavras-chave: Câncer oral, carcinoma epidermóide de lábio inferior, carcinoma
epidermóide de língua, metaloproteinase, imunohistoquímica.
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1 – INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermóide constitui quase 95% das neoplasias malignas orais e
cerca de 38% dos tumores malignos situados em cabeça e pescoço (SCULLY, 2002),
ocorrendo especialmente em língua e lábio (GERVASIO et al., 2001; KERDPON,
SRIPLUNG, 2001). A agressividade desta lesão varia com uma série de fatores, no
entanto, de modo geral, os carcinomas de língua exibem comportamentos biológico e
clínico muito agressivos, enquanto as lesões de lábio tendem a ter bom prognóstico e
baixo grau de metástase (MIRANDA, 2002; DANTAS et al., 2003). A incidência do
carcinoma epidermóide tem aumentado nos últimos anos e seu prognóstico se mostra
variável, com taxas de sobrevida de cinco anos, oscilando entre 74,4%, para lesões
iniciais, e 29,0%, para carcinomas diagnosticados em estágio IV (INCA, 2006).
Diversos estudos têm sido realizados objetivando melhor conhecer o
comportamento biológico desta neoplasia. Segundo Bryne (1991) o prognóstico do
carcinoma epidermóide está relacionado à sua atividade proliferativa, grau de
diferenciação e potencial para invasão e metástase. Estes dois últimos processos
envolvem múltiplas etapas, como a degradação da membrana basal e matriz
extracelular, alterações na adesividade celular, movimento de células tumorais e
angiogênese (CURRAN; MURRAY, 2000). Assim, no processo de invasão tumoral as
células neoplásicas interagem entre si, bem como com as células do estroma e com os
componentes da matriz extracelular (ZIOBER; SILVERMAN; KRAMER, 2001).
As metaloproteinases de matriz (MMPs) consistem em uma família de enzimas
proteolíticas que participam dos processos de invasão e metástase, mas também
exercem funções fisiológicas, como a remodelação tecidual e a embriogênese
(WESTERMARK, KAHARI, 1999; IKEJIRI et al., 2005). Coletivamente, as MMPs são
capazes de degradar todas as proteínas da matriz extracelular (MEC) (SOUZA, LINE,
2002; VICENTE et al., 2005) e estão relacionadas à progressão tumoral tanto pela
capacidade de romper estas barreiras físicas como por regularem a angiogênese e
proliferação celular através da modulação de fatores de crescimento e citocinas
estocadas na MEC (HAAS, MADRI, 1999; ZUCKER et al., 2001; FRANCHI et al.,
2002).
O estudo das metaloproteinases em variados tipos de neoplasias tem
demonstrado que estas enzimas podem ser úteis como marcadores prognósticos. Além
disso, a determinação precisa de quais MMPs estão envolvidas nos processos de invasão
tumoral e metástase nos diversos tumores pode permitir o desenvolvimento de drogas
dirigidas para MMPs específicas ou de inibidores para estas proteínas (CURRAN;
MURRAY, 2000).
Este trabalho tem o objetivo de investigar a expressão imuno-histoquímica de
metaloproteinases de matriz em carcinomas epidermóides de alto e baixo graus de
malignidade, localizados em lábio inferior e língua, dois sítios anatômicos nos quais são
observados comportamentos biológicos distintos. Com os dados obtidos, almeja-se
contribuir para um maior conhecimento acerca do carcinoma epidermóide oral,
especialmente no que diz respeito aos mecanismos envolvidos no processo de invasão
tumoral.
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2 - REVISÃO DA LITERATURA
2.1- Carcinoma Epidermóide
O câncer de boca é a neoplasia maligna mais comum da região de cabeça e
pescoço, excluindo-se o câncer de pele. A incidência desta patologia no Brasil é uma
das mais altas do mundo, estando entre o seis tipos de câncer que acometem mais
frequentemente o sexo masculino e entre os oito que mais afetam o sexo feminino
(NAGPAL, DAS, 2003; DEDIVITIS et al., 2004).
De acordo com o Instituto Nacional do Câncer, a estimativa para ocorrência de
câncer bucal no Brasil, em 2006, é de 13.470 casos, dos quais 10.060 devem acometer o
gênero masculino (INCA, 2006).
Já está bem estabelecido que o câncer oral tem etiologia multifatorial, na qual
estão envolvidos tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos, sendo provavelmente
necessária a ação de mais de um destes carcinógenos para a produção da malignidade
(NAGPAL, DAS, 2003; NEVILLE et al., 2004). De acordo com Boshoff e Weiss
(2001), ocorre, na maioria dos casos, um acúmulo seqüencial de mutações somáticas
por muitos anos, antes da expansão clonal de células transformadas.
A carcinogênese oral, portanto, é um processo multifásico que requer a
desestabilização de vários sistemas de controle que coordenam o comportamento celular
(PANDE et al., 2002; RAMALHO et al., 2002; SCHLIEPHAKE, 2003), havendo
ruptura da sinalização celular, reparo de DNA e ciclo celular, que são fundamentais para
a homeostase (BETTENDORF, PIFFKÒ, BÀNKFALVI, 2004). As lesões que se
tornam clinicamente evidentes são aparentemente resistentes aos mecanismos de defesa
da imunidade celular (KERREBIN et al., 1999).
O tabagismo e o etilismo crônicos são os principais fatores de risco para o
câncer de boca (MOORE et al., 2000; REGEZI, SCIUBBA, 2000; CANTO, DEVESA,
2002; BETTENDORF, PIFFKÒ, BÀNKFALVI, 2004; TROMP et al., 2005), pois
apenas 15 a 20% dos pacientes portadores de lesões malignas orais não têm história
pregressa destes hábitos (VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004). Conforme
Venturi, Pamplona e Cardoso (2004), o risco de desenvolvimento de carcinoma de
células escamosas oral na população geral aumenta em cerca de sete vezes com o
tabagismo, e em até quinze vezes quando este hábito está associado ao consumo crônico
de álcool.
Cerca de 94% de todas as neoplasias malignas de boca são representadas por
carcinomas epidermóides, também denominados carcinomas espinocelulares e
carcinomas de células escamosas. Esta neoplasia é caracterizada por proliferação
desordenada das células da camada espinhosa do epitélio, expressando variáveis graus
de similaridade com suas células de origem (MOORE et al., 2000; DANTAS et al.,
2003).
O carcinoma epidermóide acomete especialmente pacientes entre a 5ª e 8ª
décadas de vida, tendo ocorrido, no entanto, aumento na incidência desta neoplasia em
pacientes mais jovens, com menos de 45 anos de idade (MAKENZIE et al, 2000;
NAGLER et al., 2002). Nestes, curiosamente, a etiologia parece mais ligada à infecção
por vírus oncogênicos, especialmente o HPV, que ao consumo de fumo e álcool
(VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004; VENTURI, PAMPLONA, CARDOSO,
2004).
O gênero masculino exibe risco duas a três vezes maior, de desenvolver
carcinoma epidermóide oral, que o feminino. Esta diferença, no entanto, tem diminuído,
provavelmente devido ao aumento do hábito do tabagismo entre as mulheres (REGEZI,
SCIUBBA, 2000).
Estudando 102 carcinomas de células escamosas intra-orais, Sawair et al. (2003)
verificaram que 68,8% dos pacientes faziam uso de tabaco e 67,6% de álcool. A idade
média dos pacientes foi de 64 anos, com pico de incidência entre 50 e 79 anos.
Dedivitis et al. (2004) avaliaram o perfil de pacientes portadores de carcinomas
epidermóides de boca e evidenciaram uma proporção homem-mulher de 3,35:1. As
idades variaram de 46 a 91 anos, com mediana de 62 anos; 76,8% dos pacientes se
declararam tabagistas, enquanto 74% relataram ter o hábito do etilismo.
Em uma série de 306 carcinomas de cabeça e pescoço, Tromp et al. (2005)
evidenciaram 134 neoplasias orais. Os pacientes exibiram idades entre 34 e 89 anos,
com média de 62 anos e os homens foram cerca de duas vezes mais afetados que as
mulheres.
Com relação à localização anatômica, os sítios mais afetados pelo carcinoma
epidermóide oral são: língua, lábio inferior e soalho de boca (REGEZI, SCIUBBA,
2000; GERVÁSIO et al., 2001; NEVILLE et al., 2004).
O carcinoma de lábio representa entre 25 e 30% dos casos de câncer bucal e
ocorre especialmente em indivíduos de pele clara, que se expõem excessivamente ao
sol. Além da radiação solar, o tabagismo parece ser importante na etiologia desta
neoplasia, que eventualmente aparece na área do lábio que serve de apoio para cigarro,
cachimbo ou charuto (REGEZI, SCIUBBA, 2000; NEVILLE et al., 2004).
Cerca de 90% dos carcinomas epidermóides labiais estão localizados em lábio
inferior, estando muitas vezes associados à queilite actínica (ABREU et al., 2004;
VARTANIAN et al., 2004). De acordo com Canto, Devesa (2002) e Neville et al.
(2004) esta neoplasia tende a ter baixa agressividade, exibindo crescimento
relativamente lento, pequena taxa de recorrência e produzindo metástase tardiamente.
Abreu et al. (2004) investigaram 57 casos de carcinoma de células escamosas
(CCE) labial, dos quais 89,47% estavam localizados em lábio inferior. Os autores
observaram que 78,9% dos pacientes eram do gênero masculino e 89,47% eram
leucodermas.
Rodolico et al. (2004) estudaram 95 carcinomas epidermóides de lábio inferior e
observaram que nesta amostra mais de 96% dos pacientes eram homens e que em
22,10% dos casos foram constatadas metástases linfáticas. Neste grupo, a média de
idade foi de 72,8 anos, enquanto entre os pacientes sem evidência de metástase, a idade
média foi de 67,1 anos. Os autores verificaram que as seguintes características estão
relacionadas ao risco de desenvolvimento de metástases para os linfonodos regionais:
tamanho da lesão primária, gradação histológica, espessura da lesão, presença de
invasão perineural e expressão da proteína p27.
Em um amplo estudo, envolvendo 617 pacientes portadores de carcinomas
labiais, com média de idade de 61 anos, Vartanian et al. (2004) constataram que 81%
dos casos foram diagnosticados em estágios precoces, classificados em T1 e T2. Os
autores verificaram também que os pacientes livres de metástase apresentaram melhores
taxas de sobrevida de 5 anos que aqueles com metástase linfática.
Para os carcinomas epidermóides intra-orais, a localização preferencial é a
língua, sendo a borda lateral posterior, a região mais afetada (REGEZI, SCIUBBA,
2000; O’CHAROENRAT et al., 2003; NEVILLE et al., 2004).
A língua é, além disso, o sítio anatômico mais freqüente de lesões agressivas
(NEVILLE et al., 2004). Os carcinomas de língua exibem significativa tendência à
recorrência pós-cirúrgica, principalmente nos dois primeiros anos (AL RAJHI et al.,
2000), têm grande predisposição para produzir metástase em linfonodos regionais
(HARRISON et al., 2003; O’CHAROENRAT et al., 2003), com índices que variam de
15 a 75%, dependendo da extensão da lesão primária (DANTAS et al., 2003) e são os
tumores orais que detêm as piores taxas de sobrevida (WÜNSCH FILHO, 2002).
AL-RAJHI et al. (2000) estudaram 85 casos de carcinoma de células escamosas
de língua diagnosticados em estágio precoce, sem evidência de metástase. Eles
observaram que 5 anos após o tratamento, 71,75% dos pacientes estavam vivos e 63%
se mostravam livres da doença. Os fatores prognósticos mais significantes neste
trabalho foram a profundidade tumoral e o tamanho da margem de ressecção.
NAGLER et al. (2002) identificaram em carcinomas de células escamosas
linguais algumas variáveis independentes, que demonstraram um efeito significativo na
sobrevida do paciente: estadiamento clínico, grau histológico de malignidade e
localização da lesão.
Em um estudo desenvolvido por Gonzalez-Moles et al. (2002) o parâmetro que
exibiu maior relação com a sobrevida dos pacientes foi a profundidade tumoral. 76,76%
dos casos estudados ocorreram em homens e a média de idade foi de 58 anos.
Pesquisando as características de 50 casos de carcinoma de células escamosas de
língua, O’Charoenrat et al. (2003) constataram que o gênero masculino foi mais afetado
que o feminino e que a média de idade dos pacientes foi de 60 anos. Em 84% dos casos
a lesão primária estava localizada na borda lateral da língua, enquanto dorso e ventre
linguais sediaram, respectivamente, 12% e 4% destes carcinomas.
Em 2003, Dantas et al. investigaram 16 casos de carcinomas epidermóides de
língua e observaram, nesta amostra, grande predileção pelo sexo masculino (75% dos
casos) e maior incidência entre 61 e 70 anos de idade. A taxa de recorrência de cinco
anos após o tratamento da lesão primária foi de 56,25%.
Em uma amostra de 23 pacientes portadores de carcinomas de células escamosas
de língua, Guttman et al. (2004) observaram as seguintes características: predileção pelo
sexo masculino (52,2% dos casos), média de idade na época do diagnóstico de 59 anos,
taxa de recorrência de 47,8% nos dois primeiros anos e ocorrência de metástase linfática
em 17,39% dos pacientes, neste mesmo período.
As características clínicas do tumor, especialmente o tamanho e a extensão da
disseminação metastática, consistem excelentes indicadores prognósticos do paciente.
Estes parâmetros permitem o estadiamento das neoplasias malignas, através do sistema
de classificação TNM, onde T se refere ao tamanho do tumor, N, à propagação aos
gânglios linfáticos regionais e M, a metástases à distância. A avaliação destas três
variáveis permite a classificação das lesões em estágios de I a IV (ABREU et al., 2004;
NEVILLE et al., 2004).
O sistema TNM tem forte relação com a agressividade da lesão e, por ser
amplamente aceito e utilizado mundialmente, possui a vantagem adicional de facilitar a
comparação de resultados. De acordo com Dantas et al. (2003) e Swair et al. (2003),
entretanto, o sistema TNM não fornece informações sobre as características biológicas
do tumor.
O carcinoma epidermóide exibe ampla variação na sua morfologia microscópica,
em função do grau de maturidade das suas células. De acordo com Neville et al. (2004),
o aspecto histopatológico de um tumor encontra-se, de certa forma, relacionado com seu
comportamento biológico, embora sua correlação com o prognóstico não seja tão forte
quanto a do estadiamento clínico. A avaliação microscópica de uma neoplasia maligna
permite graduá-la de acordo com a gravidade do quadro histológico. Segundo Martins
Neto (1999) existem diversos sistemas de gradação histopatológica de malignidade, que
têm a função de fornecer subsídios que possibilitem a interpretação da agressividade da
neoplasia.
Em 1920, Broders propôs pela primeira vez um sistema de classificação
histopatológica para o carcinoma epidermóide oral, estabelecendo 4 graus de
malignidade de acordo com a diferenciação das células tumorais. Em uma publicação
posterior, em 1941, o autor enfatizou a associação entre a diferenciação tumoral e o
prognóstico da lesão.
Wahi (1971), em uma publicação da Organização Mundial da Saúde (OMS),
propôs um sistema de gradação de malignidade subdividido em três grupos, de acordo
com a análise dos seguintes parâmetros: ceratinização de células individuais, formação
de pérolas córneas, presença de pontes intercelulares, número e aspecto das figuras de
mitose, grau de pleomorfismo celular e nuclear, e presença de células gigantes
multinucleadas. Costa et al. (2002) avaliando 120 casos de carcinomas epidermóides
orais observaram correlação estatisticamente significativa entre o estadiamento clínico
TNM e a gradação histológica de malignidade proposta por Wahi.
Jackobsson et al., em 1973, idealizaram um sistema de gradação para carcinoma
epidermóide, no qual foram avaliadas as características tanto das células neoplásicas,
quanto da relação tumor-hospedeiro. Foram definidos oito parâmetros pelos autores:
estrutura neoplásica, ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, modo e
estágio de invasão, invasão vascular e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário. Cada
parâmetro recebeu escores de 1 a 4, diretamente proporcional à gravidade do quadro
histológico.
Em 1984, Crissman et al. estudaram carcinomas epidermóides de orofaringe,
utilizando uma modificação no sistema preconizado por Jackobsson (1973) para
avaliação morfológica das lesões e comparação com o estadiamento clínico TNM. Os
critérios histológicos utilizados foram: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear,
número de mitoses, padrão de invasão, infiltrado inflamatório e invasão vascular.
No mesmo ano (1984), Anneroth e Hansen analisaram histologicamente 52
carcinomas epidermóides de língua e assoalho de boca, adotando o método de
Jakobsson et al (1973), com uma pequena alteração: os autores aboliram o parâmetro
“invasão vascular”, por considerá-lo de difícil avaliação.
Anneroth, Batsakis e Luna, em 1986, utilizaram os seguintes parâmetros para
estabelecer o grau de malignidade de 89 casos de carcinoma epidermóide de assoalho de
boca: estrutura tumoral, tendência a ceratinização, aberrações nucleares, número de
mitoses, modo e estágio de invasão e resposta inflamatória. Para cada parâmetro foi
atribuído um escore de 1 a 4, sendo feita a média aritmética das pontuações de todos os
parâmetros para a obtenção do escore final. As lesões foram, então, consideradas de
baixo escore de malignidade, para valores entre 1,0 e 2,5, ou de alto escore para valores
superiores.
No ano seguinte, Anneroth, Batsakis e Luna fizeram uma revisão da
bibliografia relativa aos sistemas de gradação de malignidade e propuseram um novo
sistema para a classificação histológica dos cacinomas epidermóides orais, no qual
foram avaliados três parâmetros relativos à população tumoral (grau de ceratinização,
pleomorfismo celular e número de mitoses) e três relativos à relação tumor-hospedeiro
(padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário).
Bryne et al. (1989), estudando 68 espécimes de carcinomas de células escamosas
orais, testaram um sistema de gradação de malignidade baseado naquele preconizado
por Anneroth; Batsakis e Luna (1987), mas com avaliação apenas da área mais invasiva
do tumor. Além disso, o parâmetro estágio de invasão foi excluído e o escore final
passou a ser a somatória dos valores obtidos por cada parâmetro, sendo considerados de
baixo escore os valores de 5 a 10 e alto escore de malignidade os valores superiores a
estes. Os autores observaram que o sistema utilizado tem maior valor prognóstico em
carcinomas de células escamosas orais que o método de Broders (1920) e concluíram
que as características histológicas das áreas mais invasivas dos tumores são importantes
indicadores do seu comportamento clínico.
Diversos trabalhos subseqüentes ressaltaram a importância, como indicador
prognóstico, da gradação histopatológica do front invasivo de carcinomas de células
escamosas orais (ODELL et al., 1994; BÀNKFALVI, PIFFKO, 2000; SAWAIR et al.,
2003; SCHLIEPHAKE, 2003; KUROKAWA et al., 2005; WOOLGAR, 2005).
Em um trabalho publicado no ano de 1992, Bryne e colaboradores confirmaram
a superioridade, como indicador prognóstico, do sistema de gradação de malignidade
proposto em 1989, em comparação com o método tradicional de Broders (1920). Os
autores verificaram que a exclusão do parâmetro “número de mitoses” não alterou a
significância do valor prognóstico, mas aumentou a reprodutibilidade.
Em 1998, Bryne fez uma revisão dos trabalhos que avaliaram as características
da frente de invasão tumoral e observou que esta é a área em que mais freqüentemente
as células tumorais exibem baixo grau de diferenciação, alto grau de dissociação celular,
maior índice de proliferação, expressão aberrante de moléculas de adesão e sinalização
molecular para angiogênese e migração. Neste trabalho, a autora propôs um novo
sistema de gradação de malignidade no qual a avaliação da área mais invasiva do tumor
permite o estabelecimento de valores entre 1 e 4 para cada um dos quatro parâmetros
estabelecidos: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e
infiltrado inflamatório.
Em 1999, Martins Neto fez uma revisão da literatura sobre os sistemas de
gradação de malignidade do carcinoma espinocelular oral e identificou alguns
parâmetros histopatológicos comuns à maioria dos sistemas propostos, o que, segundo o
autor, indica a relevância destas características para a avaliação das lesões. São elas:
grau de ceratinização, atividade mitótica e atipias celulares e nucleares.
Miranda (2002), estudando carcinomas linguais e labiais, adotou o sistema de
gradação histopatológica de Bryne (1998). Entretanto, partindo do princípio de que um
dos parâmetros morfológicos estabelecidos por Bryne et al. (1989) foi abolido pela
autora no trabalho publicado em 1998, Miranda sugeriu que também a pontuação
necessária para a classificação do grau de malignidade da lesão fosse modificada,
passando a ser: 4 a 8 pontos para baixo grau e mais de 8 pontos para alto grau de
malignidade.
2.2- Matriz Extracelular (MEC)
As células tumorais estão em contato com um microambiente que consiste de
uma matriz extracelular tridimensional e células estromais, tais como fibroblastos e
células endoteliais (LYNCH, MATRISIAN, 2002). Atualmente já ficou claro que os
constituintes deste microambiente podem afetar significativamente o comportamento
das células malignas (BROVERMAN et al., 1998; DECLERCK et al., 2004).
A matriz extracelular (MEC) consiste de uma rede complexa de macromoléculas
que preenchem os espaços intercelulares. As macromoléculas são constituídas por
proteínas fibrosas e não fibrosas imersas em uma substância fundamental formada por
glicosaminoglicanas e proteoglicanas. As proteínas fibrosas da MEC, como o colágeno
e a elastina, têm função principalmente estrutural, enquanto as proteínas não-fibrosas,
como laminina, fibronectina, tenascina, entactina, entre outras, são importantes na
adesividade celular (BRASILEIRO FILHO, 2004).
A matriz extracelular funciona como um reservatório de fatores biologicamente
ativos, como fatores de crescimento, citocinas, proteases, hormônios e outras moléculas
bioativas, que eventualmente interagem com a superfície celular (BORNSTEIN, SAGE,
2002).
Muitas propriedades das células, tais como a migração, aderência, proliferação,
grau de diferenciação e predisposição a apoptose, são influenciadas pelos constituintes
da matriz extracelular e pelos fatores bioativos nela armazenados (HEMLER,
RUTISHAUSER, 2000; BORNSTEIN, SAGE, 2002).
De acordo com Alberts et al. (1997) além da matriz intersticial, há uma matriz
especializada em forma de lâmina que se localiza sob a superfície basal dos tecidos
epiteliais e endoteliais, além de envolver células musculares, adiposas e de Schwann.
Esta estrutura, denominada lâmina basal, exerce diversas funções fisiológicas: age como
barreira seletiva para o movimento celular e como filtro molecular, participa da
migração de células no desenvolvimento embrionário e nos processos de regeneração,
determina a polaridade das células e induz a diferenciação celular.
Apesar de sofrer variações de uma localização para outra, a composição básica
da lâmina basal consiste de colágeno IV, perlecana e glicoproteínas, como laminina e
entactina (ALBERTS et al., 1997). Em determinadas regiões do organismo, há um
acúmulo de fibras reticulares e complexos protéicos e glicoprotéicos em continuação
com a lâmina basal, formando a membrana basal, visível ao microscópio eletrônico
através da coloração pelo PAS ou pela impregnação das fibras reticulares pela prata
(JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2000; SCULLY et al., 2005).
As neoplasias malignas exibem caracteristicamente um crescimento infiltrativo,
sendo capazes de invadir tecidos vizinhos, ganhar uma via de disseminação, chegar a
sítios distantes e neles originar novos tumores, denominados metástases (BRASILEIRO
FILHO, 2004).
A formação de metástases depende de inúmeras interações entre as células
malignas e componentes dos tecidos normais do hospedeiro, especialmente o estroma. É
um processo complexo, formado por múltiplas etapas, envolvendo: destacamento das
células da massa tumoral primária, migração em direção dos vasos sanguíneos ou
linfáticos, ruptura da membrana basal vascular, evasão da vigilância imunológica,
adesão ao endotélio vascular de órgãos distantes do sítio primário, emigração através
das junções inter-endoteliais, degradação da membrana basal e MEC periendotelial,
sobrevivência e proliferação no microambiente invadido (HONG et al., 2000,
STAMENKOVIC, 2000).
Todas as alterações genéticas sofridas pelas células neoplásicas, através das
mutações cumulativas, não terão conseqüências se não fornecerem meios para que as
células mutadas escapem da ação destrutiva de resposta do hospedeiro (LIAW,
CRAWFORD, 1999). Apenas poucas células tumorais são capazes de vencer todos os
obstáculos e sobreviver para formar novas colônias, entretanto, são suficientes para
render ao paciente prognóstico altamente desfavorável (STAMENKOVIC, 2000).
Para iniciar o processo de invasão e posteriormente produzir metástase, as
células neoplásicas precisam degradar a membrana basal subjacente e a MEC
intersticial, o que é realizado pela ação de diversas proteases, secretadas por diferentes
tipos celulares e que podem ser divididas em cinco grupos: serinas, cisteínas, treoninas,
aspárticas e metaloproteinases. Destas enzimas, as que têm maior importância no
comportamento maligno de neoplasmas são as metaloproteinases, que desempenham
um papel crucial em invasão e metástase (KUMAGAI et al., 1994; WESTERMARCK,
KAHARI, 1999; STAMENKOVIC, 2000; MYOUNG et al, 2002; VICENTE et al.,
2005).
2.3- Metaloproteinases de Matriz (MMPs)
As metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma família de endopeptidases
dependentes de zinco, que coletivamente são capazes de degradar essencialmente todos
os componentes da matriz extracelular (CURRAN, MURRAY, 2000;
O’CHAROENRAT et al., 2002; SOUZA, LINE, 2002; PALOSAARI et al., 2003;
ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005; VICENTE et al., 2005).
As primeiras MMPs foram identificadas em 1962, quando pesquisadores
observaram que a reabsorção da cauda de girinos durante a metamorfose se dava por
meio de atividade enzimática, que tinha a habilidade de degradar colágeno em pH
neutro (STAMENKOVIC, 2000; PARDO, SELMAN, 2005).
Atualmente já está bem estabelecido que também em seres humanos as MMPs
são requeridas em diversas circunstâncias fisiológicas, como na embriogênese, reparo
de feridas, remodelação óssea, ovulação e involução pós-parto (WESTERMARCK,
KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000; SOUZA, LINE, 2002; RUNDHAUG,
2003; IKEJIRI et al., 2005).
Tem sido relatado que em diversas enfermidades se observa aumento da
expressão ou atividade de MMPs, como em neoplasias, artrite reumatóide, osteoartrite,
dermatoses bolhosas auto-imunes, periodontites, desordens da articulação têmporo-
mandibular, entre outras (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY,
2000; GEARING et al., 2002; SOUZA, LINE, 2002; KIVELÄ-RAJAMÄKI et al.,
2003; TSAI et al., 2003; PEREIRA et al, 2005).
As metaloproteinases são, em geral, constituídas por domínios bem conservados:
um peptídeo sinalizador, um pró-peptídeo cuja clivagem proteolítica é necessária para a
ativação enzimática, um domínio catalítico com um sítio de ligação para o zinco e um
domínio c-terminal hemopexina, envolvido em interações com outras MMPs e
inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). Algumas MMPs exibem domínios
adicionais ou pequenas inserções (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999;
WESTERMARCK, KAHARI, 1999; SOUZA, LINE, 2002; RUNDHAUG, 2003).
A expressão de MMPs é firmemente regulada, uma vez que seu efeito é
potencialmente devastador (CURRAN, MURRAY, 2000). Esta regulação ocorre pelo
menos em três níveis: transcricional, ativação proteolítica da pró-enzima e inibição da
atividade enzimática (STAMENKOVIC, 2000; NABESHIMA et al., 2002; POLETTE
et al., 2004).
A regulação transcricional das MMPs parece representar um etapa essencial,
pois a maioria das metaloproteinases tem seus genes expressos apenas quando há
remodelação tecidual ativa, fisiológica ou patológica (CURRAN, MURRAY, 2000;
SOUZA, LINE, 2002). Vários fatores podem estar envolvidos nesta regulação, como
citocinas, hormônios, fatores de crescimento e até mesmo fragmentos resultantes da
clivagem da MEC por MMPs (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; O’TOOLE, 2001;
NABESHIMA et al., 2002).
As metaloproteinases são, em grande parte, secretadas na forma de precursores
latentes, denominados pró-enzimas ou zimogênios, que precisam ser clivados no pró-
domínio n-terminal para assumirem a forma ativa. Esta clivagem é usualmente realizada
por proteinases serinas, como a plasmina e tripsina, e ocasionalmente por outras MMPS
(THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000; STAMENKOVIC,
2000; MYOUNG et al., 2002; SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004; VICENTE et al.,
2005).
Finalmente, a regulação da atividade proteolítica das MMPs pode ser feita
através de inibidores fisiológicos, especialmente pelos inibidores teciduais de
metaloproteinases (TIMPs), que são capazes de bloquear especificamente as formas
ativas de MMPs (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY, 2000).
A inibição das MMPs pelos TIMPs se dá pela formação de complexos enzima-
inibidor. A extensão da degradação da MEC pelas metaloproteinases, tanto em
condições fisiológicas quanto em eventos patológicos, é determinada pelo balanço entre
MMPs e TIMPs (KUMAMOTO et al., 2003; RAUVALA, PUISTOLA,
TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005).
Há atualmente quatro membros conhecidos desta família: TIMP-1, 2, 3 e 4, que
exibem 30 a 40% de homologia na cadeia de aminoácidos e possuem 12 resíduos de
cisteína conservados (WESTERMARCK, KAHARI, 1999; CURRAN, MURRAY,
2000).
Apesar dos TIMPs serem os maiores inibidores das MMPS, este não é seu único
efeito biológico, pois algumas destas proteínas também induzem alterações na
morfologia celular, estimulam o crescimento de vários tipos de células, estão envolvidas
no desenvolvimento de células germinativas e têm efeito na angiogênese
(WESTERMARCK, KAHARI, 1999). De acordo com Turpeenniemi-Hujanen (2005),
os TIMPs são capazes de reduzir a angiogênese tumoral, crescimento, migração e
metástase em modelos experimentais.
As metaloproteinases de matriz são abundantemente expressas em variadas
neoplasias malignas e estão implicadas em todos os estágios de sua progressão (IKEJIRI
et al., 2005). Interessantemente, tem sido demonstrado que, em significativo número de
casos, estas MMPs são expressas nas células estromais, tornando evidente que as células
tumorais, além da produção endógena de MMPs, são capazes de utilizar as proteinases
produzidas por células do estroma (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; ZUCKER et
al., 2001; LYNCH, MATRISIAN, 2002; O’CHAROENRAT et al., 2002).
Apesar de estar claro que a associação entre as metaloproteinases e a progressão
neoplásica está diretamente relacionada com a sua capacidade de romper as barreiras
físicas representadas pela membrana basal e MEC intersticial, as metaloproteinases
também participam de outros processos do desenvolvimento tumoral, como a regulação
da angiogênese e proliferação celular através da modulação de fatores de crescimento e
citocinas armazenadas na MEC (KUSUKAWA et al., 1996; HAAS, MADRI, 1999;
ZUCKER et al., 2001; FRANCHI et al., 2002).
De acordo com Curran e Murray (2000), diferentes MMPs são capazes de
interagir com moléculas de adesão celular, de variadas classes, facilitando o movimento
de células através da matriz extracelular.
Conforme Lynch e Matrisian (2002), as metaloproteinases de origem tumoral ou
estromal podem processar moléculas da superfície celular, proteínas da MEC ou fatores
de crescimento e citocinas armazenados na matriz extracelular, causando alterações no
microambiente e favorecendo o crescimento tumoral, migração, invasão, angiogênese e
seleção de clones celulares resistentes a apoptose. Para estes autores, as MMPs podem
ser utilizadas como um meio de comunicação pelas células tumorais e estromais.
As metaloproteinases parecem estar envolvidas também na imunossupressão
associada ao câncer. Sheu te al. (2001) demonstraram que as MMPs podem induzir a
clivagem proteolítica de IL-2Rα em células T ativadas e suprimir a capacidade
proliferativa destas células.
Assim, as metaloproteinases são importantes para a criação de um ambiente que
facilite o início e manutenção do crescimento de tumores primários e metastáticos
(CHAMBERS, MATRISIAN, 1997).
Regulação positiva na expressão de várias MMPs tem sido encontrada em
câncer humano e parece estar correlacionada a estágio avançado, invasividade,
metástase e pobre prognóstico (RUNDHAUG, 2003).
Com base em sua estrutura e especificidade de substrato, as MMPs são divididas
em cinco grupos principais: colagenases, gelatinases, estromelisinas, tipo-membrana e
outras metaloproteinases, incluindo as matrilisinas (WESTERMARCK; KAHARI,
1999, SOUZA; LINE, 2002). De acordo com Thomas, Lewis e Speight (1999), as
MMPs exibem um alto grau de similaridade estrutural entre si, havendo respectivamente
cerca de 80% e 50% de homologia na seqüência de aminoácidos intra e inter grupos.
2.4- Colagenase-1 (MMP-1)
As colagenases 1, 2 e 3, que correspondem respectivamente à MMP-1, MMP-8 e
MMP-13, são as principais proteinases capazes de iniciar a degradação de vários
colágenos fibrilares nativos, incluindo os colágenos tipo I, II, III e VII
(STAMENKOVIC, 2000; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
A MMP-1 foi a primeira metaloproteinase humana a ser clonada, sendo
considerada o protótipo para todas a colagenases intersticiais. Por ter sido obtida
inicialmente a partir de fibroblastos de pele, ficou conhecida também como colagenase
fibroblástica (PARDO, SELMAN, 2005). Esta metaloproteinase é a principal enzima
responsável pela degradação do colágeno I (ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
De acordo com Brasileiro Filho (2004), o colágeno é a proteína mais abundante
da matriz extracelular intersticial e, em mamíferos, o colágeno tipo I representa cerca de
90% do total destas proteínas fibrosas. Sua clivagem, portanto, é um evento essencial
para que uma célula normal ou neoplásica possa se mover na matriz extracelular.
A proteólise do colágeno fibrilar resulta na produção de moléculas termicamente
instáveis, que se desnaturam e assumem a forma de gelatina, que pode, então, ser
degradada por outros membros da família MMP (ZIOBER et al., 2000; PARDO,
SELMAN, 2005).
Além dos colágenos fibrilares, a MMP-1 tem diversos substratos entre as
moléculas da MEC, incluindo agrecan, nidogênio, perlecan e tenascina-C. A colagenase
1 também tem-se mostrado capaz de clivar moléculas da superfície celular e substratos
não-matriz (PARDO, SELMAN, 2005).
A expressão de MMP-1 pode ser detectada em uma variedade de processos
fisiológicos e patológicos, embora em situações de normalidade, em tecidos adultos,
seus níveis estejam usualmente baixos ou não detectáveis. Em cultura de células MMP-
1 é expressa por várias células normais, como queratinócitos, fibroblastos e células
endoteliais (LIN et al., 1997; ALA-AHO, KÄHÄRI, 2005).
Aumento na expressão de MMP-1 tem sido freqüentemente relatado em
carcinomas epidermóides, muitas vezes em associação com pobre prognóstico
(ZIOBER et al, 2000; FRANCHI et al, 2002; LIN et al, 2004; ALA-AHO, KÄHÄRI,
2005).
Objetivando examinar o papel das metaloproteinases em CCE oral, Ziober et al.
(2000) investigaram a habilidade das células HSC-3, uma linhagem de células obtida de
um carcinoma de células escamosas oral altamente invasivo, de degradar colágeno tipo
I. Os autores observaram que inicialmente as células expressaram MMP-2 e MMP-9.
Com a adição de EGF (fator de crescimento epidérmico), as células HSC-3 passaram a
secretar também MMP-1 e tornaram-se capazes de degradar completamente colágeno
tipo I. Além disso, foi demonstrado, por hibridização in situ, que MMP-1 não é expressa
em mucosa normal, apenas minimamente expressa em displasia epitelial oral e
carcinoma in situ e altamente expressa em CCE invasivo. Os autores concluíram que em
carcinoma de células escamosas invasivo a MMP-1 é expressa in vivo, regulada
positivamente por EGF e requerida para degradação do colágeno tipo I.
Em 2002, Franchi et al., investigando a expressão imuno-histoquímica de
metaloproteinases em carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço, evidenciaram
moderada ou forte marcação para MMP-1 em 74,5% dos espécimes. Não foi detectada,
entretanto, nenhuma correlação significativa entre a expressão desta colagenase e outros
indicadores de agressividade tumoral pesquisados, como marcadores de angiogênese e
de proliferação celular.
Utilizando imuno-histoquímica, Miranda (2002) avaliou a expressão de
proteínas da matriz extracelular em carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua,
com variada gradação histológica de malignidade. O autor constatou, na maior parte dos
casos investigados, ausência ou fraca marcação para o colágeno I, substrato preferencial
da MMP-1.
Lin et al. (2004) estudaram o DNA genômico do sangue de 121 pacientes
portadores de carcinoma de células escamosas oral e observaram aumento do genótipo
2G no promotor da MMP-1 em maior freqüência que nos casos utilizados como
controle. Os autores concluíram que a presença deste genótipo no promotor da MMP-1
está associada ao risco de desenvolvimento de carcinomas epidermóides, o que já foi
verificado para carcinomas localizados em outras áreas do corpo.
2.5- Gelatinases (MMP-2 e MMP-9)
O grupo das gelatinases recebe esta denominação em função da sua capacidade
de degradar colágeno desnaturado (gelatina) e é constituído por dois componentes:
gelatinase-A (MMP-2) e gelatinase-B (MMP-9) (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999;
KUBOTA et al., 2000).
Estas enzimas são capazes de clivar colágeno IV, que é o principal constituinte
da membrana basal, primeira barreira para a progressão de células epiteliais neoplásicas.
Desta forma, as gelatinases desempenham um importante papel nos processos de
invasão tumoral e metástase (HONG et al., 2000; LEV et al., 2002; ROBINSON et al.,
2003; TSAI et al, 2003; RAUVALA, PUISTOLA, TURPEENNIEMI-HUJANEN,
2005). Além do colágeno IV e gelatina, as MMPs 2 e 9 têm outros substratos, que
incluem: colágenos I, V e X e, para MMP-2, laminina (STAMENKOVIC, 2000).
A MMP-2 é geralmente expressa constitutivamente, particularmente em células
estromais. A MMP-9, no entanto, é mais restrita e, em tecidos normais, exibe níveis
tipicamente baixos ou está ausente, sendo induzida em condições que requerem
remodelação tecidual (STAMENKOVIC, 2000; POLETTE et al., 2004).
As gelatinases parecem estar envolvidas no desenvolvimento de cistos e tumores
odontogênicos, participando ativamente das interações entre as células epiteliais e os
componentes mesenquimais (KUBOTA et al., 2000; KUMAMOTO et al., 2003;
WAHIGREN et al., 2003).
Diversos trabalhos têm relatado aumento na imuno-expressão de MMP-2 e
MMP-9 em carcinomas orais ou de cabeça e pescoço (HONG et al., 2000;
TOKUMARU et al., 2000; FRANCHI et al., 2002; KATAYAMA et al., 2004; KATO et
al., 2005; LIU et al., 2005; TURPEENNIEMI-HUJANEN, 2005; VICENTE et al.,
2005). De acordo com Dang et al. (2004), a MMP-9 é um importante modulador da
matriz extracelular em carcinomas epidermóides orais.
Avaliando a imunorreatividade de proteínas da membrana basal em carcinoma
epidermóides orais, Hirota, Yoneda, Osaki (1990) evidenciaram uma diminuição na
expressão de colágeno IV, especialmente em estágios mais avançados, estando
freqüentemente ausente em tumores com metástase linfonodal.
Hong et al. (2000) examinaram, através de imuno-histoquímica e zimografia, a
expressão de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas de células escamosas orais com e sem
metástase, a fim de avaliar a importância destas proteinases em predizer o potencial
metastático das lesões estudadas. Eles observaram que ambas as metaloproteinases
tiveram maior expressão no grupo metastático, mas esta diferença só foi significativa
estatisticamente para a MMP-9, indicando, segundo os autores, que a produção de
MMP-9 pelas células tumorais poderia ser um fator mais importante no processo de
metástase linfática que a produção de MMP-2.
Tokumaru et al. (2000) estudaram a ativação de MMP-2 em amostras clínicas de
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço, bem como em uma linhagem de
células epiteliais malignas em co-cultura com fibroblastos. Eles observaram que a taxa
de ativação da pro-MMP-2 foi significativamente mais alta em tecidos carcinomatosos
que em tecidos normais e que esta taxa estava correlacionada significativamente com
presença de metástase linfática. Além disso, os resultados obtidos in vitro sugeriram que
os fibroblastos estromais produzem pro-MMP-2 e que a MMP-2 é ativada pelas células
neoplásicas.
As MMPs- 2 e 9 foram avaliadas através de imuno-histoquímica por Franchi et
al. (2002) em 43 casos de CCE de cabeça e pescoço, juntamente com a análise de
MMP-1 e de vários outros fatores envolvidos no crescimento tumoral e metástase. Os
autores não observaram correlação entre a expressão das MMPs estudadas e parâmetros
clínicos, entretanto tumores com expressão aumentada de MMP-9 tiveram mais
freqüentemente metástases linfáticas em comparação com os tumores com expressão
baixa ou ausente. Além disso, este trabalho demonstrou correlação entre a expressão de
MMP-9, ativação de óxido nítrico, taxa de p53 e angiogênese, nos casos estudados de
carcinoma de células escamosas de cabeça e pescoço.
Em carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, Miranda (2000)
demonstrou ausência de expressão imuno-histoquímica de colágeno IV e laminina na
membrana basal dos ninhos neoplásicos, em quase toda a amostra. Quando presente,
esta marcação exibiu fraca intensidade e padrão delgado e descontínuo.
Em 2002, Papparella et al. examinaram a expressão imunohistoquímica de
MMP-2 e MT1-MMP em uma série de 50 carcinomas mamários caninos. Este estudo
revelou aumento na expressão destas metaloproteinases nos carcinomas estudados,
entretanto, segundo os autores, pelo método imuno-histoquímico não foi possível
relacionar tal expressão com a progressão da doença.
Robinson et al. (2003) examinaram por zimografia os níveis de MMP-2 e MMP-
9 em linhagens de células derivadas de carcinoma oral e em ceratinócitos normais.
Além disso, avaliaram o comportamento celular através da observação da invasão e
motilidade destas células in vitro e do transplante ortotópico das células tumorais para
camundongos atímicos. Os autores encontraram correlação entre a expressão de ambas
as gelatinases pelos ceratinócitos orais malignos e a invasão e motilidade exibidas por
estas células in vitro, entretanto nenhuma correlação foi observada com o potencial
metastático in vivo.
Em 30 espécimes de carcinoma epidermóide oral e em uma linhagem de células
derivadas de câncer oral, Tsai et al. (2003) verificaram que houve produção de MMP-2
e MMP-9 in vivo e in vitro e que a atividade das gelatinases foi regulada negativamente
por inibidores da proteína-kinase – C (PKC).
Estudando 23 casos de CCE primários de língua, Guttman et al. (2004)
avaliaram, por imuno-histoquímica, a expressão de MMP-9, TIMP-1 e os fatores
angiogênicos CD-34 e fator-8, comparando-a com os aspectos clinicopatológicos das
lesões. 60,9% dos espécimes exibiram imunopositividade, especialmente
citoplasmática, para MMP-9, entretanto, nenhuma correlação estatisticamente
significativa foi constatada entre a expressão de MMP-9 ou TIMP-1 e as características
tumorais avaliadas: tamanho, metástase linfática e recorrência. Os autores concluíram
que, dentre os marcadores examinados, apenas o grau de vascularização se relacionou
com a agressividade da neoplasia.
Com o objetivo de investigar se a expressão de MMP-2 e MMP-9 tem valor
predictivo para o curso clínico e prognóstico em estágios iniciais de carcinoma de
células escamosas oral, Katayama et al. (2004) utilizaram o método imuno-histoquímico
para avaliar a reatividade às gelatinases de 53 espécimes destas neoplasias. Seus
resultados indicaram que houve significante correlação entre a expressão de MMP-9,
mas não de MMP-2, com a ocorrência de metástase linfática ou à distância e pobre
prognóstico.
Nagel et al. (2004) investigaram a expressão de MMP-2, MMP-9 e TIMP-1, 2 e
3 em 20 tumores malignos e 6 neoplasias benignas de glândulas salivares, por meio de
imuno-histoquímica e zimografia. Foi evidenciado que a imunomarcação da MMP-2 foi
significativamente mais alta em tumores malignos que em adenomas. Os autores
constataram, ainda, que em carcinomas de glândulas salivares os desequilíbrios na
proporção entre MMPs e TIMPs são causados pela regulação positiva de MMPs, mas
não pela regulação negativa de TIMPs.
Em 2005, Kato et al. verificaram, por meio de zimografia e imuno-histoquímica,
que MMP-2 e MMP-9 estão presentes em carcinomas epidermóides orais humanos nas
formas de pro-enzima e ativada. Estas enzimas também foram detectadas em células
estromais, o que levou os autores a sugerir que a interação entre células tumorais e
estromais parece desempenhar um importante papel na invasão e metástase destas
neoplasias.
Para investigar o valor prognóstico das MMPs 2 e 9, Liu et al. (2005) avaliaram
a reatividade imuno-histoquímica destas gelatinases em 72 espécimes de CCE de
laringe, comparando-as com as características clinicopatológicas e prognóstico. Seus
resultados indicaram que há expressão aumentada de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas
de células escamosas de laringe, mas sem relação estatisticamente significante com os
aspectos clínicos ou histológicos do tumor. O aumento na expressividade de MMP-2
exibiu, entretanto, relação significativa com pobre prognóstico nas lesões estudadas.
Com o objetivo de avaliar a relação das MMPs 2 e 9 com prognóstico, Vicente
et al. (2005) estudaram a imunomarcação destas proteases em 68 carcinomas
epidermóides orais. Destes, 28% expressaram MMP-2 e 17% foram positivos para
MMP-9. Ambas as MMPs mostraram imunopositividade mais freqüentemente em
pacientes com metástase linfática, embora esta diferença não tenha sido estatisticamente
significante. A expressão imuno-histoquímica da MMP-9 exibiu associação
significativa com o grau de diferenciação tumoral, estágio – T e com o consumo de
álcool. Além disso, nos pacientes sem metástase linfática, a positividade para MMP-9 se
relacionou com baixas taxas de sobrevida.
2.5- Matrilisinas (MMP-7 e MMP-26)
As matrilisinas são representadas por dois componentes: a MMP-7 e a MMP-26.
Estas metaloproteinases possuem uma estrutura muito pequena, contendo apenas o
mínimo necessário para secreção e atividade. Entretanto, são capazes de clivar uma
ampla variedade de substratos da matriz extracelular (LIU et al., 2002; YAMAMOTO et
al., 2004).
A secreção de MMP-7 (matrilisina 1) tem sido descrita em células epiteliais,
fibroblastos e macrófagos (WILSON, MATRISIAN, 1996), sendo expressa em
processos normais, como cicatrização de feridas e ciclo endometrial (BAIR et al., 2001).
A MMP-7 desempenha também um importante papel na manutenção da imunidade
inata em órgãos, tais como pulmão e intestino, onde ativa proteoliticamente peptídeos
anti-bacterianos, especialmente as pró-defensinas (BURKE, 2004).
Entre os substratos da MMP-7 podemos citar a fibronectina, gelatina, colágeno
tipo IV, laminina e elastina (BAIR et al., 2001; BURKE, 2004). Além disso, a MMP-7
também é capaz de clivar os zimogênios das proteases MMP-2 e MMP-9, sendo
importante na sua ativação (WILSON, MATRISIAN, 1996).
A MMP-7 tem sido detectada em células neoplásicas malignas de origem
epitelial, onde parece desempenhar um papel ativo em virtualmente todos os estágios da
progressão do câncer (WILSON, MATRISIAN, 1996; WIELOCKY, LIBERT,
WILSON, 2004). De acordo com Sasaki et al. (2001), esta matrilisina constitui um bom
marcador para a progressão tumoral.
A MMP-26 é a menor metaloproteinase conhecida atualmente, sendo também
denominada endometase ou matrilisina-2 (PARK et al., 2003; AHOKAS et al., 2005).
Ela foi identificada recentemente, tendo sido isolada simultaneamente por três grupos
independentes (COIGNAC et al., 2000; PARK et al., 2000; URÍA, LOPÉZ-OTÍN,
2000).
Por possuir um mecanismo autolítico de ativação do zimogênio, a MMP-26
pode ser distinguida de todas as demais metaloproteinases (PARK et al., 2000;
MARCHENKO et al., 2004).
A atividade proteolítica da MMP-26 contra vários componentes da MEC,
incluindo fibronectina, colágeno IV, vitronectina, gelatina e fibrinogênio, sugere que
esta matrilisina pode exercer uma importante função na progressão tumoral
(TUNUNGLA et al., 2003; YAMAMOTO et al., 2004; AHOKAS et al., 2005). Além
disso, tem sido relatado que a MMP-26 é um ativador fisiológico e patológico de pró-
MMP-9 (URÍA, LOPÉZ-OTÍN, 2000; AHOKAS et al., 2005).
A MMP-26 é freqüentemente expressa em tecidos adultos normais, como útero,
placenta e rim, bem como em neoplasias malignas epiteliais de diferentes sítios
anatômicos, dentre os quais podemos citar: endométrio, esôfago, língua e pele
(TUNUNGLA et al., 2003; AMORIM, 2004; MARCHENKO et al., 2004; PILKA et al.,
2004; YAMAMOTO et al., 2004; AHOKAS et al., 2005).
Em 2000, Yamashita et al. estudaram 48 casos de carcinoma esofágico, dos
quais 64,58% apresentaram aumento na expressão de MMP-7. Este aumento ocorreu
especialmente no front invasivo tumoral e, segundo os autores, exibiu relação
estatisticamente significante com o prognóstico da lesão.
Investigando a expressão de MMP-7 em uma linhagem de células provenientes
de carcinoma epidermóide oral, Bair et al. (2001) constataram que integrina β1, N-
caderina e E-caderina estavam envolvidas na indução desta matrilisina.
A relação entre MMP-7 e angiogênese foi demonstrada por Nishizuka et al.
(2001) em câncer de cólon. De acordo com estes autores, a matrilisina-1 pode facilitar o
processo de metástase desta neoplasia, por ativar a formação de novos vasos adjacentes
aos ninhos de células neoplásicas, por mecanismo ainda não esclarecido.
Sasaki et al. (2001) avaliaram os níveis de RNAm da MMP-7 em uma amostra
constituída de 73 casos de câncer de pulmão. Neste trabalho foi constatado que os
tumores em estágios mais avançados (II a IV) exibiram níveis mais elevados de RNAm
da MMP-7 que as lesões em estágio I. Além disso, tumores com metástase linfática
mostraram níveis mais altos deste RNA, em comparação às lesões não mestatáticas.
Huo et al. (2002) examinaram o efeito da MMP-7 na proliferação de células
endoteliais de veia umbilical in vitro e concluíram que esta metaloproteinase induz
diretamente a angiogênese. Os autores sugeriram que a MMP-7 poderia ser um bom
alvo para a terapia contra o câncer.
Objetivando averiguar a relação entre a expressão de matrilisinas e a
proliferação celular, Liu et al. (2002) analisaram através de imuno-histoquímica a
marcação para matrilisinas e Ki-67 em 130 pacientes portadores de carcinoma gástrico
em estágio avançado, sendo curiosamente verificada uma relação inversa entre estes
marcadores. Foi observado também que 79,2% dos casos expressaram MMP-7,
especialmente no front de invasão tumoral.
Em 86 casos de carcinoma endometrial e 50 fragmentos teciduais de endométrio
benigno, Tunungla et al. (2003) pesquisaram a expressão imuno-histoquímica de MMP-
26, TIMP-3 e TIMP-4. Foi constatado aumento da marcação para MMP-26 e TIMP-4
em células invasivas tumorais, células endoteliais, lesões de maior profundidade ou com
alto grau de malignidade. Estes resultados sugerem, de acordo com os autores, que
MMP-26 e TIMP-4 desempenham um papel importante nos processos de angiogênese e
invasão de tumores endometriais.
Amorim (2004) investigou a expressão imuno-histoquímica de MMP-7, MMP-
26 e B-catenina em 24 carcinomas epidermóides de língua divididos em dois grupos:
com e sem metástase. As lesões exibiram predominantemente marcação positiva ou
fortemente positiva para as matrilisinas, entretanto, não foi detectada correlação
significativa entre a imunorreatividade das MMPs pesquisadas entre si, nem com o
potencial metastático dos carcinomas linguais.
Em um estudo realizado por Pilka et al., publicado em 2004, a MMP-26 foi
pesquisada em 19 casos de carcinoma endometrial, 15 hiperplasias endometriais e 39
espécimes de endométrio normal, através de hibridização in situ, PCR e
imunohistoquímica. O RNAm de MMP-26 foi detectado apenas no componente
epitelial dos espécimes estudados. Curiosamente, entretanto, a expressão desta
matrilisina diminuiu com a perda da diferenciação histológica nos carcinomas
endometriais.
Yamamoto et al. (2004), examinando 50 casos de carcinoma de células
escamosas de esôfago, observaram, através de RT-PCR e imuno-histoquímica, que a
expressão da MMP-26 exibiu correlação significativa com a expressão da MMP-9.
Além disso, os pacientes com expressão concomitante de MMP-9 e MMP-26 no front
invasivo tiveram piores prognósticos, o que levou os autores a concluir que estas
metaloproteinases desempenham um papel importante na progressão do CCE esofágico.
Em 2005, Ahokas et al. demonstraram que a MMP-26 pode ser expressa por
queratinócitos em associação com várias desordens benignas de pele, no reparo de
feridas e na carcinogênese cutânea inicial.
Bister et al. (2005) utilizaram imuno-histoquímica e hibridização in situ no
estudo de 18 espécimes de enterocolite necrotizante. Eles observaram, na maior parte
dos casos estudados, aumento da expressão de MMP-7 no epitélio, de MMP-1 e MMP-
26 nas células estromais e de MMP-9 em células inflamatórias. Os autores acreditam
que as metaloproteinases são os principais fatores envolvidos na destruição tecidual
evidenciada nesta patologia e que inibidores sintéticos de MMPs podem ser utilizados
como uma nova opção terapêutica no seu tratamento.
Através de imuno-histoquímica e hibridização in situ, Impola et al. (2005)
observaram a expressão de metaloproteinases em carcinomas de células escamosas de
pele e em úlceras crônicas. Eles constataram marcação epitelial de MMP-7 em todos os
casos de CCE da amostra, especialmente nas áreas mais invasivas do tumor, mas não no
epitélio das úlceras crônicas não malignas.
Utilizando uma linhagem de células cancerosas de mama, Wang, Reierstad e
Fishman (2005) demonstraram que a transfecção do gene MMP-7 promoveu invasão
das células pesquisadas e que a expressão de MMP-7 aumentou a secreção e ativação de
pró-MMP-9 e pró-MMP-2, sugerindo que esta matrilisina pode aumentar a invasividade
parcialmente através da ativação das gelatinases.
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3 – PROPOSIÇÃO
A proposição deste trabalho consistiu em avaliar a expressão imuno-
histoquímica de metaloproteinases (MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 e MMP-26) em
carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, a fim de se verificar se há ou não
correlação entre a expressão destas enzimas e a localização anatômica da lesão ou seu
grau histológico de malignidade, estabelecido pelo sistema de gradação proposto por
Bryne (1998). Com este estudo, esperamos contribuir para um melhor entendimento do
comportamento biológico desta neoplasia, bem como do papel das metaloproteinases na
invasividade de carcinomas epidermóides de boca.
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4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
Este experimento consistiu em uma avaliação semi-quantitativa da expressão
imuno-histoquímica das metaloproteinases MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9 e MMP-
26 em uma série de casos de carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua com
diferentes graus de malignidade histológica, a fim de observar se existe diferença no
padrão de expressão destas enzimas com relação à localização ou à gradação histológica
das lesões pesquisadas.
4.2. POPULAÇÃO
A população foi constituída pelos casos de carcinoma epidermóide oral,
registrados no Serviço de Anatomia Patológica do Hospital São Marcos, da Associação
Piauiense de Combate ao Câncer, em Teresina – PI.
4.3. AMOSTRA
Foram selecionados 15 casos de carcinoma epidermóide de língua e 15 de lábio
inferior, provenientes de tratamento cirúrgico de pacientes atendidos no Hospital São
Marcos em Teresina – PI. Os dados clínicos referentes aos casos selecionados
encontram-se no quadro 1.
Quadro 1 – Dados clínicos de 30 pacientes portadores de carcinoma epidermóide
de lábio inferior e língua, atendidos no Hospital São Marcos em Teresina – PI
CASO Localização da Lesão Idade do
Paciente
Gênero do
Paciente
Presença de
Metástase
01 Lábio inferior 78 M Não
02 Lábio inferior 67 F Não
03 Lábio inferior 73 M Não
04 Lábio inferior 90 M Não
05 Lábio inferior 35 M Não
06 Língua 60 F Não
07 Língua 42 M Sim
08 Língua 70 F Não
09 Lábio inferior 84 M Não
10 Lábio inferior 72 M Não
11 Lábio inferior 57 F Não
12 Língua 39 M Sim
13 Lábio inferior 64 M Não
14 Lábio inferior 39 M Não
15 Língua 55 M Não
16 Lábio inferior 69 F Não
17 Língua 68 M Sim
18 Língua 73 F Não
19 Língua 40 M Sim
20 Língua 55 M Não
21 Lábio inferior 81 F Não
22 Língua 67 F Não
23 Lábio inferior 84 M Não
24 Língua 53 M Não
25 Lábio inferior 31 F Não
26 Lábio inferior 79 M Não
27 Língua 77 M Não
28 Língua 70 F Não
29 Língua 54 M Sim
30 Língua 65 M Sim
4.4. CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA
4.4.1. Critérios de Inclusão
Foram incluídos na amostra os casos de carcinoma epidermóide localizados em
lábio inferior e língua, resultantes de tratamento cirúrgico, sem quimioterapia ou
radioterapia prévia, cujo material emblocado em parafina encontrava-se em bom estado
de conservação e em quantidade suficiente para a realização do estudo imuno-
histoquímico.
4.4.2. Critérios de Exclusão
Foram excluídos da amostra os casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior
e língua resultantes de biópsias incisionais e/ou espécimes com material insuficiente ou
com extensas áreas de necrose.
4.5. ANÁLISE MORFOLÓGICA E GRADAÇÃO DE MALIGNIDADE
Foram obtidos cortes de 5 µm de espessura de todos os casos selecionados,
estendidos em lâminas de vidro, corados pela técnica da hematoxilina e eosina e
observados em microscopia de luz. Foi realizada uma análise descritiva dos aspectos
histomorfológicos dos espécimes, com avaliação do front de invasão tumoral e
subseqüente classificação das lesões, através do sistema de gradação histológica
proposto por Bryne (1998) (Quadro 2).
Por meio do somatório dos escores obtidos em cada parâmetro, foi calculada a
pontuação final de cada espécime estudado, viabilizando sua classificação em: baixo
escore (4 a 8 pontos) ou alto escore de malignidade (> 8 pontos). Esta classificação foi
proposta por Miranda (2002), consistindo em uma adaptação à classificação de Bryne et
al. (1989).
Quadro 2 – Sistema de gradação de malignidade “modo de invasão” recomendado
por Bryne (1998)
ESCORES
PARÂMETROS
1 2 3 4
Grau de
ceratinização
Altamente
ceratinizado
(+ de 50%
das células)
Moderadamente
ceratinizado
(20 a 50% das
células)
Mínima
ceratinização
(5 a 20% das
células)
Nenhuma
ceratinização
(0 a 5% das
células)
Pleomorfismo
nuclear
Pouco
(+ de 75% de
células
maduras)
Moderado
(50 a 75 de
células maduras)
Intenso
(25 a 50% de
células
maduras)
Extremo
(0 a 25% de
células maduras)
Padrão de
invasão
Bordas
infiltrativas
bem
delimitadas
Cordões, bandas
e/ou trabéculas
sólidas
infiltrativas
Pequenos
grupos ou
cordões de
células
infiltrativas
(n>15)
Dissociação
celular espraiada
e pronunciada,
em pequenos
grupos e/ou
individuais
(n<15)
Infiltrado
inflamatório
Intenso Moderado Escasso Ausente
4.6. ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
4.6.1. Estudo Imuno-histoquímico das Metaloproteinases
Do material emblocado em parafina, foram obtidos cortes de 3 µm de espessura,
que foram estendidos em lâminas de vidro previamente preparadas com organosilano
(3-aminopropyltrithoxy-silano, Sigma Chemical CO, USA) e submetidos ao método da
imuno-histoquímica pela técnica da estreptavidina-biotina peroxidase, descrita a seguir:
Desparafinização em xilol (1), por 30 minutos, a 60
o
C;
Desparafinização em xilol (2), por 20 minutos, à temperatura ambiente;
Hidratação em álcool etílico absoluto (1) por 5 minutos, à temperatura ambiente;
Hidratação em álcool etílico absoluto (2) por 5 minutos, à temperatura ambiente;
Hidratação em álcool etílico absoluto (3) por 5 minutos, à temperatura ambiente;
Hidratação em álcool etílico 95°, por 5 minutos, à temperatura ambiente;
Hidratação em álcool etílico 80°, por 5 minutos, à temperatura ambiente;
Remoção de pigmentos formólicos em hidróxido de amônia a 10 % , por 10
minutos, à temperatura ambiente;
Lavagem em água corrente por 10 minutos;
Passagem em água destilada por duas vezes (5 minutos cada);
Recuperação antigênica (Quadro 2);
Resfriamento dos cortes até atingir a temperatura ambiente;
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes, em
duas passagens de 15 minutos cada;
Lavagem em água corrente (10 minutos);
Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
Incubação com os anticorpos primários (Quadro 3) diluídos em solução de BSA
a 1 % em TRIS-HCl, pH 7,4.
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
Incubação com o anticorpo secundário (Biotinylated link universal – DAKO)
Duas passagens em solução de Tween 20 a 1 % em TRIS-HCl pH 7,4 por 5
minutos cada;
Incubação com o complexo estreptavidina-biotina (DAKO, A/S, Glostrup,
Dinamarca) durante 30 minutos, à temperatura ambiente;
Imersão em TRIS-HCl, duas trocas de 5 minutos cada;
Incubação em solução contendo o agente cromógeno diamonobenzidina (DAB),
durante 3 minutos, diluída em TRIS-HCL pH 7,4 e ativada com peróxido de
hidrogênio 10 volumes a 0,3 %;
Lavagem em água corrente por 10 minutos;
Passagens rápidas em água destilada ( 3 trocas )
Contra-coloração com hematoxilina de Mayer (10minutos) à temperatura
ambiente;
Passagem em água destilada (2 vezes, por 5 minutos cada);
Lavagem em água corrente por 10 minutos;
Desidratação em álcool etílico em escala crescente de 80° ao absoluto por 3
minutos cada;
Diafanização em xilol durante 10 minutos;
Montagem da lamínula em resina Permount (Ficher Scientific, USA).
Quadro 3 – Especificidade, clone, diluição, fabricante, recuperação antigênica e
tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados no estudo
imuno-histoquímico.
4.6.2. Método de Análise da Imuno-expressão das Metaloproteinases
A avaliação da expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases nos
carcinomas epidermóides foi realizada na área do front de invasão tumoral, por meio de
microscopia de luz. Um adenocarcinoma de mama foi utilizado como controle positivo.
Inicialmente, foi observada a marcação para cada metaloproteinase estudada
apenas nas células neoplásicas. Seguindo a metodologia descrita por Franchi et al.
(2002), realizou-se a análise semi-quantitativa das células positivas, com subseqüente
classificação das lesões em quatro grupos:
Ac clone
Especificidade
Diluição
Fonte
Recuperação
antigênica
Tempo de
incubação
41-1E5 MMP-1 1:100 Cabiochen
(Oncogene)
Citrato pH 6,0
steamer, 30 min
Overnight
(18 horas)
17B11 MMP-2 1:50 Novacastra
EDTA pH 8,0
steamer, 30 min
60 minutos
Ab-1/ID2 MMP-7 1:250 Labvision/
Neomarkers
Pepsina pH 1,8
a 1%, estufa a
37º, 60 min
Overnight
(18 horas)
2C3 MMP-9 1:20 Novacastra
Citrato pH 6,0
steamer, 30 min
Overnight
(18 horas)
AHP756 MMP-26 1:250 Serotec Pepsina pH 1,8
a 1%, estufa a
37º, 60 min
Overnight
(18 horas)
1. negativa (-);
2. baixa expressão (+) - menos de 10% de células positivas;
3. moderada expressão (++) - entre 10 e 50% de células positivas;
4. intensa expressão (+++) - mais de 50% de células tumorais positivas.
Os autores supracitados reorganizaram a amostra em dois grupos a fim de facilitar a
análise estatística. Neste trabalho, entretanto, optamos por trabalhar com os quatro
níveis de expressão, quando da análise das células neoplásicas.
Adicionalmente, foi realizada a avaliação da expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases nas células estromais adjacentes às células neoplásicas do front
invasivo. Para a classificação dos espécimes, adaptamos a metodologia de Franchi et al.
(2002), organizando a amostra em dois grupos:
♦ marcação negativa ou inexpressiva – 0 a 10% de células positivas;
♦ marcação expressiva – mais de 10% de células positivas.
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico com o objetivo
de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 10.0 para
Windows.
Para a verificação das hipóteses de igualdade de expressão das
metaloproteinases no parênquima tumoral com relação à localização da lesão, seu grau
histológico de malignidade e presença de metástase, utilizou-se o teste não paramétrico
de Mann-Whitney, uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do
estabelecimento de escores.
A existência de correlação entre a imunomarcação das células neoplásicas para
as metaloproteinases e os escores histológicos de malignidade foi investigada
utilizando-se o coeficiente de correlação de Spearman.
Foi empregado o teste do Qui-quadrado ou o teste exato de Fisher (para
valores menores que 5) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados
quando da intersecção de linhas e colunas das tabelas 2x2, contendo os seguintes
parâmetros:
Localização da lesão e grau histológico de malignidade
Localização da lesão e presença de metástase
Expressão das metaloproteinases no estroma tumoral e:
o Localização da lesão
o Grau histológico de malignidade
o Presença de metástase
O nível de significância utilizado para todos os testes foi de 5%.
4.8. IMPLICAÇÕES ÉTICAS
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte ( Nº 056/05 – CEP – UFRN).
=
/,$
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
5 - RESULTADOS
5.1. DADOS CLÍNICOS
A partir de uma avaliação das informações clínicas dos casos pesquisados, foram
obtidos os dados explicitados na tabela 1. Foi verificada uma variação na idade dos
pacientes de 31 a 90 anos, na época do diagnóstico, com média de 66,9 anos para os
pacientes com carcinoma epidermóide de lábio inferior e 59,2 anos para os portadores
de lesão lingual.
Tabela 1 – Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior e
língua, segundo o gênero e idade dos pacientes e presença de metástase.
Natal / RN – 2006.
Dados Clínicos Lábio inferior Língua Total
n % n % n %
GÊNERO
Feminino 5 33,33 5 33,33 10 33,33
Masculino
10 66,67 10 66,67 20 66,67
Total 15 100 15 100 30 100
IDADE
31 – 50 3 20 3 20 6 20
51 – 70 4 26,67 10 66,67 14 46,67
71 - 90 8 53,33 2 13,33 10 33,33
Total 15 100 15 100 30 100
METÁSTASE
Ausente 15 100 9 60 24 80
Presente 0 0 6 40 6 20
Total 15 100 15 100 30 100
5.2. RESULTADOS MORFOLÓGICOS
Dos 30 casos estudados, 17 (56,67%) exibiram baixo grau de malignidade,
enquanto 13 (43,33%) foram classificados como carcinomas epidermóides de alto grau
(Figuras 1 e 2). Dentre as lesões de lábio inferior, oito foram de baixo grau e sete de alto
grau. Em língua foram diagnosticados nove carcinomas de baixo grau e seis casos de
alto grau de malignidade. A tabela 2 expressa os resultados morfológicos observados
nas lesões de lábio inferior e de língua.
Tabela 2 – Escores de malignidade estabelecidos de acordo com o método de Bryne
(1998), por meio da avaliação morfológica de carcinomas epidermóides
de lábio inferior e língua. Natal/RN-2006.
Lábio inferior (n=15) Língua (n=15) Parâmetro
morfológico
Escore
n % n %
1 0 0 7 46,66
2 9 60 4 26,66
3 6 40 4 26,66
Grau de
Ceratinização
4 0 0 0 0
1 0 0 3 20
2 7 46,66 6 40
3 8 53,33 6 40
Pleomorfismo
Celular
4 0 0 0 0
1 3 20 0 0
2 7 46,66 6 40
3 4 26,66 4 26,66
Padrão de
Invasão
4 1 6,66 5 33,33
1 9 60 6 40
2 5 33,33 7 46,66
3 1 6,66 2 13,33
Infiltrado
Inflamatório
4 0 0 0 0
6 0 0 4 26,66
7 6 40 1 6,66
8 2 13,33 4 26,66
9 3 20 2 13,33
10 2 13,33 0 0
11 1 6,66 0 0
12 0 0 3 20
Escore Total
de
Malignidade
13 1 6,66 1 6,66
5.3. RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS
Nos carcinomas epidermóides estudados, as metaloproteinases imunomarcadas
foram evidenciadas, ao microscópio de luz, como uma pigmentação acastanhada. A
positividade foi observada principalmente nas células tumorais, com marcação
predominantemente citoplasmática e ocasionalmente nuclear. As células positivas se
concentraram mais freqüentemente no front de invasão tumoral, sendo esta a área de
escolha para a avaliação da expressão das metaloproteinases nos carcinomas
epidermóides de lábio inferior e língua, investigados neste trabalho. Esta avaliação foi
baseada no método de Franchi et al. (2002) e os resultados obtidos estão discriminados
na tabela 3.
A intensidade da pigmentação e a proporção de células expressando as
metaloproteinases investigadas foram heterogêneas. Em alguns casos, extensas áreas da
massa tumoral exibiram positividade, enquanto em outros, apenas alguns cordões
celulares ou células neoplásicas dispersas se mostraram marcadas. Por vezes, pôde-se
observar negatividade nas áreas centrais de ninhos ou ilhotas neoplásicas, enquanto as
células periféricas exibiram reatividade, especialmente para as MMPs 7 e 26.
Todos os casos investigados expressaram, pelo menos, duas das
metaloproteinases pesquisadas. 93,33% dos casos demonstraram alguma positividade
para MMP-1 nas células tumorais do front de invasão. Este índice foi de 60% para
MMP-2, 63,33% para MMP-9, 93,33% para MMP-7 e 100% para MMP-26.
Tabela 3 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9
e 26), nas células neoplásicas localizadas no front de invasão tumoral de
carcinomas epidermóides localizados em lábio inferior e língua.
Natal/RN-2006.
Lábio inferior (n=15) Língua (n=15) MMP % de células
positivas
n
%
n
%
0 1 6,66 1 6,66
<10% 2 13,33 2 13,33
10 – 50% 8 53,33 10 66,66
MMP-1
>50% 4 26,66 2 13,33
0 6 40 6 40
<10% 5 33,33 4 26,66
10 – 50% 4 26,66 5 33,33
MMP-2
>50% 0 0 0 0
0 0 0 2 13,33
<10% 4 26,66 1 6,66
10 – 50% 5 33,33 6 40
MMP-7
>50% 6 40 6 40
0 7 46,66 4 26,66
<10% 7 46,66 3 20
10 – 50% 1 6,66 7 46,66
MMP-9
>50% 0 0 1 6,66
0 0 0 0 0
<10% 4 26,66 3 20
10 – 50% 5 33,33 4 26,66
MMP-26
>50% 6 40 8 53,33
A amostra foi reagrupada, tomando como base o grau histológico de
malignidade dos carcinomas epidermóides estudados. A tabela 4 expressa o resultado da
avaliação imuno-histoquímica das metaloproteinases nas células neoplásicas do front
invasivo, nos 17 casos de baixo grau e nos 13 casos de alto grau de malignidade,
independente da localização.
Tabela 4 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases (MMPs -1, 2, 7, 9
e 26), nas células neoplásicas localizadas no front de invasão tumoral de
carcinomas epidermóides de baixo e alto graus de malignidade.
Natal/RN-2006.
Baixo Grau (n=17) Alto Grau (n=13) MMP % de células
positivas
n
%
n
%
0 2 11,76 0 0
<10% 2 11,76 2 15,38
10 – 50% 12 70,58 6 46,15
MMP-1
>50% 1 5,88 5 38,46
0 7 41,17 5 38,46
<10% 4 23,52 5 38,46
10 – 50% 6 35,29 3 23,07
MMP-2
>50% 0 0 0 0
0 2 11,76 0 0
<10% 5 29,41 0 0
10 – 50% 8 47,05 3 23,07
MMP-7
>50% 2 11,76 10 76,92
0 8 47,05 3 23,07
<10% 5 29,41 5 38,46
10 – 50% 4 23,52 4 30,76
MMP-9
>50% 0 0 1 7,69
0 0 0 0 0
<10% 5 29,41 2 15,38
10 – 50% 8 47,05 1 7,69
MMP-26
>50% 4 23,52 10 76,92
As figuras de 3 a 22 mostram a expressão imuno-histoquímica das MMPs 1, 2,
7, 9 e 26 em carcinomas epidermóides de baixo e alto graus de malignidade, localizados
em lábio inferior e língua.
Foi evidenciada, adicionalmente, marcação imuno-histoquímica das células
estromais adjacentes às células neoplásicas do front invasivo tumoral, o que nos
motivou a realizar a análise da expressividade das MMPs também no estroma dos 30
casos de carcinoma epidermóide. Utilizamos, para isto, a método proposto por Franchi
et al. (2002), adaptando-o para avaliação do estroma. Os resultados obtidos constam nas
tabelas 5 e 6, que trazem, respectivamente, os dados agrupados de acordo com a
localização da lesão e seu grau histológico de malignidade.
A positividade estromal variou muito entre as metaloproteinases investigadas.
Todos os casos avaliados exibiram marcação expressiva para MMP-1 em estroma,
enquanto apenas 3,33% expressaram MMP-26. As demais metaloproteinases
demonstraram índices intermediários de positividade: respectivamente 50 %, 80 % e
26,66 %, para as MMPs 2, 7 e 9.
Tabela 5- Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9
e 26), nas células estromais adjacentes ao front de invasão tumoral de
carcinomas epidermóides localizados em lábio inferior e língua.
Natal/RN-2006.
Lábio inferior (n=15) Língua (n=15) MMP % de células
positivas
n
%
n
%
< 10% 0 0 0 0 MMP-1
> 10% 15 100 15 100
< 10% 4 26,66 11 73,33 MMP-2
> 10% 11 73,33 4 26,66
< 10% 2 13,33 4 26,66 MMP-7
> 10% 13 86,66 11 73,33
< 10% 10 66,66 12 80 MMP-9
> 10% 5 33,33 3 20
< 10% 15 100 14 93,33 MMP-26
> 10% 0 0 1 6,66
Tabela 6- Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases ( MMPs -1, 2, 7, 9
e 26), nas células estromais adjacentes ao front de invasão tumoral de
carcinomas epidermóides de baixo e alto graus de malignidade. Natal /
RN-2006
Baixo Grau (n=17) Alto Grau (n=13) MMP % de células
positivas
n
%
n
%
< 10% 0 0 0 0 MMP-1
> 10% 17 100 13 100
< 10% 9 52,94 6 46,15 MMP-2
> 10% 8 47,05 7 53,84
< 10% 6 35,29 0 0 MMP-7
> 10% 11 64,70 13 100
< 10% 10 58,82 12 92,30 MMP-9
> 10% 7 41,17 1 7,69
< 10% 17 100 12 92,30 MMP-26
> 10% 0 0 1 7,69
Foi observada marcação para MMPs, com freqüência variável, em células
ductais, fibras musculares, glândulas sebáceas e fibras colágenas. O epitélio adjacente
ocasionalmente exibiu imunopositividade para as metaloproteinases estudadas, sendo as
MMPs 7 e 26 expressas nas camadas mais profundas e as MMPs 2 e 9 principalmente
na camada córnea do epitélio de revestimento.
5.4. RESULTADOS ESTATÍSTICOS
Para o tratamento estatístico dos resultados, foi utilizado o software SPSS 10.0
para Windows. O nível de significância estabelecido foi de 5%.
Inicialmente, por meio do teste do Qui-quadrado e exato de Fisher, constatou-se
que, nos carcinomas epidermóides investigados, a localização da lesão esteve
significativamente associada à presença de metástase, mas não ao grau histológico de
malignidade (tabela 7).
Tabela 7 – Distribuição dos casos de carcinoma epidermóide de lábio inferior e
língua segundo o grau histológico de malignidade e presença de metástase.
Natal / RN-2006.
Localização da lesão Variáveis Independentes
Lábio inferior
n %
Língua
n %
Total
n %
p
Grau histológico de Malignidade
Baixo 08 47,1 09 52,9 17
100
0,713
Alto 07 53,8 06 46,2 13
100
Metástase
Ausente 15 62,5 09 37,5 24
100
0,017
Presente 0 0 06 100 06
100
Para se avaliar a expressão das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no parênquima
tumoral, principal objetivo deste experimento, foi utilizado o teste de Mann-Whitney.
Com a amostra agrupada de acordo com a localização da lesão, observou-se que,
de modo geral, os carcinomas epidermóides de língua exibiram maior marcação para as
metaloproteinases, quando comparados àqueles localizados em lábio inferior, embora
esta diferença só tenha se mostrado significativa estatisticamente para a MMP-9 (figura
23).
Figura 23 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no
parênquima de carcinomas epidermóides localizados em lábio inferior e língua.
Localização da lesão
LínguaLábio inferior
Expressão da MMP-1 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
127
18
615
24
16
Localização da lesão
LínguaLábio inferior
Expressão da MMP-2 no parênquima tumoral
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
Localização da lesão
LínguaLábio inferior
Expressão da MMP-7 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
2927
Localização da lesão
LínguaLábio inferior
Expressão da MMP-9 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
Localização da lesão
LínguaLábio inferior
Expressão da MMP-26 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
Significância estatística observada através do teste Mann-Whitney para = 0,05. Valores de p: 0,572
(MMP1), 0,843 (MMP2), 0,982 (MMP7), 0,030 (MMP9), 0,488 (MMP26).
A amostra foi, então, agrupada de acordo com o grau histológico de malignidade
e a análise da expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases nas células
neoplásicas na área do front invasivo demonstrou maior positividade para MMPs nas
lesões de alto grau que naquelas exibindo baixo grau de malignidade, exceto para
MMP-2, em que se observou uma inversão desta tendência. Foi encontrada diferença
estatisticamente significativa na expressão das matrilisinas (MMP-7 e MMP-26) entre
os carcinomas epidermóides de alto e baixo graus de malignidade (Figura 24).
Nas células estromais, não foi evidenciada diferença significante ao tratamento
estatístico, na expressão das MMPs 1, 7, 9 e 26, quando se compararam as lesões de
lábio inferior àquelas localizadas em língua. A MMP-2, entretanto, foi
significativamente mais expressa no estroma dos carcinomas epidermóides de lábio
inferior (tabela 8).
Tomando por base o grau morfológico de malignidade, não foi constatada
diferença significativa na expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 9 e
26 nas células estromais dos dois grupos de carcinoma epidermóide. Contudo, as lesões
de alto grau exibiram, em estroma, marcação significantemente superior para MMP 7
que as neoplasias de baixo grau de malignidade (tabela 9).
Figura 24 – Expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no
parênquima de carcinomas epidermóides de baixo e alto graus de
malignidade.
Grau histológico de malignidade
Alto grauBaixo grau
Expressão da MMP-1 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
42
1816
15
Grau histológico de malignidade
Alto grauBaixo grau
Expressão da MMP-2 no parênquima tumoral
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
Grau histológico de malignidade
Alto grauBaixo grau
Expressão da MMP-7 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
112021
Grau histológico de malignidade
Alto grauBaixo grau
Expressão da MMP-9 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
0,0
-,5
Grau histológico de malignidade
Alto grauBaixo grau
Expressão da MMP-26 no parênquima tumoral
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
,5
13
37
Significância estatística observada através do teste Mann-Whitney para = 0,05. Valores de p: 0,071
(MMP1), 0,789 (MMP2), <0,0001 (MMP7), 0,170 (MMP9), 0,016 (MMP26).
Tabela 8- Significância estatística entre a reatividade imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma tumoral e a localização
anatômica de carcinomas epidermóides orais. Natal/RN-2006.
Localização da lesão
Lábio inferior Língua
MMP % de células
positivas
(%) (%)
p
< 10% 0 0 MMP 1
> 10% 50 50
-
< 10% 26,7 73,3 MMP 2
> 10% 73,3 26,7
0,027
< 10% 33,3 66,7 MMP 7
> 10% 54,2 45,8
0,651
< 10% 45,5 54,5 MMP 9
> 10% 62,5 37,5
0,682
< 10% 51,7 48,3 MMP 26
> 10% 0 100
1,000
Tabela 9- Significância estatística entre a reatividade imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma tumoral e a gradação
histológica de malignidade de carcinomas epidermóides orais. Natal / RN-
2006.
Grau de malignidade
Baixo grau Alto grau
MMP % de células
positivas
(%) (%)
p
< 10% 0 0 MMP 1
> 10% 56,7 43,3
-
< 10% 60 40 MMP 2
> 10% 53,8 46,7
0,713
< 10% 100 0 MMP 7
> 10% 45,8 54,2
0,024
< 10% 45,5 54,5 MMP 9
> 10% 87,5 12,5
0,092
< 10% 58,6 41,4 MMP 26
> 10% 0 100
0,433
Após a avaliação da amostra total, procedeu-se, então, à análise estatística dos
dados obtidos dentro dos dois sub-grupos, de acordo com a localização da neoplasia:
lábio inferior e língua.
Para os carcinomas epidermóides de lábio inferior foram encontradas diferenças
significativas na expressão das MMPs 1, 7 e 26 pelas células neoplásicas, entre as lesões
de baixo e alto graus de malignidade (tabela 10).
Tabela 10 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e
significância estatística para a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no parênquima de carcinomas epidermóides
de lábio inferior em relação ao grau histológico de malignidade. Natal / RN-
2006.
MMPs Grau de
Malignidade
n Mediana Q 25 Q 75 Média
dos
Postos
p
MMP-1 Baixo
Alto
8
7
2,00
3,00
1,00
2,00
2,00
3,00
5,44
10,93
0,009
MMP-2 Baixo
Alto
8
7
1,50
0
0,25
0
2,00
1,00
9,88
5,86
0,065
MMP-7 Baixo
Alto
8
7
1,50
3,00
1,00
2,00
2,00
3,00
5,44
10,93
0,012
MMP-9 Baixo
Alto
8
7
0,50
1,00
0
0
1,00
1,00
7,50
8,57
0,605
MMP-26 Baixo
Alto
8
7
2,00
3,00
1,00
2,00
2,00
3,00
6,00
10,29
0,049
A avaliação estatística da imunomarcação das metaloproteinases nas células
estromais das lesões de lábio inferior não demonstrou diferenças significativas entre os
carcinomas epidermóides estudados, com relação ao seu grau histológico de
malignidade (tabela 11).
Tabela 11 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
lábio inferior e seu grau histológico de malignidade. Natal/RN-2006.
Grau de malignidade
Baixo grau Alto grau
Total
MMP % de células
positivas
n % n % n %
p
< 10% 0 0 0 0 0 0 MMP 1
> 10% 8 53,3 7 46,7 15 100
-
< 10% 2 50 2 50 4 100 MMP 2
> 10% 6 54,5 5 45,5 11 100
1,000
< 10% 2 100 0 0 2 100 MMP 7
> 10% 6 46,2 7 53,8 13 100
0,467
< 10% 4 40 6 60 10 100 MMP 9
> 10% 4 80 1 20 5 100
0,282
< 10% 8 53,3 7 46,7 15 100 MMP 26
> 10% 0 0 0 0 0 0
-
Procedeu-se à avaliação dos carcinomas epidermóides localizados em língua,
através da análise da positividade das células neoplásicas do front de invasão tumoral
para as metaloproteinases, a fim de comparar as lesões de alto e baixo graus de
malignidade.
Não foram observadas diferenças significativas entre os dois grupos, com relação
à marcação para as MMPs 1, 2, 9 e 26. A MMP-7 foi significantemente mais expressa
no parênquima das neoplasias linguais de alto grau que naquelas de baixo grau de
malignidade ( tabela 12 ).
Quando o alvo do estudo foi o estroma tumoral dos carcinomas epidermóides de
língua, nenhuma diferença na expressão das metaloproteinases foi observada entre os
graus histológicos de malignidade (tabela 13).
Tabela 12 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e
significância estatística para a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no parênquima de carcinomas epidermóides de
língua em relação ao grau histológico de malignidade. Natal / RN-2006.
MMPs Grau de
Malignidade
n Mediana Q 25 Q 75 Média
dos
Postos
p
MMP-1 Baixo
Alto
9
6
2,00
2,00
2,00
1,00
2,00
2,25
8,33
7,50
0,673
MMP-2 Baixo
Alto
9
6
0
1,50
0
0,75
1,50
2,00
6,72
9,92
0,149
MMP-7 Baixo
Alto
9
6
2,00
3,00
0,50
2,75
2,00
3,00
5,67
11,50
0,008
MMP-9 Baixo
Alto
9
6
1,00
2,00
0
1,00
2,00
2,25
6,67
10,00
0,131
MMP-26 Baixo
Alto
9
6
2,00
3,00
1,50
2,50
3,00
3,00
6,72
9,92
0,136
Tabela 13 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
língua e seu grau histológico de malignidade. Natal / RN-2006.
Grau de malignidade
Baixo grau Alto grau
Total
MMP % de células
positivas
n % n % n %
p
< 10% 0 0 0 0 0 0 MMP 1
> 10% 9 60 6 40 15 100
-
< 10% 7 63,6 4 36,4 11 100 MMP 2
> 10% 2 50 2 50 4 100
1,000
< 10% 4 100 0 0 4 100 MMP 7
> 10% 5 45,5 6 54,5 11 100
0,103
< 10% 6 50 6 50 12 100 MMP 9
> 10% 3 100 0 0 3 100
0,229
< 10% 9 64,3 5 35,7 14 100 MMP 26
> 10% 0 0 1 100 1 100
0,400
Em toda a amostra investigada, foram encontrados seis casos com presença de
metástase na época do diagnóstico, todos exibindo lesão primária localizada em língua.
Os 15 casos de carcinomas epidermóides linguais foram divididos em dois grupos (com
presença ou ausência de metástase) e a expressão das metaloproteinases foi investigada,
tanto em parênquima quanto em estroma.
Não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os carcinomas
de língua com e sem metástase, no que diz respeito à marcação imuno-histoquímica
para as MMPs 1, 2, 7, 9 e 26 (tabelas 14 e 15).
Tabela 14 – Tamanho da amostra, medianas, quartis, média dos postos e
significância estatística para a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no parênquima de carcinomas
epidermóides de língua em relação à presença de metástase. Natal / RN-
2006.
MMPs Metástase n Mediana Q 25 Q 75 Média
dos
Postos
p
MMP-1 Ausente
Presente
9
6
2,00
2,00
2,00
1,00
2,50
2,00
9,00
6,50
0,205
MMP-2 Ausente
Presente
9
6
0
1,50
0
0
1,50
2,00
7,28
9,08
0,415
MMP-7 Ausente
Presente
9
6
2,00
3,00
1,50
1,50
2,50
3,00
6,89
9,67
0,207
MMP-9 Ausente
Presente
9
6
1,00
2,00
0
0,75
2,00
2,00
7,50
8,75
0,571
MMP-26 Ausente
Presente
9
6
3,00
2,50
2,00
1,00
3,00
3,00
8,44
7,33
0,604
Tabela 15 – Significância estatística entre a expressão imuno-histoquímica das
metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 no estroma de carcinomas epidermóides de
língua e a presença de metástase. Natal / RN-2006.
Metástase
Ausência Presença
Total
MMP % de células
positivas
n % n % n %
p
< 10% 0 0 0 0 0 0 MMP 1
> 10% 9 60 6 40 15 100
-
< 10% 6 54,5 5 45,5 11 100 MMP 2
> 10% 3 75 1 25,5 4 100
0,604
< 10% 3 75 1 25,5 4 100 MMP 7
> 10% 6 54,5 5 45,5 11 100
0,604
< 10% 7 58,3 5 41,7 12 100 MMP 9
> 10% 2 66,7 1 33,3 3 100
1,000
< 10% 8 57,1 6 42,9 14 100 MMP 26
> 10% 1 100 0 0 1 100
1,000
Utilizando-se o coeficiente de Spearman, investigou-se a correlação entre os
escores morfológicos dos carcinomas epidermóides, obtidos pelo método de Bryne
(1998), e a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26,
avaliadas de acordo com Franchi et al. (2002).
Na tabela 16 pode-se observar que, de modo geral, houve uma relação direta
entre as variáveis, ou seja, quanto mais alto o escore de malignidade, maior a expressão
das MMPs. Apenas o escore do grau de ceratinização mostrou relação inversa com duas
MMPs: 1 e 9 , mas sem significância estatística.
A MMP-7 mostrou correlação direta e estatisticamente significativa com o
escore total de malignidade e com quase todos os escores parciais. A MMP-26 exibiu
correlação direta e estatisticamente significativa com o escore total e com o escore do
padrão de invasão (tabela 16).
Tabela 16 –Coeficiente de correlação de Spearman (r) e significância estatística (p) entre expressão das metaloproteinases 1, 2, 7, 9 e 26 e
os escores morfológicos estabelecidos de acordo com o método de Bryne (1998), em carcinomas epidermóides de lábio inferior e
língua. Natal/RN-2006
Escore Total de
Malignidade
Escore do Grau de
Ceratinização
Escore de
Pleomorfismo Nuclear
Escore do Padrão de
Invasão
Escore do Infiltrado
Inflamatório
MMP
r p r p r p r p r p
MMP-1 0,195 0,301 -0,142 0,453 0,287 0,124 0,033 0,862 0,104 0,583
MMP-2 0,148 0,435 0,213 0,258 0,283 0,130 0,004 0,984 0,011 0,955
MMP-7
0,542 0,002 0,378 0,040 0,612 0,000
0,223 0,236
0,391 0,033
MMP-9 0,286 0,126 -0,050 0,795 0,231 0,220 0,176 0,352
0,401 0,028
MMP-26
0,425 0,019
0,149 0,431 0,272 0,146
0,393 0,032
0,353 0,056
2+
#/,<
D
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I
S
S
C
C
U
U
S
S
S
S
Ã
Ã
O
O
6- DISCUSSÃO
O câncer de cabeça e pescoço está emergindo como um dos principais
problemas globais de saúde (O’CHAROENRAT et al., 2002; PANDE et al., 2002).
Embora consista em um grupo heterogêneo, composto por neoplasias de variados tipos
histológicos e diversas localizações, destaca-se dentre estas patologias o carcinoma
epidermóide oral, tanto por ser uma das principais causas de morbidade e mortalidade
por câncer no mundo, quanto por sua alta incidência (NAGPAL, DAS, 2003)
O carcinoma epidermóide oral ocorre predominantemente em pacientes do
gênero masculino, com idade média em torno de 60 anos (MOORE et al., 2000;
SAWAIR et al., 2003; DEDIVITIS et al., 2004; INCA, 2006). Em concordância com a
literatura, no presente trabalho 66,67% dos pacientes pesquisados eram do gênero
masculino. As idades dos pacientes na época do diagnóstico oscilaram entre 31 e 90
anos, com pico de incidência entre 61 e 70 anos na amostra total, 51 e 70 anos para os
pacientes com carcinomas linguais e entre 71 e 90 anos para portadores de lesões de
lábio inferior. Apesar de se ter verificado que a idade média dos pacientes com
carcinomas labiais foi ligeiramente mais alta que a observada nos casos de língua,
respectivamente 66,9 e 59,2 anos, estes valores estão dentro da faixa de variação
encontrada na literatura.
De acordo com Moore et al. (2000), a incidência do carcinoma epidermóide oral
tende a aumentar com a idade do paciente, entretanto alguns trabalhos têm ressaltado
um incremento da incidência desta patologia em pacientes jovens (MAKENZIE et al.,
2000; NAGLER et al., 2002; VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004; VENTURI,
PAMPLONA, CARDOSO, 2004). Em nossa amostra, apenas quatro pacientes estavam
com menos de 40 anos quando foi feito o diagnóstico.
O carcinoma epidermóide de boca exibe variabilidade em seu comportamento
biológico em função de uma série de fatores, dentre os quais podemos citar a
localização anatômica do tumor. Já está bem estabelecido na literatura que as neoplasias
localizadas em língua são mais agressivas, exibindo altas taxas de recorrência e
metástase (AL RAJHI et al., 2000; WÜNSH FILHO, 2002; DANTAS et al., 2003;
NEVILLE et al., 2004). De acordo com O-Charoenrat et al. (2003), o alto potencial para
invasividade local e a grande propensão a metastatizar para os linfonodos cervicais
exibidos pelos carcinomas epidermóides linguais afetam a probabilidade de controle
regional da neoplasia.
Os carcinomas epidermóides de lábio inferior, por outro lado, são pouco
agressivos, raramente produzindo metástase ( REGEZI, SCIUBBA, 2000; NEVILLE et
al., 2004; VARTANIAN et al., 2004). Esta baixa taxa de metástase para linfonodos
regionais em associação com a maior facilidade de diagnóstico precoce, devido à
visibilidade da região, parece contribuir para que os carcinomas labiais tenham bom
prognóstico (CANTO, DEVESA, 2002).
Por este motivo escolhemos trabalhar com carcinomas epidermóides localizados
nestes dois sítios anatômicos: língua e lábio inferior, no intuito de fazer uma
comparação entre as neoplasias situadas em locais que tradicionalmente exibem
comportamentos biológicos tão distintos.
Com efeito, nos 30 casos constituintes da nossa amostra identificamos 06 nos
quais foram detectadas metástases linfáticas na época do diagnóstico, sendo notável o
fato de que em todos os casos a lesão primária estava localizada em língua. Aplicando o
teste exato de Fisher, foi detectada diferença estatisticamente significante entre os
carcinomas epidermóides localizados em lábio inferior e língua, no que diz respeito à
ocorrência de metástase.
Conhecer o comportamento biológico de uma lesão é essencial para adoção das
medidas terapêuticas mais indicadas para cada caso, evitando que o paciente seja
submetido a um tratamento mais rigoroso que o necessário ou que a escolha de
procedimentos inadequados venha a aumentar os riscos de desenvolvimento de lesões
recorrentes ou metastáticas.
Este problema tem movido numerosos pesquisadores em todo o mundo na busca
de indicadores prognósticos fidedignos, que complementem os indícios fornecidos pelo
estadiamento clínico do câncer, obtidos através do sistema TNM.
Uma alternativa surgiu com o sistema de gradação morfológica preconizado por
Broders (1920, 1941) para a classificação dos carcinomas epidermóides de boca,
tomando por base o grau de diferenciação das células neoplásicas. Diversos outros
sistemas de gradação histopatológica foram propostos desde então, dentre os quais
podemos citar: Wahi (1971), conhecido como a classificação da Organização Mundial
da Saúde; Jackobsson et al. (1973), que foi o primeiro a utilizar características
histológicas indicativas da relação tumor-hospedeiro além das características das células
neoplásicas; Crissman et al. (1984) e Anneroth, Batsakis e Luna (1986, 1987), que
fizeram pequenas modificações a partir do sistema de Jackobsson et al., de 1973.
É notável, no entanto, que as neoplasias malignas são constituídas de populações
celulares heterogêneas, onde as células tumorais das áreas mais invasivas diferem
substancialmente das células centrais ou superficiais (BRYNE et al., 1989; BRYNE,
1991; KUROKAWA et al., 2005). O front invasivo tumoral parece ser constituído pelas
células neoplásicas mais agressivas, sendo, portanto, as características histológicas desta
região mais úteis para determinação das informações prognósticas do carcinoma oral
(BÀNKFALVI, PIFFKO, 2000; SAWAIR et al., 2003; SCHLIEPHAKE, 2003;
WOOLGAR, 2005).
Com base nesta convicção, Bryne et al. (1989) sugeriram um novo sistema de
gradação com avaliação apenas do front invasivo tumoral e estabelecimento de escores
de 1 a 4, de acordo com a gravidade histológica, para cinco parâmetros morfológicos.
Por este método, as lesões eram classificadas em baixo grau de malignidade, com
contagem total entre 5 e 10 pontos, ou alto grau de malignidade, com pontuação maior
que 10.
Em 1998, Bryne reviu seu método e excluiu um dos parâmetros morfológicos,
restando para serem avaliadas duas características da célula neoplásica (grau de
ceratinização e pleomorfismo nuclear) e duas características da relação tumor-
hospedeiro (padrão de invasão e intensidade do infiltrado inflamatório). Miranda (2002)
propôs que, tendo havido diminuição nos parâmetros avaliados pelo método de Bryne, o
número de pontos necessários para caracterizar o grau de malignidade também deveria
ser alterado, passando a ser de 4 a 8 pontos para baixo grau e mais de 8 pontos para alto
grau.
Adotamos neste trabalho o sistema de gradação histológica de malignidade
preconizado por Bryne (1998), por ser um método rápido, de fácil realização e valor
prognóstico demonstrado em trabalhos anteriores (ODELL et al., 1994; BRYNE, 1998;
BÀNKFALVI, PIFFKO, 2000; SWAIR et al., 2003). Para classificação das lesões com
relação ao grau de malignidade, adotamos a modificação proposta por Miranda (2002).
Nos casos pesquisados no presente trabalho, houve uma variação do escore total
de malignidade entre 6 e 13 pontos, sendo 17 lesões (56,67%) classificadas como
carcinomas epidermóides de baixo grau de malignidade e 13 (43,33%) como alto grau.
Entre as neoplasias malignas de baixo grau constituintes da nossa amostra, oito se
localizavam em lábio inferior e nove em língua, enquanto entre as lesões de alto grau,
sete eram carcinomas labiais e seis linguais. Não foi encontrada diferença significativa
estatisticamente entre os carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, no que se
refere ao grau histológico de malignidade.
Este resultado é surpreendente, uma vez que, como já foi comentado
anteriormente, há evidente diferença prognóstica entre carcinomas de lábio inferior e
língua. Além disso, alguns trabalhos já detectaram correlação significativa entre
prognóstico ou estágio clínico da lesão e sua gravidade histológica, embora utilizando
diferentes sistemas de gradação histológica de malignidade (BRYNE et al., 1989,
BRYNE, 1991; COSTA et al., 2002; DANTAS et al., 2003). Ressaltamos, no entanto,
que por mais que se tente tornar um sistema de gradação de malignidade histológica um
exercício de caráter objetivo, com escores fundamentados em dados matemáticos, a
análise dos parâmetros continua sendo um exercício baseado na subjetividade dos
achados, o que pode levar a resultados conflitantes.
Diante destes fatos podemos constatar que a utilização de sistemas de gradação
histológica representa uma informação a mais para o estabelecimento do prognóstico do
carcinoma epidermóide oral, uma vez que, desta análise, pode-se inferir alguns dados do
quão agressiva morfologicamente a neoplasia se apresenta. No entanto, estes sistemas
não podem ser usados, isoladamente, na indicação do prognóstico tumoral.
Considerando que no presente trabalho a localização da lesão exibiu associação
estatisticamente significante com presença de metástase, mas não com grau histológico
de malignidade, podemos supor que em nossa amostra as lesões de língua tiveram maior
tendência a metástase que os carcinomas epidermóides de lábio inferior, independente
da gravidade do quadro histológico.
Já está bem evidente que a agressividade de uma neoplasia é determinada por
sua capacidade de sobreviver, migrar, invadir tecidos vizinhos e eventualmente
colonizar um sítio secundário. De acordo com Liaw e Crawford (1999), todas estas
ações dependem das interações das células tumorais com as proteínas da MEC e da sua
habilidade em modificar o ambiente extracelular. Para isso, as células neoplásicas
utilizam mecanismos similares aos usados por células normais em eventos fisiológicos,
para migrar através de barreiras teciduais (THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999).
Um dos fatores críticos neste processo é a produção de enzimas proteolíticas que
promovem degradação e remodelação da matriz extracelular. As metaloproteinases de
matriz, especialmente, têm sido investigadas em numerosos trabalhos, sendo
reconhecida sua importância nos eventos envolvidos na progressão tumoral, como
invasão, metástase e angiogênese (CURRAN, MURRAY, 2000; STAMENKOVIC,
2000; LYNCH, MATRISIAN, 2002; NABESHIMA et al., 2002; RUNDHAUG, 2003;
DECLERCK et al., 2004; SORSA, TJÄDERHANE, SALO, 2004; PEREIRA et al.,
2005).
A proposição deste estudo foi pesquisar a expressão de cinco destas
metaloproteinases (MMPs 1, 2, 7, 9 e 26) em carcinomas epidermóides de lábio inferior
e língua. Elegeu-se a imuno-histoquímica como método de investigação, principalmente
porque permite que se faça uma correlação direta com a morfologia do espécime. Além
disso, este método pode ser utilizado em tecidos incluídos em parafina, o que facilita,
sobremaneira, a obtenção da amostra.
A marcação imuno-histoquímica das MMPs foi avaliada na região do front de
invasão tumoral, a exemplo de numerosos trabalhos anteriores (YAMASHITA et al.,
2000; ZIOBER et al., 2000; LIU et al., 2002; TUNUNGLA et al., 2003; AMORIM,
2004; YAMAMOTO et al., 2004), por ser essa a área onde precisa e deve haver
atividade proteolítica para a progressão tumoral.
A intensidade e o padrão de reatividade às metaloproteinases exibidos pelas
neoplasias, bem como a proporção de células positivas, foram variáveis. Todos os
carcinomas epidermóides por nós pesquisados exibiram, no mínimo, duas das
metaloproteinases estudadas, o que demonstra que há aumento de produção destas
enzimas nas neoplasias em questão, indicando que as MMPs estão envolvidas no
desenvolvimento de carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua.
A MMP-1 consiste na metaloproteinase que mais eficientemente degrada
colágeno tipo I, sendo, portanto, essencial para a progressão tumoral. Em tecidos
adultos normais os níveis desta enzima permanecem usualmente baixos, entretanto sua
expressão é elevada em várias situações, como: remodelação tecidual, reparo e em
diversos processos patológicos, inclusive em neoplasias malignas (ALA-AHO,
KÄHÄRI, 2005; PARDO, SELMAN, 2005).
Em carcinomas epidermóides orais pode ser observado aumento na expressão de
MMP-1 (ZIOBER et al., 2000; FRANCHI et al., 2002), tendo sido demonstrado, por
hibridização in situ, que esta colagenase é mais intensamente expressa em lesões de
maior gravidade histológica (ZIOBER et al., 2000).
Na amostra investigada neste estudo, 93,33% dos carcinomas epidermóides
exibiram positividade para MMP-1 nas células neoplásicas localizadas no front de
invasão, sendo que em 80% dos casos esta marcação foi classificada como moderada ou
intensa. Estes valores são muito próximos aos encontrados por Franchi et al. (2000), que
foram 97,6% e 74,5%, respectivamente.
Esta imunomarcação exuberante das células neoplásicas para a metaloproteinase
1 reflete claramente a essencial importância da produção desta enzima para que o tumor
seja capaz de invadir tecidos adjacentes através da destruição dos componentes da
matriz extracelular, especialmente o colágeno I, que é a principal proteína estrutural da
MEC.
Corroborando estes resultados, Miranda (2002) evidenciou fraca expressão
imuno-histoquímica de colágeno tipo I no fronte invasivo de carcinomas epidermóides
de lábio inferior e língua, presumivelmente indicando a degradação desta proteína
durante o processo invasivo.
As gelatinases têm grande importância nos processos de invasão tumoral e
metástase. Isto se deve, principalmente, à sua capacidade de degradar colágeno tipo IV e
outros componentes da membrana basal, que consiste na primeira barreira física a ser
rompida durante estes processos. Além disso, as MMPs 2 e 9 são as principais enzimas
capazes de clivar o colágeno desnaturado, ou gelatina, resultante da degradação do
colágeno fibrilar.
Diversos trabalhos têm investigado o papel das metaloproteinases 2 e 9 em
carcinomas de células escamosas orais (HONG et al., 2000; TOKUMARU et al., 2000;
ZIOBER et al., 2000; FRANCHI et al., 2002; ROBINSON et al., 2003; GUTTMAN et
al., 2004; KATAYAMA et al., 2004; KATO et al., 2005; VICENTE et al., 2005),
encontrando, entretanto, resultados conflitantes.
Em alguns estudos tem sido demonstrado que há relação ou associação entre a
expressão das gelatinases e agressividade da lesão (HONG et al., 2000; TOKUMARU
et al., 2000; KATAYAMA et al., 2004; KATO et al., 2005; VICENTE et al., 2005), o
que permitiria a utilização destas metaloproteinases como marcadores prognósticos ou
para fins terapêuticos. Outros trabalhos, entretanto, não confirmam estes resultados
(FRANCHI et al., 2002; ROBINSON et al., 2003; GUTTMAN et al., 2004).
Dos 30 espécimes de carcinoma epidermóide que nós avaliamos, 60% exibiram
algum grau de positividade para MMP-2, sendo que em 30% dos casos esta marcação
foi considerada moderada ou forte. Hong et al. (2000) e Franchi et al. (2002) obtiveram
resultados semelhantes a este, com 34,1% e 39,5% das respectivas amostras exibindo
imunorreatividade moderada ou forte para MMP-2. Vicente et al. (2005), entretanto,
encontraram valores bem menores. Na amostra estudada por estes autores, apenas 28%
dos casos exibiram alguma positividade para MMP-2 e em 11,8% esta expressão foi
classificada como moderada ou forte.
Com relação à MMP-9, nós verificamos marcação positiva em 63,33% dos
espécimes, evidenciando expressão moderada ou forte em 30% da amostra. Estes
resultados se assemelham aos dados encontrados por Hong et al. (2000), Franchi et al.
(2002), Guttman et al. (2004) e Yamamoto et al.(2004). No estudo desenvolvido por
Vicente et al. (2005), a imunomarcação das células tumorais para MMP-9 se mostrou
bem menos expressiva, com 17,6% dos casos exibindo alguma positividade e 7,3% com
moderada ou forte marcação.
É possível que discrepâncias entre resultados de diferentes trabalhos sejam
causadas por diferenças metodológicas, especialmente no que diz respeito aos critérios
utilizados para avaliar o grau de positividade. O processamento dos espécimes teciduais
e os anticorpos utilizados são outros fatores que podem gerar divergências de
resultados.
A expressão das gelatinases observada neste estudo sugere que estas
metaloproteinases também estão exercendo um papel efetivo no desenvolvimento do
carcinoma epidermóide oral, embora suas marcações tenham sido, geralmente, bem
menores que da MMP-1. É possível que em uma fase mais precoce destes carcinomas
este quadro estivesse invertido, uma vez que, para iniciar o processo de invasão, há
necessidade de ruptura da membrana basal, com clivagem de proteínas que são os
substratos preferenciais de MMP-2 e MMP-9, como o colágeno tipo IV. Além disso, a
expressão das gelatinases também encontra-se relacionada a sua atividade de clivagem
da gelatina, produto da degradação do colágeno após sua lise pelas colagenases.
Portanto, a imuno-expressão destas MMPs no carcinoma epidermóide oral pode estar
refletindo a capacidade destas enzimas em degradar colágeno tipo IV e gelatina.
As matrilisinas são metaloproteinases de estrutura mínima, que vêm sendo
detectadas em neoplasias de origem epitelial em diversas localizações, como pele
(AHOKAS et al., 2005; IMPOLA et al., 2005), endométrio (TUNUNGLA et al., 2003;
PILKA et al., 2004), esôfago (YAMAMOTO et al. 2004), mama (WANG,
REIERSTAD, FISHMAN, 2005), pulmão (SASAKI et al., 2001), estômago (LIU et al.,
2002) e língua (BAIR et al., 2001; AMORIM, 2004).
Os casos por nós investigados exibiram ampla expressividade das duas
matrilisinas pelas células neoplásicas localizadas no fronte de invasão tumoral. Em
93,33% dos espécimes a MMP-7 pôde ser detectada imuno-histoquimicamente, sendo
esta expressão classificada como moderada ou forte em 76,67%.
Estudando carcinomas epidermóides linguais, Amorim (2004) observou que
83% dos casos se mostraram positivos ou fortemente positivos para MMP-7. Liu et al.
(2002) e Impola et al. (2005) também detectaram alta expressividade de MMP-7 em
carcinomas localizados, respectivamente, em esôfago e pele.
Com relação à MMP-26, todos os nossos casos foram positivos para esta
protease e em 76,67% esta expressão foi moderada ou forte. Amorim (2004) detectou,
em carcinomas epidermóides de língua, positividade ou forte positividade em 92% dos
casos com metástase e em 75% dos casos sem metástase. Em carcinomas esofágicos,
entretanto, a marcação para MMP-26 foi observada apenas em 46% da amostra
(YAMAMOTO et al., 2004).
Voltamos a ressaltar que diferenças na metodologia podem gerar resultados
conflitantes. Além disso, comparações entre lesões de diferentes regiões anatômicas não
são desejáveis, mas foram utilizadas devido à escassez de pesquisas de algumas MMPs,
especialmente as matrilisinas, em lesões de boca.
A forte marcação para as matrilisinas que encontramos nos carcinomas
epidermóides examinados parece indicar um grande potencial para invasão e metástase,
pois estas metaloproteinases são capazes de clivar proteínas de membrana basal, como
laminina e colágeno IV. Com efeito, Miranda (2002) observou imuno-
histoquimicamente, em carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, que o
colágeno IV e a laminina estavam predominantemente ausentes na membrana basal
peritumoral, na região do front invasivo, o que sugere atividade de enzimas
proteolíticas.
Já está bem estabelecido na literatura que o microambiente estromal exerce um
papel dinâmico e efetivo na progressão tumoral (FRANCHI et al., 2002; GUTTMAN et
al., 2004; POLETTE et al., 2004). Em numerosos experimentos, a cooperação ou
sinergismo entre células neoplásicas e fibroblastos estromais na produção de MMPs
tornou-se evidente (FRANCHI et al., 2002; PAPPARELLA et al., 2002; GUTTMAN et
al., 2004; VICENTE et al., 2005).
Apesar de diversos trabalhos ressaltarem a importância das metaloproteinases de
origem estromal para invasão tumoral e metástase, geralmente a avaliação da
expressividade das MMPs é feita somente nas células neoplásicas. Alguns estudos
apenas citam se houve ou não expressão de determinadas metaloproteinases pelas
células do estroma tumoral, mas não mencionam contagem de células positivas ou outra
técnica qualquer de classificação.
Acreditamos que esta é uma lacuna no estudo das metaloproteinases e por isso
decidimos, apesar de não ser nossa proposta inicial, avaliar também em células
estromais a marcação imuno-histoquímica destas proteases nos 30 casos de carcinoma
epidermóide constituintes da nossa amostra. Para esta avaliação elegemos o mesmo
método que adotamos para as células tumorais, preconizado por Franchi et al. (2002),
utilizando, no entanto, a classificação em apenas dois grupos de marcação: inexpressivo
e expressivo, estratégia sugerida por estes autores para facilitar a análise estatística.
A MMP-1 teve marcação expressiva nas células estromais de todos os casos
avaliados, até mesmo naqueles em que as células tumorais estavam negativas ou
inexpressivas para esta colagenase. Franchi et al. (2002) evidenciaram ampla expressão
estromal de MMP-1 em carcinomas de cabeça e pescoço, enquanto Sheu et al. (2001)
relataram baixa expressividade desta metaloproteinase em estroma de carcinomas
cervicais.
A MMP-2 também foi mais freqüente em estroma, com 50% da amostra
exibindo imunorreatividade classificada como expressiva, contra 30% quando a análise
foi feita em células tumorais, o que corrobora os achados de Vicente et al. (2005). A
MMP-9, no entanto, exibiu marcação expressiva no estroma de apenas 26,66% dos
casos, sendo, portanto, mais expressa em células tumorais, que mostraram reatividade
moderada ou forte em 30% da amostra.
Autores como Hong et al. (2000), Tokumaru et al.(2000), Sheu et al. (2001),
Papparella et al. (2002) e Guttman et al. (2004) evidenciaram fraca marcação imuno-
histoquímica das gelatinases em células estromais de carcinomas. Kato et al. (2005), por
sua vez, não evidenciaram expressão estromal de MMP-2 e MMP-9 em carcinomas
epidermóides orais, embora mais de 90% da amostra tenha apresentado
imunopositividade para estas metaloproteinases nas células tumorais.
Em nosso trabalho, a expressão imuno-histoquímica estromal das duas
matrilisinas diferiu bastante uma da outra. Para MMP-7 foi evidenciada ampla
expressividade em células do estroma em 80% dos casos, superando levemente a
positividade no parênquima, onde marcação expressiva de MMP-7 foi observada em
76,67% da amostra.
Ao avaliar a reatividade para MMP-26, no entanto, evidenciamos apenas um
caso no qual a marcação imuno-histoquímica das células estromais foi considerada
expressiva, embora em 76,67% da amostra as células tumorais exibissem, pelo menos,
moderada positividade para a matrilisina 2.
Esta tendência da MMP-26 em se expressar exclusivamente, ou quase
exclusivamente, em células tumorais já havia sido observada por Tunungla et al. (2003)
e Pilka et al. (2004), em carcinomas endometriais, Marchenko et al. (2004) em
carcinomas de mama e Ahokas et al. (2005) em carcinomas de pele.
Quando analisamos nossos resultados em conjunto, podemos afirmar que células
estromais dos carcinomas epidermóides estudados se mostraram capazes de produzir
metaloproteinases de matriz e que o fizeram com maior ou menor eficiência, de acordo
com a MMP investigada. Acreditamos que estas enzimas de origem estromal
potencializem a ação das MMPs produzidas pelo parênquima.
É válido ressaltar, ainda, que a síntese de MMPs pelo estroma tumoral confirma
a convicção de que há uma grande interação entre as células neoplásicas e o estroma
circunjacente, o que permite às neoplasias, estrategicamente, induzir as células
estromais a produzirem enzimas proteolíticas, que, sinergicamente com as enzimas
tumorais, facilitam os processos de invasão, migração e metástase.
Na literatura encontramos alguns trabalhos que testaram a associação entre o
aumento de expressão de metaloproteinases em carcinomas epidermóides e o sítio
anatômico primário da lesão. Vicente et al. (2005), investigando a expressão imuno-
histoquímica das MMPs 2 e 9 em carcinomas epidermóides orais, não encontraram
associação significativa com a localização da lesão. Estes autores, entretanto, incluíram
na amostra lesões de língua, assoalho de boca, gengiva, mucosa jugal, lábio e palato.
Yamamoto et al. (2004), estudando MMP-26 em carcinomas esofágicos, e Liu et
al. (2005) investigando MMPs 2 e 9 em carcinomas epidermóides de laringe, também
não detectaram relação significativa estatisticamente entre a reatividade destas
metaloproteinases e a localização da lesão.
Em nosso estudo, utilizamos o teste Mann-Whitney para comparar as lesões
localizadas em lábio inferior com aquelas situadas em língua, no que se refere à
expressão imuno-histoquímica das MMPs 1, 2, 7, 9 e 26 nas células neoplásicas
constituintes do front de invasão tumoral.
Observamos que, de modo geral, os carcinomas de língua exibiram maior
marcação que os de lábio inferior, o que confirmaria a maior agressividade, tão bem
documentada na literatura, das lesões linguais. Entretanto, ao tratamento estatístico dos
dados, esta diferença só foi significativa para MMP-9. Em estroma, por meio do teste
exato de Fisher, só foi detectada diferença significativa na marcação da MMP-2, que
curiosamente foi mais expressiva nas lesões de lábio inferior.
Estes achados estão em concordância com os resultados de Miranda (2002), que
demonstrou que tanto as lesões de língua quanto as de lábio inferior exibem
predominantemente ausência de expressão das proteínas de membrana basal, o que
indiretamente indica a ação de enzimas proteolíticas.
Outro objetivo do nosso trabalho foi avaliar a expressão das metaloproteinases
com relação ao grau histológico de malignidade dos carcinomas epidermóides
estudados. Diversos autores fizeram abordagens semelhantes em pesquisas publicadas
anteriormente.
Estudando carcinomas endometriais, Tunungla et al. (2003) detectaram aumento
significativo da expressão de MMP-26 em lesões de grau III, em comparação com
neoplasias de graus I e II. Resultado contrário, no entanto, foi evidenciado por Pilka et
al. (2004) e Ahokas et al. (2005), respectivamente em carcinomas endometriais e de
pele, onde houve marcação expressiva de MMP-26 nos graus I e II, mas não nos
carcinomas menos diferenciados, classificados em grau III.
Alguns trabalhos verificaram diferenças significativas na imunomarcação de
metaloproteinases na comparação entre lesões malignas e não malignas, o que sugere
que a gravidade histológica do espécime parece estar relacionada à expressão de
metaloproteinases. Ziober et al. (2000) observaram que carcinomas epidermóides orais
exibiram reatividade à MMP-1 significativamente maior que displasias epiteliais e
carcinomas in situ. Tsai et al. (2003), investigando a expressão das MMPs 2 e 9,
evidenciaram positividade significantemente mais alta em carcinomas epidermóides
orais que em queratinócitos normais. Tumores malignos de glândulas salivares exibiram
maior imunomarcação para MMP-2 que adenomas, em pesquisa realizada por Nagel et
al. (2004).
Vicente et al. (2005) detectaram associação estatisticamente significante entre o
grau histológico de malignidade de carcinomas epidermóides orais e a expressão imuno-
histoquímica da MMP-9, mas não com a MMP-2. Na pesquisa realizada por Liu et al.
(2005) em carcinomas de laringe, não houve relação significativa entre a
imunomarcação para MMP-2 e MMP-9 e o grau de diferenciação celular.
Em nossa amostra, observamos que as lesões de alto grau exibiram maior
positividade às MMPs que aquelas de baixo grau, exceto para a MMP-2. Assim, é
concebível afirmar que, nos carcinomas epidermóides investigados, as lesões de alto
grau morfológico de malignidade demonstraram maior potencial proteolítico que
aquelas de baixo grau.
O teste de Mann-Whitney atestou uma diferença significativa entre os dois
grupos, no que se refere à expressão das matrilisinas (MMP-7 e MMP-26), que são
enzimas que agem diretamente nas proteínas da membrana basal. Com efeito, Kumagai
et al. (1994) evidenciaram degradação da membrana basal em carcinomas epidermóides
orais com menor diferenciação celular e Hirota, Yoneda e Osaki (1990) constataram
diminuição na expressão de colágeno IV na membrana basal de carcinomas
epidermóides orais avançados.
Todos estes achados indicam que os carcinomas epidermóides de alto grau de
malignidade têm maior capacidade de destruir os componentes da membrana basal que
aqueles de baixo grau, o que explica o maior poder de invasão e metástase exibido pelas
lesões de maior gravidade histológica.
Verificamos também como se expressavam as MMPs 1, 2, 7, 9 e 26 dentro dos
dois subgrupos: lábio inferior e língua, avaliando a marcação em estroma e parênquima
das lesões de baixo e alto graus. Entre as lesões linguais, foi analisado ainda se a
presença de metástase estava relacionada à positividade às metaloproteinases.
No que se refere aos carcinomas epidermóides de lábio inferior, nossos
resultados mostraram que as MMPs 1, 7 e 26 foram significativamente mais expressas
nas células neoplásicas do fronte invasivo das lesões de alto grau que naquelas de baixo
grau de malignidade. Uma inversão nesta tendência foi evidenciada na MMP-2, mas não
teve significância estatística. Em estroma não foi detectada diferença significativa na
reatividade às MMPs com relação ao grau histológico de malignidade. Todos os casos
de carcinoma labial investigados exibiram marcação expressiva da MMP-1 e
inexpressiva ou ausente da MMP-26 nas células estromais adjacentes ao fronte
invasivo.
A avaliação das células tumorais do front de invasão dos carcinomas
epidermóides linguais demonstrou uma tendência das lesões de alto grau de
malignidade em exibirem maior expressão de metaloproteinases em comparação com as
de baixo grau, diferença esta que foi significante estatisticamente para a MMP-7.
Nenhuma diferença significativa, entretanto, foi detectada entre carcinomas
epidermóides de língua de alto e baixo graus de malignidade, no que diz respeito à
imunorreatividade das células estromais às MMPs pesquisadas.
Um fator reconhecidamente importante para a determinação do prognóstico de
pacientes portadores de neoplasias malignas é a presença de metástase. A relevância
deste fator é tão grande que ele tem sido utilizado como parâmetro para testar a
eficiência de numerosos possíveis marcadores de agressividade tumoral. Diversos
autores pesquisaram a expressão de metaloproteinases, comparando neoplasias malignas
com e sem metástase, mas os resultados obtidos não foram homogêneos.
Hong et al. (2000) observaram que carcinomas epidermóides orais com
metástase expressaram mais fortemente MMPs 2 e 9 que o grupo sem metástase, com
diferença estatisticamente significante para a última. Em carcinomas de cabeça e
pescoço, Katayama et al. (2004) encontraram significante correlação entre a expressão
da MMP-9, mas não da MMP-2, e a ocorrência de metástase nodal ou distante, e
Franchi et al. (2002) constataram que tumores com expressão aumentada de MMP-9
tiveram mais freqüentemente metástases linfáticas, em comparação com as lesões que
tiveram ausência ou baixa expressão desta metaloproteinase.
Em oposição a estes resultados, Vicente et al. (2005) não encontraram
correlação estatisticamente significante entre a presença de metástase e a expressão de
MMP-2 e MMP-9. Em cultura de células derivadas de carcinoma epidermóide oral
humano, Robinson et al. (2003) não detectaram correlação entre a expressão das
gelatinases e o fenótipo metastático. A presença de metástase também não exibiu
relação com a reatividade à MMP-9 nos carcinomas linguais estudados por Guttman et
al. (2004).
Também em carcinomas linguais, Amorim (2004) verificou não haver
correlação significativa entre o potencial metastático e a expressão imuno-histoquímica
das MMPs 7 e 26. No entanto, Sasaki et al. (2001), pesquisando MMP-7 em carcinomas
pulmonares e Yamamoto et al. (2004), estudando MMP-26 em carcinoma de células
escamosas de esôfago, constataram relação significativa entre metástase e a expressão
destas proteases.
Queremos ressaltar que a presença de metástase não constituía, a princípio, uma
das variáveis a serem exploradas neste estudo. No entanto, na amostra investigada
foram detectados seis carcinomas epidermóides linguais que já exibiam metástase para
os linfonodos regionais na época do diagnóstico. Comparamos, então, este grupo com
os nove casos sem metástase, no que diz respeito à expressão imuno-histoquímica das
MMPs 1, 2, 7, 9 e 26, tanto nas células tumorais do front invasivo quanto no estroma
subjacente.
Apesar de ter sido observada, em parênquima, certa tendência dos carcinomas
do grupo metastático em exibir maior reatividade a metaloproteinases que aqueles do
grupo sem metástase, não foi verificada nenhuma diferença estatisticamente significante
entre os grupos avaliados.
Acreditamos que o pequeno número de casos constituintes do grupo metastático
não permite uma avaliação conclusiva sobre a existência ou não de associação entre a
expressão de metaloproteinases e presença de metástase, entretanto, estes achados
podem ser úteis para fins de comparação com trabalhos posteriores.
Avaliamos também a existência de correlação entre os achados morfológicos e
imuno-histoquímicos em nosso trabalho. Utilizando o coeficiente de Spearman,
investigamos se os escores atribuídos para as características histológicas evidenciadas
nos carcinomas epidermóides, de acordo com Bryne (1998), estavam ou não
correlacionados à expressão imuno-histoquímica das MMPs 1, 2, 7, 9 e 26, classificadas
de acordo com o método de Franchi et al. (2002).
O escore total de malignidade teve relação direta com todas as MMPs, ou seja,
quanto mais alto o escore, maior a expressão imuno-histoquímica das metaloproteinases
investigadas. Esta correlação foi estatisticamente significativa para as metaloproteinases
7 e 26.
A imunorreatividade para as metaloproteinases também exibiu, na maioria dos
casos, relação direta com os escores parciais de malignidade, relativos ao grau de
ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e infiltrado inflamatório, exceto
para as MMPs 1 e 9, que tiveram relação inversa, mas não significativa estatisticamente,
com o escore do grau de ceratinização.
O tratamento estatístico dos dados revelou correlação significante entre a
imunorreatividade da MMP-7 e o escore do grau de ceratinização, escore do
pleomorfismo nuclear e escore do infiltrado inflamatório, e também entre a expressão
da MMP-26 e o escore do padrão de invasão. Estes achados reafirmam e complementam
uma de nossas constatações discutidas anteriormente: que os carcinomas epidermóides
de alto grau de malignidade exibiram maior expressividade, significativa
estatisticamente, para MMP-7 e MMP-26, o que poderia explicar o maior potencial
metastático exibido pelas lesões com maior gravidade histológica.
Trabalhos desenvolvidos por Kumagai et al. (1994) e Hirota, Yoneda e Osaki
(1990) demonstraram que o padrão de invasão de carcinomas epidermóides orais está
relacionado à perda de continuidade da membrana basal. Em concordância com estes
autores, nós constatamos que quanto mais disperso foi o padrão de invasão das lesões
estudadas, maior foi a expressão da MMP-26, o que reflete a degradação de
constituintes da membrana basal.
Avaliando nossos resultados em conjunto, observamos que as células
neoplásicas do fronte invasivo dos carcinomas epidermóides estudados foram capazes
de sintetizar metaloproteinases e de induzir a produção destas enzimas pelas células
estromais. Os altos índices de positividade às MMPs que encontramos nas neoplasias de
lábio inferior e língua, especialmente para MMP-1 e matrilisinas, indicam a grande
importância destas enzimas para a progressão tumoral.
Dentre todas as análises que fizemos, a relação estatisticamente significante que
mais se repetiu foi do grau histológico de malignidade com a expressividade à MMP-7.
Levando-se em consideração que a membrana basal interfere na diferenciação celular, é
perfeitamente compreensível que a degradação desta estrutura, realizada eficientemente
pela MMP-7, esteja relacionada à maior gravidade histológica dos carcinomas
epidermóides.
Evidenciamos também que as diferenças com significância estatística entre
grupos foram mais freqüentemente detectadas na expressão das metaloproteinases pelas
células tumorais. Assim, a expressão estromal de MMPs, na maioria das vezes, não
diferiu significativamente com relação à localização ou o grau histológico dos
carcinomas da nossa amostra.
Acreditamos que os dados obtidos neste experimento possam contribuir para a
construção de um conhecimento mais sólido sobre o carcinoma epidermóide de lábio
inferior e língua. É importante que outros estudos, seguindo metodologia semelhante,
sejam desenvolvidos, a fim de que os resultados possam ser comparados sem a
interferência de discrepâncias metodológicas.
Com a ampliação do entendimento acerca dos mecanismos envolvidos na
progressão do carcinoma epidermóide, especialmente no que diz respeito à síntese de
metaloproteinases, será possível determinar a viabilidade da utilização destas enzimas
como marcadores prognósticos ou de se desenvolverem agentes inibidores mais
direcionados e eficientes que auxiliem na terapêutica destas neoplasias malignas.
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7- CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos por meio da metodologia empregada no
presente trabalho, podemos concluir que:
1. As células neoplásicas do front invasivo dos carcinomas epidermóides
estudados, bem como as células estromais, expressaram imunomarcação para as
MMPs-1, -2, -7, -9 e -26, indicando uma marcante participação destas
metaloproteinases no desenvolvimento dos carcinomas epidermóides de lábio
inferior e língua.
2. De uma maneira geral, os achados deste estudo indicam que os carcinomas
epidermóides de língua exibiram tendência para maior marcação das MMPs
analisadas, quando comparados àqueles localizados em lábio inferior, embora
esta diferença só tenha se mostrado significativa estatisticamente para a MMP-9,
o que nos leva a sugerir que a marcante expressão dessas enzimas nos
carcinomas de língua pode estar contribuindo para o comportamento mais
invasivo das células neoplásicas, o que pode repercutir em um curso evolutivo
mais agressivo.
3. Os resultados aqui observados demonstram que a imunorreatividade das MMPs
estudadas mostrou tendência a uma marcação mais forte nas células neoplásicas
do front invasivo dos carcinomas de alto grau, exceto a MMP-2. Expressão
significativamente maior das MMPs-7 e -26 nos carcinomas epidermóides de
alto escore foi verificada, independentemente do sítio anatômico. Estes achados
nos levam a sugerir que a degradação de constituintes da MEC, particularmente
daqueles de membrana basal, é determinante no padrão de diferenciação
histológica, podendo, conseqüentemente, refletir no grau de agressividade
morfológica do carcinoma epidermóide de lábio inferior e língua.
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SUMMARY
The oral epidermoid carcinoma is a malignant neoplasty with high incidence and
an important cause of morbidity and mortality that presents, however, a variable
biological behavior, due to several factors. The aim of this study has consisted in
evaluating the immunohistochemical expression of MMP-1, MMP-2, MMP-7, MMP-9
and MMP-26 in epidermoid carcinomas, regarding the location of the lesion and its
histological grade of malignancy. 15 squamous cell carcinomas of lower lip and 15 of
tongue were selected and, after morphological evaluation, they were classified in low
malignancy grade (n=17) and high malignancy grade neoplasties (n=13), and
subsequently submitted to immunohistochemical study for the MMPs. All the
specimens investigated expressed at least two of the researched metalloproteinases, hat
were more evident in the cytoplasm of tumor cells located in the invasion front. The
tongue epidermoid carcinomas presented greater immunohistochemical expression of
MMPs by neoplastic cells than those of lower lip, with statistically significant
difference for MMP-9 (p=0.030). The high grade epidermoid carcinomas presented
greater expression of metalloproteinases, except for MMP-2, in comparison to the low
grade lesions, with statistically significant difference for MMP-7 (p=0,0001) and MMP-
26 (p=0,016). In addition it was evidenced a direct relation between the morphological
scores of malignancy and immunoreactivity to MMPs, with statistic significance for
MMP-7 and MMP-26. Based on these results we can conclude that a greater expression
of MMPs by tumor cells, especially MMP-9, may contribute to a higher invasive
potential of tongue carcinomas in comparison to lip carcinomas. Besides, the
histological severity of epidermoid carcinomas seems to be related to
immunohistochemical expression of metalloproteinases, especially matrilysins, which
suggests that the capacity of degrading basal membrane seems to be determinant in the
pattern of histological differentiation of neoplasties studied. The high levels of reactivity
to MMPs found in the specimens studied reflect the outstanding participation of these
enzymes in the development of epidermoid carcinomas in lower lip and tongue.
Key words: Oral cancer, epidermoid carcinoma of lower lip, epidermoid carcinoma of
tongue, metalloproteinase, immunohistochemical.
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