( PDF ) Estabelecimento in vitro e micropropagação da canjarana (cabralea canjerana)

Download PDF

ads:

SILVANA CRUZ DA ROCHA

ESTABELECIMENTO

IN VITRO

E MICROPROPAGAÇÃO DA CANJARANA

(

Cabralea canjerana

)

Dissertação apresentada como requisito

parcial à obtenção do grau de Mestre em

Botânica, Curso de Pós-Graduação em

Botânica, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná

Orientadora: Prof.

Dr.

Marguerite Quoirin

Co-orientadora: Prof.

Dr.

Luciana L. F.

Ribas

Co-orientador: Prof.º Dr.º Henrique S.

Koehler

CURITIBA

2005

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

AGRADECIMENTOS

Ao Curso de Pós-Graduação em Botânica, do Setor de Ciências Biológicas da

Universidade Federal do Paraná, por possibilitar a realização do meu mestrado.

À Professora Doutora Marguerite Quoirin, pela orientação, amizade e dedicação a

mim dispensada.

À Professora Doutora Luciana L. F. Ribas pela co-orientação e por todas as

sugestões.

Professor Doutor Henrique S. Hoehler pela co-orientação e por toda ajuda na

área de estatística, a qual foi de grande valia.

À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.

À SPVS pelo fornecimento das sementes e por toda ajuda a mim dispensada

desde a coleta de frutos até a coleta de ramos caulinares para a realização dos

experimentos.

À Mariza, Giovana e a todos os amigos e colegas de mestrado.

À Carla, Flávia e Igor pela ajuda a mim dispensada.

Ao meu querido esposo pelo seu amor, amizade e compreensão.

Aos meus pais por sempre torcerem por mim e a Deus por iluminar o meu caminho.

ads:

iii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS

.........................................................................................................

LISTA DE FIGURAS

..........................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS

..............................................................................................

RESUMO

............................................................................................................................

ABSTRACT

........................................................................................................................

xii

1 INTRODUÇÃO

................................................................................................................

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

...........................................................................................

2.1

Cabralea canjerana......................................................................................................

2.2 MICROPROPAGAÇÃO................................................................................................

2.2.1 Desinfestação do Material Vegetal............................................................................

2.2.1.1 Desinfestação de partes aéreas.............................................................................

2.2.1.2 Desinfestação de sementes...................................................................................

2.2.2 Multiplicação..............................................................................................................

2.2.3 Enraizamento.............................................................................................................

3 MATERIAL E MÉTODOS

................................................................................................

3.1 ORIGEM DO MATERIAL

VEGETAL............................................................................

3.2 DEISCÊNCIA DOS FRUTOS.......................................................................................

3.3 DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO DAS SEMENTES

IN VITRO

.............................

3.4 DESINFESTAÇÃO DE GEMAS AXILARES OBTIDAS DE PLANTAS ADULTAS.......

3.5 MULTIPLICAÇÃO DE GEMAS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS

DE PLANTAS JUVENIS..............................................................................................

3.5.1 Preparo dos Explantes..............................................................................................

3.5.2 Preparo dos Meios de Cultura...................................................................................

3.5.3 Condições de Cultura................................................................................................

3.5.4 Experimentos de Indução de Brotações Múltiplas Utilizando o Meio de Cultura MS

3.5.5 Experimentos de Indução de Brotações Múltiplas Utilizando o Meio de cultura

WPM.........................................................................................................................

3.5.6 Subcultivos................................................................................................................

3.6 EXPERIMENTO DE ALONGAMENTO E ENRAIZAMENTO DE BROTOS

(MICROESTACAS) OBTIDOS NA FASE DE MULTIPLICAÇÃO..............................

3.7 EXPERIMENTO DE ENRAIZAMENTO DE MICROESTACAS OBTIDAS DE

REBROTAS DE PLANTAS GERMINADAS E CRESCIDAS IN VITRO.....................

4 RESULTADOS

................................................................................................................

4.1 DEISCÊNCIA DE FRUTOS..........................................................................................

4.2 DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO DAS SEMENTES ............................................

4.3 DESINFESTAÇÃO DAS GEMAS AXILARES PROVENIENTES DE ÁRVORES

ADULTAS....................................................................................................................

4.4 MULTIPLICAÇÃO DE GEMAS AXILARES..................................................................

4.4.1 Culturas em Meio de Cultura MS..............................................................................

4.4.1.1 Efeito da benzilaminopurina na multiplicação de gemas axilares em segmentos

nodais e apicais ....................................................................................................

4.4.1.1.1 Taxa de multiplicação..........................................................................................

4.4.1.1.2 Efeito da BAP na percentagem de explantes com brotos...................................

4.4.1.1.3 Efeito da BAP no número médio de brotos por explante....................................

4.4.1.1.4 Efeito da BAP no comprimento médio dos brotos...............................................

4.4.1.1.5 Efeito da BAP na percentagem de explantes mortos..........................................

4.4.1.1.6 Resumo dos resultados obtidos nas culturas de segmentos nodais em MS

adicionado de BAP..............................................................................................

4.4.1.2 Culturas em Meio de Cultura MS adicionado de 2-Isopenteniladenina..................

4.4.1.2.1 Efeito da 2-iP na multiplicação de gemas axilares em segmentos nodais e

apicais ................................................................................................................

4.4.1.2.2 Efeito da 2-iP na percentagem de explantes com brotos....................................

4.4.1.2.3 Efeito da 2-iP no número médio de brotos por explante.....................................

4.4.1.2.4 Efeito da 2-iP no comprimento médio dos brotos................................................

4.4.1.2.5 Efeito da 2-iP na percentagem de explantes mortos...........................................

4.4.1.2.6 Resumo dos resultados obtidos nas culturas de segmentos nodais em MS

adicionado de 2-iP...............................................................................................

4.4.1.3 Culturas em Meio de Cultura MS adicionado de benzilaminopurina e 2-

isopenteniladenina................................................................................................

4.4.1.3.1 Efeito de BAP e 2-iP na multiplicação de gemas axilares em segmentos

nodais obtidos a partir de rebrotas.......................................................................

4.4.1.3.2 Efeito de BAP e 2-iP na percentagem de explantes com brotos obtidos a partir

de rebrotas..........................................................................................................

4.4.1.3.3 Efeito de BAP e 2-iP no número médio de brotos por explante obtidos a partir

de rebrotas..........................................................................................................

4.4.1.3.4 Efeito de BAP e 2-iP no comprimento médio dos brotos obtidos a partir de

rebrotas..............................................................................................................

4.4.1.3.5 Efeito de BAP e 2-iP na percentagem de explantes mortos obtidos a partir de

rebrotas...............................................................................................................

4.4.1.3.6 Resumo dos resultados obtidos em MS adicionado de BAP e 2-iP em

segmentos nodais originados de rebrotas.........................................................

4.4.1.4 Conclusões Sobre os Experimentos com o Meio de Cultura MS...........................

4.4.2 Culturas em Meio de Cultura WPM Adicionado de Benzilaminopurina.....................

4.4.2.1 Efeito da BAP na multiplicação de gemas axilares de segmentos nodais e

apicais....................................................................................................................

4.4.2.2 Efeito da BAP na percentagem de explantes com brotos......................................

4.4.2.3 Efeito da BAP no número médio de brotos por explante........................................

4.4.2.4 Efeito da BAP no comprimento médio dos brotos..................................................

4.4.2.5 Efeito da BAP na percentagem de explantes mortos.............................................

4.4.2.6 Conclusões Sobre o Experimento em Meio de Cultura WPM Adicionado de BAP

4.5 ENRAIZAMENTO DE BROTOS OBTIDOS NA FASE DE MULTIPLICAÇÃO.............

4.6 ENRAIZAMENTO DAS MICROESTACAS OBTIDAS A PARTIR DE REBROTAS......

5 CONCLUSÕES

...............................................................................................................

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

..................................................................................

FIGURAS

............................................................................................................................

ANEXOS

.............................................................................................................................

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 -

RESULTADOS OBTIDOS EM EXPERIMENTOS DE MULTIPLICAÇÃO

IN VITRO

DE ÁRVORES TROPICAIS EM MEIO DE CULTURA MS

ADICIONADO DE CITOCININAS...............................................................

TABELA 2 -

RESULTADOS DE DEISCÊNCIA DE FRUTOS DE CANJARANA,

ARMAZENADOS EM SACO PLÁSTICO SEM E COM SERRAGEM,

APÓS 11 DIAS...........................................................................................

TABELA 3 -

EFEITO DOS TRATAMENTOS DE DESINFESTAÇÃO NA

PERCENTAGEM DE CONTAMINAÇÃO E DESINFESTAÇAO DE

SEMENTES DE CANJARANA APÓS 7 DIAS, E NA GERMINAÇÃO

VITRO

APÓS 7 E 14 DIAS.........................................................................

TABELA 4 -

RESULTADOS DOS TRATAMENTOS DE DESINFESTAÇÃO DE

GEMAS AXILARES DE ÁRVORES ADULTAS DE CANJARANA, APÓS

14 DIAS DE CULTIVO ...............................................................................

TABELA 5 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 6 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE

CANJARANA NO 4° SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS COM

CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM.........................................................................

TABELA 7-

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS

NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA

MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO

DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................................................

TABELA 8 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS

NO CULTIVO INICIAL EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO

DE ORIGEM..............................................................................................

TABELA 9 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS

COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM.........................................................................

TABELA 10 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE COM BROTOS DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 11-

MÉDIAS DO COMPRIMENTO DOS BROTOS FORMADOS EM

EXPLANTES DE CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO

SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS ADICIONADO DE BAP,

EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM.............................

TABELA 12 -

NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, NO CULTIVO INICIAL

E NOS 1°, 3° E 4° SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM

CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM.........................................................................

TABELA 13 -

NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, NO 2º SUBCULTIVO

EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE

BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM....................

TABELA 14 -

RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA O SEGMENTO

NODAL EM TODOS OS CULTIVOS..........................................................

TABELA 15 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 16 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS

NO CULTIVO INICIAL E NOS 1º, 3º E 4º SUBCULTIVOS EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 17 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS

NO 2º SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO

DE ORIGEM...............................................................................................

TABELA 18 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP,

NO CULTIVO INICIAL E EM 2 SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO

DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................................................

TABELA 19 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP,

NO 3º SUBCULTIVO, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE

ORIGEM

TABELA 20 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE COM BROTOS DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 21 -

MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS EM

EXPLANTES DE CANJARANA EM MEIO DE CULTURA MS

ADICIONADO DE 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO

SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM..

TABELA 22 -

NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM

MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP,

NO CULTIVO INICIAL E NO 1º SUBCULTIVO, EM FUNÇÃO DO TIPO

DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................................................

TABELA 23 -

NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, CULTIVADOS EM

MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP,

NOS 2

, 3

E 4º SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM.........................................................................

TABELA 24 -

RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS

NODAIS DE CANJARANA PARA OS CULTIVOS REALIZADOS.............

TABELA 25 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO EM EXPLANTES DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E

BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS (ORIGEM:

SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS)..................................................

TABELA 26 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO EM EXPLANTES DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP e

BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E NOS 1º E 2º SUBCULTIVOS

(ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS)................................

TABELA 27 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS

EM MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP

E BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS

(SEGMENTOS DE REBROTAS)...............................................................

TABELA 28 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E

BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS

(ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS)................................

vii

TABELA 29 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS DE

CANJARANA EM MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS

TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E EM

QUATRO SUBCULTIVOS (SEGMENTOS DE REBROTAS).....................

TABELA 30 -

MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS A

PARTIR DE EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO

DE CULTURA MS ADICIONADO DE BAP E/OU 2-iP, NO CULTIVO

INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS

NODAIS OBTIDOS A PARTIR DE REBROTAS).......................................

TABELA 31 -

NECROSE EM EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO

DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-

iP), EM TRÊS SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE

REBROTAS) ..............................................................................................

TABELA 32 -

RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS

NODAIS DE CANJARANA NOS CULTIVOS REALIZADOS NO

EXPERIMENTO COM BAP E 2-iP COMBINADOS...................................

TABELA 33 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE

CANJARANA EM MEIO DE CULTURA WPM, COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO

SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO.......................

TABELA 34 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS NO 2º SUBCULTIVO DE

EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA

WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO

TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM..........................................................

TABELA 35 -

TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS NO CULTIVO INICIAL E

NO 3° SUBCULTIVO DE EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS

EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE

BAP (MEDIA DE 2 TIPOS DE SEGMENTOS) .........................................

TABELA 36 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA FORMANDO

BROTOS EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO INICIAL E NO 2º

SUBCULTIVO, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM....

TABELA 37 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA FORMANDO

BROTOS EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO 1º E 3º SUBCULTIVOS, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM...................................

TABELA 38 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO

DE ORIGEM...............................................................................................

TABELA 39 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE NO 1º, 2º E 3º

SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP (MEDIA DE DOIS TIPOS DE

SEGMENTOS) ..........................................................................................

TABELA 40 -

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E NO 1º, 2º E 3º SUBCULTIVO EM

MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP

(MEDIA DE DOIS TIPOS DE SEGMENTOS)............................................

TABELA 41 -

MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS EM

EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA

WPM ADICIONADO DE BAP, NO CULTIVO INICIAL E NOS TRÊS

PRIMEIROS SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO

DE ORIGEM...............................................................................................

viii

TABELA 42 -

NECROSE EM EXPLANTES DE CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E

EM QUATRO SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA WPM COM

TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM.........................................................................

TABELA 43 -

PERCENTAGEM DE EXPLANTES MORTOS EM SEGMENTOS

NODAIS E APICAIS DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE

CULTURA WPM, COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO 3º

SUBCULTIVO.............................................................................................

TABELA 44 -

RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS

NODAIS DE CANJARANA, NOS CULTIVOS REALIZADOS NO

EXPERIMENTO EM WPM ADICIONADO DE BAP...................................

TABELA 45 -

ENRAIZAMENTO DE BROTOS DE CANJARANA OBTIDOS NA FASE

DE MULTIPLICAÇÃO, EM MEIO DE CULTURA WPM ADICIONADO

DE IBA (0; 2,5 E 5,0

M) ...........................................................................

TABELA 46 -

ENRAIZAMENTO DE MICROESTACAS DE CANJARANA OBTIDAS A

PARTIR DE REBROTAS, EM MEIO DE CULTURA MS/2 ADICIONADO

DE IBA (0; 2,5, 5,0 E 10

M).....................................................................

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 -

Frutos de

Cabralea canjerana

: 1º - com três fissuras e parcialmente

aberto, 2º - com cinco fissuras; 3º - com cinco fissuras e totalmente

aberto.........................................................................................................

FIGURA 2 -

Fruto aberto, sementes recobertas pelo arilo alaranjado e sementes

isoladas sem o arilo da

Cabralea canjerana.

.............................................

FIGURA 3 -

Plântula germinada in vitro, com radícula, cotilédones e parte aérea,

recoberta pelo tegumento que envolvia a semente...................................

FIGURA 4 -

Segmento apical (acima) e segmento nodal..............................................

FIGURA 5 -

Segmentos nodais em meio de cultura MS com 2,5

M de BAP (após

30 dias no cultivo inicial)............................................................................

FIGURA 6 -

Segmento nodal com as gemas axilares em desenvolvimento, depois

de 30 dias (1

subcultivo)..........................................................................

FIGURA 7 -

Segmento nodal com gemas axilares, em meio de cultura MS com BAP

subcultivo)............................................................................................

FIGURA 8 -

Segmentos nodais em meio de cultura MS com BAP (3

subcultivo)..................................................................................................

FIGURA 9 -

Aspecto da rebrota, originada da gema do nó cotiledonar, com 80 dias

de idade.....................................................................................................

FIGURA 10 -

Segmentos nodais retirados de rebrotas, em meio de cultura MS

adicionado de BAP 2,5

M (1º subcultivo).................................................

FIGURA 11 -

Segmento nodal retirado de rebrota, no 3º subcultivo em meio de

cultura MS com BAP+ 2-iP........................................................................

FIGURA 12 -

Segmentos nodais em meio de cultura MS adicionado de 5,0

M de 2-

iP (2

subcultivo) ......................................................................................

FIGURA 13 -

Segmento nodal em meio de cultura WPM com 5,0

M de BAP (2

subcultivo) .................................................................................................

FIGURA 14 -

Segmento apical com uma raiz na base, em meio de cultura WPM sem

fitorreguladores (após 30 dias no cultivo inicial)........................................

]

FIGURA 15 -

Broto com raízes, após 30 dias em meio WPM adicionado de

IBA.............................................................................................................

LISTA DE ABREVIATURAS

2-iP- 2-isopenteniladenina

BAP- benzilaminopurina

- ácido giberélico

IBA- ácido indol 3-butiríco

KIN- cinetina

MS- meio de cultura de MURASHIGE e SKOOG (1962)

MS/2- meio de cultura de MURASHIGE e SKOOG (1962), com a concentração de sais

minerais reduzida

NAA - ácido ácetico

TDZ - thidiazuron

v/v - relação volume/ volume

WPM - ‘’Woody Plant Medium’’ meio de cultura de LLOYD e McCOWN (1980)

RESUMO

A canjarana,

Cabralea canjerana

(Vell.) Mart.(Meliaceae), possui uma das madeiras mais

valiosas do Sul do Brasil, sendo empregada em construções civis, marcenaria, carpintaria e

obras de escultura. A casca do caule e das raízes tem uso medicinal e dela também extraí-

se corante vermelho, utilizado na indústria de tinturaria. O suco do fruto tem ação inseticida.

O arilo das sementes é consumido por várias espécies animais, razão pela qual sua

presença é indispensável na composição de reflorestamentos heterogêneos ou restauração

de áreas de preservação permanente. As sementes são recalcitrantes e a bibliografia

referente à propagação vegetativa da espécie é escassa. O presente trabalho teve como

objetivo desenvolver um protocolo de micropropagação da canjarana a partir de plantas

crescidas

in vitro

e de plantas adultas. Para otimizar a obtenção de sementes a partir de

frutos quase maduros e uniformizar a idade das plântulas utilizadas nos experimentos, foi

realizado um experimento de deiscência dos frutos, sendo essa obtida com sucesso

deixando os frutos, ainda sem fissuras de deiscência, em sacos plásticos fechados, a 25

C. As sementes foram desinfestadas com hipoclorito de sódio (2,5% v/v) por 30 minutos,

obtendo-se 75% de desinfestação e 90% de germinação

in vitro.

Em seguida foram

realizados experimentos de multiplicação utilizando segmentos nodais e/ou apicais,

retirados de plantas crescidas

in vitro

. Os segmentos foram inoculados em meio de cultura

MS ou WPM adicionado de 30 g.L

-1

de sacarose e 7 g.L

-1

de ágar. A estes meios de cultura

foram adicionadas as citocininas benzilaminopurina (BAP) e/ou 2-isopenteniladenina (2-iP)

nas concentrações de 2,5; 5,0; 10 e 20

M. As variáveis analisadas foram: a taxa de

multiplicação, a percentagem de explantes com brotos, o número e comprimento dos brotos

e a percentagem de explantes mortos. Os brotos obtidos foram colocados em meio de

cultura WPM adicionado de ácido indol butírico - IBA (0, 2,5 e 5,0

M) para indução do

enraizamento. Na fase de multiplicação, o segmento nodal cultivado em presença de 2,5 e

5,0

M de BAP, propiciou os melhores resultados, em comparação ao segmento apical e ao

segmento nodal cultivado em presença de 2-iP. A maior taxa de multiplicação foi observada

em segmentos nodais cultivados no meio de cultura MS adicionado de 2,5

M de BAP com

um valor de 1,72 contra 1,41 no mesmo tipo de explante e meio de cultura MS adicionado

de 5,0

M de 2-iP. O meio de cultura MS foi o mais adequado para a multiplicação da

canjarana, nele foram obtidos os melhores resultados em comparação com o WPM. Além

disso, nesse último foi observada clorose foliar dos brotos. O enraizamento dos brotos

oriundos de meio de cultura contendo citocininas foi baixo (20%) em presença de 5,0

M de

IBA. Entretanto, o enraizamento das microestacas oriundas de rebrotas de plântulas foi

satisfatório (77%) na mesma concentração de IBA. Em conclusão, a micropropagação da

canjarana a partir de segmentos nodais pode se tornar viável. Entretanto, novos

experimentos devem ser realizados para melhorar as taxas de multiplicação e obter uma

percentagem significativa de desinfestação de gemas axilares de plantas adultas.

Palavras-chave: citocininas, espécie nativa, Meliaceae, micropropagação, multiplicação

xii

ABSTRACT

The canjarana,

Cabralea canjerana

(Vell.) Mart. (Meliaceae), possess one of the most

valuable wood of the South of Brazil, being used in building sites, joinery, carpentry and

sculpture works. Stem and root bark has medicinal use and red dye is extracted from stem

bark and used in staining industry. Fruit juice has insecticide action. The arilo of the seeds is

consumed by several animal species, reason for which its presence is essential in the

composition of heterogeneous reforestation or restoration of areas of permanent

preservation. The seeds are recalcitrant and the bibliography regarding the vegetative

propagation of the species is scare. The purpose of our work was to establish a protocol of

micropropagation of the canjarana, starting from plants grown

in vitro

and of adult plants. To

optimize the obtention of seeds from almost ripe fruits, and to standardize the age of the

seedlings used in the experiments, an experiment of fruit dehiscence was achieved. The

dehiscence was successful when the fruits, still without dehiscence fissures, were kept in

closed plastic bags at 25 ± 3°C. The seeds were treated with sodium hypochlorite at 2.5%

(v/v) for 30 minutes, with 75% of the seeds being disinfested and 90% germinating

in vitro

Multiplication experiments were accomplished using nodal and/or apical segments, excised

from plants grown

in vitro

. The segments were inoculated in MS or WPM culture medium,

supplemented with 30 g.L

-1

of sucrose and 7 g.L

-1

agar. To these culture media was added

the cytokinin benzylaminopurine (BAP) and/or 2-isopentenyladenine (2-iP) at concentrations

of 2.5; 5.0; 10 and 20

M. The evaluated variables were: the multiplication rate, the

percentage of explants with shoots, the number and length of the shoots and the percentage

of dead explants. The shoots obtained in the multiplication experiment were used in a rooting

experiment where medium culture was WPM medium supplemented with indolebutyric acid -

IBA (0, 2.5 and 5.0

M) for root induction. In the multiplication phase, the nodal segment, in

the presence of 2.5 and 5.0

M of BAP, gave the best results for the analyzed variables, in

comparison with the apical segment and with the 2-iP treatments. The largest multiplication

rate, for instance, in nodal segments cultivated with 2.5

M BAP, was of 1.72 against 1.41 in

the same type of explant cultured in MS medium supplemented with 5.0

M 2-iP. The MS

culture medium was the most appropriate for the multiplication of the canjarana. Morevover,

leaf chlorosis was observed. The rooting of the shoots originating from culture medium

containing cytokinin was low (20%) in the presence of 5.0

M IBA. However, the rooting of

the microcuttings originating from new shoots was satisfactory (77%) in the same

concentration of IBA. In conclusion, the micropropagation of the canjarana, starting from

nodal segments, can become viable. However, new experiments should be accomplished to

improve the multiplication rates and to obtain a significant percentage of desinfestation of

axillary buds from adult plants.

Key words: cytokinins, Meliaceae, micropropagation, multiplication, native species.

1 INTRODUÇÃO

A propagação vegetativa geralmente é utilizada quando a propagação sexuada não

tem sucesso, quando o número de plantas requerido pelo mercado não é suficiente ou

ainda, quando é de interesse a propagação de plantas com características selecionadas.

Neste tipo de propagação assexuada estão incluídas a macropropagação, a qual pode ser

obtida por meio das técnicas de estaquia, enxertia, alporquia, mergulhia e a

micropropagação. Já a embriogênese somática, a proliferação de gemas adventícias e a

proliferação de gemas axilares, são técnicas utilizadas na micropropagação (HARTMANN et

al., 2002). Entre a micropropagação e a macropropagação existem diferenças como o custo

financeiro e o número de plantas obtidas. Na macropropagação o número de explantes

retirados da planta matriz pode ser limitado, entretanto na micropropagação podemos obter

um grande número de propágulos a partir de um pequeno número de árvores de elite,

devido ao pequeno tamanho dos explantes (LIEW; TEO, 1998). Também, pode se obter

uma taxa de multiplicação mais elevada comparada com a macropropagação (HARTNEY,

1982).

A micropropagação ou propagação vegetativa

in vitro

possui essa denominação

devido ao tamanho dos propágulos utilizados (TORRES et al., 1998) e engloba vários

protocolos de regeneração a partir de tecidos vegetais, incluindo como explantes: folhas,

gemas apicais ou axilares, segmentos nodais dentre outros. A possibilidade de utilização de

vários tipos de explantes para iniciar a cultura se baseia na teoria da totipotência das células

vegetais, sendo essa a potencialidade em iniciar um novo indivíduo a partir de explantes

unicelulares ou pluricelulares (TORRES et al., 2000). A micropropagação é utilizada para

propagação de genótipos modificados ou não, produção de biomassa de produtos

bioquímicos do metabolismo secundário, produção de plantas livre de vírus, preservação de

germoplasma e em investigações científicas. Os procedimentos citados estão incluídos na

Biotecnologia (GUPTA, 1988; HARTMANN et al., 2002).

Técnicas de micropropagação têm sido utilizadas para propagação de algumas

espécies florestais nativas e para o estabelecimento de matrizes para produção de

sementes. Entretanto, são necessários estudos básicos de micropropagação para as

espécies tropicais lenhosas (CID et al., 1997), como é o caso das espécies nativas. Logo,

trabalhos científicos nessa área são importantes para aumentar o conhecimento científico e

sua aplicação prática.

A espécie (

Cabralea canjerana

) foi escolhida para o desenvolvimento do presente

trabalho devido à curta viabilidade de suas sementes quando armazenadas (sementes

recalcitrantes), à variação na porcentagem de germinação indicada na literatura e à escassa

bibliografia referente à propagação vegetativa da espécie. A micropropagação permitiriá a

propagação massal de mudas para reflorestamento com esta espécie. O presente trabalho

teve como objetivo geral desenvolver um protocolo de multiplicação vegetativa da canjarana

(

Cabralea canjerana

) pela micropropagação, o qual aumentará o número de propágulos

desta espécie florestal. Os objetivos específicos foram: estabelecer culturas assépticas

vitro

a partir de sementes e de gemas axilares de árvores adultas, encontrar uma

concentração de citocininas que permita a multiplicação de gemas axilares de segmentos

nodais e apicais de plântulas crescidas

in vitro

e obter o enraizamento

in vitro

microestacas.

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1

Cabralea canjerana

A canjarana (

Cabralea canjerana

)

é uma espécie arbórea, perenifólia a

semicaducifólia, pertencente à família Meliaceae, conhecida popularmente como canjarana,

canjerana, cedro-canjerana, caiarana, pau-de-santo, canharana e outros (CARVALHO,

1994). A canjarana pode ser encontrada na Costa Rica, Guiana, Perú, Bolívia, Argentina,

Paraguai (BACKES; IRGANG, 2002) e no Brasil nos Estados de Alagoas, Bahia, Espiríto

Santo, Góias, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Pará, Rio de Janeiro,

Roraima, São Paulo, Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e no Distrito Federal

(CARVALHO, 1994). O habitat da espécie compreende a Floresta Ombrófila Densa

(Floresta Atântica), Floresta Estacional Semidecidual, Floresta Estacional Decidual, Floresta

Ombrófila Mista (Floresta com Araucária) e Campos de Altitude (CARVALHO, 1994).

A árvore da canjarana pode alcançar até 30 m de altura e 100-150 cm de DAP

(diâmetro na altura do peito); possui tronco cilíndrico e geralmente tortuoso. As folhas são

compostas, opostas e imparipenadas (CARVALHO, 1994), com folíolos alternos, peciólulos

de 3 mm de comprimento, lâminas oblongas, bordo inteiro, um quase reto e outro curvo e

base assimétrica (REITZ et al., 1983).

A madeira da canjarana é considerada como uma das mais valiosas do Sul do Brasil,

pois possui uma grande durabilidade, quando exposta a intempéries, e pode ser trabalhada

com facilidade fornecendo um bom acabamento (REITZ et al., 1983). É de ótima qualidade e

a sua cor varia de branca até vermelho-escuro, com vivos reflexos nas faces radiais, textura

média e lisa ao tato, apresentando resistência satisfatória ao ataque de organismos

xilófagos em condições favoráveis ao apodrecimento (CARVALHO, 1994; BACKES;

IRGANG, 2002). Devido a estas características, a madeira é empregada em construções

civis (indicada para obras internas e externas), dormentes, marcenaria, confecção de caixas,

embalagens, carpintaria e obras de escultura (CARVALHO, 1994; LONGHI, 1995). Além

disso, ela apresenta as vantagens da madeira do cedro, sendo mais firme, resistente e

durável (REITZ et al., 1983) e ainda quando comparada ao cedro (

Cedrela fissilis

) é pouco

afetada pela broca

Hypsipyla grandella.

Porém, em um plantio comprobatório de canjarana,

observou-se, no sexto ano após o plantio, um aumento no número e na percentagem de

árvores com seca nos ponteiros devido ao ataque deste inseto, o que diminuiu a

sobrevivência do povoamento, inviabilizando plantios puros acima de 0,5 ha (CARVALHO et

al., 1996).

A casca do caule e das raízes da árvore tem importantes aplicações na terapêutica

popular (REITZ et al., 1983) e uso medicinal como purgativo, febrífugo, abortivo (BACKES;

IRGANG, 2002), antidispéptico, adstringente e emético (CARVALHO, 1994). Da casca do

caule, também, extraí-se corante vermelho, que é utilizado na indústria de tinturaria,

principalmente para tingir pelegos (CARVALHO, 1994; BACKES; IRGANG, 2002).

A espécie possui flores hermafroditas, nectaríferas, com coloração branca

esverdeada, pequenas e aromáticas, que são utilizadas na indústria da perfumaria devido

ao seu intenso aroma. O suco do fruto tem ação inseticida. As sementes possuem um arilo

suculento que as envolve, o qual é consumido por várias espécies de pássaros, macacos e

outros mamíferos (BACKES; IRGANG, 2002) como o mono-carvoeiro (

Brachyteles

arachnoides

), razão pela qual sua presença é indispensável na composição de

reflorestamentos heterogêneos ou restauração de áreas de preservação permanente

(LORENZI, 1996).

A longevidade das sementes armazenadas é curta, devido à perda rápida da

viabilidade durante a secagem (LONGHI et al., 1984). Isso ocorre por essa semente ser

recalcitrante (ou seja, responde à dessecação com a diminuição da sua viabilidade). O início

desse processo dá-se quando a semente é separada do fruto, sendo o seu poder

germinativo diminuído após 10 dias (LONGHI et al., 1984). Por essa razão, a germinação

das sementes deve ocorrer logo após a maturação (HARTMANN et al., 2002). Como a

semente possui essa característica e não são ainda conhecidos métodos eficazes para

manter a sua viabilidade, não é aconselhável o seu armazenamento (CARVALHO, 1994).

A viabilidade das sementes foi estudada em experimentos

utilizando dois tipos de

embalagens: saco plástico e saco de filó. Neste último as sementes foram misturadas a

casca de arroz umedecida. As sementes foram armazenadas em câmara fria a 5

comparando com o armazenamento em embalagem aberta fora da câmara fria. O melhor

resultado obtido foi com o saco de filó, que manteve parte da viabilidade das sementes,

sendo capaz de apresentar 50% da germinação inicial até 120 dias de armazenamento

(FRASSETO; MENEZES, 1997). Em outro experimento de armazenamento de sementes,

essas foram colocadas em vidro hermeticamente fechado e em saco plástico, os dois lotes

sendo mantidos em câmara fria a 5

C. O resultado de germinação obtido aos 105 dias foi de

39% e 1%, respectivamente (ZANON; CARPANEZZI, 1993).

A faculdade germinativa da espécie varia de 40% até 93% (CARVALHO, 1994).

Porém, LORENZI (1996) considera que a germinação é lenta e geralmente muito baixa, sem

indicar a percentagem de germinação. Segundo BACKERS e IRGANG (2002), em canteiros,

ela ocorre após 13 a 73 dias.

2.2 MICROPROPAGAÇÃO

Na micropropagação, órgãos e tecidos de plantas são introduzidos

in vitro

estabelecidos e mantidos em culturas assépticas para regenerar novas plantas

(HARTMANN et al., 2002). Os meios nutritivos fornecem substâncias essenciais para o

crescimento dos tecidos cultivados e também participam do controle do padrão de

desenvolvimento

in vitro

(CALDAS et al., 1998).

A micropropagação difere da propagação tradicional nos componentes biológicos de

cada etapa, pois são separados dentro de estágios (estabelecimento dos explantes

in vitro

multiplicação, alongamento e enraizamento), aumentando assim o controle de cada aspecto

da regeneração e dos processos de desenvolvimento. As etapas podem ser manipuladas

pela seleção de explantes e controle do desenvolvimento da cultura (HARTMANN et al.,

2002).

As técnicas

in vitro

têm mostrado vantagens sobre os métodos da propagação

tradicional, pois as culturas são iniciadas com fragmentos de plantas (explantes), requerem

pequeno espaço para manter ou para aumentar o número de plantas e podem produzir

plantas livres de patógenos como vírus. Além disso, as taxas de propagação são maiores e

em pouco tempo pode-se produzir clones de plantas que apresentam dificuldades de

propagação via macropropagação. Outra vantagem desta técnica é a produção das mudas

independente da época do ano (GEORGE, 1993).

A primeira fase de um protocolo de regeneração de plantas a partir de explantes é a

seleção do material de onde serão retirados os explantes, levando em consideração critérios

como: taxa de crescimento e conservação das características da espécie (MATEO-

SAGASTA, 1990). Esta fase também inclui o estabelecimento de culturas assépticas, que

ocorre por meio da desinfestação dos explantes (TORRES et al., 1998).

A segunda fase refere-se à produção de propágulos, ou seja, à multiplicação de

brotos axilares ou adventícios, de embriões somáticos ou de órgãos. Propágulos produzidos

nessa fase, especialmente brotos, podem ser utilizados em ciclos de multiplicação para

aumentar o seu número (GEORGE, 1993). A terceira fase compreende a transferência das

partes aéreas produzidas para um meio de enraizamento e subseqüente transplantio das

plantas obtidas para substrato ou solo na última fase a de aclimatação (TORRES et al.,

1998).

2.2.1. Desinfestação do material vegetal

2.2.1.1 Desinfestação de partes aéreas

A desinfestação é uma etapa problemática, pois o desinfestante deve eliminar os

microrganismos do tecido vegetal sem danificar o mesmo. Alguns microrganismos podem

ser endógenos ou estarem latentes tanto em sementes como em brotos. Por essa razão,

muitas vezes a obtenção de tecidos vegetais livres de microrganismos é difícil. Porém, se

apenas os meristemas forem retirados, esses geralmente estão livres de microrganismos

(BONGA; DURZAN, 1985).

A desinfestação do material juvenil geralmente não é difícil; entretanto, também são

utilizados explantes de material adulto ou de plantas crescidas em condições de campo. A

desinfestação de explantes coletados no campo é mais complicada, pois as percentagens

de contaminação são freqüentemente altas, quando comparadas com as de explantes

juvenis ou retirados de mudas mantidas em casa-de-vegetação. A contaminação pode ser

reduzida por pulverizações com inseticidas e fungicidas (BONGA; ADERKAS, 1992),

envolvendo os brotos das plantas em sacos plásticos ou mantendo-os em casa-de-

vegetação (HARTMANN et al., 2002).

Os desinfestantes mais comumente utilizados são o hipoclorito de cálcio e o

hipoclorito de sódio. O hipoclorito em pH 8,0 perde a sua eficiência e pode prejudicar o

tecido vegetal provocando sua oxidação, porém em pH próximo de 6,0 é mais efetivo

(BONGA; DURZAN, 1985). Geralmente, um surfactante como Tween

, ou um detergente, é

adicionado à solução de hipoclorito para facilitar a sua ação, aumentando o contato da

solução com os tecidos (TORRES et al., 1998). Porém, a adição deste pode, além de

diminuir a contaminação, aumentar a toxicidade do hipoclorito para o tecido vegetal

(BONGA; DURZAN, 1985).

Geralmente, no início da desinfestação, é utilizado etanol a 70% durante alguns

segundos, para eliminar bolhas de ar e parte dos lipídeos, aumentando assim o contato do

desinfestante com o material vegetal. Depois, o explante é mergulhado em hipoclorito de

sódio em uma concentração que varia de 1 a 2% durante 10 a 30 minutos, com gotas de

Tween

-20 ou 80, e em seguida são realizados enxágües em água estéril (MATEO-

SAGASTA, 1990).

A desinfestação de brotos de cana-de-açúcar obtidos de plantas adultas foi realizada

utilizando solução de hipoclorito de sódio a 2,7%, com pH 6,0. Os resultados demonstraram

que 46,8% dos explantes não contaminaram. Entretanto, o tratamento foi altamente

fitotóxico, provocando 100% de necrose e morte dos brotos (MOUTHIA; DOOKUM, 1999).

Brotos de plântulas de goiabeira (

Psidium guajava

) foram desinfestados em etanol 70% por

um minuto, seguido de hipoclorito de sódio a 5% por 5 minutos. O resultado foi 70% de

explantes desinfestados e baixa necrose (KHATTAK et al., 1990). Explantes da mesma

espécie, com 2 anos de idade, mantidos em casa de vegetação, produziram brotos e esses

foram desinfestados com 70% de etanol por um minuto, seguido de hipoclorito de sódio 2%

por 15 minutos e enxague com água destilada e esterilizada (ALI; LÜDDERS, 2001).

Brotos apicais de plantas com 2 anos de idade de

Cinnamomum camphora

crescidos

em casa de vegetação foram desinfestados com hipoclorito de sódio 0,5% adicionado de

Tween

-20 (2 gotas), por 10 minutos. Após a desinfestação, foi utilizado um explante

medindo 3-5 mm, contendo o broto apical e parte do caule subjacente. Foi escolhido este

tamanho reduzido do explante, pois minimiza a contaminação no cultivo (HUANG et al.,

1998).

Ramos do caule de 5 meses de idade da

Azadirachta excelsa

, espécie da família das

Meliaceae, foram desinfestados com hipoclorito de sódio a 1,35% acrescido de Tween

-20

(2 gotas) por 25 minutos. Em seguida, as gemas axilares foram retiradas e desinfestadas

novamente em 1,05% (v/v) de hipoclorito por 15 minutos (LIEW; TEO, 1998).

2.2.1.2 Desinfestação de sementes

No caso de

Swietenia macrophylla

, o mogno, a desinfestação de sementes e

segmentos nodais de plantas germinadas

in vitro

foi efetuada com hipoclorito de sódio 0,8%

durante 20 minutos (ALBARRÁN et al., 1997). Em outro trabalho com esta espécie, suas

sementes foram desinfestadas com hipoclorito de sódio a 10% por 10 minutos, antes da

remoção do tegumento e, após a remoção deste, o tempo da desinfestação foi de 5 minutos

na mesma concentração de hipoclorito (VENKETESWARAN et al., 1987). Outros

pesquisadores desinfestaram as sementes do mogno com etanol 70% (3 segundos),

seguido de hipoclorito de sódio comercial na concentração de 5,5% por 20 minutos

(CERDAS et al., 1998).

Em outro trabalho com representante da família Meliaceae,

Cedrela fissilis

, foram

utilizadas sementes para obtenção de plântulas em condições assépticas. Para isso, as

sementes foram desinfestadas com hipoclorito de sódio a 2,5% de cloro ativo, contendo

Tween

-20 (2 a 3 gotas), por 75 minutos (NUNES et al., 2002).

Sementes de

Miconia

sp., da família Melastomataceae, foram desinfestadas com

hipoclorito de sódio a 9% por 10 minutos e depois enxaguadas com água estéril seguido de

um tratamento com benomyl (0,5% por 10 minutos) (CID et al., 1997).

Na propagação

in vitro

Eucalyptus sideroxylon,

sementes foram desinfestadas

com hipoclorito de sódio a 2,5% e Tween

-20 por 20 minutos (CHENG et al., 1992).

No protocolo descrito por YASSEEN et al. (1995) para propagação

in vitro

goiabeira (

Psidium guajava

), o fungicida benomyl (50% por 10 minutos) seguido de

hipoclorito de sódio (0,79% por 20 minutos) foram utilizados para desinfestação de

sementes.

2.2.2 Multiplicação

A multiplicação é a segunda fase da propagação

in vitro

de plantas. Nesta fase os

explantes já possuem um crescimento uniforme e adequado; por essa razão, o propósito

desse estágio é a multiplicação das gemas ou das microestacas, para posterior

enraizamento. As plantas desenvolvidas a partir desses explantes, por possuírem gemas

pré-existentes, geralmente são fiéis na reprodução do genótipo da planta matriz

(HARTMANN et al., 2002).

Os meios de cultura utilizados nos estágios de estabelecimento da cultura e

multiplicação são similares, pois ambos possuem em suas formulações macronutrientes,

micronutrientes, carboidratos, geralmente a sacarose, e alguns compostos orgânicos como

vitaminas e aminoácidos. Entretanto, existem meios de cultura com específicas formulações

como o MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962) com altas concentrações de sais, sobretudo os

íons nitrato e amônio, quando comparado a outras formulações salinas (GEORGE, 1996) e

meios com menores concentrações de sais (especialmente nitrogênio e potássio),

comparado ao MS, como o meio de cultura WPM (LLOYD; McCOWN, 1980) (SAADAT;

HENNERTY, 2002). Esse geralmente é utilizado em espécies lenhosas quando o meio MS

não for eficiente (HARRY; THORPE, 1994).

Reguladores vegetais são adicionados ao meio de cultura para auxiliar o crescimento

e também são importantes no direcionamento da resposta do desenvolvimento dos

propágulos (HARTMANN et al., 2002). Dentre os fitorreguladores utilizados na fase de

multiplicação destacam-se as citocininas, as quais participam de vários processos

fisiológicos e de desenvolvimento incluindo a divisão celular, morfogênese da parte aérea e

das raízes e senescência (TAIZ; ZEIGER, 2004). Dentro do grupo de citocininas

encontramos BAP (benzilaminopurina), KIN (cinetina), 2-iP (2-isopentenil adenina) e ZEA

(zeatina), as quais são empregadas para formação de brotos. Outro grupo, o das auxinas

(IAA- ácido indol acético, NAA- ácido naftaleno acético e IBA- ácido indol butírico), pode ser

utilizado nessa fase, porém em baixas concentrações (HARTMANN et al., 2002). Já o uso

do 2,4-D (2,4 diclorofenoxiácetico), que também é uma auxina, é evitado, pois promove a

formação de calos e pode também causar variação genética no cultivo de células ou de

tecidos (GEORGE, 1996).

A escolha das citocininas e das auxinas nos cultivos

in vitro

é arbitrária, ou seja,

depende dos pesquisadores, porém mesmo com escolhas diferentes, esses podem obter

resultados similares. O estabelecimento de brotos e a multiplicação do número destes

podem ser promovidos por uma citocinina sem a adição de auxinas. Experimentos com

algumas espécies demonstraram que as auxinas podem ser desnecessárias e podem

reduzir a capacidade dos brotos de enraizar. Já a adição de mais de uma citocinina pode

aumentar a produção ou melhorar a qualidade dos brotos (GEORGE, 1996).

A taxa de proliferação ou multiplicação de brotos dependerá da concentração de

citocininas aplicadas (GEORGE, 1996). Geralmente, as concentrações altas induzem muitos

brotos, mas podem afetar a qualidade destes, produzindo brotos pequenos e incapazes de

alongarem-se para separação (HARTMANN et al., 2002). Os brotos produzidos podem

ainda ter dificuldades para enraizamento, uma maior suscetibilidade à hiperhidricidade

(vitrificação) e podem ser induzidos brotos adventícios. Entretanto, concentrações baixas de

citocininas podem estimular somente o crescimento de brotos axilares ou laterais

(GEORGE, 1996; HARTMANN et al., 2002).

Na fase de multiplicação podem ser realizadas várias subculturas, cada uma tendo

uma duração de duas a oito semanas. Entretanto, se o tempo de subcultura for

demasiadamente longo, as folhas se tornam amareladas e pode ocorrer necrose

(HARTMANN et al., 2002).

Dentre os métodos de micropropagação destacamos a propagação a partir de brotos

axilares, a qual inclui a cultura de gemas e segmentos nodais. Essas referem-se a cultura de

gemas com meristemas intactos e o propósito destas é a multiplicação de brotos e a

repetida formação de ramos axilares. Para que a multiplicação ocorra, a dominância apical

deve ser eliminada. Para isso, a gema apical pode ser retirada ou são utilizadas citocininas

e ou a mudança dos segmentos para a posição horizontal (GEORGE, 1996).

Na Tabela 1 são apresentados experimentos de multiplicação, utilizando como

explantes gemas axilares e segmentos nodais.

BAP+NAA não induziu ou inibiu brotações;

número de brotos por explante.

EM2 (Pronatec, Lille, França/composto para prevenção e redução da vitrificação);

TABELA 1 - RESULTADOS OBTIDOS EM EXPERIMENTOS DE MULTIPLICAÇÃO

IN VITRO

ÁRVORES TROPICAIS EM MEIO DE CULTURA MS ADICIONADO DE

CITOCININAS

Espécie

Explante

Citocininas (resultado)

Autores

Azadirachta indica

(Meliaceae)

Gemas apicais e

laterais

4,4

M de BAP(4 brot/expl.)

YOUSEF; FATTAH,

1998

Azadirachta

excelsa

(Meliaceae)

Gemas axilares

4,4

M de BAP e 0,5

M de NAA

(8 brot/ expl.)

LIEW; TEO, 1998

Cedrela fissilis

(Meliaceae)

Segmentos de

nós cotiledonares

de plântulas

jovens

1,25 a 5,0

M de BAP

(6 a 7 novos brotos)*

NUNES; CASTILHO;

MORENO; VIANA,

2002

Celastrus

paniculatus

(Celastraceae)

Segmentos

nodais e brotos

apicais

4,4

M de BAP

(3,6 brot/expl. em 94% explantes)

NAIR; SEENI, 2001

Cinnamomum

camphora

(Lauraceae)

Segmento nodal

de árvores com 2

anos e em casa

de vegetação

4,4

M de BAP (9 brot/expl.);

4,4

M de BAP + EM

1000 mg/l

(18 brotos /explante)

HUANG; HUANG;

MURASHIGE, 1998.

Dalbergia sissoo

Nós

cotiledonares

8,9

M de BAP

(7,9 brot/ expl.; 99% prolif. brotos)

PRADHAN; KAR;

CHAND, 1998

Holostemma ada-

kodien

(Asclepiadaceae)

Gemas axilares

8,9

M de BAP e 2,45

M de IBA

(8 brot/expl.)

MARTIN, 2002

Melia azedarach

(Meliaceae)

Meristemas de

brotos apicais

2,2

M de BAP e 0,49

M de IBA

VILA; SCOCCHI;

MROGINSKI, 2002

Melia azedarach

(Meliaceae)

Segmentos

nodais

6,6

M de BAP + 1,1

M de NAA

(7 brot/ expl.)

11,7

M de KIN + 1,1

M de NAA

(13brot/expl.)

SHAHZAD;

SIDDIQUI;

SHAHZAD, 2001

Morus latifolia

(Moraceae)

Gemas axilares

de árvores com

15 anos

8,9

M de BAP (6 brot/expl.)

(MS +2% frutose)

MEI-CHUN, 2002

Naregamia alata

(Meliaceae)

Gemas apicais

3,1

M de BAP e 8,6

M de GA

(9 brot/expl.)

BENNY et al., 1999

Psidium guajava

(Myrtaceae)

Segmentos

nodais com

gemas axilares

2,2

M de BAP (2,4 brotos por explante) a

4,4

(2,1 brot/expl.)

M de 2-iP (2 brot/expl.)

ALI; LÜDDERS,

2001

Punica granatum

(Puniaceae)

Gemas axilares

2,2

M de BAP + 5,4

M de NAA

(8 a 10 brot/ expl.) subcultivo em 13,3

M de

BAP + 2,7

M de NAA (20,2)

RUDRA;

JUWARKAR, 2002

Swietenia

macrophylla

(Meliaceae)

Segmentos

nodais

M de BAP

(taxa multiplicação 2,95)

M de BAP+ 2,2

M de 2-iP

(taxa multiplicação 7,22)

SCHOTTZ, 2003

2.2.3 Enraizamento

A fase de enraizamento consiste em transferir as partes aéreas produzidas na fase

de multiplicação para um meio adequado à indução de raízes. Entre as fases de

enraizamento e multiplicação pode ser necessária uma fase adicional a de alongamento das

partes aéreas, ou o sistema pode ser simplificado, eliminando-se a etapa de enraizamento

vitro

pela manipulação das partes aéreas como microestacas, as quais enraizariam

diretamente no substrato de transplantio (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

A etapa de enraizamento caracteriza-se pela formação de raízes adventícias nas

partes aéreas provenientes da multiplicação, permitindo o posterior transplantio para

condições

ex vitro

. Geralmente o enraizamento de espécies herbáceas é fácil, porém o

mesmo não ocorre com as espécies lenhosas (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). O

enraizamento de lenhosas é dependente da relação entre os níveis de auxina e citocinina,

participação de outras substâncias reguladoras de crescimento (por exemplo: as giberelinas

e o ácido abscísico), influência de co-fatores e fatores fisiológicos e externos (ASSIS;

TEIXEIRA, 1998).

A capacidade de enraizamento pode ser reduzida à medida que se utiliza material

menos juvenil, já que essa capacidade diminui quando a planta se aproxima da fase adulta

(HARTMANN, 2002). Por essa razão às vezes é necessária à restauração da competência

de enraizamento por meio do rejuvenescimento das partes aéreas (GRATTAPAGLIA;

MACHADO, 1998). O rejuvenescimento é considerado como uma reversão da fase adulta

para a juvenil, sendo esse obtido por meio de podas severas na planta-matriz, de micro-

enxertias consecutivas, sucessivos subcultivos de meristemas apicais e a aplicação de

alguns fitorreguladores como as giberelinas (HARTMANN, 2002).

A rizogênese pode ser dividida em indução, iniciação e alongamento das raízes. Na

fase de indução a capacidade para a formação da raiz é determinada. Já na fase de

iniciação visíveis mudanças citológicas ocorrem, na última fase, a qual pode ser dividida em

organização e alongamento. O primórdio da raiz pode ser observado histologicamente,

ocorrendo também o desenvolvimento das raízes (GEORGE, 1996). As duas primeiras

fases respondem ou dependem de auxina, enquanto que o crescimento das raízes é inibido

pela presença da mesma (GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998).

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ORIGEM DO MATERIAL VEGETAL

Foram coletados ramos, com 60 cm de comprimento, de árvores adultas de

canjarana localizadas no município de Antonina, na Reserva Morro da Mina, propriedade da

Sociedade de Pesquisa em Vida Selvagem e Educação Ambiental (SPVS). As gemas

axilares foram utilizadas em experimentos de desinfestação, para posterior inoculação

vitro

No período de agosto a outubro de 2003 foram coletados frutos de árvores de duas

reservas da SPVS, Reserva do Xaxim e da Cachoeira, localizadas no município de Antonina

Estado do Paraná. Os frutos sem fissuras foram utilizados em experimento de deiscência.

Segmentos nodais e apicais foram excisados das plantas germinadas e crescidas

vitro

e utilizados em experimentos de multiplicação.

3.2

DEISCÊNCIA DOS FRUTOS

Os frutos coletados no dia 21/07/03 na Reserva do Xaxim foram acondicionados em

sacos plásticos para o transporte. No laboratório, os frutos fechados foram colocados em

sacos plásticos com serragem e em sacos plásticos sem serragem. Esses foram fechados e

colocados na temperatura de 25

C. A deiscência dos frutos foi analisada após 7 e 11

dias.

As médias dos tratamentos (frutos em embalagens fechadas com e sem serragem)

foram comparadas por meio do teste-t para amostras independentes. O delineamento

experimental foi inteiramente ao acaso, com cada unidade experimental constituída por 33

frutos fechados e três repetições. As variáveis avaliadas para a deiscência dos frutos foram

a percentagem de frutos totalmente abertos (com cinco fissuras), parcialmente abertos

(número de fissuras menor que cinco), fechados, e a percentagem de frutos contaminados

por fungos.

3.3 DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO DAS SEMENTES

IN VITRO

As sementes foram retiradas dos frutos, quando esses sofreram deiscência. O arilo

foi eliminado manualmente com o auxílio de água. Em seguida, as sementes foram

desinfestadas com etanol 70% por 30 segundos, seguido de solução de hipoclorito de sódio

nas concentrações de 1,0; 2,5 e 5,0% (v/v), acrescido de Tween

20 (4% v/v), em dois

tempos de tratamento (20 e 30 minutos). Depois disso, as sementes foram lavadas em água

destilada estéril (quatro enxágues) e inoculadas no meio de cultura MS1/2 (MS com a

concentração de sais minerais e vitaminas dividida pela metade) (MURASHIGE; SKOOG,

1962). Os experimentos foram realizados em frascos de vidro com 6,5 cm de diâmetro

contendo 20 ml de meio de cultura. Os frascos foram mantidos em sala de crescimento nas

condições descritas em 3.5.3.

O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, com cinco repetições, sendo

oito frascos por repetição, uma semente por frasco e seis tratamentos.

As variáveis avaliadas foram o número de sementes contaminadas por fungos e/ou

bactérias após 7 dias e o número de sementes germinadas após 7 e 14 dias. Essas

variáveis foram utilizadas para calcular as percentagens de contaminação e germinação das

sementes.

Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância e as médias dos

tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey.

3.4 DESINFESTAÇÃO DE GEMAS AXILARES OBTIDAS DE PLANTAS ADULTAS

Testes de desinfestação de gemas axilares foram realizados após a lavagem de

ramos caulinares adultos em água corrente e detergente.

Nos experimentos 1 e 2, descritos em seguida, as gemas axilares foram retiradas em

condições assépticas, com o auxílio do bisturi, e colocadas em etanol 70% por 30 segundos,

seguido de soluções de hipoclorito de sódio. Depois de enxaguadas em água destilada

estéril, foram inoculadas em placas de petri (10 cm de diâmetro) com 20 mL meio de cultura

MS.

Experimento 1. O hipoclorito de sódio foi utilizado nas concentrações de 0,03; 0,06;

0,12; 0,24 e 0,5% (v/v) durante 4 minutos. O delineamento experimental utilizado foi

inteiramente ao acaso, com 5 repetições e 11 explantes por repetição.

Experimento 2. Hipoclorito de sódio nas concentrações de 6; 8,4; 9,6 e 10,8 % (v/v)

por 8 minutos. O delineamento experimental foi o mesmo utilizado no experimento anterior,

porém o número de repetições foi de 6 com 9 explantes por repetição.

Nos experimentos 3 e 4 descritos abaixo, os ramos caulinares foram lavados em

água e detergente, seccionados em segmentos de 7 cm de comprimento com o auxílio de

bisturi e colocados em etanol 70% por 30 segundos. Depois os explantes foram colocados

em soluções de hipoclorito de sódio e após esse processo as gemas axilares foram

enxaguadas em água destilada autoclavada e inoculadas em tubos de ensaio com meio de

cultura MS.

Experimento 3. Os ramos contendo gemas axilares foram desinfestados com 6 e

8,4% (v/v) de hipoclorito de sódio (20 minutos). O delineamento experimental utilizado foi

inteiramente casualizado, com 4 repetições e 4 explantes por repetição.

Experimento 4. As concentrações de hipoclorito de sódio utilizadas foram as

seguintes: 0,5; 1,0 e 2,0% (v/v) com pH ajustado em 6,0, em dois tempos de imersão (15 e

20 minutos). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, entretanto foram

utilizadas 5 repetições por tratamento e 8 explantes por repetição.

As variáveis avaliadas foram a percentagem de explantes contaminados por fungos

e/ou bactérias e a percentagem de sobrevivência das gemas axilares após 14 dias.

3.5 MULTIPLICAÇÃO DE GEMAS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE

PLANTAS JUVENIS

3.5.1 Preparo dos Explantes

Os segmentos nodais e apicais foram retirados de plântulas germinadas e crescidas

in vitro

com 60 dias de idade. Os segmentos apicais foram cortados com auxílio de uma

tesoura deixando a base em bisel. Cada segmento de aproximadamente 0,8 cm de

comprimento, continha uma gema axilar com uma folha jovem e a gema apical. Os

segmentos nodais também foram seccionados com auxílio da tesoura com a base em bisel

e o ápice em corte reto. O comprimento dos segmentos era de aproximadamente 1,2 cm,

sendo que cada segmento nodal continha duas gemas axilares opostas.

3.5.2 Preparo dos Meios de Cultura

Os meios de cultura foram preparados com água destilada e de acordo com as

formulações salinas e vitamínicas para os respectivos meios de cultura, adicionadas de 30

g.L

-1

de sacarose e 7 g.L

-1

de ágar. O pH foi ajustado em 5,8 antes da esterilização, a qual

foi realizada por passagem na autoclave por 20 minutos a uma temperatura de 120ºC. Os

fitorreguladores foram adicionados aos meios de cultura antes da autoclavagem.

3.5.3. Condições de Cultura

Todas as culturas

in vitro

(com exeção da germinação das sementes e dos testes de

desinfestação de gemas axilares retiradas de plantas adultas) foram realizadas em frascos

de vidro com 6,5 cm de diâmetro contendo 25 ml de meio de cultura por frasco, tampados

com papel alumínio.

As culturas foram mantidas na sala de crescimento do Laboratório de

Micropropagação do Departamento de Botânica da Universidade Federal do Paraná. As

condições foram: temperatura de 25

C, densidade de fluxo de fótons de

mol.m

-2

(lâmpadas fluorescentes da marca Philips “Luz do dia”) e fotoperíodo de 16 horas.

3.5.4 Experimentos de Indução de Brotações Múltiplas Utilizando o Meio de Cultura MS

Experimento 1. Dois tipos de segmentos, nodais e apicais, foram inoculados em meio

de cultura MS, acrescido de BAP nas concentrações de 2,5; 5,0; 10 e 20

M e no meio

controle sem BAP.

Experimento 2. Foram utilizados segmentos nodais e apicais, que foram inoculados

em meio de cultura MS, acrescido de 2,5; 5,0; 10 e 20

M de 2-iP e no meio controle sem 2-

iP.

Nos dois experimentos, o delineamento experimental foi inteiramente casualizado

para os dois fitorreguladores. O arranjo fatorial dos tratamentos 5x2 foi utilizado, para

estudar a interação entre as concentrações de citocinina e o tipo de segmento. Foram

utilizadas 8 repetições por tratamento e a unidade experimental era composta por dois

frascos com três segmentos nodais cada.

Para as variáveis: percentagem de explantes mortos, percentagem de explantes com

brotos e o número médio de brotos novos por explante, os dados foram transformados para

(x+1), sendo que o valor de “x” está na forma decimal.

Nos dois experimentos, os resultados foram submetidos à análise de variância e as

médias dos tratamentos obtidas foram comparadas pelo teste de Tukey, com exceção da

variável comprimento dos brotos, para a qual não foi realizada análise estatística em razão

do grande número de valores nulos em algumas repetições dos tratamentos. O programa

estatístico utilizado foi o MSTAT-C.

Experimento 3. Esse foi realizado utilizando o meio de cultura MS e rebrotas (brotos

originados do nó cotiledonar, após a poda da parte aérea da planta) com 70 dias de idade,

de plantas germinadas e crescidas

in vitro

. As rebrotas foram seccionadas em segmentos

nodais de aproximadamente 1,4 cm de comprimento, contendo duas gemas axilares

alternadas. O ápice caulinar foi descartado.

As citocininas testadas foram BAP ou 2-iP na concentração de 2,5

M e as duas

combinadas na mesma concentração. O delineamento experimental foi inteiramente

casualizado, com 8 repetições por tratamento, a unidade experimental sendo composta por

dois frascos com três segmentos nodais em cada.

Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos

foram comparadas pelo teste de Tukey. Para as variáveis: percentagem de explantes

mortos, percentagem de explantes com brotos e número médio de brotos novos por

explante, os dados foram transformados para (x+1), sendo que o valor de “x” está na forma

decimal.

3.5.5 Experimentos de Indução de Brotações Múltiplas Utilizando o Meio de Cultura WPM

Segmentos nodais (1,2 cm de comprimento) e apicais (0,8 cm de comprimento)

obtidos de plantas germinadas e crescidas

in vitro

com 70 dias de idade foram inoculados

em meio de cultura WPM, acrescido de 0, 2,5 e 5,0

M de BAP. O delineamento

experimental foi inteiramente casualizado, com 8 repetições e a unidade experimental sendo

composta por dois frascos com três segmentos nodais cada.

Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias dos tratamentos

foram comparadas pelo teste de Tukey, para as variáveis: percentagem de explantes

mortos, percentagem de explantes com brotos e o número médio de brotos novos por

explante, os dados foram transformados para (x+1), sendo que o valor de “x” está na forma

decimal. A variável comprimento dos brotos não foi submetida à análise estatística em razão

do grande número de valores nulos em algumas repetições dos tratamentos. O programa

estatístico utilizado foi o MSTAT-C.

3.5.6 Subcultivos

No cultivo inicial, as avaliações foram realizadas após 45 dias da inoculação dos

explantes. Porém, nos quatro subcultivos, essas foram realizadas a cada 30 dias. Após as

avaliações, os explantes tiveram a extremidade inferior cortada novamente em bisel e foram

subcultivados em meios de culturas com as mesmas composições iniciais e as mesmas

concentrações de citocininas.

Os explantes foram avaliados, considerando as seguintes variáveis: número inicial de

gemas em cada tratamento, número de gemas ao final da subcultura, incluindo as gemas

dos novos brotos formados, o número de explantes mortos e o tamanho dos brotos

superiores a 0,5 cm. A partir desses dados foi calculada a taxa de multiplicação da maneira

seguinte: o número final de gemas no final da subcultura, incluindo as gemas axilares dos

brotos, foi dividido pelo número de gemas no início da subcultura. Também foram calculados

a percentagem de explantes com brotos, o número médio de brotos (com caule > 0,5 cm)

novos por explante (para o cálculo desta variável, foram considerados apenas os brotos

novos produzidos em cada subcultivo, divididos pelo número de propágulos presentes em

cada subcultivo), o número médio de brotos em explantes com brotos, o comprimento médio

dos brotos e a percentagem de explantes mortos. Foi considerado propágulo toda estrutura

utilizada para multiplicação vegetativa da planta, segundo a definição de TORRES et al.

(1999).

Nos experimentos utilizando o meio de cultura MS, acrescido de BAP ou 2-iP, antes

de executar o 2º subcultivo, todos o segmentos nodais contendo duas gemas opostas

(maiores que 0,3 cm) foram divididos em dois explantes, cada um com uma gema axilar. Já

nos experimentos com o meio de cultura MS utilizando segmentos nodais de rebrotas e no

experimento com WPM acrescido de BAP utilizando segmentos nodais e apicais, a divisão

das gemas axilares (maiores que 0,3 cm) presentes nos segmentos dos explantes foi

realizada antes do início do 1º subcultivo, pois o tamanho das gemas axilares foi utilizado

como padrão para a divisão. Nos subcultivos subseqüentes, as gemas maiores que 0,3 cm

foram separadas dos brotos e também, foram divididos os brotos quando era possível a

obtenção de propágulos maiores que 0,4 cm (Desenho 1).

Desenho 1 - A- Segmento nodal com duas gemas axilares (GAx) na base dos pecíolos (PE),

quando secionado produziu dois explantes;

B- Um explante subcultivado produziu um broto (BR) com gema apical (GAp) e

uma gema axilar (> 0,3 cm), essa foi separada para posterior subcultivo.

3.6 EXPERIMENTO DE ALONGAMENTO E ENRAIZAMENTO DE BROTOS

(MICROESTACAS) OBTIDOS NA FASE DE MULTIPLICAÇÃO

Os brotos obtidos em meio de cultura MS e em tratamentos com BAP (2,5, 5,0 e

M), depois de quatro subcultivos foram transferidos para o meio WPM adicionado de

BAP 2,5

M, para o alongamento destes. Depois de 30 dias, os brotos com comprimento

maior ou igual a 1,0 cm, foram seccionados em bisel na base para confecção de

microestacas, as quais foram colocadas em meio de cultura WPM em três tratamentos sem

e com 2,5

M e 5,0

M de IBA, para testar o enraizamento. O delineamento experimental foi

inteiramente ao acaso, sendo composto por 11 repetições de cada unidade experimental

com quatro microestacas por frasco. Aos 30 e 60 dias, foram observadas as seguintes

variáveis: percentagem de microestacas enraizadas, número médio de raízes e o

comprimento médio das raízes.

GAp

GAx

3.7 EXPERIMENTO DE ENRAIZAMENTO DE MICROESTACAS OBTIDAS DE REBROTAS

DE PLÂNTULAS GERMINADAS E CRESCIDAS

IN VITRO

As microestacas foram obtidas a partir de rebrotas (com

9 meses de idade) que

sobraram de plântulas das quais foram retirados os explantes para os experimentos de

multiplicação. As microestacas foram confeccionadas com aproximadamente 2 cm de

comprimento, duas folhas na porção apical e a base cortada em bisel duplo. Foram

inoculadas em meio de cultura MS/2 (MS com a concentração de sais reduzida pela

metade).

No experimento 1 foram aplicados 4 tratamentos: 0; 2,5; 5,0 e 10

M de IBA,

adicionado aos meios de cultura.

No experimento 2, os tratamentos utilizados foram os mesmos do experimento 1,

porém as microestacas permaneceram apenas 7 dias nos meios de cultura citados e na

ausência de luz. Depois desse período, as microestacas foram retiradas dos respectivos

tratamentos e transferidas a meio de cultura MS/2 sem a adição de IBA.

O delineamento experimental utilizado nos experimentos foi inteiramente

casualizado, com 4 repetições, contendo 10 microestacas por repetição.

A avaliação dos experimentos foi realizada com 30 e 60 dias após a instalação e as

variáveis observadas foram: percentagem de microestacas enraizadas, número médio de

raízes e comprimento médio das raízes.

4 RESULTADOS

4.1 DEISCÊNCIA DE FRUTOS

Os resultados obtidos após 7 dias de armazenamento mostraram que esse período

de armazenamento foi insuficiente para a deiscência dos frutos, pois apenas 3% deles

abriram totalmente quando submetidos ao 1º tratamento com saco plástico sem serragem e,

no tratamento com serragem, nenhum fruto sofreu deiscência.

Após 11 dias de armazenamento, foi verificado que existiam frutos fungados, abertos

totalmente (com cinco fissuras) e parcialmente (com menos de 5 fissuras) (Figura 1) (Tabela

2 e anexo 1).

De acordo com a percentagem de frutos abertos totalmente e parcialmente, o melhor

tratamento para deiscência dos frutos foi o de armazenamento em saco plástico sem

serragem, por 11 dias.

A análise estatística utilizando o teste-t para a comparação dos dois tratamentos

revelou diferença estatística para as seguintes variáveis: frutos totalmente abertos, frutos

parcialmente abertos e frutos fechados. Para essas variáveis o melhor tratamento para

deiscência foi com saco plástico sem serragem (Tabela 2). O resultado apresentado nos

sugere que para deiscência de frutos de canjarana devem ser utilizados sacos plásticos

fechados. Entretanto, INOUE (1978) que também estudou a deiscência dos frutos de

Cabralea

sp., obteve a maior porcentagem de frutos abertos em sacos plásticos com

serragem e justificou o resultado pela absorção de parte da umidade, essencial para

deiscência, de dentro do saco plástico pela serragem. No presente trabalho, provavelmente

a umidade presente nos frutos era suficiente para sua deiscência, logo a serragem pode ter

absorvido parte da umidade necessária para deiscência dos frutos. A alta percentagem de

frutos fungados nos dois tratamentos pode ser devida à falta de assepsia antes da utilização

dos frutos no experimento e também às condições favoráveis para o desenvolvimento das

hifas de fungos pré-existentes na superfície dos frutos.

TABELA 2 -

RESULTADOS DE DEISCÊNCIA DE FRUTOS DE CANJARANA, ARMAZENADOS EM

SACO PLÁSTICO SEM E COM SERRAGEM, APÓS 11 DIAS

Variáveis

Tratamento sem

serragem

Média

desvio padrão

Tratamento com

serragem

Média

desvio padrão

Teste-t

Frutos abertos

totalmente (%)

Frutos

abertos

parcialmente

(%)

Frutos fechados

(%)

Frutos

fungados(%)

10,40

2,31

57,37

2,08

32,23

3,05

77,66

6,02

1,50

3,00

12,75

7,08

82,50

23,04

68,25

21,82

t= 3,70; G.L= 5; P> 0,03

t= 9,95; G.L= 5; P> 0,0002

t= - 4,79; G.L= 5;P> 0,0049

t= 0,71;G.L= 5;P< 0,508

4.2 DESINFESTAÇÃO E GERMINAÇÃO DAS SEMENTES

O tratamento com 2,5% de hipoclorito de sódio, durante 30 minutos, apresentou o

melhor resultado de desinfestação (75%) e de germinação (65% após 7 dias e 90% após 14

dias) (Tabela 3 e Anexos 2 e 3 e Figuras 2 e 3).

Houve diferença estatisticamente significativa na desinfestação das sementes

apenas entre as concentrações de hipoclorito de sódio 1% (v/v) e 2,5% no tempo de 30

minutos, nas quais encontraram-se a maior e a menor percentagem de contaminação. Em

outro trabalho com

Cedrela fissilis

, as sementes também foram desinfestadas com

hipoclorito de sódio na mesma concentração, porém por 75 minutos (NUNES et al., 2002).

No experimento com a canjarana, um menor tempo de exposição ao agente desinfestante

foi efetivo provavelmente, devido às sementes na sua maioria terem sido obtidas ainda

dentro dos frutos, dos quais grande parte sofreu deiscência no próprio laboratório. CHENG

et al. (1992) também desinfestaram sementes de

Eucalyptus sideroxylon

com solução de

hipoclorito de sódio a 2,5% por 20 minutos.

No mesmo experimento a análise estatística mostrou existirem diferenças

estatisticamente significativas entre os tratamentos com hipoclorito de sódio, para a

germinação de sementes aos 14 dias, sendo que os melhores resultados foram observados

na concentração de 2,5% (v/v) nos dois tempos testados (Tabela 3).

TABELA 3 -

EFEITO DOS TRATAMENTOS DE DESINFESTAÇÃO NA PERCENTAGEM DE

CONTAMINAÇÃO E DESINFESTAÇAO DE SEMENTES DE CANJARANA APÓS 7

DIAS, E NA GERMINAÇÃO

IN VITRO

APÓS 7 E 14 DIAS

Concentração

de hipoclorito de

sódio (%)

Tempo de

exposição (min)

Contaminação por

fungos e/ou

bactérias após 7

dias (%)

Sementes

germinadas após

7 dias (%)

Sementes

germinadas após 14

dias (%)

1,0

2,5

5,0

20’

30’

20’

30’

20’

30’

38 ab

68 a

50 ab

25 b

46 ab

55 ab

33 ab

23 ab

38 ab

65 a

15 b

37 ab

34 b

32 b

70 a

90 a

20 b

40 b

Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

O hipoclorito de sódio é um potente oxidante. Sua ação pode ser resultante de

modificações nas propriedades das membranas celulares do tegumento ou no fornecimento

de oxigênio adicional para a semente, aumentando desta forma a percentagem de

germinação (HSIAO; QUICK, 1984). Sendo assim, o hipoclorito de sódio pode ter

influenciado a percentagem de germinação da canjarana. Porém, a maior percentagem de

germinação foi obtida em uma concentração intermediária de hiploclorito de sódio (2,5%

(v/v)), esse resultado pode ser devido às altas percentagens de contaminação das sementes

desinfestadas em solução de hipoclorito de sódio a 1,0% e 5,0% (v/v). Além disso, a maior

concentração de hipoclorito de sódio pode ter causado a ‘’queima’’ de tecidos, já que foi

observada a perda de parte da coloração de algumas sementes e a necrose de algumas

radículas.

4.3 DESINFESTAÇÃO DE GEMAS AXILARES PROVENIENTES DE ÁRVORES ADULTAS

Os resultados de experimentos de desinfestação das gemas axilares nas

concentrações propostas de hipoclorito de sódio podem ser observados na Tabela 4. As

concentrações de hipoclorito de sódio aqui testadas foram escolhidas por terem sido já

testadas em outros trabalhos com outras espécies como

Psidium guajava, Cinnamomum

camphora

Azadirachta excelsa

. Enretanto, a desinfestação total ou em uma porcentagem

suficiente para realização de experimentos não foi obtida.

TABELA 4 - RESULTADOS DOS TRATAMENTOS DE DESINFESTAÇÃO DE GEMAS AXILARES

DE ÁRVORES ADULTAS DE CANJARANA, APÓS 14 DIAS DE CULTIVO

Experimentos

Concentrações

do hipoclorito

de sódio (%)

Tempo de

exposição ao

desinfestante

Contaminações

com

fungos (%)

Contaminações

com bactérias

(%)

Contaminações

com fungos e

bactérias (%)

0,03; 0,06;

0,12; 0,24; 0,5

4’

100

6; 8,4; 9,6; 10,8

8’

100

6 e 8,4

20’

(pH ajustado

em 6,0)

0,5

1,0;

2,0

15’

(pH ajustado

em 6,0)

0,5

1,0;

2,0

20’

As gemas axilares aparentemente desinfestadas foram colocadas em placas de petri,

em meio de cultura MS estéril. Porém, após 7 dias, a maioria delas estava contaminada.

Entretanto, alguns explantes sobreviveram após a desinfestação com as maiores

concentrações de hipoclorito de sódio, 6 e 8,4% (v/v), as quais levaram esses a oxidação.

Resultados similares de oxidação foram observados por AMIN e JAISWAL (1988) nos

explantes retirados de plantas adultas de goaibeira (

Psidium guajava

). Optou-se por não

continuar os experimentos com gemas axilares de árvores adultas, pois além da dificuldade

de obter explantes desinfestados em número suficiente para a realização de experimentos

de multiplicação, foi observada a oxidação dos explantes desinfestados.

Resultados similares de contaminação foram observados por SCUTTI (1999) em

segmentos nodais retirados de plantas adultas de guabirobeira (

Campomanesia

nthocarpa

Berg.), mantidas em condições de campo, que apresentaram 100% de

contaminação depois de tratamentos com hipoclorito de sódio (10% e 20% por 5 e 10

minutos).

CHATURVEDI et al. (2004) também relataram a dificuldade de desinfestação de

segmentos nodais retirados de plantas adultas de

Azadiracha indica

, uma Meliaceae como a

canjarana. Os autores citados obtiveram uma percentagem de contaminação dos explantes

de 20 a 100 %.

Apesar da regeneração de tecidos em explantes retirados de espécies lenhosas

adultas ser baixa (JAMES, et al., 1984) e haver uma maior dificuldade de desinfestação do

material adulto, a micropropagação utilizando esse tipo de material é freqüentemente

escolhida, pois podem ser selecionadas plantas que demonstram características de

interesse (BONGA; ADERKAS, 1992). Entretanto, protocolos de micropropagação a partir

de material juvenil apresentam algumas vantagens do ponto de vista experimental, pois

pode ser obtido um grande número de explantes sem contaminação e esses explantes tem

elevada capacidade de crescimento e também uma rápida resposta à aplicação de

fitorreguladores. Logo, esse tipo de explante pode orientar e auxiliar a elaboração de

protocolos para explantes retirados de plantas adultas (GRATTAPAGLIA; MACHADO,

1998).

4.4 MULTIPLICAÇÃO DE GEMAS AXILARES

4.4.1 Culturas em Meio de Cultura MS

4.4.1.1 Efeito da benzilaminopurina na multiplicação de gemas axilares em segmentos

nodais e apicais

4.4.1.1.1 Taxa de multiplicação

Os resultados da análise de variância (Anexo 4) indicaram que a interação entre os

fatores (tipo de segmento e concentrações de BAP) foi significativa, revelando que os

fatores não são independentes, para todos os subcultivos com exceção do último (para esse

houve diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações e entre os tipos de

segmento). Logo, quando a interação é significativa, o melhor resultado para as

concentrações de BAP depende do tipo de segmento utilizado.

O teste de Tukey (Tabela 5) revelou que, para o segmento nodal (Figura 4), no

cultivo inicial, as taxas de multiplicação obtidas com 2,5 e 5,0

M de BAP não diferiram

entre si e foram superiores às demais concentrações testadas (Figura 5). No 1º e 3º

subcultivos, a taxa de multiplicação obtida com 2,5

M de BAP, foi superior e diferiu das

demais doses testadas, porém no 2º subcultivo a concentração de 5,0

M de BAP, foi

superior e diferiu das demais (Figuras 6, 7 e 8).

Para o segmento apical, no cultivo inicial, a taxa de multiplicação obtida com 2,5

de BAP foi superior e diferiu das outras. Para o 1º e 2º subcultivos, as médias de taxa de

multiplicação na concentração de 5,0

M de BAP foram superiores e diferiram das demais.

Já, no 3º subcultivo as médias das taxas de multiplicação não diferiram entre si.

A taxa de multiplicação da canjarana foi baixa em ambos os tipos de segmentos nas

concentrações de BAP testadas. No entanto, as concentrações de BAP que forneceram os

melhores resultados para os dois tipos de segmentos foram 2,5 e 5,0

M em todos os

subcultivos, e as maiores taxas de multiplicação foram observadas no segmento nodal

(Tabela 5).

TABELA 5 – TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS, EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

BAP

(

SN*

SA*

1,00 c A

1,00 b A

1,00 c A

1,00 d A

1,00 c A

1,00 b A

1,00 a A

2,5

1,57 a A

1,29 a B

1,72 a A

1,15 c B

1,41 b A

1,02 b B

1,24 a A

1,04 a B

5,0

1,46 a A

1,13 b B

1,31 b A

1,37 a A

1,77 a A

1,16 a B

1,05 b A

1,06 a A

1,20 b A

1,02 b B

1,02 c B

1,25 b A

1,10 c A

1,00 b B

1,03 b A

1,00 a A

1,00 c A

1,00 b A

1,00 c A

1,00 d A

1,00 c A

1,00 b A

1,00 a A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na vertical, e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 6) revelou que no 4º

subcultivo, apesar de não haver interação significativa entre os fatores, a taxa de

multiplicação da concentração de 2,5

M diferiu e foi superior a média das concentrações de

0 e 20

M de BAP independente do tipo de segmento e o melhor tipo de segmento

independente da concentração de BAP foi o nodal, o qual diferiu estatisticamente do

segmento apical (média de todas as concentrações de BAP para o segmento apical 1,01) e

foi obtida a maior taxa de multiplicação (média de todas as concentrações de BAP para o

segmento nodal 1,06).

TABELA 6 – TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE CANJARANA NO

4° SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE

BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Concentrações de BAP (

Segmento Nodal

Segmento Apical

Médias

1,00

1,00 b

2,5

1,14

1,03

1,09 a

5,0

1,08

1,02

1,05 ab

1,09

1,02

1,05 ab

1,00

1,00 b

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

No presente trabalho foram realizados quatro subcultivos a cada 30 dias. De acordo

com VENGADESAN et al. (2002), subcultivos freqüentes em intervalos de 25 a 30 dias têm

uma importante influência no aumento da multiplicação de gemas e no desenvolvimento de

brotos, pois repetidos subcultivos causam a ativação e o condicionamento dos meristemas.

Entretanto, nesse trabalho no geral a taxa de multiplicação variou pouco entre os

subcultivos, às vezes aumentando e depois diminuindo no subcultivo seguinte (Tabela 5).

Esse resultado é provavelmente devido ao crescimento dos brotos para posterior

desenvolvimento de novas gemas axilares.

Em algumas espécies, o número de subcultivos para a máxima multiplicação de

brotos já é conhecido, como é o caso de

Dieffenbachia exotica

cultivar Marianna

na qual 3

sucessivas subculturas produzem o maior número de brotos (14,5 por explante). Depois

desse período o número de brotos novos diminui (VOYATZI; VOYATZIS, 1989). De acordo

com os resultados obtidos no presente trabalho, em meio de cultura MS, as maiores taxas

de multiplicação de gemas, assim como, os maiores números de brotos, dentro dos

subcultivos realizados, foram observados até o terceiro subcultivo (Tabelas 5 e 9). Este

resultado se assemelha ao obtido no caso de

Dieffenbachia exotica

, para a qual as taxas de

multiplicação também diminuiram depois do terceiro subcultivo. Ao contrário, em

Vaccinium

macrocarpon

, repetidos subcultivos aumentaram o número de brotos, entretanto, os autores

não indicaram em qual subcultivo houve o número máximo de brotos (DEBNATH; McRAE,

2001).

4.4.1.1.2 Efeito da BAP na percentagem de explantes com brotos

Os resultados da análise de variância (Anexo 5) indicaram que a interação entre os

fatores (tipo de segmento e concentrações de BAP) foi significativa para os subcultivos,

revelando que não são independentes, com exceção da cultura inicial. Portanto, podemos

concluir que o melhor resultado para as concentrações de BAP depende do tipo de

segmento, como no caso da taxa de multiplicação. O teste de Tukey para comparação de

médias revelou que o segmento nodal diferiu estatisticamente do apical e proporcionou as

maiores percentagens de explantes com brotos, chegando a quase 50% no 3º subcultivo na

concentração de 2,5

M de BAP, a qual foi superior e diferiu estatisticamente das demais

concentrações (Tabela 7).

O mesmo teste foi realizado para o segmento apical e revelou que a maior

percentagem de explantes com brotos para esse tipo de segmento foi de 14,60%, no 1º

subcultivo, na concentração de 10

M de BAP, a qual diferiu estatisticamente das demais,

com exceção da concentração de 2,5

M de BAP.

TABELA 7 – PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS NO CULTIVO

INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

BAP

(

2,10 c A

0,00 b A

2,10 c A

4,20 a A

0,00 c A

4,10 a A

0,00 b A

0,00 a A

2,5

26,70 a A

2,10 ab B

36,66 a A

8,30 a B

49,50 a A

8,30 a B

21,70 a A

7,10 a B

5,0

20,04 ab A

0,00 b B

22,50 ab A

7,50 a B

26,66 b A

3,10 a B

21,11 a A

0,00 a B

11,50 bc A

14,60 a A

20,80 b A

0,00 a B

20,40 b A

13,80a B

9,51 ab A

9,41 a A

0,00 c A

0,00 b A

0,00 c A

0,00 a A

0,00 c A

0,00 a A

0,00 b A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

No cultivo inicial, o teste de Tukey para comparação de médias indicou que a maior

percentagem de explantes com brotos (26,61%) foi obtida na concentração de 2,5

M de

BAP, independente do tipo de segmento utilizado (Tabela 8).

TABELA 8 – PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS NO CULTIVO

INICIAL EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

Concentrações de BAP (

Segmento Nodal

Segmento Apical

Médias

0,00

0,00 c

2,5

33,33

19,89

26,61 a

5,0

16,66

4,16

10,41 b

0,60

0,60 bc

0,00

0,00 c

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

De acordo com as variáveis taxas de multiplicação e percentagem de explantes com

brotos, no geral os melhores resultados foram obtidos para os mesmos tratamentos, ou seja,

as gemas axilares produzidas nesses tratamentos alongaram-se em brotos.

4.4.1.1.3 Efeito da BAP no número médio de brotos por explante

Os resultados da análise de variância, apresentados no Anexo 6, indicaram que a

interação entre os fatores foi significativa, revelando que os fatores tipo de segmento e

concentrações de BAP não são independentes, para os cincos subcultivos. Logo, podemos

concluir que o melhor resultado para as concentrações de BAP depende do tipo de

segmento. O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 9) revelou que, para o

segmento nodal, no cultivo inicial, nos 2º e 3º subcultivos, a média do número de brotos

formados na presença de 2,5

M de BAP diferiu estatisticamente e foi superior à média

obtida com as demais concentrações testadas. Para 1º subcultivo, o resultado obtido com

esta concentração de BAP diferiu dos demais e foi superior. Porém, na presença de 5,0

de BAP, o resultado não foi diferente estatisticamente daquele obtido com 2,5

M. Para o

último subcultivo as concentrações de 2,5, 5,0 e 10

M de BAP não diferiram

estatisticamente entre si.

O mesmo teste foi realizado para o segmento apical e revelou que no cultivo inicial a

concentração de 2,5

M de BAP foi superior e diferiu estatisticamente das outras

concentrações. Nos outros subcultivos, as médias do número de brotos não diferiram

estatisticamente entre si.

Quando comparadas as concentrações, foi observado o maior número de brotos nas

concentrações de 2,5

M, 5,0

M e 10

M de BAP, para ambos os tipos de segmentos.

Esses valores diferiram entre os tipos de segmentos e foram superiores para o segmento

nodal (Tabela 9).

TABELA 9 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA NO CULTIVO

INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS

cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

BAP

(

SN*

SA*

0,00 c A

0,00 b A

0,02 c A

0,00a A

0,02d A

0,02a A

0,00c A

0,02a A

0,00b A

0,00a A

2,5

0,37 a A

0,20 a B

0,25 a A

0,02a B

0,56a A

0,08a B

0,71a A

0,11a B

0,40a A

0,09a B

5,0

0,23 b A

0,02 b B

0,20 ab A

0,00a B

0,42b A

0,06a B

0,31b A

0,03a B

0,30a A

0,00a B

0,02 c A

0,02 b A

0,12 b A

0,02a B

0,24c A

0,00a B

0,32b A

0,02a B

0,25a A

0,11a B

0,00 c A

0,00 b A

0,00 c A

0,00a A

0,00d A

0,00a A

0,00c A

0,00a A

0,00b A

0,00a A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

Os resultados obtidos para o número médio de brotos por explante e a taxa de

multiplicação demonstraram que apesar de ter ocorrido pouca resposta, o melhor tipo de

explante foi o segmento nodal, nas concentrações de 2,5 e 5,0

M de BAP. Resultados

similares foram observados por HUANG et al. (1998), quando utilizaram segmentos nodais e

apicais de plantas de

Cinnamomum camphora

com dois anos de idade. O maior número de

brotos foi obtido com segmentos nodais (9 brotos/segmento) inoculados em meio de cultura

com 4,4

M de BAP. No caso da guabirobeira, SCUTTI (1999), testando várias

concentrações de BAP, obteve o maior número de brotos (3,13 por microestaca) de

microestacas retiradas de plântulas crescidas

in vitro

com 2,2

M de BAP, concentração

semelhante àquela utilizada para a canjarana. Os valores obtidos nos dois trabalhos citados

são mais altos quando comparados aos nossos. Isso possivelmente pode ser devido à uma

menor produção de brotos pela canjarana e ou à forma de avaliação diferente em nosso

trabalho, já que consideremos como brotos somente as gemas maiores que 0,5 cm e

nesses trabalhos não houve essa distinção.

Com relação às concentrações testadas, a concentração mais alta de BAP (20

M),

apresentou um efeito inibitório na indução dos brotos, como também foi observado por LIEW

e TEO (1998). Esses pesquisadores trabalharam com

Azadirachta excelsa

e verificaram que

altas concentrações de BAP (44

M) não induziam a formação de brotos. Para essa espécie

o maior número de brotos foi obtido na concentração de 17,6

M de BAP, porém os brotos

formados eram vitrificados. Por essa razão, os autores sugeriram que as concentrações

mais baixas de BAP são as melhores para a iniciação de brotos. Embora, nos experimentos

do presente trabalho, o número de brotos produzidos por explante seja pequeno, também foi

verificado que as menores concentrações testadas induziram os maiores valores para essa

variável.

Os brotos de canjarana não apresentaram vitrificação, ao contrário do que foi

observado por NUNES et al. (1999) no porta-enxerto de macieira Marubakaido (

Malus

prunifolia

) e por LIEW e TEO (1998) em

Azadirachta excelsa

. Segundo esses autores,

menores concentrações de BAP produziram um maior número de brotos não-vitrificados,

evidenciando que as maiores concentrações de BAP podem ser um dos fatores envolvidos

no descontrole do potencial hídrico nas células. Além disso, no caso de Marubakaido, foi

mostrado que as altas concentrações de BAP podem diminuir as taxas de divisão celular,

como ocorre nas células dos centros quiescentes dos ápices radiculares, e provocar um

menor desempenho de todas as variáveis estudadas (número de brotos e número de

entrenós) (NUNES et al., 1999).

Para complementar os dados obtidos para a variável citada, foi calculado o número

médio de brotos em explantes com brotos. De acordo com esses resultados foi observado

que os maiores números médios de brotos por explantes com brotos foram identificados no

tratamento com 2,5

M de BAP com um valor máximo de 1,59 em explantes originados de

segmentos nodais (Tabela 10). Esse resultado confirmou o observado na Tabela 9.

TABELA 10 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE COM BROTOS DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS

cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

BAP

(

SN*

SA*

0,00

0,13

0,00

0,13

0,00

0,13

0,00

2,5

1,19

0,81

1,32

0,13

1,59

0,31

1,46

0,50

1,56

0,38

5,0

0,48

0,25

0,67

0,00

0,94

0,25

0,75

0,13

0,88

0,00

0,13

0,38

0,87

0,00

0,75

0,13

0,63

0,25

0,00

4.4.1.1.4 Efeito da BAP no comprimento médio dos brotos

As médias dos comprimentos dos brotos para ambos os tipos de segmentos são

apresentadas na Tabela 11.

Os resultados demonstraram que no segmento nodal foram observados os maiores

comprimentos de brotos em comparação ao segmento apical. Para ambos os tipos de

segmentos, a concentração mais elevada de BAP não induziu a formação de brotos (Tabela

11).

TABELA 11 - MÉDIAS DO COMPRIMENTO DOS BROTOS FORMADOS EM EXPLANTES DE

CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS EM MEIO DE

CULTURA MS ADICIONADO DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE

ORIGEM

COMPRIMENTO DOS BROTOS (cm)

cultivo inicial

subcultivo

BAP

(

0,00

0,50

0,00

0,50

0,00

0,50

0,00

2,5

0,53

0,58

0,73

0,68

0,70

0,52

0,60

0,58

0,61

0,56

5,0

0,55

0,50

0,53

0,00

0,57

0,50

0,51

0,00

0,58

0,00

0,50

0,00

0,52

0,00

0,52

0,00

0,55

0,50

0,53

0,50

0,00

4.4.1.1.5 Efeito da BAP na percentagem de explantes mortos

Os resultados da análise de variância (Anexo 7) indicaram que a interação entre os

fatores (tipo de segmento e concentrações de BAP) foi significativa, revelando que os

fatores não são independentes, para todos os cultivos com exceção do 2º subcultivo.

Portanto, o melhor resultado para as concentrações de BAP depende do tipo de segmento.

O teste de Tukey para comparação de médias revelou que para o segmento nodal,

no cultivo inicial, a maior percentagem de explantes mortos foi observada na concentração

de 20

M de BAP, diferindo estatisticamente e sendo superior das outras concentrações

testadas. Já no 1º subcultivo as percentagens obtidas com 10 e 20

M de BAP diferiram das

demais e foram superiores, com exceção da concentração de 20

M de BAP, pois nessa

concentração a média estatisticamente igual à da concentração 5,0

M de BAP (Tabela 12).

No 2º subcultivo, a interação não foi significativa e, apesar das concentrações não

diferirem estatisticamente entre si (Tabela 13), a percentagem independente da

concentração, no caso dos segmentos nodais (5%), a qual diferiu de explantes mortos foi

superior, estatisticamente do segmento apical (0%). No 3º subcultivo as concentrações

também não diferiram entre si (Tabela 12). Já, no 4º subcultivo as concentrações de 5,0 e

M de BAP induziram os maiores valores de necrose e diferiram estatisticamente das

demais.

O mesmo teste foi realizado para o segmento apical e revelou que no cultivo inicial a

percentagem de explantes mortos na concentração de 20

M de BAP (54%) foi superior e

diferiu das demais, assim como no segmento nodal. Para o 1º subcultivo, a percentagem de

explantes mortos na concentração de 10

M de BAP (65%) foi superior e diferiu das demais.

Já, nos dois últimos subcultivos as percentagens foram superiores e diferiram

estatisticamente dentre as concentrações testadas, na concentração de 2,5

M e 5,0

M de

BAP, respectivamente.

TABELA 12 – NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, NO CULTIVO INICIAL E NOS 1°, 3°

E 4° SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES

DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

EXPLANTES MORTOS (%)

Cultivo inicial

1º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

BAP

(

SN*

SA*

2,10 a A

0,00 a A

10,50 a A

0,00 a A

2,5

0,00 a A

4,12 a A

6,37 ab A

12,50 a A

6,37 a A

41,63 b A

2,12 a A

4,25 a A

5,0

0,00 a A

18,87 bc B

2,12 a A

10,63 a A

6,25 a A

16,75 b A

35,38 c B

0,00 a A

2,12 a A

33,25 d A

64,50 c B

6,37 a A

0,00 a A

12,50 b A

16,63 b A

16,75 b A

54,16 b B

29,13 cd A

33,25 b A

0,00 a A

Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na vertical e as médias seguidas pela mesma letra minúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

TABELA 13 - NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, NO 2º SUBCULTIVO EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE

SEGMENTO DE ORIGEM

Concentrações de BAP (

EXPLANTES MORTOS (%)

Segmento Nodal

Segmento Apical

Médias

0,00

0,00 a

2,5

5,0

6,30

2,12

14,62

4,12

2,20

0,00

4,25 a

1,06 a

7,31 a

2,06 a

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

Quando comparados dois tipos de segmentos, a menor percentagem de explantes

mortos foi observada no caso dos segmentos nodais, sendo diferente estatisticamente da

percentagem obtida com os segmentos apicais (Tabela 12).

Os resultados indicaram que as concentrações de 10

M e 20

M de BAP foram

fitotóxicas aos dois tipos de segmentos, nos primeiros subcultivos. Nos demais subcultivos,

a mortalidade não foi superior nas concentrações anteriormente citadas, pois restaram

poucos explantes nessas concentrações. Em conclusão, a menor porcentagem de explantes

mortos foi observada nos meios de cultura adicionados de 2,5

M e 5,0

M de BAP, sendo

essas concentrações as mais indicadas para uma menor perda de explantes. Já, para o

mogno, outra Meliaceae, a concentração de 20

M de BAP foi a mais eficiente em promover

a multiplicação das gemas a partir de segmentos nodais, com uma taxa de multiplicação de

2,95 aos 45 dias, enquanto que a concentração de 50

M proporcionou uma elevada

mortalidade como observado no nosso trabalho com 20 µM (SCHOTTZ, 2003).

Analisando todos os resultados obtidos para as variáveis estudadas, observamos

que o melhor tipo de explante para a multiplicação de gemas axilares foi o segmento nodal,

pois proporcionou as maiores taxas de multiplicação, o maior número médio de brotos

desenvolvidos e uma menor percentagem de explantes mortos (Tabela 14).

Esse resultado pode estar relacionado com a dominância apical, a qual é devida à

auxina produzida pela gema apical e transportada para as gemas axilares, inibindo assim o

crescimento destas. Porém, apesar da citocinina poder modificar o efeito da dominância

apical (TAIZ; ZEIGER, 2004), em nosso trabalho o desenvolvimento da gema axilar, em

segmentos apicais, continuou sendo inibido mesmo quando estes permanecerem em meio

de cultura adicionado de citocinina. Portanto, podemos concluir que o efeito da auxina não

pôde ser modificado pela citocinina presente no meio de cultura.

Já no segmento nodal a dominância apical foi eliminada com a excisão do ápice

caulinar e a presença de citocinina no meio de cultura pode ter promovido o crescimento das

gemas axilares laterais e a multiplicação destas (TAIZ; ZEIGER, 2004).

Em trabalho com

Dieffenbachia exotica

a dominância apical apresentou, também,

um efeito negativo na produção de novos brotos, pois quando foram utilizados como

explantes brotos apicais, esses não foram eficientes para a produção de brotos, pois o

desenvolvimento de gemas axilares foi quase totalmente inibido (VOYIATZI; VOYIOATZIS,

1989). Também, na espécie

Cedrela fissilis,

a multiplicação de brotos só ocorreu devido à

liberação das gemas axilares da dominância apical; isso ocorreu graças à presença de BAP

no meio de cultura (NUNES et al., 2002). Resultados similares foram obtidos em nosso

trabalho; entretanto, a citocinina presente no meio de cultura não foi suficiente para superar

o efeito da dominância apical induzido pela auxina presente nas gemas axilares dos

segmentos apicais.

O balanço interno entre a citocinina e a auxina tem um papel fundamental na indução

do início de diferenciação celular, sendo a citocinina um dos requisitos básicos para a

proliferação celular em tecidos que contém ou são adicionados de um nível suficiente de

auxina. Existem evidências que ambos hormônios participam da regulação do ciclo celular,

mas que as auxinas podem regular eventos para induzir a replicação do DNA, embora as

citocininas regulem eventos para induzir a mitose (FOSKET, 1994).

Variações nas proporções de auxinas e citocininas colocadas em uma cultura de

tecidos podem influenciar fortemente o tipo de diferenciação celular, como foi demonstrado

no experimento clássico de SKOOG e MILLER em 1957. Nesse experimento, quando a

proporção de cinetina era superior a de AIA, foi observada a formação de gemas a partir de

calos, já em concentrações de IAA maiores às de cinetina, a resposta obtida foi a

diferenciação de raízes a partir de calos (BIASI, 2002). Portanto, a diferenciação e a divisão

celular são influenciadas pela ação das auxinas e das citocininas. Sendo assim, a obtenção

de maiores taxas de multiplicação de gemas axilares em segmentos nodais, possivelmente

se deve a um balanço adequado para produção de partes aéreas, enquanto que nos

segmentos apicais esse balanço não apresentou um efeito tão positivo comparado ao

segmento nodal.

4.4.1.1.6 Resumo dos resultados obtidos nas culturas de segmentos nodais em MS

adicionado de BAP

Os resultados apresentados na Tabela 14 mostram que no geral os melhores

resultados para as variáveis analisadas foram obtidos no 1º subcultivo nas concentrações de

2,5 e 5,0

M de BAP. Já no 3º e 4º subcultivos, a taxa de multiplicação decresceu, o número

médio de brotos e o comprimento médio se mantiveram constantes e a percentagem de

explantes mortos foi reduzida no tratamento com 2,5

M de BAP e apresentou um aumento

no tratamento com 5,0

M de BAP.

TABELA 14 - RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA O SEGMENTO NODAL EM TODOS

OS CULTIVOS

Cultivo Inicial

BAP(

Variáveis

2,5

Taxa de multiplicação

1,00

1,57

1,46

1,20

1,00

Explantes formando brotos (%)

0,00

33,33

16,66

0,60

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,37

0,23

0,02

0,00

Nº médio de brotos em

explantes c/brotos

0,00

1,19

0,48

0,13

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,53

0,55

0,50

0,00

Necrose (%)

2,10

0,00

0,0

16,75

1º subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,72

1,31

1,02

1,00

Explantes formando brotos (%)

2,10

26,70

20,04

11,50

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,25

0,20

0,12

0,00

Nº médio de brotos em

explantes c/brotos

0,13

1,32

0,67

0,38

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,50

0,73

0,53

0,52

0,00

Necrose (%)

0,00

6,37

18,87

33,25

29,13

2º subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,41

1,77

1,10

1,00

Explantes formando brotos (%)

2,10

36,66

22,50

20,80

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,56

0,42

0,24

0,00

Nº médio de brotos em

explantes c/brotos

0,13

1,59

0,94

0,87

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,50

0,70

0,57

0,52

0,00

Necrose (%)

0,00

6,30

2,12

14,62

4,12

3º subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,24

1,05

1,03

1,00

Explantes formando brotos (%)

0,00

49,50

26,66

20,40

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,71

0,31

0,32

0,00

Nº médio de brotos em

explantes c/brotos

0,00

1,46

0,75

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,60

0,51

0,55

0,00

Necrose (%)

0,00

6,37

10,63

6,37

0,00

4º subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,14

1,08

1,09

1,00

Explantes formando brotos (%)

0,00

21,70

21,11

9,51

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,40

0,30

0,25

0,00

Nº médio de brotos em

explantes c/brotos

0,00

1,56

0,88

0,63

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,61

0,58

0,53

0,50

Necrose (%)

0,00

2,12

16,75

12,50

0,00

4.4.1.2 Culturas em Meio de Cultura MS Adicionado de 2-Isopenteniladenina

4.4.1.2.1 Efeito da 2-iP na multiplicação de gemas axilares em segmentos nodais e apicais

Os resultados da análise de variância (Anexo 8) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa para o cultivo inicial e para o 1º e 2º subcultivo, revelando que os

fatores tipo de segmento e concentrações de 2-iP não são independentes. Portanto, o

melhor resultado para as concentrações de 2-iP depende do tipo de segmento. Os

resultados da análise de variância para o 3º e 4º subcultivo na presença de 2-iP (Anexo 8),

indicam que a interação entre os fatores não foi significativa e não houve diferenças

estatisticamente significativas entre as concentrações e entre os tipos de segmentos. Por

essa razão o teste de Tukey não foi realizado.

Para o segmento nodal, o teste de Tukey para comparação de médias revelou que,

no cultivo inicial, as médias de taxa de multiplicação obtidas com 2,5, 5,0 e 10

M de 2-iP

não diferiram estatisticamente e foram superiores às médias obtidas com as demais

concentrações testadas. No 1º subcultivo, as taxas obtidas na presença de 2,5 e 5,0

M de

2-iP, diferiram do controle e da taxa obtida com uma concentração de 20

M e foram

superiores, porém não diferiram do tratamento com 10

M. Para o 2º subcultivo (Figura 12),

as taxas nas concentrações de 2,5 e 5,0

M de 2-iP, diferiram estatisticamente das outras e

foram superiores. Para o 3º e 4º subcultivos não houve diferenças estatisticamente

significativas entre os tratamentos (Tabela 15).

O mesmo teste foi realizado para o segmento apical e revelou que, no cultivo inicial e

no 1º subcultivo, as médias de taxa de multiplicação foram superiores na concentração de

2,5

M de 2-iP e diferiram das outras. Nos subcultivos seguintes, elas não diferiram

estatisticamente entre si. Quando comparados os resultados obtidos com os dois tipos de

segmentos em função da concentração de 2-iP (Tabela 13), se observou que, no cultivo

inicial, a taxa de multiplicação dos segmentos apicais foi superior e diferiu estatisticamente

daquela dos segmentos nodais para a concentração de 2,5

M de 2-iP. Para o 1º subcultivo,

a taxa dos segmentos nodais foi superior e diferiu estatisticamente da taxa dos segmentos

apicais cultivados com 5,0

M e 10

M de 2-iP. No 2º subcultivo, o segmento nodal também

proporcionou um valor superior que diferiu estatisticamente do valor do segmento apical nas

duas concentrações citadas. Em conclusão, somente no cultivo inicial não se observou o

resultado obtido no experimento com BAP, no qual o melhor tipo de segmento foi o nodal.

TABELA 15 – TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

2-iP

(

SN*

SA*

1,00 b A

1,00 d A

1,00 b A

1,00 c A

1,00 a A

1,02

1,00

1,03

1,00

2,5

1,19 a B

1,46 a A

1,16 a A

1,17 a A

1,22 b A

1,02 a B

1,02

1,00

5,0

1,28 a A

1,29 b A

1,18 a A

1,05 b B

1,41 a A

1,00 a B

1,00

1,20 a A

1,17 bc A

1,10 ab A

1,00 b B

1,00 c A

1,00 a A

1,00

1,00 b B

1,13 cd A

1,00 b A

1,00 c A

1,00 a A

1,00

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; *SA- Segmento Apical

Comparando os resultados obtidos com BAP e 2-iP, verificamos que as melhores

taxas de multiplicação foram obtidas com BAP. Entretanto, esse resultado não é satisfatório,

já que a maior taxa de multiplicação na presença de 2,5 e 5,0

M de BAP (nas quais foram

observados os maiores valores), não alcançou o valor de 2 (Tabela 5). Este resultado é

semelhante ao descrito por TRAUTMANN e VISSER (1990) com

Parthenium argentatum

(espécie arbustiva fonte de látex, pertencente à família Asteraceae). Pois, quando esses

autores compararam as taxas de multiplicação obtidas com as duas citocininas, observaram

como em nosso trabalho que na presença da citocinina BAP (2,22

M) foi obtida a maior

taxa de multiplicação. Na presença dessa citocinina, após 3 semanas de subcultivo, houve

uma produção média de 10,67

5,15 brotos por explante. Bons resultados com altas taxas

de multiplicação, também foram obtidos pelos autores citados quando utilizaram a

concentração de 4,44

M de BAP, porém o aspecto dos brotos era menos saudável (parte

dos brotos eram vitrificados) que na concentração de 2,22

Outros pesquisadores verificaram que, no caso de

Grevillea

, a adição de BAP no

meio de cultura, freqüentemente promove o aumento do número de gemas produzidas em

cada segmento nodal (com dois nós). Porém, altas concentrações dessa citocinina podem

inibir a diferenciação de gemas e, conseqüentemente, a produção de brotos (LEONARDI et

al., 2001). Foi o que ocorreu no presente trabalho, pois nos tratamentos com altas

concentrações, obtivemos valores mínimos para as taxas de multiplicação e nenhuma

formação de brotos.

A aplicação de 2-iP em concentrações semelhantes em canjarana e mogno resultou

em taxas de multiplicação baixas, porém para o último inferiores a 1,00, sendo ainda

observado em ambas as espécies pouco alongamento dos brotos nos tratamentos com a

citocinina citada (Tabela 21) (SCHOTTZ, 2003). Baixas taxas de multiplicação (1,4 e 1,1

brotos por segmento) foram observadas por AUGUSTO (2001) nas concentrações de 5 e 10

M de 2-iP, respectivamente, em segmentos nodais de amoreira-preta, cv Brazos,

cultivados em meio de cultura MS. Essa resposta pode ser devida ao fato que a enzima

citocinina oxidase dos tecidos degrada a 2-iP por meio do rompimento da ligação da cadeia

lateral da molécula. Em conseqüência, baixos índices de multiplicação são obtidos

(GEORGE, 1993).

4.4.1.2.2 Efeito do 2-iP na percentagem de explantes com brotos

Os resultados da análise de variância (Anexo 9) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa apenas para o 2º subcultivo, revelando que os fatores tipo de

segmento e concentrações de 2-iP não são independentes, para esse subcultivo. Mesmo

não havendo interação entre os fatores para o cultivo inicial e o 1º subcultivo, foram

observadas diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações de 2-iP e os

tipos de segmento. Já para o 3º subcultivo não houve diferenças significativas

estatisticamente.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 16) revelou que no cultivo

inicial a maior percentagem de explantes com brotos foi observada na presença de 2,5

de 2-iP, a qual diferiu das demais concentrações testadas. E o melhor tipo de segmento

para essa variável nesse cultivo foi o segmento nodal (7%), o qual diferiu do apical (2%). No

1º subcultivo a maior percentagem, também, foi observada na concentração de 2,5

M de 2-

iP, independente do tipo de segmento. Porém essa diferiu estatisticamente apenas do

controle e foi menor que no cultivo inicial. No 2º subcultivo (Tabela 17) foi observada a maior

percentagem de explantes com brotos (40%), no caso do segmento nodal na mesma

concentração já citada, a qual diferiu estatisticamente da percentagem obtida com o

segmento apical e das demais concentrações.

No caso do segmento apical, houve diferença estatisticamente significativa apenas

no 2º subcultivo, no qual a percentagem de explantes com brotos foi superior na presença

de 2,5

M de 2-iP e diferiu estatisticamente das demais. (Tabela 17).

Quando comparados os dois tipos de segmentos, as maiores percentagens de

explantes com brotos foram observadas no segmento nodal, geralmente nas concentrações

de 2,5

M, 5,0

M e 10

M de 2-iP. Esses valores diferiram estatisticamente e foram

superiores aos obtidos com segmento apical.

TABELA 16 - PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS NO CULTIVO

INICIAL E NOS 1º, 3º E 4º SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

Cultivo inicial

1º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

2-iP

(

SN*

SA*

Médias

2,00

0,00

1,00 b

2,00

0,00

1,00 b

0,00

4,00

0,00

2,5

27,00

10,00

18,50 a

21,00

8,00

14,50 a

2,00

8,00

0,00

5,0

2,00

0,00

1,00 b

17,33

2,33

9,83 ab

2,00

0,00

0,00 b

8,90

0,00

4,45 ab

0,00

4,00

2,00

3,00 b

23,84

0,00

11,92 ab

0,00

Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

SN-Segmento Nodal; SA-Segmento Apical

TABELA 17 - PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS NO 2º

SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE

2-iP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

Concentrações de 2-iP (

2,10 b A

4,10 b A

2,5

40,50 a A

20,81 a B

5,0

10,61 b A

0,00 b B

12,53 b A

0,00 b B

0,00 b A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

* SN-Segmento Nodal; SA-Segmento Apical

4.4.1.2.3 Efeito da 2-iP no número médio de brotos por explante

Os resultados da análise de variância (Anexo 10) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa, revelando que os fatores tipo de segmento e concentração de 2-iP

não são independentes, para cultivo inicial e para os 1º e 2º subcultivos. Para o 3º subcultivo

houve diferenças estatisticamente significativas somente para as concentrações de 2-iP.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 18) revelou que para o

segmento nodal, no cultivo inicial, a média do número de brotos obtida na presença de 2,5

M de 2-iP diferiu das demais médias e foi estatisticamente superior. No 1º subcultivo na

presença de 5,0

M de 2-iP, a média de 0,57, diferiu estatisticamente das demais médias e

foi superior. Porém, no 2º subcultivo, as médias obtidas com 2,5 e 10

M de 2-iP diferiram

estatisticamente das outras e foram superiores. No 3º subcultivo nas concentrações de 2,5 e

5,0

M de 2-iP, as médias diferiram estatisticamente das outras e foram superiores às

demais (Tabela 19). No 4º subcultivo não houve desenvolvimento de brotos.

O mesmo teste foi realizado para o segmento apical e revelou que no cultivo inicial e

nos três subcultivos, as médias do número de brotos não diferiram estatisticamente entre si

(Tabela 18), os valores sendo nulos ou muito baixos.

Quando comparados os dois tipos de segmentos, para o cultivo inicial, no segmento

nodal na concentração de 2,5

M de 2-iP, foi observado o maior número médio de brotos

desenvolvidos, o qual diferiu estatisticamente e foi superior ao apical. Entretanto, para 1

2º subcultivo o mesmo tipo de segmento diferiu estatisticamente e foi superior ao outro, nas

concentrações de 2,5

M, 5,0

M e 10

M de 2-iP.

TABELA 18 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E

EM 2 SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS

cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

2-iP

(

SN*

SA*

0,04 b A

0,00 a A

0,04 c A

0,00 a A

0,02 c A

0,02 a A

2,5

0,30 a A

0,00 a B

0,32 b A

0,08 a B

0,54 a A

0,08 a B

5,0

0,08 b A

0,02 a A

0,57 a A

0,08 a B

0,30 b A

0,00 a B

0,00 b A

0,00 a A

0,12 c A

0,00 a B

0,54 a A

0,00 a B

0,04 b A

0,02 a A

0,08 c A

0,00 a A

0,00 c A

0,00 a A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na

horizontal, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

* SN-Segmento Nodal; SA-Segmento Apical

TABELA 19 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO 3º SUBCULTIVO, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS

Concentrações de 2-iP (

Segmento Nodal

Segmento Apical

Médias

2,5

5,0

0,00

0,12

0,08

0,00

0,08

0,00

0,00 b

0,10 a

0,04 ab

0,00 b

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade.

Analisando as taxas de multiplicação e os números médios de brotos, observou-se

que em alguns casos houve a multiplicação de gemas, sem que houvesse crescimento

destas e formação de brotos, principalmente no cultivo inicial. Por essa razão o número

médio de brotos pode ser igual a zero. Podemos também verificar casos onde as taxas de

multiplicação foram iguais a 1,0 (nas quais não houve aumento do número de gemas

axilares), mas o número de brotos foi superior a zero, já que foi observado o crescimento

das gemas axilares pré-existentes (gema > 0,5 cm é considerada broto).

Os resultados obtidos quando o 2-iP foi adicionado aos meios de cultura

demonstraram que, na maioria dos subcultivos, as taxas de multiplicação de gemas e o

número de brotos foram maiores nos segmentos nodais. Esse resultado também foi

observado por DEBNATH e MCRAE (2001), os quais constataram que a maior produção de

brotos foi obtida em segmentos nodais de

Vaccinium macrocarpon

cultivados em meio de

cultura adicionado de 12,3

M e 24,6

M de 2-iP, quando esses foram comparados aos

segmentos apicais. No mesmo trabalho, foi demonstrado que concentrações maiores

provocaram uma alta mortalidade, impedindo o crescimento dos brotos e a proliferação de

gemas, resultando em brotos com menor vigor.

Utilizando os dois tipos de segmentos de

Carthamus tinctorius

, ORLIKOWSKA e

DYER (1993) observaram que nenhuma destas duas citocininas (BAP e 2-iP) estimulou a

proliferação de brotos nos segmentos apicais. Contudo, o segmento nodal produziu os

melhores resultados em experimentos com ambas as citocininas isoladas, sendo obtidos de

8 a 12 brotos por explante na presença de 2,22 e 4,44

M de BAP e de 7 a 15 brotos por

explante na presença de 9,84

M de 2-iP.

Para o presente experimento também foi calculado o número médio de brotos em

explantes com brotos. Os valores obtidos (Tabela 20) mostram que, como no experimento

com BAP, o tratamento com 2,5 µM de 2-iP apresentou a maior média de brotos (1,50 no 2°

subcultivo).

TABELA 20 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE COM BROTOS DE CANJARANA

NO CULTIVO INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA MS COM

CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE

ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

2-iP

(

SN*

SA*

0,00

0,13

0,00

0,13

0,00

2,5

1,38

0,00

1,13

1,00

1,50

0,69

0,13

0,50

5,0

0,25

1,37

0,13

0,81

0,00

0,13

0,00

1,00

0,00

0,63

0,00

0,25

0,13

0,75

0,00

4.4.1.2.4 Efeito da 2-iP no comprimento médio dos brotos

As médias dos comprimentos dos brotos para ambos os tipos de segmentos são

apresentadas na Tabela 21.

TABELA 21 - MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS EM EXPLANTES DE

CANJARANA EM MEIO DE CULTURA MS ADICIONADO DE 2-iP, NO CULTIVO

INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE

ORIGEM

COMPRIMENTO DOS BROTOS (cm)

cultivo inicial

subcultivo

Concentrações

de 2-iP

(

0,00

0,52

0,00

2,5

0,50

0,00

0,55

0,88

0,52

0,53

0,60

0,50

0,00

5,0

0,50

0,54

0,00

0,55

0,00

0,60

0,00

0,50

0,00

0,55

0,00

0,50

0,00

0,62

0,00

Os resultados indicaram que o comprimento dos brotos apresentou valores inferiores

a 1 cm com poucas alterações no decorrer dos subcultivos.

4.4.1.2.5 Efeito da 2-isopenteniladenina na percentagem de explantes mortos

Os resultados da análise de variância (anexo 11) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa, com exceção do 1º subcultivo, no qual houve diferença

estatisticamente significativa apenas entre as concentrações. A interação significativa revela

que os fatores tipo de segmento e concentração de 2-iP não são independentes.

O teste de Tukey para comparação de médias revelou que, para o segmento nodal,

no cultivo inicial na presença de 2-iP, as médias das percentagens de explantes mortos não

diferiram entre si. Já no 1

subcultivo, no qual não houve interação significativa entre os

fatores, as concentrações mais elevadas 10 e 20

M de 2-iP, diferiram das demais e

proporcionaram as maiores percentagens de mortalidade, 18% e 32% respectivamente

(Tabela 22).

No 2º subcultivo (Tabela 23), as concentrações de 5 e 10

M de 2-iP, diferiram

estatisticamente das outras e foram superiores as demais testadas. Entretanto, para o 3

subcultivo os valores dos dois primeiros tratamentos (2,5 e 5,0

M) diferiram dos outros

tratamentos e foram superiores, com exceção do tratamento com 10

M, o qual foi

estatisticamente igual ao do tratamento com 2,5

M de 2-iP. No último subcultivo a

percentagem de explantes mortos foi superior na concentração de 2,5

M de 2-iP e diferiu

estatisticamente das percentagens obtidas com as demais concentrações testadas.

Para os segmentos apicais, no cultivo inicial, a percentagem média de explantes

mortos foi superior na presença de 20

M de 2-iP e diferiu das outras médias. Já no 2º e 4º

subcultivos, as médias não diferiram estatisticamente entre si. No 3º subcultivo na

concentração de 2,5

M de 2-iP a percentagem de explantes mortos foi superior, com

exceção da concentração de 5,0

M de 2-iP, e diferiu estatisticamente das demais

concentrações testadas.

Quando se comparam os resultados para o tipo de segmento, no 2º subcultivo,

observa-se que houve menos necrose nos explantes formados a partir de segmentos

apicais nas concentrações de 5,0, 10 e 20

M de 2-iP. Entretanto, para o 3º subcultivo, o

mesmo tipo de segmento diferiu e teve a menor percentagem de explantes mortos apenas

na concentração 5,0

M. Os resultados obtidos em ambos os tipos de segmentos, até o 2º

subcultivo, mostraram que a concentração de 2,5

M de 2-iP é a mais indicada para uma

menor perda de explantes.

TABELA 22 – NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E

NO 1º SUBCULTIVO, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

EXPLANTES MORTOS (%)

Cultivo inicial

1º subcultivo

Concentrações

de 2-iP (

Segmento

Nodal

Segmento

Apical

Segmento

Nodal

Segmento

Apical

Médias

0,00 a

0,00

0,00 a

8,37 a

0,00 a

23,06

6,06

14,56 ab

6,25 a

8,37 a

10,13

13,00

11,57 ab

12,45 a

4,25 a

22,70

12,80

17,75 bc

2,5

5,0

2,12 a

27,00 b

45,76

19,00

32,38 c

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade.

TABELA 23 – NECROSE DOS EXPLANTES DE CANJARANA, CULTIVADOS EM MEIO DE

CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NOS 2

, 3

E 4º

SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM.

EXPLANTES MORTOS (%)

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

Concentrações

(

M de 2-iP)

SN*

SA*

0,00 a A

2,12 a A

0,00 a A

2,5

14,63 b A

8,37 a A

16,80 bc A

16,80 b A

37,39 b B

2,12 a A

5,0

35,38 c B

2,12 a A

24,50 c B

4,10 b A

10,50 a A

4,12 a A

29,13 c B

0,00 a A

4,30 ab A

0,00 a A

22,88 bc B

4,25 a A

0,00 a A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e pela mesma letra maiúsculas na horizontal, não diferem

estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

*SN- Segmento Nodal; *SA- Segmento Apical

4.4.1.2.6 Resumo dos resultados obtidos nas culturas de segmentos nodais em MS

adicionado de 2-iP

Os resultados obtidos no experimento com 2-iP foram geralmente piores quando

comparados aos obtidos com BAP, sendo observados nos 1º e 2º subcultivos os melhores

resultados para as variáveis analisadas (Tabela 24).

TABELA 24 – RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS NODAIS DE

CANJARANA PARA OS CULTIVOS REALIZADOS

Cultivo Inicial

2-iP (

Variáveis

2,5

Taxa de multiplicação

1,00

1,19

1,28

1,20

1,00

Explantes formando brotos (%)

2,00

27,00

2,00

0,00

4,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,30

0,08

0,00

0,04

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,00

1,38

0,25

0,00

0,25

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,50

0,00

0,50

Necrose (%)

0,00

8,37

6,25

12,45

2,12

1º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,16

1,18

1,10

1,00

Explantes formando brotos (%)

2,00

21,00

17,33

8,90

23,84

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,32

0,57

0,12

0,08

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,13

1,13

1,37

1,00

0,75

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,55

0,54

0,50

0,62

Necrose (%)

0,00

23,06

10,13

22,70

45,76

2º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,22

1,41

1,00

Explantes formando brotos (%)

2,10

40,50

10,61

12,53

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,54

0,30

0,54

0,00

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,13

1,50

0,81

0,63

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,52

0,55

0,00

Necrose (%)

0,00

14,63

35,38

29,13

22,88

3º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,02

1,00

Explantes formando brotos (%)

0,00

49,50

26,66

20,40

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,12

0,08

0,00

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,00

0,13

0,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,00

0,60

0,00

Necrose (%)

0,00

16,80

24,50

4,30

0,00

4º Subcultivo*

Taxa de multiplicação

1,03

1,00

Necrose (%)

0,00

37,39

10,50

0,00

* Não foi observada a presença de brotos

Em ambos os experimentos citados adicionados de BAP ou de 2-iP os melhores

resultados, levando em consideração todas as variáveis analisadas, foram observados no

tratamento com 2,5

M das respectivas citocininas (Tabelas 14 e 24).

4.4.1.3 Culturas em Meio de Cultura MS adicionado de Benzilaminopurina e 2-

Isopenteniladenina

4.4.1.3.1 Efeito da BAP e da 2-iP na multiplicação de gemas axilares em segmentos nodais

obtidos a partir de rebrotas

O presente experimento foi realizado para observação da influência das duas

citocininas em conjunto na multiplicação da

Cabralea canjerana

, uma vez que os resultados

obtidos com cada citocinina aplicada separadamente não foram satisfatórios

A tabela 25 apresenta as médias dos tratamentos com 2-iP, BAP e BAP+2-iP obtidas

em segmentos nodais retirados de rebrotas (Figura 9), em meio de cultura MS, no cultivo

inicial e em quatro subcultivos. Podemos observar que, nos dois últimos subcultivos, as

taxas de multiplicação diminuíram na presença de BAP e BAP+2-iP.

TABELA 25 - TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO EM EXPLANTES DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), NO CULTIVO

INICIAL E EM 4 SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS)

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Tratamentos

cultivo

inicial

1º

subcultivo

2º

subcultivo

3º

subcultivo

4º

subcultivo

2-iP(2,5

1,00

1,05

1,00

BAP (2,5

1,12

1,35

1,42

1,25

1,05

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

1,28

1,23

1,66

1,19

1,08

Os resultados da análise de variância (Anexo 12) indicaram que houve diferenças

estatisticamente significativas entre os tratamentos com BAP, no cultivo inicial e nos dois

primeiros subcultivos.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 26) revelou que, para o cultivo

inicial e o 2º subcultivo, a taxa de multiplicação do tratamento com BAP combinado com 2-iP

diferiu estatisticamente e foi superior às demais. No 1º subcultivo (Figuras 10 e 11), os

tratamentos com BAP somente ou combinado a 2-iP diferiram estatisticamente e foram

superiores ao tratamento com 2-iP, mas não diferiram entre eles.

TABELA 26 - TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO EM EXPLANTES DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP e BAP+ 2-iP), NO CULTIVO

INICIAL E NOS 1º E 2º SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE

REBROTAS)

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Tratamentos

Cultivo inicial

subcultivo

2-iP(2,5

1,00 b

1,05 c

BAP (2,5

1,12 b

1,35 a

1,42 b

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

1,28 a

1,23 a

1,66 a

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

Os resultados obtidos nos experimentos anteriores com BAP e com 2-iP, testados

isoladamente, mostraram que os melhores resultados para a variável taxa de multiplicação

foram obtidos na presença de 2,5 e 5,0

M de BAP em segmentos nodais. Resultado

semelhante foi observado quando comparadas as taxas de multiplicação obtidas na

presença de BAP e da combinação de BAP e 2-iP, pois as maiores taxas, também, foram

obtidas na presença de BAP sozinho ou em combinação com 2-iP. Logo, para a variável em

questão, a citocinina BAP sozinha ou em conjunto seria a mais indicada. No entanto, como

a taxa de multiplicação foi baixa, acreditamos que o uso de outra citocinina, assim como

combinações de BAP e 2-iP não testadas nesse trabalho, podem melhorar a taxa de

multiplicação da canjarana. Já, em segmentos nodais de mogno, SCHOTTZ (2003) obteve

alta taxa de multiplicação (7,22 brotos por segmento em 10

M BAP combinado a 2,2

M de

2-iP, em meio de cultura MS) esse resultado apesar de diferir do presente trabalho pela

baixa taxa obtida, apresentou resultados similares, pois no meio adicionado de 2-iP (2,2

e desprovido de BAP a taxa de multiplicação também foi baixa (2,04).

4.4.1.3.2 Efeito de BAP e 2-iP na percentagem de explantes com brotos em segmentos

nodais obtidos a partir de rebrotas

Os resultados da análise de variância (Anexo 13) indicaram que houve diferenças

estatisticamente significativas entre os tratamentos, no cultivo inicial, no 1º e 4º subcultivo.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 27) revelou que para o cultivo

inicial, as percentagens de explantes com brotos na presença de BAP e BAP+2iP diferiram

estatisticamente e foram superiores às obtidas com 2-iP. Para o 1º, 2º e 3º subcultivos, não

houve diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos. No 4º subcultivo foi

observada uma percentagem superior na presença de BAP+2-iP e essa diferiu

estatisticamente das demais.

TABELA 27 - PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA COM BROTOS EM MEIO DE

CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), NO CULTIVO

INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS (SEGMENTOS DE REBROTAS)

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

Tratamentos

Cultivo inicial

subcultivo

Subcultivo

2-iP(2,5

2,10 b

3,61 a

7,00

16,00

8,30 b

BAP (2,5

22,90 ab

41,92 a

27,00

25,00

8,40 b

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

41,61 a

19,80 a

25,01

37,00

37,40 a

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de

5% de

probabilidade.

4.4.1.3.3 Efeito de BAP e 2-iP no número médio de brotos por explante em segmentos

nodais obtidos a partir de rebrotas

Os resultados da análise de variância (Anexo 14) indicaram que houve diferença

estatisticamente significativa entre os tratamentos, no cultivo inicial e nos dois primeiros

subcultivos. Segundo o teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 28), no cultivo

inicial o número de brotos formados na presença de BAP+2iP diferiu estatisticamente e foi

superior aos demais. Para o 1º e 2º subcultivos, os números obtidos na presença de BAP e

de BAP+2-iP diferiram estatisticamente e foram superiores aos obtidos com 2-iP. Esses

resultados são distintos dos encontrados por KATAOKA e INOUE (1992) em explantes de

mamão, onde o número médio de brotos formados em BAP+2-iP foi superior ao alcançado

quando foi utilizado BAP sozinho.

TABELA 28 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), NO CULTIVO

INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE

REBROTAS)

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE

Tratamentos

cultivo inicial

subcultivo

2-iP(2,5

0,02 c

0,04 b

0,07 b

0,37

0,13

BAP (2,5

0,25 b

0,25 a

0,52 a

0,43

0,21

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

0,52 a

0,29 a

0,56 a

0,55

0,36

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade.

Quando comparados os resultados obtidos para a variável número médio de brotos e

para a taxa de multiplicação, verificamos que os melhores resultados em ambas as variáveis

foram observados nos tratamentos com BAP+2-iP e com BAP sozinho.

Como nos experimentos com BAP e 2-iP isolados, também foi calculado o número

médio de brotos por explante com brotos. Verificou-se que o maior número médio de brotos

foi obtido quando as duas citocininas estavam presentes (Tabela 29).

TABELA 29 – NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), NO

CULTIVO INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS (SEGMENTOS DE REBROTAS)

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS

Tratamentos

Cultivo

inicial

subcultivo

2-iP(2,5

0,13

0,25

0,50

0,13

BAP (2,5

0,94

0,63

0,81

1,00

0,75

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

1,02

0,50

1,04

1,08

1,63

4.4.1.3.4 Efeito de BAP e 2-iP no comprimento médio dos brotos em segmentos nodais

obtidos a partir de rebrotas

As médias dos comprimentos dos brotos para os segmentos nodais são

apresentadas na Tabela 30.

Os resultados mostraram que houve poucas diferenças entre os tratamentos e que,

neste caso também, o tamanho dos brotos sempre foi inferior a 1 cm.

TABELA 30 - MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS A PARTIR DE

EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA MS

ADICIONADO DE BAP E/OU 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO

SUBCULTIVOS (ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS OBTIDOS A PARTIR DE

REBROTAS)

COMPRIMENTO DOS BROTOS (cm)

Tratamentos

(em

Cultivo inicial

subcultivo

2-iP (2,5)

BAP (2,5)

BAP(2,5)+2-iP(2,5)

0,60

0,63

0,52

0,60

0,52

0,53

0,55

0,64

0,76

0,58

0,65

0,69

0,61

0,54

0,56

4.4.1.3.5 Efeito de BAP e 2-iP na percentagem de explantes mortos em segmentos nodais

obtidos a partir de rebrotas

Os resultados da análise de variância (Anexo 15) indicaram que houve diferenças

estatisticamente significativas entre os tratamentos, para os 1

, 2

e 3º subcultivos. Para o 4º

subcultivo não houve diferenças estatisticamente significativas.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 31) revelou para os três

subcultivos analisados, que o tratamento com o 2-iP provocou a maior percentagem de

explantes mortos e diferiu estatisticamente dos demais. As menores percentagens de

explantes mortos foram observadas nos tratamentos com BAP sozinho ou combinado com

2-iP.

TABELA 31 - NECROSE EM EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA

MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP E BAP+ 2-iP), EM TRÊS SUBCULTIVOS

(ORIGEM: SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS)

EXPLANTES MORTOS (%)

Tratamentos

Cultivo

inicial

1º

subcultivo

2º

subcultivo

3º

subcultivo

4º

subcultivo

2-iP(2,5

0,00

52,00 b

32,60 b

37,50 b

13,21

BAP (2,5

0,00

3,10 a

12,30 a

3,61 a

13,00

BAP+ 2-iP (2,5

M+2,5

0,00

7,20 a

6,50 a

8,81 a

7,00

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de

5% de

probabilidade.

4.4.1.3.6 Resumo dos resultados obtidos em MS adicionado de BAP e 2-iP em segmentos

nodais originados de rebrotas

Os melhores resultados para as variáveis analisadas obtidos nesse experimento

foram observados nos tratamentos com BAP isolado ou em conjunto com 2-iP, nos 1º e 2º

subcultivos (Tabela 32).

TABELA 32 – RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS NODAIS DE

CANJARANA NOS CULTIVOS REALIZADOS NO EXPERIMENTO COM BAP E 2-

iP COMBINADOS

Cultivo Inicial

Citocininas (

Variáveis

2-iP

2,5

BAP

2,5

BAP+2-iP (2,5+2,5)

Taxa de multiplicação

1,00

1,12

1,28

Explantes formando brotos (%)

2,10

22,90

41,61

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,25

0,52

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,13

0,94

1,02

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,60

0,63

0,52

Necrose (%)

0,00

1º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,35

1,23

Explantes formando brotos (%)

3,61

41,92

19,80

Nº médio de brotos/explante

0,04

0,25

0,29

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,25

0,63

0,50

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,60

0,52

0,53

Necrose (%)

52,00

3,10

7,20

2º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,05

1,42

1,66

Explantes formando brotos (%)

16,00

25,00

37,00

Nº médio de brotos/explante

0,07

0,52

0,56

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,25

0,81

1,04

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,55

0,64

0,76

Necrose (%)

32,60

12,30

6,50

3º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,05

1,25

1,19

Explantes formando brotos (%)

16,00

25,00

37,00

Nº médio de brotos/explante

0,37

0,43

0,55

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,50

1,00

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,58

0,65

0,69

Necrose (%)

37,50

3,61

8,81

4º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,05

1,08

Explantes formando brotos (%)

8,30

8,40

37,40

Nº médio de brotos/explante

0,13

0,21

0,36

Nº médio de brotos em

explantes com brotos

0,13

0,75

1,63

Tamanho médio dos brotos

(cm)

0,61

0,54

0,56

Necrose (%)

13,21

13,00

7,00

4.4.1.4 Conclusões Sobre os Experimentos em Meio MS

As quatro variáveis analisadas demonstram que o tratamento com 2-iP sozinho não

foi eficiente para a multiplicação de gemas axilares, produção de brotos, indução do

crescimento das gemas e ainda provocou uma grande mortalidade nos explantes, quando

comparado aos outros tratamentos. Ao relacionarmos os resultados obtidos ao do

experimento com BAP, observamos que os números de brotos foram semelhantes nos dois

experimentos, porém as maiores taxas de multiplicação e as menores percentagens de

explantes mortos foram encontradas no experimento com BAP somente. Isso indica que,

analisando todas as variáveis aqui descritas, BAP adicionado sozinho no meio de cultura

para segmento nodal proporcionou os maiores valores em comparação com 2-iP e BAP

combinado com 2-iP (Tabelas 14, 24 e 32). Entretanto, as taxas de multiplicação ainda não

são satisfatórias para uma eficiente multiplicação e por essa razão recomendamos a

realização de outros experimentos com outras combinações de BAP e com outras

citocininas, como, por exemplo, o tidiazuron (TDZ) e a zeatina.

Os resultados obtidos demonstraram que a citocinina BAP (2,5 e 5,0

M), em meio

de cultura MS, proporcionou valores de taxa de multiplicação superiores aos obtidos com 2-

iP e também alguns dos maiores números de brotos, apesar das taxas de multiplicação e do

número de brotos ainda não serem satisfatórios. No caso de

Anacardium occidentale

também, a melhor proliferação de brotos axilares foi obtida com BAP (com

aproximadamente 70 % de brotos multiplicando) em comparação ao 2-iP e a outras

citocininas como KIN e ZEA (MNENEY; MANTELL, 2002).

4.4.2 Culturas em Meio de Cultura WPM Adicionado de Benzilaminopurina

Como as taxas de multiplicação observadas nos experimentos com MS não foram

satisfatórias, o presente experimento foi realizado com o intuito de verificar se a composição

do meio de cultura WPM seria mais eficaz na indução da multiplicação da canjarana.

Conjuntamente foram utilizadas as concentrações de BAP para as quais foram verificados

os melhores resultados nos experimentos anteriores.

4.4.2.1 Efeito da BAP na multiplicação de gemas axilares de segmentos nodais e apicais

A Tabela 33 apresenta as médias das taxas de multiplicação obtidas nos tratamentos

com BAP em segmentos nodais e apicais e em meio de cultura WPM, no cultivo inicial e em

quatro subcultivos.

TABELA 33 - TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM EXPLANTES DE CANJARANA EM

MEIO DE CULTURA WPM, COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO

INICIAL E EM QUATRO SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

Concentrações de

BAP (

SN*

SA*

1,00

2,5

1,00

1,12

1,02

1,08

1,00

1,02

1,00

1,04

1,00

5,0

1,28

1,15

1,10

1,18

1,02

1,09

1,05

1,08

1,00

* SN: segmento nodal, SA: segmento apical

Os resultados da análise de variância (Anexo 16) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa apenas no 2º subcultivo, revelando que os fatores ‘’ tipo de

segmento’’ e ‘’concentrações de BAP’’ não são independentes nesse subcultivo. Entretanto ,

para o cultivo inicial e 3º subcultivo os fatores são independentes e nesses houve diferenças

estatisticamente significativas apenas entre as concentrações. No 1

e 4º subcultivo não

foram obtidas diferenças estatisticamente significativas. No 2º subcultivo, o teste de Tukey

(Tabela 34) mostrou que, para o segmento nodal, a taxa de multiplicação média (1,18)

obtida na presença de 5,0

M de BAP foi superior e diferiu estatisticamente das outras

taxas. Porém, para o segmento apical, as médias de taxa de multiplicação não diferiram

estatisticamente entre si. A taxa mais elevada (1,28) foi obtida no cultivo inicial a partir dos

segmentos nodais. No 2° subcultivo (Figura 13), este tipo de segmento apresentou os

melhores resultados que diferiram estatisticamente dos resultados obtidos com os apicais,

com exceção do controle (Tabela 34).

TABELA 34 - TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS NO 2º SUBCULTIVO DE EXPLANTES

DE CANJARANA CULTIVADOS, M MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS

CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

2º subcultivo

Concentrações (

M de BAP)

SN*

SA*

1,00 b A

1,00 a A

2,5

1,08 b A

1,00 a B

5,0

1,18 a A

1,02 a B

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e as médias seguidas pela mesma letra maiúscula na horizontal não

diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

SN*- Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

No cultivo inicial, o teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 35) revelou

que a média de taxa de multiplicação na concentração de 5,0

M de BAP diferiu

estatisticamente e foi superior às demais. No 3º subcultivo e para esta mesma

concentração, a taxa diferiu estatisticamente e foi superior apenas ao controle.

TABELA 35 - TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS NO CULTIVO INICIAL E NO 3°

SUBCULTIVO DE EXPLANTES DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE

CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP (MEDIA DE 2 TIPOS DE

SEGMENTOS)

TAXA DE MULTIPLICAÇÃO

CONCENTRAÇÕES DE BAP (

cultivo inicial

3º subcultivo

1,00 b

1,01 ab

2,5

5,0

1,21 a

1,07 a

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

No geral, as maiores taxas de multiplicação foram observadas na concentração de

5,0

M de BAP, sendo que as taxas tenderam a diminuir com os subcultivos.

4.4.2.2 Efeito da BAP na percentagem de brotos por explante

Os resultados da análise de variância (Anexo 17) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa apenas no cultivo inicial e para o 2º subcultivo, revelando que os

fatores tipo de segmento e concentrações de BAP não são independentes. Já para 1

subcultivo houve diferenças estatisticamente significativas apenas entre as concentrações

de BAP e, para o 3º subcultivo, não houve diferenças estatisticamente significativas.

O teste de Tukey para comparação de médias (Tabela 36) revelou que, no cultivo

inicial e no 2º subcultivo não houve diferença estatística entre as concentrações testadas,

porém foi observada diferença estatisticamente significativa entre os segmentos, sendo o

segmento nodal superior ao apical. Já, para o 1º subcultivo, os resultados obtidos com as

concentrações de 2,5 e 5,0

M de BAP diferiram do controle e foram superiores;

independentemente do tipo de segmento (Tabela 37). No 3° subcultivo, o melhor resultado

foi observado na concentração de 2,5

M para ambos os tipos de segmentos. O valor mais

elevado foi obtido no 1° subcultivo na presença de 5 µM de BAP com 26% dos segmentos

formando brotos.

TABELA 36 - PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA FORMANDO BROTOS EM MEIO

DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO INICIAL

E NO 2º SUBCULTIVO, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

cultivo inicial

2º subcultivo

Concentrações de BAP

(

Segmento Nodal

Segmento Apical

Segmento Nodal

Segmento Apical

0,00 a A

2,10 a A

0,00 a A

2,5

20,81 a A

0,00 a B

7,20 a A

0,00 a A

5,0

18,70 a A

0,00 a B

16,50 a A

0,00 a B

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e pela mesma letra maiúscula na horizontal não diferem

estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

TABELA 37 - PERCENTAGEM DE EXPLANTES DE CANJARANA FORMANDO BROTOS EM MEIO

DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO 1º E 3º

SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

1º subcultivo

3º subcultivo

Concentrações de BAP

(µM)

Segmento

Nodal

Segmento

Apical

Médias

Segmento

Nodal

Segmento

Apical

2,10

2,10 b

2,10

2,11

16,60

16,30 a

4,90

8,40

2,5

5,0

26,00

19,00

22,50 a

4,20

0,00

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

4.4.2.3 Efeito da BAP no número médio de brotos por explante

Os resultados da análise de variância (Anexo 18) indicaram que a interação entre os

fatores foi significativa apenas no cultivo inicial, revelando que os fatores tipo de segmento e

concentrações de BAP não são independentes para esse subcultivo. Para o 1

e o 2

subcultivo, houve diferenças estatisticamente significativas entre as concentrações e, para o

3º subcultivo, não houve diferença estatisticamente significativa. O teste de Tukey para

comparação de médias (Tabela 38) revelou que, para o segmento nodal no cultivo inicial, o

número de brotos foi superior nos meios adicionados de 2,5

M e 5,0

M de BAP e diferiu

estatisticamente do controle. Nos segmentos apicais não houve a formação de brotos nesse

subcultivo. No 1º subcultivo, o resultado obtido com a concentração de 5,0

M de BAP,

diferiu dos demais e foi superior, independente do tipo de segmento. Entretanto no 2º

subcultivo o resultado obtido com a mesma concentração diferiu estatisticamente e foi

superior apenas ao controle (Tabela 39). O melhor tipo de segmento, qualquer que seja a

concentração, foi o segmento nodal (1,09 brotos/explante), o qual diferiu e foi

estatisticamente diferente do segmento apical (1,02).

TABELA 38 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE DE CANJARANA NO CULTIVO

INICIAL EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, EM

FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE

Concentrações de BAP (

Segmento Nodal

Segmento Apical

0,00 b A

0,00 a A

2,5

0,30 a A

0,00 a B

5,0

0,33 a A

0,00 a A

Médias seguidas pela mesma letra minúscula na vertical e pela mesma letra maiúscula na horizontal não diferem

estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.

TABELA 39 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE NO 1º, 2º E 3º SUBCULTIVO EM

MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP (MEDIA DE DOIS

TIPOS DE SEGMENTOS)

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE

Concentrações de BAP

(µM)

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

0,02 c

0,02 b

0,02

0,11 b

0,05 ab

0,05

2,5

5,0

0,25 a

0,09 a

0,01

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5%

de probabilidade.

Na micropropagação de

Swartzia madagascariensis

(Fabaceae) foi comparado o

número de brotos por explante obtidos em diferentes meios de culturas como o MS e o

WPM, adicionados de BA. O melhor resultado para o número de brotos foi obtido no meio

MS adicionado de 2,2

M de BAP (37 brotos/explante). Esse resultado diferiu do observado

para outras espécies lenhosas, já que a baixa concentração iônica do WPM não causou

efeitos benéficos na indução de brotos (BERGER; SCHAFFNER, 1995). Com relação à

multiplicação da canjarana, também observamos que, em comparação ao WPM, o meio de

cultura MS proporcionou os melhores resultados para as variáveis testadas. Esse meio de

cultura adicionado de BAP induziu também uma multiplicação de gemas melhor em

comparação ao 2-iP (comparar as Tabelas 5 e 15). No trabalho de SAADAT e HENNERTY

(2002) resultado similar, com maiores valores obtidos em meio de cultura MS, foi observado

para a nogueira (

Juglans regia

Como nos experimentos em meio de cultura MS, o número médio de brotos em

explantes com brotos foi calculado para complementação dos resultados obtidos no meio de

cultura WPM. Foi observado que os valores dessa variável foram geralmente menores que

1,00 e mesmo a maior média não superou a média observada nos experimentos em meio

de cultura MS, indicando que o número de brotos foi menor no experimento em meio WPM

(Tabela 40).

TABELA 40 - NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTES COM BROTOS DE CANJARANA NO

CULTIVO INICIAL E NO 1º, 2º E 3º SUBCULTIVO EM MEIO DE CULTURA WPM COM

TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP (MEDIA DE DOIS TIPOS DE SEGMENTOS)

NÚMERO MÉDIO DE BROTOS EM EXPLANTE COM BROTOS

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

Concentrações de BAP

(µM)

SN*

SA*

0,00

0,13

0,00

0,25

1,13

0,00

0,63

0,50

0,63

0,00

0,25

2,5

5,0

0,99

0,00

0,83

0,88

1,08

0,00

0,17

0,00

SN* - Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

4.4.2.4 Efeito da BAP no comprimento médio dos brotos

As médias dos comprimentos dos brotos para ambos os tipos de segmentos são

apresentadas na Tabela 41.

TABELA 41 - MÉDIAS DOS COMPRIMENTOS DOS BROTOS FORMADOS EM EXPLANTES DE

CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA WPM ADICIONADO DE BAP,

NO CULTIVO INICIAL E NOS TRÊS PRIMEIROS SUBCULTIVOS, EM FUNÇÃO DO

TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

COMPRIMENTO MÉDIO DOS BROTOS (cm)

cultivo inicial

subcultivo

Concentrações

de BAP

(

SN*

SA*

0,00

2,5

0,52

0,00

0,50

0,00

0,55

0,50

5,0

0,54

0,00

0,62

0,53

0,52

0,50

0,00

SN* - Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

Os maiores comprimentos dos brotos foram observados nos segmentos nodais e

geralmente na concentração de 5,0

M de BAP. Houve poucas diferenças entre os

tratamentos em todos os subcultivos. Os valores foram baixos e variaram de 0,5 a 0,62 cm.

MERETI et al. (2002) observaram, em

Arbutus unedo

(Ericaceae), comprimentos de

brotos similares entre os tratamentos (0; 5,5; 11,1 e 22,2

M de BAP), exceto para

concentração de 5,5

M de BAP, que proporcionou o maior comprimento dos brotos (1,06

cm). No presente trabalho também foram obtidos os maiores comprimentos em

concentração similar.

4.4.2.5 Efeito da BAP na percentagem explantes mortos

A Tabela 42 apresenta as percentagens médias de explantes mortos obtidas nos

tratamentos com BAP, em segmentos nodais e apicais e em meio de cultura WPM.

TABELA 42 - NECROSE EM EXPLANTES DE CANJARANA NO CULTIVO INICIAL E EM QUATRO

SUBCULTIVOS EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE

BAP EM FUNÇÃO DO TIPO DE SEGMENTO DE ORIGEM

ÈXPLANTES MORTOS (%)

Cultivo inicial

1º subcultivo

2º subcultivo

3º subcultivo

4º subcultivo

Concentrações de

BAP (

SN*

SA*

0,00

2,12

0,00

2,5

0,00

4,20

2,12

10,50

7,12

12,50

2,50

5,0

0,00

6,30

0,00

4,60

2,12

21,00

6,30

11,10

0,00

SN* - Segmento Nodal; SA*- Segmento Apical

Os resultados da análise de variância (Anexo 19) indicaram que não existiu interação

entre os fatores tipos de segmento e concentrações de BAP, em nenhum dos subcultivos

analisados. A análise revelou ainda, que não houve diferenças estatisticamente

significativas para o 1º e 2º subcultivos e, para o 3º subcultivo só houve diferenças

estatisticamente significativas entre as concentrações. Para o último subcultivo a diferença

foi estatisticamente significativa apenas para o tipo de segmento.

O teste de Tukey para comparação de médias foi realizado para o 3º subcultivo

(Tabela 43) mostrando que o controle induziu a menor percentagem de explantes mortos e

diferiu estatisticamente somente do tratamento com 5,0

M de BAP. Para o 4º subcultivo,

não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias das percentagens de

explantes mortos obtidos para os dois tipos de segmentos. Observando todos os

subcultivos, os resultados demonstram que a concentração de 2,5

M e 0

M de BAP

induziram, em ambos os tipos de segmentos, as menores percentagens de explantes

mortos. No geral as percentagens obtidas foram baixas com no máximo 21,00 de explantes

mortos, sendo que o comportamento geralmente observado foi o aumento nos valores das

percentagens no decorrer dos subcultivos.

TABELA 43 - NECROSE EM EXPLANTES DE CANJARANA NO 3º SUBCULTIVO EM MEIO DE

CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP EM FUNÇÃO DO TIPO

DE SEGMENTO DE ORIGEM

CONCENTRAÇÕES DE BAP

(

EXPLANTES MORTOS (%)

(Média para os 2 tipos de segmentos)

2,10 a

2,5

8,81 a

5,0

13,60 a

Médias seguidas pela mesma letra na vertical, não diferem estatisticamente pelo teste de Tukey ao nível de 5% de

probabilidade.

4.4.2.6 Conclusões sobre o experimento em meio de cultura WPM adicionado de BAP

Os resultados obtidos no presente experimento demonstraram que em meio WPM a

citocinina BAP induziu resultados ainda menos satisfatórios que os observados nas mesmas

concentrações desta citocinina em meio de cultura MS (Tabelas 14 e 44).

Comparando os resultados com BAP nas mesmas concentrações e em meios de

culturas diferentes, podemos concluir que, para a variável percentagem de explantes

mortos, o melhor meio de cultura seria o WPM, pois esse apresentou os menores valores

para a variável em questão. Entretanto, nesse meio de cultura foi observada a clorose em

algumas das folhas dos brotos a partir do 3º subcultivo e menores taxas de multiplicação do

que no meio de cultura MS (comparar a Tabela 5 com a Tabela 33), assim como menores

comprimentos de brotos e um menor número de brotos.

TABELA 44 – RESUMO DOS RESULTADOS OBTIDOS PARA SEGMENTOS NODAIS DE

CANJARANA, NOS CULTIVOS REALIZADOS NO EXPERIMENTO EM WPM

ADICIONADO DE BAP

Cultivo Inicial

BAP(

Variáveis

2,5

Taxa de multiplicação

1,00

1,28

Explantes formando brotos (%)

0,00

20,81

18,70

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,30

0,33

Nº médio de brotos em explantes

com brotos

0,00

1,13

0,99

Tamanho médio dos brotos (cm)

0,00

0,52

0,54

Necrose (%)

0,00

1º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,12

1,10

Explantes formando brotos (%)

2,10

16,60

26,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

0,11

0,25

Nº médio de brotos em explantes

com brotos

0,13

0,63

0,83

Tamanho médio dos brotos (cm)

0,00

0,50

0,62

Necrose (%)

0,00

6,30

2º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,08

1,18

Explantes formando brotos (%)

2,10

7,20

16,50

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,05

0,09

Nº médio de brotos em explantes

com brotos

0,13

0,63

1,08

Tamanho médio dos brotos (cm)

0,00

0,50

0,52

Necrose (%)

2,12

4,60

3º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,02

1,09

Explantes formando brotos (%)

2,10

4,90

4,20

Nº médio de brotos/explante

0,02

0,05

0,01

Nº médio de brotos em explantes

com brotos

0,25

0,17

Tamanho médio dos brotos (cm)

0,00

0,55

0,50

Necrose (%)

2,12

10,50

21,00

4º Subcultivo

Taxa de multiplicação

1,00

1,04

1,08

Explantes formando brotos (%)

0,00

Nº médio de brotos/explante

0,00

Nº médio de brotos em explantes

com brotos

0,00

Tamanho médio dos brotos (cm)

0,00

Necrose (%)

0,00

12,50

11,10

No processo de micropropagação podem ser utilizados vários meios de cultura,

entretanto, o meio de cultura WPM é o mais comum para a propagação

vitro

de espécies

lenhosas (VENGADESAN et al., 2002). A utilização desse meio de cultura em segmentos

apicais proporcionou bons resultados de multiplicação para o mogno,

Swietenia

macrophylla

, e para o cedro,

Cedrela odorata

, na concentração de 0,88

M de BAP

(MARUYAMA et al., 1989a). No caso do cedro os autores citam a produção de 3,5 brotos

por explante (MARUYAMA et al,. 1989b).

No presente trabalho bem como nos trabalhos utilizando espécies de

Acacia

(VENGADESAN et al., 2002) e

Anacardium occidentale

(MNENEY; MANTELL, 2002), o

meio de cultura MS apresentou melhores resultados que o WPM para indução de brotos.

Portanto, para

Cabralea canjerana

de acordo com os resultados obtidos utilizando os dois

meios citados e a citocinina BAP, o meio de cultura MS foi o mais indicado para a

multiplicação de gemas axilares. Isso pode estar relacionado com o fato do meio WPM

possuir apenas 45% da força iônica total do MS (NUNES et al., 2002) e concentrações

menores de nitrato (MS 40

M; WPM 9,7

M) e amônio (MS 20

M; WPM 4,9

M). Além

disso, o WPM possui também uma baixa quantidade de nitrogênio total (14,69) comparado

ao MS (60,00) (GEORGE, 1996) e esse fato pode influenciar na clorose foliar (SCHOTTZ,

2003), sendo que esse sintoma foi observado nos explantes de canjarana cultivados em

meio de cultura WPM, já em meio de cultura MS os explantes não apresentaram clorose

foliar em nenhum dos subcultivos avaliados. A importância da transferência dos explantes,

depois de 3 semanas, para meio de cultura fresco, foi destacada como essencial para

prevenir a desfoliação, a perda de vigor da cultura e para sustentar o crescimento dos brotos

(SHEKHAWAT et al., 1997). Quando o meio de cultura WPM é utilizado, a duração de cada

subcultura deve ser menor, ou ainda esse meio de cultura pode não ser adequado para

Cabralea canjerana.

Mesmo sendo observados os melhores resultados em meio de cultura MS a

obtenção de brotações multíplas foi baixa, porém eram brotações que apresentavam um

aspecto normal, com coloração verde e folhas compostas com folíolos sem anormalidades.

Por essa razão sugerem-se novos testes com outras citocininas (como o TDZ) ou essas em

combinações com outros fitorreguladores (como o NAA).

Apesar das taxas de multiplicação obtidas serem baixas, alguns segmentos retirados

de determinadas plântulas demonstraram uma grande capacidade de multiplicação,

produzindo mais que o dobro do número de gemas axilares iniciais entre dois subcultivos.

Essa variação na resposta à citocinina pode ser explicada pelo fato das sementes terem

sido originadas de polinização aberta e, portanto, provavelmente com grande variabilidade

genética.

4.5 ENRAIZAMENTO DE BROTOS OBTIDOS NA FASE DE MULTIPLICAÇÃO

O meio WPM foi utilizado no experimento de enraizamento devido ao resultado de

enraizamento observado no experimento de multiplicação neste meio de cultura. Nesse

experimento, os explantes obtidos de segmentos apicais na ausência de BAP apresentaram,

aos 30 dias de cultivo, 12,5% de enraizamento (Figura 14) e 1,5% nos de segmentos

nodais. Aos 45 dias de cultivo, a percentagem de explantes enraizados para os segmentos

apicais continuou a mesma, porém para os segmentos nodais aumentou para 2,43%.

Os resultados apresentados na Tabela 45 indicaram que as percentagens de

enraizamento variaram entre 18 e 20% nos meios de cultura WPM adicionado de 2,5 e 5,0

M de IBA (Figura 15), demonstrando que a percentagem de enraizamento foi baixa se

comparada a percentagens de outras espécies e ao experimento de multiplicação no qual

15% dos brotos (média para os dois tipos de explantes) enraizaram sem a presença de

auxinas exógenas. Esse resultado pode ser devido à influência do BAP utilizado na fase de

multiplicação, já que BAP pode ter estimulado a produção de citocininas endógenas

(VANKOVA et al., 1991) e isso, por sua vez, pode inibir a iniciação da raiz (BOLLMARK et

al., 1988) e também o alongamento (TAIZ et al., 2004). Sendo assim, um aspecto importante

no enraizamento in vitro é a composição dos meios de multiplicação, já que o contato

prolongado dos explantes com altas concentrações da citocinina BAP na fase de

multiplicação pode ser prejudicial ao enraizamento (ASSIS; TEIXEIRA, 1998). Uma relação

elevada entre as citocininas e as auxinas geralmente promove a formação de brotos e a

redução do enraizamento em estacas caulinares, assim como a taxa de crescimento da raiz

é reduzida (TAIZ et al., 2004). O efeito residual das citocininas pode ser observado quando

pré-tratamentos com as mesmas são utilizados (GEORGE, 1993). Por tanto, a ação da

citocinina adicionada na fase de multiplicação pode ter influenciado negativamente o

enraizamento da canjarana. GRATTAPAGLIA et al. (1987) constataram o efeito residual de

BAP inibindo o enraizamento em

Eucalyptus urophylla, E. cloeziana, E. citriodora

explantes provenientes de um teste fatorial combinando BAP e ANA.

TABELA 45 - ENRAIZAMENTO DE MICROESTACAS DE CANJARANA ORIGINADAS DE BROTOS

OBTIDOS NA FASE DE MULTIPLICAÇÃO, EM MEIO DE CULTURA WPM

ADICIONADO DE IBA (0; 2,5 E 5,0

Microestacas enraizadas

(%)

Número médio de raízes

por microestaca

Comprimento médio das

raízes (cm)

Concentrações de

IBA (

30 dias

60 dias

30 dias

60 dias

30 dias

60 dias

2,27

1,12

1,00

0,30

0,70

2,5

18,18

1,25

1,75

0,28

0,73

5,0

18,18

20,45

1,00

1,33

0,30

0,42

Em outra Meliacea,

Cedrella fissilis

, as percentagens de enraizamento na presença

de IBA foram maiores do que as encontradas nos experimentos realizados no presente

trabalho. Os autores obtiveram de 87 a 100% de enraizamento em meio de cultura MS,

completo ou meia força, adicionado de 2,5

M de IBA, utilizando brotos obtidos na fase de

multiplicação, procedentes de segmentos nodais cotiledonares (Nunes et al., 2002).

As percentagens de enraizamento dos explantes (microestacas com 2-3 cm,

oriundos da fase de multiplicação) da espécie lenhosa

Arbutus unedo

(Ericaceae) em meio

de cultura contendo os sais do meio WPM e vitaminas do MS, foram de 92% na presença de

M de IBA, de 75% em 5

M e de 65% em 2,5

M. Entretanto, o controle apresentou 45

% de enraizamento (MERETI et al., 2002). Esse resultado mostra que esta espécie não

possui grandes dificuldades de enraizamento quando comparada à canjarana e também que

o BAP utilizado na fase anterior provavelmente não interferiu expressivamente no

enraizamento.

Em microestacas de

Cornus florida

(Cornaceae), oriundas de um meio de

multiplicação contendo 4,4

M de BAP, o máximo de enraizamento (83%) foi obtido em meio

de cultura WPM com 4,4

M de IBA (SHARMA et al., 2005). Já, a canjarana apresentou em

concentração similar de IBA, apenas 20% de enraizamento, mostrando a necessidade de

novos testes para aumentar essa percentagem.

O número médio de raízes e o comprimento dessas foram baixos; por essa razão

recomenda-se a utilização de outras concentrações de IBA, ou ainda a utilização de

explantes após um subcultivo em meio de cultura sem fitorreguladores ou contendo carvão

ativo.

4.6 ENRAIZAMENTO DAS MICROESTACAS OBTIDAS A PARTIR DE REBROTAS

Os experimentos 1 e 2 de enraizamento de microestacas foram realizados como

alternativa para o enraizamento da espécie. Altas percentagens de enraizamento (87,5% e

83,2%) foram obtidas com 5,0 e 10 µM de IBA aos 60 dias no experimento 2. Entretanto,

quando comparados ambos os experimentos os maiores valores foram obtidos na

concentração de 10 µM de IBA para o experimento 1 e de 5,0 µM de IBA no experimento 2.

No experimento 1 observou-se o maior número médio de raízes por microestacas de 3,92

no meio contendo 10 µM de IBA (Tabela 46).

Os resultados indicaram que a permanência de apenas 7 dias em meio de cultura

adicionado de IBA foi mais favorável na indução de raízes proporcionando as maiores

percentagens de enraizamento, porém o número médio de raízes por microestacas foi

menor quando comparado à indução permanente realizada no experimento 1. Em ambos

experimentos foram observadas altas percentagens de explantes com raízes no tratamento

com 10

M de

IBA. Entretanto, LOPES et al. (2001) observaram a maior percentagem de

enraizamento (40,0%) em microestacas de mogno (oriundas da fase de multiplicação em

meio de cultura adicionado de BAP e ANA), em uma menor concentração de IBA (0,49

M).

A diferença no comportamento observado para as duas espécies mostra que, possivelmente

os níveis endógenos de auxinas sejam diferentes, já que no mogno o IBA (4,89 e 14,67

induziu uma menor percentagem de enraizamento (10%) e que

na canjarana esta auxina

induziu um melhor resultado em uma concentração intermediara.

O enraizamento de microestacas obtido nos dois últimos experimentos apresentou

altas percentagens quando comparado ao experimento com microestacas oriundas de

brotos da fase de multiplicação. Essa diferença entre os resultados obtidos pode ser devida

a vários fatores, como a diferença na origem dos explantes (brotos oriundos de meio de

cultura WPM adicionado de citocinina e segmentos apicais de rebrotas obtidos em meio de

cultura MS/2 sem fitorregulador), o tamanho dos explantes, o meio de cultura utilizado

(WPM e MS/2) e a presença de um período de indução, no caso do experimento 2.

Apesar dos fatores citados, as microestacas obtidas a partir de brotos originados na

fase de multiplicação, provavelmente poderiam apresentar uma porcentagem de

enraizamento em meio de cultura MS/2 adicionado de 10 µM de IBA.

TABELA 46 - ENRAIZAMENTO DE MICROESTACAS DE CANJARANA OBTIDAS A PARTIR DE

REBROTAS, EM MEIO DE CULTURA MS/2 ADICIONADO DE IBA (0; 2,5, 5,0 E 10

Microestacas

enraizadas (%)

Número médio de

raízes por microestaca

Comprimento médio das

raízes (cm)

IBA (

30 dias

60 dias

30 dias

60 dias

30 dias

60 dias

40,0

42,5

1,06

0,67

1,03

2,5

60,0

70,0

2,02

2,19

0,41

0,48

5,0

40,0

53,5

2,63

3,10

0,28

0,32

Experimento

55,0

75,5

2,88

3,92

0,32

0,49

36,7

41,9

1,12

1,07

0,45

0,76

2,5

70,0

80,0

1,80

2,09

0,51

0,76

5,0

77,5

87,5

2,30

2,55

0,40

0,43

Experimento

76,9

83,2

2,39

2,57

0,38

0,46

5 CONCLUSÕES

•

A deiscência dos frutos da espécie

Cabralea canjerana

pode ser obtida com sucesso

em laboratório deixando os frutos, ainda sem fissuras de deiscência, em sacos

plásticos fechados, por período de 11 dias;

•

A percentagem de germinação

in vitro

atingiu 90% das sementes germinadas após

um período de 14 dias, mas esse resultado dependeu da concentração de hipoclorito

de sódio (2,5 (v/v) por 30 minutos), que pode atuar favorecendo a germinação em

determinadas concentrações;

•

A cultura dos explantes em meio MS adicionado de 2,5 µM de BAP permite uma

multiplicação dos brotos com uma taxa que permanece inferior a 2 durante 4

subcultivos;

•

As maiores taxas de multiplicação são obtidas a partir de segmentos nodais, assim

como o maior número de brotos e os maiores comprimentos destes;

•

O meio de cultura WPM, a partir do 3º subcultivo, induz a clorose em algumas folhas

dos brotos e não é adequado para a multiplicação das gemas;

•

O meio de cultura WPM suplementado com 5,0 µM de IBA permite o enraizamento

de 20% das microestacas obtidas a partir de brotos originados na fase de

multiplicação;

•

O meio de cultura MS/2 adicionado de 5,0 µM de IBA permite o enraizamento de

aproximadamente 87% das microestacas obtidas de rebrotas;

•

As gemas axilares de plantas adultas são dificilmente desinfestadas pelo hipoclorito

de sódio.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALBARRÁN, J. G.; VIELMA, M.; CONTRERAS, G. Cultivo in vitro de

Swietenia macrophylla

King.: Estudio de condiciones óptimas para la regeneración y transformación genética.

Revista Forestal Venezuelana

, Merida, v. 41, n. 2, p. 111-118, 1997.

ALI, M. A.; LUDDERS, P. In vitro culture and its application on the cloning of guava (

Psidium

guajava

L.).

Journal of Applied Botany,

Berlim, v. 75, p. 164-167, 2001.

AMIN, M. N.; JAISWAL, V. S. Micropropagation as an aid to rapid cloning of a Guava

cultivar. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 36, p. 89-85, 1988.

ASSIS, T. F.; TEIXEIRA, S. L. Enraizamento de plantas lenhosas.

In:

TORRES, A. C.;

CALDAS, L. C.; BUSO, J.A.

Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

Brasília: Embrapa/CNPH, v. 1, p. 261-296,1998

AUGUSTO, C. S. S.

Micropropagação da amorera-preta cv. Brazos

. Curitiba, 2001. 115 f.

Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal

do Paraná.

BACKES, P.; IRGANG, B.

Árvores do Sul:

guia de identificação e interesse ecológico.

Santa Cruz do Sul: Instituto Souza Cruz, 2002. p. 200-201.

BENNY, D.; SHAJI, J.; SONIYA, E. V.; NAIR, G. M.; DANIEL, B.; JOHN, S. Micropropagation

of Naregamia alata W & A- an important medicinal plant.

Journal of Plant Biochemistry

and Biotechnology,

New Delhi, v. 8, n. 2, p. 105-107, 1999.

BERGER, K; SCHAFFNER, W. In vitro propagation of the leguminous tree

Swartzia

madagascariensis

Plant Cell, Tissue and Organ Culture

. Dordrecht, v. 40, p. 289- 291,

1995.

BIASI, L. A. Reguladores de Crescimento Vegetal. In: Fisiologia vegetal: produção e pós-

colheita. WACHOWICZ, C. M.; CARVALHO, R. I. N. Curitiba: Champagnat, 2002. p. 63-91.

BOLLMARCK, M.; KUBAT, B.; ELIASSON, L. Variation in endogenous cytokinin content

during adventitious root formation in pea cuttings.

Journal of Plant Physiology

, Jena, v.

132, p. 262-265, 1988.

BONGA, J.M.; ADERKAS.

In vitro culture of trees.

Boston: Kluwer Academic Publishers, v.

2, p. 54-97. 1992.

BONGA, J. M.; DURZAN, D. J.

Cell and tissue culture in forestry.

Dordrecht: Martinus

Nijhoff Publishers, 1985. v. 3, p. 416.

CALDAS, L. S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.;

CALDAS, L. C.; BUSO, J.A.

Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

Brasília: Embrapa/CNPH, 1998. v. 1, p. 87-132.

CARVALHO, P. E. R.

Espécies florestais brasileiras recomendações silviculturais,

potencialidades e uso da madeira.

Colombo: Embrapa/CNPF- SPI, p. 107-112, 1994.

CARVALHO, P. E. R.; ZELAZOWSKI, W. H.; KAMINSKI, N. L.; LOPES, G. L.

Plantio

comprobatório de canjarana (

Cabralea canjerana

subsp.

canjerana

Colombo:

Embrapa/ CNPF, dez/1996. 2 p. (Pesquisa em Andamento)

CERDAS, L. V.; DUFOUR, M.; VILLALOBOS, V.

In vitro

organogenesis in

Albizia

guachapele

Cedrella odorata

and

Swietenia macrophylla

(Fabaceae, Meliaceae).

Revista

Biologia Tropical

, San Jose, v. 46, n. 2, p. 225-228, 1998.

CHATURVEDI, R.;RAZDAN, M. K.; BHOJWANI. In vitro clonal propagation of an adult tree of

neem (

Azadirachata indica

A. Juss.) by forced axillary branching.

Plant Science (Limerich)

Limerich, v.166, ed. 2, p. 501-506, 2004.

CHENG, B.; PETERSON, C. M; MITCHELL, R. J. The role of sucrose, auxin and explant

source on in vitro rooting of seedling explants of

Eucalyptus sideroxylon

Plant Science

(Limerich)

, Limerich, v. 87, p. 207-214, 1992.

CID, L. P. B.; GOMES, A. C. M.; COSTA, S. B. R.; TEIXEIRA, J. B. Micropropagation of

Miconia

sp a woody melastomaceae from Brazil, using thidiazuron as plant growth regulator.

Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal,

Brasília, v. 9, n. 1, p. 21-25, 1997.

DEBNATH, S.; McRAE, K. E. An efficient

in vitro

shoot propagation of cranberry (

Vaccinium

macrocarpon

AIT.) by axillary bud proliferation.

In vitro Cellular & Developmental Biology

Plant

, Largo, v. 37, p. 243-249, 2001.

FOSKET, D. E.

Plant growth development: a molecular approach

. San Diego: Academic

Press. 580p, 1994.

FRASSETO, E. G.; MENEZES, N. L. Influência da temperatura de germinação, da abertura

dos frutos e da embalagem na viabilidade de sementes de cangerana (

Cabralea canjerana

(Vell.) Mart.) – MELIACEAE. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE SEMENTES, 10, 1997,

Brasília.

Informativo Abrates.

Brasília,

1997.

v. 7, n. 1/2. p. 213.

GEORGE, F. E.

Plant propagation by tissue culture.

Exegetics Limited: England, 2

Edition, v.1 e 2, 1996.

GRATTAPAGLIA, D.; MACHADO, M, A. Micropropagação.

In:

TORRES, A. C.; CALDAS, L.

C.; BUSO, J.A.

Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.

Brasília:

Embrapa/CNPH, v. 1, 1998, p. 183-260.

GRATTAPAGLIA, D.; ASSIS, T. F.; CALDAS, L. S. Efeito residual de BAP e NAA na

multiplicação e enraizamento

in vitro

Eucalyptus

. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE

CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS, 2., 1987, Brasília, DF.

Resumos...

Brasília: ABCTP/

EMBRAPA-CNPH, 1987.

GUPTA, P. K. Advances in biotechnology of conifers.

Current Science,

Bangalore,

v. 57, n.

12, June 20, p. 629-637, 1988.

HARRY, I. S.; THORPE, T. A.

In vitro

culture of forest trees. In: VASIL, I. K.; THORPE, T. A.

Dordrecht: Kluwer Academic Publishers.

Plant Cell and Tissue Culture

, p. 539-560, 1994.

HARTMANN, H. T.; KESTER, D. E.; DAVIES, F. T.; GENEVE, R. L.

Plant Propagation:

Principles and Pratices.

7 ed. New Jersey: Prentice Hall, 2002.

HARTNEY, V. J. Tissue of Eucalyptus. In: International Plant Propagators Society.

Combined Proceedings

. Seattle, v. 32, p.98-109, 1982.

HSIAO, A. I.; QUICK, W. A. Actions of hypoclorite and hydrogen peroxide on seed dormancy

and germination of wild oats,

Avena fatua

L. Weed Research, Oxford, v.24, p. 411-419,

1984.

HUANG, L-C; HUANG, B-L.; MURASHIGE, T. A Micropropagation protocol for

Cinnamomum

camphora.

In vitro Cellular & Developmental Biology Plant

, Largo,

v. 34, p. 141-146,

1998.

INOUE, M. T. Indução à deiscência de frutos de

Cabralea

sp.

Floresta (Curitiba)

, Curitiba,

v. 9, n. 1, p 14-18, 1978.

JAMES, D. J; PASSEY, A. J.; MALHOTRA, S. B. Organogenesis in callus derived from stem

and leaf tissues of apple and cherry rootstocks. In: JAMES, D. J; PASSEY, A. J.; RUGINI, E.

Journal of Plant Physiology

, Jena, v. 132, p. 148-154, 1988.

KATAOKA, I.; INOUE, H. Factors influencing

ex vitro

rooting of tissue cultured papaya

shoots.

Acta Horticulturae

, Wageningen, v.321, p. 589-597, 1992.

KHATTAK, M. S; MALIK, M.N.; KHAN, M. A. Effect of surface sterilization agents on in vitro

culture of guava (

Psidium guajava

L.) cv sufeda tissue.

Sarhad Journal of Agriculture,

Peshawar, v. 6, n. 2, p. 151-154, 1990.

LEONARDI, C.; RUGGERI, A.; MALFA, S. Hormone effects on in vitro proliferation and

rooting of

Grevillea

explants.

Scientia Horticulturae,

Amsterdam, v. 90, p. 335-341, 2001.

LIEW, T. K.; TEO, C.K.H. Multiple shoot production in vitro of the tropical timber tree,

sentang (

Azadirachta excelsa

Linn.).

Hortscience,

Alexandria, v. 33, n. 6, p. 1073-1075,

1998.

LLOYD, G.; McCOWN, B. H. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel,

Kalmia latifolia

, by use of shoot- tip culture.

International Plant Propagators’ Society

Combined Proceedings of Annual

, Seattle, v. 30. p. 421-427, 1980.

LOPES, S, C.; LAMEIRA, O. A.; FORTES, G. R. L.; NOGUEIRA, P. C.; PINTO, J. E. B. P.

Enraizamento

in vitro

de mogno (

Swietenia macrophylla

King).

Cerne

, Lavras, v. 1, p. 124-

128, 2001.

LORENZI, H.

Árvores Brasileiras:

manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas

nativas do Brasil. São Paulo: Nova Odessa, Ed. Plantarum, v. 1, p. 239, 1996.

LONGHI, R. A.

Livro das árvores e arvoretas do sul.

Porto Alegre: L&PM, p. 51-52, 1995.

LONGHI, R. A.; MARQUES, S. E.; BISSANI, V. Época de colheita, tratamento de sementes

e métodos de semeadura utilizados no viveiro florestal de Nova Prata. In: CONGRESSO

FLORESTAL ESTADUAL, 5, 1984, Nova Prata.

Anais.

Nova Prata: Prefeitura Municipal, v.

2, p. 533-553, 1984.

MARUYAMA, E.;ISHII, K.; SAITO, A.; MIGITA, K. Screening of suitable sterilization of

explants and proper media for tissue culture of eleven tree species of Perú – Amazon Forest.

Journal of Agricultural Science, The Tokyo University of Agriculture

, v. 33, n.4, p. 252-

261, 1989a.

MARUYAMA, E.;ISHII, K.; SAITO, A.; MIGITA, K. Micropropagation of cedro (

Cedrela

odorata

L.) by shoot-tip culture.

Journal of the Japan Forestry society

, v. 71, n.8, p. 329-

331, 1989b.

MARTIN, K. P. Rapid propagation of

Holostemma ada-kodien

Schult., a rare medicinal plant,

through axillary bud multiplication and indirect organogenesis.

Plant Cell Reports,

Berlim, v.

21, n. 2, p. 112-117, 2002.

MATEO-SAGASTA, L. A.

Cultivo

in vitro

de las plantas superiores

. Madrid: Ediciones

Mundi-Prensa, p. 89-94, 1990.

MEI-CHUN, L. Micropropagation of

Morus latifolia

Poilet using axillary buds from mature

trees.

Scientia Horticulturae,

Amsterdam, v. 96, n. 1-4, p. 239-341, 2002.

MERETI, M.; GRIGORIADOU, K.; NANOS, G. D. Micropropagation of the strawberry tree,

Arbutus unedo

Scientia Horticulturae

, Amsterdam, v. 93, p. 143-148, 2002.

MNENEY, E.E.; MANTELL, S. H. Clonal propagation of cashew (

Anacardium occidentale

L.)

by tissue culture.

Journal of Horticultural Science & Biotechnology

, Ashford, n. 77, v. 6,

p. 649-657, 2002.

MOUTHIA, M; DOOKUN, A. Evaluation of surface sterilization and hot water treatments on

bacterial contaminants in bud culture of sugarcane.

Experimental Agriculture

, Cambridge,

v. 35, n. 3, p. 265-274, 1999.

MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco

tissue culture.

Physiologia Plantarum

, Copenhagen,

v. 15, p. 437-497, 1962.

NAIR, L. G.; SEENI, S. Rapid in vitro multiplication and restoration of

Celastrus paniculatus

Willd. Sub sp.

paniculatus

(Celastraceae), a medicinal woody climber.

Indian Journal of

Experimental Biology

, New Delhi, v. 39, v. 7, p. 697-704, 2001.

NUNES, E. C.; CASTILHO, C. V.; MORENO, F. N.; VIANA, A. M. In vitro culture of

Cedrela

fissilis

Vellozo (Meliaceae).

Plant Cell, Tissue and Organ Culture.

Dordrecht: Kluwer

Academic Publishers, v. 70, p. 259-268, 2002.

NUNES, J. C. O.; BARPP, A.; SILVA, F. C.; PEDROTTI, E. Micropropagação do porta-

enxerto ‘Marubakaido’ (

Malus prunifolia

) a partir da cultura de meristemas.

Revista

Brasileira de Fruticultura

, Jaboticabal, v. 21, n.2, p. 191-195, 1999.

ORLIKOWSKA, T. K.; DYER, W. E. In vitro regeneration and multiplication of safflower

(

Carthamus tinctorius

L.).

Plant Science (Limerich),

Limerich, v. 93, p. 151-157, 1993.

PRADHAN, C.; KAR, S.; PATTNAIK, S.; CHAND, P. H. Propagation of

Dalbergia sisso

Roxb.

Through in vitro shoot proliferation from cotyledonary nodes.

Plant Cell Reports

, Berlim, v.

18, n. 1-2, p. 122-126, 1998.

REITZ, R.; KLEIN, R. M.; REIS, A. Projeto madeira do Rio Grande do Sul.

Sellowia,

Itajaí, n.

34/35, p. 246-253, 1983.

RUDRA, J.; JUWARKAR, A. S. In vitro multiplication of

Punica granatum

Linn. CV GBG-1

(Ganesh), through axillary bud cultures.

Advances in Plant Sciences

, Muzaffarnagar, v. 15,

n. 1, p. 5-10, June, 2002.

SAADAT, Y. A.; HENNERTY, M. J. Factors affecting the multiplication of Persian walnut

(

Juglans regia

L.)

Scientia Horticulturae

, Amsterdam, v. 95, p. 251-260, 2002.

SCUTTI, M. B.

Propagação vegetativa da guabirobeira (

Campomanesia

nthocarpa

Berg.) in vitro e por estaquia

. Curitiba, 1999. 95 f. Dissertação (Mestrado em Produção

Vegetal) – Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná.

SHAHZAD, A.; SIDDIQUI, S. Micropropagation of

Melia azedarach

Phytomorphology

Delhi, v. 51, n. 2, p. 151-154, 2001.

SHARMA, A. R.; TRIGIANO, R. N.; WITTE, W. T.; SCHWARZ, O. T. In vitro adventitious

rooting of

Cornus florida

microshoots. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 103, p.381-385,

2005.

SHEKHAWAT, M. S.; RACHERE, T.S; SINGH, R. P.; DOERA, N. S.; RAO, S. R. Factors

affecting in vitro propagation of

Prosapis cineraria.

Plant Growth Regulation

, Dordrecht,

v.12, p. 273-280, 1997.

SCHOTTZ, E. S.

Micropropagação do mogno (

Swietenia macrophylla

King) a partir de

material juvenil.

Curitiba, 2003. 56 f. Dissertação (Mestrado em Botânica) – Setor de

Ciências Biológicas, Universidade Federal do Paraná.

TAIZ, L; ZEIGER, E.

Fisiologia vegetal

. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, 2004.

TORRES, A. C.; CALDAS, L. C.; BUSO, J.A.

Cultura de tecidos e transformação genética

de plantas.

Brasília: Embrapa/CNPH, v. 1, 1998 e v 2, 1999.

TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; SÁ, F. G.; BUSO, J. A.;CALDAS, L. S.; NASCIMENTO,

A. S.; BRÍGIDO, M. M.; ROMANO, E.

Glossário de Biotecnologia Vegetal

. Brasília:

Embrapa Hortaliças, 2000.

TRAUTMANN, I. A.; VISSER, J. H. An in vitro study of organogenesis in guayule

(

Parthenium argentatum

Gray).

Plant Science (Limerich)

, Limerich, v. 72, p. 275-281, 1990.

VANKOVA, R.; HSIAO, K-C.; BORNMAN C. H.; GAUDINOVA, A. Effects of synthetic

cytokinins and respiration patterns of

Beta vulgaris

cells in suspension.

Journal of Plant

Growth Regulation

, New York, v. 10, p. 197-199, 1991.

VENGADESAN, G.; GANAPATHI, A.; AMUTHA, S.; SELVARAJ, N. In vitro propagation of

Acacia

species - a review.

Plant Science (Limerich)

, Limerich, v. 163, p. 663-671, 2002.

VENKETESWARAN, S.; DIAS, M. D. L.; SULTANBAWA, F.; WEYERS, U. V. Tissue culture

studies on mahogany tree,

Swietenia.

Somatic Cell Genetics of Woody Plants. In: IUFRO

Working Party S 2.

Proceedings,

n. 04-07, 1987. Federal Republic of Germany:

Grosshansdorf: Federal Research Centre for Forestry and Forestry Products / Institute of

Forest Genetics and Forest Tree Breeding. p. 147-153.

VILA, S.; SCOCCHI, A.; MROGINSKI, L. Plant regeneration from shoot apical meristems of

Melia azedarach

L. (Meliaceae).

Acta Physiologiae Plantarum

Cracow,

v. 24, n. 2, p. 195-

199, 2002.

VOYIATZI, C.; VOYIATZIS, D. G. In vitro shoot proliferation rate of

Dieffenbachia exotica

cultivar ‘Mariana’ as affected by cytokinins, the number of recultures and the temperature.

Sciencia Horticulturae

, Amsterdam,

v.40, p. 163-169, 1989.

YOUSEF, S. A.; FATTAH, F. A. Propagation of neem plant (

Azadirachta indica

L.) by tissue

culture (research note).

Dirasat Agricultural Sciences

, Amman, v. 26, n. 2, p. 287-291,

1998.

YASSEN, M-J. ; SHERYL, A. B.; SCHNELL, R. J.; SPLITTSTOESSER, W. E.

In vitro

shoot

proliferation and propagation of guava (

Psidium guajava

L.) from germinated seedlings.

Plant Cell Reports

, Berlin, v. 14, p. 525-528, 1995.

ZANON, A.; CARPANEZZI, A. A. Armazenamento de sementes de

Cabralea glaberrima

Jusseiu – Resultados preliminares. In: CONGRESSO FLORESTAL BRASILEIRO, v.7, 1993.

Curitiba.

Anais...

Curitiba: Sociedade Brasileira de Silvicultura, Sociedade Brasileira de

Engenheiros Florestais, v.1, p. 223-224, 1993.

FIGURAS

FIGURA 1 - Frutos de Cabralea canjerana: 1º - com três fissuras e parcialmente

aberto, 2º - com cinco fissuras; 3º - com cinco fissuras e totalmente

aberto.

FIGURA 2 - Fruto aberto, sementes recobertas pelo arilo alaranjado e sementes

isoladas sem o arilo de Cabralea canjerana.

FIGURA 3 - Plântula germinada in vitro, com radícula, cotilédones e parte aérea,

recoberta pelo tegumento que envolvia a semente.

FIGURA 4 - Segmento apical (acima) e segmento nodal.

FIGURA 5 - Segmentos nodais em meio de

cultura MS com 2,5 µM de BAP (após 30

dias no cultivo inicial).

FIGURA 7 - Segmento nodal com gemas

axilares, em meio de cultura MS com BAP

(2° subcultivo)

FIGURA 8 - Segmentos nodais em meio de

cultura MS com BAP (3

subcultivo)

FIGURA 6 - Segmento nodal com as

gemas axilares em desenvolvimento,

depois de 30 dias (1° subcultivo).

FIGURA 11 - Segmento nodal retirado de rebrota, no 3º subcultivo em meio de

cultura MS com BAP+ 2-iP.

FIGURA 9 - Aspecto da rebrota, originada da gema do nó cotiledonar, com 80 dias

de idade.

FIGURA 10 - Segmentos nodais retirados de rebrotas, em meio de cultura MS adicionado de

BAP 2,5

M (1º subcultivo).

ANEXOS

FIGURA 13 - Segmento nodal em

meio de cultura WPM com 5,0 µM

de BAP (2° subcultivo)

FIGURA 15 - Broto com raízes, após 30 dias em meio

WPM adicionado de IBA

FIGURA 12 - Segmentos nodais em meio

de cultura MS adicionado de 5,0

M de 2-iP

(2° subcultivo)

FIGURA 14 - Segmento apical com uma raiz na base, em

meio de cultura WPM sem fitorreguladores

(após 30 dias no cultivo inicial)

ANEXOS

ANEXO 1 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA E DO TESTE DE BARTLETT PARA DESINFESTAÇÃO DE

SEMENTES DA

Cabralea canjerana

UTILIZANDO TRÊS CONCENTRAÇÕES DE

HIPOCLORITO DE SÓDIO EM DOIS TEMPOS

Fonte de Variação

Graus de Liberdade

Quadrado Médio

Repetição

Tratamentos

Erro Experimental

Total

0,053

0,108 *

0,037

Teste de Bartlett- x

2,862

Coeficiente de Variação

13%

ns - não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* - significativo ao nível de 5% de probabilidade

ANEXO 2 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA E DO TESTE DE BARTLETT PARA GERMINAÇÃO DE

SEMENTES, AOS 7 DIAS, DE

Cabralea canjerana

DESINFESTADAS EM SEIS

CONCENTRAÇÕES DE HIPOCLORITO DE SÓDIO

Fonte de Variação

Graus de Liberdade

Quadrado Médio

Repetição

Tratamentos

Erro Experimental

Total

0,035

0,130 *

0,047

Teste de Bartlett- x

4,300

Coeficiente de Variação

16%

ns - não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* - significativo ao nível de 5% de probabilidade

ANEXO 3 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA E DO TESTE DE BARTLETT PARA GERMINAÇÃO DE

SEMENTES, AOS 14 DIAS, DE

Cabralea canjerana

DESINFESTADAS EM SEIS

CONCENTRAÇÕES DE HIPOCLORITO DE SÓDIO

Fonte de Variação

Graus de Liberdade

Quadrado Médio

Repetição

Tratamentos

Erro Experimental

Total

0,026

0,369 **

0,027

Teste de Bartlett- x

3,319

Coeficiente de Variação

11%

ns - não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* - significativo ao nível de 5% de probabilidade

** - significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 4 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA TAXA DE MULTIPLICAÇÃO DE CANJARANA

UTILIZANDO SEGMENTOS NODAIS E APICAIS CULTIVADOSEM MEIO DE

CULTURA MS, COM CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO INICIAL E NOS

QUATRO SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

Cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,496**

0,060**

0,983**

0,034*

0,046*

Concentrações de BAP

0,493**

0,622**

0,641**

0,054**

0,022*

Segmento X BAP

0,211**

0,367**

0,297**

0,031**

0,010

Erro Experimental

0,009

0,005

0,007

0,006

Total

Teste de Bartlett-x

11,443

14,640

13,322

7,339

5,919

Coeficiente de Variação

8,15%

6,07%

6,01%

8,20%

7,17%

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 5 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS DE

CANJARANA UTILIZANDO SEGMENTOS NODAIS E APICAIS CULTIVADOS EM MEIO

DE CULTURA MS, COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, NOS 5 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

Cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,053*

0,154**

0,307**

0,362**

0,103**

Concentrações de BAP

0,204**

0,073**

0,131**

0,224**

0,069**

Segmento X BAP

0,024

0,065**

0,069**

0,141**

0,040**

Erro Experimental

0,009

0,012

0,010

0,009

Total

Teste de Bartlett-x

11,69

7,98

12,14

11,15

9,54

Coeficiente de Variação

9,19%

8,58%

9,77%

8,95%

9,03%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1).

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

– não significativo

ANEXO 6 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE

OBTIDOS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA,

CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA MS, COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE

BAP, NOS 5 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,134*

0,260**

0,916**

1,079**

0,446**

Concentrações de BAP

0,250**

0,053**

0,310**

0,443**

0,195**

Segmento X BAP

0,043**

0,041**

0,182**

0,263**

0,093**

Erro Experimental

0,009

0,006

0,009

0,012

Total

Teste de Bartlett-x

14,99

4,50

15,61

13,34

15,21

Coeficiente de Variação

8,65%

7,47%

8,51%

9,40%

9,74%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1).

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 7 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES MORTOS OBTIDOS A

PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA, CULTIVADOS EM

MEIO DE CULTURA MS, COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO

INICIAL E NOS SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,138**

0,049*

0,051**

0,098*

0,050*

Concentrações de BAP

0,380**

0,624**

0,014*

0,184**

0,207**

Segmento X BAP

0,108**

0,119**

0,013

0,073**

0,024*

Erro Experimental

0,007

0,009

0,006

0,011

0,005

Total

Teste de Bartlett-x

8,444

13,935

6,245

12,790

6,886

Coeficiente de Variação

7,56%

7,70%

7,52%

9,84%

6,40%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1)

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 8 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A COMPARAÇÃO DAS TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO

OBSERVADAS EM SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA, CULTIVADOS

EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO CULTIVO

INICIAL E NOS QUATRO SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,116**

0,036*

0,869**

0,000

0,001

Concentrações de 2-iP

0,309**

0,084**

0,196**

0,000

0,001

Segmento X 2-iP

0,060**

0,018**

0,171**

0,000

0,001

Erro Experimental

0,009

0,007

0,004

Total

Teste de Bartlett-x

14,376

5,784

4,048

12,883

14,857

Coeficiente de Variação

8,07%

7,67%

7,29%

6,02%

6,67%

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 9 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A COMPARAÇÃO DA PERCENTAGEM DE

EXPLANTES COM BROTOS OBSERVADOS EM SEGMENTOS NODAIS E APICAIS

DE CANJARANA, CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E EM 3 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

Cultivo inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,039*

0,311**

0,133**

0,009

Concentrações de BAP

0,096**

0,049**

0,242**

0,008

Segmento X BAP

0,018

0,026

0,033*

0,003

Erro Experimental

0,008

0,013

0,009

0,008

Total

Teste de Bartlett-x

4,331

13,645

10,125

13,304

Coeficiente de Variação

8,35%

10,36%

8,85%

9,03%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 10 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A COMPARAÇÃO DO NÚMERO MÉDIO DE BROTOS

POR EXPLANTE FORMADOS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE

CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA MS COM CINCO

CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NO CULTIVO INICIAL E NOS 3 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

Cultivo inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,126**

0,825**

1,353**

0,013

Concentrações de BAP

0,060**

0,232**

0,320**

0,033**

Segmento X BAP

0,060**

0,198**

0,254**

0,006

Erro Experimental

0,009

0,012

0,009

0,008

Total

Teste de Bartlett-x

13,663

13,833

12,769

9,069

Coeficiente de Variação

9,02%

9,94%

8,39%

8,82%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

NOTA 2: No 4º subcultivo não observada a presença de brotos

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 11 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES MORTOS OBTIDOS A

PARTIR SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO

DE CULTURA MS COM CINCO CONCENTRAÇÕES DE 2-iP, NOS CINCO

SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,009

0,217

0,580**

0,049*

0,139**

Concentrações de 2-iP

0,046**

0,218**

0,070**

0,108**

0,119**

Segmento X 2-iP

0,074**

0,058

0,090**

0,031*

0,094**

Erro Experimental

0,011

0,030

0,010

0,009

0,008**

Total

Teste de Bartlett-x

16,168

15,283

13,484

5,655

7,412

Coeficiente de Variação

9,87%

14,98%

8,78%

8,77%

8,46%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1)

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 12 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA TAXA DE MULTIPLICAÇÃO EM SEGMENTOS NODAIS

DE REBROTAS DE CANJARANA, EM MEIO DE CULTURA MS COM TRÊS

TRATAMENTOS (2-iP, BAP e BAP+ 2-iP), NO CULTIVO INICIAL E NOS

SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Repetição

0,006

0,009

0,020

0,028

0,004

Tratamentos

0,160 **

0,251 **

0,751 **

0,088

0,012

Erro Experimental

0,012

0,009

0,017

0,027

0,009

Total

Teste de Bartlett-x

1,912

1,02

3,43

0,898

0,189

Coeficiente de Variação

9,57%

7,85%

9,50%

14, 20%

8,88 %

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 13 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DAS PERCENTAGENS DE EXPLANTES COM BROTOS

OBTIDOS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS DE CANJARANA

EM MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP e BAP+ 2-iP),

NO CULTIVO INICIAL E NOS QUATRO SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Repetição

0,038

0,093

0,031

0,075

0,046

Tratamentos

0,313 *

0,295 *

0,103

0,082

0,225 **

Erro Experimental

0,068

0,091

0,032

0,071

0,015

Total

Teste de Bartlett-x

2,702

4,831

2,550

0,454

2,433

Coeficiente de Variação

21,3%

24,7%

15,0%

21,2%

10,4%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1)

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 14 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTES

FORMADOS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS DE CANJARANA

EM MEIO DE CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP e BAP+ 2-iP),

NO CULTIVO INICIAL E NOS QUATRO SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Repetição

0,006

0,008

0,059

0,099

0,087

Tratamentos

0,501 **

0,144 *

0,605 **

0,250

0,117

Erro Experimental

0,008

0,024

0,031

0,084

0,132

Total

Teste de Bartlett-x

2,831

3,528

2,561

1,336

0,734

Coeficiente de Variação

7,07%

12,8%

21,6%

29,4%

NOTA: Os dados foram transformados para (x+1)

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 15 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES MORTOS OBTIDOS A

PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS DE REBROTAS DE CANJARANA EM MEIO DE

CULTURA MS, COM TRÊS TRATAMENTOS (2-iP, BAP e BAP+ 2-iP), NOS QUATRO

SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

subcultivo

Repetição

0,017

0,005

0,018

Tratamentos

0,588 **

0,151 **

0,267 **

0,008

Erro Experimental

0,006

0,009

0,006

0,015

Total

Teste de Bartlett-x

0,490

2,353

2,026

2,935

Coeficiente de Variação

6,62%

8,29%

6, 67%

10,96%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

NOTA 2: Não foi realizada análise estatística para o cultivo inicial, pois todos os valores dos dados eram nulos.

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 16 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DAS TAXAS DE MULTIPLICAÇÃO OBSERVADAS EM

SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA CULTIVADOS EM MEIO DE

CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO INICIAL E

NOS QUATRO SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo

inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,024

0,015

0,077**

0,004

0,017

Concentrações de BAP

0,244**

0,043

0,037**

0,021 *

0,006

Segmento X BAP

0,024

0,014

0,025*

0,002

0,006

Erro Experimental

0,012

0,015

0,005

0,006

0,007

Total

Teste de Bartlett-x

7,617

9,791

3,306

4,358

2,333

Coeficiente de Variação

10,40%

11,73%

6,77%

7,38%

8,27%

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 17 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES COM BROTOS

UTILIZANDO SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA CULTIVADOS EM

MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NO CULTIVO

INICIAL E NOS 3 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,208**

0,007

0,075**

0,000

Concentrações de BAP

0,052**

0,171**

0,027*

0,011

Segmento X BAP

0,052**

0,006

0,027*

0,006

Erro Experimental

0,09

0,018

0,008

0,010

Total

Teste de Bartlett-x

6,10

9,04

3,36

3,19

Coeficiente de Variação

9,07%

11,91%

8,67%

9,44%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

NOTA 2: Não foi observada a presença de explantes com brotos no 4 º subcultivo

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 18 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DO NÚMERO MÉDIO DE BROTOS POR EXPLANTE

OBTIDOS A PARTIR DE SEGMENTOS NODAIS E APICAIS DE CANJARANA

CULTIVADOS EM MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE

BAP, NO CULTIVO INICIAL E NOS 3 SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

cultivo inicial

subcultivo

Tipo de Segmento

0,525**

0,047

0,057**

0,000

Concentrações de BAP

0,133**

0,251**

0,022*

0,008

Segmento X BAP

0,133**

0,033

0,014

0,002

Erro Experimental

0,010

0,016

0,006

Total

Teste de Bartlett-x

14,99

4,50

15,61

13,34

Coeficiente de Variação

9,25%

11,39%

7,13%

7,74%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

NOTA 2: Não foi observada a presença de brotos no 4 º subcultivo

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

ANEXO 19 - ANÁLISE DE VARIÂNCIA DA PERCENTAGEM DE EXPLANTES MORTOS EM

SEGMENTOS NODAIS (SN) E APICAIS (SA) DE CANJARANA CULTIVADOS EM

MEIO DE CULTURA WPM COM TRÊS CONCENTRAÇÕES DE BAP, NOS QUATRO

SUBCULTIVOS

Quadrado Médio

Fonte de Variação

Graus de

Liberdade

subcultivo

Tipos de Segmento

0,001

0,044

0,060*

Concentrações de BAP

0,004

0,001

0,053*

0,024

Segmento X BAP

0,011

0,001

0,024

0,015

Erro Experimental

0,007

0,004

0,014

0,009

Total

Teste de Bartlett-x

3,140

1,651

9,862

10,186

Coeficiente de Variação

8,44%

6,35%

10,83%

9,01%

NOTA 1: Os dados foram transformados para (x+1)

NOTA 2: Não foi realizada análise estatística para o cultivo inicial, pois todos os valores dos dados eram nulos.

– Não significativo ao nível de 5% de probabilidade

* – significativo ao nível de 5% de probabilidade

** – significativo ao nível de 1% de probabilidade

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 