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Angela Falcai
“ASSOCIAÇÃO ENTRE
POLIMORFISMOS EM GENES DA
RESPOSTA IMUNE E O
DESENVOLVIMENTO DA
TOXOPLASMOSE OCULAR”
2006
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ANGELA FALCAI
“ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS
EM GENES DA RESPOSTA IMUNE E O
DESENVOLVIMENTO DA TOXOPLASMOSE
OCULAR”
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Área de concentração:
Imunologia
Orientador:
Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo
São Paulo
2006
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ANGELA FALCAI
“ASSOCIAÇÃO ENTRE POLIMORFISMOS
EM GENES DA RESPOSTA IMUNE E O
DESENVOLVIMENTO DA TOXOPLASMOSE
OCULAR”
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo,
para obtenção do Título de
Mestre em Ciências
(Imunologia).
São Paulo
2006
DEDICATÓRIA
À minha mãe Cleonice e irmãs
Tânia e Márcia pelo carinho e
apoio incondicionais durante
toda a minha vida! Meus
agradecimentos pela educação
sempre primorosa!
Ao Jorge, pelo amor, carinho,
apoio e paciência!
Muito obrigada.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Luiz Vicente Rizzo por ter me acolhido em seu laboratório e proporcionado
uma tão profícua experiência, sem a qual não teria aprendido o que é imunologia.
Meus sinceros agradecimentos.
Aos colaboradores Dr. Cláudio Silveira e sua equipe, Prof. Jorge Kalil, Profa. Dra.
Anna Carla Goldberg, Dr. Rajendranath Ramasawmy, que possibilitaram a
realização desse trabalho.
Aos amigos do laboratório de Imunologia Clínica:
Alessandra Commodaro, Gisele Baracho, Ivo Marguti, Jean Estige, Julieta Genre,
Lília Rios, Luciana de Deus, Miguel, Natália Nepomuceno, Paolo Errante, Rafael
Larocca, Tatiana Takishi pela convivência e experiências compartilhadas. A nossa
“secretária” Laudicéia de Almeida por sua disposição e eficiência com que resolve
qualquer problema. As nossas técnicas, Áurea e Cristina por sempre estar dispostas
a ajudar. E ao nosso ex-técnico de laboratório Ulisses Rodrigues pela sua amizade.
A todos amigos da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo do
laboratório de Imunologia por terem me acolhido no laboratório para realização dos
experimentos que fizeram parte deste trabalho.
Aos amigos Julieta Genre, Rafael Larocca pela paciência e Gisele Baracho, Paolo
Errante pela amizade, carinho, apoio e por todos os momentos que passamos
juntos. Obrigada.
Aos amigos Alexandra, Érica, Juliana, Lucas, Henrique, Alex, Axel, Ricardo que ao
longo do tempo foram grande amigos e ótimas companhias nos momentos mais
inusitados e aos pós-graduandos do Departamento de Imunologia do Instituto de
Ciência Biomédicas da Universidade de São Paulo pela convivência.
Aos professores do Departamento de Imunologia do ICB por todo carinho e auxílio
durante a minha formação.
Ao Prof. João Gustavo Pessini Amarante-Mendes por compartilhar conosco seus
conhecimentos e manter as portas de seu laboratório sempre abertas para
utilizarmos equipamentos e materiais sempre que necessário. E todos os seus
estudantes por nos receberem gentilmente e sempre dispostos a nos ajudar, além
da amizade e respeito.
Ao Prof. Antonio Condino Neto por me aceitar como aluna de doutorado em seu
laboratório. Espero aprender muito com você.
Aos amigos Valéria, Eni, Jotelma pela amizade e assitência.
Aos amigos Otacílio, Milton, Móises e a todos os funcionários do ICB que tive o
prazer de conviver todos estes anos.
Aos funcionários da Biblioteca da ICB pela disponibilidade e serviços prestados.
Ás minhas irmãs Márcia e Tânia e meus sobrinhos Bianca, Letícia e Matheus por
todo carinho e amor. Devo muito esta conquista ao seu incentivo, respeito e apoio,
pois sem vocês esta etapa jamais teria se concretizado. Obrigado por tudo, amo
muito vocês.
E a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para que este estudo
fosse concluído.
À Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de São Paulo pela Bolsa de
Mestrado.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Á Dra. Adriana Lima Vallochi, orientadora, conselheira, amiga. Obrigado
por tudo. Agradeço primeiramente, por ter acreditado em mim, por ter
me ensinado a pensar cientificamente e por sua enorme contribuição,
em minha evolução como profissional e ser humano. Pude chegar à reta
final desse trabalho, em virtude da sua paciência, dedicação e carinho.
Devo somente a Deus por ter lhe colocado em meu caminho. Jamais
poderei esquecê-la.
O sonho é uma porta estreita, dissimulado no
que tem a alma de mais obscuro e de mais
íntimo; abre-se sobre a noite original e
cósmica que pré-formada a alma muito antes
da existência da consciência do eu e que
perpetuará até muito além do que posso
alcançar a consciência individual.
Jung.
RESUMO
A Toxoplasmose é causada pelo protozoário Toxoplasma gondii.
Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada com o T. gondii. Em
regiões endêmicas, como na região de Erechim, Rio Grande do Sul, Brasil, cerca de
90% da população está infectada pelo T. gondii e 18% destes indivíduos apresentam
lesões oculares, denominadas retinocoroidite toxoplásmica.
Resultados de nosso grupo de pesquisa sugerem que a resistência ao
desenvolvimento de lesões oculares em seres humanos está relacionada com a
secreção de IL-12 e IFN-γ e que a suscetibilidade está associada à produção de
IL-1, TNF-α e IL-10. Dados recentes sugerem a participação de Toll like receptors na
produção de IL-12 e da molécula de MBL na opsonização e fagocitose de parasitas.
Considerando a importância da IL-12 e outras citocinas e seus receptores para o
desenvolvimento da resposta imune, nós investigamos uma possível associação
entre polimorfismos genéticos nestes genes e toxoplasmose ocular.
Foram avaliados 99 voluntários com toxoplasmose ocular na Clínica
Silveira em Erechim, RS. Avaliamos também 39 indivíduos soronegativos (IgM e
IgG) para T. gondii e 61 indivíduos soropositivos sem lesão ocular. As associações
dos polimorfismos nos genes de TNFA (G308A e G238A), IL-12p40 (A1188C), TLR2
(Arg753Gln), TLR4 (Asp299Gly), TLR5 (R392Stop) e MBL (-550, -221, +4, codon 52,
54 and 57 no exon 1) e a retinocoroidite causada pelo T. gondii foram avaliados
através da técnica de PCR-RFLP.
De acordo com o teste de Fischer´s, não existem diferenças estatísticas
dos resultados encontrados entre os grupos estudados. Em função dos resultados
obtidos nesse trabalho, sugerimos que os polimorfismos analisados nos genes de
TNFA, IL-12p40, MBL e TLR 2, 4, 5, não têm associação à lesão ocular causada por
T. gondii no grupo em estudo.
ABSTRACT
Toxoplasmosis is caused by the intracellular protozoan Toxoplasma
gondii. It is estimated that one third of the world population is infected with T. gondii.
In endemic regions as Erechim in Rio Grande do Sul, Brazil, around 90% of the
population is infected with the parasite, and 18% of these individuals present ocular
lesions, denominated toxoplasmic retinochoroiditis.
Results of our group suggested that resistance to development of ocular
lesion in humans is associated to IL -12 and IFN-γ secretion and that susceptibility is
associated to the IL-1, TNF-α and IL-10 production. Recent data suggest that Toll
like receptors are involved in IL-12 production and the MBL molecule is important for
opsonization and phagocytosis of parasites. Considering the importance of IL-12 and
other cytokines and their receptors for development of immune responses we
investigated the possible association between genetic polymorphisms in these genes
and ocular toxoplasmosis.
Ninety nine volunteers with acquired ocular toxoplasmosis were evaluated
at Dr. Silveira´s Clinic in Erechim city. We have also evaluated thirty nine relatives of
the patients who had negative antibody titers (IgM and IgG) for T. gondii and sixty
one seropositive individuals without ocular lesion. The association of the
polymorphisms in the genes of TNFA (G308A and G238A), IL-12p40 (A1188C),
TLR2 (Arg753Gln), TLR4 (Asp299Gly), TLR5 (R392Stop) and MBL (-550, -221, +4,
codon 52, 54 and 57 in exon 1) and the retinochroroiditis caused for the T. gondii
was analyzed through PCR-RFLP technique.
Statistical analysis of the results using Fisher´s test showed no difference
between the groups. In function of the results obtained, we suggest that the
polymorphisms analyzed in TNFA, IL-12p40, MBL and TLR 2, 4, 5 genes present no
association with ocular toxoplasmosis in our group of study.
SUMÁRIO
1-INTRODUÇÃO........................................................................................17
2- OBJETIVO ............................................................................................. 34
3 - MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................... 35
3.1 - PACIENTES........................................................................................................................................................35
3.2- EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO .......................................................................................................................36
3.3- REAÇÕES DE PCR-RFLP (POLYMERASE CHAIN REACTION – RESTRICTION FRAGMENT LENGTH
POLYMORPHISM)......................................................................................................................................................38
3.3.1- Condições de amplificação.......................................................................................................................39
3.4-ANÁLISE ESTATÍSTICA .......................................................................................................................................40
4- RESULTADOS ...................................................................................... 42
4.1- ANÁLISE DE POLIMORFISMO NOS GENES DAS CITOCINAS TNF-α E IL-12P40.....................................................43
4.2- ANÁLISE DE POLIMORFISMO NOS GENES TLRS..................................................................................................52
4.3- ANÁLISE DE POLIMORFISMOS NO GENE MBL....................................................................................................62
5 - DISCUSSÃO......................................................................................... 80
6- CONCLUSÕES...................................................................................... 92
7- REFÊRENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................... 93
8-
ANEXOS......................................................................................103
1-INTRODUÇÃO
A toxoplasmose é causada pelo protozoário Toxoplasma gondii, um
parasita intracelular obrigatório amplamente disseminado em todo o mundo. Estima-
se que um terço da população mundial tenha sido exposta ao T. gondii (Tenter et al.,
2000).
A soroprevalência estimada em populações humanas varia bastante entre
países, entre diferentes áreas geográficas dentro do mesmo país e entre diferentes
grupos étnicos vivendo na mesma área. As soroprevalências são maiores na
América Latina (51% a 72%: Argentina, Brasil, Cuba, Jamaica e Venezuela) e na
África Ocidental (54% a 77%: Benin, Camarões, Congo, Gabão e Togo)
provavelmente pelo clima quente e úmido e pelo hábito alimentar da população. As
menores soroprevalências foram encontradas no sudoeste da Ásia, China e Coréia
(4 a 39%) e em países de clima frio como, os países da Escandinávia (11 a 28%)
(Tenter et al., 2000).
O T. gondii apresenta três formas de vida: os esporozoítos presentes nos
oocistos, os bradizoítas formando os cistos teciduais e os taquizoítas, intra e
extracelulares. As três formas são infecciosas tanto para os hospedeiros
intermediários como para os definitivos. Os hospedeiros definitivos são membros da
família dos felídeos, sendo o gato doméstico o mais importante. Todos os animais
homeotérmicos podem ser hospedeiros intermediários, inclusive os seres humanos.
Os hospedeiros intermediários se infectam ingerindo alimentos contaminados com
cistos ou oocistos. Enzimas digestivas do trato gastrintestinal dos hospedeiros atuam
nos cistos e oocistos liberando os bradizoítas e esporozoítos, respectivamente.
Ambos se convertem em taquizoítas, entram na circulação sanguínea e se
disseminam pelo organismo. A transmissão da toxoplasmose pode ser vertical,
através de taquizoítas que passam pela placenta da mãe infectada para o feto
(toxoplasmose congênita), ou horizontal através da ingestão de vegetais e água
contaminados por oocistos e pela ingestão de carne de suínos, ovinos ou de aves
contaminadas com cistos (toxoplasmose adquirida) (Tenter et al., 2000).
Há um equilíbrio dinâmico entre o parasita e o hospedeiro. Clinicamente a
infecção pelo T. gondii pode ser assintomática ou sintomática, que variam na
dependência do status imunológico do indivíduo, sendo uma importante causa de
aborto, retardo mental, encefalite e cegueira (Holland, 1999). Uma infecção crônica é
mantida com a presença de cistos formados em praticamente todos os tecidos,
podendo causar encefalite toxoplásmica e toxoplasmose ocular (Jacobs et al., 1960).
As lesões oculares causadas pelo T. gondii podem ser decorrentes tanto da infecção
congênita quanto da infecção adquirida (Holland et al., 1998).
A toxoplasmose ocular corresponde aproximadamente a 50% das uveítes
infecciosas diagnosticadas no Brasil. É a segunda maior causa de morbidade ocular
em indivíduos com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Pacientes
imunocompetentes apresentam doença recorrente, podendo resultar na destruição
da retina com perda da visão (Boyer, 1996).
Na região endêmica de Erechim, RS, cerca de 90% dos indivíduos da
população são soropositivos para T. gondii, sendo que 18% destes apresentam
lesões oculares (Glasner et al., 1992). Nesta região foram descritos inúmeros casos
de infecção pós-natal (Silveira et al., 1988; Glasner et al., 1992) e, recentemente, um
estudo dos riscos da infecção nos EUA concluiu que pelo menos dois terços dos
casos de toxoplasmose ocular foram causados pela infecção adquirida (Gilbert et al.,
2000).
Nosso grupo vem investigando a toxoplasmose ocular na região Sul do
Brasil e pelo acompanhamento e diagnóstico diferencial da toxoplasmose ocular
adquirida e toxoplasmose ocular congênita, pudemos elucidar algumas
características da resposta imunológica destes pacientes ao parasita. Nossos dados
sugerem que a susceptibilidade ao desenvolvimento da lesão ocular está associada
à produção de citocinas como TNF-α, IL-1 e IL-10, ao passo que indivíduos
soropositivos sem lesão apresentaram altos níveis de IL-12 e IFN-γ, demonstrando a
resistência ao desenvolvimento da lesão ocular (Yamamoto et al., 2000).
O TNF-α é uma proteína homotrímera de 17 kDa constituída por 157
aminoácidos. Em humanos, o gene que codifica esta proteína está localizado no
cromossomo 6 (Muller et al., 1987). O TNF-α é produzido principalmente por
macrófagos, linfócitos T e células natural killer (NK). Esta citocina pode ser
produzida em pequenas quantidades por outros tipos celulares, incluindo
fibroblastos, células dos músculos lisos e células tumorais (Bemelmans et al., 1996).
TNF-α estimula o recrutamento de neutrófilos e monócitos para os sítios
inflamatórios, fazendo com que células endoteliais vasculares expressem em sua
superfície novos receptores que tornam a superfície endotelial adesiva para os
leucócitos e estimulam células endoteliais e macrófagos a secretarem quimiocinas
induzindo a quimiotaxia e recrutamento de leucócitos. Não obstante, o TNF-α induz
macrófagos a secretarem IL-1, a qual atua de maneira semelhante ao TNF-α, além
de ativar diferentes tipos celulares para a erradicação de eventuais microrganismos
existentes no tecido inflamado (Bemelmans et al., 1996).
A literatura científica aponta um papel controverso do TNF-α na reposta
imune contra o T. gondii. No modelo experimental murino, alguns autores
demonstraram que TNF-α tem papel importante na resistência à toxoplasmose tanto
na forma crônica quanto na aguda (Chang et al., 1990; Johnson, 1992). Além disso,
foi demonstrada a ação combinada de IFN-γ e TNF-α no controle da replicação do
parasita através da ativação de macrófagos (Suzuki et al., 1989; Gazzinelli et al.,
1992; Gazzinelli et al., 1993; Scharton-Kersten et al., 1996). Entretanto, foi
demonstrado por outros autores que altos níveis desta citocina contribuem para o
dano hepático e cerebral (Beaman et al., 1992; Marshall et al., 1999) e que a
produção de TNF-α está associada à disseminação do T. gondii no cérebro de
camundongos (Grau et al., 1992).
Diferentes relatos na literatura têm apontado a importância do
polimorfismo genético na resposta imune e que o mesmo pode estar associado a
uma maior ou menor suscetibilidade ao desenvolvimento ou resistência a diferentes
doenças.
Dois polimorfismos na região promotora do gene de TNFA foram
descritos, um presente na posição -308 (Wilson et al., 1997) e outro na posição -238
(Kaluza et al., 2000). Estes polimorfismos estão associados respectivamente, ao
desenvolvimento assintomático e sintomático de leishmaniose após infecção por
Leishmania chagasi (Karplus et al., 2002) e ao desenvolvimento de asma na
população japonesa (Noguchi et al., 2001). Além disso, o polimorfismo na posição
-308 no gene de TNFA está associado à redução da sobrevida em pacientes
brasileiros com cardiopatia grave pela doença de Chagas (Drigo et al., 2005).
Entretanto, outros autores demonstraram não existir uma associação de
suscetibilidade às doenças e polimorfismo de TNFA -238A e -308A, como observado
em pacientes japoneses com doenças auto-imunes como, Psoriasis vulgaris,
Psoriatic arthritis ou Pustular psoriasis (Nishibu et al., 2002) ou pacientes da Turquia
com febre reumática aguda (Berdeli et al., 2006).
É amplamente aceito que o IFN-γ é o mediador mais importante da
resistência contra a infecção pelo T. gondii (Suzuki et al., 1989; Gazzinelli et al.,
1992; Gazzinelli et al., 1993; Scharton-Kersten et al., 1996). IFN-γ apresenta
numerosas atividades biológicas que favorecem a destruição de parasitas, induzindo
principalmente a ativação de macrófagos, aumento de expressão de moléculas
classe I e II do MHC – aumentando a capacidade de processamento e apresentação
de antígenos aos linfócitos T –, a diferenciação para resposta Th1 e inibição da
resposta Th2. Macrófagos ativados pelo IFN-γ são capazes de inibir o crescimento
ou são capazes de destruir formas intracelulares de T. gondii (Denkers et al., 1998) e
induz a síntese de quimiocinas importantes para o recrutamento de linfócito T
(Amichay et al., 1996; Scharton-Kersten et al., 1996; Liesenfeld, 1999; Khan et al.,
2000).
No modelo experimental murino, foram observadas vias de indução da
síntese de IFN-γ, dependente e independente do linfócito T, sendo as células NK e
linfócitos T CD4 e CD8 as principais fontes de IFN-γ (Rytel et al., 1966). Em
camundongos β2mKO, que não apresentam células T CD8+ funcionais, a
proliferação do parasita é controlada pela enorme expansão de células NK
produtoras de IFN-γ (Denkers et al., 1993). IL-12 foi originalmente denominada fator
estimulador de célula NK e tem importante papel na estimulação da produção de
IFN-γ pelas células NK. A função chave da IL-12 é a ativação de STAT-4 e T-bet,
diretamente implicados na sinalização para a produção de IFN-γ (Liesenfeld, 1999).
Outras citocinas, como IL-18, IL-1β e TNF-α, colaboram com IL-12 nesta resposta
(Gazzinelli et al., 1993; Hunter et al., 1994; Cai et al., 2000).
As células dendríticas são as principais células produtoras de IL-12 (Reis
E Sousa et al., 1997). Esta produção ocorre rapidamente e é independente da
sinalização via IFN-γ ou de sinais vindos de linfócitos T, como CD40 ligante. Em
modelos experimentais de infecção por T. gondii, foi observado que células
dendríticas murinas purificadas, após estimulação com antígeno solúvel de T. gondii,
tanto in vitro quanto in vivo, produzem grande quantidade de IL-12 e essa produção
foi correlacionada com maior resistência dos animais à infecção pelo parasita
(Scanga et al., 2002; Liu et al., 2006).
A IL-12 é uma molécula heterodimérica de 70 kDa, produzida
principalmente por células dendríticas e fagócitos mononucleares, embora
granulócitos também possam contribuir para a produção inicial de IL-12 (Sieburth et
al., 1992, ). Esta citocina é constituída por duas subunidades, IL-12p40 (ou IL-12-β
de 40kDa) e IL-12p35 (ou IL-12-α de 35kDa) (Gubler et al., 1996). Os genes para as
subunidades IL-12p35 e p40 residem em loci independentes no genoma humano, os
quais estão localizados nos cromossomos 3p12-3q13.2 e 5q31-33, respectivamente
(Gubler et al., 1991; Trinchieri, 2003). Nos camundongos esses genes estão
localizados em cromossomos diferentes aos observados em seres humanos. O
receptor da IL-12 (IL-12R) é composto por duas cadeias IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2, sendo
expresso principalmente na superfície das células T ativadas, macrófagos e células
NK (Pflanz et al., 2002). A cadeia de IL-12p40 associa-se com outras duas
moléculas p19 e p28 formando, respectivamente as citocinas IL-23 e IL-27, que
agem sinergicamente com IL-12 estimulando a produção de IFN-γ pelas células T
CD4+. No entanto, a IL-23 não é eficiente como a IL-12 para induzir a produção de
IFN-γ e a polarização de células T para um padrão Th1, mas IL-23 é mais eficiente
que a IL-12 para indução de proliferação de células T de memória (Newport et al.,
1996; Holland et al., 1998). Enquanto que a IL-27 é uma potente indutora de
resposta proliferativa para células T CD4+ naïve, mas não tem um efeito nas células
T CD4+ de memória (Dorman et al., 1998).
Em humanos foram identificados defeitos genéticos em três genes que
controlam a produção de IFN-γ: no receptor 1 do IFN-γ (IFNGR1) que codifica a
cadeia ligante do IFN-γ (Altare, Durandy et al., 1998; De Jong et al., 1998), no
receptor 2 do IFN-γ (IFNGR2) e no ativador do fator de transcrição 1 (STAT1),
moléculas importantes na transdução de sinais intracelulares responsáveis pela
ativação celular (Altare, Lammas et al., 1998). Além destes, também foram
identificados defeitos em dois genes que controlam a produção de IFN-γ, IL-12B, que
codifica IL-12p40 e IL-12RB1 que codifica a primeira cadeia do receptor de IL-12
(IL-12RB1).
Indivíduos com deficiência na cadeia do receptor da IL-12Rβ1, produzem
quantidades menores de IFN-γ, o que a princípio não lhes causa maiores
transtornos, uma vez que alguns destes apresentam-se assintomáticos até a vida
adulta, mesmo na presença de infecções de repetição por micobactérias atípicas
(Fieschi et al., 2003). Uma mutação dentro do gene codificante para IL-12p40, que
impede a produção de IL-12p70 funcional pelas células dendríticas ativadas e
fagócitos, foi observada em uma criança com infecção disseminada pela
administração intradérmica de BCG (Bacille Camette-Guérin – Mycobacterium
bovis). Este fenômeno é o resultado da baixa produção de IFN-γ pelos linfócitos T.
Dessa forma, é reforçado que a IL-12, juntamente com o IFN-γ é essencial para o
controle e erradicação de bactérias intracelulares como Mycobacteria spp. e
Salmonella spp (Ottenhoff et al., 2002; Van De Vosse et al., 2005). Até 2003, foram
descritos na literatura 73 pacientes em todo o mundo com deficiência total de
IL-12p40 ou IL-12Rβ1, demonstrando a importância da IL-12 na defesa contra
microorganismos intracelulares (Hall et al., 2000; Huang et al., 2000). Várias
mutações funcionais ou não funcionais recentemente foram descritas nos genes de
IL-12B1 e IL-12RB1, que podem ajudar no esclarecimento da função e estrutura da
IL-12 e deste receptor nas doenças humanas (Morahan et al., 2002).
Outros estudos também apontaram a importância não só dos defeitos
genéticos, mas também do polimorfismo do gene codificador de IL-12p40. Uma
análise completa da seqüência de IL-12p40 identificou a presença de um
polimorfismo localizado na porção intrônica do gene; o polimorfismo de um único
nucleotídeo (SNP) na posição +1188 (+1188 A/C) na região 3’ não-transcrita (UTR)
de IL-12B (Yin et al., 2004). Este polimorfismo foi associado à maior susceptibilidade
dos pacientes às doenças auto-imunes, em especial diabetes do tipo 1 (Ikeda et al.,
2004). Além disso, o polimorfismo na região 3’ UTR de IL-12p40 aparentemente está
associado ao fenótipo de pacientes infectados com o vírus da hepatite C (HCV), mas
não a pacientes com tireoidite auto-imune. Indivíduos heterozigotos apresentaram
infecções auto-limitadas e indivíduos homozigotos com alelos raros apresentam
infecções persistentes com HCV (Stanilova et al., 2005). Embora pacientes com
tireoidite auto-imune tenham apresentado redução nos níveis de mRNA de IL-12,
não foi observada uma correlação entre a doença e o polimorfismo (Reis E Sousa et
al., 1997).
Recentemente foi demonstrado que o polimorfismo na região 3’ UTR do
gene de IL-12p40 influencia a produção de IL-12p40 e que esta produção é
dependente do tipo de estímulo utilizado para indução de sua produção. PBMCs
obtidas a partir de indivíduos homozigotos em relação aos alelos raros produziram
menores quantidades de IL-12 quando comparados com indivíduos heterozigotos.
Esta produção foi maior na presença da glicoproteína ligante de C3b (C3bgp),
quando comparada com lipopolissacarídeo e fitohemaglutinina (Zhou et al., 1998;
Huffnagle et al., 1999). Este polimorfismo pode ser importante em indivíduos
infectados com T. gondii, uma vez que o T. gondii é um forte indutor da produção de
IL-12 por células murinas (Aliberti et al., 2000).
Existem vários receptores presentes na superfície das células dendríticas
com possível relevância na produção de IL-12, como o receptor de quimiocina 5
(CCR5) e os Toll Like Receptor (TLR). A regulação positiva para a produção de IL-12
é observada através de presença de receptores de quimiocinas como CCR5 na
superfície dos fagócitos (Bliss et al., 1999), enquanto que a sua regulação negativa é
obtida através da produção de metabólitos do ácido aracdônico pela via das
lipoxinas (Kobayashi et al., 1989).
Polimorfismos em genes de receptores CCR5 e TLR podem estar
envolvidos na maior susceptibilidade à toxoplasmose e às infecções por outros
microorganismos intracelulares (Huffnagle et al., 1999). Camundongos deficientes
em CCR5 apresentam uma menor produção de IL-12, além de apresentarem maior
susceptibilidade à infecção pelo T. gondii (Sato et al., 1999), Cryptococcus
neoformans (Zhong et al., 2004), Leishmania donovani (Blanpain et al., 2000) e
Listeria monocytogenes (Mun et al., 2003). Mutações no CCR5 foram descritas em
várias populações humanas. Entre elas, a deleção de 32pb (CCR5
Δ
32), que impede
a expressão do receptor na membrana, é a mais freqüentemente observada em
caucasianos residentes na Europa (Zhou et al., 1998; Huffnagle et al., 1999).
Contudo, nosso grupo de estudo não observou uma associação entre CCR5
Δ
32 e
desenvolvimento de doença ocular em pacientes infectados por T. gondii
(manuscrito em preparação).
A investigação de prováveis receptores em células dendríticas envolvidos
com a produção de IL-12, deflagrada por componentes de T. gondii, resultou no
envolvimento de receptores dependentes da molécula adaptadora MyD88,
pertencente à família dos receptores TLR (Scanga et al., 2002). Camundongos
deficientes desta molécula produzem níveis significativamente reduzidos de IL-12
após desafio com o parasita ou com seu antígeno ou ainda com outros
microorganismos intracelulares (Janeway et al., 2002), sugerindo a participação de
membro(s) da família dos TLRs na resposta contra o T. gondii (Hoffmann et al.,
1999). Até o momento, foram descritos 11 TLRs em células de mamíferos, os quais
são importantes na resposta imune inata (Janeway, 1989).
A resposta imune inata é filogeneticamente a mais antiga contra
microrganismos e está presente em todos os organismos multicelulares, incluindo
plantas e animais (Janeway et al., 2002; Takeda et al., 2003). É a primeira linha de
reconhecimento e defesa contra microrganismos patogênicos, incluindo a
identificação de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) (Janeway,
1989; Debierre-Grockiego et al., 2003), os quais podem ser reconhecidos por
receptores que reconhecem padrões (PRRs), como os TLRs. O contato de produtos
microbianos, liberados durante a resposta inflamatória, com esses receptores
propicia uma cooperação entre a imunidade inata e adaptativa. Este processo pode
ter início através dos TLRs, expressos nas células dendríticas imaturas, as quais
após o reconhecimento de estruturas físico-químicas dos patógenos, passarão por
um processo de maturação, caracterizado pelo aumento de expressão de moléculas
classe II do MHC e moléculas co-estimuladoras como CD80 e CD86 em sua
superfície. Essas células também produzem citocinas pró-inflamatórias como IL-12,
que irão polarizar os linfócitos T naïve para um padrão de resposta Th1. Deste
modo, fazendo o elo de ligação da imunidade inata com imunidade adaptativa, o
sistema imune é capaz de proporcionar uma resposta específica e dirigida
unicamente ao patógeno em questão (Schwandner et al., 1999; Takeuchi et al.,
1999).
No caso de protozoários, um importante padrão molecular é a presença
de ancoras lipídicas dos glicosilfosfatidilinositol (GPI) em muitas proteínas de
superfície. Assim, GPIs de T. brucei, Leishmania mexicana e Plasmodium falciparum
podem estimular macrófagos para uma regulação positiva de iNOS e produção de
TNF e IL-1. Similar, uma fração da ancora de GPI, as mucinas de tripomastigotas de
T. cruzi estimulam macrófagos a produzirem IL-12 e TNF (Almeida et al., 1999;
Ropert et al., 2004). Curiosamente, as GPI dos epimastigotas nos estágios de inseto
não são capazes de estimularem a produção de citocinas. Esta inatividade parece
correlacionar-se com a ausência de resíduos de galactose e ácidos graxos não
saturados presentes nas âncoras de GPI isoladas de tripomastigotas (Almeida et al.,
1999). Dados recentes sugerem que TLR2 são receptores que estão envolvidos no
reconhecimento de GPI presentes no T. cruzi, bem como no T. gondii (Brightbill et
al., 1999; Takeuchi, Kaufmann et al., 2000). Assim, macrófagos de camundongos
deficientes de TLR2 quando estimulados com GPI falham na produção de IL-12,
TNF-α e óxido nítrico (NO). Além disso, foi demonstrado que GPI, LPG
(lipofosfoglicano) e GIPLS (glicosilinositolfosfolípídeo) de Leishmania inibem a via de
sinalização nos macrófagos, resultando em uma menor produção de citocinas
proinflamatórias, incluindo IL-12 (Piedrafita et al., 1999). Uma estrutura semelhante
expressa em E. histolytica, denominada lipofosfopeptidioglicano, também induz uma
resposta imune antiinflamatória e uma baixa regulação na expressão do gene de
TLR2 nos monócitos humanos (Maldonado et al., 2000). Assim, parece que a
variação na estrutura da GPI do parasita dá propriedades diferentes na transdução
de sinal sobre esta classe de glicolipídeos.
A influência do polimorfismo na família de genes dos TLRs, embora eles
sejam mediadores críticos da resposta imune a patógenos, também é objeto de
intensa pesquisa para compreender sua relação com a suscetibilidade a diferentes
infecções e enfermidades em seres humanos. O polimorfismo no gene de TLR 2
Arg753Gln na posição 753 é caracterizado por uma mudança de arginina por uma
glutamina, onde este polimorfismo leva a um aumento da susceptibilidade à febre
reumática aguda em crianças (Hoshino et al., 1999).
É interessante ressaltar que camundongos deficientes de TLR 2 quando
infectados com altas cargas do parasita apresentam maior susceptibilidade ao T.
gondii (Berdeli et al., 2005). Porém, existem trabalhos demonstrando que a
resistência à infecção pelo T. gondii e a produção de IL-12 não estão relacionados
com a expressão de TLR 2 e TLR 4 (Medzhitov, Preston-Hurlburt et al., 1997).
O primeiro TLR a ser descrito em mamíferos foi o TLR 4, expresso em
vários tipos celulares, de forma predominante na superfície de macrófagos e células
dendríticas (Lin et al., 2005), envolvido no reconhecimento de lipopolissacarídeos
presentes na parede celular de bactérias gram–negativas (Hayashi et al., 2001). O
polimorfismo no gene TLR 4 Asp299Gly, é caracterizado por uma mudança de um
ácido aspártico por uma glicina, e este polimorfismo atenua a sinalização por este
receptor. Este polimorfismo está associado a um aumento da susceptibilidade à
doenças coronarianas, fenômeno descrito na população caucasiana de etnia
chinesa em Taiwan (Hawn et al., 2003).
O TLR 5 está envolvido no reconhecimento da flagelina, uma proteína
conservada encontrada em flagelos de bactérias gram-positivas e gram-negativas. A
ativação do TLR 5 mobiliza o fator de transcrição NF-kB e estimula a produção do
TNF-α (Yarovinsky et al., 2005). Este polimorfismo gera um códon de parada no
domínio de TLR 5 (TLR5
392STOP
) que interrompe prematuramente a transcrição da
proteína no domínio extracelular e causa a perda deste domínio e de toda a cauda
citoplasmática envolvida na sinalização do TLR 5. Este polimorfismo foi associado a
uma maior suscetibilidade para o desenvolvimento pneumonia por Legionella
pneumophila (Zhang et al., 2004).
Recentemente, Sher e colaboradores demonstraram que TLR 11 é o
principal receptor de reconhecimento de padrão envolvido na sinalização em DCs
murinas para a produção de IL-12 pelo T. gondii e por outros parasitas do Filo
Apicomplexa. Este mesmo grupo descreveu o ligante do TLR 11, presente em T.
gondii, como uma molécula profilin-like, denominada PFTG (Yarovinsky et al., 2005).
A proteína recombinante PFTG induziu uma produção 100 vezes maior de IL-12 do
que o antígeno total do parasita. Enquanto camundongos deficientes de TLR11
parecem não produzir IL-12. Estes animais, diferentemente dos camundongos
deficientes em MyD88 e IL-12 retêm resistência parcial ao desafio e sobreviveram à
fase aguda da infecção, muito provavelmente devido ao IFN-γ residual. Esta
resistência pode refletir a contribuição de outros membros da família dos TLRs.
Análise filogenética de componentes da família dos TLR apontaram
grande similaridade entre TLR 5 e TLR 11, sugerindo que estes dois TLRs possam
representar um subgrupo evolutivamente conservado. Além disso, foi descrita a
presença de um códon de parada no gene TLR 11 em humanos, sugerindo que este
não é funcional (Zhang et al., 2004). Tanto receptores acoplados a proteínas G,
quanto os TLRs, são componentes importantes do reconhecimento e comunicação
celular. Assim, sabe-se que a síntese de IL-12 em DCs ativadas por T. gondii ou por
seu antígeno depende de um, ou vários TLRs, mas não é conhecida a dependência
das vias sinalizadas por estes receptores.
Trabalhos realizados no nosso laboratório demonstram que pacientes
com infecção crônica por T. gondii apresentavam taquizoítas na circulação
sangüínea (Silveira et al., submitted to JID). Desse modo é possível que outros
mecanismos e PRRs da resposta imune possam estar envolvidos, como no caso da
lectina ligante a manose (MBL).
A MBL é importante na defesa do hospedeiro, principalmente na
infância, quando a imunidade adquirida não é totalmente desenvolvida. Indivíduos
com deficiência dessa proteína podem desenvolver infecções recidivantes graves
(Holmskov et al., 1994).
A MBL é uma proteína produzida pelo fígado durante a fase aguda em
estágios iniciais de infecção (Sastry et al., 1989). Esta proteína pertence a família
das colectinas, caracterizada por possuir um domínio que reconhece carboidrato
(CRD) e um domínio de colágeno (Koch et al., 2001). A estrutura da proteína
trimérica é composta por polipeptídios idênticos, com peso molecular em torno de 32
KD (228 aminoácidos), onde 3 a 6 trímeros combinam-se para formar uma estrutura
semelhante a um buquê de tulipas, similar ao complemento C1q (Summerfield et al.,
1997). Cada polipeptídio é formado por um CRD, um domínio de sustentação (a
neck domain), um domínio de colágeno e uma região rica em cisteína. A MBL
reconhece vários microrganismos por estes CDRs e exerce um efeito similar aos das
opsoninas (Madsen et al., 1998; Garred et al., 2001).
A estrutura multimérica da MBL permite reconhecer diferentes
microrganismos, como bactérias gram-positivas e negativas, micobactérias, vírus e
fungos. A ligação da MBL leva a aglutinação desses microrganismos, os quais
subseqüentemente são eliminados pelos macrófagos. Além disso, a MBL ativa a via
das lectinas ligando-se às serino-proteases (MASPs) desencadeando toda a cascata
do complemento (Lipscombe et al., 1992; Tsutsumi et al., 2001).
O polimorfismo em MBL tem sido investigado em diferentes populações,
e, a presença deste polimorfismo tem sido correlacionada com a baixa concentração
de MBL2 no soro em humanos (Madsen et al., 1995; Madsen et al., 1998). Diversos
alelos de MBL têm um importante papel não só na defesa contra infecções por
micróbios, mas também no desenvolvimento de doenças auto-imunes (Madsen et
al., 1994).
Até o momento, seis polimorfismos distintos para o gene de MBL2
foram descritos. Dois polimorfismos estão presentes na região promotora do gene na
posição -550, que codifica os alelos H/L e na posição -221, que codifica os alelos
X/Y. O terceiro polimorfismo ocorre na região 5´UTR na posição +4 (Sumiya et al.,
1991), que codifica os alelos P/Q. Os demais polimorfismos estão na região do exon
I, nos códons 52 (Lipscombe et al., 1992), 54 (Madsen et al., 1995) e 57 (Madsen et
al., 1995), que codificam os alelos D, B e C respectivamente.
Acredita-se que as variantes da molécula de MBL podem ser
responsáveis pela baixa concentração de MBL no soro (Super et al., 1989). O
haplótipo HY está correlacionado com altos níveis de MBL no soro, LY com nível
intermediário e o haplótipo LX com baixo nível de MBL no soro. As influências das
variações X/Y são mais expressivas do que a variação H/L (Madsen et al., 1995). É
razoável supor que baixas concentrações de MBL possam acarretar deficiência na
opsonização favorecendo uma maior susceptibilidade às infecções por bactérias
encapsuladas (Lipscombe et al., 1992; Madsen et al., 1994).
Em um estudo realizado com três populações distintas, constituídas por
esquimós, caucasianos e africanos, foi demonstrado que os haplótipos HY foram
mais freqüentes em esquimós, os haplótipos LY foram mais freqüentes em
caucasianos e os haplótipos LX foram mais freqüentes em caucasianos e africanos
(Madsen et al., 1994). As variantes dos alelos de exon 1 foram mais freqüentes em
populações saudáveis, estando presentes em 20 a 50% dos indivíduos e foram
encontrados com maior freqüência em africanos (Thiel et al., 1997). O alelo B é
comum em caucasianos, chineses e esquimós, enquanto o alelo C foi encontrado
exclusivamente em africanos e o alelo D foi mais freqüente em caucasianos e
africanos .
Além desses estudos foram identificados oito alelos para os haplótipos
dos genes de MBL2, sendo HYPA, HYPD, LYPA, LYPB, LYPD, LXPA, LYQA e
LYQC, e 26 diferentes genótipos. Indivíduos brasileiros com descendência européia
apresentavam 16,8% com genótipo HYPA/LXPA, 12,4% com genótipo HYPA/LYQA
e 11,4% com genótipo HYPA/HYPB; indivíduos brasileiros com descendência
africana apresentavam 18,75% com genótipo LYQA/LYPA, 12,50% com genótipo
LXPA/LYQC, 9,4% com genótipo LYPA/LYPA e 9,4% HYPA/LYQA e indivíduos
brasileiros com descendência oriental apresentavam 25% HYPA/HYPA, 25%
HYPA/HYPB e 18,75% HYPA/LXPA .
Como visto através de dados descritos em literatura, o polimorfismo
genético é importante, tanto na resistência, quanto na susceptibilidade a infecções,
seja por patógenos intra ou extracelulares. Dessa forma, decidimos estudar a
importância destes polimorfismos em pacientes com T. gondi a fim de tentar
esclarecer quais são os genes envolvidos na resposta imune contra o T. gondii e a
alta incidência da toxoplasmose ocular na região de Erechim (RS). Investigamos os
polimorfismos dos genes que codificam para a proteína MBL, as citocinas TNF-α,
IL-12 e os receptores de toll e buscamos associação desses polimorfismos com o
desenvolvimento da toxoplasmose ocular nesta população brasileira.
2-OBJETIVO
Investigar a possível associação entre os polimorfismos nos genes de
TNFA, IL-12p40, TLR2, TLR4, TLR5 e MBL e a retinocoroidite causada pelo
Toxoplasma gondii.
3-MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Pacientes
Para este estudo foram recrutados 199 voluntários provenientes do Rio
Grande do Sul, em acompanhamento pelo Dr. Cláudio Silveira na Clínica Silveira,
em Erechim. Todos os pacientes em estudo são caucasianos descendentes de
europeus, principalmente poloneses e italianos. Os indivíduos soronegativos e
soropositivos para T. gondii sem lesão ocular foram recrutados de forma que a
idade, o sexo e a etnia apresentassem as mesmas características que nos grupos
de pacientes com lesão ocular.
Todas as pessoas incluídas nesse estudo foram submetidas à avaliação
sorológica para T. gondii, HIV e sífilis, além de avaliação oftalmológica, através do
exame de oftalmoscopia indireta. O número e a localização da lesão foram
documentados em todos os pacientes por fotografia. Foram excluídos do estudo
pacientes com inflamação intraocular ativa, infecção por HIV e sífilis.
Estes pacientes foram divididos em três grupos: 1) soronegativos para
T. gondii (IgM negativo e IgG negativo); 2) indivíduos soropositivos (IgG positivo e
IgM negativo ou positivo) e sem lesão ocular acompanhados durante 5 anos; 3)
indivíduos soropositivos (IgG positivo e IgM negativo ou positivo) com retinocoroidite
toxoplásmica. Nossos protocolos foram aprovados pela comissão de ética do
Instituto de Ciências Biomédicas/USP e todos os voluntários assinaram o Termo de
Consentimento Livre Esclarecido (TCLE) (anexos 1 e 2).
3.2- Extração de DNA Genômico
O sangue dos pacientes em estudo foi coletado a partir de punção venosa
periférica, utilizando tubos de vidro de 10,0 ml contendo heparina. Os tubos foram
mantidos sob refrigeração até o momento do processamento do sangue, que
consistia em diluí-lo em meio de cultura DMEM (Gibco, Walkersville, EUA) estéril
(diluição 1:1). A seguir, foi adicionado o gradiente de centrifugação
(Isolymph,Gallard-Scheleisinger Ind., Carle Place, NY, EUA) abaixo da camada de
sangue no mesmo volume coletado. Após centrifugação a 1.000 g por 20 min, as
células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram coletadas. As PMBCs
foram lavadas duas vezes com PBS (0,15 M) estéril e centrifugadas a 200 g por 10
min e temperatura ambiente, com descarte do sobrenadante. A seguir as células
precipitadas foram recuperadas, ressuspensas no pequeno volume restante e
processadas para a extração do DNA genômico utilizando coluna de separação ou
DNAzol (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA).
Para a extração do DNA genômico por coluna foi utilizado o Kit da
Amersham Pharmacia Biotech (GFX Genomic Blood DNA Purification Kit, Gibco,
Germany, USmarca, cidade e país). Cerca de 5 x 10
6
a 1x10
7
células foram
colocadas em um tubo de microcentrífuga de 2 mL (DNAse/RNAse free), sendo a
seguir acrescentados 500 μL da solução de extração, imediatamente misturados e
incubados por 5 minutos à temperatura ambiente (TA). A mistura foi transferida para
a coluna GFX para adsorção do DNA à coluna e centrifugada a 5.000 g por 1
minuto. Outros 500 μL da solução de extração à coluna foram acrescentados e
centrifugados a 5000 g por 1 minuto. A amostra de DNA foi lavada com o acréscimo
de 500 μL da wash solution à coluna e centrifugada a 14.000 g por 3 minutos. A
eluição do DNA da coluna foi feita com 200 μL de TE pré-aquecido diretamente à
matriz da coluna e centrifugada a 14.000 g por 3 minutos.
A quantificação do DNA foi determinada utilizando-se comprimento de
onda de 260 e de 280 nm por espectrofotometria, utilizando o programa SOFTMax
Pro 4.0 e o aparelho SPECTRAmax 190 da Molecular Devices.
Para extração de DNA genômico por DNAzol foram adicionados aos
leucócitos totais (buffy coat) 10 mL de solução de lise gelada (Tris-HCl 0,5 M (pH
8,0), NaCl 5 M, MgCl
2
1 M) e centrifugados a 450 g à 4ºC por 10 minutos. O
sobrenadante foi desprezado, o precipitado ressuspenso em 1 mL de DNAzol,
homogeneizado gentilmente e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos.
Após este período de incubação, 800 μL de etanol absoluto foram adicionados e
misturados gentilmente por inversão até que a nuvem de DNA estivesse visível. A
nuvem de DNA foi colhida e transferida para outro tubo eppendorf de 2,0 ml. Foi
adicionado a este tubo 1 mL de etanol a 95% misturando gentilmente por inversão.
Após um período curto em repouso para deposição do DNA, o sobrenadante foi
removido, 1 mL de etanol 75% foi adicionado e misturado gentilmente por inversão.
Novamente o tubo foi deixado em repouso por alguns minutos para deposição do
DNA, onde o sobrenadante foi totalmente removido e o precipitado seco, mas não
totalmente. O DNA foi ressuspendido em NaOH 8 mM e incubado a 4ºC sob
agitação branda e, quando necessário, mais NaOH 8 mM foi adicionado para
dissolução completa do DNA. A integridade do DNA foi verificada em gel de agarose
a 0,8% e este armazenado a 4ºC até o uso.
As amostras de DNA foram quantificadas por espectrofotometria a 280 nm
e por densitometria comparando a intensidade das bandas em gel de agarose com
DNA λ digerido com Hind III (Invitrogen) através do programa AlphaEaseFC
(AlphaDigiDoc1000 v3.2β) da Alpha Innotech Corporation.
3.3- Reações de PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction –
Restriction Fragment Length Polymorphism)
As amplificações para análise dos genes de MBL, TLR2, TLR4, TLR5,
TNF-α e IL-12p40 foram realizadas no termociclador GeneAmp PCR System 9700
(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações foram preparadas em
um volume final de 25 μl contendo 20 ng de DNA genômico, 2,0 U Taq polymerase
(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA), tampão da enzima 1x
concentrado [20 mM Tris-HCl (pH 8,3) e 50 mM KCl], 1,5 mM MgCl
2,
40 μM de
dNTPs (Invitrogen) e 0,25 pmol de cada oligonucleotídeo (tabela 1).
As digestões foram realizadas em 30 μL de volume final contendo 10 μL
de produto de PCR e 0,5 U de enzima de restrição por 3 horas, de acordo com as
condições de incubação descritas na tabela 2. As amostras foram submetidas à
eletroforese em géis contendo 4% de agarose (Invitrogen), porém a proporção de
agarose ultra pura (Invitrogen) e agarose 1000 (Invitrogen) variou de acordo com o
produto gênico analisado da seguinte maneira: MBL -221, +4 e IL-12p40 (somente
agarose ultra-pura 4%), MBL -550, MBLex1 códon 54 (1:1), MBLex1 códon 52,
TLR2, TLR4, TLR5 e TNF-α (3:1). As corridas eletroforéticas foram realizadas a 70V
a temperatura ambiente durante 1 hora e 30 minutos e os produtos foram
visualizados após a coloração com brometo de etídio. Diferentemente dos demais, o
polimorfismo de MBLex1 códon 57 foi analisado em gel de poliacrilamida 15%.
Todas imagens foram obtidas por câmara digital (MJC Research) utilizando o
programa Eagleeye.
3.3.1- Condições de amplificação
As reações de PCR para cada um dos polimorfismos estudados foram
realizadas como descrito a seguir:
MBL: Os polimorfismos na região do promotor nas posições -550, -221 e
na região 5’UTR na posição +4 foram analisados após a amplificação em 35 ciclos a
95°C por 20s, 60°C por 20s e 72°C por 30s. As análises dos polimorfismos no exon I
(códons 52, 54 e 57) foram realizadas nas mesmas condições aumentando-se
apenas a temperatura de anelamento para 62ºC. Uma etapa de desnaturação inicial
a 95ºC por 5 min foi empregada e ao final dos ciclos de amplificação foi feita uma
extensão final de 72ºC por 7min.
TLR2 (Arg677Trp e Arg753Gln): Desnaturação inicial a 94°C por 5
minutos, seguido de 35 ciclos a 94°C por 20s, 60°C por 20s e 72°C por 30s. Uma
extensão final de 72°C por 7 minutos.
TLR4 (Asp299Gly): Desnaturação inicial a 95°C por 5 minutos, seguido
de 35 ciclos a 95°C por 30s, 62°C por 30s e 72°C por 30s. Extensão final de 72°C
por 7 minutos.
TLR5
392STOP
: Desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos, seguido de 35
ciclos a 95°C por 20s, 58°C por 20s e 72°C por 30s. Uma extensão final de 72°C por
7 minutos também foi empregada.
TNFA: Os polimorfismos nas posições G-308A e G-238A da região
promotora foram analisados após a amplificação de 35 ciclos a 95°C por 20s, 60°C
por 20s e 72°C por 20s. Uma desnaturação inicial a 95ºC por 5 minutos foi
empregada e ao final dos ciclos de amplificação foi realizada uma extensão final de
72ºC por 7minutos.
IL-12p40 (A1188C): Desnaturação inicial a 95°C por 10 minutos, seguido
de 34 ciclos a 95°C por 30s, 52°C por 30s e 72°C por 25s. Extensão de 72°C por 7
minutos.
3.4-Análise Estatística
A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPadPrism
3,02 da GraphPadSoftware. Para análise do estudo de associação empregando
marcadores polimórficos, foram utilizadas tabelas de contingência do tipo 2x2 e a
análise estatística foi realizada empregando o teste de Fisher com correção de
Yates, com intervalo de confiança de 95% (Bailey, 1973).
Tabela 1: Seqüências de pares de oligonucleotídeos e produto esperado da
reação em cadeia (PCR) para amplificação de cada gene polimórfico.
Genes Polimorfismos Forward Reverse
Produto
(pb)
MBL MBL-550 5’-TCC TGC CAG AAA GTA GAC AG-3’
5’-AGT TTG CTT CCC CTT GGT GTT
CTA-3’
116
MBL MBL-221 e +4
5’-GTT TCC ACT CAT TCT CAT TCC
CTA AG-3’
5’-CTC AGT TAA TGA ACA CAT ATT
TA
T-3’
330
MBL MBLex1 (52, 54 e 57)
5’-CAT CAA CGG CTT CCC AGG CAA
AGAT G
CG-3’
5’-CAG GCA GTT TCC TCT GGA AGG
TAA AG-3’
119
TLR2
TLR2 (Trg677Trp e
Arg753Gln)
5′-GCC TAC TGG GTG GAG AAC CT-3′ 5′-GGC CAC TCC AGG TAG GTC TT-3′ 340
TLR4 TLR4 (Asp299Gly)
5′-GAT TAG CAT ACT TAG ACT ACT
ACC TCC ATG-3′
5′-GTG GGA ATG CTT TTT CAG AAG
TTGA TC -3′
249
TLR5 TLR 5 (
392STOP
) 5’-GGT AGC CTA CAT TGA TTT GC-3’
5- GAG AAT CTG GAG ATG AGG TAC
CCG -3’
276
TNF-α TNFA (G308A e G238A)
5’-GGC AAT AGG TTT TGA GGG
CCA
TG-3’
5’-CAC ACT CCC CAT CCT CCC TGA
TC-3’
120
IL-12p40 IL-12p40 (A1188C) 5’-TTC TAT CTG ATT TGC TTT TA-3’ 5’-TGA AAC ATT CCA TAC ATC-3’ 233
Tabela 2: Enzimas e temperaturas utilizadas para análise de RFLP
Genes Polimorfismos Enzima Temperatura
MBL
MBL-550
Xba I
37ºC
MBL
MBL-221 e +4 BsaJI e Taq I 60ºC e 65ºC
MBL
MBLex1 (52, 54 e 57) Hha I, Ban I e Mbo II 37ºC
TLR2
TLR2 (Trg677Trp e Arg753Gln)
Aci I
36ºC
TLR4
TLR4 (Asp299Gly)
Nco I
37ºC
TLR5
TLR5 (
392STOP
)
Dde I
37ºC
TNF-α
TNFA (G-308A e G-238A) NcoI e Alw I 37ºC
IL-12p40
IL-12p40 (A1188C)
Taq I
65ºC
4-RESULTADOS
Neste estudo foram analisados polimorfismos nos genes de TNFA,
IL-12p40, TLR 2, TLR 4, TLR 5, e MBL de 173 voluntários da Clínica Silveira,
Erechim, RS através da técnica de PCR-RFLP. Os voluntários foram divididos em 3
grupos: indivíduos soronegativos, indivíduos soropositivos para T. gondii e sem
doença ocular e indivíduos soropositivos com toxoplasmose ocular.
Fizeram parte deste estudo 102 indivíduos do sexo masculino, sendo 19
soronegativos, 30 soropositivos sem lesão e 53 indivíduos com lesão ocular e 97
indivíduos do sexo feminino, sendo 20 indivíduos soronegativos, 31 soropositivos
sem lesão e 46 soropositivos com lesão ocular (tabela 3), com idades mínimas de
18, máxima de 61 e média de 35,25 anos (tabela 4). Contudo, os números de
indivíduos avaliados variam para os diferentes polimorfismos, uma vez que as
amostras dos indivíduos não amplificaram para todos os polimorfismos analisamos.
Tabela 3: Sexo dos voluntários analisados.
Sexo Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Masculimo
19 30 53
Feminino
20 31 46
Total
39 61 99
Tabela 4: Idade dos voluntários analisados.
anos Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
18- 28
19 41 48
29-39
12 14 32
40-50
5 4 12
51-61
3 2 7
Total
39 61 99
4.1- Análise de polimorfismo nos genes das citocinas TNF-
α
e
IL-12p40.
Neste estudo analisamos polimorfismos em genes que codificam duas
proteínas que compõem duas citocinas, o trímero do TNF-α e a proteína de 40kD do
heterodímero que forma a IL-12. Observamos que os polimorfismos nos genes de
TNFA e IL-12p40 não estavam associados ao desenvolvimento de lesão ocular.
O polimorfismo na região promotora do gene TNFA na posição -308 é
definido pela mudança de uma guanina por uma adenina, sendo detectado através
da não digestão do produto de amplificação com a enzima de restrição Nco I. O
produto de amplificação da região apresenta uma banda de 120 pb. Quando este
não é digerido pela enzima de restrição, trata-se do alelo -308A, quando o produto
de amplificação é digerido, o alelo -308G é revelado (Wilson, AG., 1997). Indivíduos
que apresentam uma banda de 120 pb são homozigotos com genótipo A308A e
alelos A/A. Quando visualizamos três bandas (120 pb, 100 pb e 20 pb) apenas um
alelo foi clivado, revelando um indivíduo heterozigoto com genótipo A308G e alelos
AG. Indivíduos que possuem duas bandas de 100 pb e 20 pb são homozigotos com
o genótipo G308G e alelos GG (Figura 1).
Figura 1: Polimorfismo do gene de TNFA A308G: Produto de
amplificação digerido com Nco I de três pacientes ilustrando um
indivíduo heterozigoto com genótipo A308G e alelos AG,
apresentando duas bandas de 120 pb e 100 pb (a banda de 20pb
não está demonstrada), um indivíduo homozigoto com genótipo
A308A e alelos AA, apresentando uma banda 120 pb e um indivíduo
homozigoto com genótipo G238G e alelos GG, apresentando uma
banda de 100 pb. Os fragmentos foram observados em gel de
agarose 4% marcado com brometo de etídeo. Para este experimento
foi utilizado o marcador de peso molecular de DNA de 100 pb
(Invitrogen).
Similar o polimorfismo no gene TNFA na posição -238 é caracterizado
pela mudança de uma guanina por uma adenina, sendo detectado através da não
digestão do produto de amplificação com a enzima Aiw I. O produto de amplificação
da região apresenta uma banda de 120 pb. Quando este não é cortado pela enzima
de restrição, trata-se do alelo -238A, quando o produto de amplificação é digerido, o
alelo -238G é revelado (Kaluza et al., 2000). Indivíduos que possuem uma banda de
120 pb são homozigotos com genótipo A238A e alelos AA. Quando são observadas
três bandas (120 pb, 100 pb e 20 pb) apenas um alelo foi clivado, revelando um
indivíduo heterozigoto com genótipo A238G e alelos AG. Indivíduos que possuem
duas bandas de 100 pb e 20 pb são homozigotos com genótipo G238G e alelos GG
(Figura 2).
Figura 2: Polimorfismo do gene de TNFA A238G: Produto de
amplificação digerido com Aiw I de três voluntários ilustrando um
indivíduo heterozigoto com genótipo A238G e alelos AG,
apresentando duas bandas de 120 pb e 100 pb (a banda de 20 pb
não está demonstrada) e dois indivíduos homozigotos com genótipo
G238G e alelos GG, apresentando uma banda 100 pb. Os
fragmentos foram observados em gel de agarose 4% marcado com
brometo de etídeo. Para este experimento foi utilizado o marcador de
peso molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Avaliamos 158 indivíduos para o polimorfismo de TNFA na posição -308,
sendo 23 indivíduos soronegativos, 49 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e
86 indivíduos soropositivos com lesão ocular para o polimorfismo. Analisamos as
freqüências dos alelos e observamos que 78%, 70% e 76% dos indivíduos
apresentaram o genótipo G308G, 17%, 26% e 18% dos indivíduos apresentaram o
genótipo G308A e 5%, 4% e 6% dos indivíduos apresentaram o genótipo A308A nos
grupos de soronegativos, soropositivos sem lesão e soropositivos com lesão ocular,
respectivamente. Quando analisamos os alelos, observamos que 13%, 17% e 14%
dos indivíduos apresentaram o alelo -308A, e 87%, 83% e 86% dos indivíduos
apresentaram o alelo -308G (tabela 5). A porcentagem dos alelos A e G entre os
grupos foram semelhantes.
Tabela 5: – Freqüência dos genótipos e alelos na posição -308 do TNFA na
população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
G308G
18 (0,78) 34 (0,70) 66 (0,76)
G308A
4 (0,17) 13 (0,26) 16 (0,18)
A308A
1 (0,05) 2 (0,04) 4 (0,06)
Total
23 49 86
Alelos
A
6 (0,13) 17 (0,17) 24 (0,14)
G
40 (0,87) 81 (0,83) 148 (0,86)
Total
46 98 172
Avaliamos 163 indivíduos para o polimorfismo de TNFA na posição -238,
sendo 32 indivíduos soronegativos, 46 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e
85 indivíduos soropositivos com lesão ocular para o polimorfismo. Analisamos as
freqüências dos alelos observamos que 8%, 3% e 6% dos indivíduos apresentaram
o alelo -238A e 98%, 97% e 94% dos indivíduos apresentaram o alelo -238G nos
grupos de soronegativos, soropositivos sem lesão e soropositivos com lesão ocular,
respectivamente (tabela 6). A porcentagem dos alelos A e G entre os grupos foram
semelhantes.
Tabela 6: – Freqüência dos genótipos e alelos na posição -238 de TNFA na
população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
G238G
31 (0,03) 43 (0,93) 77 (0,90)
G238A
1 (0,97) 3 (0,06) 6 (0,07)
A238A
0 (0,00) 0 (0,00) 2 (0,03)
Total
32 46 85
Alelos
A
1 (0,08) 3 (0,03) 10 (0,06)
G
63 (0,98) 89 (0,97) 160 (0,94)
Total
64 92 170
Analisamos o polimorfismo IL-12B no gene IL-12p40 na região 3’UTR na
posição 1188, caracterizado pela mudança de uma adenina por uma citosina, sendo
detectado através da digestão do produto de amplificação com a enzima de restrição
Taq I. O produto de amplificação da região apresenta uma banda de 233 pb.
Quando este não é digerido pela enzima de restrição, trata-se do alelo A, quando o
produto de amplificação é digerido, o alelo C é revelado (Seegers et al., 2002).
Indivíduos que apresentam uma banda de 233 pb são homozigotos com genótipo
A1188A e alelos AA. Indivíduos heterozigotos com genótipo A1188C e alelos AC
apresentaram três bandas (233 pb, 165 pb e 68 pb), demonstrando que apenas um
alelo foi clivado. Indivíduos que apresentam duas bandas de 165 pb e 68 pb são
homozigotos com genótipos C1188C e alelos CC (Figura 3).
Figura 3 – Polimorfismo de IL-12B. Produto de amplificação da
região 3’UTR na posição 1188 do IL12B digerido com Taq I de três
voluntários ilustrando um indivíduo heterozigoto com genótipo
A1188C e alelos AC, apresentando três bandas de 233, 165 e de
68pb (a banda de 68 pb não aparece), um indivíduo homozigoto com
genótipo C1188C e alelos CC, apresentando uma banda de 165 (a
banda de 68 pb não aparece) e um indivíduo homozigoto com
genótipo A1188A e alelos AA, apresentando uma banda de 233pb.
Os fragmentos foram observados em gel de agarose 4% marcado
com brometo de etídeo. Para este experimento foi utilizado o
marcador de peso molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Avaliamos 142 voluntários, sendo 12 voluntários soronegativos, 48
voluntários soropositivos sem lesão ocular e 82 voluntários com lesão ocular.
Analisamos a freqüência dos alelos do gene 3’UTR IL-12B observamos que 92%,
85% e 75% dos indivíduos apresentaram o alelo A e 8%, 15% e 25% dos indivíduos
apresentaram o alelo C, nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão, respectivamente (tabela 7). Os dados sugerem uma
associação do alelo C ao grupo de voluntários com doença ocular, entretanto a
diferença entre os grupos não é estatisticamente significativa.
Tabela 7 – Freqüência dos genótipos e alelos de IL-12B na população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
C1188C
0 (0,00)
0 (0,00) 5 (0,06)
A1188C
2 (0,17) 14 (0,3) 30 (0,36)
A1188A
10 (0,83) 34 (0,7) 47 (0,58)
Total
12 48
82
Alelos
A
22 (0,92) 82 (0,85) 124 (0,75)
C
2 (0,08) 14 (0,15) 40 (0,25)
Total
24
96 164
4.2- Análise de polimorfismo nos genes TLRs.
Analisamos polimorfismos em três diferentes tipos de TLRs: TLR 2, TLR 4
e TLR 5. Dois polimorfismos no gene de TLR2 foram descritos; o polimorfismo
Arg677Trp, caracterizado pela mudança de uma citosina por uma timina, resultando
na troca de uma argenina (R) por um triptofano (W) na posição 677 (Kang et al.,
2001) e o polimorfismo Arg753Gln, caracterizado por uma mudança de um
nucleotídeo adenina por uma guanina, resultando na substituição de um aminoácido
arginina (R) por uma glutamina (Q) na posição 753 (Lorenz et al., 2000).
O produto de PCR, que abrange a região dos dois polimorfismos em
TLR2, possui 340 pb. Com a digestão da enzima de restrição Aci I, o alelo mais
freqüente na população, denominado de alelo R, é revelado. São duas clivagens que
geram fragmentos de 227 pb, 75 pb e 38 pb (as bandas de 75 pb e 38 pb não são
visualizadas no gel de eletroforese). O polimorfismo Arg677Trp é detectado através
da não digestão do produto na posição 677 do gene e, com apenas uma clivagem,
dois fragmentos são observados (302 pb e 38 pb) revelando o alelo 677W. Enquanto
o polimorfismo Arg753Gln é detectado através da não digestão do produto
amplificado na posição 753, há apenas uma digestão e são gerados dois fragmentos
de 265 pb e 75 pb, revelando o alelo 753Q (Figura 4).
O polimorfismo Arg677Trp não foi observado nos voluntários de Erechim.
Por outro lado, o polimorfismo Arg753Gln foi observado em indivíduos heterozigotos
com genótipo R753Q, revelado pela presença de três bandas (265 pb, 227 pb e 75
pb) onde apenas um alelo foi clivado. A maior parte dos voluntários era homozigoto
com genótipo R753Q, revelado pela presença de duas bandas de 227 pb e 75 pb
(Figura 4).
Figura 4 – Polimorfismo no gene TLR2 (Arg753Gln). Produto de
amplificação digerido com Aci I de 3 voluntários ilustrando dois
indivíduos homozigotos com genótipo R753R, apresentando uma
banda de 227 pb (a banda de 75 pb não é mostrada) e um indivíduo
heterozigoto com genótipo R753Q, apresentando duas bandas, de
265 pb e 227 pb (a banda de 75 pb não é mostrada). Os fragmentos
foram observados em gel de agarose 4% marcado com brometo de
etídeo. Para este experimento foi utilizado o marcador de peso
molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
A caracterização do polimorfismo Asp299Gly no gene de TLR4 é
conferido por uma mudança do nucleotídeo citosina por uma adenina, resultando na
substituição de um aminoácido ácido aspártico (D) por uma glicina (G) na posição
299, sendo detectado através da digestão do produto de amplificação com a enzima
Nco I. Este polimorfismo atenua a sinalização deste receptor e aumenta o risco de
infecções agudas graves (Schmitt et al., 2002). O alelo mais freqüente na população
apresenta uma banda de 249 pb e é denominado de alelo 299D. Quando o produto
de amplificação é digerido, o alelo 299G é revelado. Indivíduos com uma banda de
249 pb são homozigotos com genótipo D299D. Quando são visualizadas três
bandas (249pb, 172 pb e 77pb), apenas um alelo foi clivado, revelando indivíduo
heterozigoto com genótipo D299G. Indivíduos com duas bandas de 172 pb e 77pb
são homozigotos com genótipos G299G (Figura 5).
Figura 5 – Polimorfismo no gene TLR4 (Asp299Gly). Produtos de
amplificação digeridos com Nco I de três voluntários ilustrando três
indivíduos homozigotos com genótipo D299D, apresentando uma
banda de 249 pb, e um indivíduo heterozigoto com genótipo D299G,
apresentando duas bandas, de 249 pb e 172 pb (a banda de 77 pb
não é mostrada). Os fragmentos foram observados em gel de
agarose 4% marcado com brometo de etídeo. Para este experimento
foi utilizado o marcador de peso molecular de DNA de 100 pb
(Invitrogen).
O polimorfismo TLR5
392STOP
no gene de TLR5 é caracterizado por uma
mudança do nucleotídeo citosina por uma timina na posição 753, resultando na
substituição de um aminoácido arginina por um códon de parada (TLR5
392STOP
). Esta
substituição prematuramente interrompe a transcrição da proteína no domínio
extracelular e causa a perda deste domínio e de toda a cauda citoplasmática
envolvida na sinalização do TLR5 (Hawn et al., 2003). Este polimorfismo é detectado
através da digestão do produto de amplificação com a enzima Dde I. O alelo mais
freqüente na população apresenta uma banda de 276pb e é denominada de alelo
392R. Quando o produto de amplificação é digerido, o alelo 392Stop é revelado.
Indivíduos que apresentam uma banda 276 pb são homozigotos com genótipo
R392R. Indivíduos heterozigoto com genótipo R392Stop apresentam três bandas
(276 pb, 186 pb e 91 pb), indicando que apenas um alelo foi clivado. Indivíduos que
possuem duas bandas (185 pb e 91 pb) são homozigotos com genótipo
Stop392Stop (Figura 6).
Figura 6 – Polimorfismo no gene (TLR5
392STOP
). Produtos de
amplificação digeridos com Nco I de 3 voluntários ilustrando um
indivíduo heterozigoto com genótipo R392Stop, apresentando duas
bandas de 276 pb, 185 pb e 91 pb, um indivíduo homozigoto com
genótipo R392R, apresentando uma banda de 276 pb e um indivíduo
homozigoto com genótipo Stop392Stop, apresentando duas bandas
de 185 pb e 91 pb. Os fragmentos foram observados em gel de
agarose 4% marcado com brometo de etídeo. Para este experimento
foi utilizado o marcador de peso molecular de DNA de 100 pb
(Invitrogen).
Avaliamos 137 indivíduos para o polimorfismo TLR2 Arg753Gln, sendo 11
indivíduos soronegativos, 50 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e 76
indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisando as freqüências dos genótipos
observamos que 100%, 98% e 97% dos indivíduos apresentaram o genótipo R753R
e 0%, 2% e 3% dos indivíduos apresentaram o genótipo R753Q nos grupos
soronegativos, soropositivos sem lesões oculares e soropositivos com lesão ocular,
respectivamente. Em nosso trabalho, nenhum dos indivíduos em estudo apresentou
o genótipo Q753Q. As porcentagens dos genótipos entre os grupos foram
semelhantes. Quando analisamos os alelos, observamos que 0% 2% e 2% dos
indivíduos apresentaram o alelo 753R e 100%, 98% e 98% dos indivíduos
apresentaram o alelo 753Q, nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesões
oculares e soropositivos com lesão ocular, respectivamente. As porcentagens dos
alelos entre os grupos foram estatisticamente não significativas (tabela 8).
Tabela 8: – Freqüência dos genótipos e alelos TLR2 (Arg753Gln) na população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
R753R
11(1,00)
49 (0,98) 73 (0,97)
R753Q
0 (0,00) 1 (0,02) 3 (0,03)
Q753Q
0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)
Total
11 50
76
Alelos
Q
0 (0,00) 1 (0,02) 3 (0,02)
R
22 (1,00) 99 (0,98) 149 (0,98)
Total
22
100 152
Avaliamos 163 indivíduos, sendo 12 indivíduos soronegativos, 54
indivíduos soropositivos sem lesão ocular e 82 indivíduos soropositivos com lesão
ocular. Analisando as freqüências dos genótipos, observamos que 96%, 87% e 91%
dos indivíduos apresentaram o genótipo D299D, 4%, 13% e 9% dos indivíduos
apresentaram o genótipo D299G nos grupos soronegativos, soropositivos sem
lesões oculares e soropositivos com lesão ocular, respectivamente. Em nosso
trabalho, nenhum dos indivíduos em estudo apresentou o genótipo Q753Q. As
porcentagens dos genótipos entre os grupos foram semelhantes. Quando
analisamos os alelos, observamos que 98%, 94% e 95% dos indivíduos
apresentaram o alelo 299D e 2%, 6% e 5% dos indivíduos apresentaram o alelo
299G nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão ocular e soropositivos com
lesão. A porcentagem dos alelos entre os grupos foi estatisticamente não
significativa (tabela 9).
Tabela 9: – Freqüência dos genótipos e alelos TLR4 (Asp299Gly) na população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
G299G
0 (0,00)
0 (0,00) 0 (0,00)
D299G
1 (0,04) 7 (0,13) 8 (0,09)
D299D
23 (0,96) 47 (0,87) 77 (0,91)
Total
24 54
85
Alelos
D
47 (0,98) 101 (0,94) 162 (0,95)
G
1 (0,02) 7 (0,06) 8 (0,05)
Total
48
108 170
Avaliamos 174 indivíduos para o polimorfismo TLR5
392STOP
, sendo 29
indivíduos soronegativos, 55 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e 90
indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisando as freqüências dos genótipos
observamos que 90%, 91% e 94% dos indivíduos apresentaram o genótipo R392R e
10%, 9% e 6% dos indivíduos apresentaram o genótipo R392Stop nos grupos
soronegativos, soropositivos sem lesões oculares e soropositivos com lesão ocular,
respectivamente. Em nosso trabalho, nenhum dos indivíduos em estudo apresentou
o genótipo Stop392Stop. As porcentagens dos genótipos entre os grupos foram
semelhantes. Quando analisamos os alelos observamos que 95%, 96% e 97% dos
indivíduos apresentaram o alelo 392R e 5%, 4% e 3% dos indivíduos apresentaram
o alelo 392Stop, nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão ocular e
soropositivo com lesão, respectivamente. A porcentagem dos alelos entre os grupos
foi estatisticamente não significativa (tabela 10).
Tabela 10: – Freqüência dos genótipos e alelos TLR5
392STOP
na população.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
Stop392Stop
0 (0,00)
0 (0,00) 0 (0,00)
R392Stop
3 (0,10) 5 (0,09) 6 (0,06)
R392R
26 (0,90) 50 (0,91) 84 (0,94)
Total
29 55
90
Alelos
R
55 (0,95) 105 (0,96) 174 (0,97)
Stop
3 (0,05) 5 (0,04) 6 (0,03)
Total
58
110 180
Alguns autores sugerem que o polimorfismo em mais de um receptor de
TLRs possa estar envolvido na susceptibilidade ao T. gondii. Os voluntários que
foram avaliados para os 3 polimorfismos nos TLRs foram analisados para a
ocorrência de mais de um polimorfismo (tabela 11). Comparamos 128 voluntários,
sendo 11 indivíduos soronegativos, 47 indivíduos soropositivos sem lesão e 70
indivíduos soropositivos com lesão e não observamos associação entre os
polimorfismos em mais de um receptor de TLRs e a doença ocular.
Tabela 11– Polimorfismos em TLRs em pacientes com toxoplasmose ocular.
Presença de
Polimorfismos
Soronegativos
Soropositivos
sem lesão
Soropositivos
com lesão
Nenhum
9 34 55
Apenas 1
1 13 15
2
1 0 0
Total
11 47 70
4.3- Análise de polimorfismos no gene MBL.
Seis diferentes polimorfismos no gene MBL foram avaliados em nosso
estudo, sendo que dois polimorfismos investigados estão na região promotora do
gene: posição -550, que codifica os alelos H/L, e na posição -221, que codifica os
alelos X/L. Um polimorfismo está na região 5´UTR na posição +4 do sítio de início da
transcrição, que codifica os alelos P/Q, e os outros três polimorfismos investigados
estão na região do exon I, nos códons 52, 54 e 57, que codificam os alelos D, B e C,
respectivamente, sendo que o alelo A o mais freqüente na população (Figura 7).
Figura 7: Representação dos seis polimorfismos no gene de MBL
investigados: -550, -221, +4, códon 52, códon 54 e códon 57. Os
nucleotídeos ou aminoácidos afetados estão discriminados, bem como os
alelos de MBL revelando os genótipos ou nucleotídeos presentes e a
denominação dos alelos ((Madsen et al., 1994); MADSEN et al., 1995;
MADSEN et al., 1998; (Sumiya et al., 1991); LIPSCOMBE et al., 1992).
O polimorfismo na posição -550 é caracterizado pela mudança de uma
citocina por uma guanina. Esta troca de nucleotídeo cria um sítio de restrição para a
enzima Xba I. O produto de amplificação da região possui uma banda de 116 pb,
revelando o alelo L (-550C) Após a digestão com a enzima, observa-se duas
bandas, uma de 91 pb e outra de 25 pb, revelando o alelo H (-550G) (Madsen et al.,
1995; Madsen et al., 1998). Indivíduos que apresentam uma banda de 116 pb são
homozigotos com genótipo GG e alelos L/L. Quando observamos três bandas (116
pb, 91 pb e 25 pb) apenas um alelo foi clivado, revelando um indivíduo heterozigoto
com genótipo CG e alelos H/L. Indivíduos que apresentam duas bandas de 91 pb e
25 pb são homozigotos com genótipo CC e alelos H/H (Figura 8).
Figura 8: Polimorfismo do gene de MBL na posição -550 (H/L):
Produto de amplificação digerido com Xba I de quatro voluntários
ilustrando dois indivíduos homozigotos com genótipo CC e alelos
H/H, apresentando uma banda de 91 pb (a banda de 25 pb não está
demonstrada), um indivíduo homozigoto com genótipo GG e alelos
L/L, apresentando uma banda maior de 116 pb e um indivíduo
heterozigoto com genótipo CG (alelos H/L), apresentando duas
bandas, 116 pb e 91 pb (a banda de 25 pb não está demonstrada).
Os fragmentos foram observados em gel de agarose 4% marcado
com brometo de etídeo. Para este experimento foi utilizado o
marcador de peso molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Neste trabalho avaliamos 168 indivíduos para o polimorfismo de MBL -
550, sendo 25 indivíduos soronegativos, 55 indivíduos soropositivos sem lesão
ocular e 88 indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisando as freqüências
dos genótipos, observamos que 36%, 34% e 36% dos indivíduos apresentaram o
genótipo CC, 8%, 26% e 24% apresentaram o genótipo GG e 56%, 40% e 40% dos
indivíduos apresentaram o genótipo CG, nos grupos soronegativos, soropositivos
sem lesão ocular e soropositivo com lesão, respectivamente. As porcentagens dos
genótipos entre os grupos foram semelhantes. Analisamos a porcentagem entre os
alelos H e L do gene de MBL na posição -550 na população, observamos que 36%,
45% e 44% dos indivíduos apresentaram o alelo L e 64%, 55% e 56% dos indivíduos
apresentaram o alelo H nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão ocular, respectivamente. Não foi observada diferença
estatística significativa na comparação entre os alelos (tabela 12).
Tabela 12: – Freqüência dos genótipos e alelos de MBL -550 (H/L).
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
CC
9 (0,36)
19 (0,34) 32 (0,36)
CG
14 (0,56) 22 (0,40) 35 (0,40)
GG
2 (0,08) 14 (0,26) 21 (0,24)
Total
25 55
88
Alelos
H
18 (0,36) 50 (0,45) 77 (0,44)
L
32 (0,64) 60 (0,55) 99 (0,56)
Total
50
110 176
O polimorfismo na região promotora do gene de MBL X/Y é caracterizado
pela mudança de uma citosina por uma guanina na posição -221. O produto
amplificado possui 330 pb e é digerido com Bsa J I, originando dois fragmentos de
243 pb e de 87 pb quando o alelo X (-221C) é presente. Na presença do alelo Y
(-221G), o fragmento 243 pb é clivado gerando fragmentos de 166 pb e de 77 pb
(Madsen et al., 1995; Madsen et al., 1998). Indivíduos que possuem duas bandas de
243 pb e de 87 pb são homozigotos com genótipo CC (alelos XX). Quando são
visualizadas três bandas (243 pb, 166 pb e 77 pb), apenas um alelo foi clivado,
revelando que o indivíduo é heterozigoto com genótipo GC (alelos X/Y). Indivíduos
que possuem duas bandas de 166 pb e de 77 pb são homozigotos com genótipo GG
(alelos Y/Y) (Figura 9).
Figura 9: Polimorfismo do gene de MBL na posição -221 (X/Y):
Produto da digestão com BsaJI de quatro voluntários ilustrando dois
indivíduos homozigotos com genótipo GG (alelos YY), apresentando
duas bandas de 166 pb e 77 pb, um indivíduo heterozigoto com
genótipo CG (alelos X/Y), apresentando três bandas de 243 pb, 166
pb e 77 pb e um indivíduo homozigoto com genótipo CC (alelos X/X),
apresentando duas bandas de 243 pb e 87 pb. Os fragmentos foram
observados em gel de agarose 4% marcado com brometo de etídeo.
Para este experimento foi utilizado o marcador de peso molecular de
DNA de 100 pb (Invitrogen).
Avaliamos 131 indivíduos da área de Erechim, sendo 11 indivíduos
soronegativos, 44 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e 76 indivíduos
soropositivos com lesão ocular. Analisamos as freqüências dos genótipos do gene
de MBL na posição -221 nesta população e observamos que 81%, 70% e 60% dos
indivíduos apresentaram o genótipo GG, 19%, 23% e 35% dos indivíduos
apresentaram o genótipo CG e 0%, 7% e 5% dos indivíduos apresentaram o
genótipo CC, nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão e soropositivos
com lesão, respectivamente. As porcentagens dos genótipos entre os grupos foram
semelhantes. Quando analisamos a freqüência dos alelos, observamos que 9%,
18% e 22% dos indivíduos apresentaram o alelo X, e 91%, 82% e 78% dos
indivíduos apresentaram o alelo Y nos grupos soronegativos, soropositivos sem
lesão e soropositivos com lesão ocular, respectivamente. Não foi observada uma
diferença estatística significativa na comparação entre os alelos (tabela 13).
Tabela 13: – Freqüência dos genótipos e alelos de MBL -221 (X/Y).
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
GG
9 (0,81)
31(0,70) 46 (0,60)
GC
2 (0,19) 10 (0,23) 26 (0,35)
CC
0 (0,00) 3 (0,07) 4 (0,05)
Total
11 44
76
Alelos
X
2 (0,09) 16 (0,18) 34 (0,22)
Y
20 (0,91) 72 (0,82) 118 (0,78)
Total
22
88 152
O polimorfismo no gene de MBL na região 5’ UTR na posição +4 é
caracterizado pela mudança de uma timina por uma citocina. Essa troca de
nucleotídeo cria um sítio de restrição para enzima Taq I, discriminando os alelos
+4P/Q. O produto de PCR possui uma banda de 330 pb. Quando o alelo P (+4C) é
presente, o fragmento é clivado pela Taq I em 304 pb e 26 pb. A presença do alelo
Q (+4T) elimina o sítio de restrição e o produto amplificado continua não clivado (340
pb) (Madsen et al., 1995; Madsen et al., 1998). Indivíduos que apresentam uma
banda de 330 pb são homozigotos com genótipo TT e alelos Q/Q. Quando são
reveladas três bandas: 330 pb, 304 pb e 26 pb, o indivíduo é denominado portador
do genótipo CT e alelos P/Q. Indivíduos que apresentam duas bandas, de 304 e 26
pb são homozigotos para o genótipo CC e alelos P/P (Figura 10).
Figura 10: Polimorfismo do gene de MBL na posição +4 (P/Q):
Produto da digestão com Taq I de três voluntários ilustrando um
indivíduo heterozigoto com o genótipo CT (alelos P/Q),
apresentando duas bandas de 330 pb e 304 pb (a banda de 26 pb
não está demonstrada), um indivíduo homozigoto com genótipo CC
e alelos P/P, apresentando uma banda de 304 pb (a banda de 26
pb não está demonstrada) e um indivíduo homozigoto com o
genótipo TT e alelos Q/Q, apresentando uma banda de 330 pb. Os
fragmentos foram observados em gel de agarose 4% marcado com
brometo de etídeo. Para este experimento foi utilizado o marcador
de peso molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Avaliamos 141 indivíduos, sendo 12 indivíduos soronegativos, 48
indivíduos soropositivos sem lesão ocular e 81 indivíduos soropositivos com lesão
ocular. Analisando as freqüências dos genótipos gene de MBL na posição +4,
observamos que 66%, 69% e 65% dos indivíduos apresentaram o genótipo CC,
33%, 25% e 30% dos indivíduos apresentaram o genótipo CT e 0%, 6% e 5% dos
indivíduos apresentaram o genótipo TT, nos grupos soronegativos, soropositivos
sem lesão e soropositivo com lesão. As porcentagens dos genótipos entre os grupos
foram semelhantes. Quando analisamos os alelos observamos que 17%, 19% e 20%
dos indivíduos apresentaram o alelo Q, e 83%, 81% e 80% dos indivíduos
apresentaram o alelo P nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão oculares, respectivamente. Não foi observada uma
diferença estatística significativa na comparação entre os alelos (tabela 14).
Tabela 14: – Freqüência dos genótipos e alelos de MBL +4 (P/Q).
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
CC
8 (0,66)
33 (0,69) 53 (0,65)
TC
4 (0,33) 12 (0,25) 25 (0,30)
TT
0 (0,00) 3 (0,06) 3 (0,05)
Total
12 48
81
Alelos
Q
4 (0,17) 18 (0,19) 31 (0,20)
P
20 (0,83) 78 (0,81) 131 (0,80)
Total
24
96 162
A caracterização do polimorfismo no exon 1 do gene de MBL é conferida
pelas análises dos códons 52, 54 e 57. O produto de amplificação destas regiões
apresenta uma banda de 119 pb, e três polimorfismos são revelados pela não
digestão do mesmo produto com três enzimas de restrição.
O polimorfismo no códon 52 é caracterizado pela mudança de uma
citosina por uma timina e resulta na substituição de um aminoácido arginina (R) por
uma cisteína (C), sendo detectado quando o produto de amplificação não é digerido
com a enzima de restrição Hha I. O alelo menos freqüente apresenta uma banda de
119 pb e é denominado de alelo D. Quando o produto de amplificação é digerido, o
alelo A é revelado (Madsen et al., 1994). Indivíduos que apresentam uma banda de
119 pb são homozigotos com o genótipo R52R e alelos D/D. Indivíduos
heterozigotos com genótipos R52C e alelos A/D apresentam três bandas (119 pb, 91
pb e 28 pb) indicando que apenas um alelo foi clivado. Indivíduos que possuem
bandas de 91 pb e de 28 pb são homozigotos com o genótipo C52C e alelos A/A
(figura 11).
O polimorfismo no códon 54 é caracterizado pela mudança de uma
guanina por uma adenina, que resulta na substituição de um aminoácido glutamina
(Q) por um ácido aspártico (D), sendo detectado quando o produto de amplificação
não é digerido com a enzima de restrição Ban I. O alelo menos freqüente na
população apresenta uma banda de 119 pb e é denominado de alelo B. Quando o
produto de amplificação é digerido, o alelo A é revelado (Sumiya et al., 1991).
Indivíduos que possuem uma banda de 119pb são homozigotos com genótipo Q54Q
e alelos B/B. Quando são visualizadas três bandas (119 pb, 84 pb e 35 pb) apenas
um alelo foi clivado, revelando indivíduos heterozigotos com genótipo Q54D e alelos
A/B. Indivíduos que apresentam duas bandas (84 pb e 35 pb) são homozigotos com
genótipo D54D e alelos A/A (Figura 12).
Em relação ao códon 57, o polimorfismo é marcado pela mudança de uma
guanina por uma adenina, resulta na substituição de um aminoácido glicina (G) por
uma glutamina (Q), sendo detectado quando o produto de amplificação não é
digerido pela enzima de restrição Mbo II. O alelo menos freqüente na população
apresenta uma banda de 119 pb e é denominado de alelo C. Quando o produto de
amplificação é digerido, o alelo A é revelado (Lipscombe et al., 1992). Indivíduos que
possuem uma banda de 119 pb são homozigotos com o genótipo G57G e alelos
C/C. Quando são visualizadas três bandas (119 pb, 75 pb e 44 pb) isto significa que
apenas um alelo foi clivado, revelando indivíduos heterozigotos com genótipo G57Q
e alelos A/C. Indivíduos que apresentam duas bandas (75 pb e 44 pb) são
homozigotos com genótipo Q57Q e alelos A/A (Figura 12).
Figura 11: Polimorfismo do exon I do gene de MBL no códon
52: Produto de amplificação digerido com Hha I de quatro
voluntários ilustrando dois indivíduos homozigotos com genótipo
C52C e alelos A/A, apresentando uma banda de 91 pb (a banda de
28 pb não está demosntrada), dois indivíduos heterozigotos com
genótipo R52C e alelos A/D, apresentando duas bandas de 119 pb
e 91 pb (a banda de 28 pb não está demonstrada). Os fragmentos
foram observados em gel de agarose 4% marcado com brometo de
etídeo. Para este experimento foi utilizado o marcador de peso
molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Figura 12: Polimorfismo do exon I do gene de MBL no códon
54: Produto de amplificação digerido com Ban I de três voluntários
ilustrando dois indivíduos heterozigotos com genótipo Q54D e
alelos A/B, apresentando duas bandas de 119 pb e 84 pb (a banda
de 35 pb não está demonstrada) e um indivíduo homozigoto com
genótipo D54D e alelos A/A, apresentando uma banda de 84 pb (a
banda de 35 pb não está demonstrada). Os fragmentos foram
observados em gel de agarose 4% marcado com brometo de
etídeo. Para este experimento foi utilizado o marcador de peso
molecular de DNA de 100 pb (Invitrogen).
Figura 13: Polimorfismo do exon I do gene de MBL no códon
57: Produto da digestão com Mbo II de três voluntários ilustrando
dois indivíduos heterozigoto genótipo G57Q e alelos A/C,
apresentando três bandas de 119 pb, 75 pb e 44 pb e um indivíduo
homozigoto com genótipo Q57Q e alelos A/A, apresentando duas
bandas de 75 pb e 44 pb. Os fragmentos foram observados em gel
de poliacrilamida 15% marcado com brometo de etídeo. Para este
experimento foi utilizado o marcador de peso molecular de DNA de
100 pb (Invitrogen).
Avaliamos 177 indivíduos para o polimorfismo na região do exon 1, no
códon 52, sendo 28 indivíduos soronegativos, 59 indivíduos soropositivos sem lesão
ocular e 90 indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisamos as freqüências
dos alelos de MBL na região do exon 1, e observamos que 5%, 6% e 8% dos
indivíduos apresentaram o alelo D e 95%, 94% e 92% dos indivíduos apresentaram
o alelo A (códon 52), nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão ocular e
soropositivos com lesão ocular, respectivamente. Não foi observada diferença
estatística significativa na comparação entre os alelos (tabela 15).
Tabela 15: – Freqüência dos genótipos e alelos do exon I no códon 52 do gene
de MBL.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
A/A (C52C)
25 (0,89) 52 (0,88)
77 (0,85)
A/D (R52C)
3 (0,11) 7 (0,12) 13 (0,15)
D/D (R52R)
0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)
Total
28 59
90
Alelos
D
3 (0,05) 7 (0,06) 13 (0,08)
A
53 (0,95) 111 (0,94) 167 (0,92)
Total
56 118
180
Em relação ao polimorfismo no códon 54, avaliamos 154 indivíduos,
sendo 33 indivíduos soronegativos, 45 indivíduos soropositivos sem lesão ocular e
76 indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisamos a freqüência dos alelos e
observamos que 12%, 15% e 14% dos indivíduos apresentaram o alelo B e 88%,
85% e 86% dos indivíduos apresentaram o alelo A, nos grupos soronegativos,
soropositivos sem lesão ocular e soropositivo com lesão ocular, respectivamente.
Observamos que a porcentagem dos alelos B e A entre os grupos foi semelhante
(tabela 16).
Tabela 16: – Freqüência dos genótipos e alelos do exon I no códon 54 do gene
de MBL.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
A/A (D54D)
27 (0,82)
32 (0,71) 55 (0,72)
A/B (D54Q)
4 (0,12) 12 (0,27) 21 (0,28)
B/B (Q54Q)
2 (0,06) 1 (0,02) 0 (0,00)
Total
33 45
76
Alelos
B
8 (0,12) 14 (0,15) 21 (0,14)
A
58 (0,88) 76 (0,85) 131 (0,86)
Total
66
90 152
Para investigarmos o polimorfismo no códon 57, avaliamos 179
indivíduos, sendo 37 indivíduos soronegativos, 56 indivíduos soropositivos sem
lesão ocular e 86 indivíduos soropositivos com lesão ocular. Analisando a
freqüências dos alelos observamos que 0%, 0% e 1% dos indivíduos apresentaram
o alelo C nos grupos soronegativos, soropositivos e soropositivos com lesão ocular,
respectivamente e 100%, 100% e 99% dos indivíduos apresentaram o alelo A nos
grupos de soronegativos, soropositivos sem lesão e soropositivos com lesão
oculares, respectivamente. Observamos que a porcentagem dos alelos C e A entre
os grupos foram semelhantes (tabela 17).
Tabela 17: – Freqüência dos genótipos e alelos do exon I no códon 57 do gene
de MBL.
Soronegativos Soropositivos sem lesão Soropositivos com lesão
Genótipos
A/A (Q57Q)
37 (1,00) 56 (1,00) 85 (0,99)
A/C (Q57G)
0 (0,00) 0 (0,00) 1 (0,01)
C/C (G57G)
0 (0,00) 0 (0,00) 0 (0,00)
Total
37 56
86
Alelos
C
0 (0,00) 0 (0,00) 1 (0,01)
A
74 (1,00) 112 (1,00) 171 (0,99)
Total
74
112 172
A análise dos haplótipos de MBL não foi realizada, uma vez que as
amostras de poucos indivíduos amplificaram para todos os seis genes de MBL
necessários para realizar esta análise. Estes voluntários foram recrutados
novamente e estamos empenhados em finalizar esta investigação.
5-DISCUSSÃO
A doença ocular causada pelo T. gondii se manifesta como retinocoroidite,
em que lesões focais na retina e intensa reação inflamatória no vítreo são
características. A lesão clássica inicia-se na retina neural e, com o desenvolvimento
da resposta inflamatória, ela passa a envolver as demais camadas da retina e a
coróide. Com a diminuição da resposta inflamatória a lesão progride para a
cicatrização e atrofia com bordas hiperpigmentadas. Podem ocorrer sucessivas
recidivas da lesão ocular nas bordas da lesão primária, freqüentemente com perda
de visão (Boyer, 1996). Os fatores que levam ao desenvolvimento da doença ocular
na fase aguda ou na fase crônica da infecção, assim como a ocorrência de recidivas
ainda não foram esclarecidos. Sugere-se, contudo, que diferenças genéticas dos
hospedeiros e das cepas do Toxoplasma gondii podem estar associadas a maior ou
menor suscetibilidade ao desenvolvimento das lesões e o longo tempo de exposição
ao parasita em áreas endêmicas pode favorecer o comprometimento ocular (Ronday
et al., 1995; Vallochi et al., 2002).
Dados do nosso grupo sugerem que a resistência à infecção pelo
T. gondii pode estar relacionada com a secreção de IL-12 e IFN-γ, como a
observada em indivíduos soropositivos sem lesões oculares, ao passo que a
suscetibilidade ao desenvolvimento de lesões oculares está associada à produção
de IL-1, TNF-α e IL-10 (Yamamoto et al., 2000).
A ação do TNF-α na infecção por T. gondii tem sido bastante investigada.
No modelo murino, o TNF-α tem um importante papel na resistência à toxoplasmose
crônica e aguda (Chang et al., 1990; Johnson, 1992; Langermans et al., 1992).
Contudo, altos níveis desta citocina, produzidos durante a infecção letal em murinos,
podem contribuir para o dano hepático e cerebral (Black et al., 1989; Beaman et al.,
1992; Marshall et al., 1999). Além disso, a produção de TNF-α está associada à
disseminação intracerebral de T. gondii em camundongos (Grau et al., 1992) e como
nosso grupo demonstrou, está associada à ocorrência de retinocoroidite
toxoplásmica em humanos (Yamamoto et al., 2000).
A investigação da ocorrência dos alelos A e G (-308 e -308) do gene
TNFA no grupo de voluntários infectados com e sem lesões oculares revelou que
estes estão em freqüências similares nos dois grupos. A produção diferenciada de
TNF-α observada em estudo anterior, entre indivíduos soropositivos para T. gondii
com e sem lesões oculares (Yamamoto et al., 2000) não é, portanto, devida ao
polimorfismo -308 e -208 no gene do TNFA dos indivíduos analisados.
Outros autores também demonstraram não haver associação de
suscetibilidade a doenças e o polimorfismo de TNFA -238A e -308A, como em
pacientes japoneses com doenças auto-imunes como Psoriasis vulgaris, Psoriatic
arthritis ou Pustular psoriasis (Nishibu et al., 2002) e em pacientes da Turquia com
febre reumática aguda (Berdeli et al., 2006). Por outro lado, foi demonstrada a
associação entre esses polimorfismos em TNFA e o desenvolvimento assintomático
e sintomático da doença de Chagas depois da infecção com Leishmania chagasi
(Karplus et al., 2002) e a associação ao desenvolvimento de asma na população
japonesa (Noguchi et al., 2001). Além disso, foi demonstrado que o polimorfismo -
308 no gene de TNFA está associado à redução da sobrevida em pacientes
brasileiros com cardiopatia grave devido à doença de Chagas (Drigo et al., 2005).
Porém nossos dados sugerem que não há associação entre os polimorfismos de
TNFA e o desenvolvimento da toxoplasmose ocular.
Estudos recentes propõem que T. gondii seja um grande manipulador da
resposta imunológica do hospedeiro (Denkers, 2003; Filisetti et al., 2004; Gazzinelli
et al., 2004). O parasita simultaneamente desencadeia respostas associadas à
produção de citocinas protetoras e paradoxalmente suprime os mesmos tipos de
respostas (Denkers, 2003). Esta influência aparentemente contraditória permite o
estabelecimento de uma interação estável entre o parasita e o hospedeiro. Falhas
em estabelecer o sincronismo dessas respostas origina conseqüências negativas
para ambos. A comunicação molecular entre o sistema imune inato do hospedeiro e
o protozoário intracelular T. gondii está surgindo como um exemplo dramático destes
princípios básicos.
O sistema imune inato é importante não somente pela ação imediata de
defesa contra infecção, mas também porque este é essencial para a ativação
adequada do sistema imune adaptativo; e a citocina IL-12 tem papel fundamental
nesta inter-relação (Akira, 2001).
A importância da IL-12 na resistência do hospedeiro ao T. gondii já foi
demonstrada no modelo murino pelo tratamento com anti-IL-12 e pela infecção de
animais deficientes desta citocina (Gazzinelli et al., 1994; Scharton-Kersten et al.,
1996) e está associada à indução da produção de IFN-γ, ao passo que
camundongos deficientes de IL-12 falham na produção de IFN-γ e sucumbem à
toxoplasmose aguda com a mesma cinética observada em camundongos deficientes
de IFN-γ (Scharton-Kersten et al., 1997).
A IL-12 é importante tanto na fase aguda como na crônica da infecção
pelo T. gondii e também na manutenção da resposta imune contra este parasita
(Yap et al., 2000). A função chave de IL-12 é a ativação de STAT-4 e T-bet, os quais
promovem a diferenciação para Th1 (Liesenfeld, 1999). O IFN-γ induz a síntese de
quimiocinas importantes para o recrutamento de linfócito T (Scharton-Kersten et al.,
1996; Liesenfeld, 1999). É amplamente aceito que o IFN-γ é o mediador mais
importante da resistência contra a infecção pelo T. gondii (Scharton-Kersten et al.,
1996).
Neste trabalho analisamos o polimorfismo em um único nucleotídeo (SNP)
na posição 1188 da região 3’ não traduzida no gene de IL-12p40 e observamos que
92%, 85% e 75% dos indivíduos apresentaram o alelo A e 8%, 15% e 25%
apresentaram o alelo C nos grupos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão, respectivamente. Os dados sugerem uma provável
associação matemática do alelo C na população do polimorfismo no gene de IL-12B
ao grupo de voluntários com doença ocular, entretanto a diferença entre os grupos
não é estatisticamente significativa.
Há discordâncias na literatura quanto ao papel do polimorfismo no gene
da IL-12p40 e doenças auto-imunes. Há associação do polimorfismo à
suscetibilidade à diabetes do tipo 1 (Morahan et al., 2002), mas, apesar da redução
nos níveis de mRNA de IL-12 em pacientes com tireoidite auto-imune, não foi
observada associação entre a doença e o polimorfismo (Ikeda et al., 2004).
Entretanto, a IL-12 está envolvida com a resistência à doenças infecciosas em seres
humanos (Yamamoto et al.,2000 ; Yin et al., 2004), uma vez que constatou-se a
presença de infecções auto-limitadas em indivíduos heterozigotos a este
polimorfismo e infecções persistentes pelo vírus da hepatite C (HCV) em pacientes
homozigotos (Yin et al., 2004). Além disso, este polimorfismo é um importante
marcador genético, pois o alelo C está envolvido com a menor produção de IL-12 e
esta produção é dependente do estímulo utilizado (Stanilova et al., 2005).
O envolvimento de resposta auto-imune na destruição da retina também
foi investigado em pacientes com toxoplasmose ocular. Nosso grupo demonstrou
que, embora a presença de uma resposta imune para auto-antígenos não seja
protetora contra o desenvolvimento de lesão ocular pelo T. gondii, esta pode
proteger o desenvolvimento de doença ocular grave. E, quanto à produção de
citocinas, chama atenção a maior produção de IL-10 e IL-12p40 no grupo de
soronegativos do que no de soropositivos, enquanto pacientes com lesão ocular
grave têm altos níveis de IL-12p70, IFN-γ e TNF-α e baixos níveis de IL-10. Essa
produção elevada de IL-10 e IL-12p40 em indivíduos soronegativos pode sugerir a
participação de células reguladoras (Vallochi et al., 2005).
Células dendríticas murinas produzem grande quantidade de IL-12 após
estimulação in vitro e in vivo com antígenos de T. gondii e a produção precoce de IL-
12 está relacionada com a resistência do animal à infecção (Scanga et al., 2002). O
reconhecimento do protozoário pelas DCs envolve a via da molécula adaptadora
MyD88, participante da via dos receptores TLR (Mun et al., 2003). Posteriormente,
outros estudos demonstraram que MyD88 é requerida na defesa contra diferentes
tipos de protozoários, tais como Leishmania spp. (Hawn et al., 2003; De Trez et al.,
2004) e Trypanosoma cruzi (Campos et al., 2001), e outros microorganismos
intracelulares (Zhou et al., 1998; Huffnagle et al., 1999).
Os Toll like receptors, aparentemente, constituem um elemento chave no
sistema imune inato devido à sua propriedade de reconhecer padrões dos
patógenos e de seu envolvimento direto no controle da resposta imune adaptativa
(Iwasaki et al., 2004).
A primeira evidência a respeito da participação de TLR no
reconhecimento do parasita veio dos estudos da infecção com T. gondii e
Plasmodium berghei (Scanga et al., 2002). Estudos subseqüentes demonstraram
que células dendríticas, ainda melhor que macrófagos, são células ativadas pelo
T. gondii ou antígenos solúveis de T.gondii que induzem a produção de IL-12,
independentemente de sinais co-estimuladores mediados por linfócitos, como a
ligação de CD40 ou ativação por IFN-γ (Reis E Sousa et al., 1997). Dados de
Scanga e colaboradores (2002) sustentam esta idéia, onde demonstraram que DCs
esplênicas, bem como macrófagos peritoneais e neutrófilos, derivados da medula
óssea de camundongos deficientes de MyD88 mostraram uma falha na produção de
IL-12 induzida pelo T. gondii.
Um possível TLR envolvido na resposta contra T. gondii é o TLR2, o qual
se associa a âncoras de glicosilfosfatidilinositol (GPI), abundantes nas membranas
de taquizoítas, bem como, de outros parasitas, incluindo Tripanosoma, Leishmania e
Plasmodium ssp (Campos et al., 2001; Ropert et al., 2002; Gazzinelli et al., 2004).
Além de GPIs, outros ligantes de TLR2, ainda desconhecidos, presentes em T.
gondii estimulam a produção de citocinas por macrófagos (Debierre-Grockiego et al.,
2003). O envolvimento dos TLRs na resposta pró-inflamatória dos macrófagos contra
os protozoários tem sido demonstrado e que, in vivo, o TLR2 tem um papel
predominantemente imunoregulador durante a infecção aguda pelo T. cruzi (Ropert
et al., 2004).
Analisamos os polimorfismos nos genes de TLR 2, TLR 4 e TLR 5 e sua
associação à ocorrência de toxoplasmose ocular. Quando avaliamos o polimorfismo
Arg753Gln no gene TLR2, o polimorfismo Asp299Gly no gene TLR4, e o
polimorfismo TLR5
392STOP
, observamos que tanto indivíduos soronegativos,
soropositivos sem lesão ocular, quanto indivíduos que apresentam lesão ocular, em
sua maioria apresentaram os alelos Q, D e R, enquanto uma pequena porcentagem
dos indivíduos apresentou os alelos R, G, STOP, respectivamente, sendo os
resultados estatisticamente não significativos.
Tem sido demonstrado que camundongos deficientes de TLR2 como de
MyD88 são altamente susceptíveis a infecção com Staphylococcus aureus
(Takeuchi, Takeda et al., 2000) e Streptococcus pneumoniae (Echchannaoui et al.,
2002). Além disso, foi demonstrado que camundongos deficientes de TLR2
infectados com T. gondii produziam menos IL-12p40 quando comparados com
camundongos selvagens (Scanga et al., 2002). Porém, outros autores demonstraram
que camundongos deficientes de TLR2 mostram aumento da suscetibilidade ao T.
gondii, mas somente quando infectados com altas doses do parasita (Mun et al.,
2003).
Em humanos, o polimorfismo Arg753Gln do gene TLR2 (Lorenz et al.,
2000) está associado ao desenvolvimento de tuberculose (Ogus et al., 2004), como
também é fortemente associado a febre reumática em crianças (Berdeli et al.,
2005). Entretanto nossos dados demonstram que o polimorfismo no gene TLR2 não
está associado ao desenvolvimento da toxoplasmose ocular.
O polimorfismo Asp299Gly no gene TLR4 atenua a sinalização por este
receptor e já foi demonstrado que este polimorfismo está associado a um aumento
no risco de doenças coronarianas na população caucasiana de etnia chinesa em
Taiwan (Lin et al., 2005). Entretanto, camundongos deficientes de TLR4 não são
mais susceptíveis à infecção com T. gondii quando comparados com camundongos
selvagens (Scanga et al., 2002) e nossos resultados sugerem que o polimorfismo no
gene de TLR4 não está associado à suscetibilidade a toxoplasmose ocular.
Recentemente, o grupo do Dr. Sher demonstrou que TLR11 é o principal
receptor de reconhecimento de padrão envolvido na sinalização para a produção de
IL-12 por DCs em resposta aos estímulos por T. gondii e por outros apicomplexas.
Além disso, verificaram que TLR11 se ligava à moléculas do tipo profilin-like
encontradas em T. gondii (Yarovinsky et al., 2005).
Em células humanas, o TLR11 provavelmente não é um receptor
funcional, devido à presença de um códon de parada que impede a codificação do
receptor completo. Porém, a análise filogenética de componentes da família dos
TLRs indicou grande similaridade entre TLR11 e TLR5, sugerindo que estes dois
receptores são moléculas conservadas evolutivamente e que possam ter funções
biológicas semelhantes (Zhang et al., 2004).
O polimorfismo TLR5
392STOP
interrompe prematuramente a tradução da
proteína, causando a perda dos domínios extracelular e intracitoplasmático
envolvidos na sinalização do TLR5. Este polimorfismo está associado à maior
suscetibilidade para pneumonia causada por Legionella pneumophila (Hawn et al.,
2003). Entretanto, nossos dados sugerem que o polimorfismo de TLR5 não está
associado à suscetibilidade a toxoplasmose ocular.
Alguns autores propõem a associação de mais de um polimorfismo em
diferentes TLRs e susceptibilidade ao T. gondii. Avaliamos a correlação simultânea
entre os polimorfismos em TLR 2, TLR 4 e TLR 5 e a doença ocular e não
detectamos associação da doença ocular com dois ou mais polimorfismos em
receptores toll.
O sistema imune inato possui receptores conservados evolutivamente que
reconhecem padrões, estes podem ser expressos nas superfície de células, como os
TLR, ou secretados nos fluídos corporais, como as MBL (Medzhitov e Janeway,
1997). As lectinas ligantes a manose (MBL) são proteínas que reconhecem
moléculas solúveis e são produzidas pelo fígado durante uma resposta aguda em
infecções recentes (Gewurz et al., 1982; Schwalbe et al., 1992; Thiel et al., 1997;
Fraser et al., 1998).
Analisamos o polimorfismo no promotor -550 (H/L) do gene MBL e
observamos que nos grupos de indivíduos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão ocular aproximadamente 50% dos indivíduos nos três
grupos apresentaram o alelo H e 50% dos indivíduos apresentaram o alelo L. No
entanto, o polimorfismo na posição -221 (X/Y) do promotor e na região 5´UTR +4
(P/Q), tantos os indivíduos soronegativos e soropositivos sem lesão como os
soropositivos com lesão apresentaram aproximadamente 80% dos alelos Y e P nos
três grupos, enquanto que aproximadamente 20% dos indivíduos apresentaram os
alelos X e Q, respectivamente.
Em relação aos polimorfismos nos exons de MBL, caracterizado pelas
análises dos códons 52 (D), 54 (B) e 57 (C) destes mesmos indivíduos, observamos
que aproximadamente 90% dos indivíduos soronegativos, soropositivos sem lesão e
soropositivos com lesão ocular apresentaram o alelo A, enquanto que
aproximadamente 10% dos indivíduos apresentaram os alelos D, B e C. O conjunto
de dados do gene MBL sugere que não há associação da presença de alelos raros e
suscetibilidade à toxoplasmose ocular. Uma outra maneira de analisar esses dados
é considerar a formação da configuração cis ou trans dos alelos, originando assim os
diferentes haplótipos de MBL.
As variantes estruturais da molécula de MBL podem ser responsáveis
pela baixa concentração de MBL no soro e a freqüência dos haplótipos de MBL pode
estar correlacionada com diferentes grupos étnicos (Madsen et al., 1995). O
haplótipo HY, está correlacionado com altos níveis de MBL no soro, LY com nível
intermediário e o haplótipo LX com baixo nível de MBL no soro. As influências das
variações X/Y são mais expressivas do que a variação H/L (Madsen et al., 1995). É
razoável supor que baixas concentrações de MBL são desvantajosas, pois podem
acarretar deficiência na opsonização, que pode aumentar a susceptibilidade a
infecções (Super et al., 1989). Trabalhos recentes realizados pelo nosso grupo
mostraram que o T. gondii está presente na circulação sangüínea de indivíduos com
infecção crônica (Silveira et al., submitted to JID). Isto poderia nos sugerir o papel da
opsonização, fagocitose e ativação do complemento na eliminação do parasita
extracelular. Entretanto, nossos resultados demonstraram que o polimorfismo de
MBL não está associado ao desenvolvimento de lesão ocular.
Além desses estudos foram identificados oito alelos para os haplótipos
dos genes de MBL2, sendo HYPA, HYPD, LYPA, LYPB, LYPD, LXPA, LYQA e
LYQC, e 26 diferentes genótipos. Indivíduos brasileiros com descendência européia
apresentam 16,8% com genótipo HYPA/LXPA, 12,4% com genótipo HYPA/LYQA e
11,4% com genótipo HYPA/HYPB; indivíduos brasileiros com descendência africana
apresentam 18,75% com genótipo LYQA/LYPA, 12,50% com genótipo LXPA/LYQC,
9,4% com genótipo LYPA/LYPA e 9,4% HYPA/LYQA e indivíduos brasileiros com
descendência oriental apresentam 25% HYPA/HYPA, 25% HYPA/HYPB e 18,75%
HYPA/LXPA (Thiel et al., 1997).
A população da região de Erechim é de caucasianos, principalmente
poloneses e italianos (Glasner et al., 1992). Segundo alguns estudos (Madsen et al.,
1994; Madsen et al., 1995; Liesenfeld, 1999), seria razoável encontrarmos os
haplótipos LY e os alelos B ou C na população estudada, como também indivíduos
com genótipos HYPA/LXPA, HYPA/LYQA, HYPA/HYPB. Entretanto não foi possível
analisarmos os haplótipos nesta população, uma vez que amostras de poucos
indivíduos amplificaram para todos os seis genes de MBL necessários para realizar
esta análise. Estes voluntários foram recrutados novamente e estamos empenhados
em finalizar esta investigação.
A relação entre doenças auto-imunes, imunodeficiências, doenças
infecciosas e polimorfismos genéticos tem sido reportados em vários estudos. Nós
investigamos polimorfismos em seis genes diferentes, responsáveis pela tradução
de moléculas importantes, particularmente para a ativação da resposta imune inata e
controle da infecção por T. gondii. Em um estudo anterior, nosso grupo demonstrou
que, em sobrenadante de cultura de células de voluntários com doença ocular desta
mesma população, os níveis de IL-12 secretada estavam reduzidos. Entretanto, a
presença do alelo C, associado à baixa produção de IL-12, não está associada à
susceptibilidade à toxoplasmose ocular na população estudada. Além disso, embora
tenhamos analisado amostras de mais de 130 voluntários, não conseguimos
estabelecer correlação estatisticamente significativa entre a doença ocular e os
polimorfismos analisados de TNFA e MBL, assim como de TLR 2, TLR 4, TLR 5,
prováveis receptores envolvidos na produção inicial de IL-12, fundamental para a
resistência ao T. gondii.
6-CONCLUSÃO
9 Concluímos que o alelo G dos polimorfismos G308A e G238A no gene
de TNFA, o alelo A do polimorfismo A1188C no gene de IL-12B, o alelo Q do
polimorfismo Arg753Gln no gene de TLR2, o alelo D do polimorfismo Asp299Gly no
gene de TLR4, o alelo R do polimorfismo R392Stop do gene de TLR5 são os mais
freqüentes na população de Erechim.
9 Ao passo que no gene de MBL, o alelo Y da posição -221, o alelo P da
posição +4 e o alelo A da região do exon 1 nos códons 52, 54 e 57 são os mais
freqüentes na população, enquanto que os alelos H e L estão presentes igualmente
nos indivíduos analisados.
9 Os dados sugerem uma provável associação matemática do alelo C na
população do polimorfismo no gene de IL-12B ao grupo de voluntários com doença
ocular, entretanto a diferença entre os grupos não é estatisticamente significativa.
9 Não foi verificada nenhuma associação entre a doença ocular e os
polimorfismos investigados em TNFA e MBL, assim como em TLR 2, TLR 4, TLR 5,
prováveis receptores envolvidos na produção inicial de IL-12, fundamental para a
resistência ao T. gondii.
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