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GABRIEL DAMIANI VICTORA
RESPOSTA IMUNE ÀS PROTEÍNAS DE CHOQUE
TÉRMICO 65 E 60 EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE
DE CABEÇA E PESCOÇO VACINADOS COM
DNA-HSP65 EM ENSAIO CLÍNICO DE FASE I
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GABRIEL DAMIANI VICTORA
RESPOSTA IMUNE ÀS PROTEÍNAS DE CHOQUE
TÉRMICO 65 E 60 EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE
DE CABEÇA E PESCOÇO VACINADOS COM
DNA-HSP65 EM ENSAIO CLÍNICO DE FASE I
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências (Imunologia).
São Paulo
2006
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GABRIEL DAMIANI VICTORA
RESPOSTA IMUNE ÀS PROTEÍNAS DE CHOQUE
TÉRMICO 65 E 60 EM INDIVÍDUOS
PORTADORES DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE
DE CABEÇA E PESCOÇO VACINADOS COM
DNA-HSP65 EM ENSAIO CLÍNICO DE FASE I
Dissertação de Mestrado apresentada
ao Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para
obtenção do Título de Mestre em
Ciências.
Área de concentração:
Imunologia
Orientadora:
Verônica Coelho
São Paulo
2006
Dedico esta tese à memória dos
19 pacientes que faleceram no
decorrer do presente estudo e,
principalmente, aos dois que
continuam vivos, na esperança
de que meu trabalho possa
contribuir para que mais e mais
pacientes permaneçam entre
estes últimos.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Jorge Kalil pela amizade, acolhimento e principalmente pelo
papel decisivo na minha mudança de carreira;
À Verônica Coelho pela disposição em orientar uma pessoa vinda de uma
área tão remota e pelo ânimo e otimismo com que me ajudou a enfrentar
todas as dificuldades inerentes a um ensaio clínico;
Ao Rajendranath Ramasawmy, meu primeiro orientador e grande amigo, pela
introdução ao mundo das ciências biológicas;
---
Ao meu pai, que me ensinou a ser cientista muito antes de eu saber o que
era imunologia;
À minha mãe e à minha irmã, por todo o apoio;
À Angelina Bilate, pelo amor, companheirismo e paciência;
----
A toda a equipe clínica do estudo de fase I, especialmente ao Dr. Pedro
Michaluart Jr. e à Dra. Fanny Dantas Lima;
Ao Adalberto Socorro da Silva, grande amigo e parceiro nesse projeto, por ter
dividido comigo o árduo trabalho de coleta e processamento dos materiais
biológicos;
À Evelyn Volsi, cuja ajuda nesse sentido também foi indispensável;
À Cristina Caldas e à Geórgia Porto, entre outras coisas, pela ajuda na
produção das proteínas recombinantes;
Ao restante do Grupo de Transplantes do laboratório de Imunologia do InCor,
especialmente à Sandra Maria Monteiro e à Lin Hui Tzu.
À Andréia Kuramoto e à Priscila Teixeira pela ajuda na análise das proteínas
recombinantes;
Ao Fábio Higa e à Letícia Tozzi pela ajuda com a padronização dos ensaios
de ELISA;
À Sandra Emiko Oshiro, pela enorme ajuda com os ensaios celulares;
Ao Laboratório de HLA pelo processamento e estocagem dos soros;
À Dra. Luiza Guglielmi e ao Dr. Edecio Cunha Neto pela ajuda com a
discussão dos presentes e de outros resultados;
RESUMO
Victora GD. Resposta imune às proteínas de choque térmico 65 e 60 em
indivíduos portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
vacinados com DNA-Hsp65 em ensaio clínico de fase I.
[dissertação/dissertation]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo; 2006.
A vacina de DNA que codifica a proteína de choque térmico de 65 kDa
(Hsp65) de Micobacterium leprae (DNA-Hsp65), desenvolvida inicialmente
como vacina preventiva e terapêutica para a tuberculose, foi capaz também
de prevenir a instalação de tumores em modelos experimentais em
camundongos, induzindo uma potente resposta anti-tumoral. Essa vacina foi
utilizada pela primeira vez em um ensaio clínico de Fase I com pacientes com
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço sem alternativas terapêuticas.
O objetivo do presente estudo foi avaliar se a vacina DNA-Hsp65 em
plasmídeo pVAX é capaz de induzir resposta humoral e celular nos pacientes
vacinados nesse ensaio. Além disso, como a resposta imune à homóloga
humana da Hsp65 – Hsp60 – está envolvida em vários processos auto-
imunes, investigamos também se a vacinação com DNA-Hsp65 foi capaz de
alterar a resposta imune à Hsp60 humana. Vinte e um pacientes receberam
três doses de 150, 400 ou 600 µg de DNA-Hsp65 por via intratumoral, com
intervalo de três semanas entre as doses. Amostras de sangue periférico
foram coletadas antes e em vários tempos após a vacinação. As respostas
humoral e celular sistêmica contra Hsp65 e Hsp60 foi analisada por ELISA
para detecção de anticorpos, por Elispot para detecção de células produtoras
de IFN-γ e IL-10, e proliferação celular. Não houve variação nos níveis de IgG
ou IgM anti-Hsp60 ou Hsp65 ou produção de IFN-γ na resposta contra a
Hsp65 ao longo ou após a vacinação em qualquer dos pacientes,
independentemente da dose de vacina recebida. Houve baixa produção de
IFN-γ na resposta contra a Hsp60 em alguns pacientes, mas esta
aparentemente não esteve associada à vacinação. Houve aumento na
produção de IL-10 ao longo da vacinação em 4/13 pacientes analisados. No
entanto, esse aumento foi acompanhado de aumento em outras medidas não
específicas, como proliferação espontânea ou produção de IL-10 e IFN-γ
frente a estímulos com toxóide tetânico ou fitohemaglutinina. Não houve
indícios de imunização contra o antígeno segundo os critérios de produção
de anticorpos e IFN-γ. No entanto, parece ter ocorrido imuno-estimulação
não-específica relacionada ao potencial inflamatório da Hsp65 ou mesmo do
DNA plasmideal, o que pode ser favorável para a geração de uma resposta
anti-tumoral.
Palavras-chave: imunoterapia; neoplasias de cabeça e pescoço; vacinas,
DNA; proteína de choque térmico 65, Mycobacterium leprae; proteína de
choque térmico 60, humana; ensaios clínicos, fase I.
ABSTRACT
Victora GD. Resposta imune às proteínas de choque térmico 65 e 60 em
indivíduos portadores de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
vacinados com DNA-Hsp65 em ensaio clínico de fase I.
[dissertação/dissertation]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo; 2006.
DNA-Hsp65, a DNA vaccine encoding heat shock protein 65 (Hsp65)
from Mycobacterium leprae, initially developed as a preventive vaccine
against tuberculosis, was also capable of preventing the installation of tumors
in experimental mouse models, inducing potent antitumoral immune
responses. This vaccine was tested for the first time in human beings in a
phase I clinical including patients with head and neck squamous-cell
carcinoma without therapeutic alternatives. The aim of the present study was
to assess whether DNA-Hsp65, cloned into a pVAX vector, was capable of
inducing humoral and cellular immune responses in the subjects vaccinated in
this trial. In addition, given that reactivity to the human homologue of Hsp65 –
Hsp60 – is believed to be involved in a number of autoimmune processes, we
also investigated whether vaccination with DNA-Hsp65 was capable of
altering physiological immune responses to human Hsp60. Twenty-one
patients were given three intratumoral injections of 150, 400, or 600 µg of
DNA-Hsp65, at three-week intervals. Peripheral blood samples were collected
before and at several time points after vaccination. Systemic humoral and
cellular immune responses to Hsp65 and Hsp60 were analyzed by ELISA for
the presence of serum antibodies, Elispot for the detection of IFN-γ and IL-10
secreting cells, and lymphocyte proliferation. There was no variation in levels
of serum anti-Hsp60 or anti-Hsp65 IgG or IgM, or in the production of IFN-γ
upon stimulation of cells with Hsp65 during or after vaccination in any of the
patients tested, irrespective of vaccine dose. We found low production of IFN-
γ upon stimulation with Hsp60 in 7/13 patients, but this was apparently not
associated with vaccination. There was an increase in the production of IL-10
along with vaccination in 4/13 patients. However, this increase was
accompanied by increases in other non-specific measures, such as
spontaneous lymphocyte proliferation or IL-10 or IFN-γ production in response
to tetanus toxoid or phytohemagglutinin. We found no evidence of
immunization against Hsp65, as determined by antibody and IFN-γ
production. However, our data suggest the presence of non-specific immune
stimulation related to the inflammatory potential of Hsp65 and/or of plasmid
DNA, which may also favor the generation of an antitumoral immune
response.
Key words: immunotherapy; head and neck neoplasms; vaccines, DNA;
heat-shock protein 65, Mycobacterium leprae; heat-shock protein 60, human;
clinical trials, phase I.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................11
2 OBJETIVOS....................................................................................................24
2.1 Objetivo geral...........................................................................................24
2.2 Objetivos específicos ...............................................................................24
3 MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................25
3.1 Casuística ................................................................................................25
3.2 Desenho experimental .............................................................................28
3.2.1 Coleta de material biológico de pacientes elegíveis.................................28
3.3 Antígenos.................................................................................................29
3.3.1 Produção das regiões intermediária e C-terminal da Hsp60....................29
3.3.2 Remoção de endotoxinas.........................................................................31
3.4 Caracterização da resposta imune...........................................................32
3.4.1 Separação de PBMC ...............................................................................32
3.4.2 Congelamento e descongelamento de PBMC .........................................32
3.4.3 Proliferação celular por incorporação de timidina
3
H ...............................33
3.4.4 Detecção de anticorpos contra Hsp60 e Hsp65.......................................34
3.4.5 Detecção de células produtoras de IL-10 e IFN-γ por Elispot ..................35
3.5 Análise estatística ....................................................................................38
4 RESULTADOS ...............................................................................................39
4.1 Expressão
, purificação e remoção de endotoxina de proteínas
recombinantes..........................................................................................39
4.2 Obtenção de material biológico................................................................40
4.2.1 Sangue.....................................................................................................40
4.3 Avaliação da resposta imune sistêmica ...................................................42
4.3.1 Produção de anticorpos específicos contra Hsp65 e Hsp60....................42
4.3.2 Proliferação de linfócitos por incorporação de timidina
3
H .......................45
4.3.3 Produção de IFN-
γ
e IL-10 .......................................................................49
4.4 Avaliação clínica e laboratorial de rotina..................................................54
4.4.1 Eventos adversos potencialmente relacionados à resposta imune..........54
4.4.2 Avaliação de sinais clínicos de auto-imunidade patológica......................54
4.4.3 Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia ..........................................55
4.4.4 Contagem de neutrófilos
, linfócitos e monócitos......................................57
4.5 Caracterização geral da resposta imune individual..................................60
5 DISCUSSÃO...................................................................................................69
6 CONCLUSÕES...............................................................................................88
REFERÊNCIAS..................................................................................................89
ANEXO 1 – Projeto do ensaio clínico de fase I na íntegra ............................97
ANEXO 2 – Critérios de seleção de pacientes..............................................108
ANEXO 3 – Resultados brutos.......................................................................109
Introdução 11
1 INTRODUÇÃO
A terapia gênica para a indução de resposta imune contra tumores tem
sido bastante estudada nos últimos anos como forma de superar a baixa
imunogenicidade característica de antígenos tumorais. Duas abordagens têm
predominado tanto em modelos experimentais quanto em ensaios clínicos. A
primeira abordagem, baseada no conceito clássico de vacinação, propõe a
utilização de vacinas de DNA que codificam antígenos tumorais definidos,
tais como PSA (do inglês, prostate-specific antigen) (Pavlenko et al., 2004) e
MART-1 (do inglês, melanoma-associated antigen recognized by T cells)
(Triozzi et al., 2005), gerando assim resposta específica contra células
tumorais. Tal abordagem é válida apenas para tumores para os quais existem
antígenos específicos definidos, como é o caso do tumor de próstata e do
melanoma.
A segunda abordagem, mais geral, baseia-se na utilização de
plasmídeos contendo genes codificadores de citocinas (Mach; Dranoff, 2000)
ou moléculas co-estimulatórias (Townsend; Allison, 1993), visando facilitar a
ativação do sistema imune de forma não-específica, revertendo a
imunossupressão causada pelo tumor. Essa abordagem tem a vantagem de
prescindir de uma definição do antígeno tumoral, dado que a estimulação não
é antígeno-específica. Em contrapartida, tais vacinas não têm por base um
mecanismo específico para a apresentação dos antígenos tumorais ao
sistema imune.
Uma terceira alternativa para indução de resposta imune anti-tumoral,
que combinaria a imuno-estimulação não-específica característica da terapia
gênica com citocinas e moléculas co-estimulatórias com a especificidade da
Introdução 12
apresentação de antígenos tumorais, é uso de proteínas de choque térmico,
ou HSP (do inglês, heat-shock proteins) (Srivastava, 2002a).
As HSP, apesar de originalmente descritas devido a sua elevada
expressão em situações de estresse térmico (Tissieres; Mitchell; Tracy,
1974), são proteínas expressas constitutivamente em todas as células. Em
condições fisiológicas, essas proteínas correspondem a em torno de 5% da
massa protéica de uma célula, podendo essa proporção chegar a 15% em
situações de estresse celular (Srivastava, 2002a; Pockley, 2003). As HSP
estão entre as proteínas mais conservadas filogeneticamente, com, por
exemplo, homologias de até 50% entre as seqüências de aminoácidos da
HSP de 60 kD (Hsp60) humana e de micobactéria (Jindal et al., 1989). As
diversas famílias de HSP (Small Hsps, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90,
Hsp100, calreticulina, entre outras) desempenham funções essenciais na
manutenção da homeostase celular, servindo principalmente como
chaperonas moleculares, moléculas que carreiam e estabilizam outras
proteínas em estágios intermediários de dobramento, montagem e
translocação através de membranas, bem como durante o processo de
degradação (Bukau; Horwich, 1998).
Além dessas funções, as HSP desempenham importante papel na
ativação e regulação do sistema imune (van Eden; van der Zee; Prakken,
2005). O estudo da interação das HSP com o sistema imune teve origem na
observação de que anticorpos e linfócitos T reativos a HSP autólogas e
bacterianas poderiam estar envolvidos no desenvolvimento de diversas
doenças auto-imunes (Kiessling et al., 1991), que foram seguidas de
inúmeros estudos sugerindo um papel regulador para as HSP em vários
Introdução 13
contextos (van Eden; van der Zee; Prakken, 2005). A capacidade das HSP de
estimular diretamente o sistema imune inato levou à hipótese de que as HSP
poderiam servir como “sinais de perigo” que, quando liberados no meio
extracelular por rompimento da membrana plasmática, levariam à ativação do
sistema imune (Matzinger, 1994, 2002; Chen et al., 1999).
Outra vertente de estudos mostrou que as HSP autólogas são capazes
de transportar peptídeos antigênicos, tanto no interior da célula quanto no
meio extracelular, estando diretamente envolvidas na apresentação de
antígenos. A apresentação auxiliada pelas HSP pode ocorrer tanto pela via
tradicional quanto pela via cruzada (cross-priming), o que envolveria
receptores específicos para essas proteínas, tais como o CD91 (Srivastava et
al., 1998; Srivastava, 2002a,b). A combinação de carreamento/apresentação
de antígenos e imuno-estimulação não-específica fez das HSP uma
alternativa interessante para a imunoterapia de tumores. O trabalho pioneiro
de Srivastava e colaboradores mostrou que imunização com preparados de
HSP purificadas de tumores mostrou-se eficaz na inibição do
desenvolvimento do próprio tumor de origem, mas não de outros tumores.
Isso foi atribuído à capacidade das Hsp70, 90 e gp96 autólogas de se ligarem
a peptídeos intracelulares, carregando, entre outros peptídeos, o conjunto de
antígenos tumorais, o que os autores chamaram de antigen fingerprint, ou o
painel de peptídeos antigênicos do tumor. Por um mecanismo de
apresentação/imuno-estimulação ainda pouco definido, mas que pode
envolver a presença de receptores para as HSP em células apresentadoras
de antígeno, as HSP contendo o painel antigênico do tumor foram capazes
de desencadear resposta imune específica contra o tumor de origem. O fato
Introdução 14
de que os mesmos preparados foram incapazes de gerar resposta anti-
tumoral após depleção dos peptídeos associados às HSP apóia a hipótese
da sinergia entre apresentação antigênica e imuno-estimulação não-
específica.
No presente estudo, investigamos os efeitos da imunoterapia gênica de
tumores utilizando a Hsp65 de Micobacterium leprae. Essa proteína é parte
da família das Hsp60, também conhecidas como chaperoninas, que são
encontradas no citoplasma de procariotos e nas mitocôndrias de eucariotos,
e estão envolvidas no redobramento de polipeptídeos dobrados de forma
inadequada (Bukau; Horwich, 1998).
As Hsp60 de patógenos são antígenos imunodominantes – isto é,
antígenos contra os quais a resposta imune é preferencialmente direcionada
– em diversas infecções bacterianas, o que levou as Hsp60 de bactérias
patogênicas a serem conhecidas como o “antígeno bacteriano comum”
(Thole et al., 1988). Essa imunodominância serviu como base para estudos
de uma possível utilização do potencial antigênico das Hsp60 no
desenvolvimento de vacinas contra diversos patógenos. A Hsp65, encontrada
em abundância nas micobactérias (M. tuberculosis, M. leprae, M. bovis, etc.),
é um dos antígenos imunodominantes na resposta imune contra esses
microorganismos (Young et al., 1988; Young, 1990; Kaufmann et al., 1991).
Silva, Lowrie e colaboradores mostraram que camundongos imunizados por
via intramuscular com uma vacina de DNA codificador da Hsp65 de M. leprae
(vacina DNA-Hsp65, inicialmente clonada em vetor pcDNA3.1)
desenvolveram resposta protetora semelhante à induzida por imunização
com BCG quando desafiados com M. tuberculosis por via intravenosa ou
Introdução 15
intraperitoneal (Lowrie; Silva; Tascon, 1997; Lowrie et al., 1999). A vacina
também foi eficaz no tratamento de animais já infectados, gerando resposta
predominantemente do tipo Th1, com produção de interferon (IFN)-γ e altos
títulos de IgG2a.
Além de seu potencial para a prevenção e tratamento da tuberculose,
outros estudos mostraram também que a vacina DNA-Hsp65 pode ter efeito
anti-tumoral, reforçando a idéia de que as HSP podem ser utilizadas na
imunoterapia gênica de tumores. O primeiro desses estudos, realizado por
Lukacs et al. (1993) mostraram que a transfecção estável de linhagens
celulares altamente tumorigênicas (J774) com DNA-Hsp65 em vetor retroviral
pZIPNeoSV(x) tornou-as incapazes de gerar tumores quando injetadas no
peritônio de camundongos. Desafio posterior com células J774 não-
transfectadas também resultou em rejeição, embora a instalação de outras
linhagens tumorais não tenha sido afetada. Isso sugere que a injeção prévia
de células transfectadas com Hsp65 foi capaz de gerar resposta imune de
memória contra antígenos específicos do tumor de origem, o que foi
confirmado pela presença de células T citotóxicas contra células J774 não-
transfectadas. Efeito semelhante foi detectado pelo mesmo grupo utilizando a
vacina DNA-Hsp65. A vacinação de camundongos portando tumores já
instalados (4º ou 10º dias após a injeção intraperitoneal de células J774)
com DNA-Hsp65 por via intraperitoneal resultou em importante diminuição no
tamanho dos tumores (Lucaks et al., 1997), sugerindo que a imunoterapia
gênica com Hsp65 poderia ser aplicável a tumores humanos. Nesse estudo
também houve imunização contra antígenos tumorais, demonstrada pelo
aumento da reatividade humoral a lisados de células J774 não-transfectadas.
Introdução 16
Esses achados foram confirmados por estudo realizado posteriormente
por grupo independente (Lanuti et al., 2000). Nesse estudo, utilizou-se um
modelo de mesentelioma em camundongos CBA, bastante semelhante ao
modelo de Lukacs et al., mostrando-se um aumento dramático na sobrevida
de animais vacinados após a indução do tumor com plasmídeo pCMV
contendo o gene da Hsp65. Também nesse modelo, houve resposta
secundária após desafio com a mesma linhagem celular, com importante
participação de linfócitos T citotóxicos. No entanto, efeito semelhante foi
observado com plasmídeo contendo o gene da β-galactosidase ou com o
plasmídeo vazio, sugerindo uma atividade independente da presença da
Hsp65.
Em vista dos resultados promissores obtidos em animais, foi proposta a
realização de um ensaio clínico de Fase I com a vacina DNA-Hsp65 em
indivíduos portadores de tumor epidermóide de cabeça e pescoço sem
alternativas de tratamento. Esse ensaio, realizado no Hospital de Clínicas da
FMUSP, utilizou uma versão da vacina DNA-Hsp65 clonada em plasmídeo
pVAX, aprovado para uso em humanos, administrada por meio de injeção
intra-tumoral de DNA nu (não complexado a lipídios). Como tanto o
plasmídeo quanto a via de imunização diferem dos utilizados nos
camundongos nos quais a vacina para tuberculose foi testada (Lowrie; Silva;
Tascon, 1997; Lowrie et al., 1999), e como é provável que a resposta em
humanos, especialmente em pacientes terminais, seja diferente da observada
em animais sadios, é importante determinar se a vacina DNA-Hsp65 foi
capaz de gerar resposta imune específica à Hsp65 nos pacientes vacinados.
Apesar de este ser um ensaio de fase I e de, nos modelos animais, a
Introdução 17
resposta imune específica à Hsp65 não ser relevante para o efeito anti-
tumorigênico observado, o possível uso da vacina DNA-Hsp65 para a
prevenção e tratamento de tuberculose e o fato de que esta é a primeira vez
em que essa vacina é utilizada em humanos justificam a inclusão de uma
avaliação de imunogenicidade a essa altura.
Há dois fatores importantes a serem considerados na análise de
imunogenicidade nesse contexto. O primeiro diz respeito à definição de
imunização em humanos. Em estudos de fases I e II de vacinas profiláticas,
nos quais não é possível utilizar como desfecho o desenvolvimento ou não de
doença, a avaliação de imunização requer a utilização de correlatos de
proteção. Uma desvantagem dessa abordagem é o fato de que tais
correlatos, que incluem produção de anticorpos, testes cutâneos de
hipersensibilidade tardia e ensaios celulares ex vivo, nem sempre refletem de
forma adequada a resistência à infecção. Isso torna-se especialmente
importante no caso da tuberculose, para a qual não existem correlatos de
proteção inteiramente satisfatórios (Ellner; Hirsch; Whalner, 2000), ou mesmo
parâmetros adequados para a detecção de infecção latente (Fine; et al.,
1999; Lalvani et al., 2001). Os testes cutâneos de hipersensibilidade tardia
contra tuberculina ou PPD (do inglês, purified protein derivative; derivado
protéico purificado), tradicionalmente utilizados para esse fim, parecem não
ter poder discriminatório suficiente para diferenciar entre proteção, doença
latente e exposição a micobactérias ambientais (Fine et al., 1999).
A produção de anticorpos, um importante correlato de proteção em
vacinas contra outras doenças (Zinkernagel, 2003), pode não ser um
parâmetro adequado para a avaliação da imunidade à tuberculose, dado que
Introdução 18
respostas imunes predominantemente humorais não estão associadas com
proteção contra patógenos intracelulares, como é o caso da M. tuberculosis
(Lowrie; Silva; Tascon, 1998). No entanto, deve-se ressaltar que um correlato
de proteção não precisa necessariamente estar envolvido no mecanismo de
resistência à doença, ou seja, pode funcionar somente como um marcador do
desencadeamento de uma resposta imune eficaz. Um efeito sobre a
produção de anticorpos pode, portanto, ser indicativo de desencadeamento
paralelo de uma resposta celular protetora. Isso é confirmado pelos estudos
em modelos murinos da vacina DNA-Hsp65 (Lowrie; Silva; Tascon, 1997;
Lowrie et al., 1999), onde respostas tanto de IgG2a quanto de IgG1 contra o
antígeno vacinal estiveram associadas à proteção contra desafio com M.
tuberculosis.
Outro correlato importante de proteção contra a tuberculose – e talvez o
mais sensível e específico entre os métodos atualmente disponíveis – é a
produção antígeno-específica de IFN-γ por células do sangue periférico
(Ellner; Hirsch; Whalner, 2000). Sabe-se que o IFN-γ é uma citocina
importante na resistência à tuberculose (Kaufmann, 1993). A produção dessa
citocina, fortemente indicativa de uma resposta do tipo Th1, também esteve
associada à proteção nos modelos animais (Lowrie; Silva; Tascon, 1997;
Lowrie et al., 1999).
Por último, há também a linfoproliferação antígeno-específica de células
do sangue periférico, que pode fornecer uma medida mais geral da ativação
do sistema imune frente ao antígeno. Embora essa ativação não indique
necessariamente proteção, a vantagem da medição de linfoproliferação é sua
capacidade de detectar a presença de clones de linfócitos específicos para o
Introdução 19
antígeno em questão independentemente de seu perfil de produção de
citocinas. Essa medida pode ser importante quando não se sabe exatamente
qual tipo de resposta esperar após a vacinação, como é o caso em ensaios
clínicos de fase I.
No presente estudo, utilizamos uma combinação desses diferentes
correlatos para permitir uma detecção mais apurada da imunogenicidade da
vacina (definida como o potencial da vacina de gerar resposta imune, seja ela
protetora ou não).
O segundo fator a ser considerado na avaliação da imunização no
presente ensaio é a imunossupressão característica de pacientes em
estágios avançados de tumor de cabeça e pescoço, que pode influenciar
negativamente a imunogenicidade da vacina. Apesar de tanto o ambiente em
que o tumor se desenvolve quanto a própria massa tumoral serem ricos em
células do sistema imune, os tumores de cabeça e pescoço são muito pouco
imunogênicos, sendo frequentemente resistentes à ação do sistema imune.
Isso se deve principalmente à disfunção ou propensão à apoptose das
células do infiltrado inflamatório e a falhas no processo de apresentação de
antígenos, tais como a baixa expressão de MHC de classe I, pelas próprias
células tumorais (Whiteside, 2005). Essa imunossupressão não está restrita
ao ambiente tumoral, podendo estender-se sistemicamente. As células
mononucleares do sangue periférico de pacientes com tumor de cabeça e
pescoço estão mais predispostas à apoptose espontânea do que as células
de indivíduos sadios (Hoffmann et al., 2002). Além disso, pacientes em
estadios avançados de câncer de cabeça e pescoço são frequentemente
não-responsivos a testes cutâneos de hipersensibilidade, como o PPD
Introdução 20
(Pumhirun; Wasuwat, 2003). Em conjunto, essas observações sugerem que o
estado imunológico de pacientes com câncer avançado de cabeça e pescoço
pode não ser o ideal para a indução e detecção de uma resposta imune
vacinal.
Outro fator que pode influenciar a imunogenicidade nesse contexto é o
fato de que a resposta imune à Hsp65 pode envolver a produção de IL-10
(Lewthwaite et al., 2001). A IL-10 tem importantes efeitos supressores sobre
o sistema imune (Moore, 2001) e, se induzida concomitantemente com a
expressão do antígeno vacinal, pode comprometer a indução de uma
resposta imune antígeno-específica. Isto é uma preocupação no desenho de
vacinas contra câncer, onde a produção de IL-10 por células T reguladoras, é
vista como um empecilho ao estabelecimento de imunidade anti-tumoral
(Baecher-Allan; Anderson, 2006). Dado o potencial da Hsp65 de gerar
produção de IL-10 e a predisposição à produção de IL-10 em pacientes com
tumores avançados (Baecher-Allan; Anderson, 2006), é importante
determinar também se a vacinação com DNA-Hsp65 pode levar a uma
modulação na produção dessa citocina no presente ensaio.
O objetivo principal de um estudo de Fase I, no entanto, é o de avaliar a
toxicidade da terapia a ser testada (clinicaltrials.gov). Nesse contexto, um
questão importante a ser considerada em relação à Hsp65 é o potencial que
essa proteína tem de desencadear auto-imunidade patológica. O papel do
reconhecimento tanto celular quanto humoral da Hsp65 está bem
estabelecido em diversas doenças com componentes auto-imunes, tais como
artrite reumatóide e idiopática juvenil (van Eden, 1991), diabetes do tipo I
(Cohen, 1991) e aterosclerose (Wick, 2004). Além disso, existem modelos de
Introdução 21
indução de auto-imunidade patológica em animais utilizando preparados
contendo Hsp65. O mais antigo e conhecido desses modelos é a artrite
induzida por adjuvante (AA), em que o adjuvante completo de Freund, que
contém micobactérias mortas por calor (e, conseqüentemente, quantidades
elevadas de Hsp65), é utilizado para induzir artrite em ratos Lewis (Pearson,
1956). Modelos de auto-imunidade patológica utilizando a Hsp65 purificada
incluem a indução de aterosclerose em coelhos (Xu et al., 1992) e a
aceleração do desenvolvimento de diabetes em camundongos NOD (non-
obese diabetic) (Elias et al., 1990). Deve-se ressaltar, no entanto, que esses
são animais altamente suscetíveis ao desenvolvimento das doenças em
questão, e que tentativas de indução de artrite experimental em ratos Lewis
com a proteína purificada resultaram em proteção contra a indução posterior
de AA (van Eden, 1991).
Um possível mecanismo para o envolvimento da Hsp65 em doenças
auto-imunes é a indução, por microorganismos, de reatividade cruzada contra
a Hsp60 humana, em fenômeno conhecido como “mimetismo molecular”
(Oldstone, 1998). Dados referentes a esse reconhecimento cruzado
provenientes de estudos realizados em pacientes são bastante controversos.
Por exemplo, em um grande número de estudos de pacientes com artrite
reumatóide ou idiopática juvenil mostra-se que a reatividade à Hsp60 humana
é na verdade um fator de proteção contra o desenvolvimento de doença
(Pope et al., 1991; van Eden et al., 1995; de Graeff-Meeder et al., 1995;
Prakken et al., 1996; Prakken et al., 1997). Por outro lado, Wick e
colaboradores (2004) vêm mostrando, em estudos tanto experimentais
quanto epidemiológicos, que a reatividade cruzada de linfócitos T e B contra
Introdução 22
a Hsp60 humana e a Hsp65 de micobactéria pode estar na origem do
processo aterosclerótico, e Cohen e colaboradores mostraram aumento da
proliferação linfocitária frente à Hsp60 em indivíduos com a diabetes do tipo I
(Abulafia-Lapid et al., 1999). Um fator de confusão na relação entre auto-
reatividade e doença é o fato de que a reatividade celular e humoral à Hsp60
autóloga está presente também em indivíduos sadios (Abulafia-Lapid et al.,
1999; Pockley et al., 1999; Granja, 2000; Caldas, 2005), o que dificulta a
discriminação entre o fisiológico e o patológico. Além disso, o predomínio de
estudos do tipo caso-controle nessa área dificulta o estabelecimento de
relações causais entre auto-reatividade e doença, especialmente dado o
potencial envolvimento da reatividade à Hsp60 na regulação de processos
inflamatórios (Cohen; Young, 1991), (van Eden; van der Zee; Prakken, 2005).
Já no caso de modelos animais de auto-imunidade patológica, a
vacinação com Hsp60 ou Hsp65 parece quase invariavelmente induzir
proteção contra o desenvolvimento de doença, com a possível exceção dos
dois modelos altamente suscetíveis mencionados acima (van Eden; van der
Zee; Prakken, 2005). Além disso, vacinação com a própria DNA-Hsp65
mostrou efeito protetor contra a indução de artrite em modelos animais
(Quintana et al., 2002; Santos-Junior et al., 2005).
Apesar da controvérsia em torno do papel do reconhecimento da Hsp60
em doenças auto-imunes, não se pode descartar a possibilidade de que a
vacinação com DNA-Hsp65 possa levar a alterações na reatividade contra a
Hsp60, e mesmo induzir auto-imunidade patológica. A avaliação clínica de
sinais e sintomas de auto-imunidade patológica (artrite, artralgia, vasculite,
etc.) está prevista no protocolo do estudo de fase I, assim como a avaliação
Introdução 23
histopatológica de órgãos no caso de óbito. Como complemento aos dados
clínicos, é importante também realizar um monitoramento da reatividade
humoral e celular à Hsp60 após vacinação, pois este poderá fornecer
informações importantes a respeito do efeito da vacinação com DNA-Hsp65
sobre a auto-reatividade ao homólogo humano.
Esses resultados, em conjunto com a avaliação de imunogenicidade
descrita acima, poderão gerar subsídios para o planejamento de estudos
posteriores em pacientes com tumores em estados menos avançados e/ou
voluntários sadios, visando uma possível utilização da vacina em seu objetivo
original, que é o de prevenir a tuberculose.
Objetivos 24
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Dado que esta é a primeira vez em que a vacina DNA-Hsp65 é testada
em humanos, e que existe a possibilidade de que a vacina venha a acarretar
em modificações na auto-imunidade fisiológica à Hsp60 autóloga, o objetivo
do presente trabalho é avaliar a resposta imune humoral e celular contra
Hsp65 vacinal e Hsp60 humana em pacientes portadores de carcinoma
epidermóide de cabeça e pescoço após vacinação com DNA-Hsp65.
2.2 Objetivos específicos
• Verificar se a vacina DNA-Hsp65 em plasmídeo pVAX foi capaz de
gerar resposta imune celular e humoral contra a Hsp65;
• Avaliar os efeitos da vacina sobre a auto-reatividade celular e humoral
à Hsp60 humana.
Material e Métodos 25
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Casuística
O ensaio clínico de fase I foi realizado no serviço de cirurgia de cabeça
e pescoço do HC-FMUSP, sob coordenação dos Drs. Kald Abdallah, Pedro
Michaluart Jr. e Célio Lopes Silva. O projeto desse ensaio está reproduzido
na íntegra no Anexo 1. Nesse estudo, foram incluídos inicialmente 18
pacientes com carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço, sem outras
possibilidades terapêuticas curativas. Os critérios para a inclusão de
pacientes foram estabelecidos no projeto principal (vide Anexo 2).
A participação no ensaio clínico e, conseqüentemente, a coleta de
sangue dos pacientes esteve condicionada à assinatura de termo de
consentimento livre e esclarecido. Este estudo foi aprovado pelas comissões
de ética do Hospital das Clínicas da FMUSP (CAPEPesq, processo n
o
183/02) e do ICB-USP (Parecer n
o
660/CEP), bem como pela CONEP
(processo n
o
1308/02).
A Tabela 1 mostra algumas características dos sujeitos incluídos no
estudo e do estado da doença no momento do início do protocolo de
imunização. Foram incluídas na tabela variáveis consideradas relevantes
para a avaliação do potencial de resposta desses pacientes à vacinação.
Dados importantes incluem a ausência de resposta a testes cutâneos (PPD,
candidina e tricofitina) em 16 de 21 (76%) pacientes e a neutrofilia observada
em 13 de 21 (62%) pacientes.
Os 18 pacientes previstos foram subdivididos em 3 grupos de 6
pacientes cada (Tabela 1). Os pacientes do Grupo A receberam 3 doses de
Tabela 1. Características dos sujeitos incluídos no ensaio antes do início da vacinação.
Hemograma
(10
3
céls./mm
3
)
Grupo
Paciente
Sexo Idade Localização
do tumor
Estadio Volume
tumoral
(ml)
Tratamento DTH
Neu Lin Mo
IMC
(kg/m
2
)
Karno-
fsky (%)**
Óbito (tempo
pós-1ª dose)
003 M 64 Seio piriforme IVb 52,9 RT/QT - 12,7
2
0,9 0,6 19,9 90 388 dias
004
M 59 Cavidade oral
IVb 19,5 CIR/RT/QT - 5,6 1,1 0,8 22,2 90 275 dias
005* F 59 Língua IVa 84,4 CIR/RT - 7,8
2
1,6 0,6 21,9 90 120 dias
006 F 49 Laringe IVa 4,9 RT/QT - 7,5
2
1,6 0,7 17,7 80 Viva (>2 anos)
007 M 56 Cavidade oral
IVa 87,1 CIR/RT - 4,3 1,0 0,6 18,2 80 145 dias
Grupo A
150 µg
008 M 64 Laringe IVb 146,4 CIR/RT - 9,2
2
1,3 0,2 17,6 80 37 dias***
009 M 62 Cavidade oral IVa 81,6 CIR/RT - 4,8 0,6 0,5 19,3 90 127 dias
010
F 73 Cavidade oral IVa 8,5 CIR/RT - 9,2
2
0,7 0,4 17,1 90 38 dias***
011 M 55 Cavidade oral
IVa 8,3 CIR/RT Trico+
11,5
2
1,0 0,7 21,9 90 70 dias
012 M 65 Laringe IVa 5,6 CIR/RT/QT - 4,4 0,7 0,3 23,0 90 Vivo (>2 anos)
013 M 51 Orofaringe
IVb 328,1 CIR/RT/QT - 7,2
2
0,9 0,4 25,3 90 228 dias
Grupo B
600 µg
014* M 45 Laringe IVa 59,6 CIR/RT PPD+
10,0
2
1,0 0,6 16,9 90 23 dias***
015* M 64 Cavidade oral IVb 70,5 RT/QT - 9,1
2
1,7 0,5 17,2 90 63 dias
016
M 54 Laringe IVb 171,7 CIR/RT - 9,5
2
0,6 0,4 27,3 80 52 dias
017 M 64 Laringe IVa 78,8 CIR/RT PPD+
3,5 1,1 0,3 18,6 90 34 dias***
018 M 33 Orofaringe IVb 22,3 CIR/RT/QT - 8,4
2
0,2
1
0,1 20,7 80 pós-107 dias****
019* M 66 Seio piriforme IVa 85,2 CIR/RT/QT PPD+ 9,7
2
0,9 0,6 19,6 80 22 dias***
020 M 63 Orofaringe IVb 8,1 CIR/RT - 3,7 0,7 0,5 15,0 90 172 dias
021 M 49 Orofaringe IVb 96,2 CIR/RT - 8,5
2
0,5 0,8 20,0 70 pós-79 dias****
022 M 67 Cavidade Oral
IVb 81,9 CIR/RT - 4,7 0,7 0,8 14,2 90 108 dias
Grupo C
400 µg
023 M 50 Laringe IVa 13,2 RT/QT PPD+ 6,2 0,7 0,5 16,3 90 127 dias
Média
57,7 72,13
7,51 0,93 0,52 19,52 86,2 108 dias*****
DP
9,2 75,08
2,56 0,38 0,19 3,26 5,9
*paciente não analisado em ensaios celulares/humorais.
**escala de qualidade de vida – vide Anexo II.
***não completou o protocolo de imunização.
****data exata não determinada; o período dado foi calculado com base na data da última consulta.
*****mediana de sobrevida.
DP – desvio padrão.
Tratamento – tratamento recebido pelo paciente antes da inclusão no estudo: CIR – Cirurgia; RT – radioterapia; QT – quimioterapia.
DTH – reação de hipersensibilidade tardia (do inglês, delayed-type hypersensitivity) a testes cutâneos (PPD, tricofitina e candidina); PPD = purified protein
derivative; Trico = tricofitina); positivo = nódulo ≥ 5mm.
Hemograma: Neu = neutrófilos; lin = linfócitos; mo = monócitos;
1
abaixo do valor de referência;
2
acima do valor de referência.
Material e métodos 26
Material e Métodos 27
150 µg e os do Grupo B, 3 doses de 600 µg da vacina DNA-Hsp65, em
intervalos de 21 dias. Como houve dor e inflamação excessiva nos pacientes
do grupo B, os 6 pacientes do grupo C receberam uma dose intermediária de
400µg (“escalonamento para baixo”, como previsto no protocolo inicial).
Como 4 dos 6 pacientes desse último grupo morreram antes do término do
protocolo de vacinação, foram adicionados ao grupo mais 3 pacientes,
totalizando 21 pacientes vacinados. O protocolo de vacinação previa
“tratamento compassional” (administração de doses adicionais da vacina)
caso o paciente viesse a beneficiar-se do tratamento inicial. Apenas um
paciente foi incluído nesse protocolo (paciente 003, Grupo A), tendo recebido
3 doses adicionais da vacina entre 6 e 8 meses após a primeira dose.
A imunização foi realizada no serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço
do HC-FMUSP, em colaboração direta com o serviço de Imunologia Clínica e
Alergia do HC-FMUSP. A vacinação deu-se por meio de injeção intratumoral
de DNA nu (não complexado a lipídeos), em um volume final de 1,5 ml, com
concentração de DNA variando de acordo com a dose a ser administrada. A
injeção foi realizada com auxílio de ultra-som para orientar a punção do
tumor, evitando vasos sangüíneos e áreas de necrose tumoral. Sempre que
possível, a injeção foi realizada em duas regiões do tumor (0,75 ml cada) a
fim de aumentar a área exposta. Cada paciente recebeu três doses da vacina
nos tempos 0, 21 e 42 dias, com exceção de pacientes que morreram
durante o protocolo. Os pacientes foram acompanhados por 5-7 dias após
cada aplicação, com coleta de material para exames e avaliação clínica
diária.
Material e Métodos 28
3.2 Desenho experimental
Foi realizado estudo longitudinal, com análise de e células do sangue
periférico (PBMC, do inglês, peripheral blood mononuclear cells) dos
pacientes em momentos distintos, antes e após imunização com DNA-Hsp65.
3.2.1 Coleta de material biológico de pacientes elegíveis
A Figura 1 mostra um esquema do cronograma de coletas de acordo
com as doses de vacina recebidas. As seguintes amostras foram coletadas:
Pré-vacina
Amostra Pré-vacina (0) – dia 0; no dia da primeira dose de vacina,
porém antes da vacinação.
Pós-vacina
Amostra 1 – dia 21, três semanas após a 1
a
dose, no dia da 2
a
dose;
Amostra 2 – dia 42, três semanas após a 2ª dose, no dia da 3
a
dose;
Amostra 3 – dia 49, uma semana após a 3ª dose;
Amostra 3m – 3 meses após a 1
a
dose;
Amostra 6m – 6 meses após a 1
a
dose;
Amostra 1a – 12 meses após a 1
a
dose.
Foi prevista a coleta de amostras extras em caso de intercorrência
clínica ou após tratamento compassional.
Figura 1. Cronograma de vacinação e coletas de material biológico. Os triângulos pretos
representam as coletas de sangue e os triângulos brancos, as três doses de
vacina.
Material e Métodos 29
3.3 Antígenos
A Hsp65 recombinante de M. leprae foi cedida pelo Dr. M. Singh, da
Lionex Diagnostics and Therapeutics (Alemanha), e foi submetida a protocolo
para eliminação de LPS (lipopolissacarídeos) por Triton X-114, conforme
descrito abaixo. A Hsp60 humana recombinante utilizada nos ensaios foi
fornecida pela Lionex Diagnostics and Therapeutics (Alemanha), já com
níveis de endotoxina abaixo de 1 EU/mg. A Hsp60 humana utilizada nos
ensaios humorais foi produzida em nosso laboratório para projeto anterior
(Caldas, 2005). Os antígenos (Hsp65 e Hsp60) utilizados para a detecção de
anticorpos séricos não passaram por processo de remoção de endotoxina. O
toxóide tetânico foi produzido pelo Instituto Butantan (Brasil).
3.3.1 Produção das regiões intermediária e C-terminal da Hsp60
Resumidamente, as regiões intermediária (I-Hsp60) e carboxi-terminal
(C-Hsp60) da proteína Hsp60, clonadas no vetor pRSET foram expressas em
Escherichia coli, de acordo com o protocolo padronizado e em uso no nosso
laboratório (Caldas, 2005). As proteínas recombinantes foram purificadas
utilizando-se coluna de níquel (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia,
EUA). as proteínas foram quantificadas utilizando-se kit BCA (Pierce, EUA),
de acordo com as especificações do fabricante. As preparações protéicas
foram submetidas a protocolos para remoção de LPS (lipopolissacarídeos)
com Triton X-114. As etapas envolvidas para a produção das proteínas
recombinantes empregadas neste estudo estão descritas a seguir.
Expressão de proteínas recombinantes
Material e Métodos 30
A expressão dos fragmentos da Hsp60 foi feita em Escherichia coli. Para
isso, células da linhagem bacteriana BL21(DE3)-pLysS foram transformadas
com o plasmídeo de interesse (pRSET-I-Hsp60; pRSET-C-Hsp60) pelo
método de cloreto de cálcio, adaptado de Sambrook, Fritsch e Maniatis
(1989). Inoculou-se uma colônia transformante em 200 ml de meio LB com
ampicilina e cloranfenicol. Este pré-inóculo foi incubado por 16 h a 37
o
C, com
agitação. A partir deste pré-inóculo, foi feito um inóculo em 4 litros de meio
com antibiótico, de modo que a ABS
600nm
atingisse 0,1. Incubou-se a 37
o
C
com agitação, até a cultura celular atingir uma densidade óptica entre 0,6 e
0,8 a 600
nm
. A produção da proteína de interesse foi induzida adicionando-se
IPTG (1,2 mM) e a cultura foi incubada a 37
o
C sob agitação, por 2 h. Após
indução, a cultura bacteriana foi centrifugada a 4300 g a 4
o
C por 10 minutos.
O botão bacteriano foi ressuspenso em 90 ml de Tris 100 mM pH 8,0 NaCl
300 mM imidazol 5 mM, Uréia 8 M e Triton X-100 0,3% (Tampão detergente).
Este tampão foi utilizado para a lise bacteriana. O tubo foi homogeneizado
por vórtex ou por inversão e incubado no gelo por 60 minutos. O lisado
bacteriano foi centrifugado a 9000 g por 20 minutos a 4
o
C, visando a
separação da fração protéica solúvel da insolúvel. Os fragmentos
intermediário (I-Hsp60 e C-terminal (C-Hsp60) foram purificados a partir do
sobrenadante (fração solúvel) em coluna de Ni
+2
sepharose, conforme
descrito a seguir.
Purificação das proteínas recombinantes
A purificação dos fragmentos recombinantes da Hsp60 (regiões
intermediária e C-terminal) foi realizada em coluna de Níquel-sepharose sob
condições desnaturantes. A coluna (Chelating Sepharose Fast Flow –
Material e Métodos 31
Pharmacia) foi montada e, adaptada a uma bomba peristáltica. A coluna foi
incubada com 15 ml de NiSO
4
(300mM) e lavada com 20 ml de água Milli-Q
para retirada do excesso de níquel. A coluna foi equilibrada com 50 ml de Tris
100 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM, Uréia 8 M. Aplicou-se a
amostra a ser purificada, ajustando-se o fluxo para 1 ml/minuto. Lavou-se a
coluna com 50 ml de Tris 100 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 5 mM,
Uréia 8M. As proteínas foram eluídas com 20 ml de Tris 100 mM pH 8,0,
NaCl 300 mM, imidazol 800 mM, Uréia 8 M e foram coletadas amostras de 1
ml. Foram retiradas alíquotas de 40 µl de cada fração coletada para posterior
análise em gel SDS-PAGE 15%. As frações que continham a proteína
purificada foram unidas, dialisadas contra PBS e quantificadas.
3.3.2 Remoção de endotoxinas
A remoção de endotoxinas das proteínas recombinantes foi realizada
utilizando o detergente Triton X-114, segundo protocolo adaptado de Aida e
Pabst (1990). Inicialmente, preparou-se uma solução de Triton X-114 10%
(em água apirogênica) e incubou-se a 4
o
C na geladeira para a completa
dissolução do detergente. Adicionou-se Triton X-114 (1%) à solução protéica
e misturou-se esta solução cuidadosamente com uma micropipeta. Os tubos
foram incubados no gelo por pelo menos 30 minutos, agitando-se no vórtex a
cada 5 a 10 minutos. Em seguida, os tubos foram aquecidos a 37
o
C por 5
minutos, para permitir a formação de duas fases. Os tubos foram
centrifugados por 5 minutos a 13000 g, à temperatura ambiente. Após a
centrifugação, formou-se uma fase de detergente no fundo do tubo. A fase
aquosa foi removida cuidadosamente para não misturar com a fase oleosa.
Material e Métodos 32
Este ciclo foi repetido por mais 6 a 8 vezes, dependendo da proteína. A
detecção de endotoxinas foi realizada pelo kit LAL QCL1000 cromogênico
(BioWhittaker, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.
3.4 Caracterização da resposta imune
Para a caracterização da resposta imune dos pacientes vacinados foram
utilizados os seguintes procedimentos: utilizados os seguintes
procedimentos:
3.4.1 Separação de PBMC
As PBMC foram isoladas a partir de 30-40 ml de sangue periférico,
coletado em tubos heparinizados, por meio de punção venosa. Amostras de
sangue foram diluídas 1:1 em solução salina isotônica e separadas em
gradiente de Ficoll-Hypaque, com densidade 1.077 g/l (Ficoll: Pharmacia
Biotech, Suécia e Hypaque: Urografina 370, Schering, Brasil; ou Ficoll-Paque
PLUS, Amersham Biosciences, Suécia). Após centrifugação a 720 g por 30
minutos, o anel de células mononucleares foi coletado, ressuspenso em
salina e centrifugado a 720 g por 10 minutos. As células foram lavadas com
salina e centrifugadas a 180 g duas vezes para a remoção de plaquetas. O
botão celular foi ressuspenso em salina para determinação do número de
células por contagem direta em câmara de Neubauer.
3.4.2 Congelamento e descongelamento de PBMC
As PBMC separadas por Ficoll-Hypaque foram ressuspensas (~5-10 x
10
6
células/ml) em solução de congelamento contendo 90% de soro fetal
bovino inativado (SFBi, Cultilab, Brasil) e 10% dimetilsulfóxido (Sigma, EUA).
Material e Métodos 33
Alíquotas de 1 ml foram distribuídas em tubos de congelamento previamente
resfriados, que foram então transferidos para freezer -70
o
C e posteriormente
para tanques de nitrogênio líquido. Para o descongelamento, os tubos foram
transferidos do nitrogênio líquido para o banho-maria a 37
o
C até o completo
descongelamento. A suspensão celular foi transferida para outro tubo
contendo 10 ml de meio RPMI (Gibco-BRL, EUA). Após duas centrifugações
a 580 g por 8 minutos, a viabilidade celular foi determinada utilizando-se
corante vital Azul de Tripan (MCB Manufacturing Chemists Inc., EUA).
3.4.3 Proliferação celular por incorporação de timidina
3
H
Após descongelamento, PBMC de cada paciente/período estudado
foram cultivadas na concentração de 2x10
5
células/poço em 200 µl de meio
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, Sigma) enriquecido com 10 mM
de Hepes (Sigma, EUA), 2 mM de L-glutamina (Sigma, EUA), 1 mM de
piruvato de sódio (Sigma, EUA), 40 µg/ml de gentamicina (HC-USP, SP,
Brasil), 0,1 ng/ml de cefalosporina (Peflacin®, Rhodia, SP, Brasil) e 10% de
soro humano inativado (DMEM completo) em placas de poliestireno com 96
poços, fundo U (Falcon, Beckton Dickinson, EUA) que foram mantidas a 37°C
em estufa úmida com 5% de CO2, por 5 dias. As culturas foram realizadas
em quadruplicata para cada uma das seguintes condições: (i) células em
meio; (ii) células em meio com 10 µg/ml de Hsp60 humana ou Hsp65
bacteriana recombinante; (iii) células em meio com 3 µg/ml das frações
intermediária ou C-terminal da Hsp60 humana; (iv) células em meio com 3,2
Lf (unidades de floculação)/ml de toxóide tetânico; e (v) células em meio com
5 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) (Sigma, EUA), como controle positivo. Ao
final do 5º dia, foram adicionados 25 µl de solução de timidina triciada (0,5
Material e Métodos 34
µCi/poço) (Amersham Life Science, Inglaterra). Após 18 horas, as células
foram aspiradas em coletor celular a vácuo (Cell-Harvest, Packard
Instruments Co., Inc, EUA) e transferidas para um filtro (Pré-filtro Millipore,
Brasil). A proliferação foi medida pela incorporação de timidina
3
H
às células
em contador de radiação beta de cintilação líquida (Beta-Plate 1205-LKB-
Wallac EUA). Os resultados foram expressos pelo índice de estimulação
(I.E.), obtido dividindo-se a mediana das contagens por minuto (C.P.M.) das
quadruplicatas de culturas estimuladas pela mediana das C.P.M. das
quadruplicatas de células cultivadas somente em meio. Como valor de corte,
utilizamos I.E. ≥ 2 para indução de e I.E. ≤ 0.5 para inibição de proliferação
celular.
3.4.4 Detecção de anticorpos contra Hsp60 e Hsp65
A dosagem anticorpos IgG totais e IgM anti-Hsp60 e 65 foi realizada
pelo método de ELISA direto antígeno-específico, conforme protocolos
estabelecidos em nosso laboratório. Placas de 96 poços (Corning, USA)
foram sensibilizadas com 100 µl de Hsp60 ou Hsp65 a 1 µg/ml em tampão
carbonato-bicarbonato (Na
2
CO
3
15 mM, NaHCO
3
35 mM, pH 9,6), por 1 hora
a 37°C. Após lavagem com PBS-Tween 0,05% (tampão fosfato 150 mM, pH
7,4 contendo 0,05% de Tween 20), o bloqueio de reações inespecíficas foi
feito com PBS-Tween 0,05%-gelatina 2,5 g/l por 45 minutos a 37°C. Após
lavagem, os soros foram incubados (100 µl/poço em diluição 1:100 em PBS-
Tween-gelatina) a 4
o
C por 17 horas. Em seguida, as placas foram incubadas
com 100 µl de anti-IgG total humano (1/60.000) ou anti-IgM humano
(1/10.000) conjugados com peroxidase, por 30 minutos a 37
o
C. As reações
foram reveladas adicionando-se 100 µl de solução contendo o-
Material e Métodos 35
fenilenodiamina (OPD, Sigma, EUA) e H
2
O
2
diluídas em tampão citrato-
fosfato (ácido cítrico 0,1 M e Na
2
HPO
4
0,2 M, pH 5,0), por 30 minutos a 37
o
C.
As reações foram interrompidas com 50 µl de H
2
SO
4
2 N. As placas foram
lidas em leitor automático de ELISA (BioRad, EUA) em comprimento de onda
de 492 nm. Os resultados foram expressos em absorbância.
3.4.5 Detecção de células produtoras de IL-10 e IFN-γ por Elispot
O número de células produtoras de IFN-γ e IL-10 foi determinado por
Elispot, utilizando-se o Elispot Set BD (Beckton Dickinson, EUA).
Resumidamente, placas de filtração Millipore (Immunospot) de 96 poços
foram sensibilizadas com anticorpos monoclonais de captura anti-IFN-γ ou
anti-IL-10 diluídos a 5 µg/ml em tampão PBS estéril (100 µl/poço) e
incubadas a 4ºC por 16h. Reações inespecíficas foram bloqueadas com 200
µl de meio RPMI completo (RPMI (Gibco-BRL, EUA) enriquecido com 2 mM
de L-glutamina (Sigma, EUA), 40 µg/ml de gentamicina (HC-USP, SP, Brasil),
0,1 ng/ml de cefalosporina (Peflacin®, Rhodia, SP, Brasil) e 10% de soro fetal
bovino inativado (Gibco-BRL, EUA)) por 2 h à temperatura ambiente. As
placas foram então incubadas com 200 µl da suspensão de células
mononucleares de sangue periférico (10
5
células/poço) em RPMI completo,
nas seguintes condições experimentais: células sem estímulo, células
estimuladas com Hsp65 de M. leprae (10 µg/ml), Hsp60 humana (10 µg/ml), I-
Hsp60 (3,5 µg/ml), C-Hsp60 (3,5 µg/ml) e toxóide tetânico (3,2 lf/ml); e células
estimuladas com mitógeno (PHA, 5 µg/ml). As placas foram incubadas a
37ºC em estufa com 5% de CO
2
por 48 h. Após lavagens com água
deionizada e PBS-Tween 0,05%, foram adicionados 2 µg/ml de anticorpos de
Material e Métodos 36
detecção anti-IFN-γ e anti-IL-10 biotinilados (100 µl/poço). As placas foram
incubadas por 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas com PBS-
Tween. As placas foram então incubadas com strepto-avidina peroxidase
(1:100) por 1 h à temperatura ambiente. Após novas lavagens com PBS-
Tween e PBS, foram adicionados 100 µl/poço da solução de revelação (kit
substrato AEC, BD, EUA) por 15 min (IFN-γ) ou 25 min (IL-10). A reação
enzimática foi interrompida com água destilada. As placas foram mantidas ao
abrigo da luz e os spots (do inglês, pontos) foram contados com auxílio do
leitor de Elispot (KS Elispot, Zeiss, Alemanha).
Nos poços em que o número de spots de IL-10 foi superior ao limite de
contagem do leitor automático (geralmente > 500 spots por poço,
dependendo da intensidade e formato dos spots), foi realizada contagem
manual de um campo de 2,88 mm
2
, com auxílio do programa analisador de
imagens AxioVision 3.0 (Zeiss, Alemanha). Essa contagem foi multiplicada
por 5,514 (razão entre a área do campo e a área do poço), e o resultado
obtido foi considerado como o número estimado de células contidas no poço.
Para a validação da contagem manual, foram contadas manualmente 20
poços com diferentes números de spots (de 153 a 589) em que a contagem
automática foi considerada válida. A Figura 2 mostra que houve boa
correlação entre a contagem manual e a contagem automática (r
pearson
=
0,917).
Material e Métodos 37
0
1
00
2
00
3
00
4
00
5
0
0
6
00
7
00
0
100
200
300
400
500
600
700
SFU/10
5
PBMC, contagem manual
SFU/10
5
PBMC, contagem automática
Figura 2. Correlação entre a contagem manual e automática de poços com diversas
concentrações de SFU de IL-10. Poços foram contados automaticamente (Eixo Y)
utilizando o software KS Elispot ou manualmente em microscópio Zeiss. r
pearson
=
0,917). SFU = spot forming units, do inglês unidades formadoras de pontos.
Como a resposta de IFN-γ à PHA freqüentemente resulta em spots mal
definidos, devido ao grande número de spots e elevada densidade de células
respondedoras, a análise da indução de IFN-γ por PHA foi realizada
qualitativamente. Os poços estimulados foram avaliados visualmente, sendo
atribuídos graus entre + e +++++, conforme a escala apresentada na Figura
3. A avaliação foi feita por dois investigadores distintos. Em caso de
discrepância entre os avaliadores, foi utilizada a média das duas avaliações
(por exemplo, avaliador 1 ++ e avaliador 2 +++ = ++/+++). Não houve
diferenças maiores do que 1 grau entre os avaliadores, e graus idênticos
foram atribuídos para 90% das amostras avaliadas (45/50).
Material e Métodos 38
+ ++ +++ ++++ +++++
Figura 3. Escala utilizada para avaliação da resposta de IFN-γ de
células estimuladas com fitohemaglutinina (PHA).
Todas as amostras são de uma mesma placa, que foi
utilizada como padrão durante a avaliação.
Na avaliação da resposta de IFN-γ, foi considerada positiva produção
induzida (após descontado o valor espontâneo) ≥ 50 SFU/10
6
PBMC, ou 5
spots por poço plaqueado, e pelo menos ≥ 2 x o valor da produção
espontânea. Na avaliação da resposta de IL-10, não foi utilizado ponto de
corte para positividade, os resultados tendo sido avaliados apenas
quantitativamente.
3.5 Análise estatística
Para a comparação dos níveis de IL-10 em resposta a Hsp65 e Hsp60,
foi utilizado o teste não-paramétrico de Wilcoxon. Foram comparadas as
produções médias de IL-10 em todas as amostras de cada sujeito frente aos
dois estímulos. Para a correlação entre a produção média de IL-10 frente a
Hsp65 e Hsp60, foi utilizado o teste não-paramétrico de Spearman. Todos
os testes foram realizados utilizando o programa estatístico SPSS, versão
10.0.
Devido ao pequeno número de sujeitos e à falta de diferentes amostras
em diferentes indivíduos, não foram realizados outros testes estatísticos.
Resultados 39
4 RESULTADOS
4.1 Expressão, purificação e remoção de endotoxina de proteínas
recombinantes
A Tabela 2 mostra a massa de proteína recombinante obtida em 4 litros
de cultura bacteriana após a purificação e após a remoção de endotoxina
com Triton X-114, bem como a atividade endotóxica final por mg de proteína,
determinada por LAL. Como indicado na tabela, os preparados produzidos
e/ou purificados em nosso laboratório para o presente projeto tiveram
atividade endotóxica final abaixo de 10 EU/mg.
Tabela 2. Expressão, purificação e remoção de endotoxina das proteínas recombinantes usadas
como antígeno nos ensaios celulares.
Proteína Massa após
purificação (mg)
Massa após remoção
de endotoxina (mg)
Nível de endotoxina na
preparação final (EU/mg)
Hsp60 humana,
região intermediária
10,5 6,6 5
Hsp60 humana,
região C-terminal
24,0 8,0 < 2
Hsp65, M. leprae 2,4* 1,7 < 1
*a Hsp65 foi produzida pela Lionex Diagnostics and Therapeutics (Alemanha).
A pureza das proteínas foi verificada em gel SDS-PAGE 15% corado
com Coomassie Blue. A Figura 4 mostra o perfil eletroforético obtido para
ambas as regiões da Hsp60 e para a Hsp65 comercial, após a remoção de
endotoxina.
Resultados 40
1 2 P.M. 3
12P.M.3
Figura 4. Gel SDS-PAGE das proteínas recombinantes produzidas ou manipulados em
nosso laboratório para o presente projeto, indicando bandas protéicas do tamanho
previsto. (1) Hsp60 humana, região C-terminal (C-Hsp60) e (2) Hsp60 humana,
região intermediária (I-Hsp60), expressas em E. coli e purificadas em nosso
laboratório. (3) Hsp65 de M. leprae, cedida pela Lionex Diagnostics and
Therapeutics (Alemanha). Todas as proteínas passaram por protocolo de remoção
de endotoxina por Triton X-114, realizado em nosso laboratório.
4.2 Obtenção de material biológico
4.2.1 Sangue
A Figura 5 mostra os resultados das coletas de soro e PBMC dos
pacientes vacinados. Houve perdas significativas de material, especialmente
celular. Ao final do período de coleta, estavam disponíveis para análise 51
(55%) amostras de células e 65 (70%) de soro de 93 possíveis, com entre 1 e
7 amostras seqüenciais por paciente. Além disso, foram coletadas duas
amostras extras: paciente 003 – 8 meses, após 6ª dose de vacina (3ª dose do
tratamento compassional) e paciente 013 – 3,5 meses, por ocasião de um
derrame pericárdico. Os motivos principais para a perda de amostras foram a
contra-indicação clínica para retirada de sangue do paciente, perda de
amostras no processo de estocagem e morte celular após descongelamento
superior a 30%.
Resultados 41
Os ensaios humorais/celulares foram realizados somente para pacientes
com mais de um ponto coletado. Quando o número de células após o
descongelamento foi insuficiente, foi dada preferência primeiro aos
experimentos com antígenos Hsp65 e Hsp60 e aos controles (15 amostras
sem I-Hsp60, C-Hsp60 e/ou toxóide tetânico) e, posteriormente, aos ensaios
de Elispot (5 amostras sem ensaio de proliferação celular, marcadas com
asteriscos na Figura).
Coleta: dia 0 dia 21 dia 42 dia 49 3 m 6 m 12 m
Paciente pré 2a dose 3a dose biópsia
003
004
005*
006
007
008
009
010
011
** **
012
013
014*
015*
016
017
** **
018
019*
020
021
**
022
023
Grupo 1: 150µgGrupo 2: 600µgGrupo 3: 400µg
Figura 5. Coletas seqüenciais de células/soro de pacientes vacinados
com DNA-Hsp65: material disponível para análise.
soro e células coletados perda de material
somente células coletadas óbito
somente soro coletado
*paciente não analisado
**não foi realizado ensaio de proliferação celular
Resultados 42
4.3 Avaliação da resposta imune sistêmica*
4.3.1 Produção de anticorpos específicos contra Hsp65 e Hsp60
Para avaliar se a vacinação com DNA-Hsp65 foi capaz de gerar
resposta humoral contra o antígeno codificado (Hsp65 de M. leprae) ou
contra o homólogo humano (Hsp60), medimos a resposta de anticorpos
contra esses antígenos por ELISA.
Como mostra a Figura 6,** houve grande variação entre pacientes já no
período pré-vacina. No entanto, os níveis de IgG contra Hsp65 e Hsp60
mantiveram-se estáveis após vacinação em todos os pacientes analisados,
independentemente da dose de vacina recebida.
Todos os pacientes apresentaram níveis detectáveis de IgG anti-Hsp65
e Hsp60 em diluição 1/100 (pelo menos 2 vezes o valor do controle negativo
sem soro). Se considerarmos como aumento pós-vacina um aumento de pelo
menos 2 vezes em relação ao valor pré-vacina, nenhum dos pacientes
apresentou aumento nos níveis de IgG específica, tanto contra Hsp65 quanto
contra Hsp60. O paciente 003, que recebeu 6 doses da vacina como
tratamento compassional (ver métodos, item 3.1), mostrou aumento quase
positivo (1.88 vezes o valor pré-vacina, ver Figura 14-003-E) no nível de
anticorpos contra Hsp65 último ponto analisado (1 ano após a primeira dose).
No entanto, a coleta imediatamente posterior à 6ª dose de vacina (8 meses
após a primeira dose) mostrou absorbância menor do que a da amostra de 6
*Os resultados brutos encontram-se no Anexo 3.
**Na Figura 6, bem como nos outros gráficos desse tipo (Figuras 7, 8, 9, 10, 11B, 12), foram
representados preferencialmente os tempos 0 (pré-vacina) e 3 (49 dias, uma semana após a
3ª dose, no provável pico de uma eventual resposta imune induzida pela vacina). Quando,
por motivos de óbito do paciente ou de ausência da amostra, um desses pontos não esteve
disponível, o ponto mais próximo foi utilizado para comparação. Para o paciente 003, são
representados os pontos 0, 3 e 6 (após a 3ª dose do tratamento compassional, ou 6ª dose de
vacina).
Resultados 43
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
AHsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
AHsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
BHsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
BHsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
Figura 6. Reatividade de IgG total dirigida a Hsp65 e Hsp60 em pacientes vacinados
com DNA-Hsp65, medida por ELISA. (A) Reatividade contra Hsp65
recombinante;
(B) Reatividade contra Hsp60 recombinante. Reatividade
determinada por ELISA utilizando 1
µg/ml de proteína, soros em diluição 1/100 e
anti-IgG total humana conjugado com peroxidase e diluição 1/30.000. Os números
abaixo das barras indicam o número de doses recebidas antes de cada amostra
analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 =
49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose).
meses, anterior ao tratamento compassional (0,629 vs. 0,603,
respectivamente). Fenômeno semelhante ocorreu com o paciente 013, 6
meses após a primeira dose de vacina (também aumento de 1,88 vezes o
valor pré-vacina, ver Figura 14-013-E). Esse paciente, que apresentou
derrame pericárdico 3,5 meses após a primeira dose de vacina, já
apresentava níveis bastante elevados de anticorpos contra Hsp60 humana
Resultados 44
antes do início do protocolo (Abs. ~ 1,2), e essa absorbância apresentou
ligeiro aumento no momento do derrame (Abs. = 1,169, ver Figura 14-013-E).
O paciente 018 apresentou queda importante na reatividade de IgG contra
Hsp65 entre 49 dias e 3 meses após a 1ª dose (de Abs. = 1,341 para Abs. =
0.323; ver Figura 14-018-E). Entre os pacientes vacinados, o paciente 023
apresentou o maior aumento entre os tempos pré-vacina e 49 dias (1 semana
após a última dose), mas esse aumento não chegou a 2 vezes (de Abs. =
0,416 a Abs. = 0,677, aumento de 1,63 vezes).
Como havia a possibilidade de uma indução de resposta humoral sem
mudança de isotipo de IgM para IgG, avaliamos também a presença de IgM
específica para Hsp65 e Hsp60. A Figura 7 mostra que a reatividade de IgM
contra Hsp65 e Hsp60 teve comportamento semelhante ao da IgG, sem
variação importante ao longo da vacinação.
Resultados 45
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
AHsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
AHsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
0 3 6 1 2 0 1 0 3 1 2 0 1 0 3 0 3 0 3 0 1 0 1 1 3 0 3 0 3 0 3 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
BHsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
BHsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
003
0
04
0
06
007
0
09
0
10*
011
012
013
016
0
17*
018
020
021
022
0
23
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
150
µ
g4
µ
g600
µ
g 00
BHsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Absorbância (490 nm)
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
Figura 7. Reatividade de IgM dirigida a Hsp65 e Hsp60 em pacientes vacinados com
DNA-Hsp65, medida por ELISA. (A)
Reatividade contra Hsp65 recombinante; (B)
Reatividade contra Hsp60 recombinante. Reatividade determinada por ELISA
utilizando 0.1
µg/poço de proteína, soros em diluição 1/100 e anti-IgM humana
conjugado com peroxidase e diluição 1/10.000. Os números abaixo das barras
indicam o número de doses recebidas antes de cada amostra analisada (0 = pré-
vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 = 49 dias, pós-3ª
dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose).
4.3.2 Proliferação de linfócitos por incorporação de timidina
3
H
Para determinar se houve aumento da proliferação celular contra os
antígenos Hsp65 e Hsp60, utilizamos o ensaio de proliferação celular por
incorporação de timidina
3
H com PBMC de pacientes vacinados. Como
mostra a Figura 8, alguns dos pacientes apresentaram proliferação
Resultados 46
espontânea alta (>1.000 C.P.M.), tanto antes quanto após a vacina. Houve
aumento de pelo menos 2 vezes na proliferação espontânea após a
vacinação em 4 pacientes (003, 008, 013 e 023) e diminuição em apenas 1
(paciente 010). O paciente 018 não pôde ser considerado como um caso de
diminuição devido à ausência da coleta pré-vacina. Essa alta proliferação
espontânea deve ser considerada ao analisar a proliferação induzida por
antígenos.
O paciente 006, cujos pontos disponíveis para ensaios celulares (pré-
vacina, 6 meses e 1 ano) não foram considerados informativos por não
cobrirem o período de vacinação, foi excluído dessa e das próximas análises.
003
0
0
7
00
8*
010
*
01
2
0
1
3
018
0
20
0
2
1
0
2
2
023
0
1000
2000
3000
4000
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
C.P.M.
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
003
0
0
7
00
8*
010
*
01
2
0
1
3
018
0
20
0
2
1
0
2
2
023
0
1000
2000
3000
4000
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
C.P.M.
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
Figura 8. Proliferação celular espontânea por incorporação de timidina
3
H em
pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
2x10
5
PBMC foram cultivados por 5 dias
em meio DMEM suplementado com 10% de soro humano inativado. Após o 5
o
dia,
as células foram pulsadas com 0,5
µCi por poço de timidina
3
H. Os números
abaixo das barras indicam o número de doses recebidas antes de cada amostra
analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 =
49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose). C.P.M. = contagens por minuto.
*pacientes morreram antes do término do protocolo de vacinação
Resultados 47
A Figura 9A mostra que, ao contrário do esperado, houve predomínio de
inibição da proliferação celular (I.E. < 0,5) quando as células foram
estimuladas com Hsp65 (14 dos 23 pontos representados). Apenas um
paciente (013) com resposta negativa antes da vacinação passou a
apresentar resposta marginalmente positiva após 3 doses 600 µg de vacina
(I.E. de 1,0 para 2,1). Um paciente (023) com resposta positiva no pré-vacina
passou a apresentar inibição (de 2,5 para 0,4).
Apesar de ter sido encontrada inibição em alguns dos pacientes na
resposta à Hsp60 (Figura 9B), não houve uma tendência tão clara à inibição
quanto frente à Hsp65. Apenas um paciente (010) com resposta negativa
antes da vacinação passou a apresentar resposta positiva após uma dose de
600 µg de vacina. Outros dois pacientes apresentaram resposta positiva
somente no período pré-vacina, com destaque para o paciente 023, que
passou de um I.E. de 13,7 antes da vacinação para um I.E. de 0,5 após 3
doses de vacina. Este foi o mesmo paciente que apresentou inibição na
proliferação celular frente à Hsp65, como descrito acima. Apesar de ter sido
observada uma redução nos níveis absolutos de incorporação de timidina
frente às duas HSP nesse paciente (ver Figura 14-023-A), a magnitude da
redução em termos de I.E. pode ser parcialmente explicada pelo aumento na
proliferação espontânea, o denominador no cálculo do índice, de 277 para
918 C.P.M. (Figura 8).
Resultados 48
(+)
(-)
003
007
008*
010
*
012
013
018
020
021
022
023
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
150
µ
g400
µ
g600
µ
g
A
Hsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses após 3 doses após 6 doses
003
007
008*
010
*
012
013
018
020
021
022
023
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
150
µ
g400
µ
g600
µ
g
A
Hsp65
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses após 3 doses após 6 dosespré-vacinapré-vacina
após 1 doseapós 1 dose
após 2 dosesapós 2 doses após 3 dosesapós 3 doses após 6 dosesapós 6 doses
(+)
(-)
003
007
008*
010*
012
013
018
020
0
21
022
0
23
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
003
007
008*
010*
012
013
018
020
0
21
022
0
23
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
Figura 9. Proliferação celular frente a Hsp65 e Hsp60 por incorporação de timidina
3
H
em pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
2x10
5
PBMC foram cultivados por 5
dias em meio DMEM suplementado com 10% de soro humano inativado na
presença de 10
µg/ml de Hsp65 (A) ou Hsp60 (B). Após o 5
o
dia, as células foram
pulsadas com 0,5
µCi por poço de timidina
3
H. O índice de estimulação foi
calculado dividindo-se o C.P.M. da amostra estimulada com antígeno pelo da
amostra não estimulada. Índices de estimulação acima de 2 (+) e abaixo de 0,5 (-)
são consideradas como indução e inibição de proliferação, respectivamente. Os
números abaixo das barras indicam o número de doses recebidas antes de cada
amostra analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª
dose; 3 = 49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose). * pacientes morreram
antes do término do protocolo de vacinação.
Resultados 49
Como controle positivo, as amostras foram cultivadas também na
presença de PHA. A Figura 10 mostra que, com exceção do ponto 1 (pós-1ª
dose) do paciente 020 (I.E. = 1,4), todas as amostras de PBMC responderam
à PHA com I.E. > 2. A baixa proliferação nos pacientes 020 e 003 pode ser
devido em parte à alta proliferação espontânea das mesmas amostras (vide
Figura 8).
00
3
00
7
008
*
01
0*
01
2
01
3
01
8
02
0
02
1
022
02
3
1
2
4
8
16
32
64
128
256
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses após 3 doses após 6 doses
00
3
00
7
008
*
01
0*
01
2
01
3
01
8
02
0
02
1
022
02
3
1
2
4
8
16
32
64
128
256
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 3 0 3 1 3 1 3 0 2 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
Índice de Estimulação
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses após 3 doses após 6 dosespré-vacinapré-vacina
após 1 doseapós 1 dose
após 2 dosesapós 2 doses após 3 dosesapós 3 doses após 6 dosesapós 6 doses
Figura 10. Proliferação celular frente à PHA por incorporação de timidina
3
H em
pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
2x10
5
PBMC foram cultivados por 5
dias em meio DMEM suplementado com 10% de soro humano inativado na
presença de 5
µg/ml fitohemaglutinina. Após o 5
o
dia, as células foram pulsadas
com 0,5 µCi por poço de timidina
3
H. O índice de estimulação foi calculado
dividindo-se o C.P.M. da amostra estimulada com antígeno pelo da amostra não
estimulada. Índices de estimulação acima de 2 e abaixo de 0,5 são consideradas
como indução e inibição de proliferação, respectivamente. Os números abaixo
das barras indicam o número de doses recebidas antes de cada amostra
analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 =
49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose).
* pacientes morreram antes do término do protocolo de vacinação
4.3.3 Produção de IFN-γ e IL-10
Para avaliar se houve mudança no número de células produtoras de
IFN-γ mediante estímulo com Hsp65 e Hsp60 ao longo da vacinação,
utilizamos o enzyme-linked immunospot assay (Elispot). A produção
Resultados 50
espontânea de IFN-γ foi em geral muito baixa (< 50 SFU/10
6
PBMC, dados
não mostrados), com exceção dos pacientes 018, com 70 SFU/10
6
PBMC 3
meses após a 1ª dose de vacina, e 020, que apresentou aumento
progressivo, com 50, 75 e 165 SFU/10
6
PBMC após a 1ª, 2ª e 3ª dose de
vacina, respectivamente.
Nenhum dos pacientes apresentou resposta de IFN-γ considerada
positiva (≥ 50 SFU/10
6
PBMC, ou ≥ 5 SFU por poço, acima da produção
espontânea) contra Hsp65 em nenhum dos pontos pós-vacina,
independentemente da dose de DNA administrada (Figura 11A). Frente à
Hsp60 (Figura 11B), destacam-se 3 pacientes que apresentaram resposta
considerada positiva no tempo pré-vacina mas cuja resposta tornou-se
negativa após uma dose (008, 010, 017). Deve-se ressaltar, no entanto, que
esses foram os três pacientes que morreram antes do término do protocolo
de vacinação. Os pacientes 022 e 023 apresentaram resposta bastante
positiva, tanto no pré- quanto no pós-vacina, sendo que o número de células
produtoras de INF-γ manteve-se estável (de 240 para 235 SFU/10
6
PBMC) no
primeiro e apresentou pequeno aumento (de 140 para 200 SFU/10
6
PBMC)
no último. O único paciente cuja resposta passou a ser positiva somente após
a última dose de vacina recebida foi o paciente 018. No entanto, o aumento
no número de células produtoras de IFN-γ foi muito pequeno (de 45 para 55
SFU/10
6
PBMC). O paciente 013 mostrou resposta marginalmente positiva
(55 SFU/10
6
PBMC) após 1 dose de vacina (ponto não mostrado na Figura
11B, ver Figura 14-013-D), mas essa resposta caiu para abaixo do nível de
detecção após a 3ª dose. Todos os pacientes apresentaram resposta positiva
Resultados 51
contra PHA, com alta freqüência de spots (avaliada qualitativamente, vide
Anexo III C) .
50
pré 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0
100
200
300
400
500
50
A Hsp65
Tempo pós 1a dose
SFU IFN-
γ
/10
6
PBMC
50
003
00
7
0
0
8
*
010*
011
012
0
13
01
7
*
018
02
0
0
2
1
0
2
2
0
2
3
0
100
200
300
400
500
50
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g400
µ
g600
µ
g
†
††
‡
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
SFU IFN-
γ
/10
6
PBMC
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
50
003
00
7
0
0
8
*
010*
011
012
0
13
01
7
*
018
02
0
0
2
1
0
2
2
0
2
3
0
100
200
300
400
500
50
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g400
µ
g600
µ
g
†
††
‡
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
SFU IFN-
γ
/10
6
PBMC
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
Figura 11. Número de células produtoras de IFN-γ frente a Hsp60 e Hsp65,
determinado por Elispot, em pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
10
5
PBMC foram cultivados por 48 h em meio RPMI suplementado com 10% de soro
fetal bovino na presença de 10
µg/ml de Hsp65 (A) ou Hsp60 (B). Os resultados
indicam o número de células produtoras de IFN-γ (SFU IFN-γ) por 10
6
PBMC em
poços estimulados, após descontada a produção espontânea. Foram
consideradas positivas amostras com
≥ 50 SFU IFN-γ/10
6
PBMC (≥ 5
spots/poço) e pelo menos o dobro do n
o
de spots da produção espontânea. (A)
As colunas indicam os diferentes tempos; cada símbolo representa um tempo de
um paciente. Resultados negativos (abaixo do espontâneo) foram considerados
como zero. As setas indicam as doses de vacina recebidas.
(B) Os números
abaixo das barras indicam o número de doses recebidas antes de cada amostra
analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21 dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 =
49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses, pós-6ª dose). *pacientes morreram antes do
término do protocolo de vacinação;
† CFU induzido ≤ espontâneo; ‡ não
considerado positivo (< 2x espontâneo).
Resultados 52
A produção espontânea de IL-10 pelos pacientes vacinados foi em
geral baixa (mediana de todos os tempos de todos os pacientes = 40
SFU/10
6
PBMC). No entanto, alguns pacientes tiveram produção espontânea
alta em um ou mais tempos, elevando a média para 311 SFU/10
6
PBMC.
Três de 13 pacientes estudados apresentaram freqüência de produção
espontânea > 1000 SFU/10
6
PBMC, e outros 4, > 100 SFU/10
6
PBMC, em
pelo menos um dos tempos avaliados.
A produção de IL-10 frente a Hsp65 e Hsp60 foi muito maior do que a
produção de IFN-γ frente a esses mesmos estímulos (média = 2909 e 4254
SFU IL-10/10
6
PBMC vs. 1 e 51 SFU IFN-γ/10
6
PBMC contra Hsp65 e Hsp60,
respectivamente). Houve grande variabilidade na produção de IL-10 pré-
vacina entre os diferentes pacientes, tanto frente à Hsp65 (min. 65; máx.
7450 SFU IFN-γ/10
6
PBMC) quanto frente à Hsp60 (min. 300; máx. 8290 SFU
IFN-γ/10
6
PBMC). Após a vacinação, 5 de 13 pacientes apresentaram
aumento na produção de IL-10 contra Hsp65 superior a 2 vezes o nível basal
(paciente 012: 100-260; paciente 013: 1120-3840; paciente 020: 2870-6620;
paciente 022: 65-140; paciente 023: 1565-9285 SFU IFN-γ/10
6
PBMC)
(Figura 12A). Destes, quatro também apresentaram aumento na produção de
IL-10 frente à Hsp60 (013: 3755-8275; 020: 4635-12385; 022: 300-2350; 023:
1860-14030 SFU IFN-γ/10
6
PBMC) (Figura 12B). Em geral, embora a
produção de IL-10 tenha sido significativamente maior frente à Hsp60 do que
à Hsp65 (p
wilcoxon
= 0,011), nota-se uma forte correlação entre a freqüência
média de células produtoras de IL-10 nos diferentes pacientes frente a essas
duas proteínas. Ou seja, pacientes que, em média, produziram mais IL-10
Resultados 53
quando estimulados com Hsp65, também o fizeram quando estimulados com
Hsp60 (r
spearman
= 0,815; p = 0,0004).
0
03
0
07
0
08*
01
0*
0
11
0
1
2
0
13
017
*
0
18
020
0
21
0
22
0
23
0
5000
10000
15000
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
SFU IL-10/10
6
PBMC
A
Hsp65
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
0
03
0
07
0
08*
01
0*
0
11
0
1
2
0
13
017
*
0
18
020
0
21
0
22
0
23
0
5000
10000
15000
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
SFU IL-10/10
6
PBMC
A
Hsp65
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
00
3
007
00
8*
0
1
0*
0
11
01
2
0
13
01
7
*
01
8
020
02
1
0
22
0
23
0
5000
10000
15000
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
SFU IL-10/10
6
PBMC
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
00
3
007
00
8*
0
1
0*
0
11
01
2
0
13
01
7
*
01
8
020
02
1
0
22
0
23
0
5000
10000
15000
0 3 6 1 2 0 1 0 1 0 1 0 3 0 3 0 1 1 3 1 3 0 3 0 1 0 3
150
µ
g 400
µ
g600
µ
g
B
Hsp60
N
o
de doses
recebidas
Paciente
Grupo
de dose
SFU IL-10/10
6
PBMC
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
pré-vacina
após 1 dose
após 2 doses
após 3 doses
após 6 doses
Figura 12. Número de células produtoras de IL-10 frente a Hsp60 e Hsp65, determinado
por Elispot, em pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
10
5
PBMC foram
cultivados por 48 h em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal bovino na
presença de 10
µg/ml de Hsp65 (A) ou Hsp60 (B). Os resultados indicam o número
de células produtoras de IL-10-
γ (SFU IL-10) por 10
6
PBMC em poços estimulados,
após descontada a produção espontânea. Os números abaixo das barras indicam o
número de doses recebidas antes de cada amostra analisada (0 = pré-vacina; 1 = 21
dias, pós-1ª dose; 2 = 42 dias, pós-2ª dose; 3 = 49 dias, pós-3ª dose; 6 = 8 meses,
pós-6ª dose). *pacientes morreram antes do término do protocolo de vacinação.
Resultados 54
4.4 Avaliação clínica e laboratorial de rotina
A seguir mostraremos alguns dados clínicos que consideramos
relevantes para a interpretação dos resultados referentes à imunogenicidade
da vacina. Todos os dados clínicos foram coletados pela equipe clínica do
ensaio. Os testes cutâneos e o hemograma foram realizados pelo laboratório
central do HC-FMUSP. Essas análises incluem todos os pacientes do
ensaio, e não somente os incluídos nas análises de imunogenicidade.
4.4.1 Eventos adversos potencialmente relacionados à resposta imune
Todos os 21 pacientes relataram aumento de dor local após a
vacinação. Destes, 18 também apresentaram edema local, sugestivo de
inflamação. A intensidade tanto da dor como do edema nos pacientes variou
de nível 1 (“leve”) a nível 4 (“com risco de vida”). Ambos os eventos foram
considerados como sendo relacionados à vacinação pela equipe clínica. O
paciente 023 apresentou adenomegalia retroauricular moderada entre 24 e
28 horas após o recebimento da primeira dose de vacina.
4.4.2 Avaliação de sinais clínicos de auto-imunidade patológica
Somente o paciente 013 apresentou evento clínico possivelmente
relacionado a auto-imunidade patológica. Este foi um derrame pericárdico
detectado 3,5 meses após a primeira dose de vacina, que poderia ser
decorrente de pericardite, possivelmente de origem auto-imune. Não foi
possível realizar exame histopatológico durante a autópsia do paciente para a
confirmação da presença de infiltrado inflamatório no pericárdio. No entanto,
Resultados 55
a análise macroscópica foi sugestiva de transudato e não de exsudato,
sugerindo origem não-inflamatória.
4.4.3 Testes cutâneos de hipersensibilidade tardia
Todos os 21 pacientes foram submetidos a testes cutâneos de
hipersensibilidade tardia contra PPD, candidina e tricofitina. Esses testes
foram realizados antes e aproximadamente três meses após a primeira dose
de vacina. Como mostra a Tabela 3, somente 5 dos 21 pacientes (14%)
apresentaram resposta positiva a pelo menos um dos antígenos no período
anterior à vacina, dos quais 4 responderam ao PPD e 1 à Tricofitina. Dos 5
pacientes inicialmente positivos, 2 passaram a apresentar resposta negativa
a todos os antígenos testados e 3 morreram antes da segunda avaliação.
Dois dos 16 pacientes inicialmente não-reativos passaram a apresentar
resposta positiva somente ao PPD após vacinação (Paciente 006 – 18mm;
Paciente 012 – 10mm). No entanto, não houve produção concomitante de
IFN-γ por esses pacientes no mesmo momento, segundo o ensaio de Elispot
(Tabela 4).
Resultados 56
Tabela 3. Resposta de hipersensibilidade tardia (DTH) a testes cutâneos com PPD,
Candidina e Tricofitina em pacientes vacinados com DNA-Hsp65 antes e cerca
de 3 meses após a vacinação.
Grupo Paciente DTH pré-vacina DTH pós-vacina
003 Negativo Negativo
004 Negativo Negativo
005* Negativo Negativo
006 Negativo PPD 18 mm
007 Negativo Negativo
Grupo A
150 µg
008 Negativo Negativo
009 Negativo Negativo
010 Negativo Óbito
011 Tricofitina 30 mm Negativo
012 Negativo PPD 10 mm
013 Negativo Negativo
Grupo B
600 µg
014* PPD 20 mm Óbito
015* Negativo Negativo
016 Negativo Óbito
017 PPD 15 mm Óbito
018 Negativo Negativo
019* PPD 10 mm Óbito
020 Negativo Negativo
021 Negativo Negativo
022 Negativo Negativo
Grupo C
400 µg
023 PPD 18 mm Negativo
Ponto de corte para positividade: 5mm.
Tabela 4. Comparação entre a resposta ao teste cutâneo com PPD e a produção de IFN-γ
frente à Hsp65, medida por Elispot, em pacientes vacinados com DNA-Hsp65.
Paciente Pré-vacinação Pós-vacinação
PPD
IFN-γ*
PPD
IFN-γ*
006 negativo 0 18mm 0
018 negativo 0 10mm 0
*Valores em SFU/10
6
células após descontada a produção espontânea
Resultados 57
4.4.4 Contagem de neutrófilos, linfócitos e monócitos
Foram realizados hemogramas periódicos nos pacientes vacinados,
antes e após cada dose de vacina. Apresentamos a seguir alguns dados
relativos à contagem de neutrófilos, linfócitos e monócitos nesses pacientes.
A Tabela 1 (ver Métodos, item 3.1), mostra que, antes do início do protocolo,
13 de 21 dos pacientes apresentavam neutrofilia (> 7x10
3
neutrófilos/mm
3
),
possivelmente devido à alta prevalência de infecções nesses indivíduos,
relacionada às características do tumor (feridas abertas, frequentemente no
interior da cavidade oral, o que favorece a infecção por patógenos). No
entanto, como mostra a Figura 13, não houve tendência clara a aumento ou
diminuição no número de neutrófilos após vacinação. Embora o número de
linfócitos e monócitos tenha permanecido predominantemente dentro da faixa
normal entre os pacientes vacinados, três pacientes passaram a apresentar
monocitose (019,021,023), dois passaram a apresentar linfopenia (009,014) e
um passou de linfopenia a níveis normais (018) após a vacinação.
Como os ensaios celulares descritos acima (linfoproliferação e produção
de citocinas) utilizaram populações mistas de células mononucleares, que
incluem tanto linfócitos quanto monócitos, apresentamos também a razão
média entre monócitos e linfócitos de cada paciente, calculada como a média
aritmética dos resultados de entre 2 e 8 hemogramas seqüenciais de cada
paciente durante a vacinação (Tabela 5).
Resultados 58
003-
pré
003-3
003-6
004-p
r
é
004-3
005-pré
00
5-
3
006-pré
006-
3
007-
pré
007-
3
008-
pr
é
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
10
3
células/mm
3
009-
pr
é
009-3
010-
pr
é
010-1
011-
pré
01
1-
2
012-p
r
é
01
2-
2
013-p
r
é
013-
3
014-pré
014-
1
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
10
3
células/mm
3
015-
pr
é
015-3
016-pré
016-1
017-pré
017-2
018-p
r
é
018-
1
019-
pré
019-
1
020-
pr
é
020-3
02
1-
pré
021-3
022-pré
022-3
023-p
r
é
023-3
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
10
3
células/mm
3
A
B
C
Figura 13. Contagem de neutrófilos, linfócitos e monócitos no sangue de pacientes
vacinados com DNA-Hsp65, segundo grupo de dose.
Dados provenientes de
hemogramas realizados pelo serviço de rotina do Laboratório Central do Hospital
das Clínicas, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo.
(A) Grupo
A, 150 µg; (B) Grupo B, 600 µg; (C) Grupo C, 400 µg. As legendas abaixo do
eixo das ordenadas indicam o número do paciente seguido do número de doses
recebidas: pré – antes da vacinação; 1 – pós-1ª dose; 2 – pós-2ª dose; 3 – pós
3ª dose; 6 – pós 6ª dose (terceira dose do tratamento compassional, somente
paciente 003). A faixa de valores considerados normais está indicada por linhas
da mesma cor das barras: neutrófilos: 2,0-7,0x10
3
/mm
3
; linfócitos: 0,5-
3,4x10
3
/mm
3
; monócitos: 0,1-1,0x10
3
/mm
3
.
Resultados 59
Tabela 5. Média dos números de linfócitos e monócitos e razão média monócito/média
linfócito em entre 2 e 8 hemogramas seqüenciais (1 pré-vacinação e demais pós-
vacinação) nos pacientes vacinados com Hsp65.
Grupo
Paciente Linfócitos
(10
3
/mm
3
)
Monócitos
(10
3
/mm
3
)
Razão
monócito/
linfócito
003 1,14 0,54 0,47
004 1,33 0,67 0,50
005 1,54 0,40 0,26
006 1,54 0,49 0,31
007 0,90 0,53 0,59
Grupo A
150 µg
008 1,10 0,25 0,23
009 0,60 0,48 0,80
010 0,70 0,33 0,48
011 1,00 0,68 0,68
012 1,13 0,28 0,25
013 1,03 0,37 0,35
Grupo B
600 µg
014 0,60 0,40 0,67
015 1,33 0,38 0,28
016 0,65 0,35 0,54
017 1,03 0,33 0,32
018 0,97 0,51 0,53
019 1,05 1,00 0,95
020 0,86 0,46 0,53
021 0,59 0,85 1,44
022 0,78 0,75 0,97
Grupo C
400 µg
023 0,63 0,72 1,13
Média 0,97 0,49 0,57
DP 0,30 0,17 0,32
Como mostra a tabela, a razão média monócito/linfócito nesses
pacientes (0,57; IC95% 0,44-0,70) foi superior ao valor esperado em
indivíduos sadios, que é de cerca de 0,3. Isso pode ser resultado tanto de
infecções recorrentes (que levam a aumento no número de monócitos)
quanto de uma menor quantidade de linfócitos relacionada à
imunossupressão causada pelo tumor.
Resultados 60
4.5 Caracterização geral da resposta imune individual
Apresentamos a seguir um painel de todos os ensaios realizados com
sangue periférico por paciente para permitir uma visualização conjunta dos
resultados. A Figura 14 apresenta os resultados de proliferação celular (em
C.P.M. (A) e I.E. (B)), produção de IL-10 (C), IFN-γ (D e F) e anticorpos IgG e
IgM (E) e número de neutrófilos, linfócitos e monócitos (G) de todos os
pacientes com mais de dois pontos analisados em ensaios celulares, com
exceção do paciente 006, que tinha disponíveis para análise somente os
pontos 0, 6 meses e 1 ano. Como foi analisada de forma qualitativa, a
resposta de IFN-γ à PHA é apresentada em gráfico separado. Além dos
antígenos descritos acima, a Figura 14 mostra também a resposta
proliferativa e de produção de citocinas frente às regiões da Hsp60 (I-Hsp60
e C-Hsp60) e ao toxóide tetânico, utilizado como controle não específico, nos
pacientes e tempos nos quais houve células suficientes para que esses
antígenos fossem testados. Para fins de destaque, a Hsp65 é representada
sempre em vermelho. Além de sua relevância para a avaliação de
inflamação, os números de linfócitos e monócitos em cada ponto avaliado
podem auxiliar na interpretação dos dados de Elispot e linfoproliferação, visto
que esses ensaios foram realizados com amostras de PBMC, que contém
esses dois tipos de células.
Apesar da grande variabilidade entre as respostas dos diferentes
pacientes à vacina, alguns pontos merecem ser destacados. Primeiro,
embora não tenhamos encontrado resposta positiva de IFN-γ frente à Hsp65,
parece ter havido uma relação entre a variação na resposta de IL-10 à Hsp65
ao longo da vacinação e a variação em outros parâmetros avaliados,
Resultados 61
incluindo a resposta a outros antígenos e medidas não-específicas, como a
proliferação espontânea ou a produção de IFN-γ frente à PHA. Como
exemplo, podemos citar o paciente 003, em que a queda e posterior aumento
da resposta de IL-10 frente à Hsp65 (Figura 14-003-C) é acompanhada de
movimento semelhante nas respostas de IL-10 (C) e proliferação celular à
PHA (F); ou o paciente 013, em que o aumento e posterior queda da resposta
de IL-10 à Hsp65 (Figura 14-013-C) é acompanhado por movimento
semelhante na proliferação espontânea (A) e na produção de IL-10 frente ao
toxóide tetânico (C).
Segundo, a produção de IL-10 pelo paciente 003, que recebeu 2 séries
de 3 doses da vacina, mostrou comportamento oposto no decorrer de cada
uma dessas séries, com diminuição e aumento no número de células
produtoras dessa citocina durante a primeira e segunda séries,
respectivamente (Figura 14-003-C). Essa modulação foi acompanhada de
variação semelhante no número de neutrófilos no sangue. Já algumas
medidas não-específicas, como a proliferação espontânea e frente à PHA
(A), mostraram aumento progressivo durante o período de 1 ano estudado.
Por último, o paciente 023 apresentou um aumento acentuado na
produção de IL-10 frente a Hsp65 e Hsp60 ao longo da vacinação (Figura 14-
023-C). Esse aumento foi acompanhado de uma queda na proliferação
celular contra esses antígenos (B), que passou de resposta positiva (I.E. ≥ 2)
a inibição (I.E. ≤ 0.5). Os números de neutrófilos e monócitos também
aumentaram no mesmo período, com o paciente apresentando tanto
neutrofilia quanto monocitose uma semana após a terceira dose de vacina.
Resultados 62
003*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
G
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 8m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
* Inclui coleta extra realizada aos 8 meses, após a 6ª dose de vacina (3ª dose do tratamento
compassional). Data de óbito: 388 dias pós 1ª dose.
Resultados 63
012*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
G
* Paciente com resposta ao teste cutâneo com PPD inicialmente negativa, mas que passou a
ser positiva (10mm) 3 meses após a 1ª dose de vacina. Paciente vivo > 2 anos pós 1ª dose.
Resultados 64
013*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 3.5m 6m 1a
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 3,5m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
G
* Inclui coleta extra realizada aos 3,5 meses, por ocasião de um derrame pericárdico. Data
de óbito: 228 dias pós 1ª dose.
Resultados 65
018*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
G
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
* Data de óbito: após 107 dias pós 1ª dose (data da última consulta; data exata de óbito não
determinada).
Resultados 66
020
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
G
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
* Paciente apresentou aumento progressivo também na produção espontânea de IFN-
γ (50,
75 e 165 SFU/10
6
PBMC nos tempos 21d, 42d e 49d, respectivamente). Data de óbito: 172
dias pós-1ª dose.
Resultados 67
021*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
G
* Data de óbito: 172 dias pós-1ª dose.
Resultados 68
023*
Proliferação
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
100
1000
10000
100000
Espontânea
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
C.P.M.
Proliferação (I.E.)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Tempo pós 1a dose
I.E.
IL-10
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
5000
10000
15000
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
PHA
Espontânea
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
IFN-γ
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
50
100
150
200
250
Hsp65
Hsp60
I-Hsp60
C-Hsp60
tox. tet.
Tempo pós 1a dose
SFU/10
6
PBMC
Anticorpos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
IgG Hsp65
IgG Hsp60
IgM Hsp65
IgM Hsp60
Tempo pós 1a dose
Absorbância (490nm)
IFN-γ PHA (qualitativo)
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1A
0
+
++
+++
++++
+++++
PHA
Tempo pós 1a dose
Intensidade
A
B
C
D
E
F
G
Leucócitos
pre 21d 42d 49d 3m 6m 1a
0.0625
0.125
0.25
0.5
1
2
4
8
16
Neutrófilos
Linfócitos
Monócitos
Tempo pós 1a dose
10
3
células/mm
3
* Paciente apresentou adenomegalia retroauricular grau 2 (moderada) 24-48 h pós 1ª dose.
Data de óbito: 127 dias pós-1ª dose.
Discussão 69
5 DISCUSSÃO
Apesar de ter sido desenvolvida há quase uma década, essa é a
primeira vez que a vacina DNA-Hsp65 é testada em humanos. Isso traz ao
mesmo tempo vantagens e desvantagens ao presente estudo. A grande
vantagem é a possibilidade de se estudar a vacina DNA-Hsp65 no organismo
para qual ela vem sendo planejada, o ser humano, o que representa um
grande avanço em relação aos estudos em modelos animais. É comum que o
sucesso obtido com novos tratamentos em animais não se traduza para o
uso em humanos, e a passagem do uso em modelos para o ensaio clinico é
um passo fundamental na progressão de um tratamento da pesquisa para a
clínica. Por outro lado, os ensaios clínicos em humanos, principalmente em
pacientes terminais, alvo freqüente de ensaios de Fase I, trazem consigo
importantes dificuldades logísticas e experimentais, muitas das quais
prejudicaram a avaliação da imunogenicidade da vacina DNA-Hsp65 no
presente estudo.
Em primeiro lugar, o estado precário de saúde dos pacientes (somente
três dos 21 pacientes estudados sobreviveram mais de um ano) prejudicou
tanto a coleta quanto o processamento do material biológico, o que foi
responsável pela grande quantidade de perdas observada (Figura 5). A perda
de amostras de tempos diferentes em pacientes diferentes, aliada à grande
variabilidade dos níveis basais (pré-vacina) na maioria dos ensaios
realizados, impediu que fosse realizada análise estatística dos dados na
maioria dos casos, pois o poder estatístico de tais análises seria muito baixo.
Segundo, a ausência de outros estudos utilizando essa vacina em
humanos dificulta a interpretação de nossos resultados, que têm de ser
Discussão 70
comparados a estudos com modelos animais ou a ensaios clínicos utilizando
outras vacinas de DNA. Além disso, como o objetivo do estudo de Fase I é
avaliar toxicidade e não eficácia, não foram incluídos grupos controles, tais
como pacientes não vacinados ou pacientes vacinados com plasmídeo vazio,
que poderiam fornecer informações importantes acerca da progressão natural
da doença e do mecanismo de ação da vacina, respectivamente.
Finalmente, é provável que a imunossupressão característica de
pacientes com câncer terminal – os sujeitos do presente estudo eram em sua
maioria (76%) anérgicos segundo critérios clínicos (hipersensibilidade tardia a
PPD, candidina e tricofitina) – tenha afetado tanto a atividade imunogênica da
vacina quanto a avaliação dos resultados obtidos com estimulação de PBMC
ex vivo. Essa discussão será retomada mais adiante.
Apesar das dificuldades descritas acima, diversas informações
importantes puderam ser extraídas das presentes análises. A primeira diz
respeito à imunogenicidade da vacina nesses pacientes.
Não foi observado aumento na reatividade humoral à Hsp65 após
imunização, mesmo no grupo imunizado com a maior dose (600 µg de DNA
nu) (Figura 6A). Embora dois pacientes tenham apresentado aumento
próximo a duas vezes na reatividade de IgG à Hsp65 (Pacientes 003 e 013;
1,88 vezes em ambos os casos; ver Figuras 14-003-E e 14-013-E), esses
aumentos estiveram temporalmente dissociados da vacinação, o que sugere
a participação de outros fatores, tais como infecções com micobactérias ou
outros microorganismos cujas Hsp60 tenham reatividade cruzada com a
Hsp65 de M. leprae.
Discussão 71
Nossos resultados não estão de acordo com o observado nos modelos
animais utilizados no desenvolvimento da vacina DNA-Hsp65, nos quais
houve aumento importante nos títulos de IgG2a após vacinação (Lima et al.,
2003a). Dois fatores podem ser responsáveis por essa diferença. Primeiro,
estudos na literatura mostram que o sucesso obtido com vacinas de DNA em
animais de laboratório e até mesmo em primatas não-humanos dificilmente
se reproduz em ensaios clínicos (Donnelly; Berry; Ulmer, 2003), o que tem
levado a grandes investimentos em estratégias para tornar as vacinas de
DNA mais imunogênicas, incluindo o uso de micro-esferas lipídicas (Lima et
al., 2003b) e até mesmo a eletroporação in vivo (Otten et al., 2005).
Segundo, a formulação da vacina DNA-Hsp65 testada em camundongos
utiliza o plasmídeo pcDNA3.1, que foi substituído no presente ensaio pelo
plasmídeo pVAX, apropriado para uso em humanos. Esse plasmídeo é
derivado do pcDNA3.1 pela deleção de 3.000 pares de bases e pela
substituição do gene de resistência à ampicilina por um de resistência à
canamicina, e é aparentemente menos eficaz do que seu antecessor na
indução de resposta humoral mesmo em modelos murinos (Grupo do Prof.
Célio Silva, FMRP-USP, observações não publicadas). Quando utilizado para
o tratamento de câncer em pacientes com tumor de próstata, o plasmídeo
pVAX contendo o gene codificador do PSA foi capaz de induzir resposta
imune somente em pacientes do grupo de maior dose (900 µg de DNA) e em
esquema altamente imunogênico (5 doses de 900 µg (90 µg intradérmica +
810 µg intramuscular), cada uma acompanhada de 3 doses de 40 µg de GM-
CSF antes da vacinação e 5 doses de 75 µg de IL-2 após a vacinação)
(Pavlenko et al., 2004). A utilização da via intratumoral de administração no
Discussão 72
presente estudo dificulta a comparação com dados da literatura, visto que
esta é uma via pouco comum de imunização, e pode diferir das vias
tradicionais (intramuscular e intradérmica) em termos de acesso à circulação
e expressão do antígeno.
A hipótese de que a vacinação pudesse ter induzido somente resposta
IgM, ou seja, não tivesse sido capaz de induzir mudança de isotipo de IgM
para IgG, também foi investigada, mas a ausência de aumento nos níveis de
IgM anti-Hsp65 ao longo da vacinação (Figura 7) não corrobora essa
hipótese.
O segundo critério utilizado para a avaliação de imunogenicidade foi a
produção de IFN-γ contra o antígeno de interesse. Também não foi
observada imunização segundo esse critério, com respostas sempre
inferiores ao ponto de corte estabelecido (50 SFU/10
6
PBMC, ou 5 spots por
poço após descontada a produção espontânea e pelo menos o dobro da
produção espontânea) (Figura 11A; Figura 14D). Esse ponto de corte foi
definido com base em estudos da literatura (Wang et al., 2004; MacGregor et
al., 2005; Mancini-Bourgine et al., 2005) que utilizam o ponto de corte de ≥ 5
spots por poço para a avaliação de resposta a vacinas de DNA em humanos,
embora a concentração de células por poço nesses estudos tenha sido em
geral maior, reduzindo, portanto, o valor do ponto de corte corrigido para 10
6
PBMC. Embora não tenham sido encontrados na literatura estudos de Elispot
contra Hsp65 em humanos, estudos utilizando a ESAT-6 (do inglês, early-
secreted antigenic target protein-6), outro antígeno micobacteriano (Lalvani et
al., 2001), mostram respostas entre 100 e 1000 (o limite máximo de
detecção) SFU/10
6
PBMC em contatos de pacientes com tuberculose ativa,
Discussão 73
sugerindo que a resposta encontrada contra a Hsp65, um dos antígenos
imunodominantes das micobactérias (Thole et al., 1988), em infecções com
esses microorganismos pode ser muito mais alta do que o ponto de corte
estabelecido no presente estudo.
Em estudo relacionado ao de Pavlenko e colaboradores (2004), descrito
acima, utilizando os mesmos pacientes vacinados com DNA-PSA e citocinas,
Miller e colaboradores (2004) encontraram respostas bastante intensas (entre
1000 e 3000 SFU IFN-γ/10
6
PBMC) no grupo de maior dose (900 µg). No
entanto, essa discrepância pode estar relacionada a diferenças no protocolo
utilizado para realização do ensaio de Elispot, no qual foram utilizadas como
estímulo células dendríticas, diferenciadas de monócitos do próprio paciente,
pulsadas com PSA, o que pode ter aumentado a sensibilidade do método.
Em conjunto, os dados de resposta humoral e de produção de IFN-γ não
mostram imunização sistemicamente detectável contra a Hsp65 após
vacinação, mesmo no grupo de maior dose, sugerindo uma baixa
imunogenicidade da vacina, pelo menos nesses pacientes. Esses dados
contrastam com a positivação do teste de hipersensibilidade tardia ao PPD,
observada em dois dos pacientes após a vacinação. No entanto, a resposta
ao PPD, dado seu caráter multi-antigênico, pode refletir outros fenômenos
além da imunização contra a Hsp65, tais como exposição a micobactérias
ambientais ou reativação de uma resposta já existente após reversão da
imunossupressão relacionada ao tumor pelo processo inflamatório
desencadeado pela vacina. A falta de especificidade do PPD tem levado à
preferência pelos ensaios de produção de IFN-γ contra antígenos específicos
Discussão 74
para a avaliação de vacinas, e mesmo para a detecção de tuberculose
latente (Ellner; Hirsch; Whalner, 2000; Lalvani et al., 2001).
Apesar da aparente ausência de respostas de anticorpos e IFN-γ, não
se pode descartar a possibilidade de que outros tipos de resposta tenham
sido desencadeadas pela vacina. Para investigar essa hipótese, utilizamos o
ensaio de proliferação de PBMC por incorporação de timidina
3
H, que fornece
uma medida mais ampla de imunização do que os ensaios anteriores.
Apenas dois pacientes apresentaram resposta proliferativa positiva
contra Hsp65 (Figura 11A), um dos quais no momento pré-vacina (paciente
023, Figura 14-023-B). Em um único paciente a proliferação celular frente à
Hsp65 passou a ser positiva após vacinação, aos 49 dias, ou uma semana
após a terceira dose de vacina (paciente 013; Figuras 14-013-A e B). No
entanto, deve-se considerar esse aumento com cautela, dada sua pequena
magnitude (I.E. = 2,05, valor muito próximo do limite estabelecido de I.E. ≥ 2).
Outros estudos utilizando vacinas de DNA contra proteínas do HIV
mostraram aumento na linfoproliferação antígeno-específica após imunização
com 3 ou 4 doses de 300 µg de DNA, tanto em pacientes HIV-positivos
(MacGregor et al., 1998) quanto em voluntários sadios (Boyer et al., 2000).
Este último mostrou proliferação induzida em todos os voluntários do grupo
de maior dose (300 µg), mesmo utilizando um ponto de corte de I.E. ≥ 5.
Surpreendentemente, no presente estudo houve predomínio de inibição
da proliferação basal pela Hsp65, tanto antes quanto após a vacinação
(Figura 9A; Figura 14). Essa inibição aparentemente não foi devido a efeito
citotóxico do preparado de Hsp65, visto que não havia morte celular aparente
Discussão 75
à inspeção microscópica nos poços de células incubadas essa proteína
(observações não mostradas). Um efeito citotóxico do Triton X-114 utilizado
para a remoção de endotoxina foi descartado por estudos anteriores de
nosso grupo (Caldas, 2005). Um dos possíveis mecanismos por trás da
inibição de linfoproliferação frente à Hsp65 é a produção de IL-10, citocina
que tem o potencial de inibir a proliferação de linfócitos (Moore et al., 2001),
detectada na grande maioria dos pacientes do presente estudo também em
resposta à Hsp65. A resposta de IL-10 é discutida em mais detalhe a seguir,
mas vale ressaltar que a forte inibição da proliferação induzida (I.E.) frente a
estímulo com Hsp65 ou Hsp60 ao longo da vacinação no paciente 023, que
acompanha o acentuado aumento na produção de IL-10 no mesmo período
(Figuras 14-023-B e C), parece apoiar a idéia de que essa citocina possa
estar envolvida na inibição observada. No entanto, essa relação inversa não
esteve presente em outros indivíduos (o paciente 013, por exemplo,
apresentou relação direta entre a proliferação celular e a produção de IL-10
frente à Hsp65; Figura 14-013-A e C), o que sugere a existência de outros
mecanismos de inibição além da IL-10.
Os efeitos mais dramáticos observados ao longo da vacinação dizem
respeito à produção de IL-10 frente aos antígenos testados. Houve aumento
de pelo menos duas vezes na freqüência de células produtoras de IL-10
frente à Hsp65 ao longo da vacinação em 5/13 indivíduos estudados (Figura
12A), sendo esse aumento progressivo e mais acentuado nos pacientes 013,
020 e 023 (Figuras 14-013-C, 020-C e 023-C). A alta produção de IL-10 não é
inesperada. Como mostrado por nosso grupo, a resposta de PBMC à Hsp60
humana é predominantemente direcionada à IL-10 (Caldas, 2005). Contudo,
Discussão 76
a população celular responsável pela produção dessa citocina não foi
definida. A presença de linfócitos T reguladores que secretam grandes
quantidades de IL-10, tanto na periferia quanto entre linfócitos infiltrantes de
tumor, já foi mostrada em pacientes com diversos tipos de câncer (Liyanage
et al., 2002; Baecher-Allan; Anderson, 2006). Existe, portanto, a possibilidade
de que as grandes quantidades de IL-10 secretadas pelas PBMC dos
pacientes do presente estudo em resposta à Hsp65 estejam relacionadas à
presença desse tipo de linfócito. A produção espontânea de IL-10 > 100
SFU/10
6
PBMC em 7 dos 13 pacientes estudados, 5 dos quais apresentaram
produção acima de 100 SFU já no período pré-vacina, pode ser
conseqüência desse processo. A presença importante de células T
reguladoras também explicaria a ausência de resposta de muitos dos
pacientes aos testes cutâneos de hipersensibilidade.
Por outro lado, foi mostrado que a Hsp65 de M. tuberculosis, em
concentração igual à utilizada no presente estudo, é capaz de induzir a
produção de IL-10 por parte de PBMC de indivíduos sadios (Lewthwaite et
al., 2001), e que tal indução pode ser devido à ativação direta de células
monocíticas, já que a depleção de linfócitos do PBMC não resultou em
redução dos níveis tanto de IL-6 quanto de IL-8. Embora a produção de IL-10
não tenha sido testada nesse último modelo, permanece o fato de que a
Hsp65 tem efeito direto sobre a produção de citocinas em células mielóides.
Um efeito direto da Hsp65 sobre células mielóides estaria mais de acordo
com as altas freqüências de células produtoras de IL-10 (> 1000 SFU/10
6
PBMC) detectadas antes da vacinação em 9 dos 11 pacientes com tempo
pré-vacina analisado. Nesse caso, outro fator que poderia contribuir para a
Discussão 77
elevada produção de IL-10 nas amostras testadas seria a alta razão
monócito/linfócito nesse grupo de pacientes (Tabela 4), o que significaria que
um número maior do que o normal de monócitos estaria sendo adicionado às
culturas celulares.
A variação observada no número de células produtoras de IL-10 ao
longo da vacinação poderia, portanto, ser o resultado de mudanças no estado
de ativação de células monocíticas no PBMC. Uma forte inflamação local,
como a observada clinicamente em 18 de 21 pacientes (edema), ou em todos
os 21 pacientes (aumento da dor após vacinação), e corroborada pelo
aumento da linfoproliferação espontânea em 4 de 11 pacientes analisados,
poderia reduzir o limiar de ativação de células mielóides, favorecendo,
portanto, a produção de IL-10 por essas células. Fenômeno semelhante foi
descrito em modelo de camundongo, onde o pré-tratamento com CpG
aumentou a produção de TNF-α e a conseqüente mortalidade após indução
de choque séptico por LPS e a produção de TNF-α e IL-6 por células de
Kupfer em cultura (Schuchmann et al., 2004). A produção de IL-10 não foi
avaliada nesse modelo. Nessa mesma linha, Wang e colaboradores (2001)
mostraram que o choque térmico de macrófagos peritoneais de camundongo
(o que provavelmente levaria a um aumento nos níveis de Hsp60 expressos
por essas células, embora os autores tenham mostrado aumento somente na
expressão de Hsp70) levou ao aumento da produção de IL-10 e redução da
produção de IL-12 por essas células frente a estímulo com LPS.
Em conjunto, esses dados parecem apoiar a hipótese de que a
vacinação com DNA-Hsp65 pode ter induzido, em vez de resposta adaptativa
específica para o antígeno codificado, uma imuno-estimulação generalizada,
Discussão 78
semelhante à induzida por citocinas ou adjuvantes. Essa hipótese é apoiada
pela observação de que, nos pacientes nos quais houve modulação
importante na resposta de IL-10 contra Hsp65, houve também mudança
correspondente em uma ou mais medidas não específicas às HSP, como
mostra a Tabela 6, baseada na Figura 14.
Tabela 6. Pacientes com mais de dois pontos avaliados que apresentaram modulação
importante no número de células produtoras de IL-10 no sangue periférico e
mudanças não-especificas concomitantes.
Paciente Modulação da resposta de IL-10 à Hsp65 Respostas com perfil
semelhante
003 Diminuição (nadir 49d) e posterior aumento
IL-10/PHA; IFN-
γ/PHA
013 Aumento (pico 49d) e posterior diminuição IL-10/TT; prolif. espontânea
018 Aumento (pico 42d) e posterior diminuição IL-10/PHA
020 Aumento progressivo
IL-10/PHA; IFN-
γ/PHA espontâneo
023 Aumento progressivo
IL-10/PHA; IFN-
γ/PHA
PHA: fitohemaglutinina; TT: toxóide tetânico.
Diferentes mecanismos poderiam explicar uma possível imuno-
estimulação generalizada. Primeiro, existe a possibilidade de que a Hsp65
produzida por células tumorais transfectadas pela vacina possa ter exercido,
in vivo, os mesmos efeitos imuno-estimulatórios descritos em por Lewthwaite
et al. (2001) em PBMC de indivíduos sadios ex vivo – incluindo a produção
de IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 e GM-CSF – o que poderia gerar uma
resposta semelhante à observada pela injeção de adjuvante (Warren; Vogel;
Chedid, 1986).
Segundo, é possível que tenha havido uma expansão de clones de
linfócitos T específicos para peptídeos da Hsp65, e que tal expansão tenha
levado à imuno-estimulação observada em alguns pacientes. Como no
presente estudo analisamos somente a produção de IFN-γ e IL-10, não
Discussão 79
podemos descartar a hipótese de que tenha havido expansão de clones de
linfócitos T produtores de outras citocinas, como IL-2 e TNF-α, o que poderia,
teoricamente, levar a uma estimulação mais ampla. A total ausência de
números detectáveis de células produtoras de IFN-γ na resposta à Hsp65, no
entanto, parece não apoiar essa hipótese.
Todavia, essas hipóteses permanecem de caráter especulativo, dado
que, embora a vacina DNA-Hsp65 em pcDNA3.1 seja expressa em modelos
animais, ao menos em forma de RNA mensageiro (Lima et al., 2003b), não
há evidências de que o mesmo tenha ocorrido nos pacientes vacinados com
DNA-Hsp65 em pVAX (Grupo do Prof. Célio Silva, FMRP-USP, dados não
mostrados). Um obstáculo para se determinar se houve ou não expressão da
proteína Hsp65 é a não-disponibilidade de anticorpos comerciais que
reconheçam somente a Hsp65 de micobactéria sem reatividade cruzada com
a Hsp60 humana.
Uma terceira possibilidade, não dependente da expressão da Hsp65, é a
de uma imuno-estimulação desencadeada pelo próprio plasmídeo utilizado.
Sabe-se que o DNA plasmideal, por ser produzido em bactérias e, portanto,
conter seqüências CpG não metiladas, pode ser reconhecido por receptores
TLR9 (Krieg, 2002). O engajamento desses receptores, presentes
principalmente em células dendríticas plasmocitóides (Hornung et al., 2002),
leva à produção de altos níveis de IFN-α e β, o que poderia desencadear
uma imuno-estimulação generalizada, com conseqüências na atividade de
PBMC. Esse reconhecimento, aliado à observação de que células dendríticas
plasmocitóides infiltrantes são freqüentemente encontradas em tumores de
cabeça e pescoço (Hartmann et al., 2003) sugere que, ao menos
Discussão 80
teoricamente, todos os componentes necessários para a geração de uma
resposta via TLR9 (CpG e células que expressam TLR9) estão presentes no
ambiente intratumoral após vacinação. A hipótese de um efeito do plasmídeo
é corroborada pelos estudos utilizando a vacina DNA-Hsp65 em modelos
animais, que mostram efeitos semelhantes para a vacina e para o plasmídeo
vazio (Lukacs et al., 1997; Lanuti et al., 2000). Além disso, estudo recente de
Sawamura et al. (2005) mostra que a injeção intradérmica de plasmídeo
vazio em animais e voluntários sadios induz dermatite com infiltrado de
células mononucleares CD3-, e que esse efeito é menor em animais TLR9
-/-
.
Nos pacientes do presente estudo, um efeito somente do plasmídeo,
independente da transcrição e tradução da Hsp65 nas células do tumor,
também explicaria a falta de imunogenicidade da DNA-Hsp65, mesmo na
presença de intensa inflamação no local da vacina. Como, por razões éticas,
não foi possível a inclusão de um grupo controle vacinado somente com o
plasmídeo vazio, essa é uma questão que permanece em aberto.
Outra possibilidade a ser considerada é de que a modulação observada
na produção de IL-10 seja conseqüência natural da doença e não um efeito
da vacinação, especialmente dadas as freqüentes infecções às quais tais
pacientes estão sujeitos. Como, novamente, não foi possível a inclusão de
um grupo controle não-vacinado, essa hipótese também não pôde ser
investigada. Independentemente do mecanismo responsável, é possível que
a grande quantidade de IL-10 produzida pelos pacientes estudados tenha tido
efeito negativo sobre o potencial de imunização da vacina DNA-Hsp65, como
sugerido por Baecher-Allan e Anderson (2006) para a imunoterapia de câncer
em geral.
Discussão 81
Um importante fator a ser contemplado na discussão da
imunogenicidade da vacina é a anergia clínica constatada na maioria (15/21)
dos pacientes antes da vacinação. Essa discussão passa pela definição do
termo “anergia” e por sua relação com a imunossupressão. A anergia foi
originalmente descrita como a ausência de reatividade à tuberculina em
pacientes infectados com o vírus do sarampo (von Pirquet, 1908).
Posteriormente, descobriu-se que essa hipo-responsividade era devido à
superativação, por superantígenos virais, de linfócitos T, que se tornavam
incapazes de responder a outros estímulos (revisado em Schwartz, 2003).
Segundo esses critérios, a hipo-responsividade encontrada em pacientes
com câncer avançado de cabeça e pescoço não seria literalmente anergia,
mas sim uma imunossupressão relacionada a outros fatores, tais como
apoptose excessiva de células mononucleares e expressão de moléculas
inibitórias pelas células do próprio tumor (Whiteside, 2005). Tal
imunossupressão pode ser menos prejudicial a um estabelecimento de
resposta antígeno-específica do que a anergia clássica. Enquanto que a
anergia clássica necessitaria da remoção do antígeno causador para ser
revertida (Schwartz, 2003), é possível que uma imunossupressão, como a
encontrada nos pacientes vacinados, seja passível de reversão somente pela
imuno-estimulação causada pelo plasmídeo. Além disso, se considerarmos a
definição in vitro de anergia, ou seja, ausência de linfoproliferação, reversível
pela adição de IL-2 (Schwartz, 2003), muitos dos pacientes estudados não
seriam considerados anérgicos, visto que 8 dos 11 pacientes para os quais
há dados de linfoproliferação apresentaram intensa proliferação espontânea
(> 1000 C.P.M.) em pelo menos um dos tempos analisados. A presença de
Discussão 82
sinais e sintomas de inflamação local nos pacientes após a vacinação
também sugere atividade imunológica, reforçando a idéia de que a ausência
de reatividade a testes cutâneos não significa necessariamente uma falta de
atividade imunológica. No entanto, independentemente da presença ou não
de anergia nesses pacientes, chamamos atenção para o fato de que a falta
de imunogenicidade da vacina DNA-Hsp65 constatada no presente estudo
deve ser interpretada com cautela, dado o estado terminal dos pacientes.
Por último, é preciso considerar que todas as avaliações apresentadas
no presente estudo são de natureza sistêmica. Dadas as características dos
sujeitos do ensaio clínico, é possível que, mesmo que tenha havido
imunização, esta não tenha sido detectável na periferia. O estudo in situ de
linhagens infiltrantes de tumor obtidas de 4 desses pacientes, para a
detecção de clones de linfócitos respondedores à Hsp65, poderá fornecer
maiores informações a esse respeito.
A segunda questão abordada no presente trabalho foi a possibilidade de
indução de alteração na resposta imune fisiológica à Hsp60 humana
mediante vacinação com Hsp65, com possíveis conseqüências no
desenvolvimento de doenças auto-imunes. Dada a extensa homologia entre a
Hsp65 de micobactéria e a Hsp60 humana (Jindal et al., 1989), nosso
objetivo inicial foi o de investigar se a modulação da resposta contra a
primeira levaria a uma modificação da resposta contra a segunda,
possivelmente por um mecanismo de mimetismo molecular (Oldstone, 1998).
Esse objetivo foi prejudicado pelo fato de não termos observado imunização
contra a Hsp65. No entanto, algumas observações merecem ser discutidas.
Discussão 83
Como níveis altos de IgG anti-Hsp60 têm sido associados a diversas
doenças com componentes auto-imunes (de Graeff-Meeder et al., 1993; Zhu
et al., 2001; Ozawa Y, et al., 1996; Kilidireas et al., 1992), investigamos
primeiramente a capacidade da vacina DNA-Hsp65 de gerar resposta
humoral contra a Hsp60. Nos pacientes estudados, a reatividade de IgG e
IgM contra a Hsp60 comportou-se de maneira semelhante à reatividade
contra Hsp65, ou seja, manteve-se estável ao longo do processo de
vacinação, sugerindo que a vacina não teve efeito também sobre a
reatividade humoral à Hsp60 (Figuras 6 e 7). Dois pacientes apresentaram
tendência a aumento na reatividade de IgG contra Hsp65 (Paciente 003,
entre 8 meses e 1 ano; Figura 14-003-E e paciente 013, entre 3,5 meses e 6
meses, Figura 14-013-E). Em nenhum desses pacientes houve aumento
correspondente na reatividade de IgG à Hsp60, o que sugere que estes
foram fenômenos independentes. Essa hipótese é apoiada pela aparente
dissociação entre os níveis individuais de anti-Hsp65 e anti-Hsp60, com
alguns pacientes apresentando níveis mais altos da primeira e outros da
segunda (Figuras 6 e 7). Dissociação semelhante é relatada também por
Prohászka e colaboradores, que não detectaram correlação entre os níveis
de anticorpos contra Hsp60 e Hsp65 em 745 indivíduos (incluindo pacientes
com doença coronariana e controles) (Prohászka et al., 2001). Esse grupo
também sugere que existe uma diferença qualitativa entre os anticorpos
contra Hsp60 e Hsp65, medida pela capacidade desses anticorpos de
ligarem-se ao antígeno homólogo e de ativar a cascata do complemento
(Prohászka et al., 1999), sugerindo que os anticorpos que reconhecem
Hsp65 e Hsp60 podem não ser os mesmos.
Discussão 84
Por outro lado, alguns pacientes passaram a apresentar resposta
positiva de IFN-γ frente à Hsp60 após a vacinação (pacientes 003, 013, 018 e
020; Figura 14), o que poderia ser sugestivo de uma resposta auto-imune
pró-inflamatória (Baccala; Kono; Theofilopoulos, 2005). Entre eles, destaca-
se o paciente 018, que mostrou aumento importante 3 meses após a primeira
dose de vacina. No entanto, esse aumento não foi acompanhado de aumento
na produção de IFN-γ frente à Hsp65, o que descarta a possibilidade de
mimetismo molecular (Figura 14-018-D). O aumento da produção de IFN-γ
frente à Hsp60 nesse paciente foi acompanhado de aumento na produção
dessa citocina frente a C-Hsp60, toxóide tetânico e PHA (Figura 14-018-F), e
de uma concomitante redução na produção de IL-10 espontânea e frente a
Hsp65, Hsp60 e PHA (Figura 14-018-C). Em conjunto, esses dados sugerem
que pode ter havido nesse paciente um desvio de resposta imune de Th2 ou
T reguladora para Th1, não restrita à Hsp60.
A produção de IL-10 frente à Hsp60 apresentou variação semelhante à
observada na produção induzida por Hsp65, embora a primeira tenha sido
significativamente mais alta do que a segunda (p = 0,011) (Figuras 12 e 13).
Existem na literatura relatos de que a Hsp60 pode exercer efeitos diretos
sobre células linfóides, independentemente de apresentação e
reconhecimento por TCR. Esse efeito, que pode envolver tanto a produção
de IL-10 (Zanin-Zhorov et al., 2005; Cohen-Sfady et al., 2005) quanto de IFN-
γ (Osterloh et al.; 2004), foi atribuído à interação da Hsp60 com os
receptores inatos TLR2 em linfócitos T (Zanin-Zhorov et al., 2003) e TLR4 em
linfócitos B (Cohen-Sfady et al., 2005). Em contrapartida, somente um estudo
mostra a produção de IL-10 por células mielóides após estímulo com Hsp60
Discussão 85
(Flohe et al., 2003) e, mesmo assim, em pequenas quantidades. Essa
aparente discrepância entre as populações celulares produtoras de IL-10
frente às Hsp60 e 65 é difícil de conciliar com a semelhança observada entre
a produção de IL-10 frente a essas proteínas na maioria dos pacientes
estudados, que sugere a existência de um mecanismo comum. É possível
que, como a maioria dos estudos da interação da Hsp60 com células do
sistema inato concentre-se na produção de citocinas pró-inflamatórias
(Prazeres da Costa et al; Wagner; Miethke, 2003), a produção de IL-10 por
essas células ainda venha a ser detectada.
O único sinal clínico sugestivo de auto-imunidade patológica observado
entre os pacientes estudados foi um derrame pericárdico apresentado pelo
paciente 013, 3,5 meses após a primeira dose de vacina, que poderia estar
relacionado à presença de uma pericardite de origem auto-imune. Nesse
paciente foi observada a única dissociação mais evidente entre a resposta de
IL-10 à Hsp65 e à Hsp60, com um pico de produção de IL-10 contra a
segunda proteína. Esse pico foi acompanhado de aumento na proliferação
frente à PHA e na produção de IFN-γ tanto espontânea quanto frente à PHA
(Figura 14-013). Novamente, esse aumento na produção de IL-10 parece não
ser específico à Hsp60, dado o aumento concomitante na resposta a
estímulos não relacionados. A razão pela qual não houve aumento na
produção de IL-10 frente à Hsp65 nesse caso não está clara. É interessante
notar também que o paciente 013 já apresentava níveis basais altos de IgG
anti-Hsp60, o que pode refletir uma predisposição ao desenvolvimento de
auto-imunidade patológica, como sugerido por alguns grupos (Wick, 2004).
Discussão 86
As mesmas amostras de soro desse paciente foram testadas para anticorpos
anti-FAN e anti-DNA, com resultados sempre negativos.
Em conjunto, nossos dados parecem indicar que a produção de IL-10
frente aos diversos estímulos testados pode ser um marcador do processo
inflamatório desencadeado pela vacinação, em vez de o efeito de um
reconhecimento específico da Hsp65 induzido pela vacina. Os efeitos
observados para as diversas proteínas na produção de IL-10 podem refletir
sua ligação direta em receptores inatos presentes em células mielóides e/ou
linfóides (o efeito do toxóide tetânico pode ser atribuído à contaminação
residual com endotoxina detectada no preparado protéico utilizado (dados
não mostrados)), que estariam em estado de maior ativação, devido à
expressão de Hsp65 no tumor ou simplesmente devido ao efeito do
plasmídeo, como sugerido pelos experimentos de Schuchmann et al. (2004)
e Wang et al. (2001), descritos acima.
Em conclusão, quanto à imunização contra Hsp65, nossos dados
parecem indicar que a vacina DNA-Hsp65 não foi capaz de imunizar os
indivíduos testados, pelo menos no que diz respeito à produção de IgG e
IFN-γ. Em contrapartida, houve intensa inflamação na maioria dos pacientes
vacinados, o que, independentemente do mecanismo envolvido, pode
favorecer o estabelecimento de uma resposta imune contra o tumor vacinado,
trazendo benefícios para o paciente. Nossos dados sugerem que será
necessário investir em estudos utilizando como sujeitos indivíduos sadios ou
em estado menos avançado de doença, com sistemas imunológicos mais
ativos, para que se possa ter a real dimensão do potencial imunogênico da
vacina. Com isso em mente, nossos dados relativos à auto-reatividade contra
Discussão 87
Hsp60, em conjunto com a avaliação clínica de auto-imunidade e toxicidade,
indicam que, pelo menos quanto a esse critério, a vacina é segura para ser
utilizada em ensaios clínicos de fase II.
Nota referente à presença de endotoxina na Hsp60 recombinante
Durante os estágios finais da elaboração da presente dissertação foi
constatado que, ao contrário do que alegava o fabricante (Lionex
Therapeutics and Diagnostics, Alemanha), havia uma grande quantidade de
endotoxina (>10.000 UI/mg) no preparado protéico de Hsp60 humana
recombinante utilizado nos ensaios celulares. Devido ao caráter recente
dessa constatação, não foi possível modificar a discussão de nossos
achados para incluir esse dado.
A concentração final de endotoxina nos ensaios celulares seria portanto
> 100 UI/ml, suficiente para levar à ativação de células mielóides, o que
poderia explicar a alta freqüência de células produtoras de IL-10 frente a esse
estímulo nas PBMC dos pacientes vacinados. No entanto, analisando os
nossos resultados, acreditamos ser pouco provável que a produção de IL-10
tenha sido decorrente dessa contaminação, uma vez que observamos
significativa diversidade nas respostas. A princípio, a contaminação não
afetaria diretamente nem a proliferação celular nem a produção de IFN-γ,
visto que essas são medidas predominantemente (ou exclusivamente, no
caso da segunda) relacionadas à atividade de linfócitos. No entanto, deve-se
considerar a possibilidade de um efeito indireto sobre os linfócitos via
ativação de monócitos.
A concentração de endotoxina na Hsp65 e nos fragmentos intermediário
e C-terminal da Hsp60 foi confirmada em < 10 UI/mg.
Conclusões 88
6 CONCLUSÕES
- A vacina DNA-Hsp65 não foi capaz de induzir resposta imune específica
contra a Hsp65 nos pacientes analisados, pelo menos segundo os
parâmetros utilizados;
- A variação na freqüência de células produtoras de IL-10 frente a diversos
estímulos sugere que a vacina tenha levado a uma imuno-estimulação não
específica nesses pacientes, o que pode ser favorável para a indução de
imunidade anti-tumoral;
- Não houve alteração na reatividade fisiológica contra Hsp60, indicando
que, pelo menos quanto a esse critério, a vacina é segura para ser utilizada
em ensaios clínicos de fase II.
Referências 89
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Anexos 97
ANEXO 1 – Projeto do ensaio clínico de fase I na íntegra
Fase 1 do estudo da aplicação de vacina de DNA-HSP65 (Heat Shock Protein) do Mycobacterium
Leprae no tratamento de formas avançadas de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço.
1. INTRODUÇÃO
Muito se evoluiu no conhecimento e tratamento de câncer porém o manejo de pacientes com
estadios avançados da doença é um dos maiores desafios dentro da prática médica. De acordo com
dados do Ministério da Saúde, as neoplasias malignas foram responsáveis por 11,84% do total de
óbitos registrados em 1997. Em nosso meio, o câncer na região de cabeça e pescoço é um dos mais
prevalentes; considerando-se apenas a cavidade oral, estima-se que no Brasil ocorreram 10.890 novos
casos de câncer em 2000. O carcinoma epidermóide é o responsável por aproximadamente 95% destes
casos.
Pacientes portadores de tumores avançados de cabeça e pescoço sofrem de maneira acentuada
com dor, problemas de deglutição, respiração e desestruturação estética que leva ao isolamento social.
O carcinoma epidermóide, que tem origem na mucosa do trato aero-digestivo alto, é um tumor
agressivo local e regionalmente. Os principais fatores prognósticos desses tumores são o tamanho e
localização da lesão primária, e a existência de metástases em linfonodos cervicais ou à distância.
Entretanto, a causa mais freqüente de óbito dos pacientes com formas avançadas está relacionada a
invasão de estruturas cervicais. Portanto, formas de terapia (intra-tumoral ou intra-lesional) de doença
refratária locorregionalmente podem ter grande impacto na evolução da doença.
A imunoterapia em câncer é uma antiga forma de tratamento retomado nos últimos anos e,
assim como outras formas de tratamento biológico do câncer avançado, mostrou resultados importantes
[Rosemberg, 2000; Bendani, 1999]. A demonstração de que as células “in vivo”, principalmente
células em intensa replicação, como as células tumorais, captam e expressam o plasmídeo de DNA com
muito mais facilidade do que inicialmente previsto, levou a um grande interesse pelo uso da vacina de
DNA no tratamento do câncer [Greten, 1999]. É possível que a utilização intratumoral destes agentes
induzam a co-expressão de antígenos tumorais e antígenos infecciosos, facilitando uma resposta
cruzada anti-tumoral, através do recrutamento de células inflamatórias para o tumor. A vacina de
DNA-HSP65 já demonstrou ser capaz de gerar uma potente resposta imune celular (Linfócito T CD4+)
Th1 em modelos animais (Lowrie, 1999). Considerando-se que a resposta dos linfócitos T CD4+ é
fundamental no controle de tumores é muito provável que esta vacina tenha papel na indução de
imunidade anti-tumoral também no homem. (Pardoll, 1999; Hung, 1998).
Portanto propomos um estudo clínico inicial - Fase 1 - da utilização da vacina de DNA que
codifica o HSP65 da Mycobacterium Leprae em pacientes com formas avançadas tumores de cabeça e
pescoço, que não têm outras alternativas terapêuticas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Características de um Estudo Clínico Fase 1 (www.clinicaltrials.gov)
Servem para determinar a dose segura de uma droga para aplicação na fase 2 e definir efeitos
agudos sobre os tecidos normais, bem como estudar a farmacologia da droga e até certas evidências de
ação anti-tumoral.
Estudos prévios em animais fornecem as seguintes informações:
-
dose inicial para ensaios clínicos;
-
previsão de possíveis efeitos nos tecidos normais aos quais o investigador deverá ficar
atento.
Na fase 1 aumenta-se a dose gradativamente, através de procedimento previamente definido,
até atingir limite tolerável de toxicidade conforme o Common Toxicity Criteria (anexo) e/ou
sinais clínicos de ação terapêutica.
Selecionam-se pacientes com doença maligna comprovada sem resposta satisfatória a terapia
convencional ou sem tratamento padronizado. Tais indivíduos devem ter as funções orgânicas
preservadas.
O cronograma de administração é determinado por diversos fatores incluindo: evidências de
cronogramas em estudos experimentais in vivo, farmacocinética, mecanismo de ação e dados clínicos
relevantes se existirem.
Anexos 98
A dose inicial geralmente equivale a 1/10 da dose em camundongos em mg/m2 de superfície
corpórea, quando não for tóxica para nenhuma espécie testada. Quando houver tal toxicidade a dose
inicial é a mínima que não demonstrou produzir mais do que efeitos mínimos e reversíveis na espécie
mais sensível testada.
2.2. Características do carcinoma epidermóide
O carcinoma epidermóide corresponde a mais de 90% de todos os tumores malignos de cabeça
e pescoço. Os principais fatores de risco para o desenvolvimento desse tipo de neoplasia são o
tabagismo e o etilismo. Outros fatores são os hábitos de higiene bucal e os traumatismos crônicos,
imunodeficiência, fatores nutricionais e exposição solar nos tumores de pele e lábio. O tratamento das
afecções de cabeça e pescoço é complexo devido ao grande número de estruturas nobres na região. Nas
últimas décadas, os avanços cirúrgicos deveram-se principalmente a melhora da anestesia, dos
cuidados peri-operatórios e à reconstrução com retalhos livres. Com a segurança da reconstrução
tornou-se possível a ressecção ampla de tumores que antes não eram operados devido ao defeito pós-
operatório. Dessa forma se obteve melhora do controle do tumor primário porém a doença regional -
metástase linfonodal - continuou sendo o determinante do fracasso terapêutico.
Independente da localização do tumor primário na região do trato aéreo-digestivo alto, o local
mais freqüente de metástases é o pescoço. Não se conhecem todas as condições necessárias para que o
tumor seja propenso a apresentar metástases porém sabemos que o tamanho, a profundidade, o caráter
infiltrativo do tumor e a imunodepressão do paciente são fatores implicados no aparecimento das
metástases [Abraham, 2001].
Quando já existe doença regional ao diagnóstico de carcinoma epidermóide mucoso de cabeça
e pescoço, o tratamento proposto na Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço – HCFMUSP é a
cirurgia seguida de radioterapia. Apesar desse tratamento agressivo, a recorrência regional da doença é
freqüente e, via de regra, o determinante do óbito do paciente.
Nos casos de recidiva cervical após cirurgia e radioterapia, muito pouco existe para ser
oferecido ao paciente. A principal terapêutica nesses casos é a quimioterapia sistêmica. Esse tratamento
não é isento de efeitos colaterais e muitas vezes necessita de internação hospitalar prolongada, apesar
de ser apenas paliativo. Portanto fica claro que é fundamental a necessidade de investigar novas
abordagens terapêuticas para este grupo de pacientes com doença avançada.
2.3. Mycobacterium sp como adjuvante de uma resposta imune.
Geluk et al. identificaram seqüências comuns entre o MHC classe 2 de diversos primatas e o
Homo Sapiens e demonstraram que segmentos importantes para a ligação com o peptídeo de algumas
moléculas de HLA-DR permaneceram inalterados por cerca de 30 milhões de anos. Essas moléculas se
ligam a peptídeos derivados do M. Tuberculosis e Leprae [Geluk, 1993], inclusive peptídeos derivados
da HSP65 do M. Leprae, demonstrando que esta proteína é um epítope importante e pode ter tido um
papel na pressão evolutiva do MHC dos primatas. Um grande corpo de evidências sugere que as
infecções, tais como Lepra e Tuberculose, vêm esculpindo o sistema imune no decorrer de milhões de
anos. Este dado é reforçado pelo fato de que populações isoladas da tuberculose, como por exemplo os
índios Yanomanis da selva amazônica, são especialmente sensíveis a esta infecção e respondem mal
mesmo quando previamente vacinados [Souza, 1997]. A presença de uma alta freqüência de linfócitos
reagindo contra antígenos do Mycobacterium sp e de uma estrutura de apresentação de antígenos
preparada para tal é explorada dentro da imunologia com a utilização destes antígenos como adjuvantes
em imunizações.
Antígenos derivados do Mycobacterium sp vêm sendo utilizados há muitos anos pelos
pesquisadores de imunologia como adjuvantes na indução da resposta imune, principalmente celular.
Para ilustrar este mecanismo poderemos citar o fato de que a imunização com antígenos derivados do
colágeno ou da mielina somente causam artrite ou encefalite autoimune quando misturados com
antígenos do M. tuberculosis. O BCG (Mycobacterium bovis) também é utilizado clinicamente e com
sucesso no tratamento do câncer de bexiga precoce. O uso intravesical de BCG já é pratica consagrada
no tratamento do câncer de bexiga [Abraham, 2001]. Os exemplos de como os antígenos do
Mycobacterium sp podem ser utilizados como adjuvantes da resposta imune são inúmeros e este
conceito é bem estabelecido dentro da imunologia [Rosemberg, 2000].
2.3.1. Justificativa do uso da vacina de DNA-HSP65
Anexos 99
Dados recentes demonstram que a resposta anti-tumoral depende muito do linfócito CD4+
[Toes, 1999] e a célula apresentadora de antígenos desempenha um papel fundamental na
sensibilização do linfócito T selvagem (naive), sendo a célula dendrítica a única célula descrita que tem
a capacidade de sensibilizar linfócitos selvagens [Benchereau, 1998 e 2000; Lotze, 2000].
O vacinação com DNA protege camundongos contra desafios infecciosos como tuberculose e
estabelece uma resposta imune celular antígeno específica que é tanto citotóxica quanto produtora de
IFN-gama representada pelos linfócitos T CD4+ e CD8+. Este padrão é considerado o ideal na indução
de uma resposta anti-tumoral efetiva [Toes, 1999; Pardoll, 2000]. A eficácia da vacina de DNA no
tratamento da tuberculose foi tão grande que pela primeira vez se demonstrou que uma vacina de
tuberculose possuía uma atividade coadjuvante terapêutica efetiva [Lowrie, 1999]. Dados mais recentes
sugerem que a interação dentro de agrupamentos de células é importante na definição e no
comprometimento final de uma célula T naive em Th1 ou Th2 [Schuhbauer, 2000]. A apresentação de
antígenos ocorre em pequenos grupos (clusters) de células, e é possível imaginar que a apresentação de
antígenos derivados do Mycobacterium sp apresentados pela mesma célula dendrítica (ou por uma no
mesmo agrupamento) pode contaminar o tipo de resposta a outros antígenos apresentados localmente,
principalmente se houver um grande número de células dendríticas infiltrando o local e estas estiverem
devidamente ativadas e produzindo IL-12.
O mecanismo pelo qual a vacina de DNA induz uma resposta imune é pouco claro, porém
estudos mais recentes demonstram que a ativação e a transfecção das células dendríticas é um evento
fundamental na indução da resposta imune [Akbari, 1999]. A indução de uma resposta imune celular
citotóxica (CD8+) também foi claramente demonstrada com esta vacina [Lowrie, 1999].
Parte importante do efeito adjuvante das vacinas de DNA devem-se ao seu conteúdo de
seqüências CpG não-metiladas que induzem a secreção de IL-12 pelas células apresentadoras de
antígenos locais. Esta citocina promove a aquisição de um fenótipo tipo 1 (Th1) e citotoxicidade
durante a apresentação e maturação dos linfócitos T adjacentes, independentemente da sua
especificidade. [Lowrie, 1999].
Lukacs et al. demonstraram que a inserção ex vivo do gene da HSP65 do M. Leprae em
linhagens de células tumorais resultou na incapacidade destas células de formar tumores em
camundongos imunocompetentes. Este grupo também descreve que a transfecção do mesmo gene in
vivo causou a regressão de modelos experimentais de tumores altamente agressivos. Este fato ocorreu
em camundongos imunocompetentes e não em camundongos SCID (Severe combined
ImunoDeficiency), sugerindo que a presença de células T mediaram a resposta anti-tumoral e
erradicaram o tumor [ Lukacs, 1997]. Tais dados sugerem que a utilização de HSP65 pode ser uma
nova abordagem no tratamento de tumores estabelecidos.
Lukacs et al. também demonstraram que a utilização de uma linhagem de células tumorais
transfectada com o gene do HSP65 do M. Leprae (Cell line J774-HSP65) também induziu proteção
contra o crescimento de tumores da linhagem original que não expressava o gene HSP65 (Cell line
J774). Esta reatividade cruzada demonstra que a resposta imune contra o tumor não se dirige
esclusivamente a epitopes do HSP65 e esta resposta se “espalha” (spreading) a outros antígenos,
indicando que a HSP65 predispõe a quebra da tolerância imunológica aos antígenos tumorais,
fornecendo o racional de uma indução de resposta cruzada na transfecção de um tumor com antígenos
do M. Leprae [Lukacs,1993]. Por este motivo a terapia com HSP65 não requer grande nível de
expressão gênica pois relativamente poucas células tumorais transfectadas são capazes de induzir
resposta imune eficaz, o que constitui uma grande vantagem considerando-se as limitações impostas
pela alta tecnologia e custo da terapia gênica atualmente. Além disso, este grupo demonstrou in vitro
que Linfócitos T derivados de camundongos vacinados com a linhagem singênica J774-HSP65 eram
citotóxicos para células da linhagem original J774, confirmando que a resposta citotóxica não se dirigia
exclusivamente ao antígeno HSP65 e que esta resposta se dirigia também a antígenos tumorais
[Lukacs, 1993]. A HSP65 funciona como chaperonas aumentando a antigenicidade de proteínas
tumorais estranhas estimulando linfócitos T capazes de eliminar células tumorais transfectadas ou não
modificadas [Lukacs, 2000].
Estes dados experimentais demonstram que a transfecção do HSP65 do
M. Leprae induz uma
resposta anti-tumoral cruzada e que esta propriedade desta vacina pode ser utilizada para novas
abordagens no tratamento de tumores em seres humanos.
2.4. Considerações sobre segurança no uso de uma vacina de DNA.
Anexos 100
O risco de indução ou aceleração de uma doença autoimune com o uso de uma vacina de DNA foi
estudado extensamente em modelos murinos. Nos experimentos com camundongos houve detecção
de um aumento do título de anticorpos anti-DNA que não foi acompanhado de nenhum sinal de
doença autoimune sistêmica como revisto em White e cols [White, 2000]. Estudos clínicos de Fase
1 em humanos observaram atentamente o surgimento de qualquer sinal de autoimunidade ou de
anticorpos anti-DNA e nenhum destes foi detectado [White, 2000]. Diversos ensaios clínicos com
vacinas de DNA já estão em andamento no momento, entre estes incluímos as vacinas para: AIDS,
Hepatite B, Herpes, Influenza, Malaria, Câncer de Colon, Linfoma, melanoma, etc
[www.clinicaltrials.gov; Rosenberg, 2000]. As vacinas de DNA tem sido associadas a reações
típicas do uso de vacinas (febre, adenomegalia, reação local, etc) porém não houve relatos de
reações graves com risco de vida para o indivíduo [White, 2000].
A vacina de DNA pode teoricamente induzir a uma mutação e ser oncogênica. Entretanto, este
risco teórico não foi demonstrado em nenhum modelo experimental [White, 2000]. Além disso, a
utilização generalizada de vacinas contendo vírus de DNA replicantes (Varíola) não foi associada a
oncogênese e possui teoricamente risco similar a uma vacina de DNA [Rosemberg, 2000; White,
2000].
A HSP65 é uma proteína da família das HSP60 gerada em condições de estresse oxidativo,
com potente ação imunogênica e que conserva grande homologia entre as diferentes espécies.
Entretanto Lukacs , um dos principais pesquisadores desta área, refere que nos seus estudos de
sobrevida a longo prazo nenhum animal desenvolveu sinais de doença autoimune e cita outros estudos
que demonstraram os benefícios da HSP65 em prevenir artrite reumatóide [Lukacs, 2000].
O uso de uma vacina de HSP65 pode teoricamente induzir uma resposta contra a proteína e
não se sabe se isto poderia levar a uma resposta cruzada contra proteínas semelhantes no Homo
Sapiens. Um estudo demonstra a presença de uma resposta imune (anticorpos) contra antígenos HSP 65
e 70 (HSP das espécies estudadas) em pacientes com Lupus Eritematoso Sistêmico (LES) e em animais
com LES experimental. Entretanto, não houve correlação clinica entre a atividade da doença e os
títulos dos anticorpos, sugerindo que os anticorpos são um epifenomeno da doença e que não
participam da resposta imune [Faulds, 1995].
A demonstração de que a proteína recombinante HSP65 do M. Leprae é um antígeno
importante e induz uma resposta celular e humoral em pacientes com Hanseníase e em contactuantes
sãos destes pacientes sugere que a reatividade cruzada entre esta proteína e outras proteínas humanas é
improvável, pois não houve nenhuma descrição de eventos autoimunes nestes pacientes [Ilangumaran,
1994]. Entretanto, teoricamente, a apresentação de tal proteína através de uma vacina de DNA não
necessariamente é a mesma de uma infecção natural. A vacina pode ser muito mais imunogênica e
induzir uma resposta autoimune mesmo que a infecção natural não a induza.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo primário
1.
Testar a segurança clínica da utilização de uma vacina de DNA-HSP65 e definir uma dose
tolerável desta em pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço.
4. MATERIAL
A vacina de DNA-HSP65 será obtida e purificada no Laboratório do Dr. Célio Silva, na USP
de Ribeirão Preto, conforme técnica descrita em Lowrie ,1999.
As Disciplinas de Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Imunologia Clínica e Alergia da USP de
São Paulo, dispõem de estrutura ambulatorial, hospitalar e laboratorial necessária para realização deste
estudo.
5. METODOLOGIA
Anexos 101
5.1. Método de definição da qualidade dos lotes da vacina para os ensaios clínicos da vacina de DNA-
HSP65. Avaliação microbiológica e de contaminantes.
O método a ser empregado na definição da segurança do uso clínico será o correntemente
utilizado na formulação de materiais biológicos. O produto será testado quanto a presença de fungos,
vírus, bactérias e pirógenos. Este serviço será realizado no Laboratório de Parasitologia, Microbiologia
e Imunologia da Faculdade de Medicina da USP de Ribeirão Preto sob a responsabilidade do
Farmacêutico José Maciel Rodrigues Júnior de acordo com critérios da legislação vigente. Segue
descrição detalhada do método:
a.
Estabelecimento de um Banco de Células de Referência (BCR) visando
assegurar a identidade e pureza do material de partida do lote de DNA a ser
obtido: O BCR será montado a partir de uma única colônia de bactéria após
caracterização pelos testes descritos no item “2.g”. Para tal, E. coli DH5α
transformada com o plasmídeo de interesse será cultivada a 37°C em meio LB agar
contendo antibiótico como marcador de seleção. Uma das colônias desenvolvidas
será removida da placa e expandida em meio LB líquido contendo antibiótico. Esta
cultura será dividida em diversas alíquotas que serão crioarmazenadas a -70°C ou em
nitrogênio líquido dando origem ao BCR.
b.
Estabelecimento de um Banco de Células de Trabalho (BCT): O BCT será obtido
pela expansão, em meio LB líquido contendo antibiótico, de uma alíquota de células
oriundas do BCR. A cultura obtida será dividida em alíquotas, crioarmazenadas a -
70°C ou em nitrogênio líquido, e utilizadas para iniciar a produção dos lotes de
plasmídeos.
c.
Estabelecimento do protocolo de fermentação a fim de otimizar os critérios de
qualidade e rendimento em larga escala: Será preparado um pré-inóculo onde uma
alíquota do BCT será rapidamente descongelada a 37°C e assepticamente inoculada
em meio LB contendo antibiótico. Esta amostra será incubada a 37°C sob agitação.
Durante o meio da fase exponencial de crescimento, uma alíquota desta cultura
inicial será retirada e diluída em meio LB contendo antibiótico. Como na etapa
anterior, o procedimento de crescimento será repetido e, quando a cultura atingir o
meio da fase exponencial de crescimento, ela será utilizada para inocular o
fermentador. O cultivo nesta fase será feito em um fermentador de 50 litros.
d.
Fermentação: a fermentação será realizada a 37°C sendo que as condições de pH,
aeração, formação de espuma, nível de produção de rejeito dentre outros fatores que
podem afetar a produção de biomassa deverão ser monitoradas experimentalmente e
controladas de forma a alcançar uma eficiente expressão do produto desejado. As
células deverão ser coletadas, de forma asséptica, no final da fase exponencial de
crescimento e armazenadas a -70°C.
e.
Otimização da recuperação de DNA pela lise em meio alcalino: Para realizar a
lise alcalina, as células serão descongeladas e resuspensas em um tampão específico.
Após serem homogeneizadas, o tampão de lise será adicionado e a suspensão será
homogeneizada e incubada à temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. Após
incubação, o tampão de neutralização será adicionado e após homogeneização, a
suspensão será filtrada em membrana de nylon e o filtrado será coletado. Embora os
volumes dos tampões de resuspensão, lise e neutralização devam ser equivalentes, a
determinação dos mesmos deverá ser feita experimentalmente monitorando o
rendimento do plasmídeo e o nível de contaminação do mesmo em função da
biomassa.
Anexos 102
f. Estabelecimento do processo de purificação pela combinação de técnicas
cromatográficas: Nesta etapa serão utilizadas, para fins de otimização, três resinas e
misturas das mesmas. Esta etapa não será detalhada neste momento devido a motivos
de proteção industrial.
g. A validação do processo será assegurada pela avaliação do produto final em:
-
Gel de agarose e análise de restrição: a presença do inserto no plasmídeo será
verificada pela digestão deste com enzimas de restrição. Três µg de cada plasmídeo
(pVAX e pVAX-hsp65 utilizados como modelo nesta fase) serão incubadas com 20
unidades de Bam H1 (Pharmacia Biotech) a 30° C por 3 horas. Em seguida, 10
unidades de Not 1 (Amersham Life Science) serão adicionadas a cada amostra. Após
3 horas de incubação a 37°C, o produto da digestão de cada amostra, bem como
plasmídeos não digeridos, serão submetidos à eletroforese em gel de agarose
(SIGMA) a 1%. A corrida será realizada a 60 V por 3 horas em aparelho Horizon
TM11.14 (BRL). 1 Kb Plus DNA Ladder (Gibco BRL) será utilizado como
marcador de peso molecular. O gel será corado com brometo de etídio e a
visualização das bandas será feita em luz ultravioleta no ImageMaster VDS
(Pharmacia Biothech);
-
Medida da absorbância DO 260/280: A quantificação dos plasmídeos será feita por
espectrofotometria em λ= 260/280nm no aparelho Gene Quant II (Pharmacia
Biotech);
-
Teste de endotoxina: a avaliação da contaminação por endotoxina será realizada
utilizando-se o método LAL;
-
Determinação da expressão da proteína recombinante: a capacidade do pVAX-
hsp65 em expressar a hsp65 em células de mamíferos será avaliada pela transfecção
de células HeLa (Human epitheloid cervical carcinoma) e células J774 (macrófagos
de linhagem tumoral originários de camundongos BALB/c) utilizando o Lipofectin®
(GIBCO BRL) como agente de transfecção. Células J774-hsp65 (células J774
transfectadas com o vetor retroviral [pZIPNeoSV(x)] carreando o gene da hsp65 de
M. leprae) serão utilizadas como controle positivo do ensaio. As células serão
cultivadas em meio RPMI 1640 (SIGMA) suplementado com 2% de soro fetal
bovino inativado por aquecimento, a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. 100µL da
suspensão de células (5x10
5
células) serão adicionados à superfície de lamínulas
estéreis em placas de 24 poços e incubados por 3 horas para permitir a adesão celular.
Após a incubação, as células serão tratadas como a seguir:
1.
células J774 e HeLa receberão 1mL de meio RPMI servindo como controle
negativo da expressão de hsp65
2. células J774-hsp65 receberão 1mL de meio RPMI servindo como controle
positivo da expressão de hsp65
3. células J774 e HeLa receberão 1 mL de meio RPMI contendo pVAX-hsp65
complexado com Lipofectin® (GIBCO BRL) segundo instruções do
fabricante.
Após 24 horas de incubação, os sobrenadantes das culturas serão
removidos e repostos com 1 mL de meio RPMI contendo 10% de soro fetal
bovino. Análises de RT-PCR e imunocitoquímica serão realizadas 48 e 72
horas, respectivamente, após o início do teste.
Anexos 103
- RT-PCR: o RNA total será isolado das células por extração em Trizol (Gibco
BRL, Grand Island, NY, USA) e precipitação em álcool seguida por um tratamento
adicional com Dnase I (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA) para evitar
contaminação com DNA genômico e plasmídeal. A amplificação por PCR será
realizada utilizando pares de primers específicos da hsp65 de M. leprae (sense 5’–
ATG-GCC-AAG-ACA-ATT-GCG-TAC-3’; antisense 5’-TTG-AGC-AGG-TCC-
TCG-TAC-TCA-c-3’; dando uma banda de 1.4 kb). A PCR será conduzida
preparando-se 50 µL da mistura como se segue: 0.5 µL de cada primer 5’ e 3’ na
concentração de 100µM, 5 µL de tampão 10X da enzima Taq, 0.5 µL de Taq
polimerase a 5 UI/µL (Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 1 µL de dNTP a 10
mM; e 2 µL da amostra. A mistura será submetida a 30 ciclos de amplificação em um
termociclador PTC-100 Programmable Thermal Controller (MJ Research Inc,
Watertown, MA, USA). Em cada ciclo, a desnaturação será a 96°C por 45 segundos,
o anelamento dos primers para formar o cDNA será conduzido a 60°C por 45
segundos, e a extensão será a 72°C por 90 segundos. O RNA mensageiro para β-
actina será detecctado por PCR (sense 5’-GTG-GGC-CGC-TCT-AGG-CAC-CAA-
3’; antisense 5’-CTC-TTT-GAT-GTC-ACG-CAC-GAT-TTC-3’; dando uma banda
de 902 bp) a fim de normalizar os níveis de RNA nas diferentes amostras. Os
produtos da PCR serão visualizados por iluminação ultravioleta após eletroforese em
gel de agarose a 0,8% contendo brometo de etídio;
- Imunocitoquímica: para realização da imunocitoquímica, as células serão lavadas
por três vezes consecutivas em solução de PBS 0,01M, pH 7,2 contendo 1% de soro
albumina bovina (BSA) (SIGMA). Em seguida elas serão fixadas em
paraformaldeído 4% por 30 minutos à temperatura ambiente, e lavadas novamente.
Todas as lavagens serão realizadas por três vezes consecutivas. Posteriormente,
realizar-se-á o bloqueio da peroxidase endógena pela incubação com PBS contendo
3% de H2O2 por 30 minutos à temperatura ambiente. Após as lavagens com PBS-
BSA 1%, as células serão incubadas com tampão de bloqueio (3 % de soro de coelho,
1% de BSA e 0.01% de Triton X 100) por 1 hora à temperatura ambiente a fim de
se obter o bloqueio das ligações protéicas inespecíficas. Em seguida, o anticorpo anti-
hsp65 será adicionado e as células incubadas em câmara úmida a 4°C durante a noite
. Após as lavagens consecutivas será feita a incubação com anticorpo anti-IgG de
camundongo conjugado à biotina (B-7022, Sigma) por 1 hora à temperatura
ambiente. Após novas lavagens as lamínulas serão incubadas por 30 minutos à
temperatura ambiente com o complexo streptoavidina biotina – peroxidase
(Streptoavidin –Dako Corporation, CA-USA). Após lavagem as reações serão
reveladas utilizando o Após lavagem as reações serão reveladas utilizando o
substrato 3-3’-Diaminobenzidina (SIGMA) (5mg em 10 ml de PBS) adicionado a
180µ de H2O2 (20 volumes). A revelação foi feita por 10 a 20 minutos, à
temperatura ambiente e protegida da luz. As reações foram interrompidas com água
destilada e as lamínulas contra-coradas com hematoxilina de Mayer previamente
filtrada, por 5 a 10 minutos, à temperatura ambiente. Após serem lavadas com água
destilada por duas vezes, azuladas com água amoniacal (solução aquosa de hidróxido
de amônio a 0,5%) e, novamente lavadas com água destilada, as lamínulas foram
secas à temperatura ambiente e montadas em lâminas com Bálsamo do Canadá. O
controle negativo das reações foi realizado através da substituição dos anticorpos
primários por PBS ou isotipos de imunoglobulinas não relacionados. A
documentação da citoquímica foi realizada em microscópio Aristoplan (Leitz),
acoplado ao sistema de fotografia MC80DX, e a análise foi realizada com auxílio do
programa Image-pro Plus versão 3 para Windows após a captação da imagem da
microscopia por meio de câmara digital SONY CCD-IRIS acoplada ao microscópio.
-
Avaliação da contaminação por RNA e por DNA genômico: será feita por
eletroforese em gel de agarose
-
Testes de esterilidade: serão realizados de acordo com procedimentos
farmacopéicos.
Anexos 104
5.2. Aplicação da vacina de DNA-HSP65 em pacientes com câncer epidermóide avançado de cabeça e
pescoço.
O estudo de fase 1 da vacina de DNA-HSP65 será realizado em pacientes com metástases
cervicais recidivadas de carcinoma epidermóide, sem outras possibilidades terapêuticas curativas, no
serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HCFMUSP em colaboração direta com o serviço de
Imunologia Clínica e Alergia do HCFMUSP. Os pacientes serão acompanhados ambulatorialmente por
três clínicos (Dr. Kald Abdallah ,Dra. Fanny D. Lima e Dr. Luis Felipe Ensina) e dois cirurgiões (Dr.
Pedro Michaluart Jr. E Dr. Rodney B. Smith). Os pacientes serão inicialmente avaliados para a inclusão
de acordo com os critérios abaixo relacionados. O estadiamento do tumor será definido com todos os
exames complementares usualmente necessários para tal. O tumor será medido detalhadamente através
de tomografia computadorizada e/ou ressonância magnética. Um método de imagem será repetido após
o término das injeções em todos os pacientes que participarem do estudo para se avaliar o impacto
sobre a massa tumoral.
5.3. Seleção de pacientes
Serão adotados os seguintes critérios de inclusão:
•
Idade maior que 18 anos.
•
Compreender claramente e concordar com o estudo assinando o consentimento informado.
•
Karnofsky acima de 70%.
•
Expectativa de vida maior que três meses.
•
Diagnóstico histológico de carcinoma epidermóide de mucosa de cabeça e pescoço.
•
Doença sem terapêutica curativa possível.
•
Massa cervical irressecável de acordo com os seguintes critérios: a) invasão da base do
crânio; b) invasão da fáscia pré-vertebral; c) invasão da musculatura profunda do pescoço;
d) invasão da artéria carótida interna ou comum;
•
Ausência de doença pulmonar debilitante.
•
Creatinina inferior a 2mg/dL.
•
Ausência de sinais clínicos de insuficiência cardíaca.
•
Ausência de neutropenia, plaquetopenia ou anemia severa (hematócrito menor que 35%).
•
Mais de um mês desde o último tratamento radioterápico.
•
Mais de um mês desde a última dose de quimioterapia.
•
Mais de um mês desde a última cirurgia.
•
Ausência de infecções concomitantes.
•
Ausência de outras doenças malignas (exceto carcinoma basocelular de pele localizado).
•
Sem terapia biológica prévia (terapia gênica baseada em vírus, DNA recombinante)
•
Sem doenças auto-imunes (Chron, Doença Reumatóide, etc.).
•
Sem história psiquiátrica (exceto depressão controlada).
•
Se o paciente for do sexo feminino, deverá ser não gestante e pacientes em idade fértil
devem ter teste de gravidez negativo e usar anticoncepcional.
(a) Critérios de exclusão
•
Uso de corticoesteróides.
•
Anergia cutânea (definida como intradermo-reação com área de enduração menor que 5mm
contra dois ou mais dos seguintes antígenos: Tuberculina, Tricofitina e Levedurina).
•
Linfopenia (contagem de linfócitos abaixo do limite normal inferior do método).
5.4. Desenho experimental
O estudo aqui proposto é prospectivo não randomizado, aberto, não controlado, com a
finalidade de definir a dose máxima tolerável da vacina de DNA-HSP65 em pacientes com câncer
avançado de cabeça e pescoço. Está previsto um n de 18 pacientes subdivididos em 3 grupos de 6
pacientes. Cada paciente receberá 3 doses da vacina que será aplicada em uma injeção intratumoral nos
tempos 0, 21
o
e 42
o
dia. Da seguinte forma: Grupo A receberá 3 doses de 150 mcg, Grupo B: 3 doses
de 600 mcg e Grupo C 3 doses de 1,2 mg. Os pacientes serão acompanhados durante 5 a 7 dias após as
aplicações da vacina com coletas de exames e avaliação clínica diariamente. Dados preliminares em
outros ensaios com vacinas de DNA sugerem que doses de 0,5 a 4 mg podem ser utilizadas com
Anexos 105
segurança por isso a dose máxima proposta é de 1,2 mg. Os pacientes serão submetidos a uma biópsia
do tumor no local da inoculação da vacina uma semana após a terceira dose da vacina:
A biópsia tumoral servirá para análise da resposta inflamatória causada pela vacina dentro do tumor,
através do estudo histopatológico. Além disso, parte da biopsia será processada para coleta de material
para realização de RtPCR no tecido para verificação da presença de mRNA da HSP65 do M. leprae. A
presença de mRNA documentará a transfecção do DNA-HSP65. Com o intuito de comprovar a eficácia
da vacina em induzir uma resposta imune eficaz será realizada dosagem pré e pós-vacinal dos títulos de
anticorpos anti-HSP65 do M. leprae por ELISA.
5.6. Dose máxima tolerada
A dose máxima tolerada será definida como a dose inferior à dose que ocasionar toxicidade
graus 3 ou 4 em um terço dos pacientes. Critérios de toxicidade foram derivados dos critérios do
National Cancer Institute Common Toxicity Criteria (vide anexo).
5.7. Exames laboratoriais auxiliares
Uma coleta de material (sangue) será realizada imediatamente antes da injeção e a partir de
então semanalmente por 6 semanas.
1.
Hemograma completo com plaquetas.
2.
Bilirrubinas totais e frações.
3.
Ureia e creatinina.
4.
Cálcio iônico e fósforo.
5.
Sódio e potássio.
6.
Glicemia.
7. ALT, AST, DHL, CPK, fosfatase alcalina.
8.
Coagulograma.
9.
Linfócitos T CD4+.
10. Haptoglobina.
11.
Teste de Coombs.
12.
Fibrinogênio.
13. FAN e anti-DNA.
6. EQUIPE TÉCNICA PRINCIPAL
Alberto R. Ferraz - Professor Titular da Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço -
HCFMUSP.
Célio Silva -Professor Titular da Disciplina de Microbiologia e Imunologia da FMUSP- RP.
Fanny Dantas de Lima – Posgraduanda da Divisão de Alergia e Imunologia Clínica do HCFMUSP.
Jorge Kalil - Professor Titular da Disciplina de Alergia e Imunologia Clínica do HCFMUSP.
José Maciel Rodrigues Júnior – Farmacêutico do Laboratório do Vacinas Gênicas da FMUSP- RP.
Kald A. Abdallah – Médico Pesquisador da Divisão de Alergia e Imunologia Clínica do HCFMUSP.
Karla Lima – Farmacêutica do Laboratório do Vacinas Gênicas da FMUSP- RP.
Luis Felipe Ensina – Médico Alergista e Imunologista Clínico. Mestrando do ICB-USP.
Anexos 106
Pedro Michaluart Jr. - Médico Assistente da Disciplina de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do
HCFMUSP.
Roger Chammas - Médico Pesquisador do LIM da Disciplina de Oncologia/FMUSP.
7. RESULTADOS ESPERADOS
O projeto visa a identificação da dose adequada e segura de uma vacina de DNA-HSP65 para
futura aplicação em um estudo fase 2, estabelecendo assim uma alternativa para o tratamento local de
recidivas de metástases cervicais de carcinoma epidermóide. Os autores acreditam que a discussão e a
interação surgida por projetos que envolvam a colaboração de pesquisadores de campos tão diferentes
irá incentivar novas idéias e novos projetos, gerando ganhos de conhecimentos científicos e
tecnológicos.
8. REFERÊNCIAS
Abraham J e Allegra CJ. Handbook of Clinical Oncology 2001. 1
st
Edition. Lippincott Williams &
Wilkins, Philadelphia.
Akbari O, Panjwani N, Garcia S, Tascon R, Lowrie D, Stockinger B. DNA vaccination: Transfection
and activation of Dendritic cells as key events for immunity. J Exp Med 1999; 189(1):169-177.
Banchereau J, Briere F, Caux C, Davoust J, Lebecque S, liu Y, Pulendran B, Palucka C.
Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev of Immunol 2000; 18:767-811.
Banchereau J, Steinman. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998, 392: 245-252.
Bendani M, Gocke CD, Kobrin CB, et al. Complete molecular remissions induced by patient-specific
vaccination plus granulocyte-macrophage colony-stimulating factor against lymphoma. Nature
Medicine 1999; 5(10):1171-7.
Faulds G, Conroy S, Madaio M, Isemberg D, Latchman. Increased levels of antibodies to heat shock
proteins with increasing age in MRL/MP-LPR/LPR mice. Brit J Rheumatol 1995; 34:610-615.
Geluk A, Elferink DG, Slierendregt BL, Meijgaarden KEV, Vries RRD, Ottenhoff TH, Bontrop RE.
Evolutionary conservation of major histocompatibility complex-DR/peptide/T cell interactions in
primates. J Exp Med 1993; 177:979-87.
Greten TF e Jaffee EM. Cancer Vaccines. J Clin Oncol 1999; 17(3):1047-60.
Hung K, Hayashi R, Lafond-Walker A, Lowenstein C, Pardoll D, Levitsky H. The central role of
CD4+ T cells in the antitumor immune response. J Exp Med 1998; 188:2357-2368.
Lukacs KV, Lowrie DB, Stokes RW, Colston MJ. Tumor cells transfected with a bacterial heat-
shock gene lose tumorigenicity and induce protection against tumors. J Exp Med 1993 Jul
1;178(1):343-348.
Lukacs KV, Nakakes A, Atkins CJ, Lowrie DB, Colston MJ. In vivo gene therapy of malignant
tumors with heat shock protein-65 . Gene Ther 1997 Apr;4(4):346-350.
Lucaks KV, Pardo OJ, Colston MJ, Geddes DM, Alton EWFW. Heat shock proteins in cancer therapy
in Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges. 2000. Habib Kluwer Academic/
Plenum Publishers, New York.
Lotze MT, Thomson AW. Dendritic Cells. Biology and clinical applications. Academic Press, 1999.
Anexos 107
Lowrie DB , Tascon RE , Bonato VLD , Lima VMF , Faccioli LH , Stavropoulos E , Colston MJ ,
Hewinson RG , Moelling K , Silva CL. Therapy of tuberculosis in mice by DNA vaccination. Nature
1999; 400: 269- 271.
Pardoll DM. Inducing autoimmunity disease to treat cancer. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:5340-2.
Rosemberg SA. Biologic Theraphy of Cancer 2000. 3
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Edition. Lippincott Williams & Wilkins,
Philadelphia.
Toes REM, Ossendorf F, Offringa R, Melief CJM. CD4+ cells and their role in antitumor immune
resposnse. J Exp Med 1999; 189:753-6.
WhiteSA e Conry RM. Cancer Vaccines: Clinical applications (pg 679) in Rosemberg SA. Biologic
Theraphy of Cancer 2000. 3
rd
Edition. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia.
Schuhbauer DMS, Mitchison NA, Mueller B. Interaction within clusters of dendritic cells and helper T
cells during initial Th1/Th2 commitment. European Journal of Immunology 2000; 30(5):1255-62.
Sousa AO, Salem JI, Lee FK, Verçosa MC, Cruaud P, Bloom BR, Lagrange PH, David HL. Na
epidemic of tuberculosis with a high rate of tuberculin anergy among a population previously
unexposed to tuberculosis, the Yanomani indians of the brazilian amazon. Proc Natl Acad Sci USA
1997; 94:13227-13232.
Anexos 108
ANEXO 2 – Critérios de seleção de pacientes
Idade superior a 18 anos.
Compreender claramente e concordar com o estudo, assinando o consentimento
informado.
Karnofsky* acima de 70%
Expectativa de vida maior que três meses.
Diagnóstico histológico de carcinoma epidermóide de mucosa de cabeça e pescoço.
Doença sem terapêutica curativa possível.
Massa cervical irressecável de acordo com os seguintes critérios: a) invasão da base
do crânio; b)invasão da fáscia pré-vertebral; c) invasão da musculatura profunda do
pescoço; d) invasão da artéria carótida interna ou comum;
Ausência de doença pulmonar debilitante.
Creatinina inferior a 2mg/dL.
Ausência de sinais clínicos de insuficiência cardíaca.
Ausência de neutropenia, plaquetopenia ou anemia severa (hematócrito menor que
35%).
Mais de um mês desde o último tratamento radioterápico.
Mais de um mês desde a última dose de quimioterapia.
Mais de um mês desde a última cirurgia.
Ausência de infecções concomitantes.
Ausência de outras doenças malignas (exceto carcinoma basocelular de pele
localizado).
Sem terapia biológica prévia (terapia gênica baseada em vírus, DNA recombinante).
Sem doenças auto-imunes (Doença de Chron, Doença Reumatóide, etc.).
Sem história psiquiátrica (exceto depressão controlada).
Se o paciente for do sexo feminino, deverá ser não-gestante e pacientes em idade
fértil devem ter teste de gravidez negativo e usar anticoncepcional.
Critérios de exclusão:
Uso de corticoesteróides.
Linfopenia (contagem de linfócitos abaixo do limite normal inferior do método).
* Escala de atividade funcional para pacientes: 100% = Perfeitamente bem; 90% = Sintomas menores –
capaz de viver uma vida normal; 80% = Atividade normal com algum esforço; 70% = Incapaz de realizar
atividade normal, mas capaz de cuidar de si próprio; 60% = Necessita de assistência ocasional para
cuidar de suas necessidades básicas; 50% = Incapacitado; 40% = Requer assistência médica e de
enfermagem mas não encontra-se hospitalizado; 30% Severamente incapacitado, hospitalizado; 20% =
Muito doente, requer suporte ativo; 10% = Moribundo; 0% = Morte.
Anexos 109
ANEXO 3 – Resultados brutos
A. Reatividade de anticorpos (ELISA) – Absorbância
Hsp65 – IgG Hsp65 – IgM Hsp60 – IgG Hsp65 – IgM
Grupo A (150
µ
g)
003-pré
0,470 0,770 0,585 0,327
003-1
0,520 0,810 0,626 0,356
003-3
0,599 0,830 0,689 0,374
003-6m
0,629 0,915 0,682 0,377
003-8m
0,603 0,854 0,698 0,351
003-1A
0,883 0,954 0,697 0,339
004-1
0,806 0,105 0,548 0,214
004-2
0,805 0,117 0,623 0,189
004-3m
0,835 0,123 0,645 0,180
004-6m
0,609 0,114 0,581 0,148
006-pré
0,671 0,168 1,084 0,212
006-1
0,511 0,104 0,838 0,126
006-6m
0,647 0,140 0,962 0,171
006-1A
0,914 0,172 1,266 0,215
007-pré
0,259 0,429 0,410 0,467
007-3
0,275 0,405 0,421 0,534
Grupo B (150
µ
g)
009-1
0,637 0,582 0,334 0,503
009-2
0,696 0,523 0,367 0,474
010-pré
0,325 0,173 0,521 0,235
010-1
0,263 0,126 0,444 0,176
011-pré
0,488 0,412 0,425 0,511
011-1
0,523 0,415 0,504 0,477
011-2
0,448 0,367 0,461 0,487
011-3
0,385 0,393 0,513 0,555
012-pré
0,391 0,268 0,749 0,268
012-1
0,426 0,269 0,733 0,269
021-2
0,506 0,286 0,785 0,286
012-3
0,504 0,270 0,793 0,270
012-3m
0,605 0,296 0,812 0,296
012-6m
0,522 0,310 0,806 0,310
012-1A
0,490 0,350 0,826 0,350
013-pré
0,549 0,145 1,259 0,156
013-1
0,667 0,135 1,193 0,147
013-2
0,642 0,148 1,163 0,161
013-3
0,669 0,154 1,142 0,163
013-3m
0,605 0,158 1,077 0,164
013-3.5m
0,714 0,202 1,305 0,199
013-6m
1,034 0,180 1,093 0,171
016-pré
0,505 0,110 0,569 0,265
016-1
0,454 0,095 0,476 0,288
Anexos 110
Reatividade de anticorpos (ELISA) – Absorbância (cont.)
Hsp65 – IgG Hsp65 – IgM Hsp60 – IgG Hsp65 – IgM
Grupo C (150
µ
g)
017-pré
0,822 0,282 0,604 0,341
017-1
0,725 0,319 0,665 0,393
018-1
1,294 0,134 0,958 0,190
018-2
1,335 0,140 1,044 0,178
018-3
1,341 0,148 1,092 0,214
018-3m
0,323 0,017 0,927 0,031
020-pré
0,260 0,014 0,883 0,021
020-1
0,405 0,027 0,902 0,038
020-2
0,305 0,023 0,907 0,032
020-3
0,313 0,021 0,946 0,033
021-pré
1,477 0,113 1,346 0,145
021-1
1,293 0,122 1,057 0,154
021-2
1,336 0,172 0,829 0,199
021-3
1,416 0,174 1,088 0,210
022-pré
1,118 0,049 1,054 0,108
022-1
1,395 0,049 1,024 0,117
022-2
1,268 0,042 1,087 0,099
022-3
1,279 0,043 1,065 0,098
023-pré
0,416 0,166 0,925 0,181
021-1
0,384 0,171 0,874 0,194
023-2
0,671 0,200 0,871 0,211
023-3
0,677 0,192 0,859 0,200
Anexos 111
B. Proliferação celular (C.P.M.)
Esp. Hsp65 Hsp60 I-Hsp60 C-Hsp60 TT PHA
Grupo A (150
µ
g)
003-pré
554 225 435 342 323 377 4650
003-1
1421 342 473 679 724 272 2979
003-2
1437 293 623 n/a n/a n/a 4393
003-3
2215 607 2277 2199 1914 469 6395
003-3m
1802 538 1667 n/a n/a n/a 7921
003-8m
1707 551 1404 1193 1717 524 8473
003-1A
2138 561 1839 1056 1274 695 13549
006-pré
541 245 146 148 179 179 30888
006-6m
547 334 341 247 204 224 32063
006-1A
494 393 157 260 212 414 50394
007-1
1230 309 266 241 247 412 72315
007-2
1805 404 1094 357 332 1203 118701
008-pré
131 70 243 n/a n/a 173 27316
008-1
325 46 238 102 98 289 23033
Grupo B (150
µ
g)
010-pré
1123 464 1282 544 882 16 32567
010-1
245 174 542 146 197 15 21079
011-pré
n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
011-1
n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
012-pré
314 203 662 247 369 273 18911
012-1
243 229 703 427 337 278 19099
012-3
511 299 1472 544 874 378 18976
012-3m
290 255 471 202 295 126 11029
012-6m
324 310 576 264 320 146 14263
012-1A
487 399 489 327 357 178 43123
013-pré
308 317 299 398 180 322 12713
013-1
872 547 440 572 654 526 44476
013-2
1283 382 436 666 641 507 17313
013-3
1032 2124 484 n/a n/a n/a 16440
013-3m
991 1863 379 254 286 274 6462
013-
3,5m
470 306 121 n/a n/a n/a 42741
013-6m
673 540 288 n/a n/a n/a 73775
Grupo C (150
µ
g)
017-pré
n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
017-1
n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
018-1
2228 814 1992 1835 2234 4983 49321
018-2
1125 622 1302 n/a n/a n/a 31494
018-3
685 490 1119 n/a n/a n/a 30135
018-3m
1640 1173 1208 n/a n/a n/a 19293
020-1
3848 1176 2809 n/a n/a n/a 5312
020-2
7091 1875 5381 n/a n/a n/a 12364
020-3
2633 845 1801 n/a n/a n/a 7691
021-pré
797 211 264 444 529 239 26729
021-1
2231 251 660 348 533 901 45634
021-2
862 509 858 394 620 1471 49304
021-3
n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a
022-pré
717 327 2430 507 696 n/a 6325
022-1
680 254 865 264 616 n/a 8384
023-pré
277 693 3778 n/a n/a n/a 17468
021-1
599 455 1540 630 555 n/a 16914
023-2
1262 508 1622 n/a 1101 n/a 19670
023-3
918 323 461 493 840 n/a 21248
Esp – produção espontânea; TT – toxóide tetânico; PHA – fitohemaglutinina;
n/a – não avaliado.
Anexos 112
C. Produção de IFN-γ (Elispot) – CFU/10
6
PBMC
Esp. Hsp65 Hsp60 I-Hsp60 C-Hsp60 TT PHA
Grupo A (150
µ
g)
003-pré
10 0 0 15 5 25 ++
003-1
10 5 0 10 0 0 ++
003-2
10 0 20 10 30 25 ++
003-3
0 0 0 10 0 10 +
003-3m
0 5 5 15 20 5 ++
003-8m
10 10 15 20 10 0 +++
003-1A
30 25 80 75 95 20 ++++
006-pré
10 0 5 0 0 10 +/++
006-6m
0 0 10 0 10 5 +/++
006-1A
10 5 30 10 25 10 ++/+++
007-1
0 0 35 10 40 0 +
007-2
5 5 15 5 0 0 +
008-pré
35 20 180 50 40 85 +/++
008-1
15 15 35 15 25 45 +
Grupo B (150
µ
g)
010-pré
10 55 425 70 170 345 ++++
010-1
0 0 5 5 5 45 +
011-pré
0 5 10 5 5 20 ++++
011-1
0 10 5 0 0 0 +
012-pré
0 0 5 5 0 5 ++/+++
012-1
0 0 5 5 0 0 +/++
012-3
5 0 20 0 0 0 ++/+++
012-3m
0 0 5 0 5 0 +/++
012-6m
0 0 5 0 0 0 ++/+++
012-1A
0 0 0 0 0 0 +
013-pré
5 10 20 5 15 5 +
013-1
15 5 70 30 30 40 ++++
013-2
15 10 60 20 10 25 ++
013-3
15 5 50 5 20 25 +++
013-3m
20 10 60 15 20 55 +
013-
3,5m
5 5 65 0 0 0 +++++
013-6m
5 5 0 0 30 10 +
Grupo C (150
µ
g)
017-pré
40 55 100 55 95 145 ++
017-1
20 5 0 10 0 15 +
018-1
0 45 45 20 30 70 ++++
018-2
20 40 70 n/a n/a n/a +++
018-3
10 50 65 n/a n/a n/a +++
018-3m
70 70 175 70 250 310 +++++
020-1
50 65 80 n/a n/a n/a ++
020-2
75 70 45 n/a n/a n/a ++++
020-3
165 80 225 n/a n/a n/a +++++
021-pré
0 5 20 0 0 n/a ++
021-1
0 5 15 0 0 n/a +
021-2
5 0 15 0 5 n/a ++
021-3
0 0 15 n/a n/a n/a +++
022-pré
0 10 240 5 25 n/a +
022-1
25 10 260 10 55 n/a ++
023-pré
40 85 180 n/a n/a n/a ++
021-1
35 40 230 25 30 n/a +++
023-2
20 10 55 10 20 n/a +++
023-3
25 35 225 15 35 n/a ++++
Esp – produção espontânea; TT – toxóide tetânico; PHA – fitohemaglutinina n/a –
não avaliado.
Anexos 113
D. Produção de IL-10 (Elispot) – CFU 10
6
PBMC
Esp. Hsp65 Hsp60 I-Hsp60 C-Hsp60 TT PHA
Grupo A (150
µ
g)
003-pré
1705
9150 9590 10090 10230
2110 3940
003-1
280
6260
4040 5445
6730
705 1620
003-2
450 4255 4425 4075 4715 145 1455
003-3
160 4050 3080 2065 3015 40 1260
003-3m
430
6640
4595 4535 4225 855 1895
003-8m
1280
9950 5380 6200 7060
1600
4330
003-1A
2250
11080 6950 8490 10090
2135
6040
006-pré
15 2335 3510 2645 2595 150 225
006-6m
370 2720 3250 3255 3480 610 445
006-1A
100 3605 4075 3855 4780 460 1170
007-1
20 1730 3360 3760 4360 915 175
007-2
20 215 1905 265 570 140 260
008-pré
65 2820 3325 450 2100 1635 275
008-1
35 1685 3625 110 935 1660 105
Grupo B (150
µ
g)
010-pré
210 4310 5220 3820 5695 4800 1635
010-1
10 865 1765 1605 2295 1845 130
011-pré
20 2210 4360 1775 3225 2960 300
011-1
25 1155 2615 n/a n/a n/a 30
012-pré
15 110 1385 5 25 345 1295
012-1
20 135 540 0 2 90 1420
012-3
10 265 1905 0 5 95 1535
012-3m
45 645 1660 130 205 415 1050
012-6m
5 250 1980 20 25 170 1220
012-1A
5 25 280 0 15 5 160
013-pré
65 1180 3820 435 1410 925 1020
013-1
30 2845 6560 1965 3835 3850 680
013-2
160 2655
10060
2745 5110 4260 1940
013-3
465 4305
8740
4960 4520 3525 1345
013-3m
110 1820 3615 3980 3685 2160 1255
013-
3,5m
5 750
7500
n/a n/a n/a 145
013-6m
30 710 1995 4235 3985 670 20
Grupo C (150
µ
g)
017-pré
170 4025 4295 990 2290 760 450
017-1
80 3305 2995 810 1225 165 175
018-1
750
5540 9040
n/a n/a n/a
6180
018-2
1660
9260 10090
n/a n/a n/a
7720
018-3
1020
6730 8990
n/a n/a n/a
4140
018-3m
90 2300 3710 n/a n/a n/a 1935
020-1
465 3330
5100
n/a n/a n/a 1555
020-2
700
4380 7610
n/a n/a n/a 2545
020-3
2065
8680 14450
n/a n/a n/a
4550
021-pré
15 1175 2210 55 165 285 155
021-1
0 385 1210 15 15 80 55
021-2
10 835 1100 75 135 125 170
021-3
0 1995 1820 n/a n/a 295 250
022-pré
0 65 300 25 70 n/a 15
022-1
20 160 2370 205 525 n/a 495
023-pré
20 1585 1880 n/a n/a n/a 1450
021-1
15 3405 5880 170 125 n/a 2260
023-2
15 3760 6020 690 345 n/a 3185
023-3
30
9315 14060
2840 1580 n/a
10560
Esp – produção espontânea; TT – toxóide tetânico; PHA – fitohemaglutinina n/a –
não avaliado. Valores em negrito foram determinados manualmente.
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