ads:
i
DANIELA MARIA BASTOS DE SOUZA
CARACTERIZAÇÃO PATOLÓGICA E GÊNICA (GENE
P53) DOS TUMORES MAMÁRIOS EM CADELAS
RECIFE- PERNAMBUCO
MARÇO/2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
DANIELA MARIA BASTOS DE SOUZA
CARACTERIZAÇÃO PATOLÓGICA E GÊNICA (GENE
P53) DOS TUMORES MAMÁRIOS EM CADELAS
RECIFE- PERNAMBUCO
MARÇO/2006
ads:
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO PATOLÓGICA E GÊNICA (GENE P53) DOS
TUMORES MAMÁRIOS EM CADELAS
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência Veterinária da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para a obtenção
de grau de Doutor em Ciência Veterinária.
ORIENTADA: DANIELA MARIA BASTOS DE SOUZA
ORIENTADORA: PROFª DRª. AUREA WISCHRAL
CO-ORIENTADOR: PROF. DR. MANOEL ADRIÃO GOMES FILHO
RECIFE – PERNAMBUCO
MARÇO/2006
iv
Ficha catalográfica
Setor de Processos Técnicos da Biblioteca Central – UFRPE
S729c Souza, Daniela Maria Bastos de
Caracterização patológica e gênica (gene P53) dos
tumores mamários em cadelas / Daniela Maria Bastos
de Souza – 2006.
78 f. : il.
Orientador: Áurea Wischral
Tese (Doutorado em Ciência Veterinária) – Univer-
sidade Federal Rural de Pernambuco. Departamento de
Medicina Veterinária.
Referências
CDD 574.88
1. DNA
2. PCR
3. Cão
4. Histopatologia
5. Mama – Tumores
6. Câncer em cão
I. Wischral, Aurea
II. Título
v
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO PATOLÓGICA E GÊNICA (GENE P53) DOS TUMORES
MAMÁRIOS EM CADELAS
Tese Doutorado elaborada por
Daniela Maria Bastos de Souza
Aprovada pela Banca Examinadora
Profª Drª Aurea Wischral
Orientadora
Prof. Dr. Manoel Adrião Gomes Filho
Co-orientador
Profª Drª Mirian NogueiraTeixeira
Profª Drª Márcia Maria Bezerra da Silva
Prof. Dr. Fernando Leandro dos Santos
Prof. Dr. Paulo Fernandes de Lima
vi
SUMÁRIO
Páginas
Dedicatória
Agradecimentos
RESUMO
1
INTRODUÇÃO 1
2
REVISÃO DE LITERATURA 4
2.1 A glândula mamária 4
2.2 Neoplasias das glândulas mamárias 6
2.3 O ciclo celular 9
2.4 A proteína p53 13
2.5 A atividade da proteína p53 14
2.6 Mutações no gene p53 15
3
ARTIGO 1
Caracterização histopatológica das neoplasias mamárias e sua relação
com fatores de risco em cadelas na cidade do Recife-PE, Brasil.
21
4
ARTIGO 2
Estudo de mutações nos exons 4 a 8 do gene p53 em tumores malignos
em glândulas mamárias de cadelas.
45
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS 72
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 74
7
ABSTRACT 79
8
ANEXO 80
vii
Dedico
Gabriela, Ulysses, Ignês e Joaquim
Dedico a vocês a minha vida.
No meio das tempestades eu encontrava a luz nos teus olhares.
Sim eram anjos. E foi em vocês que meu coração encontrou o abrigo e a paz tão sonhada, é na
família que mora a felicidade.. Pude então saber que o amor contido em meu coração era de vocês.
viii
Agradecimentos
AgradecimentosAgradecimentos
Agradecimentos
A Luz que nos guia, Deus
A minha filha Gabriela agradeço-lhe, você é a melhor parte da minha vida.
A meus pais Ignês e Joaquim que sempre foram incentivadores natos, que sempre acreditaram nas minhas
escolhas. Pelo apoio intensivo nesta última fase.
A meu amor Ulysses, pelo carinho, dedicação, paciência e sobretudo apoio que sempre me foi dado.
A meus irmãos Isaac e David e cunhadas Eliane e Sandra, pelo companheirismo.
A meus sobrinhos, Alessandra, Isaac, Rafaela, Bruno e David, pelas alegrias e carinhos por esta Tia Dani.
A minha avó Iracy e tia Severina (In memorian) e tia Terezinha pelo carinho.
A meu tio Isaac pelo primeiro excelente modelo de Veterinário e meu tio Inaldo por sempre resolver as broncas do
computador.
À Profa. Dra. Aurea Wischral, pela confiança, amizade, calma e delicadeza que conduz a orientação e
sobretudo pelo exemplo de ser humano, pelo respeito as pessoas, estimo minha admiração.
Ao Prof. Dr. Manoel Adrião pelos ensinamentos, incentivos e principalmente pelo entusiasmo com o trabalho.
A minha grande amiga Zoraide, pela vontade em ajudar, pelo carinho, amizade sincera, dedico este trabalho.
A meu amigo Simonal, pelo prazer em ajudar, dedicação e sobretudo amizade sincera, e Kelly sua namorada que
em muitas situações certamente sentiu a falta do seu amor
Mirella, pela ajuda fundamental na execução deste trabalho , pelos ensinamentos, amizade e sobretudo pelo
carinho, a Seu Namorado Victor, que também abdicou da sua convivência
A grande amiga Karina Melo, que sempre foi incentivadora nata, que sempre acreditou no meu trabalho.
A querida amiga Lirêda, que sempre tinha uma palavra de carinho, um gesto delicado e pelo apoio durante o
experimento.
A Vandilson, pelo incentivo e coleta das amostras, fundamental para execução deste trabalho.
A Profa. Márcia Pereira e Prof. Fernando Leandro pela leitura das lâminas de histopatológico e pelo carinho.
Aos alunos da graduação Jarbas que sempre esteve ajudando nas coletas e Thaysa pelo carinho.
Aos funcionários da Animal Vet Center, Karina Feitosa, Tanagra, , Silvani e José Ricardo, por tantas vezes
ouvir pacientemente as vivências deste trabalho.
A área de Reprodução, que sempre foi inspiradora.
Ao Prof. Paulo Fernandes de Lima pelo carinho e primeira oportunidade na área de Reprodução..
À Profa. Maria Madalena Pessoa Guerra, pela afeição.
À Profa. Márcia Brayner Paes Barreto, pelo incentivo.
ix
A querida Edna, por sempre está disposta a nos ajudar.
A área de Cirurgia, por ter permitido, através de Vandilson, Acácio, Vera e Ilma a coleta das minhas amostras.
A área de Fisiologia, através do Prof. Manoel Adrião que permitiu a utilização do laboratório FAMA para
desenvolvimento deste trabalho.
A Dra. Márcia e Dra. Alessandra. que nos mostrou o caminho certo para o desenvolvimento e avaliação dos
resultados.
Ao Dr. Gaus que nos mostrou como dar os primeiros passos da Biologia Molecular.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco, através do curso de Pós-graduação em Ciência
Veterinária, representado pela Profa. Dra.Aurea Wischral..
À CAPES e o CNPq pelo apoio financeiro fundamental para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos animais, principalmente Kidinho (In memorian) que mesmo não estando presente físicamente é ele que
sempre me faz amar cada vez mais minha profissão, Steban, Tonica, Teça, Sheik, Kid Júnior, Kika, Princesa,
Columbia, Catarina, Petruquio, Pretinha, Cida, Anka, Uti e Preta (In memorian).
x
RESUMO
Os tumores mamários em cadelas tem alta incidência e malignidade sendo provocados
por vários fatores de risco incluindo idade, atividade hormonal, nutrição, vírus,
pseudogestação e administração de progestágenos exógenos. O gene p53, conhecido
como um gene supressor de tumor, tem apresentado mutações relacionadas com
neoplasias. Neste trabalho, o objetivo foi caracterizar os tumores mamários em cadelas,
avaliar o comprometimento da mama lateral ao tumor e o envolvimento de fatores de
risco sobre a ocorrência dos tumores; analisar o gene p53, na região entre os exons 4 e 8
e relacionar os tumores malignos e mamas normais com as mutações ocorridas neste
gene. Foram utilizadas 50 cadelas com tumor de mama e 11 cadelas normais que foram
atendidas no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
Foram colhidas amostras dos tumores e das mamas adjacentes, clinicamente normais,
bem como biopsias de mamas das cadelas normais, para análise histopatológica segundo
as técnicas rotineiras. Outros fragmentos foram processados para extração do DNA,
amplificação dos exons pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) com
oligonucleotídeos específicos e sequenciamento. Os animais foram de raças variadas
tendo idade compreendida entre 4 e 19 anos para as cadelas com tumor e entre 7 meses
e 6 anos para as cadelas normais, sendo que a faixa etária entre 9 e 13 anos foi a que
apresentou a maior freqüência de neoplasias (48%). Das 50 alterações mamárias, 68%
foram carcinosarcomas, 24% foram carcinomas, 2% tumor misto benigno, 2%
hemorrágicas, 2% fibroses e 2% foram processos inflamatórios inespecíficos. Não
houve diferença na relação entre os fatores de risco e a ocorrência de tumores nas
cadelas. Das mamas laterais aos tumores, apenas 36% foram normais, 48%
apresentavam carcinoma, 6% carcinosarcomas, 2% hiperplasia, 2% fibrose e em 6% o
material não foi suficiente para garantir o diagnóstico. Foram escolhidas amostras de 9
carcinomas e 7 carcinosarcomas com as respectivas mamas normais adjacentes, e de 6
cadelas normais, que foram seqüenciadas em seqüenciador automático e analisadas para
a presença de mutações em comparação com a seqüência de nucleotídeos da p53 canina
(GenBank - S77819). Foram encontradas mutações em 85% das amostras que após o
sequenciamento apresentaram homologia com a proteína p53 canina, de 86,3% em
média (GenBank - AAB42022.1). Das mutações observadas, as mais freqüentes foram
as missense e os exons mais acometidos foram o 5 e o 8 com, respectivamente, 23,2% e
24,9% das mutações. As alterações de nucleotídeos mais freqüentes foram deleções e
inserções, que resultaram na maioria das mutações missense. Conclui-se que nos
animais estudados não houve interferência dos fatores pseudogestação e uso de
anticoncepcionais no surgimento dos tumores, mas que a idade é um fator relevante,
sendo, entretanto, a idade avançada considerada um fator de risco elevado.
Considerando a alta freqüência de tumores nas mamas laterais às neoplásicas e a
ocorrência de mutações nos genes destas amostras, sugere-se que na exerése do tumor
seja retirada a cadeia lateral completa para evitar recidiva. A alta incidência de
mutações no segmento do gene que transcreve a parte da proteína que se liga ao DNA,
sugere a possibilidade da alteração na funcionalidade da proteína, o que é ressaltado
pela alta malignidade dos tumores estudados.
Palavras Chave: câncer, patologia, DNA, neoplasias, PCR, biologia molecular
1
1 INTRODUÇÃO
Dentre as neoplasias que acometem as cadelas, o tumor de mama é uma das mais
freqüentes (50%) (DE NARDI et al., 2002) apresentando alta taxa de malignidade –
50% (CASSALI, 2000). Poucas doenças causam tanto temor quanto o câncer, pois
apesar de existirem fatores carcinogênicos que desencadeiam o processo, com
freqüência o câncer parece surgir ao acaso. No organismo normal, o ciclo de
proliferação celular é rigorosamente controlado para que as células constituam
comunidades organizadas. No entanto, as células cancerígenas não se submetem a esse
esquema de cooperação, são células com o DNA danificado que escapam dos
mecanismos de controle do ciclo celular (LOPES et al., 2002). Elas se dividem de forma
descontrolada, de modo que muitas das terapias anticâncer são estratégias para debelar
rapidamente células em divisão. Como conseqüência, muitas células normais, que
também estão em divisão, são prejudicadas pelos efeitos colaterais (KREUZER e
MASSEY, 2002).
Via de regra, todo aumento de tecido mamário deve ser avaliado considerando
uma possível neoplasia. Aumentos generalizados, que não estejam relacionados com
pseudociese, lactação ou mastite, devem receber atenção especial. De forma semelhante,
tumores de origem diversa daquele do tecido mamário podem aparecer na região das
glândulas mamárias, sendo de grande importância, pois diferentes tratamentos podem
ser indicados (ZUCCARI et al., 2001a).
Os estudo sobre alterações mamárias vem crescendo em relação aos estudos de
outras afecções, e as técnicas de biologia molecular vêm favorecendo o aprofundamento
dos conhecimentos genéticos, conduzindo a diagnósticos precoces e precisos (FARAH,
2
2000; ZUCCARI, et al., 2001a). A biopatologia dos tumores mamários caninos,
interessa à comunidade científica em geral pelo fato destes tumores terem sido
propostos como modelo comparativo para o estudo do câncer de mama da mulher. Em
ambas as espécies, o sexo feminino é mais afetado, tendo-se observado, no tipo
histológico adenocarcinoma, semelhanças histológicas e comportamentais notórias
(QUEIROGA e LOPES, 2002).
Uma estratégia que tem permitido avançar no conhecimento dos diferentes
aspectos da carcinogênese mamária comparada tem sido a utilização de modelos
animais, buscando maior entendimento dos fatores responsáveis pela doença no homem
e a expectativa de que estes possam ser identificados, eliminados ou controlados. O
estudo dos tumores mais freqüentes em animais pode fornecer dados epidemiológicos e
indicações para a melhor compreensão de sua etiologia, bem como material para
investigação biológica e terapêutica (CASSALI, 2000).
Qualquer processo que se repete inúmeras vezes é passível de erro. Embora o
DNA duplique sua molécula com precisão, com milhões de divisões celulares que
acontecem ao longo da vida de um organismo, os erros podem ocorrer. Existe dentro da
célula um sistema de controle de qualidade, que tende a reparar os erros que acontecem
na cópia da informação genética, chamado de sistema de reparo do DNA, porém, algum
defeito pode, eventualmente escapa, provocando mutação (FARAH, 2000). O gene p53
faz parte deste sistema e tem sido um dos mais importantes alvos das mutações
(MOURA-GALLO et al., 2004).
O estudo dos mecanismos moleculares, por meio de técnicas como hibridação do
DNA, reação em cadeia da polimerase (PCR) e a produção de anticorpos monoclonais
identificaram, isolaram e caracterizaram genes e produtos de genes clinicamente
importantes. Porém, o maior uso destes conhecimentos estão direcionados aos seres
3
humanos, desta forma à medida que novos métodos diagnósticos e terapêuticos
estiverem disponíveis na Medicina Veterinária, a compreensão mais abrangente com
relação à biologia da neoplasia, permitirá ao Médico Veterinário o tratamento mais
efetivo para os animais, podendo levar a respostas no campo da Medicina Humana
(RICHARDSON et al., 1997).
Com o objetivo de identificar a freqüência e os tipos de mutações no gene p53
em cadelas com câncer de mama, foram estudadas as seqüências dos nucleotídeos em 7
exons do gene p53. Foram analisadas as possíveis associações entre a presença de
tumores de mama e fatores de risco clássicos como idade, ocorrência de pseudogestação
e uso de hormônios contraceptivos. E ainda, a associação entre a presença de mutações
no p53 e os tipos de tumores malignos e glândulas mamárias macroscopicamente e
microscopicamente normais laterais aos tumores.
4
2 REVISÃO DA LITERATURA
A cada ano, cresce o número de pessoas e de animais domésticos acometidos por
algum tipo de neoplasia. A etiologia da neoplasia da glândula mamária em cadelas é
desconhecida, mas há indícios de que múltiplos fatores influenciam o micro ambiente
das células susceptíveis do tecido mamário causando o câncer (MORRISON, 1998). O
estilo de vida da sociedade moderna contribui para aumentar a exposição da população
a alguns fatores ambientais, nutricionais, químicos e hormonais potencialmente
carcinogênicos. É claro que a interferência do homem nos hábitos alimentares dos
animais e no seu ambiente também o coloca sob o mesmo risco. Talvez essa seja uma
das explicações pela qual a freqüência de algumas neoplasias tem aumentado no homem
e nos animais domésticos (MOULTON, 1990).
2.1 A glândula mamária
As glândulas mamárias são glândulas cutâneas, especificamente sudoríparas
modificadas (CASSALI, 2003) que se desenvolvem lentamente a partir do ectoderma
cutâneo do embrião. Na vida intra-uterina, formam-se espessamentos paralelos e
lineares de ectoderma cutâneo, são as linhas mamárias, que se estendem de ambos os
lados desde a axila até a região inguinal da parede abdominal ventral. A continuidade da
crista que se forma rompe-se no número apropriado de botões mamários que darão
origem à parte funcional da glândula mamária (REECE, 1996; CUNNINGHAM, 2004).
O mesênquima dérmico, que envolve os condutos, se diferencia em tecido conjuntivo
frouxo, que circunda os condutos e suas ramificações, e em tecido conjuntivo denso,
que forma os tabiques entre os primórdios de conduto e divide a glândula em lobos
(KOLB, 1984; GENESER, 2000; HENSON, 2003).
O desenvolvimento da glândula mamária na vida pós-fetal sofre modificações
aparentes a partir do primeiro ciclo estral pela influência do estrógeno que promove o
desenvolvimento do sistema ductal e discreto aumento das células adiposas,
5
observando-se um aumento discreto no volume da glândula, o que acontece, sobretudo
nas mamas abdominais caudais e inguinais. O desenvolvimento de alvéolos a partir das
extremidades terminais dos ductos requer o aumento de progesterona e prolactina na
metade da gestação ou pseudogestação, quando atingem sua maturação morfológica e
atividade funcional completa (CUNNINGHAM, 2004; ZUCCARI et al. 2001b;
CASSALI, 2003; OLIVEIRA et al., 2003).
As mamas apresentam dois tipos celulares em sua estrutura, as células epiteliais
luminais, que sintetizam e excretam proteínas lácteas e lipídios durante a lactação, e as
células epiteliais basais ou mioepiteliais, que se contraem, sob a influência de ocitocina,
expelindo o leite dos ductos. Ambos os tipos celulares são derivados de uma única
população celular ou células tronco. Além do tecido epitelial, ainda há a presença de
fibroblastos e células adiposas que compõem e fazem a sustentação do tecido mamário.
O tecido subcutâneo da parede ventral do abdome contém as mamas torácicas,
abdominais e inguinais e os vasos e nervos que as suprem (HOWARD e
DELAHUNTA, 2001).
Na fêmea canina, os vasos epigástricos craniais superficiais são vistos
subcutaneamente, junto a papila mamária abdominal cranial. A artéria epigástrica
superficial caudal segue cranialmente à superfície profunda da mama inguinal e fornece
os ramos mamários. A artéria prossegue para suprir a mama abdominal caudal e fazer
anastomose com ramos da artéria epigástrica superficial cranial. Os linfonodos inguinais
superficiais ficam adjacentes aos vasos epigástricos superficiais caudais e craniais,
drenando as mamas e a parede ventral do abdome, cranialmente até o umbigo (Fig.1)
(HOWARD e DELAHUNTA, 2001).
6
Figura 1 – Veias e artérias superficiais do abdome canino.
Fonte: HOWARD e DELAHUNTA, 2001.
2.2 Neoplasias das glândulas mamárias
As neoplasias da mama canina se originam de células de revestimento epitelial,
ductal ou alveolar, de células mioepiteliais periféricas e do tecido conectivo intersticial
(CARRUIDO et al., 2003). As que se originam de células epiteliais são denominadas de
carcinomas e aquelas com origem no tecido conjuntivo ou muscular são denominadas
sarcomas (ALBERTS et al., 1997). Nas cadelas, devido à elevada incidência de tumores
de mama, o estudo desta patologia vem crescendo, pela importância dos cães como
animal de companhia e também por representar um modelo experimental de grande
7
valor e viabilidade técnica nas pesquisas do câncer humano, devido às similaridades
histológicas entre os tumores, além da facilidade na realização das mastectomias
parciais ou totais dos segmentos mamários (LUIZ et al., 2002), por não haver limitações
estéticas, facilitando a retirada de glândulas macroscopicamente normais, fundamentais
para um estudo mais aprofundado.
De todos os fatores envolvidos no aparecimento do câncer, o componente de
natureza hormonal tem sido o mais aceito, devido às diferenças na incidência de
tumores mamários entre cadelas castradas e não castradas (MIALOT, 1988; DONNAY
et al., 1996; SOARES e SILVA, 1998; ZUCCARI et al., 2001b; FOSSUM et al., 2002).
Quando a ovariectomia foi realizada antes do primeiro ciclo estral, o risco de ocorrer
câncer mamário foi de aproximadamente 0,5%; naquelas em que a castração foi
realizada após o primeiro ciclo estral, o risco foi de 8%, e após dois ou mais ciclos
estrais o risco foi de 26%. Em animais castrados após 2,5 anos de idade o efeito
profilático para o câncer mamário, foi mínimo, tendo em vista que nesta idade as
glândulas mamárias já se desenvolveram plenamente (MIALOT, 1988; SOARES e
SILVA, 1998; ZUCCARI et al., 2001b; FOSSUM et al., 2002; QUEIROGA et al.,
2005).
O rápido desenvolvimento das glândulas mamárias durante a puberdade, pode
contribuir para a formação de clones de células alteradas que se tornam nódulos
hiperplásicos. Tais nódulos, que têm entre 1 e 4 mm de diâmetro e não são detectáveis
clinicamente podem, sob ação de fatores carcinogênicos, sofrer transformação
neoplásica demonstrando que o estrógeno tem um papel indireto no desenvolvimento
tumoral. Ele induz à proliferação do epitélio ductal das glândulas mamárias e, desta
forma, propicia as condições necessárias para que mutações genéticas ocorram, nas
8
diferentes fases do ciclo celular (NETO, 1992; NETO, 1997; O’KEEFE, 1997; PÉREZ
et al. 2001; ZUCCARI et al., 2001b).
A atividade normal da célula depende da perfeita integração entre as várias vias
metabólicas. Grande parte desse metabolismo é controlada pelos hormônios, lançados
no sangue até os órgãos alvos. Como as necessidades de um determinado hormônio
variam continuamente, torna-se necessário que suas concentrações estejam sujeitas à
regulação (GUYTON, 1997). Quando há descontrole da secreção hormonal, ocorre
perda da homeostasia celular resultando em várias alterações, dentre elas o câncer. Os
hormônios estão dentre os vários fatores indutores ou promotores da carcinogênese e
sejam endógenos ou exógenos, eles estimulam a proliferação celular predispondo aos
erros do DNA na divisão celular (HENDERSON e FEIGELSON, 2000).
Neoplasias de caráter maligno são as mais importantes em cadelas não castradas,
uma vez que elas são as mais freqüentes e normalmente produzem metástases em outros
órgãos. Na cadela existem cinco pares de glândulas mamárias localizadas ao longo da
parte ventral do tórax e abdome (ARGYLE, 1998). A ocorrência das neoplasias das
glândulas mamárias como nódulos de formas múltiplas do mesmo ou de diferentes
tipos, em uma ou mais glândulas deve-se à existência de conexões linfáticas variáveis
entre as glândulas adjacentes lateral, cranial ou caudal (MORRISON, 1998).
A formação vascular da região mamária é de extrema importância no estudo dos
tumores mamários, pela relação direta entre seus componentes e o prognóstico da lesão
(BANKS, 1992; ZUCCARI et al. 2001b). No entanto, os tumores mamários malignos
apresentam maior vascularização em relação aos tumores benignos, apresentando uma
proliferação vascular maior em animais com média de 9 anos, em relação aos animais
mais jovens (CASSALI, 2000).
9
Os tumores correspondem a um grande agregado de células cancerosas
descendentes de uma única célula ou clone “fundador”. O ancestral é uma célula de
funcionamento normal, que por alguma circunstância desencadeou alterações
fundamentais, iniciando divisão e proliferação autonomamente, sem haver resposta aos
estímulos externos fundamentais para a ocorrência do crescimento celular. Estes
mutantes dividem-se rapidamente, gerando bilhões de células alteradas, constituintes da
massa tumoral, extremamente agressivas invadindo tecidos e órgãos, podendo espalhar-
se por metástase para todo o organismo (RICHARDSON et al., 1997; PERERA e
WEINSTEIN, 2000).
Além dos agentes carcinogênicos, o surgimento de tumores pode ocorrer como
conseqüência do acúmulo de alterações genéticas que interferem no controle normal do
crescimento e diferenciação celular; pela transformação de uma célula maligna através
de múltiplas etapas, chamada de progressão tumoral, que envolve a ocorrência de
mutações, em diferentes fases do ciclo celular (DOBSON, 2001); ou ativação anormal
dos genes que controlam o crescimento celular (LOURO, 2000), resultando em
modificações progressivas da biologia celular caracterizadas por alterações na
proliferação, diferenciação e na interação das células com o meio extracelular
(COTRAN et al., 2000).
2.3 O ciclo celular
O DNA é constituído de duas cadeias de nucleotídeos que se enrolam originando
a dupla hélice e se dispõem de modo antiparalelo, ou seja, direção 5’ para 3’ e a
complementar no sentido 3’ para 5’. Ambas as cadeias são mantidas juntas através de
fracas ligações químicas, as ligações de hidrogênio, que ocorrem entre as bases
nitrogenadas de cadeias diferentes, adenina (A) sempre se liga a uma timina (T),
10
enquanto uma citosina (C) sempre aparece ligada a uma guanina (G) (Fig.2) (FARAH,
2000).
Para compor o uma proteína, todos os aminoácidos são codificados por uma
combinação de três bases do DNA, formando um tríplex chamado códon, podendo um
aminoácido ser definido por mais de um códon. Um gene é um segmento de DNA que
contém a informação completa da seqüência de aminoácidos para sintetizar uma cadeia
polipeptídica específica. Uma seqüência do DNA com a mensagem para a síntese de
uma cadeia polipeptídica é, geralmente, interrompida por porções que não têm função
codificante e, portanto, não aparecem representadas na proteína. Tais porções são os
íntrons que são removidas quando o transcrito primário é processado, para dar origem
ao RNA maduro. As regiões com informações codificadas são os exons, cujas
seqüências estão representadas no RNA maduro e, portanto, um gene começa e termina
com exons (FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
Figura 2 – Representação esquemática da dupla hélice do DNA e suas bases
nucleotídeas. Fonte: www.biologycorner.com
11
A progressão tumoral parece envolver a ativação de vários oncogenes, que
codificam proteínas promovendo a perda do controle sobre o ciclo mitótico e levando as
células a se tornarem cancerosas, e a inativação de genes supressores de tumor, que são
recessivos, isto é, o efeito cancerígeno só aparece quando eles estão ausentes ou são
defeituosos nos dois cromossomos do genoma. Cada uma dessas alterações representa
um passo adicional em direção à plena malignidade, ocorrendo freqüentemente por
muitos anos antes que se inicie uma transformação neoplásica (DAL BELLO et al.
2002; DOBSON, 2001; LERA et al. 2006; LEE e KWEON, 2002).
O ciclo celular compreende a alternância da mitose e interfase. A mitose é o
processo pelo qual as células eucarióticas dividem seus cromossomos entre duas células
filhas, que dura, em média, 90 a 120 minutos e é dividido em quatro etapas; prófase,
metáfase, anáfase e telófase (ALBERTS et al., 1997).
Na prófase, os cromossomos, que foram duplicados durante a fase S da interfase,
se condensam. Os microtúbulos citoplasmáticos são desarranjados e a célula se prepara
para a reorganização destes microtúbulos formando o fuso mitótico. O cromossomo
mitótico consiste em duas cromátides que estão conectadas por uma região denominada
de centrômero, na superfície deste centrômero existem dois cinetócoros, um deles está
associado à cromátide e o outro ao fuso mitótico, resultando na movimentação
cromossomal, seguindo para a metáfase (THOMPSON, 1993; ALBERTS et al., 1997;
FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
Durante a metáfase alguns dos microtúbulos que formam os aparatos do fuso se
prendem aos cinetócoros formando o fuso mitótico. A partir daí os cromossomos
iniciam uma série de movimentos que resultam num alinhamento de todos os
cromossomos na região equatorial do fuso, dando início à preparação da anáfase
(THOMPSON, 1993; ALBERTS et al. 1997; FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
12
A anáfase caracteriza-se pelo momento onde as cromátides iniciam a migração
para cada pólo da célula, em direção aos centríolos, provocando a separação das
cromátides irmãs. Acredita-se que a força que movimenta as cromátides tem origem
através da polimerização de proteínas dos microtúbulos, actina, miosina e tubulina
(THOMPSON, 1993; ALBERTS et al. 1997; FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
Durante a telófase, ocorre a separação completa das cromátides irmãs para cada
pólo da célula, havendo com isto a reconstituição do envelope nuclear ao redor dos
cromossomos, descondensação dos cromossomos, dissolução do aparato mitótico,
formação de uma constrição ao nível da zona equatorial da célula-mãe, que vai
progredindo e termina por dividir o citoplasma e suas organelas em duas partes iguais.
Neste ponto a célula termina a fase de divisão celular (mitose) e entra na fase de
replicação do DNA (interfase) iniciando um novo ciclo (THOMPSON, 1993;
ALBERTS et al. 1997; FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
Na interfase, não são visualizadas modificações tanto no citoplasma quanto no
núcleo. As células, porém, encontram-se em plena atividade, sintetizando os
componentes que irão constituir as células filhas. Esta fase é composta pela sucessão de
três fases; G
1
que corresponde ao intervalo de tempo entre o final da mitose, durante o
qual RNAs e proteínas são sintetizadas, sem que haja replicação de DNA; fase S de
síntese de DNA, onde o conteúdo total de DNA aumenta de um valor diplóide de 2n,
para o valor completo de replicação 4n; e fase G
2
que correlaciona-se com o intervalo
de tempo entre o final da fase S e o início da mitose (THOMPSON, 1993; ALBERTS,
1997; FARAH, 2000; LEWIN, 2001).
13
2.4 A proteína p53
O gene p53, considerado como o “guardião do genoma”, dentre todos aqueles
reconhecidamente envolvidos nos processos de carcinogênese, é o de maior
importância. Conhecer seus mecanismos de ação representa uma etapa fundamental
para compreender os aspectos da biologia molecular relacionados ao câncer. O gene é
ativado em resposta a sinais de dano celular, tornando-se mais presente nas células
(FETT-CONTE E SALLES, 2002).
Este gene codifica uma fosfoproteína de 53kDa, tetramérica, ou seja, com quatro
subunidades básicas idênticas que se juntam, constituindo a forma funcionalmente ativa
da molécula que se liga especificamente ao DNA e age como fator de transcrição
(HUNTER, 1993; MIYASHITA et al., 1994). Cada unidade básica da proteína p53 é
formada por quatro domínios que representam unidades funcionais distintas, o primeiro
segmento (região amino terminal) é composto por 80 aminoácidos, estando relacionado
com a capacidade de transativação de outros genes; o segundo domínio (localizado entre
os aminoácidos 100 e 300) representa a parte central, sendo responsável pela capacidade
de ligação com a molécula de DNA (Fig. 3) e na porção carboxi-terminal, localizam-se
os sítios de dimerização e a região de tetramerização das quatro unidades básicas da
molécula p53 (CAVALCANTI JÚNIOR et al., 2002).
14
FIGURA 3- Moléculas de DNA e da proteína p53 demonstrando os pontos de ligação
entre os amino-ácidos e a cadeia de DNA.
Fonte: ads.u-strasbg.fr/ forum2005/img/p53.jpg
2.5 Atividade da proteína p53
Dois tipos de eventos podem ser desencadeados pela atividade de p53; a
interrupção da multiplicação ou apoptose, os quais dependem, em parte, do estágio do
ciclo celular que foi atingido. Em células no início de G1, a proteína p53 desencadeia
um ponto de checagem que bloqueia a progressão do ciclo celular, isto permite que o
DNA danificado seja reparado antes que a célula tente entrar na fase S. Porém, se uma
célula já está comprometida com a divisão, esta proteína p53 desencadeia um programa
de morte celular. Os resultados típicos desta apoptose são o colapso de célula em uma
pequena massa heteropicnótica e a fragmentação do DNA nuclear (LEWIN, 2001;
MUTO et al., 2000; LEE e KWEON, 2002; FARIAS et al., 2005).
O crescimento tumoral está relacionado a um balanço entre proliferação e morte
celular. A medida combinada de morte celular e proliferação é uma importante arma na
predição mais realista do comportamento tumoral. Estudos recentes demonstram a
15
relevância da morte celular programada na homeostase tecidual, na organogênese e na
patogenia dos tumores. A apoptose depende de processos bioquimicamente regulados,
contingenciados por eventos de estimulação do meio ambiente tecidual. Do ponto de
vista morfológico, podemos observar, a partir da clivagem do DNA pelas
endonucleases, alterações como picnose, fragmentação nuclear e proteólise do
citoesqueleto. Os detalhes da regulação da apoptose por oncongenes e genes supressores
ainda não são totalmente entendidos, embora saiba-se da participação do gene p53
(FARIAS et al., 2005). Um grande aumento da quantidade desta proteína foi observado
em muitas células transformadas ou em linhagens derivadas de tumores.
2.6 Mutações no gene p53
O gene pode ser considerado um alvo das mutações e alterações em qualquer
parte dele podem abolir a sua função, entretanto, alguns sítios sofrerão um número
maior de mutações, chamadas “sítios quentes”, sendo, portanto alvo de estudo para a
cancerologia (LEWIN, 2001).
Dentre os genes envolvidos nas etapas de desenvolvimento do câncer de mama,
o p53 é o gene que se apresenta mais mutado nesta doença
(LERA et al., 2006;
MOURA-GALLO et al., 2004).
As mutações no gene p53 ocorrem principalmente nos exons 3 a 8 (KRAEGEL,
et al. 1995), entre os exons 4 e 7 (CHU et al., 1998) e 5 e 8 (HAGA, 2001),
determinando a perda do controle do ciclo celular e, como conseqüência, a
sobrevivência das células com alto grau de mutações (YORIKO et al., 2000). No
desenvolvimento de tumores na espécie canina, a inativação da forma não mutante do
gene p53 ocorre por uma série de mecanismos, incluindo as aberrações cromossômicas
16
estruturais como deleção e translocação (KRAEGEL, et al. 1995; SETOGUCHI, et al.
2001).
As mutações em p53 acumulam-se em muitos tipos de cânceres, provavelmente
porque a perda de p53 confere uma vantagem multiplicativa às células (MUTO et al.,
2000; LEWIN, 2001). A diversidade dos cânceres sugere que p53 não está envolvida
em um evento tecido-específico, mas sim em algum controle geral e bastante comum da
proliferação celular; e a perda deste controle pode ser um evento secundário que ocorre
para contribuir com a multiplicação celular em muitos tumores. As células com p53
mutante também possuem uma maior propensão a amplificar DNA, o que
provavelmente reflete a função p53 na instabilidade característica do genoma que é
encontrada em células cancerosas (LEWIN, 2001).
Outra classe de genes que fazem parte do material genético, envolvidos na
indução e regulação do crescimento e da divisão celular são os pro-oncogene, as formas
mutantes são os oncogenes. As mutações em oncogenes que levam ao câncer são
diferentes das mutações em genes supressores de tumor, pois nos oncogenes, as
mutações precisam ativar a proteína para promover o crescimento inadequado. Para os
genes supressores de tumor, entretanto, é necessária a perda da função da proteína para
promover o desenvolvimento do câncer. Nas pesquisas com cânceres humanos,
observou-se que mutações do p53 estão presentes em mais formas diferentes de câncer
que qualquer outra alteração genética, aproximadamente 50% de todos os cânceres
(YORIKO et al., 2000; KREUZER e MASSEY, 2002).
Assim, a pesquisa das alterações genéticas e sua associação com vários fatores
podem levar à compreensão dos mecanismos envolvidos na etiologia desta doença,
assim como auxiliar no diagnóstico e tratamento. Mutações no gene p53, localizado no
cromossomo 17, estão presentes nos cânceres humanos e caninos, tornando este gene o
17
alvo mais comum de alterações genéticas no processo neoplásico. Além disso, a
homologia entre o gene p53 humano e canino é de 81% (CHU et al.,1998;
VELDHOEN e MILNER, 1998)
As mutações podem ser silenciosas, não apresentando efeito discernível na
célula ou organismo, ou resultarem em alterações estruturais e/ou funcionais no gene
e/ou seu produto protéico (WALKER e RAPLEY, 1999; FARAH, 2000). Todos os
tipos de mutações, especialmente aquelas ocorrendo nas extensas seqüências intrônicas
não codificantes ou extragênicas de DNA, podem ser silenciosas. Algumas mutações
pontuais no interior de regiões codificantes podem ser também silenciosas, devido à
degeneração do código genético. Este é especialmente o caso para aquelas que afetam a
terceira base de um códon, pois isto não produz, frequentemente, uma alteração na
ordem de aminoácidos codificada pelo gene. Portanto, tais mutações são evidenciadas
no nível dos nucleotídeos mas, indetectáveis no nível da proteína, pois muitos
aminoácidos são codificados por mais de um códon (WALKER e RAPLEY, 1999;
KREUZER e MASSEY, 2002).
Todos os tipos de mutações ocorrendo tanto em seqüências codificantes como
não-codificantes de DNA, podem afetar o funcionamento de um gene e sua proteína
codificada. Mutações pontuais na porção codificante de um gene podem criar um códon
prematuro de parada, resultando na expressão de um polipeptídeo truncado e em um
fenótipo mutante e neste caso a mutação é denominada nonsense. Por outro lado,
mutações em regiões não-codificantes podem alterar uma seqüência regulatória
funcional, como um promotor ou sinal de iniciação, levando a um aumento ou
diminuição da expressão gênica. Inserções e deleções em regiões codificantes e
envolvendo múltiplos de três nucleotídeos, podem também resultar na produção de
polipeptídeos com comprimentos incorretos. Entretanto, deleções ou inserções não
18
envolvendo múltiplos de três nucleotídeos, resultarão em uma mutação com
deslocamento do quadro de leitura. Isto altera efetivamente o código, impedindo a
expressão de uma proteína funcional. Tanto inserções como deleções podem também
afetar a expressão de determinado gene, se alterarem seqüências regulatórias associadas
ao gene (WALKER e RAPLEY, 1999; KREUZER e MASSEY, 2002).
Em células normais, a proteína p53 é sintetizada continuamente, mas não se
acumula em níveis significativos, sendo degradada pela célula em 2-15 minutos
(HUNTER, 1993; MIYASHITA et al., 1994). No entanto, quando as células são
expostas a agentes que danificam o DNA, a proteína se torna estável e passa a controlar
diversos genes que são seus alvos, impedindo a progressão do ciclo, o que permite
reparar os danos nas células ou disparar o processo de morte destas por apoptose
(FARIAS et al., 2005). A inativação do p53 pode ocorrer por vários mecanismos,
incluindo as deleções, translocações e mutações (KRAEGEL et al., 1995). As mutações
em p53 encontradas nos mais diversos tumores malignos analisados, são pontuais e
estão majoritariamente localizadas na região da molécula altamente conservada, que
corresponde ao domínio de ligação da proteína com o DNA (HAINAUT e
HOLLSTEIN, 2000). Anormalidades no gene p53 são as alterações moleculares mais
freqüentes encontradas nos diversos tipos de neoplasias. Tem-se demonstrado que a
maioria das mutações missenses do gene p53 causa alterações na conformação da sua
proteína, prolongando a sua meia-vida e podendo acumular-se no núcleo das células
neoplásicas (BEGNAMI et al., 2005).
A análise de mutações encontradas no gene p53 tem sido muito valorizada em
estudos de epidemiologia molecular de câncer (PERERA e WEINSTEIN, 2000).
Recentemente, Hill e Sommer (2002) consideraram esta análise como um possível teste
mutagênico para o câncer de mama. Mutações deste gene têm sido também associadas
19
com outros tipos de tumores de baço (KRAEGEL et al., 1995) e tumores ósseos
(LOUKOPOULOS et al., 2003), ambos são tumores bastante agressivos, com taxas de
sobrevida muito baixas, tornando interessante a possível utilização da análise de
mutações em p53 para auxiliar no prognóstico dos diversos tumores em fases iniciais
com maior possibilidade de serem tratados com sucesso (MOURA-GALLO et al.,
2004).
Apesar da aparência dos fenótipos mutantes ter sido originalmente utilizada para
detectar mutações, a identificação da maioria das formas de mutações, particularmente
de mutações silenciosas, requer abordagens alternativas. Técnicas mais sensíveis e
sofisticadas são necessárias para a detecção das formas mais comuns de mutações em
pequena escala. Incluindo a reação em cadeia da DNA-polimerase (PCR) e o
sequenciamento de nucleotídeos (WALKER e RAPLEY, 1999).
A PCR caracteriza-se pela amplificação enzimática de uma seqüência específica
de DNA, visando a produção de milhões de cópias desta seqüência em um tubo de
ensaio. Essa técnica foi descrita por Kary Mullis no final dos anos 80 e tem
revolucionado a genética molecular, pois possibilita uma nova estratégia na análise de
genes por meio de um método simples e rápido de amplificação de seqüências
específicas (FARAH, 2000).
A PCR explora a capacidade de duplicação do DNA. Uma fita simples de DNA
é usada como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da
enzima DNA-polimerase, capaz de adicionar corretamente os nucleotídeos
complementares à fita molde adicionados na reação. A DNA-polimerase requer,
entretanto, um ponto de iniciação, ligado à fita molde que servirá de apoio para que os
nucleotídeos subseqüentes sejam adicionados. Esse ponto de início da síntese é
fornecido por um oligonucleotídeo iniciador que se hibridiza à fita molde simples. A fita
20
simples serve de fita molde para a síntese, desde que se forneça oligonucleotídeos
iniciadores específicos a cada fita molde diferente. Dessa forma, a região do DNA a ser
sintetizada é definida pelo desenho do oligonucleotídeo iniciador, que se anelam
especificamente às suas seqüências complementares na fita molde, delimitando o
fragmento de DNA que se deseja amplificar (FARAH, 2000).
A biologia molecular, em particular, tornou-se integrada a muitos aspectos da
oncologia e este reconhecimento está conduzindo aos avanços no diagnóstico e
tratamento do câncer nos mamíferos (BHARAJ, et al., 1998; CAIRNS, 2000). A
caracterização molecular permite estimar parâmetros de grande importância para
compreender a estrutura genética e com isso direcionar estratégias de novos métodos de
diagnóstico e terapêutico através do uso de marcadores moleculares baseados na reação
em cadeia da polimerase (PCR), hibridização do DNA e a produção de anticorpos
monoclonais.
As novas técnicas de imuno-histoquímica e biologia molecular
possibilitarão a identificação de marcadores tumorais, aumentando assim, a capacidade
de se detectar células neoplásicas em uma etapa mais precoce da doença, conduzindo ao
sucesso final de terapias do câncer, muitas das quais tornar-se-ão efetivas ao máximo se
instituídas na etapa do desenvolvimento tumoral, como antes da formação de metástase
(DOBSON, 2001).
21
Artigo 1
22
CARACTERIZAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS
E SUA RELAÇÃO COM FATORES DE RISCO EM CADELAS NA CIDADE DO
RECIFE-PE, BRASIL.
HISTOPHATOLOGIC CHARACTERIZATION OF CANINE MAMMARY TUMORS AND ITS
RELATIONSHIP WITH RISK FACTORS IN THE RECIFE- PE- BRAZIL
Souza, D.M.B.
1
; Silva, J.S.C.
2
; Silva, V. R.
3
; Barros, M.G.O.
2
; Coleto, Z.F
1
.;
Pereira, M. F.
4
; Santos, F.L.
4
; Adrião, M.
5
; Wischral, A.
4
RESUMO
Os tumores mamários em cadelas tem alta incidência e malignidade sendo
provocados por vários fatores de risco incluindo idade, atividade hormonal, nutrição,
vírus, pseudogestação e administração de progestágenos exógenos. O objetivo deste
trabalho foi avaliar a ocorrência dos tipos de tumores mamários em cadelas e sua
relação com idade, pseudogestação e o uso de progestágenos. Utilizou-se 50 cadelas
com tumor de mama, submetidas à exerese da mama e 11 cadelas normais que foram
submetidas a ovariosalpingohisterectomia eletiva no Hospital Veterinário da
Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram colhidas amostras dos tumores e das
mamas clinicamente normais para análise histopatológica segundo as técnicas rotineiras.
Os animais foram de raças variadas tendo idade entre 4 e 19 anos para as cadelas com
tumor e entre 7 meses e 6 anos para as cadelas normais, sendo que a faixa etária entre 9
e 13 anos foi a que apresentou a maior freqüência de neoplasias (48%). Das 50
alterações mamárias, 68% foram carcinosarcomas, 24% foram carcinomas, 2% tumor
misto benigno, 2% hemorrágicas, 2% fibroses e 2% foram processos inflamatórios
inespecíficos. Não houve diferença na relação entre os fatores de risco e a ocorrência de
tumores nas cadelas. Das mamas laterais aos tumores, apenas 36% foram normais, 48%
apresentavam carcinoma, 6% carcinosarcomas, 2% hiperplasia, 2% fibrose e em 6% o
material não foi suficiente para garantir o diagnóstico. Conclui-se que nos animais
estudados não houve interferência dos fatores pseudogestação e uso de
anticoncepcionais no surgimento dos tumores, mas que a idade é um fator relevante,
1
Médica Veterinária, MSc, Doutoranda do Programa de Pós-graduação em Ciência Veterinária –
Universidade Federal Rural de Pernambuco/ UFRPE. E-mail: daniela.bastos@oi.com.br
2
Graduando em Medicina Veterinária, Bolsista Pibic/CNPq
3
Médico Veterinário, UFRPE
4
Professor, Depto de Medicina Veterinária da UFRPE
5
Professor, Depto de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE
Apoio financeiro: CNPq, FACEPE
23
sendo, entretanto, a idade avançada considerada um fator de risco elevado.
Considerando a alta freqüência de tumores nas mamas laterias às neoplásicas, sugere-se
a retirada de toda a cadeia mamária do lado acometido.
Palavras chave: cadela, câncer, mama, patologia
ABSTRACT
The canine mammary tumors has high incidence and malignancy being provoked by
several risk factors including age, hormonal activity, nutrition, virus, pseudopregnancy
and exogenous progestagen. In this work the goal was to characterize the canine
mammary tumors, evaluate the implication of the adjacent mamma and the risk factors
involvement on the occurrence of the tumors. They were used 50 bitches with mamma
tumor diagnosis and submitted to mastectomy of the mamma and 11 normal bitches that
were submitted for elective ovariosalpingohisterectomy in Hospital Veterinary of
UFRPE. They were picked biopsies of the tumors and of the normal mammas for
histopathologic analysis according to the routine techniques. The animals went of varied
races having age comprehended between 4 and 19 years for the bitches with tumor and
between 7 months and 6 years for the normal bitches, and the ages between 9 and 13
years were to what it presented the biggest neoplasic frequency (48%). Of the 50
tumors, 68% were carcinosarcoms, 24% were carcinomas, 2% benign mixed tumor, 2%
hemorrhagic, 2% fibrosises and 2% were inflammatory processes. The relation of the
tumors with the risk factors did not are demonstrate when compared between the
malignant tumors and between the normal bitches and the tumor carriers. Of the
adjacent mammas, just 36% were normal, 48% presented carcinoma, 6%
carcinosarcoms, 2% hiperplasy, 2% fibrosis and in 6% the material was not enough to
guarantee the diagnosis. It concludes that in these animals there was no interference of
the factors pseudopregnancy and contraceptives use in the appearance of the tumors, but
that the age is an important factor, being the more seniorest susceptible. Considering
the tumors high frequency in the adjacent mammas to tumour mammas, it suggests the
withdrawal of all the mammary chain of the attacked side.
Key words: bitch, cancer, breast, pathology
24
INTRODUÇÃO
O câncer, principal problema mundial de saúde, é uma das causas mais
importantes de morbidade e mortalidade em humanos, e deriva de proliferação
descontrolada e propagada de clones de células transformadas. O crescimento de um
tumor maligno é determinado em grande parte pela capacidade proliferativa das células
tumorais e pela capacidade de invadirem os tecidos do hospedeiro e por produzir
metástase em sítios distantes. Alem disso, admite-se que os tumores malignos são
capazes de superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (ABBAS et al., 2002).
O surgimento de tumores pode ocorrer como conseqüência do acúmulo de
alterações genéticas que interferem no controle normal do crescimento e diferenciação
celular, pela transformação de uma célula normal em célula tumoral através de
múltiplas etapas, chamada de progressão tumoral, que envolve a ocorrência de
mutações, em diferentes fases do ciclo celular (DOBSON, 2001) e, dentre os genes
envolvidos nas etapas de desenvolvimento do câncer de mama, o p53 é o gene que se
apresenta mais mutado nesta doença
(MOURA-GALLO et al., 2004).
Os estudos relativos a esta lesão vêm se intensificando devido a vários fatores,
dentre os quais: a alta incidência em cães e sua malignidade, com cerca de 50% dos
tumores considerados malignos, diminuindo a qualidade e tempo de vida (HELLMÉN,
2005), e a possibilidade de representar um modelo experimental de grande valor e
viabilidade técnica nas pesquisa de câncer humano. A similaridade histológica entre os
tumores em caninos e humanos e a facilidade na realização das mastectomias parciais
ou totais dos segmentos mamários (LUIZ et al., 2002), facilitando a retirada de
glândulas macroscopicamente normais, fundamental para um estudo mais aprofundado,
justificam estas tentativas de comparação.
25
Todo aumento de tecido mamário deve ser avaliado considerando uma possível
ocorrência de neoplasia. Aumentos de volume generalizados que não estejam
relacionados a pseudociese, lactação ou mastite devem receber atenção especial
(ZUCCARI et al., 2001b).
Dentre as principais neoplasias observadas em cadelas, os tumores mamários são
os mais freqüentes, representando mais de 50% de todos os tumores das fêmeas da
espécie canina (ITOH et al., 2005; KARAYANNOPOULOU et al., 2005; QUEIROGA
et al., 2005), sendo a incidência três vezes maior do que na mulher.
Os cânceres são classificados de acordo com o tecido e tipo de célula de origem,
podem se originar das células de revestimento epitelial, ductal ou alveolar, das células
mioepiteliais periféricas ou do tecido conectivo intersticial (SOUZA, et al., 2001;
CARRUIDO et al., 2003). Os malignos de origem epiteliais são denominados de
carcinomas, e aqueles com origem no tecido conjuntivo ou muscular são denominados
sarcomas (ALBERTS et al., 1997).
Estudos realizados, para caracterizar os tipos e freqüência dos tumores de mama
em cadelas, têm demonstrado que há alta incidência de tumores malignos, cerca de 50%
e destes a maioria são de tumores mistos (36,25%), seguidos por carcinomas (25%)
(CASSALI, 2000).
O desenvolvimento tumoral está intimamente relacionado com diversos fatores
predisponentes como: idade, obesidade, dieta rica em gordura e, principalmente,
problemas hormonais (SONNENSCHEIN et al., 1991; PÉREZ ALENZA et al., 1998;
CASSALI, 2000). Zuccari et al. (2001a) ressaltam que as hipóteses mais citadas sobre a
etiologia das neoplasias mamárias são: origem viral, dieta, principalmente no que se
refere ao consumo de gorduras, e a atividade hormonal, que tem maior repercussão.
26
Em relação à dieta, os pesquisadores concluíram que o risco de aparecimento do
tumor mamário pode estar ligado a fatores nutricionais interagindo já nos primeiros
meses da vida do animal (SONNENSCHEIN et al., 1991; PÉREZ ALENZA et al.,
1998). Um estudo retrospectivo de tumores mamários em cadelas demonstrou que
filhotes de até um ano de idade, obesos, apresentaram maior risco de desenvolver
tumores no decorrer de suas vidas (PÉREZ ALENZA et al., 1998). De acordo Yoo et
al. (2001), citado por Silva et al. (2004) na espécie humana, a relação entre obesidade e
incidência de tumor mamário é explicada através das elevadas concentrações de
estrógeno proveniente da transformação da androstenediona em estrona e,
posteriormente, em estrógeno no tecido adiposo.
O envolvimento de um componente etiológico de natureza hormonal tem sido
mais aceito, devido às diferenças, na incidência de tumores mamários entre cadelas
castradas e não castradas (MIALOT, 1988; SOARES e SILVA, 1998; ZUCCARI et al.,
2001b; FOSSUM et al., 2002) pois, quando a ovariectomia foi realizada antes do
primeiro ciclo estral, resultou em aproximadamente 0,5% de risco de ocorrer neoplasia
mamária; naquelas em que a castração foi realizada após o primeiro ciclo estral têm 8%,
e após dois ou mais ciclos estrais o risco aumentou para 26%. Em animais com mais de
2,5 anos de idade, a castração produziu um escasso efeito profilático para o câncer
mamário, tendo em vista que nesta idade as glândulas mamárias já se desenvolveram
plenamente (MIALOT, 1988; SOARES e SILVA, 1998; ZUCCARI et al., 2001b;
FOSSUM et al., 2002; QUEIROGA et al., 2005).
Os estudos sobre a carcinogênese propõem que os cânceres necessitam de um
período de latência dividido em dois principais estágios: iniciação, no qual o agente
cancerígeno induz mutações e altera a velocidade da divisão celular, e promoção,
estágio sucessivo em que o processo evolui até constituir-se num tumor observável.
27
Neste processo, a célula se modifica e, torna-se cancerosa, expande-se com
desenvolvimento anômalo formando uma colônia de descendentes denominada clone
(WÜNSCH FILHO e GATTÁS, 2001)
O rápido desenvolvimento das glândulas mamárias durante a puberdade,
período em que a ação estrogênica é acentuada, pode contribuir para a formação de
clones de células alteradas que se tornam nódulos hiperplásicos. Tais nódulos, que têm
entre 1 e 4 mm de diâmetro e não são detectáveis clinicamente podem, sob ação de
fatores carcinogênicos, sofrer transformação neoplásica. Assim, o papel do estrógeno no
desenvolvimento tumoral é indireto, induzindo à proliferação do epitélio ductal das
glândulas mamárias e, desta forma, propiciando as condições necessárias para que
mutações genéticas ocorram. O estrógeno também pode estar envolvido na
transformação maligna pela regulação de muitos protooncogenes nucleares (NETO,
1992; NETO, 1997; O’KEEFE, 1997; PEREZ et al., 2001; ZUCCARI et al., 2001a).
A progesterona atua significativamente sobre as glândulas mamárias das cadelas,
e o ciclo estral destes animais promove uma ação prolongada desse hormônio durante o
diestro, que retorna ao nível basal cerca de 80 a 100 dias após o início do estro
(GOBELLO et al., 2001; JOHNSTON et al., 2001; ZUCCARI et al. 2001a; CASSALI,
2003). Em um estudo realizado por Queiroga et al. (2005) foram observadas diferenças
significativas nos níveis séricos de estrógeno e progesterona comparados entre cadelas
sem alteração mamária e cadelas com tumores benignos e malignos, observado-se que
os níveis destes hormônios eram maiores quando havia lesões mamárias.
A prolactina e somatrofina têm efeito sobre o crescimento das glândulas
mamárias, sendo também estudada sua influência sobre as neoplasias mamárias caninas
(CASSALI, 2003; QUEIROGA et al., 2005).
28
As glândulas mamárias diferenciam-se durante os sucessivos estágios de vida do
animal. As mamas da fêmea impúbere apresentam um sistema tubular ramificado
rudimentar ligado aos ductos lactíferos. Quando sob efeito dos estrógenos, durante a
puberdade, o sistema tubular se desenvolve, com discreto aumento de células adiposas.
Portanto, o volume externo da glândula aumenta ligeiramente, o que acontece,
sobretudo nas mamas abdominais caudais e nas mamas inguinais (CASSALI, 2003). As
mamas apresentam dois tipos celulares em sua estrutura, as células epiteliais luminais
que sintetizam e excretam proteínas lácteas e lipídios durante a lactação, e as células
epiteliais basais ou mioepiteliais que se contraem sob a influência de ocitocina,
expelindo o leite dos ductos. Ambos os tipos celulares são derivados de uma única
população celular ou células tronco. Além do tecido epitelial, ainda há a presença de
fibroblastos e células adiposas que compõem e fazem a sustentação do tecido mamário.
O tecido subcutâneo da parede ventral do abdome contém as mamas abdominais e
inguinais e os vasos e nervos que as suprem. Na fêmea canina, os vasos epigástricos
craniais superficiais são vistos subcutaneamente, junto à papila mamária abdominal
cranial. A artéria epigástrica superficial caudal segue cranialmente à superfície profunda
da mama inguinal e fornece os ramos mamários. A artéria prossegue para suprir a mama
abdominal caudal e fazer anastomose com ramos da artéria epigástrica superficial
cranial (HOWARD e DELAHUNTA, 2001).
Essa formação é de extrema importância no estudo dos tumores mamários, pela
relação direta entre seus componentes e o prognóstico da lesão (BANKS, 1992;
ZUCCARI et al. 2001a). Na cadela há 5 pares de glândulas mamárias, no entanto
aproximadamente 60% de todos os tumores mamários ocorrem nas mamas inguinais. A
razão desta ocorrência é desconhecida, podendo estar relacionada com o maior volume
destas glândulas e com as correspondentes alterações proliferativas em resposta aos
29
estrógenos (QUEIROGA e LOPES, 2002), segundo Withrow e Susaneck (1986) os
tumores ocorrem, em 50% dos casos, nas mamas abdominais e inguinais.
A pseudogestação consiste em algumas mudanças hormonais similares à
gestação, normalmente entre a 6ª e 14ª semana após o estro, resultando em transtornos
psicológicos e fisiológicos. Sua etiologia está associada a uma concentração plasmática
elevada de prolactina ou uma maior sensibilidade do animal a esse hormônio
(SARTORI, 2003). Episódios de pseudogestação podem aumentar o aparecimento de
lesões pré-neoplásicas, devido ao acúmulo de secreções lácteas intra-mamárias,
responsáveis pela grande distenção alveolar, provocando compressão vascular seguida
de hipoxia, com liberação de radicais livres com potencial carcinogênico, além disso, o
acúmulo de leite nos ductos mamários durante a pseudogestação é acompanhado de
estagnação e degradação dos produtos de secreção (TANAKA, 2003; VERSTEGEN et
al., 2005) (Fig 1).
Figura 1 – Cadela em pseudogestação apresentando aumento de volume das glândulas
mamárias.
Segundo Tanaka (2003) as fêmeas da espécie canina que apresentaram
regularmente falsas gestações foram as mais propensas aos tumores de mama, como
conseqüência do desenvolvimento de estase láctea e formação de focos inflamatórios.
30
A população de risco, no que se refere aos tumores mamários, não tem
predisposição racial específica e é constituída por cadelas entre os seis e 12 anos de
idade, sendo a idade de maior susceptibilidade entre os nove e 11 anos (PELETEIRO,
1994; CASSALI, 2003) ou entre 7 e 15 anos (MUTO et al., 2000).
A administração de hormônios esteróides de longa ação, tem sido amplamente
utilizada como método de controle do ciclo estral das cadelas (TANAKA, 2003). Estes
hormônios entre eles os esteróides naturais, progesterona e testosterona, além de uma
variedade de esteróides sintéticos, tais como acetato de medroxiprogesterona, acetato de
megestrol, acetato de melengestrol, proligestona e miborelone, suprimem a atividade
ovariana cíclica, através da supressão da secreção de hormônios gonadotróficos.
Contudo, segundo Oliveira et al. (2003), a administração prolongada destes
progestágenos tende a resultar em hiperplasia endometrial cística e infecção uterina
subseqüente, além do desenvolvimento de tumores mamários e, segundo Withrow e
Susaneck (1986), em experimento desenvolvido com Beagles, 66% apresentaram
tumores com 5 a 7 anos de idade após uso prolongado de contraceptivos orais.
Na oncologia, é necessário ir além do diagnóstico e buscar informações sobre
todos os aspectos envolvidos, incluindo fatores de risco, conduzindo às soluções mais
adequadas, e indicando medidas profiláticas.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de avaliar a ocorrência dos tipos de
tumores mamários em cadelas e sua relação com idade, pseudogestação e o uso de
progestágenos.
31
MATERIAL E MÉTODOS
Foram coletados 50 tumores mamários e 50 glândulas macroscopicamente
normais adjacentes e ipsolaterais à tumoração de cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), no período de
2003 a 2005. Como controle negativo foram utilizadas de 11 cadelas saudáveis, sem
presença de tumor, submetidas a ovariohisterectomia eletiva no mesmo Hospital, das
quais foram retiradas biópsias de tecido mamário.
Figura 2 – Cadela apresentando tumor na glândula mamária.
As cadelas eram de raças variadas, as com tumoração (Fig. 2) tinham idade entre
4 e 19 anos e as do grupo controle entre 7 meses e 6 anos. Após exame clínico, foi
preenchido questionário de histórico reprodutivo, hábitos alimentares, ocorrência de
pseudogestação e uso de anticoncepcionais (ANEXO 1).
32
Para a cirurgia os animais foram submetidos a pré-anestesia com sulfato de
atropina (0,044 mg/ Kg) e acepromazina (0,2 mg/Kg), indução com thiopental sódico
2,5% (12,5 mg/kg) e anestesia com ketamina 10% (10 mg/kg) ou halotano.
Os tumores foram mensurados e identificados quanto à localização (Fig. 3), e os
fragmentos das mamas coletados (com ou sem tumor) através de biópsia foram fixados
em solução de formalina neutra e tamponada a 10%. Posteriormente, os fragmentos
foram processados por técnica usual de histologia, incluídos em parafina e cortados em
micrótomo a 3µm e as lâminas coradas pelo método de hematoxilina e eosina
(PROPHET et al., 1992).
Figura 3 – Esquema utilizado para identificação e localização dos tumores em cadelas.
(D) lado direito, (E) lado esquerdo, (A) linfonodos axiais e (I) linfonodos
inguinais.
As amostras foram examinadas por dois patologistas, sem conhecimento prévio
do resultado para análise histopatológica que identificaram os tumores com base nas
D E
1
2
3
4
5
A A
I I
33
características celulares de acordo com a classificação histológica preconizada pela
Organização Mundial de Saúde (OMS). Após esta análise, os resultados foram
estratificados de acordo com o tipo de tumor, ocorrência prévia de pseudogestação;
glândula mamária afetada; uso de anticoncepcional e ocorrência de neoplasia na mama
macroscopicamente normal.
Os dados foram analisados pelo teste de comparação de proporções e pelo teste
χ
2
com significância de P<0,05 (REIS, 2003).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As mamas dos animais saudáveis apresentaram as características celulares
preservadas, sem alterações que sugerissem neoplasia (Fig.4 e 5).
Figura 4 – Aparência externa da cadeia mamária de cadela normal com ausência de
nódulos tumorais.
34
Figura 5 – Fotomicrografia de tecido mamário normal em cadela com ausência de
tumoração. H.E. Aumento 63X.
A idade de maior freqüência de tumores mamários nas cadelas deste estudo,
variou entre 9 a 13 anos (48%) estando de acordo com os achados de Peleteiro (1994) e
Cassali (2003), as demais ficaram entre 4 a 8 anos (42%) e 14 a 19 anos (10%),
demonstrando a importância do fator idade no aparecimento dos tumores, apesar da
amplitude da variação de idade neste estudo, 4 a 19 anos, ter sido maior do que a
observada por Peleteiro (1994) e Muto et al. (2000).
A baixa freqüência observada na faixa etária de 14 – 19 anos é reflexo da alta
malignidade dos tumores, pois não são muitos os animais que atingem esta expectativa
de vida, especialmente quando acometidos por tumores mamários.
A maior freqüência dos tumores em animais mais velhos pode ser decorrente do
fato que já passaram por vários ciclos estrais, sendo submetidos a alterações hormonais
35
cíclicas fisiológicas e, portanto mais sujeitos à carcinogênese hormonal, conforme
sugerido por Silva et al. (2004).
Neste estudo observou-se uma maior freqüência dos carcinosarcomas (68%)
(Fig. 6) seguidos pelo carcinoma (24%) (Fig. 7; Tab.1) demonstrando a malignidade dos
tumores encontrados, conforme os achados de Cavalcante (1977), Santos (1994) e
Marques (2000) que identificaram maior freqüência de carcinosarcoma mamários, na
cidade de Recife-PE. No entanto, os achados de Souza et al. (2001) na cidade de
Salvador-BA, Queiroga et al. (2005) na cidade de Madrid – Espanha e Cassali (2003)
em Belo Horizonte-MG encontraram maior freqüência, de tumores mistos benignos.
Além destes dois tipos de tumores foram encontrados em menor freqüência,
tumor misto benigno, fibrose, hemangiosarcoma e processo inflamatório (Fig. 8 a 11) .
Tabela 1 - Classificação dos achados histológicos de lesões mamárias de cadelas atendidas no
Hospital Veterinário da UFRPE, Recife, 2003/2005
Classificação histológica n %
Carcinoma 12 24
carcinosarcoma 34 68
Misto benigno 1 2
Hemangiosarcoma 1 2
Fibrose 1 2
Processo inflamatório 1 2
TOTAL 50 100
36
Figura 6- Fotomicrografia de carcinosarcoma mamário em cadela, com formação
irregular de ductos e ácinos, constituídos por células epiteliais com elevado
grau de anisocitose e anisocariose, associados a áreas de proliferação de
células mioepiteliais e células de origem mesenquimal mal diferenciadas.
Inúmeras mitoses estão presentes.H.E. Aumento 400X.
Figura 7- Fotomicrografia de carcinoma papilar em mama de cadela., demonstrando
estruturas ductais com proliferação do epitélio em forma de papilas. H.E.
Aumento 400X.
37
Figura 8- Fotomicrografia de hemangiosarcoma em mama de cadela, com células
endoteliais imaturas mostrando anaplasia, formando espaços vasculares.
H.E. Aumento 63X.
Figura 9- Fotomicrografia de tumor misto benigno em mama de cadela. Arranjo de
células epiteliais em ácinos e ninhos, com proliferação de células
mioepiteliais.H.E. Aumento 250X.
38
Figura 10- Fotomicrografia de fibrose em mama de cadela. Substituição de tecido
glandular por tecido conjuntivo fibroso.H.E. Aumento 63X.
Figura 11- Fotomicrografia de processo inflamatório em mama de cadela. Caracterizado
por acúmulo de leucócitos mononucleados no lúmen dos ácinos e no tecido
intersticial. H.E. Aumento 63X.
39
Nas glândulas macroscopicamente normais, laterais aos tumores (Tab. 2),
observou-se que 54% delas já apresentavam alterações tumorais com maior freqüência
de carcinomas (48%), indicando que as alterações iniciaram na porção epitelial (Luiz et
al., 2002). Além das alterações já apresentadas nas mamas com processos tumorais,
observou-se também um caso de hiperplasia mamária (Fig. 12).
Figura 12- Fotomicrografia de hiperplasia em mama de cadela. Nódulo hiperplásico
mostrando múltiplos lóbulos em diferentes estágios de hiperplasia. H.E.
Aumento 63X.
Tabela 2 - Avaliação histológica das glândulas mamárias macroscopicamente normais,
laterais aos tumores mamários de cadelas atendidas no Hospital
Veterinário da UFRPE, Recife, 2003/5
Avaliação histológica n %
Glândulas normais 18 36
Carcinoma 24 48
Fibrose 1 2
Carcinosarcoma 3 6
Hiperplasia 1 2
Material insuficiente 3 6
TOTAL 50 100
40
Não foi observado neste estudo influência da pseudogestação e do uso de
anticoncepcionais como fatores de risco, tendo em vista que a maioria das fêmeas
afetadas com tumores mamários (78%) não apresentaram pseudogestação prévia e em
68% delas não foi usado anticoncepcional, demonstrando que estes fatores não foram os
indutores dos tumores nestes casos estudados, ao contrário do que foi sugerido por
Verstegen et al. (2005), Tanaka (2003) e Oliveira et al. (2003) (Tab.3)
Tabela 3 - Ocorrência de tumores de mama com existência de pseudogestação e o uso
de anticoncepcionais em cadelas atendidas no Hospital Veterinário da
UFRPE, Recife, 2003/2005
Gestação Pseudogestação Anticoncepcional Condição
n %
n %
n %
Cadelas com Tumor (n=50)
29 58,0 11 22,0 16 32,0
Cadelas Normais (n=11) 4 36,6 1 0,9 5 45,4
Entre as cadelas que apresentaram tumores malignos (carcinoma ou
carcinosarcomas) também não foi observada associação com a gestação,
pseudogestação e o uso de anticoncepcionais (Tab. 4)
Tabela 4 – Ocorrência de tumor maligno com a existência de pseudogestação e uso de
anticoncepcionais em cadelas atendidas no Hospital Veterinário da UFRPE,
Recife, 2003/2005
Gestação Pseudogestação Anticoncepcional Tipo de Tumor
n %
n %
n %
Carcinoma (n=12)
9 76,0 3 25,0 6 50,0
Carcinosarcoma (n=34) 16 47,0 8 23,5 10 29,4
Neste experimento, observou-se maior freqüência de tumores mamários nas
glândulas inguinais (37,63%) e abdominais (35,47%) (Tab. 5). Estando os estudos de
41
acordo com Queiroga e Lopes (2002) e Withrow e Susaneck (1986) que também
obtiveram maior incidência dos tumores mamários nas glândulas inguinais, porém estes
autores constataram uma freqüência de 60% e 50% respectivamente. A razão desta
diferença é desconhecida, podendo estar relacionada com o maior volume de tecido
nestas glândulas e com as correspondentes alterações proliferativas em resposta aos
estrógenos.
Notou-se também que a maioria dos animais apresentou mais de uma mama afetada
na mesma ou na cadeia contralateral. Segundo Fossum (2002) isto é conseqüência da
disseminação das células tumorais tanto por via linfática quanto por via sanguínea e,
segundo Luiz et al. (2002), por ocorrer anastomoses de vasos tanto das mamas laterais
como das cadeias mamárias. De acordo com Linzell (1959), citado por Luiz et al.
(2002), além do aumento da irrigação, ocorre inversão de fluxo venular e há uma
propensão no desenvolvimento de processos inflamatórios e hipertróficos glandulares,
que em 50% dos casos, levam a malignização e morte do animal pela disseminação
tumoral, tanto por via linfática quanto por via sangüínea. Contudo, para afirmar este
processo neste trabalho, seria necessária realização de estudos de angiogênese.
Tabela 5 - Freqüência de glândulas mamárias afetadas pelo tumor de mama em cadelas
atendidas no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de
Pernambuco da UFRPE, Recife, 2003/2005
1 – 5: seqüência de mamas de uma mesma cadeia em ordem crescente
no sentido crâneo –caudal; D: lado direito; E: lado esquerdo.
Glândulas mamárias mais afetadas n %
1D 2 2,15
2D 8 8,60
3D 5 5,37
4D 20 21,50
5D 19 20,43
1E 1 1,07
2E 4 4,30
3E 5 5,37
4E 13 13,97
5E 16 17,20
93 100
42
Conclui-se que, na população estudada, a ocorrência de tumores mamários não
foi relacionada aos fatores de risco pseudogestação e uso de contraceptivos hormonais,
mas está relacionado com a idade avançada e que, pela malignidade dos tumores
observados e a freqüência de sinais tumorais nas mamas adjacentes às afetadas,
recomenda-se indicar a prática de extirpação completa da cadeia mamária afetada, a fim
de evitar as recidivas e invasão nos tecidos adjacentes diminuindo, portanto, a
possibilidade de futuras metástases e conseqüentemente aumentando a sobrevida do
animal.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunidade aos tumores. In:
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia celular e molecular. 4
ª ed., Rio de Janeiro: Revinter, 2002. p. 384-403
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.;
WATSON, J. D. A mecânica da divisão celular. In: Biologia molecular da célula. São
Paulo: Artes Médicas Sul, 1997. cap. 18, p. 911 – 946.
BANKS, W. J. Sistema tegumentar. In: BANKS Histologia veterinária aplicada. São
Paulo: Manole, 1992, cap. 20, p. 391-424.
CARRUIDO, A. C. C.; SALAS, Y.; ORLANDO, E.; MENDEZ, D. COLMENAREZ,
V. Incidencia de las neoplasias de glándula mamaria en caninos diagnosticadas por
histopatología en el hospital veterinario "Dr. Humberto Ramírez Daza" desde
1983 hasta 2003. Disponível em http://www.monografias.com/trabajos15/tumores-
caninos/tumores-caninos.shtml, 2003. Acesso em: 12/01/2006.
CASSALI, G. D. Estudos morfológicos, imuno-histoquímico e citométrico de
tumores da cadela – Aspectos comparativos com neoplasias da mama humana.
Belo Horizonte, 2000. Tese de Doutorado. Universidade Federal de Minas Gerais.
CASSALI, G. D. Patologia da glândula mamária. In: NASCIMENTO, E. F.;
SANTOS, R. L. Patologia da reprodução dos animais domésticos. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2003. Cap. 12, p. 119-133.
CAVALCANTE, M.I. Oncologia comparativa entre caninos e humanos, na cidade
do Recife, Brasil. Recife, 1977. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal Rural
de Pernambuco.
DOBSON, J. M. Princípios da terapia do câncer. In: DUNN, J, K. Tratado de
Medicina de Pequenos Animais. São Paulo: Roca, 2001. cap. 50, p. 979-1022.
43
FOSSUM, T. W.; HEDLUND, C. S.; HULSE, D. A.; JOHNSON, A. L.; SEIM, H. B.;
WILLARD, M. D.; CARROLL, G. L. Cirurgia dos sistemas reprodutivos e genitais In:
Cirurgia de pequenos animais. São Paulo: Roca, 2002. cap. 13, p. 571-637
GOBELLO, C.; CONCANNON, P. W.; VERSTEGEN, J. Pseudopreñez canina: Una
revisión In: Recent Advances in Small Animal Reproduction, Ithaca: International
Veterinary Information Service, 2001. Disponível em
http://www.ivis.org/advances/Concannon/gobello_es/ chapter_frm.asp?LA=2. Acesso
em 02/01/2006
HELLMÉN, E. Complex mammary tumour in the female dog: a review. Journal of
Dairy Research, Cambridge, v.72, p. 90-97, 2005.
HOWARD, E. E.; DELAHUNTA. Abdome, pelve e membro pélvico. In: Guia para a
dissecção do cão. Rio de Janeiro: Guanabara, 2001. p. 117-119
ITOH, T.; UCHIDA, K.; ISHIKAWA, K. KUSHIMA, K. KUSHIMA, E. TAMADA,
H. MORITAKE, T. NAKAO, H.; SHII, H. Clinicopathological surgy of 101 canine
mammary gland tumors: differences between small-breed dogs and others. Journal of
Veterinary Medical Science, Tokyo, v. 67, n. 3, p. 345-347, 2005
JOHNSTON, S. D.; KUSTRITZ, M. V. R.; OLSON, P. N. S. Disorders of the
mammary glands of the bitch. In: Canine and feline theriogenology, Philadelphia:
W.B. Saunders, 2001. cap. 13, p. 243-274
KARAYANNOPOULOU, M.; KAALDRYMIDOU, E.; CONSTANTINIDIS, T. C.;
DESSIRIS, A. Histological grading and prognosis in dogs with mammary carcinomas:
application of a human grading method. Journal of Comparative Pathology,
Edinburgh, v. 133, p. 246-252, 2005.
LUIZ, C. R.; MIGLINO, M. A.; SANTOS, T.C. Segmentos anatómo-cirurgicos arteriais
da glandula mamária em cães (canis familiaris, Linnaeus, 1758). Archives of
Veterinary Science, v.7, n.1, p. 27-36, 2002.
MARQUES, N. B. Avaliação dos hormônios tireoideanos de fêmeas da espécie
canina com tumores de mama. Recife, 2000. Dissertação Mestrado, Universidade
Federal Rural de Pernambuco.
MIALOT, J. P. Patologia da mama. In: MIALOT, J. P. Patologia da reprodução dos
carnívoros domésticos. Porto Alegre: A Hora Veterinária, 1988. 160 p.
MOURA-GALLO, C. V.; SIMÃO, T. A.; RIBEIRO, F. S.; SERPA, M. J. A.;
CARDOSO, L. E. B.; MENDONÇA, G. A. S.
Mutações no gene TP53 em tumores
malignos de mama: associação com fatores de risco e características clínico-patológicas,
inclusive risco de óbito, em pacientes residentes no Rio de Janeiro. Revista Brasileira
de Epidemiologia, Rio de Janeiro, v.7, n.2, p.167-175 , 2004.
MUTO, T.; WAKUI, S.; TAKAHASHI, H.; MAEKAWA, S.; MASAOKA, T.;
USHIGOME, S.; FURUSATO, M. P53 gene mutations occurring in spontaneuos
benign and malignant mammary tumor of the dog. Veterinary Pathology, Washington,
v. 37, p. 248-243, 2000.
NETO, L. N. Tumores mamários malignos na cadela. São Paulo: Arte & Ciência,
1997. 144p.
NETO, L. Z. Neoplasias malignas em cães. Sua analogia com alguns processos
idênticos na espécie humana. UNIMAR CIÊNCIAS, Marília, v. 1, p. 4-9, 1992.
44
O’KEEFE, D. A. Tumores do sistema genital e glândulas mamárias. In: ETTINGER, S.
A. & FELDMAN, E. C. Tratado de medicina interna veterinária. São Paulo:
Manole, 1997. v. 2, p. 2344 – 2351
OLIVEIRA, E.C.S.; MARQUES JÚNIOR, A.P.; NEVES, M.M. Endocrinologia
reprodutiva e controle da fertilidade da cadela – revisão. Archives of Veterinary
Science, Curitiba, v. 8, n. 1, p. 1-12, 2003.
PELETEIRO, M. C. Tumores mamários na cadela e na gata. Revista Portuguesa de
Ciências Veterinárias, Lisboa, v.89, p. 10-34, 1994.
PEREZ ALENZA D.; RUTTEMAN, G. R.;, PENA, L.; BEYNEN, A. C.; CUESTA, P.
Relation between habitual diet and canine mammary tumors in a case-control study.
Journal of Veterinary Internal Medicine, Lawrence, v. 12, n. 3, p. 132-9, 1998.
PÉREZ, A. M. D.; TABANERA, E.; PEÑA, L. Inflammatory mammary carcinoma in
dogs: 33 cases (1995-1999). Journal of the American Veterinary Medical
Association, Schaumburg, v.219, n. 15, p. 1110 – 1114, 2001.
PROPHET, E.B.; MILLES, B.; ARRINGTON, J.B.; SOBIN, L.H. In: PROPHET, E.B.;
MILLES, B.; ARRINGTON, J.B.; SOBIN, L.H. Laboratory methods in
histotecnology. Washington: Armed Force Institute of Pathology American Registry of
Pathology, 1992, 279p.
QUEIROGA, F.; LOPES, C. Tumores mamários caninos, pesquisa de novos factores de
prognóstico. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, Lisboa, v.97, n. 543, p.
119-127, 2002.
QUEIROGA, F. L.; PÉREZ-ALENZA, M. D.; SILVAN, G.; PEÑA, L.; LOPES, C.;
ILLERA, J. C. Role of steroid hormones and prolactin in canine mammary cancer.
Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, Oxford, n. 94, p. 181-187,
2005.
REIS, J.C. Estatística aplicada à pesquisa em ciência veterinária. Olinda: Luci Artes
Gráficas, 2003. 651p.
SANTOS, F.L. Alguns aspectos de neoplasias, em caninos, na cidade do Recife-
Pernambuco-Brasil, no período de 1982 a 1990. Recife, 1994. Dissertação de
Mestrado, Universidade Federal Rural de Pernambuco.
SARTORI, M. Pseudociese- gravidez psicológica 2003. Disponível em
http://www.labrador.com.br/lab_news16.htm. Acesso em 10/12/2006
SILVA, A. E.; SERAKIDES, R.; CASSALI, G. D.
Carcinogênese hormonal e
neoplasias hormônio-dependentes Ciência Rural, Santa Maria, v. 34, n. 2, 625-633,
2004.
SOARES, J. A. G.; SILVA, P. A.. R. Castração precoce em cães e gatos. Clínica
Veterinária, São Paulo, n. 13, p. 34-40, 1998.
SONNENSCHEIN, E. G.; GLICKMAN L. T.; GOLDSCHMIDT, M. H.; MCKEE, L. J.
Body conformation, diet, and risk of breast cancer in pet dogs: a case-control study.
American Journal of Epidemiology, Baltimore, v. 133, n. 7, p. 694-703, 1991.
SOUZA, V. T. F.; PARAGUASSU, A. A.; MOREIRA, E. L. T. Ocorrência de
neoplasias em caninos na cidade de Salvador, Bahia (achados de biopsias). Revista
Brasileira de Saúde e Produção Animal, Salvador, v. 2, n. 2, p. 53-58, 2001.
45
TANAKA, N. Tumor de mama: qual a melhor conduta? Boletim Informativo, São
Paulo, ano VII, n.29, p.6-7, 2003. Disponível em http://www.anclivepa-sp.org.br/rev-7-
29-01.htm.
VERSTEGEN, J.; SCALAIS, S.; ONCLIN, K. Cancerologia canina: os tumores
mamários e a prolactina. A Hora veterinária, Porto Alegre, n. 32, p. 50-54, 2005.
WITHROW, S. J.; SUSANECK, S. J. Tumors of the canine female reproductive tract.
In: MORROW, D. A. Current therapy in theriogenology diagnoses, treatment and
prevention of reproductive diseases in small and large animal, Philadelphia:
W.B.Saunders, 1986. p. 521-528
WUNSCH FILHO, V.; GATTAS, G. J. F. Biomarcadores moleculares em câncer:
implicações para a pesquisa epidemiológica e a saúde pública. Cadernos de Saúde
Pública, v..17, n. 3, p. 467-480, 2001.
ZUCCARI, A. P. C.; SANTANA, A. E.; ROCHA, N. S. Correlação entre a citologia
aspirativa por agulha fina e a histologia no diagnóstico de tumores mamários de cadelas.
Brazilian Journal Veterinary Research Animal Science, São Paulo, v. 38, n.1, p. 38-
41, 2001a.
ZUCCARI, D. A. P. C.; SANTANA, A. E.; ROCHA, S. N. Fisiologia da neoplasia
mamária em cadelas – Revisão. Clínica Veterinária, São Paulo, n.32, p.52-54, 2001b.
46
Artigo 2
47
ESTUDO DE MUTAÇÕES NOS EXONS 4 A 8 DO GENE p53 EM TUMORES
MALIGNOS EM GLANDULAS MAMÁRIAS DE CADELAS
Mutations study in exons 4 to 8 of the gene p53 in malignant tumors in
bitches' mammary glands
Souza
6
, D.M.B.; Barros
7
, M.G.O; Silva
2
, J.S.C; Coleto
1
, Z.F.; Adrião
8
, M.;
Wischral
9
, A.
RESUMO
Os tumores em mamas de cadelas, representam mais de 50% de todos os tumores em
fêmeas da espécie canina. Estes tumores apresentam na maioria, comprometimento do
DNA, pela influência de fatores carcinogênicos que desencadeiam as mutações. O gene
p53, conhecido como um gene supressor de tumor, vem sendo muito estudado pela
relação entre as mutações e o aparecimento destes tumores. Para estudar as mutações
nos exos 4 a 8 do gene p53, foram utilizadas 50 cadelas com tumores de mamas e 11
normais. O DNA genômico foi extraído pela técnica fenol-clorofórmio e os exons 4 a 8
foram amplificados através da técnica de reação em cadeia da DNA-polimerase (PCR)
com oligonucleotídeos específicos. Dos tumores analisados, foram escolhidas amostras
de 9 carcinomas e 7 carcinosarcomas com as respectivas mamas normais adjacentes, e
de 6 cadelas normais, cujos DNAs foram seqüenciados e avaliados quanto a presença de
mutações nos nucleotídeos do p53 canino (GenBank - S77819). Foram encontradas
mutações em 86,1% das amostras que após o sequenciamento apresentaram, em média
homologia de 86,3% com a proteína p53 canina (GenBank - AAB42022.1). Das
mutações observadas, as mais freqüentes foram as missense (74,6 %) e os exons mais
acometidos foram o 5 e o 8 com 23,2% e 24,9% das mutações, respectivamente. As
alterações de nucleotídeos mais freqüentes foram deleções (C e G) e inserções (A e T),
que resultaram na maioria das mutações missense. Os resultados deste trabalho
permitiram concluir que a neoplasia mamária em cadelas tem relação com mutações no
gene p53 e que as mutações se encontram principalmente na região da proteína que se
liga ao DNA no núcleo celular, o que pode alterar a funcionalidade da mesma e
propiciar o crescimento tumoral. As mamas adjacentes aos tumores, apesar de
6
Doutoranda – Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de
Pernambuco - E-mail: d[email protected]m.br
7
Graduando em Medicina Veterinária, Bolsista Pibic/CNPq
8
Professor, Depto de Morfologia e Fisiologia Animal da UFRPE
9
Professor, Depto de Medicina Veterinária da UFRPE
48
macroscopicamente e microscopicamente normais, apresentam mutações que
representam risco de recidivas se não forem retiradas junto com o tumor já existente.
Palavras chave: DNA, neoplasias, PCR, biologia molecular
ABSTRACT
The mammary tumors are the more frequent neoplasm lesions, representing more than
50% of all the tumors of the canine females and the gene p53, known as a tumor
suppressor gene, it has been presented mutations related with neoplasies. To study the
mutations in exons 4 to 8 of the p53 gene, they were used 50 females with mammary
tumor and 11 normal ones. The genomic DNA was extracted by the phenol-chloroform
procedure, and amplification of the 4 to 8 exons, was through the polimerase chain
reaction (PCR) with specific primers. Among analyzed tumors, they were chosen 9
carcinomas and 7 carcinosarcomas with the ones respective adjacent normal mammas,
and 6 of the normal animals that were sequenciated in automatic sequencer and
analyzed for the presence of mutations in comparison to nucleotides sequence of the
p53 canine (GenBank - S77819). Were found mutations in 86,1% of the samples that
presented homology (86,3%) with the canine protein p53 (GenBank - AAB42022.1). Of
the observed mutations, the most frequent were missense ones (74,6 %) and the most
attacked exons were the 5 and the 8 with, respectively, 23,2% and 24,9% of the
mutations. The more frequent nucleotides alterations were deletions (C and G) and
inserts (A and T), which resulted in majority of the mutations missense. It concludes
that mammary tumors in canine female has relation with mutations in the gene p53 and
that the mutations meet mostly in the region of the protein that is linked to the DNA in
the cellular nucleus, what it can change the functionality of the same and to propitiate
the tumor growth. The adjacent mammas to the tumors, despite macroscopically normal,
present mutations that can represent reincidence if are not withdrawn with already
existing tumor.
Key words: DNA, neoplasm, PCR, molecular biology
49
INTRODUÇÃO
O crescimento do corpo é dado pela multiplicação de células e milhões de
divisões celulares ocorrem ao longo da vida de um organismo. Cada vez que uma célula
se divide, a molécula de DNA duplica-se para continuar controlando a síntese das
proteínas nas células filhas e cada cadeia servirá de molde para produção de uma cadeia
complementar, resultando em duas moléculas de DNA com exatamente a mesma
informação genética (FARAH, 2000).
Nas glândulas mamárias ocorre um rápido desenvolvimento durante a
puberdade, período em que a ação estrogênica é acentuada, contribuindo para a
formação de clones de células alteradas que se tornam nódulos hiperplásicos que, sob
ação de fatores carcinogênicos, sofrem transformações neoplásicas. A prolactina e a
somatrofina têm efeito sobre o crescimento das glândulas mamárias, sendo também
estudada sua influência sobre as neoplasias mamárias caninas. Assim, o papel hormonal
no desenvolvimento tumoral é indireto, induzindo à proliferação do epitélio ductal das
glândulas mamárias e, desta forma, propiciando as condições necessárias para que
mutações genéticas ocorram (NETO, 1992; NETO, 1997; O’KEEFE, 1997; PEREZ et
al., 2001; ZUCCARI et al., 2001; CASSALI, 2003; QUEIROGA et al., 2005).
O gene é o alvo das mutações e o dano em sua estrutura pode abolir a sua
função. O gene p53, conhecido como um gene supressor de tumor, codifica uma
fosfoproteína tetramérica, que se liga especificamente ao DNA e age como fator de
transcrição. Cada unidade básica da proteína p53 é formada por quatro domínios que
representam unidades funcionais distintas, sendo a parte central (localizada entre os
50
aminoácidos 100 e 300), responsável pela capacidade de ligação com a molécula de
DNA (CAVALCANTI JÚNIOR et al., 2002).
Em células normais, esta proteína é sintetizada continuamente mas, não se
acumula em níveis significativos, sendo degradada pela célula em 2-15 minutos. No
entanto, quando as células são expostas a agentes que modificam o DNA, a proteína se
torna estável e passa a controlar diversos genes que são seus alvos, impedindo a
progressão do ciclo (MUTO et al., 2000; LEWIN, 2001; LEE e KWEON, 2002;
KANAYA et al., 2002; FARIAS et al., 2005). A ação da proteína p53, é de regular a
proliferação celular, a estabilidade genômica e morte celular programada (KRAEGEL et
al., 1995; CHU et al., 1998; WONG et al., 1999; MUTO et al., 2000; SETOGUCHI et
al., 2001) reparando o DNA lesado e conduzindo a novo fator de transcrição
(VELDHOEN e MILNER, 1998; LEE e KWEON, 2002). Um grande aumento na
quantidade da proteína p53 é observado em muitas células transformadas ou em
linhagem derivadas de tumores (LEWIN, 2001).
Alguns estudos têm focado a investigação da função supressora de tumor do
gene p53 na tumorogênese dos cânceres caninos, humanos e várias outras espécies.
Mutações neste gene, localizado no cromossomo 17, estão presentes em
aproximadamente 50% dos cânceres humanos, sendo o alvo mais comum de alterações
genéticas no processo neoplásico (MOURA-GALLO et al., 2004).
As mutações em p53 encontradas nos mais diversos tumores malignos
analisados são pontuais e estão majoritariamente localizadas na região da molécula
altamente conservada, que corresponde ao domínio de ligação da proteína com o DNA
(KRAEGEL et al., 1995; CHU et al., 1998; VELDHOEN e MILNER, 1998; WONG et
al., 1999; MUTO et al., 2000; SETOGUCHI et al., 2001; LEE e KWEON, 2002).
51
Ocorre, ainda, modificação da localização da proteína, do núcleo para o citoplasma, e
conseqüente impedimento da sua ligação com o DNA (LEWIN, 2001).
Os tumores em mamas são as lesões mais freqüentes nas fêmeas da espécie
canina representando mais de 50% de todos os tumores, sendo a incidência três vezes
maior quando comparada com os humanos (ITOH et al., 2005;
KARAYANNOPOULOU et al., 2005; QUEIROGA et al., 2005).
Além dos agentes carcinogênicos (FETT-CONTE e SALLES, 2002), os tumores
podem ocorrer como conseqüência do acúmulo de alterações genéticas que interferem
no controle normal do crescimento e diferenciação celular, pela transformação de uma
célula maligna através de múltiplas etapas, chamada de progressão tumoral, que envolve
a ocorrência de mutações, nas diferentes fases do ciclo celular (DOBSON, 2001). Por
outro lado, a ativação anormal dos genes que controlam o crescimento celular (LOURO,
2000), resulta em modificações progressivas da biologia celular caracterizadas por
alterações na proliferação, diferenciação e na interação das células com o meio
extracelular (COTRAN et al., 2000).
Dentre os genes envolvidos nas etapas de desenvolvimento do câncer de mama,
o p53 é o gene que se apresenta mais mutado nesta doença
(CHU et al., 1998; MUTO
et al., 2000; MOURA-GALLO et al., 2004). As alterações neste gene foram
identificadas em vários tipos de tumores tanto em humanos como nos animais, nas
glândulas mamárias de mulheres (MOURA-GALLO et al., 2004), nos melanonas
(ROELS et al., 2001), no papiloma oral (MAYR et al., 1994), no adenoma da glândula
perianal (MAYR et al., 1997), nos osteossarcomas (LOUKOPOULOS et al., 2003), nos
linfoma maligno, leucemia e câncer de colon (SETOGUCHI et al., 2001) dos caninos.
Nos melanonas felinos (ROELS et al., 2001) e nos carcinomas cutâneos das células
escamosas nos eqüinos (PAZZI et al., 1996). A diversidade destes cânceres sugere que o
52
p53 não está envolvido em um evento tecido-específico, mas sim em algum controle
geral e bastante comum da proliferação celular e a perda deste controle pode ser um
evento secundário que ocorre para assistir à multiplicação celular de muitos tumores
(LEWIN, 2001).
As mutações podem ser silenciosas, não apresentando efeito discernível na
célula ou organismo, ou resultarem em alterações estruturais e/ou funcionais no gene
e/ou seu produto protéico (WALKER e RAPLEY, 1999; FARAH, 2000).
Todos os tipos de mutações, especialmente aquelas ocorrendo nas extensas
seqüências intrônicas não codificantes ou extragênicas de DNA, e as pontuais, no
interior de regiões codificantes, podem ser também silenciosas, devido à degeneração
do código genético. Este é o caso daquelas que afetam a terceira base de um códon, pois
isto não produzirá freqüentemente, uma alteração na ordem de aminoácidos codificada
pelo gene. Portanto, tais mutações são indetectáveis no nível da proteína, mas podem ser
observadas no nível dos nucleotídeos, pois muitos aminoácidos são codificados por
mais de um códon. As mutações com sentido errôneo missense, resultam em alteração
na seqüência codificada de aminoácidos, podem afetar a atividade ou expressão da
proteína codificada e são detectadas tanto ao nível dos nucleotídeos como da proteína.
As mutações missense podem afetar a estrutura e/ou a função da proteína codificada,
dependendo do aminoácido envolvido e de sua localização (KRAEGEL et al., 1995;
CHU et al., 1998; VELDHOEN e MILNER, 1998; WALKER e RAPLEY, 1999;
WONG et al., 1999; MUTO et al., 2000; SETOGUCHI et al., 2001; KREUZER e
MASSEY, 2002; LEE e KWEON, 2002).
Outras mutações, que ocorrem tanto em seqüências codificantes como não-
codificantes de DNA, podem afetar o funcionamento de um gene e sua proteína
codificada. Mutações pontuais na porção codificante de um gene podem criar um códon
53
prematuro de parada (nonsense), resultando na expressão de um polipeptídeo truncado
e em um fenótipo mutante. Por outro lado, mutações em regiões não-codificantes podem
alterar uma seqüência regulatória funcional, como um promotor ou sinal de iniciação,
levando a um aumento ou diminuição da expressão gênica. Inserções e deleções em
regiões codificantes e envolvendo múltiplos de três nucleotídeos, podem também
resultar na produção de polipeptídeos com comprimentos incorretos. Entretanto,
deleções ou inserções não envolvendo múltiplos de três nucleotídeos, resultarão em uma
mutação com deslocamento do quadro de leitura. Isto altera efetivamente o código,
impedindo a expressão de uma proteína funcional. Tanto inserções como deleções
podem também afetar a expressão de determinado gene, se alterarem seqüências
regulatórias associadas ao gene (WALKER e RAPLEY, 1999; KREUZER e MASSEY,
2002).
No desenvolvimento de tumores na espécie canina a inativação da forma “wild”,
ou não mutante, do gene p53, ocorre por uma série de mecanismos, incluindo as
aberrações cromossômicas estruturais como deleção, transições e translocação
(KRAEGEL et al., 1995; SETOGUCHI et al., 2001; LEE e KWEON, 2002). As
mutações ocorrem principalmente nos exons 3 – 8 (KRAEGEL, et al. 1995), entre os
exons 4-7 (CHU et al., 1998), 5 – 8 (HAGA, 2001) e 5 – 9 (ALBARIC et al., 2001)
determinando a perda do controle do ciclo celular e, como conseqüência, a
sobrevivência das células com alto grau de mutações (YORIKO et al., 2000).
Considerando a relevância médico-científica dos resultados obtidos a partir dos
estudos realizados com o gene p53, este trabalho foi realizado com o objetivo de
identificar a freqüência e os tipos de mutações no gene p53 em 22 cadelas com câncer
de mama; associar as mutações com os tumores malignos (carcinoma e carcinosarcoma)
e identificar alterações nas glândulas mamárias macroscopicamente e
54
microscopicamente normais, laterais aos tumores, visando ampliar os conhecimentos a
cerca do tumor mamário em cadelas e propiciar subsídios para o diagnóstico precoce
desta patologia .
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção das amostras
Foram utilizadas 9 amostras de carcinoma e 7 de tumor misto, com as
respectivas mamas normais laterais aos tumores e 6 amostras de cadelas normais, sem
nenhum sinal aparente de neoplasia mamária. Os fragmentos das mamas foram
submetidos a exame histopatológico de rotina para caracterizar o tipo de alteração
tumoral ou sua ausência. As cadelas tinham idades variando de 4 a 15 anos (com
neoplasia) e 1,5 a 6 anos (normais) com raças variadas.
Para análise do DNA os fragmentos coletados (± 1cm
3
) foram acondicionados
em tubos de criopreservação e congelados em nitrogênio líquido até a chegada ao
laboratório, onde foram armazenados à –20 °C (freezer).
Análise das mutações no gene p53
O DNA genômico foi extraído no laboratório de Fisiologia Animal e Molecular
Aplicada, UFRPE. De cada amostra, utilizou-se 0,5g de tecido, que foi macerado com
nitrogênio líquido. Após a completa maceração e evaporação do nitrogênio, em um tubo
cônico (SSI – Scientific Specialities Inc) de 1,5 ml devidamente identificado, foram
adicionados 100 µl de TE (Tris, 10 mM - Invitrogen life technologies e EDTA, 1 mM
pH 8,0- Sigma Chemical Co.) e 100 µl de fenol (Merck) equilibrado em pH 8,0. A
amostra foi homogeneizada por 1 min em um vortex (Phoenix) e centrifugada (SIGMA
2K15) a 17.968 g por 5 min a 4 °C. Em seguida o sobrenadante foi transferido para
55
outro tubo ao qual foi adicionado 100 µl de fenol-clorofórmio (1:1) (MANIATIS et al.,
1998), a amostra foi homogeneizada por 1 min e centrifugada a 17.958 g por 5 min. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo devidamente identificado onde foram
adicionados 100 µl de clorofórmio (Merck), misturado por 1 min e centrifugado a
17.968g por 5 min. Novamente em outro tubo, devidamente identificado, foram
adicionados: 10 µl de acetato de amônio 3 M (Cromato Produtos Químico LTDA), 100
µl do sobrenadante do tubo anterior (onde encontra-se o DNA) e 100 µl de isopropanol
(Merck). A mistura foi homogeneizada por 1 min e incubada por 30 minutos no freezer
a –20 °C, em seguida, centrifugada a 17.968g por 15 min, o sobrenadante foi
desprezado e o sedimento lavado com 500 µl de etanol 70% (Merck) por centrifugação
a 17.968g durante 5 min a 4 ºC. O etanol foi retirado e o sedimento deixado em
temperatura ambiente e ressuspendido em água ultra-pura. O DNA extraído foi
analisado em gel de agarose (Invitrogen life Technologies) a 2%, com marcador de peso
molecular fago-lambda, corado com brometo de etídeo, para análise em luz ultravioleta
e fotografado (ZoomBrowser-Canon – PowerShot S70 – Digital Câmara) para
verificação de sua qualidade.
Os oliginucleotídeos para amplificar os exons de 4 a 8 do gene p53 foram
desenhados segundo os dados previamente publicados (CHU et al., 1998) (Tab. 1).
As reações de PCR foram realizadas em um volume final de 20 µl contendo
50ng de DNA genômico, 20 mM Tris-HCl, pH 8.4; 50 mM KCl; 2 mM MgCl
2
, 0,2 mM
dNTP, 10 pmoles de cada oligonucleotídeo e 2,5 U Taq-polimerase (Invitrogen Life
Technologies Ltda). As amplificações foram feitas em termociclador (Eppendorf
Mastercycler personal) e consistiram de uma desnaturação inicial do DNA a 94 °C (2
min), seguida de 35 ciclos de 94 °C (1 min), 1 minuto da temperatura de anelamento
56
dos oligonucleotídeos (55 °, 58 ° ou 60 °C), 72 °C (1min) e um período de extensão
final de 3 minutos à 72 °C (CHU et al., 1998; MUTO et al., 2000).
Tabela 1 – Pares de oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos exons 4 a 8 do
gene p53 canino através da técnica de reação em cadeia da polimerase
(PCR)
Exons Oligonucleotídeos
Temperatura
de anelamento (°C)
4(S1)
5’: CTTGACTCTGGTCTCGCC
3’: GGGTAGGTCTTCGGGGAA
58
4(S2)
5’: CCCTATCATCCTCTGTCC
3’: GCCAGCCCCATGGAAACC
58
5(S1)
5’: GACCTGTCCATCTGTCCT
3’: ATAGATGGCCATAGCGCGG
58
5(S2)
5’:ACCCCACCCAATACCTG
3’: GCCTTGTCCCATCTGTAG
58
6 (S)
5’: TGATTCCTCCCCGATGGC/
3’: AGACCCCTCAGATGCCAA
55
7(S)
5’: ACCCTGGGCCTACCTTCTA/
3’: AGGGTGGCAGGCAGGTC
58
8 (S)
5’: GCTTCTCTCTTCTCACCTG/
3’: CTCCTTCACCTCCTCTTGT
58
Os produtos de amplificação foram analisados por eletroforeses em gel de
agarose a 2% corado com Brometo de Etídio, visualizados em transluminador de
ultravioleta e comparados com o marcador de peso molecular 50bp (DNA Ladder,
Invitrogen, USA) e fotodocumentados.
Os produtos obtidos pela PCR foram purificados usando protocolo comercial
(PureLink PCR Purification Kit, Invitrogen, USA) para remoção de sais e resíduos de
oligonucleotídeos e dNTPs.
O sequenciamento dos produtos de PCR foi realizado no Centro de Estudos do
Genoma Humano – Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, setor de
57
sequenciamento de DNA, onde foram processados em seqüenciador automático
(MegaBACE 1000) utilizando o DYEnamic ET Dye Terminator Kit (com Thermo
Sequenase™ II DNA Polimerase). As seqüências foram analisadas pelo software
Sequence Analyser utilizando Base Caller Cimarron 3.12. Cada sequenciamento foi
realizado com oligonucleotídeos sense e antisense.
As seqüências obtidas foram analisadas em programas de computação
específicos. Os arquivos foram lidos e a geração da fita reversa e complementar foi
realizada no CHROMAS (versão 2.01, 2005, cópia livre, www.technelysium.com.au).
Os produtos de PCR foram submetidos ao programa BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool , disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/index.shtml)
para análise de homologia com as seqüências disponíveis onde foram confirmadas as
amostras representativas da proteína expressa pelo p53 da espécie canina.
O alinhamento de nucleotídeos/proteínas foi obtido através de programa
Multalin (CORPET, 1988), disponível em:
http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html. Escolheu-se de cada amostra a
seqüência, sense ou antisense, que apresentou a melhor taxa de homologia com as
seqüências da proteína p53 canina depositadas no GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Inicialmente foram alinhadas as amostras de cadelas normais para identificar a
região da proteína mais conservada em cada exon e que seria utilizada para a busca por
mutações nas amostras de cadelas com tumor de mama.
Cada uma das amostras foi comparada com a seqüência de nucleotídeos do gene
p53 canino (GenBank - S77819) a fim de analisar as diferenças encontradas entre as
seqüências, considerando, inserções, deleções e trocas de bases, conforme o códon.
58
A freqüência dos tipos de mutações foi analisada através do teste de comparação
de proporções (REIS, 2003).
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Das 185 amostras amplificadas (Fig. 1), 174 foram seqüenciadas com os
oligonucleotídeos sense, tendo 94,0% de aproveitamento e, dentre elas, 107 amostras
(61,5%) apresentaram homologia com a proteína p53 canina (GenBank - AAB42022.1).
Das 174 amostras seqüenciadas com o oligonucleotídeo iniciador antisense, 169
(97,1%) foram seqüenciadas e, destas, 71,0% apresentaram homologia com a proteína
p53 canina (Tab. 2). A homologia entre as seqüências e a proteína foi, em média, de
86,3%, uma taxa alta que demonstra a especificidade dos oligonucleotídeos utilizados.
Figura 1 – Foto de gel de agarose a 2% referente às amostras amplificadas com o
oligonucleotídeo 4S1.
As seqüências de DNAs das cadelas normais, transcritas em aminoácidos e
alinhadas com a proteína p53 canina, permitiram selecionar as áreas mais conservadas
em cada exon e definir a posição dos códons na seqüência de nucleotídeos.
A quantidade de amostras seqüenciadas em cada exon variou de acordo com o
grupo estudado (Tab.2), sendo observado um resultado inferior com as seqüências
59
amplificadas com o oligonucleotídeo 6S. Neste caso, apesar da amplificação ter sido
obtida pela mudança da temperatura para 55°C, diferente dos 58°C propostos por Chu et
al. (1998), a maioria das amostras não teve sequenciamento satisfatório, demonstrando
uma possível instabilidade deste exon que de fato tem sido pouco utilizado pelos autores
(MAYR et al., 1994; KRAEGEL et al., 1995; MAYR et al., 1997) que estudaram as
mutações nos sítios quentes do gene p53 canino, ou seja, entre os exons 5 e 8 (CHU et
al. 1998).
60
Tabela 2 – Número de amostras amplificadas e enviadas para sequenciamento (AS), seqüenciadas (Seq) e com homologia para a proteína p53 canina
(p53) e respectivos percentuais (%) conforme os grupos e os exons estudados
CA MNCA CS MNCS CN
EXON
AS
Seq
% p53
%
AS
Seq
% p53
%
AS
Seq
% p53
%
AS
Seq
% p53
%
AS
Seq
% p53
%
4S1 9 9 100,0
9 100,0
8 8 100,0
7 87,5
7 7 100,0
6 85,7
7 7 100,0
7 100,0
6 6 100,0
4 66,7
4S2 8 8 100,0
1 12,5
7 7 100,0
6 85,7
5 5 100,0
0 0
7 7 100,0
5 71,40
5 4 80,0 4 80,0
5S1 5 5 100,0
5 100,0
7 7 100,0
6 85,7
3 3 100,0
3 100,0
2 2 100,0
2 100,0
0 0 0 0 0
5S2 0 0 0 0 0
9 9 100,0
5 55,5
0 0 0 0 0
7 7 100,0
3 42,8
5 5 100,0
5 100,0
6S 1 1 100,0
1 100,0
9 2 22,2 0 0
1 1 100,0
1 100,0
7 4 57,1 1 14,3
6 6 100,0
6 100,0
7S 5 4 80,0 4 80,0
5 5 100,0
5 100,0
3 3 100,0
3 100,0
3 3 100,0
3 100,0
1 1 100,0
0 0
8S 9 9 100,0
9 100,0
8 8 100,0
7 87,5
7 7 100,0
4 57,1
6 6 100,0
6 100,0
6 6 100,0
6 100,0
Total 37 36 97,3 29 80,5
53 46 86,8 36 78,3
26 26 100,0
17 65,4
39 36 93,9 27 75,0
29 28 96,5 25 89,3
CA-carcinoma; MNCA- mama normal lateral ao carcinoma; CS – carcinosarcoma; MNCS-mama normal lateral ao carcinosarcoma; CN – cadelas
normais
61
A análise comparada de 214 seqüências de nucleotídeos, de todas as amostras para cada
grupo e exons, com o gene p53, revelou que 32 (14,9%) delas não apresentavam alterações na
região conservada de cada exon.
Dentre as mutações observadas, as mais freqüentes, em todos os exons, foram as missense
(Tab. 3) para todos os grupos, inclusive com observação de mais de uma mutação por exon na
mesma amostra. Estas mutações também foram as mais freqüentes nos tumores estudados por
Wong et al. (1999) e Muto et al. (2000). Por outro lado, Muto et al. (2000) identificaram freqüência
de 20% nas mutações missenses, mais baixa do que as observadas neste trabalho, porém deve ser
considerado que estes autores utilizaram apenas as seqüências de três exons (5, 7 e 8). Enquanto
Kanaya et al. (2002) não encontraram mutações no p53 de tumores mamários em humanos, Chu et
al. (1998) identificou 15% de mutações no p53 dos carcinomas.
A alta freqüência de amostras com mutações (85%) nas cadelas com tumores, tanto nas
mamas afetadas como nas aparentemente normais, comparada aos resultados obtidos por outros
autores pode ser devido ao estágio de desenvolvimento dos tumores que se encontravam bastante
adiantados, até 20 cm de diâmetro, sem o risco de contaminações por células não neoplásicas
conforme foi salientado por Chu et al. (1998). Os outros autores não fizeram menção sobre as
características macroscópicas dos tumores (MAYR et al., 1994; KRAEGEL et al., 1995; MAYR et
al., 1997; CHU et al., 1998; WONG et al., 1999; MUTO et al., 2000).
As mamas normais laterais aos tumores apresentaram mutações missence similares às
encontradas nos tumores estudados (Tab. 3), demonstrando que as alterações podem estar presentes
precocemente nos tecidos, antes mesmo que possam ser detectadas no exame citológico ou
histopatológico.
Com relação às mutações nonsense, apesar de terem ocorrido em pequeno número,
observou-se que todos os casos foram referentes às amostras de mama normal das cadelas que já
apresentavam carcinomas ou carcinosarcomas. A presença destas mutações pode representar um
62
alto risco de aparecimento do tumor nestas mamas, pois as mutações nonsense inserem um código
de parada na tradução do RNA e, portanto, o peptídeo completo não se forma.
Tabela 3 – Número (n) e porcentagem dos tipos de mutações encontradas nas seqüências
amplificadas para 7 exons do gene p53 canino, conforme o grupo de tumor de mama
canino
CA
MNCA
CS
MNCS
Total % Tipos de
mutações
n %
N %
N %
n %
n
Missence 31 70,4
46 73,0
38 86,4
44 73,3
159 74,6
Nonsense
0 0
5 7,9
0 0
4 6,7
9 4,2
Silenciosa 1 2,3
2 3,2
5 6,8
5 8,4
13 6,1
Sem alteração 12 27,3
10 15,9
3 6,8
7 11,6
32 15,1
Total 44 100,0
63 100,0
44 100,0
60 100,0
213 100,0
CA-carcinoma; MNCA- mama normal lateral ao carcinoma; CS – carcinosarcoma; MNCS-mama normal lateral ao
carcinosarcoma
Considerando as mutações identificadas neste estudo (Tab. 4), os exons 5S1 e 8S foram os
mais alterados com 23,2% e 24,9% das mutações, respectivamente, estando de acordo com os
resultados obtidos por Chu et al. (1998), Muto et al. (2000) e Lee e Kweon (2002), que afirmaram
ser os exons 5, 7 e 8, regiões de sítio quente para as mutações. Por outro lado, Mayr et al. (2000)
estudaram o exon 1 e não detectaram mutações neste trecho do gene, o que corrobora as afirmações
dos outros autores sobre os sítios quentes. Apesar dos exons 5 e 8 terem apresentado a maior
ocorrência de mutações, os resultados deste trabalho demonstraram que há uma taxa de mutação
relevante no exon 4 (8,8% - 4S1 e 16,6% - 4S2). No estudo realizado por Setoguchi et al. (2001),
com vários tipos de tumores caninos, foram identificados 49 mutações e destas 37 (75,5%), estavam
localizadas na área de domínio central do gene p53 canino, que corresponde aos exons 4 a 8 do
gene p53 humano, os mesmos utilizados neste estudo e que apresentaram 85% de mutações.
63
Tabela 4 – Número e percentual de mutações encontradas em cada exon do gene p53 de mamas
caninas com tumores
Classificação da mutação
Exon
Missence Nonsense Silenciosa Total %
4S1 16 0 0 16 8,8
4S2 23 3 4 30 16,6
5S1 38 0 4 42 23,2
5S2 9 3 1 13 7,2
6S 4 0 0 4 2,2
7S 27 0 4 31 17,1
8S 42 3 0 45 24,9
TOTAL 159 9 13 181 100,0
Considerando as mutações missenses e nonsenses, as alterações de nucleotídeos mais
freqüentes foram as deleções de G (13,9%) e C (12,8%) e as inserções de A (10,7%) e T (13,3%). A
partir destes resultados foi possível identificar as mudanças nas bases e conseqüentemente nos
aminoácidos.
Quando a inserção ou deleção ocorreu na terceira base e não alterou o aminoácido,
foi considerada silenciosa (7,18%), por outro lado quando estas mutações alteraram a leitura dos
códons subseqüentes, foram consideradas missenses. Setoguchi et al. (2001) observaram que a
deleção de uma base (G) resultou na alteração dos 29 aminoácidos da seqüência da proteína.
Nas trocas das bases, detectou-se, na maioria, transversões (22,1%) e menor número de
transições (12,7%), discordando dos achados de Lee e Kweon (2002) que encontraram maior
porcentagem (16,66%) de transição. Comparando os grupos estudados, observou-se que esta
proporção se manteve exceto para as mamas acometidas por carcinoma, onde as transições foram
em maior número.
Na Tabela 5 estão apresentadas as trocas de aminoácidos que ocorreram em função das
mutações observadas nos diferentes exons e grupos. A repetição da mutação nos mesmos códons de
64
um exon se identifica com os pontos quentes sujeitos às alterações gênicas, sugerindo que
ocorreram alterações na função da proteína p53.
Foram consideradas as mutações nos pontos quentes do gene p53 canino, aquelas que
apresentavam mais de uma alteração no mesmo códon. Nos carcinomas os códons que
apresentaram mais de uma mutação e suas respectivas mudanças de aminoácidos foram o 109
(Val→Ser ou Val→Gly), 230 (Gly→Val ou Gly→Asp), nas mamas normais laterais ao carcinoma
as alterações ocorreram nos códons 77 (Leu→Cys ou Leu→Thr), 96 (Phe→Val ou Phe→Leu), 134
(Glu→Stop ou Glu→Ala), 138 (Arg→Ser ou Arg→Cys), 232 (Asn→Thr) e 244 (Arg→Glu ou
Arg→Stop). Nos carcinosarcomas os códons mais acometidos de mutações foram o 35 (Asp→Met),
93 (Asn→Ser), 109 (Val→Ser ou Val→Gly), 212 (Arg→Pro) e 251 (Glu→Val ou Glu→Asn). Nas
mamas normais laterais aos carcinosarcomas os códons que sofreram mais alterações foram o 35
(Asp→Met), 73 (Arg→Val), 77 (Leu→Thr ou Leu→Cys), o 87 (Trp→Stop ou Trp→Cys), 135
(Val→Asp), 230 (Glu→Asp ou Glu→Val), 231 (Arg→Leu ou Arg→Leu) e o 252 (Asn→Ile ou
Asn→Lys), conforme tabela 5.
Apesar da existência de repetições de mutações no mesmo códon, foi demonstrado que há
uma variação entre os códons mutados, pois, conforme Hainaut e Hollstein (2000), as mutações
podem estar distribuídas em mais de 250 códons da p53.
65
Tabela 5 – Descrição das mutações com as respectivas alterações nos aminoácidos e códons de cada
exon e grupo de tumores de mama em cadelas
Grupos
CA MNCA CS MNCS
Exons
AA Códon AA Códon AA Códon AA Códon
4S1
GAT→ATG
Asp→Met
35
-
-
CCA→ACCA
Pro→Thr
GTG→AGTG
Val→Ser
CCA→CACA
Pro→His
GAG→AGAAG
Glu→Arg
GAT→ATG
Asp→Met
GAT→ATG
Asp→Met
14
16
22
23
35
35
CTA→TAG
Leu→Thr
GAT→ATG
Asp→Met
GAT→ATG
Asp→Met
GCT→TCT
Ala→Ser
AGG→ACG
Arg→Thr
29
35
35
36
38
4S2 TTC→GTTC
Phe→Val
76
CGT→GTT
Arg→Val
CTG→TGC
Leu→Cys
CTG→ACTG
Leu→Thr
GCC→AGCC
Ala→Ser
GTT→GCTT
Val→Ala
TGG→TGA
trp→Stop
73
77
77
82
85
87
-
TTC→TCC
Phe→Ser
CGT→GTT
Arg→Val
CGT→GTT
Arg→Val
CTG→ACTG
Leu→Thr
CTG→TGC
Leu→Cys
ACT→CCT
Thr→Pro
TGG→TGA
Trp→Stop
TGG→TGA
Trp→Stop
TGG→TGC
Trp→Cys
72
73
73
77
77
86
87
87
87
5S1 CCT→CTC
Pro→Leu
CTC→ATC
Pro→Ile
CTC→CATC
Leu→His
AAG→AGA
Lys→Arg
GTC→TCA
Val→Ser
GTC→TCA
Val→Ser
GTC→TCA
Val→Ser
GTC→TCA
Val→Ser
GTG→GGG
Val→Gly
90
91
92
94
109
109
109
109
109
AAG→AGA
Lys→Arg
TTG→ATT
Leu→Ile
TTT→GTG
Phe→Val
TTT→TTA
Phe→Leu
TGC→TTG
Cys→Leu
GTC→TCA
Val→Ser
AGC→ATC
Ser→Ile
AAT→AAGT
Asp→Lys
94
95
96
96
97
109
110
116
TCC→GCC
Ser→Ala
TCC→GCC
Ser→Ala
AAC→AGC
Asn→Ser
AAG→AGT
Lys→Ser
CAG→AGC
Gln→Ser
TGC→GCC
Cys→Ala
TGG→TGT
Trp→Cys
GTC→TCA
Val→Ser
GTC→GGT
Val→Gly
AAT→AAGT
Asn→Lys
89
90
93
94
98
103
108
109
109
116
GTC→TCA
Val→Ser
AAT→AAGT
Asn→Lys
109
116
5S2
-
GTG→TGTG
Val→Cys
GAG→TGAG
Glu→Stop
GAG→TGAG
Glu→Stop
GAG→GCAG
Glu→Ala
GAG→GCAG
Glu→Ala
CGC→TCGC
Arg→Ser
CGC→TGC
Arg→Cys
CAC→ACC
His→Thr
132
134
134
134
134
138
138
141
-
AAG→TAA
Lys→Stop
GTT→GATT
Val→Asp
GTT→GATT
Val→Asp
127
135
135
6 CTG→TGG
Leu→Trp
170 - - CTG→TGG
Leu→Trp
170 GTG→GGTG
Val→Gly
181
7 ACC→CAT
Thr→His
AAC→CAAC
195
199
TCT→TTG
Se→Leu
ACC→AAC
191
194
CCA→CTA
Pro→Leu
GAG→CAG
186
188
-
-
66
Asn→Gln
ATG→ATTG
Met→Ile
GGA→GAG
Gly→Glu
AAC→AAAC
Asn→Lys
CGG→TCGG
Arg→Ser
207
208
211
213
Thr→Asp
ACC→CAT
Thr→His
ATC→TATC
Ile→Tyr
195
218
Glu-Gln
ACC→CCAT
Thr→Pro
TGT→TCGT
Cys→Ser
CGG→CGT
Arg→Pro
CGG→CGT
Arg→Pro
ACT→AACT
Thr→Asn
ACC→AAC
Thr→Asn
195
202
212
212
217
220
8 GGA→GTA
Gly→Val
GGA→GAC
Gly→Asp
GAC→AGA
Asp→Arg
GAG→GTAG
Glu→Val
GAG→AGG
Glu→Arg
230
230
245
251
258
CTG→TCTG
Leu→Ser
GGA→GAC
Gly→Asp
AAC→ACA
Asn→Thr
AAC→ACA
Asn→Thr
AGC→ATGC
Ser→Met
CGC→GCGC
Arg→Ala
GTT→AGCTT
Val→Ser
CCC→CACC
Pro→His
AGA→GAAGA
Arg→Glu
GAG→TGAG
Arg→Stop
AGA→TAGA
Arg→Stop
GAC→GAGC
Asp→Glu
229
230
232
232
233
237
238
242
244
250
244
245
GGA →GAC
Gly→Asp
CGC→GCGC
Arg→Ala
GAC→GAGC
Asp→Glu
GAG→GTAG
Glu→Val
GAG→GATG
Glu→Asn
AAT→ATAT
Asn→Ile
230
231
245
251
251
252
GGA→GAC
Gly→Asp
GGA→GTA
Gly→Val
CGC→GCGC
Arg→Ala
CGC→CTGG
Arg→Leu
AAC→ACA
Asn→Thr
AGC→ATGC
Ser→Met
GTT→AGCTT
Val→Ser
CGC→CGTC
Arg→Val
CGG→CCGG
Arg→Pro
AAT→AT
Asn→ Ile
AAT→AAGT
Asn→Lys
AAG→AATG
Lys→Asn
AAG→TAAG
Lys→Sotp
GAG→AGC
Glu→Ser
230
230
231
231
232
233
238
246
247
252
252
255
256
258
As mutações missense e nonsense nas seqüências do material proveniente de tumores
mamários podem resultar em alterações na estrutura tridimensional da proteína p53. Wong et al.
(1999) demonstraram que proteínas p53 mutantes na espécie humana, apresentam alterações no
domínio central de ligação ao DNA que comprometem sua conformação e conseqüentemente a
atividade da proteína. Estes mutações estão relacionadas especialmente com os códons 248 e 273,
que codificam o aminoácido arginina, responsável pela ligação da proteína ao DNA (Fig. 2) e os
códons 143 e 175 que garantem a conformação adequada para esta ligação (LEVINE, 1997).
67
Figura 2 – Esquema ilustrativo da proteína do p53 humano e os aminoácidos da área de domínio
central de ligação ao DNA com seus códons 120, 248, 273 e 277, os quais correspondem
aos códons 83, 212, 237 e 241, respectivamente, na espécie canina.
Fonte: http://www.geocities.com/apinop_hospital/esocancer/pic03.html
Considerando a homologia existente entre as seqüências caninas (Tab. 6) e entre diferentes
espécies para o gene p53 (Fig. 3), foi realizado o alinhamento das seqüências dos nucleotídeos do
gene p53 depositadas no GenBank para as espécies humana, canina, suína, ovina, bovina, eqüina e
murina a fim de detectar o percentual de homologia destas com a seqüência de p53 utilizada para as
análises deste trabalho. A homologia observada entre as espécies humana e canina foi de 86%,
estando acima do relatado por Chu et al. (1998), que identificaram 81% e Setoguchi et al. (2001),
79,7%, porém similar a Veldhoen e Milner (1998) que relataram 86,3% de homologia entre o gene
p53 canino e humano. Além da espécie humana observa-se que há alta homologia deste gene canino
com o mesmo gene de eqüinos (88%), suínos (86%), ovinos e bovinos (84%) e camundongos e
ratos (81%).
As seqüências do gene p53 são compostas de 828 e 883 nucleotídeos, respectivamente para
canino e humano, sendo que o trecho com identidade obtida no BLAST, foi de apenas 626
nucleotídeos, Veldhoen e Milner (1998) e Kraegel et al. (1995) justificaram esta diferença de
68
tamanho nas seqüências como sendo devida à deleções nas regiões ricas em prolina do p53 canino,
que ocorreram durante a evolução.
A partir desta homologia com a espécie humana foi possível analisar os códons que na
espécie canina estão relacionados com a ligação da proteína ao DNA (Fig.2), ou seja, 212 e 237,
bem como os responsáveis pela conformação estrutural que estão nas posições 106 e 138, todos no
domínio central da ligação ao DNA. Apesar de apenas algumas amostras terem apresentado
mutações nestes códons, a maioria das alterações se localizaram em códons próximos e, além disso,
as inserções e deleções de nucleotídeo, predominantes entre as mutações missenses, provavelmente
acarretam a leitura incorreta da seqüência e conseqüente comprometimento da estrutura e função do
peptídeo (WALKER e RAPLEY, 1999; KREUZER e MASSEY, 2002).
69
101 150
Canino SSVPSPKTYPGTYGFRLGFLHSGTAKSVTWTYSPLLNKLFCQLAKTCPVQ
Humano SSVPSQKTYQGSYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKMFCQLAKTCPVQ
Bovino SFVPSQKTYPGNYGFRLGFLQSGTAKSVTCTYSPSLNKLFCQLAKTCPVQ
Ovino SFVPSQKTYPGNYGFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPSLNKLFCQLAKTCPVQ
Suino SFVPSQKTYPGSYDFRLGFLHSGTAKSVTCTYSPALNKLFCQLAKTCPVQ
Rato SSVPSQKTYQGNYGFHLGFLQSGTAKSVMCTYSISLNKLFCQLAKTCPVQ
Camundongo SFVPSQKTYQGNYGFHLGFLQSGTAKSVMCTYSPPLNKLFCQLAKTCPVQ
Equino ........................................CQLAKTCPVQ
Consenso s.vpsqkty.g.ygfrlgfl.sgtaksvtctysp.lnklfCQLAKTCPVQ
151 200
Canino LWVSSPPPPNTCVRAMAIYKKSEFVTEVVRRCPHHERCSDSSDGLAPPQH
Humano LWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSD.SDGLAPPQH
Bovino LWVDSPPPPGTRVRAMAIYKKLEHMTEVVRRCPHHERSSDYSDGLAPPQH
Ovino LWVDSPPPPGTRVRAMAIYKKLEHMTEVVRRSPHHERSSDYSDGLAPPQH
Suino LWVSSPPPPGTRVRAMAIYKKSEYMTEVVRRCPHHERSSDYSDGLAPPQH
Rato LWVTSTPPPGTRVRAMAIYKKSQHMTEVVRRCPHHERCSD.GDGLAPPQH
Camundongo LWVSATPPAGSRVRAMAIYKKSQHMTEVVRRCPHHERCSD.GDGLAPPQH
Equino LLVSSPPPPGTRVRAMAIYKKSEFMTEVVRRCPHHERCSDSSDGLAPPQH
Consenso LwVsspPPpgtrVRAMAIYKks#.mTEVVRRCPHHERcSD.sDGLAPPQH
201 250
Canino LIRVEGNLRAKYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDYTTIHYNYMCNSSCM
HUMANO LIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNYMCNSSCM
Bovino LIRVEGNLRAEYLDDRNTFRHSVVVPYESPEIDSECTTIHYNFMCNSSCM
Ovino LIRVEGNLRAEYFDDRNTFRHSVVVPYESPEIESECTTIHYNFMCNSSCM
Suino LIRVEGNLRAEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNFMCNSSCM
Rato LIRVEGNPYAEYLDDRQTFRHSVVVPYEPPEVGSDYTTIHYKYMCNSSCM
Camundongo LIRVEGNLYPEYLEDRQTFRHSVVVPYEPPEAGSEYTTIHYKYMCNSSCM
Equino LIRVEGNLRAEYLDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYNFMCNSSCM
Consenso LIRVEGNlraeYL#DR#TFRHSVVVPYEpPEvgS#cTTIHYn%MCNSSCM
251 300
Canino GGMNRRPILTIITLEDSSGNVLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENFHKKG
Humano GGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEKENLRKKG
Bovino GGMNRRPILTIITLEDSCGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENLRKKG
Ovino GGMNRRPILTIITLEDSRGNLLGRSSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKG
Suino GGMNRRPILTIITLEDASGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENFLKKG
Rato GGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRDSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKE
Camundongo GGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRDSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKE
Equino GGMNRRPILTIITLEDSSGNLLGRNSFEVRVCACPGRDRRTEEENFRKKE
Consenso GGMNRRPILTIITLEDSsGNlLGR#SFEVRVCACPGRDRRTEeENfrKKg
Simbolos do Consenso: ! = I ou V; $ = L ou M; % = F ou Y; # = qualquer NDQEBZ
Figura 3 - Alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína p53 de diferentes espécies, com
destaque (barra) aos domínios (II a V) que se mantiveram conservados entre as espécies.
II
III
IV
V
70
Tabela 6- Relação de tamanho em aminoácidos (aa) e percentual de homologia entre as seqüências
de p53 canina depositadas no GenBank
Nome Tamanho(aa) Nome Tamanho(aa) Homologia (%)
AAB42022.1 276 AAB16961.1 285 94
AAB42022.1 276 AAC37335.1 281 74
AAB42022.1 276 AAD42225 246 79
AAB42022.1 276 AAC16909 381 100
AAB42022.1 276 BAA78379 381 100
AAB16961.1 285 AAC37335.1 281 71
AAB16961.1 285 AAD42225 246 77
AAB16961.1 285 AAC16909 381 92
AAB16961.1 285 BAA78379 381 92
AAC37335.1 281 AAD42225 246 99
AAC37335.1 281 AAC16909 381 100
AAC37335.1 281 BAA78379 381 100
AAD42225 246 AAC16909 381 99
AAD42225 246 BAA78379 381 99
AAC16909 381 BAA78379 381 99
Os resultados deste estudo indicaram que as alterações no gene p53 estão envolvidas na
carcinogênese do tumor mamário canino. Além disso, as alterações podem estar presentes
precocemente nos tecidos, pelo fato das mutações terem sido detectadas não somente nos tumores,
mas também nas mamas macroscópica e histologicamente normais, laterais aos tumores. Isto pode
justificar a retirada cirúrgica de toda a cadeia mamária do lado afetado a fim de evitar as recidivas e
servir como uma ferramenta de diagnóstico precoce para tumores mamários caninos.
O conhecimento dos eventos moleculares da tumorogênese canina irá proporcionar melhor
entendimento do câncer nesta espécie. Considerando que os cães apresentam freqüência de tumor
mamário maior do que na mulher e que dividem com os humanos o mesmo habitat e, em alguns
casos, estão sujeitos aos mesmos fatores de risco (dieta, fatores ambientais, estresse, etc), e que há
uma alta homologia da p53 canina com a humana, pode ser indicada a utilização da espécie canina
como modelo de estudo para as neoplasias de mama humana.
71
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBARIC, O.; BRET, L.; AMARDEIHL, M.; DELVERDIER, M. Immunohistochemical
expression of p53 in animal tumors: a methodological study using four anti-human p53 antibodies.
Histology and Histopathology: Cellular and Molecular Biology, Murcia, v.16, p. 113-121, 2001.
CASSALI, G. D. Patologia da glândula mamária. In: NASCIMENTO, E. F.; SANTOS, R. L.
Patologia da reprodução dos animais domésticos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003. cap.
12, p. 119-133.
CAVALCANTI JÚNIOR, G.B.; KLUMB, C.E.; MAIA, R.C. p53 e as hemopatias malignas.
Revista Brasileira de Cancerologia, Rio de Janeiro, v.48, n.3, p. 419-427, 2002.
CHU, L.L.; RUTTEMAN; G.R., KONG; J.M.C.; GHAHREMANI, M.; SCHMEING, M.;
MISDORP, W.; VAN GARDEREN, E.; PELLETIER, J. Genomic organization of the canine p53
gene and its mutation status in canine mammary neoplasia. Breast Cancer Research Treatment,
Haque, v. 50, p. 11-25, 1998.
CORPET, F. Multiple sequence alingment with hierarchial clustering. Nucleic Acids Research,
Oxford, v. 16, n. 22, p. 10890-10890, 1988.
COTRAN, R.S.; KUMAR,V.; ROBBINS, S.L. Patología estrutural e funcional. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2000. 6 ed. 1400p.
DOBSON, J. M.; Princípios da terapia do cancer. In: DUNN, J. K. Tratado de Medicina
Veterinária de Pequenos Animais. São Paulo: Ed. Rocca, 2001. p. 979-1022.
FARAH, S. B. DNA no diagnóstico de doenças humanas. In: DNA segredos e mistérios. São
Paulo: Sarvier, cap. 5, p. 103-140, 2000.
FARIAS, R.E; SOUZA, A. R.; ARESTRUP, F. M. Avaliação da apoptose no carcinoma ductal
infiltrante da mama: associação com graus histológicos e fatores prognósticos. Revista Brasileira
de Cancerologia, v. 51, n. 3, p. 209-218, 2005.
FETT-CONTE, A.C.; SALLES, A.B.C.F. A importância do gene p53 na carcinogênese humana.
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, São José do Rio Preto, v.24, n.2, 2002.
Disponível: www.sielo.com.br. Acesso em: 09/02/2006.
HAGA, S.; NAKAYAMA, M.; TATISUMI, K.; MAEDA, M.; IMAI, S.; UMESAKO, S.;
YAMAMOTO, H. HILGERS, J.; SARKAR, N. H. Overexpression of the p53 gene product canine
mammary tumors. Oncology reports, v. 8, p. 1215-1219, 2001.
HAINAUT, P.; HOLLSTEIN, M. p53 and human cancer: the first thousand mutations. Advances in
Cancer Research, New York, v. 77, p. 81-137, 2000.
ITOH, T.; UCHIDA, K.; ISHIKAWA, K. KUSHIMA, K. KUSHIMA, E. TAMADA, H.
MORITAKE, T. NAKAO, H.; SHII, H. Clinicopathological surgy of 101 canine mammary gland
tumors: differences between small-breed dogs and others. Journal of Veterinary Medical Science,
Tokyo, v. 67, n. 3, p. 345-347, 2005
KANAYA, N.; OKUDA, M.; TOYAMA, N.; OIKAWA, T.; INOKUMA, H.; MORIMOTO, M.;
HAYASHI, T,; UNE, S.; NAKAICHI, M.; TAURA, Y.; TSUJIMOTO, H.; ONISHI, T. Detection
of anti-p53 antibodies in dog with tumors. Journal Veterinary Medicine Science, Tokyo, v.64,
n.11, p. 973-979, 2002.
KARAYANNOPOULOU, M.; KAALDRYMIDOU, E.; CONSTANTINIDIS, T. C.; DESSIRIS, A.
Histological grading and prognosis in dogs with mammary carcinomas: application of a human
grading method. Journal of Comparative Pathology, Edinburgh, v. 133, p. 246-252, 2005.
72
KRAEGEL, S. A.; PAZZI, K. A.; MADEWELL, B. R. Sequence analysis of canine p53 in the
region of exons 3 – 8. Cancer Letter, v. 92, p. 181-186, 1995.
KREUZER, H.; MASSEY, A. A genética molecular do câncer. In: Engenharia genética e
biotecnologia. 2ª ed. São Paulo: Artmédica, 2002. p.272-276
LEE, C.; KWEON, O. K. Mutation of canine tumor supresor gene p53 in a mammary gland
adenocarcinoma and a malignant mast cell tumor. Journal Veterinary Clinical, n. 19, v.2, p. 195-
198, 2002.
LEVINE, A.J. p53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell, Cambridge, v. 88, p. 323-
331, 1997.
LEWIN, B. Ciclo celular e regulação do crescimento. In: Genes VII. Porto Alegre: Artmed, 2001.
cap. 27, p.799 – 829
LOUKOPOULOS, P.; THORNTON, J.R.; ROBINSON, W.F. Clinical and pathologic relevance of
p53 index in canine osseous tumors. Veterinary Pathology, Washington, v. 40 p. 237-248, 2003.
LOURO I.D. Oncogenética. Revista da Sociedade Brasileira de Cancerologia, n.11, p. 36-42,
2000.
MANIATIS, T., FRITSCH, E. F., SAMBROOK, J. (Eds.) Molecular Cloning: a laboratory
manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, v.1-3, 1998.
MAYR, B.; SCHELLANDER, K.; SCHLEGER, W.; REIFINGER, M. Sequence of an exon of the
canine p53 gene-mutation in a papiloma. British Veterinary Journal, Vienna, v.150, n. 1, p.81-84,
1994.
MAYR, B.; SCHELLANDER, K; BOTTO, I.; REIFINGER, M.; LOUPAL, G. Canine tumour
suppressor gene p53-mutation in a case of adenoma of circumanal glands. Veterinary Research
Communications, Viena, v.21, n.5, p. 369-373, 1997.
MAYR, B.; RESCH, S.; HEPPERLE, S.; BREM, G.; REIFINGER, M.; SCHAFFNER.
Comparative studies in the promoter and exon 1 regions of tumor suppressor p53 in several
mammalian species: Absence of in a panel of spontaneous domestic animal tumours. Journal
Veterinary Medicine. Vienna, v. 47, p. 593-597, 2000.
MOURA-GALLO, C. V.; SIMÃO, T. A.; RIBEIRO, F. S.; SERPA, M. J. A.; CARDOSO, L. E.
B.; MENDONÇA, G. A. S.
Mutações no gene TP53 em tumores malignos de mama: associação
com fatores de risco e características clínico-patológicas, inclusive risco de óbito, em pacientes
residentes no Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Epidemiologia, Rio de Janeiro, v.7, n.2,
p.167-175 , 2004.
MUTO, T.; WAKUI, S.; TAKAHASHI, H.; MAEKAWA, S.; MASAOKA, T.; USHIGOME, S.;
FURUSATO, M. p53 Gene Mutations Occurring in Spontaneous Benign and Malignant Mammary
Tumors of the Dog. Veterinary Pathology, Washington, v. 37, p. 248–253, 2000.
NETO, L. Z. Neoplasias malignas em cães. Sua analogia com alguns processos idênticos na espécie
humana. UNIMAR CIÊNCIAS, Marília, v. 1, p. 4-9, 1992.
NETO, L. N. Tumores mamários malignos na cadela. São Paulo: Arte & Ciência, 1997.144p.
O’KEEFE, D. A. Tumores do sistema genital e glândulas mamárias. In: ETTINGER, S. A.;
FELDMAN, E. C. Tratado de medicina interna veterinária. São Paulo: Manole, 1997. v. 2, p.
2344 – 2351
PAZZI, A. K; KRAEGEL, S. A.; GRIFFEY, S. M.; THEON, A. P.; MADEWELL, B.R. Analysis
of the equine tumor suppressor gene p53 in the normal horse and in eight cutaneus squamous cell
carcinomas. Cancer Letter, California, v. 107, p. 125-130, 1996.
73
PÉREZ, A. M. D.; TABANERA, E.; PEÑA, L. Inflammatory mammary carcinoma in dogs: 33
cases (1995-1999). Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v.
219, n. 15, p. 1110 – 1114, 2001.
QUEIROGA, F. L.; PÉREZ-ALENZA, M. D.; SILVAN, G.; PEÑA, L.; LOPES, C.; ILLERA, J. C.
Role of steroid hormones and prolactin in canine mammary cancer. Journal of Steroid
Biochemistry and Molecular Biology, Oxford, n. 94, p. 181-187, 2005.
REIS, J.C. Estatística aplicada à pesquisa em ciência veterinária. Olinda: Luci Artes Gráficas,
2003. 651p.
SETOGUCHI, A.; SAKAI, T.; OKUDA, M.; MINIHATA, K.; YAZAWA, M.; ISHIZAKA, T.;
WATARI, T.; NISHIMURA, R.; SASAKI, N.; HASEGAWA, A.; TSUJIMOTO, H. Aberrations
of the p53 tumor suppressor gene in various tumors in dogs. American Journal of Veterinary
Research, Chicago, v. 62, n.3, p. 433-439, 2001.
VELDHOEN, N.; MILNER, J. Isolation of canine p53 cDNA and detailed chracterization of full
length canine p53 protein. Oncogene, Basingstoke, v. 16, p. 1077-1084, 1998.
WALKER, M.R.; RAPLEY, R. Guia de rotas na tecnologia do gene. São Paulo: Atheneu, 1999.
334p.
WONG, K.; DEDECKER, BS.; FREUND, S.M.V.; PROCTOR, M.R.; BYCROFT, M.; FERSHT,
A.R. Hot-spot mutants of p53 core domain evince characteristic local structural changes.
Proceedings of the National Academy of Science. U.S.A., Washington, v.96, n. 15, p.8438-8442,
1999.
YORIKO, J.; TEIXEIRA, L. C.; GURGEL, M. S. C.; ALVARENG, M.; BRENELLI, H. B.
Correlação entre a expressão da proteína p53 e a resposta a quimioterapia primária no carcinoma
mamário. Acta Oncológica Brasileira, São Paulo, v.20, n.1, p. , 2000.
ZUCCARI, A. P. C.; SANTANA, A. E.; ROCHA, N. S. Correlação entre a citologia aspirativa por
agulha fina e a histologia no diagnóstico de tumores mamários de cadelas. Brazilian Journal
Veterinary Research Animal Science, São Paulo, v. 38, n.1, p. 38-41, 2001a.
74
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A alta malignidade dos tumores mamários em cadelas, comprovada neste trabalho pela
presença de carcinomas e carcinosarcomas em maior freqüência, ressalta a importância dos estudos
a respeito desta patologia nesta espécie, uma vez que comprometem a qualidade de vida destes
animais. É importante considerar que a detecção de células neoplásicas em mamas
macroscopicamente normais reflete a importância da retirada precoce das mamas adjacentes, em
animais que apresentam nódulos mamários.
O envolvimento do gene p53 no controle das neoplasias torna-se notório, especialmente nas
mamas afetadas, mas também como indicativo precoce de mutações em mamas que são
consideradas histologicamente normais.
Diante dos resultados encontrados podemos considerar a pesquisa com o gene p53 de grande
importância para o estudo e conhecimento dos cânceres.
Fundamentalmente a identificação precoce desta doença, carece de respostas rápidas, a fim
de controlar seu desenvolvimento e evitar que outras áreas sejam atingidas através das metástases.
O sucesso do tratamento está diretamente relacionado com o diagnóstico tumoral, muito
antes que tenham a chance de se transformar em uma ameaça à vida. E o conhecimento da biologia
molecular, permite melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na carcinogênese, tornando-se
um importante instrumento para aprimorar e padronizar técnicas de detecção das mutações que
desencadeiam a progressão tumoral.
A importância médica deste gene é inegável, pela detecção de mutações nos tecidos
tumorais estudados indicando ser um alvo perfeito para prevenção, estimulando as abordagens de
terapia gênica.
Este trabalho caracteriza o início de uma linha de pesquisa, cujos resultados serão
necessários para que o conhecimento e, principalmente, o entendimento perfeito de todas as
possibilidades de interação de um determinado gene em seu sistema, possa estabelecer uma
75
metodologia de reparo genético de um desarranjo funcional, visando o restabelecimento do fenótipo
normal fisiológico ou, no caso das células tumorais, seu extermínio, levando-as à apoptose, ao
mesmo tempo que se poupa as células normais ao redor delas.
A história da biologia molecular e de sua evolução exuberante nesta última década traz
inúmeras possibilidades futuras de entendimento, de controle e de cura, a qual nada mais é do que o
restabelecimento da função normal de qualquer célula.
76
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALBERTS, B.; BRAY, D.; LEWIS, J.; et al. A mecânica da divisão celular. In: ALBERTS, B.;
BRAY, D.; LEWIS, J.; et al. Biologia molecular da célula. São Paulo: Artes Médicas Sul, 1997.
cap. 18, p. 911 – 946
ARGYLE, D.J. The mammary gland. In: SIMPSON, G. Manual of Small Animal Reproduction
and Neonatology, Cheltenham: BSVA, 1998. cap. 5, p. 53-59
BANKS, W. J. Sistema tegumentar. In: BANKS Histologia veterinária aplicada. São Paulo:
Manole, 1992, cap. 20, p. 391-424.
BEGNAMI, M. D.; CAMPOS, A. H. J. M.; MONTAGNINI, A.; NASCIMENTO, C. F.;
NONOGAKI, S.; SOAREAS, F. Expressão imunohistoquímica de c-erb-B
2
e p53 em carcinomas
gástricos. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, Rio de Janeiro, v. 41, n. 4, p.
279-286, 2005.
BHARAJ, B. S.; ANGELOPOULOU, K. DIAMANDIS, E. P. Rapid sequencing of p53 gene with a
new automated DNA sequencer. Clinical Chemistry, Baltimore, v. 44, n. 7, p. 1397, 1998.
CAIRNS, J. The interface between molecular biology and cancer research. Mutation Research,
Amsterdan, v. 462, p.423-428, 2000.
CARRUIDO, A. C. C.; SALAS Y.; ORLANDO, E.; MENDEZ, D. Incidencia de las neoplasias de
glándula mamaria en caninos diagnosticadas por histopatología.
www.monografias.com/trabajos15/tumores-caninos/tumores-caninos.html, 2003.
CASSALI, G. D. Patologia da glândula mamária. In: NASCIMENTO, E. F.; SANTOS, R. L.
Patologia da reprodução dos animais domésticos. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2003. cap.
12, p. 119-133.
CASSALI, G.D. Estudos morfológicos, imunohistoquímicos e citométrico de tumores
mamários da cadela – aspectos comparativos com neoplasias da mama humana. 2000. 73f.
Tese (Doutorado em Ciência Animal – Patologia – Escola de Veterinária – UFMG).
CAVALCANTI JÚNIOR, G.B.; KLUMB, C.E.; MAIA, R.C. p53 e as hemopatias malignas.
Revista Brasileira de Cancerologia, Rio de Janeiro, v.48, n.3, p. 419-427, 2002.
CHU, L.L.; RUTTEMAN; G.R., KONG; J.M.C.; GHAHREMANI, M.; SCHMEING, M.;
MISDORP, W.; VAN GARDEREN, E.; PELLETIER, J. Genomic organization of the canine p53
gene and its mutation status in canine mammary neoplasia. Breast Cancer Research Treatment,
Haque, v. 50, p. 11-25, 1998.
COTRAN, R.S.; KUMAR,V.; ROBBINS, S.L. Patología estrutural e funcional. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2000. 6 ed. 1400p.
CUNNINGHAM, J. G. A glândula mamária. In: Tratado de fisiologia veterinária. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2004.cap. 38, p. 417-430
DAL BELLO, C. P.; SOUZA, G.; LAURENTI, M.; SOUZA, T. V. G. Aconselhamento genético
no cancer. 2002 http://www.sitemedico.com.br/artigos/estudantes/Famerp/ acons_gen2.asp Acesso
em: 01/10/2002
DALECK, C. R. Tumor mamário canino. Clínica Veterinária, São Paulo, n. 2, v. 1, p.12-14, 1996.
DE NARDI, A.B. ; RODASKI, S. ; SOUSA, R.S.; COSTA, T.A.; MACEDO, T.R.; RODIGHERI,
S.M. ; RIOS, A. ; PIEKARZ, C.H. Prevalência de neoplasias e modalidades de tratamentos em
cães, atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná. Archives of
Veterinary Science, Curitiba, v.7, n.2, p.15-26, 2002.
77
DOBSON, J. M.; Princípios da terapia do cancer. In: DUNN, J. K. Tratado de Medicina
Veterinária de Pequenos Animais. São Paulo: Ed. Rocca, 2001. p. 979-1022.
DONNAY, I.; DEVLEESCHOUWER, N.; WOUTERS-BALLMAN, P.; LECLERCQ, G.;
VERSTEGEN, J. Relationship between receptors for epidermal growth factor and steroid hormones
in normal, dysplastic and neoplastic canine mammary tissues. Research in Veterinary Science,
London, v. 60, p. 251-254, 1996.
FARAH, S. B. DNA no diagnóstico de doenças humanas. In: DNA segredos e mistérios. São
Paulo: Sarvier, cap. 5, p. 103-140, 2000.
FARIAS, R.E; SOUZA, A. R.; ARESTRUP, F. M. Avaliação da apoptose no carcinoma ductal
infiltrante da mama: associação com graus histológicos e fatores prognósticos. Revista Brasileira
de Cancerologia, Rio de Janeiro, v. 51, n. 3, p. 209-218, 2005.
FETT-CONTE , A.C.; SALLES, A. B. F. A importância do gene p53 na carcinogênese humana.
Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, Santos, v. 24, n. 2, p. 85-89, 2002.
FOSSUM, T. W.; HEDLUND, C. S.; HULSE, D. A.; JOHNSON, A. L.; SEIM, H. B.; WILLARD,
M. D.; CARROLL, G. L. Cirurgia dos sistemas reprodutivos e genitais In: Cirurgia de pequenos
animais. São Paulo: Roca, 2002. cap. 13, p. 571-637
GENESER, F. Glândulas mamárias. In: GENESER, F. Histologia, 3ª edição, Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2000. p. 538-542
GUYTON, A.C.; HALL, J.E. Tratado de Fisiologia Médica, Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
1997. 1014p.
HAGA, S.; NAKAYAMA, M.; TATISUMI, K.; MAEDA, M.; IMAI, S.; UMESAKO, S.;
YAMAMOTO, H. HILGERS, J.; SARKAR, N. H. Overexpression of the p53 gene product canine
mammary tumors. Oncology reports, v. 8, p. 1215-1219, 2001.
HAINAUT, P.; HOLLSTEIN, M. p53 and human cancer: the first thousand mutations. Advaces in
Cancer Reseach, New York, v. 77, p. 81-137, 2000.
HENDERSON, B.E.; FEIGELSON, H.S. Hormonal carcinogênesis. Carcinogenesis, Oxford, v.
21, n.3, p. 427-433, 2000.
HENSON, K. L. Sistema reprodutor. In: RASKIN, R. E.; MEYER, D. J. Atlas de citologia de cães
e gatos, São Paulo: Roca, 2003. Cap. 11, p.233-250.
HILL, K.A.; SOMMER, S. p53 as mutagen test in breast cancer. Environment Molecular
Mutagenesis, New York, v. 39, p.216-217, 2002
HOWARD, E. E.; DELAHUNTA. Abdome, pelve e membro pélvico. In: Guia para a dissecção
do cão. Rio de Janeiro: Guanabara, 2001. p. 117-119
HUNTER, T. Braking the cycle. Cell, Cambridge, v. 75, p. 839-841, 1993.
KOLB, E. Fisiologia da Glândula Mamária. In: KOLB, E. (ed.) Fisiologia Veterinária, Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 1984. p. 413-430.
KRAEGEL, S. A.; PAZZI, K. A.; MADEWELL, B. R. Sequence analysis of canine p53 in the
region of exons 3 – 8. Cancer Letter, Oxford, v. 92, p. 181-186, 1995.
78
KREUZER, H.; MASSEY, A. A genética molecular do câncer. In: Engenharia genética e
biotecnologia. 2ª ed. São Paulo: Artmed, 2002. p.272-276
LEE, C.; KWEON, O. K. Mutation of canine tumor supresor gene p53 in a mammary gland
adenocarcinoma and a malignant mast cell tumor. Journal Veterinary Clinical, n. 19, v.2, p. 195-
198, 2002.
LERA, J.M.; NAPAL, C.; DELGADO, M.G.; GARCÍA, G.L.; ABASCAL, L.; VICENTE, F.
Detección de mutaciones en el gen p53 en el cancer de mama familiar y esporádico en la
población Navarra. http//www.cfnavarra.es/salud/anales. Acesso em: 12/02/2006.
LEWIN, B. Ciclo celular e regulação do crescimento. In: Genes VII. Porto Alegre: Artmed, 2001.
cap. 27, p.799 – 829
LOPES, A. A.; OLIVEIRA, A. M.; PRADO, C. B. C. Principais genes que participam da formação
de tumores. Revista Brasileira de Ciências da Terra, v. 2, n. 2, 2002.
LOUKOPOULOS, P.; THORNTON, J.R.; ROBINSON, W.F. Clinical and pathologic relevance of
p53 index in canine osseous tumors. Veterinary Pathology, Washington, n. 40 p. 237-248, 2003.
LOURO I.D. Oncogenética. Revista da Sociedade Brasileira de Cancerologia, n.11, p. 36-42,
2000.
LUIZ, C. R.; MIGLINO, M. A.; SANTOS, T.C. Segmentos anatómo-cirurgicos arteriais da
glandula mamária em cães (canis familiaris, Linnaeus, 1758). Archives of Veterinary Science,
Curitiba, v.7, n.1, p. 27-36, 2002.
MARQUES, N. B. Avaliação dos hormônios tireoideanos de fêmeas da espécie canina com
tumores de mama. Recife, 2000. Dissertação Mestrado, Universidade Federal Rural de
Pernambuco.
MIALOT, J. P. Patologia da mama. In: Patologia da reprodução dos carnívoros domésticos.
Porto Alegre: A Hora Veterinária, 1988. 160p.
MIYASHITA, T.; KRAJEWSKI, S.; KRAJEWSKI, M.; WANG, H. G.; LIN, H. K.; LIBERMANN
D. A. et al. Tumor suppressor p53 is a regulator of bcl-2 and bax gene expression in vitro and in
vivo. Oncogene, Basingstoke, v. 9, p.1799-805, 1994.
MORRISON, W.B. Cancers in dogs and cats. Medical and surgical management. Philadelphia:
Willians & Wilkins, 1998. 785p.
MOULTON, J.E. (Ed.) Tumours in domestic animals. 3 ed. Berkeley: University of California,
1990. 672p.
MOURA-GALLO, C. V.; SIMÃO, T. A.; RIBEIRO, F. S.; SERPA, M. J. A.; CARDOSO, L. E.
B.; MENDONÇA, G. A. S.
Mutações no gene TP53 em tumores malignos de mama: associação
com fatores de risco e características clínico-patológicas, inclusive risco de óbito, em pacientes
residentes no Rio de Janeiro. Revista Brasileira de Epidemiologia, Rio de Janeiro, v.7, n.2,
p.167-175 , 2004.
MUTO, T.; WAKUI, S.; TAKAHASHI, H.; MAEKAWA, S.; MASAOKA, T.; USHIGOME, S.;
FURUSATO, M. p53 Gene Mutations Occurring in Spontaneous Benign and Malignant Mammary
Tumors of the Dog. Veterinary Pathology, Washington, v. 37, p. 248–253, 2000.
NETO, L. N. Tumores mamários malignos na cadela. São Paulo: Arte & Ciência, 1997.144p.
NETO, L. Z. Neoplasias malignas em cães. Sua analogia com alguns processos idênticos na espécie
humana. Unimar Ciências, Marília, v. 1, p. 4-9, 1992.
79
O’KEEFE, D. A. Tumores do sistema genital e glândulas mamárias. In: ETTINGER, S. A.;
FELDMAN, E. C. Tratado de medicina interna veterinária. São Paulo: Manole, 1997. v. 2, p.
2344 – 2351
OLIVEIRA, E. C. S.; MARQUES JÚNIOR, A. P.; NEVES, M. M. A. Endocrinologia reprodutiva e
controle da fertilidade da cadela – revisão. Archives of Veterinary Science, Curitiba, v. 8, n. 1, p.
1-12, 2003.
PERERA, F. P.; WEINSTEIN, I.B. Molecular epidemiology: recent advances and future directions.
Carcinogenesis, Oxford, v. 21, p. 517-24, 2000.
PÉREZ, A. M. D.; TABANERA, E.; PEÑA, L. Inflammatory mammary carcinoma in dogs: 33
cases (1995-1999). Journal of the American Veterinary Medical Association, Schaumburg, v.
219, n. 15, p. 1110 – 1114, 2001.
QUEIROGA, F. L.; PÉREZ-ALENZA, M. D.; SILVAN, G.; PEÑA, L.; LOPES, C.; ILLERA, J. C.
Role of steroid hormones and prolactin in canine mammary cancer. Journal of Steroid
Biochemistry and Molecular Biology, Oxford, n. 94, p. 181-187, 2005.
QUEIROGA, F.; LOPES, C. Tumores mamários caninos, pesquisa de novos factores de
prognóstico. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, Lisboa, v.97, n. 543, p. 119-127,
2002.
REECE, W. O. Lactação. In: Fisiologia de animais domésticos. São Paulo: Ed. Roca, 1996. cap.
13, p. 313-325.
RICHARDSON, R. C.; HAHN, K. A.; KNAPP, D. W. Biologia dos tumores. In: ETTINGER, S.
A.; FELDMAN, E. C. Tratado de medicina interna veterinária. São Paulo: Manole, 1997. v. 1,
p. 665-675
SANTOS, F.L. Alguns aspectos de neoplasias, em caninos, na cidade do Recife-PE- Brasil, no
período de 1982 a 1990. Recife, 1994. Dissertação Mestrado, Universidade Federal Rural de
Pernambuco.
SETOGUCHI, A.; SAKAI, T.; OKUDA, M.; MINIHATA, K.; YAZAWA, M.; ISHIZAKA, T.;
WATARI, T.; NISHIMURA, R.; SASAKI, N.; HASEGAWA, A.; TSUJIMOTO, H. Aberrations
of the p53 tumor suppressor gene in various tumors in dogs. American Journal of Veterinary
Research, Chicago, v. 62, n.3, p. 433-439, 2001.
SOARES, J. A. G.; SILVA, P. A.. R. Castração precoce em cães e gatos. Clínica Veterinária, São
Paulo, n. 13, p. 34-40, 1998.
THOMPSON,M.W. Genética Médica. 5ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1993. 339p.
VELDHOEN, N.; MILNER, J. Isolation of canine p53 cDNA and detailed chracterization of full
length canine p53 protein. Oncogene, Basingstoke, v. 16, p. 1077-1084, 1998.
WALKER, M.R.; RAPLEY, R. Guia de rotas na tecnologia do gene. São Paulo: Atheneu, 1999.
334p.
YORIKO, J.; TEIXEIRA, L. C.; GURGEL, M. S. C.; ALVARENG, M.; BRENELLI, H. B.
Correlação entre a expressão da proteína p53 e a resposta a quimioterapia primária no carcinoma
mamário. Acta Oncológica Brasileira, São Paulo, v.20, n.1, p. , 2000.
ZUCCARI, A. P. C.; SANTANA, A. E.; ROCHA, N. S. Correlação entre a citologia aspirativa por
agulha fina e a histologia no diagnóstico de tumores mamários de cadelas. Brazilian Journal
Veterinary Research Animal Science, São Paulo, v. 38, n.1, p. 38-41, 2001a.
ZUCCARI, D. A. P. C.; SANTANA, A. E.; ROCHA, S. N. Fisiologia da neoplasia mamária em
cadelas – Revisão. Clínica Veterinária, São Paulo, n.32, p.52-54, 2001b.
80
7 ABSTRACT
The mammary tumors in bitches has high incidence and malignancy being provoked by several risk
factors including age, hormonal activity, nutrition, virus, exogenous progestagen and
pseudopregnancy. The gene p53, known as a suppressor gene of tumor, has been presented
mutations related with neoplasies. In this work, the goal was to characterize the mammary tumors in
bitches, evaluate the implication of the lateral mamma to the tumor and the risk factors involvement
on the occurrence of the tumors; analyze the gene p53, in the region among exons 4 and 8 and to
relate the malignant tumors and normal mammas with the occurred mutations in this gene. Were
used 50 bitches with mamma tumor and 11 normal ones that were attended in Veterinary Hospital
of the University Federal Rural of Pernambuco. They were harvested samples of the tumors and of
the adjacent, clinically normal mammas, as well as mammas biopsies of the normal bitches, for
histopathologics analysis according to the routine procedures. Other fragments were collected for
extraction of the DNA, amplification of the exons by the polimerase chain reaction (PCR) with
primers specific. The animals went of varied races having age comprehended between 4 and 19
years for the bitches with tumor and between 7 months and 6 years for the normal bitches, and the
of age band between 9 and 13 years was to what it introduced the biggest neoplasic frequency
(48%). Of the 50 mammary alterations, 68% were carcinosarcoms, 24% were carcinomas, 2%
benign mixed tumor, 2% hemorrhagic, 2% fibrosises and 2% were unspecific inflammatory
processes. There was no difference in the relation among risk factors and the tumors occurrence in
the bitches. Of the lateral mammas to the tumors, just 36% were normal, 48% presented carcinoma,
6% carcinosarcoms, 2% hiperplasy, 2% fibrosis and in 6% the material was not enough to guarantee
the diagnosis. They were chosen samples of 9 carcinomas and 7 carcinosarcoms with the respective
adjacent normal mammas, and of 6 normal bitches, which were sequenceted in automatic sequencer
and analyzed for the presence of mutations in comparison to nucleotides sequence of the dog p53
(GenBank - S77819). Were found mutations in 85,0% of the samples that after sequencing
presented homology with the canine protein p53, of 86,3% on an average (GenBank -
AAB42022.1). Of the observed mutations, the most frequent were missense and the most attacked
exons were the 5 and the 8 with, respectively, 23,2% and 24,9% of the mutations. nucleotides
alterations more frequent were deletions (C and G) and inserts (A and T), which resulted in majority
of the mutations missense. It concludes that in the studied animals there was no interference of the
contraceptives pseudopregnancy factors and use in the appearance of the tumors, but that the age is
an important factor, being, however, the considered advanced age a factor of elevated risk.
Considering the tumors high frequency in the lateral mammas to neoplasics and the mutations
occurrence in the genes of these samples, it suggests that in extirpation of the tumor be extract the
complete lateral chain to avoid reincidence. The mutations high incidence in the segment of the
gene that it transcribes the part of the protein that is linked to the DNA, it suggests the possibility of
the alteration in the functionality of the protein, what is emphasized by the high malignancy of the
studied tumors.
Key words: cancer, pathology, molecular biology, neoplasm, PCR, DNA
81
ANEXO
82
8 ANEXO
FICHA DE ACOMPANHAMENTO DO PROJETO NEOPLASIA MAMÁRIA
Data: ___ / ___ / _____
Nº da ficha:
N° do Prontuário:
Nome do animal: Idade:
Raça: Pelagem:
Proprietário:
Endereço:
CEP: Fone:
E-mail:
Anamnese
Sinais:
Sintomas:
Início:
Alimentação: ( ) Ração - Marca comercial:
( ) Caseira - Qual?
Perda de peso: ( ) Sim ( ) Não Intolerância ao exercício: ( ) Sim ( ) Não
OSH anterior: ( ) Sim ( ) Não
Início da puberdade:
Nº de cios: Intervalo entre ciclos:
Nº de gestações: Intervalo entre gestações:
Período de desmame: Abortos:
Dificuldade reprodutiva:
Tempo de ciclo reprodutivo:
Apresentou pseudogestação:
Aplicação de anticoncepcional: ( ) SIM ( ) NÃO Qual:
Quantas vezes:
Histórico familiar de tumor mamário:
Histórico de mastite:
Fez exames radiográficos:
Já fez mastectomia:
83
Massa tumoral
D E
1
2
3
4
5
A A
I I
Características do tumor
Mobilidade s n
Ulceração s n
Eritema s n
Aderência da pele s n
Infecção s n
Envolvimento de fascia
ou músculo
s n
Dor local s n
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
