Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
AVALIAÇÃO DA INFILTRAÇÃO BACTERIANA IN VITRO ATRAVÉS DA
INTERFACE IMPLANTE/CONECTOR E COMPARAÇÃO ENTRE DOIS
MÉTODOS DE QUANTIFICAÇÃO DA
CONTAMINAÇÃO INTERNA DE IMPLANTES
Dissertação apresentada à Faculdade
de Odontologia de Ribeirão Preto-USP
para obtenção do título de Mestre em
Reabilitação Oral – Área de
Concentração Materiais Dentários e
Prótese
C
ANDIDATO: RODRIGO EDSON SANTOS BARBOSA
ORIENTADOR: PROF. DR. RUBENS FERREIRA DE ALBUQUERQUE JÚNIOR
RIBEIRÃO PRETO
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Rodrigo Edson Santos Barbosa
Avaliação da infiltração bacteriana in vitro através da interface
implante/conector e comparação entre dois métodos de quantificação da
contaminação interna de implantes.
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para obtenção do
grau de Mestre em Odontologia.
Área de Concentração: Reabilitação Oral.
Aprovado em ___ / ___ / 2006.
Banca Examinadora
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição_______________________Assinatura________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição_______________________Assinatura________________________
Prof. Dr. ________________________________________________________
Instituição_______________________Assinatura________________________
ads:
DEDICATÓRIA
Dedicatória
À Deus,
pela presença constante,
pelas oportunidades
e pela força interior que me impulsiona a seguir em busca dos meus sonhos.
Ao meu pai Severino Ramos Barbosa
e minha mãe Ivonise dos Santos Barbosa
que sempre ensinaram o caminho certo a seguir.
Obrigado pelo amor incondicional, suporte emocional nos momentos de necessidade e
confiança.
Obrigado por serem tão especiais, por me ouvir e me apoiar sempre.
À minha irmã Raquel Ângela dos Santos Barbosa
e ao meu irmão Ricardo dos Santos Barbosa,
pela grande amizade, companheirismo e por tão intenso amor.
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
À empresa SIN (Sistema de Implante, São Paulo),
pela doação dos implantes e componentes, necessários para elaboração do presente
trabalho, sem os quais seria inviável a realização do mesmo.
Meu reconhecimento e sinceros agradecimentos ao meu orientador,
Prof. Dr. Rubens Ferreira de Albuquerque Júnior,
Prof. Dr. da Disciplina de Clínica Integrada, da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto, da Universidade de São Paulo,
pelos ensinamentos, pela orientação habilidosa deste trabalho, tornando-se além de
orientador, um grande amigo.
À Profa. Dra. Izabel Yoko Ito, à Profa. Dra. Nádia Monesi e à Profa. Dra. Cláudia
Helena Lovato da Silva que, com amizade, boa vontade e troca de informações,
estiveram sempre prontas a ajudar.
Agradecimentos
Ao Coordenador da Pós-Graduação na área de Reabilitação Oral o
Prof. Dr. Osvaldo Luiz Bezzon e ao Prof. Dr. Vinícius Pedrazzi
pelo excelente trabalho realizado no curso e incansável incentivo.
À Thais Helena Andreolli do Amaral,
agradeço pela compreensão, carinho e apoio durante grande parte da elaboração desse
trabalho. Obrigado por sua paciência e incansável incentivo.
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP,
onde obtive minha formação como Cirurgião-Dentista e pela oportunidade da
realização do curso de Mestrado.
Aos amigos, pelo excelente convívio.
Agradecimentos
Um agradecimento especial aos pós-graduandos
Cássio do Nascimento, Cristiano Nakao, Evandro Watanabe
e João Paulo Mardegan Issa,
pelo auxílio imprescindível para a realização deste trabalho, pelo companheirismo e
sobretudo pela amizade.
Às funcionárias
Regiane de Cássia Tirado e Ana Paula Xavier,
por todo suporte a mim oferecido durante o curso e pelo carinho constante e tão
agradável convívio.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram na elaboração deste
trabalho,
Muito obrigado.
RESUMO
RESUMO
BARBOSA, R. E. S. Avaliação da infiltração bacteriana in vitro através da
interface implante/conector e comparação entre dois métodos de
quantificação da contaminação interna de implantes. 2006. 141p.
Dissertação Mestrado – Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
As interfaces entre implantes e componentes de próteses
parafusadas implanto-suportadas apresentam pequenos espaços ou fendas,
descritos na literatura internacional como "microgaps". Esses espaços
possibilitam a penetração de fluidos orais e, com isso, a penetração de
microrganismos nas partes internas de implantes, contaminando também os
tecidos peri-implantares. Este trabalho teve como objetivo avaliar a infiltração
bacteriana na interface implante/componente protético e comparar, in vitro, os
métodos do “Checkerboard DNA-DNA Hybridization” e o da análise microbiana
em meios de cultura. Para isto, foram utilizados 20 implantes da marca SIN
(Sistema de Implante, São Paulo), divididos em 2 grupos de 10 unidades, um
analisado pela técnica de DNA checkerboard e, o outro, pelo método de cultura
microbiana tradicional. Em condições assépticas, foram inoculados 3 µL de uma
solução contendo Streptococcus sobrinus em Caldo de Sacarose Bacitracina
(CaSa B) na rosca interna de cada implante, conectando-se o pilar protético
com torque de 32 Ncm. O conjunto implante/conector protético foi colocado
individualmente em tubos de ensaio contendo 5,0 mL de meio de cultura CaSa
B, mantido em estufa bacteriológica durante 14 dias e observado a cada 24
horas quanto à ocorrência de turvação. Após o teste, os microrganismos foram
recuperados e analisados pelos dois métodos. Para comparação inicial entre as
técnicas, os 20 implantes utilizados no experimento, foram criteriosamente
limpos, esterilizados, testados quanto a presença de DNA remanescente e
divididos em 2 grupos de 10 unidades, um analisado pela técnica de DNA
checkerboard e, o outro, pelo método de cultura microbiana tradicional.
Seguindo o mesmo processo de assepsia do meio, foram inoculados 3 µL da
solução contendo Streptococcus sobrinus na rosca interna de cada implante.
Logo em seguida, os microrganismos foram recuperados e analisados pelos
dois métodos. Ao final do período de14 dias, observou-se a turvação do meio
de cultura em 6 conjuntos implante/conectores. A freqüência de contaminação
dos conjuntos foi de 0,3. Houve redução significante, tanto pelo método DNA-
Checkerboard como pelo método de cultura tradicional, em relação à contagem
dos microrganismos provenientes do interior dos conjuntos implante/conectores
após o período de imersão em meio de cultura CaSa B. Tanto no período inicial
quanto após 14 dias, o método DNA-Checkerboard apresentou maiores
contagens de S. sobrinus em relação ao grupo analisado pela técnica de cultura
(p < 0,05). Auxílio FAPESP (n° processo: 03/04585-1)
Palavras-chave: Implantes dentários, Contaminação bacteriana, Métodos de
avaliação, Cultura, Checkerboard.
ABSTRACT
ABSTRACT
BARBOSA, R. E. S.
In vitro evaluation of bacterial leakage along the
implant/abutment interface and comparison of two methods of evaluation.
2006. 141p. Dissertation (Masters- Oral Rehabilitation) – Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
The interfaces between implants and components of screwed
prostheses show small spaces or gaps, described in the international literature
as microgaps. These spaces allow the penetration of oral fluids and bacteria to
the inner part of implants, also contaminating the peri-implant tissue. The aim of
this work was to evaluate the bacterial leakage through the interface
implant/abutment and to compare, in vitro, the methods of Checkerboard DNA-
DNA Hybridization and the microbial analysis in culture medium. For this work,
20 dental implants (SIN - Sistema de Implantes, SP, Brazil), were divided in 2
groups of 10 units, one analyzed by the technique of DNA checkerboard and the
other by the traditional microbial culture method. In aseptic conditions, 3.0 µL of
Sacarose Bacitracin Broth (CaSa B), containing Streptococcus sobrinus, were
inoculated in the internal part of each implant. These implants were connected
to the prosthetics pillar with torque of 32 Ncm. The group implant/abutment was
put individually in test tubes containing 5.0 mL of CaSa B, incubated in a candle
jar at 37ºC for 14 days under microaerophilic conditions and observed every 24
hours for the occurrence of turbidity. After the test, the microorganisms were
recovered and analyzed by the two methods. For initial comparison between the
techniques, the 20 implants used in the experiment were carefully cleaned,
sterilized, tested if there were remaining DNA, and divided in 2 groups of 10
units. One was analyzed by the technique of DNA checkerboard and the other
by the method of traditional microbial culture. Following the the environment
asepsis, 3.0 µL of CaSa B containing Streptococcus sobrinus were inoculated to
the internal part of each implant. Soon afterwards, the microorganisms were
recovered and analyzed by the two methods. At the end of 14 days, 6
assemblies showed clouded of the medium. The frequency of contamination
was 0,3. There was significant reduction in the number of microorganisms in the
inner part of the implants after the immersion period by the both methods. In the
initial period and after 14 days, the method DNA-Checkerboard presented larger
counts of S. sobrinus than the group analyzed by the culture technique (p
<0,05). This study was supported by FAPESP (03/04585-1).
Key Words: Dental implants, Bacterial contamination, Evaluation methods,
Culture, Checkerboard.
SUMÁRIO
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
1 – INTRODUÇÃO........................................................................................... 17
2 – REVISTA DA LITERATURA ..................................................................... 25
2.1 –
Estudos longitudinais de implantes......................................................... 26
2.2 –
Contaminação bacteriana peri-implantar.................................................. 31
2.3 – Interface implante/conector protético ...................................................... 41
2.4 –
Métodos de identificação bacteriana ........................................................ 49
3 – PROPOSIÇÃO.......................................................................................... 59
4 – MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 61
4.1 – P
assagem do microrganismo através da interface implante/conector................62
4.2
– Comparação entre os métodos de cultura e checkerboard..............................76
5 – ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................... 99
6 – RESULTADOS......................................................................................... 101
7 – DISCUSSÃO........................................................................................... 109
8 – CONCLUSÕES....................................................................................... 122
REFERÊNCIAS ............................................................................................. 124
1 - INTRODUÇÃO
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 18
A ausência de estruturas dentárias sempre foi um problema para uma
parcela considerável da população, interferindo de forma negativa tanto na
saúde quanto no convívio social destes indivíduos.
O emprego do titânio nos implantes e o surgimento do conceito de
osseointegração, proposto inicialmente por Brånemark et al. (1969), criaram
novas perspectivas na área de reabilitação oral. Osseointegração na
odontologia se define pela união física e estrutural direta entre o implante de
titânio e a loja óssea localizada na maxila ou na mandíbula. Devido a essa
capacidade, à sua baixa condutividade térmica, excelente biocompatibilidade e
baixo custo, o titânio passou a ser empregado na Odontologia na forma de
implantes, viabilizando assim, a substituição de elementos dentários perdidos
(LAUTENSCHLAGER e MONAGHAN, 1993).
Os implantes osseointegrados, cirurgicamente implantados no osso
alveolar, proporcionam um sistema de suporte eficiente tanto para próteses
fixas quanto para próteses removíveis (ERICSSON et al., 1986; TANNER et al.,
1997; HULTIN et al., 2002; QUIRYNEN et al., 2002). No entanto, o sucesso da
osseointegração é limitado por fatores microbiológicos e mecânicos
freqüentemente associados à falhas na sua manutenção (PIATTELLI et al.,
2001; QUIRYNEN et al., 2002). Estes fatores, no entanto, não atuam de forma
decisiva isoladamente.
Os fatores mecânicos, representados principalmente por cargas
irregulares sobre as próteses implanto-suportadas, podem interferir de forma
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 19
negativa no processo de osseointegração prejudicando o prognóstico do
tratamento. Estas cargas, agindo sobre o osso de suporte além do limite
fisiológico, não permitem a estabilização do coágulo sangüíneo, causando
necrose da região peri-implantar e formação de tecido fibroso, o que
impossibilita a osseointegração (ORINGER et al., 1998; RIMONDINI et al.,
2001).
Quanto aos fatores microbiológicos, os casos de insucesso da
osseointegração parecem estar intimamente associados aos microrganismos
causadores da doença periodontal (NEWMAN et al., 1988; HAANAES, 1990;
MAX et al., 1999; LEE et al., 1999; PIATELLI et al., 2001). Estudos demonstram
que as bactérias responsáveis pelas alterações patológicas nas estruturas de
suporte ao redor dos implantes falhos apresentam-se de forma semelhante em
dentes naturais com problemas periodontais (KOKA et al., 1993; LEONHARDT
et al., 1999; LEONHARDT et al., 2003). Em pacientes parcialmente
desdentados, que recebem tratamento reabilitador com implantes, observa-se
uma similaridade na composição da microbiota oral associada aos tecidos peri-
implantares e periodontais (LEE et al., 1999; RIMONDINI et al., 2001). Em
bolsas mais profundas de implantes comprometidos, a microbiota se apresenta,
na maior parte, composta por microrganismos anaeróbios e,
predominantemente, gram-negativos, semelhante aos de dentes
periodontalmente comprometidos (HAANES et al., 1990; KOKA et al., 1993).
Por esse motivo, um controle rigoroso da saúde periodontal é necessário a fim
de se manter a funcionalidade dos implantes. Fatores como fumo e o álcool
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 20
também podem aumentar as chances de problemas ao redor tanto de dentes
naturais quanto dos implantes (BOSTRÖM et al., 2001; QUIRYNEN et al.,
2002).
O sucesso da osseointegração de implantes em pacientes
periodontalmente saudáveis tem sido documentado em inúmeros estudos
longitudinais nos últimos anos (ERICSSON et al., 1986; BUSER et al., 1997;
HULTIN et al., 2000; RIMONDINI et al., 2001). No entanto, em relação à falha
na osseointegração, é difícil estimar o número de perdas por problemas
periodontais, já que em muitos casos o implante é tratado ou removido sem que
qualquer documentação seja realizada (TANNER et al., 1997). Esta falha é
caracterizada principalmente pela perda do osso de suporte.
Sintomatologicamente podem ocorrer dores espontâneas ou durante o torque,
apertamento dos dentes, percussão ou palpação. Observa-se também uma
inflamação local, incluindo sangramento à sondagem e vermelhidão
(MOMBELLI et al., 1988; HEYDRENRIJK et al., 2002). No entanto, a presença
de implantes sem problemas na cavidade oral de pacientes com doença
periodontal permanece ainda pouco estudada (MENGEL et al., 2001). Por este
motivo, muitas pesquisas têm sido desenvolvidas a fim de analisar o motivo do
insucesso de certos implantes, seja durante ou após o período de
osseointegração (MICHAEL et al., 1988; BOLLEN et al., 1996; LEONHARDT et
al., 1999).
Em contraste com os dentes, os implantes são introduzidos em um
ambiente totalmente diferente, onde já existe uma microbiota estabelecida.
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 21
Além disso, sabe-se que a superfície dura do titânio do implante oferece um
novo sítio para a aderência e a colonização bacteriana (BUSER et al., 1992).
O tempo de contaminação e estabilização bacteriana após a
colocação e exposição do implante no meio bucal ainda é bastante controverso
e discutido entre os estudiosos. Técnicas de cultura indicam que 2 a 3 meses,
após a instalação de implantes, são requeridos para a detecção de
microrganismos periodonto-patogênicos na microbiota subgengival de pacientes
edêntulos reabilitados com implantes (MOMBELLI et al., 1988). No entanto,
existem estudos atuais demonstrando que a contaminação por microrganismos
causadores de doenças periodontais foi observada 14 dias após a exposição
dos implantes na cavidade oral (KOKA et al., 1993).
Nos últimos anos, os tipos de microrganismos na cavidade oral
identificados como patógenos, suspeitos de causarem certas formas de
doenças periodontais destrutivas, vêm sendo investigados (ERICSSON et al.,
1995; LISTGARTEN e LAI, 1999; RIMONDINI et al., 2001). Espécies envolvidas
na doença periodontal, como as fusobactérias e espiroquetas, têm sido também
identificadas em pacientes com infecção ao redor de implantes (KELLER et al.,
1998). Dentre os fatores que influenciam as características da microbiota ao
redor e no interior dos implantes destacam-se o encaixamento passivo dos
componentes protéticos sobre os implantes assim como sua adaptação
marginal além da presença de dentes remanescentes, estado do periodonto,
rugosidade superficial dos componentes transmucosos dos implantes, tempo de
exposição dos implantes e componentes na cavidade oral, reação de corpo
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 22
estranho nas bolsas peri-implantares e higiene oral (BOLLEN et al., 1996;
HAANAES et al., 1990; LISTGARTEN e CHERN, 1999).
Desde a fase cirúrgica para colocação do implante e durante todo o
período em função na cavidade oral, infecções próximas à crista óssea, onde se
encontra a união entre implante e componente protético, podem ocorrer,
induzindo, assim, processos inflamatórios análogos a periodontite (LEMONS et
al., 1986; FLEMMING et al., 1991; JANSEN e RICHTER, 1997; HULTIN et al.,
2002).
Um grande fator de risco para o desenvolvimento da peri-implantite é
o afrouxamento dos parafusos, o que permite a penetração de microrganismos
periodontopatogênicos para o interior dos implantes e componentes (LEE et al.,
1999). O tratamento da reabsorção óssea peri-implantar, provocada por esses
microrganismos consiste basicamente na remoção física do biofilme existente
acima e abaixo da gengiva marginal, ou da redução da área subgengival
disponível para a contaminação bacteriana através de procedimentos cirúrgicos
de remoção de bolsa periodontal profunda (HAFFAJEE et al., 1997), e do uso
de antibioticoterapia (LEE et al., 1999).
O sistema de implante cujos componentes são parafusados resulta
em espaços, que podem atuar como um alçapão para as bactérias e causar
reações inflamatórias nos tecidos moles peri-implantares (GUINDY et al., 1998).
Mesmo tendo seu significado clínico, na maioria das vezes negligenciado,
muitos sistemas ainda utilizam esse tipo de ancoragem para as próteses e, por
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 23
isso, observar o quesito infiltração bacteriana através da interface
implante/conector, é de extrema importância clínica.
Não existe ainda um método simples e direto que possibilite ao clínico
prever a ocorrência desses problemas periodontais (TORRESYAP et al., 2003).
O método mais comumente empregado, nos dias de hoje, baseia-se na
utilização de meios de cultura, sendo analisadas apenas espécies microbianas
específicas, já que estes meios são seletivos ou até mesmo restritos a um
número limitado e bem conhecido de espécies bacterianas. Entretanto, os
métodos recentes de análise do DNA bacteriano possibilitam a identificação e
quantificação rápida dos microrganismos da cavidade oral, auxiliando no
diagnóstico das doenças periodontais e peri-implantares. A técnica de análise
“Checkerboard DNA–DNA Hybridization” tem sido empregada cada vez mais
freqüentemente com a finalidade de ampliar o número de espécies analisadas
ao mesmo tempo, tornando mais rápido o resultado, sem, no entanto, perder a
confiabilidade dos resultados (DAHLE’N e LEONHARDT, 2006). A técnica de
“Checkerboard DNA–DNA Hybridization” possibilita análises quantitativas de
amostras bacterianas contra até 43 espécies microbianas em um só teste,
utilizando-se de sondas de DNA. Esta técnica, inicialmente utilizada para a
detecção de bactérias predominantemente gram-negativas da placa
subgengival (WALL-MANNING, et al., 2002), vem sendo aprimorada podendo
ser, atualmente, utilizada para qualquer espécie, sendo ela gram-negativa ou
gram-positiva e, portanto, tem sido considerado um instrumento bastante útil na
análise da microbiota oral (SOCRANSCKY et al., 1994). Desta forma, a
BARBOSA, R. E. S. INTRODUÇÃO - 24
presente dissertação tem por objetivo avaliar a passagem da espécie
bacteriana Streptococcus sobrinus, do interior para o exterior de implantes,
através de sua interface com o conector protético e comparar a técnica
microbiológica convencional e o método de DNA-DNA checkerboard, na
detecção e quantificação deste microrganismo, comumente encontrado na
cavidade oral.
2 – REVISTA DA LITERATURA
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 26
2.1 - Estudos longitudinais de implantes
A dificuldade em se realizar estudos longitudinais que mostram a
resposta da região peri-implantar após o período de osseointegração ocorre em
virtude, principalmente, da limitação do pesquisador e da disposição do
paciente na realização de consultas para controle por períodos prolongados. No
entanto, os estudos presentes demonstram a viabilidade da manutenção ou do
restabelecimento (quando os implantes se encontram acometidos por doença
periodontal) da saúde da região peri-implantar por períodos longos de tempo.
O sucesso em longo prazo dos implantes depende de vários fatores.
O desenho na remodelação óssea em volta do implante formado imediatamente
após sua inserção na loja óssea e com o passar do tempo favorece ou não a
manutenção deste na cavidade oral. A excessiva perda óssea não é aceitável,
pois leva a um aumento no desenvolvimento de bolsas favorecendo o acúmulo
de placa bacteriana subgengival aumentando, assim, o risco de infecção nessa
porção cervical do implante, comprometendo a implantação. É possível
observar que até nos implantes considerados satisfatoriamente
osseointegrados há, com o passar do tempo, uma reabsorção óssea
progressiva. No entanto, para que seja considerado um processo fisiológico, há
um limite para essa perda óssea. Em um estudo realizado por Cox e Zarb
(1987) foi constatada que de forma geral, ocorre uma perda óssea de cerca de
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 27
1,3 milímetros no primeiro ano, e 0,1 milímetros por ano nos anos
subseqüentes.
Buser et al. (1997) acompanhou implantes clínica e radiograficamente
durante um período de oito anos com intuito de avaliar o prognóstico deste
tratamento reabilitador em pacientes parcial e totalmente desdentados. Mil e
três pacientes receberam um total de 2359 implantes e foram reabilitados com a
colocação de próteses fixas ou removíveis, sendo então, acompanhados. Após
o período de cicatrização, os pacientes foram chamados para avaliação clínica
e radiográfica, sendo os implantes classificados em osseointegrados ou com
falha precoce. Os implantes considerados com sucesso tiveram o tratamento
protético realizado e foram acompanhados por um período de 8 anos. Durante o
período de cicatrização 13 implantes se apresentaram falhos, não sendo
incluídos na análise da fase protética. Durante os 8 anos seguintes, 127
implantes foram perdidos do acompanhamento clínico e radiográfico. A análise
dos resultados mostrou uma taxa de sucesso em 90% após 8 anos de
colocação das próteses sobre os implantes demonstrando a viabilidade de
manutenção deste tratamento reabilitador em longo prazo.
O contato direto do implante ao ambiente bucal tem sido considerado
um fator importante na reabsorção óssea. Visando analisar a influência do grau
de remodelação óssea em diferentes tempos de exposição de implantes na
cavidade oral, Astrand et al. (2002) compararam, por meio de um estudo clínico,
o índice de sucesso e a perda óssea marginal, utilizando implantes submersos
e não submersos das marcas Brånemark e ITI, respectivamente. Cada
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 28
hemiarcada maxilar de cada paciente foi reabilitada com um sistema de
implante, para que pudessem ser comparadas após o período estipulado para
este estudo. Após 6 meses da fase cirúrgica para a colocação de ambos
implantes, os 28 pacientes parcialmente desdentados, com dentição anterior
preservada, receberam reabilitações protéticas e passaram a ser observados
após um ano de instalação das próteses. Dois implantes submersos foram
perdidos antes de se aplicar efetivamente a carga sobre eles, enquanto um não
submerso foi perdido após ter sido colocado em função. Após 1 ano de carga,
ocorreu perda óssea nos dois sistemas de implantes, no entanto, as avaliações
radiográficas não demonstraram diferenças estatísticas nos níveis de
reabsorção entre os dois sistemas avaliados, demonstrando o sucesso clínico
de implante de apenas uma etapa cirúrgica.
Leonhardt et al. (2003) analisaram os resultados, em longo prazo, do
tratamento de implantes infectados com a utilização de técnicas cirúrgicas
periodontais e uso de antimicrobianos. Foi observado que dos 26 implantes
acompanhados por um período de 5 anos, 7 foram perdidos, 4 continuaram a
perder osso, 9 não mudaram o nível ósseo e 6 ganharam tecido ósseo. Esta
série de casos mostrou que é possível, em alguns casos, a manutenção de
implantes seriamente comprometidos por peri-implantite na cavidade oral
quando o controle periódico por parte do cirurgião dentista e colaboração do
paciente são realizados de forma eficiente.
Palmer et al. (2004) analisaram o desempenho clínico e radiográfico
de dentes e implantes, unidos entre si por uma prótese fixa de três elementos e
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 29
submetidos a cargas funcionais normais por um período de três anos. Para tal,
19 indivíduos com desdentamento posterior bilateral na maxila ou mandíbula,
com oclusão em dentes naturais ou próteses fixas, foram reabilitados mediante
colocação de implantes. Radiografias padronizadas e registros clínicos foram
realizados anualmente. Analisando os dados, notou-se um aumento de
profundidade de sondagem entre os intervalos de acompanhamentos clínicos.
No entanto, não foi observado nenhum sangramento à sondagem, tanto na área
de implante, como na região dos dentes. Não houve intrusão dos dentes ligados
aos implantes em nenhum dos 19 pacientes analisados. Este experimento
comprovou, mesmo sem análise microbiológica, a eficácia dos implantes
quando submetidos às cargas por um período prolongado de tempo,
evidenciando o sucesso clínico desse tipo de tratamento reabilitador.
Quirynen et al. (2005) avaliaram clínica e microbiologicamente o
comportamento de implantes após 10 anos de sua colocação em pacientes
desdentados reabilitados com prótese. Para isto, 37 indivíduos participaram
deste estudo. Todos eles eram totalmente desdentados e tinham sido tratados
com próteses totais superiores convencionais e próteses inferiores retidas a
implantes (Brånemark systems, Nobel Biocare AB) por pelo menos 10 anos.
Dois grupos de pacientes foram selecionados. O grupo 1 consistiu de 25
pacientes tratados com overdenture. O grupo 2 consistiu de 12 pacientes
reabilitados com próteses fixas. O registro das condições periodontais foi
realizado em visitas periódicas ao mesmo periodontista, no qual foram
analisadas presença ou ausência de placa bacteriana em 4 sítios dos implantes
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 30
dentais, tendência de sangramento ocorridos nos tecidos moles ao redor dos
abutments produzidos pela sondagem, profundidade de sondagem, recessão
tecidual e o nível do attachment. Amostras bacterianas subgengivais foram
removidas de dois implantes de cada paciente para posterior analise
microbiológica. As amostras foram analisadas utilizando a técnica de hibridação
de DNA. Após 10 anos de carga, a microbiota subgengival dos implantes de
todos os grupos, tanto os que utilizaram como tratamento reabilitador próteses
fixas ou overdentures, foram comparáveis entre si, apresentando baixa
prevalência de espécies bacterianas, mas alta detecção para os
microrganismos Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas
gingivalis e Tannerella forsythensis, pertencentes ao complexo vermelho. A
média do índice de placa, sangramento à sondagem e altura do nível ósseo
marginal não foi significantemente diferente, nem entre o grupo que utilizava
overdenture nem entre o que utilizava prótese fixa, passado o período de
acompanhamento clínico. Desta forma, evidenciaram-se a possibilidade de
viabilidade clínica da manutenção destes implantes em ambos os tipos de
tratamento reabilitador na cavidade oral.
Bornstein et al. (2005) avaliaram clínica e radiograficamente, a taxa
de sucesso de implantes de titânio em pacientes por um período de 60 meses.
Um total de 104 implantes foi incluído na análise. Após o período de
cicatrização de 6 semanas, todos os implantes foram colocados em função por
meio da cimentação de coroas fixas. Durante a fase de cicatrização do alvéolo
e de aplicação de cargas sobre as próteses quatro implantes foram perdidos,
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 31
sendo excluídos da análise. Nos 100 implantes restantes, foi realizada
manutenção do controle da quantidade de placa bacteriana ao redor. A partir
daí, houve redução significativa em relação ao sangramento à sondagem no
intervalo estipulado. Houve uma redução gradativa tanto da média de
profundidade de sondagem quanto da distância entre o ombro do implante e a
margem gengival. A estabilidade dos implantes foi observada durante todo o
período de análise. Um pequeno aumento da distância nos períodos de 3
meses e 5 anos, entre o ombro do implante e a crista óssea marginal foi
estaticamente observada. Os resultados obtidos só vieram a corroborar outros
estudos que comprovam possibilidade de manutenção do sucesso clínico, em
longo prazo, de implantes osseointegrados na sustentação de próteses fixas
bem planejadas e adaptadas.
2.2 - Contaminação bacteriana peri-implantar
A complexidade da microbiota subgengival tem sido desvendada
desde a primeira análise microscópica realizada por Van Leeuwenhoek em
1683 (SOCRANSKY et al., 1998). Assim como ocorre na dentição natural
(MOORE et al., 1991), existe a formação de placa bacteriana na superfície dos
implantes. Koka et al. (1993), observando o desenvolvimento bacteriano
associado a implantes em pacientes parcialmente desdentados, verificaram que
a colonização bacteriana subgengival ocorre em torno de 14 dias. Portanto,
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 32
segundo os autores, pode haver uma população bacteriana potencialmente
agressiva aos tecidos peri-implantares após 14 dias da colocação do
cicatrizador.
Bollen et al. (1996) em um estudo que analisou o acúmulo de placa
na superfície dos abutments com diferentes rugosidades superficiais e a
mucosa peri-implantar, selecionaram seis pacientes, com idade média de 60
anos. Em cada paciente, dois implantes Brånemark foram instalados com a
finalidade de fixar as próteses. As próteses foram confeccionadas três a quatro
meses após a colocação dos implantes. A análise foi realizada mediante
mensuração de profundidade de bolsa, sangramento à sondagem e análise
microbiológica por meio de cultura. Os resultados foram obtidos três e 12
meses após exposição dos implantes ao meio oral. Como resultado, não foi
observado nenhuma modificação significativa quando os parâmetros foram
analisados aos três e 12 meses. Observou-se também que a redução da
rugosidade do abutment resultou em um retardo no tempo da maturação da
placa. No entanto, o abutment de superfície mais lisa pôde interferir com a
estabilidade dos tecidos moles periodontais.
Leonhardt et al. (1999) avaliaram as alterações qualitativas na
microbiota subgengival ao redor dos implantes com sinais clínicos de peri-
implantite comparando-as com a microbiota presente no sulco de implantes
clinicamente sadios. Participaram desse estudo 37 pacientes apresentando pelo
menos um implante com perda óssea superior a três espiras, sangramento a
sondagem ou supuração e 51 pacientes com mucosa clinicamente saudável. As
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 33
regiões peri-implantares foram analisadas microbiologicamente por métodos de
cultura. Foi observada certa relação entre o tipo de microrganismo encontrado
ao redor dos implantes e sua condição clínica. Ao redor dos implantes
comprometidos periodontalmente, houve uma prevalência de Porphyromonas
gingivalis, Prevotella intermédia, Prevotella nigrescens e Actinobacillus
actinomycetecomitans, comumente encontrados em sítios dentais acometidos
de doença periodontal. Em contraste, implantes circundados por tecido sadio
demonstraram uma microbiota associada à saúde periodontal. Desta forma, foi
observada uma correlação entre a região peri-implantar e periodontal,
evidenciando a importância do diagnóstico microbiológico como guia no
tratamento antimicrobiano de sítios peri-implantares ou periodontais
comprometidos.
Um estudo realizado por Lee et al. (1999), no qual 43 pacientes
desdentados parciais receberam 101 implantes, teve por objetivo identificar a
microbiota peri-implantar relacionando-a com o tipo de restauração protética
utilizada, tempo de exposição dos implantes e histórico de doença
periodontal/peri-implantar. Vinte e três tipos de sondas bacterianas, em especial
as do complexo vermelho, foram utilizadas para análise. Observou que, a pesar
da mínima influência da restauração protética na característica microbiológica
subgengival, o tempo de exposição e de função dos implantes está relacionado
à complexidade microbiana observada nos sítios perimplantares. No entanto, a
colonização patógenos periodontais, incluindo espécies complexas vermelhas,
foi superior em pacientes com histórico de doença periodontal.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 34
Concluiu-se, desta maneira, que a presença ou não de restauração protética
pouco influi na microbiota da região e que o histórico de doença periodontal ou
infecções peri-implantares têm grande influência na microbiota subgengival. No
entanto, apesar da presença destes microorganismos na região, os implantes
analisados encontravam-se osseointegrados e funcionais.
Van Winkejhoff et al. (2000) observaram a colonização inicial e
subseqüente de bolsas periodontais e peri-implantares em indivíduos
parcialmente desdentados. Para este estudo foram recrutados 20 pacientes.
Todos tinham menos de 65 anos de idade, sem sinais clínicos de cárie,
periodontite e indicados para a colocação de duas ou três unidades protéticas
apoiadas sobre dois implantes. A condição dos tecidos gengivais foi monitorada
antes, imediatamente após a cirurgia, seis e 12 meses a partir da colocação das
próteses, sendo registrada a presença ou ausência de inflamação local.
Radiografias foram tomadas logo em seguida à cirurgia e 12 meses após a
colocação das próteses. Amostras para o teste microbiológico foram obtidas
imediatamente antes da cirurgia, durante o procedimento cirúrgico e nos
períodos propostos após a colocação das próteses. Todas as amostras
coletadas nos sulcos foram analisadas pelo método de cultura. No exame
inicial, foi encontrada maior freqüência dos microrganismos Fusobacterium
nucleatum, Prevotella intermédia e Peptostreptococcus micros. Após seis
meses da colocação das próteses, quase todas as amostras coletadas dos
implantes haviam detectado as mesmas espécies microbianas encontradas nos
sítios periodontais. Foi possível constatar a presença em grande concentração
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 35
do microrganismo P. gingivalis em dois pacientes após 12 meses da análise
inicial, o que possivelmente tenha causado a perda de seus implantes. Com
isso concluiu-se que, após seis meses da colocação das próteses, já se
observa uma similaridade de microrganismos entre bolsa periodontal e bolsa
peri-implantar indicando que, nesse período, o equilíbrio entre dentes e
implantes já tenha ocorrido e que o apropriado controle da infecção periodontal
antes da colocação de implantes em pacientes parcialmente desdentados pode,
de certa maneira, prevenir complicações peri-implantares futuras.
Rutar et al. (2001) em um estudo retrospectivo, analisaram a possível
relação entre a característica clínica peri-implantar e a condição microbiológica
do mesmo sítio. Foram selecionados 45 pacientes parcialmente edêntulos
(média: 51 anos), com um total de 64 implantes. Durante o período de cinco a
10 anos após a instalação dos implantes e o exame clínico, nove implantes
apresentaram um quadro de peri-implantite enquanto seis implantes tiveram
este quadro duas vezes. Ao final do acompanhamento, 42 implantes (66%)
mostraram uma profundidade de sondagem superior a quatro milímetros. Dos
sítios que sofreram de perimplantite, quatro implantes mostraram evidência de
presença de Porphyromonas gingivalis, e dois implantes para Actinobacillus
actinomycetemcomitans, bactérias anaeróbias. A análise estatística revelou
uma relação significante entre profundidade de sondagem peri-implantar e a
presença de microrganismos anaeróbios periodontopatogênicos.
Hultin et al. (2002) avaliaram clínica, radiográfica e
microbiologicamente 55 implantes osseointegrados após 10 anos de função
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 36
oclusal em pacientes tratados para edentulismo parcial. Para esse estudo, 15
indivíduos foram reabilitados com implantes do sistema Brånemark. Os
pacientes foram seguidos de perto em um programa de cuidado e manutenção
que incluiu pelo menos um exame clínico por ano. Cada amostra coletada foi
analisada pela técnica de “Checkerboard DNA-DNA Hybridization”. Nenhuma
complicação durante o período de observação ocasionou perda dos 55
implantes analisados. Sessenta e cinco por cento das superfícies dentais
apresentaram placa bacteriana visível, comparado aos 47% encontrados nas
superfícies implantares. O grau de inflamação dos dentes e implantes foi
semelhante. Nenhuma diferença significativa foi observada quanto à
profundidade de sondagem de todos os dentes em relação aos dentes
adjacentes aos implantes selecionados para a análise. A porcentagem de
amostras positivas para todas as espécies analisadas, com exceção da T.
denticola, foi maior nos implantes que nos dentes. As espécies mais
comumente encontradas tanto em dentes quanto em implantes foram
T.denticola, P. micros e S. intermedia. Com esse resultado, constatou-se a
possibilidade de se obter excelentes resultados clínicos e manter a saúde tanto
de dentes quanto de implantes por um período funcional de 10 anos em
pacientes parcialmente desdentados e reabilitados com implantes dentais
osseointegrados.
Vários estudos vêm sendo realizados e publicados com o intuito de
promover a redução dos principais microrganismos causadores da doença
periodontal e peri-implantar, tendo como foco principal de análise as bactérias
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 37
do complexo vermelho, sendo, em sua maioria, anaeróbias gram-negativas.
Com isso, Carvalho et al. (2005) avaliaram as mudanças nos níveis e
proporções de 39 espécies bacterianas em amostras de placas gengivais após
a raspagem e alisamento radicular, com ou sem a administração de
metronidazol, em pacientes portadores de periodontite crônica. Sessenta
brasileiros com mais de 34 anos portadores de periodontite crônica e que não
haviam recebido nenhum tipo de tratamento periodontal foram recrutados para
o estudo. Os indivíduos possuíam no mínimo 15 dentes, nos quais oito
apresentavam pelo menos um sítio com profundidade de sondagem e nível
periodontal entre seis e 10 milímetros e três sítios com profundidade de
sondagem e nível periodontal inferior a quatro milímetros. Durante a fase inicial,
os indivíduos receberam monitoramento clínico e microbiológico a cerca dos
cuidados necessários durante o período de análise e receberam raspagem
supragengival (SRP) em todos os dentes, sendo realizado sob anestesia local.
O tratamento da cavidade oral foi completado em torno de 14 dias. Após o
tratamento inicial, os pacientes foram distribuídos de forma randomizada em
cada um dos seguintes grupos terapêuticos: grupo controle: SRP e placebo;
grupo 1: SRP e administração sistêmica de metronidazol; grupo 2: SRP e
limpeza realizada por profissional 1 vez por semana.; grupo 3: SRP, limpeza
realizada por profissional 1 vez por semana e administração de metronidazol.
Os grupos 1 e 3 receberam 400 mg de metronidazol, três vezes ao dia, por 10
dias. Os grupos controle e 2 receberam cápsulas de placebo, seguindo o
mesmo protocolo listado anteriormente. Os pacientes dos grupos 2 e 3
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 38
realizaram a remoção da placa supragengival semanalmente, por um período
de três meses. Passado o período de tratamento de todos os grupos, cada
amostra recolhida foi analisada para a identificação de 39 espécies
subgengivais, utilizando a técnica de hibridação DNA-DNA checkerboard.
Observou-se após os 90 dias de tratamento, uma redução do número de
espécies bacterianas, particularmente aquelas do complexo vermelho, T.
forsythensis, P. gingivalis e T. denticola.
Essas três sofreram uma redução
significativa em indivíduos dos grupos 2 e 3. Pacientes do grupo 2 também
mostraram uma redução na média de contagem de cinco espécies do complexo
laranja,
C. gracilis, C. rectus, E. nodatum, F. periodonticum e P. nigrescens. O
presente estudo demonstrou, assim, uma redução da média total dos
microrganismos subgengivais frente as diferentes terapias previamente citadas,
evidenciando a redução principal dos microrganismos do complexo vermelho.
A relação da condição periodontal de dentes remanescentes com a
composição microbiológica ao redor dos implantes dentários vem sendo
discutida e evidenciada na literatura. Com este intuito, Gerber et al. (2006)
avaliaram a microflora de dentes e implantes a partir da coleta de material do
fluido crevicular e de placa subgengival. Amostras de placas foram coletadas do
sulco gengival de dentes e implantes, com auxílio de curetas, e do fluido
gengival, utilizando cones de papel absorvente. Um total de 28 indivíduos foi
envolvido no estudo. A média do tempo de função para cada implante analisado
foi de 3,7 anos. Informações sobre a profundidade de sondagem, sangramento
à sondagem e índice de placa foram realizadas a cada retorno. Antes da coleta
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 39
do material referente à amostragem, a placa supragengival foi removida com
auxílio de cureta estéril e descartada. Todas as amostras foram analisadas pela
técnica de “Checkerboard DNA-DNA Hybridization”. O sangramento à
sondagem foi maior na região de implantes do que nos sítios dentais
analisados. Nenhum dos casos mostrou perda óssea alveolar associada à peri-
implantite, sendo estatisticamente insignificante a diferença de profundidade de
sondagem. A composição bacteriana do fluido gengival de amostras de
implantes evidenciou maior quantidade principalmente de T. forsythia e T.
denticola. Nenhuma diferença na quantidade de bactérias foi observada na
placa subgengival dos dentes remanescentes e no sulco peri-implantar. Desta
forma, demonstrou-se que a análise conjunta do fluido crevicular e da placa
subgengival poderia oferecer dados mais seguros a cerca da condição
microbiológica tanto periodontal quanto peri-implantar.
De Boever e de Boever (2006) avaliaram a composição
microbiológica de implantes de apenas uma fase cirúrgica após um período de
seis meses em pacientes parcialmente desdentados, tratados de periodontite
agressiva. Foram selecionados 22 pacientes (68 implantes) para esse estudo.
Inicialmente, foi realizado o tratamento periodontal em cada paciente. Após a
estabilização da condição periodontal, os pacientes passaram por um período
de controle e manutenção de saúde que consistia em instrução de higiene oral,
controle de placa, raspagem e, se necessário, cirurgia a cada seis meses.
Radiografias periapicais dos implantes foram feitas um e três meses após a
realização da cirurgia e imediatamente antes de se realizar a fase protética.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 40
Amostras da microbiota subgengival foram coletadas nos sítios com bolsas
periodontais mais profundas nos dentes antes da cirurgia e seis meses após o
período de colocação das próteses. O mesmo procedimento foi seguido para a
região peri-implantar 10 dias, um, três e seis meses após a colocação dos
implantes. A análise dos microrganismos foi realizada com a técnica de PCR.
Com exceção de 2 pacientes, nenhuma mudança no índice de quantidade de
placa e índice de sangramento à sondagem foi evidenciada durante o período
experimental. Em 6 meses de controle, nenhum sinal de reabsorção óssea
significante foi observado radiograficamente. A profundidade de sondagem de
todos os implantes não excedeu 4 mm. O resultado microbiológico e clínico
comprovou que as bolsas peri-implantares de pacientes parcialmente
desdentados previamente tratados de doença periodontal agressiva possuem
as mesmas características das bolsas periodontais dos dentes remanescentes
periodontalmente controlados. Observou-se também que microbiota
permaneceu praticamente inalterada durante todo o período do experimento,
evidenciando que, mediante colaboração e controle por parte dos pacientes, é
possível a osseointegração e manutenção de implantes em regiões
previamente comprometidas periodontalmente.
Contrastando dados da literatura a cerca da relação da composição
microbiológica entre dentes e implantes, Listgarten e Lai (1999) compararam a
distribuição de patógenos periodontais ao redor de implantes falhos e em
dentes naturais acometidos de periodontite crônica e periodontite refratária.
Para este estudo foram selecionados 41 pacientes. Os microrganismos foram
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 41
analisados por cultura (ágar) e por imunofluorescência indireta. Constatou-se
que os microrganismos B. forsytus e as espécies de Fusobacterium foram mais
comumente detectados em amostras dos dentes que nos implantes. Já as
espiroquetas, seguidas por Fusobacterium e p. micros foram mais prevalentes
em implantes. No entanto, não se observou diferença significativa do C. rectus
em implantes e dentes. Notou-se, desta forma, uma diferença de espécies de
microrganismos em implantes falhos e dentes com periodontite. No entanto, a
freqüência e níveis de microrganismos encontrados em periodontite crônicas ou
refratárias aparecem de forma similar.
2.3 - Interface implante/conector protético
O sucesso reabilitador em relação à utilização de implantes se
caracteriza, clinicamente pela boa sustentação óssea do implante dentário. Se
a interface implante/conector protético não possuir precisão e adaptação
adequadas, pode permitir, in situ, a penetração bacteriana em virtude da
passagem de fluidos e, com isso, a passagem de nutrientes necessários para o
crescimento bacteriano (TRAVERSY e BIREK, 1992; GROSS et al, 1999).
Estes microrganismos podem passar através da interface, contribuindo em
parte, para o desenvolvimento de peri-implantite, além de servirem como fonte
contínua de contaminação para as regiões peri-implantares (STEFLIK et al.,
1991). Sabe-se, no entanto, que nenhum dos sistemas comercializados
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 42
atualmente elimina esses espaços (MEFFERT, 1988). A busca pela
minimização dessas fendas e o controle periodontal adequado desses sítios
tornam-se, desta forma, fatores indispensáveis para a manutenção da saúde
peri-implantar em longo prazo.
Estudos experimentais demonstraram que o rebordo ósseo peri-
implantar e os tecidos moles subjacentes são influenciados diretamente pela
posição ápico-coronal do ombro do implante, onde se localizam as micro-fendas
entre ele e o componente protético (HANGGI et al., 2005).
Quirynen e van Steenberghe (1993) investigaram a presença de
microrganismos nas roscas internas de implantes do sistema Brånemark. Em
nove voluntários, a parte apical dos parafusos de intermediários, que haviam
sido instalados há três meses, foi examinada em microscópio de contraste de
fases. Todos os parafusos apresentaram uma quantidade significante de
microorganismos, principalmente células cocóides (86,2%) e bastonetes
imóveis (12,3%). Microorganismos móveis (1,3%) e espiroquetas (0,1%) foram
encontrados apenas esporadicamente.
Um ano depois o mesmo autor (QUIRYNEN, 1994) verificou, in vitro,
a existência de passagem microbiana através da interface implante/conector do
sistema Brånemark de implante. Para esta análise 32 implantes foram utilizados
com os respectivos componentes. Após montados sob ambiente estéril, todos
os implantes foram imersos, em pares, em meio de cultura enriquecedor
contendo microrganismos comuns da cavidade oral. Oito pares foram
parcialmente inseridos no meio de cultura, tendo o conjunto imerso até a
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 43
interface implante/conector. O restante dos implantes foi completamente imerso
com o intuito de quantificar tanto a penetração ao longo do parafuso de
cobertura quanto na interface implante conector. Imediatamente antes da
imersão, a parte interna de um implante em cada par foi preenchida com
solução salina e então parafusada, enquanto o outro permaneceu com a parte
interna do implante seca. Após sete dias de inserção nos meios de cultura os
conjuntos foram removidos e as amostras foram coletadas da região interna dos
implantes. Foi utilizada a técnica de cultura tradicional para a identificação
bacteriana. Os implantes parcialmente imersos com a superfície interna
previamente seca demonstraram a penetração de um número menor de
microrganismos que os dos outros grupos analisados. A maior quantidade de
microrganismos encontrados quando os implantes se encontravam totalmente
submersos reforçam, além da capacidade de penetração bacteriana através da
interface implante/conector, a possibilidade de contaminação interna através de
outras fontes.
Em um estudo realizado por Persson et al. (1996), foi analisada a
mucosa peri-implantar de pacientes que receberam implantes do sistema
Brånemak. Dez pacientes parcialmente desdentados, que foram reabilitados
com uma prótese parcial fixa suportada por implantes, foram incluídos nesse
estudo. O tempo médio de uso dessas próteses foi de oito anos. Um total de 28
implantes foi utilizado. As próteses fixas foram checadas quanto à mobilidade e,
em seguida, removidas para análise. Os parafusos dos abutments foram
afrouxados e classificados em estáveis, facilmente removíveis ou frouxos. As
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 44
amostras coletadas após a reabertura da prótese foram analisadas pelo método
de cultura tradicional. Radiografias intra-orais foram realizadas depois de
completado todos os exames clínicos e microbiológicos. O nível de osso
marginal (dista e mesial) foi aferido com uma precisão de 0,5 espiras.
Observou-se que apesar dos tecidos moles ao redor do abutment de titânio
encontrarem-se clinicamente saudáveis na maioria dos casos, e a perda óssea
ao redor das próteses após a conexão dos abutments ter sido pequena, as
amostras microbiológicas das superfícies internas de todos os implantes
mostraram um crescimento bacteriano intenso. A flora consistiu principalmente
de estreptococos anaeróbios e facultativos, bastonetes gram +, anaeróbios
(espécies: Propionibacterium, Eubacterium e Actinomyces) e bastonetes Gram -
anaeróbios (espécies: Fusobacterium, Prevotela e Porphyromonas). A análise
desses resultados não mostrou nenhuma relação entre o tipo e comprimento do
abutment, estabilidade do abutment, perda óssea e tipo e número de
microrganismos achados nas amostras, mas evidenciou a passagem dos
microrganismos pelos “microgaps” existentes entre os implantes e os
respectivos componentes.
Guindy et al. (1998) realizaram um estudo in vitro em que foi
analisada a contaminação bacteriana no interior dos implantes da marca Ha-ti e
a saída de bactérias do seu interior. Trinta coroas pré-fabricadas para esses
implantes foram divididas em três grupos de 10. Nestes três grupos, diferentes
conectores de titânio foram usados com diferenças na espessura e na estrutura
da camada superficial de óxido de titânio, obtida por meio de oxidação anódica.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 45
Foi constatada a penetração microbiana em nove das 10 amostras de cada
grupo em um período de 24 a 48 horas quando estes estavam totalmente
imersos em solução de Trypticase Soy broth (TSb) contendo cultura microbiana.
Em um período de 24 a 120 horas, todas as amostras dos três grupos
continham bactéria em seu interior. Quando o inóculo foi injetado no interior dos
implantes e imerso em um meio de cultura estéril, houve saída bacteriana de
todas as amostras analisadas. Nesse estudo, foi possível observar que mesmo
num sistema de implantes considerado de alto grau de precisão, não há
garantia de selamento contra microrganismos nas interfaces marginais.
Na tentativa de avaliar a influência dos “gaps” e comparar a
composição microbiológica da região interna e externa em implantes com
próteses retidas a parafuso relacionando-a, ainda, com dentes remanescentes,
Keller et al. (1998) requisitaram 15 pacientes para esse estudo. No total, 15
implantes com a reconstrução de coroa retida a parafuso, cinco cimentadas e
60 sítios periodontais foram investigados. O índice de placa foi avaliado tanto
ao redor dos implantes quanto dos dentes. O índice de sangramento à
sondagem também foi realizado. Em seguida, as estruturas retidas a parafuso
foram removidas e foi coletado o material de dentro da coroa. A profundidade
de sondagem e o índice de recessão gengival também foram mensurados,
tanto nos dentes previamente selecionados, quanto nos implantes. As amostras
coletadas tanto do sulco quanto do interior das supra-estruturas foram
analisadas com auxílio da microscopia de campo escuro e pelo método de
cultura tradicional. Quanto às comparações clínicas entre coroas retidas a
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 46
parafuso e cimentadas, não foi observada nenhuma diferença estatística. No
entanto, um índice ligeiramente maior de microrganismos ao redor dos
implantes foi observado nas próteses fixadas por meio de cimentação apesar
de se verificar a contaminação interna nos implantes que continham próteses
parafusadas. Constatou-se também que a composição microbiológica ao redor
dos implantes é diretamente influenciada pela flora dental remanescente e que
o modo de fixação das supra-estruturas influencia, mesmo que minimamente,
os parâmetros clínicos e microbiológicos dos sulcos peri-implantares.
A influência do torque no grau de micro-infiltração na interface
implante/intermediário de cinco sistemas de implantes (Branemark, Sulzer
Calcitek, 3i, ITI e Esteri-Oss) foi verificada por Gross et al. (1999). Em todos os
sistemas, os diferentes torques aplicados, apresentaram evidências de
infiltração. No entanto, o resultado correspondente aos torques de 10 Ncm, 20
Ncm e o recomendado por cada fabricante, mostrou uma redução progressiva
da micro-infiltração em todos os sistemas. A análise de variância mostrou
relação entre o torque e o tempo que as amostras foram expostas para a micro-
infiltração e entre os diferentes sistemas. Desta forma pôde-se concluir que a
aplicação do torque como recomendado pelo fabricante pode reduzir
potencialmente os efeitos adversos dessa micro-infiltração.
Piattelli et al. (2001) analisaram, in vitro, a penetração de fluidos e de
microrganismos para o interior de implantes em componentes retidos a
parafuso e cimentados. Doze implantes, divididos em dois grupos, foram
analisados para avaliar a presença de “gaps” entre o abutment e o implante.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 47
Para análise de penetração de fluido e microrganismos, quatro milímetros de
papel absorvente foi introduzido na parte interna de todos os implantes. Após a
inserção dos abutments, cimentados ou parafusados, os implantes foram
imersos por 30 horas em solução de azul de toluidina, à uma temperatura de
37°C. Após esse período, os implantes parafusados foram desrosqueados e os
cimentados tiveram, necessariamente, de ser cortados para se recuperar o
papel absorvente. Para a análise microbiológica, o microrganismo de escolha
foi Pseudomonas aeruginosa. Outro grupo de 12 implantes também foi utilizado
neste estudo. Foi colocado no interior de implantes estéreis 20 µl de solução
nutriente, também estéril, sendo, em seguida, fechados e levados em meios de
cultura contendo suspensão do microrganismo previamente estabelecido.
Passadas 72 horas, os implantes foram removidos e o conteúdo do interior
deles foi analisado pelo método de cultura tradicional. Observou-se pela
microscopia a existência de espaços entre o abutment e o implante
parafusados, o que permitiu a penetração tanto de fluidos quanto de bactérias
para o interior dos implantes. O mesmo não foi observado nos abutments
cimentados nos implantes.
Wahl e Lang (2003) em um estudo piloto procuraram analisar a
deformação da interface implante/componente protético frente a cargas
oclusais. Para isso, foram utilizados três grupos de implantes parafusados de
4,1 milímetros de diâmetro que foram submetidos à carga utilizando um
aparelho pizoelétrico. Grupo 1: coroa total metálica com parafuso na oclusal.
Grupo 2: coroa metalocerâmica com parafuso na oclusal. Grupo 3: coroa
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 48
metalocerâmica com parafuso na horizontal. Cada grupo sofreu cinco séries de
cargas realizando-se um novo aperto nos parafusos após cada série. A força
foi aplicada nas cúspides palatais da supra-estrutura sob um ângulo de 45°. Os
resultados demonstraram a ocorrência de uma deformação padrão na região da
interface implante/componente protético em todos os grupos, resultando na
criação de diferentes graus de fendas. As deformações observadas estavam
relacionadas diretamente à força e inclinação das cargas, demonstrando a
dificuldade de criação de abutments pré-fabricados livres de desajustes.
Hecker et al. (2006) analisaram, in vitro, a influência de cargas
oclusais na interface implante/componente protético. Para isto, 15 supra-
estruturas suportadas por 5 implantes do Sistema Brånemark (Nobel Biocare),
posicionados e fixados em um modelo padrão, foram analisadas. Após fixação
e torque dos abutments aos implantes, as supra-estruturas foram fixadas ao
conjunto implante-abutment com um torque de 10 Ncm e submetidas a cargas
oclusais. Três condições de ciclos de carga foram realizadas: na região anterior,
unilateral posterior (região cantilever), bilateral posterior (região cantilever).
Após aplicação dos ciclos de carga, os abutments foram removidos e
adaptados aos análogos dos implantes e fixados com o mesmo torque utilizado
no modelo padrão. Em seguida, as supra-estruturas foram fixadas seguindo os
mesmos critérios utilizados anteriormente. Com auxílio de microscópio, os
espaços existentes entre o abutment e a prótese foram aferidos. Em seguida,
os abutments utilizados foram substituídos por novos e a adaptação com a
prótese foi novamente analisada. Foi observado que ocorreram mudanças
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 49
secundárias nos componentes que sofreram cargas oclusais cíclicas, no
entanto, não houve diferenças significativas nos gaps previamente existentes
quando comparados os abutments novos e os que sofreram carga.
2.4 - Métodos de identificação bacteriana
A identificação bacteriana através de técnica microbiológica
convencional tem dado espaço, em alguns casos, à análise molecular
bacteriana, como a técnica “Checkerboard DNA–DNA Hybridization”, que
permite a enumeração de muitas espécies bacterianas em um grande número
de amostras ao mesmo tempo.
O uso de análise de DNA na identificação bacteriana foi descrita por
Savitt et al. em 1988. Neste estudo comparou-se a análise de DNA e a técnica
de cultura tradicional na identificação dos microrganismos Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Bacteroides gingivalis e Bacteroides intermedius em
sulcos periodontais de humanos considerados sadios e sulcos
periodontalmente comprometidos. Nos sítios saudáveis houve um baixo índice
de detecção dos microrganismos pelas duas técnicas de análise. Foi
observada maior detecção de microrganismos técnica de análise de DNA em
sulcos periodontalmente acometidos quando comparada à cultura,
evidenciando uma maior correlação entre o estado clínico periodontal e o
resultado obtido pela técnica de análise de DNA. Estes resultados sugeriram
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 50
que o uso da técnica de sondas de DNA foi equivalente ou até mesmo superior
que a técnica de cultura tradicional.
Loesche et al. (1992) compararam a capacidade de detecção de
vários métodos microbiológicos para análise dos microrganismos
Porphyromonas gingivalis, Bacteroides forsythus e Actinobacillus
actinomycetemcomitans em placa de subgengival de 204 sítios
periodontalmente comprometidos. Os testes utilizados para esta análise foram:
cultura tradicional, utilização de sondas de DNA e teste de imunofluorescência
indireta. Dentre os três métodos analisados, o de cultura obteve os mais baixos
índices de detecção bacteriana, aventando a dúvida de qual método seria mais
seguro na detecção e quantificação bacteriana.
Van Steenbergen et al. (1996) compararam a técnica de análise de
DNA para a detecção de bactérias com técnicas culturais convencionais para a
detecção dos microrganismos Actinobacillus actinomycetemcomitans,
Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia em amostras de placa de
subgengival. Para isto, amostras de 20 pacientes com graus de periodontite de
moderada a severa foram avaliadas a partir do primeiro dia de tratamento até
um período de 15 meses de tratamento periodontal. Os mesmos sítios
periodontais foram analisados tanto pela técnica de cultura padrão quanto pela
análise de DNA. Uma baixa concordância de resultados foi obtida entre os
métodos avaliados. A primeira coleta mostrou uma freqüência de detecção
maior pela técnica de análise de DNA para os microrganismos A.
actinomycetemcomitans e P. gingivalis, enquanto que a cultura detectou em
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 51
maior prevalência P. intermédia. A análise de DNA mostrou, nas três cepas
previamente conhecidas, um resultado de falso positivo em aproximadamente
16%. Além disso, 40% das cepas de P. gingivalis não foram detectadas pelas
sondas de DNA. Os dados sugeriram que pelo menos parte das discrepâncias
relatadas entre a técnica de sonda de DNA e métodos de cultura tradicional
foram causadas pelos resultados falso positivo e falso negativo obtidos pela
técnica que utilizou a sonda de DNA, questionando o uso indiscriminado da
técnica na detecção de patógenos periodontais.
Papapanou et al. (1997) compararam a técnica de “Checkerboard
DNA-DNA Hybridization” com o método de cultura para análise da composição
da microbiota subgengival. Um total de 70 indivíduos apresentando uma
variedade de condições periodontais (desde gengivite até periodontite severa)
participou deste estudo, contribuindo com um total de 283 amostras. Cada
amostra bacteriana foi transferida para um Eppendorf contendo 300 µl de
solução PBS (Tampão Fosfato Sorensen) e então, suspendida por pipetação e
homogeneização no agitador de tubos. A amostra foi dividida em duas metades.
A primeira metade foi analisada pelo método de cultura tradicional enquanto a
segunda foi analisada pela técnica de checkerboard. A comparação dos dados
obtidos pelos dois métodos foi realizada após a conversão da contagem das
UFC (unidades formadoras de colônias) obtidas pela análise microbiológica
convencional, em escores, utilizadas como padrão pelo método de
checkerboard. O experimento demonstrou que quando os dados obtidos a partir
da cultura foram utilizados como referência, observou-se uma maior
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 52
especificidade da análise pelo checkerboard, demonstrando diferenças
significativas principalmente na quantificação microbiológica. No entanto,
espécies bacterianas não escaladas no início da pesquisa foram identificadas
quando foi realizada a análise de cultura tradicional, demonstrando o valor que
esse método ainda possui, já que foi possível de detectar o não esperado. A
detecção de maior número de bactérias pela técnica "Checkerboard DNA-DNA
Hybridization” quando comparadas aos métodos de cultura anaeróbia
evidenciou a importância do uso concomitante dos métodos para uma precisão
dos resultados, já que o próprio processamento dessas bactérias pode induzir
morte celular.
Socransky et al. (1998) analisaram, via utilização da técnica
“Checkerboard DNA-DNA Hybridization”, as espécies bacterianas obtidas nas
placas subgengivais e relacionando-as com características clínicas observadas
em pacientes com doença periodontal. Para a realização da análise, 185
indivíduos, divididos em periodontalmente saudáveis e com evidências de perda
periodontal, foram selecionados. Amostras de placas subgengivais foram
coletadas da região mesio-lingual de cada dente dos pacientes em cada visita
ao consultório. Cerca de 40 sondas de espécies bacterianas subgengivais
foram determinadas para cada amostra coletada. Esta analise reforçou a
correlação existente entre diferentes complexos microbiológicos, evidenciando
a maior prevalência dos micorganismos Bacterioides forsytos, Porphyromonas
gingivalis e Treponema denticola, relacionando-os diretamente às principais
alterações clínicas em pacientes periodontalmente comprometidos.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 53
A detecção de microrganismos anaeróbios pela técnica de cultura
torna-se um procedimento restrito em virtude das condições ideais de
processamento e manipulação para que essas bactérias de desenvolvam. Por
isso Sunde et al. (2000) utilizaram a técnica de hibridação DNA-DNA
checkerboard na detecção de microrganismos, predominantemente anaeróbios,
em lesões periapicais. Para este estudo, 34 pacientes com lesões periodontais
e periapicais foram divididos em dois grupos. No grupo 1, a coleta do material
da região periapical foi realizada mediante cirurgia com incisão marginal. No
grupo 2, uma incisão sub-marginal foi realizada para que se procedesse à
coleta do material. Essas amostras foram analisadas contra 40 espécies de
sonda bacteriana. Índices de detecção foram maiores nas amostras do grupo 1,
apoiando a idéia de que, seguindo uma incisão marginal, bactérias do sulco
periodontal poderiam alcançar os tecidos subjacentes através de bacteremia
ocasionada pelo cirurgião.
Um estudo realizado por Colombo et al. (2002), teve por finalidade
avaliar a microbiota subgengival de pacientes brasileiros periodontalmente
comprometidos e não tratados usando a técnica “Checkerboard DNA-DNA
Hybridization”. Este estudo incluiu 45 pacientes sem história de tratamento
periodontal anterior. Todos estes pacientes possuíam pelo menos sete sítios
com profundidade de sondagem maior ou igual a quatro milímetros. Amostras
de placas subgengivais foram coletadas de quatro sítios por dente. As amostras
foram processadas segundo o método descrito por Socransky et al. (1969).
Este experimento mostrou maior prevalência de microrganismos
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 54
periodontopatogênicos em sítios com maior profundidade de sondagem quando
comparadas com pacientes periodontalmente saudáveis. Espécies detectadas
em mais de 50% dos indivíduos incluíram: V. parvula, S. sanguinis, S. oralis
N.mucosa, A. naesllundi II e H. aphrophillus. Outro ponto bastante interessante
foi a detecção em alta prevalência de A. actinomycetemcomitans, não somente
em pacientes portadores de doenças periodontais, mas também em pacientes
periodontalmente saudáveis. Dessa forma, este estudo indicou que a microbiota
subgengival de brasileiros com periodontite crônica é similar às espécies
bacterianas na microbiota de adultos em populações ao redor do mundo.
Wall-Manning (2002) buscou comprovar a validade do método
checkerboard, na identificação de espécies bacterianas cariogênicas gram-
positivas e C. albicans na cavidade oral. Quarenta e oito espécies bacterianas
foram cultivadas nos meios de cultura apropriados. Suspensões contendo os
específicos microrganismos e amostras de pacientes com problemas
cariogênicos, possuindo prováveis sítios de bactérias gram-positivas, foram
utilizadas. Sondas, a partir dos DNAs, foram marcadas e quantificadas para
realização do experimento. Este teste confirmou a presença dos
microrganismos Gram-positivos nos pacientes selecionados e a necessidade de
um rigoroso critério, tanto para o preparo das sondas, quanto na pré-hibridação
e hibridação das amostras, a fim se obter uma detecção confiável desses
microrganismos.
Para demonstrar a utilidade da técnica de checkerboard na
determinação e quantificação bacteriana na cavidade oral, Socranscky et al.
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 55
(2004) avaliaram 8887 amostras de placa gengival de 79 pacientes
periodontalmente saudáveis e 8126 amostras de 166 indivíduos com diferentes
níveis de doença periodontal antes e após o tratamento periodontal. A coleta foi
realizada com auxílio de curetas esterilizadas de Gracey na face mesial de cada
dente analisado. Para análise dos resultados, as bactérias mais comumente
encontradas na cavidade oral foram selecionadas e, então suas sondas foram
marcadas. O marcador utilizado para este experimento foi a digoxigenina. Eles
constataram que, quando apropriadamente empregada, a técnica de
“Checkerboard DNA–DNA Hybridization” permite uma investigação etiológica e
quantitativa, dentro de limites, que não seriam viáveis em outros métodos de
análise. Este dado clínico demonstrou boa confiabilidade ao examinar a
microbiota em diferentes estados de doença e saúde. Outra vantagem, também
verificada no presente estudo foi a não necessidade de amplificação do DNA
bacteriano, favorecendo, além da economia de tempo, a quantificação próxima
do real dos microrganismos in situ.
Outro estudo, proposto por Dahle’n e Leonhardt (2006) avaliaram,
utilizando o método “Checkerboard’ DNA–DNA Hybridization”, a associação de
13 espécies bacterianas recentemente identificadas como causadoras de
doença periodontal, com outras 12 já previamente consideradas
periodontopatogênicas. Para realização do experimento, 50 indivíduos
portadores de problemas periodontais severos foram selecionados. A coleta de
materiais no interior dos sulcos foi realizada com cones de papéis absorventes.
Os controles das 25 espécies bacterianas foram quantificados em 10
4
,10
5
e 10
6
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 56
microrganismos a fim de que se pudessem ter parâmetros quantitativos da
presença dos microrganismos relatados nos pacientes. Das 25 espécies
selecionadas para a análise, 24 foram detectadas nas placas subgengival nos
sítios doentes. Tal experimento confirmou a presença majoritária dos
microrganismos listados mais recentemente como causadores de doença
periodontal em bolsas periodontalmente comprometidas, além da eficácia do
método ”Checkerboard’ DNA–DNA Hybridization” para esse fim.
A preocupação no modo e tempo de estocagem das amostras para
futura aplicação das técnicas microbiológicas é um fator fundamental na
confiabilidade dos resultados. Por tal motivo, Katsoulis et al. (2005) avaliaram a
eficácia da estocagem de amostras na detecção bacteriana em indivíduos
utilizando-se a técnica de “Checkerboard DNA-DNA Hybridization”. Após a
remoção da placa supragengival, amostras de placas gengivais de cinco sítios
diferentes, com profundidade de sondagem maior que seis milímetros, foram
coletadas com auxílio de curetas esterilizadas. As amostras foram estocadas
seguindo orientação proposta por Socranscky (1969), sendo divididas em
quatro alíquotas equivalentes, permitindo que cada uma sofresse um diferente
protocolo de análise: grupo 1: processamento realizado logo após a coleta das
amostras; grupo 2: amostras estocadas a +4°C por seis semanas antes do
processamento; Grupo 3: amostras estocadas a -20°C por seis meses antes do
processamento e grupo 4: amostras estocadas a +4°C por 12 meses antes do
processamento. Um total de 40 cepas bacterianas foi incluído no estudo. A
análise dos dados basearam-se nos seis complexos microbianos relacionados à
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 57
doença periodontal previamente relatados na literatura em um sétimo grupo
(complexo cinza) num total de 40 cepas de referência. Todas as análises
realizadas concluíram que a distribuição proporcional de patógenos do
complexo vermelho, em especial T. forsythensis, P. gingivalis e T. denticola,
permanece constante comparando-se os processamentos ocorridos
imediatamente e após seis semanas da coleta da amostra, mas mostrou-se
diferente quando esta análise foi realizada seis e 12 meses após a coleta do
material, mostrando a importância do correto processamento das amostras e a
necessidade de se seguir criteriosamente as condições ideais para
acondicionamento do material a ser analisado.
Agerbaek et al. (2006) compararam a microflora oral ao redor de
implantes e sítios dentais utilizando a técnica DNA checkerboard, onde 40
espécies de sondas bacterianas foram selecionadas. Foram coletadas amostras
de 127 implantes e de todos os dentes em 56 pacientes que realizaram terapia
de suporte periodontal. Após a coleta das amostras, os dados clínicos, como
profundidade de sondagem e sangramento gengival, foram aferidos em 6 sítios
dentais e peri-implantares. Os resultados mostraram profundidade de
sondagem superior a quatro milímetros em 16.9% dos sítios dentais, e em
26.6% dos implantes. Os sítios dentais com profundidade de sondagem
superior a quatro milímetros obtiveram três vezes maior quantidade de
microrganismos que nos sítios com profundidade similar em implantes. No
entanto, nenhuma diferença na composição microbiológica foi achada para
estes sítios. Maior quantidade de carga bacteriana foi encontrada em implante
BARBOSA, R. E. S. REVISTA DA LITERATURA - 58
com profundidade de bolsa maior ou igual a quatro milímetros. Os sítios dentais
abrigaram mais bactérias que os mesmos sítios ao redor dos implantes com
profundidade de sondagem comparáveis.
3 - PROPOSIÇÃO
BARBOSA, R. E. S. PROPOSIÇÃO - 60
Objetivos:
- Avaliar, in vitro, a passagem da espécie bacteriana Streptococcus
sobrinus, do interior para o exterior de implantes, por meio de sua interface com
o conector protético.
- Comparar dois métodos de análise da contaminação: método
tradicional de semeadura das amostras em meios de cultura e método de
hibridização de DNA checkerboard.
4 – MATERIAL E MÉTODOS
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 62
4.1 - Avaliação da passagem do microrganismo Streptococcus
sobrinus através da interface implante/conector
Seleção dos implantes
Para a avaliação da contaminação pela interface implante/conector
foram selecionados 20 implantes da marca SIN (Sistema de Implante, São
Paulo), com diâmetro de 3,25 mm e 8,50 mm de comprimento, 20 conectores
do tipo UCLA, com plataforma pré-fabricada em Cromo-Cobalto associada a
cilindro calcinável para sobrefundição, e os respectivos parafusos protéticos.
Todos os implantes se encontravam acondicionados em embalagens
lacradas e estéreis. Os componentes protéticos foram encerados, simulando a
confecção de uma base para aplicação de cerâmica, com volume padronizado,
e sobrefundidos em liga de Ni-Cr (Vera Bond II- Aldadent- Califórnia - USA), de
acordo com orientações do fabricante. Após a sobrefundição e usinagem, os
conectores protéticos foram selados individualmente em envelopes grau
cirúrgico e esterilizados em autoclave à temperatura de 121ºC, durante 30
minutos.
Preparo do inóculo
Para os testes de contaminação foi selecionada a bactéria
Streptococcus sobrinus (cocos gram-positivos) ATCC 27352, por estar presente
no biofilme dentário, sendo este, causa inicial do desenvolvimento de doenças
periodontais e perimplantares (LINDQUIST e EMILSON, 1991) e por essa
bactéria ser de fácil cultivo e caracterização. O microrganismo foi obtido junto à
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 63
Disciplina de Microbiologia Oral do Departamento de Análises Clínicas,
Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto da USP e reativado 48 horas antes do experimento.
Preparo do meio de cultura
Após a reativação do microrganismo, alíquotas de 100 µL foram
semeadas em Caldo de Sacarose Bacitracina (CaSa B) e incubadas a 37ºC por
48 horas em estufa bacteriológica.
Composição do Caldo Sacarose Bacitracina (CaSa B):
Casitona ........................Difco ..........................15,0 g
Extrato de levedura .......Difco ............................5,0 g
L- cisteína......................Merck...........................0,2 g
Sulfito de sódio..............Merck...........................0,1 g
Acetato de sódio............AnalytiCals ................20,0 g
Sacarose .......................Açúcar cristal...........200,0 g
Água destilada............... ..............................1000,0 mL
Os componentes do meio de cultura foram pesados em balança
elétrica Marte, modelo AS 2000 (São Paulo, Brasil) e transferidos para um balão
de Erlenmeyer. Em seguida, foi realizada a adição de 1000,0 mL de água
destilada e a homogeneização do meio. O balão de Erlenmeyer foi fechado com
tampão de algodão, encapsulado com papel e esterilizado em autoclave a 120
ºC por 20 minutos. Decorrido o período de esterilização, o balão foi mantido em
banho-maria para que o meio de cultura esfriasse gradualmente até atingir
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 64
cerca de 50 ºC, quando foi adicionado o antibiótico bacitracina (Sigma, EUA),
na proporção de 0,2 UI por mililitro. A bacitracina perde sua propriedade
antimicrobiana em temperatura superior a 57ºC. Sendo assim, a bacitracina não
pode ser autoclavada. Se o meio de cultura for conservado em geladeira (cerca
de 4ºC) poderá ser utilizado por um período máximo de sete dias, uma vez que
decorrido este tempo, a bacitracina perde a sua atividade antimicrobiana.
Este meio de cultura foi utilizado para a preparação do inóculo
microbiano de S. sobrinus (37 ºC por 48 horas) e imersão dos implantes (14
dias).
O meio de cultura Ágar Sacarose Bacitracina (SB
20
) foi utilizado para
verificar a pureza e a quantificação do inóculo microbiano de S. sobrinus (37 °C
por 24 horas).
Padronização da concentração
Em um balão Erlenmeyer com 500,0 mL de CaSa B foi semeado 1%
de uma alíquota de cultura jovem de S. sobrinus. Depois do período de
incubação à 37 ºC por 48 horas, o inóculo de S. sobrinus foi transferido para
tubos Falcon de 50,0 mL e centrifugados por 30 minutos. O sobrenadante foi
desprezado e o sedimento ressuspenso em solução fisiológica.
Com auxílio do espectrofotômetro Spectrophotomer 22 PC
(Spectrumlab), foi calibrada uma suspensão de S. sobrinus com absorbância de
2,722 em comprimento de onda de 625 nm com aproximadamente 10
7
unidades formadoras de colônia por mililitro de solução fisiológica (UFC/mL).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 65
A verificação da pureza da cultura foi realizada pela semeadura de
alíquotas em placas de Petri (20x100 mm) com meio de cultura SB
20
, que foram
incubadas em atmosfera de microaerofilia (chama de vela) a 37ºC por 48 horas
(Figura 1).
Segundo Westergren e Krasse (1978), a avaliação da quantidade de
S. sobrinus (UFC/mL) foi determinada pela diluição decimal seriada até 10
-8
, em
tubos de ensaio com 4,5 mL de solução fisiológica, e semeadura em sentido
horário de alíquotas/gotas de 50 µL das amostras in natura e diluídas na
superfície do meio de cultura SB
20
em placas de Petri (20x100 mm), de acordo
com a Figura 2.
Figura 1 – Placa de Petri contendo o microrganismo
S. sobrinus para verificação da pureza da cultura.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 66
Figura 2 – Placa de Petri contendo o microrganismo
S. sobrinus para avaliação da quantidade de
microrganismos viáveis presentes no inóculo utilizado
durante a fase experimental.
Contaminação controlada dos implantes
Medidas foram tomadas no sentido de evitar a contaminação externa
durante a execução das etapas experimentais. A bancada de trabalho foi
desinfetada com álcool a 70% e forrada com campos cirúrgicos estéreis. A
etapa de contaminação dos implantes foi realizada em câmara de fluxo laminar
(VECO, Campinas, SP, BR), ativada anteriormente com luz ultravioleta por 30
minutos. O experimento foi realizado na zona reservada do interior da capela,
na região asséptica do bico de Bunsen. Todo o instrumental utilizado foi
previamente esterilizado. Os operadores estavam paramentados com luvas,
gorro e máscara cirúrgica em todas as análises.
O volume da região interna dos implantes foi estimado em 6,0 µL.
Após alguns testes de inoculação de líquido nessa região, fixação dos
conectores protéticos parafusados, reabertura e coleta com aplicadores do tipo
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 67
Microbrush (Microbrush
®
, USA) de tamanho regular, verificou-se que o volume
ideal de inóculo para o experimento foi de 3,0 µL.
Na etapa de contaminação, cada implante foi retirado de seu
invólucro, apreendido com uma pinça estéril forte, tipo porta agulhas cirúrgico, e
mantido na posição vertical. Com uma pipeta automática (Gilson, França), e
ponteira esterilizada, foram transferidos 3,0 µL do inóculo para a região da
rosca interna de cada implante (figuras 3, 4 e 5).
Figura 3 – Embalagem do implante da marca SIN,
utilizado no experimento.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 68
Figura 4 – Implante apreendido com pinça tipo porta-agulha
para aplicação do inóculo.
Figura 5 – Pipeta de precisão, calibrada em 3,0 µL.
Com o auxílio de uma chave manual acoplado ao torquímetro, o
parafuso do conector protético foi rosqueado até que um torque de 32 Ncm
(figura 6, 7, 8, e 9).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 69
Figura 6 – Chave para o parafuso do conector
protético.
Figura 7 – Torquímetro.
Figura 8 – Implante, componente protético
(UCLA) e parafuso, separados e montados.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 70
Figura 9 – Aplicação do torque de 32Ncm, preconizado
pelo fabricante.
Para evitar penetração de meio de cultura e passagem de
microrganismos pela região interna do componente protético, foi realizada uma
cobertura com gutapercha no orifício superior e, em seguida, selamento da
interface material obturador/borda do componente, com três camadas de
adesivo Loctite Super Bonder (Henkel Ltda., Brasil; figura 10).
Figura 10 – Vedamento superior do componente protético
com gutapercha e adesivo a base de cianoacrilato.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 71
Controle da contaminação da superfície externa dos implantes
O conjunto implante/conector foi introduzido e mantido durante 30
segundos em um tubo de ensaio (12X75 mm) contendo 5,0 mL de CaSa B,
para teste de contaminação de sua superfície externa, eventualmente ocorrido
durante os procedimentos de deposição do inóculo (figura 11).
Figura 11 – Implante mergulhado no meio de
cultura CaSa B por 30 segundos.
Em seguida, o conjunto foi retirado e colocado em outro tubo de
ensaio (12x75 mm) também com 5,0 mL de CaSa B estéril, onde permaneceu
por 14 dias.
Controle da turvação do meio de cultura
Tanto os tubos que serviram como controle para possíveis
contaminações externas como os que fizeram parte do teste de passagem de
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 72
microrganismos através da interface implante/conector durante os 14 dias,
foram observados a cada 24 horas quanto à ocorrência ou não de turvação do
meio por um único observador, alheio aos procedimentos prévios (figura 12).
Figura 12 – Tubos de ensaio contendo o controle negativo
e o conjunto implante/conector.
Caso fosse observada a turvação do meio nos tubos que serviram de
controle para a contaminação da superfície externa dos conjuntos
implantes/conectores, seria considerada a hipótese de que esta poderia ter
ocorrido durante os procedimentos de contaminação controlada das regiões
internas dos implantes e fixação dos conectores. Isto ocorrendo, implicaria na
exclusão daquela amostra.
Caso fosse observada a turvação do meio nos tubos em que os
conjuntos implantes/conectores permaneceram por 14 dias, seria considerada a
hipótese da passagem do S. sobrinus através das interfaces de conexão.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 73
Como referência para o controle de turvação, foi utilizado um tubo de
ensaio contendo apenas o CaSa B esterilizado (controle negativo), sem
nenhum contato prévio com elementos externos.
Todos os tubos utilizados nos testes de contaminação foram
numerados, colocados em uma estante na posição vertical, e incubados à
temperatura de 37 °C em condição de microaerofilia (figura 13).
Figura 13 – A: Jarra de incubação dos tubos de ensaio; B: Condição de
microaerofilia obtida pela técnica de chama de vela.
Para confirmação da ocorrência ou não de contaminação, 0,1 mL do
conteúdo dos tubos de ensaio foi semeado em SB
20
e incubado por 48 horas à
37 ºC sob condições de microaerofilia (chama de vela).
Quando se observava a turvação do meio, a ocorrência era anotada
em prontuário experimental.
Decorrido o período de 14 dias de imersão em CaSa B, os conjuntos
implantes/conectores foram retirados dos tubos em zona asséptica, colocados
sobre papel absorvente e secados externamente com jatos de ar.
A
B
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 74
Coleta de material da região interna do implante
Após o teste de contaminação do meio de cultura, os conjuntos
implantes/conectores foram divididos em dois grupos para coleta de amostras a
serem utilizadas em comparações posteriores entre os métodos de cultura e do
checkerboard:
Grupo 1: para análise pelo método tradicional de cultura;
Grupo 2: para análise pelo método de hibridização de DNA
checkerboard.
Para a verificação da capacidade de absorção de líquido pela
microbrush, 20 Microbrushes (Microbrush
®
, USA) de tamanho regular, foram
pesadas em uma balança analítica elétrica (Mettre), sendo em seguida
imergidas (somente a ponta) em uma solução fisiológica, cuja densidade era de
1 µg/µL, e levadas novamente à balança para cálculo do volume. Este teste
permitiu determinar, aproximadamente, que fração do volume total do inóculo, a
ser depositado na região interna dos implantes, seria recolhida pela escova.
Cada conjunto foi apreendido com pinça tipo porta-agulha para
desaperto dos parafusos e remoção cuidadosa dos conectores.
Com o auxílio de microbrushes, foram coletadas amostras do material
presente nas roscas internas dos implantes e das roscas dos parafusos (figura
14).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 75
Figura 14 – Coleta do material do interior do implante.
As pontas das microbrushes do Grupo 1 foram cortadas próximo às
suas extremidades e depositadas em tubos Eppendorf de 1,5 mL, contendo 1,0
mL de solução tampão fosfato Sorensen (PBS). As do Grupo 2 foram
seccionadas do mesmo modo, mas depositadas em tubos Eppendorf com
150,0µL TE, aos quais foram adicionados 150,0 µL de NaOH 0,5 M (figura 15),
conforme Haffajee (1997).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 76
Figura 15 – Microbrush no interior de tubos
Eppendorf para análise pelo método de cultura ou
checkerboard.
4.2 - Comparação entre os métodos de cultura e checkerboard
na avaliação quantitativa da contaminação dos implantes
pelo Streptococcus sobrinus
Os 20 implantes utilizados previamente na avaliação da passagem do
Streptococcus sobrinus através da interface implante/conector foram
criteriosamente limpos, esterilizados, testados quanto a presença de DNA
remanescente e divididos em 2 grupos:
1 Grupo 1: composto por 10 implantes, para a análise pelo método
de cultura microbiana;
2 Grupo 2: composto por 10 implantes, para a análise pelo método
de hibridização de DNA checkerboard.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 77
Um volume de 3,0 µL de suspensão foi inoculado no interior desses
implantes. Decorrido 40 segundos da inoculação, com auxílio de uma
microbrush, coletou-se a suspensão. As pontas contendo as amostras foram
cortadas próximo à suas extremidades sendo 10 colocadas em tubos Eppendorf
(Axygen, USA) de 1,5 mL com 1,0 mL de solução fisiológica para serem
analisadas pelo método de cultura e as outras 10 em tubos Eppendorf (Axygen,
USA) de 1,5 mL contendo 150,0 µL de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH
7,6), para serem analisadas pelo método de análise de DNA checkerboard.
Dez amostras de 3 µL da suspensão utilizada para este teste foram
depositadas diretamente, com auxílio de uma pipeta automática (Gilson,
França), em tubos Eppendorf (Axygen, USA) de 1,5 mL contendo 150,0 µL de
TE e analisadas pela técnica de checkerboard. O resultado deste experimento
serviu como referência para a comparação da intensidade obtida destes sinais,
com àqueles obtidos pela captura do mesmo volume de solução inoculada no
interior dos implantes.
Processamento microbiológico pelo método checkerboard
O método utilizado na etapa de análise molecular bacteriana foi o de
hibridação DNA-DNA checkerboard, desenvolvido por Socransky et al. (1994),
com modificações. Alternativamente ao uso do anticorpo anti-digoxigenina,
descrito no protocolo original, optou-se pela anti-fluoresceína AP, mais
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 78
acessível em nosso país atualmente e com resultados comprovados em outros
métodos de hibridação de DNA.
Extração e purificação e quantificação do DNA bacteriano
Para a extração do DNA do S. sobrinus cultivado em meio CaSaB, a
suspensão foi inicialmente colocada em tubos Falcon de 50 mL e centrifugada a
13000 rpm por 15 minutos. O meio de cultura foi removido do tubo por
esgotamento, permanecendo apenas o “pellet”, ressuspendido em 300 µL de
lisozima 125 mg/mL homogeneizando-se com o auxílio de pipeta. O conteúdo
foi, então, dividido em Eppendorfs de 1,7 mL, sendo colocado 100 µL em cada
tubo. Após incubação a 37 °C por uma hora, foram acrescidos 500 µL de GES
(60% tiocianato de guanidina; 0,5% Sarkosyl; EDTA 0,1 M), misturando-se
gentilmente por 10 minutos. Duzentos e cinqüenta microlitros de acetato de
amônio (pH 7,5) foram adicionados aos tubos, imersos, em seguida, em gelo
moído por 10 minutos. Após a adição de 500 µL de clorofórmio/2-pentanol,
procedeu-se à agitação vigorosa por 10 minutos e à centrifugação a 13000rpm
por mais 10 minutos (figura 16).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 79
Figura 16 – Centrifugação dos tubos Eppendorf.
A fase presente acima do “disco” de impurezas, formado após a
centrifugação, foi transportada para outro tubo Eppendorf de 1,7 mL estéril
(figura 17).
Figura 17 – Formação do tampão no Eppendorf após a centrifugação.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 80
A este novo tubo foram acrescidos 875 µL de etanol 100%, na
temperatura aproximada de -20 °C. O conjunto foi gentilmente homogeneizado
e armazenado a -20 °C “overnigth”. Após 24 horas, os tubos foram
centrifugados, o sobrenadante foi descartado e 1,0 mL de etanol 70% gelado foi
acrescido para armazenamento do material a -20 °C.
Para limpeza e purificação do DNA presente, os tubos foram
novamente centrifugados por um minuto a 13000rpm, o sobrenadante foi
desprezado e 1,0 mL de etanol 70% foi adicionado e homogeneizado com
pipeta. Foi realizada nova centrifugação por 1 minuto, o sobrenadante foi
novamente descartado e o etanol residual removido com auxílio de papel
absorvente estéril. Cem microlitros de TE foram então adicionados para
armazenamento a 4 °C, até a dissolução completa do material.
Após 24 horas, foram adicionados 100 µL de clorofórmio/álcool
isoanídrico na proporção 24:1, e 100 µL de fenol, agitando-se vigorosamente
por dois minutos. O material foi centrifugado a 13200 rpm por cinco minutos
para separação de fases. O volume acima do tampão formado após
centrifugação foi transportado para outro tubo Eppendorf de 1,7 mL, estéril.
Este procedimento foi repetido por mais duas vezes, sendo que da última não
foi adicionado o fenol. O volume total, contendo o DNA limpo e purificado do
microrganismo, foi de 150µL.
Após os processos de extração e limpeza, o DNA obtido foi analisado
em gel de agarose para verificação do seu grau de pureza.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 81
Para a quantificação do DNA existente em suspensão, a 5 µL do total
de 150 µL, foram adicionados 95 µL de solução de RNAse, na concentração de
20 µg/mL. Os 100 µL de solução foram divididos em dois tubos de Eppendorf. A
cada tubo foram adicionados 950 µL solução tampão (TE). Essas soluções
foram levadas ao aparelho Spectrophotometer V-2001 (Hitachi, Japan), sendo
comparadas com uma solução padrão, composta de 100 µL de Rnase e 900 µL
de TE. Para comparação, o material genético foi também quantificado no
aparelho GeneQuant pro (Amersham Pharmacia Biotech, UK). Após os
processos de extração e purificação, o DNA estava pronto para utilização no
experimento.
Preparo da sonda de DNA
Sondas de DNA cromossômico marcadas com fluoresceína foram
preparadas pelo método random primer (FEINBERG e VOGELSTEIN, 1983).
Para marcação do DNA e confecção da sonda, 1,0 µg do material genômico da
bactéria (2,78 µl) foi incorporado a 31,22 µL de água deionizada, em um tubo
Eppendorf de 0,5 mL, completando um volume de 34 µL. Os DNAs foram
desnaturados pela imersão do tubo em água fervente por 5 minutos e, em
seguida, em gelo moído. Com a finalidade de precipitar possíveis resíduos que
podem se formar na tampa, devido à condensação da solução durante a
fervura, foi realizada uma breve centrifugação. Foram acrescentados, então, o
Nucleotide Mix (10 µL; Amersham Biosciences, UK) e o Primer Solution (5 µL;
Amersham Biosciences, UK), sempre sob refrigeração. Após a incubação
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 82
durante a noite, a 25 ºC, acrescentou-se EDTA 20 mM ao tubo, para estocagem
a -20 ºC.
Para verificação da eficácia da marcação da sonda, diluições do Nucleotide Mix
em solução tampão TE (pH 8,0), foram realizadas nas proporções de 1/5, 1/10,
1/25, 1/50, 1/100, 1/250 e 1/500, como padrões de referência. Um volume de
5,0 µl de cada uma destas diluições foi colocado sobre uma fita da membrana
Hybond N+ (Amersham Bioscieces). Em outra fita foram colocadas amostras
com 5,0 µL da sonda marcada do S. sobrinus e 5 µL do Nucleotide Mix na
diluição 1/5. Esta segunda fita foi então imersa em 150 mL de solução SSC 2X
e lavada por 30 minutos a 60°C. Esta lavagem teve por objetivo remover os
nucleotídeos não aderidos à sonda. Por não ter nenhuma ligação à sonda, a
diluição 1/5 foi completamente removida da membrana durante a lavagem,
demonstrando a eficácia desse processo. As duas fitas foram levadas ao
aparelho Transluminador (MacroVue UV-20, Heofer Scientific, USA) e, através
da comparação visual da intensidade da fluorescência, foi realizada a análise.
Preparo e calibração das amostras-controle
A partir da concentração inicial de 3,26 µg/µL do DNA genômico do S.
sobrinus, foi realizada uma diluição de 1:10, resultando numa solução com
concentração final de 0,33 µg/µL.
Para a elaboração das amostras-padrão, correspondentes à
quantidades de 10
5
, 10
6 e
10
7
células do microrganismo, partiu-se de uma
concentração de DNA de 0,5 µg/mL. Baseando-se no peso molecular médio do
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 83
DNA genômico de uma célula bacteriana, estimou-se que 0,2 mL dessa solução
correspondiam a 10
7
células bacterianas. Assim, a uma alíquota de 800 µL de
TE, pH 8,0, foi adicionada a 200 µL dessa solução, resultando numa
concentração de 0,1 µg/mL. Coletando-se 10 µL dessa solução-mãe, obteve-se
10
5
microrganismos, em 100 µL, obteve-se 10
6
microrganismos e a partir de 20
µl da solução na concentração 0,5 µg/mL obteve-se 10
7
microrganismos.
Preparo da amostras colhidas dos implantes
Inicialmente, os Eppendorfs foram homogeneizados por um período
de dois minutos em agitador de tubos AP 56 (Phoenix, Brasil). As pontas das
microbrushes foram então removidas com auxílio de pinças clínicas
previamente esterilizadas.
Todos os Eppendorfs analisados pela técnica “Checkerboard DNA-
DNA Hybridization”, tanto das amostras quanto dos controles, foram levados a
banho-maria em água fervente por cinco minutos e, em seguida, resfriados em
gelo, a fim de evitar o religamento das cadeias duplas dos DNAs bacterianos.
Os tubos foram, então, rapidamente centrifugados, com o intuito de remover
materiais precipitados formados na tampa durante a fervura, voltando, em
seguida, ao gelo. As amostras foram finalmente neutralizadas com 0,8 mL de
acetato de amônio a 5 M para aplicação no aparelho Minislot 30 (Immunetics,
USA).
Distribuição das amostras no aparelho Minislot 30
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 84
O aparelho Minislot 30 permitiu a deposição de amostras diferentes
em “faixas” individuais, sobre uma única membrana de nylon de 15X15
centímetros, além de amostras-controle de 10
5
, 10
6
e 10
7
células de cada
espécie a ser testada (figura 18).
Figura 18 – Aparelho Minislot, desmontado para a colocação da membrana de
nylon.
Para cada estudo foram utilizadas 13 canaletas, sendo três
correspondentes às concentrações-controle. Primeiramente, o Minislot foi
acoplado a uma bomba de vácuo produzida por tromba-d’água. Quatorze
quadrados (15 X 15 centímetros) de papel filtro foram cortados, umedecidos em
água deionizada estéril e colocados sobre a metade inferior do Minislot. Uma
membrana de nylon Hybond N+ (Boehringer, Mannheim), também cortada no
tamanho de 15X15 centímetros, foi pré-umedecida em água deionizada estéril e
posicionada sobre a face inferior da peça superior do Minislot. A parte inferior
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 85
do aparato foi, então, encaixada sobre a parte superior e os parafusos de
fixação apertados em posição. Em seguida, o vácuo foi acionado para remoção
do excesso de água presente na membrana (figura 19).
Figura 19 – Tampa do Minislot acoplada a sua base, com a
membrana já em posição.
A aplicação de alíquotas de 1,1 mL de cada amostra foi realizada a
partir de uma das extremidades das canaletas e o aparato foi inclinado para que
o líquido preenchesse toda a sua extensão. Cinco minutos após o
preenchimento da última canaleta utilizada o vácuo foi acionado por três
minutos. A bomba de vácuo foi então desligada, 1,0 mL da solução tampão
(TE), pH 8,0, foi depositado em cada canaleta e a bomba religada. Este
procedimento foi realizado por mais uma vez (figura 20).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 86
Figura 20 – Aplicação das amostras na canaleta do aparelho Minislot.
O aparato foi aberto e a membrana removida, deixando-a secar a
temperatura ambiente sobre um papel filtro esterilizado.
A membrana foi, a seguir, embrulhada em papel filtro e levada ao
forno de hibridação (Hybridization Oven/Shaker, Amersham Biosciences, UK), a
80 ºC por duas horas para fixação do DNA presente nas amostras (figura 21).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 87
Figura 21 – Forno de Hibridação.
Pré-hibridação da membrana
A membrana foi umedecida em 50 mL de solução de SSC 2X, em
uma bacia, sob agitação manual, por cinco minutos. Em seguida, foi colocada
em uma caixa de acrílico contendo 100 mL de solução de pré-hibridação, e
levada ao forno de hibridação à 42 ºC, ajustado para agitação em cinco
rotações por minuto, “overnight”.
Composição da solução de pré-hibridação:
SSC...............................................................................5X
SDS...........................................................................0,1%
DEXTRAN.................................................................5,0%
LIQUID BLOCK (Amersham Biosciences) .................20X
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 88
Aplicação da sonda no aparelho Miniblotter 45
As sondas para hibridação foram preparadas a partir das sondas
marcadas na concentração de 9 ng/mL. À alíquota de 3 µL da sonda
previamente calibrada foi acrescida água deionizada até um volume final de 20
µL. Em seguida, o Eppendorf contendo a sonda foi mergulhado em água
fervente por cinco minutos, resfriado em gelo, centrifugado por oito segundos,
novamente resfriado e mantido em gelo. Após estes procedimentos,
acrescentou-se, a cada Eppendorf, 130 µL de solução de hibridação. A
composição da solução de hibridação foi a mesma que a de pré-hibridação. As
sondas assim preparadas estavam prontas para aplicação sobre as amostras,
no aparelho Miniblotter 45.
Uma almofada 15 X15 (Immunetics, USA) foi aplicada sobre a parte
inferior do Miniblotter 45 (Immunetics, USA) cobrindo-a com uma camada de
filme de PVC (figura 22).
Figura 22 – Miniblotter desmontado, com
almofada de cobertura.
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 89
Na parte superior do aparato, a membrana de nylon foi colocada com
a face em que estavam fixadas as amostras, voltada para as canaletas. A
membrana foi posicionada de modo que as faixas contendo as amostras
ficassem dispostas em ângulo de 90º em relação às canaletas do aparelho.
À semelhança do aparelho anterior, a parte superior do Miniblotter foi
encaixada e apertada por meio de parafusos, removendo-se o excesso de
solução de pré-hibridação com auxílio de uma ponteira de pipeta ligada ao
vácuo.
A sonda de DNA cromossômico marcada com fluoresceína,
previamente preparada, foi depositada sobre uma canaleta de forma a
preenchê-la em toda a sua extensão (figura 23).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 90
Figura 23 – Aplicação da sonda na canaleta.
As canaletas que não receberam sonda foram preenchidas com
solução de hibridação (150 µL). Após o preenchimento de todas as canaletas,
os Manifolds F2 (Immunetics, USA) foram encaixados nas extremidades do
aparato, a fim de minimizar a evaporação da solução depositada nas canaletas
durante o período de hibridação (Figura 24).
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 91
Figura 24 – Manifold F2 adaptado ao aparelho
Miniblotter.
Em seguida, foram colocados papéis umedecidos com água
destilada estéril sob o aparelho e o conjunto embrulhado em filme (PVC). Ainda,
no sentido de evitar qualquer evaporação da solução durante o processo de
hibridação, o aparelho foi depositado em saco plástico transparente contendo
gazes umedecidas com água destilada estéril.
O aparato empacotado da forma descrita foi deixado no forno de
hibridação pré-aquecido a 60 ºC por 20 horas, sob leve agitação no sentido das
canaletas.
Lavagem da membrana, bloqueio, aplicação da anti-fluoresceína e
remoção de anticorpo livre
Após 20 horas, os invólucros foram retirados do aparato e, sob ação
da bomba de vácuo, o excesso de solução de hibridação foi removida. Em
seguida, o aparato foi aberto e a membrana retirada do aparelho. Após o
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 92
esgotamento da solução residual, a membrana foi banhada por duas vezes em
450 mL de solução SSC 1X e SDS 0,1% (sodium dodecyl sulfate; SIGMA,
USA), pré-aquecida a 65 ºC, por 15 minutos, renovando a solução para o
segundo banho.
A membrana foi, a seguir, removida da solução de lavagem,
deixando-se escorrer o excesso, e mergulhada em 160 mL de uma solução de
bloqueio com a composta de:
LIQUID BLOCK (Amersham Biosciences) ................... 16,0 mL
BUFFER A (esterilizado) ............................................ 144,0 mL
A solução foi depositada sobre a membrana em recipiente plástico,
levada ao forno de hibridação, à temperatura ambiente, por 1 hora, sob
agitação máxima.
Para a detecção dos híbridos, uma solução contendo o anticorpo
anti-fluoresceina AP (Amersham Biosciences, UK) foi preparada imediatamente
antes da aplicação desta na membrana. Para aplicação numa área de 15X15
centímetros, correspondente à membrana utilizada, foi calculado um volume de
aproximadamente 68 mL de solução.
Composição da solução contendo anticorpo:
BSA fração V (Sigma)................................................... 34,0 g
BUFFER A (esterilizado) .............................................. 68,0 mL
Anti-fluoresceína (Amersham Biosciences).................. 13,6 µL
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 93
A membrana imersa na solução contendo o anticorpo foi mantida no
forno de hibridação por uma hora, à temperatura ambiente e sob agitação, em
uma velocidade de cinco rotações por minuto.
Para remover os anticorpos não aderidos ao DNA microbiano, foram
realizados três banhos de 10 minutos em 500,0 mL de solução de lavagem, no
forno de hibridação, em temperatura ambiente, sob máxima agitação e
renovando a solução após cada banho.
Composição da solução de lavagem:
BUFFER A (esterilizado) ........................................... 1500 mL
TWEEN 20 (sigma)......................................................... 4,5 mL
Detecção, exposição, revelação e avaliação das reações de hibridação
Após a lavagem, foram depositados 6,7 mL do reagente de detecção
(CDP-star detection reagent, Amersham Biosciences, UK), espalhados com um
bastão de vidro esterilizado por toda a superfície, durante cinco minutos.
A membrana foi, então, colocada sobre uma lâmina de papel
alumínio, embrulhada e levada ao forno, a 37 ºC, por uma hora, a fim de se
aguardar o período de estabilização do sinal emitido pelas sondas que
apresentaram reações positivas com as amostras.
Após esse período, a membrana foi retirada do papel alumínio e
lacrada em plástico transparente com seladora térmica (Barbi, Brasil). A
superfície do plástico foi limpa com auxílio de gaze umedecida em álcool 70% e
o conjunto levado ao Hypercassete
TM
(Amersham Biosciences, UK), em contato
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 94
com filme radiográfico Hyperfilm
TM
(Amersham Biosciences, UK), para
exposição por um período de cinco minutos. Em seguida, o filme foi revelado e
fixado em soluções para processamento radiográfico (Kodak, Brasil).
Concluído o processo de revelação, o filme foi fotografado sobre um
painel luminoso (Visual Plus SV-450, Taiwan) com câmera digital (Coolpix 995,
Nikon, Japan). A imagem obtida foi analisada visualmente, sobre o painel
luminoso, e com o auxílio do programa ImageQuant TL (Amersham
Biosciences, USA). Nesta análise, a não detecção de sinal foi interpretada
como zero, embora conceitualmente entre 1 e 1000 células pudessem estar
presentes. As reações positivas foram avaliadas quantitativamente por
comparação com os sinais quimiluminescentes observados nas
amostras-padrão, nas concentrações correspondentes a 10
5
, 10
6
e 10
7
células
bacterianas, e classificadas em escores da seguinte forma:
0: não houve detecção de sinal quimiluminescente;
1: o sinal apresentou menor intensidade que o controle 10
5
células;
2: o sinal foi aproximadamente igual ao observado para o controle 10
5
células;
3: o sinal apresentava intensidade maior que 10
5
e menor que 10
6
células;
4: a intensidade do sinal era aproximadamente igual ao de 10
6
células;
5: a intensidade do sinal era maior que o de 10
6
células.
Processamento microbiológico pelo método de cultura
microbiana
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 95
Os tubos Eppendorf (Axygen, USA) contendo as amostras foram
agitados de forma descontínua por dois minutos em um aparelho agitador
(Mixtrom-Topctronix), em velocidade máxima, com o intuito de desagregar o
material coletado do interior dos implantes das cerdas das microbrushes.
Para verificar se ainda havia bactéria viável nas cerdas após o
processo de agitação e remoção da escova, uma microbrush foi depositada em
tubo de ensaio contendo 5,0 mL de meio de cultura CaSa B,
o qual foi levado
para incubação em condições de microaerofilia por 48 horas à 37 °C (figura 25
e 26).
Figura 25 – A: agitação do conteúdo dos tubos; B: remoção da escova microbrush.
A
B
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 96
Figura 26 – Microbrush imersa em tubo de ensaio.
Preparo do meio de cultura
O meio de cultura selecionado para a avaliação da contaminação dos
implantes pelo S. sobrinus foi o Agar Sacarose Bacitracina (SB
20
).
Composição do Ágar Sacarose Bacitracina (SB
20
):
Casitona ........................Difco ..........................15,0 g
Extrato de levedura .......Difco ............................5,0 g
L- cisteína......................Merck...........................0,2 g
Sulfito de sódio..............Merck...........................0,1 g
Acetato de sódio............AnalytiCals ................20,0 g
Sacarose .......................Açúcar cristal...........200,0 g
Ágar...............................Difco ..........................15,0 g
Água destilada............... ..............................1000,0 mL
Para o preparo deste meio, os componentes foram pesados em
balança elétrica Marte, modelo AS2000 (São Paulo, SP, BR) e transferidos para
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 97
um balão de Erlenmeyer. Em seguida, foi realizada a adição de 1000 mL de
água destilada e a homogeneização do meio. O balão de Erlenmeyer foi
fechado com tampão de algodão, encapsulado com papel e esterilizado em
autoclave a 120 ºC por 20 minutos. Decorrido o período de esterilização, o
balão foi mantido em banho-maria para que o meio de cultura esfriasse
gradualmente até atingir cerca de 50 ºC, quando foi adicionado o antibiótico
bacitracina (Sigma, EUA), na proporção de 0,2 UI por mililitro.
Inoculação em placa de Petri
Diluições decimais seriadas, a partir de um volume de 500 µL do
inóculo inicial, foram realizadas até 10
-4
, em 4,5 mL de Tampão Fosfato
Sorensen, em zona asséptica e fluxo laminar. Um volume de 50 µL das
amostras puras e de cada diluição foi depositado em placas Petri (20x100 mm)
contendo meio de cultura SB
20
, com o auxílio de pipeta centesimal esterilizada.
Durante a semeadura, as placas permaneceram sobre bandejas de alumínio
desinfetadas com álcool 70%, flambadas e em zona asséptica. Após a
semeadura do material, as placas foram flambadas em toda a superfície,
transferidas para o ambiente de incubação e incubadas em microaerofilia,
obtida por meio do sistema de chama de vela em jarra hermeticamente vedada.
Contagem de microrganismo
Após o período de incubação de 48 horas das amostras em placas de
Petri (20x100 mm), a avaliação da quantidade de S. sobrinus (UFC/mL) foi
BARBOSA, R. E. S. MATERIAL E MÉTODOS - 98
determinada a partir da diluição decimal seriada até 10
-4
, em tubos de ensaio
com 4,5 mL de solução fisiológica, e semeadura em sentido horário de
alíquotas/gotas de 50 µL das amostras in natura e diluídas na superfície do
meio de cultura SB
20
em placas de Petri, de acordo com os critérios descritos
por Westergren e Krasse (1978; Figura 27).
Figura 27 – Colônias bacterianas desenvolvidas em
meio SB
20
.
5 – ANÁLISE ESTATÍSTICA
BARBOSA, R. E. S. ANÁLISE ESTATÍSTICA - 100
A comparação entre os diferentes métodos de análise laboratorial foi
realizada utilizando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney U. Para a análise
da influência do tempo na quantificação bacteriana, foi utilizado o teste não-
paramétrico de Wilcoxon Signal-Rank Test, com auxílio do software NCSS
(Number Cruncher Statistical Software). Diferenças com o valor de p<0,05
foram consideradas significantes.
6 - RESULTADOS
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 102
Dos 20 conjuntos implantes/conectores selecionados para a análise
da passagem bacteriana através da interface, 2 foram excluídos em virtude de
contaminações externas ocorridas durante os processos de inoculação do
microrganismo no interior dos implantes e conexão.
A tabela 1 mostra os resultados do teste de contaminação externa
provocada pelo processo de inoculação do microrganismo, e do teste de
contaminação do meio de cultura após os 14 dias de imersão dos conjuntos
implantes/conectores no meio de cultura CaSa B. Dos 18 conjuntos avaliados, 6
apresentaram evidências da passagem do S. sobrinus pela interface
implante/conector após o período avaliado (figura 28).
Tabela 1 – Seleção das amostras viáveis e índice
de implantes contaminados durante o período de
14 dias.
Implante
Teste de
contaminação
prévia
Passagem pela
interface
implante/conector
1- -
2- +
3- +
4 + Excluído
5- -
6- -
7- +
8- -
9- -
10 - -
11 - -
12 - +
13 - -
14 - +
15 - -
16 - -
17 + Excluído
18 -
+
19 - -
20 - -
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 103
Figura 28 – Freqüência de contaminação do meio CaSa
B, em que estavam imersos os 18 conjuntos
implantes/conectores, após 14 dias.
A absorbância do DNA do S. sobrinus após os processos de extração
e purificação, obtida pela razão entre os comprimentos de onda de 260 nm e
280 nm foi de 1,94, considerado satisfatório para a confecção da sonda. A
quantidade total de DNA obtida foi de 489 µg, num volume final de 150 µL de
solução TE.
As figuras 29 e 30 ilustram o resultado alcançado na etapa de
marcação da sonda preparada com o DNA do S. sobrinus. Na primeira imagem,
pode-se observar as marcas fluorescentes produzidas na fita controle de
membrana Hybond N+, após gotejamento de 6 diferentes diluições de
Nucleotide Mix. A imagem seguinte corresponde à marcação obtida pela sonda,
de intensidade semelhante à diluição 1/10 da fita controle, adequada para os
testes de hibridação.
Implantes
contaminados
Implantes não
contaminados
0,7
0,3
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 104
Figura 29 – Fita controle de membrana Hybond N+ com 6 diferentes diluições de
Nucleotide Mix, vista por transluminação.
Figura 30 – Sinal fluorescente produzido pela sonda de DNA de S. sobrinus
sobre membrana Hybond N+, vista por transluminação para comparação com
fita controle.
A capacidade de absorção de solução salina pelas microbrushes
utilizadas no experimento foi de 6,12 ± 0,24 µL (média ± desvio padrão), um
volume duas vezes superior, portanto, ao do inóculo de S. sobrinus depositado
no interior dos implantes.
O crescimento de colônias de S. sobrinus no meio de cultura CaSa
B, após processo de coleta do material inoculado nos implantes, deposição da
ponta da microbrush em 1 mL de solução salina, agitação e remoção da
escova, pode ser observado na figura 31. Esse resultado indica que parte das
bactérias coletadas do interior dos implantes permaneceu aderida na escova
após sua remoção do Eppendorf contendo TE.
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 105
Figura 31 – Microbrush e colônias de S. sobrinus em meio de cultura CaSa B após 48 horas de
incubação.
A tabela 2 apresenta os dados obtidos na análise das amostras
coletadas com microbrushes do interior dos implantes, imediatamente após a
deposição de 3,0 µL de inóculo de S. sobrinus, e de amostras de 3,0 µL do
mesmo inóculo, mas coletadas com pipeta, ambas pelo método checkerboard.
Seis das 10 amostras coletadas com pipetas receberam escore 5, enquanto
todas as coletadas com microbrush apresentaram escore 3. Esta diferença
corresponde a quantidades menores de células bacterianas detectadas a partir
da coleta pela microbrush e foi significante a um nível de p = 0,002.
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 106
Tabela 2 – Escores obtidos a partir da análise pelo método checkerboard de amostras
coletadas com pipeta (3,0 µL), diretamente do inóculo e de amostras coletadas com
microbrushes do interior dos implantes, imediatamente após a deposição de 3,0 µL do mesmo
inóculo.
Amostra Inóculo
Microbrush
Im
p
lante
1
53
2
33
3
53
4
53
5
53
6
43
7
53
8
53
9
33
10
33
Mediana
53
Os resultados da aplicação dos métodos de cultura e checkerboard
na avaliação quantitativa da contaminação dos implantes pelo S. sobrinus estão
ilustrados na figura 32. Para a comparação estatística entre métodos, os
números de UFC correspondentes às contagens em meio SB
20
foram
convertidos em escores. Na tabela 4 estão reunidos os dados originados a
partir da aplicação dos dois métodos em amostras coletadas imediatamente ou
14 dias após a inoculação dos implantes. Pode-se observar a constância nos
valores dos escores para as amostras coletadas imediatamente após a
contaminação.
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 107
De maneira geral, os valores obtidos com o checkerboard foram
significativamente maiores que os encontrados com o método de cultura (p <
0,001).
Em ambos os métodos, a detecção de microrganismos foi menor para
as amostras coletadas 14 dias após a contaminação dos implantes do que para
aquelas cuja coleta foi realizada logo em seguida à aplicação do inóculo
(p<0,05; tabela 3, figura 33).
Figura 32 – A: Sinais quimioluminescentes em películas radiográficas (Hyperfilm) obtidas pelo
método checkerboard: De cima para baixo: amostras coletadas do inóculo com pipeta (3,0 µL);
amostras coletadas com microbrushes do interior dos implantes imediatamente após a
deposição do mesmo inóculo; amostras coletadas com microbrushes do interior dos implantes
após 14 dias de incubação. B: Colônias de S. sobrinus em meio SB
20
em placas de Petri,
obtidas pela coleta de amostras do interior dos implantes com microbrushes pelo método de
cultura após 14 dias de incubação.
BARBOSA, R. E. S. RESULTADOS - 108
Tabela 3 – Escores e valores absolutos x 10
5
(UFC), obtidos pelos métodos checkerboard e de cultura, a
partir de amostras coletadas do interior dos implantes, imediatamente e 14 dias após a inoculação de 3,0
µL S. sobrinus em meio CaSa B.
Escore
* Ŧ
Num. abs. Escore
* ρ
Num. abs. Escore
# Ŧ
Num. abs. Escore
# ρ
Num. abs.
1
3 5,50 0 0,00 1 0,34 0 0,00
2
3 5,50 3 5,50 1 0,40 1 0,13
3
3 5,50 3 5,50 1 0,54 0 0,00
4
3 5,50 0 0,00 1 0,21 1 0,23
5
3 5,50 2 1,00 1 0,40 0 0,00
6 3 5,50 4 10,00 1 0,42 0 0,00
7 3 5,50 2 1,00 1 0,30 1 0,13
8
3 5,50 3 5,50 1 0,62 0 0,00
9
3 5,50 0 0,00 1 0,54 0 0,00
10
35,50
--
10,42
--
Mediana
3 5,50 2 1,00 1 0,41 0 0,00
*, # - Diferenças estatística entre os índices detectados pelo teste Wilcoxon Signal-Rank Test (p < 0,05).
Ŧ, ρ - Diferenças estatística entre os índices detectados pelo teste Mann-Whitney U (p < 0,05).
Cultura
Amostra
Checkerboard
14 diasImediato14 diasImediato
Figura 33 – Medianas em escore dos resultados obtidos pelas técnicas de
quantificação checkerboard e método tradicional de cultura imediatamente e
após 14 dias de inoculação nos implantes.
7 - DISCUSSÃO
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 110
Neste estudo avaliou-se, in vitro, a passagem da espécie bacteriana
Streptococcus sobrinus, do interior para o exterior de implantes, através de sua
interface com o conector protético.
A adaptação adequada entre o componente protético e o implante é o
objetivo primário almejado durante a confecção de próteses sobre implante
(HECKER et al., 2006). Sabe-se que a presença de fendas entre os
componentes parafusados e a plataforma dos implantes favorece a passagem
de microrganismos do meio externo para o interior dos implantes e em sentido
contrário (GROSS et al., 1999; PIATTELLI et al., 2001; WAHL et al., 2004). Nos
sistemas de apenas um estágio cirúrgico, a margem da prótese cimentada é
acentada diretamente sobre o implante e os espaços entre ambos são
preenchidos pelo agente de cimentação. A interface entre os elementos, nesse
caso, se situa a aproximadamente três milímetros do rebordo alveolar. Nos
sistemas de dois estágios cirúrgicos, a plataforma do implante é posicionada
mais próxima do rebordo alveolar, o que implica no uso de um conector
protético intermediário, parafusado, que servirá de base para uma prótese
parafusada ou cimentada. Outra possibilidade é o uso de um componente do
tipo UCLA, necessariamente parafusado sobre o implante. Nesses sistemas
associados, tanto próteses parafusadas quanto intermediários parafusados que
podem servir de suporte para próteses parafusadas ou cimentadas, sempre
haverá uma interface de união entre o implante e o componente protético, cujas
fendas ou microgaps não estarão preenchidas por um agente de cimentação.
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 111
Clinicamente, a perda óssea marginal ao redor dos implantes
dentários está diretamente relacionada à existência da interface
implante/conector protético na crista alveolar, o que pode favorecer a
manutenção de um processo inflamatório crônico na área pelo acúmulo de
bactérias (QUIRYNEN et al., 2002). Por meio de avaliação microbiológica, é
possível correlacionar esta possibilidade, a qual não pode ser analisada
isoladamente, uma vez que o desenvolvimento da doença peri-implantar está
associado a diversos fatores de risco, assim como: higiene bucal, microbiota
residente, histórico de doença periodontal e tabagismo (BOSTRÖM et al., 2001;
QUIRYNEN et al., 2002).
A análise da contaminação bacteriana avaliada in vitro nos permite
extrapolar resultados para a prática clínica, uma vez que a seleção dos
implantes deverá respeitar aqueles, cuja capacidade de infiltração bacteriana
esteja em um nível não prejudicial aos tecidos periodontais.
A mensuração do espaço na interface implante/conector protético tem
sido estudada por diversos autores que tentaram correlacionar seu aumento ou
freqüência com o grau de infiltração bacteriana (STEFLIK et al., 1991;
TRAVERSY e BIREK, 1992; ORSINI et al., 2000; PIATTELLI et al., 2001;
HANGGI et al., 2005).
Em relação à avaliação do grau de contaminação externa através da
interface implante/conector, 20 conjuntos implante/conectores foram
selecionados. O volume da região interna dos implantes, aferido durante os
testes de inoculação de solução salina e fixação dos conectores protéticos, foi
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 112
de 6,0 µL. Desta forma, optou-se pela inoculação de um volume de 3,0 µL da
suspensão a fim de evitar extravasamento durante o torque padronizado.
O período de 14 dias para observação da contaminação externa dos
implantes através da interface corrobora com o estudo de Koka et al. (1993)
que verificaram que a colonização bacteriana subgengival se processa nesse
mesmo intervalo de tempo. Nakazato et al. (1991) verificaram que em quatro
horas ocorre formação de colônias bacterianas na superfície dos conectores
protéticos, logo, na interface implante/conector protético, existe esta
possibilidade.
Neste experimento, no entanto, dois conjuntos foram excluídos em
virtude de contaminações externas ocorridas durante os processos de
inoculação do microrganismo. Estas evidências de contaminação foram
detectadas, devido ao fato de que houve crescimento bacteriano nos tubos de
ensaio controle onde os implantes foram imersos por 30 segundos, antes de
sua incubação de 14 dias. Desta forma, a avaliação da passagem do S.
sobrinus pela interface nestes conjuntos não pôde ser verificada.
Dos 18 conjuntos avaliados por um período de 14 dias, pôde-se
observar em seis, evidências da passagem do S. sobrinus pela interface
implante/conector. A simples existência de contaminação externa dos implantes
analisados evidenciou que a presença das micro-fendas pode servir como meio
físico para a passagem bacteriana para o meio externo. A passagem de
microrganismos através desta interface foi também observada em outros
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 113
estudos, porém com maiores índices de contaminação (JANSEN et al., 1997;
GUINDY et al. 1998; GROSS et al., 1999).
O baixo índice de passagem de microrganismos da região interna dos
implantes para o meio externo, pode ter ocorrido, em parte, pela obliteração
coronal do componente UCLA. Como o intuito do trabalho foi analisar a
passagem de microrganismos através da interface implante/conector, procedeu-
se um vedamento da superfície oclusal do componente protético com guta-
percha e três camadas de adesivo à base de cianoacrilato (CARRASCO et al.,
2003; CARRASCO et al., 2004) evitando a possibilidade da passagem de
microrganismos pela região de união entre o parafuso protético, componente
protético e a plataforma do implante. A interferência da obliteração dessa região
oclusal do componente protético ficou evidenciada no estudo de Quirynen
(1994), onde se observou maior contaminação bacteriana no interior dos
implantes que foram totalmente submersos em meio de cultura sem o
vedamento oclusal quando comparados àqueles imersos somente até a
interface implante/conector, mostrando, assim, que a passagem de
microrganismos por meio do parafuso protético também pode interferir na
percolação de bactérias para o interior dos implantes.
Outro fator que deve ser considerado é o ambiente em que os
conjuntos implantes/conectores foram mantidos durante o período experimental.
A condição estática em que foram mantidos em meio de cultura, não provocou
os fluxos de líquidos que poderiam favorecer a passagem dos microrganismos
pelas microfendas. Sabe-se que a presença de forças oclusais sobre as
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 114
próteses implanto-suportadas poderia induzir um aumento neste índice de
contaminação externa. Wahl e Lang (2003) demonstraram um aumento do
espaço entre os componentes e a plataforma dos implantes quando estes foram
submetidos à força oclusal. Além do aumento de espaço entre as estruturas, a
carga oblíqua que incide sobre as próteses durante a função mastigatória
produz movimentações dos componentes, que fazem com que o conjunto
funcione como bomba, empurrando os microrganismos através da interface
(RIMONDINI et al., 2001).
O torque empregado para a adaptação e estabilidade dos conectores
protéticos também deve ser considerado. Weiss et al. (2000) valorizaram a
importância do torque para melhorar a adaptação dos componentes protéticos
sobre os implantes, visto que torques inadequados possibilitam uma
desadaptação, o que favorece a colonização bacteriana no interior dos
implantes.
O torque utilizado seguiu as recomendações dos fabricantes,
evitando assim possíveis variáveis que pudessem interferir nos resultados. A
influência do torque empregado no conjunto implante/conector foi comprovada
por Gross et al. (1999), onde a utilização de torques de 10 Ncm, 20 Ncm e o
recomendado pelo fabricante de cada sistema de implante analisado mostraram
uma redução progressiva do grau de micro-infiltração pela interface.
Outro fator de importante validade clínica é a utilização de novas
tecnologias ou testes de diagnóstico na detecção e quantificação de
microrganismos da cavidade oral. Neste experimento, foi realizada a
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 115
comparação entre o método de análise microbiológica tradicional de semeadura
de amostras em meios de cultura e o de hibridização de DNA checkerboard.
Estes métodos são empregados em muitos estudos microbiológicos para
determinação da microbiota em sulcos periodontais e peri-implantares
(LOESCHE et al., 1992; PAPAPANOU et al., 1997; WALL-MANNING et al.,
2002; COLOMBO et al., 2002; SOCRANSCKY et al., 2004; CARVALHO et al.,
2005; DAHLE’N e LEONHARDT 2006; AGERBAEK et al., 2006).
A metodologia empregada para a detecção de células microbianas no
diagnóstico de sítios contaminados é um assunto bastante comentado e
discutido quanto ao seu grau de confiabilidade (LOESCHE et al., 1992;
PAPANOU et al., 1992; MORAES et al., 2002). O método de coleta das
amostras também é um fator crítico na avaliação dos processos de
contaminação. Para a comparação entre os métodos, a coleta do material
inoculado do interior dos implantes foi realizada com auxílio de microbrushes
devido à sua capacidade de adsorção de 6,12 µL ± 0,24 (média ± desvio
padrão), sendo este volume superior ao inoculado no interior dos implantes, que
foi de 3,0 µL, maximizando, desta forma, a capacidade de recuperação do
conteúdo previamente inoculado nos implantes. Testes preliminares, realizados
no laboratório, indicaram que a capacidade de recuperação de microrganismos
com o uso de microbrush obteve resultados superiores quando comparados a
outros materiais, como cones de papel absorventes comumente empregados
para análise de contaminação interna de implantes (TRAVERSY e BIREK,
1992; PIATTELLI et al., 2001).
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 116
A comparação dos escores obtidos pelo método checkerboard a
partir da colheita padronizada do inóculo de S. sobrinus com pipeta ou com
microbrush, possibilitou uma estimativa da relação entre o número de células
bacterianas presentes em um determinado local e o que foi recuperado com
auxílio da microbrush. Apesar da capacidade volumétrica do microbrush ser
superior ao volume inoculado nos implantes, foi observado, neste caso, uma
redução do nível de detecção quando os microrganismos foram coletados do
interior dos implantes. A superfície interna dos implantes, com suas roscas e
outras irregularidades, dificulta a remoção dos microrganismos. Além disso, a
incubação em meio de cultura dessas escovas, após intensa agitação para
dispersão do material agregado às cerdas, comprovou a permanência do S.
sobrinus no aplicador.
Com relação às técnicas de detecção empregadas no presente
estudo, é de conhecimento científico que a técnica de cultura tradicional sempre
foi, e ainda é utilizada na determinação de bactérias periodontopatogênicas
(BOLLEN et al., 1996; LEONHARDT et al., 1999; PIATTELLI et al., 2001;
HEIJDENRIJK, et al., 2006). No entanto, novas técnicas, como as baseadas na
hibridação do DNA microbiano, surgiram recentemente e vem sendo
aprimoradas. As técnicas de biologia molecular para a detecção e identificação
de microrganismos têm colaborado para a melhor compreensão da microbiota
envolvida em infecções periodontais (SOCRANSCKY et al., 2004; DAHLE’N e
LEONHARDT, 2006).
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 117
O método tradicional de cultura apresenta como principal vantagem a
possibilidade de detecção de espécies bacterianas inesperadas quando a
utilização de meios de cultura permitem seu crescimento (COLOMBO et al.,
2002). O método de hibridação DNA-DNA checkerboard, desenvolvido por
Socransky et al. (1994), apresenta como vantagens a facilidade de execução, a
possibilidade de análise de várias amostras clínicas, identificando até 40
espécies bacterianas diferentes em uma mesma membrana, além de detectar
espécies fastidiosas e de difícil crescimento pelos métodos convencionais de
cultura (SIQUEIRA Jr. et al., 2002). Em muitos casos, devido à necessidade de
um resultado rápido em um grande número de amostras na tentativa de
detecção de vários microrganismos ao mesmo tempo, a técnica Chekerboard
DNA-DNA Hybridization tem sido empregada como método de escolha na
análise de sulcos peri-implantares e periodontais (COLOMBO et al., 2002;
SOCRANSCKY et al., 2004; CARVALHO et al., 2005; DAHLE’N e LEONHARDT
2006).
Para que fosse possível a comparação dos diferentes métodos de
análise em relação à quantificação bacteriana, houve necessidade de
padronização dos resultados apresentados. Como a técnica Checkerboard
DNA-DNA Hybridization expressa seus resultados na forma de escore, os
dados obtidos em UFC pela técnica de cultura tradicional foram convertidos nos
mesmos intervalos utilizados pela técnica de checkerboard para fins de
comparação. O mesmo procedimento foi também empregado por Papapanou et
al. (1997) na comparação de metodologias de análise diferentes.
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 118
De maneira geral, os valores obtidos pela técnica de checkerboard
foram maiores que os encontrados com o método de cultura. No presente
estudo, as amostras coletadas no tempo zero e após 14 dias, analisadas pelo
método de cultura, evidenciaram uma forte tendência de redução no número de
UFC, bem como o método de checkerboard, com redução significante. No
entanto, os dados obtidos mostraram uma maior prevalência de microrganismo
pela técnica de checkerboard quando comparada à cultura após o período de
14 dias. Resultado semelhante também pôde ser comprovado clinicamente em
um estudo realizado por van Steenbergen et al. (1996), onde se obteve
detecção evidentemente menor em relação à microbiota em amostras de placa
subgengival pela técnica de cultura tradicional quando comparadas às técnicas
Checkerboard DNA-DNA Hybridization.
As diferenças do grau de detecção microbiana entre as técnicas
tornam-se mais evidentes quando as bactérias selecionadas para a análise são
anaeróbias ou microaerófilas (SAVITT et al., 1988; SUNDE et al., 2000). Sabe-
se que os principais microrganismos responsáveis pelo desenvolvimento de
doenças periodontais e peri-implantares são microaerófilos ou
predominantemente anaeróbios (ADONOGIANAKI et al., 1995; LEONHARDT et
al., 1999; van WINKEJHOFF et al., 2000; XIMENEZ-FYVIE et al., 2006). Dentre
os microrganismos passíveis de serem analisados para a contaminação dos
implantes, optou-se pelo S. sobrinus, por ser microaerófilo e em virtude da sua
alta prevalência na placa bacteriana, sendo esta a responsável inicial para o
desenvolvimento de doenças peri-implantares (LINDQUIST e EMILSON, 1991).
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 119
Dentre os fatores responsáveis por esta diferença entre os resultados
obtidos nos dois métodos destaca-se a característica de microaerofilia do
microrganismo utilizado para esta análise. A diferença entre os graus de
detecção pelos diferentes métodos de análise também foi verificada no
experimento de Loesche et al. (1992) onde se concluiu que a diluição seriada
realizada durante o processamento microbiológico, principalmente de bactérias
anaeróbias, detecta uma resposta em menor quantidade de microrganismos
pelo método de cultura, corroborando os resultados obtidos no presente
trabalho.
A detecção pela técnica de cultura torna-se mais crítica quando
comparada à análise por checkerboard, pois há necessidade de
microrganismos viáveis para que ocorra o crescimento bacteriano em placas de
Petri, enquanto que, pela análise do DNA, a simples presença do material
genético preservado é detectada (PAPAPANOU et al., 1997). Por se tratar de
um microrganismo microaerófilo, durante os processos de leitura da
concentração no espectrofotômetro, inoculação, coleta, dispersão em meio de
cultura e transporte para a jarra de anaerobiose pode ocorrer morte de células
microbianas, que não são detectadas pela técnica de cultura tradicional
(SUNDE et al., 2000). Além disso, a técnica tradicional de cultura possui
limitações quanto ao grau de precisão na contagem bacteriana. A limitação em
relação à detecção de microrganismos pelo método de cultura foi descrita por
Mombelli et al. (1989), onde se observou uma variação de até 24% nos valores
de contagem de UFC em uma mesma amostra, evidenciando a limitação de
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 120
precisão quando utilizada esta técnica, especificamente para espécies com alta
tendência de agregamento.
Sabe-se que os subprodutos bacterianos originados pela lise
bacteriana podem danificar e destruir o material genético disperso no meio de
cultura impedindo uma ligação efetiva do DNA com as sondas podendo
influenciar, desta forma, em sua detecção pelo método do checkerboard
(KRUSZEWSKA et al., 2004). Quanto mais tempo estiverem em contato com
resíduos bacterianos, maior a destruição do material genético (AHMAD et al.,
1995) e menor a detecção de unidades de DNA pelo método de checkerboard.
A degradação pode iniciar depressa e proceder durante algum tempo fazendo
com que se minimizem os sítios de ligação DNA bacteriano /sonda, reduzindo,
assim, o sinal obtido pelo teste, levando à redução do sinal fluorescente
produzido pelas amostras pelo método Checkerboard DNA-DNA Hybridization.
Este processo de degradação celular reflete também nos resultados obtidos
pela técnica de cultura, já que há necessidade da presença de células
bacterianas viávies para que sejam detectadas nas placas de Petri.
A temperatura de estocagem de microrganismos também influencia
no grau de detecção bacteriana em ambos os métodos. Temperaturas mais
baixas possibilitam uma taxa de sobrevida bacteriana mais alta (van
RENSBURG et al., 2004). A elevada temperatura acelera o metabolismo
celular, fazendo com que ocorra um aumento de destruição celular. Neste
estudo, os implantes foram estocados a uma temperatura de 37°C, semelhante
à temperatura corporal, o que poderia acelerar o processo de metabolismo
BARBOSA, R. E. S. DISCUSSÃO - 121
celular. Desta forma, a grande concentração de células bacterianas no interior
dos implantes e a elevada temperatura representam possíveis fatores
responsáveis pela redução da quantidade bacteriana detectada por ambos os
métodos.
Desta forma, fazendo-se um paralelo clínico, os métodos de
diagnósticos de quantificação e viabilidade de espécies microbianas utilizados
neste experimento representam, em conjunto, técnicas eficazes para
determinação de planos de tratamentos relacionados às doenças periodontais e
peri-implantares.
Juntamente com estas análises realizadas, novos estudos
longitudinais e in vivo devem ser realizados, a fim de se avaliar a influência
destes fatores em situação clínica em longo prazo.
8 - CONCLUSÕES
BARBOSA, R. E. S. CONCLUSÕES- 123
Nas condições experimentais do presente estudo, parece-nos lícito
afirmar que:
1. Os conjuntos implantes/conectores protéticos analisados apresentaram baixa
freqüência de contaminação externa através da sua interface quando
comparados a outros sistemas de implantes relatados na literatura.
2. Após 14 dias de incubação dos conjuntos implante/conectores contaminados
em meio de cultura CaSa B, a detecção de microrganismos pelos dois métodos
testados foi menor do que no início do experimento, o que sugere redução na
viabilidade e degradação do material genético bacteriano após esse periodo.
3. A sensibilidade aparentemente maior do método Checkerboard DNA-DNA
Hybridization está provavelmente relacionada à sua capacidade de detectar não
somente a presença de microrganismos viáveis, como ocorre com o método de
cultura microbiana, mas também de material genético originário de células não
viáveis.
4. Os resultados do presente estudo sugerem que cada um dos métodos
testados apresenta aplicações específicas e complementares entre si na
avaliação da microbiota associada a implantes odontológicos
.
REFERÊNCIAS
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 125
ADONOGIANAKI, E., MOONEY, J., WENNSTRÖM, J.L., LEKHOLM, U.,
KINANE D.F. - Acute-phase proteins and immunoglobulin G against
Porphyromonas gingivalis in peri-implant crevicular fluid: a comparison with
gingival crevicular fluid. Clin. Oral Impl. Res. v. 6, p. 14-2, 1995.
AGERBAEK, M.R., LANG, N.P., PERSSON, G.R. Comparisons of bacterial
patterns present at implant and tooth sites in subjects on supportive
periodontal therapy. I. Impact of clinical variables, gender and smoking. Clin.
Oral Impl. Res., v. 17, p.18–24, 2006.
AHMAD, N. N.; CU-UNJIENG, A. B.; DONOSO, L. A. Modification of standard
proteinase K/phenol method for DNA isolation to improve yield and purity
from frozen blood. Journal of Medical Genetics, v. 32, p.129–130,1995.
ASTRAND, P.; ENGQUIST, B.; ANZEN, B.; BERGENDAL, T.; HALLMAN, M.;
KARLSSON, U.; KVINT,S.; LYSELL, L.; RUNDCRANTZ, T. Nonsubmerged
and submerged implants in the treatment of the partially edentulous maxilla.
Clin. Implant Dent. Relat. Res., v. 4, n. 3, p.115- 127, 2002.
BOLLEN, C.M.L..; PAPAIOANNOU, W.; van ELDERE J.; SCHEPERS, E.; van
STEENBERGHE, D. The influence of abutment surface roughness on plaque
accumulation and peri-implant mucositis. Clin. Oral Impl. Res., v. 7, n. 3, p.
201-211, Sep. 1996.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 126
BORNSTEIN, M.M.; SCHMID, B.; BELSER, U.C.; LUISSI, A.; BUSER, D. Early
loading of non-submerged titanium implants with a sandblasted and acid-
etched surface: 5-year results of a prospective study in partially edentulous
patients. Clin. Oral Impl. Res., v. 16, p. 631–638, 2005.
BOSTRÖM, L.; BERGSTRÖM, J.; DAHLÉN, G.; LINDER, L.E. Smoking and
subgingival microflora in periodontal disease. J. Clin. Periodontol., v. 28, n.
3, p. 212-219, Mar. 2001.
BRǺNEMARK, P.I; ADELL, R.; BREINE, U.; HANSSON, B.O.; LINDSTROM, J.
OHLSSON, A. Intra-osseous anchorage of dental prosthesis. Experimental
studies. Scand. J. Plast. Reconst. Surg., v. 3, p. 81-100, 1969.
BUSER, D.; MERICSKE-STERN, R.; BERNARD, J.P.; BEHNEKE, A..;
BENHEKE, N.; HIRT, H.P.; BELSER, U.C.; LANG, N.P. Long-term
evaluation of non-submerged ITI implants. Part 1: 8-year life table analysis of
a prospective multi-center study with 2359 implants. Clin. Oral Impl. Res., v.
8, n. 3, p. 161-172, Jun. 1997.
BUSER, D.; WEBER, H.P.; DONATH, K.; FIORELLINI, J.P.; PAQUETTE, D.W.;
WILLIAMS, R.C., Soft reactions to non-submerged unloaded titanium
implants in beagle dogs. J. Periodontol., v. 63, n. 3, p. 225-235, Mar. 1992.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 127
CARRASCO, L.D.; FRONER, I.C.; CORONA, S.A.M.; PECORA, J.D. Effect of
internal bleaching agents on dentinal permeability of non-vital teeth:
quantitative assessment. Dental Traumatology, v. 19, n.2, p. 85-89, Apr.
2003.
CARRASCO, L.D.; PECORA, J.D.; FRONER, I.C. In vitro assessment of
dentinal permeability after the use of ultrasonic-activated irrigants in the pulp
chamber before internal dental bleaching. Dental Traumatology, n. 3, v. 20,
p.164-168, Jun. 2004.
CARVALHO, L.H.; D’AVILA, G.B.; LEÃO, A.; GONÇALVES, C.; HAFFAJEE,
A.D.; SOCRANSKY, S.S.; FERES, M. Scaling and root planing, systemic
metronidazole and professional plaque removal in the treatment of chronic
periodontitis in a Brazilian population II – microbiological results. J. Clin.
Periodontol. v. 32, p. 406–411, 2005.
COX, J.F.; ZARB, G.A. The longitudinal clinical efficacy of osseointegrated
dental implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants, v. 2, n. 1, p. 92-100,
1987.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 128
DAHLE´N, G.; LEONHARDT Ǻ. A new checkerboard panel for testing bacterial
markers in periodontal disease. Oral Microbiol. Immunol.,, v. 21, p. 6–11,
2006.
DE BOEVER, A.L.; DE BOEVER, J.A. Early colonization of nonsubmerged
dental implants in patients with a history of advanced aggressive
periodontitis. Clin. Oral Impl. Res., v. 17, p. 8–17, 2006.
COLOMBO, A.P.V.; TELLES, R.P.; TORRES, M.C.; SOUTO, R.; ROSALÉM JR.
W.; MENDES, M.C.S.; UZEDA, M. Subgengival microbiota of Brazilian
Subjects with untreated chronic periodontitis. J. Perodontol., v. 73, n. 4 p.
360-369, Apr. 2002.
ERICSSON, I.; LEKHOLM, U.; BRÅNEMARK P.I.; LINDHHE, J.; GLANTZ, P.O.
NYMAN, S. A clinical evaluation of fixed-bridge restorations supported by the
combination of teeth and osseointegrated titanium implants. J. Clin.
Periodontol., v. 13, n. 4, p. 307-312, Abr. 1986.
ERICSSON, I.; PERSSON, L.G.; BERGLUNDH, T.; MARINELLO, C.P.;
LINDHE, J.; KLIINGE, B.J. Different types of inflammatory reactions in peri-
implant soft tissues. Clin Periodontol., v. 22, n.3, p. 255-61, Mar. 1995.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 129
FEINBERG, A.P.; VOGELSTEIN, B. A technique for radiolabeling DNA
restriction endonuclease fragments to high specific activity. Anal Biochem.,
v. 132, p. 6-13, Jul. 1983.
FLEMMING, T.F.; SORENSON, J.A.; NEWMAN, M.G.; NACHNANI, S. Gingival
enhancement in fixed prosthodontics. Part microbiologic findings. J. Prosth.
Dent., v. 65, n. 3, p. 365-372, Mar. 1991.
GERBER, J.; WENAWESER, D.; HEITZ-MAYFIELD, L.; LANG, N.P.;
PERSSON, R.G. Comparison of bacterial plaque samples from titanium
implant and tooth surfaces by different methods. Clin. Oral Impl. Res., v. 17,
p. 1-7, 2006.
GROSS, M.; ABRAMOVICH, I.; WEISS, E.I. Microleakage at the abutment-
implant interface of osseointegrated implants: a comparative study. Int. J.
Maxillofac. Implants, v. 14, n. 1, p. 94-100, Jan/Feb. 1999.
GUINDY, J.S.; BESIMO, C.H.E.; BESIMO, R.; SCHIEL, H.; MEYER, J. Bacterial
leakage into and from prefabricated screw-retained implant-borne crowns in
vitro. Journal of Oral Rehabilitation, v. 25, n. 6, p. 403-408, Jun. 1998.
HAANAES, H.R. Implants and infections with special reference to oral bacteria.
Periodontol., v. 17, n. (7 ( Pt 2)), p. 516-524, Aug. 1990.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 130
HAFFAJEE, A.D.; CUGINI, M.A.; DIBART, S.; SMITH JR, R.L.; SOCRANSKY,
S.S. The effect of SRP on the clinical and microbiological parameters of
periodontal diseases. J. Clin. Periodontol., v. 24, n. 5, p. 324-334, May.
1997.
HANGGI, M.P.; HANGGI, D.C.; SCHOOLFIELD, J.D.; MEYER, J.; COCHRAN,
D.L.; HERMANN, J.S. Crestal bone changes around titanium implants. Part I:
A retrospective radiographic evaluation in humans comparing two non-
submerged implant designs with different machined collar lengths. J.
Periodontol., v. 76, n. 5, p. 791-802, May. 2005.
HECKER, D.M.; ECKERT, S.E.; CHOI, Y.G. Cyclic loading of implant-supported
prostheses: comparison of gaps at the prosthetic-abutment interface when
cycled abutments are replaced with as-manufactured abutments. J.
Prosthet. Dent., v. 95, n. 1, p. 26-32, Jan. 2006.
HEIJDENRIJK, K.; RAGHOEBAR. G.M.; MEIJER, H.J.; STEGENGA, B.; van
DER REIJDEN, W.A. Feasibility and Influence of the Microgap of Two
Implants Placed in a Non-Submerged Procedure: A Five-Year Follow-Up
Clinical Trial. J Periodontol., v. 77, n. 6, p. 1051-1060, Jun. 2006.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 131
HEYDENRIJK, K.; RAGHOEBAR, G.M.; MEIJER, H.J.A.; van DER REIJDEN
W.A.; van WINKELHOLFF, A.J.; STEGENGA, B. Two-part implants inserted
in a one stage or a two-stage procedure. A prospective comparative study. J.
Clin. Periodontol., v. 29, n. 10, p. 900-909, Oct. 2002.
HULTIN, M.; GUSTAFSSON, A.; HALLSTRÖM, H.; JOHANSSON, L..Å.;
EKFELDT, A.; KLINGE, B. Microbiological findings and host response in
patients with peri-implantitis. Clin. Oral Impl. Res., v. 13, n. 4, p. 349-358,
Aug. 2002.
HULTIN, M.; GUSTAFSSON, KLINGE, B. Long-term evaluation of
osseointegrated dental implants in the treatment of partly edentulous
patients. J. Clin. Periodontol., v. 27, n. 2, p. 128-133, Feb. 2000.
JANSEN, V.K..; CONRADS, G.; RICHTER, E.J. Microbial leakage and marginal
fit of the implant-abutment interface. Int. J. Oral Maxillofac. Implants, v. 12,
n. 5, p. 527-540, Sep-Oct. 1997.
JANSEN, V.K.; RICHTER, E.J. Microbial leakage and marginal fit of the implant-
abutment interface Int. J. Maxilofac. Implants., v. 12, n. 4, p. 527-540,
Jul/Aug. 1997.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 132
KATSOULIS, J.; LANG, N.P.; PERSSON, G.R. Proportional distribution of the
red complex and its individual pathogens after sample storage using the
checkerboard DNA–DNA hybridization technique. J. Clin. Periodontol., v.
32, p. 628–633, 2005.
KELLER, W.; BRÅGER, U.; MOMBELLI, A. Peri-implant microflora of implants
with cemented and screw retained suprastructures. Clin. Oral implant Res.
v. 9, p. 209-217, 1998.
KOKA, S.; RAZZOOG, M.E.; BLOEM, T.J.; SYED, S. Microbial colonization of
dental implants in partially edentulous subjects. Prosthetic Dentistry, v. 70,
n. 2, p. 141-144, Aug. 1993.
KRUSZEWSKA, H.; MISICKA, A.; CHMIELOWIEC, U. Biodegradation of DNA
and nucleotides to nucleosides and free bases. Il Farmaco., v. 59, p. 13–20,
2004.
LAUTENSCHLAGER, E.P.; MONAGHAN, P. Titanium and titanium alloys as
dental materials. Int. dent. J., v. 43, n. 1, p.245-253, 1993.
LEE, K.H.; MAIDEN, M.F.J.; TANNER, A.C.R.; WEBER, H.P. Microbiota of
successful osseointegrated dental implants.J. Periodontol,, v. 70, n. 2, p.
131-138, Feb. 1999.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 133
LEMONS, J.; NATIELLA, J. Biomaterials, biocompatibility, and peri-implant
considerations. Dent Clin North Am., v. 30, n. 1, p. 3-23, Jan. 1986.
LEONHARD, Å.; DAHLÉN, G.; RENVERT, S. Five-year clinical, microbiological,
and radiological outcome following treatment of peri-implantitis in man. J.
Periodontol., v. 74, n. 10, p. 1415-1422, Oct. 2003.
LEONHARD, Å.; RENVERT, S.; DAHLÉN, G. Microbial findings at failing
implants. Clin. Oral Impl. Res., v. 10, n. 5, p. 339-345, Oct. 1999.
LINDQUIST, B.; EMILSON, C.G. Dental location of Streptococcus mutans and
Streptococcus sobrinus in humans harboring both species. Caries Res., v.
25, n. 2, p. 146-52, 1991.
LISTGARTEN, M.A.; LAI, C.H. Comparative microbiological characteristics of
failing implants and periodontally disease theeth. J. Periodontol., v. 70, n. 4,
p. 431-437, Apr. 1999.
LOESCHE, W.J.; LOPATIN. D.E.; STOLL, J.; van POPERIN, N.; HUJOEL, P.P.
Comparison of various detection methods for periodontopathic bacteria: can
culture be considered the primary reference standard? J. Clin. Microbiol., v.
30, n. 2, p. 418- 426, 1992.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 134
MEFFRET, R.M. The sofá tissue interface in dental implantology. J.Dent.
Educ., v. 52. p. 801-810, 1988.
MENGEL, R.; SCHRÖDER, T.; FLORES-DE-JACOBY L. Osseointegrated
implants in patients treated for generalized chronic periodontitis and
generalized aggressive periodontitis: 3- and 5-year results of a prospective
long-term study. J. Periodontol., v. 72, n. 8, p. 977-989, Aug. 2001.
MOMBELLI, A..; BUSER, D.; LANG, N.P. Colonization of osseointegrated
titanium implants in edentulous patients. Early results. Oral Microbiol.
Immunol., v. 3, n. 3, p. 113-120, Sep. 1988.
NAKAZATO, G.; TSUCHIYA, H.; SATO, M.; YAMAUCHI, M. In vivo plaque
formation on implant materials. Int. J. Oral Maxillofac. Implants, v . 4 n. 4,
p. 321- 325, 1989.
NEWMAN, M.G.; FLEMMIG, T.F. Periodontal considerations of implants and
implant associated microbiota. J. Dent. Education., v. 52, n. 12, p. 737-744,
Dec. 1988.
ORINGER, R.J.; PALYS, M.D.; IRANMANESH, A.; FIORELLINI, J.P.;
HAFFAJEE, A.D.; SOCRANSKY, S.S.; GIANOBILE, W.V. C-telopeptide
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 135
pyridinoline cross-links (ICTP) and periodontal pathogens associated with
endosseous oral implants. Clin. Oral Impl. Res., v. 9, n. 6, p. 365-376, Dec.
1998.
ORSINI, G.; FANALI, S.; SCARANO, A.; PETRONE, G.; DI SILVESTRO, S.;
PIATTELLI, A. Tissue reactions, fluids, and bacterial infiltration in implants
retrieved at autopsy: a case report. Int. J. Oral Maxillofac. Implants.,v. 15,
n. 2, p. 283-286, Mar-Apr. 2000.
PALMER, R.M.; HOWE, L.C.; PALMER, P.J. A prospective 3-year study of fixed
bridges linking Astra Tech ST implants to natural teeth. Clin. Oral Impl.
Res., v. 16, p. 302–307, 2005.
PAPAPANOU, P.N.; MADIANOS, P.N.; DAHLÉN, G.; SANDROS, J.
Checkerboard versus Culture: a comparison between two methods for
identification of subgengival microbiota. Eur. J. Sci., v. 105, p. 389-396,
1997.
PERSSON, L.G.; LEKHOLM, U.; LEONHARDT Å.; DAHLÉN, G.; LINDHE, J.
Bacterial colonization on internal surface of Branemark system implant
components. Clin. Oral Implant. Res., v. 7, n. 2, p. 90-95, Jun. 1996.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 136
PIATTELLI, A.; SCARANO, A.; PAOLANTONIO, M.; ASSENZA, B.; LEGHISSA,
G.C.; DI BONAVENTURA, G.; CATAMO, G.; PICCOLOMINI, R. Fluids and
microbial penetration in the internal part of cement-retained versus screw-
retained implant-abutment connections. J. Periodontol., v. 72, n. 9, p. 1146-
1150, Sep. 2001.
QUIRYNEN, M.; van STEENBERGHE, D. Bacterial colonization of the internal
part of two-stage implants. Clin. Oral Implants Res., v. 4, n. 3, p. 158-161,
Sep. 1993.
QUIRYNEN, M.; BOLEN, C.M.L.; EYSSEN. H.; van STEENBERGHE, D.,
Microbial penetration along the implant components of the Branemårk
system. Clin. Oral Impl. Res., v. 5, n. 4, p. 239-244, Dec. 1994.
QUIRYNEN, M.; DE SOETE, M.; STEENBERGHE, D.V., Infectious risks for oral
implants: a review of the literature. Clin. Oral Impl. Res., v. 13, n. 1, p. 1-19,
Feb. 2002.
QYUIRYNEN, M.; ALSAADI, G.; PAUWELS, M.; HAFFAJEE, A.; van
STEENBERGHE, D.; NAERT, I. Microbiological and clinical outcomes and
patient satisfaction for two treatment options in the edentulous lower jaw
after 10 years of function. Clin. Oral Impl. Res., v. 16, p. 277–287, 2005.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 137
RIMONDINI, L.; MARIN, C.; BRUNELLA, F.; FINI, M. Internal contamination of a
2-component implant system after occusal loading and provisionally luted
reconstrution with or without a washer device. J. Periodontol., v. 72, n. 12,
p. 1652-11657, Dec. 2001.
RUTAR, A.; LANG, N.P.; BUSER, D.; BURGIN, W.; MOMBELLI, A.
Retrospective assessment of clinical and microbiological factors affecting
periimplant tissue conditions. Clin. Oral. Implants. Res., v. 12, n. 3, p.189-
195. Jun. 2001.
SAVITT, E.D.; STRZEMPKO, M.N.; VACCARO, K.K.; PEROS, W.J.; FRENCH,
C.K. Comparison of cultural methods and DNA probe analyses for the
detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides gingivalis,
and Bacteroides intermedius in subgingival plaque samples. J. Periodontol.,
v. 59, n. 7, p. 431-438 Jul. 1988.
SIQUEIRA Jr., J.F.; ROÇAS, I.N.; UZEDA, M.; COLOMBO, A.P.; SANTOS, K.
Comparison of 16S rDNA-based PCR and checkerboard DNA-DNA
hybridization. J. Med. Microbiol., v. 51, n. 12, p. 1090-1096, dec. 2002.
SOCRANSKY, S. S.; CIBBONS, R. J.; DALE, A. C.; BORTNICK, L.;
ROSENTHAL, E.; MACDONALD, J.B. The microbiota of the gingival crevice
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 138
in man-I. Total microscopic and viable counts and counts of specific
organisms. Arch. Oral Biol,, v. 8, p. 275-80, 1963.
SOCRANSKY, S.S.; SMITH, C.; MARTIN, L.; PASTER, B.J.; DEWHIRST, F.E.;
LEVIN, A.E. "Checkerboard" DNA-DNA hybridization. Biotechniques, v. 17,
p. 788-92, 1994.
SOCRANSKY, S.S.; HAFFAJEE, A.D.; CUGINI, M.A.; SMITH, C.; KENT, Jr.
Microbial Complex in subgengival plaque. J. Clin. Periodontol., v. 25,
p.134-144, 1998.
SOCRANSKY, S.S.; HAFFAJEE, A.D.; SMITH, C.; MARTIN, L.; HAFFAJEE,
J.A.; UZEL, N.G.; GOODSON, J.M. Use of checkerboard DNA–DNA
hybridization to study complex microbial ecosystems. Oral Microbiol.
Immunol., v.19, p. 352–362, 2004.
STEFLIK, D.E.; MCKINNEY, R.V.; SISK, A.L.; PARR, G.R.; MARSHALL, B.L.
Dental implants retrieved from humans: a diagnostic light microscopy review
of the findings in seven cases of failure. Int. J. Oral Maxillofac. Implants, v.
6, n. 2, p. 147- 153, 1991.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 139
SUNDE, P.T.; TRONSTAD, L.; ERIBE, E.R.; LIND, P.O.; OLSEN, I. Assessment
of periradicular microbiota by DNA-DNA hybridization. Endod. Dent.
Traumatol., v. 16, n. 5, p. 191-196, Oct. 2000.
TANNER, A.; MAIDEN, M.F.J.; LEE, K.; SHULMAN, L.B.; WEBER, H.P. Dental
implant infections. Clinical Infectious Disease, v. 25, n. 2, p. 213-217, Sep.
1997.
TANNER, A.; MAIDEN, M.F.J.; MACUCH, P.J.; MURRAY, L.L.; KENT JR., R.L.
Microbiota of health, gingivitis and initial periodontitis. J. Clin. Periodontol.,
v. 25, n. 2, p. 85-98, Feb. 1998.
TORRESYAP, G.; HAFFAJEE, A.D.; UZEL, N.G.; SOCRANSKY, S.S.
Relationship between periodontal pocket sulfide levels and subgingival
species. J. Clin. Periodontol., v. 30, n.11, p. 1003-1010, Dec. 2003.
TRAVERSY, M.C.; BIREK, P. Fluid and microbial leakage of implant-abutment
assembly in vitro. J. Dent. Res., v. 71, p. 754, Apr. 1992.
XIMENEZ-FYVIE, L.A.; ALMAGUER-FLORES, A.; JACOBO-SOTO, V.; LARA-
CORDOBA, M.; SANCHEZ-VARGAS, L.O.; ALCANTARA-MARURI, E.
Description of the subgingival microbiota of periodontally untreated Mexican
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 140
subjects: chronic periodontitis and periodontal health. J Periodontol., v. 77,
n. 3, p. 460-471, Mar. 2006.
van RENSBURG, E.; DU PREEZ, J.C.; KILIAN, S.G. Influence of the growth
phase and culture medium on the survival of Mannheimia haemolytica during
storage at different temperatures. J. Appl. Microbiol., v. 96, n. 1, p.154-161,
2004.
van STEENBERGEN, T.J.; TIMMERMAN, M.F.; MIKX, F.H.; DE QUINCEY, G.;
van DER WEIJDEN, G.A.; van DER VELDEN, U.; DE GRAAFF, J.
Discrepancy between culture and DNA probe analysis for the detection of
periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol., v. 23, n. 10, p.955-959, Oct.
1996.
van WINKELHOFF, A..J.; GOENÉ, R.J.; BENSCHOP, C.; FOLMER, T. Early
colonization of dental implants by putative periodontal pathogens in partially
edentulous patients. Clin. Oral Impl. Res., v. 11, p. 511–520, 2000.
WALL-MANNING, G.M.; SISSONS, C.H.; ANDERSON, S.A.; LEE, M.
Checkerboard DNA–DNA hybridisation technology focused on the analysis
of Gram-positive cariogenic bacteria. Journal of Microbiological Methods,
v. 51, p. 301– 311, 2002.
BARBOSA, R. E. S. REFERÊNCIAS - 141
WAHL, G.; LANG, H. Deformation at the implant interface to prosthetic
superstructure: an interferometric approach. Clin. Oral Implant. Res., v.15,
n. 2, p.233-238, Apr. 2004.
WEISS, E.I.; KOZAK, D.; GROSS, M.D. Effect of repeated closures on opening
torque values in seven abutmentimplant systems. J. Prosthet. Dent.,, v. 84,
n. 2, p.194-199, 2000.
WESTERGREN, G.; KRASSE, B. Evaluation of a micromethod for determination
of Streptococcus mutans and Lactobacillus infection. J. Clin. Microbiol., v.7,
n. 1, p. 82-83, Jan. 1978.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo