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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
ROBERTA PAULERT
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E CONTROLE DA ANTRACNOSE DO
FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.) UTILIZANDO
POLISSACARÍDEO E EXTRATOS DA MACROALGA MARINHA Ulva fasciata
FLORIANÓPOLIS
2005
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2
ROBERTA PAULERT
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E CONTROLE DA ANTRACNOSE DO
FEIJOEIRO COMUM (Phaseolus vulgaris L.) UTILIZANDO
POLISSACARÍDEO E EXTRATOS DA MACROALGA MARINHA Ulva fasciata
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biotecnologia da
Universidade Federal de Santa Catarina
como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre em Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Artur Smânia Júnior
Co-orientador: Prof. Dr. Marciel J. Stadnik
FLORIANÓPOLIS
2005
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3
PAULERT, Roberta
Atividade antimicrobiana e controle da antracnose do feijoeiro
comum (Phaseolus vulgaris L.) utilizando polissacarídeo e
extratos da macroalga marinha Ulva fasciata / Roberta Paulert.
Florianópolis/SC, 2005. 107 p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Santa
Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, 2005.
4
Dedico este trabalho a Deus e
aos meus pais Flávio e Tereza
pelo amor em todos os
momentos da minha vida.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Artur Smânia Júnior, pela oportunidade de realizar este trabalho, pela
valiosa orientação, confiança e incentivo
Ao Prof. Marciel Stadnik, no qual encontrei apoio, coragem, amizade e
principalmente incentivo
À minha mãe, que nas horas mais difíceis sempre encontrou a melhor solução e que
me ensinou que ser feliz é sempre o mais importante
Ao meu pai, uma das melhores pessoas que já conheci, que embarcou em todas as
minhas aventuras
À minha irmã Renata, pelo carinho e companheirismo
Ao Kurt, pelo amor e compreensão em todos os momentos deste trabalho
À Viviane Talamini, que contribui de forma valiosa em várias etapas deste trabalho,
sempre se mostrando disponível e paciente
À Profª. Margarida de Matos Mendonça, pelos ensinamentos, idéias e conselhos
oferecidos
À Profª. Vetúria Lopes de Oliveira, pelo carinho e amizade
À Profª. Elza Smânia pelo apoio e amizade em todos os momentos
Ao amigo Leandro Borsato do Laboratório de Fitopatologia do CCA, pela ajuda e
pela companhia no laboratório
Ao Prof. Moacir Pizzolatti pelo gentil auxílio na identificação das amostras
À Profª. Lenilza Bouzon pela identificação da macroalga
À secretaria da Pós-Graduação em Biotecnologia (Joice e Lígia) pela atenção e
paciência
Agradeço a coordenação do Curso de Pós-Graduação em Biotecnologia da UFSC
pela oportunidade
À Deus por iluminar sempre o meu caminho e a ajudar a tomar as decisões mais
corretas.
6
“
Andei...
Por caminhos difíceis, eu sei.
Mas olhando o chão sob meus pés, vejo a vida correr.
E assim a cada passo que der
Tentarei fazer o melhor que puder.
Aprendi...
Não tanto quanto quis, mas vi que conhecendo
O universo ao meu redor e aprendo a me conhecer melhor;
Assim escutarei o tempo que me ensinará
A tomar a decisão certa a cada momento.
E partirei...
Em busca de muitos ideais,
Mas sei que hoje se encontram meu passado, presente e futuro.
Hoje sinto em mim a emoção da despedida.
Hoje é o ponto de chegada.
Mas, ao mesmo tempo, tempo de partida”.
(Autor desconhecido)
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Principais algas marinhas utilizadas na agricultura em diversos países, de acordo com a
divisão que pertencem.........................................................................................................22
Tabela 2. Países onde são encontradas espécies de Ulva..................................................................33
Tabela 3. Composição química (em 100 g de amostra) de Ulva lactuca coletada em Guaraqueçaba
nos meses de outubro e fevereiro de 1996 e de Ulva fasciata coletada na Ilha do Mel em
dezembro e fevereiro de 1995.............................................................................................39
Tabela 4. Local, quantidade de algas frescas coletadas e o respectivo peso de matéria
seca.....................................................................................................................................42
Tabela 5. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e as respectivas concentrações utilizadas para o
teste de inibição do crescimento miceliano de Colletotrichum
lindemuthianum...................................................................................................................48
Tabela 6. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e as respectivas concentrações utilizadas para o
teste de inibição da germinação de conídios de Colletotrichum lindemuthianum...............50
Tabela 7. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e polissacarídeo B obtido de Ulva sp. e as
respectivas concentrações utilizadas para avaliar o efeito sobre a antracnose em plantas
feijoeiro comum...................................................................................................................52
Tabela 8. Escala descritiva da severidade da antracnose do feijoeiro.................................................56
Tabela 9. Peso fresco, peso seco e o rendimento das algas coletadas em três praias da Ilha de
Florianópolis/SC..................................................................................................................58
Tabela 10. Efeito do extrato metanólico, extrato insolúvel em metanol e da ulvana obtidos de Ulva
fasciata frente bactérias patogênicas para o homem, bactérias fitopatogênicas e
levedura...............................................................................................................................62
Tabela 11. Avaliação da atividade antifúngica do extrato metanólico, insolúvel em metanol e da
ulvana obtidos de Ulva fasciata, através da determinação da concentração inibitória
mínima.................................................................................................................................64
Tabela 12. Índice de velocidade de crescimento miceliano (IVCM) de Colletotrichum lindemuthianum
em meio ágar batata dextrose (BDA) contendo diferentes concentrações de extrato
metanólico, insolúvel em metanol, extrato etanólico e
ulvana..................................................................................................................................65
Tabela 13. Germinação de conídios (%) de Colletotrichum lindemuthianum em presença de extrato
metanólico, insolúvel em metanol, extrato etanólico e ulvana obtidos de Ulva
fasciata................................................................................................................................67
Tabela 14.
Valores de peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com
os extratos metanólicos obtidos de Ulva fasciata, aplicados duas vezes, quatro e dois dias
antes da inoculação do fungo Colletotrichum lindemuthianum.
...............................................69
Tabela 15.
Valores de peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com
polisscarídeo B de Ulva sp. quatro horas, três e seis dias antes da inoculação com o fungo
Colletotrichum lindemuthianum
..............................................................................................74
8
Tabela 16. Valores de peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com
polisscarídeo B (10 mg/ml) de Ulva sp. em três concentrações diferentes três dias antes da
inoculação do fungo Colletotrichum lindemuthianum.
.............................................................76
Tabela 17. Valores de peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas
com ulvana de Ulva fasciata em três concentrações diferentes, por duas vezes, quatro e
dois dias antes da inoculação do fungo Colletotrichum
lindemuthianum...................................................................................................................79
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Lesões características de antracnose. Massa de conídios de Colletotrichum
lindemuthianum, de coloração rosa, formada nos acérvulos, em vagem de feijão
infectada.................................................................................................................................06
Figura 2. Macroalga marinha Ulva fasciata..........................................................................................34
Figura 3. Representação esquemática da estrutura principal do polissacarídeo sulfatado (ulvana) de
Ulva. Fonte: PARADOSSI et al., 1999.................................................................................36
Figura 4. Efeito do (1) extrato metanólico (1 mg/ml), (2) extrato metanólico (2 mg/ml), (4) da ulvana
(10 mg/ml) de Ulva fasciata e (3) da testemunha (somente meio de cultura) sobre o
crescimento miceliano de Colletotrichum lindemuthianum após 20 dias de
incubação............................................................................................................................66
Figura 5.
Efeito da aplicação foliar dos extratos metanólicos de Ulva fasciata na severidade da antracnose
em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a inoculação. Os tratamentos foram
realizados por duas vezes, quatro e dois dias antes da inoculação das plantas com
Colletotrichum
lindemuthianum...........................................................................................................................
68
Figura 6.
Efeito da aplicação foliar do extrato etanólico (10 mg de alga seca/ml) de Ulva fasciata na
severidade da antracnose em plantas de feijão comum inoculadas com Colletotrichum
lindemuthianum quatro horas, três e seis dias após o tratamento. A avaliação foi realizada sete
dias após a inoculação.
.........................................................................................................71
Figura 7.
Efeito da pulverização de polissacarídeo B (10 mg/ml) obtido de Ulva sp. na severidade da
antracnose em plantas de feijão comum inoculadas com Colletotrichum lindemuthianum quatro
horas, três e seis dias após o tratamento, avaliado sete e 14 dias após a
inoculação.
............................................................................................................................73
Figura 8.
Efeito do polissacarídeo B obtido de Ulva sp. nas concentrações de 0,1, 3 e 10 mg/ml na
severidade da antracnose em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a
inoculação. Os tratamentos foram realizados três dias antes da inoculação das plantas com
Colletotrichum lindemuthianum
..............................................................................................75
Figura 9.
Efeito do tratamento foliar da ulvana (0,1, 1 e 10 mg/ml) obtida de Ulva fasciata na severidade
da antracnose em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a inoculação. Os
tratamentos foram realizados por duas vezes; quatro e dois dias antes da inoculação das
plantas com Colletotrichum lindemuthianum
...........................................................................77
10
RESUMO
Compostos presentes em algas marinhas podem desempenhar importantes
funções biológicas, entre elas: atividade antimicrobiana direta, influenciando as
interações entre planta-patógeno ou ativando mecanismos de defesa das plantas
tratadas. O polissacarídeo ulvana, os extratos solúvel e insolúvel em metanol, o
extrato etanólico obtidos de Ulva fasciata e o polissacarídeo B obtido de Ulva sp.
foram testados quanto a atividade antimicrobiana e o potencial desta macroalga
marinha no controle da antracnose de feijoeiro comum, causada pelo fungo
Colletotrichum lindemuthianum. Para a obtenção da ulvana, algas frescas foram
autoclavadas com água destilada; a solução resultante foi filtrada e precipitada com
etanol. O polissacarídeo foi identificado por RNM-
1
H e RNM-
13
C e I.V. como
unidades repetidas de ácido ulvanobiurônico-3-sulfato. Para a obtenção dos extratos
metanólicos e do extrato etanólico, algas secas e moídas foram extraídas com
metanol em sistema de soxhlet ou com etanol, respectivamente. A atividade
antimicrobiana da ulvana e dos extratos metanólicos foi determinada pelo método de
difusão em ágar frente a bactérias potencialmente patogênicas ao homem:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus,
Micrococcus luteus, a levedura Candida albicans e bactérias fitopatogênicas:
Xanthomonas campestris e Erwinia carotovora. A concentração inibitória mínima,
através do método de microdiluição em caldo, foi determinada contra os fungos: C.
lindemuthianum (fitopatogênico), Trichophyton mentagrophytes e Microsporum canis
(dermatófitos). Além disto, o efeito da ulvana e dos extratos metanólicos foi avaliado,
in vitro, nos testes de inibição de crescimento miceliano e inibição da germinação de
conídios de C. lindemuthianum. In vivo, foi avaliado o efeito do extrato etanólico,
extratos metanólicos, ulvana e polissacarídeo B na proteção de plantas de feijão
comum (Phaseolus vulgaris L.) contra antracnose em casa-de-vegetação. Os
resultados demonstraram que os extratos metanólicos inibiram o crescimento de
bactérias Gram-negativas: P. aeruginosa, X. campestris e E. carotovora. Além disso,
o extrato insolúvel (2 mg/ml) em metanol inibiu o crescimento de T. mentagrophytes
e o extrato solúvel em metanol (1 e 2 mg/ml) inibiu significativamente (p<0,05) o
crescimento miceliano de C. lindemuthianum. Por outro lado, nenhum dos extratos
testados inibiu a germinação dos conídios deste fungo e a ulvana não apresentou
nenhuma atividade in vitro contra os microrganismos testados. Nos experimentos in
vivo, observou-se que o extrato etanólico (10 mg de alga seca/ml) e a ulvana (10
mg/ml) de U. fasciata apresentaram uma possível indução de resistência quando
pulverizados três dias e quatro dias antes da inoculação do fungo, respectivamente.
Palavras-chave: Ulva fasciata, atividade antimicrobiana, polissacarídeo,
Colletotrichum lindemuthianum.
11
ABSTRACT
Compounds present in seaweeds can play important role against pathogens
and on plant-pathogen interactions, through direct antimicrobial action or by inducing
a defence mechanism in plants treated with such compounds. The cell-wall
polysaccharide ulvan, soluble- and insoluble-methanol extracts from Ulva fasciata
and the polysaccharide B from Ulva sp. were studied for their antimicrobial activity
and their potencial to control bean anthracnose, caused by Colletotrichum
lindemuthianum. Ulvan was extracted by autoclaving, precipited in ethanol and
identified by
1
H, NMR-
13
C and I.V. as an ulvanobiuronic acid-3-sulfate repeated
structure. In order to obtain the crude extracts, the dried alga was extracted with
methanol in soxhet apparatus or with ethanol, respectively. The antimicrobial activity
of methanol extracts and ulvan was determined by the agar diffusion method against
bacteria and yeast and the minimal inhibitory concentration was determined for fungi
using the method of broth dilution. The following human bacterial species and yeast
were tested: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus cereus, Micrococcus luteus, Candida albicans and two plant pathogens:
Xanthomonas campestris and Erwinia carotovora. The filamentous fungi tested were
Colletotrichum lindemuthianum (plant pathogen), Trichophyton mentagrophytes and
Microsporum canis (dermatophyte pathogen). The effect of ulvan and methanol
extracts were tested, in vitro, on fungal development against C. lindemuthianum
(growth mycelium inhibition and fungitoxicity against conidia) and ethanol extract,
methanol extracts, ulvan and polysaccharide B were tested on the protection of bean
plants (Phaseolus vulgaris L.) under greenhouse conditions. The results indicated
that methanol extracts were active against Gram-negative bacteria P. aeruginosa, X.
campestris and E. carotovora. The insoluble-methanol extract (2 mg/ml) inhibited the
growth of T. mentagrophytes and the soluble-methanol extract (1 and 2 mg/ml)
inhibited significantly (p<0,05) the mycelium growth of C. lindemuthianum. In
contrast, none of extracts tested were able to reduce conidia germination and ulvan
did not show in vitro activity against the tested microorganisms. In the in vivo
experiments, ethanolic extract and ulvan (10 mg/ml), reduced (p<0,05) of the severity
on the bean anthracnose, could potentially induce resistance in bean against C.
lindemuthianum.
Keywords: Ulva fasciata, antimicrobial activity, polysaccharide, Colletotrichum
lindemuthianum
12
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS...............................................................................................................................i
LISTA DE FIGURAS..............................................................................................................................iii
RESUMO................................................................................................................................................iv
ABSTRACT.............................................................................................................................................v
SUMÁRIO...............................................................................................................................................vi
1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................................1
2. JUSTIFICATIVA..................................................................................................................................4
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................................................5
3.1. Antracnose do feijoeiro................................................................................................................5
3.2. Características e importância das algas marinhas......................................................................8
3.3. Metabólitos sulfatados e/ou halogenados de macroalgas marinhas.........................................12
3.4. Atividades biológicas das algas marinhas.................................................................................13
3.4.1. Atividade antibacteriana....................................................................................................14
3.4.2. Atividade antiviral..............................................................................................................16
3.4.3. Atividade antifúngica.........................................................................................................18
3.4.4. Outras atividades biológicas das algas marinhas.............................................................19
3.5. Utilização de algas marinhas na agricultura.............................................................................20
3.5.1. Indução de resistência em plantas...................................................................................25
3.5.1.1. Indução de resistência em plantas por compostos derivados de algas marinhas.........29
3.6. O gênero Ulva...........................................................................................................................31
3.6.1. Ulva fasciata.....................................................................................................................32
3.6.2. Composição química do gênero Ulva...............................................................................35
4. OBJETIVOS......................................................................................................................................40
4.1. Objetivo Geral............................................................................................................................40
4.2. Objetivos Específicos................................................................................................................40
5. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................................41
5.1. Coleta, secagem e identificação da macroalga........................................................................41
5.2. Preparo dos extratos e obtenção de ulvana.............................................................................43
5.2.1. Extrato metanólico............................................................................................................43
5.2.2. Extrato etanólico...............................................................................................................43
5.2.3. Obtenção de ulvana..........................................................................................................43
5.3. Identificação química da ulvana................................................................................................44
5.4. Testes in vitro............................................................................................................................45
5.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana utilizando o teste de difusão.................................45
5.4.2. Avaliação da atividade antifúngica através da determinação da concentração inibitória
mínima (CIM).....................................................................................................................46
5.4.3. Efeito de extratos e da ulvana sobre o crescimento miceliano de Colletotrichum
lindemuthianum.................................................................................................................47
13
5.4.4. Efeito de extratos e da ulvana sobre a germinação de conídios de Colletotrichum
lindemuthianum.................................................................................................................49
5.5. Testes in vivo.............................................................................................................................51
5.5.1. Qualidade das sementes de feijão....................................................................................51
5.5.2. Cultivo das plantas............................................................................................................51
5.5.3. Tratamento das plantas.....................................................................................................51
5.5.4. Inoculação do fungo..........................................................................................................52
5.5.5. Experimento I –Efeito do extrato metanólico e do extrato insolúvel em metanol sobre a
severidade da antracnose..............................................................................................53
5.5.6. Experimento II – Efeito do extrato etanólico sobre a severidade da antracnose............53
5.5.7. Experimento III – Efeito do polissacarídeo B (PS B) sobre a severidade da
antracnose......................................................................................................................54
5.5.8. Experimento IV – Efeito de diferentes concentrações do PS B sobre a severidade da
antracnose......................................................................................................................55
5.5.9. Experimento V – Efeito da ulvana sobre a severidade da antracnose...........................55
5.5.10. Avaliação da severidade da doença.............................................................................55
5.5.11. Determinação do peso da matéria fresca e da matéria seca das
plantas............................................................................................................................56
5.6. Análise dos resultados..............................................................................................................57
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................................................58
6. 1. Rendimento da macroalga coletada.........................................................................................58
6.2. Rendimento dos extratos de Ulva fasciata................................................................................59
6.3. Identificação química da ulvana................................................................................................60
6.4. Testes in vitro............................................................................................................................61
6.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana utilizando teste de difusão....................................61
6.4.2. Avaliação da atividade antifúngica através da determinação da concentração inibitória
mínima ..............................................................................................................................64
6.4.3. Avaliação do crescimento miceliano de Colletotrichum lindemuthianum..........................65
6.4.4. Teste de germinação de conídios.....................................................................................66
6.5. Testes in vivo............................................................................................................................68
6.5.1. Experimento I – Efeito de extratos metanólicos sobre a antracnose................................68
6.5.2. Experimento II – Efeito do extrato etanólico sobre a antracnose......................................70
6.5.3. Experimento III – Efeito do polissacarídeo B (PS B) sobre a antracnose.........................73
6.5.4. Experimento IV – Efeito de diferentes concentrações de polissacarídeo B sobre a
antracnose.........................................................................................................................75
6.5.5. Experimento V – Efeito da ulvana sobre a antracnose.....................................................76
7. CONCLUSÕES.................................................................................................................................80
REFERÊNCIAS.....................................................................................................................................81
14
1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento biotecnológico é hoje uma realidade, sendo a sociedade
surpreendida quase diariamente com novos avanços neste setor. A biotecnologia é
encarada pelos países desenvolvidos como a chave para um novo padrão de
desenvolvimento econômico. No Brasil, um dos maiores detentores da diversidade
biológica do planeta, a biotecnologia deve assumir um papel estratégico dentro de
um projeto de desenvolvimento nacional, com especial enfoque nas áreas da saúde
e agricultura.
Os organismos marinhos têm recebido atenção durante os últimos anos por
serem fonte de compostos naturais; uma nova e promissora área de estudos.
Recentemente, um relevante número de substâncias isoladas desses organismos
tem sido identificadas com diversos tipos de bioatividades (CLUZET et al., 2004; EL
GUEDDARI et al., 2002; GONZÁLEZ DEL VAL et al., 2001; IMMANUEL et al., 2004;
LIMA-FILHO et al., 2002; SELVIN e LIPTON, 2004; MAYER e HAMANN, 2005).
Polissacarídeos de algas marinhas são substâncias naturalmente ativas,
possuindo importantes aplicações. Ágar, carragenanas e fucoidanas são bem
conhecidos por terem vasta aplicação na indústria alimentícia, farmacêutica e
biotecnológica. Entretanto, o interesse pelo potencial dos polissacarídeos de algas
marinhas é recente (PENGZHAN et al., 2003a).
Polissacarídeos de algas marinhas têm demonstrado diversos tipos de
atividades biológicas, como antitumoral (KAEFFER et al., 1999), antiviral (TEAS et
al., 2004; CARLUCCI et al., 1997; TALARICO et al., 2005; TALARICO et al., 2004),
antilipêmica (PENGZHAN et al., 2003b) e diferentes extratos de algas possuem
atividade antibacteriana (VAIRAPPAN, 2003; IMMANUEL et al., 2004;
MAGALLANES; CÓRDOVA; OROZCO, 2003; SELVIN e LIPTON, 2004; VLACHOS;
15
CRITCHLEY; HOLY, 2000). Embora as macroalgas sejam uma abundante fonte de
metabólitos bioativos, ainda são pouco utilizadas para o controle de doenças de
plantas (STADNIK, 2003) e poucos trabalhos se referem à atividade antifúngica
(BHOSALE; JAGTAP; NAIK, 1999; EDRADA et al., 2002; ABOURRICHE et al.,
1999).
Apesar do Brasil ser o maior produtor e consumidor mundial de feijão, a
cultura ainda apresenta baixa produtividade média, cerca de 700 kg/ha, decorrente
de fatores negativos, tais como a ocorrência de várias doenças (PEREIRA;
SANTOS; ABREU, 2004).
Semelhante ao que ocorre em outros países, a produção brasileira de feijão
destina-se principalmente ao abastecimento interno, sendo baixo o comércio
internacional (ASSUMPÇÃO et al., 2003). Desta forma, o feijão é um alimento de
grande importância econômica e social para o Brasil (PEREIRA; SANTOS; ABREU,
2004). Juntamente com o arroz, constitui o cardápio básico da alimentação
(ASSUMPÇÃO et al., 2003) por ser uma das principais fontes de proteína e energia
de origem vegetal (PEREIRA; SANTOS; ABREU, 2004).
As pragas e doenças, tais como a antracnose, podem causar elevadas perdas
na produção e a alta produtividade pode ser garantida somente quando intervenções
químicas são realizadas (WORDELL FILHO, 2004). Atualmente, em todos os lugares
do mundo onde se pratica a agricultura com fins comerciais, a intervenção para o
controle de doenças de plantas é largamente realizada pelo uso de pesticidas. Sem
dúvida, o uso racional desses produtos pode ter, a curto prazo, um efeito positivo
para o produtor. No entanto, a longo prazo, além do surgimento de isolados dos
fitopatógenos resistentes aos fungicidas utilizados, os resultados para a sociedade
como um todo e para o meio ambiente podem se tornar negativos devido à poluição
16
causada pelos seus resíduos. Nesse contexto, termos como “agricultura alternativa”,
“agricultura sustentável” ou “manejo ecológico” estimulam a busca de novas medidas
de proteção das plantas contra as doenças (STADNIK e TALAMINI, 2004).
A biomassa de Ulva é importante fonte de polissacarídeo com capacidade de
formar géis com potencial importância econômica (PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS,
2004). O polissacarídeo hidrossolúvel obtido desta alga, denominado ulvana,
(LAHAYE e AXELOS, 1993) é composto por uma combinação de ramnose, glicose,
xilose, manose, galactose, ácidos urônicos e grupos sulfatos (CLUZET et al., 2004;
LAHAYE; BRUNEL; BONNIN, 1997; LAHAYE e RAY, 1996).
Na busca de novos compostos elicitores provenientes de organismos
marinhos para utilização no controle da antracnose do feijão comum (Phaseolus
vulgaris) e novos compostos com atividade antimicrobiana, foram estudados a
ulvana e diferentes extratos obtidos da macroalga marinha Ulva fasciata.
17
2. JUSTIFICATIVA
Considerando a abundância de Ulva fasciata no litoral sul brasileiro e a
potencialidade desta macroalga marinha, tanto na medicina quanto para uso na
agricultura, o objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antibacteriana, antifúngica
e o efeito sobre a antracnose, causada por Colletotrichum lindemuthianum, em
feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris), utilizando diferentes extratos e polissacarídeos
obtidos de Ulva fasciata.
18
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Antracnose do feijoeiro
O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) é afetado por inúmeras doenças que,
além de diminuir a produtividade da cultura, depreciam a qualidade do produto,
provocando importantes perdas econômicas.
A antracnose do feijoeiro é uma das doenças de maior importância dessa
cultura em todo o mundo. Quanto mais precoce for o aparecimento da doença,
maiores poderão ser as perdas (DALLA PRIA; AMORIM; BERGAMIN FILHO, 2003);
podendo atingir até 100% da lavoura quando são utilizadas sementes de baixa
qualidade, cultivar suscetível e sementes infectadas em condições ambientais
favoráveis ao seu desenvolvimento (EMBRAPA, 2004; KIMATI et al., 1997).
A antracnose é mais fácil de ser reconhecida nas vagens, onde as lesões que
caracterizam os sintomas se apresentam de forma arrendondada, deprimida, de
tamanho variável e com o centro claro, delimitadas por um anel negro, um pouco
saliente, cercado por bordas de cor café avermelhada. Quando as condições de
umidade e temperatura são favoráveis forma-se, no centro das lesões, uma massa
de esporos de coloração rosada (KIMATI et al., 1997), conforme ilustrado na Figura
1.
Esta doença é de distribuição ampla; já tendo sido constatada em vários
países da Europa, África, Ásia e América (RAVA et al., 1993). No Brasil, ocorre nos
estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo, Minas Gerais,
Bahia, Pernambuco, Espírito Santo, Alagoas, Sergipe e Paraíba (DALLA PRIA;
AMORIM; BERGAMIN FILHO, 2003; PEREIRA; SANTOS; ABREU, 2004;
BALARDIN, 1997).
19
O fungo pode aparecer em todos os estádios de crescimento e em toda a
parte aérea da planta, provocando lesões em folhas, caule, ramos, vagens e
sementes. Quando atinge as nervuras das folhas, promovendo a desestruturação da
lamela média e, conseqüentemente, o colapso do sistema de feixes vasculares,
reduz a translocação de fotoassimilados, provoca a concentração de carboidratos e
diminuição da taxa de assimilação de CO
2
(KIMATI et al., 1997). Além de diminuir o
rendimento da cultura, deprecia a qualidade do produto por ocasionar manchas nos
grãos, tornando-o impróprio para o consumo (DALLA PRIA; AMORIM; BERGAMIN
FILHO, 2003).
Figura 1. Lesões características de antracnose. Massa de conídios de Colletotrichum
lindemuthianum, de coloração rosa, formada nos acérvulos, em vagem de feijão infectada.
O gênero Colletotrichum é o agente etiológico da antracnose, principal doença
de uma ampla variedade de espécies cultivadas pelo homem (BALARDIN, 1997). O
fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus.) Briosi & Cavara pertence ao
filo Ascomycota e à classe Coelomycetes. A fase perfeita (teleomorfa ou sexual),
também pertencente ao filo Ascomycota, corresponde a Glomerella cingulata
(Stonem.) Spauld. & Schrenk f. sp. phaseoli e raramente é encontrada em culturas
ou na natureza (TU, 1992; ROCA; DAVIDE; MENDES-COSTA, 2003; GUARRO et
al., 1998).
20
Este fungo é patogênico para outras espécies de leguminosas, como
Phaseolus lunatus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus, Vigna unguiculata e
Vicia faba (KIMATI et al., 1997; TU, 1992).
O fungo produz micélio septado e ramificado, de coloração hialina a quase
negra, à medida que envelhece. Os conídios são hialinos, unicelulares, podendo ser
oblongos, cilíndricos, com pontas arredondadas ou uma delas mais pontiaguda.
Medem de 2,5-5,5 x 11-20 µm e podem apresentar uma área clara semelhante a um
vacúolo central e são formados no interior de acérvulos (KIMATI et al., 1997).
O fungo sobrevive em restos de cultura, mas sementes infectadas são a
principal via de sobrevivência e disseminação (VECHIATO et al., 2001). Respingos
de chuva, o homem e insetos também podem disseminar o patógeno (KIMATI et al.,
1997).
A temperatura tem grande influência sobre a severidade da antracnose
(DALLA PRIA; AMORIM; BERGAMIN FILHO, 2003). É uma doença que ocorre em
locais de temperatura baixa a moderada e alta umidade. Por este motivo, é mais
problemática em regiões de clima temperado e subtropical. A doença é favorecida
por temperaturas entre 13 e 27ºC, com ótimo a 21ºC, e umidade relativa acima de
91%. Os conídios germinam em 6 e 9 horas sob condições favoráveis, formam tubo
germinativo e apressório, penetrando na cutícula e epiderme do hospedeiro
(HUTCHISON et al., 2000).
C. lindemuthianum forma um apressório melanizado que é a primeira e a mais
importante estrutura de infecção formada para a invasão do hospedeiro, pois
aumenta a área de contato e a área fixação entre o fungo e a superfície da planta. A
partir do apressório, é emitida uma hifa que, por força mecânica e através de
liberação de enzimas, penetra na cutícula da célula vegetal (HUTCHISON et al.,
21
2000). O aparecimento dos sintomas ocorre a partir de 5 dias após o contato do
fungo com a planta (KIMATI et al., 1997).
C. lindemuthianum apresenta grande variabilidade patogênica (TU, 1992),
com mais de 30 raças já identificadas na América Latina (MAHUKU et al., 2002). No
sul do país, já foram detectadas mais de 25 raças distintas, com predomínio das
raças do grupo Alfa 65, 73, 81 e 89 (BALARDIN, 1997), sendo a raça 73 aquela
encontrada frequentemente em Santa Catarina (LOFFAGUEN; TALAMINI;
STADNIK, 2005).
Para diminuir as perdas causadas pela doença, recomenda-se a prática
integrada das seguintes ações: isolamento da cultura, utilização de sementes
sadias, tratamento químico da semente, rotação de culturas, incorporação de restos
culturais, aplicação de fungicidas e semeadura de genótipos resistentes (EMBRAPA,
2004; KIMATI et al., 1997). Vários fungicidas têm eficiência no controle da
antracnose: entre eles o clorotalonil, benomyl, tiofanato metílico (GIANASI, 2002).
Levando-se em conta a biodiversidade, a conservação do meio ambiente e o
excessivo dispêndio com defensivos agrícolas, especialmente os fungicidas, optar
por controles alternativos ao controle químico é uma forma de diminuir os impactos
da agricultura na natureza. Um exemplo de controle alternativo é a aplicação de
extratos de plantas ou de algas marinhas; uma vez que os defensivos agrícolas
acima listados e utilizados no controle da antracnose do feijoeiro apresentam
diversas formas de agressão ao meio ambiente.
3.2. Características e importância das algas marinhas
Algas marinhas são vegetais sem sistema vascular. Entretanto, suas células
podem formar aglomerações, na forma de fios ou de lâminas finas (PÁDUA;
22
FONTOURA; MATHIAS, 2004; MATIAS, 1999; OLIVEIRA et al., 2005). Encontram-
se distribuídas por diferentes habitats: oceanos, corpos de água doce, solos, rochas,
sobre a neve e superfície de vegetais; desde que disponham de luz e umidade
suficientes (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004). No reino plantae são encontradas as
macroalgas, organismos pluricelulares eucariontes e autótrofos, que podem ser
classificados em três grupos de acordo com a coloração (PÁDUA; FONTOURA;
MATHIAS, 2004). As principais características desses grupos são:
- Filo Chlorophyta. São descritas aproximadamente 10.000 espécies
(WAALAND; STILLER; CHENEY, 2004). É composto pelas algas verdes,
extremamente abundantes nos ambientes aquáticos. Podem habitar águas doces ou
salgadas, solos úmidos ou troncos.
- Filo Rhodophyta. São descritas aproximadamente 6.000 espécies
(WAALAND; STILLER; CHENEY, 2004). Composto pelas algas vemelhas, quase
que exclusivamente pluricelulares e marinhas (99%) que vivem fixadas em
substratos. A principal característica é a presença do pigmento ficoeritrina em suas
células, responsável pela coloração avermelhada desses organismos (VIDOTTI e
ROLLEMBERG, 2004).
- Filo Phaeophyta. Composto pelas algas marrons, organismos pluricelulares
predominantemente marinhos. As algas pardas são as maiores existentes, podendo
atingir mais de 25 metros de comprimento. Nesses organismos são encontrados os
pigmentos fucoxantina, carotenóides e como susbtâncias de reserva, óleos e
polissacarídeo de reserva (laminarana) (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
Cerca de 4 milhões de toneladas de algas são colhidas anualmente em todo o
mundo; sendo os principais produtores a China e o Japão, seguidos pelos Estados
Unidos e Noruega. A partir das algas são obtidos produtos imprescindíveis para a
23
vida do homem moderno, com valores que ultrapassam alguns bilhões de dólares
anuais (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
Mais de 250 espécies de algas são exploradas comercialmente, onde 145
espécies são utilizadas na alimentação e 101 espécies para a produção de
ficocolóides (ZEMKE-WHITE e OHNO, 1999). Os gêneros de macroalgas mais
cultivados para exploração comercial incluem Porphyra, Laminaria, Monostroma,
Enteromorpha e Gracilaria (MOLL e DEIKMAN, 1995).
Diversas rodofíceas são utilizadas comercialmente na extração de
ficocolóides, como o ágar, utilizado na fabricação de gomas, laxantes ou como meio
de cultura para uso em laboratórios de microbiologia. Outro aspecto de interesse
econômico é a extração da carragenana, um hidrocolóide utilizado na fabricação de
alimentos, como iogurtes, “flans”, sorvetes, achocolatados, embutidos (salsichas,
presuntos), gelatinas e geléias. A carragenana é utilizada, também, como
emulsificante e estabilizante; sua aplicação substitui o amido e a gordura na
preparação de certos produtos alimentícios, com a vantagem de não ser energética,
não ter cheiro, cor e nem sabor. Também são encontradas diversas aplicações em
indústrias não alimentícias (tintas, têxteis, perfumes) e famacêuticas (produtos
anticoagulantes e antiinflamatórios) (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
As algas marrons são utilizadas para a alimentação do homem e de animais e
também como fertilizantes (FLEURENCE, 1999). São importante fonte de ácidos
algínicos, cujas propriedades coloidais são aproveitadas, por exemplo na
preparação de pomadas e suspensões (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
As algas verdes são comumente utilizadas como alimentos devido ao alto
conteúdo de vitaminas, β-caroteno e minerais (FLEURENCE, 1999). Ulva e
Enteromorpha são espécies consumidas em países asiáticos e, na França,
24
receberam autorização para consumo humano como vegetais (QUEMENER;
LAHAYE; BOBIN-DUBIGEON, 1997). Algumas espécies de Ulva já são
comercializadas secas acondicionadas em embalagens próprias, como por exemplo
Nature- Algues
, na França (LAHAYE; BRUNEL; BONNIN, 1997).
Ulvaria oxysperma é uma espécie pouco estudada, embora seja utilizada para
consumo humano. É coletada por habitantes do município de Guaraqueçaba, no
Paraná, e vendida para complementar o orçamento doméstico. A alga é coletada
manualmente, seca em temperatura ambiente e embalada para fins comerciais
(PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS, 2004).
No Brasil, a região costeira compreendida entre o estado do Ceará e o norte
do estado do Rio de Janeiro abriga a flora algal mais diversificada do país. Com
relação à exploração de espécies para fins comerciais, a atividade de maior porte
corresponde à coleta de algas vermelhas (Gracilaria e Hypnea) no litoral do
nordeste, principalmente na costa entre os estados do Ceará e Paraíba. A coleta da
Gracilaria vem sendo realizada desde a década de 60, de forma manual, para fins
de exportação e também para processamento no próprio país, na produção do ágar.
Já a Hypnea tem sido exportada como matéria prima ou já processada para a
produção de carragenana (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
É preciso potencializar os recursos científicos, tecnológicos e financeiros,
coordenando os esforços nas áreas ligadas à utilização das algas e à pesquisa
básica, para que as propriedades destes organismos possam ser plenamente
aproveitadas, priorizando a qualidade de vida humana e respeitando os
ecossistemas.
25
3.3. Metabólitos sulfatados e/ou halogenados de macroalgas marinhas
A vida teve origem nos oceanos. Nesse imenso espaço, os organismos
aquáticos e o ambiente abiótico estão interrelacionados e interagem entre si. Por
isso, os organismos marinhos adaptaram-se às elevadas concentrações de sais do
meio e desenvolveram mecanismos para utilizar os nutrientes disponíveis
(CARVALHO e ROQUE, 2000).
São numerosas as substâncias sulfatadas isoladas de organismos marinhos
que parecem estar envolvidas na transferência do enxofre inorgânico para o
orgânico, pois somente em ambientes com altas concentrações do ânion sulfato são
observados organismos capazes de acumulá-lo. A sulfatação é também um modo
efetivo de tornar determinadas substâncias solúveis em água, favorecendo, assim,
sua excreção (CARVALHO e ROQUE, 2000).
Propriedades biológicas dos compostos sulfatados, como por exemplo a
atividade antibiótica, são encontradas nos três grupos de algas, ressaltando a
importância desses organismos (SMIT, 2004; MAGALLANES; CÓRDOVA;
OROZCO, 2003).
Os polissacarídeos sulfatados devem sua importância econômica ao fato de
serem atóxicos e possuírem propriedades gelatinizantes e espessantes, o que lhes
atribui considerável valor comercial (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004; CARVALHO
e ROQUE, 2000). Apresentam também, diversas atividades farmacológicas e são as
mais estudadas substâncias sulfatadas provenientes de algas (MAYER e HAMANN,
2005; PENGZHAN et al., 2003a; SMIT, 2004; ZHU et al., 2004).
Dentre as macroalgas, as rodófitas apresentam maior capacidade para
sintetizar produtos halogenados. O gênero Laurencia apresenta uma grande
26
variedade de metabólitos halogenados com propriedades biológicas, principalmente
com atividades antibacterianas (VAIRAPPAN, 2003; XU et al., 2003).
Apesar da elevada diversidade de espécies de algas marinhas, estas ainda
são subutilizadas, principalmente na área agrícola. O fato é que pouco se conhece a
respeito das suas potencialidades, mas atualmente é um campo que tem despertado
interesse e uma série de pesquisas nessa área foram iniciadas (STADNIK e
TALAMINI, 2004).
3.4. Atividades biológicas das algas marinhas
Diversas substâncias de origem marinha com propriedades biológicas, sejam
elas metabólitos primários ou secundários, estão sendo estudadas visando a sua
utilização como fármacos (MAGALLANES; CÓRDOVA; OROZCO, 2003; ZHU et al.,
2004; IMMANUEL et al., 2004; LIMA-FILHO et al., 2002; KAEFFER et al., 1999;
GONZÁLEZ DEL VAL et al., 2001; MAYER e HAMANN, 2005). Entre os organismos
marinhos, as esponjas e as algas, além de fornecer o maior número de produtos
naturais conhecidos, deram origem à cerca de 65% das patentes de produtos
antitumorais e antivirais. A síntese de análogos de moléculas naturais tem sido um
dos alvos de extenso estudo em todo o mundo, na busca de novos compostos com
propriedades farmacológicas (FRUGULHETTI et al., 2005).
Segundo Mayer e Hamann (2005) e Smit (2004), a maioria dos compostos de
macroalgas marinhas que apresentam atividades biológicas pertencem à classe de
lectinas, terpenos e polissacarídeos sulfatados.
Metabólitos isolados de algas marinhas podem ser compostos bioativos de
grande interesse para a indústria farmacêutica para o desenvolvimento de novos
medicamentos. Inúmeros pesquisadores têm demonstrado a atividade antiviral,
27
antibacteriana e/ou antifúngica de compostos extraídos das algas marinhas frente
diferentes patógenos e também atividades antitumorais e antiinflamatórias (MAYER
e HAMANN, 2005; LIMA-FILHO et al., 2002; SELVIN e LIPTON, 2004).
Nas últimas três décadas, as descobertas de metabólitos com atividades
biológicas de macroalgas têm aumentado significativamente. Entretanto, poucos
produtos finais têm chegado ao ponto de comercialização (SMIT, 2004).
3.4.1. Atividade antibacteriana
Algas marinhas são fonte importante de antibióticos com ampla e eficiente
atividade antibacteriana (VAIRAPPAN, 2003; XU et al., 2003). O potencial
antibacteriano das algas se deve à capacidade de sintetizar, entre outros
compostos, os terpenóides, muitos desses halogenados (SMIT, 2004;
MAGALLANES; CÓRDOVA; OROZCO, 2003). Esteróis, compostos fenólicos e
heterocíclicos são também encontrados nas algas e podem apresentar atividade
antibacteriana (SMIT, 2004).
Segundo Lima-Filho et al. (2002), a atividade antimicrobiana depende de dois
fatores: da espécie de alga e da eficiência na extração dos compostos ativos. Então,
como uma eficiente estratégia de investigação, solventes orgânicos têm sido
utilizados para a extração de possíveis princípios ativos de macroalgas marinhas.
Os extratos da macroalga Amansia multifida (família Rhodophyceae) foram
fracionados com solventes orgânicos: hexano, clorofórmio, etanol e apresentaram
atividade antibacteriana frente a espécies Gram-negativas: Enterobacter aerogenes,
Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Salmonella
cholerae-suis, Serratia marcescens, Vibrio cholerae e contra bactérias Gram-
positiivas: Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Já o extrato hexânico da alga
28
Caulerpa cupressoides, pertencente à família Chlorophyceae, mostrou atividade
antibacteriana somente contra Morganella morganii, B. subtilis e S. epidermidis
(LIMA-FILHO et al., 2002).
Doze extratos etanólicos de diferentes espécies de macroalgas da costa
central do Peru foram testados quanto à atividade antibacteriana, em estudo
realizado por Magallanes, Córdova e Orozco (2003). As algas Gratelopuia
doryphora, Prionitis decipiens e Ahnfeltiopsis durvillaei (Rhodophyta), Petalonia
fascia (Phaeophyta) e Bryopsis plumosa (Chlorophyta) apresentaram atividade
antibacteriana frente as espécies clínicas S. aureus e Enterococcus faecalis.
O extrato metanólico da alga verde Dunaliella primolecta inibiu o crescimento
de S. aureus, B. cereus e E. aerogenes. Apresentou estabilidade em relação a
mudanças de pH e a diferentes solventes (CHANG et al., 1993). Já, o extrato
metanólico da alga verde Cladophora prolifera inibiu o crescimento de S. aureus e V.
cholorae, enquanto que o extrato da alga marrom Stoechospermum marginarum
inibiu o crescimento de Klebsiella sp. e V. cholerae (ELY; SUPRIYA; NAIK, 2004).
A partir do extrato metanólico da alga marinha Rhodomela confervoides foram
isolados bromofenóis. Um desses compostos foi identificado, através de análises
espectroscópicas, como 2,3-dibromo-4,5-dihidroxibenzil e mostrou-se um eficiente
agente antibacteriano, apresentando concentração inibitória mínima (CIM) de 35
µg/ml para S. epidermidis ATCC 12228 e CIM de 70 µg/ml para S. aureus ATCC
29213 e P. aeruginosa ATCC 27853 (XU et al., 2003).
Os compostos oleosos halogenados etalol e iso-obtusol foram isolados de
Laurencia majuscula. Elatol inibiu o crescimento de S. epidermidis, K. pneumoniae e
Salmonella sp. e as CIM foram 1 mg/ml, 1 mg/ml e 2 mg/ml, respectivamente. Já, o
29
iso-obtusol apresentou CIM de 1 mg/ml e 1,5 mg/ml para Salmonella sp. e K.
pneumoniae, respectivamente (VAIRAPPAN, 2003).
Extratos das algas Osmundaria serrata, Galaxaura diessingiana e Codium
duthieae não apresentaram variações na atividade antibacteriana após três anos de
armazenamento. Variações sazonais da atividade antibacteriana não foram
encontradas em extratos de G. diesseingiana e C. duthieae. Entretanto, o extrato de
O. serrata apresentou um aumento da atividade antibacteriana no período do
inverno (VLACHOS; CRITCHLEY; HOLY, 2000).
Um promissor agente antibacteriano é uma furanona halogenada, pertencente
a classe das lactonas, de Delisea pulchra. É uma substância com perspectivas de
uso para tratamento de infecções crônicas por P. aeruginosa, bactéria caracterizada
pela produção de alginatos e pela formação de biofilmes em pulmão de pacientes
portadores de fibrose cística. Esta molécula inibe a colonização bacteriana através
da inibição da comunicação de células inter e intra-espécies (HOIBY, 2002). O efeito
antibacteriano desta furanona tem sido observado para várias bactérias Gram-
negativas: inibição da formação do véu de Serratia liquefaciens, inibição do
crescimento de espécies patogênicas de Vibrio (SMIT, 2004).
3.4.2. Atividade antiviral
Extrato aquoso de Undaria e diterpenos isolados da alga parda Dictyota
menstrualis e D. pfaffi inibem, in vitro, a atividade da enzima transcriptase reversa do
vírus HIV. Polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas, como por exemplo
Aghardhiella tenera e Nothogenia fastigiata e extrato aquoso de Sargassum inibem,
in vitro, os vírus HIV e herpes simples tipo 1 (HSV-1) (TEAS et al., 2004;
30
FRUGULHETTI et al., 2005) e os diterpenos de D. menstrualis e D. pfaffi inibem a
replicação do vírus HSV-1 em cultura de células (FRUGULHETTI et al., 2005).
Ivanova et al. (1994) isolaram um polissacarídeo com atividade antiviral de
Ulva lactuca. O polissacarídeo contém arabinose, xilose, ramnose, galactose,
manose e glicose (1:9:5:2:5:16), além de um outro açúcar não identificado. A
atividade antiviral, in vitro, foi observada contra o vírus influenza humano e de aves.
Esta propriedade mostrou-se dose-dependente, espécie-específica e seletiva. Já, a
atividade antiviral do extrato alcóolico de Ulva fasciata foi descrita por Garg et al.
(1992).
λ-Carragenanas e carragenanas parcialmente ciclizadas (µ/ν) isoladas da
alga vermelha Gigartina skottsbergii demostraram eficiente efeito antiviral contra
HSV 1 e 2 (CARLUCCI et al., 1997).
Uma carragenana, chamada de carraguard, é potente inibidora, in vitro, do
vírus HIV e está em estudos clínicos de fase III. Para este grupo de compostos não
foram observados significantes níveis de citotoxicidade para células de mamíferos
ou atividade anticoagulante (SMIT, 2004).
Zhu et al. (2004) isolaram um polissacarídeo sulfatado da alga marrom
Sargasssum patens que inibiu, de forma dose-dependente, a replicação do vírus
HSV 2.
Um polissacarídeo sulfatado com atividade antiviral também foi isolado de
uma alga marinha verde, Monostroma latissimum (LEE et al., 1998). Este
polissacarídeo e uma fucana sulfatada de Sargassum horneri inibiram a replicação
do vírus HSV-1 (HOSHINO et al., 1999).
31
3.4.3. Atividade antifúngica
Diversos trabalhos científicos demonstraram a atividade antifúngica de
organismos marinhos, como esponjas, corais e bactérias; porém, poucos estudos se
referem a atividade antifúngica de macroalgas marinhas (BHOSALE; JAGTAP;
NAIK, 1999).
Substâncias isoladas de bactérias e esponjas marinhas mostraram-se
eficientes inibidoras fúngicas (MAYER e HAMANN, 2005). Um composto isolado da
esponja marinha Theonella swinhoei mostrou-se um potente antifúngico,
apresentando CIM de 1,2 e 1,0 µg/ml para Candida albicans e Aspergillus fumigatus,
respectivamente (EDRADA et al., 2002).
Em relação a atividade antifúngica, Bhosale, Jagtap e Naik (1999),
observaram que o extrato metanólico das algas Amphiroa sp. e Poryphyra sp.
possuem propriedades inibitórias frente a A. japonicus e A. niger, respectivamente.
Por outro lado, o extrato metanólico de U. fasciata não teve atividade contra A.
fresenii, A. japonicus e A. niger.
A partir de Nostoc commune, foi isolado um lipopeptídeo de fórmula molecular
C
48
H
76
O
18
N
10,
chamado de nostofungicidina. Este composto apresentou potente
atividade antifúngica contra Aspergillus candidus e a sua CIM foi de 1,6 µg/ml
(KAJIYAMA et al., 1998).
Frações em hexano, éter etílico e diclorometano do extrato da alga marrom
Cystoseira tamariscifolia apresentaram atividade frente fungos e bactérias. Porém a
fração em éter etílico mostrou uma maior atividade para as bactérias Agrobacterium
tumefaciens, E. coli e S. aureus e para os fungos fitopatogênicos Botrytis cinerea,
Fusarium oxysporum e Verticillium albo-atrum (ABOURRICHE et al., 1999).
32
3.4.4. Outras atividades biológicas das algas marinhas
Ulva rigida apresentou elevadas concentrações de prolina e ácido ascórbico,
moléculas utilizadas na síntese do colágeno. Também apresentou ácido glicurônico,
um dos principais constituintes do polissacarídeo ulvana, que é um componente
importante da condroitina (matriz de mucopolissacarídeos viscosos que atuam como
flexíveis conectores entre filamentos de colágeno e as cartilagens) (RAMAZANOV,
2004).
O polissacarídeo ulvana de Ulva pertusa e duas frações de menores pesos
moleculares apresentaram ações antihiperlipidêmicas: diminuíram o colesterol total
plasmático, LDL, triglicerídeos e aumentaram o HDL; sugerindo que a ulvana tem um
potencial de prevenção de doenças isquêmicas cardiovasculares e cerebrais
(PENGZHAN et al., 2003a,b).
Segundo Sampaio et al. (1993), as hemaglutininas (proteínas com atividade
hemaglutinante de células ou glicoconjugados com capacidade de reconhecimento
específico e ligação reversível a carboidratos ou compostos contendo carboidratos)
de algas marinhas possuem propriedades particulares, tais como: capacidade de
aglutinar eritrócitos de coelho tratados enzimaticamente, não apresentar afinidade
por monossacarídeos, não requerer íons metálicos, baixas massas moleculares
quando comparadas as hemaglutininas de plantas superiores e ocorrência em
formas monoméricas.
De todas as hemaglutininas provenientes de algas marinhas isoladas e
purificadas, apenas as hemaglutininas da alga vermelha Ptilota plumosa e das algas
verdes Codium fragile e Ulva lactuca apresentaram especificidade para os grupos
sangüíneos humanos B, A
1
e O(H), respectivamente. A hemaglutinina de U. lactuca,
além de apresentar especificidade para o grupos sangüíneos humanos, tem a
33
propriedade de distinguir por intensidade de aglutinação os grupos A
2
, A
2
B de A
1
e
A
1
B (SAMPAIO et al., 1993).
3.5. Utilização de algas marinhas na agricultura
As macroalgas são organismos muito diversificados e de ocorrência freqüente
em ambientes marinhos. Apresentam vantagens como o rápido crescimento e
produção de grande volume de biomassa, além de terem ampla ocorrência no litoral
brasileiro e algumas espécies serem facilmente cultivadas. Estes são atributos
importantes que podem possibilitar a exploração comercial para a produção de
matéria prima para os mais variados usos, além daqueles já conhecidos, tais como
produção de alimentos, fabricação de ágar, fertilizantes, fármacos e cosméticos
(STADNIK, 2003).
O uso de pesticidas, em função da sua praticidade e eficiência tornou-se há
muitos anos uma prática comum para o controle de doenças de plantas. No entanto,
o uso excessivo desses produtos vêm criando sérios problemas para a sociedade,
principalmente relacionados a saúde pública e a contaminação das águas.
A demanda por produtos naturais para o controle de doenças de plantas vem
aumentando rapidamente, devido às tendências atuais do mercado, que buscam
disponibilizar produtos fitossanitários cada vez menos tóxicos ao homem e ao meio
ambiente. Trabalhos de bioprospecção buscando moléculas bioativas em plantas,
fungos, algas e outros organismos ganharam maior destaque neste século
(STADNIK, 2003; BONALDO et al., 2004; KLARZYNSKI et al., 2003; STADNIK,
BETTIOL; SAITO, 2003).
Nas relações custo/benefício dos investimentos em pesquisa, os produtos
naturais têm os maiores retornos, pois não necessitam de síntese de novas
34
moléculas. Além disso, atualmente tem-se enfocado o desenvolvimento de novos
produtos fitossanitários que mimetizem moléculas naturais, tendo como finalidade a
síntese de novos compostos bioativos capazes de controlar doenças de plantas,
com menor impacto na saúde e ambiente (STADNIK, 2003).
Aproximadamente 70% da biosfera são ocupados por biomas marinhos, os
quais detém diversidade taxonômica e bioquímica maior do que os biomas
terrestres. Neste contexto, as algas são uma das fontes potenciais para o
desenvolvimento destes novos produtos. Embora inúmeros trabalhos científicos
relatem diversos compostos bioativos em extratos de algas, entre os quais, aqueles
capazes de inibir o crescimento de bactérias e de fungos, estimular o crescimento
e/ou fortalecer as defesas das plantas contra o ataque de patógenos, somente na
última década produtos extraídos desses organismos despertaram maior interesse
da comunidade científica e da iniciativa privada (STADNIK, 2003).
Algumas espécies de algas, usadas na forma seca ou em extratos, já estão
sendo comercializadas como bioestimulantes/fertilizantes, como por exemplo os
produtos Folical E
, Phycarine
, Roots
, Selecal
, Tonialg
, comercializados em
países da Europa e nos Estados Unidos, sendo capazes de aumentar a resistência
de plantas a doenças e a geadas (GOËMAR, 2005). Contudo, o real potencial de
macroalgas para a produção de produtos naturais na agricultura permanece pouco
explorado (STADNIK, 2003).
Extratos da alga Ascophyllum nodosum estimulam processos fisiológicos das
plantas, como a fotossíntese, a absorção e a utilização de nutrientes (GOËMAR,
2005). Tasco-Forage, um extrato desta alga, apresenta atividade antioxidante em
plantas (ALLEN et al., 2001).
35
Segundo Zeemke-White e Ohno (1999) diversos gêneros de algas são
utilizadas na agricultura em diversos países, conforme mostrado na Tabela 1.
Tabela 1. Principais algas marinhas utilizadas na agricultura em diversos países, de acordo com a
divisão que pertencem.
Gênero País
Divisão Chlorophyta
Enteromorpha spp. Portugal
Ulva spp. Portugal, Itália, França, Chile, Brasil
Divisão Rhodophyta
Ahnfeltia plicata Chile
Gracilaria spp. Portugal
Gracilaria chilensis Nova Zelândia
Halymenia venusta Kenya
Laurencia papilosa Kenya, Filipinas
Lithothamnion corallioides França, Reino Unido, Irlanda
Phymatolithon calcareum França, Irlanda, Reino Unido
Divisão Phaeophyta
Alaria fitulosa Alasca
Ascophyllum nodosum França, Canadá, China, Chile
Fucus spp. França
Fucus gardneri Canadá
Hidroclathrus clathratus Filipinas
Laminaria schinzii África do sul
Macrocystis pyrifera Austrália
Nereocystis luetkaena Alasca, Canadá
Sargassum spp. Brasil, Vietnã
Fonte: ZEMKE-WHITE e OHNO, 1999; STADNIK e TALAMINI, 2004; PÁDUA; FONTOURA;
MATHIAS, 2004.
36
A alga calcárea Corallina pilulifera apresenta alto conteúdo de elementos
minerais: magnésio, cálcio, ferro, zinco, quando comparada a algas verdes, marrons
ou vermelhas. Esta alga pode ser cultivada e, portanto, explorada comercialmente
para fins agrícolas e para a criação de animais como fornecedora de elementos
minerais necessários para o desenvolvimento de plantas e animais (YAN, 1999).
Entre o estado do Espírito Santo e a região de Búzios (RJ), uma característica
marcante é a presença de vasta área coberta por fundos de algas calcárias com teor
em carbonatos superior a 90%, estendendo-se por várias dezenas de metros de
profundidade e aflorando nas marés baixas. Este banco de algas calcárias tem
despertado interesse e vem sendo explorado para produção de adubos e aditivos de
rações (VIDOTTI e ROLLEMBERG, 2004).
A empresa Göemar, localizada na França, comercializa um produto líquido a
base de extrato de alga, chamado de Göemar BM 86
, que otimiza o
desenvolvimento das plantas (GOËMAR, 2005). Também na França, o grupo
Roullier oferece produtos (Lithothamne
, Biomag
, Magneplus
e Maxlith 68
) a
base de carbonato de cálcio obtidos de uma alga marinha calcárea, Lithothamnium
calcareum, também chamada de “maërl”. Estes produtos possuem um conteúdo rico
em elementos minerais, principalmente cálcio e magnésio, e servem para otimizar o
balanço físico-químico de solos ácidos e favorecer o ambiente para a microbiota do
solo, deixando-o mais fértil (ROULLIER, 2005).
Em estudos de taxonomia e ecologia, realizados em Santa Catarina, foi
constatado que a espécie predominante era Sargassum vulgare, representando
mais de 47% da biomassa total. Com relação à estrutura do banco de algas
calcáreas, de 30 a 48% do recobrimento do ambiente esteve representado por
Lithothamnion heteromorphum (HORTA, 2005).
37
O favorecimento do crescimento de algas bentônicas em reservatórios de
água com excrementos provenientes da criação de animais é uma vantagem, pois,
estas algas convertem o nitrogênio (N) que seria volatilizado para a atmosfera sob a
forma de amônia e o fósforo (P) dos excrementos em um rápido crescimento de
biomassa (MULBRY et al., 2005). A matéria seca destas algas apresenta um grande
acúmulo de nutrientes como nitrogênio (4,9 a 7,1%) e fósforo (1,5 a 2,1%),
necessários ao desenvolvimento de plantas. Depois de colhida e seca, a biomassa
de algas concentra os nutrientes em um pequeno volume, facilitando assim, o seu
armazenamento e diminuindo os custos de transporte (WILKIE e MULBRY, 2002).
O potencial das algas melhorarem as condições do solo para o cultivo
agrícola tem recebido mais atenção nas últimas décadas e esta propriedade tem
sido atribuída ao fato de que o solo fica revestido por partículas de polissacarídeos
que estimulam o crescimento de bactérias e fungos saprófitas do solo, eliminando
assim, os microrganismos patogênicos. Além disso, as algas melhoram a agregação
do solo, minimizando a erosão e otimizando a aeração, aumentando a capacidade
de retenção e de movimentação da água, desenvolvimento de raízes, além de
fertilizá-lo (WILKIE e MULBRY, 2002).
Além da atividade direta contra fitopatógenos, algumas espécies de algas
produzem moléculas bioativas capazes de induzir a resistência em plantas (CLUZET
et al., 2004). Embora as macroalgas sejam uma importante fonte de metabólitos
bioativos, ainda são pouco utilizadas para o controle de doenças de plantas
(STADNIK, 2003).
38
3.5.1. Indução de resistência em plantas
O manejo ecológico de doenças pode ser definido como produção econômica
de culturas de alta qualidade, utilizando métodos de cultivo ecologicamente seguros,
minimizando os efeitos secundários indesejáveis e utilizando métodos de manejo
que garantam a saúde dos seres vivos e a preservação do ambiente. Portanto,
deve-se ter em mente que a adoção do manejo ecológico não é uma alternativa,
mas uma necessidade para a preservação do meio ambiente e a própria
sobrevivência da humanidade (WORDELL FILHO, 2004).
A indução de resistência é um fenômeno muito comum na natureza, onde
alguns tipos de estresse ou uma pré-infecção com um patógeno tornam as plantas
mais resistentes a infecções subseqüentes por outros patógenos. Embora conhecido
desde o início do século XX, este fenômeno biológico tem sido investigado com
maior persistência somente nas últimas décadas. A indução de resistência é uma
estratégia eficiente e alternativa para a proteção de plantas e mostra-se menos
agressiva à saúde humana e ao equilíbrio de agroecossistemas (STADNIK e
MARASCHIN, 2004).
A indução de resistência foi constatada no trabalho de Chester, em 1933, que
demonstrou que plantas inoculadas com um microrganismo atenuado ficavam
protegidas contra subseqüentes infecções pelo mesmo microrganismo ou contra
outros patógenos. Mas, somente o trabalho de Ross, em 1961, demonstrou que uma
infecção localizada pode induzir resistência sistêmica, ou seja, em tecidos distantes
do local da primeira infecção, a uma ampla gama de patógenos. A indução de
resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes existentes nas
plantas (STADNIK e MARASCHIN 2004).
39
No curso da evolução, as plantas desenvolveram um complexo mecanismo
de reações de reconhecimento, ataque e defesa para se protegerem contra
patógenos. Em poucos minutos, o reconhecimento de patógenos pelas plantas gera
respostas de defesa como, por exemplo, modificação do influxo de íons através da
membrana plasmática, fosforilação e desfosforilação de proteínas sinalizadoras,
produção de radicais reativos do oxigênio. Em poucas horas, estes eventos são
seguidos pela indução de amplo espectro de reações que conferem resistência local
contra os microrganismos, incluindo: a) reforços na parede celular pela síntese de
lignina; b) produção de metabólitos secundários sinalizadores da via dos
fenilpropanóides e octadecanóides, como o ácido salicílico e jasmonatos,
respectivamente; c) acúmulo de componentes com atividades antimicrobianas, como
as fitoalexinas e proteínas relacionadas a patogênese (PR-proteínas), como por
exemplo a PR-1 ácida. Em algumas interações com patógenos, estas respostas de
defesa são acompanhadas por reações de hipersensibilidade, causando a morte
celular programada nos sítios de ataque do microrganismo (KLARZYNSKI et al.,
2003; RAD; MUELLER; DURNER, 2005).
O reconhecimento de microrganismos invasores também pode resultar no
aumento da resistência em partes não afetadas da planta, um processo conhecido
por resistência sistêmica adquirida, conferindo longo período de resistência a
diferentes patógenos, em locais não diretamente tratados (STICHER; MAUCH-
MANI; MÉTRAUX, 1997).
As plantas detectam o ataque de microrganismos ou de elementos estranhos
através de componentes de superfície do invasor (SELITRENNIKOFF, 2001;
KLARZYNSKI et al., 2003) ou através de moléculas sinalizadoras, também
chamadas de elicitores. Portanto, elicitores são moléculas capazes de acionar as
40
respostas de defesa de plantas contra patógenos e podem ser ferramentas
alternativas no controle de doenças de plantas (CLUZET et al., 2004).
Para o uso de elicitores como protetores de plantas, é importante selecionar
compostos que: (1) causem um amplo espectro de respostas; (2) não causem
alterações no metabolismo primário da planta e (3) garantam a proteção contra
doenças (CLUZET et al., 2004).
Elicitores podem ser moléculas de origem biótica ou abiótica. Os elicitores
bióticos podem ser microrganismos viáveis ou inativados (STADNIK e MARASCHIN,
2004; STANGARLIN et al., 1999) e também compreendem moléculas como
glicoproteínas, peptídeos, carboidratos e lipídeos (CLUZET et al., 2004). Muitos
elicitores têm sido caracterizados como poli ou oligossacarídeos de parede celular,
incluindo β-glucanas de microrganismos e oligômeros derivados da quitina
(KLARZYNSKI et al., 2003).
Elicitores abióticos são representados por derivados do ácido salicílico, ácido
aminobutírico, ácido 2,6-dicloroisonicotínico (BONALDO et al., 2004),
benzotiadiazólicos (STADNIK e BUCHENAUER, 2000), luz ultravioleta, fosfatos
(BONALDO et al., 2004), entre outros.
Elicitores acionam várias vias sinalizadoras, que também são ativadas em
casos de infecção por microrganismos. Geralmente começam com influxo de cálcio
e com explosão oxidativa, seguida de síntese de moléculas sinalizadoras como
ácido salicílico, ácido jasmônico e etileno. Genes relacionados com as defesas das
plantas levam a um mecanismo de resistência de caráter estrutural, como o
fortalecimento das paredes celulares através da formação de anéis de lignificação ao
redor das paredes e deposição de papilas lignificadas nos sítios de penetração
fúngica (MOERSCHBACHER et al., 1988) ou levam a um mecanismo de resistência
41
de caráter bioquímico, como a acumulação de compostos antimicrobianos como as
fitoalexinas, indução da síntese de proteínas relacionadas à patogênese (β-1,3
glucanase e quitinase, enzimas degradadoras da parede celular de fungos) e
proteínas com atividades hidrolíticas ou inibitórias contra microrganismos, como por
exemplo peroxidases (CLUZET et al., 2004; STADNIK e MARASCHIN, 2004).
O composto sintético benzo (1,2,3) tiadiazol-7 carbotióico S-éster metílico
(BTH) é o primeiro produto pertencente a uma classe de compostos protetores de
plantas (benzotiadiazólicos) efetivos na indução de resistência. Em 1996, este
composto foi introduzido na Alemanha como constituinte da formulação de um
produto chamado Bion
(Novartis, Basel) para o controle do oídio do trigo (STADNIK
e BUCHENAUER, 2000). Atualmente, é comercializado em diversos países, entre
eles, o Brasil.
A variada natureza química dos elicitores demonstra que não há um
característica estrutural única que determine a atividade elicitora e mostra-se como
uma estratégia potencial para o controle fitossanitário (STADNIK e MARASCHIN,
2004).
O polissacarídeo quitosana é um polímero natural obtido por desacetilação da
quitina, que é o segundo composto orgânico renovável mais abundante (antecedido
somente pela celulose), e é encontrado no exoesqueleto de crustáceos, de insetos e
no plâncton. Quitosana é um polímero linear, formado por unidades repetitivas de 2-
amino-2-deoxi-D-glicose (D-glicosamina) ligadas por β–(1,4) (ASSIS e PESSOA,
2004). Por outro lado, quitosana também é um típico constituinte de parede celular
de fungos patogênicos biotróficos. Enzimas como quitinases e, possivelmente,
quitosanases de plantas podem degradar essas quitosanas de fungos patogênicos
invasores. Isto não somente destrói as paredes celulares de fungos, mas também
42
libera oligômeros solúveis em água e/ou polímeros de quitina e/ou quitosana que
podem atuar como elicitores em reações de defesa das plantas. Portanto, quitosana
é um polissacarídeo elicitor das reações de defesas em plantas (VANDER et al.,
1998).
3.5.1.1. Indução de resistência em plantas por compostos derivados de
algas marinhas
Algas marinhas representam uma abundante e natural fonte de potenciais
elicitores (KLARZYNSKI et al., 2000; KLARZYNSKI et al., 2003; CLUZET et al.,
2004), além de apresentarem atividade direta contra fungos e bactérias, conforme
descrito em itens anteriores. Diversas plantas tratadas com extratos de algas
tornaram-se resistentes à doenças, além de melhorar a germinação de sementes
(KLARZYNSKI et al., 2003; CLUZET et al., 2004).
A λ-carragenana, um polissacarídeo sulfatado encontrado na parede celular
de algas marinhas vermelhas, é um composto elicitor, dose-dependente, que
apresenta atividade a partir de 100 µg/ml induzindo o acúmulo de ácido salicílico e
de outros compostos em folhas tratadas de Nicotiana tabacum, aumentando a
expressão de genes relacionados às defesas contra patógenos (MERCIER et al.,
2001).
Extratos da alga marrom Ascophyllum nodosum são eficientes para controlar
Oomycetes. Em videira, pulverizações foliares com extratos desta alga reduziram o
número de folhas infectadas, área foliar lesionada e a taxa de esporulação de
Plasmopora viticola, em 28, 40 e 50%, respectivamente. Estudos bioquímicos com
plantas de pimentão tratadas com extrato de A. nodosum revelaram aumento da
43
atividade de peroxidase e síntese de fitoalexina capsidiol, conseqüentemente,
aumentando a resistência das plantas a Phytophtora capsici (LIZZI et al., 1998).
O produto Phyllum
,
registrado como bioestimulante natural, possui em sua
formulação extrato de A. nodosum e é comercializado no Chile para estimular
processos fisiológicos de plantas (STADNIK e TALAMINI, 2004).
Um polímero linear de β-1,3-glucana, chamado de laminarana, foi extraído e
purificado da alga marrom Laminaria digitata (KLARZYNSKI et al., 2000). Em uma
suspensão de cultura de células de tabaco, a concentração de 200 µg/ml de
laminarana, em poucos minutos, alcalinizou o meio extracelular e aumentou a
concentração de peróxido de hidrogênio. Em poucas horas, estimulou a atividade de
enzimas, como a fenilalanina amônia liase, lipoxigenase e propiciou o acúmulo de
ácido salicílico, sem causar danos as células da cultura. Por outro lado, quando esta
concentração foi infiltrada em folhas de tabaco, após 48 horas a laminarana ativou a
produção de quatro famílias de PR-proteínas e após cinco dias do tratamento,
reduziu a infecção por Erwinia carotovora subsp. carotovora, quando comparada
com folhas tratadas apenas com água (KLARZYNSKI et al., 2000).
O extrato de L. digitata é registrado e comercializado pela empresa Göemar
com o nome de Iodus 40
(40 g de laminarana por litro) para induzir resistência
contra doenças em trigo, tais como fusariose, oídio e septoriose. Esse produto não é
fitotóxico e os custos energéticos para a planta, devido a indução de resistência, são
baixos ou inexistentes (STADNIK e TALAMINI, 2004).
Fucanas sulfatadas são componentes estruturais comuns em paredes
celulares de algas marinhas marrons. Klarzynski et al. (2003), utilizando-se de uma
enzima hidrolase isolada de bactéria marinha para preparar oligossacarídeos de
fucanas sulfatadas, demonstraram atividade elicitora destes oligômeros em plantas
44
de fumo, contra o vírus do mosaico do tabaco. Análises bioquímicas de folhas de
fumo tratadas com estes oligossacarídeos, mostraram aumento de marcadores de
resistência sistêmcia adquirida (SAR): acúmulo sistêmico de ácido salicílico e
fitoalexina escopoletina, indução das enzimas fenilalanina amônia liase e
lipoxigenase e também aumento da expressão de inúmeras proteínas relacionadas a
patogênese após 200 µg de oligofucanas infiltradas nas folhas.
3.6. O gênero Ulva
Ulva spp. são algas verdes pertencentes à divisão Chlorophyta. Após um
corte transversal, o gênero Ulva se diferencia do gênero Ulvaria, pois apresenta
duas camadas de células, enquanto que este apresenta somente uma camada.
Devido a esta característica as lâminas de U. lactuca e U. fasciata são mais rígidas
que as lâminas de Ulvaria oxysperma, atualmente chamada de Monostroma
oxysperma (PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS, 2004).
Espécies de Ulva spp são encontradas em diversos habitats. Os zoósporos
podem se fixar em matéria orgânica ou inorgânica e originam lâminas maiores que
20 centímetros de comprimento. U. fasciata utiliza rochas como substrato, enquanto
que U. lactuca utiliza manguezais e areia para o seu crescimento (PÁDUA;
FONTOURA; MATHIAS, 2004).
Segundo estudo realizado por Taquil e Yoneshigue-Valentin (2002) na Praia
de Boa Viagem (Niterói, RJ), as espécies U. fasciata Delile e U. rigida C. Agardh
foram encontradas nas quatro estações do ano. Já a espécie U. lactuca L. foi
encontrada somente na primavera e no inverno. Porém, segundo Lamare e Wing
(2001), U. lactuca é anual, mas cresce abundantemente no inverno. No ano de
2002, a flora da Praia de Boa Viagem era formada predominantemente por U.
45
fasciata e Enteromorpha compressa, espécies capazes de reter metais pesados,
potencialmente indicadoras de poluição orgânica (LAHAYE, 1998; TAQUIL e
YONESHIGUE-VALENTIN, 2002).
Ulva representa uma importante biomassa ainda pouco utilizada (LAHAYE;
BRUNEL; BONNIN, 1997). Algumas das espécies de Ulva são utilizadas como
alimento para o homem, por serem ricas em fibras (LAMARE e WING, 2001;
LAHAYE; BRUNEL; BONNIN, 1997; GARG et al., 1992). U. lactuca é utilizada na
alimentação de animais ruminantes (VENTURA e CASTAÑÓN, 1998; LAHAYE,
1998; PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS, 2004) e como fertilizantes na agricultura
(GARG et al., 1992). U. reticulata também é utilizada na agricultura como
condicionador de solo (VAIRAPPAN e SUZUKI, 2000).
As espécies de Ulva são encontradas em diversos países, conforme descrito
na Tabela 2.
3.6.1. Ulva fasciata
U. fasciata é uma alga verde (Figura 2) que apresenta ampla distribuição no
litoral catarinense (HORTA et al., 2001) e cresce abundantemente na Ilha do Mel,
litoral do Paraná (PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS, 2004). Esta macroalga, também
conhecida como alface do mar (sea lettuce), pertence à divisão Chlorophyta, ordem
Ulvales, família Ulvaceae e gênero Ulva. É constituída por talos muito finos, que se
apresentam sob a forma de extensas lâminas. Aproximadamente 10 a 15 cm da
base, essas lâminas começam a afilarem-se gradualmente até atingirem 2,5 cm de
largura; podendo chegar a mais de 1 metro de comprimento. Na base, são lâminas
largas que se dividem em muitas tiras com margens regulares, freqüentemente
onduladadas. Mantêm-se presas às rochas através de pequenas raízes escuras. As
46
lâminas são verdes brilhantes ou verdes escuras, douradas nas bordas em fase de
reprodução (JOLY, 1965).
Tabela 2. Países onde são encontradas espécies de Ulva.
Local Espécie de Ulva Referência
Brasil (PR, SC, RJ, CE)
Ulva fasciata, Ulva lactuca, Ulva rigida
PÁDUA; FONTOURA, MATHIAS, 2004; TAQUIL e
YONESHIGUE-VALENTIN, 2002; PEREIRA et al.,
2000; HORTA et al., 2001
França
Ulva rigida, Ulva rotundata, Ulva armoricana,
Ulva olivascens, Ulva scandinavica
CLUZET et al., 2004; RAY e LAHAYE, 1995a;
LAHAYE et al., 1999; BRIAND e MORAND, 1997;
LAHAYE e AXELOS, 1993
China
Ulva fasciata; Ulva pertusa
WANG et al., 2004; PENGZHAN et al., 2003a;
LEE e CHEN, 1998
Hawaii
Ulva fasciata
UNIVERSITY OF HAWAII, 2004
Espanha
Ulva gigantea, Ulva rigida
LAHAYE et al., 1999; GONZÁLEZ DEL VAL et al.,
2001
Índia
Ulva fasciata, Ulva lactuca
SELVIN e LIPTON, 2004; GARG et al., 1992;
BHOSALE; JAGTAP; NAIK, 1999; IMMANUEL et
al., 2004
Peru
Ulva nematoidea
MAGALLANES; CÓRDOVA; OROZCO, 2003
Estados Unidos
Ulva lactuca
SCHLOSSER et al., 2005
Malásia
Ulva reticulata
VAIRAPPAN e SUZUKI, 2000
Tanzania
Ulva reticulata
MSUYA e NEORI, 2002
Nova Zelândia
Ulva lactuca
LAMARE e WING, 2001
Portugal Ulva spp. ZEMKE-WHITE e OHNO, 1999
Itália
Ulva rigida, Ulva armoricana, Ulva lactuca,
Ulva rotundata,
PARADOSSI et al., 1999; PARADOSSI;
CAVALIERI; CHIESSI, 2002; ZEMKE-WHITE e
OHNO, 1999
Os talos com as lâminas expandidas apresentam somente duas finas
camadas de células. A divisão celular pode ocorrer em qualquer parte do talo, mas
sempre em um plano perpendicular a sua superfície. As células são geralmente
retangulares, com 8 a 20 µm de largura por 14 a 40 µm de comprimento,
47
irregularmente arranjadas. As paredes das células são constituídas de celulose
(UNIVERSITY OF HAWAII, 2004).
Figura 2. Macroalga marinha Ulva fasciata.
É comumente encontrada em paredões rochosos ou rochas isoladas com
ondas fortes e baixas, com poucos herbívoros (JOLY, 1965). Freqüentemente
abundante em áreas de água fresca corrente com grande oferta de nutrientes, perto
de córregos, riachos ou onde desembocam canos. Sua presença indica zonas
poluídas ou de maré forte, sendo encontrada nos oceanos Pacífico, Atlântico e
Índico (UNIVERSITY OF HAWAII, 2004).
U. fasciata e Enteromorpha flexuosa são geralmente as primeiras macroalgas
a colonizar novos substrados em áreas de maré com elevada oferta de nutrientes.
Esta característica pode ser atribuída a sua simples morfologia e reprodução. A
facilidade de reprodução dessa alga se deve a capacidade fotossintética das células
reprodutivas, que podem sintetizar moléculas que auxiliam na mobilidade e no rápido
crescimento após a fixação ao substrato. As células reprodutivas de U. fasciata
possuem similar capacidade fotossintética do que as células adultas vegetativas,
porém com maior capacidade respiratória. Esta ampla distribuição também se deve
ao poder invasivo. Águas costeiras próximas a portos, complexos industriais e
48
residenciais com elevada oferta de nutrientes favorecem o aumento rápido de
espécies de Ulva (“blooms”) (UNIVERSITY OF HAWAII, 2004).
No Hawai, U. fasciata é uma alga marinha muito utilizada na alimentação. É
incluída nas saladas, sopas (RAMAZANOV, 2004) ou utilizada como tempero
(UNIVERSITY OF HAWAII, 2004).
3.6.2. Composição química das algas do gênero Ulva
Ulva contém três principais componentes polissacarídicos: (a) celulose
amorfa, que pode ser convertida em uma forma mais cristalina por tratamento
térmico em solução aquosa de ácido clorídrico; (b) polissacarídeos aniônicos
solúveis em água contendo grupos sulfatos; e (c) amido. Os polissacarídeos a e b
estão localizados na parede celular, enquanto que o amido é a forma de
armazenamento da glicose. A grande concentração de enxofre é atribuída a
presença dos polissacarídeos aniônicos sulfatados e a presença de íons de cálcio e
de magnésio é atribuída a elevada concentração de carbonatos. Não possui íons
sódio. Também contém clorofilas a e b e muitos compostos carotenóides, incluindo
β-caroteno (PARADOSSI et al., 1999).
Polissacarídeos da parede celular de U. rigida foram extraídos
sequencialmente com oxalato de sódio, hidróxido de potássio (KOH) 1 e 4 M, cloreto
de sódio e KOH a 4 M novamente. A composição química dos extratos solúveis e
insolúveis e de frações de polissacarídeos solúveis obtidas de uma coluna de DEAE-
Sepharose foi determinada. Através desta metodologia, Ray e Lahaye (1995a)
obtiveram três principais famílias de polissacarídeos. A principal família foi composta
de polissacarídeo ácido, formado principalmente de ramnose (23,8-26,3 mol%),
ácido urônico (18,4-22,6 mol%), sulfato (38,4-41,9 mol%), xilose (10,2-12,3 mol%) e
49
traços de glicose unidos sob a forma de glicuronoramnoxiloglicanas sulfatadas em
uma mesma cadeia e o rendimento, em relação ao peso de alga seca utilizada na
extração, foi de 10,52 %. Esta família de polissacarídeos sulfatados ramificados de
Ulva foi denominada ulvana por Lahaye e Axelos em 1993. As outras duas famílias
isoladas são cadeias hemicelulósicas lineares solúveis em meio alcalino, compostas
de β-1,4-glicuronanas e β-1,4-glicoxilanas. Em menor quantidade, uma quarta fração
consistiu em polissacarídeos neutros sulfatados, extraídos com KOH a 1 e 4 M e
cloreto de sódio, contendo principalmente glicose, xilose e em menor concentração
ramnose, ácidos urônicos e sulfatos, além de apresentar também proteínas.
As ulvanas, são compostas, então, principalmente por unidades
dissacarídicas regulares formadas por ácido β-D-glicuronosilurônico (1→4)-L-
ramnose ou simplesmente ácido ulvanobiurônico ou ácidos aldobiourônicos,
conforme ilustrado na Figura 3 (PARADOSSI et al., 1999).
Figura 3. Representação esquemática da estrutura principal do polissacarídeo sulfatado (ulvana)
obtido de Ulva. Fonte: PARADOSSI et al., 1999.
A ulvana encontra-se em todas as paredes celulares (BOBIN-DUBIGEON et
al., 1999), representando a maior fração de biopolímeros da parede (PARADOSSI;
CAVALIERI; CHIESSI, 2002). Segundo Ray e Lahaye (1995a), glicoproteínas
sulfatadas, compostas de ácido glicurônico, glicose, ramnose e xilose também foram
encontradas em extratos obtidos de U. lactuca com hidróxido de sódio (NaOH) a 1 M
e xilose, glicose e galactose foram obtidas de extrações com KOH 4 M.
50
As hidrólises enzimática e ácida permitem a obtenção de oligômeros deste
polissacarídeo: ácido urônico, que pode ser conjugado com a glicose formando
ácido glicurônico (RAY e LAHAYE, 1995b), ramnose sulfatada, xilose (LAHAYE e
RAY, 1996; PARADOSSI et al., 1999) e em menores concentrações glicose e
galactose (RAY e LAHAYE, 1995a). Devido a esta estrutura química particular, os
ácidos aldobiourônicos são resistentes a hidrólise ácida, a enzimas digestivas
humanas e a fermentações in vitro pela biota fecal humana, impedindo assim a
quebra das ligações entre glicose e ramnose (RAY e LAHAYE, 1995b). Estes
polissacarídeos são solúveis em água (RAY e LAHAYE, 1995a) e possuem a
capacidade de formar géis na presença de íons cálcio e borato (PARADOSSI et al.,
1999).
Estudos de desulfatação, de redução e espectroscopia de RNM de
1
H e
13
C
evidenciaram que na ulvana o O-3 da ramnose e o O-2 da xilose são sítios de
sulfatação e que aproximadamente 16,8-20,7% da ramnose está ramificada em O-2
e sulfatada em O-3 (RAY e LAHAYE, 1995b; LAHAYE e RAY, 1996)
Os polissacarídeos insolúveis em soluções básica são muito semelhantes
entre as espécies. Em U. lactuca, são compostos de celulose de cadeias lineares de
β-1,4-xiloglicanas (LAHAYE e RAY, 1996). A ramnose é freqüentemente encontrada
em exopolissacarídeos de bactérias ou em alguns polissacarídeos vegetais, mas
ramificações em O-2 de (1→4) ácido-β-D-glicurônico ligado a L-ramnose somente
foram descritas no exopolissacarídeo produzido pela bactéria Arthrobacter sp.
(LAHAYE e RAY, 1996).
A maioria das cadeias possui na extremindade uma unidade de ácido
glicurônico, que é o principal carboidrato do polissacarídeo solúvel em água (ulvana)
dos membros da ordem Ulvales (RAY e LAHAYE, 1995b). Devido as suas
51
características estruturais, a ulvana é similar a classe dos polissacarídeos naturais
chamados de mucopolissacarídeos (PARADOSSI et al., 1999). O comprimento da
cadeia ainda é desconhecido e não é possível afirmar que os sítios de ligações dos
sulfatos e dos açúcares são os mesmos entre ulvanas de diferentes espécies de
Ulva (LAHAYE e RAY, 1996).
Enteromorpha intestinalis também possui polissacarídeos sulfatados (LEE et
al., 1998) formados por glicuronoxiloramana, contendo 43% de ramnose, 19,8% de
íons sulfatos e 17% de ácidos urônicos. Esta composição é comparável a de outras
algas da família Ulvaceae. Porém, os extratos obtidos com oxalato de amônio a
75ºC contém galactose e menores valores de viscosidade, provavelmente como
resultado da quebra de ligações lábeis entre cadeias (REVIERS e LEPROUX, 1993).
Este polissacarídeo apresenta uma potente atividade anticoagulante (LEE et al.,
1998)
Poucas famílias de enzimas degradadoras de polissacarídeos de algas têm
sido descritas. Foram descritas alginatos liases e galactanas hidrolases (β- e α-
agarases, κ- e ι-carragenases) para estudos de estrutura química dos seus
susbtratos e para a produção de protoplastos de algas. Para a degradação de
ulvana, Lahaye; Brunel e Bonnin (1997), obtiveram uma enzima a partir de uma
bactéria Gram-negativa formadora de pequenas colônias de coloração alaranjada
isolada de lama contendo Ulva sp. em decomposição, apresentando atividade
máxima em pH próximo a 9,0 e à temperatura entre 40-50ºC. Esta enzima gerou
várias unidades de ácido ulvanobiurônico, confirmando que estas unidades são as
principais unidades de construção do esqueleto da ulvana.
Em um estudo realizado por Pádua, Fontoura e Mathias (2004), a alga U.
lactuca, coletada em Guraraqueçaba nos meses de outubro e fevereiro, apresentou
52
16,79% de proteínas, 1,20% de lipídeos, 10,78 de fibras e 58,03% de carboidratos,
em média. Já, a alga U. fasciata coletada na Ilha do Mel durante os meses de verão
(dezembro e fevereiro) apresentou menores porcentagens de proteínas, lipídeos e
carboidratos, porém apresentou a mesma porcentagem de fibras, conforme ilustrado
na Tabela 3.
Tabela 3. Composição química (em 100 g de amostra) de Ulva lactuca coletada em Guaraqueçaba
nos meses de outubro e fevereiro de 1996 e de Ulva fasciata coletada na Ilha do Mel em dezembro e
fevereiro de 1995.
Parâmetros analisados
Ulva lactuca
1
Ulva lactuca
2
Ulva fasciata
3
Ulva fasciata
4
Proteínas
15,2 18,3 13,3 16,1
Lipídeos
1,2 1,1 1,9 0,3
Fibras
11,9 9,6 10,8 9,3
Carboidratos
58,4 57,6 53,3 56,5
Fonte: PÁDUA; FONTOURA; MATHIAS, 2004.
1
Coletada em Guaraqueçaba em outubro.
2
Coletada em Guaraqueçaba em fevereiro.
3
Coletada na Ilha do Mel em dezembro.
4
Coletada na Ilha do Mel em fevereiro.
53
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo Geral
- Avaliar, in vitro, a atividade antibacteriana e antifúngica e, in vivo, o efeito
sobre a antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) de extratos e
polissacarídeos da macroalga marinha Ulva fasciata, obtidos por diferentes
processos de extração.
4. 2. Objetivos Específicos
- Avaliar, in vitro, o efeito de extratos e de ulvana obtidos de Ulva fasciata
sobre a germinação de conídios e sobre o crescimento miceliano de Colletotrichum
lindemuthianum;
- Avaliar, in vitro, a atividade antibacteriana e antifúngica de extratos e ulvana
através de método qualitativo, utilizando difusão em ágar;
- Avaliar, in vitro, a atividade antifúngica de extratos e ulvana através de
método quantitativo, utilizando microdiluição em caldo;
- Estudar o efeito local e sistêmico de extratos e polissacarídeos no controle
da antracnose em plantas de feijoeiro comum;
- Avaliar o efeito do tratamento foliar com extratos e polissacarídeos sobre o
peso de matéria fresca e peso de matéria seca das plantas de feijoeiro comum.
54
5. MATERIAL E MÉTODOS
O preparo dos extratos da macroalga marinha, o teste de difusão em ágar e a
determinação da concentração inibitória mínima foram conduzidos no Laboratório de
Antibióticos do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da Universidade Federal de
Santa Catarina (UFSC). Os demais testes in vitro e in vivo foram conduzidos no
Laboratório de Fitopatologia e em casa-de-vegetação, respectivamente, no Centro
de Ciências Agrárias (CCA), também localizado na UFSC.
5.1. Coleta, secagem e identificação da macroalga
A coleta da alga foi realizada manualmente, em horários de maré baixa, nos
costões rochosos da Praia Mole, Praia da Daniela, Praia do Forte e Praia da
Armação do litoral de Florianópolis, Santa Catarina.
Foram realizadas 9 coletas de algas; sendo que, 3 destas foram realizadas na
Praia Mole, no período compreendido entre julho e setembro de 2004; 3 foram
realizadas na Praia da Daniela e na Praia do Forte, durante os meses de janeiro e
fevereiro de 2005 e 3 coletas na Praia da Armação nos meses de fevereiro a abril de
2005 (Tabela 4).
Imediatamente após a coleta, todo material foi levado ao laboratório em sacos
plásticos e as amostras foram submetidas a uma limpeza manual, para eliminação
dos contaminantes: areia, sal, organismos epífitos, fauna acompanhante e
separação de outras espécies de alga. Após, o material selecionado foi lavado
abundantemente com água corrente.
Após a lavagem, as algas foram pesadas e imediatamente colocadas em
estufa com aeração a 40-45ºC, por 24 a 48 horas. Após o material estar
completamente seco, foi triturado até a obtenção de um pó fino, o qual foi pesado e
55
armazenado em temperatura de 6 ± 2ºC até o momento da extração. O rendimento
foi calculado em relação ao peso de matéria fresca da alga.
Amostras de alga fresca foram enviadas ao Laboratório de Biologia Celular
Vegetal do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa
Catarina, sob responsabilidade da Professora Dra. Zenilda Laurita Bouzon, para a
identificação do material coletado. Com base em sua morfologia, as algas coletadas
foram identificadas, segundo Joly (1965), como Ulva fasciata
Tabela 4. Local, quantidade de algas frescas coletadas e o respectivo peso de matéria seca.
Coletas (data) Local da coleta Peso fresco (g) Peso seco (g)
1 (21/07/04) Praia Mole 1.545,6 115,4
2 (28/07/04)
Praia Mole
1.322,3
97,7
3 (20/09/04)
Praia Mole
1.215,4
105,1
4 (17/01/05)
Praia da Daniela e Praia do Forte 2,153,1 179,8
5 (26/01/05)
Praia da Daniela e Praia do Forte 1.091,9 86,8
6 (08/02/05)
Praia da Daniela e Praia do Forte 500,0 78,2
7 (09/02/05)
Praia da Armação 210,5 26,6
8 (10/03/05)
Praia da Armação 424,1 51,5
9 (20/04/05) Praia da Armação 200,1 27,87
56
5.2. Preparo dos extratos e obtenção de ulvana
5.2.1. Extrato metanólico
Para a obtenção do extrato metanólico, 202,13 g de alga seca e moída foram
extraídos com metanol em sistema de Soxhlet. O solvente permaneceu em contato
com o material até a extração exaustiva das substâncias.
Todo o solvente do extrato bruto, assim obtido, foi evaporado em evaporador
rotatório sob vácuo a 45-50ºC e o extrato concentrado foi armazenado à temperatura
de 6±2ºC. No momento da realização dos testes, o extrato concentrado foi diluído
em água destilada ou em dimetilsulfóxido (DMSO) para obter-se as concentrações
de 1 mg/ml e 2 mg/ml. O rendimento do extrato em relação à quantidade de alga
seca utilizada na extração foi determinado.
5.2.2. Extrato etanólico
Para a obtenção do extrato etanólico, 10 g de alga seca e moída foi extraída
com 10 ml de etanol P.A. durante 24 horas. Após esse período, o extrato foi filtrado
em papel filtro e todo solvente foi evaporado em evaporador rotatório sob vácuo a
45-50ºC. No momento da realização dos testes, o extrato bruto foi diluído com água
destilada até a obtenção de uma relação de peso/volume de 10 mg de alga seca/ml
de água.
5.2.3. Otenção de ulvana
Para a obtenção de compostos de alto peso molecular (polissacarídeos) da
parede celular da alga, 10 g de alga seca e moída foram autoclavadas com 300 ml
de água destilada durante 2 horas a 110ºC (PENGZHAN et al., 2003a).
Paralelamente, também foram utilizadas algas frescas para a obtenção de
57
polissacarídeo. Para tal, foram autoclavadas 100 g de alga fresca em 300 ml de
água destilada, também durante 2 horas a 110ºC (CLUZET et al., 2004). O líquido foi
filtrado, concentrado por evaporação em estufa a 50ºC até aproximadamente 80 ml e
então, precipitado com 3 volumes de etanol P.A. e armazenado a – 20ºC por 48
horas. Após esse período, o sobrenadante aquoso foi desprezado, o precipitado foi
recuperado por filtração e seco em estufa a 50±2ºC durante aproximadamente 24
horas até peso constante para a determinação do rendimento, em relação ao peso
da alga fresca ou seca. Logo após, o polissacarídeo foi armazenado em
temperaturas de 6±2ºC até o momento do uso; quando dissolvido em água
destilada, sob agitação, para a obtenção das concentrações de 0,1, 1, 5 e 10 mg/ml.
O polissacarídeo de Ulva sp., extraído segundo a metodologia de Maraschin
et al. (2000) e denominado de polissacarídeo B, foi fornecido pelo Professor Dr.
Marcelo Maraschin do Laboratório de Morfogênese e Bioquímica Vegetal do Centro
de Ciências Agrárias (CCA) da UFSC, também utilizado nos testes in vivo.
5.3. Identificação química da ulvana
A composição do polissacarídeo da alga em estudo foi determinada pelo
Professor Dr. Moacir Geraldo Pizzolatti do Laboratório de Química de Produtos
Naturais do Departamento de Química da UFSC através de espectros de ultra-
violeta (U.V.), infra-vermelho (I.V.) e ressonância nuclear magnética de
1
H e
13
C (
1
H-
RNM e
13
C-RNM). Para tal, fragmentos do polissacarídeo foram analisados por
espectroscopia no Infra-Vermelho em espectrofotômetro Perkin Elmer FT-16PC com
transformada de Fourier. Os espectros de RNM
1
H e
13
C foram obtidos em D
2
O em
espectrômetro Bruker AC-200 a 200 MHz e 50 MHz respectivamente.
58
5.4. Testes in vitro
Os testes in vitro realizados no Laboratório de Antibióticos tiveram como
objetivo avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica de diferentes extratos e da
ulvana obtidos de U. fasciata em relação a bactérias patogênicas ao homem,
bactérias fitopatogênicas, fungos dermatófitos, fitopatogênico e levedura. Já, os
testes in vitro realizados no Laboratório de Fitopatologia tiveram como objetivo
verificar o efeito de diferentes extratos e da ulvana sobre o crescimento miceliano e
sobre a germinação de conídios de C. lindemuthianum
5.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana utilizando o teste de difusão
Foram utilizadas as estirpes potencialmente patogênicas ao homem:
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas
aeruginosa ATCC 27853, Bacillus cereus MIP 96016 (MIP, Departamento de
Microbiologia de Parasitologia da UFSC), Micrococcus luteus MIP 200401 e Candida
albicans ATCC 14053. Também foram utilizadas as bactérias fitopatogênicas:
Xanthomonas campestris var. vesicatoria MIP 2002001 e Erwinia carotovora subsp.
carotovora MIP 2002003 que permaneceram em temperatura de 6±2ºC no
Laboratório de Antibióticos, em caldo BHI (“brain heart infusion”), até o momento da
realização dos testes.
O método de difusão em ágar foi utilizado para estudo qualitativo da atividade
antibacteriana e antifúngica do extrato metanólico, do extrato insolúvel em metanol e
da ulvana. Para tal, volumes de 18 ml de ágar Müeller-Hinton foram vertidos em
placas de Petri e após a solidificação do meio foram feitos 5 orifícios de 7 mm de
diâmetro em cada placa.
59
O inóculo bacteriano foi preparado a partir de 300 µl de cada cultura estoque
transferidos para 3 ml de caldo BHI. A incubação foi mantida durante 24 horas a
36ºC±1ºC, sendo a pureza das culturas confirmada após as primeiras 8 horas de
incubação em meio ágar sangue. Após esse procedimento, a suspensão bacteriana
foi diluída em solução fisiológica (0,9%) até corresponder a 10
6
UFC/ml (SMANIA et
al., 1999).
Os extratos metanólicos foram ressuspensos em DMSO, a fim de se obter a
concentração final de 4 mg/50 µl e a ulvana foi ressuspensa em água destilada
esterilizada, obtendo-se também uma concentração final de 4 mg/50 µl (Valgas,
2002). Os orifícios foram preenchidos com 50 µl dos extratos a serem testados. 50 µl
de DMSO foram utilizados como de teste toxicidade do solvente frente aos
microrganismos testados. As placas foram incubadas durante 20 horas a 36±1ºC. O
resultado positivo foi definido quando houve a formação de um halo de inibição do
crescimento bacteriano ou fúngico (SMANIA et al., 1999), revelando, então, a
produção de substâncias antibióticas.
5.4.2. Avaliação da atividade antifúngica através da determinação da
concentração inibitória mínima (CIM)
Para a determinação da CIM foram utilizados o extrato metanólico, o extrato
insolúvel em metanol e a ulvana contra Trichophyton mentagrophytes MIP 2005001,
Microsporum canis MIP 2005003 (dermatófitos). Estas culturas permaneceram em
temperatura de 6±2ºC no Laboratório de Antibióticos, em batata dextrose ágar
(BDA), até o momento da realização dos testes. A CIM dos extratos e da ulvana
também foi determinada em relação ao isolado de Colletotrichum lindemuthianum
raça 73 Labfitop 001-03, obtido do Laboratório de Fitopatologia, previamente
60
identificado por Loffaguen et al. (2005). O fungo foi conservado em meio ágar batata
dextrose (BDA) em temperatura de 6±2ºC e também pelo método de Castelani em
temperatura ambiente até o momento da realização dos testes.
Quatro miligramas dos extratos e da ulvana foram dissolvidos em 200 µl
DMSO e água destilada, respectivamente, diluídos em 1800 µl caldo nutritivo e após,
diluídos seriadamente (2 a 0,0156 mg/ml). Cem microlitros de cada diluição foram
depositados em orifícios de uma placa de microdiluição, aos quais foram
adicionados 5 µl do inóculo fúngico contendo 1,2x10
4
conídios/ml de C.
lindemuthianum e 10
5
UFC/ml dos fungos dermatófitos. As placas foram incubadas a
25±1ºC durante 48 horas. Após este período, a leitura foi realizada em leitor de
ELISA, utilizando-se o comprimento de onda de 530 nm. Como controle de
crescimento de cada fungo e toxicidade do solvente foram utilizados em um orifício
somente meio de cultura e o inóculo e em outro meio de cultura acrescido de DMSO,
respectivamente. A CIM foi considerada a menor concentração da substância onde
foi observada inibição total do crescimento fúngico. Cada teste foi realizado em
duplicata e o resultado médio foi expresso em mg/ml (SMANIA et al., 2005).
5.4.3. Efeito de extratos e da ulvana sobre o crescimento miceliano de
Colletotrichum lindemuthianum
Foi avaliado o efeito de extratos e da ulvana sobre o crescimento miceliano de
C. lindemuthianum. Para tal, os extratos e a ulvana em diferentes concentrações
(Tabela 5), previamente solubilizados em água destilada, foram diluídos em meio de
cultura BDA (na temperatura de 55ºC) e 15 ml foram distribuídos em cada placa de
Petri. Após a solidificação do meio, discos de 7 mm contendo micélio de uma cultura
fúngica em placa de Petri contendo BDA foram transferidos para o centro de cada
61
placa e incubadas em câmara de crescimento a 21º C com fotoperíodo de 12 horas.
O tratamento testemunha incluiu apenas meio BDA.
Os parâmetros avaliados foram medições do diâmetro das colônias (média de
duas medidas diametralmente opostas) a cada dois dias, durante 20 dias.
As medidas foram iniciadas 24 horas após a realização do experimento e
foram conduzidas até o momento em que as colônias fúngicas testemunhas
atingiram 2/3 da superfície do meio de cultura (após 20 dias de incubação). Foram
utilizadas seis repetições para cada tratamento e o delineamento foi inteiramente
casualizado. O resultado, analisado estatisticamente pelo teste de Tukey (p<0,05),
foi expresso em relação ao índice de velocidade de crescimento miceliano (IVCM) do
fungo em cada tratamento, calculado pela seguinte equação:
IVCM= Σ (D – Da)
N
Onde,
IVCM: Índice de velocidade de crescimento miceliano
D: Diâmetro médio atual
Da: Diâmetro médio anterior
N: número de dias de crescimento
Tabela 5. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e as respectivas concentrações utilizadas para o
teste de inibição do crescimento miceliano de Colletotrichum lindemuthianum.
Extratos Concentrações utilizadas (mg/ml)
Extrato metanólico 1 e 2
Extrato insolúvel em metanol 1 e 2
Extrato etanólico 10
a
Ulvana 0,1, 5 e 10
a
mg/ml de matéria seca.
62
5.4.4. Efeito de extratos e da ulvana sobre a germinação de conídios de
Colletotrichum lindemuthianum
Para a realização dos testes de germinação de conídios de C.
lindemuthianum, os conídios foram obtidos segundo a metodologia de Dalla Pria et
al. (2003). Vagens de feijão foram esterilizadas em autoclave a 121ºC durante 2
horas. Cada vagem, fixada em aproximadamente 3 ml de ágar batata dextrose, foi
inoculada com um disco de micélio fúngico de 6 mm de diâmetro, obtido a partir de
culturas fúngicas em meio BDA em placa de Petri e incubada durante 14-20 dias a
20ºC, com fotoperíodo de 12 horas em estufa B.O.D.
Após a incubação, as vagens foram transferidas para um becker e foram
homogeneizadas com água destilada esterilizada para a obtenção de uma
suspensão de conídios. Para o teste de germinação de conídios, as vagens foram
transferidas para um becker e os conídios coletados foram homogeneizados com
uma solução de dextrose a 4% (p/p).
A concentração de conídios por ml foi determinada através da contagem dos
conídios em 5 subcompartimentos do retículo central do hemacitômetro tipo
Neubauer. A média das cinco contagens foi obtida e aplicada na fórmula abaixo para
a obtenção da concentração total de esporos na solução.
• Número de esporos totais na solução = número médio de esporos no retículo central x 2,5x10
5
A concentração da suspensão de esporos foi ajustada em água destilada até
a obtenção da concentração de 1,2x10
4
conídios/ml, utilizando-se a fórmula: C
1
.V
1
=
C
2
.V
2.
A atividade antifúngica dos extratos foi avaliada microscopicamente através
da inibição da germinação dos conídios de C. lindemuthianum. Foram utilizadas
lâminas escavadas (26 x 76 mm) com 30 µl da suspensão de esporos (1,2x10
4
63
conídios/ml de solução de dextrose a 4%) e 30 µl de extrato. Foram utilizados os
extratos metanólicos, etanólico e a ulvana, conforme a Tabela 6. Como testemunha
foram utilizados 30 µl da suspensão de conídios e 30 µl de solução de dextrose a
4%. As lâminas foram incubadas em câmara úmida dentro de placas de Petri
vedadas com filme de polietileno, em temperatura de 20±1ºC e fotoperíodo de 12
horas. Os experimentos foram realizados em duplicata e os valores médios foram
comparados pelo teste de Tukey (p<0,05).
Tabela 6. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e as respectivas concentrações utilizadas para o
teste de inibição da germinação de conídios de Colletotrichum lindemuthianum.
Extratos Concentrações utilizadas (mg/ml)
Extrato metanólico 2
Extrato insolúvel em metanol 2
Extrato etanólico 10
a
Ulvana 0,1, 5 e 10
a
mg/ml de matéria seca.
A porcentagem de conídios germinados foi determinada 48 horas após o
início do experimento, através da adição de uma gota do corante azul de Aman para
paralisar a germinação. A avaliação foi realizada através da observação dos
conídios ao microscópio ótico com aumento de 400 vezes. Foram contados 200
conídios em cada repetição, totalizando-se a observação de 400 conídios por
tratamento. Foram considerados como conídios germinados aqueles que
apresentaram a emissão do tubo germinativo (BONALDO et al, 2004).
64
5.5. Testes in vivo
5.5.1. Sementes de feijão
As sementes certificadas de feijão comum (Phaseolus vulgaris) cultivar
Uirapuru, utilizadas nos testes in vivo, foram gentilmente fornecidas pelo Instituto
Agronômico do Paraná (IAPAR) de Palotina, Paraná.
As sementes de feijão desta cultivar foram utilizadas para o desenvolvimento
dos experimentos in vivo por serem suscetíveis a raça 73 do fungo C.
lindemuthianum, em experimentos anteriores (LOFFAGUEN; TALAMINI; STADNIK,
2005).
Em análises laboratoriais de germinação e sanidade, segundo Vechiato et al.
(2001), verificou-se que a germinação do lote usado era de 83% e as sementes
eram isentas de patógenos.
5.5.2. Cultivo das plantas
Plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) cultivar Uirapuru foram
cultivadas em vasos plásticos, contendo aproximadamente 3 kg de solo orgânico,
mantidas em casa-de-vegetação e irrigadas periodicamente, conforme as
necessidades hídricas da cultura.
5.5.3. Tratamento das plantas
Plantas com aproximadamente 24 dias de crescimento em casa-de-vegetação,
quando o primeiro trifólio apresentou-se totalmente expandido, foram pulverizadas
(tratadas) com os extratos: metanólico, extrato insolúvel em metanol, etanólico, com
diferentes concentrações de ulvana e de polissacarídeo B em 5 experimentos
distintos (Experimento I, II, III, IV e V), conforme descrito na Tabela 7. Como
65
testemunha, plantas foram pulverizadas somente com água. A aplicação dos
extratos, polissacarídeos e da água foi realizada em toda a parte aérea das plantas
com bomba pulverizadora manual até o ponto de escorrimento (aproximadamente 4
ml/planta).
Tabela 7. Extratos e ulvana obtidos de Ulva fasciata e polissacarídeo B obtido de Ulva sp. e as
respectivas concentrações utilizadas para avaliar o efeito sobre a antracnose em plantas de feijoeiro
comum (Phaseolus vulgaris).
Experimentos Extratos Concentrações utilizadas (mg/ml)
I
Extrato metanólico
Extrato insolúvel em metanol
2
2
II
III
Extrato etanólico
Polissacarídeo B
10
a
10
IV
Polissacarídeo B 0,1, 3 e 10
V
Ulvana 0,1, 1 e 10
a
mg/ml de matéria seca.
5.5.4. Inoculação do fungo
Após o tratamento das plantas com os extratos, polissacarídeos ou água,
quatro horas, três ou seis dias, conforme o delineamento experimental, com auxílio
de uma bomba pulverizadora manual, todas as partes aéreas das plantas foram
inoculadas com uma suspensão de conídios (1,2x10
5
ou 1,2x10
6
conídios/ml)
preparada conforme procedimento descrito no item 5.4.4, até o ponto de
escorrimento (aproximadamente 4 ml/planta).
Para testar o efeito local (ação direta) dos extratos e polissacarídeos contra o
fungo, as plantas foram inoculadas quatro horas após o tratamento das plantas
(tempo necessário para secagem completa do extrato na planta). Por outro lado,
para testar a ação residual e sistêmica dos extratos e polissacarídeos, as plantas
66
foram inoculadas três e seis dias após os tratamentos e tanto o primeiro trifólio
tratado quanto o segundo trifólio não tratado foram inoculados com o fungo.
Logo após as inoculações, as plantas permaneceram em câmara úmida, por
48 horas a 20±1ºC e com umidade relativa em torno de 98%, mantendo assim, as
condições necessárias para a germinação dos conídios do fungo e desenvolvimento
do processo infeccioso. Após o período em câmara úmida, as plantas
permaneceram novamente em casa-de-vegetação até o momento das avaliações da
severidade da doença.
5.5.5. Experimento I – Efeito do extrato metanólico e do extrato insolúvel
em metanol sobre a severidade da antracnose
Para este experimento, 12 plantas (quatro vasos com três plantas em cada)
foram pulverizadas com água como testemunhas, 12 plantas (quatro vasos com três
plantas em cada) foram pulverizadas com 2 mg/ml de extrato metanólico e 12
plantas (quatro vasos com três plantas em cada) com 2 mg/ml de extrato insolúvel
em metanol. Após 2 dias , as plantas foram pulverizadas novamente com o mesmo
tratamento e após 2 dias desse segundo tratamento, cada planta foi inoculada com
aproximadamente 4 ml de uma suspensão de conídios (1,2x10
5
conídios/ml).
5.5.6. Experimento II – Efeito do extrato etanólico sobre a severidade da
antracnose
Para a realização deste experimento, 36 plantas (12 vasos, escolhidos ao
acaso, contendo três plantas de feijão em cada, com o primeiro trifólio expandido)
foram tratadas com extrato etanólico na concentração de 10 mg de alga seca/ml de
água destilada, conforme procedimento descrito no item 5.5.3. Da mesma forma, 36
67
plantas (12 vasos contendo três plantas de feijão em cada) foram pulverizadas com
água destilada como testemunha.
Quatro horas após as pulverizações, com a finalidade de verificar efeito local
e direto do extrato sobre o fungo, foram escolhidos quatro vasos (ao acaso)
pulverizados com água, e quatro pulverizados com o extrato etanólico, e então,
inoculados com uma suspensão contendo 1,2x10
6
conídios/ml, previamente
preparada conforme descrito no item 5.4.4, de forma que cada planta recebesse
aproximadamente 4 ml do inóculo (ponto de escorrimento).
Três dias após as pulverizações, com a finalidade de verificar efeito sistêmico
do extrato sobre a antracnose, foram escolhidos ao acaso quatro vasos pulverizados
com água, e outros quatro pulverizados com o extrato etanólico. Estes oito vasos
foram inoculados com suspensão contendo 1,2x10
6
conídios/ml, até o ponto de
escorrimento.
Seis dias após as pulverizações, os quatro vasos restantes tratados com água
e os quatro vasos pulverizados com extrato foram inoculados com uma suspensão
de 1,2x10
6
conídios/ml.
5.5.7. Experimento III – Efeito do polissacarídeo B (PS B) sobre a
severidade da antracnose
O procedimento deste experimento é igual ao do experimento II, porém as
folhas foram tratadas com PS B na concentração de 10 mg/ml e não com extrato
etanólico e a concentração do inóculo foi de 1,2x10
5
conídios/ml.
68
5.5.8. Experimento IV – Efeito de diferentes concentrações do PS B
sobre a severidade da antracnose
Para este experimento, 12 plantas (quatro vasos com três plantas em cada)
foram pulverizadas com água como testemunhas, 12 plantas (quatro vasos com três
plantas em cada) foram pulverizadas com 0,1 mg/ml de PS B, 12 plantas (quatro
vasos com três plantas em cada) com 3 mg/ml de PS B e 12 plantas (quatro vasos
com três plantas em cada) com 10 mg/ml de PS B. Após três dias do tratamento,
todas as plantas foram inoculadas com aproximadamente 4 ml de uma suspensão
de conídios (1,2x10
5
conídios/ml).
5.5.9. Experimento V – Efeito da ulvana sobre a severidade da
antracnose
Doze plantas (quatro vasos com três plantas em cada) foram pulverizadas
com água como testemunhas, 12 plantas (quatro vasos com três plantas em cada)
foram pulverizadas com 0,1 mg/ml de ulvana, 12 plantas (quatro vasos com três
plantas em cada) com 1 mg/ml de ulvana e 12 plantas (quatro vasos com três
plantas em cada) com 10 mg/ml de ulvana. Assim como no experimento II, após 2
dias, as plantas foram pulverizadas novamente com os mesmos tratamentos e após
2 dias deste segundo tratamento, cada planta foi inoculada com aproximadamente 4
ml de uma suspensão de conídios (1,2x10
5
conídios/ml).
5.5.10. Avaliação da severidade da doença
Nos experimentos descritos acima, a severidade da antracnose nas plantas
foi avaliada da seguinte maneira: sete dias após a inoculação do fungo foi realizada
uma primeira avaliação e 14 dias após a inoculação foi realizada uma segunda
69
avaliação em cada folíolo da planta, utilizando uma escala descritiva de notas
proposta por Tamayo (1995), apresentada na Tabela 8. Exceto o experimento I, que
teve somente a primeira avaliação. Posteriormente, as notas foram transformadas
em porcentagem de área lesionada, fornecendo assim, a severidade de antracnose
de cada planta.
Tabela 8. Escala descritiva da severidade da antracnose do feijoeiro.
Nota Severidade de
Antracnose (%)
Descrição dos sintomas de antracnose
1 0 Ausência de sintomas visíveis da doença
3 1 Poucas lesões pequenas, geralmente nas nervuras da face inferior da
folha, aproximadamente 1% de área foliar atacada
5 5,5 Muitas lesões pequenas no pecíolo e nas nervuras primárias e
secundárias da face inferior da folha
7 10 Numerosas lesões grandes na face inferior da folha. Lesões necróticas
nas hastes e nos pecíolos. Nas nervuras, presença de lesões
medianas (mais de 2 mm de diâmetro). Sinais de esporulação. Lesões
em aproximadamente 10% das nervuras
9 25 Necrose em folhas, pecíolos, ramos e gema apical, cobrindo mais de
25% dos tecidos da planta. Morte dos tecidos. Presença abundante de
acérvulos esporulando
Fonte: TAMAYO, 1995.
5.5.11. Determinação do peso da matéria fresca e seca das plantas
Após a segunda avaliação, as plantas foram cortadas na base do caule rente
ao solo e toda a parte aérea foi pesada, obtendo-se assim o peso da matéria fresca.
Após isto, as plantas foram acondicionadas imediatamente em embalagens de
papel, onde permaneceram por 48 horas na estufa a 110ºC para a determinação do
peso da matéria seca.
70
5.6. Análise dos resultados
Os resultados foram analisados com auxílio do programa Statlets
para
determinação como paramétricos ou não-paramétricos. Os resultados foram
classificados como paramétricos e assim submetidos à Análise de Variância no
Programa Statlets
e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05) ou por
regressão linear no software Sisvar
, da Universidade Federal de Lavras.
71
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6. 1. Rendimento da macroalga coletada
O peso da matéria fresca, o peso da matéria seca e o rendimento das algas
obtidas em nove coletas, estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Peso da matéria fresca, da matéria seca e o rendimento das algas coletadas em três praias
da Ilha de Florianópolis/SC.
Local de coleta das algas Peso da matéria
fresca (g)
Peso da matéria
seca (g)
Rendimento (%) ±
Desvio Padrão
Praia Mole 4.083,3 318,3
7,8 ± 1,1
Praia da Daniela e Praia do Forte 3.745,3 344,8
10,6 ± 7,0
Praia da Armação 834,6 105,9
12,9 ± 1,5
As algas apresentaram em média 10,4% de matéria seca. As algas da Praia
Mole, coletadas durante o inverno, foram as que apresentaram a menor
porcentagem de matéria seca (7,8%), enquanto as algas coletadas na Praia da
Armação, durante o verão, apresentaram a maior porcentagem de matéria seca
(12,9%). Pádua; Fontoura e Mathias (2004) determinaram as porcentagens de fibras,
proteínas, lipídeos e carboidratos de amostras de U. fasciata coletadas em
dezembro e amostras coletadas em fevereiro no estado do Paraná. As algas
coletadas em fevereiro foram as que apresentaram as maiores porcentagens de
carboidratos e proteínas (aumento de 6%). U. lactuca, coletada também em
fevereiro, apresentou maior porcentagem de proteínas (aumento de 3%) do que
amostras de U. lactuca coletadas em outubro. Portanto, a maior porcentagem de
matéria seca das algas coletadas na Praia da Armação pode ser, então, devida a um
72
maior acúmulo de proteínas e/ou carboidratos durante os meses de verão ou pode
ser devido às condições ambientais diferentes (temperatura da água, quantidade de
nutrientes disponíveis, poluição, luminosidade).
6.2. Rendimento dos extratos de Ulva fasciata
A partir de 202,13 g da alga seca, foram obtidos 1,77 g de extrato metanólico
bruto pastoso, de coloração verde escura. O rendimento deste extrato em relação a
matéria seca foi de 0,88%.
Após o resfriamento do extrato metanólico, uma fração que era solúvel a
50ºC, permaneceu insolúvel no fundo do balão, originando o extrato insolúvel em
metanol (0,61 g); o qual foi utilizado tanto para testes in vitro quanto para testes in
vivo. O rendimento foi de 0,30% em relação ao peso de alga seca utilizada na
extração. O rendimento do extrato etanólico não foi determinado.
Após o procedimento descrito no item 5.2.3 (material e métodos), o
rendimento da ulvana de U. fasciata foi determinado por duas metodologias
diferentes: utilizando a alga fresca e alga seca moída. Utilizando-se a alga seca para
a obtenção do polissacarídeo, o rendimento foi de 37,3% ± 2,3. Por outro lado,
quando o polissacarídeo foi obtido a partir de alga fresca, o rendimento foi de 4,0% ±
0,3.
Cem gramas de alga fresca correspondem, em média, a 10 g de alga seca
(item 6.1). Então, o rendimento da ulvana foi de 4 g em 100 g de algas frescas (4%),
o equivalente a 4 g em10 g de algas secas (40%). Já, o rendimento da ulvana foi de
3,7 g em 10 g de algas secas (37%). Então, para a obtenção desse polissacarídeo,
como o rendimento é o mesmo, não é necessário o dispêndio de tempo e energia na
73
secagem e trituração das algas antes da extração. Porém, a extração deve ser
imediatamente após a coleta, pois as algas são perecíveis. Por outro lado, algas
secas e trituradas podem ser facilmente armazenadas.
Pengzhan e colaboradores (2003a) obtiveram ulvana de U. pertusa,
utilizando-se de 200 g de alga seca em 40 vezes o volume de água, autoclavando
por duas horas a 110ºC. O rendimento foi de 22,5 ± 0,8% de ulvana, após diálise do
polissacarídeo por 48 horas. Por outro lado, Ray e Lahaye (1995a) extraíram ulvana
de U. rigida seca, após duas extrações com solução de oxalato de sódio 0,05M em
banho-maria a 100ºC e o rendimento obtido foi de 20,54%.
Para comparar o rendimento da ulvana obtida de U. fasciata com o
rendimento da ulvana de U. pertusa, descrito por Pengzhan et al. (2003a), seria
necessário uma diálise de 48 horas, após a extração. Por outro lado, não é possível
comparar o rendimento da ulvana obtida de U. fasciata com o rendimento de ulvana
de U. rigida obtida por Ray e Lahaye (1995a) porque as extrações utilizam solventes
diferentes. Porém, a metodologia de extração de ulvana com oxalato de sódio
apresentou um menor rendimento, quando comparada às extrações com água em
autoclave, conforme os resultados obtidos e aqueles apresentados por Pengzhan et
al. (2003a).
6.3. Identificação química da ulvana
Os espectros de infra-vermelho do polissacarídeo obtido de U. fasciata
evidenciaram amplas bandas de absorção em 3353 cm
-1
atribuídas a grupo
hidroxilas, em 1643 cm
-1
e 1096 cm
-1
atribuídas ao estiramento da ligação C=O dos
ácidos urônicos e vibrações C-O-C de ligações glicosídicas. Três outras importantes
74
bandas foram visualizadas em 1230 cm
-1
, atribuídas ao estiramento das ligações C-
O-S, e em 835 e 788 cm
-1
, indicando a presença de substituições éster-sulfato.
O espectro de RNM-
1
H apresentou um perfil de polissacarídeo com sinais
localizados em δ 1,19 (H-6 da ramnose) e ressonância de H-1 da ramnose-3-sulfato
em δ 4,90. Já, no espectro de RNM-
13
C o polissacarídeo apresentou sinais em δ
175,0 e 18,4 facilmente reconhecidos como C-6 dos ácidos urônicos e C-6 da
ramnose, respectivamente. A comparação dos outros sinais obtidos com resultados
previamente descritos para polissacarídeos de Ulva sp. revelou que os sinais
predominantes foram de ácido-3-sulfato-ulvanobiurônico, demonstrando que as
estruturas básicas que se repetem no polissacarídeo são as mesmas estruturas
presentes em ulvanas, previamente descritas nos trabalhos de Lahaye (1998);
Lahaye et al. (1999); Pengzhan et al. (2003a).
Os componentes da ulvana não puderam ser quantificados devido a uma
dificuldade em realizar hidrólise ácida. Mas, segundo Lahaye (1998), ulvana extraída
a partir de U. rigida e degradada com uma preparação enzimática (ulvana-liase)
extraída de bactéria marinha, apresentou 26,9 mol% de ramnose, 21,5 mol% de
ácido urônico, 10,6 mol% de xilose e 36,7 mol% de íons sulfato. Por outro lado,
ulvana extraída de U. pertusa apresentou 13,7% de ramnose, 6,4% de xilose, 4,0%
de glicose e 23,2% de ácido urônico.
Monostroma latissimum, assim como o gênero Ulva pertence a divisão
Chorophyta e apresenta também polissacarídeo constituído de ramnose (67,9%),
ácido urônico (7,6%), xilose (8,3%) e glicose (11,9%) (LEE et al., 1998).
6.4. Testes in vitro
6.4.1. Avaliação da atividade antimicrobiana utilizando teste de difusão
75
Os resultados do teste de difusão em ágar estão apresentados na Tabela 10.
A ulvana de U. fasciata não foi ativa (ou seja, não inibiu o crescimento) frente as
bactérias testadas, nem contra a levedura C. albicans. Porém, os extratos
metanólico e insolúvel em metanol inibiram o crescimento de bactérias Gram-
negativas: P. aeruginosa, X. campestris e E. carotovora, não sendo ativos em
relação as estirpes Gram-positivas.
A bibliografia envolvendo testes de avaliação do potencial antibacteriano dos
extratos de algas, menciona que os processos de extração a quente e com álcoois
oferecem maiores vantagens na obtenção de substâncias bioativas (MAGALLANES;
CÓRDOVA; OROZCO, 2003).
Tabela 10. Efeito do extrato metanólico, extrato insolúvel em metanol e da ulvana obtidos de Ulva
fasciata no crescimento bactérias patogênicas para o homem, bactérias fitopatogênicas e levedura.
Microrganismos Extrato metanólico Extrato insolúvel em metanol Ulvana
Micrococcus luteus
-
a
- -
Staphylococcus aureus
- - -
Bacillus cereus
- - -
Pseudomonas aeruginosa
++ ++ -
Xanthomonas campestris
++ ++ -
Erwinia carotovora
++ + -
Candida albicans
- - -
a
(-) Não houve inibição do extrato sobre o crescimento bacteriano; (+) halo < 10 mm de inibição; (++)
halo de inibição de > 10 mm.
Extratos com atividade antibacteriana de U. rigida foram obtidos após
extração com diferentes solventes. Já, U. reticulata foi extraída com benzeno, éter e
tampão fosfato resultando em três extratos com atividade antibacteriana. O extrato
benzênico apresentou atividade frente a bactérias Gram-negativas: Aeromonas
hydrophila, V. alginolyticus, E. coli e V. parahaemolyticus e o extrato em éter etílico
também apresentou atividade frente a A. hydrophila, V. parahaemolyticus. O extrato
76
obtido com o tampão fosfato apresentou atividade frente a Azomonas sp., E. coli e V.
parahaemolyticus (VAIRAPPAN e SUZUKI, 2000).
Segundo Lima-Filho et al. (2002), o extrato em hexano de U. fasciata não
apresentou atividade antibacteriana frente a bactérias Gram-positivas: B. subtilis, S.
epidermidis, S. aureus e bactérias Gram-negativas: Citrobacter freundii, E. coli , E.
aerogenes, K. penumoniae, M. morganii, P. aeruginosa, Salmonella typhimurium e S.
enteritidis. Extrato etanólico (obtido com etanol a 80% a 20ºC) de U. nematoidea
também não apresentou atividade antibacteriana frente a S. aureus, P. aeruginosa,
A. hydrophila, Aeromonas sobria, Vibrio vulnificus, V. parahaemolyticus, E. faecalis e
E. coli (MAGALLANES;CÓRDOVA; OROZCO, 2003). Por outro lado, extrato em n-
butanol de U. lactuca inibiu o crescimento de V. parahaemolyticus (IMMANUEL et
al., 2004), extrato metanólico (algas secas moídas extraídas com metanol sob
agitação por 15 minutos) de U. rigida apresentou atividade antibacteriana contra S.
aureus e B. subtilis, porém não apresentou inibição de P. aeruginosa, S. marcescens
e Mycobacterium smegmatis (GONZÁLEZ DEL VAL et al., 2001).
U. fasciata e Hypnea musciformis secas foram extraídas com metanol-
diclorometano (1:1). O extrato de U. fasciata inibiu o crescimento de B. cereus, E.
coli, Micrococcus luteus, P. aeruginosa, V. alginolitycus, Vibrio harvey e A.
hydrophila em experimentos conduzidos a 20ºC e menores atividades foram
verificadas em experimento conduzidos a 30ºC. O extrato de Hypnea apresentou
atividade antibacteriana frente a M. luteus e P. aeruginosa a 20ºC. O menor
crescimento bacteriano a 20ºC pode ter sido a razão do aumento da atividade dos
extratos destas algas (SELVIN e LIPTON, 2004).
Segundo os dados da literatura, os extratos de espécies de Ulva que inibiram
o crescimento das bactérias, Gram-negativas ou Gram-positivas, foram extratos
77
brutos (metanólico, benzênico, em diclorometano, em éter, tampão fosfato), ou seja,
não foram extratos fracionados. Já, quando o extrato metanólico foi fracionado em
hexano, não apresentou nenhuma atividade antibacteriana (LIMA-FILHO et al.,
2002). Porém, não foram encontrados trabalhos relacionados à atividade
antibacteriana de substâncias isoladas de espécies de Ulva.
Estudos realizados na África do Sul, consideram que o grupo das algas
marrons e vermelhas são as que apresentam o maior número de espécies com
potencial antibacteriano (VLACHOS; CRITCHLEY; HOLY, 2000). Entretanto, os
resultados obtidos, que corroboram com trabalhos de outros autores
(MAGALLANES;CÓRDOVA, OROZCO, 2003; GONZÁLEZ DEL VAL et al., 2001),
confirmam a existência de macroalgas verdes produtoras de compostos
antibacterianos.
6.4.2. Avaliação da atividade antifúngica através da determinação da
concentração inibitória mínima
Os valores obtidos no teste de microdiluição do extrato metanólico, insolúvel
em metanol e da ulvana de U. fasciata contra C. lindemuthianum, T. mentagrophytes
e M. canis estão apresentados na Tabela 11.
Os extratos testados não inibiram o crescimento fúngico na maior
concentração testada (2 mg/ml). Apenas o extrato insolúvel em metanol inibiu o
crescimento de T. mentagrophytes na concentração de 2 mg/ml, que pode ser
comparada a outros extratos naturais com atividades antifúngicas (SMANIA et al.,
2005; SMANIA et al., 2003). Porém, uma substância chamada de swinhoeiamida A,
isolada da esponja marinha Theonella swinhoei, inibiu o crescimento fúngico em
concentrações expressivamente menores do que os extratos brutos. Esta substância
78
apresentou atividade antifúngica contra C. albicans e Aspergillus fumigatus em
concentrações mínimas inibitórias de 1,2 e 1,0 µg/ml, respectivamente (EDRADA et
al., 2002).
Tabela 11. Avaliação da atividade antifúngica do extrato metanólico, insolúvel em metanol e da
ulvana obtidos de Ulva fasciata, através da determinação da concentração inibitória mínima.
Microrganismos testados Extrato metanólico Extrato insolúvel em metanol Ulvana
Colletotrichum lindemuthianum
> 2
a
> 2 > 2
Trichophyton mentagrophytes
> 2 2 > 2
Microsporum canis
> 2 > 2 > 2
a
Média de duas repetições expressa em mg/ml.
Extrato metanólico de U. rigida não apresentou atividade contra A. fumigatus
e C. albicans (GONZÁLEZ DEL VAL et al., 2001). Da mesma forma, o extrato
metanólico de U. fasciata não teve atividade contra A. fresenii, A. japonicus e A.
niger (BHOSALE; JAGTAP; NAIK, 1999).
6.4.3. Avaliação do crescimento miceliano de Colletotrichum
lindemuthianum
Os resultados médios para o ensaio de inibição do crescimento miceliano
estão representados na Tabela 12 e Figura 4. Verificou-se que o extrato metanólico
na concentração de 1 e 2 mg/ml de meio de cultura conseguiu diminuir
significativamente o crescimento miceliano de C. lindemuthianum, quando
comparado à testemunha (p<0,05). O extrato insolúvel em metanol nas
concentrações de 1 e 2 mg/ml não interferiu no crescimento miceliano do fungo, pois
apresentou valores idênticos de IVCM à testemunha.
79
Tabela 12. Índice de velocidade de crescimento miceliano (IVCM) de Colletotrichum lindemuthianum
em meio ágar batata dextrose (BDA) contendo diferentes concentrações de extrato metanólico,
insolúvel em metanol, extrato etanólico e ulvana.
Extratos testados Concentrações
(mg/ml)
IVCM (mm/dia) Alteração do crescimento
miceliano (%)
a
Extrato metanólico 1 2,33 a
b
↓ 17,0,8
Extrato metanólico 2 1,24 b
↓ 55,87
Extrato insolúvel em metanol 1 2,80 c
↓ 0,01
Extrato insolúvel em metanol 2 2,81 c 0
Extrato etanólico
c
10 3,08 c
↑ 9,6
Ulvana 0,1 3,23 d e
↑ 14,95
Ulvana 5 3,42 e f
↑ 21,71
Ulvana 10 3,47 f
↑ 23,49
Testemunha (BDA) - 2,81 c -
a
Inibição (↓) do crescimento miceliano ou aumento (↑) do crescimento miceliano quando comparados
à testemunha.
b
Valores médios obtidos a partir de 6 repetições. Os valores seguidos pela mesma letra não diferem
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
c
mg/ml de matéria seca
1234
Figura 4. Efeito do (1) extrato metanólico (1 mg/ml), (2) extrato metanólico (2 mg/ml), (4) da ulvana
(10 mg/ml) de Ulva fasciata e (3) da testemunha (somente meio de cultura) sobre o crescimento
miceliano de Colletotrichum lindemuthianum após 20 dias de incubação.
80
Utilizando o extrato metanólico na concentração de 2 mg/ml de meio de
cultura, foi observado 55,8% de inibição do crescimento miceliano do fungo testado,
quando comparado à testemunha. Por outro lado, quando utilizou-se o
polissacarídeo ulvana na concentração de 10 mg/ml de meio de cultura, houve
23,49% de aumento do crescimento miceliano de C. lindemuthianum. O efeito do
estímulo do polissacarídeo sobre o fungo pode ser atribuído, possivelmente, aos
nutrientes presentes e disponíveis, principalmente carboidratos (predominantemente
a ramnose), na composição química deste polissacarídeo incorporado junto ao meio
BDA.
6.4.4. Teste de germinação de conídios
Os resultados médios para este ensaio in vitro estão representados na Tabela
13. Somente a ulvana na concentração de 0,1 mg/ml apresentou diferença
significativa (p<0,05) no teste de germinação de conídios, porém aumentou a
porcentagem de germinação dos conídios em 16,75% quando comparada com a
testemunha. Este fato pode ser explicado, assim como no teste de inibição do
crescimento miceliano do fungo, pela quantidade de carboidrato possivelmente na
forma assimilável, presente na composição química deste polissacarídeo.
Apenas 29,5% dos conídios germinaram no tratamento testemunha. Esta
porcentagem é menor do que aquela apresentada por outros autores. Por exemplo,
a germinação de Colletotrichum lagenarium no tratamento controle (água destilada)
foi de 92%, em trabalho realizado por Bonaldo et al. (2004).
O extrato metanólico na concentração de 2 mg/ml, apesar de reduzir o crescimento
miceliano não alterou significativamente (p<0,05) a germinação dos conídios de C.
lindemuthianum. No entanto, o extrato etanólico de U. fasciata reduziu, in vitro, a
81
germinação de esporos de Puccinia graminis, fungo causador da ferrugem em
plantas de trigo (STADNIK; EL-GUEDDARI; MOERSCHBACHER, 2005),
demonstrando um possível efeito direto do extrato etanólico contra este fungo.
Tabela 13. Germinação de conídios (%) de Colletotrichum lindemuthianum em presença de extrato
metanólico, insolúvel em metanol, extrato etanólico e ulvana obtidos de Ulva fasciata.
Extratos testados Concentrações (mg/ml) Conídios germinados (%)
a
Ulvana 0,1 46,25 d
b
Ulvana 1 28,75 a b
Ulvana 5 40,43 b c d
Ulvana 10 42,25 c d
Extrato metanólico 2 19,99 a
Extrato etanólico
c
10 32,75 a b c
Extrato insolúvel em metanol 2 28,70 a b
Testemunha
d
- 29,50 a b c
a
Média de 2 repetições com 2 contagens em cada uma.
b
Os valores seguidos pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
c
mg/ml de matéria seca.
d
Somente água destilada foi utilizada como testemunha.
6.5. Testes in vivo
6.5.1. Experimento I – Efeito de extratos metanólicos sobre a antracnose
Os resultados do efeito do extrato metanólico, do extrato insolúvel em
metanol, e das plantas testemunhas que foram tratadas apenas com água destilada
estão na Figura 5.
Ambos os extratos testados, quando aplicados por duas vezes (quatro e dois
dias) antes da inoculação, não conseguiram diminuir a severidade da doença, pois
não houve diferença significativa (p<0,05) em relação às plantas testemunhas;
apesar do extrato metanólico ter diminuído, in vitro, o crescimento miceliano do
fungo conforme descrito no item 6.4.3.
82
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
7 dias 14 dias
Severidade de antracnose (%)
Extrato metanólico
Extrato insolúvel em metanol
Água
Avaliações (dias após a inoculação)
a*
a
a
a
a
a
Figura 5. Efeito da aplicação foliar dos extratos metanólicos de Ulva fasciata na severidade da
antracnose em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a inoculação. Os tratamentos
foram realizados por duas vezes, quatro e dois dias antes da inoculação das plantas com
Colletotrichum lindemuthianum.
*Barras seguidas da mesma letra, no mesmo período de avaliação, não diferem estatisticamente
entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05).
Como a segunda avaliação foi realizada 14 dias após a inoculação do fungo e sete
dias após a primeira, seria esperado um aumento na porcentagem da severidade de
antracnose nas plantas, uma vez que o fungo se dissemina através de inóculo
secundário tornado disponível à medida que a colonização aumenta. No entanto,
este fato não foi verificado na Figura 5, pois quando a 2ª avaliação ocorreu, através
do modelo de avaliação proposto por Tamayo (1995), a maioria dos folíolos já se
encontravam necrosados e haviam se desprendido da planta, sendo que suas
respectivas porcentagens de severidade (que seria em torno de 25%) não foram
somadas. Desta forma, houve uma diminuição da porcentagem da severidade.
Essas observações levam a concluir que somente uma avaliação deve ser realizada,
conforme descrito no trabalho de indução de resistência em feijão de Bigirimana e
Höfte (2002), a qual foi realizada sete dias após a inoculação com o patógeno.
83
Quando uma segunda avaliação foi realizada, esta deve ser feita poucos dias após a
primeira ou deve-se atribuir nota máxima para os folíolos ausentes.
Após a segunda avaliação, a parte aérea das plantas foi cortada para a
determinação do peso da matéria fresca e da matéria seca. Os valores estão
descritos na Tabela 14.
Tabela 14. Peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com os
extratos metanólicos obtidos de Ulva fasciata, aplicados duas vezes, 4 e 2 dias antes da inoculação
do fungo Colletotrichum lindemuthianum.
Tratamento Concentração
testada (mg/ml)
Peso de matéria
fresca
a
Peso de matéria
seca
a
Extrato metanólico 2 22,84 a
b
2,36 a
Extrato insolúvel em metanol 2 22,68 a 2,40 a
Testemunha
c
- 20,60 a 1,98 a
a
Os valores de ambos os pesos são valores médios de 15 plantas (5 repetições ou seja, 5 vasos e
cada um contendo 3 plantas), expressos em g/planta.
b
Valores seguidos pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05), dentro do
mesmo peso.
c
As plantas testemunha (15 plantas) foram tratadas somente com água destilada.
Os valores do peso da matéria fresca e da matéria seca das plantas tratadas
com os extratos de U. fasciata e das plantas tratadas apenas com água destilada
(testemunhas) não diferiram estatisticamente. Portanto, o extrato metanólico e o
insolúvel em metanol não interferem no crescimento das plantas, quando
pulverizados sobre as superfícies foliares, além de não reduzirem a severidade da
antracnose, tal como observado na Figura 5.
Entretanto, apesar de não se detectar uma diferença significativa entre os
pesos de matérias frescas e pesos de matérias secas das plantas tratadas com os
84
extratos metanólicos e das plantas testemunhas, houve uma tendência para um
aumento dos pesos das plantas tratadas com os extratos. Yan (1999), Allen et al.
(2001), Zemke-White e Ohno (1999) têm relatado que extratos de algumas espécies
de algas tais como: Ascophyllum nodosum, Corallina piluliferra, Enteromorpha sp.,
Laurencia papillosa, Gracilaria spp., Lithothamnion corallioides, entre outras
promovem o crescimento das plantas tratadas.
6.5.2. Experimento II – Efeito do extrato etanólico sobre a antracnose
Os resultados do efeito do extrato etanólico sobre a antracnose em plantas de
feijão estão apresentados na Figura 6. Quando a inoculação com C. lindemuthianum
foi realizada quatro horas ou seis dias depois da aplicação do extrato etanólico, não
se observou redução da severidade da doença, que foi de 22,75 e 8,12%,
respectivamente, quando comparada às plantas testemunhas, onde a severidade foi
de 24,25 e 8,20%, respectivamente. Por outro lado, quando as plantas de feijão
foram inoculadas três dias após o tratamento com o extrato de U. fasciata, a
severidade da doença foi reduzida significativamente em 48,24%, quando
comparada às plantas testemunhas.
Embora a concentração de conídios fosse a mesma, plantas inoculadas
quatro horas após o tratamento com o extrato foram mais severamente atacadas por
C. lindemuthianum em comparação às plantas inoculadas três e seis dias após o
tratamento. Por outro lado, com base na Figura 6, não se pode descartar totalmente
o efeito direto do extrato etanólico sobre o fungo, pois a severidade da doença
(22,75 e 24,25% para as plantas tratadas com extrato e água, respectivamente) foi
muito elevada, onde quase todas as folhas das plantas já estavam praticamente
mortas. Este fato talvez possa ser explicado devido às condições ambientais mais
85
favoráveis ao desenvolvimento do fungo quando a inoculação foi realizada quatro
horas após o tratamento, uma vez que Campos et al. (2003) não observaram
variação da indução de resistência em plantas de feijão em diferentes estádios de
desenvolvimento das plantas.
0
5
10
15
20
25
30
4 horas 3 dias 6 dias
Inoculação (horas ou dias após o tratamento)
Severidade de antracnose (%)
Extrato etanólico
Água
aa
a
a
b
a
Figura 6. Efeito da aplicação foliar do extrato etanólico (10 mg de alga seca/ml) de Ulva fasciata na
severidade da antracnose em plantas de feijão comum inoculadas com Colletotrichum
lindemuthianum quatro horas, três e seis dias após o tratamento. A avaliação foi realizada sete dias
após a inoculação.
*Barras seguidas da mesma letra, no mesmo período de inoculação, não diferem estatisticamente
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Embora o extrato etanólico de U. fasciata apresente atividade direta (redução
significativa do crescimento miceliano), in vitro, contra C. lindemuthianum, conforme
relatado por Abreu (2005), nenhum efeito significativo foi observado quando as
plantas foram inoculadas quatro horas após o tratamento. Por outro lado, constatou-
se uma redução significativa da severidade de antracnose quando a inoculação do
patógeno ocorreu três dias após o tratamento. Esse efeito deve ser explicado por
uma fraca indução de resistência na planta por aproximadamente três dias, pois
quando o fungo foi inoculado seis dias após o tratamento esse efeito não foi mais
86
verificado e vale ressaltar que nestes dois períodos de inoculação as plantas
tratadas com o extrato apresentaram níveis semelhantes de severidade.
Portanto, sugere-se que o extrato etanólico de U. fasciata possa induzir
temporariamente resistência em plantas de feijoeiro contra C. lindemuthianum na
concentração testada não apresentando aparente efeito direto sobre o fungo. Para
que ocorra a resistência, provavelmente há necessidade de um intervalo de tempo
em torno de três dias entre o tratamento e a inoculação. Por outro lado, o extrato
etanólico de U. fasciata, em estudos realizados pelo Laboratório de Fitopatologia da
Universidade Federal de Santa Catarina, reduziu entre 80 e 45% o número de
colônias de oídio (Erysiphe polygoni) em folhas de feijoeiro comum tratadas quatro
horas antes da inoculação, quando comparadas ao controle (STADNIK e
ZEFERINO, 2004; LEONETTI et al., 2003). Estudos microscópicos têm sugerido que
o extrato etanólico afeta diretamente a germinação de uredósporos de Puccinia
graminis, fungo causador da ferrugem em plantas de trigo (Triticum aestivum)
(STADNIK; EL-GUEDDARI; MOERSCHBACHER, 2005).
Para analisar conclusivamente o envolvimento da indução de resistência na
redução da severidade da antracnose pelo extrato etanólico, torna-se necessário a
determinação da atividade de enzimas relacionadas à defesa das plantas contra
patógenos (CAMPOS et al., 2003). Pode-se quantificar também, compostos que
auxiliam na formação ou rigidez da parede celular (MOERSCHBACHER et al.,
1988), para avaliar se o extrato etanólico teve a capacidade de aumentar a síntese
de compostos de parede celular para a construção de uma parede mais rígida,
impedindo a penetração pelo fungo e, portanto, reduzindo a severidade da doença.
Também é necessário o conhecimento do mecanismo pelo qual o extrato propiciou a
diminuição da severidade, para que se possa maximizar o potencial.
87
6.5.3. Experimento III – Efeito do polissacarídeo B (PS B) sobre a
antracnose
Os resultados do efeito do PS B de Ulva sp. sobre a severidade da
antracnose na primeira e segunda avaliação estão apresentados na Figura 7.
0
2
4
6
8
10
12
14
Severidade de antracnose (%)
PS B
Água
a*
a
a
a
a
b
a
b
a
a
a
a
4 horas 6 dias
9 dias
4 horas
6 dias 9 dias
1ª avaliação ( 7 dias após a inoculação) 2ª avaliação (14 dias após a inoculação)
Figura 7. Efeito da pulverização de polissacarídeo B (10 mg/ml) obtido de Ulva sp. na severidade da
antracnose em plantas de feijão comum inoculadas com Colletotrichum lindemuthianum quatro horas,
três e seis dias após o tratamento, avaliado sete e 14 dias após a inoculação.
*Barras seguidas da mesma letra, no mesmo período de inoculação, não diferem estatisticamente
entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Neste experimento, as plantas tratadas com o PS B na concentração de 10
mg/ml apresentaram redução estatisticamente significante (p<0,05) na severidade
da antracnose, quando comparadas às testemunhas, no período de inoculação aos
seis dias, na primeira avaliação. Porém na segunda avaliação, apresentaram
redução significativa (p<0,05) quando inoculadas quatro horas após o tratamento
com PS B. Tais efeitos devem ser explicados pela indução de resistência na planta
após aplicação do polissacarídeo e, para isto ocorrer, provavelmente há
necessidade de um intervalo entre o tratamento e a inoculação de aproximadamente
seis a sete dias para a planta iniciar a seqüência de eventos importantes para o
88
estabelecimento da defesa. Em primeiro lugar, influxo de cálcio, aumento da
alcalinidade extracelular, seguido de produção de substâncias antimicrobianas,
síntese de ácido salicílico, lignificação da parede celular e por último a ativação de
sinais sistêmicos de defesa em partes da planta não tratada, como a ativação de
genes de PR-proteínas relacionadas à defesa (MEZIANE et al., 2005; CLUZET et al.,
2004; CAMPOS et al., 2003).
Assim como explicado no experimento I, na segunda avaliação a severidade
da doença foi menor que na primeira avaliação.
Após a segunda avaliação, a parte aérea das plantas foi cortada para a
determinação do peso de matéria seca e de matéria fresca sendo que os valores
estão apresentados na Tabela 15. Os valores do peso da matéria fresca e da
matéria seca das plantas tratadas com polissacarídeo B e as tratadas apenas com
água destilada não foram estatisticamente diferentes.
Tabela 15. Peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com
polisscarídeo B (10 mg/ml) de Ulva sp. quatro horas, três e seis dias antes da inoculação o fungo
Colletotrichum lindemuthianum.
Tratamento Peso de matéria fresca
a
Peso de matéria seca
a
Polissacarídeo B – 4 horas 17,40 a
b
2,54 a
Testemunha** – 4 horas 14,28 a 2,20 a
Polissacarídeo B – 3 dias ND ND
Testemunha** – 3 dias ND ND
Polissacarídeo B – 6 dias 11,96 a 2,40 a
Testemunha
c
– 6 dias 7,64 a 2,20 a
a
Os valores de ambos os pesos são valores médios de 12 plantas (4 repetições ou seja, 4 vasos e
cada um contendo 3 plantas), expressos em g/planta.
b
Barras seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05), dentro do
mesmo peso.
ND – Não determinado
c
As plantas testemunha (12 plantas) foram tratadas somente com água destilada.
89
6.5.4. Experimento IV – Efeito de diferentes concentrações de
polissacarídeo B sobre a antracnose
Os resultados do efeito de diferentes concentrações de PS B sobre a
antracnose nas plantas estão na Figura 8. As plantas testemunhas foram tratadas
apenas com água destilada. O tratamento foliar com PS B três dias antes da
inoculacão do fungo em nenhuma das três concentrações testadas reduziu
significativamente a severidade da antracnose das plantas tratadas, quando
comparadas às plantas testemunhas tratadas apenas com água, assim como
verificado no experimento anterior. Este fato pode ser devido ao alto desvio padrão
das repetições dentro de um mesmo tratamento.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
7 dias 14 dias
Severidade de antracnose (%)
0,1 mg/ml de PS B
3 mg/ml de PS B
10 mg/ml de PS B
Água
a*
a
a
a
a
a
a
a
Avaliações (dias após a inoculação)
Figura 8. Efeito do polissacarídeo B obtido de Ulva sp. nas concentrações de 0,1, 3 e 10 mg/ml na
severidade da antracnose em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a inoculação. Os
tratamentos foram realizados 3 dias antes da inoculação das plantas com Colletotrichum
lindemuthianum.
*Barras seguidas pela mesma letra, dentro da mesma avaliação, não diferem entre si pelo teste de
Tukey (p<0,05).
Os valores do peso da matéria fresca e da matéria seca das plantas tratadas
com polissacarídeo B e as tratadas apenas com água destilada não foram
estatisticamente diferentes (Tabela 16), assim como no experimento anterior.
90
Portanto, pode-se observar que o polissacarídeo B não interferiu no crescimento das
plantas em nenhuma das concentrações testadas.
Tabela 16. Peso da matéria fresca e da matéria seca da parte aérea das plantas tratadas com
polisscarídeo B de Ulva sp. em três concentrações diferentes 3 dias antes da inoculação do fungo
Colletotrichum lindemuthianum.
Tratamento Concentração
testada (mg/ml)
Peso de matéria
fresca
a
Peso de matéria
seca
a
Polissacarídeo B 0,1 19,24 a
b
3,56
a
Polissacarídeo B 3 21,46 a 3,70
a
Polissacarídeo B 10 20,04 a 3,74 a
Testemunha
c
- 19,24
a 3,68 a
a
Os valores de ambos os pesos são valores médios de 15 plantas (5 repetições ou seja, 5 vasos e
cada um contendo 3 plantas), expressos em g/planta.
b
Valores seguidos pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05), dentro do
mesmo peso.
c
As plantas testemunha (12 plantas) foram tratadas somente com água destilada.
6.5.5. Experimento V – Efeito da ulvana sobre a antracnose
Os resultados do efeito da pulverização foliar de ulvana em diferentes
concentrações estão na Figura 9. Tanto na primeira como na segunda avaliação, as
plantas de feijoeiro inoculadas com C. lindemuthianum quatro dias após o tratamento
com a ulvana (10 mg/ml) de U. fasciata, observou-se uma redução significativa
(p<0,05) na severidade da doença, em comparação às plantas testemunhas. Por
outro lado, quando as plantas foram inoculadas com 0,1 ou 1 mg/ml de ulvana não
se observou redução da severidade da doença. Portanto, sugere-se que ulvana de
U. fasciata pode induzir resistência em plantas de feijoeiro inoculadas com C.
lindemuthianum, dependendo da concentração utilizada. Provavelmente há uma
concentração mínima necessária para ativar os mecanismos de defesa das plantas.
91
Segundo Stadnik e Maraschin (2004), a indução de resistência é
caracterizada, entre outros fatores, pela necessidade de um intervalo de tempo entre
a exposição da planta ao indutor e a expressão da resistência, falta de relação entre
magnitude da resistência expressa e quantidade do indutor aplicado.
Embora seja conhecido que algas marrons e vermelhas dispõem de
polissacarídeos elicitores de defesas nas plantas, como por exemplo laminarana
extraída de Laminaria digitata e carragenanas extraídas de Eucheuma spinosa,
Gigartina acicularis e G. pistillata, o relato da presença de elicitores em algas verdes
é recente (CLUZET et al., 2004; ABREU, 2005).
y
1
= -0,2743x + 7,2112
R
2
= 0,6633**
y
2
= -0,2056x + 4,9155
R
2
= 0,7646**
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0246810
Concentração de ulvana (mg/ml)
Severidade de antracnose (%)
Linear (1ª Avaliação - 7 dias após a inoculação)
Linear (2ª Avaliação - 14 dias após a inoculação)
Figura 9. Efeito do tratamento foliar da ulvana (0,1, 1 e 10 mg/ml) obtida de Ulva fasciata na
severidade da antracnose em plantas de feijão comum, avaliado sete e 14 dias após a inoculação. Os
tratamentos foram realizados por duas vezes, quatro e dois dias antes da inoculação das plantas com
Colletotrichum lindemuthianum.
**Valores de R
2
são significativos (p<0,01).
Polissacarídeos obtidos de espécies de Ulva spp. (principalmente U.
armoricana) demonstraram atividade elicitora em uma outra leguminosa, Medicago
truncatula. Isto foi verificado quando as folhas foram pulverizadas com uma solução
de 0,5 mg/ml de polissacarídeo. Houve aumento, após dois dias do tratamento, na
92
expressão do gene PR10 e na expressão de diversos genes adicionais envolvidos
na defesa da planta, incluindo os genes relacionados com a biossíntese de
fitoalexinas, outros genes de PR proteínas e de proteínas de parede celular. Em
contraste, a expressão de genes relacionados com o metabolismo primário da planta
não foi alterado. Portanto, o tratamento prévio com polissacarídeos de Ulva protege
Medicago trunculata contra infecções de Colletotrichum triifolii pelo mecanismo de
indução de resistência (CLUZET et al., 2004).
Tratamentos com alguns microrganismos não patogênicos, como por exemplo
as rizobactérias Pseudomonas aeruginosa, P. putida, P. fluorescens e fungos como
Botrytis cinerea, B. allii (BIGIRIMANA e HÖFTE, 2002; MEZIANE et al., 2005;
SOYLU et al., 2002) e vários compostos abióticos também podem ser considerados
como potenciais indutores de respostas de defesa em plantas, como ácido 2,6-
dicloroisonicotínico (INA), ácido β-aminobutírico, ácido salicílico, entre outros
(BOYLE e WALTERS, 2005; SOYLU et al., 2002). No entanto, muitos destes
compostos podem apresentar fitotoxicidade e/ou causar a morte de células ou da
planta se usados em elevadas concentrações (BOYLE e WALTERS, 2005); ao
contrário da ulvana, que não apresentou nenhum sinal de toxicidez na maior
concentração testada (10 mg/ml) sobre as plantas.
Assim como nos experimentos anteriores, após a segunda avaliação, a parte
aérea das plantas foi destacada para a determinação do peso de matéria seca e
peso de matéria fresca e os valores estão descritos na Tabela 17.
Os valores do peso da matéria fresca e peso da matéria seca das plantas
tratadas com ulvana e das plantas tratadas apenas com água destilada
(testemunhas) não foram estatisticamente diferentes, assim como nos experimentos
anteriores. Portanto, pode-se concluir que a ulvana não interfere no crescimento das
93
plantas de feijão comum, quando pulverizada sobre a superfície foliar. Da mesma
forma, a aplicação foliar ou a aplicação no solo de sacarina (possível indutor de
resistência) em plantas de feijão (Vicia faba) não apresentou significante efeito no
peso da matéria fresca, da matéria seca ou na área foliar das plantas tratadas
(BOYLE e WALTERS, 2005)
Tabela 17. Valores de peso da matéria fresca e peso da matéria seca da parte aérea das plantas
tratadas com ulvana de Ulva fasciata em três concentrações diferentes, por duas vezes, 4 e 2 dias
antes da inoculação do fungo Colletotrichum lindemuthianum.
Tratamento Concentração
testada (mg/ml)
Peso de matéria
fresca
a
Peso de matéria
seca
a
Ulvana 0,1 24,22 a
b
2,92 a
Ulvana 1 24,48 a 2,98 a
Ulvana 10 24,70 a 2,88 a
Testemunha
c
- 23,76 a 3,14 a
a
Os valores de ambos os pesos são valores médios de 15 plantas (5 repetições ou seja, 5 vasos e
cada um contendo 3 plantas), expressos em g/planta.
b
Valores seguidos pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05), dentro do
mesmo peso.
c
As plantas testemunha (12 plantas) foram tratadas somente com água destilada.
94
7. CONCLUSÕES
- O polissacarídeo identificado é composto por unidades repetidas de ácido
ulvanobiurônico-3-sulfato, chamado de ulvana
- O extrato metanólico e insolúvel em metanol apresentaram inibição no crescimento de
Pseudomonas aeruginosa, Erwinia carotovora e Xanthomonas campestris
no teste de
difusão em ágar
- O extrato insolúvel em metanol apresentou concentração mínima inibitória de 2 mg/ml
contra
Trichophyton mentagrophytes
- O extrato metanólico (1 e 2 mg/ml) inibiu,
in vitro
, o crescimento miceliano de
Colletotrichum lindemuthianum
- Nenhum dos extratos testados inibiu,
in vitro
, a germinação dos conídios de
C.
lindemuthianum
nas concentrações testadas
- O extrato etanólico (10 mg de alga seca/ml) reduziu a severidade de antracnose,
quando aplicado 3 dias antes da inoculação do fungo
- Ulvana na concentração de 10 mg/ml (em duas aplicações consecutivas) apresentou
possível indução de resistência, quando aplicada quatro dias antes da inoculação do
fungo
- O extrato metanólico e insolúvel em metanol não apresentaram efeito
in vivo
, nos
modelos testados
- São necessárias dosagens de enzimas relacionadas à patogênese e análise de
expressão gênica para comprovar esta possível indução de resistência da ulvana contra
C. lindemuthianum
.
95
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