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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
SANDRA SATO
Avaliação in vivo dos efeitos de um dispositivo de liberação lenta
de metronidazol para tratamento de bolsas periodontais:
parâmetros clínicos e microbiológicos em um modelo animal
(Edição revisada)
Ribeirão Preto
2006
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SANDRA SATO
Avaliação in vivo dos efeitos de um dispositivo de liberação lenta
de metronidazol para tratamento de bolsas periodontais:
parâmetros clínicos e microbiológicos em um modelo animal
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
a obtenção do título de Doutora em Odontologia.
Área de concentração: Reabilitação Oral
Orientador: Prof. Dr. Vinícius Pedrazzi
Ribeirão Preto
2006
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,
PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Sato, Sandra
Avaliação in vivo dos efeitos de um
dispositivo de liberação
lenta de metronidazol para tratamento de bolsas periodontais:
parâmetros clínicos e microbiológicos em um modelo animal.
Ribeirão Preto, 2006.
155 f. : il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Odontologia
de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Reabilitação Oral.
Orientador: Pedrazzi, Vinícius.
1. Metronidazol. 2. Gel. 3. Periodontite. 4.
Dispositivo de
liberação lenta. 5. Hibridização DNA-DNA checkerboard.
FOLHA DE APROVAÇÃO
Sandra Sato
Avaliação in vivo dos efeitos de um dispositivo de liberação lenta de metronidazol para
tratamento de bolsas periodontais: parâmetros clínicos e microbiológicos em um modelo
animal
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para
obtenção do título de Doutora.
Área de Concentração: Reabilitação Oral
Aprovada em: 20/09/2006
Banca Examinadora
Prof. Dr. Vinícius Pedrazzi (Orientador)
Instituição: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP
Profa. Dra. Izabel Yoko Ito
Instituição: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP
Prof. Dr. Osvaldo de Freitas
Instituição: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP
Prof. Dr. João Neudenir Arioli Filho
Instituição: Faculdade de Odontologia de Araraquara - UNESP
Profa. Dra. Helena de Freitas Oliveira Paranhos
Instituição: Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP
Dedicatória
A toda minha família, meus pais, Jorge e Luzia, e meus irmãos Sonia e Nelson, pela
dedicação, compreensão e apoio ao longo de toda minha vida, em especial no período de
elaboração deste trabalho.
Agradecimentos especiais
Ao Prof. Dr. Vinícius Pedrazzi, meu orientador e principalmente meu grande amigo, e
Profa. Dra. Izabel Yoko Ito, ambos exemplos de simplicidade, humildade e humanidade.
Devo meu aprendizado e evolução na pós-graduação e especialmente na vida a essas duas
pessoas.
MUITO OBRIGADA!
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado forças para vencer mais essa jornada.
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto - USP, na pessoa da diretora Profa. Dra.
Marisa Semprini.
À Comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP,
representada pela presidente Profa. Dra. Léa Assed Bezerra da Silva.
Ao Prof. Dr. Ricardo Faria Ribeiro, chefe anterior, e ao Prof. Dr. Osvaldo Luiz Bezzon,
atual chefe Departamento de Materiais Dentários e Prótese da Faculdade de Odontologia de
Ribeirão Preto – USP, por possibilitar o uso da estrutura do departamento para o
desenvolvimento do trabalho.
À Profa. Dra. Maria da Glória Chiarello de Mattos, coordenadora anterior, e Prof. Dr.
Osvaldo Luiz Bezzon, atual coordenador do Curso de Pós-Graduação na Área de Reabilitação
Oral da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP, pelo apoio para a realização
deste trabalho.
À Profa. Dra. Helena de Freitas Oliveira Paranhos, do Departamento de Materiais
Dentários e Prótese da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP, pelo
acompanhamento deste trabalho por meio dos relatórios semestrais analisados e pareceres
emitidos.
Aos Profs. Drs. Heitor Panzeri e Elza Helena Guimarães Lara, que inicialmente nos
sugeriram seguir esta linha de pesquisa, a de liberação programada de fármacos.
À Profa. Dra. Maria José Vieira Fonseca, do Departamento de Ciências Farmacêuticas
da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP, pelas sugestões valiosas
para a realização do trabalho.
Ao farmacêutico José Orestes Del Ciampo, técnico da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP, pela amizade, disponibilidade e principalmente pela
preparação do gel experimental testado neste trabalho.
Ao químico José Roberto Jabor, técnico da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de
Ribeirão Preto – USP, pela amizade, paciência e dedicação na realização de todas as análises
cromatográficas.
Ao Doutorando da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP,
Evandro Watanabe, pela amizade e especialmente pela colaboração imprescindível na
realização da parte microbiológica deste trabalho.
À médica veterinária, Dra. Caroline Floreoto Baldo Garcia Pereira, que acompanhou
toda a parte experimental realizada nos cães, com especial cuidado com o bem-estar dos
animais.
Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação, Isabel Cristina Galino Sola e Regiane
Cristina Moi Sacilotto, pela cordialidade e presteza com que sempre me atenderam.
À funcionária Regiane de Cássia Tirado Damasceno, secretária do Departamento de
Materiais Dentários e Prótese da Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto – USP, pelas
informações e pela atenção dispensadas.
A todos os docentes, funcionários e colegas de pós-graduação do Departamento de
Materiais Dentários e Prótese, pela amizade e pela agradável convivência no decorrer do
Doutorado.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro
fundamental para a realização deste trabalho (Processo Nº 04/09545-0).
Às empresas Basf S.A., Formil Química Ltda. e Dentsply Maillefer do Brasil, que
gentilmente forneceram material para o desenvolvimento desta pesquisa.
A todos aqueles que contribuíram de maneira direta ou indireta na realização deste
trabalho.
MUITO OBRIGADA A TODOS!
RESUMO
SATO, S. Avaliação in vivo dos efeitos de um dispositivo de liberação lenta de
metronidazol para tratamento de bolsas periodontais: parâmetros clínicos e
microbiológicos em um modelo animal. 2006. 155 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Dispositivos de liberação lenta destinados à liberação local de fármacos apresentam muitas
vantagens em relação à terapia periodontal convencional. Um dispositivo de liberação lenta,
sob a forma de um gel contendo 15% de metronidazol foi testado in vivo em um modelo
animal (cão) para se verificar seus efeitos em relação a parâmetros clínicos e microbiológicos.
Seis cães foram utilizados neste estudo e somente sítios com profundidade de sondagem ≥ 4
mm foram selecionados para tratamento. Cada cão recebeu quatro tratamentos em um
desenho experimental do tipo split-mouth. Os grupos de tratamento foram: 1) raspagem e
alisamento radicular + gel de metronidazol a 15% - RAR+Gel (grupo experimental); 2)
raspagem e alisamento radicular somente - RAR (controle positivo), 3) gel de metronidazol a
15% (experimental) e 4) nenhum tratamento – NT (controle negativo). A presença de
metronidazol no fluido crevicular gengival foi monitorada pela cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) e os parâmetros clínicos (profundidade de sondagem – PS, nível de
inserção relativo – NIR e sangramento à sondagem – SS) e microbiológicos foram registrados
no baseline, 7, 30 e 90 dias após as terapias. A técnica microbiológica utilizada neste estudo
foi a hibridização DNA-DNA checkerboard. Os resultados demonstraram que o metronidazol
podia ser detectado por até 48 horas após a aplicação do gel no interior das bolsas
periodontais, e em níveis bastante baixos. Os parâmetros clínicos e microbiológicos não
puderam demonstrar diferenças entre os quatro grupos de tratamento. PS e NIR tiveram uma
redução significante no período de 90 dias de duração deste estudo. Algumas bactérias
analisadas neste estudo demonstraram diferenças significantes nas prevalências ao longo do
tempo, nos grupos de tratamento que receberam o gel de metronidazol (RAR+Gel e Gel).
Somente o SS não demonstrou diferenças em função do tempo. A absorção sistêmica do
fármaco foi detectada pela análise do plasma. Nas condições experimentais adotadas neste
estudo, não ficou demonstrado que o gel isoladamente ou combinado com a RAR era
diferente dos controles RAR e NT.
Palavras-chave: Metronidazol. Gel. Periodontite. Dispositivo de liberação lenta. Hibridização
DNA-DNA checkerboard.
ABSTRACT
SATO, S. In vivo evaluation of the effects of a metronidazole slow release device for the
treatment of periodontal pockets: clinical and microbiological parameters in an animal
model. 2006. 155 p. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Slow release devices designed for local drug delivery have many advantages over the
conventional periodontal therapy. A slow release device, in a gel form, containing 15%
metronidazole was tested in vivo in an animal model (dog) for its effects in relation to clinical and
microbiological parameters. Six dogs were used in this study, and only sites with probing depth ≥
4 mm were selected for treatment. Each dog received four treatments in a split-mouth design. The
treatment groups were: 1) scaling and root planning + 15% metronidazole gel -SRP+Gel
(experimental group); 2) scaling and root planning only – SRP (positive control), 3) 15%
metronidazole gel - Gel (experimental) and 4) no treatment – NT (negative control). The presence
of metronidazole in the gingival crevicular fluid was monitored by high performance liquid
chromatography (HPLC) and clinical (probing depth –PD, relative attachment level – RAL and
bleeding on probing – BOP) and microbiological parameters were recorded at baseline, 7, 30 and
90 days post-therapies. The microbiological technique used in this study was the checkerboard
DNA-DNA hybridization. The results demonstrated that the metronidazole could be detected up
to 48 hours after the application of the gel into the periodontal pockets and at very low levels. All
the clinical and microbiological parameters could not demonstrate any differences among the four
treatment groups. PD and RAL reduced significantly in all treatment groups over the 90 day
period of the study. Some of the bacteria analyzed in this study demonstrated significant
differences in prevalence over time in the groups that received the metronidazole gel (SRP+Gel
and Gel). Only BOP did not show differences over time. Systemic absorption of the drug was
detected in plasma samples. In the experimental conditions adopted in this study, it could not be
demonstrated that the gel alone or combined with SRP is different from the controls SRP and NT.
Keywords: Metronidazole. Gel. Periodontitis. Slow release device. Checkerboard DNA-DNA
hybridization.
SUMÁRIO
p.
1. INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 12
2. REVISTA DA LITERATURA...................................................................................... 16
3. PROPOSIÇÃO ............................................................................................................... 37
4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................... 39
4.1 PREPARO DO GEL....................................................................................................... 40
4.2 PROCEDIMENTOS NOS ANIMAIS ........................................................................... 41
4.3 PARÂMETROS AVALIADOS..................................................................................... 44
4.3.1 Parâmetros clínicos indicadores de doença periodontal........................................ 44
4.3.2 Parâmetros microbiológicos ..................................................................................... 45
4.4 MONITORAMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE METRONIDAZOL NO
FLUIDO CREVICULAR GENGIVAL (FCG) PELA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)........................................................................................ 51
4.4.1 Colheita e determinação do volume de FCG dos sítios que receberam o gel de
metronidazol ....................................................................................................................... 51
4.4.2 Processamento das tiras de papel absorvente para a extração do metronidazol. 55
4.4.3 Condições cromatográficas....................................................................................... 56
4.4.4 Validação da metodologia analítica para a dosagem do metronidazol pela
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)............................................................. 58
4.4.4.1 Linearidade do método ............................................................................................. 58
4.4.4.2 Precisão e exatidão ................................................................................................... 59
4.4.4.3 Sensibilidade do método: limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)....... 59
4.4.4.4 Seletividade ou especificidade.......................................................................................... 60
4.5 DETECÇÃO E DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE METRONIDAZOL
PELA CLAE EM AMOSTRAS DE PLASMA SANGÜÍNEO................................................. 61
4.6 TESTE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO GEL DE METRONIDAZOL........ 62
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................... 62
5. RESULTADOS............................................................................................................... 64
5.1 PARÂMETROS CLÍNICOS.......................................................................................... 65
5.2 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS....................................................................... 70
5.3 DOSAGEM DO METRONIDAZOL NAS AMOSTRAS DE FCG POR CLAE PARA
AVALIAÇÃO DA PERSISTÊNCIA DO GEL NAS BOLSAS PERIODONTAIS .........77
5.4 RESULTADOS DO PROCESSAMENTO DAS TIRAS DE PAPEL ABSORVENTE
PARA A EXTRAÇÃO DO METRONIDAZOL ........................................................... 78
5.5 VALIDAÇÃO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO (CLAE) PARA A DOSAGEM
DO METRONIDAZOL ................................................................................................. 79
5.5.1 Linearidade do método ............................................................................................. 80
5.5.2 Precisão e exatidão .................................................................................................... 82
5.5.3 Sensibilidade do método - limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)........... 82
5.5.4 Seletividade ou especificidade .................................................................................. 82
5.6 DOSAGEM DO METRONIDAZOL NO PLASMA SANGÜÍNEO ............................ 83
5.7 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO GEL DE METRONIDAZOL ....................... 83
6. DISCUSSÃO................................................................................................................... 85
7. CONCLUSÕES..............................................................................................................107
REFERÊNCIAS ................................................................................................................109
APÊNDICES......................................................................................................................121
APÊNDICE A .....................................................................................................................122
APÊNDICE B......................................................................................................................126
APÊNDICE C......................................................................................................................129
ANEXO...............................................................................................................................154
ANEXO A ...........................................................................................................................155
1 Introdução
_____________________________________________________________________________ Introdução
13
1
INTRODUÇÃO
As periodontites são o resultado de uma infecção bacteriana local, provocada por uma
microbiota patogênica, organizada sob a forma de um biofilme subgengival, que se forma em
sulcos gengivais de profundidade aumentada, as bolsas periodontais.
Sendo a etiologia dessas doenças de origem bacteriana, a terapia periodontal tem como
finalidade principal combater essa infecção. O tratamento padrão para tais doenças consiste na
remoção mecânica, pelo profissional, do biofilme e cálculo supra e subgengival por meio do
procedimento de raspagem e alisamento radicular (RAR). Em bolsas mais profundas,
entretanto, existe uma maior dificuldade em se realizar a raspagem de maneira completa e
eficiente. Nesses casos, pode-se lançar mão de técnicas cirúrgicas para o tratamento dessas
bolsas periodontais remanescentes, ou ainda de antibióticos, especialmente para debelar
infecções periodontais mais severas (MAGNUSSON et al., 1984).
Vários antibióticos foram testados e utilizados como tratamento independente da
terapêutica mecânica, ou como auxiliares dela no tratamento das periodontites, entre elas a
tetraciclina, o metronidazol, a doxiciclina e a minociclina.
O metronidazol foi desenvolvido na França em 1957, para o tratamento de infecções
provocadas por protozoários. Em 1962, foi relatada a utilidade do seu uso na Odontologia ao
promover a cura da gengivite ulcerativa aguda quando utilizada para o tratamento de
infecções causadas pela Trichomonas vaginalis (LEKOVIC et al., 1983). Seu espectro de ação
envolve bactérias anaeróbias, principalmente as Gram-negativas, que normalmente estão
presentes em pacientes com periodontite.
_____________________________________________________________________________ Introdução
14
Os antibióticos em Periodontia podem ser de ação sistêmica ou aplicados de maneira
local apenas nos sítios doentes.
Ao instituir uma antibioticoterapia por via sistêmica a um paciente com periodontite,
podem ocorrer alguns efeitos adversos, tais como náuseas, vômitos, diarréias, dores
abdominais, vertigem, dores de cabeça, gosto metálico ou mesmo manchamento dos dentes
(LEVIN-GOLDSTEIN, 1992), além da possibilidade de surgir microrganismos resistentes
quando os antibióticos são utilizados por longos períodos de tempo.
Em contraste com a terapia sistêmica de antibióticos, a administração de agentes
antimicrobianos diretamente na bolsa periodontal tem as seguintes vantagens:
• liberação de antimicrobianos em concentrações altas e sustentadas por longos períodos
de tempo;
• mínimo risco de desenvolvimento de resistência;
• não é necessária a cooperação do paciente quando o fármaco é aplicado pelo
profissional;
• risco insignificante de superinfecções extra-orais;
• nenhuma reação gastrintestinal adversa.
Algumas limitações da terapia local:
• incapacidade de afetar os patógenos periodontais residentes no tecido gengival ou
outros sítios na cavidade bucal;
• dificuldade em atingir a base de bolsas periodontais ou lesões de furca profundas;
• alto custo da terapia para alguns dos dispositivos de liberação lenta.
A aplicação local de agentes farmacológicos deve suprir alguns critérios básicos, tais
como: 1) a medicação deve atingir o sítio-alvo, 2) devendo permanecer em concentração
adequada no sítio doente por um período de tempo suficiente para a sua ação (GOODSON,
1989).
_____________________________________________________________________________ Introdução
15
Outro aspecto desejável diz respeito à capacidade de adesão desses sistemas de
liberação lenta, característica que permite uma manutenção por maior tempo do dispositivo no
sítio de ação. Foi demonstrado que alguns polímeros adesivos, tais como o Carbopol 934
®
e a
hidroxipropil metilcelulose, são adequados para o uso em preparações destinadas à cavidade
bucal (PEDRAZZI, 1999), devido à sua habilidade em aderir aos tecidos mucosos, nas
condições locais, e liberar o princípio ativo.
Os dispositivos para liberação local de fármacos em bolsas periodontais têm sido
intensamente pesquisados nos últimos anos (ARONNA et al., 1998; AWARTANI,
ZULQARNAIN, 1998; ESPOSITO et al., 1996; HITZIG et al., 1997; JANSSON;
BRATTHALL; SODERHOLM, 2003; JANSSON et al., 2004; JONES et al., 1997; KELLY
et al, 2004; KIM et al., 2004; KINANE, RADVAR, 1999; MAGNUSSON, 1998). Têm como
objetivo manter concentrações efetivas de um agente terapêutico no local de aplicação por
longos períodos. São divididos em duas classes, de acordo com a duração da liberação:
dispositivos de liberação sustentada, que promovem liberação por menos do que 24 horas e os
sistemas de liberação controlada, que devem ter uma duração que exceda um dia
(AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, 2000).
2 Revista da Literatura
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
17
2 REVISTA DA LITERATURA
Addy et al. (1982) desenvolveram tiras de polietilmetacrilato para a liberação de agentes
antimicrobianos e compararam o padrão de liberação in vitro com tubos de diálise. Os agentes
testados foram: o acetato de clorexidina nas concentrações de 10 a 50%, o metronidazol a
40% e a tetraciclina a 40%. A quantidade do agente liberado foi medida por
espectrofotometria. As tiras também foram testadas in vivo em voluntários portadores de
periodontite avançada, demonstrando liberação mais lenta do que os tubos de diálise, com boa
aceitabilidade por parte dos pacientes.
Yeung, Newman e Addy (1983) compararam o uso de tiras de resina acrílica com
metronidazol a 40% com irrigações subgengivais de clorexidina a 0,2%. Foram avaliados os
índices de placa, sangramento à sondagem, profundidade de bolsa e retração gengival. Não
foram encontradas diferenças significantes entre os grupos, concluindo-se que os regimes
foram igualmente eficazes em melhorar a saúde periodontal em um período de três meses.
Addy e Langeroudi (1984) observaram, por meio da microscopia de campo escuro, os
efeitos na microbiota subgengival que decorriam do uso de tiras de acrílico contendo 40% de
um fármaco, podendo este ser a clorexidina, o metronidazol ou a tetraciclina, todos testados
na mesma concentração. As tiras foram deixadas por dois a três dias dentro de bolsas com
mais de 6 mm de profundidade. Os três fármacos produziram efeitos similares, com aumento
na proporção de cocos e redução na de microrganismos móveis, sendo que o metronidazol foi
mais eficaz que a tetraciclina e a clorexidina na redução de espiroquetas.
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
18
Addy, Alam e Rawle (1984) avaliaram as mudanças na microbiota que ocorreram com o
uso de tiras acrílicas contendo metronidazol a 40% colocadas em bolsas periodontais. Os
métodos bacteriológicos utilizados foram a microscopia de campo escuro, coloração de Gram,
câmara de contagem, diluição serial e cultura. Após o tratamento, as mudanças observadas
foram: o aumento na percentagem de cocos e diminuição de outras formas; o aumento de
cocos Gram-positivos e a diminuição de bacilos Gram-negativos; a diminuição maior que
80% na contagem total de microrganismos; e a diminuição maior que 75% para o total de
microrganismos cultiváveis. Concluíram que as mudanças ocorridas na microbiota após o uso
de um tratamento antimicrobiano local podem ser evidenciadas pelo uso de técnicas
microbiológicas simples.
Golomb et al. (1984) desenvolveram um filme de etilcelulose adicionado ou não de
polietilenoglicol, contendo metronidazol a 10%, para inserção em bolsas periodontais e
examinaram o perfil de liberação in vitro e in vivo. A liberação do fármaco foi avaliada por
meio de um espectrofotômetro de luz ultravioleta e a atividade microbiológica foi baseada em
um microrganismo indicador (Bacteroides fragilis). O estudo demonstrou que o filme de
etilcelulose contendo metronidazol foi capaz de uma liberação prolongada do fármaco na
bolsa periodontal por três dias.
Newman et al. (1984) observaram o efeito do metronidazol, aplicado em bolsas
periodontais, de duas formas: sob a forma de uma solução a 0,5% em finos tubos de diálise e
na forma de pó incorporado à resina acrílica a 40%. Foi notado que as tiras de resina
liberaram o medicamento por 14 dias e os tubos de diálise por 24 horas. Concluíram que o uso
local de metronidazol, mesmo na forma de 0,5% nos tubos de diálise, tinha um papel positivo
no controle da periodontite crônica.
Wan Yusof et al. (1984) compararam o uso de tubos de diálise, contendo em seu interior
uma solução de metronidazol a 0,5%, trocados semanalmente, durante três semanas seguidas,
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
19
com irrigações subgengivais com uma solução de clorexidina a 0,2% realizadas diariamente
pelo próprio paciente. Ambos os tratamentos foram mantidos por 28 dias. Foi observado que,
tanto as irrigações com a clorexidina, quanto os tubos de diálise contendo metronidazol,
foram igualmente eficientes em promover uma melhora nos parâmetros clínicos da
periodontite por pelo menos 8 semanas após o término do período de aplicação das terapias.
Addy, Langeroudi e Hassan (1985) descreveram o uso de tiras de acrílico para serem
usadas como carreadores de agentes antimicrobianos para o interior de bolsas periodontais.
Foram testados a tetraciclina, a clorexidina e o metronidazol em um estudo clínico, e
verificou-se que com os três fármacos foi obtida uma alteração marcante da microbiota
subgengival. O mais notável efeito, quando observado pela microscopia de campo escuro, foi
a redução dos microrganismos móveis e um aumento correspondente dos cocos.
Addy et al. (1988) avaliaram a liberação de clorexidina, metronidazol e tetraciclina, em
bolsas periodontais, DE um dispositivo de resina acrílica, comparando os resultados desses
antimicrobianos com a raspagem e alisamento radicular, por um período de três meses.
Melhoras significativas ocorreram em vários parâmetros clínicos avaliados, tanto para a
terapia medicamentosa quanto para a raspagem e alisamento radicular, apesar da magnitude e
da duração terem sido maiores com os grupos do metronidazol e da raspagem e alisamento
radicular.
Needleman e Watts (1989) testaram o uso de um gel de metronidazol a 1% em áreas de
furca, após a terapia periodontal de manutenção. Dez pacientes com envolvimento de furca
classe II ou III foram selecionados para o estudo. Mediu-se o sangramento à sondagem e o
volume do fluido crevicular gengival, além do biofilme ter sido avaliado por microscopia de
campo escuro. Após a terapia de manutenção desses sítios, uma seringa foi usada para aplicar
o gel de metronidazol (grupo experimental) ou um gel placebo (grupo controle) nas regiões de
furca. Após 1 e 3 meses, os sítios foram reexaminados, concluindo-se que o grupo
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
20
experimental não diferiu de maneira significante do controle, em um nível de significância de
5%.
Linden e Newman (1991) compararam os efeitos de irrigações subgengivais com uma
solução contendo 0,5% de metronidazol com irrigações com uma solução placebo, realizadas
diariamente pelos próprios pacientes durante 28 dias. Os dois grupos foram monitorados por
um período total de três meses. Foi observada uma melhora na profundidade de sondagem,
índice de placa e índice de sangramento gengival em ambos os grupos em relação ao tempo,
com proporcionalmente mais sítios demonstrando melhora no grupo que irrigou com a
solução contendo metronidazol, mas sem diferença significante em relação ao grupo placebo.
Ainamo et al. (1992) compararam um gel de metronidazol a 25% com a raspagem e
alisamento radicular em um estudo que envolveu vários centros, com um total de 206
pacientes. Houve uma diferença estatisticamente significante, mas sem importância clínica.
Klinge et al. (1992a) analisaram os efeitos de uma terapia com uma pasta de
metronidazol a 10%, aplicada em bolsas periodontais de cães com periodontite induzida
experimentalmente. A doença periodontal foi induzida por meio de elásticos ortodônticos
colocados na altura do colo dos dentes, e mantidos por um período de 4 semanas. A pasta de
metronidazol foi aplicada no interior das bolsas periodontais por meio de uma seringa e uma
cânula romba em três dentes inferiores, enquanto que uma pasta placebo foi aplicada em três
dentes do lado esquerdo. As pastas foram aplicadas duas vezes por dia durante 4 semanas. Os
parâmetros observados foram clínicos e microbiológicos, com dados coletados no início do
estudo e após 7, 14, 21 e 28 dias. Os resultados desse estudo demonstraram uma melhora
significante nos parâmetros clínicos do lado tratado com a pasta contendo metronidazol, em
comparação com a pasta placebo, e que houve a eliminação de alguns dos microrganismos
associados com a doença periodontal.
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
21
Klinge et al. (1992b) compararam a eficácia clínica da raspagem e alisamento radicular
com três diferentes preparações/freqüências de metronidazol tópico em pacientes com
periodontite: a) gel de metronidazol 25% uma vez por semana por duas semanas; b)
metronidazol 15% uma vez por semana por duas semanas; c) metronidazol 15% duas vezes
por semana por duas semanas. Os parâmetros adotados foram profundidade e sangramento à
sondagem. Todos os três tratamentos antibióticos reduziram os sintomas da periodontite e
tiveram resultados similares aos encontrados após a raspagem subgengival. Das três
aplicações, a que pareceu mais promissora como terapia com antimicrobianos foi o gel de
metronidazol a 25% uma vez por semana, por duas semanas.
Pedrazzoli, Kilian e Karring (1992) compararam os efeitos clínicos e microbiológicos
da aplicação tópica de um gel de metronidazol a 25% com uma sessão de raspagem
subgengival no tratamento de periodontite em adultos. Ambos os tratamentos foram eficazes
em reduzir a profundidade das bolsas e o sangramento à sondagem. O metronidazol mostrou
tendência a ser ligeiramente superior à raspagem durante o período de estudo. O uso tópico do
gel de metronidazol a 25% pareceu ser tão eficaz quanto a terapia mecânica convencional no
tratamento da periodontite.
Stoltze (1992) monitorou a concentração de metronidazol no fluido crevicular gengival
de 12 pacientes após a aplicação de um gel a 25% por meio de cromatografia. Concluiu que as
concentrações de metronidazol nas bolsas estavam geralmente acima da concentração
inibitória mínima (CIM
50
) para os microrganismos susceptíveis, por 24 horas após uma
aplicação do gel de metronidazol a 25%.
Stoltze e Stellfeld (1992) observaram a absorção sistêmica ocorrida após a aplicação de
um gel de metronidazol a 25% em bolsas periodontais inflamadas. Amostras de sangue foram
tomadas antes e até 72 horas após a aplicação do gel para a quantificação do metronidazol no
plasma. A biodisponibilidade do metronidazol após sua aplicação foi de 71%. Além disso, os
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22
resultados indicaram que altas concentrações de metronidazol puderam ser obtidas nas bolsas
periodontais, sem induzir altas concentrações plasmáticas.
Wade et al. (1992) investigaram os efeitos da raspagem radicular associada ou não a
tiras acrílicas contendo clorexidina, metronidazol ou tetraciclina na sua composição e a
susceptibilidade da microbiota subgengival em pacientes com periodontite crônica. As tiras de
tetraciclina, de metronidazol e a raspagem e alisamento radicular associada a tiras de
metronidazol foram mais eficazes que as tiras de clorexidina na redução da contagem total de
microrganismos anaeróbios e proporção anaeróbios/aeróbios. Apesar disso, as mudanças nos
parâmetros microbiológicos se aproximaram dos níveis iniciais quatro semanas após o
término do tratamento.
Frandsen et al. (1994) estudaram a colonização bacteriana de defeitos ósseos tratados
por regeneração tecidual guiada com membranas de politetrafluoretileno expandido (ePTFE),
associadas ou não a um gel de metronidazol a 25%. A influência do gel de metronidazol no
resultado do tratamento pareceu estar confinada apenas à fase inicial da regeneração. Apesar
dos bons resultados clínicos obtidos quando o gel foi associado, a colonização por bactérias
em ambos os grupos (membranas com ou sem o gel de metronidazol) foi bastante
significativa no momento da remoção das membranas.
Hitzig et al. (1994) avaliaram os efeitos clínicos de uma única aplicação de uma fibra de
colágeno de metronidazol a 5% em bolsas periodontais associada ao debridamento mecânico,
comparada com o último somente. Nos 28 pacientes selecionados, foram avaliados o índice de
placa, nível de inserção gengival, profundidade e sangramento à sondagem antes e após 15, 30
e 90 dias do tratamento. Os resultados indicaram que o uso tópico de metronidazol serviu
como um importante adjuvante do debridamento mecânico no tratamento da periodontite.
Sander et al. (1994) avaliaram o efeito da aplicação de um gel de metronidazol na
cicatrização após regeneração tecidual guiada. Vinte pacientes foram selecionados,
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apresentando um par de defeitos ósseos verticais de tamanho e configuração similar. Os
defeitos foram tratados somente com membranas de politetrafluoretileno expandido ou com as
membranas em combinação com a aplicação local do gel de metronidazol. Os resultados
indicaram que a aplicação local do metronidazol suscitou um efeito benéfico na cicatrização
dos defeitos periodontais do tipo vertical tratados por regeneração tecidual guiada.
Stoltze (1995) estimou o período de tempo que a matriz do gel de metronidazol a 25%
Elyzol
®
, constituída por uma mistura de gliceril mono-oleatos (GMO) e triglicerídios,
persistia em bolsas periodontais após uma única aplicação. Foram incluídos 12 pacientes, dos
quais foram colhidas amostras do fluido crevicular gengival com tiras de papel antes e
imediatamente após a aplicação do gel, e após 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, e 24 horas da aplicação.
As amostras foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para a
quantificação do GMO e do ácido oléico (um produto da degradação do GMO). Apesar de o
metronidazol ser encontrado nas bolsas periodontais após 24-36 horas da aplicação do
Elyzol
®
, os componentes que formam a matriz desse gel, representados pelo GMO, foram
encontrados em quantidade inferior ao limite de quantificação após 24 horas da sua aplicação,
apresentando um desaparecimento completo após alguns poucos dias do seu uso.
Radvar, Pourtaghi e Kinane (1996) compararam a eficácia de três sistemas para
liberação local de antibióticos em bolsas periodontais, associados à raspagem e alisamento
radicular. Os sistemas avaliados foram: uma fibra contendo 25% de tetraciclina (Actisite
®
),
um gel com 2% de minociclina (Dentomycin
®
) e um gel de metronidazol a 25% (Elyzol
®
).
Após 6 semanas, foram avaliados parâmetros clínicos (profundidade e sangramento à
sondagem, nível de inserção gengival e índice gengival modificado), onde se verificou que
todos os três sistemas ofereciam algum benefício sobre a raspagem e alisamento radicular
apenas, sendo que a associação do debridamento mecânico com as fibras contendo tetraciclina
foi a que mostrou maior vantagem no tratamento de áreas com doença periodontal persistente.
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
24
Stelzel e Florès-de-Jacoby (1996) realizaram um estudo onde compararam o efeito da
raspagem subgengival à aplicação tópica de um gel de metronidazol a 25% para o tratamento
de pacientes com periodontite. Nos 30 pacientes selecionados, a profundidade e o
sangramento à sondagem foram avaliados antes do tratamento e após 2, 12 e 24 semanas. Ao
mesmo tempo, amostras de placa subgengival foram colhidas e analisadas sob microscopia de
campo escuro. Os resultados demonstraram que, tanto o tratamento mecânico quanto o
antibiótico, foram eficazes quando se compararam os valores iniciais àqueles após 6 meses do
início do tratamento, com melhora nos parâmetros clínicos analisados e mudança para uma
microbiota mais saudável, quando observada sob microscopia. Apesar disso, não foram
observadas diferenças dos tratamentos entre si, ou seja, o gel de metronidazol mostrou-se tão
eficaz quanto a raspagem subgengival no tratamento da periodontite.
Hitzig et al. (1997) investigaram o efeito na microbiota subgengival da administração
tópica de metronidazol a 5%, contido em um dispositivo esterilizado contendo 95% de
colágeno tipo 1. Em cada um dos 30 pacientes, foram colhidas amostras de sítios
subgengivais que receberam tratamento mecânico apenas (controle) e de outros que
receberam além da raspagem, o dispositivo contendo metronidazol (teste). Com o material
colhido, foram feitas culturas e contagens do total de bactérias anaeróbias cultiváveis, dos
anaeróbios pigmentados de negro e do Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa).
Espiroquetas e fusiformes foram quantificados por exame microscópico direto após a
coloração de Giemsa. Foi observada uma melhora em todos os parâmetros microbiológicos,
com uma redução estatisticamente significante de fusiformes no grupo teste. Outra
observação foi o menor número de sítios positivos para Aa no grupo teste, demonstrando uma
eficácia do uso tópico de metronidazol associado à terapêutica mecânica no tratamento da
periodontite.
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25
Jones et al. (1997) descreveram o desenvolvimento de duas formulações com
propriedades mucoadesivas para a liberação de metronidazol em bolsas periodontais, uma
contendo a hidroxietilcelulose e a outra o Carbopol, ambas acrescidas da policarbofila. Os
testes in vitro demonstraram que a formulação contendo hidroxietilcelulose e policarbofila
poderia ser vantajosa no tratamento da periodontite.
Noyan et al. (1997) testaram os efeitos clínicos e microbiológicos do uso de
metronidazol local (Elyzol
®
) e sistêmico (Flagyl
®
), associado ou não ao debridamento
mecânico subgengival, em pacientes adultos com periodontite. Foram selecionados 10
pacientes, sendo os mesmos divididos em dois grupos de 5 pacientes. Um grupo recebeu
apenas tratamento local para a doença periodontal, sendo que em cada um dos pacientes desse
grupo, cada quadrante recebeu um tratamento que poderia ser: 1) raspagem e alisamento
radicular apenas; 2) Elyzol
®
; 3) raspagem e alisamento radicular e Elyzol
®
e 4) sem
tratamento. O outro grupo foi representado por pacientes que receberam tratamento sistêmico,
onde cada paciente teve dois quadrantes tratados exclusivamente com Flagyl
®
e os outros dois
restantes com metronidazol sistêmico, associado à raspagem e alisamento radicular. Uma
semana após a primeira sessão de tratamento desses pacientes, os mesmos procedimentos
foram repetidos nos dois grupos e 6 semanas após esse período, os indivíduos foram
monitorados por exames clínicos e microbiológicos por 42 dias. Todos os tratamentos
resultaram em melhora nos parâmetros clínicos, exceto no grupo que não recebeu tratamento.
Além disso, todos os grupos tratados mostraram uma redução no número total de bactérias e
na proporção de microrganismos anaeróbios obrigatórios. Apesar dos bons resultados obtidos
com a terapia mecânica combinada a uma terapêutica antimicrobiana, os autores concluíram
que o tratamento local com metronidazol, combinado à raspagem e alisamento radicular,
produziu efeitos clínicos e microbiológicos melhores em relação aos outros tratamentos.
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Stelzel e Florès-de-Jacoby (1997) conduziram um estudo cujo objetivo foi comparar a
aplicação tópica de um gel de metronidazol a 25% com a raspagem subgengival. Foram
avaliados 24 pacientes, nos quais parâmetros clínicos, como profundidade de sondagem e
sangramento à sondagem, foram registrados no início e após 1, 3, 6, 14, 18 e 24 meses após o
término do tratamento. Além disso, amostras de biofilme foram colhidas na mesial de todas as
bolsas periodontais selecionadas para avaliação por microscopia de campo escuro. O
tratamento consistiu de duas aplicações do gel (dias 0 e 7) em dois quadrantes aleatoriamente
selecionados e de raspagem subgengival nos quadrantes remanescentes. A aplicação do gel de
metronidazol a 25% levou os pacientes a apresentarem uma melhora nos parâmetros clínicos e
microbiológicos, comparável à raspagem subgengival. Após 18 meses, a microbiota havia
revertido à composição encontrada no início do estudo, sendo que os parâmetros clínicos
ainda mostraram uma ligeira melhora em relação ao estágio inicial após 24 meses.
Aronna et al. (1998) analisaram a biocompatibilidade e eficácia de um dispositivo
contendo poli(hidroxietilmetacrilato), na forma de pequenas lâminas, na liberação de
tetraciclina ou metronidazol para o tratamento de apenas dois pacientes com periodontite.
Foram avaliados a profundidade e o sangramento à sondagem e a presença das bactérias
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia.
Os autores destacaram a biocompatibilidade do material e sua facilidade de aplicação.
Enquanto o dispositivo contendo tetraciclina mostrou-se eficiente na redução da profundidade
de sondagem, no desaparecimento do sangramento à sondagem e na redução significante da
espécie Porphyromonas gingivalis, o metronidazol mostrou-se eficiente apenas na redução da
profundidade de sondagem, mas o sangramento à sondagem persistiu e não houve redução
significante nas bactérias analisadas.
Awartani e Zulqarnain (1998) compararam os efeitos da aplicação de um gel de
metronidazol a 25% com a raspagem subgengival. Foram selecionados 13 pacientes, sendo
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que cada um recebeu simultaneamente, em quadrantes selecionados aleatoriamente, todos os
tipos de tratamento: 1) aplicação do gel de metronidazol somente, 2) raspagem subgengival,
3) uma combinação do tratamento mecânico com o gel ou 4) tratamento nenhum (controle).
Os resultados obtidos demonstraram que, para o tratamento da periodontite de adulto de
moderada a severa, a raspagem subgengival isolada foi tão eficiente quanto a combinação da
raspagem com a terapia antibiótica.
Lie, Bruun e Böe (1998) compararam três regimes de tratamento de bolsas periodontais:
raspagem e alisamento radicular apenas, raspagem e alisamento associados a um gel de
metronidazol a 25% e raspagem associada à aplicação subgengival de uma pomada de
tetraciclina a 3%. Foram avaliados parâmetros clínicos (profundidade de sondagem, nível de
inserção gengival e sangramento à sondagem) e microbiológicos, monitorados após 3 e 6
meses do tratamento. Não foram encontradas diferenças significantes entre o gel de
metronidazol e o dispositivo contendo tetraciclina. O tratamento mecânico isolado mostrou-se
tão eficaz quanto os regimes em que foi usado um antimicrobiano, apesar de ter havido uma
tendência não significante a resultados melhores nos sítios tratados com a associação da
raspagem aos antibióticos.
Magnusson (1998) realizou uma revisão dos resultados obtidos em vários trabalhos
clínicos, nos quais foi usado metronidazol tópico para o tratamento da doença periodontal. O
autor comentou as formas de aplicação do metronidazol nesses trabalhos, em filmes, tiras,
tubos de diálise e na forma de gel, associados ou não à raspagem e alisamento radicular e
ainda citou trabalhos que compararam os efeitos do metronidazol sistêmico ao tópico.
Concluiu que concentrações efetivas de metronidazol poderiam ser obtidas e mantidas em
bolsas periodontais com formulações para a liberação local e sustentada, as quais poderiam
ser biodegradáveis.
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
28
Também foi observado nesses estudos clínicos que o efeito do metronidazol de uso
tópico era comparável a uma sessão de raspagem subgengival e alisamento radicular, tanto em
pacientes nunca tratados como em pacientes em tratamento, efeito observado em parâmetros
clínicos e microbiológicos indicativos da doença periodontal. Apesar disso, o autor não sugere
a substituição do tratamento mecânico convencional pelo metronidazol porque não há estudos
que demonstrem segurança no uso repetido e prolongado desses regimes antibióticos,
recomendando o uso desses dispositivos de liberação sustentada de maneira conjunta com
terapias cirúrgicas e não-cirúrgicas para o tratamento da periodontite (MAGNUSSON, 1998).
Palmer, Matthews e Wilson (1998) observaram as respostas clínicas e microbiológicas
após o tratamento não-cirúrgico da periodontite moderada ou avançada em 84 pacientes
adultos, estratificados também em fumantes e não-fumantes, empregando um tratamento
mecânico isoladamente (raspagem subgengival e alisamento radicular), associado ao
metronidazol sistêmico ou a um gel de metronidazol a 25%, de uso tópico (Elyzol
®
). Os
parâmetros clínicos observados foram: a profundidade de sondagem, o sangramento à
sondagem e o índice de placa, enquanto o exame microbiológico consistiu de contagem de
espiroquetas, bastonetes, cocos e outros morfotipos por meio da microscopia de campo
escuro. A avaliação foi feita antes do tratamento e após 8 e 24 semanas do início das terapias.
Os resultados desse estudo não demonstraram benefícios no uso do metronidazol, sistêmico
ou tópico, como auxiliar do tratamento mecânico em pacientes com periodontite,
independente do hábito de fumar.
Rudhart et al. (1998) avaliaram os efeitos clínicos e microbiológicos de pacientes
apresentando periodontite quando submetidos a um tratamento com um gel de metronidazol a
25%. Foram selecionados para esse estudo 46 pacientes com doença periodontal inflamatória
crônica, de moderada a severa, que haviam recebido terapêutica periodontal sistemática de 6 a
24 meses antes de serem incluídos nesse estudo. Cada paciente recebeu raspagem subgengival
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e alisamento radicular em dois quadrantes e nos outros dois restantes recebeu a aplicação do
gel de metronidazol apenas. Os tratamentos foram feitos no dia zero e repetidos sete dias
depois; amostras subgengivais foram colhidas antes dos tratamentos e nos dias 21, 91 e 175
após o início do estudo. Ambos os tratamentos resultaram em redução significante da
profundidade de sondagem após 6 meses quando comparada com os níveis iniciais, mas não
foram encontradas diferenças estatisticamente significantes nos parâmetros clínicos e
microbiológicos entre a terapêutica mecânica e o antibiótico.
Somayaji et al. (1998) compararam a eficácia de dois antimicrobianos, a tetraciclina e o
metronidazol, na redução de microrganismos contidos em bolsas periodontais, usando como
meio de liberação tiras de etilcelulose. O estudo envolveu 30 pacientes que receberam
raspagem supragengival, sendo que os sítios subgengivais receberam tiras contendo
metronidazol, tetraciclina ou apenas um placebo, sem antimicrobiano. Os resultados obtidos
com ambas as substâncias foram quase idênticos, com liberação lenta e sustentada dos
fármacos por um período de 120 horas, no qual todos os microrganismos foram eliminados. A
tetraciclina mostrou uma liberação mais rápida, enquanto o metronidazol necessitou de uma
concentração menor para atingir a completa redução da microbiota subgengival.
Kinane e Radvar (1999) avaliaram a eficácia de três sistemas de liberação de
antimicrobianos disponíveis para o tratamento da doença periodontal. Foram selecionados 79
pacientes, divididos em quatro grupos: raspagem e alisamento radicular apenas (20 pacientes);
associados à aplicação de fibras de tetraciclina a 25% (19 pacientes); a um gel de minociclina
a 2% (21 pacientes) ou a um gel de metronidazol a 25% (19 pacientes). Medidas clínicas
foram realizadas no início do trabalho e após 6 semanas, 3 e 6 meses da aplicação dos
sistemas. Apesar dos três sistemas terem demonstrado algum benefício sobre a raspagem e
alisamento radicular isoladamente, a colocação de fibras de tetraciclina simultaneamente ao
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30
tratamento mecânico mostrou a maior redução na profundidade de sondagem, após 6 meses
de tratamento.
Knoll-Köhler (1999) realizou um levantamento de vários trabalhos que compararam a
raspagem e alisamento radicular com a aplicação de um gel de metronidazol a 25% (Elyzol
®
)
para responder se estava comprovada a eficácia do gel dental de metronidazol como uma
alternativa à raspagem e alisamento radicular no tratamento da periodontite de adulto
localizada. A partir dos trabalhos avaliados, concluiu que o gel de metronidazol não poderia
ser considerado uma alternativa à instrumentação mecânica no tratamento da periodontite.
Palmer, Matthews e Wilson (1999) examinaram se a terapêutica antimicrobiana com
metronidazol tópico ou sistêmico poderia melhorar a resposta, em pacientes fumantes e não-
fumantes, ao tratamento periodontal de raspagem e alisamento radicular. Foram selecionados
28 pacientes fumantes e 56 não-fumantes, distribuídos aleatoriamente em três grupos: 1)
raspagem e alisamento radicular com ultra-som, sob anestesia local, 2) raspagem e alisamento
radicular + 200 mg de metronidazol sistêmico por 7 dias e 3) raspagem e alisamento radicular
+ duas aplicações subgengivais de um gel de metronidazol a 25%. Não foram encontradas
diferenças na resposta clínica aos três regimes de tratamento após 2 e 6 meses, tanto para
fumantes quanto para não-fumantes. Este estudo confirmou que o fator fumo é responsável
por uma pior resposta ao tratamento periodontal mecânico, independentemente do uso
sistêmico ou tópico de metronidazol.
Riep, Purucker e Bernimoulin (1999) descreveram seu estudo no qual foi observado se a
aplicação de um gel de metronidazol a 25%, combinada à raspagem e alisamento radicular,
poderia melhorar os resultados da raspagem e alisamento radicular apenas. Foram
selecionados 30 pacientes com doença periodontal localizada e recorrente. Dois sítios foram
selecionados em cada paciente, sendo que um era o controle, onde foi feita apenas a raspagem
e alisamento radicular, e o outro era o sítio teste, onde além do tratamento mecânico
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convencional era também administrado o gel de metronidazol (Elyzol
®
) 5 vezes durante 10
dias. Foram registrados dados de parâmetros clínicos (profundidade e sangramento à
sondagem, nível de inserção gengival) e microbiológicos (teste ELISA comercial –
Evalusite
®
). Foi observado que não houve diferenças significantes entre o tratamento
mecânico isoladamente e associado ao gel de metronidazol, com a exceção de um
microrganismo, a Prevotella intermedia, que só foi reduzida a níveis significantes após a
raspagem e alisamento radicular isoladamente.
Zucchelli et al. (1999) compararam os efeitos da aplicação tópica de antibióticos com a
sistêmica nos procedimentos de regeneração tecidual guiada (RTG). Cinqüenta e seis defeitos
ósseos interproximais foram tratados pela RTG com as membranas de politetrafluoretileno
expandido (ePTFE) reforçadas por titânio. Os pacientes foram divididos aleatoriamente em
dois grupos, onde o teste recebeu a aplicação semanal de um gel de metronidazol a 25% e o
controle, antibiótico via sistêmica (amoxicilina e ácido clavulânico, 1 g/dia por 14 dias).
Observou-se que a administração local de antibiótico é mais efetiva que a sistêmica na
prevenção da contaminação da membrana, mas que isso não levou a resultados clínicos
melhores, provavelmente por causa da interferência do veículo (gel) nos tecidos gengivais,
reduzindo-se assim os potenciais benefícios que poderiam surgir de um melhor controle da
quantidade de microrganismos presentes.
Griffiths et al. (2000) relataram os resultados de um trabalho realizado em dois centros
de estudo, onde foram comparados os efeitos clínicos da raspagem subgengival à raspagem
subgengival associada à aplicação do gel de metronidazol a 25% Elyzol
®
, em pacientes com
periodontite de adulto crônica. Foram selecionados 88 pacientes no total (43 de um centro e
45 do outro), nos quais todos os quadrantes receberam raspagem subgengival e alisamento
radicular, sendo em cada paciente dois quadrantes selecionados aleatoriamente para receber a
aplicação do gel. Os parâmetros clínicos avaliados foram a profundidade e sangramento à
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sondagem e o nível de inserção gengival, registrados ao início do tratamento e após 1, 3, 6 e 9
meses da terapia. Concluíram que a associação da raspagem subgengival ao gel de
metronidazol foi superior ao tratamento convencional isolado, sendo essa superioridade
mantida por 9 meses.
Needleman, Collins e Moles (2000) examinaram se a liberação lenta de um gel de
metronidazol a 25% poderia exercer algum efeito benéfico na cicatrização após uma cirurgia
periodontal. Foram selecionados 43 pacientes com bolsas periodontais de profundidade igual
ou maior que 6 mm, com sangramento à sondagem. O tratamento consistiu do retalho de
Widman modificado, sem ressecção óssea. O grupo experimental recebeu a aplicação do gel
na superfície exposta da raiz, enquanto o controle não recebeu o gel. Os resultados
evidenciaram que o procedimento cirúrgico com o retalho de Widman modificado foi eficaz
em estabelecer um estado de saúde periodontal em sítios com periodontite avançada, sendo
que não foram detectados benefícios adicionais no uso do gel de metronidazol a 25%.
Stellini et al. (2000) verificaram a eficácia de um gel de metronidazol a 25% no
tratamento da periimplantite. O exame microbiológico evidenciou a diminuição de bactérias
anaeróbias Gram-negativas, especialmente bastonetes móveis e fusiformes, e um aumento de
cocos e bastonetes não móveis Gram-positivos. Foi observada também uma resolução do
processo inflamatório pela gradual diminuição de células polimorfonucleares.
Stelzel e Florès-de-Jacoby (2000) investigaram o efeito de duas aplicações de um gel de
metronidazol a 25% como terapia auxiliar à raspagem subgengival e alisamento radicular.
Foram acompanhados 59 pacientes por um período de 9 meses, nos quais foram monitorados
parâmetros clínicos (profundidade e sangramento à sondagem e nível de inserção gengival) e
microbiológicos, por meio de microscopia de campo escuro. A terapia consistiu de raspagem
subgengival e alisamento radicular de todos os quadrantes e duas aplicações do gel de
metronidazol, com um intervalo de 7 dias entre as aplicações, em dois quadrantes
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selecionados aleatoriamente, apenas em sítios com profundidade gengival igual ou maior que
5 mm. Quando foi confrontado o tratamento mecânico convencional associado ao gel de
metronidazol com o tratamento mecânico isoladamente, houve uma diferença significante
favorável à associação de terapias, porém a melhora foi considerada de pouca relevância
clínica.
Gabarra (2002) desenvolveu um dispositivo mimetizador da bolsa periodontal que
simula as condições de umidade, temperatura e fluxo do fluido crevicular gengival para
avaliar, in vitro, sistemas de liberação lenta de fármacos para o tratamento da periodontite. O
dispositivo permitiria um melhor conhecimento do sistema carreador e estudo do perfil de
liberação do fármaco, possibilitando ajustes laboratoriais antes do emprego in vivo. Para testar
esse dispositivo, foram formulados alguns sistemas de liberação lenta, sendo constituídos por
géis à base de poloxamer (Lutrol
®
F 127), um contendo hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) e
outro sem esse último. Foi adicionado a esses sistemas o metronidazol como fármaco-modelo
na concentração de 15, 20 e 25%. Cada formulação foi testada in vitro por 9 a 13 dias, período
este que normalmente corresponde ao tempo da terapia com antimicrobianos. O dispositivo
permitiu a colheita do fluido crevicular artificial para a dosagem do metronidazol por meio da
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). As formulações testadas foram capazes de
manter a liberação in vitro do metronidazol durante todo o período teste, em concentração
suficiente para inibir os microrganismos associados à periodontite, sendo que aquela
formulação com 15% de metronidazol foi a que apresentou o melhor perfil de liberação do
fármaco.
Salvi et al. (2002) compararam os efeitos clínicos e microbiológicos de três sistemas
biodegradáveis de liberação sustentada para uso em bolsas periodontais, o Atridox
®
(polímero
reabsorvível contendo doxiciclina), Elyzol
®
(gel de metronidazol) e PerioChip
®
(chip de
clorexidina). Todos os sistemas demonstraram uma redução significante na profundidade de
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sondagem, mas o Atridox
®
levou a um ganho significante no nível de inserção gengival
quando comparado ao Elyzol
®
.
Jansson, Bratthall e Soderholm (2003) avaliaram os resultados do tratamento de
pacientes com periodontite recorrente quando tratados com um gel de metronidazol a 25%.
Foram escolhidos 20 indivíduos de um programa de manutenção de periodontite, mas com
doença periodontal recorrente. Após 3 meses de raspagem e alisamento radicular, 40 sítios
foram selecionados, 2 em cada paciente, sendo um deles tratado com o gel de metronidazol
(teste) e o outro com um gel placebo (controle). As medidas clínicas iniciais e nos retornos
incluíram o índice de placa, índice gengival, sangramento e profundidade de sondagem e nível
de inserção gengival. O estudo demonstrou que o tratamento com o gel de metronidazol não
influenciou na resposta cicatricial de pacientes com doença periodontal recorrente.
Machtei, Oettinger-Barak e Peled (2003) investigaram os efeitos de uma terapêutica
antimicrobiana local na regeneração tecidual guiada de defeitos de furca classe II, em
pacientes fumantes. Trinta e oito pacientes, 21 do sexo feminino e 17 do masculino, com
idades entre 35 e 61 anos, fumantes e com comprometimento de furca classe II, foram
divididos em dois grupos, o experimental, onde foi colocada a membrana e aplicado um gel
de metronidazol a 25% na superfície externa da mesma, e o controle, onde foi usada somente
a membrana. Foram avaliados o índice de placa, índice gengival, profundidade de sondagem e
nível de inserção. Enquanto o fumo inibe a maturação e mineralização tecidual, o protocolo
que utilizou o gel de metronidazol aprimorou esses processos, levando a resultados mais
favoráveis. Dessa forma, os autores recomendaram que a terapia com antimicrobianos seja
incorporada nos casos de regeneração tecidual guiada de defeitos de furca classe II em
pacientes fumantes.
Perioli et al. (2004) testaram diferentes comprimidos contendo misturas de derivados de
celulose e do ácido poliacrílico, de forma a desenvolver uma nova formulação contendo
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metronidazol para o tratamento da doença periodontal. O melhor desempenho mucoadesivo e
o melhor perfil de liberação in vitro foram alcançados pela formulação contendo a
hidroxietilcelulose (HEC) e o poliacrilato Carbomer 940
®
, na proporção de 2:2. O
comprimido obtido continha 20 mg de metronidazol, liberando o fármaco por 12 horas em
concentrações sempre acima da concentração inibitória mínima, necessária para eliminar as
bactérias anaeróbias responsáveis pela periodontite. Segundo os autores, a maior vantagem
dessa formulação estaria em diminuir a dosagem diária do fármaco em mais de 15 vezes,
quando comparada à terapia sistêmica, diminuindo assim os efeitos colaterais e melhorando a
colaboração do paciente no tratamento.
Jansson et al. (2004) reportaram um estudo onde 20 pacientes recebiam dois tipos de
tratamento, ao mesmo tempo: enquanto uma bolsa periodontal recebia um gel de metronidazol
a 25%, outro sítio selecionado aleatoriamente recebia um gel placebo. Foram comparados os
efeitos do gel contendo metronidazol sobre a microbiota subgengival, utilizando-se para isso
apenas três microrganismos representativos nas periodontites: a P. gingivalis, P. nigrescens e
A. actinomycetemcomitans. A técnica de identificação microbiológica foi pela reação em
cadeia da polimerase (PCR). Os resultados demonstraram que o gel contendo metronidazol
não reduziu a ocorrência desses microrganismos específicos.
Perinetti et al. (2004) compararam os efeitos clínicos e microbiológicos da
administração subgengival de dois géis, um de clorexidina a 1% e outro de metronidazol a
1%, em bolsas periodontais, após o tratamento mecânico (raspagem e alisamento radicular).
Foram selecionados 63 indivíduos, 25 homens e 38 mulheres, com periodontite crônica. Eles
receberam o tratamento mecânico e instruções de higiene oral, sendo que após 3 meses foram
divididos em três grupos: um recebeu o gel de metronidazol a 1%, outro o gel de clorexidina a
1% e um último um gel placebo. Os géis foram aplicados quatro vezes, com intervalos de 7
dias entre as aplicações. Os resultados demonstraram uma eficácia dos tratamentos, tanto com
_____________________________________________________________________ Revista da Literatura
36
o gel de clorexidina, quanto com o de metronidazol, em produzir benefícios nos parâmetros
clínicos e microbiológicos em pacientes com periodontite crônica de moderada a severa.
Apesar disso, com ambos os géis não se obteve a erradicação completa de patógenos
periodontais.
3 Proposição
_____________________________________________________________________________ Proposição
38
3 PROPOSIÇÃO
O objetivo desta pesquisa foi testar in vivo um sistema polimérico de liberação lenta de
fármacos no qual o princípio ativo a ser testado foi o metronidazol, para o tratamento da
periodontite induzida experimentalmente em modelo animal (cão), avaliando-se a persistência
do fármaco no fluido crevicular gengival e os efeitos desse sistema em relação a parâmetros
clínicos e microbiológicos da doença periodontal. Os parâmetros avaliados foram:
a) Clínico-laboratoriais: a presença do fármaco no fluido crevicular gengival (FCG),
monitorada por meio da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
b) Clínicos: profundidade de sondagem - PS;
nível de inserção relativo - NIR;
sangramento à sondagem - SS;
c) Microbiológicos: avaliação microbiológica pela técnica da hibridização DNA-DNA
checkerboard.
4 Material e Métodos
_______________________________________________________________________Material e métodos
40
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 PREPARO DO GEL
A formulação do gel foi baseada em Gabarra (2002), mas modificada após a realização
de um estudo piloto (Apêndice A, p. 122). O produto básico é um gel à base do poloxamer
407, polímero registrado como Pluronic
®
F 127 ou Lutrol
®
F 127 (Basf Aktiengesellschaft,
Ludwigshafen, Germany; lote: WPHY615B). O Lutrol
®
F 127 tem a propriedade física de
manter-se na forma líquida quando resfriado à temperatura de 5°C e consistência adequada
para aplicação com uma seringa, tornando-se um gel a 37°C (temperatura do corpo humano).
Constitui-se de um copolímero de duas fases: a fase A, com até 70% de oxietileno e a fase B,
com 30% de oxipropileno. É um surfactante não-iônico, biocompatível, antiespumante,
solúvel em meio líquido, com capacidade de alterar sua forma física dependendo da
temperatura em que se encontra.
A técnica de preparação do gel consistiu na adição de 30% de Lutrol
®
F 127 à água a
uma temperatura de 5°C, tomando-se o cuidado de manter o recipiente parcialmente imerso
em banho de gelo, para que fosse mantida a temperatura e a forma líquida do gel. O processo
foi realizado sob agitação lenta e constante até total homogeneização da mistura. Em seguida,
esta foi levada a uma câmara fria (5°C) durante 4 a 5 dias para eliminação das bolhas de ar
incorporadas durante o processo e ali mantida conservada até o momento do uso.
_______________________________________________________________________Material e métodos
41
Antes do uso, ao gel foi incorporado o metronidazol (Formil Química Ltda., Jandira -
SP, Brasil; lote: FMT.05.06.027.228) como agente antimicrobiano a uma concentração de
15%, concentração esta determinada também por Gabarra (2002) como a mais adequada em
termos de perfil de liberação. Também foi adicionado o conservante metilparabeno (Nipagin,
Labsynth, Diadema - SP, Brasil; lote: 81236), para evitar a deterioração do gel e
propilenoglicol (Labsynth, Diadema – SP, Brasil; lote: 81610), como veículo. A composição
do gel está apresentada na Tabela 1.
Tabela 1 - Composição do gel de metronidazol avaliado neste trabalho
Componentes Concentração (%)
Metronidazol 15,00
Poloxamer 407 (Lutrol
®
F 127) 30,00
Propilenoglicol 5,00
Metilparabeno 0,15
Água destilada qsp 100,00
4.2 PROCEDIMENTOS NOS ANIMAIS
O presente projeto foi enviado para o Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do
Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, recebendo aprovação e o processo
registrado sob o número 2004.1.475.53.5 (Anexo A, p. 155).
Para a verificação da validade da técnica da hibridização DNA-DNA checkerboard no
cão como modelo animal, foi realizado um estudo piloto onde foram colhidas amostras de
biofilme subgengival de um cão e de pacientes humanos com periodontite, e analisado se era
_______________________________________________________________________Material e métodos
42
possível constatar a presença de microrganismos pelas sondas utilizadas na técnica da
hibridização DNA-DNA checkerboard (Apêndice B, p.126).
Confirmada pelo estudo piloto a utilidade do método microbiológico na detecção de
microrganismos no modelo animal selecionado, foram empregados seis cães sem raça
definida, três machos e três fêmeas, com idades variando entre 3 e 4 anos e peso de 10 a 15kg.
Os animais foram mantidos em baias do Biotério II da Faculdade de Odontologia de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo durante a fase experimental.
Os animais selecionados para o estudo foram previamente vacinados e tratados contra
possíveis parasitoses e mantidos pelo período de um mês em quarentena para observação se
não desenvolveriam alguma doença que pudesse comprometer o estudo.
Todos os procedimentos nos animais foram realizados sob anestesia geral inalatória,
induzida pelo propofol (Profolen
®
, Blaüsiegel, Cotia – SP, Brasil), e a manutenção da
anestesia foi feita com isoflurano (Isothane, Baxter, São Paulo – SP, Brasil).
Após a fase de quarentena, a periodontite foi induzida experimentalmente nos animais
por meio de amarrias com fio de algodão colocadas em torno da região cervical dos dentes
selecionados para o estudo, perfazendo 12 dentes por cão, 72 dentes no total do experimento,
envolvendo os grupos dos incisivos, caninos e pré-molares, tanto superiores quanto inferiores.
A indução da periodontite foi realizada de acordo com a técnica de Nociti Júnior et al. (2001),
colocando-se as amarrias dentro do sulco gengival de sítios inicialmente saudáveis, mantendo
as mesmas em posição por um período de 30 dias (Fig. 1). Neste período, os animais
receberam uma dieta pastosa para favorecer o acúmulo de biofilme supra e subgengival nos
dentes com amarrias.
_______________________________________________________________________Material e métodos
43
Figura 1. Amarria (seta) sendo colocada no sulco gengival de um pré-molar inferior para a
indução da periodontite
Após a fase de indução da periodontite, foram incluídos no estudo apenas os dentes
cujos sítios subgengivais apresentassem profundidade de sondagem igual ou superior a 4 mm.
O desenho experimental adotado foi o conhecido como split-mouth, onde cada animal recebe
um tratamento por quadrante, de forma concomitante, os quais estão descritos a seguir:
1) RAR+Gel: raspagem e alisamento radicular e aplicação do gel contendo
metronidazol a 15% (experimental);
2) RAR: raspagem e alisamento radicular (controle positivo);
3) Gel: aplicação do gel contendo metronidazol a 15% (experimental);
4) NT: nenhum tratamento (controle negativo).
Nos grupos onde foi realizada a raspagem e alisamento radicular, o biofilme supra e
subgengival foi removido por meio de curetas de Gracey. A cureta era introduzida até o fundo
da bolsa periodontal, inicialmente sem contato da lâmina do instrumento com a parede
radicular. Em seguida, a lâmina era colocada em contato com a raiz e então eram realizados
_______________________________________________________________________Material e métodos
44
movimentos de raspagem na superfície radicular, movimentando-se o instrumento por toda a
circunferência do dente. O procedimento era executado até a obtenção de uma lisura na
superfície radicular.
As aplicações do gel de metronidazol dentro das bolsas periodontais selecionadas para
receber esse tratamento foram realizadas com uma agulha metálica de tamanho 40x10, com a
extremidade sem bisel, acoplada a uma seringa hipodérmica de vidro esterilizada, com
capacidade para 5 mL, contendo o gel em seu interior. O gel era aplicado dentro das bolsas até
o seu completo preenchimento e o excesso era removido cuidadosamente com auxílio de uma
gaze esterilizada (Fig. 2).
Figura 2. Aplicação do gel de metronidazol na bolsa periodontal
4.3 PARÂMETROS AVALIADOS
4.3.1 Parâmetros clínicos indicadores de doença periodontal
_______________________________________________________________________Material e métodos
45
Os exames clínicos foram realizados todos por um mesmo operador. A sondagem foi
realizada manualmente por meio de uma sonda milimetrada tipo Williams (Duflex - SSWhite,
Rio de Janeiro – RJ, Brasil), arredondando-se os valores para o milímetro mais próximo. Para
padronizar o local das sondagens, foram realizadas com uma ponta diamantada sulcos de
referência nos dentes, de forma a padronizar as medidas sempre na mesma posição, durante
todo o experimento.
As sondagens dos sítios selecionados para o estudo foram registradas somente após a
indução da doença periodontal nos seguintes tempos: 1 - antes da aplicação das terapêuticas
(T0 = baseline), 2 - após 7 dias da realização dos tratamentos (T1 = 7 dias), 3 - 30 dias (T2 =
30 dias) e 4 - 90 dias (T3 = 90 dias), e envolveram os seguintes parâmetros clínicos:
• profundidade de sondagem (PS): representada pela medida da margem gengival livre
até a porção mais apical do sulco gengival; só foi registrada a medida do sítio com a
maior profundidade em cada dente selecionado, sendo este mesmo sítio acompanhado
longitudinalmente durante o período de duração do estudo;
• nível de inserção relativo (NIR): foi registrado como a distância entre a marca de
referência feita nos dentes à porção mais apical do sulco gengival;
• sangramento à sondagem (SS): foi registrado como a presença ou ausência de
sangramento no sítio examinado que ocorreu até 15 segundos após a sondagem.
4.3.2 Parâmetros microbiológicos:
_______________________________________________________________________Material e métodos
46
O biofilme subgengival, presente nas bolsas periodontais nos tempos T0, T1, T2 e T3,
foi colhido dos sítios de todos os grupos de tratamento (Fig. 3). Os dentes onde foram
realizadas as colheitas tinham o biofilme supragengival removido por meio de uma gaze
esterilizada e o local era isolado para evitar contaminação das amostras por saliva. Em
microtubos tipo Eppendorf contendo 1,0 mL de solução salina fosfatada tamponada (PBS)
esterilizada, dois cones de papel nº 45, esterilizados por radiação gama (Dentsply, Petrópolis -
RJ, Brasil) e contendo o biofilme de um sítio, foram colocados. O conteúdo foi
homogeneizado em um agitador de tubos por dois minutos em velocidade máxima. Após a
agitação, os cones de papel eram removidos e os microtubos eram centrifugados a 4000 rpm
por 15 minutos.
Figura 3. Colheita do biofilme subgengival com cone de papel esterilizado (seta)
O sobrenadante era desprezado e, ao sedimento, eram acrescentados 150,0 μL de
tampão TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,6), seguido por agitação em agitador de
tubos, até que fosse verificada a homogeneização do conteúdo. Um volume de 150,0 μL de
NaOH 0,5 M foi adicionado, seguido por nova agitação até que o conteúdo estivesse
_______________________________________________________________________Material e métodos
47
homogêneo. Os microtubos com as amostras foram etiquetados seqüencialmente com o
número das amostras e foram armazenados em um freezer até serem enviados para análise
pela técnica da hibridização DNA-DNA checkerboard em um laboratório da Universidade
Federal do Rio de Janeiro. A seqüência desses procedimentos está esquematizada na Fig. 4.
Figura 4. Fluxograma representativo da metodologia empregada para obtenção das amostras
de biofilme subgengival
_______________________________________________________________________Material e métodos
48
As amostras enviadas ao laboratório da UFRJ foram analisadas seguindo a metodologia
descrita por Socransky et al. (1994). As suspensões nos tubos foram fervidas em banho-maria
por 10 minutos e neutralizadas com a adição de 0,8 mL de 5 M de acetato de amônia. Dessa
forma, as células bacterianas foram lisadas e o DNA suspenso na solução. Na primeira fase de
montagem do checkerboard, uma placa metálica contendo 30 canaletas, denominada Minislot
30 (Immunetics, Cambridge-MA, USA), foi colocada sobre uma membrana de náilon (15x15
cm) com carga positiva (Boehringer Mannhein, Indianápolis-IN, USA) e o conjunto
parafusado sobre uma base de acrílico. Cada suspensão contendo DNA livre foi depositada
nas fendas do Minislot 30 e o DNA foi concentrado na membrana de náilon. Em cada
membrana, foram analisadas 28 amostras do biofilme subgengival colhido dos sítios, ficando
as outras duas canaletas restantes como controle, contendo cada uma a concentração de 10
5
e
10
6
das sondas analisadas. A membrana foi removida do aparato e o DNA fixado na mesma
pela exposição ao calor (120°C) durante 20 minutos.
Após a fixação do DNA nas membranas, essas sofreram uma pré-hibridização a 42°C
por uma hora numa solução de 50% formamida, 5 X SSC (1 SSC = 150 mM NaCl, 15 mM
citrato de sódio, pH 7,0), 1% caseína, 25 mM de fosfato de sódio (pH 6,5) e 0,5 mg/mL de
RNA de levedura. Em seguida, cada membrana foi colocada sob a placa de acrílico do
Miniblotter 45 (Immunetics) com as linhas, contendo o DNA fixado, numa posição
perpendicular às canaletas do Miniblotter 45. O Miniblotter 45 contém 45 canaletas para a
colocação de uma sonda de DNA por canaleta. Cada canaleta foi preenchida com 130 µL de
uma determinada sonda, contida numa solução de hibridização (45% de formamida, 5 X SSC,
20 mM de fosfato de sódio – pH 6,5, 0,2 mg/mL de RNA de levedura, 10% de sulfato de
dextrano, 1% de caseína e 20 ng/mL de sonda de DNA). As sondas sofreram hibridização
perpendicularmente às linhas contendo o DNA bacteriano, propiciando um formato de xadrez
com as linhas de DNA horizontais e as sondas verticais. O aparato contendo as membranas foi
_______________________________________________________________________Material e métodos
49
colocado em um saco de plástico para evitar a desidratação das mesmas. A hibridização das
amostras nas membranas com as sondas foi feita a 42°C por um período mínimo de 16 horas.
As sondas de DNA foram confeccionadas usando o kit random primer digoxigenin
labelling (Boehringer Mannheim), conforme Feinberg e Vogelstein (1983). As sondas de
DNA, específicas para espécies comumente encontradas em bolsas periodontais, foram
empregadas para identificação dos microrganismos presentes, sendo nesse estudo utilizadas
33 sondas, listadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Espécies bacterianas usadas na confecção das sondas genômicas de DNA,
utilizadas para a identificação desses microrganismos nas amostras
Sonda Procedência da cepa
Actinomyces gerencseriae ATCC 23860
Actinomyces naeslundii 1 ATCC 12104
Actinomyces viscosus ATCC 43146
Actinomyces odontolyticus ATCC 17929
Veillonella parvula ATCC 10790
Streptococcus gordonii ATCC 10558
Streptococcus intermedius 27335
Streptococcus mitis ATCC 49456
Streptococcus oralis SSII / 35037
Streptococcus sanguinis SSI / 10556
Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo a ATCC 43718 FDC Y4
Capnocytophaga gingivalis FDC 27 ATCC 33624
Capnocytophaga ochracea FDC 25 ATCC 33485
Capnocytophaga sputigena 358
Eikenella corrodens ATCC 23834
Campylobacter rectus FDC 371 ATCC 33238
Eubacterium nodatum ATCC 33099
Fusobacterium nucleatum ss nucleatum ATCC 25586
Fusobacterium nucleatum ss polymorphum ATCC 10953
Fusobacterium nucleatum ss vincentii 364 ATCC 49256
Fusobacterium periodonticum ATCC 33693
Prevotella intermédia 25611
Peptostreptococcus micros ATCC 33270
Prevotella nigrescens ATCC 33563
Streptococcus constellatus 27823
Tannerela forsythensis (Bacteroides forsythus) FDC 338 ATCC 43037
Porphyromonas gingivalis 381 ATCC 33277
Treponema denticola B1
Actinobacillus actinomycetemcomitans sorotipo b ATCC 29523
Gemella morbilorum ATCC 27824
Leptotrichia buccalis ATCC 14201
Prevotella. melaninogenica 25845
Selenomonas noxia ATCC 43541
_______________________________________________________________________Material e métodos
50
Após a hibridização com as sondas, as membranas foram removidas do Miniblotter 45 e
lavadas por 5 minutos em temperatura ambiente, seguido de duas lavagens de 20 minutos
cada a 68°C numa solução de 0,1 X SSC; 0,1% SDS, a fim de remover as sondas que não
hibridizaram completamente. Em seguida, as membranas foram imersas por uma hora numa
solução contendo 0,1 M de ácido maleico; 3,0 M NaCl; 0,2M NaOH; 0,3% Tween 20; 0,5%
caseína, pH 8,0 e 30 minutos na mesma solução contendo o anticorpo anti-digoxigenina
conjugado à fosfatase alcalina (Boehringer Mannheim) numa diluição de 1/25000 (ENGLER-
BLUM et al, 1993). As membranas foram posteriormente lavadas com uma solução de 0,1M
de ácido maleico; 0,2 M NaOH; 0,3% Tween 20, pH 8,0, 4 vezes por 10 minutos e uma vez
por 5 minutos em 0,1 M Tris HCl; 0,1 M NaCl; 50 mM MgCl
2
, pH 9,5. Os sinais foram
detectados usando o substrato AttoPhos (Amersham Life Science, ArlingtonHeights, IL,
EUA) e foram lidos usando o Storm Fluorimager (Storm 860, Molecular Dynamics,
Sunnyvale - CA, USA), um instrumento ligado a um computador que lia a intensidade dos
sinais resultantes da hibridização sonda-amostra. A sensibilidade do ensaio foi ajustada para
permitir a detecção da concentração de 10
4
células bacterianas de uma determinada espécie,
ajustando-se a concentração de cada sonda de DNA. Os sinais revelados pelo aparelho foram
visualmente avaliados, sendo que um sinal não detectado era considerado escore 0 (zero);
quando a intensidade era menor que o controle 10
5
células bacterianas, considerou-se escore
1, aproximadamente igual a 10
5
escore 2, entre 10
5
e 10
6
células escore 3, aproximadamente
igual a 10
6
, escore 4 e acima de 10
6
, escore 5.
Na Fig. 5 está apresentada a reprodução de parte de uma membrana de náilon escaneada
pelo aparelho Storm Fluorimager, onde o resultado da análise pode ser visto. As linhas
horizontais representam as sondas, ou seja, as espécies de microrganismos cujas presenças
foram testadas e as verticais são as amostras de biofilme subgengival colhido dos cães. Onde
a amostra foi positiva para uma determinada sonda, um sinal podia ser identificado.
_______________________________________________________________________Material e métodos
51
Figura 5. Reprodução de parte de uma membrana de náilon contendo as amostras nas linhas
verticais e as sondas nas horizontais; onde a amostra era positiva para uma sonda,
um sinal podia ser visto
4.4 MONITORAMENTO DA CONCENTRAÇÃO DE METRONIDAZOL NO FLUIDO
CREVICULAR GENGIVAL (FCG) PELA CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE)
4.4.1 Colheita e determinação do volume de FCG dos sítios que receberam o gel de
metronidazol
_______________________________________________________________________Material e métodos
52
Os tempos adotados para a colheita do FCG para a dosagem do metronidazol foram
imediatamente após a aplicação do gel, 1, 6, 24 e 48 horas após a aplicação do gel, sendo o
tempo máximo para colheita determinado por ensaios anteriores (Apêndice A, p.122).
Como as amostras de FCG tinham volumes diferentes, da ordem de microlitros, para
permitir que todas as amostras usassem um denominador comum para a obtenção da média
das concentrações obtidas, os volumes obtidos em cada amostra foram usados para se calcular
as concentrações do metronidazol no volume de um mililitro de FCG, padronizando todos os
resultados da dosagem do metronidazol na unidade µg/mL (microgramas de metronidazol por
mililitro de FCG).
Inicialmente, foi removido o biofilme supragengival com uma gaze esterilizada dos
dentes onde o FCG seria amostrado. Foi realizado um isolamento relativo e procedeu-se à
colheita do fluido crevicular gengival com duas tiras de papel absorvente (PerioPaper
®
,
Oraflow Inc., Plainview - NY, USA) por sítio, colocadas de maneira consecutiva, durante
cerca de 10 segundos na entrada de cada bolsa periodontal (Fig. 6).
Figura 6. PerioPaper
®
utilizado para a colheita do fluido crevicular gengival para a dosagem
de metronidazol presente nas bolsas periodontais
_______________________________________________________________________Material e métodos
53
O volume colhido do fluido crevicular gengival em cada tira de papel foi quantificado
por meio do aparelho Periotron
®
8000 (Oraflow Inc., Plainview - NY, USA), equipamento
eletrônico utilizado para determinação de pequenos volumes de fluidos (Fig. 7).
Figura 7. Aparelho Periotron
®
8000 utilizado para a quantificação do volume das amostras de
fluido crevicular gengival
Um procedimento de calibração era realizado previamente ao uso do Periotron
®
para
todas as colheitas de FCG realizadas em uma mesma semana. Para isso, volumes conhecidos
de soro sangüíneo humano, conforme a recomendação do fabricante, eram aplicados por meio
de uma seringa com capacidade para 1 µL (mod. 7001, Hamilton, Reno, USA) nas tiras de
papel absorvente (PerioPapers
®
), com volumes partindo de 0 µL até 0,7 µL, com intervalos de
0,1 µL entre os volumes, três repetições por volume medido. Uma curva de calibração foi
construída a partir dos escores que o aparelho determina para um dado volume dispensado no
PerioPaper
®
. No presente estudo, a curva de calibração foi construída com o auxílio do
programa NCSS - Number Cruncher Statistical System (HINTZE, 2006) por meio de uma
regressão polinomial de quarta ordem, modelo matemático preconizado pelo fabricante e
_______________________________________________________________________Material e métodos
54
método que fornece maior precisão (CHAPPLE et al., 1999) do que o software Periotron
Professional, programa fornecido pelo próprio fabricante. Por meio dessa curva de calibração,
os volumes desconhecidos das amostras foram obtidos por uma interpolação, convertendo-se
os escores que o aparelho fornece em volumes de FCG. A Fig. 8 representa a curva de
calibração utilizada para uso do Periotron
®
e PerioPapers
®
neste estudo.
0,0
30,0
60,0
90,0
120,0
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
Volume de soro sangüíneo (em µL)
Periotron escores
Figura 8. Curva de calibração do Periotron
®
construída para a determinação do volume de
amostras de FCG colhidas com PerioPaper
®
Após a determinação do volume de FCG absorvido nas tiras de papel com o auxílio do
Periotron
®
, os PerioPapers
®
foram colocados em microtubos tipo Eppendorf com 0,5 mL da
fase móvel utilizada no cromatógrafo, composta de uma mistura metanol:água (30:70 v/v). As
amostras eram mantidas congeladas até o momento do processamento para extração do
metronidazol presente nas tiras de papel.
_______________________________________________________________________Material e métodos
55
4.4.2 Processamento das tiras de papel absorvente para a extração do metronidazol
Como as amostras de FCG não eram colhidas diretamente, mas sim de maneira indireta,
pelo uso de tiras de papel absorvente, foi realizado um ensaio para avaliar a quantidade de
metronidazol que podia ser recuperada das tiras de papel absorvente, determinando-se assim
se havia perda do fármaco por ficar alguma quantidade dele aderida aos PerioPapers
®
.
Como a preocupação era com capacidade do método empregado em recuperar o
metronidazol das amostras, e não com a recuperação total do FCG em si, foi usado no ensaio
o próprio gel de metronidazol testado neste estudo, diluído em água destilada, para obter uma
solução que pudesse ser utilizada para umedecer os PerioPapers
®
e simular assim uma
colheita do FCG.
Foram pesados 100 mg do gel utilizado nos experimentos com os cães e diluídos em 10
mL de água destilada. Essa solução foi injetada com a seringa de Hamilton em diferentes
volumes em vários PerioPapers
®
, cada um colocado em um microtubo, sendo que
posteriormente o microtubo contendo a fase móvel e o PerioPaper
®
foram agitados em
agitador de tubos na velocidade máxima por 2 minutos. Em seguida, o líquido contido no
microtubo era injetado no cromatógrafo para a determinação da concentração do metronidazol
que dessorveu da tira de papel absorvente para o meio de dissolução. A recuperação era
considerada total (igual a 100%) quando a concentração de metronidazol da amostra do ensaio
fosse igual àquela obtida quando a própria solução-teste fosse dosada pela CLAE. Foram
realizadas 15 repetições desse ensaio.
_______________________________________________________________________Material e métodos
56
4.4.3 Condições cromatográficas
O cromatógrafo empregado para a dosagem do metronidazol presente nas amostras de
FCG era da marca Shimadzu, modelo LC-10AT, acoplado a um detector UV visível modelo
SPD-10A e a um integrador C-R6A. As condições cromatográficas foram as seguintes:
• fase móvel: metanol:água (30:70 v/v); essa proporção na mistura foi determinada
como a mais adequada por Gabarra (2002);
• fluxo da fase móvel: 1 mL/min;
• comprimento de onda: 320 nm;
• coluna: Nova-Pak C18 (4 µm), de 300 x 3,9 mm;
• temperatura considerada: 25ºC;
• volume injetado de amostra: 20 µL.
Este equipamento está no Departamento de Ciências Farmacêuticas, da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP e está apresentado na Fig. 9, com os
números descrevendo os componentes do cromatógrafo.
1. sistema de bombeamento da fase
móvel
1
2
3
4
5
2. sistema de introdução da amostra
– injetor
3. sistema analítico – coluna
cromatográfica
4. sistema de detecção (nesse caso,
um detector UV foi usado)
5. sistema de registro e tratamento de
dados - integrador.
Figura 9. Cromatógrafo utilizado para dosagem de metronidazol nas amostras de FCG
_______________________________________________________________________Material e métodos
57
O resultado da análise cromatográfica é expresso graficamente no chamado
cromatograma. Ele é formado por um conjunto de picos que representam as substâncias
presentes em uma amostra. A Fig. 10 mostra o cromatograma de uma amostra com
concentração conhecida de metronidazol (4 µg/mL). O pico único demonstra o tempo de
retenção do metronidazol na coluna cromatográfica. Uma amostra que tenha um pico nesse
tempo (3,433 minutos) identifica de forma positiva a presença do metronidazol.
Figura 10. Cromatograma de uma solução padrão de metronidazol com uma concentração
conhecida (4 µg/mL)
Para a determinação da concentração do metronidazol, foi construída uma curva-padrão,
obtida por regressão linear, plotando-se em um gráfico as alturas de pico correspondentes a
várias concentrações conhecidas de metronidazol. A partir da equação da reta obtida,
substituem-se os valores da altura do pico obtida no cromatograma de cada amostra na
equação da reta para se determinar a respectiva concentração do fármaco dosado.
O conteúdo de cada microtubo contendo a amostra de FCG passou por uma membrana
para filtração (Millex
™
LCR, 0,45 µm, 13 mm, Millipore, São Paulo, Brasil) antes de ser
injetado no cromatógrafo. A avaliação do tempo de persistência do gel no interior das bolsas
_______________________________________________________________________Material e métodos
58
foi realizada pela dosagem do metronidazol no fluido gengival dos sítios que receberam o gel,
sendo que enquanto fosse detectado o fármaco, considerava-se que o gel estava presente.
4.4.4 Validação da metodologia analítica para a dosagem do metronidazol pela
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
O método cromatográfico foi validado de acordo com Luattrocchi, Andrizzi e Laba
(1992).
4.4.4.1 Linearidade do método
Refere-se à proporcionalidade entre a concentração do analito e sua resposta.
Para esse estudo, foi preparada uma solução-estoque onde foram pesados 25 mg de
metronidazol e dissolvidos em 25 mL de metanol, obtendo-se a concentração final de 1000
µg/mL.
Essa solução foi diluída e concentrações de 0,00625 a 1000 µg/mL foram utilizadas
para os estudos de linearidade e confecção da curva analítica, com determinação da equação
da reta e coeficiente de correlação (r).
_______________________________________________________________________Material e métodos
59
4.4.4.2 Precisão e exatidão
A precisão está relacionada com a dispersão das medidas ao redor de seu valor médio
central e corresponde ao grau de concordância entre ensaios individuais quando o método se
aplica repetidamente a múltiplas alíquotas de uma amostra homogênea. É expressa
matematicamente por meio do coeficiente de variação (CV), calculado pela seguinte fórmula:
CV = (desvio-padrão/concentração média obtida) x 100
A exatidão, também conhecida como erro sistemático ou tendência, corresponde à
diferença entre a concentração média obtida e a concentração verdadeira. Matematicamente,
pode ser calculada pela seguinte fórmula:
E = concentração média obtida x 100 / concentração verdadeira
Foram utilizadas três concentrações de metronidazol (baixa, média e alta) de valores
correspondentes a 0,025, 0,10 e 1,00 µg/mL, com três replicatas cada uma, para a avaliação
da precisão e exatidão intra-ensaio.
4.4.4.3 Sensibilidade do método: limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ)
_______________________________________________________________________Material e métodos
60
A sensibilidade corresponde à mínima quantidade de analito que pode produzir um
resultado significativo. Os parâmetros para definir a sensibilidade de um método são o limite
de detecção (LD) e o limite de quantificação (LQ).
LD corresponde à menor concentração de analito que pode ser detectada, mas não
necessariamente quantificada em uma amostra, nas condições estabelecidas.
LQ é definido como a menor concentração que pode ser mensurada com uma precisão
especificada, dentro do critério de aceitação do método.
Para essas determinações, os cálculos foram realizados conforme Luattrocchi, Andrizzi
e Laba (1992).
4.4.4.4 Seletividade ou especificidade
A especificidade é a propriedade do método de produzir um sinal que pode ser medido
somente na presença específica do analito, livre da interferência de outros componentes da
amostra.
Para esta análise foram injetados, separadamente:
• o metanol;
• a fase móvel (metanol:água, na proporção de 30:70);
• o gel testado nos cães, mas sem a adição do metronidazol na formulação;
• amostras de fluido crevicular gengival tomadas antes da indução da periodontite por
meio de amarrias e após a indução da periodontite, porém antes da aplicação do gel de
metronidazol.
_______________________________________________________________________Material e métodos
61
Foi observado se alguma das substâncias presentes nas amostras poderia interferir no
tempo de retenção do metronidazol.
4.5 DETECÇÃO E DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE METRONIDAZOL
PELA CLAE EM AMOSTRAS DE PLASMA SANGÜÍNEO
Para observar se havia a ocorrência de absorção sistêmica do metronidazol e em que
quantidade, foram realizadas três colheitas de sangue de um dos animais (3 mL de sangue por
colheita) em tubo heparinizados esterilizados (Vacutainer
®
, BD, Franklin Lanes - NJ, USA), a
primeira colheita antes da aplicação do gel nas bolsas periodontais e outras duas depois de
uma e duas horas da aplicação do gel, respectivamente.
O sangue colhido foi centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos para separação do
plasma. As amostras de plasma foram processadas de acordo com a técnica descrita por
Marques et al. (1978):
• misturar plasma com igual volume de etanol;
• agitar vigorosamente por 10 segundos no agitador de tubos;
• descansar por 15 minutos à temperatura ambiente para a precipitação de proteínas do
plasma;
• centrifugar a amostra a 1700 rpm por 10 min;
• injetar 20 µL do sobrenadante no cromatógrafo.
_______________________________________________________________________Material e métodos
62
4.6 TESTE DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO GEL DE METRONIDAZOL
O gel de metronidazol foi testado para verificar a presença de atividade antimicrobiana
pelo método de difusão em ágar, pela técnica do poço e do disco. O ensaio foi feito em
duplicata, com mensuração do diâmetro, em milímetros, do halo de inibição formado. Na
técnica do poço, foram utilizados 20,0 µL do gel por poço e no caso da técnica do disco, o
mesmo foi mergulhado no gel antes de ser aplicado no meio de cultura.
As cepas utilizadas foram Kocuria rhizophila (anteriormente Micrococcus luteus)
ATCC 9341, Staphylococcus epidermidis (cepa de campo) e Staphylococcus aureus ATCC
6538. Como controle, foi utilizado um disco de papel impregnado com clorexidina a 2,0%.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A unidade experimental adotada foi o dente, sendo que cada dente forneceu
informações apenas do sítio subgengival correspondente. Os dados da profundidade de
sondagem e nível de inserção relativo foram submetidos a uma análise por um modelo linear
de efeitos mistos (SPSS, 2005). Os resultados do sangramento à sondagem, considerada
variável dicotômica (sangramento positivo ou negativo), foram submetidos ao teste Q de
Cochran, para comparar os tempos dentro de cada tratamento, enquanto que, para o fator
tratamento, dentro de cada tempo de colheita, foram construídas tabelas de freqüências e foi
medido o grau de independência entre o sangramento à sondagem e os tratamentos pelo
coeficiente de associação Cramer’s V, preconizado para amostras pequenas e para variáveis
_______________________________________________________________________Material e métodos
63
do tipo dicotômica. No caso do exame microbiológico, apesar do método do checkerboard
fornecer os resultados em termos de escores sendo, portanto, uma variável ordinal, os
resultados foram avaliados somente em termos de ausência ou presença (variável dicotômica)
de uma determinada espécie de microrganismo nas amostras de biofilme colhidas. Nesse caso,
para cada um dos 33 microrganismos avaliados, foram analisadas as diferenças entre tempos
de colheita dentro de cada um dos tratamentos com o teste Q de Cochran. Quanto aos
tratamentos, foram montadas tabelas de freqüências dos microrganismos em cada um dos
tratamentos e foi medida a associação entre elas com a estatística Cramer’s V. As análises
foram feitas com o software estatístico SPSS (Statistical Package for the Social Sciences),
versão 14.0.0 (SPSS Inc., Chicago – IL, USA).
Os resultados de todos os testes estatísticos foram considerados significantes quando p
era menor que 0,05.
5 Resultados
_____________________________________________________________________________Resultados
65
5 RESULTADOS
A análise estatística completa dos dados obtidos neste trabalho estão compiladas no
Apêndice C (p. 129), sendo os resultados apresentados a seguir.
5.1 PARÂMETROS CLÍNICOS
Os dados da profundidade de sondagem estão resumidos na Tabela 3 e representados na
Fig. 11, onde os tempos foram agrupados dentro de cada um dos tratamentos.
Tabela 3 - Estatística descritiva da variável profundidade de sondagem (valores em mm),
segundo os tratamentos e os tempos
Tratamento Tempo
N Média Mediana
Desvio-
padrão
Mín. Máx. Intervalo
Diferença
T3-T0
T0 14 4,64 4,50 0,74 4,00 6,00 2,00
T1 14 3,42 3,00 1,02 2,00 5,00 3,00
T2 14 2,79 3,00 0,89 2,00 5,00 3,00
RAR
+
Gel
T3 9 2,44 2,00 0,88 1,00 4,00 3,00
-2,20
T0 14 4,36 4,00 0,63 4,00 6,00 2,00
T1 14 3,28 3,00 0,47 3,00 4,00 1,00
T2 14 2,86 3,00 0,77 2,00 4,00 2,00
RAR
T3 9 2,78 3,00 0,67 2,00 4,00 2,00
-1,58
T0 15 4,47 4,00 0,64 4,00 6,00 2,00
T1 15 3,80 4,00 0,94 3,00 6,00 3,00
T2 15 3,27 3,00 1,03 2,00 5,00 3,00
Gel
T3 9 3,33 3,00 0,86 2,00 5,00 3,00
-1,14
T0 11 4,45 4,00 0,69 4,00 6,00 2,00
T1 11 3,27 3,00 0,78 2,00 5,00 3,00
T2 11 3,00 3,00 1,00 1,00 4,00 3,00
NT
T3 6 3,17 3,50 0,98 2,00 4,00 2,00
-1,28
_____________________________________________________________________________Resultados
66
Figura 11. Desenho esquemático (boxplot) para a variável profundidade de sondagem,
dispondo-se os resultados segundo o tratamento, agrupados por tempo (* -
diferenças significantes encontradas somente entre os tempos, sem diferenças
entre os tratamentos)
Foi observada uma redução progressiva das profundidades de sondagem em todos os
grupos de tratamento, em função do tempo. Considerando-se a diferença entre a profundidade
medida aos 90 dias após os tratamentos e a medida realizada no início do experimento (T3-
T0), a maior diferença encontrada foi no grupo experimental RAR+Gel, onde ocorreu uma
redução média de 2,20 mm nas profundidades das bolsas, seguida pelos grupos RAR, Gel e
NT. Apesar da PS ter reduzido em uma magnitude diferente entre os tratamentos, essas
diferenças não foram significantes (p = 0,494). Com relação ao tempo em que foram feitas as
sondagens clínicas, avaliando-se o efeito do tempo na redução observada nas profundidades
de todos os grupos de tratamento, foi observada significância estatística (p = 2,45 x 10
-17
).
_____________________________________________________________________________Resultados
67
Todas as comparações de pares de tempo realizadas mostraram diferença significante (p <
0,003), com exceção do par 30 e 90 dias (p = 1,00). Não houve significância na interação
tempo x tratamento (p = 0,162).
Os resultados dos níveis de inserção relativo estão sumarizados na Tabela 4. A Fig. 12
ilustra os resultados para essa variável.
Tabela 4 - Estatística descritiva da variável nível de inserção relativo, segundo os tratamentos
e tempos
Tratamento Tempo
N Média Mediana
Desvio-
padrão
Mín. Máx. Intervalo
Diferença
T3-T0
T0 14 4,78 4,50 1,05 3,00 6,00 3,00
T1 14 4,14 4,00 1,23 2,00 6,00 4,00
T2 14 3,64 3,50 0,93 2,00 5,00 3,00
RAR
+
Gel
T3 9 3,22 3,00 0,67 2,00 4,00 2,00
-1,56
T0 14 4,50 4,00 0,85 4,00 6,00 2,00
T1 14 3,71 3,50 0,82 3,00 5,00 2,00
T2 14 3,50 3,00 0,85 2,00 5,00 3,00
RAR
T3 9 3,33 3,00 0,87 2,00 5,00 3,00
-1,17
T0 15 4,67 4,00 0,90 4,00 7,00 3,00
T1 15 4,33 4,00 1,29 3,00 7,00 4,00
T2 15 3,73 3,00 1,10 3,00 6,00 3,00
Gel
T3 9 3,78 4,00 1,09 2,00 6,00 4,00
-0.89
T0 11 4,36 4,00 0,81 3,00 6,00 3,00
T1 11 3,73 3,00 1,01 3,00 6,00 3,00
T2 11 3,54 3,00 0,93 2,00 5,00 3,00
NT
T3 6 3,33 3,50 0,82 2,00 4,00 2,00
-1,03
_____________________________________________________________________________Resultados
68
Figura 12. Desenho esquemático (boxplot) para a variável nível de inserção relativo,
dispondo-se os resultados segundo o tratamento, agrupados pelo tempo (* -
diferenças significantes encontradas somente entre os tempos, sem diferenças
entre os tratamentos)
De forma similar ao que ocorreu com a variável profundidade de sondagem, foi observada
uma redução nas medidas dos níveis de inserção ao longo do tempo, em todos os grupos. O grupo
experimental RAR+Gel também foi o que demonstrou maior redução nas medidas, apesar dessas
diferenças entre os grupos de tratamento não terem sido estatisticamente significantes (p = 0,539).
Diferenças significantes foram encontradas somente com relação ao efeito tempo em que foram
feitas as sondagens (p = 4,58 x 10
-15
). Todas as comparações de pares de tempo realizadas
mostraram diferença significante (p < 0,001), com exceção do par 30 e 90 dias (p = 0,205). Não
houve significância na interação tempo x tratamento (p = 0,240).
Os resultados do sangramento à sondagem estão sumarizados na Tabela 5 e representados
graficamente na Fig. 13.
_____________________________________________________________________________Resultados
69
Tabela 5 – Freqüências e porcentagens dos sítios com sangramento à sondagem, segundo o
tratamento e tempo
Sim Não Total
Tratamento Tempo
Freqüência
(N)
%
Freqüência
(N)
%
Freqüência
(N)
%
T0 14 100,00 0 0,00 14 7,18
T1 10 71,43 4 28,57 14 7,18
T2 11 78,57 3 21,43 14 7,18
RAR
+
Gel
T3 9 100,00 0 0,00 9 4,62
T0 14 100,00 0 0,00 14 7,18
T1 12 85,71 2 14,29 14 7,18
T2 12 85,71 2 14,29 14 7,18
RAR
T3 9 100,00 0 0,00 9 4,62
T0 15 100,00 0 0,00 15 7,69
T1 12 80,00 3 20,00 15 7,69
T2 15 100,00 0 0,00 15 7,69
Gel
T3 8 88,89 1 11,11 9 4,62
T0 11 100,00 0 0,00 11 5,64
T1 10 90,91 1 9,09 11 5,64
T2 10 90,91 1 9,09 11 5,64
NT
T3 5 83,33 1 16,67 6 3,07
Total
177 90,77 18 9,23 195 100,00
Figura 13. Gráfico em barras para a variável sangramento à sondagem, dispondo-se os
resultados segundo o tratamento, agrupados pelo tempo
_____________________________________________________________________________Resultados
70
O parâmetro clínico sangramento à sondagem não demonstrou associação com os
tratamentos realizados em nenhum dos quatro tempos considerados (p > 0,05), indicando que
o sangramento à sondagem ocorria de forma independente do tipo de tratamento realizado.
Diferentemente do que ocorreu com a profundidade de sondagem e o nível de inserção
relativo, as freqüências dos sítios com sangramento à sondagem não demonstraram diferenças
significantes entre os tempos em que foram realizados os exames clínicos nos testes
realizados dentro de cada grupo de tratamento (p > 0,05) para as comparações de tempo
dentro de cada um dos tratamentos).
5.2 PARÂMETROS MICROBIOLÓGICOS
Os resultados disponíveis da análise microbiológica pela técnica da hibridização DNA-
DNA checkerboard correspondem a apenas três dos seis cães utilizados no estudo (somente
machos).
A Tabela 6 representa uma análise geral das amostras de biofilme subgengival colhidas
de 84 sítios subgengivais, analisados pela técnica da hibridização DNA-DNA checkerboard,
sem levar em consideração os tratamentos que foram aplicados e o tempo em que as colheitas
foram efetuadas.
_____________________________________________________________________________Resultados
71
Tabela 6 – Distribuição das freqüências de microrganismos de 84 amostras de biofilme
subgengival de três cães, empregando a técnica da hibridização DNA-DNA
checkerboard, agrupando-se as freqüências pelos escores (0 a 5)
0 1 2 3 4 5 Total
Sondas
N % N %N %N %N %N % N %
A. gerencs.
80 95,2 4 4,8 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
A. naesl.
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
A. odontol.
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
A. viscosus
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
Aaa
79 94,0 5 6,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
Aab
83 98,8 1 1,2 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
C. gingiv.
80 95,2 3 3,6 0 0,0 1 1,2 0 0 0 0,0 84 100,0
C. ochracea
73 86,9 8 9,5 0 0,0 2 2,4 0 0 1 1,2 84 100,0
C. rectus
47 62,7 28 37,3 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 75 100,0
C. sputigena
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
E. corrodens
67 79,7 14 16,7 0 0,0 3 3,6 0 0 0 0,0 84 100,0
E. nodatum
83 98,8 0 0,0 0 0,0 1 1,2 0 0 0 0,0 84 100,0
F. nuc. nucl.
71 84,5 9 10,7 0 0,0 4 4,8 0 0 0 0,0 84 100,0
F. nuc. polym.
65 77,4 16 19,0 2 2,4 1 1,2 0 0 0 0,0 84 100,0
F. nuc. vinc.
30 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 30 100,0
F. periodont.
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
G. morbilorum
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
L. buccalis
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
P. gingivalis
66 78,6 6 7,1 4 4,8 8 9,5 0 0 0 0,0 84 100,0
P. interm
77 91,6 4 4,8 1 1,2 2 2,4 0 0 0 0,0 84 100,0
P. melannog
68 81,0 16 19,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
P. micros
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
P. nigrescens
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. constelat
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. gordonii
76 90,5 8 9,5 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. interme
78 92,9 6 7,1 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. mitis
76 90,5 8 9,5 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. noxia
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. oralis
75 89,3 8 9,5 1 1,2 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
S. sanguinis
73 86,9 10 11,9 1 1,2 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
T. denticola
56 66,6 26 31,0 2 2,4 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
T. forsyth.
84 100,0 0 0,0 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
V. parvula
82 97,6 2 2,4 0 0,0 0 0,0 0 0 0 0,0 84 100,0
Total
2492 92,0 182 6,7 11 0,4 22 0,8 0 0 1 0,1 2708 100,0
Legenda: 0 = ausente; 1 = ~10
5
células bacterianas; 2 = 10
5
células; 3 = entre 10
5
e 10
6
células; 4 = 10
6
células; 5 = acima de 10
6
células
Das 33 espécies bacterianas utilizadas para análise das amostras de biofilme
subgengival dos cães, 13 delas não foram sequer detectadas, apresentando escore igual a zero
em todas as amostras.
Do total de amostras avaliadas, independentemente da espécie bacteriana considerada,
houve uma média de 92,0% de hibridizações que resultaram em escore igual a zero, ou seja,
não houve a identificação positiva para os microrganismos testados nas amostras, enquanto os
_____________________________________________________________________________Resultados
72
8,0% restantes ficaram divididos entre os escores 1, 2, 3 e 5. Nenhuma amostra foi
identificada como tendo escore igual a 4.
Por causa da grande freqüência de escores iguais a zero (92,0% do total) e da pequena
participação dos outros escores no total dos dados, não foi realizada a conversão dos escores
para contagens de células bacterianas. Os dados do exame microbiológico foram
dicotomizados para a realização da análise estatística, considerando-se ausência do
microrganismo quando o escore era igual a zero, e presença do microrganismo onde os
escores eram originalmente 1, 2, 3 ou 5.
Dessa forma, todas as análises foram feitas baseadas apenas na prevalência das espécies
bacterianas nas amostras de biofilme subgengival, e as prevalências para as 33 sondas estão
sumarizadas na Fig. 14, agrupadas de acordo com os complexos microbianos descritos por
Socransky et al. (1998).
Figura 14. Gráfico de barras representando as prevalências das 33 sondas no total de
amostras de biofilme subgengival, colhidas de três cães, independentemente do
tratamento realizado ou tempo de colheita das amostras
_____________________________________________________________________________Resultados
73
De acordo com o observado na Fig. 14, os microrganismos mais prevalentes nas
amostras foram o C. rectus (37,3%), seguido pelo T. denticola (33,3%), F. nucleatum ss
polymorphum (22,6%), P. gingivalis (21,4%), E. corrodens (20,2%) e P. melaninogenica
(19,0%). As demais espécies apareceram em freqüências inferiores a 20%.
As prevalências de cada uma das 33 espécies bacterianas foram comparadas entre os
quatro grupos de tratamento, tendo sido construído um gráfico de linhas, com as linhas
representando as freqüências dos microrganismos para um dado tratamento, sendo elaborado
um gráfico para cada um dos tempos de colheita das amostras de biofilme subgengival,
representado na Fig. 15.
_____________________________________________________________________________Resultados
74
Figura 15 - Gráficos de linhas representando as prevalências (em %) das 33 espécies
b
acterianas para cada tratamento (cor diferente), onde cada gráfico representa
um tempo de colheita do biofilme subgengival (T0 a T3)
_____________________________________________________________________________Resultados
75
A análise dos resultados microbiológicos pela estatística Cramer’s V não demonstrou a
presença de associação entre as freqüências dos microrganismos com os tratamentos
realizados, para nenhuma das bactérias avaliadas em nenhum dos 4 tempos de colheita de
amostras (p > 0,05). Isso significa que as prevalências dos microrganismos nas amostras não
foram influenciadas pelo tipo de tratamento realizado.
Apesar de não terem sido evidenciadas diferenças entre os tratamentos em cada um dos
tempos de colheita, uma avaliação visual da Fig. 15 sugere uma diminuição na prevalência do
total de espécies de microrganismos detectadas com o passar do tempo, especialmente após
30 e 90 dias. Para investigar as diferenças nas freqüências observadas dos microrganismos ao
longo do tempo, foi realizada uma comparação das proporções de microrganismos presentes
em cada um dos tempos de colheita, dentro de cada grupo de tratamento. A Fig. 16 representa
essa comparação.
_____________________________________________________________________________Resultados
76
Figura 16 - Gráficos de linhas representando as prevalências (em %) das 33
espécies bacterianas para cada tempo (cor diferente), onde cada
gráfico representa um grupo de tratamento
_____________________________________________________________________________Resultados
77
Os resultados das comparações dos tempos pelo teste Q de Cochran demonstraram que
houve diferença significante na prevalência de alguns microrganismos apenas em dois grupos
de tratamento: o RAR+Gel, onde houve um aumento significante das cinco bactérias do
complexo amarelo avaliadas, da C. ochracea (complexo verde) e da P. intermedia (complexo
laranja) após 7 dias dos tratamentos (p = 0,029 para as 7 bactérias); no grupo Gel, o único
microrganismo que teve aumento significante foi a P. melaninogenica (p = 0,029), com
aumento de freqüência nas colheitas realizadas no tempo 7 dias. Nos grupos NT e RAR, não
foram evidenciadas diferenças significantes entre as colheitas de biofilme subgengival
realizadas em diferentes tempos para nenhuma das espécies bacterianas avaliadas (p < 0,05).
5.3. DOSAGEM DO METRONIDAZOL NAS AMOSTRAS DE FCG POR CLAE PARA
AVALIAÇÃO DA PERSISTÊNCIA DO GEL NAS BOLSAS PERIODONTAIS
Na Tabela 7 encontram-se as médias das concentrações de metronidazol presentes no
FCG dos 6 cães que fizeram parte do experimento. Essas médias foram calculadas apenas
para os sítios que receberam a aplicação do gel nas bolsas (grupos RAR+Gel e Gel).
Tabela 7 – Estatística descritiva da concentração de metronidazol (em µg/mL de FCG) dos 6
animais, determinada pela CLAE
* freqüência total de sítios com metronidazol detectado, com a percentagem entre parênteses
Tempo
Estatística
Imediato 1h 6h 24h 48h
N 29 29 29 29 29
N – MET (%)* 29 (100) 29 (100) 23 (79,3) 12 (41,4) 8 (27,6)
Média 45.017,56 24.307,37 23,82 3,67 3,08
Desvio-padrão 25.152,63 31.085,07 54,43 5,67 5,78
Mediana 36.606,25 8.548,80 7,03 0 0
Mínimo 10.120,00 5,90 0 0 0
Máximo 98.085,70 114.869,20 274,47 16,43 19,05
Intervalo 87.965,70 114.863,30 274,47 16,43 19,05
_____________________________________________________________________________Resultados
78
Pode-se observar pela Tabela 7 que altas concentrações do fármaco no fluido crevicular
gengival foram obtidas até uma hora após a aplicação do gel, ocorrendo uma grande
diminuição nas concentrações a partir das colheitas realizadas após 6 horas. Após 24 e 48
horas da aplicação do gel, a percentagem de sítios positivos para a presença de metronidazol
foi diminuindo, bem como as concentrações do fármaco no fluido crevicular gengival. Na Fig.
17 está uma representação gráfica dos valores médios da concentração de metronidazol
apresentados na Tabela 7, em função do tempo de colheita das amostras de FCG
(concentração em escala logarítmica).
1,00
10,00
100,00
1.000,00
10.000,00
100.000,00
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54
Tempo (h)
Log [metronidazol]
Figura 17. Curva representativa da concentração de metronidazol no FCG (em escala
logarítmica), em função do tempo de colheita das amostras
5.4. RESULTADOS DO PROCESSAMENTO DAS TIRAS DE PAPEL ABSORVENTE
PARA A EXTRAÇÃO DO METRONIDAZOL
_____________________________________________________________________________Resultados
79
Na Tabela 8 estão os resultados referentes ao teste para determinar o grau de
recuperação do metronidazol das tiras de papel absorvente pelo método empregado.
Tabela 8 – Taxa de recuperação do metronidazol das tiras de papel absorvente após
procedimento de extração do fármaco
Ensaio Recuperação do metronidazol (em %)
1 102,80
2 93,49
3 95,00
4 104,70
5 94,42
6 104,60
7 98,57
8 100,44
9 97,67
10 93,62
11 92,35
12 97,72
13 96,92
14 94,03
15 102,43
Média±Desvio 97,92±4,21
A taxa de recuperação do fármaco conseguida com esse método de colheita (média de
97,92%) permite dizer que, para o metronidazol, existe uma extração quase que total do
fármaco das tiras de papel absorvente.
5.5 VALIDAÇÃO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO (CLAE) PARA A DOSAGEM DO
METRONIDAZOL
_____________________________________________________________________________Resultados
80
5.5.1 Linearidade do método
A Tabela 9 apresenta as concentrações de metronidazol, com as respectivas alturas dos
picos obtidas pela análise dos cromatogramas das respectivas amostras. Os valores das
concentrações foram convertidos para seus respectivos logaritmos e foi plotado um gráfico
das alturas dos picos em função dos logaritmos das concentrações de metronidazol,
representado na Fig. 18.
Tabela 9 – Concentrações de metronidazol, seus respectivos logaritmos e as alturas de pico
correspondentes às concentrações para estudo de linearidade do método
Concentração de
metronidazol (µg/mL)
Log [metronidazol] Altura do pico
0,00625 -2,2 16,5
0,01250 -1,9 32,5
0,02500 -1,6 66,0
0,05000 -1,3 141,0
0,10000 -1,0 285,7
0,25000 -0,6 730,3
0,50000 -0,3 1409,0
1,00000 0,0 2841,0
2,00000 0,3 5620,5
4,00000 0,6 11263,0
8,00000 0,9 22422,5
20,00000 1,3 54102,5
50,00000 1,7 135502,0
100,00000 2,0 264557,0
200,00000 2,3 479554,0
500,00000 2,7 967010,0
1000,00000 3,0 998331,0
_____________________________________________________________________________Resultados
81
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
-3 -2 -1 0 1 2 3 4
Log da concentração de metronidazol
Altura dos picos
Figura 18. Gráfico das alturas dos picos em função dos logs das concentrações de
metronidazol para estudo de linearidade do método
Pela Fig. 18, verificou-se que o método apresentava boa linearidade até a concentração
de 8 µg/mL. Utilizou-se, então, as concentrações de 0,00625 a 4 µg/mL para a confecção da
curva analítica. A Fig. 19 representa a curva analítica que foi utilizada neste trabalho, e sua
respectiva equação da reta e coeficiente de correlação.
y = 2823,2x + 1,5102
R
2
= 1
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
012345
Concentração de metronidazol (µg/mL)
Altura dos picos
Figura 19. Curva analítica do metronidazol, obtida por CLAE
_____________________________________________________________________________Resultados
82
5.5.2 Precisão e exatidão
Os resultados dos testes de precisão e exatidão estão resumidos na Tabela 10.
Tabela 10 – Avaliação da precisão e exatidão intra-ensaio para o metronidazol
Concentração de metronidazol
(µg/mL)
Precisão intra-ensaio
(%)
Exatidão intra-ensaio
(%)
0,025 5,09 92,00
0,100 0,57 101,00
1,000 1,10 100,50
5.5.3 Sensibilidade do método – limites de detecção (LD) e quantificação (LQ)
O limite de detecção (LD), que corresponde à menor concentração do fármaco que pode
ser detectado nas amostras foi de 0,2 ng/mL. O limite de quantificação (LQ), que é a menor
concentração de metronidazol que poderia ser determinada com valores razoáveis de precisão
e exatidão, foi de 3,4 ng/mL.
5.5.4 Seletividade ou especificidade
Os resultados dos testes de especificidade demonstraram que nas amostras de metanol,
da fase móvel utilizada no cromatógrafo (metanol:água, na proporção de 30:70), do gel
_____________________________________________________________________________Resultados
83
formulado sem a adição do metronidazol e do fluido crevicular gengival colhido antes e
depois da indução da periodontite, porém antes da aplicação do gel de metronidazol, não
havia substâncias que pudessem interferir no tempo de retenção do metronidazol nas análises
cromatográficas. O tempo de retenção do metronidazol nas amostras foi de aproximadamente
3,448 minutos.
5.6 DOSAGEM DO METRONIDAZOL NO PLASMA SANGÜÍNEO
Os resultados obtidos das concentrações do fármaco no plasma de um dos animais do
experimento estão representados na Tabela 11.
Tabela 11 – Resultados da dosagem de metronidazol no plasma sangüíneo de um dos animais
pela CLAE
Tempo de colheita do sangue
Antes do gel 1h após o gel 2h após o gel
Concentração do
metronidazol (µg/mL)
ND 1,34 1,64
ND = não detectado
5.7. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO GEL DE METRONIDAZOL
Os resultados do teste da atividade antimicrobiana do gel de metronidazol estão
expressos na Tabela 12.
_____________________________________________________________________________Resultados
84
Tabela 12 – Halos de inibição (em mm) representativos da atividade antimicrobiana do gel de
metronidazol a 15%
Poço Disco
CHX 2,0%
(controle)
Cepa
1 2 1 2 1 2
K. rhizophila
0 0 0 0 34 24
S. epidermidis
15 15 13 14 14 -
S. aureus
15 13 0 0 24 22
Obs.: O sinal - significa que o tamanho do halo não pôde ser medido, mas não equivale a 0
O resultado do teste confirmou a presença de atividade antimicrobiana no gel avaliado
neste estudo.
6 Discussão
_____________________________________________________________________________ Discussão
86
6 DISCUSSÃO
O objetivo do presente estudo foi testar in vivo um sistema de liberação local de
fármacos para o tratamento da periodontite, contendo como princípio ativo o metronidazol em
uma concentração de 15%, sob a forma de um gel. Este sistema demonstrou liberação de altas
concentrações do fármaco por tempo prolongado, em testes realizados in vitro por Gabarra
(2002).
De acordo com Goodson (1989), agentes farmacológicos para uso tópico devem, além
de atingir o sítio-alvo, no presente caso representado pelas bolsas periodontais, manter uma
concentração adequada no sítio doente por um período de tempo suficiente para a sua ação.
Uma concentração adequada deve ser aquela que iniba a sobrevivência dos microrganismos
periodontopatogênicos, responsáveis pelas periodontites. No presente estudo os sítios-alvo são
representados pelas bolsas periodontais, induzidas experimentalmente em um modelo animal
(cães).
O tempo máximo em que um sistema de liberação local é capaz de fornecer uma
concentração mínima de antimicrobiano, a qual seja suficiente para inibir as bactérias
relacionadas com a periodontite, pode ser determinado pelo monitoramento da concentração
do fármaco no fluido crevicular gengival. Para isso, amostras de fluido crevicular gengival
devem ser colhidas em diferentes intervalos de tempo e avaliadas por algum método analítico
capaz de detectar e quantificar sua presença de forma precisa.
A colheita do fluido crevicular gengival para a posterior quantificação do fármaco pode
ser realizada por diversos métodos. Foram relatadas na literatura técnicas onde são
_____________________________________________________________________________ Discussão
87
empregados: a lavagem com microseringa de Hamilton de 50 µL do fluido gengival com uma
solução isotônica de volume fixo, coletando-se o fluido diluído (SKAPSKI; LEHNER, 1976);
uso de tubos capilares (OKAZAKI et al., 1995); de micropipetas (MUKHERJEE; DAS;
PATEL, 1983; PÄHKLA et al., 2005); e ainda o uso de tiras de filtro de papel absorvente
(KIM et al., 2002, 2004; SCHWACH-ABDELLAOUI et al., 2002; STOLLER et al., 1998;
STOLTZE, 1992, 1995; VIENNEAU; KINDBERG, 1997), que é o método mais bem aceito
atualmente para tal finalidade.
Após o fluido crevicular gengival (FCG) ser colhido, deve-se proceder à avaliação do
volume a fim de se calcular posteriormente a concentração do fármaco presente nas amostras
por volume de fluido gengival colhido. O volume pode ser estimado por métodos que
envolvam medidas lineares da distância que o fluido migrou na tira de papel, evidenciando-se
o mesmo pelo uso de corantes. Esses métodos apresentam como desvantagens a possibilidade
de variação no volume medido pela evaporação do fluido, em conseqüência da demora em se
medir a tira. Outro fator negativo dessa técnica é que o uso de corantes pode impedir análises
relativas à composição da amostra, pela combinação com algum componente presente no
FCG (GRIFFITHS, 2003).
O método que envolve a quantificação eletrônica do volume presente nas tiras de papel
absorvente é o mais confiável na atualidade (DEINZER; MOSSANEN; HERFORTH, 2000),
tendo sido, por esse motivo, o eleito para estimar o volume do fluido gengival nesta pesquisa.
O aparelho utilizado para essa finalidade é o Periotron
®
, que mede a capacitância elétrica de
uma tira de filtro de papel colocada entre as pinças do instrumento. Quando uma tira de papel
seca é colocada entre as pinças, a capacitância é medida por meio do circuito elétrico e
registra uma leitura igual a zero. Colocando-se uma tira de papel umedecida pela amostra do
fluido gengival, por exemplo, a capacitância vai aumentar proporcionalmente ao volume de
líquido presente, levando o aparelho à leitura de um escore mais alto, que é posteriormente
_____________________________________________________________________________ Discussão
88
convertido em unidades de volume (µL, no caso do FCG) por meio de um programa de
computador fornecido pelo próprio fabricante do aparelho (Periotron Professional, Oraflow
Inc., Plainview, NY, USA).
Conhecendo-se o volume do fluido gengival colhido, é necessário saber a quantidade do
metronidazol presente na amostra, para que se possa calcular a concentração do fármaco por
volume amostrado de FCG. Para a quantificação de fármacos no fluido gengival, alguns dos
métodos descritos na literatura foram a difusão capilar no ágar (GORDON et al., 1980;
NOTTEN; KOEK-VAN OOSTEN; MIKX, 1982; SCHWACH-ABDELLAOUI et al., 2002) e
a cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE (KELLY et al., 2004; KIM et al., 2002,
2004; PÄHKLA et al., 2005; STOLLER et al., 1998; STOLTZE, 1992; VIENNEAU;
KINDBERG, 1997).
O método de difusão no ágar tem como fonte de possível erro na determinação da
concentração de metronidazol o fato de que as zonas de inibição formadas podem ser
decorrência não somente da presença do próprio metronidazol em uma amostra, mas da
somatória dos efeitos do metronidazol e de seus metabólitos ativos, que também têm atividade
antimicrobiana (BRITT; POHLOD, 1986).
A técnica que utiliza a CLAE foi escolhida neste trabalho devido à sua maior
especificidade na determinação do metronidazol nas amostras de fluido gengival analisadas.
A validação do método analítico foi realizada para se demonstrar se ele era apropriado para a
finalidade pretendida, ou seja, para a determinação quantitativa do metronidazol nas amostras
de fluido crevicular gengival.
Observou-se que o método analítico da CLAE teve uma boa linearidade no intervalo
utilizado para a confecção da curva analítica, cujas concentrações de metronidazol variaram
de 0,00625 a 4 µg/mL, apresentando coeficiente de correlação (r) igual a 1, sendo o mínimo
aceitável igual a 0,99 (ANVISA, 2003). A precisão e exatidão devem ter valores que não
_____________________________________________________________________________ Discussão
89
excedam 15% para métodos bioanalíticos, de acordo com a ANVISA (2003), estando neste
caso dentro dos limites aceitáveis. As amostras apresentavam concentrações dentro do limite
de sensibilidade do método (limite de quantificação e de detecção) e foi determinado que o
método também tinha especificidade, ou seja, nenhuma outra substância interferente presente
na formulação do gel ou no fluido crevicular gengival surgiu no mesmo tempo de retenção do
metronidazol.
A determinação da concentração do metronidazol no fluido crevicular gengival neste
trabalho não tinha por objetivo definir o exato perfil de liberação do fármaco pelo gel in vivo.
O principal interesse não foi saber exatamente quanto do metronidazol foi liberado nas bolsas
e em que velocidade, mas sim qual era o tempo máximo que o gel conseguia permanecer nos
sítios-alvo, avaliando-se, por esse motivo, a concentração do metronidazol no fluido
crevicular gengival, para se descobrir por quanto tempo ela permaneceria em níveis
adequados para combater os microrganismos relacionados com as periodontites. Um
dispositivo de liberação local pode até exibir in vitro um perfil de liberação adequado. Mas
ser capaz de promover uma liberação lenta e prolongada por dias não é necessariamente
garantia de que um sistema consiga persistir no seu local de ação sem ser removido, e por um
tempo adequado para liberar o fármaco e produzir os resultados clínicos esperados.
Apesar de um curto período de permanência no sítio de ação poder antecipar uma baixa
eficácia terapêutica, os efeitos da utilização de qualquer dispositivo de liberação local só
podem ser evidenciados como clinicamente significantes ou não após um estudo in vivo. Este
foi o fator que motivou a continuidade da pesquisa, mesmo sabendo de antemão da baixa
capacidade de persistência nas bolsas periodontais da formulação avaliada neste trabalho
pelos resultados obtidos nos estudos preliminares (Apêndice A, p. 122).
Os resultados da persistência do metronidazol pela sua dosagem no FCG por meio da
CLAE demonstraram que o fármaco foi encontrado em altas concentrações somente nos
_____________________________________________________________________________ Discussão
90
tempos imediatamente após a aplicação do gel e após 1 hora. Após essa hora inicial, o gel
possivelmente foi eliminado do interior das bolsas periodontais de maneira progressiva,
obtendo-se concentrações de metronidazol mais baixas no tempo 6 horas, enquanto que a
partir das 24 e 48 horas, pouco restou do gel, com uma percentagem reduzida de sítios que
ainda apresentavam uma concentração de metronidazol quantificável pelo método.
Um estudo em que também foram monitoradas as concentrações de metronidazol em
pacientes com periodontite, só que liberadas por um gel com 25% do fármaco presente, foi o
de Stoltze (1992). Foram selecionados 12 pacientes com no mínimo 12 dentes cada um. Cada
amostra era retirada de dois dentes, perfazendo um total de 6 amostras por paciente, cada uma
dessas amostras sendo colhida em um dos 6 tempos estabelecidos para colheita. Os intervalos
de tempo observados foram diferentes, mas seus resultados demonstraram que, até 12 horas
após a aplicação do gel, o metronidazol foi encontrado em concentrações quantificáveis pela
CLAE em 100% das amostras. As freqüências de detecção do fármaco diminuíram para 75%
nas amostras colhidas com 24 horas e 58% nas colhidas com 36 horas. No presente estudo, o
metronidazol só foi detectado em 100% das amostras no tempo 1 hora após a aplicação do
gel, caindo para 79,3% das amostras após 6 horas, 41,4% após 24 horas e 27,6% após 48
horas. Quanto ao tempo máximo de persistência do gel nas bolsas periodontais, enquanto no
presente estudo chegou-se até a 48 horas com amostras ainda positivas para a presença do
metronidazol, no de Stoltze (1992) o tempo máximo declarado foi de 36 horas.
As diferenças observadas entre os resultados dos dois estudos podem ser justificadas
pela concentração diferente do metronidazol das duas formulações, 25% na de Stoltze (1992)
e 15% neste estudo, além do método de amostragem ser diferente, visto que Stoltze (1992)
usava dois dentes diferentes para obter uma amostra de um determinado tempo, enquanto no
presente estudo foram usados dois PerioPapers
®
para a amostragem de um mesmo dente.
Outra diferença principal entre as formulações diz respeito à matriz que compõe os géis. Na
_____________________________________________________________________________ Discussão
91
formulação avaliada por Stoltze (1992), o gel era formado por uma mistura de gliceril mono-
oleato (GMO) e triglicerídios. Neste estudo, um poloxamer, o Lutrol
®
F 127, foi utilizado.
Esposito et al. (1996) compararam coincidentemente duas formulações para tratamento da
periodontite, uma contendo gliceril mono-oleato, e a outra contendo o mesmo poloxamer
usado no presente estudo. Apenas o fármaco-modelo adotado para esses géis foi outro, a
tetraciclina. Aplicaram os dois géis in vivo, na gengiva de dentes inferiores, cada gel de um
lado da boca, e verificaram o tempo de persistência dessas formulações na cavidade bucal. O
gel baseado em monoglicerídeos teve uma persistência de até 8 horas, enquanto que o gel de
poloxamer desapareceu completamente após 1 hora. As observações de maior persistência do
gel com veículo oleoso e menor com o gel de poloxamer contribuem para explicar as
diferenças entre os resultados obtidos por Stoltze (1992) e o presente estudo.
Os resultados obtidos em estudos realizados in vitro e in vivo podem ser discordantes.
Essas diferenças podem ser devidas principalmente à existência de fatores, conhecidos ou
não, que estão presentes nos organismos vivos, mas ausentes nos estudos laboratoriais. No
caso em questão, um aspecto que pode ter causado a diferença de resultados entre o estudo in
vitro realizado por Gabarra (2002) e o in vivo discutido neste trabalho é o pH do meio onde os
géis foram aplicados. O líquido utilizado como fluido gengival no trabalho de Gabarra (2002)
era saliva artificial, com pH neutro. Em um trabalho realizado com cães da raça beagle, foi
observado que o pH do fluido crevicular gengival se torna mais ácido na ocorrência da
periodontite induzida por amarrias (MUKHERJEE; DAS; PATEL, 1983). O que poderia ter
ocorrido no presente estudo é uma possível incompatibilidade do dispositivo testado com um
pH um pouco mais ácido da bolsa periodontal, instabilizando o sistema e encurtando o tempo
de permanência do gel dentro da bolsa, e conseqüentemente explicando o pequeno período de
persistência do metronidazol.
Além do pH, outras características do fluido crevicular gengival na presença de
_____________________________________________________________________________ Discussão
92
periodontite podem ter influenciado nos resultados. A composição do FCG envolve a
presença de enzimas. Dentre elas, por exemplo, uma que tem a concentração aumentada com
a periodontite é a aspartato-aminotransferase. O aumento na concentração dessa enzima
também foi verificado em cães com periodontite induzida experimentalmente (CHAMBERS
et al., 1984; COHEN et al., 1991). Uma maior concentração dessa ou de outras enzimas no
FCG pode também ser apontada como possível causa para uma eliminação mais acelerada do
gel de dentro das bolsas periodontais, com liberação mais rápida do fármaco do que quando
comparada à liberação desses sistemas in vitro.
O poloxamer teve sua concentração aumentada de 22%, do trabalho de Gabarra (2002),
para 30% neste trabalho porque previamente ficou demonstrado que um aumento na
concentração deste polímero fez com que a sua dissolução ocorresse de maneira mais lenta,
diminuindo a taxa de liberação do fármaco (MOORE et al., 2000). Dessa forma, a alteração
na formulação do gel foi empreendida na tentativa de melhorar sua retenção in vivo, que não
se mostrou favorável no estudo piloto efetuado com a concentração original de 22%. Outro
efeito positivo do aumento da concentração do Lutrol
®
F 127 foi o aumento da consistência
do gel, o que facilitou a aplicação do mesmo no interior das bolsas periodontais, deslocando o
FCG e ocupando o seu lugar com mais facilidade.
Apesar dos resultados da persistência do gel de metronidazol deste estudo terem sido
diferentes em comparação com os obtidos por Gabarra (2002), possivelmente pelas inúmeras
diferenças das bolsas periodontais reais em relação às artificiais e pelas características únicas
do fluido crevicular gengival, em comparação com a saliva artificial utilizada no estudo in
vitro, eles foram relativamente similares aos de Sosnik e Cohn (2004), que demonstraram que
uma formulação contendo o mesmo polímero, o Lutrol
®
F 127, e metronidazol a 0,005%
liberou in vitro todo o metronidazol presente em até dois dias. Esse mesmo período, de 48
horas, foi o tempo máximo para a detecção do metronidazol neste estudo também.
_____________________________________________________________________________ Discussão
93
A decisão de se fazer a dosagem do metronidazol no plasma sangüíneo ocorreu depois
que uma análise preliminar dos dados colhidos dos primeiros animais mostrou que não havia
diferenças entre os tratamentos, mas que havia uma melhora clínica observável em todos os
grupos, inclusive no controle negativo, que não deveria apresentá-la. Por isso, suspeitou-se
que algo poderia estar influenciando inclusive o grupo que não recebeu tratamento. Uma
hipótese formulada para isso foi a de que poderia estar ocorrendo uma absorção sistêmica do
metronidazol, e que ele assim estivesse agindo em todos os dentes, inclusive nos que não
foram tratados ativamente.
A dosagem do metronidazol no plasma sanguíneo realizada pela CLAE demonstrou
que, antes da aplicação do gel, não havia a presença do fármaco. Após 1 e 2 horas, o
metronidazol foi detectado, porém em baixas concentrações. A amostra tomada antes da
aplicação do gel serviu exatamente para demonstrar que não havia a possibilidade de o animal
já ter metronidazol no sangue antes do uso do gel. Como o fármaco apareceu somente nas
amostras de sangue tiradas após a aplicação do gel, a origem do metronidazol dosado no
plasma era provavelmente o gel testado.
Apesar dos resultados da dosagem do fármaco no plasma corresponderem a apenas um dos
animais testados e em apenas limitados tempos de colheita de sangue, houve alguma semelhança
com os resultados obtidos por Stoltze e Stellfeld (1992), que avaliaram a absorção sistêmica de
um gel de metronidazol a 25%. Observaram que o pico da concentração do fármaco no plasma
era de 0,58 µg/mL, média de 14 pacientes. O pico máximo atingido por um dos pacientes foi de
1,30 µg/mL após 6 horas da aplicação do gel. Esse pico máximo de concentração de um dos
pacientes é muito próximo da concentração obtida neste estudo, de 1,34 µg/mL, porém o tempo
de colheita foi após uma hora da aplicação do gel. Deve-se levar em consideração que, no estudo
presente, os dados apresentados referem-se a apenas um dos animais, o que limita o valor da
comparação com o estudo de Stoltze e Stellfeld (1992), que usou uma média de 14 indivíduos.
_____________________________________________________________________________ Discussão
94
Britt e Pohlod (1986) monitoraram pela CLAE as concentrações de metronidazol
obtidas no plasma e no fluido crevicular gengival após a ingestão oral de uma dose única de
250 mg de metronidazol. Observaram que as concentrações do fármaco eram sempre
superiores às do FCG, obtendo como pico da concentração no plasma 6,09 µg/mL após duas
horas da ingestão do metronidazol. Em nosso estudo, a concentração no plasma atingida foi
de 1,64 µg/mL após duas horas da aplicação do gel. Enquanto Britt e Pohlod (1986)
verificaram que as concentrações de metronidazol no sangue eram sempre superiores às
obtidas no FCG, no presente trabalho, pelo menos no tempo em que houve coincidência de
colheita de sangue e FCG (uma hora após o gel), encontrou-se uma concentração nas bolsas
periodontais (média de 29 bolsas = 24.307,37 µg/mL) muito superior à obtida no plasma
(resultado de um animal = 1,34 µg/mL). Dessa maneira, apesar das limitações dos resultados
da dosagem do metronidazol no plasma deste estudo, pode-se chegar a uma conclusão
semelhante à de Stoltze e Stellfeld (1992), que verificaram que altas doses de metronidazol
poderiam ser atingidas nas bolsas periodontais sem que provocassem uma alta concentração
do fármaco no plasma, com um dispositivo para liberação local de fármacos. Nesse caso,
haveria então uma vantagem do dispositivo de liberação local em comparação com o uso
sistêmico do metronidazol em se obter uma concentração alta do fármaco somente onde ela é
necessária, sem induzir altas concentrações no sangue, inferiores em comparação àquelas
obtidas após a ingestão oral do medicamento, representando uma maior segurança de uso do
sistema de liberação local.
Os resultados da profundidade de sondagem e nível de inserção relativo demonstraram
que não houve diferença significante entre os grupos de tratamento avaliados, tanto
experimentais (Gel e RAR+Gel) quanto controles positivo (RAR) e negativo (NT). Houve
apenas uma redução significante nas medidas desses dois parâmetros clínicos em função do
tempo em que as sondagens das bolsas periodontais foram realizadas, observáveis em todos
_____________________________________________________________________________ Discussão
95
os grupos de tratamento (experimentais e controles). Foi possível verificar pelos resultados
que o grupo RAR+Gel foi o que apresentou a maior redução na profundidade de sondagem (-
2,2 mm) e no nível de inserção relativo (-1,56 mm) quando foram subtraídas as diferenças
entre as medidas tomadas nos tempos 90 dias após os tratamentos e tempo inicial – baseline,
apesar dessas reduções não terem sido suficientes para aclamar a associação RAR+Gel como
a mais eficiente em relação aos outros grupos de tratamento.
No caso do parâmetro clínico sangramento à sondagem, não foram encontradas
diferenças entre os grupos de tratamento e nem foi observada redução do sangramento ao
longo do tempo, fato que ocorreu nos parâmetros profundidade de sondagem e nível de
inserção relativo. Essa ausência de melhora em função do tempo pode ser creditada em parte à
não realização de profilaxia dental nos cães durante o período experimental, o que manteve
um certo grau de inflamação gengival durante todo o tempo do estudo, o que pode ter
aumentado a propensão ao sangramento nos exames, mesmo após a realização dos
tratamentos.
A ausência de higiene dental nos animais deste estudo pode ser um fator limitante na
comparação com os resultados de estudos realizados em humanos, visto que estes a executam
diariamente. Por outro lado, considerando-se que o objetivo principal deste trabalho foi
comparar os grupos experimentais e controles entre si, para demonstrar se o gel era eficaz
como tratamento auxiliar ou equivalente à RAR, se a falta de higienização prejudicasse os
resultados, todos os tratamentos seriam afetados de maneira semelhante, inclusive os
controles.
Vários sistemas de liberação local contendo metronidazol para o tratamento da
periodontite foram avaliados na literatura, e dentre eles, os mais pesquisados foram
dispositivos acrílicos (ADDY et al., 1982; ADDY; LANGEROUDI, 1984; ADDY; ALAM;
RAWLE, 1984; ADDY; LANGEROUDI; HASSAN, 1985; ARONNA et al., 1998; YEUNG;
_____________________________________________________________________________ Discussão
96
NEWMAN; ADDY, 1983) e um gel de metronidazol com a matriz formada por
monoglicerídeos e concentração do fármaco igual a 25%, conhecido comercialmente como
Elyzol
®
(AINAMO et al., 1992; GRIFFITHS et al., 2000; HITZIG et al., 1994; JANSSON;
BRATTHALL; SODERHOLM, 2003; JANSSON et al., 2004; KLINGE et al., 1992a; LIE;
BRUUN; BÖE, 1998; NOYAN et al., 1997; PALMER; MATTHEWS; WILSON, 1998;
PEDRAZZOLI; KILIAN ; KARRING, 1992; RIEP; PURUCKER; BERNIMOULIN, 1999;
RUDHART et al., 1998; STELZEL; FLORÈS-DE-JACOBY, 1996, 2000).
Uma comparação direta dos resultados clínicos deste estudo com os existentes na
literatura não seria válida, visto que os estudos apresentam diferentes protocolos
experimentais e os parâmetros clínicos avaliados nem sempre são os mesmos. Os estudos
podem basicamente ser divididos em dois tipos, os estudos de equivalência, onde a
comparação é feita entre a raspagem e alisamento radicular versus o gel de metronidazol, e
estudos de associação, que consistem na comparação da raspagem e alisamento radicular
versus a raspagem combinada com o gel de metronidazol. Entre os estudos de equivalência, a
conclusão mais freqüente era a de que o tratamento com o gel de metronidazol era tão
eficiente quanto a RAR, obtendo-se com ambas as terapias reduções nas profundidades de
sondagem e no sangramento à sondagem (AINAMO et al., 1992; KLINGE et al., 1992b;
PEDRAZZOLI, KILIAN; KARRING, 1992; RUDHART et al., 1998; STELZEL; FLORÈS-
DE-JACOBY, 1996). Entre os estudos de associação do gel de metronidazol com a RAR, os
resultados obtidos demonstravam que a associação das terapias ou era mais eficiente que a
RAR realizada isoladamente (GRIFFITHS et al., 2000; HITZIG et al., 1994), ou tão eficiente
quanto a RAR (RIEP; PURUCKER; BERNIMOULIN, 1999) em reduzir a profundidade de
sondagem das bolsas periodontais, os níveis de inserção gengival e o sangramento à
sondagem. Alguns autores até encontraram diferenças significantes favoráveis à associação
das terapias, mas não souberam dizer se havia significância clínica na superioridade da
_____________________________________________________________________________ Discussão
97
associação em relação à RAR utilizada isoladamente (LIE; BRUUN; BÖE, 1998; STELZEL;
FLORÈS-DE-JACOBY, 2000).
Os trabalhos citados anteriormente avaliaram um sistema de liberação local utilizando
somente a raspagem e alisamento radicular como controle. A RAR, nesse caso, representa um
controle positivo, ou seja, um grupo onde normalmente são esperadas que ocorram mudanças,
atuando assim como um padrão contra o qual se podem comparar as diferenças obtidas nos
resultados de um novo tratamento. No caso da inclusão de um controle negativo, não são
esperadas nesse grupo mudanças em relação ao estado normal. O propósito de ser usar um
controle negativo é assegurar que um fator desconhecido não afete de maneira adversa os
indivíduos de um experimento, o que poderia levar a uma conclusão falso-positiva
(JOHNSON; BESSELSEN, 2002), ou seja, concluir erroneamente que um tratamento é
eficiente, sem saber se essa melhora ocorreu mesmo devido ao procedimento executado ou
devido a algum fator adicional não considerado.
Somente um estudo acrescentou um controle negativo, onde nenhuma terapia ativa foi
realizada para o tratamento da periodontite (NOYAN et al., 1997). Eles compararam quatro
grupos de tratamento em um mesmo indivíduo, sendo os grupos RAR apenas (controle
positivo), RAR associada ao gel de metronidazol, gel de metronidazol apenas e um grupo não
tratado (controle negativo). Os resultados do estudo de Noyan et al. (1997) demonstraram que
houve uma melhora significante nos parâmetros clínicos de todos os grupos onde foi realizada
alguma terapia, com exceção do grupo não tratado, onde não foi observada melhora clínica.
No presente estudo, no controle negativo, também foram observadas melhoras clínicas. Essa
melhora pode ter ocorrido também nesse grupo pela absorção sistêmica do metronidazol,
comprovada pela dosagem do plasma de um dos animais. Apesar da dose encontrada no
plasma ter sido baixa em comparação com as concentrações obtidas nos sítios onde foi
aplicado o gel, o metronidazol sistêmico pode ter tido alguma influência, não só no grupo
_____________________________________________________________________________ Discussão
98
controle negativo, promovendo algum grau de melhora neste grupo, como também em todos
os grupos de tratamento.
A absorção sistêmica do fármaco que, a princípio, foi projetado para ter somente ação
local, pode ter sido o fator que influenciou de forma positiva os resultados de todos os grupos
de tratamento. Isso explicaria o motivo da falta de diferença entre os tratamentos, com
alteração significante dos parâmetros clínicos profundidade de sondagem e nível de inserção
relativo ao longo do tempo, inclusive no grupo controle negativo, já que o metronidazol agiu
de forma igual em todos os sítios, tratados ativamente ou não.
Uma dúvida que ainda pode permanecer refere-se ao fato da melhora em função do
tempo: será que a melhora em função do tempo, que ocorreu em todos os grupos
experimentais, realmente ocorreu pelo efeito do metronidazol sistêmico absorvido, ou será
que essas reduções na profundidade das bolsas e níveis de inserção relativos ocorreriam
mesmo que nenhum tratamento fosse aplicado? Nesse ponto, um controle negativo verdadeiro
seria um grupo onde não houvesse a menor possibilidade de se haver contato com o fármaco-
teste, como em um estudo formado por grupos paralelos. O controle negativo, neste estudo,
não foi verdadeiramente negativo no sentido de que não representou um grupo sem tratamento
algum; houve, sim, um tratamento nesse grupo, sendo representado pelo efeito do
metronidazol absorvido sistemicamente. Por outro lado, se o controle negativo não foi
verdadeiramente negativo, de acordo com a sua definição, a sua presença nesse desenho
experimental foi fundamental para a detecção de um fator “estranho” que afetou o
experimento como um todo. Por esse prisma, cumpriu sua função adequadamente.
No caso da microbiota subgengival avaliada neste trabalho, o primeiro questionamento
poderia ser quanto à escolha do modelo animal adotado e validade das conclusões baseadas
nesse modelo. Vários modelos animais foram propostos para a realização de estudos na área
da Periodontia, como primatas (KORNMAN; HOLT; ROBERTSON, 1981), ratos, hamsters,
_____________________________________________________________________________ Discussão
99
cães (KORNMAN et al., 1981) e furões (WEINBERG; BRAL, 1999). Dentre eles, um dos
mais utilizados como modelo para avaliação de terapias para controlar a progressão da doença
periodontal é o cão, especialmente da raça beagle. As vantagens da utilização desse modelo
animal são a docilidade do temperamento, o que facilita seu manejo, a natural susceptibilidade
à periodontite desses animais e ainda porque a progressão em cães, tanto da gengivite como
da periodontite, é bastante semelhante ao que ocorre com humanos.
A Tabela 13 apresenta uma comparação das características da doença periodontal em cães e
humanos, tendo sido adaptada do estudo de Giannobile, Finkelman e Lynch (1994). Pode-se
observar que, no que diz respeito aos parâmetros clínicos, praticamente não há diferenças entre a
periodontite no homem e no animal. Quanto à microbiota, algumas diferenças entre as espécies de
microrganismos encontradas podem ser observadas.
Tabela 13 – Comparação das características clínicas e microbiológicas da doença periodontal
em cães e humanos
Parâmetro Cão Humano
• gengivite generalizada de
moderada a severa
• gengivite generalizada de leve a
severa
• sangramento à sondagem
generalizado
• sangramento à sondagem
generalizado
• placa supra e subgengival
generalizada
• placa supra e subgengival
generalizada
• cálculo supra e subgengival
generalizado
• cálculo supra e subgengival
generalizado
• perda óssea localizada ou
generalizada
• perda óssea localizada ou
generalizada
Clínico
• recessão gengival severa • geralmente com recessão gingival
Microbiológico
Biofilme
supragengival
predomínio de Gram-positivos,
incluindo A. viscos e
Streptococci
predomínio de Streptococci Gram-
positivos e Actinomyces
Biofilme
subgengival
predomínio de Gram-negativos
anaeróbios, incluindo P.
gingivalis,
F. nucleatum e Capnocytophaga
predomínio de Gram-negativos
anaeróbios, incluindo P. gingivalis,
A. actinomycetemcommitans,
B. forsythus*, P. intermedia e
E. corrodens
* atualmente Tannerella forsythensis
_____________________________________________________________________________ Discussão
100
Klinge et al. (1992a) avaliaram a administração tópica do metronidazol para tratamento
da periodontite induzida por meio de amarrias em cães da raça beagle. Analisando a
microbiota subgengival, observaram uma redução na proporção de bacilos pigmentados de
negro e espiroquetas após a terapêutica com metronidazol. Essa alteração demonstrada na
microbiota subgengival de cães também foi observada em humanos após o uso tópico de
metronidazol para tratamento da periodontite, acompanhada por um aumento na proporção de
espécies bacterianas não associadas à doença periodontal, como estreptococos
(PEDRAZZOLI; KILIAN; KARRING, 1992).
Desta forma, pode-se inferir que, mesmo que haja algumas diferenças entre a microbiota
subgengival dos cães e aquela dos humanos, as alterações que ocorrem na mesma após a
realização do tratamento da periodontite são semelhantes, podendo-se, deste modo, usar o cão
como um modelo animal válido para o teste de novas terapias para o tratamento da doença
periodontal.
Sabe-se que as doenças periodontais induzidas pela presença do biofilme dental, como
as gengivites e periodontites, são consideradas infecções mistas associadas com grupos
específicos de bactérias orais (ARMITAGE; RESEARCH, SCIENCE AND THERAPY
COMMITTEE OF THE AMERICAN ACADEMY OF PERIODONTOLOGY, 2003). Alguns
grupos de microrganismos foram comprovadamente caracterizados como tendo relação com
parâmetros clínicos utilizados para o diagnóstico da periodontite. Em estudo realizado por
Socransky et al. (1998), ficou demonstrado que as bactérias do complexo vermelho exibiram
uma forte associação com os parâmetros clínicos considerados mais significantes para o
diagnóstico da periodontite. A prevalência das bactérias do complexo vermelho era maior à
medida que aumentava a profundidade da bolsa periodontal. Além da profundidade de
sondagem, o complexo vermelho mostrou também forte associação com o sangramento à
sondagem.
_____________________________________________________________________________ Discussão
101
Dessa forma, a análise microbiológica é de valor inestimável na identificação dos
microrganismos não somente do complexo vermelho, mas de outros microrganismos também
relacionados às periodontites, permitindo assim que as alterações (melhora ou piora) nos
parâmetros clínicos sejam justificadas por mudanças na microbiota subgengival, que só
poderiam ser comprovadas por meio da análise microbiológica.
A análise microbiológica deste estudo foi realizada pela técnica da biologia molecular
que utiliza sondas de DNA para detecção de espécies bacterianas, a técnica da hibridização
DNA-DNA checkerboard. Essa técnica, inicialmente proposta por Socransky et al. (1994),
vem sendo utilizada em vários estudos científicos, especialmente na área da Periodontia. Os
métodos tradicionais de cultura, muitas vezes, subestimam parte da microbiota subgengival
devido à dificuldade de se cultivar bactérias anaeróbias e com altas exigências nutricionais.
Como o checkerboard utiliza apenas o DNA microbiano, as amostras podem ser estocadas
por períodos de tempo mais longos. Além disso, possibilita o diagnóstico de espécies de
difícil cultivo ou mesmo impossíveis de se cultivar em placas de ágar-sangue, como as
espiroquetas, importantes patógenos periodontais. Desta forma, consegue-se a avaliação de
um grande número de amostras de biofilme e de espécies bacterianas com rapidez, resultando
em uma grande quantidade de dados e, conseqüentemente, aumentando a potência desses
estudos.
Os resultados do exame microbiológico correspondem a apenas animais do gênero
masculino, apesar de não se ter verificado diferença na microbiota subgengival entre os sexos
em estudos feitos com humanos de diferentes grupos étnicos (DAROUT et al., 2002;
SCHENKEIN et al., 1993). É importante ressaltar também que os dados aqui apresentados
são referentes a apenas três animais, e que os resultados e conclusões tiradas referem-se a essa
pequena amostra.
_____________________________________________________________________________ Discussão
102
Os testes de independência entre as freqüências das diferentes espécies de
microrganismos e os tratamentos realizados demonstraram que não havia associação entre o
tratamento realizado e as freqüências de nenhuma das bactérias analisadas. Os resultados
microbiológicos reforçam a conclusão de que não houve diferenças significantes entre os
grupos de tratamento, fato observado nos resultados dos parâmetros clínicos profundidade de
sondagem e nível de inserção relativo.
Apesar das freqüências dos microrganismos não terem sido influenciadas pelo
tratamento realizado, foram encontradas diferenças significantes, para alguns microrganismos,
em relação ao tempo nos dois grupos onde foi usado o gel de metronidazol, ou seja, no grupo
RAR+Gel e no grupo Gel. No grupo RAR+Gel, foi detectada uma diferença estatisticamente
significante nas freqüências de 7 espécies bacterianas. Esses microrganismos foram 5 que
compõem o complexo amarelo (S. gordonii, S. intermedius, S. mitis, S. oralis, S. sanguinis),
uma bactéria do complexo verde (C. ochracea) e uma do complexo laranja (P. intemedia). No
grupo Gel, foi detectada diferença significante somente para o microrganismo P.
melaninogenica.
A comparação direta dos resultados microbiológicos deste trabalho com outros da
literatura não é possível por causa das diferentes técnicas microbiológicas empregadas, das
espécies de microrganismos consideradas, da forma como as terapias foram aplicadas ou por
causa dos diferentes tempos de observação e colheita de biofilme subgengival utilizadas
nesses estudos. Serão relatadas agora algumas diferenças e semelhanças com os resultados de
alguns estudos que avaliaram a microbiota subgengival após terapias que utilizaram a RAR
e/ou o metronidazol para tratamento da periodontite.
O estudo de Klinge et al. (1992a) testou uma pasta contendo 10% de metronidazol em
cães beagle com periodontite induzida experimentalmente. A pasta com metronidazol foi
aplicada em um dos lados da boca, e comparada com uma pasta placebo, aplicada do lado
_____________________________________________________________________________ Discussão
103
oposto no mesmo animal, sendo que as aplicações da pasta eram realizadas diariamente, duas
vezes ao dia, durante um mês. A cultura microbiológica foi realizada em apenas dois cães
durante o tempo da terapia, de um mês, com colheitas a cada semana. Demonstraram que
houve uma redução significante das espiroquetas e bactérias pigmentadas de preto, com
contagens de bactérias anaeróbias cerca de dez vezes menores nas bolsas tratadas com a pasta
contendo metronidazol em relação à pasta placebo.
As diferenças entre o trabalho anteriormente citado e este são várias. A técnica
microbiológica utilizada por Klinge et al. (1992a) foi a cultura, enquanto usamos a
identificação dos microrganismos por meio da técnica da hibridização DNA-DNA
checkerboard. Os tempos de colheita, que em nosso estudo chegaram a 90 dias, no de Klinge
et al. (1992a) se restringiram a um mês. A maior diferença foi certamente no regime de uso do
metronidazol local, já que em nosso estudo foi realizada uma única aplicação, justamente para
testar a duração e o efeito de uma dose única nos parâmetros clínicos e microbiológicos
analisados, enquanto que no deles houve a aplicação diária da pasta, duas vezes ao dia durante
um mês, o que certamente potencializou os efeitos do tratamento, gerando a redução
observada nas bactérias pigmentadas de preto. A P. intermedia e a P. melaninogenica, que
fazem parte do grupo dos bacteróides pigmentados de preto, foram microrganismos que em
nosso estudo tiveram uma alteração significante na freqüência de sítios infectados ao longo do
tempo, sendo a significância detectada no grupo Gel para a P. melaninogenica e no RAR+Gel
para a P. intermedia. Os nossos resultados, porém, foram opostos aos de Klinge et al. (1992a),
visto que, aos 7 dias de uso, tanto a P. intermedia quanto a P. melaninogenica tiveram um
aumento significante após 7 dias de tratamento em relação ao tempo inicial, em vez da
diminuição observada por Klinge et al. (1992a).
Foi observado em um estudo com cães que, após a realização de um procedimento de
raspagem supra e subgengival para remoção de cálculo e biofilme dental, em alguns animais,
_____________________________________________________________________________ Discussão
104
os níveis de bactérias pigmentadas de preto aumentavam em períodos tão curtos quanto
apenas um dia depois da profilaxia dental (BOYCE et al., 1995). O que pode ter ocorrido em
nosso estudo é que, depois do procedimento RAR+Gel, no caso da P. intermedia, ou somente
do gel, no caso da P. melaninogenica, como o metronidazol ficou por um curto período de
tempo na bolsa, conforme demonstrado pelos resultados da avaliação da persistência do
fármaco, os tratamentos podem ter exercido influência sobre os microrganismos por curto
espaço de tempo, resultando disso uma recolonização rápida dos sítios por bactérias, entre
elas as pigmentadas de preto, o que explicaria o rápido aumento dessas duas espécies
bacterianas ocorrido em apenas 7 dias. Some-se ainda o fato de que não foi realizada
higienização dental diária nos cães de nosso estudo, o que favoreceria ainda mais a velocidade
na ocorrência da colonização por esses microrganismos. A maior rapidez na progressão da
periodontite em cães foi descrita anteriormente por Hardham et al. (2005).
Apesar de ter sido observado esse aumento nas freqüências de duas espécies de
bactérias pigmentadas de preto nos grupos de tratamento onde o gel de metronidazol foi
utilizado, o que poderia indicar que os tratamentos mantiveram inalterado o quadro de
periodontite instalado, o que ocorreu em nosso estudo foi uma melhora clínica, com
diminuição da profundidade de sondagem e nível de inserção, além da diminuição do número
de espécies bacterianas detectáveis após 30 e 90 dias, inclusive dos bacteróides pigmentados
de preto. Outro possível sinal de que os tratamentos surtiram algum efeito na progressão da
doença periodontal foi o aumento significante, observado após 7 dias, na freqüência dos
estreptococos que compõem o complexo amarelo e da C. ochracea, do complexo verde,
ocorrido no grupo de tratamento RAR+Gel. Esse aumento também foi verificado logo após o
uso do metronidazol sistêmico em humanos (FERES et al., 2001). Esses microrganismos são
os primeiros colonizadores das bolsas periodontais, e seu aumento pode significar que a RAR,
associada ao gel de metronidazol, causou uma desorganização do biofilme subgengival antes
_____________________________________________________________________________ Discussão
105
estabelecido, demonstrando nessa colheita de 7 dias os indícios da formação de um novo
biofilme subgengival.
Outro aspecto digno de nota, observado neste estudo, foi a ausência de efeito da RAR
sobre as bactérias que compõem o complexo vermelho (P. gingivalis, T. denticola e T.
forsythensis). Foi demonstrado por Haffajee et al. (1997) que a terapia mecânica era capaz de
reduzir de maneira significante a presença das bactérias desse complexo, enquanto que em
nosso trabalho, no grupo onde apenas a RAR foi realizada, não foram encontradas diferenças
significantes nas freqüências de detecção desses microrganismos em função do tempo de
colheita das amostras. Essa aparente ausência de eficácia da RAR, pela falta de redução das
bactérias do complexo vermelho, poderia estar relacionada, também, à falta de higienização
dental diária nos cães deste estudo, como ocorre nos humanos, o que pode ter favorecido uma
recolonização mais rápida dos sítios raspados.
O aumento observado dos estreptococos do complexo amarelo e da C. ochracea, das
espécies de bacteróides pigmentados de preto, e a manutenção das bactérias do complexo
vermelho poderiam indicar que a periodontite iria progredir após os tratamentos
aparentemente insatisfatórios, já que um novo biofilme estava sendo formado rapidamente. O
que ocorreu, no entanto, foi a diminuição no número de espécies microbianas detectadas nos
tempos 30 e 90 dias. A explicação para a diminuição do número de espécies que colonizavam
os sítios subgengivais pode estar na redução da profundidade de sondagem obtida, já que uma
menor profundidade significaria um nicho menor que abrigaria menos bactérias, não
significando que as bolsas estão livres desses microrganismos, mas que eles não se encontram
em uma quantidade detectável pelo método microbiológico adotado.
Embora tenha ocorrido um aumento nas freqüências das espécies bacterianas associadas
com a doença periodontal aos 7 dias de observação, no presente caso representado pelos
bacteróides pigmentados de preto, e a manutenção da presença das bactérias do complexo
_____________________________________________________________________________ Discussão
106
vermelho ao longo dos 90 dias de estudo, a continuidade da presença de um microrganismo
na bolsa periodontal não significa que a doença deva persistir na sua progressão. Haffajee et
al. (1997) demonstraram que a raspagem e alisamento radicular pouco alterava a microbiota
subgengival, com exceção das bactérias do complexo vermelho. Apesar disso, o sucesso
clínico era obtido no tratamento da periodontite. A explicação postulada pelos autores para tal
fato resume-se em dois aspectos: a RAR altera o meio em que as espécies patogênicas
residem, diminuindo a inflamação e a profundidade das bolsas, o que afetaria a forma como
os microrganismos se relacionam com o hospedeiro; o outro aspecto é uma possível alteração
local ou sistêmica da resposta imune do hospedeiro, pela introdução de microrganismos nos
tecidos gengivais durante o procedimento de raspagem, o que poderia favorecer a produção de
anticorpos que protegeriam os tecidos periodontais.
Os resultados de um exame microbiológico não devem ser considerados como provas
definitivas de sucesso ou fracasso de uma terapia, mas como exames auxiliares, sendo que a
observação final de sucesso de uma terapia deve ser avaliada associando-se os achados
microbiológicos aos parâmetros clínicos obtidos e à magnitude da alteração, porque uma
melhora ou piora estatisticamente significante pode ser clinicamente irrelevante para o
paciente.
Outros estudos com um desenho experimental mais apropriado, como os grupos
paralelos, por exemplo, e novas formulações para o tratamento da periodontite com
capacidade adesiva podem representar uma possibilidade de se conseguir melhores resultados
com esses sistemas de liberação lenta de antimicrobianos no interior de bolsas periodontais.
7 Conclusões
____________________________________________________________________________ Conclusões
108
7 CONCLUSÕES
Após definida e validada a metodologia deste trabalho, em relação à avaliação dos
parâmetros propostos e dentro das condições experimentais adotadas neste estudo, pôde-se
chegar às seguintes conclusões:
a. o sistema de liberação de metronidazol, gel à base de poloxamer 407, não espelhou
os resultados obtidos no estudo preliminar in vitro em termos de tempo de retenção
do sistema na bolsa periodontal, posto que in vivo o fármaco foi detectado no fluido
crevicular gengival de cães pela CLAE por, no máximo, 48 horas;
b. no período de 90 dias de duração do estudo, foi observada melhora clínica pela
modificação dos parâmetros profundidade de sondagem (PS) e nível de inserção
relativo (NIR) em todos os grupos de tratamento, porém sem diferenças significantes
entre os grupos, tanto experimentais (RAR+Gel e Gel) quanto controles positivo
(RAR) e negativo (NT);
c. a análise microbiológica demonstrou que, após os tratamentos, houve uma alteração
significante na prevalência de algumas bactérias em função do tempo de colheita do
biofilme subgengival apenas nos grupos onde o gel foi aplicado (RAR+Gel e Gel),
apesar de não terem sido observadas diferenças nas prevalências quando comparados
os quatro tratamentos entre si.
Referências
____________________________________________________________________________ Referências
110
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and systemic antimicrobial therapy in guided tissue regeneration. Journal of Periodontology,
Chicago, v. 70, n. 3, p. 239-247, Mar. 1999.
Apêndices
_____________________________________________________________________________Apêndices
122
APÊNDICE A - Estudo piloto 1: Dosagem do metronidazol no fluido crevicular gengival
pela cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Para se determinar o método de amostragem do fluido crevicular gengival (FCG) e os
tempos para a realização das colheitas para a dosagem do metronidazol pela CLAE no FCG,
foi realizado um estudo inicial com um gel de metronidazol a 15%, formulação esta
desenvolvida no trabalho de Gabarra (2002) e considerada como a de melhor perfil de
liberação para esse fármaco, utilizando-se o poloxamer como a base para o gel. O teste foi
realizado em um cão do gênero feminino, cerca de 20 kg, idade aproximada de 9 anos, sem
raça definida. A Tabela A1 descreve a composição da formulação avaliada neste estudo
piloto.
Tabela A1 – Composição do gel de metronidazol testado, de acordo com a formulação
desenvolvida por Gabarra (2002)
Componentes Concentração (%)
Metronidazol 15,00
Poloxamer 407 (Lutrol
®
F 127) 22,00
Propilenoglicol 20,00
Metilparabeno 0,18
Propilparabeno 0,02
Água destilada qsp 100,00
O gel foi aplicado em 9 bolsas periodontais de um cão, formadas após a indução de
periodontite pela colocação de amarrias na região subgengival de 9 dentes, de acordo com a
_____________________________________________________________________________Apêndices
123
técnica utilizada por Nociti Júnior et al. (2001). O FCG foi colhido após 7, 14 e 30 dias,
tempo esse inicialmente proposto para o desenvolvimento do estudo.
A análise pela CLAE das amostras não evidenciou a presença do fármaco em
concentração capaz de ser detectada pelo método, ou seja, não havia traços do metronidazol
após 7, 14 e 30 dias da aplicação do gel.
A ausência do fármaco poderia ter duas origens: tempo de retenção na bolsa inferior aos
intervalos adotados ou método de colheita (cones de papel) inadequado.
Para testar a primeira hipótese, nova dosagem por CLAE foi realizada, desta vez após
dois dias da aplicação do gel, colhendo-se o FCG ainda com cones de papel. A análise
cromatográfica não demonstrou a presença do metronidazol nas amostras após dois dias da
aplicação do gel.
Com o resultado negativo nas dosagens por CLAE, várias modificações foram propostas
para tentar desenvolver uma metodologia que fosse adequada para amostragem e
determinação da concentração do fármaco no FCG:
• os tempos testados desta vez ficaram restritos a um dia e foram: imediatamente após a
aplicação do gel, 1 hora, 6 horas e 24 horas após o uso do gel;
• uso de tiras de papel absorvente esterilizadas (PerioPaper
®
) específicas para colheita
de amostras de FCG, em vez de cones de papel absorvente;
• formulação do gel: o gel proposto por Gabarra (2002) tinha 22% de poloxamer.
Testou-se agora uma concentração maior, igual a 30%, para verificar se a maior
consistência obtida favoreceria a retenção do gel nas bolsas periodontais, prolongando
o tempo de persistência do gel e retardando a liberação do fármaco nos sítios
subgengivais;
• meio para dissolução das amostras: foram avaliados a própria fase móvel (mistura de
metanol:água na proporção 30:70) e a solução salina (PBS).
_____________________________________________________________________________Apêndices
124
Os resultados obtidos estão na Tabela A2.
Tabela A2 – Concentração do metronidazol no FCG após a aplicação do gel em bolsas
periodontais, variando-se os fatores tempo, concentração de poloxamer no gel
e meio para dissolução das amostras
N°
amostra
Gel (% poloxamer) Meio
Tempo
(h)
Concentração de
metronidazol
(µg/mL de FCG)
1 22 salina 0 6927,27
2 30 salina 0 16900,00
3 22 fase móvel 0 1330,00
4 30 fase móvel 0 6270,83
5 22 salina 1 119,17
6 30 salina 1 186,83
7 22 fase móvel 1 2761,36
8 30 fase móvel 1 769,23
9 22 salina 6 202,70
10 30 salina 6 70,59
11 22 fase móvel 6 384,62
12 30 fase móvel 6 40,54
13 22 salina 24 0,00
14 30 salina 24 142,86
15 22 fase móvel 24 142,86
16 30 fase móvel 24 181,82
De acordo com os dados presentes na Tabela A2, independentemente das diferentes
condições experimentais avaliadas, conseguiu-se, afinal, determinar a presença do
metronidazol pela CLAE nas amostras de FCG após a alteração de várias condições
experimentais (tempos e meios de colheita, concentração do polímero) e utilizando-se das
tiras de papel absorvente em lugar dos cones de papel para colher o fluido gengival. Como
foram feitas apenas duas repetições para cada condição experimental, não foi possível dizer
estatisticamente qual condição foi superior (fase móvel ou salina, 22% ou 30% de
poloxamer). Com a experiência obtida nesses testes, entretanto, optou-se pela fase móvel
como meio para dissolução do fármaco presente nas amostras de FCG, por ser a mesma
_____________________________________________________________________________Apêndices
125
substância utilizada no cromatógrafo, o que pouparia tempo, já que não seria preciso diluir
novamente as amostras na fase móvel, procedimento este que seria necessário caso elas
fossem colhidas em solução salina, por exemplo. Quanto à concentração do polímero no gel,
optou-se pelo uso de 30% de poloxamer porque o gel se mostrou mais consistente com essa
concentração e capaz de vencer a resistência do fluxo do fluido crevicular gengival presente
na bolsa periodontal, preenchendo-a mais facilmente do que o de 22%, demasiadamente
fluido na temperatura de aplicação (5ºC) em comparação com o de 30%, além de se tentar
também prolongar o tempo de persistência do fármaco na bolsa por causa da maior rigidez do
gel.
O tempo máximo para colheita foi determinado por outro ensaio, onde as amostras
foram colhidas com 24 horas e 72 horas. No período de 72 horas, a CLAE não foi capaz de
detectar a presença do metronidazol nas amostras de FCG. Deste modo, o tempo máximo foi
definido abaixo de 72 horas, quando não se detectou mais o fármaco, realizando-se as
colheitas nos tempos imediatamente após a aplicação do gel, 1h, 6h, 24h e 48h.
_____________________________________________________________________________Apêndices
126
APÊNDICE B - Estudo piloto 2 - Microbiologia: Comparação da microbiota de
humanos com a de um cão pela técnica da hibridização DNA-DNA
checkerboard
Foi utilizado um cão sem raça definida, gênero feminino, idade aproximada de 9 anos
(estimada pelo veterinário), com cerca de 20 kg de peso. Ao exame bucal, o animal
apresentava muito cálculo dental e periodontite de ocorrência natural, com bolsas periodontais
presentes em alguns dentes (profundidades de sondagem não registradas).
O animal foi mantido por um mês em quarentena antes do início do experimento.
Durante esse período de quarentena do animal, paralelamente, foi feita a colheita do biofilme
subgengival de 4 pacientes humanos com periodontite, uma amostra por paciente (H1 a H4).
Após o período de quarentena do cão, foi realizada a colheita das amostras de 6 sítios
subgengivais do animal (C1 a C6).
Foram utilizados dois cones de papel esterilizados nº 45 para a colheita do biofilme
subgengival de cada sítio selecionado. Os dois cones com o material colhido foram colocados
no interior de um microtubo tipo Eppendorf com 1,0 mL de solução PBS esterilizada e as
amostras foram acondicionadas em uma caixa de isopor com gelo para o transporte até o
Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
onde as amostras foram processadas aproximadamente 30 minutos após a colheita do material
para serem analisadas posteriormente de acordo com a técnica da hibridização DNA-DNA
checkerboard.
_____________________________________________________________________________Apêndices
127
Na Tabela B1 estão os resultados da análise microbiológica realizada pela técnica do
checkerboard, onde estão comparadas as amostras de biofilme subgengival de humanos com
as do modelo animal adotado (cão).
Tabela B1 - Resultado da análise microbiológica das amostras humanas (H) e de cão (C) feita
pela técnica da hibridização DNA-DNA checkerboard
Amostras
Microrganismo
H1 H2 H3 H4 C1 C2 C3 C4 C5 C6
A. acetinomycetemcomitans a
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
Actinomyces israelii
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
A. acetinomycetemcomitans b
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
Actinomyces odontolyticus I
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
A. acetinomycetemcomitans c
0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
Actinomyces naeslundii I
0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
Tannerella forsythensis
1 4 2 5 0 0 2 1 3 0
Campylobacter rectus
2 3 2 4 1 2 4 2 3 2
Eubacterium nodatum
0 3 0 4 0 0 0 2 3 0
Eikenella corrodens
0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
Fusobacterium periodonticum
1 1 2 2 0 0 1 1 1 1
Fusobacterium nucleatum ss polymorphum
2 2 3 4 1 1 1 2 0 2
Gemella morbilorum
2 1 3 3 1 2 1 2 2 2
Neisseria mucosa
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Prevotella intermedia
0 5 0 5 0 1 1 2 4 1
Peptostreptococcus micros
0 0 1 1 0 0 1 0 2 0
Porphyromonas gingivalis
0 5 0 5 0 0 1 2 4 1
Prevotella melaninogenica
0 0 1 1 0 0 0 0 0 1
Prevotella nigrescens
0 1 1 1 0 0 0 0 1 0
Streptococcus constellatus
3 2 2 3 1 2 1 2 1 1
Streptococcus intermedius
1 1 2 2 1 2 0 2 0 1
Streptococcus anginosus
1 1 2 2 0 2 1 2 1 1
Streptococcus gordonii
0 1 3 2 2 3 1 2 1 2
Streptococcus oralis
0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
Streptococcus sanguinis
0 0 1 1 0 1 1 1 1 0
Streptococcus mitis
0 0 1 1 0 0 1 0 1 0
Selenomonas noxia
0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
Treponema denticola
2 4 3 5 1 2 1 3 2 2
Veillonella parvula
0 0 1 1 0 1 1 1 1 1
Legenda: 0 = ausente; 1 = ~10
5
células bacterianas; 2 = 10
5
células; 3 = entre 10
5
e 10
6
células; 4 = 10
6
células; 5 =
acima de 10
6
células
_____________________________________________________________________________Apêndices
128
Os resultados obtidos demonstraram que, apesar das sondas terem sido desenvolvidas para
estudo de microrganismos comumente encontrados na microbiota subgengival de humanos,
houve detecção desses microrganismos também nas amostras subgengivais do cão avaliado.
Dessa forma, demonstrou-se que as sondas usadas na técnica da hibridização do DNA-
DNA checkerboard poderiam ser utilizadas no estudo da microbiota subgengival do cão como
modelo animal da periodontite.
_____________________________________________________________________________Apêndices
129
APÊNDICE C – Quadros demonstrativos da análise estatística realizada, gerados pelos
programa SPSS
1 PROFUNDIDADE DE SONDAGEM
Mixed Model Analysis - Profundidade de sondagem
Fixed Effects
Type III Tests of Fixed Effects(a)
Source Numerator df Denominator df F Sig.
Intercept
1 48,068 1218,492
,000
Tratamento
3 48,037 ,810
,494
Tempo
3 41,135 81,337
,000
Tratamento * Tempo
9 41,087 1,553
,162
a Dependent Variable: Profundidade de bolsa.
Tempo
Pairwise Comparisons(b)
(I) Tempo (J) Tempo
Mean
Difference
(I-J) Std. Error df
Sig.(a)
95% Confidence
Interval for
Difference(a)
Lower
Bound
Upper
Bound
T0 - baseline T1 - 7 dias 1,034(*) ,078 50,000
,000
,820 1,248
T2 - 30 dias
1,503(*) ,107 50,000
,000
1,211 1,795
T3 - 90 dias
1,485(*) ,131 36,530
,000
1,120 1,850
T1 - 7 dias T0 - baseline
-1,034(*) ,078 50,000
,000
-1,248 -,820
T2 - 30 dias
,469(*) ,088 50,000
,000
,229 ,710
T3 - 90 dias ,452(*) ,119 34,805
,003
,119 ,784
T2 - 30 dias T0 - baseline
-1,503(*) ,107 50,000
,000
-1,795 -1,211
T1 - 7 dias
-,469(*) ,088 50,000
,000
-,710 -,229
T3 - 90 dias
-,018 ,110 32,138
1,000
-,325 ,290
T3 - 90 dias T0 - baseline
-1,485(*) ,131 36,530
,000
-1,850 -1,120
T1 - 7 dias -,452(*) ,119 34,805
,003
-,784 -,119
T2 - 30 dias
,018 ,110 32,138
1,000
-,290 ,325
Based on estimated marginal means
* The mean difference is significant at the ,05 level.
a Adjustment for multiple comparisons: Sidak.
b Dependent Variable: Profundidade de bolsa.
_____________________________________________________________________________Apêndices
130
2 NÍVEL DE INSERÇÃO RELATIVO
Mixed Model Analysis - Nível de inserção relativo
Fixed Effects
Type III Tests of Fixed Effects(a)
Source Numerator df Denominator df F
Sig.
Intercept
1 5,197 676,178
,000
Tratamento
3 47,454 ,731
,539
Tempo
3 44,447 55,446
,000
Tratamento * Tempo
9 44,377 1,348
,240
a Dependent Variable: Nível de inserção genvival.
Tempo
Pairwise Comparisons(b)
(I) Tempo (J) Tempo
Mean
Difference
(I-J) Std. Error df
Sig.(a)
95% Confidence
Interval for
Difference(a)
Lower
Bound
Upper
Bound
T0 - baseline T1 - 7 dias ,600(*) ,085 50,000
,000
,365 ,834
T2 - 30 dias
,974(*) ,095 50,000
,000
,712 1,235
T3 - 90 dias
1,210(*) ,119 36,609
,000
,879 1,541
T1 - 7 dias T0 - baseline
-,600(*) ,085 50,000
,000
-,834 -,365
T2 - 30 dias
,374(*) ,101 50,000
,003
,098 ,650
T3 - 90 dias ,610(*) ,149 42,045
,001
,198 1,023
T2 - 30 dias T0 - baseline
-,974(*) ,095 50,000
,000
-1,235 -,712
T1 - 7 dias
-,374(*) ,101 50,000
,003
-,650 -,098
T3 - 90 dias
,236 ,109 36,734
,205
-,068 ,540
T3 - 90 dias T0 - baseline
-1,210(*) ,119 36,609
,000
-1,541 -,879
T1 - 7 dias -,610(*) ,149 42,045
,001
-1,023 -,198
T2 - 30 dias
-,236 ,109 36,734
,205
-,540 ,068
Based on estimated marginal means
* The mean difference is significant at the ,05 level.
a Adjustment for multiple comparisons: Sidak.
b Dependent Variable: Nível de inserção genvival.
_____________________________________________________________________________Apêndices
131
3 SANGRAMENTO À SONDAGEM
Estatística Cramer’s V - Sangramento à sondagem x tratamentos
(T0 - baseline)
Tratamento
RAR+GEL RAR GEL NT
Total
Sangramento à
sondagem
Sangramento
14 14 15 11 54
Total
14 14 15 11 54
No statistics are computed because Sangramento à sondagem is a constant.
Estatística Cramer’s V - Sangramento à sondagem x tratamentos
(T1 - 7 dias)
Tratamento
RAR+GEL RAR GEL NT
Total
Sem sangramento
4 2 3 1 10
Sangramento à
sondagem
Sangramento
10 12 12 10 44
Total
14 14 15 11 54
Cramer’s V = 0,181, p = 0,621
Estatística Cramer’s V - Sangramento à sondagem x tratamentos
(T2 - 30 dias)
Tratamento
RAR+GEL RAR GEL NT
Total
Sem sangramento
3 2 0 1 6
Sangramento à
sondagem
Sangramento
11 12 15 10 48
Total
14 14 15 11 54
Cramer’s V =0,257, p = 0,312
Estatística Cramer’s V - Sangramento à sondagem x tratamentos
(T3 - 90 dias)
Tratamento
RAR+GEL RAR GEL NT
Total
Sem sangramento
0 0 1 1 2
Sangramento à
sondagem
Sangramento
9 9 8 5 31
Total
9 9 9 6 33
Cramer’s V = 0,289, p = 0,432
_____________________________________________________________________________Apêndices
132
Teste Q de Cochran - comparação de tempos no tratamento RAR+Gel
Value
RAR+Gel
0 1
T0 - baseline:
Profundidade de bolsa
0 9
T1 - 7 dias:
Profundidade de bolsa
3 6
T2 - 30 dias:
Profundidade de bolsa
1 8
T3 - 90 dias:
Profundidade de bolsa
0 9
N (RAR+Gel)
9
Cochran's Q
7,200(a)
df
3
Asymp. Sig.
,066
Sangramento à sondagem - comparação de tempos no tratamento RAR
Value
RAR
0 1
T0 - baseline:
Profundidade de bolsa
0 9
T1 - 7 dias:
Profundidade de bolsa
2 7
T2 - 30 dias:
Profundidade de bolsa
1 8
T3 - 90 dias:
Profundidade de bolsa
0 9
N (RAR)
9
Cochran's Q
4,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,194
Sangramento à sondagem - comparação de tempos no tratamento Gel
Value
Gel
0 1
T0 - baseline:
Profundidade de bolsa
0 9
T1 - 7 dias:
Profundidade de bolsa
1 8
T2 - 30 dias:
Profundidade de bolsa
0 9
T3 - 90 dias:
Profundidade de bolsa
1 8
N (Gel)
9
Cochran's Q
2,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,572
Sangramento à sondagem - comparação de tempos no tratamento NT
Value
0 1
T0 - baseline:
Profundidade de bolsa
0 6
T1 - 7 dias:
Profundidade de bolsa
0 6
T2 - 30 dias:
Profundidade de bolsa
1 5
T3 - 90 dias:
Profundidade de bolsa
1 5
N (NT)
6
Cochran's Q
2,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,572
_____________________________________________________________________________Apêndices
133
4 MICROBIOLÓGICO
Obs.: os microrganismos que não foram demonstrados apresentaram-se ausentes de todas as
amostras, por isso a estatística não foi calculada
Cramer's V para associação entre as freqüências de
microrganismos e tratamentos - T0 - baseline
C. ochracea * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 4 5 2 17
C. ochracea
positivo
0 2 1 1 4
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
C. rectus * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
4 3 3 2 12
C. rectus
positivo
2 2 3 1 8
Total
6 5 6 3 20
V = 0,144, p = 0,937
E. corrodens * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 6 5 3 19
E. corrodens
positivo
1 0 1 0 2
Total
6 6 6 3 21
V = 0,281, p = 0,646
E. nodatum * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 5 3 20
E. nodatum
positivo
0 0 1 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
F. nuc. nucl. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 4 5 2 16
F. nuc.
nucl.
positivo
1 2 1 1 5
Total
6 6 6 3 21
V = 0,194, p = 0,852
_____________________________________________________________________________Apêndices
134
F. nuc. polym. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 4 5 2 16
F. nuc.
polym.
positivo
1 2 1 1 5
Total
6 6 6 3 21
V = 0,194, p = 0,852
P. gingivalis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 5 3 20
P. gingivalis
positivo
0 0 1 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
P. interm * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 5 3 20
P. interm
positivo
0 0 1 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
P. melannog * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 3 6 2 16
P. melannog
positivo
1 3 0 1 5
Total
6 6 6 3 21
V = 0,461, p = 0,216
P. nigrescesn * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
P. nigrescesn negativo
6 6 6 3 21
Total
6 6 6 3 21
a No statistics are computed because P. nigrescesn is a constant.
S. gordon * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 5 5 2 18
S. gordon
positivo
0 1 1 1 3
Total
6 6 6 3 21
V = 0,304, p = 0,584
_____________________________________________________________________________Apêndices
135
S. mitis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 6 2 20
S. mitis
positivo
0 0 0 1 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,548, p = 0,098
S. oralis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 5 5 2 18
S. oralis
positivo
0 1 1 1 3
Total
6 6 6 3 21
V = 0,304, p = 0,584
S. sanguis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 5 5 2 18
S. sanguis
positivo
0 1 1 1 3
Total
6 6 6 3 21
V = 0,304, p = 0,584
T. denticola * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 4 5 2 17
T. denticola
positivo
0 2 1 1 4
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
Cramer's V para associação entre as freqüências de
microrganismos e tratamentos - T1 - 7 dias
A. gerencs. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
4 5 5 3 17
A. gerencs.
positivo
2 1 1 0 4
Total
6 6 6 3 21
V = 0,271, p = 0,672
Aaa * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
4 5 4 3 16
Aaa
positivo
2 1 2 0 5
Total
6 6 6 3 21
V = 0,285, p = 0,636
_____________________________________________________________________________Apêndices
136
Aab * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 5 3 20
Aab
positivo
0 0 1 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
C. gingiv. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 5 4 3 17
C. gingiv.
positivo
1 1 2 0 4
Total
6 6 6 3 21
V = 0,271, p = 0,672
C. ochracea * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 2 14
C. ochracea
positivo
3 1 2 1 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,267, p = 0,682
C. rectus * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 5 6 3 20
C. rectus
positivo
0 1 0 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
E. corrodens * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 2 14
E. corrodens
positivo
3 1 2 1 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,267, p = 0,682
F. nuc. nucl. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 4 4 2 13
F. nuc.
nucl.
positivo
3 2 2 1 8
Total
6 6 6 3 21
V = 0,155, p = 0,918
_____________________________________________________________________________Apêndices
137
F. nuc. polym. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 2 3 2 10
F. nuc.
polym.
positivo
3 3 14 11
Total
6 66 3 21
V = 0,213, p = 0,812
P. gingivalis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 4 4 3 14
P. gingivalis
positivo
3 2 02 7
Total
6 6 3 21 6
V = 0,327, p = 0,522
P. interm * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 3 15
P. interm
positivo
3 1 2 0 6
Total
6 6 6 3 21
V = 0,380, p = 0,387
P. melannog * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
2 4 3 3 12
P. melannog
positivo
4 2 3 0 9
Total
6 6 6 3 21
V = 0,436, p = 0,263
S. gordon * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 6 4 3 16
S. gordon
positivo
3 0 2 0 5
Total
6 6 6 3 21
v = 0,506, p = 0,146
S. interme * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 3 15
S. interme
positivo
3 1 2 0 6
Total
6 6 6 3 21
V = 0,380, p = 0,387
_____________________________________________________________________________Apêndices
138
S. mitis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 2 14
S. mitis
positivo
3 1 2 1 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,267, p = 0,682
S. oralis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 5 4 3 15
S. oralis
positivo
3 1 2 0 6
Total
6 6 6 3 21
V = 0,380, p = 0,387
S. sanguis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
3 4 4 3 14
S. sanguis
positivo
3 2 2 0 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,327, p = 0,522
T. denticola * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
2 5 4 2 13
T. denticola
positivo
4 1 2 1 8
Total
6 6 6 3 21
V = 0,389, p = 0,343
Cramer's V para associação entre as freqüências de
microrganismos e tratamentos - T2 - 30 dias
C. rectus * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
2 0 0 0 2
C. rectus
positivo
3 3 4 1 11
Total
5 3 4 1 13
V = 0,539, p = 0,286
_____________________________________________________________________________Apêndices
139
E. corrodens * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
4 5 4 1 14
E. corrodens
positivo
2 1 2 2 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,327, p = 0,522
F. nuc. polym. * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 5 4 3 18
F. nuc.
polym.
positivo
0 1 2 0 3
Total
6 6 6 3 21
V = 0,397, p = 0,347
P. gingivalis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 4 5 3 18
P. gingivalis
positivo
0 2 1 0 3
Total
6 6 6 3 21
V = 0,397, p = 0,347
T. denticola * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
4 3 6 2 15
T. denticola
positivo
2 3 0 1 6
Total
6 6 6 3 21
V = 0,428, p = 0,287
V. parvula * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 4 6 3 19
V. parvula
positivo
0 2 0 0 2
Total
6 6 6 3 21
V = 0,513, p = 0,137
Cramer's V para associação entre as freqüências de
microrganismos e tratamentos - T3 - 90 dias
_____________________________________________________________________________Apêndices
140
C. rectus * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 3 3 1 13
C. rectus
positivo
0 3 3 2 8
Total
6 6 6 3 21
V = 0,510, p = 0,142
E. corrodens * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 6 6 3 20
E. corrodens
positivo
1 0 0 0 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,354, p = 0,453
P. gingivalis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 2 5 2 14
P. gingivalis
positivo
1 4 1 1 7
Total
6 6 6 3 21
V = 0,463, p = 0,212
P. melannog * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 6 6 2 19
P. melannog
positivo
1 0 0 1 2
Total
6 6 6 3 21
V = 0,414, p = 0,309
S. sanguis * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
6 6 6 2 20
S. sanguis
positivo
0 0 0 1 1
Total
6 6 6 3 21
V = 0,548, p = 0,098
T. denticola * Tratamento
Tratamento
RAP+GEL RAP GEL NT
Total
negativo
5 1 4 1 11
T. denticola
positivo
1 5 2 2 10
Total
6 6 6 3 21
V = 0,548, p = 0,098
_____________________________________________________________________________Apêndices
141
Teste Q de Cochran - comparação dos tempos no tratamento
RAR+Gel
Obs.: os microrganismos que não forem representados estão ausentes de todas as amostras,
e portanto a estatística não foi realizada
Value
A. gerencseriae
0 1
v1.30 dias: A gerenc
6 0
v1.7 dias: A gerenc
4 2
v1.90 dias: A gerenc
6 0
v1.Antes do tratam.:
A gerenc
6 0
N (A. ger.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
Aaa
0 1
Aaa.30 dias: Aaa
6 0
Aaa.7 dias: Aaa
4 2
Aaa.90 dias: Aaa
6 0
Aaa.Antes do tratam.: Aaa
6 0
N (Aaa)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
C. ging.
0 1
v5.30 dias: C ging
6 0
v5.7 dias: C ging
5 1
v5.90 dias: C ging
6 0
v5.Antes do
tratam.: C ging
6 0
N (C. ging.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
C. ochracea
0 1
v6.30 dias: C ochracea
6 0
v6.7 dias: C ochracea
3 3
v6.90 dias: C ochracea
6 0
v6.Antes do tratam.: C
ochracea
6 0
N (C. ochr.)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
C. rectus Value
0 1
v7.30 dias: C rectus 2 3
v7.7 dias: C rectus 5 0
v7.90 dias: C rectus 5 0
v7.Antes do tratam.:
C rectus
3 2
N (C. rectus)
5
Cochran's Q
5,400(a)
df
3
Asymp. Sig.
,145
_____________________________________________________________________________Apêndices
142
Value
E. corrod.
0 1
v9.30 dias: E corrod
4 2
v9.7 dias: E corrod
3 3
v9.90 dias: E corrod
5 1
v9.Antes do tratam.:
E corrod
5 1
Value
F. nuc. nuc.
0 1
v11.30 dias: F nuc nuc
6 0
v11.7 dias: F nuc nuc
3 3
v11.90 dias: F nuc nuc
6 0
v11.Antes do tratam.: F
nuc nuc
5 1
Value
F. nuc. poly.
0 1
v12.30 dias: F nuc poly
6 0
v12.7 dias: F nuc poly
3 3
v12.90 dias: F nuc poly
6 0
v12.Antes do tratam.: F
nuc poly
5 1
Value
P. ging.
0 1
v17.30 dias: P gingivalis
6 0
v17.7 dias: P gingivalis
3 3
v17.90 dias: P gingivalis
5 1
v17.Antes do tratam.: P
gingivalis
6 0
Value
P. interm.
0 1
v18.30 dias: P interm
6 0
v18.7 dias: P interm
3 3
v18.90 dias: P interm
6 0
v18.Antes do tratam.:
P interm
6 0
P. melanin. Value
0 1
v19.30 dias: P melannog 6 0
v19.7 dias: P melannog 2 4
v19.90 dias: P melannog 5 1
v19.Antes do tratam.: P
melannog
5 1
N (E. corr.)
6
Cochran's Q
2,538(a)
df
3
Asymp. Sig.
,468
N (F. nuc. nuc)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
N (F. nuc. pol)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
N (P. ging.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
N (P. interm.)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (P. melan.)
6
Cochran's Q
7,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,052
_____________________________________________________________________________Apêndices
143
Value
S. gordon.
0 1
v23.30 dias: S gordon
6 0
v23.7 dias: S gordon
3 3
v23.90 dias: S gordon
6 0
v23.Antes do tratam.:
S gordon
6 0
Value
S. interm.
0 1
v24.30 dias: S interme
6 0
v24.7 dias: S interme
3 3
v24.90 dias: S interme
6 0
v24.Antes do tratam.: S
interme
6 0
Value
S. mitis
0 1
v25.30 dias: S mitis
6 0
v25.7 dias: S mitis
3 3
v25.90 dias: S mitis
6 0
v25.Antes do
tratam.: S mitis
6 0
Value
S. oralis
0 1
v27.30 dias: S oralis
6 0
v27.7 dias: S oralis
3 3
v27.90 dias: S oralis
6 0
v27.Antes do tratam.:
S oralis
6 0
Value
S. sanguinis
0 1
v28.30 dias: S sanguis
6 0
v28.7 dias: S sanguis
3 3
v28.90 dias: S sanguis
6 0
v28.Antes do tratam.: S
sanguis
6 0
T. denticola Value
0 1
v29.30 dias: T denticola 4 2
v29.7 dias: T denticola 2 4
v29.90 dias: T denticola 5 1
v29.Antes do tratam.: T
denticola
6 0
N (S. gordon.)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (S. interm.)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (S. mitis)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (S. oralis)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (S. sang)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
N (T. dentic.)
6
Cochran's Q
6,176(a)
df
3
Asymp. Sig.
,103
_____________________________________________________________________________Apêndices
144
Teste Q de Cochran - comparação dos tempos no tratamento RAR
Value
A. gerenc.
0 1
v1.30 dias: A gerenc
6 0
v1.7 dias: A gerenc
5 1
v1.90 dias: A gerenc
6 0
v1.Antes do tratam.:
A gerenc
6 0
N (A. gerenc)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
Aaa
0 1
Aaa.30 dias: Aaa
6 0
Aaa.7 dias: Aaa
5 1
Aaa.90 dias: Aaa
6 0
Aaa.Antes do tratam.: Aaa
6 0
N (Aaa)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
C. gingivalis
0 1
v5.30 dias: C ging
6 0
v5.7 dias: C ging
5 1
v5.90 dias: C ging
6 0
v5.Antes do
tratam.: C ging
6 0
N (C. gingiv.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
C. ochracea
0 1
v6.30 dias: C ochracea
6 0
v6.7 dias: C ochracea
5 1
v6.90 dias: C ochracea
6 0
v6.Antes do tratam.: C
ochracea
4 2
N (C. ochr.)
6
Cochran's Q
4,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,194
Value
C. rectus
0 1
v7.30 dias: C rectus
0 3
v7.7 dias: C rectus
2 1
v7.90 dias: C rectus
2 1
v7.Antes do tratam.:
C rectus
1 2
N (C. rectus)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
_____________________________________________________________________________Apêndices
145
Value
E. corrod.
0 1
v9.30 dias: E corrod
5 1
v9.7 dias: E corrod
5 1
v9.90 dias: E corrod
6 0
v9.Antes do tratam.:
E corrod
6 0
Value
F. nuc. nuc.
0 1
v11.30 dias: F nuc nuc
6 0
v11.7 dias: F nuc nuc
4 2
v11.90 dias: F nuc nuc
6 0
v11.Antes do tratam.: F
nuc nuc
4 2
Value
F. nuc. poly.
0 1
v12.30 dias: F nuc poly
5 1
v12.7 dias: F nuc poly
2 4
v12.90 dias: F nuc poly
6 0
v12.Antes do tratam.: F
nuc poly
4 2
Value
P. gingivalis
0 1
v17.30 dias: P gingivalis
4 2
v17.7 dias: P gingivalis
4 2
v17.90 dias: P gingivalis
2 4
v17.Antes do tratam.: P
gingivalis
6 0
Value
P. intermedia
0 1
v18.30 dias: P interm
6 0
v18.7 dias: P interm
5 1
v18.90 dias: P interm
6 0
v18.Antes do tratam.:
P interm
6 0
P. melaninogenica Value
0 1
v19.30 dias: P melannog 6 0
v19.7 dias: P melannog 4 2
v19.90 dias: P melannog 6 0
v19.Antes do tratam.: P
melannog
3 3
N (E. corrod.)
6
Cochran's Q
2,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,572
N (F. nuc. nuc.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
N (F. nuc. poly.)
6
Cochran's Q
7,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,072
N (P. ging.)
6
Cochran's Q
5,333(a)
df
3
Asymp. Sig.
,149
N (P. interm.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (P.melan.)
6
Cochran's Q
6,231(a)
df
3
Asymp. Sig.
,101
_____________________________________________________________________________Apêndices
146
Value
S. gordonii
0 1
v23.30 dias: S gordon
6 0
v23.7 dias: S gordon
6 0
v23.90 dias: S gordon
6 0
v23.Antes do tratam.:
S gordon
5 1
N (S. gordon.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
S. interm.
0 1
v24.30 dias: S interme
6 0
v24.7 dias: S interme
5 1
v24.90 dias: S interme
6 0
v24.Antes do tratam.: S
interme
6 0
N (S. interm.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
S. mitis
0 1
v25.30 dias: S mitis
6 0
v25.7 dias: S mitis
5 1
v25.90 dias: S mitis
6 0
v25.Antes do
tratam.: S mitis
6 0
N (S. mitis)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
S. oralis
0 1
v27.30 dias: S oralis
6 0
v27.7 dias: S oralis
5 1
v27.90 dias: S oralis
6 0
v27.Antes do tratam.:
S oralis
5 1
N (S. oralis)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
S. sanguinis
0 1
v28.30 dias: S sanguis
6 0
v28.7 dias: S sanguis
4 2
v28.90 dias: S sanguis
6 0
v28.Antes do tratam.: S
sanguis
5 1
N (S. sang.)
6
Cochran's Q
4,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,194
_____________________________________________________________________________Apêndices
147
Value
T. denticola
0 1
v29.30 dias: T denticola
3 3
v29.7 dias: T denticola
5 1
v29.90 dias: T denticola
1 5
v29.Antes do tratam.: T
denticola
4 2
N (T. dent.)
6
Cochran's Q
6,176(a)
df
3
Asymp. Sig.
,103
Value
V. parvula
0 1
v31.30 dias: V parvula
4 2
v31.7 dias: V parvula
6 0
v31.90 dias: V parvula
6 0
v31.Antes do tratam.:
V parvula
6 0
N (V. parv.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Teste Q de Cochran - comparação dos tempos no tratamento Gel
Value
A. gerencs.
0 1
v1.30 dias: A gerenc
6 0
v1.7 dias: A gerenc
5 1
v1.90 dias: A gerenc
6 0
v1.Antes do tratam.:
A gerenc
6 0
N (A. gerec.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
Aaa
0 1
Aaa.30 dias: Aaa
6 0
Aaa.7 dias: Aaa
4 2
Aaa.90 dias: Aaa
6 0
Aaa.Antes do tratam.: Aaa
6 0
N (Aaa)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
Aab
0 1
Aab.30 dias: Aab
6 0
Aab.7 dias: Aab
5 1
Aab.90 dias: Aab
6 0
Aab.Antes do tratam.: Aab
6 0
N (Aab)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
_____________________________________________________________________________Apêndices
148
Value
C. gingivalis
0 1
v5.30 dias: C ging
6 0
v5.7 dias: C ging
4 2
v5.90 dias: C ging
6 0
v5.Antes do
tratam.: C ging
6 0
N (C. ging.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
C. ochracea
0 1
v6.30 dias: C ochracea
6 0
v6.7 dias: C ochracea
4 2
v6.90 dias: C ochracea
6 0
v6.Antes do tratam.: C
ochracea
5 1
N (C. ochr.)
6
Cochran's Q
3,667(a)
df
3
Asymp. Sig.
,300
Value
C. rectus
0 1
v7.30 dias: C rectus
0 4
v7.7 dias: C rectus
4 0
v7.90 dias: C rectus
3 1
v7.Antes do tratam.:
C rectus
1 3
N (C. rectus)
4
Cochran's Q
7,500(a)
df
3
Asymp. Sig.
,058
Value
E. corrodens
0 1
v9.30 dias: E corrod
4 2
v9.7 dias: E corrod
4 2
v9.90 dias: E corrod
6 0
v9.Antes do tratam.:
E corrod
5 1
N (E. corrod.)
6
Cochran's Q
2,538(a)
df
3
Asymp. Sig.
,468
Value
E. nodatum
0 1
v10.30 dias: E nodat
6 0
v10.7 dias: E nodat
6 0
v10.90 dias: E nodat
6 0
v10.Antes do tratam.:
E nodat
5 1
N (E. nod.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
_____________________________________________________________________________Apêndices
149
Value
F. nuc. nuc.
0 1
v11.30 dias: F nuc nuc
6 0
v11.7 dias: F nuc nuc
4 2
v11.90 dias: F nuc nuc
6 0
v11.Antes do tratam.: F
nuc nuc
5 1
N (F. nuc. nuc.)
6
Cochran's Q
3,667(a)
df
3
Asymp. Sig.
,300
Value
F. nuc. poly.
0 1
v12.30 dias: F nuc poly
4 2
v12.7 dias: F nuc poly
3 3
v12.90 dias: F nuc poly
6 0
v12.Antes do tratam.: F
nuc poly
5 1
N (F. nuc. poly)
6
Cochran's Q
3,750(a)
df
3
Asymp. Sig.
,290
Value
P. gingivalis
0 1
v17.30 dias: P gingivalis
5 1
v17.7 dias: P gingivalis
4 2
v17.90 dias: P gingivalis
5 1
v17.Antes do tratam.: P
gingivalis
5 1
N (P. ging.)
6
Cochran's Q
,692(a)
df
3
Asymp. Sig.
,875
Value
P. intermedia
0 1
v18.30 dias: P interm
6 0
v18.7 dias: P interm
4 2
v18.90 dias: P interm
6 0
v18.Antes do tratam.:
P interm
5 1
N (P. interm.)
6
Cochran's Q
3,667(a)
df
3
Asymp. Sig.
,300
Value
P. melan.
0 1
v19.30 dias: P melannog
6 0
v19.7 dias: P melannog
3 3
v19.90 dias: P melannog
6 0
v19.Antes do tratam.: P
melannog
6 0
N (P. melan.)
6
Cochran's Q
9,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,029
_____________________________________________________________________________Apêndices
150
Value
S. gordonii
0 1
v23.30 dias: S gordon
6 0
v23.7 dias: S gordon
4 2
v23.90 dias: S gordon
6 0
v23.Antes do tratam.:
S gordon
5 1
N (S. gordon.)
6
Cochran's Q
4,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,194
Value
S. interm.
0 1
v24.30 dias: S interme
6 0
v24.7 dias: S interme
4 2
v24.90 dias: S interme
6 0
v24.Antes do tratam.: S
interme
6 0
N (S. interm.)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
S. mitis
0 1
v25.30 dias: S mitis
6 0
v25.7 dias: S mitis
4 2
v25.90 dias: S mitis
6 0
v25.Antes do
tratam.: S mitis
6 0
N (S. mitis)
6
Cochran's Q
6,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,112
Value
S. oralis
0 1
v27.30 dias: S oralis
6 0
v27.7 dias: S oralis
4 2
v27.90 dias: S oralis
6 0
v27.Antes do tratam.:
S oralis
5 1
N (S. oralis)
6
Cochran's Q
3,667(a)
df
3
Asymp. Sig.
,300
Value
S. sanguinis
0 1
v28.30 dias: S sanguis
6 0
v28.7 dias: S sanguis
4 2
v28.90 dias: S sanguis
6 0
v28.Antes do tratam.: S
sanguis
5 1
N (S. sang.)
6
Cochran's Q
3,667(a)
df
3
Asymp. Sig.
,300
_____________________________________________________________________________Apêndices
151
Value
T. denticola
0 1
v29.30 dias: T denticola
6 0
v29.7 dias: T denticola
4 2
v29.90 dias: T denticola
4 2
v29.Antes do tratam.: T
denticola
5 1
N (T. dent.)
6
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Teste Q de Cochran - comparação dos tempos no grupo NT
Value
C. ochracea
0 1
v6.30 dias: C ochracea
3 0
v6.7 dias: C ochracea
2 1
v6.90 dias: C ochracea
3 0
v6.Antes do tratam.: C
ochracea
2 1
N (C. ochr.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
E. corrodens
0 1
v9.30 dias: E corrod
1 2
v9.7 dias: E corrod
2 1
v9.90 dias: E corrod
3 0
v9.Antes do tratam.:
E corrod
3 0
N (E. corrod.)
3
Cochran's Q
4,714(a)
df
3
Asymp. Sig.
,194
Value
F. nuc. nuc.
0 1
v11.30 dias: F nuc nuc
3 0
v11.7 dias: F nuc nuc
2 1
v11.90 dias: F nuc nuc
3 0
v11.Antes do tratam.: F
nuc nuc
2 1
N (F. nuc.
nuc.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Value
F. nuc. poly.
0 1
v12.30 dias: F nuc poly
3 0
v12.7 dias: F nuc poly
2 1
v12.90 dias: F nuc poly
3 0
v12.Antes do tratam.: F
nuc poly
2 1
N (F. nuc. poly)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
_____________________________________________________________________________Apêndices
152
Value
P. gingivalis
0 1
v17.30 dias: P gingivalis
3 0
v17.7 dias: P gingivalis
3 0
v17.90 dias: P gingivalis
2 1
v17.Antes do tratam.: P
gingivalis
3 0
Value
P. melanin.
0 1
v19.30 dias: P melannog
3 0
v19.7 dias: P melannog
3 0
v19.90 dias: P melannog
2 1
v19.Antes do tratam.: P
melannog
2 1
Value
S. gordon.
0 1
v23.30 dias: S gordon
3 0
v23.7 dias: S gordon
3 0
v23.90 dias: S gordon
3 0
v23.Antes do tratam.:
S gordon
2 1
Value
S. mitis
0 1
v25.30 dias: S mitis
3 0
v25.7 dias: S mitis
2 1
v25.90 dias: S mitis
3 0
v25.Antes do
tratam.: S mitis
2 1
Value
S. oralis
0 1
v27.30 dias: S oralis
3 0
v27.7 dias: S oralis
3 0
v27.90 dias: S oralis
3 0
v27.Antes do tratam.:
S oralis
2 1
S. sanguinis Value
0 1
v28.30 dias: S sanguis 3 0
v28.7 dias: S sanguis 3 0
v28.90 dias: S sanguis 2 1
v28.Antes do tratam.: S
sanguis
2 1
N (P. ging.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (P. melan.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (S. gord.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (S. mitis)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (S. oralis)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
N (S. sang.)
3
Cochran's Q
2,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,572
_____________________________________________________________________________Apêndices
153
Value
T. denticola
0 1
v29.30 dias: T denticola
2 1
v29.7 dias: T denticola
2 1
v29.90 dias: T denticola
1 2
v29.Antes do tratam.: T
denticola
2 1
N (T. dentic.)
3
Cochran's Q
3,000(a)
df
3
Asymp. Sig.
,392
Anexo
_________________________________________________________________________________Anexo
155
ANEXO A - Certificado de aprovação do projeto pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais do Campus da USP – RP
Livros Grátis
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Milhares de Livros para Download:
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