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Universidade
Católica de
Brasília
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU EM CIÊNCIAS
GENÔMICAS E BIOTECNOLOGIA
Mestrado
Caracterização da Variabilidade Natural da Resposta a um Isolado Brasileiro
de Xanthomonas campestris pv. campestris em
Arabidopsis thaliana
Autor (a): Lílian Silveira Travassos do Carmo
Orientador (a): Dra. Betania F. Quirino
2006
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Lílian Silveira Travassos do Carmo
Caracterização da Variabilidade Natural da Resposta a um Isolado Brasileiro
de Xanthomonas campestris pv. campestris em
Arabidopsis thaliana
Orientador (a): Betania F. Quirino
Brasília
2006
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Lílian Silveira Travassos do Carmo
Caracterização da Variabilidade Natural da Resposta a um Isolado Brasileiro
de Xanthomonas campestris pv. campestris em
Arabidopsis thaliana
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós - Graduação “Stricto Sensu” em
Ciências Genômicas e Biotecnologia da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências Genômicas e
Biotecnologia.
Orientador (a): Dra. Betania F. Quirino
Brasília
2006
Termo de Aprovação
Dissertação defendida e aprovada como requisito parcial para a obtenção do Título de
Mestre em Ciências Genômicas e Biotecnologia, defendida e aprovada, em 24 de fevereiro de
2006, pela banca examinadora constituída por:
_______________________________________________
Prof (a). Dra. Betania F. Quirino
Orientador (a) - UCB
_______________________________________________
Dra. Alice M. Quezado Duval
Examinadora Externa – Embrapa – CNPH
______________________________________________
Prof. Dr. Tatsuya Nagata
Examinador Interno - UCB
Brasília
2006
A minha família que sempre esteve ao meu lado,
apoiando minhas decisões e incentivando o meu
crescimento profissional, dedico.
Agradecimentos
À Deus, que a todo o momento esteve me dando força para vencer os obstáculos encontrados.
Aos meus pais e irmã, o total apoio e incentivo.
Ao Gabriel, pela compreensão e suporte dado ao longo do curso. Sua participação foi importante
para a finalização do trabalho.
À minha orientadora, Betania Quirino, que sempre esteve presente para esclarecimento de
qualquer dúvida e pela participação direta na execução dos trabalhos.
Ao professor Dr. Eduardo Leornadecz, pela ajuda nas análises estatísticas.
À Dra. Alice Quezado Duval, por sempre esclarecer minhas dúvidas.
Aos professores, o excelente ensinamento oferecido.
Ao professor Dr. Ruy de Araújo Caldas, a persistência e dedicação em conseguir recursos para
monitoria T.A.
À Danielle Correia, assessora do curso, pela confiança depositada durante a monitoria T.A.
Aos estagiários, Pollyanna, Virgílio, Leonardo, Elizabeth e Bárbara, da equipe que me auxiliaram
quando muito precisei.
Aos colegas do curso e amigos, agradeço o carinho e conforto nas horas de desesperos.
Ao Fábio, secretário do curso, pela disposição em atender-nos.
À técnica do laboratório, Idacuí, pelo excelente suporte técnico aos alunos e competência em
executar suas tarefas.
À Cenadar, da equipe de limpeza, pela dedicação e carinho em cuidar das salas de crescimento.
À FUNADESP e UCB, pelo suporte financeiro concedido.
À todos, que direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho.
"Há homens que lutam um dia e são bons. Há
outros que lutam um ano e são melhores. Há
os que lutam muitos anos e são muito bons.
Porém, há os que lutam toda a vida.
Esses são os imprescindíveis”.
Bertolt Brecht
SUMÁRIO
Lista de Figuras ............................................................................................................................. IX
Lista de Tabelas............................................................................................................................. XI
Lista de Abreviações ....................................................................................................................XII
Resumo........................................................................................................................................XIII
Abstract.........................................................................................................................................XV
1. Introdução.................................................................................................................................. 1
1.1. Importância Econômica........................................................................................................ 2
1.2. Arabidopsis thaliana como planta-modelo .......................................................................... 3
2. Hipóteses................................................................................................................................... 12
3. Objetivos................................................................................................................................... 14
4. Materiais e Métodos................................................................................................................ 16
4.1. Origem e Condições de Crescimento das Plantas .............................................................. 17
4.2. Origem do Isolado Xcc e Preparação do Inóculo............................................................... 17
4.3. Avaliação da Severidade dos Sintomas de Doença............................................................ 20
4.4. Análise Estatística .............................................................................................................. 20
4.6. Resposta de Ecótipos Resistentes a Xcc CNPH 17 a Outro Isolado de Xcc...................... 22
4.7. Resposta de Ecótipos Resistentes a Xcc CNPH 17 a Outro Fitopatógeno......................... 22
4.8. Caracterização da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 a Diferentes Antibióticos................... 23
4.9. Investigação do Mecanismo da Resistência: Reação de Hipersensibilidade?.................... 24
5. Resultados ................................................................................................................................ 25
5.1. Otimização do Método de Inoculação de Arabidopsis....................................................... 26
5.2. Otimização da Concentração de Inóculo............................................................................ 26
5.3. Identificação de Ecótipos de Arabidopsis Resistentes a Xcc ............................................. 27
5.4. Análise Quantitativa de Clorofila em Ecótipos Resistentes e Suscetíveis ......................... 32
5.5. Análise da Resistência......................................................................................................... 35
5.6. Teste da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 à Antibióticos..................................................... 39
5.7. Isolamento de Mutante de Xcc Resistente à Rifampicina................................................... 40
5.8. Investigação do Mecanismo de Resistência: Reação de hipersensibilidade?...................... 41
5.9. Análise Genética.................................................................................................................. 42
6. Discussão .................................................................................................................................. 43
7. Considerações finais................................................................................................................ 52
8. Perspectivas.............................................................................................................................. 57
9. Referências Bibliográficas ...................................................................................................... 59
10. Apêndices................................................................................................................................ 69
Apêndice A................................................................................................................................ 70
Apêndice B ................................................................................................................................ 71
Apêndice C ................................................................................................................................ 73
Apêndice D................................................................................................................................ 74
Apêndice E ................................................................................................................................ 75
Apêndice F................................................................................................................................. 82
- IX -
Lista de Figuras
Página
Figura 1. Aspecto morfológico de Xanthomonas campestris pv. campestris ............................... 11
Figura 2. Manifestação da podridão-negra em lavoura de couve-flor........................................... 11
Figura 3. Sumário dos resultados da análise estatística referente à resposta de diferentes ecótipos
de Arabidopsis ao isolado CNPH 17 de Xcc................................................................................. 28
Figura 4. Grau de severidade dos sintomas em ecótipos de A. thaliana, no quinto dia após
inoculação...................................................................................................................................... 29
Figura 5. Ecótipos de Arabidopsis suscetíveis a Xcc CNPH 17, CS 1194 e CS 1492, no oitavo dia
após a inoculação........................................................................................................................... 30
Figura 6. Ecótipos de Arabidopsis resistentes a Xcc CNPH 17, CS 1308, CS 1566 e CS 1643, no
oitavo dia após a inoculação.......................................................................................................... 30
Figura 7. Grau de severidade dos sintomas em ecótipos de A. thaliana, no quinto dia após
inoculação...................................................................................................................................... 31
Figura 8. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1194 em diferentes dias após inoculação..... 32
Figura 9. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1492 em diferentes dias após inoculação..... 33
Figura 10. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1308 em diferentes dias após inoculação... 33
Figura 11. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1566 em diferentes dias após inoculação... 34
Figura 12. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1643 em diferentes dias após inoculação... 34
Figura 13. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação ............................................................................................................................. 36
- X -
Figura 14. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1308, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. .................................................................................................... 36
Figura 15. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1566, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. .................................................................................................... 37
Figura 16. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1643, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. .................................................................................................... 37
Figura 17. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação ............................................................................................................................. 75
Figura 18. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação ............................................................................................................................. 76
Figura 19. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação ............................................................................................................................. 77
Figura 20. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação ............................................................................................................................. 78
Figura 21. Quantificação de clorofila no ecótipo Columbia em diferentes dias após inoculação. 79
Figura 22. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 6100 em diferentes dias após inoculação... 80
Figura 23. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1438 em diferentes dias após inoculação... 81
- XI -
Lista de Tabelas
Página
Tabela 1. Ecótipos de Arabidopsis e suas procedências geográficas. ........................................... 18
Tabela 2. Análise comparativa da resposta de ecótipos de Arabidopsis a três fitobactérias......... 39
Tabela 3. Sensibilidade de Xcc isolado CNPH 17 a antibióticos em diversas concentrações. ..... 40
Tabela 4. Preparo do meio NA...................................................................................................... 71
Tabela 5. Preparo do meio MS...................................................................................................... 71
Tabela 6. Preparo de meio Kelman ............................................................................................... 72
Tabela 7. Preparo de solução-estoque de diversos antibióticos..................................................... 73
Tabela 8. Preparo de solução-estoque cloreto de magnésio 1M.................................................... 73
Tabela 9. Procedência dos isolados de Xanthomonas campestris pv. campestris......................... 74
Tabela 10. Procedência do isolado de Ralstonia solanacearum ................................................... 74
- XII -
Lista de Abreviações
NA Ágar-Nutriente
CNPH Centro Nacional de Pesquisa da Embrapa
OD Densidade ótica
o
C Graus Celsius
h hora
MS Murashige and Skoog Basal Salt mixture
μg micrograma
mg miligrama
mL mililitro
mm milímetro
mM milimolar
M molaridade
% porcentagem
Rs Ralstonia solanacearum
RH Reação de hipersensibilidade
s segundo
UFC Unidade formadora de colônia
Xcc Xanthomonas campestris pv. campestris
Xcv Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
- XIII -
Resumo
O ataque de fitopatógenos gera redução na quantidade e qualidade de importantes
produtos agrícolas destinados ao mercado nacional e internacional. Agrotóxicos vêm sendo
utilizados como forma de controlar esses agentes fitopatogênicos. Entretanto, além do custo
financeiro, este tipo de prática é danoso ao meio ambiente e pode ser prejudicial à saúde. Uma
alternativa para solucionar esses problemas é desenvolver variedades de plantas que apresentem
resistência genética contra patógenos. Arabidopsis thaliana vem sendo utilizada como sistema
modelo para estudos de fatores genéticos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro.
Este trabalho visou estudar a interação entre A. thaliana e um importante patógeno de
brássicas responsável pela podridão-negra, a bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris
(Xcc). Numa primeira fase, trinta e três ecótipos de A. thaliana foram avaliados quanto a sua
resposta ao isolado CNPH 17 de Xcc. Ainda que não tenha sido encontrada uma resistência
absoluta, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643 crescidos em luz contínua apresentaram maior
resistência em testes de infiltração foliar com 5 x 10
6
UFC/mL de suspensão bacteriana. Em
contraste, os ecótipos CS 1194 e CS 1492 apresentaram uma maior suscetibilidade, exibindo
fortes sintomas de clorose. Resultados similares foram obtidos quando os mesmos ecótipos foram
crescidos em fotoperíodo de dias curtos. Para quantificar as diferenças no grau de sintomas da
doença, clorofila total foi extraída dos ecótipos contrastantes em diferentes dias após a
inoculação. Foi comprovado um menor declínio na quantidade de clorofila dos ecótipos
considerados resistentes em comparação aos suscetíveis. Para testar a abrangência da resistência
encontrada, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, resistentes a Xcc CNPH 17 e o ecótipo CS
1438, com resistência intermediária, foram inoculados com o isolado de Xcc CNPH 77. Em todos
os ecótipos houve maior severidade de sintomas a esse isolado. Entretanto, o ecótipo CS 1566
- XIV -
apresentou-se como resistente. Além disso, os ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, resistentes
ao isolado de Xcc CNPH 17 foram inoculados com um isolado de Ralstonia solanacearum (Rs
CNPH 221). O ecótipo CS 1308 foi o mais resistente em relação aos ecótipos CS 1566 e CS 1643
que mostraram resistência intermediária a este isolado. Para iniciar testes que auxiliem no
entendimento do mecanismo de resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643 a Xcc
CNPH 17, estes foram inoculados com uma concentração de 5 x 10
8
UFC/mL e o
desenvolvimento de sintomas foi monitorado em 7, 24 e 48 h após a inoculação. Nenhum sintoma
de reação de hipersensibilidade foi observado.
Para viabilizar futuros estudos de crescimento bacteriano in planta é necessário utilizar
meio seletivo livre de contaminantes. Por essa razão, a sensibilidade do isolado CNPH 17 a
diferentes antibióticos foi testada. O isolado Xcc CNPH 17 apresentou sensibilidade a
cloramfenicol, kanamicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina e rifampicina, nas
concentrações testadas. Devido a estes resultados foi então realizada uma busca por mutantes
resistentes ao antibiótico rifampicina. Mutantes foram validados como resistentes à concentração
25 μg/mL de rifampicina. Estes mutantes serão utilizados para a investigação do mecanismo de
resistência através da obtenção de curva de crescimento bacteriano in planta e poderão ser úteis
na identificação do mecanismo de resistência envolvido na interação estudada.
Palavras-chave: Arabidopsis thaliana, Xanthomonas campestris pv. campestris , variabilidade
natural, patossistema, patógeno, hospedeiro.
- XV -
Abstract
Phytopathogens are problems for agriculture as they reduce both crop quality and
quantity. Chemicals are frequently used to control plant pathogens. However, they are
undesirable because of increased production costs to farmers as well as environmental and
consumer health negative impacts. An alternative to the use of chemicals is the development of
varieties of plants with genetic resistance against pathogens. Arabidopsis thaliana has been used
as a model system to study the genetic factors involved in the plant-pathogen-host interaction.
This work aimed to study the interaction between A. thaliana and Xanthomonas
campestris pv. campestris, an important pathogen of crucifers responsible for a disease named
Black-rot. Initially, the response of thirty - three ecotypes of A. thaliana against the isolate Xcc
CNPH 17. Although immunity was not observed, ecotypes CS 1308, CS 1566 and CS 1643
grown in continuous light showed resistance when inoculated with a bacterium suspension of 5 x
10
6
CFU/mL. In contrast, ecotypes CS 1194 and CS 1492 were found to be more susceptible
showing strong symptoms of chlorosis. Similar results were obtained when plants were grown
under short days. In order to quantify differences on the degree of disease symptoms, total
chlorophyll was extracted from contrasting ecotypes at different time points after inoculation.
Chlorophyll levels from controls and inoculated plants had similar reduction among resistant
ecotypes. In susceptible ecotypes inoculated plants showed a more pronounced reduction in
inoculated plants than in controls. In order to test how broad was the identified resistance in
ecotypes CS 1308, CS 1566, CS 1643 and CS 1438 (that showed intermediate resistance to
CNPH 17), these ecotypes were inoculated with the isolate CNPH 77 of Xcc. All ecotypes
developed disease symptoms, however ecotype CS 1566 showed some level of resistant to this
aggressive isolate of Xcc. The resistant ecotypes CS 1308, CS 1566 and CS 1643 to isolate Xcc
- XVI -
CNPH 17 were also inoculated with Ralstonia solanacearum (Rs CNPH 221), an important soil
pathogen of solaneracea crops. The ecoptype CS 1308 was more resistant than ecotypes CS 1566
and CS 1643, which showed an intermediate resistance level. In order to begin characterizing the
mechanism of resistance, ecotypes CS 1308, CS 1566 and CS 1643, were inoculated with a high
titer of Xcc CNPH 17 (5 x 10
8
CFU/mL) and symptom development was monitored at 7, 24 and
48 h after inoculation. No symptoms of hypersensitive response were observed.
To perform in planta studies of bacterial growth it is important to be able to assess the
bacterial population without the presence of spurious contaminants which can be achieved by
adding antibiotics to media. Thus, the resistance/sensitivity of Xcc CNPH 17 to different
antibiotics was investigated. This isolate showed sensitivity to chloramphenicol, kanamycin,
spectiomycin, estreptomycin, tetracycline and rifampicin in concentrations tested. Given these
results, a spontaneous rifampicin mutant was sought after. Mutants resistant to 25 μg/mL of
rifampicin were obtained. These mutants will be used fot growth cure experiments and should be
helpful in unraveling the mechanism of disease resistance to Xcc CNPH 17.
Keywords: Arabidopsis thaliana, Xanthomonas campestris pv. campestris , natural variability,
pathosystem, pathogen, host.
- XVII
-
- 1 -
1. Introdução
- 2 -
1.1. Importância Econômica
A produção agrícola brasileira é de vital importância para a economia e segundo o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o superávit do agronegócio alcançado em
2004 foi de US$ 34,2 bilhões. Entretanto, este valor poderia ser mais significante não fosse o
ataque de fitopatógenos que levam ao aumento dos custos de produção e a uma redução da
quantidade e qualidade dos produtos agrícolas brasileiros.
Os agrotóxicos são freqüentemente utilizados pelos produtores rurais para manter os
agentes causadores de doenças sob controle (Agrios, 1997). Entretanto, mesmo nos casos onde a
lavoura pode ser protegida pelos agrotóxicos, o seu uso tem mostrado desvantagens na medida
em que recursos financeiros têm de ser alocados para sua aquisição e aplicação. Além disso,
muitos problemas ambientais e efeitos nocivos à saúde humana podem ser conseqüência da
aplicação indevida destes produtos químicos.
Na tentativa de solucionar este problema, atualmente existe uma crescente busca por
alternativas para permitir à agricultura brasileira desenvolver-se e aumentar sua competitividade
no mercado internacional, ao mesmo tempo em que o seu impacto ambiental seja reduzido
(Quirino et al. 1999). Uma maneira de atingir estes objetivos é o desenvolvimento de variedades
de plantas que apresentem resistência genética contra patógenos.
A planta-modelo Arabidopsis thaliana tem sido extremamente útil para estudos de fatores
genéticos envolvidos na interação patógeno-hospedeiro (Quirino & Bent, 2003). A bactéria
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) é a causadora de uma doença de importância
mundial, a podridão-negra das brássicas (Williams, 1980, Lopes & Quezado-Soares, 1997).
- 3 -
Assim, o foco escolhido para este trabalho foi o estudo da interação patógeno-hospedeiro,
utilizando o patossistema Arabidopsis/ Xcc.
1.2. Arabidopsis thaliana como planta-modelo
Arabidopsis thaliana é membro da família das brássicas, como o repolho e a couve. Está
distribuída por toda Europa, Ásia e América do Norte (Meyerowitz & Somerville, 1994). Apesar
de não ser economicamente importante para a agricultura, A. thaliana é uma espécie vegetal
muito utilizada como organismo modelo em estudos genéticos e moleculares (Meinke et al.,
1998, Simpson & Johnson, 1990, Hugouvieux et al. 1998, Buell, 2002, Meyer et al., 2005).
Arabidopsis apresenta várias características que a tornam altamente atrativa para estudos
científicos. Ela possui um ciclo de vida curto, completado em apenas 6 semanas. Inicia-se com a
germinação da semente, seguida da formação da roseta, florescimento e maturação de novas
sementes. Arabidopsis é uma planta diplóide e seu genoma é pequeno com 125 Mpb, organizado
em cinco cromossomos (Meinke et al., 1998). Apresenta reprodução autógama e sua genética é
altamente desenvolvida com inúmeros marcadores moleculares disponíveis e até mesmo
populações prontas para mapeamento.
O genoma de A. thaliana está completamente seqüenciado desde o ano de 2000 e contém
aproximadamente 25.000 genes (INITIATIVE, 2000). Além disso, A. thaliana já foi
transformada por Agrobacterium tumefaciens (Clough & Bent, 1998, Martinez-Trujillo et al.,
2004). A criação de populações com “knockouts” de genes através de transformação têm
permitido estudos funcionais de genes (Sussman et al., 2000). Mais recentemente, a técnica de
- 4 -
interferência de RNA tem expandido ainda mais as possibilidades nesta área (Limpens et al.,
2004).
Em razão da diversidade de habitats onde Arabidopsis pode ser encontrada, existem
diferentes ecótipos que apresentam características adaptativas distintas de acordo com a
localização geográfica onde se desenvolvem (Oliveira, 1999). Recentemente, a comunidade
científica tem dado maior atenção para as variações naturais entre os diversos ecótipos de
Arabidopsis (Kover & Schaal, 2002, Chen et al., 2005). As adaptações relacionadas com climas e
solos de determinados habitats permitem demonstrar a variação genética das populações naturais
de Arabidopsis. O período de floração e quebra de dormência, por exemplo, variam entre as
populações continentais e atlânticas (Oliveira, 1999). Variações naturais, acopladas à
identificação de polimorfismos no DNA podem ser exploradas para a identificação de genes que
controlem o caráter que está sendo estudado. A diversidade natural entre ecótipos, no que tange à
diferença de resposta a patógenos, também já começa a ser explorada para a identificação dos
loci envolvidos (Buell & Somerville, 1997, Denby et al., 2004).
1.3. Descrição do patógeno e do processo de infecção
Xanthomonas campestris pv. campestris é uma bactéria Gram-negativa, aeróbica, com
formato de bastão e apenas um flagelo para mobilidade. As colônias da maioria das espécies do
gênero Xanthomonas e patovares são mucóides, convexas e são capazes de produzir um
polissacarídeo extracelular chamado de goma de xantana (Schaad et al., 2001). Quando crescida
- 5 -
em meio ágar apresenta uma pigmentação amarelada (Figura 1) devido à presença de
xantomonadinas (Chun, 2002).
De acordo com a classificação taxonômica, X. campestris está agrupada no Reino
Procaryotae, Filo Proteobacteria, Subdivisão Gama (Classe), Xanthomonadales (Ordem)
Xanthomonadacea (Família) e Gênero Xanthomonas (Takatsu, 2000). Entretanto, essa
classificação taxonômica está associada apenas com a caracterização fenotípica, o que pode
dificultar a distinção dos diversos patovares pertencentes a esse grupo taxonômico. A definição
de patovar refere-se à capacidade de uma bactéria, ou grupo de bactérias de ser patogênica para
um determinado gênero de plantas ou espécie (Agrios, 1997, Vicente et al., 2001). Estudos
mostraram que apesar da uniformidade fenotípica, há uma diversidade fitopatogênica no gênero
Xanthomonas (Vauterin et al., 2000). Uma alternativa que vem sendo utilizada na classificação
desse gênero são técnicas moleculares, como PCR e hibridização DNA-DNA, que permitem
identificar a diversidade dentro desse gênero (Vauterin et al. 2000, Massomo et al., 2003, Jones
et al., 2004, Tsygankova et al., 2004).
O conceito de raça em bactérias fitopatogênicas está relacionado com o grupo de plantas
hospedeiras que afeta, ou seja, dentro de uma espécie, um grupo de bactérias de determinado
patovar será patogênico a uma determinada variedade da planta hospedeira, mas não a outras
variedades (Agrios, 1997, Lopes & Quezado-Soares, 1997). No trabalho desenvolvido por
Vicente et al. (2001) foi possível identificar seis raças entre isolados de Xcc testados em
diferentes espécies de Brássicas. Além disso, foi proposto um modelo genético baseado nas
interações entre genes de avirulência das raças de Xcc com genes de resistência de diferentes
hospedeiros.
Xanthomonas campestris pv. campestris é patogênica para brássicas e seu modo de infecção
preferencial é através dos hidatódios, poros localizados às margens das folhas. No processo de
- 6 -
gutação, gotículas de água são liberadas pelos hidatódios permitindo a entrada da bactéria na
planta e possibilitando sua disseminação pelo sistema vascular (Hugouvieux et al., 1998). As
bactérias se multiplicam formando microcolônias e, em seguida, ocorre produção do
polissacarídeo extracelular goma de xantana, formando-se um biofilme (Leite et al., 2001). Esse
biofilme garante que as colônias de Xcc se estabilizem e que ocorra uma melhor proliferação
bacteriana. Além disso, estudos têm sugerido um possível papel para a goma de xantana na
sobrevivência de Xcc em situações de estresses causados pela planta, como a síntese de
compostos antimicrobianos (Dow et al., 2003). A goma de xantana impede o fluxo de água,
resultando no amarelecimento das folhas (clorose) na forma de V, seguido de perda de
turgescência, enegrecimento dos vasos e necrose. Em razão disso, a doença é chamada de
podridão-negra (Figura 2) (Williams, 1980, Lopes & Quezado-Soares, 1997).
Além da infecção via hidatódios, Xcc pode penetrar na planta por estômatos ou ferimentos e a
disseminação deste patógeno pode ocorrer por sementes (Williams, 1980, Lopes & Quezado-
Soares, 1997). A podridão-negra é um problema de escala mundial, afetando largamente os
numerosos cultivares de brássicas de importância agrícola, como repolho, couve e brócolos
(Williams, 1980, Buell, 2002), como em lavouras de repolho no estado do Pernambuco, onde a
podridão negra tem sido objeto de estudos epidemiológicos (Azevedo et al., 2002).
1.4. A Interação Patógeno-Hospedeiro
Na relação de interação patógeno-hospedeiro, o hospedeiro é aquela planta onde o patógeno
consegue penetrar, se instalar e de onde são retirados os recursos (nutrientes) para sua
- 7 -
sobrevivência. No caso do patógeno não conseguir infectar uma planta, por exemplo, dizemos
que esta planta não é hospedeira natural deste patógeno (Agrios, 1997).
A resistência manifestada em plantas não hospedeiras é chamada de “nonhost resistance”
(Thordal-Christensen, 2003). A “nonhost resistance” é um tipo robusto de resistência que é
durável. Infelizmente este tipo de resistência ainda é pouco entendido, mas já se sabe que possui
similaridades à resistência encontrada em determinadas variedades de plantas hospedeiras
(Thordal-Christensen, 2003, Mysore & Ryu, 2004). A “nonhost resistance” contra bactérias,
fungos e oomicetos pode ser de dois tipos. No primeiro tipo, esta resistência não é acompanhada
de nenhum sintoma visível, enquanto no segundo tipo, esta resistência está acompanhada de uma
reação de hipersensibilidade (descrito abaixo) (Mysore & Ryu, 2004).
Na presença de um patógeno, uma planta hospedeira pode reagir de duas formas. Denomina-
se resistência a reação onde há o bloqueio do avanço do patógeno e suscetibilidade a situação
onde há a sua colonização pela planta. A capacidade de resistência varia de uma variedade de
planta hospedeira para outra, ao mesmo tempo em que a capacidade infectiva do patógeno
(avirulência/virulência) varia de isolado para isolado de um mesmo patógeno. Por exemplo, uma
determinada planta ativa uma cascata de reações na presença de um isolado de uma espécie
patogênica, mas ao mesmo tempo não manifesta nenhuma reação de defesa na presença de um
outro isolado desta mesma espécie (Agrios, 1997). Assim, estudos feitos com um determinado
isolado de Xcc obtido em outro país podem não ser relevantes para isolados obtidos em lavouras
brasileiras. É importante também salientar que as condições ambientais às quais as plantas estão
expostas também influenciam na resposta de defesa (Agrios, 1997).
Os tipos de resistência podem ser divididos em resistência vertical e horizontal. A primeira,
em geral, é controlada por um ou poucos genes (monogênica ou oligogênica) e confere à planta
uma limitada proteção, ou seja, a resistência abrange apenas algumas raças de um patógeno, mas
- 8 -
não a outras raças. Em contrapartida, a resistência horizontal é geralmente controlada por muitos
genes, apresentando uma maior ou menor eficiência na resistência contra todas as raças de um
mesmo patógeno considerando-se uma determinada variedade de planta (Borem, 2001).
A teoria do gene-a-gene visou explicar como uma planta pode resistir um patógeno específico
através de herança monogênica. Segundo Flor, a resistência de uma determinada planta é
resultante da interação entre um gene de avirulência dominante (Avr) do patógeno e um gene de
resistência também dominante (R), no hospedeiro (Flor, 1971).
Moléculas protéicas receptoras que são sintetizadas por genes de resistência (R) do
hospedeiro reagem de forma específica às moléculas elicitoras produzidas pelos genes Avr
(avirulência) do patógeno (Quirino & Bent, 2003). Quando o hospedeiro reconhece a molécula
elicitora do patógeno, é desencadeada uma resposta de defesa, freqüentemente levando a uma
morte rápida de células no local da infecção, a chamada reação de hipersensibilidade (RH). Esta
resposta de defesa envolve uma interação de incompatibilidade, ou seja, a planta é resistente e o
patógeno é avirulento, não levando à formação de doença. Quando o patógeno não é reconhecido
pela planta hospedeira, este consegue penetrar e se instalar na planta, gerando a doença, trata-se
de uma interação de compatibilidade. Essa interação envolve a planta suscetível e o patógeno
virulento (Gachomo et al., 2003).
Resistência aparente é outro tipo de resistência da planta contra o patógeno e também está
dividida em dois tipos: escape de doença e tolerância à doença. O escape da doença está
relacionado com o momento em que a planta interage com o patógeno, ou seja, primeiramente, é
necessário que a planta seja hospedeira de um patógeno em particular e este seja virulento para a
planta, mas também as condições ambientais devem favorecer a infecção (Agrios, 1997). Na
tolerância à doença, todas as plantas são suscetíveis, entretanto, seu desenvolvimento não é
- 9 -
aparentemente afetado pela presença do patógeno (Tsuji et al. 1991, Buell & Somerville, 1995).
O patógeno é capaz de se multiplicar no interior da planta hospedeira sem causar morte a planta.
Estudos vêm mostrando que Arabidopsis é suscetível a diversos patógenos incluindo vírus,
fungos, nematóides, insetos e bactérias (German et al., 1995, Muckenshnabel et al., 2002,
Simpson & Johnson, 1990, Jader et al., 2001, Wubben et al., 2004).
A relação entre Arabidopsis e a bactéria Xanthomonas também tem sido analisada. Diferentes
respostas de resistência têm sido documentadas como tolerância (Tsuji et al., 1991, Buell &
Somerville, 1995), reação de hipersensibilidade (RH) (Godard et al., 2000) e resistência sem RH
(Buell & Somerville, 1997). Estudos genéticos vêm mostrando que a resistência encontrada em
alguns ecótipos de A. thaliana pode ser monogênica ou poligênica (Buell & Somerville, 1997).
O trabalho de Tsuji et al. (1991) exemplifica o tipo de interação onde a resposta de resistência
por parte da planta é do tipo tolerante ao patógeno. Dois ecótipos de Arabidopsis, Columbia (Col)
e Pr-0, inoculados com o isolado Xcc 2D520 manifestaram respostas de defesa distintas. Pr-0 foi
suscetível a Xcc, apresentando sintomas típicos, como clorose e necrose, enquanto o ecótipo Col,
reagiu tolerantemente ao crescimento bacteriano, sem desenvolver os sintomas. A análise
genética permitiu identificar que um único gene dominante, o RXC1, estaria envolvido na
resistência contra este isolado.
Em outro experimento, o mesmo isolado de Xcc (2D520) foi utilizado, porém, o tipo de
resposta foi resistência sem RH. Buell & Somerville (1997) verificaram que o gene RXC2,
dominante, confere ao ecótipo Columbia (Col) resistência contra este isolado, restringindo o
crescimento bacteriano, enquanto o ecótipo Landsberg (Ler) mostrou níveis consideráveis do
patógeno, sendo altamente suscetível. Resistência digênica a Xcc também foi descrita neste
mesmo trabalho. A interação de dois genes dominantes, RXC3 e RXC4 está envolvida no
impedimento do crescimento bacteriano.
- 10 -
No presente estudo foi utilizado este patossistema, cujo patógeno, um isolado brasileiro de
Xcc, atinge culturas de grande importância econômica. Neste trabalho foi caracterizada a
interação entre o isolado Xcc CNPH 17 e a planta modelo A. thaliana. Assim como as
hospedeiras naturais de Xcc de grande importância econômica, Arabidopsis também pertence à
família das brássicas. A riqueza do germoplasma de Arabidopsis foi explorada para identificar
ecótipos com respostas contrastantes ao patógeno. Uma maneira de analisar a divergência nas
respostas foi a quantificação dos níveis de clorofila nos ecótipos contrastastes. A caracterização
de ecótipos contrastantes de Arabidopsis (resistentes/suscetíveis) irá permitir o avanço nos
estudos da herança gênica e clonagem de gene/genes de resistência envolvidos na interação
Arabidopsis e o isolado Xcc CNPH 17. Mutantes resistentes a determinados antibióticos será útil
para obtenção de curva de crescimento bacteriano utilizadas no estudo do mecanismo de
resistência.
- 11 -
Figura 1. Aspecto morfológico de Xanthomonas campestris pv. campestris
Figura 2. Manifestação da podridão-negra em lavoura de couve-flor (Foto cedida pela Dra. Alice
Quezado-Duval).
- 12 -
2. Hipóteses
- 13 -
• Existe variação na resposta contra o patógeno Xcc, isolado brasileiro CNPH 17, no
germoplasma de A. thaliana.
As respostas contrastantes de diferentes ecótipos de A. thaliana ao isolado de Xcc CNPH
17 possuem base genética e podem ser caracterizadas.
- 14 -
3. Objetivos
- 15 -
1. Avaliar a resposta de diferentes ecótipos de Arabidopsis à infecção pelo isolado brasileiro
de Xcc CNPH 17.
2. Caracterizar a resposta a Xcc, isolado CNPH 17, em ecótipos de Arabidopsis com
respostas contrastantes (resistência x suscetibilidade).
- 16 -
4. Materiais e Métodos
- 17 -
4.1. Origem e Condições de Crescimento das Plantas
Os ecótipos de A. thaliana de diferentes origens geográficas (Tabela 1) foram obtidos de
Arabidopsis Biological Resource Center (Ohio, E.U.A.). O substrato Plantmax Hortaliças HT
(Eucatex Agro, Paulínia, SP) foi utilizado para o crescimento de todos os ecótipos. Os
fotoperíodos utilizados para a realização dos experimentos foram dias curtos (16h escuro/ 8h luz )
e luz contínua (conforme especificado). A intensidade luminosa foi de aproximadamente 100
μmol m
–2
s
–1
, a temperatura em torno de 24°C e a umidade em torno de 50%. Sementes
plaqueadas em meio MS ¼ (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) foram embebidas e colocadas a 4°C
por 2 dias para quebra de dormência, sendo em seguida expostas a luz para germinarem.
Sementes utilizadas em experimentos com fotoperíodo de dias curtos foram previamente
germinadas em fotoperíodo de dias longos (16 h luz/ 8 h escuro), sendo transferidas para dias
curtos quando transplantadas para o solo. Plantas com 3 a 6 semanas pós-germinação foram
utilizadas nos experimentos, conforme indicado em cada experimento.
4.2. Origem do Isolado Xcc e Preparação do Inóculo
O isolado Xcc CNPH 17, da coleção de trabalho da Embrapa Hortaliças, foi procedente
de uma lavoura de couve (Brassica oleracea var. acephala) com sintomas de podridão-negra,
localizada em Brazlândia, D.F. (comunicação pessoal, Alice Quezado). O isolado Xcc CNPH 17
foi armazenado em água à temperatura ambiente até sua recuperação em meio Ágar-Nutriente.
Após incubação por dois dias a 28°C, as colônias tiveram sua morfologia confirmada e foram
- 18 -
repicadas para o mesmo tipo de meio para sua utilização nos ensaios. Uma massa bacteriana foi
transferida para solução 10 mM MgCl
2
. A absorbância a 600 nm foi ajustada para 0,3 que
corresponde a uma concentração de aproximadamente 5 x 10
8
UFC/mL (Quezado-Duval &
Camargo, 2004). Para alguns testes, conforme especificado, diluições seriadas foram feitas em
solução 10 mM MgCl
2
para se atingir a concentração de 5 x 10
6
UFC/mL.
Em alguns experimentos também foi utilizado outro isolado de Xcc proveniente de
plantação de brássica com sintoma de podridão-negra. O isolado Xcc CNPH 77 foi obtido de uma
lavoura de repolho (Brassica oleracea var. capitata) em São José dos Pinhais, PR (comunicação
pessoal, Alice Quezado).
Tabela 1. Ecótipos de Arabidopsis e suas procedências geográficas.
Número de Referência Nome do Ecótipo País de Procedência
CS 903 Kas-1 Índia
CS 920 Em-D Ucrânia
CS 1020 Bu-8 Alemanha
CS 1064 Can-0 Ilhas Canárias
CS 1072 Chi-0 Rússia
CS 1084 Co-1 Portugal
CS 1093
Col-1
Estados Unidos
CS 1194 Gö-0 Alemanha
CS 1198 Gr-1 Áustria
CS 1298 La-0 Alemanha
CS 1308 Le-0 Países Baixos
CS 1354 Lz-0 França
- 19 -
CS 1438 Pa-1 Itália
CS 1466 Pla-4 Espanha
CS 1492 Ri-0 Canadá
CS 1540 Su-0 Reino Unido
CS 1566 Tu-0 Itália
CS 1594 Wil-1 Rússia
CS 1640 Tsu-1 Japão
CS 1643 Oy-1 Noruega
CS 2223 Ws-1 Rússia
CS 3112 M7323S Desconhecido
CS 6100 Kelsterbach-1 Alemanha
CS 6175 Condara Tadjikistão
CS 6181 Sn(5)-1 Tchecoslováquia
CS 6604 Na-2 Bélgica
CS 6674 Ct-1 Itália
CS 6699 Es-0 Finlândia
CS 6922 Nd-1 Alemanha
CS 6930 Col-5 (gl1) Alemanha
CS 8580 Cvi-1 Ilhas Cabo Verde
CS 22353 Harvard square-7 Estados Unidos
Columbia Col-0 Estados Unidos
Fonte: Arabidopis Information Resource (TAIR)
- 20 -
4.3. Avaliação da Severidade dos Sintomas de Doença
Metade da folha das plantas de Arabidopsis foram inoculadas com o isolado Xcc CNPH
17 (ou outro, conforme especificado), na superfície abaxial, com seringa de 1 mL sem agulha
(Plascalp, Feira de Santana- BA). A avaliação foi iniciada no quinto dia após a inoculação,
prosseguindo no sexto e sétimo dias. Nestas datas já foi possível visualizar a progressão dos
sintomas em plantas inoculadas com uma concentração de 5 x 10
6
UFC/mL. Como controle
negativo, folha das plantas de Arabidopsis foram inoculadas com tampão de MgCl
2
a 10 mM. O
controle positivo para virulência bacteriana foi repolho, Brassica oleracea var. capitata cv.
Kenzan.
Para monitorar a progressão da severidade dos sintomas da doença causada por Xcc foi
estabelecida uma escala descritiva de 0 a 5: 0 – a superfície inoculada não apresentava sintomas;
1- presença de raras lesões; 2- sintomas de clorose presentes em área inferior a 10% da região
inoculada; 3- clorose presente em cerca de 50% da área inoculada; 4- necrose do tecido foliar
inoculado, mas existência de alguma atividade fotossintética remanescente e 5- a área inoculada
apresentou-se completamente necrosada.
4.4. Análise Estatística
Os experimentos realizados foram agrupados para análise estatística, utilizando o pacote
de programas SAS (Statistical Analysis System, versão 8.2). O programa ANAVA (análise de
variância) foi utilizado para verificar se havia diferença estatisticamente significativa entre os
ecótipos. Com a confirmação dessas diferenças, utilizou-se o Teste de Médias (TUKEY) para
- 21 -
identificar quais os grupos de igualdade e diferenças dos ecótipos. Vários experimentos foram
agrupados em 4 blocos, com 30 repetições (folhas), 33 acessos (ecótipos) e com dados
desbalanceados, a fim de selecionar os ecótipos contrastantes. Com a obtenção dos ecótipos
contrastantes, uma nova análise estatística foi realizada, no qual estabeleceu-se 2 blocos, com 30
repetições (folhas), 7 acessos (ecótipos contrastantes) e com dados desbalanceados.
4.5. Quantificação de Clorofila
Folhas dos ecótipos CS 1194, CS 1492, CS 1308, CS 1566 CS 1643, com 5 a 6 semanas
pós-germinação, foram inoculadas em toda sua extensão por infiltração utilizando uma seringa
sem agulha, com tampão de MgCl
2
a 10 mM ou com uma suspensão no mesmo tampão do
isolado de Xcc CNPH 17 na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL. Foram coletados discos foliares
com 7,9 mm de diâmetro (3 discos/ planta) das folhas inoculadas e não inoculadas nos dias 0, 2, 4
e 6 após a inoculação, conforme especificado. Os discos foram imediatamente congelados em
nitrogênio líquido e armazenados a –80
o
C até a extração da clorofila.
A clorofila total (clorofila “a” e clorofila “b”) presente nos discos foi extraída
essencialmente baseada na metodologia de Wintermans & De Mots (1965). Inicialmente,
realizou-se a maceração dos discos foliares de cada amostra (planta) em nitrogênio líquido, com
pistilos. Em seguida, foi adicionado 1mL de ethanol 96% a cada amostra e estas foram
homogeneizadas por 30 s (mantendo as amostras em ambiente escuro). As amostras foram então
centrifugadas por mais 30 s, à velocidade máxima. O sobrenadante de cada amostra foi colocado
em um novo tubo de 1,5 mL para que fosse realizada a medição da absorbância.
- 22 -
A absorbância das amostras foi determinada para o comprimento de onda 654 nm. Para o
cálculo da clorofila total foi utilizada a equação Chl a+b(mg/ L)= 1000 x O.D.
654
/39, 8.
Como controle positivo para a virulência da bactéria foram utilizadas folhas de repolho
(Brassica oleracea var. capitata).
4.6. Resposta de Ecótipos Resistentes à Xcc CNPH 17 a Outro Isolado de Xcc
Para a realização deste experimento foram utilizados dois isolados de Xcc CNPH 17 e
CNPH 77 (descritos). Os ecótipos resistentes ao isolado Xcc CNPH 17 testados foram os CS
1308, CS 1566 e CS 1643, e o ecótipo CS 1438, com resistência intermediária. Plantas destes
ecótipos com 5 semanas de idade e expostas ao fotoperíodo de dias curtos foram inoculadas com
suspensão bacteriana contendo 5x10
6
UFC/mL do isolado CNPH 17 ou CNPH 77. O controle
positivo foi o repolho (Brassica oleracea var. capitata ) cv. Kenzan. A avaliação dos sintomas foi
realizada no quinto e sexto dia após a inoculação, utilizando-se a escala de severidade de
sintomas.
4.7. Resposta de Ecótipos Resistentes à Xcc CNPH 17 a Outro Fitopatógeno
Para verificar a amplitude da resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, foi
caracterizada a resposta destes ecótipos ao patógeno bacteriano Ralstonia solanacearum. O
isolado de Ralstonia solanacearum utilizado foi o CNPH 221, obtido de uma lavoura de tomate
- 23 -
(Lycopersicum esculentum Mill.) localizada em Ponte Alta-DF. Este isolado foi mantido
armazenado em água à temperatura ambiente até sua recuperação em meio Kelman. Após
incubação por dois dias a 28°C, as colônias tiveram sua morfologia confirmada e foram
novamente repicadas para o mesmo meio. As bactérias foram ressuspendidas em água estéril e a
densidade à 600 nm foi ajustada para 0,6, correspondendo a uma concentração aproximada de 5 x
10
8
UFC/mL. No experimento também foi incluído o ecótipo CS 1194, suscetível a Xcc CNPH
17.
Sete a quinze plantas dos ecótipos selecionados foram cultivadas em dias longos (16 h
luz/ 8 h escuro) e com aproximadamente 4 semanas foram utilizadas para o experimento. Com
uma ponteira de capacidade 1 mL foi feito um orifício no solo na base de cada planta a ser
inoculada e 10 mL da suspensão bacteriana foram adicionados. Os controles negativos foram
tratados similarmente, mas inoculados com 10 mL de água estéril. Como controle positivo foi
utilizado tomateiro, sendo as variedades mais utilizadas, Kada e a IPA-05, ambas altamente
suscetíveis a R. solanacearum.
Os sintomas foram monitorados aos 10 e 15 dias após inoculação, utilizando-se uma
escala numérica para quantificar a severidade dos mesmos. A escala utilizada foi: 0 - planta não
apresenta sintomas; 1- perda de turgidez foliar; 2- algumas folhas apresentam murcha; 3 - todas
as folhas estão murchas; 4 - morte da planta (Yang & Ho, 1998).
4.8. Caracterização da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 a Diferentes
Antibióticos
- 24 -
Foram preparadas placas de meio Ágar-Nutriente e placas do mesmo meio acrescidas de
diferentes antibióticos. Os antibióticos testados foram ampicilina (Amershan Biosciences,
Cleveland, Ohio - E.U.A.), cloramfenicol (USB
TM
, Ohio - E.U.A.), kanamicina (Sigma,
Alemanha), espectinomicina (Sigma, Alemanha), estreptomicina (ICN Biomedicals, Alemanha),
tetraciclina (Amershan Biosciences, Cleveland, Ohio - E.U.A.) e rifampicina (Fisher
BioReagents, Índia). O mesmo volume do isolado Xcc CNPH 17 foi espalhado em duplicatas de
placas com e sem antibióticos e estas foram incubadas a 28
o
C por 3 dias. A avaliação de
resistência/ suscetibilidade foi realizada pela contagem do número de colônias em cada placa.
4.8.1. Seleção de Mutantes de Xcc CNPH 17 Resistentes à Rifampicina
Um total de 2,5 x 10
9
UFC de Xcc isolado CNPH 17 foram distribuídas em 10 placas de
Petri contendo meio Ágar-Nutriente acrescido de 50 μg/mL de rifampicina (Fisher BioReagents,
Índia). O mesmo foi repetido para uma concentração menor de rifampicina (25 μg/mL). Após
incubação das placas a 28
o
C por 3 dias a presença de mutantes espontâneos foi avaliada.
4.9. Investigação do Mecanismo da Resistência: Reação de Hipersensibilidade?
Os ecótipos selecionados como resistentes (CS 1308, CS 1566 e CS 1643) foram testados
com uma suspensão bacteriana com 5 x 10
8
UFC/mL do isolado Xcc CNPH 17. A inoculação
deste isolado foi feita por infiltração com seringa de 1 mL (sem agulha) na metade da superfície
abaxial da folha. O desenvolvimento de sintomas foi monitorado 7 h, 24 h e 48 h após a
inoculação.
- 25 -
5. Resultados
- 26 -
5.1. Otimização do Método de Inoculação de Arabidopsis
Dois ecótipos de Arabidopsis, CS1308 e Col-0 (gi-2), com 4 semanas de idade e crescidos
em luz contínua foram utilizados para testar o método de inoculação de Xcc mais eficiente. O
isolado de Xcc utilizado foi o CNPH 17 na concentração de 5 x 10
7
UFC/mL. As plantas foram
inoculadas de quatro formas: 1) pulverização; 2) corte com tesoura infestada; 3) aplicação com
algodão e 4) infiltração com seringa. O aparecimento de sintomas foi avaliado 72 h e 7 dias após
a inoculação. O controle positivo, Brassica oleracea var. capitata cv. Kenzan desenvolveu
sintomas de encharcamento seguido de necrose, conforme esperado. Nos dois ecótipos de
Arabidopsis testados, o método de infiltração com seringa foi o que melhor produziu sintomas de
clorose e/ou necrose, em ambos os tempos de avaliação.
5.2. Otimização da Concentração de Inóculo
Para determinar a concentração do inóculo mais adequada para identificar diferenças de
sintomas entre ecótipos de Arabidopsis, três ecótipos escolhidos aleatoriamente (CS 1466, CS
1308 e Col-0), foram inoculados com Xcc CNPH 17 nas concentrações de 5 x 10
6
UFC/mL e 5 x
10
8
UFC/mL. As plantas foram crescidas em luz contínua e tinham 5 semanas de idade. No
período de 24 h após a inoculação com Xcc, não foi detectado sintoma em nenhum dos ecótipos,
nem mesmo na concentração bacteriana de 5 x 10
8
UFC/mL. Aos dois dias pós-inoculação, todos
os ecótipos inoculados com 5 x 10
8
UFC/mL começaram a exibir sintomas de clorose, enquanto
- 27 -
que nenhum sintoma foi detectado em plantas inoculadas com a concentração de 5 x 10
6
UFC/mL.
Aos oito dias pós-inoculação, as plantas testadas com a concentração de 5 x 10
6
UFC/mL
mostraram sintomas distintos. Observou-se que o ecótipo Col-0 foi o que apresentou maior
suscetibilidade, o ecótipo CS 1466 apresentou suscetibilidade intermediária e o ecótipo que se
mostrou mais resistente foi o CS 1308. Desta maneira, para identificar diferenças na progressão
de sintomas entre ecótipos, a concentração de 5 x 10
6
UFC/mL foi a mais discriminante.
5.3. Identificação de Ecótipos de Arabidopsis Resistentes à Xcc
5.3.1. Análise Comparativa da Severidade de Sintomas a Xcc em Germoplasma de
Arabidopsis
Para identificar diferenças entre ecótipos de A. thaliana quanto à suscetibilidade ao
isolado CNPH 17 de Xcc, 33 ecótipos foram inoculados com suspensão bacteriana na
concentração de 5 x 10
6
UFC/mL, pelo método de infiltração com seringa. Todas as plantas
foram mantidas em luz contínua durante seu crescimento e entre a 3
a
e a 4
a
semana foram
utilizadas para a realização dos experimentos. O monitoramento dos sintomas foi realizado entre
os dias 5 e 7 após a inoculação.
Todos os 33 ecótipos foram testados pelo menos uma vez e alguns foram repetidos. Não
foi identificado nenhum ecótipo que apresentasse resistência completa a Xcc CNPH 17 nas
condições testadas.
- 28 -
Os dados de grau de severidade de doença (escala descritiva 0 a 5) de oito experimentos
diferentes foram consolidados para análise estatística com o programa SAS
®
. A análise de
variância (ANAVA) foi realizada usando delineamento em blocos (4 blocos, 33 ecótipos com 30
repetições) com dados desbalanceados. Os resultados indicaram que houve diferença
estatisticamente significativa entre todos os ecótipos testados (P < 0,0001).
O teste de médias (Tukey) foi utilizado para identificar os grupos estatisticamente
semelhantes e diferentes em relação à severidade de sintomas da doença. Os 33 ecótipos
analisados puderam ser divididos em grupos distintos. O grupo que apresentou maior resistência
à Xcc CNPH 17 foi composto dos ecótipos CS 903, CS 1308, CS 1540, CS 1566 e CS 1643. O
grupo que apresentou maior suscetibilidade foi o dos ecótipos CS1020, CS 1064, CS 1194, CS
6181, CS 6604 e CS 6674. Os demais ecótipos apresentaram resistência intermediária. O ecótipo
CS 1492 também apresentou alta suscetibilidade, apesar de não estar no grupo dos ecótipos mais
suscetíveis (Figura 3).
Figura 3. Sumário dos resultados da análise estatística referente à resposta de diferentes ecótipos
de Arabidopsis ao isolado CNPH 17 de Xcc. Os ecótipos foram divididos em três grupos, com
resistência crescente da esquerda para a direita.
- 29 -
Os ecótipos resistentes CS 1308, CS 1566 e CS 1643 foram escolhidos para
caracterização mais detalhada. Os ecótipos suscetíveis CS 1194 e CS 1492, por apresentarem
fenótipo contrastante, também foram escolhidos. A comparação direta destes ecótipos crescidos
em luz contínua também foi realizada (Figura 4, 5 e 6).
Sete a dez plantas por ecótipo, com 3 a 4 semanas de idade, foram inoculadas por
infiltração (com seringa) com suspensão bacteriana na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL do
isolado CNPH17 de Xcc. Três folhas de cada planta foram inoculadas. A primeira avaliação de
severidade de sintomas foi realizada no quinto dia após a inoculação. O controle positivo
utilizado foi planta de repolho cv. Kenzan inoculado com Xcc e apresentou sintomas conforme
esperado.
Figura 4. Grau de severidade dos sintomas em ecótipos de A. thaliana, no quinto dia após
0
1
2
3
4
5
CS1194 CS1308 CS1492 CS1566 CS1643
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=29
n=17
n=27
n=29
n=14
inoculação com Xcc CNPH17. As colunas pretas correspondem aos ecótipos suscetíveis e as
cinzas aos ecótipos resistentes. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas utilizadas no
experimento (n). Grau de severidades dos sintomas representado pela escala descritiva: 0- folhas
- 30 -
sem sintomas, 1- folhas com raras lesões, 2- clorose em 10% da área inoculada, 3- clorose em
50% da área inoculada, 4- clorose em toda área inoculada e 5- área inoculada totalmente
necrosada. As barras verticais representam o erro padrão.
igura 5. Ecótipos de Arabidopsis suscetíveis a Xcc CNPH 17, CS 1194 e CS 1492, no oitavo
Figura 6. Ecótipos de Arabidopsis resistentes a Xcc CNPH 17, CS 1308, CS 1566 e CS 1643, no
F
dia após a inoculação. A metade da folha indicada pela seta foi inoculada por infiltração com
seringa com tampão 10 mM MgCl
2
– controle (parte superior da figura) ou com suspensão
bacteriana de 5x 10
6
UFC/mL do isolado Xcc CNPH 17 (parte inferior da figura).
oitavo dia após a inoculação. A metade da folha indicada pela seta foi inoculada por infiltração
com seringa com tampão 10 mM MgCl
2
– controle (parte superior da figura) ou com suspensão
bacteriana de 5 x 10
6
UFC/mL do isolado Xcc CNPH17 (parte inferior da figura).
- 31 -
5.3.2. Influência do Fotoperíodo na Resistência à Xcc
Para verificar se as condições de fotoperíodo presentes durante o crescimento das plantas
podiam interferir no desenvolvimento dos sintomas à Xcc, os ecótipos resistentes (CS 1308, CS
1566 e CS 1643) e os suscetíveis (CS 1194 e CS 1492) foram crescidos em dias curtos (8 h luz/
16 h escuro) por 5 a 6 semanas. A concentração de Xcc CNPH 17 utilizada para a inoculação dos
ecótipos foi 5 x 10
6
UFC/mL. O controle positivo utilizado foi o repolho cv. Kenzan. A
severidade de sintomas foi registrada segundo a escala descritiva de severidade dos sintomas e a
primeira avaliação foi realizada no quinto dia após a inoculação (Figura 7).
Semelhantemente aos resultados obtidos em luz contínua, os ecótipos CS1308, CS1566 e
CS1643 mostraram-se mais resistentes a Xcc em relação aos ecótipos CS1194 e CS 1492.
0
1
2
3
4
5
Cs 1194 CS1308 CS1492 CS1566 CS1643
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=15
n=18
n=18
n=29
n=11
Figura 7. Grau de severidade dos sintomas em ecótipos de A. thaliana, no quinto dia após
inoculação com Xcc CNPH17. As colunas pretas correspondem aos ecótipos suscetíveis e as
cinzas aos ecótipos resistentes. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas utilizadas no
experimento (n). Grau de severidades dos sintomas representado pela escala descritiva: 0- folhas
- 32 -
sem sintomas, 1- folhas com raras lesões, 2- clorose em 10% da área inoculada, 3- clorose em
50% da área inoculada, 4- clorose em toda área inoculada e 5- área inoculada totalmente
necrosada. As barras verticais representam o erro padrão.
5.4. Análise Quantitativa de Clorofila em Ecótipos Resistentes e Suscetíveis
Para corroborar os resultados anteriores de resistência e suscetibilidade obtidos com base
na escala de grau de severidade e caracterizar com maior detalhe as respostas a Xcc, foi realizada
uma análise quantitativa ao longo do tempo dos níveis de clorofila total em plantas inoculadas
com Xcc e plantas controle. Os ecótipos suscetíveis tiveram uma maior queda nos níveis de
clorofila que os ecótipos resistentes. As Figuras 8 a 12 representam a quantificação de clorofila
dos ecótipos contrastantes de diferentes experimentos.
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculaçao
Clorofila a+b (mg/L) %
Dias pós-inoculação
Figura 8. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1194 em diferentes dias após inoculação com
tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 33 -
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L) %
Figura 9. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1492 em diferentes dias após inoculação com
tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL ( ------ ).
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós a inoculação
Clorofila a+b (mg/L)%
Dias pós-inoculação
Figura 10. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1308 em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 34 -
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L)%
Figura 11. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1566 em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L) %
Figura 12. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1643 em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 35 -
5.5. Análise da Resistência
Para verificar se os ecótipos CS1308, CS 1566 e CS 1643 resistentes ao isolado Xcc
CNPH 17 também seriam resistentes a outros isolados de Xcc, novos experimentos foram
realizados.
5.5.1. Resposta a um Isolado de Xcc de Outra Localidade
Para a realização deste experimento foram utilizados dois isolados de Xcc de localidades
diferentes: CNPH 17, obtido de uma lavoura de couve, em Brazlândia (DF), e CNPH 77, isolado
de uma lavoura de repolho, em São José dos Pinhais (PR).
Os ecótipos resistentes a Xcc CNPH 17, CS 1308, CS 1566 e CS 1643 e o ecótipo CS 1438,
com resistência intermediária foram inoculados com concentração bacteriana de 5 x 10
6
UFC/mL
do isolado CNPH 17 e CNPH 77. Em todos os ecótipos houve maior severidade de sintomas com
o isolado Xcc CNPH 77 que com o isolado Xcc CNPH 17. Dentre os ecótipos testados, CS 1566
foi aquele que demonstrou menor severidade de sintomas para o isolado CNPH 77 (Figuras 13 a
16). Nenhum sintoma foi detectado nos controles inoculados com tampão 10 mM MgCl
2
. Estes
resultados foram confirmados em um segundo experimento.
- 36 -
0
1
2
3
4
5
CS 1308 CS 1438 CS 1566 CS 1643
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=24
n=21
n=19
n=20
n=21
n=22
n=22
n=24
Figura 13. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação CNPH 77 (colunas pretas) e Xcc CNPH 17 (colunas cinzas). Para cada ecótipo
foi indicado o número de folhas analisadas no experimento (n). As barras verticais em cada
coluna representam o erro padrão.
Figura 14. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1308, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. A metade da folha indicada pelas setas foi inoculada, por
infiltração com seringa, com tampão 10 mM MgCl
2
(controle) ou com suspensão bacteriana
- 37 -
(Xcc), na concentração de 5x 10
6
UFC/mL, dos isolados Xcc CNPH 17 e CNPH 77, conforme
indicado.
Figura 15. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1566, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. A metade da folha indicada pelas setas foi inoculada, por
infiltração com seringa, com tampão 10 mM MgCl
2
(controle) ou com suspensão bacteriana
(Xcc), na concentração de 5x 10
6
UFC/mL, dos isolados Xcc CNPH 17 e CNPH 77, conforme
indicado.
Figura 16. Severidade de sintomas no sexto dia após a inoculação do ecótipo CS 1643, inoculado
com diferentes isolados de Xcc. A metade da folha indicada pelas setas foi inoculada, por
infiltração com seringa, com tampão 10 mM MgCl
2
(controle) ou com suspensão bacteriana
- 38 -
(Xcc), na concentração de 5x 10
6
UFC/mL, dos isolados Xcc CNPH 17 e CNPH 77, conforme
indicado.
5.5.2. Resposta de Ecótipos resistentes à Xcc CNPH 17 a Outro Fitopatógeno
Na tentativa de verificar a amplitude de resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS
1643, resistentes ao isolado de Xcc CNPH 17, foi feito um novo experimento utilizando como
patógeno, Ralstonia solanacearum (Rs CNPH 221). O ecótipo CS 1194, suscetível a Xcc CNPH
17 também foi utilizado neste experimento. Resultados preliminares demonstraram que o ecótipo
CS 1308 mostrou-se mais resistente no primeiro dia de avaliação (décimo dia após a inoculação).
Isso foi confirmado no décimo quinto dia após a inoculação, no qual este ecótipo continuou
sendo mais resistente. Os ecótipos CS 1566 e CS 1643 mostraram ter uma resistência
intermediária a este isolado e o CS 1194 mostrou ser suscetível. Novos experimentos são
necessários para a confirmação destes dados.
A Tabela 2 mostra uma análise comparativa entre os resultados obtidos para Xcc CNPH
17, Xcc CNPH 77, Rs CNPH 221. Portanto, a resistência destes ecótipos variou com a espécie de
fitobactéria. O ecótipo CS 1308 apresentou resistência a Xcc CNPH 17 e Rs CNPH 221, mas
uma resistência intermediária a Xcc CNPH 77. Em contrapartida, o ecótipo CS 1566 mostrou-se
resistente ao Xcc CNPH 17 e Xcc CNPH 77, mas uma resistência intermediária a Rs CNPH 221.
O ecótipo CS 1194 apresentou sintomas que o caracterizaram como suscetível para os três
patógenos analisados.
- 39 -
Tabela 2. Análise comparativa da resposta de ecótipos de Arabidopsis a três fitobactérias.
- resistência; RI - resistência intermediária; S - suscetibilidade
5.6. Teste da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 à Antibióticos
Para testar a sensibilidade de Xcc CNPH 17 a diferentes antibióticos, placas de meio
Ágar-N
Ecótipo Xcc CNPH 17 Xcc CNPH 77 RS CNPH 21
CS 1308
R
a
RI
b
R
a
CS 1566 R
a
R
a
RI
b
CS 1643 R
a
RI
b
RI
b
CS 1194
S
c
S
c
S
c
R
a b c
utriente foram preparadas com diferentes concentrações de antibióticos e plaqueadas com
o isolado Xcc CNPH 17. Como esperado, nas placas controle (sem antibiótico) ocorreu
crescimento de Xcc. Nas demais placas que continham antibióticos, com exceção ao antibiótico
ampicilina, não foram detectadas colônias, indicando que o isolado de Xcc CNPH 17 não
apresenta resistência aos antibióticos cloramfenicol, kanamicina, espectinomicina,
estreptomicina, tetraciclina e rifampicina nas concentrações testadas. Entretanto, nas placas
contendo o antibiótico ampicilina na concentração de 25 μg/mL foram observadas várias colônias
bacterianas, embora elas apresentassem crescimento mais lento que aquele das placas controle
(Tabela 3). Portanto, Xcc CNPH 17 apresenta alguma resistência ao antibiótico ampicilina.
- 40 -
5.7. Isolamento de Mutante de Xcc Resistente à Rifampicina
Inicialmente foram preparadas 10 placas NA contendo 50 µg/mL de rifampicina e o
mesmo volume do isolado Xcc CNPH 17 foi depositado em placas com e sem esse antibiótico.
Em seguida, estas foram incubadas a 28
o
C por 3 dias. Após o terceiro e quarto dias, pôde-se
verificar apenas crescimento de bactérias nas placas controle. Portanto, nessa concentração de
rifampicina não foi possível isolar mutantes resistentes a esse antibiótico. Em contrapartida, entre
as placas NA contendo 25 μg/mL de rifampicina, foram observadas duas colônias mutantes e
com taxa de mutação de 0,8x 10
-9
.
Tabela 3. Sensibilidade de Xcc isolado CNPH 17 a antibióticos em diversas concentrações.
Antibiótico Concentração Número de UFC
Controle 1* - 595 ± (88,2)
a
Ampicilina 25 µg/mL 156,5 ± (43,1)
a
Ampicilina 50 µg/mL 10 ± (7,1)
a
Cloramfenicol 25 µg/mL 0
Cloramfenicol 50µg/mL 0
Kanamicina 25 µg/mL 0
Kanamicina 50 µg/mL 0
Espectinomicina 25 µg/mL 0
Espectinomicina 50µg/mL 0
Estreptomicina 25 µg/mL 0
Estreptomicina 50 µg/mL 0
Tetraciclina 25 µg/mL 0
Tetraciclina 50 µg/mL 0
- 41 -
Controle 2* - 92,5 ± (6,4)
a
Rifampicina 25 µg/mL 0
Rifampicina 50 µg/mL 0
Rifampicina 100 µgl/mL 0
a
Experimento realizado em duplicata. É mostrada a média de UFC contadas ± o desvio padrão.
*O número de controles refere-se a experimentos realizados em dias diferentes.
5.8. Investigação do Mecanismo de Resistência: Reação de Hipersensibilidade?
Uma reação de hipersensibilidade pode ser visualizada macroscopicamente através da
inoculação com alta concentração bacteriana, sendo detectada como uma extensa necrose foliar
algumas horas após a inoculação. Para determinar se a resistência a Xcc CNPH 17 apresentada
pelo ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643 está relacionada a uma reação de hipersensibilidade
(RH), três a dez plantas de cada ecótipo foram cultivadas em fotoperíodo de dias curtos e
inoculadas por infiltração com seringa, com uma concentração bacteriana de 5 x 10
8
UFC/mL. Os
sintomas foram monitorados 7 h, 24 h e 48 h após a inoculação. Nenhum dos ecótipos apresentou
sintomas de reação de hipersensibilidade, sugerindo que o mecanismo de defesa contra esse
isolado não envolva esse tipo de reação. Este experimento foi independentemente repetido com
os mesmos resultados.
- 42 -
5.9. Análise Genética
Inicialmente foi realizado cruzamento entre dois ecótipos contrastantes: Col-0 (suscetível)
x CS 1308 (resistente). A progenia, F1 e F2, foi obtida. As plantas cultivadas em fotoperíodo de
dias curtos dos ecótipos contrastantes (parentais) e da progenia foram inoculadas com seringa,
com suspensão bacteriana de Xcc CNPH 17, na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL. Durante o
período de avaliação, iniciada no quinto dia após a inoculação, não foi observada diferença
significativa no desenvolvimento de sintomas que fosse suficientemente divergente na progenia e
entre os parentais deste cruzamento. Por isso, a caracterização da herança gênica não foi
realizada. Novos cruzamentos estão sendo feitos utilizando com ecótipo suscetível CS 1194, que
tem elevado grau de suscetibilidade ao isolado em estudo, e como ecótipos resistentes foram
utilizados: CS 1308, CS 1566 e CS 1643.
- 43 -
6. Discussão
- 44 -
Arabidopsis continua sendo a planta mais bem estudada. O ecótipo Columbia foi
seqüenciado em 2000 e existem populações dos ecótipos Columbia, Wassilewskija e Lansdberg
mutagenizadas quimicamente ou por inserção de T-DNA. Até recentemente, a maioria dos
grupos estudando Arabidopsis focalizou seus esforços apenas nestes poucos ecótipos. Existe, no
entanto, uma grande riqueza de germoplasma de Arabidopsis, com ecótipos provenientes de
várias partes do mundo. Alguns estudos, particularmente aqueles dedicados à interação patógeno-
hospedeiro devem encontrar novas oportunidades para expansão do conhecimento ao analisar
novos ecótipos. É sabido que pode haver variação genética tanto do lado do patógeno, quanto do
lado do hospedeiro e que isto influencia a interação entre os mesmos. Por exemplo, enquanto uma
determinada combinação pode estar associada a uma situação de resistência, outra leva a um
quadro de doença. Para ilustrar com uma situação específica, quando Pseudomonas syringae pv.
tomato portadora do gene de avirulência avrRps2 é inoculada em Arabidopsis do ecótipo
Columbia que contém o gene de RPS2, ocorre uma resposta de resistência acompanhada de
reação de hipersensibilidade. Já quando outro ecótipo que não contém RPS2 é inoculado, esse
tipo de reação não é observada (Kunkel et al., 1993). Em outro exemplo, o trabalho de Tsuji et.
al. (1991) demonstra contraste na resposta entre dois ecótipos de Arabidopsis, Col e Pr-0, ao
isolado Xcc 2D520 cuja base genética estava relacionada com um gene dominante, RXC1. Neste
trabalho, o ecótipo Col mostrou-se tolerante ao patógeno, não havendo diferença no crescimento
bacteriano entre os dois ecótipos. Em contrapartida, O ecótipo Pr-0 suscetível ao isolado Xcc
2D520, por conter um alelo recessivo, rxc1-2, mostrou sintomas de clorose e necrose após a
infecção. Assim, cada combinação patógeno/hospedeiro ajuda a identificar novos elementos
relacionados à suscetibilidade ou resistência (Quirino & Bent, 2003).
- 45 -
O patossistema Arabidopsis/Xanthomonas campestris pv. campestris é particularmente
atrativo para novos estudos uma vez que ambos participantes da interação já possuem seus
genomas completamente seqüenciados e disponíveis publicamente (INITIATIVE, 2000, Silva et
al., 2002). Os estudos aqui descritos focalizaram na interação entre o isolado brasileiro CNPH 17
de Xcc e 33 ecótipos de Arabidopsis de procedência geográfica variada, em sua maioria pouco
estudados. Até o presente momento não há nenhum relato na literatura descrevendo o isolado Xcc
CNPH 17 (Alice Quezado, comunicação pessoal).
A podridão-negra é um problema mundial que afeta crucíferas (Williams, 1980),
particularmente as culturas de repolho (Brassica oleracea var. capitata) e couve (B. oleracea var.
acephala) onde o produto comercializado é a folha (Lopes & Quezado-Soares, 1997).
Xanthomonas campestris pv. campestris é um patógeno que pode invadir a planta pelos
hidatódios, ferimentos ou estômatos (Williams 1980, Lopes &Quezado-Soares, 1997). Quando a
infecção se inicia pelos hidatódios forma-se uma área clorótica, em forma de V, na borda das
folhas. No caso de entrada por estômatos ou ferimentos, como aqueles causados pelas traças-das-
crucíferas, a lesão formada é arredondada. Plantas muito infectadas, quando cortadas, revelam
enegrecimento das nervuras, devido à colonização do sistema vascular pela bactéria (Lopes &
Quezado-Soares, 1997). Assim, Xcc pode ter contato com o mesófilo inicialmente nos casos de
infecção por via estomática ou ferimentos. Também nos estágios mais avançados da infecção via
hidatódios Xcc foi observada por microscopia eletrônica no mesófilo foliar (Bretschneider et al.,
1989). Conclui-se, portanto, que dependendo da forma de entrada e do estágio do processo de
infecção do tecido, Xcc interage com diferentes tecidos da planta. Cada ponto de interação entre
Xcc e a planta representa uma oportunidade para estudos de como um determinado tecido reage à
presença do patógeno.
- 46 -
Em estudos laboratoriais utilizando o patossistema Arabidopsis/Xcc, diferentes
procedimentos de inoculação podem ser utilizados, havendo diversos exemplos na literatura. Em
seu trabalho, Hugouvieux et al. (1998) utilizou folhas destacadas ou fixas na planta para imersão
em suspensão bacteriana. Nestas condições, Xcc entrou preferencialmente na folha via
hidatódios. Um outro procedimento utilizado para infecção é a pulverização da suspensão
bacteriana (Lummerzheim et al., 1993, Godard et al., 2000, Lummerzheim et al., 2004). Meyer et
al. (2005) mostrou que o método de inoculação por ferimento da nervura central da folha foi o
que melhor permitiu a colonização do sistema vascular e a manifestação de sintomas típicos da
podridão-negra, em comparação aos métodos de infiltração foliar com suspensão bacteriana de
10
9
UFC/mL seguida de manutenção das plantas a 100% umidade por 2 dias e infiltração foliar
com suspensão bacteriana a 5 x 10
5
UFC/mL.
Para realização do trabalho aqui descrito, alguns métodos de inoculação foram testados e
verificou-se que o método por infiltração com seringa foi o que melhor produziu sintomas de
clorose e/ou necrose. Cada método de inoculação é mais adequado ao estudo de um determinado
passo da interação patógeno-hospedeiro. O método do ferimento desenvolvido por Meyer et al.
(2005) leva ao aparecimento do enegrecimento das nervuras e é particularmente adequado a
estudos de mecanismos que afetem a colonização do sistema vascular. A metodologia de
infiltração foliar empregada no presente trabalho é adequada para o estudo das interações entre
Xcc e o mesófilo foliar. Em relação a outros métodos como o de pulverização e imersão da folha
em suspensão bacteriana, a infiltração foliar tem a vantagem de permitir um melhor controle
sobre a quantidade de bactéria que efetivamente penetra na folha. O desenvolvimento de
sintomas de clorose, após infiltração com seringa, mostrou-se altamente reproduzível e é
comparável a uma situação de campo onde a entrada de Xcc pode se dá por estômatos ou por
ferimentos. A concentração que possibilitou um melhor discernimento de variações de sintomas
- 47 -
foi 5 x 10
6
UFC/mL. Os sintomas variaram desde simples pontos cloróticos a total necrose. A
concentração de 5 x 10
8
UFC/mL mostrou-se extremamente alta e não discriminante, uma vez
que os diferentes ecótipos testados mostraram os mesmos sintomas. Baseado nestes resultados foi
observado que nenhum ecótipo mostrou ser totalmente resistente a este patógeno. Comparada a
uma situação de campo, as concentrações bacterianas utilizadas no laboratório para realização de
experimentos são maiores. Populações epífitas de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv),
bactéria causadora da mancha-bacteriana em pimentão (Capsicum annuum L.), foram avaliadas
em cultivares resistentes e suscetíveis. No campo, cultivares suscetíveis e resistentes
apresentaram quantidades distintas de população de Xcv. Em geral, a população bacteriana foi
menor em pimentões resistentes, atingindo 10
4
colônias por g de “peso fresco”, sendo que em um
dos experimentos atingiam 3 x 10
3
por g (Pernezny & Collins, 1997).
A variação genética entre ecótipos de Arabidopsis já tem sido explorada em estudos de
interação patógeno-hospedeiro. No presente trabalho, 33 ecótipos de Arabidopsis foram testados
com o isolado brasileiro de Xcc CNPH 17. Inicialmente, por razões práticas, os experimentos
foram realizados com plantas crescidas em luz contínua e os diferentes ecótipos apresentaram
variação na resposta a esse patógeno. Os ecótipos CS 1308, CS 1566, CS 1643 mostraram-se
resistentes enquanto que CS 1194 e CS 1492 estavam entre os suscetíveis. Entretanto, pode-se
observar que não houve correlação entre a procedência geográfica dos ecótipos e o fato de ser
resistente. Estes cinco ecótipos com fenótipos contrastantes foram selecionados para
caracterização mais detalhada.
Interessantemente, o ecótipo Columbia-0 foi identificado como suscetível ao isolado Xcc
CNPH 17, desenvolvendo claros sintomas de clorose seguido de necrose. Este resultado contrasta
com o de outros trabalhos, como os de Tsuji et al. (1991), Buell & Sommerville (1997) e
Lummerzheim et al. (1993), onde este mesmo ecótipo apresentou-se resistente aos isolados de
- 48 -
Xcc 2D520 e 147. O trabalho de Tsuji et al. (1991) mostra que Columbia (Col-0) é tolerante ao
isolado Xcc 2D520, havendo crescimento bacteriano sem o desenvolvimento de sintomas. Esta
divergência de resultados ressalta o fato de que um determinado ecótipo ou variedade de planta
pode ser resistente para um isolado de um patógeno, mas suscetível para outro. Assim, variedades
importadas ditas como resistentes podem não mostrar resistência em razão da diversidade do
patógeno em diferentes locais.
A fisiologia de Arabidopsis pode ser influenciada pelas condições de fotoperíodo,
particularmente a transição entre o estado vegetativo e o reprodutivo (Levy & Dean, 1998,
Oliveira, 1999). Em luz contínua, a maioria dos ecótipos havia florescido quando os
experimentos foram realizados. Em contrapartida, ecótipos expostos a dias curtos apresentaram
um atraso no florescimento, e apresentaram, em sua maioria, apenas as rosetas no momento da
inoculação. Assim, um dos primeiros aspectos focalizados foi determinar se os fenótipos de
resistência e suscetibilidade identificados em condições de luz contínua seriam modificados em
condições de dias curtos. O comportamento dos ecótipos selecionados como resistentes e
suscetíveis foi semelhante em ambos os fotoperíodos, ou seja, os ecótipos CS1308, CS1566 e
CS1643 mostraram-se mais resistentes ao isolado Xcc CNPH 17 em relação aos ecótipos CS1194
e CS 1492. Para corroborar esses resultados e caracterizar com maior detalhe as respostas a Xcc,
foi realizada uma análise quantitativa ao longo do tempo dos níveis de clorofila total em plantas
inoculadas com Xcc. Os ecótipos suscetíveis tiveram uma maior queda nos níveis de clorofila em
relação aos ecótipos resistentes. Esses resultados confirmaram a resistência dos ecótipos CS
1308, CS 1566 e CS 1643.
Para verificar a abrangência da resistência dos ecótipos escolhidos, o isolado de Xcc
CNPH 77 e o isolado CNPH 221 de Ralstonia solanacearum foram utilizados em novos
experimentos. Primeiramente, os ecótipos resistentes de Arabidopsis foram inoculados com os
- 49 -
isolados Xcc CNPH 17 e CNPH 77. Pôde-se observar que os ecótipos CS1308, CS1438
(resistência intermediária) e CS 1643 apresentaram-se como suscetíveis ao isolado Xcc CNPH
77. Dentre os ecótipos testados, CS1566 apresentou o menor grau de sintomas da doença para
Xcc CNPH 77, apresentando resistência, ainda que inferior àquela observada contra o isolado
CNPH 17. Aparentemente, o isolado CNPH 77 tem se mostrado mais severo que o isolado CNPH
17 em inoculações realizadas em hospedeiros como couve e repolho (Alice Quezado Duval,
comunicação pessoal). Assim, embora a resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1438 e CS 1643
possa ser ineficiente contra isolados muito agressivos de Xcc, possivelmente ainda será eficaz
contra outros isolados. Em outro experimento, agora com a bactéria R. solanacearum CNPH 221,
o ecótipo CS 1308 mostrou ser resistente. Os ecótipos CS 1566 e CS 1643 mostraram ter uma
resistência intermediária. Novos experimentos deverão ser realizados para confirmação destes
resultados. Portanto, o presente trabalho sugere que o ecótipo CS 1308 apresenta resistência
efetiva contra Xcc CNPH 17 e outro fitopatógeno de importância agrícola, R. solanacearum. A
resistência apresentada pelo ecótipo CS 1566 também se apresenta como a mais promissora, pois
foi efetiva contra dois isolados de Xcc, sendo um deles sabidamente mais agressivo.
Baseado nestes resultados foi observado que entre essas fitobactérias, o isolado Xcc
CNPH 17 e Rs CNPH 221 mostraram respostas mais parecidas aos ecótipos testados em relação
ao isolado Xcc CNPH 77.
A reação de hipersensibilidade (RH) é caracterizada como uma resposta de resistência à
presença do patógeno em uma planta hospedeira. Essa resposta é iniciada com uma morte rápida
das células (necrose) no local da infecção, impedindo o avanço do patógeno pela planta
(Gachomo et al., 2003). A reação de hipersensibilidade é um tipo de morte celular programada
(Greenberg & Yao, 2004). Trabalhos que utilizam o patossistema Arabidopsis/Xcc têm mostrado
- 50 -
que alguns ecótipos apresentam resistência a um determinado isolado de Xcc, desenvolvendo
reação de hipersensibilidade (Lummerzheim et al., 1993, Godard et al., 2000).
Para determinar se as resistências observadas nos ecótipos CS 1308, CS1566 e CS 1643
poderiam estar associadas a uma reação de hipersensibilidade, uma alta concentração de Xcc
CNPH 17, 5 x 10
8
UFC/ mL, foi utilizada para inocular as plantas. O desenvolvimento de
sintomas foi monitorado 7, 24, 48 horas após a inoculação. Nenhum sintoma característico de RH
foi observado mesmo após 48 horas. Este resultado sugere que o mecanismo de defesa desses
ecótipos não está associado a uma reação de hipersensibilidade.
Para caracterizar o mecanismo de resistência envolvidos na resposta ao isolado Xcc
CNPH 17, podem ser feitos estudos de crescimento populacional bacteriano ao longo do tempo
após inoculação, bem como de perdas eletrolíticas, exemplificado pelo trabalho de Romero et al.,
2002. Para a obtenção das curvas de crescimento é interessante se trabalhar com bactérias
resistentes a um antibiótico que possa ser utilizado em placas para reduzir a contaminação. Com
este intuito, foi feito inicialmente uma avaliação da resistência/suscetibilidade do isolado Xcc
CNPH 17 a vários antibióticos. O isolado de Xcc CNPH 17 não apresentou resistência a nenhum
dos antibióticos testados, a saber, cloramfenicol, kanamicina, espectinomicina, estreptomicina,
tetraciclina e rifampicina nas concentrações testadas. Xcc CNPH 17 apresentou algum nível de
resistência a ampicilina, entretanto, a baixa resistência encontrada não é adequada para sua
utilização em experimentos para determinação de curvas de crescimento. Dados estes resultados,
foi necessário adotar uma outra estratégia: a obtenção de mutante espontâneo para rifampicina.
O antibiótico rifampicina atua inibindo a RNA polimerase presente em patógenos como as
bactérias, interrompendo o processo de transcrição (Campbell et al., 2001). Este antibiótico vem
sendo utilizado em vários trabalhos que utilizaram o patossistema A. thaliana – Xcc (Simpson &
Johnson, 1990, Tsuji et al., 1991, Aufsatz & Grimm, 1994, Buell & Somerville, 1997,
- 51 -
Hugouvieux et al., 1998). A taxa de mutação observada para o antibiótico sorangicina A foi de 2
x 10
-8
. Este antibiótico, assim como o antibiótico rifampicina, atua inibindo a RNA polimerase
(Xu et al., 2005). Neste trabalho foram isolados dois mutantes espontâneos, correspondendo a
uma taxa de mutação de 0,8 x 10
-9
, semelhante àquela obtida em outros trabalhos.
Para caracterizar a herança genética envolvida na resistência ao isolado CNPH 17, foram
feitos cruzamentos utilizando o ecótipo Columbia (Col), suscetível a esse isolado, como um dos
parentais. Esta escolha foi baseada em resultados preliminares de suscetibilidade associados ao
fato de que o ecótipo Col está seqüenciado e possui um grande número de marcadores
moleculares desenvolvidos. Entretanto, a progenia gerada do cruzamento entre Col x CS 1308
não mostrou diferença no desenvolvimento de sintomas que fosse suficientemente divergente
para estudo da herança genética. Por isso, a caracterização da herança gênica não foi concluída.
Novos cruzamentos estão sendo feitos utilizando com o ecótipo suscetível CS 1194, ecótipo este,
que sempre apresentou elevado grau de suscetibilidade ao isolado em estudo, e como ecótipos
resistentes foram utilizados: CS 1308, CS 1566 e CS 1643. Assim, estas novas populações
possibilitarão uma caracterização genética das resistências associadas a estes ecótipos.
- 52 -
7. Considerações finais
- 53 -
Baseado na caracterização do germoplasma de Arabidopsis no que diz respeito à interação
com o isolado de Xcc CNPH 17, foi possível verificar que:
1. Entre as quatro formas de inoculação testadas (pulverização, corte com tesoura
infestada, aplicação com algodão e infiltração com seringa), o método de infiltração
com seringa foi o que melhor produziu sintomas de clorose e/ou necrose.
2. A concentração do inóculo mais adequada para identificar diferenças na progressão de
sintomas entre ecótipos de Arabidopsis foi a concentração de 5 x 10
6
UFC/mL, por ser
a mais discriminante.
3. Para identificar diferenças quanto à suscetibilidade ao isolado CNPH 17 de Xcc, 33
ecótipos de A. thaliana foram inoculados com suspensão bacteriana na concentração
de 5 x 10
6
UFC/mL, pelo método de infiltração com seringa. Não foi identificado
nenhum ecótipo que apresentasse resistência completa a Xcc CNPH 17, nas condições
testadas.
4. Análise estatística dos dados de grau de severidade de doença de diferentes
experimentos mostrou que houve diferença significativa entre todos os ecótipos
testados. Através do teste de Tukey foi possível identificar grupos de ecótipos
estatisticamente semelhantes e diferentes em relação à severidade de sintomas da
doença.
- 54 -
5. Baseado na análise estatística, o grupo que apresentou maior resistência à Xcc CNPH
17 foi CS 903, CS 1308, CS 1540, CS 1566 e CS 1643 e o grupo que apresentou
maior suscetibilidade foi CS1020, CS 1064, CS 1194, CS 6181, CS 6604 e CS 6674.
Os demais ecótipos apresentaram resistência intermediária e o ecótipo CS 1492
também apresentou alta suscetibilidade apesar de não estar no grupo dos ecótipos mais
suscetíveis.
6. As condições de fotoperíodo, dias curtos e luz contínua, presentes durante o
crescimento das plantas não interferiram nos fenótipos de resistência e suscetibilidade
à Xcc. Tanto em luz contínua (16h luz/8h escuro) quanto em dias curtos (8h luz/16 h
escuro), os ecótipos CS1308, CS1566 e CS1643 mostraram-se resistentes a Xcc e os
ecótipos CS1194 e CS 1492 mostraram-se suscetíveis.
7. Uma análise quantitativa ao longo do tempo dos níveis de clorofila total em ecótipos
resistentes e suscetíveis mostrou que os ecótipos suscetíveis tiveram uma maior queda
nos níveis de clorofila em relação aos ecótipos resistentes.
8. Os ecótipos CS1308, CS1438, CS 1566 e CS 1643 selecionados como resistentes ao
isolado Xcc CNPH 17 foram testados com o isolado Xcc CNPH 77 e apresentaram
maior severidade de sintomas quando inoculados com este segundo isolado.
Entretanto, CS 1566 foi o que demonstrou menor severidade de sintomas para os dois
isolados. Estes mesmos ecótipos foram testados com o isolado Rs CNPH 221 e apenas
o CS 1308 mostrou-se resistente. Os ecótipos CS 1566 e CS 1643 apresentaram
- 55 -
resistência intermediária. O ecótipo CS 1194, também testado para esse isolado,
apresentou sintomas que o caracterizaram como suscetível.
9. O isolado de Xcc CNPH 17 é suscetível aos seguintes antibióticos: cloramfenicol,
kanamicina, espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina e rifampicina, nas
concentrações de 25 μg/mL e 50 μg/mL (por antibiótico). Entretanto, o antibiótico
ampicilina, nas concentrações de 25 μg/mL e 50mg/mL, apresentou quantidades
significativas de colônias bacterianas.
10. Foram isolados dois mutantes resistentes ao antibiótico rifampicina, na concentração
de 25 μg/ml, representando uma taxa de mutação de 0,8 x 10
-9
.
11. Uma concentração bacteriana de 5 x 10
8
UFC/mL foi utilizada para determinar se a
resistência a Xcc CNPH 17 apresentada pelo ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643
seria associada a uma reação de hipersensibilidade. Nenhum dos ecótipos apresentou
sintomas de reação de hipersensibilidade, sugerindo que o mecanismo de defesa
contra esse isolado não envolva este tipo de reação.
12. Cruzamento inicial entre os ecótipos Col (suscetível) x CS 1308 (resistente) não
mostraram diferenças no desenvolvimento de sintomas suficientes divergentes na
progenia para que fosse possível a caracterização da herança gênica. Entretanto, novos
cruzamentos estão sendo feitos utilizando como ecótipo suscetível CS 1194 e como
- 56 -
ecótipos resistentes: CS 1308, CS 1566 e CS 1643 para melhor caracterizar a
resistência envolvida com o isolado Xcc CNPH 17.
- 57 -
8. Perspectivas
- 58 -
Com os dados obtidos até o presente momento é relevante ressaltar a importância da
continuidade deste trabalho, pois a utilização deste patossistema torna viáveis estudos mais
avançados sobre que tipo de resistência envolvida, uma vez que já foi mostrado que os ecótipos
testados não desenvolveram reação de hipersensibilidade como mecanismo de defesa contra este
isolado de Xcc. A obtenção de curvas de crescimento bacteriano é uma ferramenta muito
utilizada para determinar o comportamento da bactéria na planta hospedeira e estudar o tipo de
mecanismo de defesa associado. Outras ferramentas são as sondas de genes associados a
proteínas PR (pathogenesis-related proteins). Trata-se de proteínas expressas pelas plantas como
uma das respostas ao processo de infecção. A utilização dessas sondas, através da técnica de
Northern Blot, permite verificar o comportamento da expressão dessas proteínas em ecótipos
contrastantes (resistentes/suscetíveis), uma outra maneira de caracterizar a resistência. Além
disso, a caracterização da resistência por meio de cruzamentos entre os ecótipos contrastantes e
da progenia (F1) pode viabilizar estudos de segregação do gene e/ou genes envolvidos com essa
resistência. A clonagem de genes de resistência tem sido muito utilizada pela comunidade
científica como alternativa aos problemas encontrados em cultivares economicamente
importantes. Por isso, é interessante localizar/identificar genes que poderiam estar envolvidos
com a interação de Arabidopsis e o isolado brasileiro de Xcc CNPH 17 e futura transferência
gênica para cultivares de brássicas de importância econômica, afetadas pela podridão-negra.
- 59 -
9. Referências Bibliográficas
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- 69 -
10. Apêndices
- 70 -
Apêndice A
Antibióticos, Produtos Químicos e Substrato
Produtos
Fornecedor
Agar Invitrogen, Carlsbad, CA (E.U.A.)
Ampicilina
Amershan Biosciences, Cleveland, Ohio
(E.U.A.)
Caseína Vetec, Rio de Janeiro, RJ (Brasil)
Cloramfenicol USB
TM
, Ohio (E.U.A.)
Cloreto de magnésio (hexahidratado) USB
TM
, Cleveland, Ohio (E.U.A.)
Extrato de carne Biobrás, Montes Claros, MG (Brasil)
UltraPure
TM
Glicerol Invitrogen, Carlsbad, CA (E.U.A.)
Kanamicina Sigma, Alemanha
MS Sigma, Alemanha
Peptona bacteriológica Biobrás, Montes Claros, MG (Brasil)
Rifampicina Fisher BioReagents, India
Espectiomicina Sigma, Alemanha
Estreptomicina ICN Biomedicals, Alemanha
Tetraciclina
Amershan Biosciences, Cleveland, Ohio
(E.U.A.)
Substrato Plantmax Hortaliças HT Eucatex Agro, Paulínia, SP (Brasil)
- 71 -
Apêndice B
Meios de Culturas
- Meio Ágar-Nutriente
Tabela 4. Preparo do meio NA.
Componentes Quantidade
Peptona Bacteriológica 5 gramas
Extrato de Carne 3 gramas
OBS: em 500mL de água destilada
O pH deste meio de crescimento foi ajustado para 6,8 - 7,2 e em seguida, foram
adicionados 10 gramas de ágar. Após o preparo, o meio foi autoclavado.
-
Meio MS ¼
Tabela 5. Preparo do meio MS.
Componentes Quantidade
Meio MS 0,535 gramas
OBS: em 500mL de água destilada
- 72 -
O pH deste meio de germinação foi ajustado para 5,7 com KOH e em seguida, foram
adicionados 3 gramas de ágar. Após o preparo, o meio foi autoclavado.
- Meio Kelman
Tabela 6. Preparo de meio Kelman
OBS: em 500mL de água destilada.
Componentes Quantidade/Volume
Glicerol 2,5 mL
Peptona bacteriológica 5 gramas
Caseína 0,5 gramas
O pH deste meio de crescimento foi ajustado para 7,0 e em seguida, foram adicionados 9
gramas de ágar. Após o preparo, o meio foi autoclavado.
- 73 -
Apêndice C
Soluções-estoque
- Antibióticos
Tabela 7. Preparo de solução estoque de diversos antibióticos.
Antibiótico Solução de Estoque
Ampicilina 50 mg/ mL em H
2
O
Clolamfenicol 34 mg/ mL em etanol
Kanamicina 10 mg/ mL em H
2
O
Rifampicina 25 mg/ mL em metanol
Espectinomicina 100 mg/ mL em H
2
O
Estreptomicina 10 mg/ mL em H
2
O
Tetraciclina 5 mg/ mL em etanol
OBS: A estocagem de todos os antibióticos foi a –20
o
C.
-
Solução Tampão Cloreto de Magnésio (MgCl
2
) 1M
Tabela 8. Preparo de solução-estoque cloreto de magnésio 1M
Componente Quantidade
Cloreto de magnésio hexahidratado 20,33 gramas em 100 mL de H
2
O
Após o preparo, a solução foi autoclavada.
- 74 -
Apêndice D
Bactérias
Tabela 9. Procedência dos isolados de Xanthomonas campestris pv. campestris
Isolado de Xcc Origem
Xcc CNPH 17 Brazlândia, DF
Xcc CNPH 77 São José dos Pinhais, PR
OBS: Todos os isolados foram gentilmente cedidos pela Dra. Alice M. Quezado-Duval
(Embrapa-Hortaliças).
Tabela 10. Procedência do isolado de Ralstonia solanacearum
Isolado de Rs Origem
Rs CNPH 221 Ponte Alta, DF
OBS: O isolado foi gentilmente cedido pelo Dr. Carlos Lopes (Embrapa-Hotaliças)
- 75 -
Apêndice E
Gráficos de severidade de sintomas de vários experimentos.
0
1
2
3
4
5
CS1020 CS1072 CS1308 CS1492 CS1540 CS1566 CS1640 CS 1643 CS6674 CS6922 CS6930 CS22353
Ecóti pos
Grau de severidade dos
sintomas
n=2 n=3
n=12
n=3
n=9
n=4
n=12
n=5
n=12
n=6
n=11
n=5
n=9
n=5
n=12
n=5
n=9
n=4
n=12
n=1
n=3
n=12
n=5
n=15
Figura 17. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação com Xcc CNPH 17 na concentração de 5x10
6
UFC/mL ou tampão MgCl
2
,
representado apenas pelo número de folhas. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas
utilizadas no experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
- 76 -
0
1
2
3
4
5
Col-0 CS 920 CS1298 CS1438 CS1566 CS1640 CS2223 CS6699 CS6922
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=3 n=3
n=7
n=6n=6n=2
n=9
n=5
n=8
n=5
n=9
n=3
n=8
n=9
n=5
n=9
n=3
n=11
Figura 18. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação com Xcc CNPH 17 na concentração de 5x10
6
UFC/mL ou tampão MgCl
2
,
representado apenas pelo número de folhas. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas
utilizadas no experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
- 77 -
0
1
2
3
4
5
CS1064 CS1084 CS1198 CS1643 CS6930 CS8580
Ecótipos
Grau de severidade dos sintoma
s
n=5 n=3
n=12
n=9
n=8
n=9
n=8
n=3
n=12
n=5
n=8
n=12
Figura 19. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação com Xcc CNPH 17 na concentração de 5x10
6
UFC/mL ou tampão MgCl
2
,
representado apenas pelo número de folhas. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas
utilizadas no experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
- 78 -
0
1
2
3
4
5
CS920 CS1298 CS1354 CS1540 CS1566 CS22353
Ecótipos
Grau de severidade dos sintoma
s
n=8 n=2
n=10
n=9
n=12
n=9
n=6
n=3
n=15
n=9
n=3
n=9
Figura 20. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação com Xcc CNPH 17 na concentração de 5x10
6
UFC/mL (colunas pretas) ou
tampão MgCl
2
, representado apenas pelo número de folhas. Para cada ecótipo está indicado o
número de folhas utilizadas no experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
- 79 -
Gráficos da quantificação do nível de clorofila em vários ecótipos.
- Ecótipo Columbia (Col)
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L) %
Figura 21. Quantificação de clorofila no ecótipo Columbia em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 80 -
- Ecótipo CS 6100
0
10
20
30
40
046
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L) %
Figura 22. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 6100 em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 81 -
- Ecótipo CS 1438
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculação
Clorofila a+b (mg/L) %
Figura 23. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1438 em diferentes dias após inoculação
com tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x
10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 82 -
Apêndice F
“Draft” de Artigo Científico a ser submetido.
- 83 -
Caracterização da Variabilidade Natural da Resposta a um Isolado Brasileiro de Xanthomonas
campestris pv. campestris em Arabidopsis thaliana
Carmo, L.S.T.
1
; Campos, P.F.
1
, Quezado-Duval, A. M.
2
, Leonardecz, E.
1
, Quirino, B.F.
1
1
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília,
SGAN 916 módulo B, Brasília 70790-160 DF, Brasil.
2
Embrapa Hortaliças - Rodovia BR- 060, Km 9. Brasília 70359-970 DF, Brasil.
* Autor para correspondência:
Dr. Betania Quirino
Universidade Católica de Brasília
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
SGAN 916 Av. W5 norte, módulo B,
70.790-160 Brasília, DF, Brasil.
Fones: (61)3448-7115
E-mail: [email protected]
- 84 -
Resumo
A podridão negra é uma doença que atinge várias brássicas, sendo um problema de escala
mundial. O patógeno causador dessa doença é Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc).
Diversos estudos vêm utilizando Arabidopsis thaliana como planta-modelo para aumentar o
entendimento das relações patógeno-hospedeiro, incluindo a clonagem de genes de resistência. O
objetivo deste trabalho foi caracterizar a reação de ecótipos de Arabidopsis com respostas
contrastantes (resistência x suscetibilidade) a Xcc. Trinta e três ecótipos foram testados com uma
suspensão bacteriana na concentração de 5x10
6
UFC/ mL do isolado brasileiro CNPH17 de Xcc.
Três destes ecótipos estavam entre os mais resistentes: CS 1308, CS1566 e CS1643. O nível de
clorofila foi quantificado nestes ecótipos resistentes, bem como nos ecótipos suscetíveis CS 1194
e CS 1492 para comparação. Em ecótipos resistentes, os níveis de clorofila total permaneceram
semelhantes aos dos controles enquanto que nos ecótipos suscetíveis houve grande queda nas
plantas inoculadas comparadas aos controles. Para testar a possibilidade de haver reação
hipersensitiva associada ao fenótipo de resistência, plantas dos três ecótipos resistentes
selecionados foram inoculadas com a concentração de 5x 10
8
UFC/mL. Nenhuma reação
hipersensitiva foi observada. A fim de testar a abrangência da resistência encontrada, os ecótipos
CS 1308, CS 1566 e CS1643, foram inoculados com o isolado de Xcc CNPH 77. O isolado
mostrou-se mais agressivo que o isolado CNPH 17, sendo que CS 1566 apresentou resistência.
Estes mesmos ecótipos foram inoculados com o isolado de Ralstonia solanacearum (Rs CNPH
21), sendo o ecótipo CS 1308 mais resistente a este isolado. A sensibilidade do isolado CNPH 17
a diferentes antibióticos levou a uma seleção de mutantes espontâneos resistentes ao antibiótico
- 85 -
rifampicina. Mutantes foram validados como resistentes à concentração 25 μg/mL de
rifampicina. Estes mutantes serão utilizados para a investigação do mecanismo de resistência.
Palavras-chave: Arabidopsis thaliana, Xanthomonas campestris pv. campestris, resistência,
defesa, patógeno, hospedeiro.
Introdução
A produção agrícola brasileira é de vital importância para a economia do país e segundo o
ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, o superávit do agronegócio alcançado em
2004 foi de US$ 34,2 bilhões. Entretanto, este valor poderia ser mais significante não fosse o
ataque de fitopatógenos que levam ao aumento dos custos de produção e a uma redução da
quantidade e qualidade dos produtos agrícolas brasileiros. Na tentativa de solucionar este
problema, vários trabalhos têm sido desenvolvidos com variedades de plantas que apresentem
resistência genética contra patógenos.
A planta-modelo Arabidopsis thaliana é membro da família das brássicas, como o repolho
e a couve. Apesar de não ser economicamente importante para a agricultura, A. thaliana é uma
espécie vegetal muito utilizada como organismo modelo em estudos genéticos e moleculares
(Simpson & Johnson, 1990, Hugouvieux et al., 1998, Meinke et al., 1998, Buell, 2002, Meyer et
al., 2005).
A bactéria Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) é a causadora da a podridão-
negra das brássicas, uma doença de importância mundial (Williams, 1980, Lopes & Quezado-
- 86 -
Soares, 1997). Na presença de um patógeno, uma planta hospedeira pode reagir sendo resistente
ao patógeno, ou seja, há o bloqueio do avanço do patógeno ou sendo suscetível a este, situação
onde há a disseminação do patógeno pela planta.
A relação entre Arabidopsis e a bactéria Xanthomonas tem sido analisada e diferentes
respostas de resistência têm sido documentadas, como tolerância (Tsuji et al. 1991, Buell &
Somerville, 1995) e resposta de hipersensibilidade (RH) (Godard et al., 2000).
Baseado nos trabalhos acima mencionados foi possível verificar a importância dos estudos
utilizando o patossistema Arabidopsis - Xcc para a comunidade científica. A diversidade dentro
de ecótipos de Arabidopsis e de Xcc tem ampliado muito os estudos nas áreas molecular e
genética.
O presente estudo possui uma grande relevância científica em relação a isso, pois utilizou este
patossistema, cujo patógeno, um isolado brasileiro de Xcc, atinge culturas de grande importância
econômica. Além disso, utilizou ecótipos de Arabidopsis que ainda não tinham sido testados em
outros trabalhos, (na maioria das vezes), sendo estes novos e não caracterizados. A caracterização
de ecótipos contrastantes de Arabidopsis (resistentes/suscetíveis) irá permitir o avanço nos
estudos da herança gênica e clonagem de gene/genes de resistência envolvidos na interação
Arabidopsis e o isolado Xcc CNPH 17.
Materiais e Métodos
Condições de Crescimento das Plantas
Os ecótipos de A. thaliana de diferentes origens geográficas obtidos de Arabidopsis
Biological Resource Center (Ohio, E.U.A.) foram: CS 903, CS 920, CS 1020, CS 1064, CS 1072,
CS 1084, CS 1093, CS 1194, CS 1198, CS 1298, CS 1308, CS 1354, CS 1438, CS 1466, CS
1492, CS 1540, CS 1566, CS 1594, CS 1640, CS 1643, CS 2223, CS 3112, CS 6100, CS 6175,
- 87 -
CS 6181, CS 6604, CS 6674, CS 6699, CS 6922, CS 6930, CS 8580, CS 22353 e Columbia (Col-
0). O substrato Plantmax Hortaliças HT (Eucatex Agro, Paulínia, SP) foi utilizado para o
crescimento de todos os ecótipos. Os fotoperíodos utilizados para a realização dos experimentos
foram dias curtos (16h escuro/ 8h luz) e luz contínua (conforme especificado). A intensidade
luminosa foi de aproximadamente 100 μmol m
–2
s
–1
, a temperatura aproximadamente 24°C e a
umidade em torno de 50%. Sementes plaqueadas em meio MS ¼ (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.)
foram embebidas e colocadas a 4°C por 2 dias, sendo em seguida transferidas para luz para
germinarem. Plantas com 3 a 6 semanas pós-germinação foram utilizadas nos experimentos,
conforme especificado.
Preparação do Inóculo
O isolado Xcc CNPH 17 (obtido de uma lavoura de couve, em Brazlândia –DF) e o isolado
CNPH 77 (obtido de uma lavoura de repolho, em São José dos Pinhais –PR) foram armazenados
em água à temperatura ambiente até recuperação em meio Ágar-Nutriente. Após incubação por
dois dias a 28°C, as colônias tiveram sua morfologia confirmada e foram repicadas para o mesmo
tipo de meio para sua utilização nos ensaios. Uma massa bacteriana foi transferida para solução
10 mM MgCl
2
. A absorbância a 600 nm foi ajustada para 0,3 (5 x 10
8
UFC/mL) (Quezado-Duval
et al., 2004). A concentração utilizada nos experimentos para avaliação de severidade de
sintomas foi 5 x 10
6
UFC/mL.
Avaliação da Severidade dos Sintomas de Doença
Metade da folha das plantas de Arabidopsis foram inoculadas com o isolado Xcc CNPH
17 (ou outro conforme especificado), na superfície abaxial, com seringa de 1 mL sem agulha
- 88 -
(Plascalp, Feira de Santana, BA). A avaliação foi iniciada no quinto dia após a inoculação,
prosseguindo no sexto e sétimo dia. Como controle negativo, as folhas das plantas de Arabidopsis
foram inoculadas com tampão de MgCl
2
a 10 mM. O controle positivo para virulência bacteriana
foi repolho ( Brassica oleracea var. capitata cv. Kenzan).
Para monitorar a progressão da severidade dos sintomas da doença causada por Xcc foi
utilizada uma escala numérica: (0) a superfície inoculada não apresentava sintomas; (1) presença
de raras lesões; (2) sintomas de clorose presentes em área inferior a 10% da região inoculada; (3)
clorose presente em cerca de 50% da área inoculada; (4) necrose do tecido foliar inoculado, mas
existência de alguma atividade fotossintética remanescente e (5) a área inoculada apresentou-se
completamente necrosada.
Os experimentos realizados foram agrupados para análise estatística, utilizando o pacote de
programas SAS (Statistical Analysis System, versão 8.2). O programa ANAVA (análise de
variância) foi utilizado para verificar se havia diferença estatisticamente significativa entre os
ecótipos e com a confirmação dessas diferenças, utilizou-se o Teste de Médias (TUKEY) para
identificar quais os grupos de igualdade e diferenças dos ecótipos.
Quantificação de Clorofila
Folhas de Arabidopsis, com 5 a 6 semanas pós-germinação, foram inoculadas em toda sua
extensão por infiltração utilizando uma seringa sem agulha, com tampão de MgCl
2
a 10 mM ou
com uma suspensão do isolado de Xcc CNPH 17 na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL. Discos
foliares com 7,9 mm de diâmetro (3 discos/ planta) foram coletados das folhas inoculadas e não
inoculadas nos dias 0, 2, 4 e 6 após a inoculação. Os discos foram imediatamente congelados em
nitrogênio líquido e armazenados a –80
o
C até a extração da clorofila.
- 89 -
A clorofila total (clorofila a e clorofila b) presente nos discos foi extraída baseada na
metodologia de Wintermans & De Mots (1965). A cada amostra macerada em nitrogênio líquido
foi adicionado 1 mL de ethanol 96% e homogeneizou-se por 30 s. As amostras foram
centrifugadas por mais 30 s, a velocidade máxima. O sobrenadante de cada amostra foi avaliado
quanto à absorbância (OD. 654). A absorbância das amostras foi determinada para o
comprimento de onda 654 nm. Chl a+b(mg/ L)= 1000 x O.D.
654
/39,8. Como controle positivo foi
utilizado repolho (Brassica oleracea var. capitata cv. Kenzan).
Resposta de Ecótipos Resistentes à Xcc CNPH 17 a Outro Isolado de Xcc
Para a realização deste experimento foram utilizados dois isolados de Xcc: CNPH 17 e
CNPH 77 (anteriormente descritos). Os ecótipos resistentes ao isolado Xcc CNPH 17 testados
foram os CS 1308, CS 1566 e CS 1643, e o ecótipo CS 1438, com resistência intermediária.
Plantas destes ecótipos com 5 semanas de idade e expostas ao fotoperíodo de dias curtos foram
inoculadas com suspensão bacteriana contendo 5x10
6
UFC/mL do isolado CNPH 17 ou CNPH
77. O controle positivo foi o repolho (Brassica oleracea var. capitata cv. Kenzan). A avaliação
dos sintomas foi realizada no quinto e sexto dia após a inoculação utilizando-se a escala de
severidade de sintomas.
Resposta de Ecótipos Resistentes à Xcc CNPH 17 a Outro fitopatógeno
Para verificar a amplitude da resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS 1643, a
resposta destes ecótipos a patógeno bacteriano Ralstonia solanacearum foi caracterizada. O
isolado de R. solanacearum utilizado foi o CNPH 221, obtido de uma lavoura de tomate
(Lycopersicum esculentum Mill.) localizada em Ponte Alta-DF, foi mantido armazenado em água
à temperatura ambiente até sua recuperação em meio Kelman. Após incubação por dois dias a
- 90 -
28°C, as colônias tiveram sua morfologia confirmada e foram novamente repicadas para o
mesmo meio. As bactéria foram ressuspendidas em água estéril e a O.D. 600 foi ajustada para
0,6, correspondendo a uma concentração aproximada de 5 x 10
8
UFC/mL. No experimento
também foi incluído o ecótipo CS 1194, suscetível a Xcc CNPH 17.
Sete a quinze plantas dos ecótipos selecionados foram crescidas em dias longos (16 h luz/
8 h escuro) e com aproximadamente 4 semanas foram utilizadas para o experimento. Com uma
ponteira de 1 mL foi feito um orifício no solo na base de cada planta a ser inoculada e 10 mL da
suspensão bacteriana foram adicionados. Os controles negativos foram tratados similarmente,
mas inoculados com 10 mL de água estéril. Como controle positivo foi utilizado tomateiro, sendo
as variedades mais utilizadas, Kada e a IPA-05, ambas altamente suscetíveis a R. solanacearum.
Os sintomas foram monitorados aos 10 e 15 dias após inoculação, utilizando-se uma
escala numérica para quantificar a severidade dos mesmos. A escala utilizada foi: 0 - planta não
apresenta sintomas; 1- perda de turgidez foliar; 2- algumas folhas apresentam murcha; 3 - todas
as folhas estão murchas; 4 - morte da planta (Yang & Ho, 1998).
Caracterização da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 a Diferentes Antibióticos e Seleção
Mutantes de Xcc Resistentes à Rifampicina
Placas de meio Ágar-Nutriente acrescidas de diferentes antibióticos foram preparadas. Os
antibióticos testados foram ampicilina (Amershan Biosciences, Cleveland, Ohio - E.U.A.),
cloramfenicol (USB
TM
, Ohio - E.U.A.), kanamicina (Sigma, Alemanha), espectinomicina (Sigma,
Alemanha), estreptomicina (ICN Biomedicals, Alemanha), tetraciclina (Amershan Biosciences,
Cleveland, Ohio - E.U.A.) e rifampicina (Fisher BioReagents, Índia). As concentrações testadas
de cada antibiótico foram 25 μg/mL e 50 μg/mL. O mesmo volume do isolado Xcc CNPH 17 foi
- 91 -
plaqueado em placas com e sem antibióticos e estas foram incubadas a 28
o
C por 3 dias. A
avaliação foi realizada pela contagem do número de colônias em cada placa. Para a seleção de um
mutante espontâneo resistente à rifampicina, um total de 25 x 10
8
UFC de Xcc isolado CNPH 17
foram distribuídas em 10 placas de Petri contendo meio Ágar-Nutriente acrescido de 50 μg/mL
de rifampicina. O mesmo foi feito utilizando 25 μg/mL de rifampicina. Após incubação das
placas a 28
o
C por 3 dias a presença de colônias foi avaliada.
Investigação do Mecanismo da Resistência: Reação de Hipersensibilidade (RH)?
Os ecótipos selecionados como resistentes (CS 1308, CS 1566 e CS 1643) foram testados
com uma suspensão bacteriana com 5 x 10
8
UFC/mL do isolado Xcc CNPH 17. A inoculação foi
feita por infiltração com seringa de 1 mL (sem agulha) na metade da superfície abaxial da folha.
O desenvolvimento de sintomas foi monitorado 7 h, 24 h e 48 h após a inoculação.
Resultados
Identificação de Ecótipos de Arabidopsis Resistentes a Xcc
Um total de 33 ecótipos foram inoculados com suspensão bacteriana na concentração de 5
x 10
6
UFC/mL pelo método de infiltração com seringa. Não foi identificado nenhum ecótipo que
apresentasse resistência completa a Xcc CNPH 17 nas condições testadas. Os dados de grau de
severidade de doença de diferentes experimentos foram consolidados para análise estatística
usando o programa SAS
®
. A análise de variância (ANAVA) foi realizada usando delineamento
em blocos casualisados (4 blocos, 33 ecótipos com 30 repetições) com dados desbalanceados. Os
resultados indicaram que houve diferença estatisticamente significativa entre todos os ecótipos
testados (P < 0,0001).
- 92 -
O teste de Tukey foi utilizado para identificar os grupos estatisticamente semelhantes e
diferentes em relação à severidade de sintomas da doença (Figura 1). Os ecótipos resistentes CS
1308, CS 1566 e CS 1643 foram escolhidos para caracterização mais detalhada e os ecótipos
suscetíveis CS 1194 e CS 1492, por apresentarem fenótipo contrastante. A comparação direta
destes ecótipos crescidos em luz contínua também foi realizada (Figura 2).
Influência do Fotoperíodo na Resistência à Xcc
Três ecótipos resistentes (CS 1308, CS 1566 e CS 1643) e dois suscetíveis (CS 1194 e CS
1492), crescidos em dias curtos (8 h luz/ 16 h escuro) por 5 a 6 semanas, foram inoculadas com
Xcc CNPH 17 na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL. O controle positivo utilizado para este
experimento foi o repolho (Brassica oleracea var. capitata cv. Kenzan). Semelhantemente aos
resultados obtidos em luz contínua, os ecótipos CS1308, CS1566 e CS1643 mostraram-se mais
resistentes a Xcc em relação aos ecótipos CS1194 e CS 1492 (Figura 3).
Análise Quantitativa de Clorofila em Ecótipos Resistentes e Suscetíveis
Para obtenção de dados quantitativos e caracterização dos fenótipos de resistência e
suscetibilidade, foi realizada uma análise ao longo do tempo dos níveis de clorofila total em
plantas inoculadas com Xcc e plantas controle. Os ecótipos suscetíveis tiveram uma maior
queda nos níveis de clorofila em comparação com as plantas controle em relação aos ecótipos
resistentes (Figura 4 e 5).
Análise da Especificidade em Ecótipos Resistente a Xcc CNPH 17
Para verificar se os ecótipos CS1308, CS1438 (resistência intermediária), CS 1566 e CS 1643
selecionados como resistentes ao isolado Xcc CNPH 17 também seriam resistentes ao isolado
- 93 -
CNPH 77. Plantas desses ecótipos foram inoculadas com concentração bacteriana de 5 x 10
6
UFC/mL dos isolado CNPH 17 e CNPH 77. As plantas foram crescidas em dias curtos e com
aproximadamente 5 semanas foram utilizadas nos experimentos. Em todos os ecótipos houve
maior severidade de sintomas com o isolado Xcc CNPH 77 que com Xcc CNPH 17. O ecótipo
CS 1566 demonstrou menor severidade de sintomas para o isolado CNPH 77 (Figura 6).
Resposta de Ecótipos resistentes a Xcc CNPH 17 a Outro fitopatógeno
Na tentativa de verificar a amplitude de resistência dos ecótipos CS 1308, CS 1566 e CS
1643, resistentes ao isolado de Xcc CNPH 17, foi feito um novo experimento utilizando como
patógeno, o isolado de R. solanacearum (Rs CNPH 21). Os resultados preliminares
demonstraram que o ecótipo CS 1308 mostrou se mais resistente nos dois dias de avaliação (10
o
dia e 15
o
dia após a inoculação). Os ecótipos CS 1566 e CS 1643 mostraram ter uma resistência
intermediária a este isolado. Portanto, a resistência destes ecótipos variou com o isolado, apenas o
ecótipo CS 1308 apresentou resistência a ambos os patógenos e o ecótipo CS 1194 apresentou
sintomas que o caracterizaram como suscetível (dados não mostrados).
Teste da Sensibilidade de Xcc CNPH 17 à Antibióticos e Seleção de Mutante Resistente
à Rifampicina
Para testar a sensibilidade de Xcc CNPH 17 a diferentes antibióticos, placas de meio
Ágar-Nutriente foram preparadas com diferentes concentrações de antibióticos e plaqueadas com
o isolado Xcc CNPH 17. Como esperado, nas placas controle (sem antibiótico) ocorreu
crescimento de Xcc. Nas demais placas que continham antibióticos, com exceção ao antibiótico
ampicilina, não foram detectadas colônias, indicando que o isolado de Xcc CNPH 17 não
apresenta resistência aos antibióticos, cloramfenicol, kanamicina, espectinomicina,
- 94 -
estreptomicina, tetraciclina e rifampicina nas concentrações testadas. Entretanto, nas placas
contendo o antibiótico ampicilina na concentração de 25 μg/mL foram observadas várias colônias
bacterianas, embora elas apresentassem crescimento mais lento que aquele das placas controle
(Tabela 4). Portanto, Xcc CNPH 17 apresenta alguma resistência ao antibiótico ampicilina.
Inicialmente foram preparadas 10 placas NA contendo 50 µg/mL de rifampicina e o
mesmo volume do isolado Xcc CNPH 17 foi plaqueado em placas com e sem esse antibiótico.
Em seguida, estas foram incubadas a 28
o
C por 3 dias. Após o terceiro e quarto dias, pôde-se
verificar apenas crescimento de bactérias nas placas controle. Portanto, nessa concentração de
rifampicina não foi possível isolar mutantes resistentes a esse antibiótico. Em contrapartida, entre
as placas NA contendo 25 μg/mL de rifampicina, foram observadas 2 colônias mutantes e com
taxa de mutação de 0,8x 10
-9
.
Investigação do Mecanismo de Resistência: Reação de Hipersensibilidade?
Para determinar se a resistência a Xcc CNPH 17 apresentada pelo ecótipos CS 1308, CS
1566 e CS 1643 estaria relacionada a uma reação de hipersensibilidade (RH), três a dez plantas
de cada ecótipo foram crescidas em fotoperíodo de dias curtos e inoculadas por infiltração com
seringa, com uma concentração bacteriana de 5 x 10
8
UFC/mL. Os sintomas foram monitorados 7
h, 24 h e 48 h após a inoculação. Nenhum dos ecótipos apresentou sintomas de reação de
hipersensibilidade, sugerindo que o mecanismo de defesa contra esse isolado não envolva esse
tipo de reação.
Discussão
- 95 -
Arabidopsis continua sendo a planta mais bem estudada. O ecótipo Columbia foi
seqüenciado em 2000 e existem populações dos ecótipos Columbia, Wassilewskija e Lansdberg
mutagenizadas quimicamente ou por inserção de T-DNA. Até recentemente, a maioria dos
grupos estudando Arabidopsis focalizou seus esforços apenas nestes poucos ecótipos. Existe, no
entanto, uma grande riqueza de germoplasma de Arabidopsis, com ecótipos provenientes de
várias partes do mundo. Alguns estudos, particularmente aqueles dedicados à interação patógeno-
hospedeiro devem encontrar novas oportunidades para expansão do conhecimento ao analisar
novos ecótipos. É sabido que pode haver variação genética tanto do lado do patógeno quanto do
lado do hospedeiro e que isto influencia a interação entre os mesmos. Por exemplo, enquanto uma
determinada combinação pode estar associada a uma situação de resistência, outra leva a um
quadro de doença (Tsuji et al., 1991, Kunkel et al., 1993). Assim, cada combinação
patógeno/hospedeiro ajuda a identificar novos elementos relacionados à suscetibilidade ou
resistência (Quirino & Bent, 2003).
Os estudos aqui descritos focalizaram na interação entre o isolado brasileiro CNPH 17 de
Xcc e 33 ecótipos de Arabidopsis de procedência geográfica variada, em sua maioria pouco
estudados. Até o presente momento não há nenhum relato na literatura descrevendo o isolado Xcc
CNPH 17 (Alice Quezado, comunicação pessoal).
A podridão negra é um problema mundial que afeta crucíferas (Williams, 1980),
particularmente as culturas de repolho (Brassica oleracea var. capitata) e couve (B. oleracea var.
acephala) onde o produto comercializado é a folha (Lopes & Quezado-Soares, 1997).
Xanthomonas campestris pv. campestris é um patógeno que pode invadir a planta pelos
hidatódios, ferimentos ou estômatos (Williams 1980, Lopes & Quezado-Soares, 1997). Quando a
infecção se inicia pelos hidatódios forma-se uma área clorótica, em forma de V, na borda das
folhas. No caso de entrada por estômatos ou ferimentos, como aqueles causados pelas traças-das-
- 96 -
crucíferas, a lesão formada é arredondada. Assim, Xcc pode ter contato com o mesófilo
inicialmente nos casos de infecção por via estomática ou ferimentos. Também nos estágios mais
avançados da infecção via hidatódios Xcc foi observada por microscopia eletrônica no mesófilo
foliar (Bretschneider et al., 1989). Conclui-se, portanto, que dependendo da forma de entrada e
do estágio do processo de infecção do tecido, Xcc interage com diferentes tecidos da planta.
Diferentes procedimentos de inoculação podem ser utilizados, havendo exemplos diversos
na literatura. Em seu trabalho, Hugouvieux et al. (1998) utilizou folhas destacadas ou fixas na
planta para imersão em suspensão bacteriana. Nestas condições, Xcc entrou preferencialmente na
folha via hidatódios. Um outro procedimento utilizado para infecção é a pulverização da
suspensão bacteriana (Lummerzheim et al., 1993, Godard et al., 2000, Lummerzheim et al.,
2004). O trabalho Meyer et al. (2005) mostrou que o método de inoculação por ferimento da
nervura central da folha foi o que melhor permitiu a colonização do sistema vascular e a
manifestação de sintomas típicos da podridão-negra, em comparação aos métodos de infiltração
foliar com suspensão bacteriana de 10
9
UFC/mL seguida de manutenção das plantas a 100%
umidade por 2 dias e infiltração foliar com suspensão bacteriana a 5 x 10
5
UFC/mL.
Para realização do trabalho aqui descrito, alguns métodos de inoculação foram testados e
verificou-se que o método por infiltração com seringa foi o que melhor produziu sintomas de
clorose e/ou necrose. Cada método de inoculação é mais adequado ao estudo de um determinado
passo da interação patógeno-hospedeiro. O método do ferimento desenvolvido por Meyer et al.
(2005) leva ao aparecimento do enegrecimento das nervuras e é particularmente adequado a
estudos de mecanismos que afetem a colonização do sistema vascular. A metodologia de
infiltração foliar empregada no presente trabalho é adequada para o estudo das interações entre
Xcc e o mesófilo foliar. O desenvolvimento de sintomas de clorose, após infiltração com seringa,
mostrou-se altamente reprodutível e é comparável a uma situação de campo onde a entrada de
- 97 -
Xcc pode se dá por estômatos ou por ferimentos. A concentração que possibilitou um melhor
discernimento de variações de sintomas foi 5 x 10
6
UFC/mL. Baseado nestes resultados foi
observado que nenhum ecótipo mostrou ser totalmente resistente a este patógeno. Comparada a
uma situação de campo, as concentrações bacterianas utilizadas no laboratório para a realização
de experimentos possivelmente são maiores. Populações epífitas de Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria (Xcv), bactéria causadora da mancha-bacteriana em pimentão (Capsicum annuum L.),
foram avaliadas em cultivares resistentes e suscetíveis. No campo, cultivares suscetíveis e
resistentes apresentaram quantidades distintas de população de Xcv. Em geral, a população
bacteriana foi menor em pimentões resistentes, atingindo 10
4
colônias por g de “peso fresco”,
sendo que em um dos experimentos atingiam 3 x 10
3
por g. (Pernezny & Collins, 1997).
A variação genética entre ecótipos de Arabidopsis já tem sido explorada em estudos de
interação patógeno-hospedeiro. No presente trabalho, 33 ecótipos de Arabidopsis foram testados
com o isolado brasileiro de Xcc CNPH 17. Os ecótipos CS 1308, CS 1566, CS 1643 mostraram-
se resistentes enquanto que CS 1194 e CS 1492 estavam entre os suscetíveis. Estes cinco ecótipos
com fenótipos contrastantes foram selecionados para caracterização mais detalhada.
Interessantemente, o ecótipo Columbia-0 foi identificado como suscetível ao isolado Xcc
CNPH 17, desenvolvendo claros sintomas de clorose seguido de necrose. Este resultado contrasta
com o de outros trabalhos como os de Tsuji et al. (1991), Buell & Sommerville (1997) e
Lummerzheim et al. (1993) onde este mesmo ecótipo apresentou-se resistente ao isolados de Xcc
2D520 e 147. Assim, ao importar variedades de determinada planta dita resistente para
determinado patógeno isolado em outro país o agricultor pode se decepcionar, pois a resistência
pode ser ineficiente para o isolado brasileiro.
A fisiologia de Arabidopsis pode ser influenciada pelas condições de fotoperíodo,
particularmente a transição entre o estado vegetativo e o reprodutivo (Levy & Dean, 1998,
- 98 -
Oliveira, 1999). Em luz contínua, a maioria dos ecótipos havia florescido quando os
experimentos foram realizados. Em contrapartida, ecótipos expostos a dias curtos apresentam um
atraso no florescimento, e apresentavam, em sua maioria, apenas as rosetas no momento da
inoculação. O comportamento dos ecótipos selecionados como resistentes e suscetíveis foi
avaliado em ambos os fotoperíodos, mostrando ser semelhante. Os ecótipos CS1308, CS1566 e
CS1643 mostraram-se mais resistentes a Xcc em relação aos ecótipos CS1194 e CS 1492. Para
corroborar esses resultados e caracterizar com maior detalhe as respostas a Xcc, foi realizada uma
análise quantitativa ao longo do tempo dos níveis de clorofila total em plantas inoculadas com
Xcc. Os ecótipos suscetíveis tiveram uma maior queda nos níveis de clorofila em relação aos
ecótipos resistentes.
Para verificar a abrangência da resistência dos ecótipos escolhidos, o isolado de Xcc
CNPH 77 e o isolado CNPH 221 de Ralstonia solanacearum foram utilizados em novos
experimentos. Pôde-se observar que os ecótipos CS1308, CS1438 (resistência intermediária) e
CS 1643 apresentaram-se como suscetíveis ao isolado Xcc CNPH 77. Dentre os ecótipos
testados, CS1566 apresentou o menor grau de sintomas da doença, apresentando resistência,
ainda que inferior àquela observada contra o isolado CNPH 17. É sabido que o isolado CNPH 77
é naturalmente mais severo em suas hospedeiras naturais (Alice Quezado-Duval, comunicação
pessoal). Assim, embora a resistência dos CS 1308, CS 1438 e CS 1643 possa ser ineficiente
contra isolados muito agressivos de Xcc, possivelmente ainda será eficaz contra outros isolados.
Em outro experimento, agora com a bactéria R. solanacearum CNPH 221, o ecótipo CS 1308
mostrou ser resistente. Os ecótipos CS 1566 e CS 1643 mostraram ter uma resistência
intermediária. Novos experimentos deverão ser realizados para confirmação destes resultados.
Portanto, o presente trabalho sugere que o ecótipo CS 1308 apresenta resistência efetiva contra
Xcc CNPH 17 e outro fitopatógeno de importância agrícola, R. solanacearum. A resistência
- 99 -
apresentada pelo ecótipo CS 1566 também se apresenta como promissora, pois foi efetiva contra
dois isolados de Xcc, sendo um deles sabidamente agressivo.
A Reação de Hipersensibilidade (RH) é caracterizada como uma reação à presença do
patógeno em uma planta hospedeira. Essa resposta é iniciada com uma morte rápida das células
(necrose) no local da infecção, impedindo o avanço do patógeno pela planta (Gachomo et al.,
2003). A reação de hipersensibilidade é um tipo de morte celular programada (Greenberg & Yao,
2004). Trabalhos que utilizam o patossistema Arabidopsis/Xcc têm mostrado que alguns ecótipos
apresentam resistência a um determinado isolado de Xcc, desenvolvendo reação de
hipersensibilidade (Lummerzheim et al., 1993, Godard et al., 2000).
Para determinar se as resistências observadas nos ecótipos CS 1308, CS1566 e CS 1643
poderiam estar associadas a uma reação de hipersensibilidade, uma alta concentração de Xcc
CNPH 17, 5 x 10
8
UFC/ mL, foi utilizada para inocular as plantas. O desenvolvimento de
sintomas foi monitorado 7, 24, 48 horas após a inoculação. Nenhum sintoma característico de RH
foi observado mesmo após 48 horas. Este resultado sugere que o mecanismo de defesa desses
ecótipos não está associado a uma reação de hipersensibilidade.
Com este intuito, fez-se inicialmente uma avaliação da resistência/suscetibilidade do
isolado CNPH 17 de Xcc a vários antibióticos. O isolado de Xcc CNPH 17 não apresentou
resistência a nenhum dos antibióticos testados, a saber, cloramfenicol, kanamicina,
espectinomicina, estreptomicina, tetraciclina e rifampicina nas concentrações testadas. Xcc
CNPH 17 apresentou algum nível de resistência a ampicilina, entretanto, a baixa resistência
encontrada não é adequada para sua utilização em experimentos para determinação de curvas de
crescimento. Dados estes resultados, foi necessário adotar uma outra estratégia: a obtenção de
mutante espontâneo para rifampicina.
- 100 -
O antibiótico rifampicina atua inibindo a RNA polimerase presente em patógenos como as
bactérias, interrompendo o processo de transcrição (Campbell et al., 2001). Este antibiótico vem
sendo utilizado em vários trabalhos que utilizaram o patossistema A. thaliana – Xcc (Simpson &
Johnson, 1990, Tsuji et al., 1991, Aufsatz & Grimm, 1994, Buell & Somerville, 1997,
Hugouvieux et al., 1998). A taxa de mutação observada para o antibiótico sorangicina A foi de
2x10
-8
. Este antibiótico, assim como o antibiótico rifampicina, atua inibindo a RNA polimerase
(Xu et al., 2005). Neste trabalho foram isolados 2 mutantes espontâneos, correspondendo a uma
taxa de mutação de 0,8 x 10
-9
, semelhante àquela obtida em outros trabalhos.
Para caracterizar a herança genética envolvida na resistência ao isolado CNPH 17, foram
feitos cruzamentos utilizando o ecótipo Columbia (Col), suscetível a esse isolado e já
seqüenciado, como um dos parentais. Entretanto, a progenia gerada do cruzamento entre Col x
CS 1308 não mostrou diferença no desenvolvimento de sintomas que fosse suficientemente
divergente para estudo da herança genética. Por isso, a caracterização da herança gênica não foi
realizada. Novos cruzamentos estão sendo feitos utilizando com o ecótipo suscetível CS 1194,
ecótipo este, que sempre apresentou elevado grau de suscetibilidade ao isolado em estudo, e
como ecótipos resistentes foram utilizados: CS 1308, CS 1566 e CS 1643. Assim, estas novas
populações possibilitarão uma caracterização genética das resistências associadas a estes
ecótipos.
- 101 -
Legendas das Figuras
Figura 1. Sumário dos resultados da análise estatística referente à resposta de diferentes ecótipos
de Arabidopsis ao isolado CNPH 17 de Xcc. Os ecótipos foram divididos em três grupos, com
resistência crescente da esquerda para a direita.
Figura 2. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no quinto dia
após inoculação com tampão 10 mM MgCl
2
, representado apenas pelo números de folhas, ou
com Xcc CNPH17, onde as colunas pretas correspondem aos ecótipos suscetíveis e as cinzas aos
ecótipos resistentes. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas utilizadas no
experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
Figura 3. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no quinto dia
após inoculação com tampão 10 mM MgCl
2
, representado apenas pelo números de folhas, ou
com Xcc CNPH17, onde as colunas pretas correspondem aos ecótipos suscetíveis e as cinzas aos
ecótipos resistentes. Para cada ecótipo está indicado o número de folhas utilizadas no
experimento (n). As barras verticais representam o erro padrão.
Figura 4. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1194 em diferentes dias após inoculação com
tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL ( ------ ).
- 102 -
Figura 5. Quantificação de clorofila no ecótipo CS 1308 em diferentes dias após inoculação com
tampão 10 mM MgCl
2
( ------ ) ou com o isolado CNPH 17 de Xcc na concentração de 5 x 10
6
UFC/mL ( ------ ).
Figura 6. Grau de severidade de sintomas em diferentes ecótipos de A. thaliana, no sexto dia
após inoculação com tampão10 mM MgCl
2
, representado apenas pelo números de folhas, CNPH
77 (colunas pretas) e Xcc CNPH 17 (colunas cinzas). Para cada ecótipo foi indicado o número de
folhas analisadas no experimento (n). As barras verticais em cada coluna representam o erro
padrão.
- 103 -
Agradecimentos
Agradecemos ao Sr. Joaquim Olímpio, da Embrapa Hortaliças, pelo excelente auxílio técnico.
L.S.T.C. teve bolsa da FUNADESP, P.F.C. teve bolsa da UCB. Este projeto teve apoio financeiro
do CNPq (470881/2003-8), International Foundation for Science (C/3576-1) e TWAS (03-120
RG/BIO/LA).
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- 108 -
Figura 1
Figura 2
0
1
2
3
4
5
CS1194 CS1308 CS1492 CS1566 CS1643
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=12
n=29
n=12
n=27
n=12
n=17
n=9
n=7
n=14
n=29
- 109 -
Figura 3
0
1
2
3
4
5
Cs 1194 CS1308 CS1492 CS1566 CS1643
Ecótipos
Grau de severidade dos sintomas
n=3
n=18
n=11
n=18
n=6
n=29
n=12
n=11
n=15
n=6
Figura 4
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós-inoculaçao
Clorofila a+b (mg/L) %
- 110 -
Figura 5
0
5
10
15
20
25
30
35
0246
Dias pós a inoculação
Clorofila a+b (mg/L)%
Figura 6
0
1
2
3
4
5
CS 1308 CS 1438 CS 1566 CS 1643
Ecótipos
Grau de severidade de
sintomas
n=24
n=11
n=21
n=11
n=19
n=20
n=21
n=22
n=12
n=22
n=24
n=12
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