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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
Departamento de Materiais Dentários e Prótese
COMPARAÇÂO DA PASSAGEM DO STREPTOCOCCUS SOBRINUS
ATRAVÉS DA INTERFACE ENTRE IMPLANTES ODONTOLÓGICOS E
CONECTORES TOTALMENTE CALCINÁVEIS OU COM A PLATAFORMA
PROTÉTICA PRÉ-FABRICADA EM CO-CR E AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE
DO MÉTODO DNA-CHECKERBOARD PARA SUA DETECÇÃO
Cássio do Nascimento
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo – USP, para
concorrer ao Título de Mestre, pelo curso de
Pós-Graduação em Odontologia – Área de
concentração: Reabilitação Oral.
Ribeirão Preto
2006
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NASCIMENTO, C. Mestrado
2
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE RIBEIRÃO PRETO
Departamento de Materiais Dentários e Prótese
COMPARAÇÂO DA PASSAGEM DO STREPTOCOCCUS SOBRINUS
ATRAVÉS DA INTERFACE ENTRE IMPLANTES ODONTOLÓGICOS E
CONECTORES TOTALMENTE CALCINÁVEIS OU COM A PLATAFORMA
PROTÉTICA PRÉ-FABRICADA EM Co-Cr E AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE
DO MÉTODO DNA-CHECKERBOARD PARA SUA DETECÇÃO
Cássio do Nascimento
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo – USP, para
concorrer ao Título de Mestre, pelo curso de
Pós-Graduação em Odontologia – Área de
concentração: Reabilitação Oral.
Orientador: Prof. Dr. Rubens Ferreira de
Albuquerque Junior
Ribeirão Preto
2006
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NASCIMENTO, C. Mestrado
3
Data da defesa: ____/____/ 2006
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Julgamento: ________________________ Assinatura: __________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
4
Dedicatória
À Deus,
pela presença constante,
pelas oportunidades
e pela força interior que me impulsiona a seguir em busca dos meus sonhos.
Ao meu pai Ariovaldo José do Nascimento
e minha mãe Célia Regina Pagnozzi do Nascimento
que sempre ensinaram o caminho certo a seguir.
Obrigado pelo amor incondicional, suporte emocional nos momentos de
necessidade e confiança.
Obrigado por serem tão especiais, por me ouvir e me apoiar sempre.
Ao meu irmão Ariovaldo José do Nascimento Júnior,
pela grande amizade, companheirismo e por tão intenso amor.
NASCIMENTO, C. Mestrado
5
Agradecimentos Especiais
Ao Prof. Dr. Rubens Ferreira de Albuquerque Junior
Por sua constante presença como orientador, mestre e amigo, sempre um
exemplo de disciplina, serenidade, determinação e dedicação à odontologia e à
pesquisa. Agradeço pela oportunidade de trabalharmos juntos, por todos os
ensinamentos transmitidos, e pela enorme contribuição na minha formação.
Meu reconhecimento e sinceros agradecimentos.
À Profa. Dra. Izabel Yoko Ito e à Profa. Dra. Nádia Monesi
Sua dedicação à ciência e à prática docente, a beleza de seus ensinamentos, a
amizade, paciência e disponibilidade foram fundamentais para a realização
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Vinicius Pedrazzi
Por sua atenção, disponibilidade, sugestões e companheirismo nos momentos de
dificuldade.
À empresa SIN (Sistema de Implante, São Paulo)
Pela doação dos implantes e componentes, necessários para elaboração do
presente trabalho, sem os quais seria inviável a realização do mesmo.
NASCIMENTO, C. Mestrado
6
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo
– USP, onde obtive minha formação como Cirurgião-Dentista e pela
oportunidade da realização do curso de Mestrado, nas pessoas da Diretora
Profa. Dra. Marisa Semprini e da Vice-Diretora Profa. Dra. Sada Assed.
Aos professores do Departamento de Materiais Dentários e Prótese da
Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto, nas pessoas do chefe do
Departamento Prof. Dr. Ricardo Faria Ribeiro e da Vice-chefe Profa. Dra.
Helena de Freitas Oliveira Paranhos.
Ao Coordenador da Pós-Graduação na área de Reabilitação Oral,
Prof. Dr. Luiz Osvaldo Bezzon,
pelo excelente trabalho realizado no curso e incansável incentivo.
Aos colegas de pós-graduação, pelo excelente convívio.
NASCIMENTO, C. Mestrado
7
Um agradecimento especial aos pós-graduandos
Evandro Watanabe, João Paulo Mardegan Issa
e Rodrigo Edson Santos Barbosa,
pelo auxílio imprescindível para a realização deste trabalho, pelo
companheirismo e sobre tudo pela amizade.
Às funcionárias
Regiane de Cássia Tirado, Ana Paula Xavier, Regiane Moi e Isabel Sola,
por todo suporte a mim oferecido durante o curso e pelo carinho constante e
tão agradável convívio.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram na elaboração
deste trabalho,
Muito obrigado.
NASCIMENTO, C. Mestrado
8
Sumário
Resumo........................................................................................................................ 09
Abstract........................................................................................................................ 11
1. INTRODUÇÃO......................................................................................................... 13
2. REVISTA DA LITERATURA .................................................................................... 17
2.1 Implantes Odontológicos e Osseointegração ..................................................... 18
2.2 Colonização Bacteriana e Doença Periodontal................................................... 20
2.3 Interface Implante/Conector Protético................................................................. 28
2.4 Conectores calcináveis X conectores pré-fabricados ......................................... 38
2.5 Análise Microbiológica pela Técnica de Hibridação DNA-Checkerboard ........... 46
3. PROPOSIÇÃO......................................................................................................... 52
4. MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 54
4.1 Avaliação da Passagem do Microrganismo S. sobrinus através da interface
Implante/Conector Protético...................................................................................... 55
4.2 Análise da Sensibilidade do Método de Hibridação DNA-Checkerboard ........... 61
5. RESULTADOS......................................................................................................... 73
5.1 Avaliação da Passagem do Microrganismo S. sobrinus através da interface
Implante/Conector Protético...................................................................................... 74
5.2 Purificação e Quantificação do DNA Extraído do microrganismo S. sobrinus.... 75
5.3 Verificação da Marcação da Sonda .................................................................... 76
5.4 Resultado do Teste de Sensibilidade e Especificidade da Sonda S. sobrinus... 77
5.5 Resultados da Análise de Sensibilidade pelo Método de Hibridação
DNA-Checkerboard................................................................................................... 77
6. DISCUSSÃO............................................................................................................ 81
7. CONCLUSÕES........................................................................................................ 92
8. REFERÊNCIAS........................................................................................................ 94
9. APÊNDICE............................................................................................................. 106
NASCIMENTO, C. Mestrado
9
RESUMO
NASCIMENTO, C. Mestrado
10
RESUMO
Nascimento, C. Comparação da Passagem do Streptococcus sobrinus
através da Interface entre Implantes Odontológicos e Conectores Totalmente
Calcináveis ou com a Plataforma Protética Pré-fabricada em Co-Cr e
Avaliação da Sensibilidade do Método DNA-Checkerboard para sua
Detecção. 2006. 111 f . Tese (Mestrado) - Faculdade de Odontologia,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
O objetivo deste estudo foi avaliar, in vitro, a passagem do
microrganismo S. sobrinus através da interface entre implantes e conectores
totalmente calcináveis ou pré-fabricados e a sensibilidade do método DNA -
Checkerboard para a detecção e quantificação dos microrganismos presentes no
interior dos implantes. Para a avaliação da passagem do microrganismo, foram
utilizados 20 conjuntos de implantes (SIN
®
-Sistema de Implantes, Brasil) com seus
respectivos conectores protéticos (Fundidos em Ni-Cr – Grupo 1, e Pré-fabricados
– Grupo 2), divididos em dois grupos de 10 unidades. A análise foi realizada após
a inoculação do microrganismo S. sobrinus na parte interna dos implantes,
seguida da adaptação manual dos conectores protéticos, com um torque final de
32 Ncm. Para a análise da sensibilidade do método DNA-Checkerboard na
detecção do microrganismo, amostras removidas dos conjuntos foram testadas
após os 21 dias de experimento. Ao final do período de 21 dias, observou-se a
turvação do meio de cultura em 2 conjuntos implante/conectores, um do grupo 1 e
outro do grupo 2. A freqüência de contaminação dos conjuntos em cada grupo
avaliado foi de 0,1. Não houve diferença significante entre os grupos 1 e 2 em
relação à contagem do microrganismo proveniente do interior dos conjuntos
avaliados pelo método DNA-Checkerboard. Por outro lado, o grupo 3 (controle)
apresentou maiores contagens de S. sobrinus em relação aos grupos 1 e 2 (p <
0,05). Auxílio FAPESP (n° processo: 03/04585-1)
Palavras-chave: Implantes osseointegráveis, Interface implante/conector
protético, Contaminação bacteriana, DNA-Checkerboard.
NASCIMENTO, C. Mestrado
11
ABSTRACT
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
12
ABSTRACT
Nascimento, C. In vitro evaluation of S. sobrinus leakage along the implant-
abutment interface of prefabricated or casting components and evaluation of
the sensibility of DNA-Checkerboard method for your detection. 2006. 111 f .
Tese (Mestrado) - Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo,
Ribeirão Preto, 2006.
The aim of this in vitro present study was to investigate the bacterial
leakage of Streptococcus sobrinus through interface between implants and
prefabricated or casting abutments, and the sensibility of DNA-Checkerboard
method to detect and quantify the microorganisms founded in the inner parts of
implants. Aiming to evaluate the leakage of microorganism there were used 20
implant/abutment assemblies (SIN
®
-Sistema de Implantes, Brazil) with yours
respective abutments (casting – Group 1, and prefabricated – Group 2) divided in
two groups of 10 unities. The analysis was performed after inoculation of S.
sobrinus in the inner part of the implants, following manual adaptation of the
abutments with a final 32 Ncm torque. For the sensibility analysis of DNA-
Checkerboard method to detect the microorganisms, samples removed from
assemblies were evaluated after 21 days of the experiment. After 21 days of
anaerobic incubation, 2 assemblies showed clouded medium, one of each
evaluated group. The contamination frequency of the assemblies in each group
assayed was 0.1. No difference among group 1 and 2 was observed in relation to
the counts of microorganism originated from internal parts of the assemblies
assayed by DNA-Checkerboard method. Otherwise, the group 3 (control) shows
higher counts of S. sobrinus than group 1 and 2 (p < 0.05). This study was
supported by FAPESP (03/04585-1).
Key-words: Osseointegrated implants, Implant/abutment interface, Bacterial
contamination, DNA-Checkerboard.
NASCIMENTO, C. Mestrado
13
1. INTRODUÇÃO
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
14
O uso de implantes odontológicos para a substituição de dentes
ausentes tem-se tornado uma prática importante na Odontologia moderna. Vários
tipos de implantes estão disponíveis para a aplicação em diferentes casos clínicos
e um número crescente de Cirurgiões-Dentistas tem adotado essa forma de
tratamento.
A busca por uma restauração que substituísse não só as coroas
clínicas dos dentes, mas também suas raízes, oferecendo maior estabilidade e
conforto, sempre motivou pesquisas. Segundo Albrektsson & Sennerby (1990) e
Barfield & Abele (1991), os trabalhos realizados com implantes, na época,
demonstravam um resultado pouco previsível, caracterizado por perdas ósseas
severas e infecções freqüentes. Os implantes dos tipos parafuso intra-ósseo,
agulhado, laminado e sub-periostal, foram considerados responsáveis pela baixa
credibilidade e alto índice de insucesso naquele período. Smithloff & Fritz (1987),
reportaram índices de insucesso próximos a 50% com estes tipos de implantes.
O reconhecimento da implantodontia ocorreu somente a partir do início
dos anos 80, com a divulgação dos protocolos de colocação dos denominados
implantes osseointegrados, fabricados a partir de cilindros de titânio, um metal
com alto grau de biocompatibilidade (Branemark et al., 1985).
Nos últimos anos, essa modalidade de tratamento tem conquistado um
espaço cada vez maior no contexto geral da odontologia, demonstrando alta
previsibilidade. Isto se deve às possibilidades de reposição de dentes perdidos por
NASCIMENTO, C. Mestrado
15
traumas, cáries e periodontopatias com altos índices de sucesso (Zarb & Schmitt,
1990).
Por outro lado, pesquisas recentes conduziram a um aumento da
adesão celular na interface implante/osso a partir de modificações na superfície do
titânio, aumentando significantemente seu potencial de osseointegração, quando
comparado ao das superfícies lisas (Buser et al., 1991; Jaffin & Berman, 1991;
Steinemann et al., 1991; Wong et al., 1995; Wennerberg et al., 1997; Cochran,
1999).
O sucesso primário dos implantes se deve a uma perfeita
osseointegração. No entanto, caso não ocorra uma perfeita adaptação entre o
implante e seus componentes protéticos, a área torna-se favorável à colonização
bacteriana, levando ao desenvolvimento de patologia peri-implantar, causando
comprometimento na manutenção da osseintegração (Steflik et al., 1991; Vidgal Jr
et al., 1995; Jansen et al., 1997; Gross et al., 1999).
Segundo Skalak (1983), Johansson & Palmqvist (1990) e Sertgoz
(1997), o sucesso clínico dos implantes, após a instalação das próteses é
previsível, desde que haja um processo meticuloso, com assentamento passivo da
estrutura metálica conectada aos pilares dos implantes.
A crescente busca por estabilidade, retenção, estética, eficiência
mastigatória, facilidade de higienização e bem-estar resultou na descoberta de
novas soluções para pacientes com ausência parcial ou total dos dentes. Relatos
clínicos de reabilitações com próteses implanto-suportadadas qualificavam o
tratamento como um método de comprovada eficiência no que diz respeito à
estabilidade, conforto e melhoria da função mastigatória (Neves & Fernandes
NASCIMENTO, C. Mestrado
16
Neto, 1999). Embora apresentando diversas limitações quanto à indicação, esta
alternativa de tratamento, quando possível, mostra-se superior às outras técnicas,
como a prótese parcial removível e a prótese total.
Atualmente, o tratamento com implantes osseointegrados segue um
protocolo muito parecido para a grande maioria dos sistemas de implantes (Neves
& Fernandes Neto, 1998). Na verdade, muitas dúvidas ainda existem quanto aos
princípios biomecânicos que regem o funcionamento do conjunto quando a função
mastigatória é exercida (Brunsky et al., 2000). Sabe-se, entretanto, que um ponto
chave dessa questão é a adaptação entre os componentes. A falta de adaptação
pode causar danos mecânicos, como fraturas e desaperto de parafusos, além de
danos biológicos, como mucosites e peri-implantites, relacionados à dificuldade de
higienização e retenção de bactérias nos espaços entre os componentes
(Quirynen et al., 1994; Aparicio, 1994; Romero et al., 2000).
Atualmente novos sistemas são rotineiramente apresentados ao
comércio, oferecendo novas propriedades físico-químicas, características de
superfície e adaptação dos componentes, tendo como principal objetivo a redução
dos custos. Considerando a freqüência com que os implantes vêm sendo
utilizados na prática odontológica e a importância de uma perfeita adaptação entre
seus componentes, garantindo a saúde dos tecidos peri-implantares e o sucesso
em longo prazo dos implantes, julgamos relevante a avaliação da possível
passagem bacteriana através da interface implante/conector protético e sua
identificação e quantificação.
NASCIMENTO, C. Mestrado
17
2. REVISTA DA LITERATURA
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
18
2. 1 Implantes odontológicos e osseointegração
O implante odontológico é definido como um elemento artificial
inserido na mucosa oral e osso, cujo objetivo é substituir os dentes ausentes e
restabelecer a forma e função dos maxilares (Hobkirk & Watson, 1996).
A substituição dos dentes naturais ausentes, visando o
restabelecimento funcional e estético do sistema estomatognático é uma forma de
tratamento há muito tempo utilizada na odontologia. Implantes confeccionados em
diversas ligas metálicas e diferentes formatos foram desenvolvidos para este
propósito (Mangini & Schiochett, 1999).
Segundo Hobo et al. (1997), a implantologia moderna começou na
década de 40, com o surgimento de um implante parafusado desenvolvido por
Formiggini. Com o decorrer dos anos, vários tipos de implantes foram
desenvolvidos. Em 1943, Gustav Dahl desenvolveu os implantes subperiosteais
(Magini & Schiochett, 1999). Em 1967, Scialon criou os implantes agulhados e,
Linkov, os laminados (Resende, 1994).
No entanto, a implantologia somente ganhou impulso a partir das
publicações de Branemark et al. (1969) que definiram a osseointegração como a
conexão direta, estrutural e funcional entre o osso vital e a superfície de titânio do
implante, capaz de receber carga funcional, sem a presença de tecido conjuntivo
entre as duas estruturas.
Os implantes intra-ósseos foram definidos como pinos cilíndricos ou
parafusos, instalados no osso, que se projetam através do tecido mucoperiosteal,
NASCIMENTO, C. Mestrado
19
considerados osseointegrados quando não há a presença de tecido indiferenciado
entre o implante e o osso (Branemark et al., 1987).
Segundo Branemark (1985), os requisitos para se alcançar uma
perfeita osseointegração são: biocompatibilidade do material, formato adequado
do implante, uso de técnicas cirúrgicas atraumáticas na preparação do leito ósseo
e colocação do implante, e um período de cicatrização óssea sem aplicação de
carga.
Smith & Zarb (1989) descreveram alguns critérios para a avaliação do
tratamento com implantes, baseados em investigações científicas. A revisão da
literatura e análise dos resultados de pesquisas indicam que seis critérios
deveriam ser observados para que o tratamento com implantes apresente sucesso
clínico: 1) ausência de mobilidade do implante quando avaliado individualmente; 2)
não deve haver radioluscência ao redor do implante; 3) a perda óssea média
vertical anual não deve ser maior que 0,2 mm após o primeiro ano de função; 4)
deve haver ausência de dor, desconforto ou infecção freqüente na região do
implante; 5) o tratamento não deve comprometer a estética; 6) uma taxa de
sucesso de 85% após 5 anos e 80% para dez anos de observação são os níveis
mínimos aceitáveis para o tratamento com implantes osseointegrados.
Segundo Skalak (1983), o sucesso da osseointegração depende da
maneira como o estresse mecânico é transferido do implante para o osso. Tanto o
implante como o osso não deve ser submetido às forças extremas. O conjunto
prótese/implante/osso funciona como uma estrutura única e, desta forma, qualquer
má adaptação no conjunto resultará em um estresse interno da prótese, implante
e osso.
NASCIMENTO, C. Mestrado
20
2. 2 Colonização bacteriana e doença periodontal
A colonização da cavidade bucal, nos seres humanos, inicia-se
durante o nascimento e a presença de bactérias continua por toda a vida (Bowden
& Edwardsson, 1995).
O evento inicial da colonização bacteriana ocorre através da adesão
seletiva dos microrganismos a diferentes superfícies (Gibbons, 1984). A
viabilidade das células bacterianas e sua capacidade de adesão são requisitos
fundamentais para o sucesso e manutenção da colonização bacteriana (Gibbons
& Van Houte, 1971; 1975).
São várias as espécies bacterianas que colonizam a cavidade bucal
transitoriamente. Entretanto, se houver uma superfície favorável para sua
aderência e permanência, essa colonização poder ser prolongada (Socransky &
Manganiello, 1997).
Estudos sugerem que cepas que colonizam a cavidade bucal podem
se manter estáveis por diversos anos, embora alguns microrganismos detectados
num determinado momento, podem não estar presentes anos mais tarde (Caufield
& Walker, 1989; Alaluusua et al., 1994; Redmo Emanuelson & Thornqvist, 2000).
As interações entre as diferentes espécies bacterianas podem inibir ou
estimular o crescimento de outras bactérias, exercendo uma influência significante
na composição da microbiota bucal (Loesche, 1968; Grenier & Maynard, 1986). A
presença ou ausência de espécies antagonistas e patógenos invasores pode
NASCIMENTO, C. Mestrado
21
influenciar a condição de saúde ou doença (Hillman et al., 1985; Socransky et al.,
1988).
A doença periodontal afeta os tecidos de suporte dos dentes e é
caracterizada pela perda de inserção periodontal e reabsorção do osso alveolar.
Sua etiologia é multifatorial, sendo que o biofilme microbiano desempenha uma
função essencial na patogenia das doenças periodontais (Lamont & Jenkinson,
1998).
O termo “peri-implantite” caracteriza a condição de doença nos tecidos
de suporte dos implantes, e foi definido no Workshop Europeu de Periodontia em
1993 (Albrektsson & Isidor, 1994). Este termo não é sinônimo de “falha do
implante”. A presença de uma inflamação nos tecidos peri-implantares não
significa que, inevitavelmente, haverá um comprometimento da osseointegração e
conseqüente perda do implante (Mombelli et al., 2002).
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Tannerella forsythensis, e
Porphyromonas gingivalis são considerados patógenos fundamentais para o
desenvolvimento da periodontite e peri-implantite. Outras espécies, como
Prevotella intermedia, Campylobacter rectus, Peptostreptococcus micros,
Fusobacterium nucleatum, Eubacterium nodatum, Streptococcus intermedius e
espiroquetas, são apontadas como possíveis patógenos associados à condição de
doença (Renvert et al., 1998; Cugini et al., 2000; Quirynen et al., 2002; Socransky
& Haffajee, 2002).
A primeira colonização bacteriana nas bolsas peri-implantares
caracteriza-se por um aumento no número de estreptococos anaeróbios
facultativos. Entretanto, anaeróbios gram-negativos foram isolados em alguns
NASCIMENTO, C. Mestrado
22
casos em pequenas quantidades (Mombelli et al., 1988). Com o decorrer do
tempo, há uma diminuição dos estreptococos facultativos e um aumento na
proporção de gram-negativos anaeróbios estritos, como Fusobacterium spp. e
Prevotella spp. (Mombelli & Mericske-stern, 1990). As bactérias encontradas em
sítios com doença periodontal estão associadas àquelas encontradas na
periodontite de adultos, com exceção dos microrganismos Porphyromonas
gingivalis e Actinobacillus actinomycetemscomitans (Mombelli et al., 1987).
A reabilitação dentária por implantes em pacientes totalmente e
parcialmente desdentados apresenta uma porcentagem de êxito muito elevada
(Albrektsson, 1988). Entretanto, insucessos podem ocorrer e, muitas vezes, estão
relacionados às infecções peri-implantares (Esposito et al., 1998; Taner et al.,
1997). Os danos aos tecidos que circundam o implante, e sua conseqüente perda,
podem ser causados por forças mecânicas ou infecções peri-implantares (Rams et
al., 1984; Mombelli et al., 1997; Alcoforado et al., 1991; Rosenberg et al., 1991).
Segundo Suuronen et al. (2005), a composição do biofilme bacteriano
no sulco peri-implantar difere nos variados períodos de cicatrização que sucedem
à colocação do implante e sofre alterações posteriormente. Imediatamente após a
cirurgia de colocação do implante, as bactérias encontradas no sulco são
semelhantes àquelas presentes em infecções odontogênicas agudas. Com o
decorrer do tempo, as bactérias isoladas do sulco peri-implantar assemelham-se
às bactérias encontradas em doenças periodontais crônicas.
Estudos apontam a microbiota presente na cavidade oral antes da
colocação de implantes como determinante de uma nova microbiota após a
instalação dos mesmos. Em pacientes parcialmente desdentados, a microbiota
NASCIMENTO, C. Mestrado
23
dental parece ser uma importante fonte de bactérias. Pacientes com história de
doença periodontal podem apresentar uma alta prevalência de patógenos
anaeróbios (Apse et al.,1989; Quyrinen & Listgarten, 1990; Leonhardt et al., 1992;
Koka et al., 1993; Kohavi et al., 1994; Mombelli et al., 1995).
A colonização bacteriana em implantes de pacientes desdentados
origina-se a partir da superfície da mucosa oral (Smedberg et al., 1993; Danser et
al., 1997). Quando pacientes parcialmente desdentados são avaliados, o impacto
da dentição remanescente na composição bacteriana do biofilme sobre os
implantes torna-se notável (Quirynen et al., 2002). Pacientes totalmente
desdentados e reabilitados com implantes apresentam baixos índices de
microrganismos móveis e espiroquetas, além de baixa prevalência de patógenos
periodontais, quando comparados com pacientes parcialmente desdentados
(Mombelli et al., 1988; Apse et al., 1989; Quirynen & Listganten, 1990; Mombelli &
Mericske-stern, 1990; Papaioannou et al., 1995; Danser et al., 1997; Quirynen et
al., 2002).
Edgerton et al. (1996) estudaram a adesão de diferentes espécies de
estreptococos à superfície do titânio. Os autores concluíram que a adesão das
espécies S. sanguinis e S. oralis foi maior do que a de outras espécies estudadas.
As bactérias desta família normalmente se desenvolvem em sítios peri-implantares
saudáveis, mas estão associadas ao mecanismo inicial de formação do biofilme
bacteriano, podendo favorecer a colonização secundária por espécies
patogênicas.
Um número crescente de estudos alerta para o efeito do biofilme
bacteriano composto por anaeróbios gram-negativos sobre a saúde do tecido peri-
NASCIMENTO, C. Mestrado
24
implantar. Fusobacterium spp, Prevotella spp e espiroquetas são exemplos típicos
de anaeróbios gram-negativos freqüentemente encontrados em grande
quantidade em bolsas peri-implantares (Mombelli & Lang, 1998).
Van Winkelhoff et al. (2000) observaram que a colonização bacteriana
em bolsas peri-implantares de pacientes parcialmente desdentados caracteriza-se
por um rápido aparecimento de gram-negativos anaeróbios, associados à
infecções periodontais e peri-implantares, diferentemente dos achados em
desdentados totais. Uma possível explicação é a presença de bolsas periodontais
atuando como reservatórios para estas bactérias. Dos vinte pacientes avaliados
nesse estudo, dois apresentaram infecção peri-implantar associada ao
microrganismo P. gingivalis, dos quais um perdeu o implante.
Socransky et al. (1998) analisaram, por método de diagnóstico
molecular de DNA, a microbiota subgengival de 185 pacientes, e observaram a
existência de interações microbianas, dividindo-as em cinco complexos.
Concluíram que a presença de uma bactéria específica está na dependência da
presença de pelo menos mais uma bactéria do mesmo complexo. Segundo os
autores, os microrganismos do complexo vermelho (P. gingivalis, T. Forshytensis e
T. denticola) estão associados às bolsas periodontais profundas, e a presença
destas bactérias na microbiota gengival resulta em uma maior destruição dos
tecidos periodontais. Concluíram também que estes microrganismos estão
fortemente associados aos do complexo laranja, que compreende as espécies
Fusobacterium, Prevotella e Campylobacter. Estes dados sugerem a existência de
uma sucessão na colonização de acordo com os complexos, sendo o laranja
antecessor e menos agressivo que o vermelho.
NASCIMENTO, C. Mestrado
25
Quirynen & Listgarten (1990) analisaram o biofilme subgengival ao
redor de dentes e de implantes por meio de microscopia de contraste de fase.
Observaram que, em comparação ao dente natural, as amostras de implantes
apresentavam contagens inferiores de bactérias. Em 24 pacientes parcialmente
desdentados, com implantes e dentes no mesmo arco, não foi encontrada
diferença significante na distribuição de bactérias em superfícies de dentes e
implantes. Entretanto, quando a composição do biofilme de pacientes totalmente
desdentados, que receberam implantes, foi comparada com a de pacientes
desdentados sem implantes, diferenças significantes ocorreram. Os resultados
sugerem que estruturas duras podem servir como reservatório para a colonização
bacteriana.
Alguns fatores, como as características da superfície dos dentes e
implantes, podem favorecer o acúmulo de biofilme. A adesão bacteriana em
superfícies duras da cavidade oral é altamente influenciada pelo grau de
rugosidade destas estruturas. Quanto mais rugosa a superfície, maior o número
de colônias bacterianas formadas. Os estudos de Quirynen et al. (1993),
demonstraram uma correlação positiva entre a rugosidade da superfície dos
dentes ou dos implantes e a taxa de maturação do biofilme supragengival e
subgengival. Os autores compararam as características de superfície de pilares de
conexão de quatro sistemas de implantes diferentes (Astra Tech, Bonefit,
Branemark, Core-Vent, IMZ e Steri-Oss) em relação a resinas compostas
metalograficamente polidas. Para cada sistema de implante, dois pilares de
conexão foram examinados quanto à rugosidade e dureza de superfície. O
segundo serviu como indicador para a resistência contra a formação de
NASCIMENTO, C. Mestrado
26
rugosidades durante os procedimentos de higiene bucal profissional ou pessoal.
Os valores de rugosidade (em microns) dos pilares de conexão testados foram:
Steri-Oss, 0,10; Branemark, 0,21; Bonefit, 0,23; Astra Tech, 0,27; e Core-Vent,
0,30. Os valores de dureza Vickers (em VHN) foram: Branemark, 154; IMZ, 208;
Astra Tech, 258; Bonefit, 292; Core-Vent, 304; e Steri-Oss, 340. Em relação às
resinas compostas, os pilares de conexão de titânio mostraram uma rugosidade
de superfície inicial maior e uma dureza de superfície ligeiramente maior. Isto
pode explicar, juntamente com a alta energia livre de superfície conhecida do
titânio, o crescimento rápido de biofilme nestes pilares de conexão.
Quirynen et al. (1996), estudaram a influência da rugosidade do pilar
de conexão de titânio sobre o acúmulo de placa e sobre a gengivite. Foram
colocados 4 pilares de conexão de titânio com diferentes rugosidades superficiais
em seis pacientes reabilitados com próteses implanto-suportadas. Após um mês
de exposição ao meio bucal, foram comparadas amostras de placa subgengival
dos pilares de conexão de cada paciente através de microscopia de contraste de
fase. Após 3 meses, amostras de placa supragengival de cada paciente foram
comparadas por microscopia de contraste de fase e também por meio de cultura.
Na mesma visita foram registrados a profundidade de sondagem, a recessão
gengival e o sangramento à sondagem. A microscopia de contraste de fase
mostrou que, ao nível subgengival, somente os dois pilares de conexão mais
rugosos abrigaram espiroquetas após um mês. Após 3 meses, a composição da
microbiota subgengival mostrou pequena variação nos diferentes pilares de
conexão, apesar das espiroquetas estarem presentes nos pilares de conexão
mais rugosos. A cultura anaeróbica resultou em amostras comparáveis de
NASCIMENTO, C. Mestrado
27
unidades formadoras de colônia para todos os tipos de pilares de conexão, tanto
supra quanto subgengivalmente. O pilar de conexão mais rugoso mostrou algum
ganho de inserção (0,2 mm) durante 3 meses, enquanto todos os outros pilares de
conexão proporcionaram perda de inserção variando de 0,8 a mais de 1,0 mm.
Para os autores, os resultados indicam que uma redução na rugosidade superficial
(menor que 0,2 microns) do pilar de conexão não apresentou grandes efeitos
sobre a composição microbiológica tanto supra quanto subgengivalmente. Estas
observações indicam a presença de um limiar de rugosidade abaixo do qual não
deve ocorrer impacto algum sobre a adesão e/ou colonização bacteriana.
Entretanto, a avaliação clínica parece indicar que uma certa rugosidade na
superfície do pilar de conexão é necessária para um aumento na resistência à
sondagem. O uso de instrumentos de limpeza sobre os implantes de titânio pode
causar alterações superficiais indesejáveis.
O papel da saliva, biofilme supragengival e tecidos moles sobre a re-
colonização subgengival após terapia periodontal ainda é controversa (Petersilka
et al., 2002). O debridamento das superfícies sem um subseqüente controle
periodontal é menos efetivo quando comparado a repetidas raspagens
subgengivais. Portanto, acredita-se que parte da re-colonização subgengival seja
proveniente do biofilme supragengival constituinte da saliva, dentes e tecidos
moles (Socransky & Haffajee, 2002).
Um correto controle da infecção periodontal pode evitar o surgimento
de complicações provenientes da contaminação bacteriana inicial por patógenos
periodontais como a P. gingivalis. Isto parece ter elevada importância em
pacientes com história prévia de periodontite (Malmstrom et al., 1990; Mombelli,
NASCIMENTO, C. Mestrado
28
1997). A aplicação de testes microbiológicos em pacientes parcialmente
desdentados, com história prévia de doença periodontal, pode auxiliar a prevenir
peri-implantites. O emprego de terapia antibiótica antes da colocação dos
implantes pode ser uma forma eficiente de prevenção (Van Winkelhoff & Winkel,
1997).
2. 3 Interface implante/conector protético
Uma das possíveis causas de falhas em implantes osseointegrados é
a inadequada adaptação entre o conector ou pilar intermediário, ou transmucoso,
e o implante. Os espaços vazios, provenientes dessa pobre adaptação, atuam
como armadilhas para as bactérias presentes na cavidade oral, podendo causar
reações inflamatórias nos tecidos moles peri-implantares. Essas reações
inflamatórias, se não controladas, podem levar ao desenvolvimento de uma peri-
implantite, comprometendo o sucesso clínico dos implantes (Jansen et al., 1997).
O formato de alguns implantes favorece o acúmulo do biofilme
bacteriano entre seus componentes. Isso geralmente ocorre na interface
implante/conector, na interface conector/prótese e sobre as superfícies dos
conectores, próteses e implantes. O tamanho da fenda existente na interface
implante/conector contribui para o acúmulo de biofilme e produz um meio ideal
para a colonização bacteriana. Acredita-se que estes espaços se encontrem
aumentados quando há forças oblíquas durante a função (O’ Mahony et al., 2000).
Segundo Quirynen et al. (2005), os componentes protéticos dos
implantes favorecem a instalação do biofilme bacteriano e é necessário determinar
NASCIMENTO, C. Mestrado
29
a composição desse biofilme em várias etapas clínicas para compreender seu
papel na manutenção da saúde periodontal ou desenvolvimento da doença.
Vários estudos sobre a microbiota presente ao redor de implantes
odontológicos têm sido publicados, alguns dos quais relatam a presença de
possíveis patógenos periodontais habitando o sulco peri-implantar de implantes
que falharam (Ellen, 1998). Os estudos sugerem que os patógenos periodontais
podem estar envolvidos na perda óssea peri-implantar. Possivelmente, os
microrganismos ou os produtos de seu metabolismo alojam-se nas fendas
existentes entre os componentes e são responsáveis por essa perda óssea
(Lindhe, et al., 1992; Quirynen & van Steenberghe, 1993; Ericsson et al., 1995;
Persson et al., 1996).
Holmes et al. (1989), relataram que a terminologia utilizada na
descrição da adaptação dos componentes e as técnicas para medi-la variam
consideravelmente na literatura, havendo muita variação quanto ao local em que a
adaptação – ou má adaptação – é medida. Segundo o autor, as medidas da má
adaptação em diferentes pontos são relacionadas geometricamente e definidas
como fenda interna, fenda marginal, discrepância marginal vertical, discrepância
marginal horizontal, sobre-extenção, sub-extensão, discrepância marginal absoluta
e discrepância de assentamento.
Sorensen et al. (1991), avaliaram a fidelidade nas interfaces de
próteses unitárias, instaladas sobre 4 diferentes sistemas de implantes, a fim de
verificar se a adaptação das interfaces poderia interferir no acúmulo de biofilme e
na inflamação gengival. Foram comparadas as interfaces implante/pilar
intermediário e intermediário/prótese. A avaliação foi realizada após a confecção
NASCIMENTO, C. Mestrado
30
de infra-estrutura sobre anel de ouro, seguida da aplicação de porcelana e
instalação com uma chave de torque. A análise foi feita por meio de observação
direta, com auxílio de um microscópio com unidade de medição e aumento de
200x. O grupo 1 apresentou uma adaptação entre interfaces significantemente
maior que os demais.
Traversy & Birek (1992), realizaram um estudo para determinar se
ocorre infiltração de fluido ou penetração bacteriana bidirecional entre os
componentes do sistema de implantes Branemark. Foram testadas as hipóteses
de que: 1) existe infiltração entre a junção implante/pilar (I/P) seguramente
apertada, e, 2) se os Streptococcus sanguinis podem penetrar no espaço entre
I/P. Oito amostras foram imersas em uma solução padrão de paranitrofenol (PNP).
Após 24 horas as amostras foram abertas e a quantidade de PNP foi analisada
por um espectrofotômetro. Oito implantes imersos em uma solução sem PNP
serviram como controle. Sete implantes com a interface selada serviram como
controles positivos. No teste de infiltração de fora para dentro, foi encontrada
diferença estatística (p<0,0001) entre as medidas de densidade óptica. No teste
de infiltração de dentro para fora, a diferença foi também significante. Amostras
estéreis dos componentes conjugados, seladas e não seladas, foram imersas em
meio de cultura, inoculado com Streptococcus sanguinis. A infiltração foi medida
pela contagem de unidades formadoras de colônia (UFC). Após incubação de
pontas de papel estéril, esfregadas contra as superfícies dos corpos-de-prova, em
meio de cultura e contagem das ufc, foram encontradas diferenças significantes
entre o grupo experimental e o controle, mostrando que houve contaminação de S.
sanguinis através da interface implante/pilar.
NASCIMENTO, C. Mestrado
31
Quirynen & van Steenberghe (1993), investigaram a presença de
microrganismos nas roscas internas de implantes do sistema Branemark. Em nove
voluntários, a parte apical de dois parafusos de intermediários que haviam sido
instalados há três meses foi examinada em microscópio de contraste de fases.
Todos os parafusos apresentaram uma quantidade significante de
microrganismos, principalmente cocos (86,2%) e bastonetes imóveis (12,3%).
Microrganismos móveis (1,3%) e espiroquetas (0,1%) foram encontrados apenas
esporadicamente. A infiltração microbiana na interface implante/intermediário
parece ser o mecanismo de contaminação mais provável.
Quirynen et al. (1994), examinaram in vitro a existência de infiltração
microbiana ao longo de componentes do sistema Branemark. Trinta e dois
conjuntos implante/conectores estéreis foram apertados com força constante de
10 Ncm e colocados em meio líquido contendo sangue e previamente inoculado
com microrganismos da microbiota oral. Para examinar a infiltração na interface
implante/conector, 16 amostras dispostas duas a duas foram parcialmente
imersas. As 16 restantes, também dispostas duas a duas, foram totalmente
submersas para observar a infiltração na interface implante/conector e ao longo do
parafuso do conector. Cabe ressaltar que uma das amostras de cada par recebeu
em seu interior uma solução salina, enquanto a outra foi imersa com a parte
interna seca. Após sete dias de inoculação anaeróbica, os microrganismos
eventualmente presentes na parte interna dos implantes foram coletados e
incubados em placas com Agar Sangue em condições anaeróbicas. Foram
encontrados microrganismos em todas as amostras, e em maior quantidade nas
que foram totalmente imersas, quando comparadas às que foram parcialmente
NASCIMENTO, C. Mestrado
32
imersas, indicando que a infiltração bacteriana, inclusive de microrganismos de
maior diâmetro, como o Fusobacterium nucleatum, parece existir em ambos os
níveis. Muitas bactérias que penetram através da interface implante/conector
estão associadas à peri-implantite. Desta forma, os autores defendem a
esterilização do pilar previamente à instalação e a desinfecção da parte interna do
implante.
O objetivo do estudo de Person et al. (1996) foi examinar a microbiota
da superfície interna dos componentes de 28 implantes Branemark em 10
pacientes parcialmente desdentados que haviam sido tratados com prótese parcial
fixa. As próteses, em função por 1 a 8 anos, foram checadas em relação à
mobilidade e removidas. Os parafusos de pilar de conexão foram afrouxados e
classificados como estáveis, facilmente removidos ou frouxos. Então, foram
obtidas amostras bacterianas das várias superfícies internas do sistema de
implantes. A identificação das espécies mais predominantes e a estimativa do
número de microrganismos foi realizada em placas de Agar Sangue. A
identificação foi baseada na reação de Gram, sensibilidade ao oxigênio e testes
bioquímicos. As superfícies internas de diferentes componentes do sistema
Branemark, após períodos variáveis de função na cavidade bucal,
consistentemente hospedaram uma microbiota heterogênea e primariamente
anaeróbia. As amostras individuais demonstraram uma grande variação. Não foi
observada relação entre o tipo e o comprimento do pilar de conexão, perda óssea
e tipo e número de microrganismos encontrados nas amostras. A microbiota era
constituída principalmente de estreptococos anaeróbios e facultativos, bastonetes
anaeróbios gram-positivos, tais como as espécies Propionibacterium, Eubacterium
NASCIMENTO, C. Mestrado
33
e Actinomyces, e bastonetes anaeróbios gram-negativos, incluindo as espécies
Fusobacterium, Prevotella e Porphyromonas. Há razões para sugerir que a
presença de bactérias é o resultado de: (1) contaminação dos implantes e pilar de
conexão durante o primeiro e/ou segundo estágio de instalação do implante, e/ou,
(2) transmissão de microrganismos do ambiente bucal durante a função
subseqüente à instalação da prótese.
Jansen et al. (1997) relataram que os sistemas de implantes com dois
estágios estão mais sujeitos a apresentar fendas e cavidades entre implantes e
pilar, que podem atuar como um alçapão para bactérias, possibilitando reação
inflamatória no tecido mole peri-implantar. Os autores observaram que tais fendas
entre componentes são inevitáveis e sua significância clínica tem há muito sido
negligenciada pelos fabricantes e clínicos. Assim, para determinar se havia
infiltração microbiana por esta interface, 13 diferentes combinações pilar-implante
foram feitas a partir de 9 sistemas de implantes: Ankylos, Astra, Bonefit com pilar
cônico, Bonefit com pilar octa, Branemark, Calcitek, Frialit-2 com anel de silicone,
Frialit-2 com pilar convencional, Ha–Ti com coroa, Ha–Ti com pilar telescópico,
IMZ Titanium abutment e IMZ conector e Semados. Tais combinações foram
expostas à cultura microbiana in vitro, na qual a penetração da bactéria
Escherichia coli foi observada em dez espécimes de cada combinação. A
extensão da fenda marginal entre os componentes pré-fabricados, medida com
um microscópio eletrônico de varredura, foi menor que 10 mm em todos os
sistemas. Todos os sistemas apresentaram infiltração microbiana, porém, quando
o implante Frialit-2 foi unido com um anel de silicone o escoamento foi menor.
NASCIMENTO, C. Mestrado
34
Dellow et al. (1997) relataram que o acoplamento impreciso dos
componentes pode influenciar no prognóstico em longo prazo de tratamentos com
implantes. Através de microscopia de varredura foram analisadas as micro-fendas
(falta de adaptação vertical), e a discrepância pilar/implante quanto ao perfil (falta
de adaptação horizontal). Após a análise de 4 sistemas de implantes, os autores
concluíram que certos sistemas de implantes e pilares são intercambiáveis e que
a precisão da adaptação encontrada é semelhante, ou as vezes excede, os
critérios propostos pelo sistema original sueco – Branemark System. As variações
nestes casos não foram maiores que 10 mm de espaço entre os componentes. Os
autores observaram que há incompatibilidade entre dois sistemas, SteriOss e
Southern.
Hagiwara et al. (1997), com o propósito de avaliar a compatibilidade
tridimensional de 3 sistemas diferentes de implantes: Implant Innovations (3i),
Nobelbiocare (NP) e Steri-Oss (SO), verificaram a adaptação da interface
implante/pilar e pilar/anel de ouro entre os componentes de um mesmo sistema, e
entre componentes de sistemas diferentes. O assentamento dos componentes foi
padronizado através de chave de torque e as medidas de desajuste horizontal e
vertical, para cada interface foi medida por microscopia eletrônica. Os
componentes 3i apresentaram excelente compatibilidade, enquanto os
componentes do próprio sistema Nobel Biocare demonstraram pobre adaptação.
Os autores concluíram que a associação de sistemas diferentes pode ser
considerada aceitável, porém, uma compatibilidade segura e estável é obtida com
componentes do mesmo sistema.
NASCIMENTO, C. Mestrado
35
Guindy et al. (1998) estudaram, in vitro, a infiltração bacteriana do
interior do sistema de implante Ha-Ti
®
para o meio externo, bem como no sentido
contrário, em próteses pré-fabricadas parafusadas. A análise foi feita nas fendas
marginais e nos espaços entre os parafusos. Em estudo prévio, in vivo, os autores
demonstraram que a colonização bacteriana no interior dos implantes ocorre,
apesar das más adaptações encontradas terem sido mínimas. No presente
estudo, trinta coroas pré-fabricadas do sistema Ha-Ti
®
foram divididas em três
grupos de 10 espécimes cada. O fator de variação em cada grupo foi a espessura
e a oxidação da superfície do conector protético. O microrganismo utilizado para
este estudo foi o Staphylococcus aureus. Os resultados mostraram haver
infiltração microbiana pelas fendas, do meio externo para o interior dos implantes,
bem como no sentido contrário, dentro do intervalo de 24 a 120 horas. Os
principais caminhos para a infiltração foram os espaços existentes entre os
parafusos transversais e não através das fendas marginais das coroas pré-
fabricadas. Esses estudos mostram que, apesar do alto grau de precisão nas
adaptações da grande maioria dos sistemas de implantes, não há como evitar a
micro-infiltração dos microrganismos pelas fendas existentes. Estes resultados
são compatíveis com àqueles obtidos in vivo por Quirynen & van Steenberghe
(1993), e in vitro por Traversy & Birek (1992).
Gross et al. (1999), estudaram a micro-infiltração na interface
implante/intermediário, consideradas potencialmente capazes de causar mau odor
e inflamação dos tecidos peri-implantares. O grau de micro-infiltração na interface
de 5 sistemas de implantes foi comparativamente aceitável, variando os níveis de
torque. Utilizando provas de traçado colorido em um sistema com pressão de
NASCIMENTO, C. Mestrado
36
2atm, a micro-infiltração na interface de implantes Branemark, Sulzer Calcitek, 3i,
ITI e Steri-Oss foi determinada por um espectrofotômetro. A micro-infiltração na
interface implante/intermediário ocorreu em todos os sistemas, variando de acordo
com a marca e o torque aplicado. Conforme o torque aumentou de 10 Ncm para
20 Ncm, e até o recomendado pelo fabricante, a micro-infiltração diminuiu
significantemente para todos os sistemas. Interação significante entre o torque e o
tempo de exposição das amostras aos microrganismos foi evidenciada por análise
de variância. Os resultados indicaram que fluidos e pequenas moléculas foram
capazes de passar através da interface implante/intermediário de todos os grupos
estudados. Os autores concluíram que, presumivelmente, fluidos contendo
produtos bacterianos e nutrientes necessários para o crescimento bacteriano
poderiam passar através da interface, contribuindo em parte pelo mau odor e
comprometimento dos tecidos peri-implantares. Concluíram ainda, que a aplicação
do torque como recomendado pelo fabricante pode reduzir potencialmente efeitos
adversos da micro-infiltração.
Neves et al. (2000), observaram que o alto percentual de sucesso e
longevidade dos implantes osseointegrados estavam associados a significativas
alterações morfológicas nos intermediários e apresentaram subsídios teóricos
para a seleção do melhor intermediário para cada caso individual, além de
informações técnicas sobre seu uso.
Recentemente, tem-se observado tanto in vitro quanto in vivo, que
implantes com conectores protéticos rosqueáveis estão mais freqüentemente
associados à infiltração bacteriana para seu interior. Uma alternativa para diminuir
NASCIMENTO, C. Mestrado
37
essa infiltração é representada por implantes que podem receber o componente
intermediário cimentado.
Piattelli et al. (2001), realizaram um estudo para comparar o grau de
penetração bacteriana e fluidos orais em dois sistemas de implantes diferentes,
um com o conector protético apenas rosqueável (SRA) e outro com o componente
cimentado (CRA), utilizando 12 amostras de cada tipo. A análise por microscopia
eletrônica demonstrou que a fenda entre o implante e o componente rosqueável
variou entre 2 e 7 mm, enquanto que nos cimentados esta fenda foi de 7 mm. Nos
cimentados, a fenda foi completamente preenchida pelo cimento. Em testes de
infiltração marginal, utilizando azul de toluidina e cultura microbiana, foi possível
observar que a penetração do corante e dos microrganismos ocorreu apenas pela
interface implante/conector protético e para os espaços internos do sistema
rosqueável. Com base nos resultados obtidos neste estudo, os autores concluíram
que os conjuntos com conectores cimentados apresentam melhores resultados em
relação à penetração bacteriana e de fluidos comparados aos rosqueáveis.
Rimondini et al. (2001), avaliaram, in vivo, a contaminação do interior
de conjuntos implante/conectores, após a aplicação da carga oclusal, em
implantes selados ou não com silicone. Oito conjuntos selados e nove não selados
foram colocados em sete pacientes que apresentaram boa higiene oral. Dois
meses após a reconstrução protética, coroas e intermediários foram removidos e a
contaminação orgânica e inorgânica foram avaliadas através de microscopia
eletrônica e análise de dispersão de energia através de um espectroscópio. Uma
contaminação amorfa e cristalina, sugestiva de cálcio e fosfato, foi encontrada em
todas as superfícies das roscas. Contaminação bacteriana foi observada mais
NASCIMENTO, C. Mestrado
38
freqüentemente no grupo não selado. Não houve diferenças quanto a tipos
morfológicos de bactérias presentes nos dois grupos, sendo cocos os
microrganismos mais representativos. Os autores concluíram que, em situações
clínicas, penetração de fluidos ocorre através da interface implante/conector, mas
é limitada em pacientes com boa higiene oral, e que a contaminação pode ser
reduzida através do selamento com silicone.
Buchmann et al. (2003), avaliaram a microbiota presente na superfície
externa de conectores protéticos do sistema de implantes Frialit-2, e comparam os
achados microbiológicos com parâmetros peri-implantares após dois anos de
função. Foram examinados 32 conectores protéticos em 16 pacientes. O método
utilizado para a identificação dos microrganismos foi a cultura microbiana. Os
autores não encontraram diferença significante entre a microbiota presente na
superfície dos conectores e os parâmetros peri-implantares examinados. A
microbiota removida dos conectores revelou colonização de bactérias gram-
positivas (A. israelli, 68,8%; E. lentum, 56,3%; e V. parvula, 43,8%) e baixas
quantidades de microrganismos gram-negativos patógenos periodontais (F.
nucleatum, 87,5%; P. gingivalis, 81,3%; e P. micros, 68,8%). Os autores
concluíram que, após dois anos em função, a colonização bacteriana dos
conectores protéticos é compatível com a saúde dos tecidos peri-implantares.
2. 4 Conectores calcináveis X conectores pré-fabricados
Adaptação passiva, segundo Sahin & Cehreli, em 2001, é sinônimo de
uma adaptação ideal. Teoricamente, uma infra-estrutura deveria proporcionar uma
adaptação passiva, não induzindo tensão nos componentes dos implantes e ao
NASCIMENTO, C. Mestrado
39
osso adjacente. Entretanto, segundo os autores, uma adaptação passiva é
impossível de ser obtida. Os procedimentos clínicos e laboratoriais utilizados na
confecção de infra-estruturas são inadequados para proporcionar tal adaptação.
Complicações como afrouxamento e fratura dos parafusos, fratura do
intermediário, da infra-estrutura e material de cobertura têm sido documentadas e
relacionadas à desadaptação das infra-estruturas. Não há estudos clínicos
longitudinais comprovando falhas nos implantes atribuídas especificamente à falta
de adaptação da infra-estrutura. Uma adaptação marginal aceitável entre os
componentes não significa a obtenção de uma adaptação passiva. Os autores
sugerem que o melhor método para se avaliar a passividade de uma infra-
estrutura seria a análise de tensão gerada em cada conector e/ou componente
protético antes e após o apertamento dos parafusos e/ou cimentação da mesma.
Cada passo durante a confecção de uma infra-estrutura influencia a adaptação
final e, segundo os autores, as técnicas e os materiais utilizados atualmente não
são precisos dimensionalmente, havendo a necessidade de novos estudos.
Byrne et al., em 1998, relataram a insuficiência de informação a
respeito da adaptação dos conectores protéticos aos implantes. Os autores
observaram as adaptações entre conectores pré-fabricados, fundidos e pré-
fabricados modificados em laboratório em duas condições: interface do conector e
implante e assentado por parafuso de ouro no interior e na base do conector. Seis
combinações de conectores e implantes foram avaliadas no estudo: Grupo 1-
implante Nobelpharma e conector CeraOne com torque de 32 Ncm do parafuso de
ouro sem o ciclo de queima da porcelana; Grupo 2- implante 3i e conector STR
com torque de 32 Ncm do parafuso de ouro sem o ciclo de queima da porcelana;
NASCIMENTO, C. Mestrado
40
Grupo 3- implante 3i e conector UCLA de padrão plástico com torque de 20 Ncm
do parafuso de ouro com queima da porcelana; Grupo 4- implante Nobelpharma e
conector UCLA de padrão plástico com torque de 20 Ncm do parafuso de ouro
com queima da porcelana; Grupo 5- implante 3i e conector UCLA pré-fabricado
com parafuso de ouro e torque de 32 Ncm com ciclo de queima da porcelana;
Grupo 6- implante 3i e conector UCLA pré-fabricado com parafuso de ouro e
torque de 32 Ncm sem ciclo de queima da porcelana. Para os grupos 3, 4 e 5 foi
feito um enceramento de um UCLA e confecção de uma matriz de silicone, para o
enceramento uniforme das amostras. As amostras foram fundidas com liga de
ouro/paládio. Os grupos 3, 4 e 5 fundidos foram submetidos ao ciclo de queima da
porcelana. Os conectores foram parafusados e presos a uma base de resina. Os
conjuntos conectores/implantes foram seccionados no sentido horizontal e levados
para análise em microscópio eletrônico. Foram analisadas 5 amostras por grupo.
As medidas das fendas externas dos grupos 1, 3 e 4 apresentaram grande
discrepância (86 ± 19µm) (74± 33µm), (84 ± 26µm). As medidas verticais foram:
grupo 1- 35 ± 17 µm, grupo 2- 15± 16 µm, grupo 3- 68 ± 44 µm, grupo 4- 66 ± 33
µm, grupo 5- 31 ± 30 µm e grupo 6- 17 ± 20 µm. As maiores desadaptações foram
apresentadas pelos conectores UCLA de plástico fundidos em ouro/paládio. Os
autores concluíram que os conectores protéticos pré-fabricados possuem
adaptação superior aos fundidos em laboratório e sugerem a necessidade de um
padrão mais refinado para fundições realizadas em laboratório.
Vigolo et al., em 2000, avaliaram as alterações da interface
implante/conector após a fundição com um metal nobre e aplicação de cerâmica
em conectores do tipo UCLA (3i) de ouro. Utilizaram 30 conectores (SGUCGI) que
NASCIMENTO, C. Mestrado
41
foram parafusados sobre análogos fixados em resina. Sobre os conectores, foram
realizados enceramentos com dimensões de um incisivo central, e posteriormente
fundidos com uma liga áurea de alta fusão. Nestes, foram realizadas aplicações
de cerâmica seguindo as instruções do fabricante. Medidas foram realizadas
antes, após a fundição e depois da aplicação da cerâmica, da profundidade e
largura da porção interna do hexágono, diâmetro da base do conector UCLA, e
liberdade rotacional entre a extensão hexagonal do implante e a contra-parte do
conector. Os resultados evidenciaram médias de 0,620 mm, 0,621 mm e 0,620
mm na profundidade do hexágono. 2,712 mm, 2,710 mm e 2,711 mm para a
largura do hexágono interno; 4,408 mm, 4,407 mm e 4,409 mm para o diâmetro da
base; 6,33 min, 6,37 min e 6,38 min de liberdade rotacional (antes, após fundição
e após aplicação da cerâmica respectivamente). Os autores concluíram que a
adaptação dos conectores UCLA de ouro (3i) não demonstraram alterações
significantes das medidas originais, ou da liberdade rotacional na superfície da
porção interna. Sugeriram a seleção adequada de componentes com baixa
tolerância de usinagem, seleção adequada da liga metálica e a utilização de
procedimentos clínicos e laboratoriais meticulosos para reduzir a adaptação
rotacional e aumentar a estabilidade do parafuso.
Tavarez, em 2003, realizou um estudo para avaliar as alterações na
interface implante/conector de sistemas com conexão interna e externa com
conectores pré-fabricados ou calcináveis, através das medidas de desadaptação,
e a condição de torque e destorque dos parafusos de fixação quando submetidos
a ensaios de fadiga. Nos 5 grupos estudados: grupo 1- implante HE e conector
UCLA com restaurações cimentadas, grupo 2- implante HI e conector pré-
NASCIMENTO, C. Mestrado
42
fabricado com restauração cimentada, grupo 3- implante HI e conector pré-
fabricado com restauração cimentada, grupo 4- implante HE e conector UCLA com
restauração parafusada e grupo 5- implante HE com conector CeraOne e
restauração cimentada. Os corpos de prova foram submetidos a ensaios de fadiga
de até 500.000 ciclos utilizando-se uma máquina de ensaio MTS 810. Testes de
torque e destorque dos parafusos de fixação, e análise da desadaptação da
interface implante/conector antes e após a aplicação de cargas foram realizados.
Observou-se que: 1) houve diferenças no diâmetro da base de assentamento dos
implantes e conectores entre 0,03 mm e 0,75 mm; e no diâmetro do
hexágono/octágono entre implantes e conectores de 0,01 a 0,05 mm, sendo que
no grupo que utilizou HI não foram encontradas diferenças; 2) o comprimento dos
parafusos variou entre 5,95 mm e 8,83 mm, o comprimento das roscas variou
entre 4,52 mm e 5,72 mm, enquanto que o diâmetro variou de 1,79 a 1,99 mm; 3)
após o ensaio de fadiga, observou-se melhor adaptação dos conjuntos de
implantes HE com conectores CeraOne quando comparados aos implantes HI e
conectores tipo UCLA; 4) houve redução estatisticamente significante da condição
de torque dos grupos estudados após o ensaio de fadiga, e 5) houve uma forte
correlação entre a aplicação das cargas cíclicas e a diminuição da condição de
torque, enquanto que nas demais variáveis não houve esta correlação.
Em 1995, Kano et al., analisaram a desadaptação do cilindro de ouro
do sistema Nobelpharma, comparando-o a componentes similares fundidos a
partir de matrizes calcináveis (3i) usando diferentes tipos de ligas metálicas
(Porson-4, Palliag-M e Durabond). Foram confeccionadas 5 amostras para cada
grupo. As medidas foram realizadas em um projetor de perfil com aumento de 30
NASCIMENTO, C. Mestrado
43
vezes. Obtiveram os seguintes resultados em ordem crescente de adaptação: 117
µm (cilindro de ouro), 132 µm (matriz plástica e liga Porson-4), 135 µm (matriz
plástica antes da fundição), 156 µm (matriz plástica e liga Durabond), 224 µm
(matriz plástica e liga Palliag-M). Os autores concluíram que os cilindros de ouro
pré-fabricados apresentaram os melhores resultados, e não apresentaram
diferença estatística em relação a matriz plástica antes da fundição e após a
fundição a partir da liga Person-4.
Binon e MacHugh, em 1996, avaliaram a influência da liberdade
rotacional em implantes de hexágono externo de dimensões diferentes, na
estabilidade da união parafusada. Para o experimento, utilizaram 2 grupos
diferentes de conectores protéticos UCLA não segmentados, sendo um grupo com
conector hexagonal pré-fabricado em ouro com seu parafuso de fixação em titânio;
e outro com conector hexagonal externo calcinável e seu correspondente parafuso
de fixação. Assim, conectores cônicos totais metálicos foram obtidos com 8 mm de
altura por 8 mm de largura. Como grupo controle, utilizaram conectores pré-
fabricados em ouro. Nas amostras, foram aplicados 20 Ncm de torque inicialmente
e depois de um milhão de ciclos foram reapertados com 30 Ncm. Em todas as
amostras foram aplicadas cargas cíclicas utilizando a metodologia desenvolvida
por Binon previamente, com 133,3 Ncm de carga, uma rotação anti-horária de 28
ciclos por minuto, 1.150 ciclos por minuto de carga vertical até ocorrer a falha do
parafuso. Seus resultados mostraram uma média de liberdade rotacional de 5° em
ambos os grupos testes, sendo que todas as amostras do grupo pré-fabricado
afrouxaram entre 384.215 e 409.170 ciclos, na primeira parte do experimento. No
segundo grupo teste, só um implante falhou em 597.366 ciclos, as outras
NASCIMENTO, C. Mestrado
44
amostras permaneceram estáveis durante o primeiro milhão de ciclos, sendo que
o segundo grupo teste teve uma maior resistência ao afrouxamento, na primeira e
segunda parte do experimento. Encontrou-se também uma correlação direta entre
a liberdade rotacional do conjunto implante/conector e o afrouxamento do
parafuso, sendo que esta união é mais resistente ao afrouxamento quanto menor
é a liberdade rotacional.
No ano de 1996, Carr et al., avaliaram in vivo a resistência do parafuso
de ouro e a carga a que o mesmo está submetido quando se variam os
componentes com os quais são fabricadas as próteses. Os autores
confeccionaram as próteses sobre conectores convencionais, usando cilindros de
ouro pré-fabricados e outras, usando cilindros de plástico. Concluíram que os
parafusos de ouro que seguram as próteses fabricadas com cilindro de ouro
estavam em condições de carga muito melhores que àqueles que prendiam as
próteses fabricadas sobre os cilindros de plástico. Observaram também que os
cilindros de plástico sofrem mais alterações nos resultados finais quando se
variavam os procedimentos laboratoriais, como por exemplo, a liga, o tipo de
revestimento ou acabamento. Os autores concluíram, ainda, que o uso de cilindros
pré-fabricados em ouro oferece vantagens em relação à magnitude de carga e à
precisão dos parafusos de ouro.
Sartori, em 1999, comparou a estabilidade que se estabelece entre
intermediários estéticos de diversas empresas (Nobel Biocare, 3i e conexão
fabricados em ouro; e Conexão e Carbontec fabricados em plástico) e seus
respectivos cilindros protéticos. A adaptação marginal, observada em microscópio
ótico, encontrou medidas que variaram de 5,7 a 10,49 µm quando os cilindros
NASCIMENTO, C. Mestrado
45
eram fabricados em ouro e de 17,8 µm a aproximadamente 20 µm quando
fabricados de plástico. Após as leituras iniciais, os cilindros receberam
enceramentos, foram incluídos e fundidos com ligas à base de ouro, de
prata/paládio e de níquel/cromo, e novamente analisados. As medidas variaram de
5,8 a 20,4 µm quando os cilindros de ouro foram fundidos com as ligas de ouro e
prata/paládio, e de 32,1 a 141 µm quando os cilindros de plástico foram fundidos
com a liga de níquel/cromo. Os resultados demonstraram que os cilindros
usinados em plástico sofrem variabilidade de comportamento em relação à
estabilidade dimensional das margens, em grau maior do que os cilindros
usinados em ouro.
Segundo Kano et al. (2006), a união dos implantes aos seus
componentes está sujeita a uma perda da força inicial de torque devido à fricção a
que serão submetidas as peças, e à pobre adaptação entre seus componentes.
Em seu estudo, compararam a perda do torque inicial em uniões de implantes com
conectores de hexágono externo pré-fabricados em titânio e calcináveis a partir do
padrão UCLA. Foram avaliados 4 grupos contendo 12 amostras cada: (1)
conectores de titânio pré-fabricados, (2) conectores fundidos em paladium, (3)
conectores calcináveis fundidos em níquel – cromo e, (4) conectores calcináveis
fundidos em cromo – cobalto. Os conectores foram unidos aos implantes com uma
força de 30 Ncm, conforme instruções do fabricante. Após o torque, os parafusos
foram desenroscados por 3 vezes. A média da força aplicada para abrir o conjunto
(destorque) foi computada para cada conjunto. As médias do destorque, obtidas
para cada grupo, foram respectivamente: (1) 92,3 ± 2,9%, (2) 81,6 ± 5,0%, (3) 86,4
± 4,6% e (4) 84,0 ± 7,0%. Os conectores pré-fabricados apresentaram uma maior
NASCIMENTO, C. Mestrado
46
força de destorque quando comparados aos grupos calcináveis (p<0,05).
Nenhuma diferença significante foi observada entre os grupos calcináveis. Os
autores concluíram que os conectores pré-fabricados apresentam uma maior
manutenção da força de torque inicialmente aplicada, necessitando de uma maior
força para soltar o conjunto, e que os procedimentos de fundição diminuem a
porcentagem do torque inicial, o que pode influenciar na estabilidade final do
conjunto.
2. 5 Análise microbiológica pela técnica de hibridação DNA - Checkerboard
A doença periodontal, resultado de uma infecção polimicrobiana, é a e
mais freqüente doença que acomete a cavidade oral. É causada por várias
espécies microbianas, tais como A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum, P.
gingivalis, T. forshytensis, P. intermédia e T. denticola. O estudo da microbiota oral
humana tem-se limitado a métodos de análise de cultura microbiana convencional.
Entretanto, muitas espécies encontradas na cavidade oral ainda não foram
totalmente caracterizadas ou cultivadas. Conseqüentemente, estudos avaliando os
possíveis agentes causadores das doenças da cavidade oral, como a doença
periodontal, restringem-se apenas às espécies cultiváveis. Portanto, um grande
número de microrganismos não detectados pelo método tradicional de cultura
pode estar exercendo um papel fundamental na origem e desenvolvimento dessas
doenças (Sakamoto et al., 2005).
Na década passada, a introdução de novas técnicas para identificação
de espécies bacterianas, em amostras de placas subgengivais, estendeu nossos
NASCIMENTO, C. Mestrado
47
conhecimentos em relação à composição da microbiota periodontal, assim como o
efeito das terapias periodontais sobre a composição e manutenção dos biofilmes.
Essas técnicas são mais rápidas que as convencionais e são realizadas por meio
do uso de sondas de DNA (Colombo et al., 1998; Haffajee et al., 1998; Ximenez-
Fyvie et al., 2000).
Para Socransky et al. (2004), é muito difícil conduzir estudos em larga
escala sobre os complexos ecossistemas microbiológicos usando técnicas
microbiológicas convencionais. Técnicas moleculares de identificação, como a
técnica de hibridação DNA-Checkerboard, permitem identificar um grande número
de espécies em um grande número de amostras. É uma técnica rápida, sensível e
relativamente barata. A técnica consiste no cruzamento das amostras coletadas
contra as sondas dos microrganismos a serem estudados, preparadas a partir de
seu DNA genômico.
As sondas de DNA genômico têm sido utilizadas extensivamente em
estudos sobre a composição de placas subgengivais e microbiota associada com
lesões endodônticas (Haffajee et al., 1998; Ximenez-Fyvie et al., 2000; Siqueira et
al., 2002).
A técnica de hibridação DNA-Checkerboard foi descrita pela primeira
vez em 1994, por Socransky et al. Usando sondas específicas provenientes de 40
espécies bacterianas, os autores determinaram que a placa bacteriana
subgengival contém diversas espécies bacterianas, e dividiram essa espécies em
diferentes complexos. Os diferentes complexos parecem ter diferentes
associações com a severidade da doença periodontal e os vários estágios de
desenvolvimento da placa bacteriana. Os complexos amarelo e verde, os quais
NASCIMENTO, C. Mestrado
48
incluem espécies de estreptococos orais e várias espécies de bastonetes gram-
negativos facultativos, foram detectados nos sítios gengivais mais saudáveis, no
início da formação da placa. A colonização por espécies do complexo laranja
parece depender da presença dos primeiros complexos (amarelo e verde) e
compreende as espécies Prevotella spp e Campylobacter spp. As espécies mais
patogênicas (complexo vermelho) incluem P. gingivalis, T. forshytensis e
Treponema denticola. Essas espécies não foram encontradas na ausência dos
outros complexos. Outras espécies foram agrupadas em um quinto complexo, o
roxo. Algumas espécies, como Actinobacillus spp não foram enquadradas em
nenhum grupo. (Sokransky et al., 1998).
A técnica DNA-checkerboard tem sido muito utilizada, recentemente,
para examinar a composição microbiana das placas supra e subgengivais de
pacientes saudáveis e com periodontite, a relação da microbiota da saliva com a
doença periodontal, o relacionamento do cigarro na composição da placa
subgengival, as diferenças da composição da placa subgengival de pacientes de
localizações diversas, a relação da interface entre os componentes dos implantes
e o acúmulo de placa, bem como os efeitos de várias terapias periodontais no
tratamento da doença (Ximenez-Fyvie et al., 2000; Sakamoto et al., 2005).
Dahlèn & Leonhardt (2006) avaliaram através da técnica do DNA-
Checkerboard, a associação de 13 novas bactérias periodontopatogênicas, com
12 patógenos periodontais consagrados. Amostras de sítios saudáveis e com
doença periodontal foram coletadas de 50 pacientes com cones de papel
absorventes. Essas amostras foram testadas contra 25 sondas genômicas das
espécies a serem avaliadas. Os autores observaram que, das 25 espécies
NASCIMENTO, C. Mestrado
49
estudadas, 24 foram detectadas mais freqüentemente nos sítios com doença
periodontal que em sítios saudáveis. Das novas espécies associadas às doenças
periodontais, apenas Prevotella tannerae, Filifactor alocis e Porphyromonas
endodontalis apresentaram diferenças estatísticas em relação aos sítios saudáveis
e com doença periodontal. Os autores concluíram que estes microrganismos
devem ser considerados em conjunto com as 12 espécies já consagradas no
diagnóstico da periodontite associada à microbiota bacteriana.
Katsoulis et al. (2005), avaliaram o efeito do armazenamento de
amostras bacterianas em relação à detecção microbiológica pela técnica do DNA-
Checkerboard, bem como a proporção de distribuição dos patógenos pertencentes
ao complexo vermelho de Socransky. Amostras de placas subgengivais foram
divididas em quatro grupos: (1) processamento imediato, (2) após armazenamento
a +4° C por 6 semanas, (3) após armazenamento a -20° C por 6 meses e (4) após
armazenamento a -20° C por 12 meses. A proporção de distribuição dos
microrganismos pertencentes ao complexo vermelho não apresentou diferenças
entre os três primeiros grupos. Entretanto, a quantidade total de DNA bacteriano
avaliado diminuiu significantemente nos grupos 3 e 4. Quantidades relativas de
Tannerella forsythensis, Porphyromonas gingivalis e Treponema denticola
permaneceram estáveis no segundo grupo, mas nos grupos 3 e 4 tiveram suas
quantidades reduzidas. Os autores concluíram que todas as amostras bacterianas
devem ser processadas seguindo um protocolo de armazenamento máximo de 6
semanas a +4° C, de modo a obter melhores resultados qualitativos e
quantitativos, quando comparados ao processamento imediato das amostras.
NASCIMENTO, C. Mestrado
50
Quirynen et al. (2005), estudaram a composição microbiológica
através da técnica de hibridação DNA-Checkerboard em pacientes submetidos à
tratamento com implantes (Branemark System, Nobelbiocare) mandibulares após
10 anos de função. Trinta e sete pacientes desdentados totais com média de
idade variando dos 36 aos 85 anos, foram divididos em dois grupos: (1) 25
pacientes reabilitados com próteses tipo overdenture (OD) e, (2) 12 pacientes
portadores de prótese fixas sobre os implantes (FFP). As amostras das placas
subgengivais foram coletadas com o auxílio de cones de papel estéreis. Após os
10 anos de função das próteses não foram observadas diferenças estatísticas
quanto à composição das placas subgengivais entre os grupos estudados (OD e
FFP). A microbiota subgengival dos implantes apresentou baixas quantidades de
DNA (±10x10
5
), mas grande freqüência de detecção de Actinobacillus
actinomycetemcomitans (>90%), Prophyromonas gingivalis (>85%) e Tannerella
forsythensis (30%).
A dinâmica das modificações microbiológicas subgengivais durante as
primeiras semanas após a terapia periodontal ainda não é bem compreendida. O
impacto do ambiente supragengival (saliva, placa supragengival e tecidos moles)
sobre a recolonização subgengival, após terapia periodontal, ainda é controversa
(Petersilka et al., 2002). Os implantes odontológicos possibilitam a observação do
modelo inicial de colonização subgengival. Quirynen et al. (2005) estudaram o
desenvolvimento inicial do biofilme bacteriano e o tempo necessário para que uma
microbiota subgengival complexa se instalasse em implantes com bolsas
periodontais. As bolsas (rasas <3 mm; moderadas >3 mm) foram realizadas
NASCIMENTO, C. Mestrado
51
durante a colocação do componente intermediário, e foram comparadas às dos
dentes vizinhos do mesmo paciente, com bolsas rasas (≤4 mm) e moderadas (>4
mm). Os pacientes foram orientados a fazerem bochechos com clorexidina 0,2%
por uma semana. Quatro amostras de placa subgengival foram coletadas das
bolsas ao redor dos implantes e dentes após 1, 2 e 4 semanas da colocação do
componente intermediário. A análise pelo método do DNA-Checkerboard, e pelo
de cultura, revelaram uma microbiota complexa, incluindo várias espécies
patogênicas nas bolsas iniciais após uma semana, com um aumento mínimo de
microrganismos no final da quarta semana. A análise dos resultados demonstrou
que até mesmo quando o ambiente supragengival é a única origem para o início
da colonização bacteriana, uma microbiota complexa pode desenvolver-se em
apenas uma semana.
NASCIMENTO, C. Mestrado
52
3. PROPOSIÇÃO
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
53
Os objetivos do presente estudo, in vitro, foram:
– Avaliar a passagem do Streptococcus sobrinus através da interface
entre implante e conector protético totalmente calcinável ou com a plataforma
protética pré-fabricada em Co-Cr;
– Avaliar a sensibilidade do método de hibridação DNA-Checkerboard
a partir da contaminação controlada da região interna do implante pelo mesmo
microrganismo.
NASCIMENTO, C. Mestrado
54
4. MATERIAIS E MÉTODOS
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
55
4. 1 Avaliação da passagem do microrganismo Streptococcus sobrinus
através da interface implante/conector
Seleção dos implantes
Para o presente estudo foram utilizados 20 implantes odontológicos de
titânio com hexágono externo (Figura 1A - Implante Ultra Rosqueável, SIN
®
-
Sistema de Implante Nacional, São Paulo, Brasil), 10 conectores protéticos do tipo
UCLA totalmente calcináveis (Figura 1B), e 10 conectores protéticos do tipo UCLA
com plataforma protética pré-fabricada em Co-Cr (Figura 1C). Esses implantes e
componentes foram divididos em grupos, da seguinte forma: Grupo 1 - 10
conjuntos implantes/conectores calcináveis; e Grupo 2 - 10 conjuntos
implantes/conectores com plataforma pré-fabricada em Co-Cr.
Todos os implantes apresentavam 3,75 mm de diâmetro por 8,5 mm
de altura. Os implantes foram recebidos do fabricante em embalagens estéreis,
assim como são disponibilizados comercialmente.
O fabricante recomenda que, tanto o conector totalmente calcinável,
como a parte calcinável do conector pré-fabricado, utilizada para sobre-fundição,
sejam fundidos em ligas de alto ponto de fusão, indicadas para restaurações
metalo-plásticas ou metalo-cerâmicas.
Após consulta ao fabricante, para verificação da compatibilidade entre
os metais utilizados, optou-se por uma liga de Ni-Cr (Vera Bond II, AalbaDent,
USA), para todas as fundições e sobre-fundições realizadas. Para isso, a porção
calcinável dos conectores UCLA dos grupos 1 e 2 foi reduzida a uma altura que
NASCIMENTO, C. Mestrado
56
correspondesse ao mesmo peso para todas as amostras estudadas (0,5 g),
padronizando desta forma a distorção causada pela fundição. Os componentes
foram então fundidos pela técnica de cera perdida (Figura 1D). Os conectores dos
dois grupos foram dispostos individualmente em envelopes grau cirúrgico e
esterilizados em autoclave à temperatura de 121°C durante 30 minutos.
Obtenção do microrganismo
Todas as etapas microbiológicas foram realizadas em ambiente
asséptico, livre da contaminação externa, em um fluxo laminar e com bico de
Bunsen. Inicialmente, a área interna do fluxo foi iluminada durante 30 minutos por
luz ultra-violeta, após desinfecção por álcool 70. Toda a vidraria, pinças,
torquímetro e chaves para torque foram previamente autoclavados. Os operadores
foram devidamente paramentados com luvas cirúrgicas, gorros e máscaras
estéreis.
O microrganismo selecionado para o presente estudo foi o
Streptococcus sobrinus (ATCC 33478). Essa espécie foi selecionada para o
estudo por ser considerada uma das primeiras colonizadoras do biofilme
bacteriano dentário e por seu potencial papel no surgimento e desenvolvimento
das doenças periodontais e peri-implantares (Cao et al., 1990; Zee et al., 1996). A
cepa utilizada foi obtida junto ao Departamento de Microbiologia da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP.
NASCIMENTO, C. Mestrado
57
Crescimento e ativação bacteriana
Para o crescimento e multiplicação do microrganismo foi utilizado o
meio de cultura TSBy (Tryptic Soy Broth yeast, Difco, USA). Após
descongelamento da cepa do S. sobrinus em banho-maria, a 37°C por 5 minutos,
100 µL foram depositados em um tubo de ensaio contendo caldo de TSBy (Figura
2A) e levados para incubação em estufa bacteriológica a 35°C por 48 horas.
Determinação da concentração do microrganismo
Após a incubação do microrganismo em meio de cultura, o inóculo foi
transferido para tubos Falcon e centrifugado a 15000 rpm por 30 minutos. O
sobrenadante foi desprezado e o sedimento resuspenso em solução fisiológica. A
solução foi diluída até corresponder à concentração de 10
8
UFC/mL. A diluição foi
feita acrescentando-se solução fisiológica, e a comparação foi visual até atingir a
densidade 0,5 da escala de McFarland. A confirmação da concentração desejada
foi verificada no espectrofotômetro Spectrophotomer 22 PC (Spectrumlab, Brasil) a
um comprimento de onda de 625 nm com 0,08 a 0,1 de absorbância (CLSI). A
partir do crescimento obtido, verificou-se a pureza da cultura e a confirmação da
quantidade de microrganismos por meio da semeadura em placas de Petri
(20X100 mm), em meio de cultura SB20 (Difco, USA; Figura 2B). Após a
incubação a 35°C por 48 horas, foi realizada a contagem visual de unidades
formadoras de colônias (UFC) nas placas, confirmando a concentração indicada
pelos outros métodos e definida previamente em testes-piloto como adequada
para o estudo.
NASCIMENTO, C. Mestrado
58
Inoculação dos microrganismos
Os implantes foram retirados de suas embalagens, apreendidos com o
auxílio de uma pinça forte, tipo porta agulhas, e mantidos na posição vertical
(Figura 3A). Com o auxílio de uma pipeta de precisão (Gilson S.A.S., France -
Figura 3B), foram inoculados no interior de cada implante 3,0 µL da solução
contendo a concentração de 10
8
UFC/mL do microrganismo (Figura 3C).
Em seguida, os conectores protéticos foram adaptados aos implantes
dos grupos 1 e 2, com o auxílio da chave manual (SIN
®
-São Paulo, Brasil – Figura
4A). O torque final foi dado com um torquímetro (SIN
®
-São Paulo, Brasil) calibrado
em 32 Ncm, conforme instruções do fabricante (Figura 4B).
Os 20 conjuntos implantes/conectores dos grupos 1 e 2 (Figura 4C)
tiveram sua superfície superior selada com uma camada de gutapercha (Hygienic,
DFL, Brasil) e cola adesiva à base de cianoacrilato (Super Bonder, Loctite, Brasil -
Figura 4D).
Controle da contaminação externa
Após o selamento, os conjuntos foram introduzidos em tubos de
ensaio contendo 5,0 mL do meio de cultura CasaB estéril, durante 30 segundos,
para identificação de possíveis contaminações externas (Figura 5A). Os conjuntos
eram removidos e esses tubos passaram, então, a ser comparados diariamente
aos tubos controles, contendo o CasaB estéril quanto a ocorrência de turvação
(Figura 5B). Caso essa turvação fosse observada, seria levantada a hipótese de
contaminação da superfície externa do implante durante sua manipulação ou
contaminação ambiental, e o implante em questão seria excluído do estudo.
NASCIMENTO, C. Mestrado
59
Em seguida, os implantes foram retirados e colocados em outros tubos
de ensaio, também contendo 5,0 mL de CasaB estéril, onde permaneceram para
avaliação da ocorrência de infiltração e possível contaminação do meio (Figura
6A).
Avaliação da turvação do meio de cultura
Os tubos foram numerados de 1 a 10, separados em dois grupos (1 e
2), e mantidos na posição vertical em estufa bacteriológica a 35°C por 21 dias
(Figuras 6B). As observações visuais foram feitas a cada 24 horas, sempre no
mesmo horário, para verificação de possíveis turvações do meio, atribuída à
contaminação bacteriana. Como parâmetro de comparação, foram utilizados os
tubos para identificação da contaminação externa, e um tubo contendo o meio
CasaB estéril (Figura 6C). As análises foram realizadas por um único observador
que desconhecia a origem e o processo de identificação dos tubos.
Quando se observava a turvação do meio, 0,1 mL do conteúdo do
tubo era semeado em meio SB20, na placa de Petri, e incubado por 48 horas a
35°C, sob condições de anaerobiose, em estufa bacteriológica, para confirmação
da ocorrência de contaminação pelo microrganismo.
NASCIMENTO, C. Mestrado
60
C
B
A
D
Figura 1 – A: Implante Ultra Rosqueável Sin
®
3,25 mm X 8,5 mm; B: conector tipo UCLA
totalmente calcinável; C: conector tipo UCLA calcinável com plataforma protética pré-
fabricada em Co-Cr; D: conectores protéticos após fundição em liga de Ni-Cr.
A
B
Figura 2 – A: Inoculação de 100,0 µL de Streptococcus sobrinus
ATCC 33478 em caldo TSBy; B: Colônias de Streptoccocus
sobrinus em placa de Petri contendo SB20, após cultivo por 48 h,
em condições ideais.
Figura 3 – A: Implante apreendido com uma pinça tipo porta-agulhas; B: Pipeta
de precisão ajustada em 3,0 µL; C: Inoculação de 3,0 µL do meio de cultura
contendo S. sobrinus na região interna dos implantes dos 3 grupos.
A
B
C
A
B
C
D
Figura 4 – A: Adaptação inicial do componente com a chave manual; B: Torque final
com o torquímetro calibrado em 32 Ncm; C: conjuntos unidos após inoculação; D:
selamento da superfície superior do conjunto.
NASCIMENTO, C. Mestrado
61
A
B
Figura 5 – A: Imersão do conjunto implante/conector em
meio CasaB estéril, para controle de contaminação
externa; B: Tubo para avaliação da contaminação externa.
A
B
C
Figura 6 – A: tubos posicionados na estante para observação diária; B: incubação em
estufa bacteriológica, em anaerobiose, a 35° C; C: observação dos tubos contendo os
conjuntos em comparação ao tubo contendo o meio estéril.
4. 2 Avaliação da sensibilidade do método de hibridação DNA Checkerboard
Amostras do conteúdo interno do conjunto implante/conector foram
colhidas com o objetivo de identificar e quantificar os microrganismos presentes,
utilizando para isto, a técnica de hibridação com sondas de DNA genômico DNA –
Checkerboard. A técnica foi empregada neste estudo com uma modificação em
relação à técnica inicialmente proposta por Socransky et al. (1994). Devido à
dificuldade de importação do marcador genômico quimiluminescente Digoxigenina,
utilizamos como agente de marcação da sonda genômica do S. sobrinus um outro
tipo de marcador quimiluminescente, a Fluoresceína.
NASCIMENTO, C. Mestrado
62
Preparo e marcação da sonda do S. sobrinus
As sondas foram preparadas a partir da extração do DNA genômico do
microrganismo Streptococcus sobrinus (ATCC 33478). Os procedimentos para
ativação e multiplicação do microrganismo foram os mesmos descritos
anteriormente.
Extração do DNA genômico
A solução contendo o meio de cultura e o microrganismo foi colocada
em tubos de 50,0 mL para centrifugação a 13200 rpm por 15 minutos, e obtenção
dos pellets. Os pellets foram removidos e colocados em um tubo eppendorf.
Foram acrescentados 300,0 µL de lisozima 125 mg/mL e o tubo foi armazenado a
37°C por 1 hora, para rompimento da parede celular. Seguiu-se com a adição de
500,0 µL de GES (Tiocianato de guanidina, EDTA e Sarkosyl 30%). Quando as
células estavam completamente lisadas, adicionou-se 250,0 µL de acetato de
amônio e colocação no gelo por 10 minutos. Após este procedimento,
acrescentou-se 500,0 µL de clorofórmio/2-pentanol e agitou-se vigorosamente por
10 minutos, para misturar as duas fases. O conteúdo foi centrifugado por 10
minutos a 13200 rpm para formar um tampão na interface das soluções. A solução
da parte superior do tubo (acima do tampão) foi removida cuidadosamente e
colocada em outro tubo eppendorf com 875,0 µL de etanol 100% gelado, onde
permaneceu a -20°C overnight. Após este período as fibras de DNA formadas
foram removidas e colocadas em etanol 70% gelado, e foram armazenadas a
-20°C.
NASCIMENTO, C. Mestrado
63
Purificação e quantificação do DNA
Os tubos contendo as fibras foram levados à centrífuga a 13200 rpm
por 1 minuto. Removeu-se a solução sobrenadante e foi acrescentado 1,0 mL de
etanol 70%. As fibras foram lavadas com etanol 70% até a remoção dos excessos
de sais e carboidratos. Após a lavagem, removeu-se todo o álcool e o excesso
com o auxílio de papel absorvente. Foram acrescentados 100,0 µL de TE (pH=8,0)
e o tubo foi armazenado a 4°C até entrar em solução. Após entrar em solução,
completou-se o procedimento de lavagem acrescentado 100,0 µL de
clorofórmio/álcool isoanídrico.
Seguiu-se o tratamento de purificação do DNA com a adição da
RNase. Em um tubo eppendorf de 1,5 mL, foram colocados 5,0 µL do
microrganismo com 95,0 µL de RNase 20 µg/mL, onde permaneceram por 30
minutos. Após o processo de extração e limpeza, o DNA foi ressuspendido em TE
para análise em gel de agarose (Figura 10), além de quantificação e verificação do
grau de pureza no equipamento GeneQuant pro (Amersham Pharmacia Biotech,
UK).
Marcação da sonda
O protocolo utilizado para a marcação do DNA do S. sobrinus foi
aquele estabelecido pela empresa fabricante do marcador genômico (Gene
Images Random Prime Labeling Kit, Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK).
O protocolo baseia-se na marcação de 50 ng do DNA genômico do microrganismo
a ser estudado, atingindo uma concentração final de 7 ng/µL na solução de
NASCIMENTO, C. Mestrado
64
hibridação. O DNA é diluído em água deionizada dentro de tubos eppendorf de 0,5
mL e desnaturado em água fervente por 5 minutos. Imediatamente, são resfriados
em gelo para manter as cadeias de nucleotídeos abertas. São acrescentados os
componentes do Kit de marcação, primeiro o Nucleotídeo Mix – que compreende o
nucleotídeo marcado com a fluoresceína, seguido do Primer e Enzima, que iniciam
a reação de polimerização das cadeias de DNA. Os tubos foram incubados a
25°C overnight.
Verificação da marcação da sonda
Foram realizadas diluições do Nucleotídeo Mix, em solução tampão
TE, nas proporções de 1/5, 1/10, 1/25, 1/50, 1/100, 1/250 e 1/500 a fim de
monitorar a incorporação da fluoresceína à sonda. Em uma fita da membrana
Hybond N+ (Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK) foram colocados 5,0 µL
da sonda marcada do S. sobrinus e 5,0 µL da diluição 1/5. A fita foi imersa em
150,0 mL de solução SSC 2X e lavada por 30 minutos a 60 °C. A lavagem é
realizada para remover os excessos de nucleotídeos que não se incorporaram à
sonda. Em uma outra fita Hybond N+, foi realizado um controle para comparação
da marcação, onde foram colocados 5,0 µL de cada diluição restante. As fitas
foram visualizadas em aparelho Transluminador (MacroVue UV-20, Heofer
Scientific, USA), através da comparação visual da intensidade da fluorescência
(Figura 11). Para que a marcação tenha sido realizada com sucesso, a
intensidade da fluorescência da marcação da sonda deve estar no intervalo das
diluições de 1/10 a 1/250 da fita de referência.
NASCIMENTO, C. Mestrado
65
Teste de sensibilidade e especificidade da sonda S. sobrinus
A sensibilidade do teste foi ajustada para permitir a observação de
reações de hibridação positivas para a presença de 10
4
,10
5
e 10
6
células
bacterianas, de acordo com a quantidade de sonda usada. Amostras de DNA
genômico do microrganismo estudado, nas concentrações de 10
4
,10
5
e 10
6
células
foram hibridadas contra as sondas marcadas (Figura 12).
Seleção das amostras
Após o teste de contaminação do meio de cultura, os conjuntos
remanescentes de cada grupo e um terceiro grupo, composto pelo mesmo número
e tipo de implantes dos outros dois grupos, foi constituído para servir como
controle para o teste de sensibilidade do método DNA – Checkerboard:
• Grupo 1 - 9 conjuntos implantes/conectores calcináveis;*
• Grupo2 - 9 conjuntos implantes/conectores com plataforma pré-
fabricada em Co-Cr;*
• Grupo 3 - 9 implantes (Controle).
* um conjunto de cada grupo (1 e 2), dos 10 iniciais, foi excluído por evidências de contaminação
externa.
Inoculação e coleta do grupo controle
No Grupo 3, o microrganismo foi inoculado no interior dos implantes,
como descrito anteriormente, e imediatamente coletado com escovas do tipo
microbrush (KGBrush, KG Sorensen, Brasil), servindo como controle para
comparação com os níveis de contaminação interna, encontrados nos demais
NASCIMENTO, C. Mestrado
66
grupos. As amostras foram armazenadas a -20°C até a aplicação do método DNA
– Checkerboard.
Coleta do material para análise pelo método DNA - Checkerboard
Ao final do período de 21 dias da observação de turvação do meio, os
implantes foram removidos dos tubos com o auxílio de uma pinça estéril, lavados
cuidadosamente com solução tampão salina fosfatada 0,1 M estéril (pH=7,0), e
secados com gaze estéril.
Os implantes foram novamente mantidos na posição vertical com o
auxílio da pinça porta agulha, o selamento superior foi removido com o auxílio de
uma sonda exploradora e reabertos através da chave manual, no interior do fluxo
laminar. O conteúdo do interior dos implantes e o material presente na superfície
de seus respectivos parafusos foram coletados com o auxílio de escovas do tipo
microbrush (Figuras 7A, 7B, 7C e 7D). Após a coleta, as pontas das escovas
foram colocadas individualmente em tubos eppendorf contendo 150,0 µL de TE
(10 Mm Tris-HCl, 1 Mm EDTA pH 7,6). Em seguida, cada um dos tubos recebeu
150,0 µL de NaOH 0,5 M e foi armazenado a -20
o
C para processamento pelo
método DNA - Checkerboard. Nos tubos onde houve a contaminação do meio de
cultura, os implantes foram abertos e a coleta foi realizada no mesmo dia da
turvação.
Processamento e aplicação das amostras
Os tubos contendo as amostras foram descongelados à temperatura
ambiente. Com o auxílio de um agitador de tubos (AP 56, Phoenix, Brasil), os
NASCIMENTO, C. Mestrado
67
tubos foram agitados por 4 minutos para a desagregação total do conteúdo
coletado pela escova microbrush (Figura 8A). Ao final do período de agitação, a
ponta da escova foi removida com o auxílio de uma pinça clínica estéril (Figura
8B). Os tubos foram então fervidos em banho-maria por 5 minutos para a
separação das fitas de DNA, e logo resfriados em gelo. Após a fervura, as
suspensões foram neutralizadas com a adição de 800,0 µL de acetato de amônio
5 M, o que permitiu a lise e a suspensão do DNA na solução.
Uma placa metálica denominada Minislot 30 (Immunetics, Cambridge,
MA – Figura 8C) contém 30 canaletas dispostas paralelamente, e é utilizada para
a aplicação das amostras sobre a membrana de nylon Hybond N+ disposta sob o
aparelho. A membrana tem carga positiva e deve medir 15 X 15 cm, cobrindo
desta forma todo o comprimento das canaletas. O aparelho permite a deposição
de 28 diferentes amostras em canaletas individuais, bem como duas canaletas
contendo os controles 10
5
e 10
6
de cada espécie estudada. Cada solução
contendo o DNA livre foi depositada no interior das canaletas (Figura 8E), e após 5
minutos da aplicação, o DNA foi depositado na membrana de nylon com o auxílio
do vácuo. A membrana foi removida do aparelho e o DNA fixado na membrana
através da exposição ao calor (80° C) no forno de hibridação Hybridization
Oven/Shaker (Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK) por 2 horas.
Pré-Hibridação
Após a fixação do DNA, a membrana foi umedecida em solução 5x
SSC por 5 minutos, e logo em seguida pré-hibridada dentro da garrafa no forno de
hibridação a 60 °C, overnight, em uma solução contendo 1x SSC, SDS 0,1%
NASCIMENTO, C. Mestrado
68
(Sigma-Aldrish, USA) e Sulfato de Dextran 5% (Sigma-Aldrish, USA) e Líquido de
bloqueio diluído 20 vezes (Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK) – Figura
8F.
Aplicação das sondas e reação de hibridação
Após a pré-hibridação, a membrana foi colocada no Miniblotter 45
(Immunetics, USA) com as linhas contendo o DNA fixado perpendiculares às
canaletas do aparelho.
As sondas para hibridação foram preparadas a partir das sondas
marcadas com concentração de 7 ng/mL. Foram colocadas as quantidades de
sonda pré-estabelecidas no teste de calibração (28 ng), em um eppendorf de 1,5
mL e o volume completado com solução tampão T.E. (pH=8,0) até 20,0 µL. Os
tubos foram fervidos por 5 minutos e logo resfriados no gelo. O volume final das
sondas foi completado até 140,0 µL com a adição da solução de hibridação. Os
tubos foram mantidos no gelo até a aplicação na membrana.
As canaletas do Miniblotter 45 foram preenchidas com 140,0 µL de
sonda do microrganismo (Figura 8G). As canaletas que não continham sondas
foram preenchidas com 140,0 µL solução de hibridação. Após a aplicação das
sondas, o aparelho foi embrulhado várias vezes em filme de PVC, e embalado em
saco plástico, evitando a desidratação (Figura 8H). A hibridação da membrana foi
realizada a 60° C, overnight, no forno de hibridação (Figura 8I).
NASCIMENTO, C. Mestrado
69
Lavagem para remoção das sondas
Após a hibridação com as sondas, o excesso de solução de hibridação
foi removido com o auxílio do dispositivo Manifold (Immunetics, USA) e do vácuo.
O aparelho foi aberto e a membrana removida para a lavagem, a fim de remover
as sondas que não hibridaram completamente. Foram realizadas duas lavagens a
65° C, de 15 minutos cada, com 1x SSC/ SDS 0,1% e 0,1x SSC/SDS 0,1%,
respectivamente.
Bloqueio e Aplicação do Anticorpo
Após as lavagens, a membrana foi bloqueada por 1 hora, em
temperatura ambiente e sob agitação suave, em uma solução composta por
Líquido de bloqueio 10% diluído em Buffer A (100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl
pH9,5).
Seguido ao bloqueio, a membrana permaneceu 1 hora, também em
temperatura ambiente e sob agitação suave, em uma solução contendo o
anticorpo anti-fluoresceína conjugado a fosfatase alcalina (Amersham
Biosciences, GE Healthcare, UK).
As membranas foram, então, lavadas por três vezes consecutivas com
a solução de lavagem (Tween 20 0,3% diluído em Buffer A), para a remoção do
excesso de anticorpo. Cada lavagem durou 10 minutos, e foi realizada à
temperatura ambiente sob máxima agitação.
NASCIMENTO, C. Mestrado
70
Detecção
Sobre a membrana lavada, foram aplicados 6,7 mL do reagente de
detecção CDP-Star
®
(Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK), deixando-o
agir em toda a superfície da membrana por 5 minutos. Após este período, o
excesso do reagente foi removido. A membrana foi embrulhada em papel alumínio
e levada ao forno de hibridação a 37° C por 1 hora, para estabilização do sinal.
Exposição e Revelação
Para este procedimento, utilizou-se um cassete de exposição
Hypercassete (Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK). Dentro de uma
câmara escura, a membrana foi colocada no interior do cassete (Figura 8J), e
sobre ela foi posicionado um filme radiográfico Hyperfilm (Amersham Biosciences,
GE Healthcare, UK). A exposição durou 10 minutos, seguindo-se o procedimento
de revelação para a detecção dos sinais de quimiluminescência (Figura 8K).
Ao final, se obtém um filme radiográfico com os sinais detectados
pelas sondas de DNA, onde as linhas horizontais representam as sondas e as
verticais as amostras dos implantes, configurando desta forma um “tabuleiro de
xadrez” - DNA-Checkerboard (Figura 9).
NASCIMENTO, C. Mestrado
71
Figura 7 – Reabertura dos conjuntos e coleta do material para processamento pelo DNA-
Checkerboard.
A
B
C
D
A
B
C
D
E
F
G
H
K
I
J
Figura 8 – Processamento pela técnica de hibridação DNA-Checkerboard. A: homogeneização dos
tubos; B: remoção da escova microbrush; C: colocação da membrana no aparelho Minislot 30,
cobrindo todo o comprimento das canaletas; D: colocação do papel filtro e fechamento do
aparelho; E: aplicação das amostras em canaletas individuais sobre a membrana de Nylon; F: pré-
hibridação da membrana no forno de hibridação
; G: aplicação das sondas do S. sobrinus nas
canaletas do Miniblotter 45; H: aparelho embalado em filme de PVC para evitar desidratação; I:
hibridação da membrana forno de hibridação
; J: posicionamento da membrana embalada no
interior do cassete; K: exposição da membrana por 10 minutos.
NASCIMENTO, C. Mestrado
72
Amostras DNA
Sondas DNA
Figura 9 – Esquema exemplificando a reação de hibridação pelo método DNA-Checkerboard,
onde as linhas horizontais representam as sondas e as verticais as amostras dos implantes,
configurando desta forma um “tabuleiro de xadrez”. Os sinais nos cruzamentos das linhas
representam os híbridos obtidos.
Análise dos resultados pelo método Checkerboard
A leitura dos resultados é semiquantitativa, feita através da
comparação dos sinais das amostras com as amostras controle, feitas a partir do
DNA da bactéria que está sendo pesquisada, e colocada nas duas últimas
canaletas do Minislot 30, que equivalem a 10
5
e 10
6
células. Tipicamente, eles
devem ser registrados como 0: não detectado; 1: < 10
5
células; 2: ~10
5
; 3: 10
5
~
10
6
; 4: ~10
6
; e 5: > 10
6
células (Socransky et al. 2004). Desta forma, se obtém um
número aproximado de células bacterianas em cada amostra. A leitura baseia-se
em análise visual e confirmação dos resultados por meio do programa Image
Quant TL (Amersham Biosciences, GE Healthcare, UK).
Análise estatística
Por se tratar de uma quantificação baseada em índices de score, onde
há uma distribuição não linear dos dados, utilizou-se o teste não-paramétrico
Kruskal-Wallis, com nível de confiança de 95% (α=0,05).
NASCIMENTO, C. Mestrado
73
5. RESULTADOS
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
74
5.1 Avaliação da passagem do S. sobrinus através da interface
implante/conector protético
Dos 20 conjuntos utilizados na avaliação da passagem do S. sobrinus
através da interface implantes/conectores, 2 foram excluídos do estudo por
apresentarem evidências de contaminação externa, sendo um do grupo 1
(calcináveis) e outro do grupo 2 (pré-fabricados). A tabela 1 mostra os resultados
de cada grupo para esse teste.
Tabela 1. Resultado do teste de contaminação
externa
Amostras
Grupo 1 Grupo 2
01 - -
02 - -
03 - -
04 - -
05 - +
06 - -
07 - -
08 - -
09 + -
10 - -
+ presença de contaminação
- ausência de contaminação
A freqüência de contaminação dos conjuntos em cada grupo avaliado
foi de 0,1. Ao final do período de 21 dias, observou-se a turvação do meio de
cultura apenas para 2 conjuntos implante/conectores, um do grupo 1 e outro do
grupo 2. O conjunto implante/conector do grupo 1 turvou o meio de cultura no 2°
dia após a inoculação, enquanto o conjunto do grupo 2 turvou no 3° dia. Isto
sugere a passagem de microrganismos para o meio, iniciando um processo de
NASCIMENTO, C. Mestrado
75
crescimento e multiplicação que produz a mudança na opacidade do TSBy. A
tabela 2 representa os resultados das amostras avaliadas em relação à passagem
do microrganismo S. sobrinus pela interface implante/conector protético.
Tabela 2. Número de conjuntos avaliados, conjuntos que apresentaram
contaminação externa e foram excluídos do teste, e conjuntos onde houve a
passagem do microrganismo pela interface implante/conector protético.
Contaminação Remanescentes Passagem bacteriana /
Grupo n° externa para o experimento tempo de incubação (h)
Pré-fabricados 10 1 9 1 / 48 h
Calcináveis 10 1 9 1 / 72 h
Total 20 2 18 2
5.2 Purificação e quantificação do DNA extraído do microrganismo S.
sobrinus
S. sobrinus
λ 1 2 3
23,0 Kb
9,4 Kb
6,5 Kb
2,2 Kb
2
,
0 Kb
0,5 Kb
Figura 10 - Análise da amostra do DNA genômico do S. sobrinus em gel de agarose 0,8% corado
com brometo de etídeo. Cada raia contém 1,0 mL de DNA genômico. No alto da figura estão
indicados os números correspondentes às diferentes preparações analisadas.
λ: marcador de peso
molecular (DNA genômico de fago lambda digerido com Hind III, o maior fragmento corresponde a
23 Kb).
NASCIMENTO, C. Mestrado
76
A absorbância do DNA do S. sobrinus após os processos de extração
e purificação, obtida pela razão entre os comprimentos de onda de 260 nm e
280 nm, foi de 1,94. O resultado obtido é considerado satisfatório para a
confecção da sonda. A quantidade total de DNA obtida foi de 489 µg, num volume
final de 150 µL de solução TE.
5.3 Verificação da marcação da sonda
O resultado obtido na etapa de marcação da sonda, preparada com o
DNA do S. sobrinus, está ilustrado na Figura 11. Na parte superior da figura
podem ser vistas as marcas fluorescentes produzidas na fita controle de
membrana Hybond N+, após gotejamento de 6 diferentes diluições de Nucleotide
Mix. A parte inferior da figura representa a marcação obtida pela sonda, de
intensidade semelhante à diluição 1/10 da fita controle, adequada para os testes
de hibridação.
1/10 1/25 1/50 1/100 1/500 1/250
Sonda S. sobrinus
Figura 11 – Verificação da marcação da sonda de
DNA do
S. sobrinus com fluoresceína,
demonstrando intensidade de sinal semelhante à
diluição 1/10 do
Nucleotide Mix.
NASCIMENTO, C. Mestrado
77
5.4 Resultado do teste de sensibilidade e especificidade da sonda S.
sobrinus marcada
A Figura 12 mostra o resultado do teste de hibridação de quantidades
padronizadas de sonda marcada com fluoresceína contra quantidades definidas
de DNA (de 10
4
, 10
5
ou 10
6
células) do microrganismo S. sobrinus. Os melhores
sinais foram obtidos com o uso de 28 ng de sonda.
S. sobrinus 10
5
S. sobrinus 10
6
S. sobrinus
(
28 n
g)
S. sobrinus 10
4
Figura 12 – Teste de hibridação demonstrando a
sensibilidade da sonda do
S. sobrinus. As linhas
indicam as células alvo do microrganismo nas
quantidades de 10
4
, 10
5
e 10
6
células. A coluna
superior representa a sonda preparada. 10
4
células da
espécie avaliada não puderam ser detectadas.
5.5 Resultados da análise de sensibilidade pelo método de hibridação DNA-
Checkerboard
Nos grupos 1 e 3 deste experimento, todas as amostras apresentaram
reação de hibridação positiva para o microrganismo S. sobrinus. No grupo 2
(conectores pré-fabricados), 7 das 9 amostras avaliadas apresentaram resposta
positiva. As Figuras 13A, 13B e 13C representam as reações de hibridação dos 3
NASCIMENTO, C. Mestrado
78
grupos. A prevalência do microrganismo no interior dos implantes e parafusos do
grupo com conectores pré-fabricados foi menor que para os outros grupos (p<0,05
- Figura 14).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5
10
6
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5
10
6
C
Figura 13 – Reações de hibridação; A: Grupo 1, B: Grupo 2, e
C: Grupo 3 (controle). Os números representam as amostras;
os controles estão representados pelas concentrações 10
5
e
10
6
.
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Prevalência
Controle
Pré-fabricado
Calcinável
Grupos avaliados
S. sobrinus
S. sobrinus
Figura 14 – Prevalência do microrganismo S. sobrinus detectados pelo teste de
hibridação
DNA - Checkerboard.
NASCIMENTO, C. Mestrado
79
Os escores obtidos a partir da aplicação do método DNA -
Checkerboard nas amostras dos três grupos estão listados na Tabela 3 e
ilustrados na Figura 15.
Tabela 3. Descrição da amostra para a análise dos níveis do microrganismo S.
sobrinus
detectadas nas roscas dos parafusos e regiões internas de implantes das
amostras avaliadas, onde 0: não detectado; 1: < 10
5
células; 2: ~10
5
; 3: 10
5
~ 10
6
;
4: ~10
6
; e 5: > 10
6
células
Score n° absoluto
Grupo n° Mediana Máx/Mín Mediana Máx/Mín
Calcinável 9 1 3 e 1 0,5* 5,5* e 0,5*
Pré-usinado 9 1 3 e 0 0,5* 5,5* e 0
Controle 9 3 3 e 3 5,5* 5,5* e 5,5*
* Níveis médios (x10
5).
0,0
1,0
2,0
3,0
Calcinável
Pré-fabricado Controle
Número de células bacterianas
Perfil Microbiológico dos Conjuntos
Implantes/Conectores
Figura 15 – Gráfico de caixa (box-plot) dos níveis estimados de células da bactéria S.
sobrinus
detectadas pelo método DNA – Checkerboard nas amostras coletadas dos três
grupos experimentais.
NASCIMENTO, C. Mestrado
80
Não houve diferença significante entre os grupos 1 e 2 em relação à
contagem do microrganismo proveniente do interior dos conjuntos. Por outro lado,
o grupo 3 (controle) apresentou maiores contagens de S. sobrinus em relação aos
grupos 1 e 2 (p < 0,05).
NASCIMENTO, C. Mestrado
81
6. DISCUSSÃO
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
82
Neste estudo, a passagem do S. sobrinus através da interface entre
implantes e conectores fundidos ou pré-fabricados e a sensibilidade do método
DNA - Checkerboard na identificação e quantificação das bactérias presentes no
interior dos implantes foram avaliadas in vitro.
Os resultados obtidos indicam a ocorrência de infiltração bacteriana
através da interface implante/conector protético em baixas proporções, tanto para
os conectores totalmente calcináveis como para os pré-fabricados. Diversos
estudos também demonstraram a ocorrência deste tipo de infiltração microbiana
(Traversy & Birek, 1992; Quirynen & Van Steenberghe, 1993; Jansen et al., 1997;
Gross et al., 1999; Piatelli et al., 2001; Rimondini et al., 2001; Steinebrunner et al.,
2005), porém, a maior parte deles relata uma freqüência mais elevada. Uma
possível explicação para o baixo percentual de contaminação encontrado, pode
estar relacionada ao vedamento realizado na parte superior dos conjuntos com
uma camada de guta-percha e adesivo à base de cianoacrilato, impedindo que
células microbianas passassem por outros espaços além dos existentes entre a
interface implante/conector. Quirynen et al. (1994) observaram que a passagem
de microrganismos por outras vias, como as fendas existentes entre conectores e
próteses, também ocorre. Em outro estudo in vitro, em que se demonstrou um
maior percentual de contaminação, foram utilizadas várias associações de
implantes e os conjuntos foram reabertos várias vezes durante o período
experimental (Jansen et al., 1997). De modo semelhante, a infiltração foi mais
intensa no trabalho de Piatelli et al. (2001) que, no entanto, submeteram os
conjuntos à agitação constante de 60 ciclos/minuto. Outra causa possível dos
NASCIMENTO, C. Mestrado
83
reduzidos níveis de infiltração encontrados neste estudo pode estar associada à
força de torque utilizada para unir os componentes. A força utilizada foi a
recomendada pelo fabricante, de 32 Ncm, obtida com o uso de um torquímetro
calibrado. Gross et al., em 1999, estudaram o grau de micro-infiltração na interface
implante/conector protético variando os níveis de torque em 5 sistemas de
implantes. A micro-infiltração na interface ocorreu em todos os sistemas, variando
de acordo com a marca e o torque aplicado. Conforme o torque aumentou de 10
Ncm para 20 Ncm, e até o recomendado pelo fabricante, a micro-infiltração
diminuiu significantemente para todos os sistemas. Os autores concluíram que,
presumivelmente, fluidos contendo produtos bacterianos e nutrientes necessários
para o crescimento bacteriano poderiam passar através da interface quando são
aplicados torques menores que os recomendados pelo fabricante, contribuindo em
parte pelo mau odor e comprometimento dos tecidos peri-implantares. Outro fator
que pode ter influenciado na redução do índice de infiltração bacteriana entre os
grupos pode ter sido a condição estática e ausência de forças incidindo sobre os
conjuntos, o que sabidamente interfere na estabilidade dos componentes (Binon &
McHugh, 1996; Carr et al., 1996; Tavarez, 2003). Steinebrunner et al. (2005),
avaliando o mesmo tipo de infiltração, aplicaram uma carga de 120 Ncm sobre os
conjuntos numa freqüência de 1.200.000 ciclos e verificaram que a passagem de
microrganismos pela interface foi maior. Por fim, os reduzidos índices de infiltração
encontrados podem estar associados à uma adaptação mais precisa entre os
componentes do sistema avaliado e conseqüente minimização das fendas e dos
níveis de infiltração.
NASCIMENTO, C. Mestrado
84
Em relação à quantificação dos microrganismos retirados dos
conjuntos, os resultados obtidos neste estudo demonstraram uma diferença na
prevalência do microrganismo S. sobrinus entre os grupos estudados. No grupo 1
(conectores calcináveis) e grupo 3 (controle), a prevalência do microrganismo nas
amostras avaliadas foi de 100%, enquanto que no grupo 2 (conectores pré-
fabricados), a prevalência foi de aproximadamente 77,8%. A não detecção de
microrganismos em algumas amostras pela técnica do DNA-Checkerboard pode
ser explicado pelo fato de que esta técnica de hibridação permite a detecção das
espécies bacterianas somente quando ocorre a presença mínima de 10
4
células.
Desta forma, a ausência de sinal em duas amostras do grupo 2 não significa,
necessariamente, que não há a presença do microrganismo. Outro fator que pode
ter interferido na detecção do microrganismo nas amostras é a ocorrência de
degradação celular. Se por algum motivo houve uma degradação celular dos
microrganismos, haverá uma diminuição na sua identificação. Este é um fator que
deve ser melhor estudado em estudos futuros, pois a degradação celular de
alguns microrganismos pode interferir no crescimento e multiplicação dos demais.
Apesar da diferença na prevalência, os grupos 1 e 2 não
apresentaram diferença significante entre si em relação à contagem do
microrganismo entre as amostras (p > 0,05). A diferença entre as medianas do
número de microrganismos encontrados nos conjuntos com conectores
calcináveis e pré-fabricados quando comparados ao grupo controle foi altamente
significante (p= 0,0014). Julgamos mais correto analisar estatisticamente os dados
obtidos em nosso estudo através das medidas descritivas medianas, máximo e
NASCIMENTO, C. Mestrado
85
mínimo, por se tratarem de valores determinados a partir de índices de escores, e
não apresentarem uma distribuição normal.
Essa ausência de diferença na quantificação entre os grupos com
componentes calcináveis e pré-fabricados está relacionada aos resultados obtidos
na avaliação da passagem do microrganismo através da interface
implante/conector, na qual também não houve diferença significante entre os
grupos avaliados. Estes resultados podem estar relacionados aos achados por
alguns autores, que observaram não haver diferenças significantes nas alterações
da interface implante/conector antes e após a fundição de padrões UCLA em ligas
metálicas. Os autores sugeriram que a seleção adequada de componentes com
baixa tolerância de usinagem, a seleção adequada da liga metálica e a utilização
de procedimentos clínicos e laboratoriais meticulosos podem reduzir a adaptação
rotacional e aumentar a estabilidade do parafuso (Vigolo et al., 2000). Kano et al.,
em 2006, analisaram a desadaptação do cilindro de ouro do sistema
Nobelpharma, comparando-o a componentes similares fundidos a partir de
matrizes calcináveis (3i) usando diferentes tipos de ligas metálicas (Porson-4,
Palliag-M e Durabond). Os autores concluíram que os cilindros de ouro pré-
fabricados apresentaram os melhores resultados, e não apresentaram diferença
estatística em relação a matriz plástica antes da fundição e os cilindros fundidos a
partir da liga Person-4.
O sucesso primário dos implantes deve-se a uma adequada
osseointegração ao sistema de suporte (Branemark et al., 1969). No entanto, caso
não exista uma perfeita adaptação entre o implante e seus componentes
protéticos, a área torna-se favorável à colonização bacteriana, favorecendo o
NASCIMENTO, C. Mestrado
86
desenvolvimento de patologia na mucosa peri-implantar e comprometendo o
desenvolvimento e a manutenção da osseointegração (Albrektson & Isidor, 1994;
Jansen et al., 1997; Mombelli et al., 2002). A execução deste estudo é justificada
por diversos achados na literatura, onde a presença de bactérias no interior de
implantes de titânio e a passagem bidirecional de fluidos são relatados por
diversos autores (Traversy & Birek, 1992; Quirynen & Van Steenberghe, 1993).
Vários estudos sobre a microbiota presente ao redor de implantes
odontológicos têm sido publicados, alguns dos quais referentes à presença de
possíveis patógenos periodontais colonizando o sulco peri-implantar de implantes
que falharam (Quirynen et al., 1993; Mombelli et al., 1997; 1998; Ellen, 1998).
Porém, poucos trabalhos de investigação in vitro, utilizando implantes de sistemas
nacionais, são descritos na literatura relatando a infiltração estritamente pela
interface implante/conector protético.
A adaptação e precisão da interface implante/conector protético dos
sistemas de implantes também têm sido relatadas como um aspecto importante na
preservação e manutenção da saúde dos tecidos peri-implantares adjacentes
(Dellow et al., 1992; Binon et al., 1996; Guindy et al., 1998; Gross et al., 1999;
Piatelli et al., 2001). A ausência de uma perfeita adaptação entre os componentes
pode resultar na formação de um espaço ou fenda, o que possivelmente
provocará uma invasão e colonização bacteriana, acúmulo de biofilme e uma
resposta tecidual adversa (Jansen et al., 1997; Gross et al., 1999).
Os implantes utilizados neste estudo apresentavam conexão
hexagonal externa. De acordo com os resultados encontrados por Cravinhos
(2003) e Jansen et al. (1997), a infiltração bacteriana em implantes de conexão
NASCIMENTO, C. Mestrado
87
interna e externa é semelhante, uma vez que não foram encontradas diferenças
significantes entre os grupos avaliados. Desta forma, o tipo de conexão utilizado
não parece ter influenciado nos resultados obtidos. A conexão hexagonal externa
foi inicialmente desenvolvida para permitir a instalação do implante no leito
cirúrgico e tornou-se fundamental para a restauração unitária, pois permite
desenvolver um mecanismo de estabilização anti-rotacional entre o implante e os
componentes protéticos, tornando a interface implante/conector protético mais
resistente (Cibirka, 2001). Seguindo a mesma linha de pensamento, as conexões
hexagonais internas foram desenvolvidas com o objetivo de melhorar a adaptação
entre os hexágonos e estabelecer uma interface mais estável, aumentando a
precisão de adaptação e reduzindo os riscos de complicações, como
afrouxamento do parafuso de fixação (Niznick, 1991).
Assim como nos dentes, na superfície dos implantes também existe a
formação de biofilme bacteriano. A primeira colonização bacteriana nas bolsas
peri-implantares caracteriza-se por um aumento no número de estreptococos
anaeróbios facultativos (MOMBELLI et al., 1988). Com o decorrer do tempo, há
uma diminuição dos estreptococos facultativos e um aumento na proporção de
gram-negativos anaeróbios estritos, como Fusobacterium spp. e Prevotella spp.
(MOMBELLI & MERICSKE-STERN, 1990). O microrganismo Streptococcus
sobrinus (ATCC 33478) é um anaeróbio facultativo e apresenta tamanho variando
entre 0,5 e 1,2 µm em média, e foi selecionado para o estudo por ser considerado
um dos primeiros colonizadores do biofilme bacteriano dentário e por seu potencial
papel no surgimento e desenvolvimento das doenças periodontais e peri-
implantares (Cao et al., 1990; Zee et al., 1996).
NASCIMENTO, C. Mestrado
88
O período de tempo empregado para a observação da ocorrência de
infiltração bacteriana, 21 dias, vem de encontro aos achados na literatura.
Nakazato et al. (1989) verificaram que após 4 horas de exposição aos fluidos
bucais há a formação de colonização bacteriana na superfície dos conectores
protéticos associados aos implantes. Koka et al. (1993), avaliaram a colonização
bacteriana em implantes do sistema Branemark em pacientes parcialmente
desdentados. Amostras de biofilme bacteriano foram removidas após 14 e 28 dias
da reabertura dos implantes e colocação dos componentes protéticos, e foram
comparadas às placas bacterianas de dentes. Concluíram que a colonização
marginal dos implantes ocorre em 14 dias, enquanto que a colonização
subgengival ocorre dentro de 28 dias. Quirynen et al. (2006) estudaram a
colonização subgengival inicial em bolsas peri-implantares médias e profundas,
após 1, 2, 4, 13, 26 e 78 semanas da colocação do conector protético. Concluíram
que a colonização das bolsas peri-implantares com bactérias associadas à
periodontite ocorre dentro de 2 semanas.
Guindy et al. (1998) estudaram, in vitro, a infiltração bacteriana do
interior do sistema de implante Ha-Ti
®
para o meio externo, bem como no sentido
contrário, em próteses pré-fabricadas parafusadas. O microrganismo utilizado para
este estudo foi o Staphylococcus aureus. A análise foi feita nas fendas marginais e
nos espaços entre os parafusos. Em estudo prévio, in vivo, os autores
demonstraram que a colonização bacteriana no interior dos implantes também
ocorre, apesar das más adaptações encontradas terem sido mínimas. Mostraram
haver infiltração microbiana pelas fendas em ambos os sentidos, no intervalo de
24 a 120 horas. Observaram que as principais vias de infiltração foram os espaços
NASCIMENTO, C. Mestrado
89
existentes entre os parafusos transversais e não através das fendas marginais das
coroas pré-fabricadas. Esses estudos mostram que, apesar do alto grau de
precisão nas adaptações da grande maioria dos sistemas de implantes, não há
como evitar a micro-infiltração dos microrganismos pelas fendas existentes entre
os componentes. Estes resultados são compatíveis com àqueles obtidos in vivo
por Quirynen & van Steenberghe (1993), e in vitro por Traversy & Birek (1992).
Vários autores sugerem que os componentes protéticos dos
implantes favorecem a instalação do biofilme bacteriano e é necessário determinar
a composição desse biofilme em várias etapas clínicas para compreender seu
papel na manutenção da saúde periodontal ou desenvolvimento da doença (Rams
et al., 1984; Mombelli et al., 1997; Alcoforado et al., 1991; Rosenberg et al., 1991;
Quirynen et al., 2005).
Os métodos de análise de cultura microbiana convencional vêm sendo
utilizados há décadas para o estudo da microbiota oral humana, sendo capaz de
identificar apenas microrganismos viáveis. Entretanto, sabemos que muitas
espécies que colonizam a cavidade oral ainda não foram totalmente
caracterizadas ou cultivadas. Conseqüentemente, estudos avaliando os possíveis
agentes causadores das doenças da cavidade oral, como a doença periodontal,
restringem-se apenas às espécies cultiváveis (Sakamoto et al., 2005).
A metodologia escolhida por nós para determinar a presença e a
concentração do microrganismo S. sobrinus no interior de cada conjunto
implante/conector foi a técnica de hibridação do DNA-Checkerboard. As técnicas
de biologia molecular para detecção e identificação de microrganismos têm
colaborado para a melhor compreensão da microbiota envolvida nas doenças
NASCIMENTO, C. Mestrado
90
periodontais e peri-implantares (Socransky et al., 1998; Ximenez-Fyvie et al.,
2000; Sakamoto et al., 2005; Quirynen et al., 2005; Dahlén & Leonhardt, 2006).
Essas técnicas são mais rápidas que as convencionais e são realizadas por meio
do uso de sondas de DNA (Colombo et al., 1998; Haffajee et al., 1998; Ximenez-
Fyvie et al., 2000). Neste estudo utilizou-se esta técnica por ser de execução
relativamente fácil e possibilitar a análise de várias amostras clínicas em uma
mesma membrana. Além de que, de acordo com Loesche et al. (1992), a técnica
de cultura não é indicada para ser usada isoladamente em estudos de
prevalência. De acordo com os autores, as técnicas de hibridação, como o DNA-
Checkerboard, são significantemente superiores ao método convencional de
cultura na detecção de espécies bacterianas. Este tipo de técnica, por identificar
os microrganismos pelo DNA, detecta tanto viáveis como não viáveis.
A determinação da concentração do microrgaismo S. sobrinus nas
amostras deste estudo, utilizando a técnica do DNA-Checkerboard, foi empregada
com uma modificação em relação à técnica inicialmente proposta por Socransky et
al. (1994). Devido à dificuldade de importação do marcador genômico
quimiluminescente Digoxigenina, utilizou-se como agente de marcação da sonda
genômica do S. sobrinus, a Fluoresceína. Os resultados de padronização da
técnica com o uso da Fluoresceína mostraram-se semelhantes e tão eficazes
quanto os obtidos com o outro tipo de marcador.
Apesar dos conectores pré-fabricados sabidamente apresentarem
uma maior precisão de adaptação marginal ao implante e, consequentemente,
uma menor probabilidade de infiltração bacteriana, tanto nos estudos encontrados
NASCIMENTO, C. Mestrado
91
na literatura quanto em nosso trabalho, apresentaram passagem de
microrganismo através de suas interfaces implante/conector.
Os resultados deste estudo confirmam aqueles encontrados pelos
autores citados, onde a ausência de uma perfeita adaptação marginal entre os
componentes dos implantes pode resultar na formação de fendas ou espaços,
permitindo a passagem e conseqüente colonização bacteriana, e sugerem a
necessidade de novos estudos buscando uma adaptação mais precisa e novas
formas de se evitar esta microinfiltração.
NASCIMENTO, C. Mestrado
92
7. CONCLUSÕES
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
93
Com base nos resultados obtidos pôde-se concluir que:
1) A passagem do microrganismo Streptococcus sobrinus, in vitro, através da
interface implante/conector protético ocorreu nos dois tipos de conectores
avaliados, totalmente calcináveis (grupo1) e com a plataforma protética pré-
fabricada em Co-Cr (grupo2), apesar dos baixos índices de contaminação.
2) Nas condições experimentais do presente estudo, não houve diferença
significante em relação ao número de microrganismos encontrados no
interior das amostras dos grupos 1 e 2.
3) O método de hibridação DNA-Checkerboard foi capaz de identificar e
quantificar os microrganismos provenientes do interior dos conjuntos
implantes/conectores protéticos.
4) A ausência de uma adaptação precisa entre os componentes dos
implantes, permitindo a passagem de microrganismos através da interface
implante/conector, pode representar um risco para o sucesso em longo
prazo do tratamento reabilitador com implantes.
NASCIMENTO, C. Mestrado
94
8. REFERÊNCIAS
________________________________________________________
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NASCIMENTO, C. Mestrado
106
9. APÊNDICE
________________________________________________________
NASCIMENTO, C. Mestrado
107
9. 1 Apêndice A
Quadro 1 - Escores das células bacterianas detectadas em cada uma das amostras,
onde 0: não detectado; 1: < 10
5
; 2: ~10
5
; 3: 10
5
~ 10
6
; 4: ~10
6
; e 5: > 10
6.
Amostras
Grupo 1
Conectores
Calcináves
Grupo 2 Grupo 3
Conectores Pré-
fabricados
Controle
1
1 3 3
2
1 3 3
3
2 1 3
4
3 1 3
5
3 0 3
6
1 1 3
7
2 1 3
8
1 1 3
9
1 0 3
NASCIMENTO, C. Mestrado
108
9. 2 Apêndice B
Composição do meio de cultura TSBy:
O TSBy, utilizado para o crescimento, reativação e multiplicação do S.
sobrinus, apresenta a seguinte composição por litro:
Digerido pancreático de caseína............................... 17,0g
Digerido papaínico de soja.......................................... 3,0g
Dextrose ...................................................................... 2,5g
Cloreto de sódio .......................................................... 5,0g
Fosfato dipotássico...................................................... 2,5g
Preparo:
• pesar 30,0g do produto desidratado e adicionar 1000,0 mL de água destilada;
• misturar bem e aquecer até obter dissolução completa do produto;
• distribuir em volumes de cerca 15,0 mL em tubos de 15X150 mm, com rolha
de rosca;
autoclavar a 121°C por 15 minutos.
NASCIMENTO, C. Mestrado
109
9. 3 Apêndice C
Composição do Caldo Sacarose Bacitracina (CaSa B):
Casitona .................................... ...................................15,0 g
Extrato de levedura ................... .....................................5,0 g
L- cisteína.................................. .....................................0,2 g
Sulfito de sódio.......................... .....................................0,1 g
Acetato de sódio........................ ...................................20,0 g
Sacarose ................................ ....................................200,0 g
Água destilada........................... ...............................1000,0 mL
Preparo:
Os componentes do meio de cultura foram pesados em balança
elétrica Marte, modelo AS2000 (São Paulo, Brasil) e transferidos para um balão de
Erlenmeyer. Em seguida, foi realizada a adição de 1000,0 mL de água destilada e
a homogeneização do meio. O balão de Erlenmeyer foi fechado com tampão de
algodão, encapsulado com papel e esterilizado em autoclave a 120ºC por 20
minutos. Decorrido o período de esterilização, o balão foi mantido em banho-maria
para que o meio de cultura esfriasse gradualmente até atingir cerca de 50ºC,
quando foi adicionado o antibiótico bacitracina (Sigma, EUA), na proporção de 0,2
UI por mililitro.
NASCIMENTO, C. Mestrado
110
9. 4 Apêndice D
Ágar Sacarose Bacitracina (SB20):
Casitona .................................... ...................................15,0 g
Extrato de levedura ................... .....................................5,0 g
L- cisteína.................................. .....................................0,2 g
Sulfito de sódio.......................... .....................................0,1 g
Acetato de sódio........................ ...................................20,0 g
Sacarose ................................ ....................................200,0 g
Ágar ........................................... ...................................15,0 g
Água destilada........................... ...............................1000,0 mL
Preparação do meio de cultura de acordo com o CaSa B, porém com a
adição de ágar a 1,5%.
Este meio de cultura foi utilizado para verificar a pureza e a
quantificação do inóculo microbiano de S. sobrinus (37 C por 48h).
NASCIMENTO, C. Mestrado
111
AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e/ou divulgação total ou parcial da presente obra, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
Cássio do Nascimento
Assinatura:______________________________
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