( PDF ) Papel de prion celular em modelos experimentais de convulsão e detecção de polimorfismos do gene PRNP em pacientes portadores de epilepsia

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PAPEL DE PRION CELULAR EM MODELOS

EXPERIMENTAIS DE CONVULSÃO E DETECÇÃO DE

POLIMORFISMOS DO GENE PRNP EM PACIENTES

PORTADORES DE EPILEPSIAS

MICHELE CHRISTINE LANDEMBERGER

Tese apresentada à Fundação Antônio

Prudente para a obtenção do título de

Doutor em Ciências

Área de concentração: Oncologia

Orientadora: Dra. Vilma Regina Martins

Co-Orientador: Prof. Dr. Roger Walz

São Paulo

2006

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Milhares de livros grátis para download.

FICHA CATALOGRÁFICA

Preparada pela Biblioteca do Centro de Tratamento e Pesquisa

Hospital do Câncer A.C. Camargo

Landemberger, Michele Christine

Papel de prion celular em modelos experimentais de convulsão e

detecção de polimorfismos do gene PRNP em pacientes portadores de

epilepsias / Michele Christine Landemberger -- São Paulo, 2006.

99p.

Tese (doutorado)-Fundação Antônio Prudente.

Curso de Pós-Graduação em Ciências-Área de concentração: Oncologia.

Orientadora: Vilma Regina Martins

Descritores: 1. EPILEPSIA/genética. 2. POLIMOSRFISMO GENÉTICO. 3.

PRION. 4. CROMATOGRAFIA LÍQUIDA.

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NÃO EXISTE UM CAMINHO PARA A FELICIDADE

A FELICIDADE É O CAMINHO

(GANDHI)

A persepção do desconhecido é a mais bela experiência que podemos viver

É a verdadeira fonte de toda arte e ciência

Aquele que nunca sentiu essa emoção, que não consegue mais se deslumbrar,

Tem os olhos fechados para a vida,

Os sentidos anestesiados, como num coma.

Somente nossa intuição mais profunda é capaz de perceber

Que o impenetrável existe e se manifesta

Na mais radiante beleza e na mais alta sabedoria.

(Albert Einstein)

DEDICATÓRIA

À minha mãe Marly Landemberger

Pelo apoio incondicional em todas as etapas de minha vida...

Pelo amor, carinho e compreensão sempre...

Pelo exemplo de força e perseverança mesmo nos momentos mais

difíceis de nossa jornada....

Pela educação e ensinamentos que me fizeram ser quem eu sou...

A você MÃE

Muito Obrigada

Eu não teria chegado aqui sem você

MEUS SINCEROS AGRADECIMENTOS

À Dra. Vilma Martins pela oportunidade e confiança em todos estes anos. Por tudo

que me ensinou de Ciência e de vida.

Ao meu co-orientador e amigo Prof. Dr. Roger Walz, um exemplo para mim.

Ao Silvio Zanata pelo grande incentivo e por tudo que me ensinou durante minha

IC.

Ao Prof. Ricardo Brentani a quem tenho enorme adimiração e que me deu o

privilégio de discutir muitos experimentos.

Ao Dr. Luiz Fernando Lima Reis pela excelência de nossa pós-graduação e pelo

grande apoio durante o curso de Bio Mol.

À Diretora do Instituto Ludwig Dra. Luisa Villa pelo esforço para manter a nossa

filial.

Aos queridos amigos do BCM – Cinthia e Cleiton pelo enorme carinho, Flavio,

Tiago e Gabriel pelas boas risadas, Mari e Glau por toda a ajuda científica,

Pamela, Zanith, Camila e Evânia pelo convívio.

Aos amigos do Lab vizinho: Fabio, Fabrício, Andréa e Simone.

As secretárias Eliane, Aline, Stella e Birgit por toda a ajuda que me deram.

À amiga Roseli Ziola pelo apoio e amizade.

Aos amigos antigos do Ludwig, Adriana Mercadante, Adriana Freitas, Kil,

Regina Nomizo, Angelita, Ana Lucia, Luiz, Mônica e Beatriz Stolf.

Aos Bioteristas Sr. João, Éder, Wanderley e Oraci.

Ao Carlinhos, Severino e Sueli pelo apoio técnico.

Aos funcionários da Administração, serviços gerais e manutenção pela eficiência.

Aos demais pesquisadores e colegas do Instituto Ludwig por todos estes

maravilhosos anos de convivência.

À Dra. Karina pela ajuda com as análises estatísticas.

Ao pessoal da pós-graduação.

Ao pessoal da Biblioteca, especialmente a Suely pelo suporte com a TESE.

Aos Drs. Bruce Chesebro e Giovanna Mallucci pelos animais usados neste

trabalho.

Ao Dr. Américo Sakamoto pelas amostras de pacientes.

Ao Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer e ao Hospital do Câncer por

todo o suporte técnico durante minha permanência de quase 7 anos.

À FAPESP, principal financiadora deste trabalho.

À Raquelzinha pela imensa paciência na minha IC.

Aos amigos de RP Érica e Bruno.

Ao meu psiquiatra predileto Ricardo Guarnieri.

Ao Iguatemi e Diogo, pelo exemplo de amor a Ciência.

À Professora Yukie por acreditar em mim.

As amigas: Fernanda, Carine, Wanda e Yonne.

Ao Tio Odair e a Fátima

Aos meus queridos avós sempre presentes em meu coração: Olga e Umberto,

Aparecida e Mauro.

À minha querida MÃE que moldou meu caráter e investiu em minha educação.

A TODOS que de alguma forma contribuíram para meu desenvolvimento pessoal e

profissional.

RESUMO

Landemberger MC. Papel de prion celular em modelos experimentais de

convulsão e detecção de polimorfismos do gene PRNP em pacientes portadores

de epilepsias. São Paulo; 2006. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente]

Prion celular (PrP

) é uma glicoproteína expressa em neurônios e nas células

da glia. É muito conservada entre as espécies e sua função celular tem sido

intensamente estudada nas últimas décadas. Nosso grupo mostrou que PrP

é capaz

de promover adesão e diferenciação neuronais e proteger contra morte celular,

através de sua associação a laminina e a STI1. No presente trabalho avaliamos a

sensibilidade aos agentes convulsivantes ácido caínico (KA) e pentilenotetrazol

(PTZ) em diferentes linhagens de animais knockout e transgênicos para PrP

. A

depleção de PrP

leva a uma maior sensibilidade a crises convulsivas induzidas por

KA ou por PTZ de maneira independente do background genético do animal. A

maior sensibilidade foi observada tanto nos animais que não expressam a proteína

desde o período embrionário quanto naqueles onde o gene de PrP

foi desligado

apenas nos neurônios no período pós-natal, indicando que este fenótipo é causado

por uma disfunção neuronal e não por um déficit de desenvolvimento. A presença de

apenas uma cópia do gene de PrP

foi capaz de reverter o baixo limiar para

convulsão dos animais knockout, enquanto que a superexpressão de PrP

levou a uma

alta resistência às convulsões induzidas farmacologicamente. Portanto, o limiar de

convulsão parece estar diretamente associado com as concentrações celulares de

PrP

. A plausibilidade biológica destes resultados levou-nos a investigar prevalência

de variantes alélicas no gene que codifica PrP

(PRNP) em pacientes com epilepsias

focais e generalizadas primárias e comparar com controles hígidos. Para isso,

validamos a padronização da técnica de DHPLC (cromatografia de fase líquida

denaturante) que foi capaz de detectar adequadamente a presença de polimorfismos

do gene PRNP em todas as amostras estudadas. A análise preliminar mostrou que há

uma maior freqüência do polimorfismo para valina em homozigose no códon 129

entre pacientes do que nos controles. Uma análise detalhada incluindo a

estratificação dos pacientes de acordo com o diagnóstico preciso das síndromes

epilépticas bem como a correlação do genótipo e variáveis clínicas e demográficas é

um ponto a ser investigado futuramente.

SUMMARY

Landemberger MC. [The role of cellular prion in models of experimental seizure

and evaluation of PRNP gene polymorphisms in patients with epilepsy]. São

Paulo; 2006. [Tese de Doutorado-Fundação Antônio Prudente]

Cellular prion protein (PrP

) is a glycoprotein expressed in neurons and glia.

It is highly conserved among species and its function is being consistently studied in

the last decades. Our group showed that PrP

can promote neuronal adhesion and

differentiation and protects against cell death through its association with laminin

and STI1. In the present study, we evaluated the sensibility of different Prnp

knockout and transgenic mice overexpressig PrP

, to seizures induced by Kainic acid

(KA) and Pentylenetetrazol (PTZ). The absence of PrP

leads to a higher sensibility

to seizures induced by these two drugs despite of the animal genetic background. The

elevated sensibility was observed both in the animals that do not express the protein

since the embryonic period as well as in those where the PrP

was switched off only

in the neurons at the post-natal period. Thus, indicating that this phenotype is caused

by a neuronal dysfunction and not by a development deficit. The presence of just one

Prnp allele was capable of reverting de lower seizure threshold observed in Prnp

knockout mice, whereas PrP

overexpression leads to a higher resistance to

pharmacological-induced seizures. Therefore, the seizure threshold seems to be

directly associated to PrP

cellular concentrations. The biological relevance of these

results leads us to investigate de presence of PRNP allelic variants in patients with

different forms of epilepsy. Firstly, we validated the DHPLC (Denaturing High

Performance Liquid chromatography) technique that was able to efficiently detect

the PRNP polymorphisms in all samples that were evaluated. The preliminary

analysis demonstrated a higher frequency of valine homozygozity at códon 129 when

patients were compared to controls. A more detailed evaluation including patients´

diagnosis, clinical and demographic parameters will be performed in order to

correlate them with PRNP variant alleles.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Esquema de acasalamentos dos animais ZPrnp

0/0

, ZPrnp

+/+

e Tg20. 39

Figura 2 Esquema de acasalamentos dos animais EPrnp

-/-

, EPrnp

+/+

e E Prnp

+/-

Figura 3 Esquema de acasalamento dos animais nocautes pós-natal. 41

Figura 4 Western Blot para quantificação de PrPc no cérebro das cepas usadas

neste estudo. 42

Figura 5 Curva dose resposta de KA em animais ZPrnp

0/0

, C57/BL6J, ZPrnp

+/+

e Tg20. 45

Figura 6 Convulsão induzida por KA nas linhagens EPrnp e knockouts pós-

Natal. 49

Figura 7 Convulsão induzida por PTZ em diferentes linhagens de camundongos

knockout para Prnp ou transgênicos que superexpressam Prnp. 56

Figura 8 Perfil de DHPLC para o protótipo e depleção de um octarepeat em

PRNP. 61

Figura 9 Perfil de DHPLC das variantes alélicas A117A sil e M129V de PNRP. 62

Figura 10 Perfil de DHPLC das variantes alélicas G124G sil e M129V de PRNP. 63

Figura 11 Perfil de DHPLC da variante alélica N171S de PRNP. 64

Figura 12 Eletroesferogramas do seqüenciamento de PRNP na região do códon

129. 64

Figura 13 Eletroesferogramas do seqüenciamento de PRNP na região do códon

171. 66

Figura 14 Digestão da ORF de PRNP com enzimas de restrição para caracterização

de variantes alélicas nos códons 117, 129 e 171. 67

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Principais Mutações descritas no gene PRNP. 15

Tabela 2 Principais polimorfismos descritos para o gene PRNP. 15

Tabela 3 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com KA usando o animal EPrnp

+/+

como parâmetro. 47

Tabela 4 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com KA usando o animal EPrnp

+/-

como parâmetro. 47

Tabela 5 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

fêmeas

tratadas com KA usando o animal EPrnp

+/+

como parâmetro. 47

Tabela 6 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

fêmeas tratadas com KA usando o animal EPrnp

+/-

como parâmetro. 47

Tabela 7 Descrição da semiologia das crises convulsivas induzidas pelo

tratamento com KA nos camundongos usados neste estudo. 53

Tabela 8 Análise estatística dos animais ZPrnp

+/+

, ZPrnp

0/0

e C57/BL6J

machos tratados com PTZ que morreram usando o animal ZPrnp

+/+

como parâmetro. 57

Tabela 9 Análise estatística dos animais ZPrnp

+/+

, ZPrnp

0/0

e C57/BL6J

machos tratados com PTZ que morreram usando o animal

C57/BL6J como parâmetro. 57

Tabela 10 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos tratados com PTZ que morreram usando o animal EPrnp

+/+

como

parâmetro. 57

Tabela 11 Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com PTZ que morreram usando o animal EPrnp

+/-

como

parâmetro. 58

Tabela 12 Análise estatística dos animais nocautes pós-natal e seus

respectivos controles machos tratados com PTZ que morreram usando

o animal Tg46* como parâmetro. 58

Tabela 13 Análise estatística dos animais nocautes pós-natal e seus respectivos

controles machos tratados com PTZ que morreram usando o animal

CreTg37 como parâmetro. 58

Tabela 14 Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95%

para epilepsia (n= 270) de acordo com a presença das variantes alélicas

do gene PRNP. 70

Tabela 15 Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95% para

epilepsia focal (n = 168) de acordo com as variantes alélicas do gene

PRNP. 70

Tabela 16 Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95% para

epilepsia generalizada idiopática (n = 40) de acordo com a presença das

variantes alélicas do gene PRNP. 71

LISTA DE ABREVIATURAS

BSE Encefalopatia Espongiforme Bovina

CJD Doença de Creutzfeld-Jakob

CWD Doença Crônica Debilitante

DHPLC Cromatografia Líquida de Fase Reversa Denaturante

DNA Ácido Desoxirribonucléico

EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra Acético

GABA

Ácido γ-aminobutírico tipo A

GPI Glicosilfosfatidilinositol

GSS Síndrome de Gerstmann-Sträussler-Scheinker

IFF Insônia Familial Fatal

KA Ácido Caínico

kDa KiloDalton

LN Laminina

MAPK Preoteína Quinase Ativada por Mitógeno

Min Minutos

Neo Neomicina

NMR Ressonância Nuclear Magnética

pb Pares de Bases

PCR Reação em Cadeia de Polimerase

PI3K Fosfatidil-Inositol-3 Quinase

PKA Proteína Quinase dependente de AMP cíclico

Prnp Gene que codifica para a proteína Prion Celular em camundongos

PRNP Gene que codifica para a proteína Prion Celular em humanos

PrP

Proteína Prion Celular

PrP

Proteína Prion Scrapie

PTZ Pentilenotetrazol

RB Retinoblastoma

RRE Razão de Risco Estimado

SDS Dodecil Sulfato de Sódio

SDS PAGE-Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS

STI 1 Stress Inducible Protein 1

TSE Encefalopatias Espngiformes Transmissíveis

vCJD Nova variante da Doença de Creutzfeld-Jakob

ÍNDICE

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Prions 1

1.2 Prion Celular 4

1.3 Funções Celulares de PrP

1.4 PrP

e alterações na excitabilidade neuronal e no limiar de convulsão 8

1.5 Epilepsias 11

1.6 Variantes alélicas do gene de PrP

2 OBJETIVOS 19

3 MATERIAL E MÉTODOS 20

3.1 Modelos animais 20

3.2 Genotipagem dos camundongos knockouts e transgênicos 22

3.3 Modelos experimentais de convulsão 24

3.3.1 Modelo de ácido caínico 25

3.3.2 Modelo de pentilenotetrazol 25

3.4 Escala de Racine 26

3.5 Análise estatística 26

3.6 Quantificação da expressão de PrPc por imunodetecção em extratos

cerebrais 27

3.7 Humanos 28

3.7.1 Casos: Pacientes portadores de epilepsia 28

3.7.2 Controles 28

3.8 Coleta de Material Biológico 29

3.9 Extração de DNA de Leucócitos 29

3.10 Seqüenciamento do gene PRNP 30

3.10.1 Reação de amplificação por PCR 30

3.10.2 Seqüenciamento de PRNP 32

3.11 DHPLC (Cromatografia líquida de fase reversa denaturante) 33

3.12 Identificação de polimorfismos/mutações no gende de PRNP por digestão do

DNA com Endonucleases 35

3.13 Análise Estatística 36

4 RESULTADOS I – ANIMAIS 37

4.1 Avaliação da presença do gene Prnp e expressão de PrP

nos animais do

estudo 37

4.2 Modelo de convulsão induzida quimicamente por ácido caínico em

camundongos 43

4.3 Descrição da semilogia das crises convulsivas 50

4.4 Modelo de convulsão induzida quimicamente por pentilenotetrazol em

camundongos 53

5 RESULTADOS II – HUMANOS 59

5.1 Padronização da técnica de DHPLC (cromatografia líquida de fase reversa

denaturante) para detecção de polimorfismos no gene PRNP 59

5.2 Avaliação de polimorfismos no gene PRNP em pacientes portadores de

síndromes epiléticas e em indivíduos normais 68

6 DISCUSSÃO I 72

7 DISCUSSÃO II 79

8 CONCLUSÕES 84

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 85

ANEXO

Anexo 1 Artigo publicado na revista J Neurosci Methods, intitulado High

capacity and low cost detection of prion protein gene variant alleles by

denaturing HPLC.

1 INTRODUÇÃO

1.1 PRIONS

As encefalopatias espngiformes transmissíveis (TSE) são um grupo de

doenças neurodegenerativas fatais que atingem tanto humanos quanto animais. Entre

as formas humanas estão a Doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), a Síndrome de

Gerstmann-Sträussler-Scheinker (GSS), a Insônia Familial Fatal (PRUSINER 1993),

além do Kuru, doença infecciosa associada a rituais canibalísticos praticados por

nativos da Papua Nova Guiné que mantinham a tradição de ingerir vísceras de seus

antepassados mortos (GAJDUSEK 1977). As desordens neurológicas que atingem os

animais são o scrapie em gado ovino, a Encefalopatia Espongiforme Bovina (BSE)

em gado bovino e a doença crônica debilitante (chronic wasting disease, CWD) em

cervídeos. A BSE foi a TSE mais alarmante durante as décadas de 80 e 90, pois

atingiu grande parte do gado do Reino Unido e foi responsável pelo surgimento de

uma nova doença no homem, denominada nova variante de CJD (vCJD), ocasionada

à ingestão de derivados de carne contaminada (AGUZZI 1996; BUTLER 1996). Isso

transformou as doenças priônicas em um grande problema econômico e de saúde

pública mundial.

As TSE são caracterizadas por demência progressiva, ataxia, associada por

degeneração espongiforme do cérebro com eventual deposição de material amilóide

no sistema nervoso central (revisado por MALLUCCI e COLLINGE 2004). Embora

a etiologia destas doenças tenha permanecido obscura durante muitos anos, sendo

atribuída a uma infecção por vírus de ação lenta ou viróides (CHO 1976), sabe-se

hoje que elas são causadas pelo acúmulo intracerebral progressivo da proteína

extremamente insolúvel conhecida como prion ou PrP

(Revisado por PRUSINER

1991, 1997 e 1998).

O termo prion foi designado em 1982 por Stanley Prusiner e deriva da

expressão em inglês de proteinaceous infectious only. Esta foi proposta após muitos

anos de tentativas de isolamento do agente infeccioso a partir de amostras de

cérebros infectados com TSE. A idéia causou uma grande polêmica na comunidade

científica, por quebrar o dogma central da biologia molecular, onde a replicação de

um organismo, neste caso um agente infeccioso, dependia de ácidos nucleicos.

Entretanto, o agente infeccioso responsável pelas TSEs apresentava características

fisico-químicas incomuns àquelas dos patógenos conhecidos até então, como por

exemplo, a resistência a altas temperaturas e a desnaturação por formaldeído.

Diversos métodos conhecidos por solubilizar partículas infecciosas foram

ineficientes, tais como o uso de detergentes, de sais, alterações de pH e sonicação.

(MCKINLEY et al. 1983, 1986; BOLTON et al. 1984). Outros métodos físico-

químicos, eficientes em alterar ácidos nucléicos, tais como radiação ultravioleta, ação

de nucleases e dietil pirocarbonato, também foram incapazes de alterar a capacidade

infecciosa deste agente (revisado por PRUSINER 1992). Entretanto, métodos que

desnaturavam proteínas, como altas temperaturas, uréia e detergentes catiônicos

como o Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) foram eficientes tanto na solubilização

dessas partículas como na diminuição de sua capacidade infectante (PRUSINER

1982 e revisado por PRUSINER 1997).

Estudos demonstraram que cérebros de animais não infectados apresentavam

uma forma similar da proteína infecciosa (OESCH et al. 1985). Esta proteína foi

denominada de proteína prion celular (PrP

), enquanto a infecciosa depositada no

cérebro dos animais infectados foi designada de proteína prion scrapie (PrP

). O uso

de espectroscopia de ressonância nuclear magnética (NMR) determinou a presença

de diferenças nas estruturas secundárias das duas proteínas, indicando que no

processo infeccioso ocorrem alterações conformacionais que levam a conversão de

estrutura de α hélice presente principalmente em PrP

para folha β-pregueada,

abundante em PrP

(GASSET et al. 1992).

Desta forma, PRUSINER (1988) supôs que a partícula infecciosa responsável

pelas TSEs era composta unicamente por proteína, PrP

, sendo que, a propagação do

agente infeccioso ocorreria pela capacidade de PrP

em promover a conversão da

estrutura de sua isoforma celular PrP

gerando exponencialmente novas moléculas

infecciosas.

A geração de camundongos que não expressam o gene de PrP

foi crucial

para a comprovação de que PrP

é absolutamente necessária para o estabelecimento

da doença, uma vez que estes animais são totalmente resistentes à infecção

(BÜELER et al. 1992;

SAKAGUCHI et al. 1995; MOORE et al. 1999;

MONTRASIO et al. 2001; MALLUCCI et al. 2002).

A proposta de Prusiner ganhou um suporte experimental importante em

ensaios recentes onde foi possível amplificar a proteína infecciosa in vitro a partir de

extratos de cérebro ou de proteína recombinante e produzir infecção in vivo

(LEGNAME et al.2004; CASTILLA et al. 2005).

Admite-se que as doenças priônicas são causadas por ganho de função da

proteína prion celular que adquire novas características, em particular a

neurotoxicidade, ao se transformar em prion. Entretanto, é plausível pensar que a

patogênese destas doenças pode também estar relacionada à perda de função de PrP

(SAMAIA e BRENTANI 1998; MARTINS et al. 2002; HETZ et al. 2003; SOTO e

CASTILLA 2004). Desta forma tornou-se essencial buscar um maior entendimento

de PrP

e sua relevância biológica.

1.4 PRION CELULAR

Prion celular ou PrPP

é uma glicoproteína abundantemente encontrada em

neurônios e glia, extremamente conservada entre as espécies o que sugere que tenha

uma função celular importante (PRUSINER 1991).

Os genes que codificam a proteína prion celular do homem, hamster,

camundongo, rato, cabra e galinha já foram seqüenciados há pelo menos uma década

(KRETZSCHMAR et al. 1986; BASLER et al. 1986; LOCHT et al. 1986;

WESTAWAY et al. 1987; LIAO et al. 1987; HARRIS et al. 1991). O gene de PrP

humano é demominado de PRNP e o de camundongo Prnp. Todos codificam

proteínas de aproximadamente 250 aminoácidos, e 27kDa com um peptídeo

sinalizador de 22 aminoácidos na extremidade amino-terminal e um peptídeo

hidrofóbico de 23 aminoácidos na porção carboxi-terminal.

PrPc é sintetizado no retículo endoplasmático rugoso, encaminhado para o

Golgi e transportado até a superfície celular (revisado por HARRIS 1999). No

retículo endoplasmático rugoso o peptídeo sinal N-terminal (resíduos 1-22) e o

segmento hidrofóbico C-terminal (resíduos 231-253) são clivados, seguindo-se a

adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) (STAHL et al. 1987).

PrP

sofre ainda outras modificações pós-traducionais como adição de

oligossacarídeos N-ligados em regiões consenso e formação de uma ponte de

dissulfeto intramolecular entre os resíduos de cisteína 179 e 214. (CAUGHEY et al.

1989; RUDD et al. 2002).

Na membrana plasmática, foi demonstrado que PrP

encontra-se em

microdomínios ricos em colesterol, denominados de rafts (KESHET et al. 2000).

Entretanto, PrP

pode também ser encontrado em outras organelas celulares como o

complexo de Golgi e endossomos de reciclagem (LEE et al. 2001) ou no

compartimento citoplasmático uma vez que esta sofre ubiquitinação e degradação

pelo sistema de proteassoma (MA e LINDQUIST 2001).

1.3 FUNÇÕES CELULARES DE PRP

Uma importante propriedade de PrPP

é a sua capacidade de ligar íons Cu

através de 4 resíduos de histidina contidos em 4 ou 5 regiões repetidas, de oito

aminoácidos cada, denominada de octarepeat, localizada na porção amino-terminal

da molécula compreendendo os aminoácidos 51 a 90 em humanos (BROWN et al.

1997a). Animais que tiveram o gene que codifica PrP

removido, possuem 20 vezes

menos cobre no cérebro que animais normais, indicando que a associação é

fisiológica (BROWN et al. 1997a). Além disso, células de cerebelo de animais que

não expressam PrP

são mais sensíveis a radicais livres que células normais

(BROWN et al. 1997b). Uma vez que a ligação a cobre é importante para a atividade

catalítica de muitas enzimas envolvidas com o estresse oxidativo, incluindo a

superóxido dismutase (BROWN et al. 1999), foi sugerido que PrP

possa atuar como

um depósito de íons cobre destinado à ligação a enzimas que previnem o estresse

oxidativo (BROWN et al. 1997a; BROWN et al. 1999).

Dados da literatura sugerem ainda que PrP

poderia ser um sensor de estresse

celular que desencadearia um processo de sinalização ativando os sistemas

antioxidantes e as defesas celulares (RACHIDI et al. 2003). PrP

participa ainda na

modulação da ativação de plasminogênio tecidual de maneira dependente de íons

cobre (ELLIS et al. 2002).

A caracterização de ligantes celulares de PrP

tem proporcionado um avanço

importante na determinação do seu papel biológico. Foi demonstrado que o receptor

de laminina de 37/67KDa interage com PrP

e participa de sua internalização

(GAUCZYNSKI et al. 2001). Além disso, o receptor de laminina é requerido para a

propagação de PrP

em células neuronais infectadas com scrapie (LEUCHT et al.

2003). PrP

interage ainda com plasminogênio (ELLIS et al. 2002) e com caseína

quinase (MEGGIO et al. 2000) modulando suas atividades. Diversas moléculas da

matriz extracelular também já foram descritas como ligantes de PrP

, entre elas os

glicosaminoglicanos (GONZALEZ-IGLESIAS et al. 2002), os proteoglicanos

(KESHET et al. 2000), a heparina (WARNER et al. 2002) e a molécula de adesão

celular neural (NCAM) (SCHMITT-ULMS et al. 2001).

Foi descrito também o envolvimento de PrP

no estímulo de vias de

sinalização, como as vias fosfatidil-inositol-3 quinase (PI3K), proteína quinase

dependente de AMP cíclico (PKA) e proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)

(CHEN et al. 2003).

Nosso grupo demonstrou que PrP

pode se ligar a três outras proteínas: STI1

(stress inducible protein 1), Vitronectina e Laminina (LN). A ligação entre PrP

STI1 é específica e de alta afinidade no sítio que compreende os aminoácidos 113-

128 da molécula de PrPP

e nos resíduos 230-245 de STI1. A interação entre as duas

proteínas desencadeia sinais de proteção dependentes da via de PKA em neurônios

retinianos (ZANATA et al. 2002; CHIARINI et al. 2002), promove crescimento

neurítico, além de proteger neurônios hipocampais da morte celular induzida por

estaurosporina (LOPES et al. 2005).

PrP

interage com vitronectina através de uma ligação específica e de alta

afinidade que está mapeada entre os resíduos 105 a 119 da molécula de PrP

e nos

resíduos 309-322 na molécula de vitronectina. Esta interação promove crescimento

axonal de gânglios da raiz dorsal e diferenciação de neurônios hipocampais (dados

enviados para publicação.

Em 2000 demonstramos a interação de alta afinidade e especificidade entre

PrP

e a região carboxi-terminal da cadeia γ1 de LN, mais especificamente o

peptideo RNIAEIIKDI. Esta associação é responsável por mediar a formação e

manutenção de neuritos “in vitro” (GRANER et al, 2000 a e b). Além disso,

mostramos que esta interação é importante para a consolidação da memória

(COITINHO et al. 2006).

Laminina é uma molécula em forma de cruz composta por três cadeias

polipeptídicas: α de 400 kDa (isoformas 1 a 5), β de 210 kDa (isoformas 1 a 3) e γ de

200 kDa (isoformas 1 a 3). Essa glicoproteína possui múltiplos domínios e é um dos

principais componentes não colagênicos das membranas basais, tais como as

alinhadas ao epitélio, as que circundam os vasos e nervos e as que estão localizados

sob a pia máter do cérebro (TIMPL e DZIADEK 1986).

Sabe-se ainda que LN é uma molécula vital nos processos de adesão e

diferenciação celulares em particular os que envolvem a neuritogênese (BECK et al.

1990). Esta função da molécula é determinada por domínios específicos, entre eles o

decapeptídeo da cadeia γ 1 RNIAEIIKDI (LIESI et al. 1989), que até a determinação

de sua interação com PrP

, pelo nosso grupo (MERCADANTE 2000; GRANER et

al. 2000a), não se conhecia o ligante celular que se associava a esta região da LN.

A LN foi descrita ainda como alvo de degradação por ativador de

plasminogênio que é induzido por ácido caínico, um análogo de glutamato, que por

sua vez induz processos epileptogênicos e morte neuronal. (CHEN e STRICHLAND

1997). Os autores argumentam que não se conhecia o receptor celular de laminina

que estava implicado neste processo, mas que este não parecia ser uma das

integrinas, receptores clássicos de proteínas da matriz extracelular (CHEN e

STRICHLAND 1997).

1.4 PRPP

E ALTERAÇÕES NA EXCITABILIDADE NEURONAL E

NO LIMIAR DE CONVULSÃO

Experimentos com camundongos knockouts para PrP

, demonstraram que

esses animais têm desenvolvimento e comportamento aparentemente normais

(BÜELER et al. 1992; MANSON et al. 1994). Foi também descrito que eles

apresentam um nível de ansiedade normal, porém com um discreto aumento na

atividade locomotora durante a exploração de um campo aberto (ROESLER et al.

1999).

Estudos eletrofisiológicos demonstraram uma redução do bloqueio na

inibição rápida do receptor GABA

(ácido γ-aminobutírico tipo A) na linhagem

ZrchI (BÜELER et al. 1992) de animais knockouts de PrP

. Foi observada ainda uma

diminuição na potenciação de longo prazo (LTP) no hipocampo em duas linhagens

de camundongos que não expressam PrP

, Zrch I e Npu (COLLINGE et al. 1994;

MANSON et al. 1994; WHITTINGTON et al. 1995; HERMS et al. 2000) além de

um distúrbio nas correntes de K

ativadas por Ca

. tanto em neurônios hipocampais

como em células de Purkinje no cerebelo (COLLING et al. 1996; HERMS et al.

2000). Da mesma fora, animais knockouts condicionais onde a expressão de PrP

abolida apenas em neurônios após a décima segunda semana de vida pós-natal,

apresentam uma diminuição dos potenciais de pós-hiperpolarização em células da

região CA1 do hipocampo (MALLUCCI et al. 2002). Estes últimos experimentos são

particularmente importantes, pois demonstram que uma disfunção neuronal ao invés

de um déficit de desenvolvimento está presente nestes animais.

As alterações descritas previamente são consistentes com os achados do

nosso grupo que mostram que animais knockouts da linhagem Zrch I apresentam

maior suscetibilidade à convulsão induzida por três agentes, ácido caínico,

pentilenotretazol e pilocarpina, que têm mecanismos de ação distintos (WALZ et al.

1999). Interessantemente, como já comentado previamente, o ácido caínico foi

descrito por mediar a ativação de plasmina que tem a laminina cerebral como

substrato (CHEN e STRICKLAND 1997).

Entretanto, resultados obtidos com modelos animais onde genes são

removidos ou adicionados ainda são muito discutíveis. Alterações detectadas nestes

camundongos podem ser causadas pelo background genético do animal, manipulação

genética ou ainda por mecanismos compensatórios. O animal knockout de PrP

denominado ZrchI (BÜELER et al. 1992) que foi usado no nosso estudo anterior

(WALZ et al. 1999) é passível de críticas importantes. Primeiro, porque possui um

background misto das cepas 129Sv e C57/BL6J e segundo, este animal é um

knockout constitutivo, portanto, a ausência de expressão deste gene durante a

embriogênese pode ter levado ao aparecimento de mecanismos compensatórios.

Desta forma, é de fundamental importância que estas diferenças no limiar de

convulsão previamente mostrados por nós no animal ZrchI possam ser reproduzidas

em outras linhagens de animais knockouts constitutivos e condicionais para PrP

É ainda notável que os animais knockouts para PrPP

apresentam modificações

na reorganização sináptica das fibras musgosas do hipocampo (COLLING et al.

1996), semelhantes em parte, ao observado no hipocampo de pacientes portadores de

epilepsia de lobo temporal mesial relacionada à esclerose hipopcampal (ELTM-EH)

(MATHERN et al. 1995).

Portanto, estes dados apontam que PrP

pode estar envolvido no controle da

excitabilidade neuronal e portanto no limiar de convulsão. Além disso, é relevante

pensar que modificações na atividade funcional de PrP

causada pela presença de

certos polimorfismos possam participar nos processos associados à epilepsia.

1.5 EPILEPSIAS

As epilepsias são doenças crônicas e representam um grave problema de

saúde pública com uma prevalência em torno de 5 a cada 1.000 habitantes nos países

desenvolvidos e superior nos países em desenvolvimento. Embora as razões para a

maior prevalência das epilepsias em países em desenvolvimento não estejam

claramente determinadas, parece provável que essa diferença esteja relacionada à

assistência pré-natal e maternal insuficiente, aos traumas de parto, maior número de

infecções e parasitoses do sistema nervoso central e traumatismos cranianos. Além

de afetar pessoas de todas as idades e raças (HAUSER et al. 1998), as epilepsias

representam a segunda maior causa de incapacidade mental, principalmente em

pacientes jovens (KALE 1997).

Muitas patologias adquiridas são fatores de risco para epilepsia, incluindo

traumatismos, infecções, tumores cerebrais e crises convulsivas prolongadas na

infância (ENGEL 1996). Acredita-se que, no caso das epilepsias secundárias a lesões

identificáveis (sintomáticas), após a injúria ocorram diversos mecanismos

adaptativos envolvendo neuroplasticidade, que em última análise podem contribuir

para o processo de epileptogênese. Embora alterações genéticas tenham sido

descritas em formas familiares de epilepsia (revisado por STEINLEIN 2001), na

maioria das vezes elas são causadas por uma interação de fatores genéticos e

ambientais (revisado por BERKOVIC e JACKSON 2000). Além disso, estudos

experimentais sugerem que o processo de epilepitogênese seja decorrente de

modificações herdadas ou adquiridas na fisiologia intrínseca dos neurônios e da rede

neural da qual fazem parte (ENGEL e PEDLEY 1998).

De acordo com a etiologia, a Liga Internacional de Combate a Epilepsia

classifica as epilepsias em (ENGEL e PEDLEY 1998):

1- Primárias, idiopáticas ou essenciais: são aquelas que não estão

associadas a lesões cerebrais ou anormalidades neurológicas. Os fatores genéticos

são bastante importantes neste tipo de epilepsias;

2- Secundárias, sintomáticas ou adquiridas: São epilepsias em que há uma

causa identificável e estão sempre associadas a lesões;

3- Criptogênicas: São epilepsias secundárias, também estão associadas a

lesões, porém não se consegue identificar a etiologia.

Nas epilepsias idiopáticas, entende-se que o processo de “epileptogênese”

depende principalmente de expressão e repressão de genes ao longo da formação e

desenvolvimento do cérebro. Nas epilepsias sintomáticas, o processo de

epileptogênese depende do tipo de insulto, da região cerebral afetada, e da resposta

tecidual, sendo esta última dependente das duas primeiras, das características

genéticas do indivíduo e da faixa etária na qual ocorreu o primeiro insulto ou evento.

Nos casos de epilepsias secundárias e criptogênicas, os fatores genéticos

possuem mecanismos complexos. No entanto, acredita-se, como já comentado, que

em praticamente todos os casos de epilepsia há uma relativa interação entre fatores

adquiridos e predisposição genética. (ENGEL e PEDLEY 1998).

Nas epilepsias focais existe uma região cortical ou sub-cortical (hipocampo,

amígdala) que é capaz de promover uma atividade hiperexcitável e hipersincrônica

anormal. Esta região é denominada de zona epileptigênica. Esta atividade anormal

pode propagar-se ao longo do córtex levando em última análise a uma crise

generalizada. Em termos clínicos as crises podem ser focais (também chamadas de

parciais) seguidas ou não de generalização secundária. As manifestações clínicas

sejam elas sinais ou sintomas, vão depender de qual região está sendo envolvida pela

crise naquele determinado momento (WALZ et al. 2003).

No caso das epilepsias generalizadas primárias, a atividade epileptiforme

intercrítica (fora da crise) ou mesmo a atividade ictal (crise propriamente dita), se

manifesta simultaneamente em toda a superfície cortical. Eletroencefalograficamente

não é possível detectar um início focal e uma eventual propagação como no caso das

epilepsias focais. Nestes casos, a atividade epileptiforme é captada simultaneamente

em toda a superfície cortical e resulta de um mecanismo de sincronização tálamo-

cortical. Não está completamente elucidado se esta manifestação se dá por um

gatilho cortical com rápida propagação para o tálamo ou se é iniciada diretamente no

tálamo. Clinicamente o protótipo das epilepsias generalizadas primárias são as crises

de ausência, nas quais o paciente tem uma diminuição ou perda completa da

reatividade ao meio, com duração de segundos, seguida de restabelecimento imediato

da consciência. Durante este período observa-se uma atividade eletroencefalográfica

generalizada (ambos os hemisférios) e síncrona, com morfologia e freqüência

específicas (WALZ et al. 2003).

Assim, em termos gerais as epilepsias podem ser classificadas do ponto de

vista clínico e eletroencefalográfico em dois grandes grupos. As focais, nas quais a

atividade ictal se inicia em uma região do córtex, e as generalizadas, onde a atividade

epileptiforme é bilateral e síncrona. Existem diferentes tipos de epilepsias focais e

generalizadas, cujos aspectos clínicos, demográficos, prognóstico e etiologia são

variáveis (WALZ et al. 2003).

1.6 VARIANTES ALÉLICAS DO GENE DE PRP

O gene de PrP

em humanos (PRNP) está localizado no braço curto do

cromossomo 20 e é composto por 2 exons, sendo que a fase aberta de leitura está

inteira contida no segundo exon que é composto por 737 pares de base. Existem

atualmente descritas na literatura 55 mutações no gene PRNP associadas a doenças

priônicas hereditárias (Tabela 1) e 16 polimorfismos identificados em humanos

(Tabela 2). Isto inclui 24 mutações “missenses” (tradução da proteína com troca de

aminoácidos), 27 mutações por inserção, 2 mutações por depleção, 2 mutações

“nonsense” (tradução de proteína truncada), 12 polimorfismos que não resultam em

modificação do aminoácido e 4 que resultam em modificação do aminoácido

(PARCHI et al. 1996; PRUSINER 1997; JACKSON e COLLINGE 2001).

O códon 129 de PRNP é polimórfico na população humana sendo que cerca

de 43% do indivíduos são homoziotos para metionina (M129M), 49% são

heterozigotos metionina valina (M129V) e 8% são homozigotos para valina V129V

na população caucasiana (ZIMMERMANN et al. 1999). Na população japonesa e

chinesa a distribuição é bem diferente, sendo 92% M129M, 8% M129V e 0% V129V

nos japoneses e nos chineses 97% M129M, 3% M129V e 0% V129V (DOH-URA et

al. 1991; TSAI et al. 2001).

Tabela 1 - Principais Mutações descritas no gene PRNP.

Códon Mutação Patologia associada Referência

51-91 Inserção 48 a 216 pb CJD /GSS GOLDFARB et al. 1993

102 Pro→Leu GSS HSIAO et al. 1989

105 Pro→Leu GSS YAMADA et al. 1993

117 Ala→Val GSS DOH-URA et al. 1989

145 Tyr→STOP GSS GHETTI et al. 1996

171 Asn→Ser Esquizofrenia SAMAIA et al. 1997

178 Asp→Asn IFF/CJD GOLDFARB et al. 1991, MEDORI et al. 1992

180 Val→ Ile CJD KITAMOTO et al. 1993

183 Thr→Ala CJD NITRINI R et al. 1997

187 His→Arg GSS CERVENAKOVA et al. 1999

188 Trh→Lys Demência FINCKH et al. 2000

196 Glu→Lys CJD PEOC’H et al. 2000

198 Phe→Ser GSS HSIAO et al. 1992

200 Glu→Lys CJD GOLDFARB et al. 1990

202 Asp→Asn GSS PICCARDO et al. 1998

208 Arg→His CJD MASTRIANNI et al. 1996

210 Val→ Ile CJD POCCHIARI et al. 1993

211 Glu →GLN CJD PEOC’H et al. 2000

212 GLN→ Pro GSS PICCARDO et al. 1998

217 GLN→ Arg GSS HSIAO et al. 1989

232 Met→ Arg CJD KITAMOTO et al. 1993

Tabela 2 - Principais polimorfismos descritos para o gene PRNP.

Códon Polimorfismo Freqüências na população Referência

51-91 Depleção 24pb 9% PERRY et al. 1995

51-91 Inserção 24pb ~1% CERVENAKOVA et al. 1994

114 Depleção 45% SALVATORE et al. 1994

117 Silenciosa

5.4% HSIAO et al. 1989

124 Silenciosa

~1% PRUSINER et al. 1997

129 Met→ Val M/V 50%; V/V 10% DOH-URA et al. 1989

171 Asn → Ser 7 a 10% da população negra MEAD et al. 2003

188 Thr→Arg ~1% WINDL et al. 1999

219 Glu→ Lys 12% KITAMOTO et al. 1993

As freqüências constantes são as descritas na literatura (WINDLT et al. 1999; LAMPE et al. 1999). As referências são as dos autores que citaram esses polimorfismos pela primeira vez.

Alterações silenciosas também já foram descritas em pacientes e populações controle (

A presença de metionina neste códon está associada a maior susceptibilidade

a doenças de prion esporádicas bem como a nova variante de CJD (WADSWORTH

et al. 2004). O aminoácido presente neste códon é ainda determinante na distinção de

que tipo de doença hereditária de prion está associada à mutação no códon 178. A

presença de metionina no códon 129 no mesmo alelo da mutação em 178 causa

Insônia Familial Fatal enquanto que valina nesta posição leva a um quadro de CJD

(GOLDFARB et al. 1992). Portanto, o códon 129 parece ter um papel primordial na

estrutura da molécula de PrP

e estudos mostram uma maior propensão a formação

de folha β-pregueada quando metionina está nesta posição (PETCHANIKOW et al.

2001). Portanto, é plausível admitir que a presença de um ou outro aminoácido neste

códon possa interferir não só com a patologia das doenças de prion, mas também

com a função fisiológica de PrP

Interessantemente, variantes aléticas do códon 129 já foram associadas com

melhor desempenho cognitivo em pacientes idosos, em indivíduos com síndrome de

Down, com doença de Alzheimer (RUJESCU et al. 2003; DEL BO et al. 2003 e

2006; GACIA et al. 2006).

Além disso, este polimorfismo pode influenciar o aparecimento de sintomas

neurológicos e hepáticos na Doença de Wilson (GRUBENBECHER et al. 2006).

Alterações na freqüência alélica do códon 129 também já foram correlacionadas com

quadros de afasia primária progressiva (LI et al. 2005) e com as medidas

neuropsicológicas e psicopatológicas de desordens psiquiátricas (MARTORELL et

al. 2006). Uma melhor memória de longa duração foi ainda associada com o alelo

129 metionina em adultos jovens normais (PAPASSOTIROPOULOS et al. 2005).

Um outro polimorfismo no gene PRNP está presente na região conhecida por

octarepeats, que contém o domínio de interação ao íon cobre, este domínio de oito

aminoácidos está repetido cinco vezes em cerca de 90% da população humana, sendo

que os restantes 10% apresentam apenas 4 repetições (PERRY et al. 1995). A

presença de três ou mais que 7 octarepeats foi associada a doenças de prion

(GOLDFARB et al. 1993). Entretanto, não se sabe se este polimorfismo (4 ou 5

repetições) pode alterar as funções normais de PrP

Em 1997 SAMAIA et al. mostraram uma possível relação entre uma variante

no códon 171 de PRNP e uma forma atípica de esquizofrenia familiar (SAMAIA et

al. 1997), sugerindo que outras doenças neurológicas de causa desconhecida podem

estar associadas à perda total ou parcial da função de PrP

. Este polimorfismo foi

ainda encontrado em algumas formas de epilepsia (WALZ et al. 2003, 2004),

entretanto estes dados não foram reproduzidos por outro grupo (CAVALLERI et al.

2005). O códon 171 encontra-se próximo ao sítio de ligação de PrP

a laminina

(COITINHO et al. 2006) e simulações estruturais mostram que a mudança do

aminoácido nesta posição altera a hidrofobicidade dos aminoácidos vizinhos. Nós

especulamos que o polimorfismo descrito nesta região, onde uma asparagina é

trocada por uma serina (N171S), possa modificar a interação PrP

-laminina e em

última análise favorecer o processo de epileptogênese. Embora não se possa excluir a

possibilidade de co-segregação de outros genes não estudados nestes trabalhos

(WALZ et al. 2003 e 2004), a hipótese do envolvimento do PrP

no processo de

epileptogênese em humanos é biologicamente plausível considerando as diversas

alterações vistas nos animais knockouts para esta proteína.

Desta forma, o presente trabalho pretende primeiramente tornar mais robusta

a plausibilidade biológica do papel de PrP

sobre a sensibilidade a convulsões. Para

isso usaremos modelos farmacológicos de convulsão que serão testados em

diferentes linhagens de camundongos onde a expressão de PrP

é abolida ou

contrariamente onde ela é muito alta. Com intuito de descartar falsas respostas

ocasionadas pela presença de algum tipo específico de background genético ou ainda

de mecanismos compensatórios estabelecidos durante embriogênese, usaremos

animais com diferentes backgrounds genéticos e ainda que tiveram o gene Prnp

removido durante a fase embrionária ou apenas na fase adulta.

Em segundo lugar avaliaremos os polimorfismos do gene PRNP em pacientes

portadores de diferentes síndromes epilépticas na tentativa de demonstrar a

existência de uma correlação entre a presença de variantes alélicas deste gene e o

processo de epileptogênese.

2 OBJETIVOS

9 Avaliar o papel de PrP

na sensibilidade a convulsões. Modelos

farmacológicos de convulsão por ácido caínico e PTZ serão testados em

diferentes linhagens de camundongos onde a expressão de PrPP

é abolida ou é

muito alta. Com intuito de descartar falsas respostas ocasionadas pela

presença de algum tipo específico de backgronud genético ou ainda de

mecanismos compensatórios estabelecidos durante embriogênese, usaremos

animais com diferentes backgronuds genéticos e ainda que tiveram o gene

Prnp removido durante o período embrionário ou pós natal.

9 Validar a técnica de DHPLC (Denaturing High Performance Liquid

Chromatography) na determinação de variantes alélicas do gene PRNP

usando amostras de DNA de pacientes com diferentes síndromes epiléticas.

9 Determinar a freqüência das variantes alélicas no gene PRNP em pacientes

portadores de epilepsias focais e generalizadas e compará-las com as

observadas em controles hígidos.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MODELOS ANIMAIS

Camundongos Zrch ou ZPrnp

0/0

- Construídos por BÜELER et al. (1992)

tiveram o gene Prnp deletado na região dos aminoácidos 4 a 186, sendo que esta foi

substituída por um cassete de neomicina. Estes animais têm background genético

misto C57/BL6J X 129 Sv.

Camundongos Tg-20 - Estes animais são transgênicos construídos a partir de

blastocistos do camundongo ZPrnp

0/0

. Neles foram inseridas cópias adicionais do

gene de PrP

que levam a expressão de aproximadamente 6 vezes mais proteína no

cérebro que os animais selvagens (FISCHER et al. 1996). Estes animais têm,

portanto, o mesmo background genético dos ZPrnp

0/0

Camundongos controle Zrch Prnp

+/+

(ZPrnp

+/+

) - foram gerados de um

acasalamento entre os animais C57/BL6J e 129 Sv. O cruzamento contínuo a partir

dos F1 destes animais gerou a cepa tipo selvagem de background misto que é

controle para os camundongos ZPrnp

0/0

e Tg20.

Camundongos Edbg Prnp

-/-

Edbg Prnp

+/-

Edbg Prnp

+/+

- Estes animais

foram construídos por MANSON et al. (1994), e neles o cassete de neomicina foi

inserido no sítio de restrição da enzima Kpn-1 presente na ORF de Prnp. Esta

linhagem possuía backgroud puro 129SV, que não é bem aceita para ensaios

cognitivos. Nos últimos anos estes animais foram re-acasalados com animais de

background C57/BL10 por 4 gerações no Laboratório do Dr Bruce Chesebro (Rocky

Mountains NIH).

Na tentativa de controlar o background genético desta linhagem dentro dos

experimentos, animais heterozigotos (Edbg Prnp

+/-

) são continuamente acasalados

com C57/BL10 (backcross). Os 25% de animais heterozigotos provenientes destes

acasalamentos são acasalados entre si e geram uma prole onde 25% dos animais são

homozigotos para a depleção (EPrnp

-/-

), 25% são controles homozigotos sem

depleção EPrnp

+/+

e 50% são heterozigotos (EPrnp

+/-

). Estas proles então são usadas

para os experimentos, pois têm o mesmo background e o controle tipo selvagem

vindo do mesmo acasalamento.

Camundongos Tg46*, Cre-Tg46, Tg37* e Cre-Tg37 – Estes camundongos

são knockouts pós-natal, onde o gene Prnp é mantido durante toda a embriogênese e

desligado em torno de 14 semanas pós-natal apenas em neurônios. Para a construção

deste animal foi usado um vetor com a região aberta de leitura do gene de PrP

flanqueado por sítio MloxP. Este foi microinjetado em oócitos FVB Prnp

0/0

para a

produção das matrizes cuja progênie expressava PrP

. Foram gerados desta forma 2

cepas Tg46 e Tg37, sendo que a primeira apresenta a expressão de PrP

semelhante

ao animal tipo selvagem e a segunda apresenta aproximadamente 3 vezes mais

proteína no cérebro.

Foi então gerado um terceiro camundongo expressando a enzima Cre

recombinase do fago P1 sob controle do promotor do gene de neurofilamento H

(NFH) que é especificamente ativado a partir da décima quarta semana pós-natal

apenas em neurônios. A proteína Cre codificada por fago P1 é uma proteína de 38

kDa que promove recombinação do DNA. A recombinação ocorre num sítio

específico chamado Lox (cada sítio com 34 pb) e pode ser tecido específica se Cre

estiver sob controle de promotores tecido-específicos (SAUER e HENDERSON

1988). Oócitos FVB Prnp

0/0

foram usados

para a introdução deste vetor. O animal

onde o gene de PrP

vai ser desligado após a 14 semanas pós-natal é um F1

proveniente do cruzamento de animais Prnp

0/0

lox (Tg46 ou Tg37) e CRE NFH,

denominado NFH-Cre-MloxP. Os animais do mesmo acasalamento que não possuem

CRE são os controles dos experimentos, pois não têm o gene de PrP

desligado e os

animais que sofrerem recombinação tem o gene de PrP

desligado apenas nos

neurônios.

3.2 GENOTIPAGEM DOS CAMUNDONGOS KNOCKOUTS E

TRANSGÊNICOS

Todos os animais nocautes constitutivos Edgb e condicionais Tg46*,

CreTg46, Tg37* e CreTg37, foram genotipados antes da realização de cada

experimento.

Para a genotipagem dos animais Edbg, DNA extraído da cauda foi

amplificado em duas reações multiplex. A primeira delas para amplificar o gene de

neomicina usando 0,25 μM dos iniciadores 5’ – TTG AGC CTG GCG AAC AGT

TC – 3’ e 5’ – GAT GGA TTG CAC GCA GGT TC – 3’ e 0,5 μM dos iniciadores 5’

– AAT AGA GGC ACT CCC TTC AC – 3’ e 5’ – GGT AAG CCC TTG ACC TAA

AA – 3’ para amplificar o gene de retinoblastoma, usado como controle interno da

reação. As condições de ciclagem foram 94ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos de

94ºC por 1 min, 57ºC por 1 min e 72ºC por 45 seg, seguidos de uma extensão final

de 72ºC por 5 min.

A segunda reação para amplificar o gene de Prnp usando 0,25μM dos

iniciadores 5’ – AAC CGT TAC CCA CCT CAG GGT -3’ e 5’ – GCG CTC CAT

CAT CTT CAC A – 3’ e 0,25μM dos iniciadores para amplificar o gene de

retinoblastoma como descrito acima. As condições de ciclagem foram 35 ciclos de

94ºC por 1 min, 60ºC por 1 min e 72ºC por 45 seg seguidos de uma extensão final de

72ºC por 5 min. As amostras foram amplificadas por PCR, utilizando-se o Kit de

amplificação Taq DNA polimerase (Promega, WI, USA). As reações foram feitas em

um volume de 10 μL contendo 25 μg de DNA genômico, 20 mM Tris HCl pH 8,0;

50 mM KCl; 25 mM MgCl

; 500 μM dNTP (Life Technologies, Gibco BRL); 0,5μM

de iniciadores (Forward e Reverse), DMSO 10% e 1 U de Taq DNA polimerase.

Para a genotipagem dos animais Tg46*, Cre-Tg46, Tg37* e Cre-tg37, DNA

extraído da cauda dos animais de interesse foi amplificado em uma reação multiplex,

usando 0,25μM dos iniciadores 5’ – ATC AGT CAT CAT GGC GAA C – 3’ e 5’ –

AGA GAA TTC TCA GCT GGA TCT TCT CCC GTC – 3’ para amplificar o gene

de Prnp e 5’ – TCG ACC ATG CCC AAG AAG AAG – 3’ e 5’ – ACG TTT TCT

TTT TCG GAT CCG CCG CAT – 3’ para amplificar o gene de Cre. As condições de

ciclagem foram 94ºC por 5 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC por 45 seg, 60ºC por

50 seg e 72ºC por 90 seg, seguidos de uma extensão final de 72ºC por 10 min.

As amostras foram amplificadas por PCR, utilizando-se o Kit de amplificação

Taq DNA polimerase (Promega, WI, USA). As reações foram feitas em um volume

de 10 μL contendo 25 μg de DNA genômico, 20 mM Tris HCl pH 8,0; 50 mM KCl;

25 mM MgCl

; 500 μM dNTP (Life Technologies, Gibco BRL); 0,5μM de

iniciadores (Forward e Reverse), DMSO 10% e 1 U de Taq DNA polimerase.

3.3 MODELOS EXPERIMENTAIS DE CONVULSÃO

Nos modelos experimentais de crise convulsiva em camundongos induzida

quimicamente, foram usadas diferentes doses de Ácido Caínico (KA) e

Pentilenotetrazol (PTZ).

Os animais foram separados por grupo, com 4 ou 5 animais por caixa e

pesados antes da injeção da droga (KA ou PTZ). Após a injeção intraperitoneal dos

agentes, os animais foram observados durante 120 min. Durante este período os

animais foram avaliados quanto a presença de crises convulsivas as quais foram

classificados quanto a sua intensidade usando a Escala de Racine (RACINE 1977).

Seguindo o prtocolo usado por WALZ et al. (1999) a solução de ácido caínico

foi preparada a fresco diluída em PBS na concentração 1 mg/mL ou 2 mg/mL e a

solução de PTZ foi também preparada a fresco e diluída em PBS na concentração 40

mg/mL ou 60 mg/mL.

Os animais permaneceram em um sistema de iluminação artificial, períodos

claro e escuro 12/12, e com livre acesso a comida e água. Todos os experimentos

foram conduzidos em temperatura controlada entre 22-24º C e os procedimentos

realizados com estes animais foram realizados de maneira a minimizar qualquer

sofrimento e o número de animais utilizados. Em todos os experimentos o guia

“Principles of laboratory animals care” (NIH # 85-23, revisado em 1996) foi

estritamente seguido.

3.3.1 Modelo de Ácido Caínico

O ácido caínico (cainato) é uma toxina análoga do glutamato, extraído da

Digenea simplex, um tipo de alga vermelha, que cresce em águas quentes. É um

potente agonista de aminoácidos excitatórios e sua potente atividade neurológica tem

sido atribuída a sua semelhança estrutural com o neurotransmissor ácido L-

glutâmico. É um importante modelo para o estudo de neurotoxicidade e tem sido

vastamente usado como modelo de epilepsia de lobo temporal, uma vez que os

achados histopatológicos são semelhantes à esclerose hipocampal em humanos,

ocorrendo reorganização sináptica e brotamento das fibras musgosas.

3.3.2 Modelo de Pentilenotetrazol

O Pentilenotetrazol é um agente farmacológico estimulador do sistema

nervoso central e respiratório. É considerado um antagonista não competitivo de

GABA.

O modelo de convulsão induzida por pentilenotetrazol (PTZ) é

reconhecidamente um modelo agudo de crise generalizada. O PTZ, um inibidor da

transmissão de receptor GABAérgico em doses altas (60-70 mg/kg) induz

inicialmente abalos mioclônicos, seguidos de uma crise generalizada do tipo tônico-

clônica com duração de segundos, evoluindo para um período pós-ictal de minutos

(SEJIMA et al. 1997).

Em doses muito baixas (10-20 mg/Kg, intra-peritoneal) o PTZ induz o

surgimento de crises do tipo ponta-onda em roedores, sendo útil no estudo do

entendimento dos circuitos tálamo-corticais envolvidos nas descargas do tipo ponta-

onda e comumente usado na varredura de drogas para tratamento de ausência

(MODY et al. 1997).

3.4 ESCALA DE RACINE

A observação das crises convulsivas foi feita usando a Escala de Racine:

1. Automatismos orofaciais

2. Mioclonia cefálica

3. Mioclonia de membros superiores

4. Rearing ou levantamento

5. Levantamento seguido de queda por perda de equilíbrio

Estágios 1 e 2 são caracterizados por comportamentos muito sutis e difícil

observação. Desta forma só foi considerado o início da crise convulsiva quando o

animal atingia o estágio 3. As classes 4 e 5 foram consideradas crises generalizadas.

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Foi analisada a proporção de convulsão e mortalidade nas diferentes cepas de

animais estudados utilizando o teste de Qui-Quadrado. A magnitude de associação

entre a presença de Prnp e a ocorrência de convulsão e mortalidade foi medida pela

razão de risco estimado (RRE, do inglês odds ratio) e o respectivo intervalo de

confiança de 95% (IC 95%) usando um modelo de regressão logística incondicional

através do programa de estatística SPSS versão 12.0 (Chicago, IL). Foram

considerados estatísticamente significativos p< 0,05.

3.6 QUANTIFICAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PRP

POR

IMUNODETECÇÃO EM EXTRATOS CEREBRAIS.

Extratos cerebrais provenientes de animais adultos (4 meses) das cepas

ZPrnp

+/+

, C57/BL6J, Tg20, EPrnp

+/+

, EPrnp

+/-

, Tg46 e Tg37 foram adquiridos

através da maceração em tampão de lise [50mM Tris-HCl pH 7,4; 1mM EDTA;

0,2% de deoxilato de sódio; 0,5% Triton X-100; + 10% de inibidores de protease

(Complete, Mini, ROCHE, cat. n° 1836153). As proteínas foram dosadas através de

ensaio colorimétrico pelo reagente de Bradford, separadas eletroforeticamente em gel

de poliacrilamida a 10% contendo SDS (SDS-PAGE), transferidas e imobilizadas em

membrana de nitrocelulose (0,45μm - Schleicher e Shuell, Alemanha). A membrana

foi incubada durante 1 hora, com TBST (120mM de NaCl, 20mM de Tris e 0,05% de

Tween 20) contendo 5% de leite desnatado liofilizado (Molico-Nestlé) para bloquear

as ligações inespecíficas. Em seguida, incubações de 12 horas a 4ºC com anticorpos

primários - policlonal anti PrP

e β actina (policlonal da Sigma cat. n

A 2066),

diluídos em Molico/TBST, 1:5000 ou 1:1000 respectivamente foram feitas. Após três

lavagens de 10 minutos com TBST, a membrana foi incubada com anticorpo

secundário (anticorpo anti Ig de camundongo ou coelho conjugado à peroxidase)

diluídos 1:5000 ou 1:3000 respectivamente em Molico/TBST por 1 hora à

temperatura ambiente. Após nova seqüência de lavagens a reação foi revelada

utilizando o "kit ECL Western Blotting Analysis System” (Amersham-Pharmacia)

seguida de exposição de um filme de raio X à membrana.

As bandas do filme radiográfico foram quantificadas usando-se o programa

Scion Image e a expressão de PrPP

normalizada pela expressão de β actina em cada

linha.

3.7 HUMANOS

3.7.1 Casos: Pacientes portadores de epilepsia

Foram analisadas 270 amostras de DNA humano de pacientes portadores de

epilepsia, sendo que 168 apresentavam epilepsia focal (com ou sem generalização

secundária) e 40 tinham epilepsia do tipo generalizada primária. Em 62 casos o

diagnóstico do tipo de epilepsia não foi revisado pelos pesquisadores.

Estes pacientes estão em acompanhamento no Centro de Cirurgia de

Epilepsia, HC-Ribeirão Preto, USP e todos assinaram um consentimento informado

concordando na doação do seu sangue para extração de DNA e a avaliação de

polimorfismos no gene PRNP. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em

Pesquisa da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (HCRP 6949/99) e pelo

Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital do Câncer A.C. Camargo (482/03).

3.7.3 Controles

No grupo controle foram recrutados 202 indivíduos sadios, sem doença

neurológica ou psiquiátrica prévia ou história familiar destas doenças descritos no

momento da entrevista e sem nenhum grau de parentesco com os pacientes. Dele

fazem parte colaboradores do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer e de

acompanhantes de pacientes do Centro de Cirurgia de Epilepsia, HC-Ribeirão Preto,

USP. Todos os controles assinaram um consentimento informado concordando na

doação do seu sangue para extração de DNA e a avaliação de polimorfismos no gene

PRNP.

3.8 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO

Após a assinatura do consentimento pós-informado, foi coletada uma amostra

de 5 mL de sangue através de punção venosa da veia braquial, na presença de agente

anti coagulante EDTA, sendo as amostras divididas no estudo em casos e controles.

A coleta de sangue foi feita no CIREP – Centro de Cirurgia em Epilepsia (casos e

controles) e no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (controles).

3.9 EXTRAÇÃO DE DNA DE LEUCÓCITOS

Para a extração de DNA de todas as amostras incluídas neste estudo, foi

usado o Kit Wizard Genomic DNA Purification

da Promega, catálogo A1120, que

tem se mostrado um kit rápido e eficaz na purificação de DNA genômico.

Seguindo o protocolo do fabricante, as amostras de sangue foram

homogeneizadas por 15 minutos, 3 mL de sangue foram adicionados a 9 mL de

solução de lise, a amostra incuba sob agitação a temperatura ambiente por 10

minutos, seguido de centrifugação por 10 minutos a 1700 x g O sobrenadante foi

descartado e o precipitado homogeneizado vigorosamente. A seguir foram

adicionados 3 mL de solução contendo Tris [hidroximetil aminoetano],

etilenodiamino-tetra acético e dodecil sulfato de sódio para promover a lise nuclear e

30 μL de RNAse seguidos de incubação a 37

C por 30 minutos. A amostra foi então

resfriada a 4

C e 2 mL de solução de precipitação de proteínas (contendo SDS) foi

adicionada e misturada vigorosamente. O material foi centrifugado (1700 x g) o

sobrenadante transferido para um tubo contendo 3 mL de isopropanol e misturado

lentamente até a precipitação do DNA. Foi realizada uma nova centrifugação (1700 x

g), o sobrenadante foi desprezado e o precipitado lavado com 3 mL de etanol 70%,

seguido de uma nova centrifugação (1700 x g) por 5 minutos. O sobrenadante foi

novamente desprezado e o DNA foi então seco por 30 minutos e ressuspenso em 100

μL de Líquido de Hidratação (Tris/EDTA), seguido de uma incubação a 65º C, para a

completa solubilização.

Após a extração, o DNA foi dosado pela absorbância, em comprimento de

onda de 260nm e submetido à eletroforese em gel de agarose para verificação de sua

integridade e pureza. O material foi então catalogado e armazenado a -20°C em

nosso banco de DNAs para posterior seqüenciamento do gene PRNP.

3.10 SEQÜENCIAMENTO DO GENE PRNP

3.10.1 Reação de amplificação por PCR

A região codificadora (fase aberta de leitura) do gene PRNP foi dividida em

duas porções que se sobrepõem: Fragmento 1, que corresponde a 423 pb, com início

no nucleotídeo 65 (ATG inicial) e término no 488 e Fragmento 2, que contém 404

pb, com início no nucleotídeo 455 e término no 858, 53 pares de base do códon

terminal. Os iniciadores foram analisados quanto a possíveis associações entre eles

(hairpin e formação de dímeros) em software Premier Primer. Os iniciadores foram

sintetizados pela Life Technologies do Brasil (S.P., Brasil):

As amostras foram amplificadas por PCR, utilizando-se o Kit de amplificação

Taq DNA polimerase (Promega, WI, USA). As reações foram feitas em um volume

de 20 μL contendo 50 μg de DNA genômico (diluído em água Dnase/Rnase Free,

Invitrogen), 20 mM Tris HCl pH 8,0; 50 mM KCl; 25 mM MgCl

; 500 μM dNTP

(Life Technologies, Gibco BRL); 0,5 μM de iniciadores (Forward e Reverse) e 1 U

de Taq DNA polimerase. A amplificação da primeira metade do gene PRNP foi

realizada usando-se os iniciadores Forward1: 5’ATG CTG GTT CTC TTTGTG 3’ e

Reverse1: 5’AAC GGT CCT CAT AGT CAC TGC 3’. As condições de ciclagem

foram 95ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos de 95ºC por 1 min seg, 64ºC por 1 min e

72ºC por 1 min, seguidos de uma extensão final de 72ºC por 10 min.

A amplificação da segunda metade do gene de PRNP foi feita usando-se os

iniciadores Forward2: 5’ TCA TGG TGG TGG CTG GGG TCA 3’ e Reverse2: 5’

CGC CTC CCT CAA GCT GGA AAA 3’.

As condições de ciclagem foram 95ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos de

95ºC por 1 min seg, 66ºC por 1 min e 72ºC por 1 min, seguidos de uma extensão

final de 72ºC por 10 min.

Os produtos de PCR amplificados foram separados por eletroforese em gel de

agarose 0,8%, diluídos na proporção 5:1 em TBE (TRIS Borato EDTA). Após a

corrida, o gel foi incubado por 40 minutos com sybr gold (Invitrogen - cat S11494) e

os produtos amplificados visualizados em Luz UV.

Os produtos destas amplificações foram usados subseqüentemente nas

reações de seqüenciamento.

3.10.2 Sqüenciamento de PRNP

Após ter o DNA amplificado (item 3.10.1) foi utilizado o kit DYEnamic ET

terminator

(Amersham Pharmacia Biotech, Inc, USA) para a reação de

seqüenciamento. As reações foram realizadas segundo as especificações do

fabricante, em um volume final de 10μL contendo 0,2 pmoles de DNA genômico e

0,5 pmoles de iniciador, adicionados a mistura reagente contendo os dNTPs

fluorescentes. A amplificação foi feita em termociclador DNA Thermal Cycler PTC-

100 (MJ Research, Inc), utilizando-se um programa que consta de uma desnaturação

inicial de 1 minuto a 94°C, 1 minuto e 15 segundos a 60° C e 20 segundos a 94° C

por 25 ciclos. Nestas reações foram usados iniciadores sintetizados pela Life

Technologies do Brasil (S.P., Brasil). Primeira metade da seqüência aberta de leitura

de PRNP: F1seq – 5’ CTG GTT CTC TTT GTG GCC 3’ ou R1seq – 5’ AAC GGT

CCT CAT AGT CAC TGC 3’, para a segunda metade da seqüência aberta de leitura

de PRNP: F2 seq – 5’TGG TGG TGG CTG GGG TCA AGG 3’ e R2 seq – 5’ CTC

CCT CAA GCT GGA AAA AGA 3’.

Após esta reação de ciclagem, foi adicionado 1μL de AcNa/EDTA e 40μL de

etanol 95% e o material permanecer por 15 min no escuro e a 4º C. Este foi a seguir

submetido a centrifugação a 10.600 x g por 15 min a 4ºC. O sobrenadante foi

aspirado e o precipitado lavado com 250 μL de etanol 70%, seguido de centrifugação

por 10.600 xg por 5 min a 4º C. O sobrenadante foi aspirado e o precipitado seco a

C. As amostras foram aplicadas em gel e a leitura da seqüência foi feita em

seqüenciador ABI 3100 Genetic Analyzer da Applied Biosystems (New Jersey,

USA).

3.11 HPLC (CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE FASE REVERSA

DENATURANTE)

Os DNAs extraídos de leucócitos de cada um dos pacientes e controles foram

amplificados por PCR, utilizando-se o Kit de amplificação AmpliTaq Gold (Applied

Biosystems, New Jersey, USA). As reações foram feitas em um volume de 50 μL

contendo 100 μg de DNA genômico (diluído em água Dnase/Rnase Free,

Invitrogen), 100 mM Tris HCl pH 8,3; 500 mM KCl; 25 mM MgCl

; 500 μM dNTP

(Life Technologies, Gibco BRL); 0,5 μM de iniciadores (Forward e Reverse) e 5 U

de AmpliTaq Gold. Os iniciadores utilizados foram sintetizados pela Life

Technologies do Brasil (S.P., Brasil). A primeira metade da fase aberta de leitura de

PRNP foi amplificada usando o par de iniciadores Forward: 5’ATG CTG GTT CTC

TTTGTG 3’ e Reverse: 5’AAC GGT CCT CAT AGT CAC TGC 3’. Para a segunda

metade foram usados os iniciadores Forward: 5’ ATC ATA CAT TTC GGC AGT 3’

Reverse: 5’ CTC CCT CAA GCT GGA AAA AGA 3’. Para a amplificação foi

utilizado programas touchdown.

Para a 1ª metade de PRNP as condições de ciclagem foram 95ºC por 10 min,

seguido de 10 ciclos de 95ºC por 1 min 63º C por 1 min e 72º C por 1 min, 10 ciclos

de 95ºC por 1 min 61º C por 1 min e 72º C por 1 min, 10 ciclos de 95ºC por 1 min

59º C por 1 min e 72º C por 1 min, seguidos de uma extensão final de 72ºC por 10

min.

Para a 2ª metade de PRNP as condições de ciclagem foram 95ºC por 10 min,

seguido de 10 ciclos de 95ºC por 1 min 62º C por 1 min e 72º C por 1 min, 10 ciclos

de 95ºC por 1 min 60º C por 1 min e 72º C por 1 min, 10 ciclos de 95ºC por 1 min

58º C por 1 min e 72º C por 1 min, seguidos de uma extensão final de 72ºC por 10

min.

As amostras de DNA amplificados por PCR foram submetidas à

cromatografia líquida de fase reversa denaturante usando-se o equipamento Wave-

nucleic acid Fragment Analysis System da Transgenomic (CA, USA), para a

pesquisa da presença de variantes alélicas (fitas de DNA em heteroduplex). Para isso

os produtos de PCR são primeiramente aquecidos a 95° C por 5 minutos, para

denaturação total das fitas duplas de DNA e resfriados gradativamente até a

temperatura ambiente para renaturação. Em seguida as amostras são colocadas no

cromatógrafo onde, primeiramente 8 μL destas são aquecidos a uma temperatura de

50°C onde se verifica a qualidade do DNA amplificado (denominada "double-

stranded sizing – single fragment") e em seguida 12 μL do produto de PCR são

aquecidos à temperatura de anelamento, onde se faz a pesquisa de

mutações/polimorfismos por formação de heteroduplex (HUBER et al. 1992). Esta

temperatura foi calculada pelo software do aparelho e se mostrou ótima para a

resolução total dos heteroduplex em 65°C para o fragmento 1 (primeira metade) e

61ºC ou 63ºC para o fragmento 2 (segunda metade).

Os parâmetros de gradiente e fluxo de tampões (tampão A = TEEA 5% e

tampão B = acetonitrila a 25%) foram ajustados utilizando-se o software Wavemaker

system control software (Transgenomic Inc, CA, USA).

Amostras que revelaram somente um pico de saída no cromatograma

(homoduplex) são misturadas em igual quantidade com DNA protótipo e

desnaturadas a 95° C por 5 minutos para a formação de possíveis heteroduplex, caso

a amostra contenha uma mutação/polimorfismo em homozigose. A seguir as

amostras são submetidas novamente à analise cromatográfica como descrito

anteriormente.

3.12 IDENTIFICAÇÃO DE POLIMORFISMOS/MUTAÇÕES NO

GENE DE PRNP POR DIGESTÃO DO DNA COM ENDONUCLEASES

Para a digestão do DNA com enzimas de restrição foram feitas amplificações

de toda a fase aberta de leitura do gene PRNP. Para isso usamos os iniciadores F1 -

5’ATG CTG GTT CTC TTTGTG 3’ e R2seq - 5’ CTC CCT CAA GCT GGA AAA

AGA 3’, kit Taq DNA polimerase recombinante (Gibco, USA), seguindo as

especificações do fabricante, em um volume de 20μL por reação, utilizando também

um programa touchdown, com uma temperatura inicial de anelamento de 63°C. O

produto assim obtido foi purificado através de uma precipitação inicial com 400μL

de 2-propanol (P.A, Merck, Germany), seguida de outra com 400μL de 70% etanol

(Merck, Germany). O DNA foi ressuspendido em água estéril para uma concentração

aproximada de 20ng/uL e avaliado através de eletroforese em agarose. As

endonucleases PvuII, NspI and BbvI (New England Biolabs and Amersham

Biosciences) foram usadas para a análise dos códons 117, 129 e 171 respectivamente

(WINDL et al. 1999; FINK et al. 1994). Para a digestão foi usada 1U enzima/ug de

DNA. As reações foram incubadas por 16 horas a 37°C seguidos de 20 minutos a

65°C para inativação da enzima e término da reação. Os produtos assim obtidos

foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida a 8% e revelados por

coloração de prata.

3.14 ESTATÍSTICA

Foi analisada a proporção de casos que apresentavam alelos variantes para o

gene PRNP. A magnitude de associação entre a presença dos alelos variantes e a

ocorrência de epilepsia foi medida pela razão de risco estimado (RRE, do inglês odds

ratio) e o respectivo intervalo de confiança de 95% (IC 95%) usando um modelo de

regressão logística incondicional através do programa de estatística SPSS versão 12.0

(Chicago, IL). A mesma análise foi feita separadamente para pacientes portadores de

epilepsias focais (n = 168) e generalizadas primárias (n = 40). Nesta segunda análise

os casos cujos diagnósticos não tenha sido revisado (n = 62). Em todas as análises foi

calculado o RRE ajustado para sexo e a presença de alelos variantes nos códons 117,

129 e depleção do octarepeat.

4 RESULTADOS I - ANIMAIS

4.1 AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DO GENE PRNP E EXPRESSÃO

DE PRP

NOS ANIMAIS DO ESTUDO

Os esquemas das figuras 1, 2 3 mostram o procedimento de acasalamento das

linhagens de animais usadas no estudo.

Na Figura 1 estão mostrados os animais ZrchI (BÜELER et al. 1992)

ZPrnp

0/0

e seu respectivo controle ZPrnp

+/+

assim como o animal que superexpressa

PrP

, denominado Tg20. Estes três animais têm um background misto C57/BL6J x

129Sv e suas genotipagens não são feitas rotineiramente uma vez que as linhagens

são mantidas isoladas, isto é não há acasalamento entre elas.

A Figura 2 apresenta o esquema de acasalamento dos animais da linhagem

Edbg (MANSON et al. 2004). Os animais são mantidos com a depleção de Prnp em

heterozigose e acasalados entre eles para a geração de animais com os diferentes

genótipos na mesma ninhada. Todos estes animais são genotipados e os produtos das

reações de PCR usados para identificação dos genótipos estão mostrados na Figura

2C.

A Figura 3 mostra o esquema de obtenção dos animais knockouts

condicionais Tg46*, Cre-Tg46, Tg37* e Cre-tg37. As linhagens originais contendo o

gene Prnp flanqueado por Mlox são também denominadas Tg37 e Tg46 e a linhagem

contendo o gene da CRE recombinase modulado pelo promotor de neurofilamento H

é denominado Tg63. Os animais gerados dos acasamentos entre Tg37 x Tg63 ou

Tg46xTg63 (Tg46*, Cre-Tg46, Tg37* e Cre-tg37) são todos genotipados e os

produtos das reações de PCR usados para identificação dos genótipos estão

mostrados na Figura 3C.

Para confirmar a expressão de PrPP

nas cepas de animais Tg20 e naqueles que

dão origem aos animas knockout condicionais Tg37 e Tg46, extratos de cérebro de

cada um destes camundongos foram avaliados por Western Blot usando-se anticorpos

contra PrP

e β-actina como controle de carregamento (Figura 4A). Na Figura 4B os

valores relativos da expressão de PrP

foram determinados a partir da relação entre a

intensidade das bandas obtidas para PrP

e as respectivas intensidades de β-actina.

Assim, podemos observar que o animal Tg37 apresenta três vezes mais PrP

cérebro do que o animal Tg46, enquanto o Tg20 expressa aproximadamente 6 vezes

mais PrP

quando comparado com o controle C57/BL6J. Estes dados são consistentes

com os descritos previamente (FISHER et al. 1996; MALLUCCI et al. 2002).

ZPrnp

0/0

neo

Acasalamento por

10 anos no ILPC

ZPrnp

+/+

Prnp

0/0

C57/BL6Jx129Sv

Prnp

0/0

C57/BL6Jx129Sv

Prnp

0/0

C57/BL6Jx129Sv

ZPrnp

0/0

C57/BL6Jx129Sv

C57/BL6J

ZPrnp

+/+

C57/BL6Jx129Sv

C57BL6J

x 129Sv

129Sv

Acasalamento por

10 anos no ILPC

Tg20

neo

Prnp

Tg 20

C57BL6Jx 129Sv

Tg 20

C57BL6Jx 129Sv

Tg 20

C57BL6Jx 129Sv

Tg 20

C57BL6Jx 129Sv

Acasalamento por

10 anos no ILPC

20x

Legenda: Obtenção das linhagens de camundongos ZPrnp

0/0

, ZPrnp

+/+

e Tg20. Estes animais têm

sido mantidos neste esquema de acasalamento nos últimos 10 anos.

Figura 1 - Esquema de acasalamentos dos animais ZPrnp

0/0

, ZPrnp

+/+

e Tg20.

Prnp

neo

Prnp

-/-

Prnp

+/+

EPrnp

-/-

EPrnp

+/-

EPrnp

+/+

Prnp

+/-

Edbg C57/BL10

Prnp

+/-

C57BL10

Prnp

+/-

C57BL10

Prnp

Neo

600 pb

400 pb

600 pb

400 pb

Legenda: Obtenção dos animais EPrnp

-/-

, EPrnp

+/+

e EPrnp

+/-

provenientes do acasalamento de dois

heterozigotos para Prnp e gel mostrando reação de PCR realizada para a genotipagem destes animais.

Figura 2 - Esquema de acasalamentos dos animais EPrnp

-/-

, EPrnp

+/+

e EPrnp

+/-

Expressão de PrPc neuronal

Nascimento

Expressão de Cre

NFH

Deleção neurônio

específica de PrPc

MloxP

NFH

Cre

Semanas

Expressão de PrPc neuronal

Nascimento

Expressão de Cre

NFH

Deleção neurônio

específica de PrPc

MloxP

NFH

Cre

Expressão de PrPc neuronal

Nascimento

Expressão de Cre

NFH

Deleção neurônio

específica de PrPc

MloxP

NFH

Cre

Semanas

MALLUCCI et al. 2003 Modificado

Tg46

Lox

Prnp

Tg63

Cre Hemizigose

Cre

Tg46

Lox

Prnp

Tg46

Lox

Prnp

Controle

Knokout

pós-

natal

Tg46

Lox

Prnp

Tg63

Cre Hemizigose

Cre

Tg46

Lox

Prnp

Tg46

Lox

Prnp

Controle

Knokou

pós-

natal

Tg37

Lox

Prnp

Tg63

Cre Hemizigose

Cre

Tg37

Lox

Prnp

Tg37

Lox

Prnp

Controle

Knokou

pós-

natal

Tg37

Lox

Prnp

Tg63

Cre Hemizigose

Cre

Tg37

Lox

Prnp

Tg37

Lox

Prnp

Controle

Knokou

pós-

natal

Neo

Prn

-lox

CRE

Legenda: Em A esquema de depleção de Prrnp neurônio-específica modificado de MALLUCCI et al.

(2003). Em B, esquema de acasalamento dos animais knockouts pós-natal e em C gel mostrando

reação de PCR realizada para a genotipagem destes animais.

Figura 3 - Esquema de acasalamento dos animais nocautes pós-natal.

PrP

29 KDa

ZPr

+/+

Tg20

EPrnp+/-

Tg46

Tg3

Expressão Relativa de PrP

β Actina

45 KDa

ZPrnp

+/+

C57/BL6J Tg20 EPrnp

+/+

EPrnp

+/-

Tg46 Tg37

Legenda: (A) Reação de western blot para PrP

e β-actina em extratos de cérebro de camundongos

C57Bl6J, Tg20, Tg46 e Tg37. (B) Expressão relativa de PrP

. Os valores representam a intensidade da

reação para PrP

de cada animal normalizada pela expressão respectiva de β-actina.

Figura 4 - Western Blot para quantificação de PrPc no cérebro das cepas usadas

neste estudo.

4.2 MODELO DE CONVULSÃO INDUZIDA QUIMICAMENTE POR

ÁCIDO CAÍNICO EM CAMUNDONGOS

Dados anteriores do grupo mostraram que animais

knockouts para PrP

, Zrch

Prnp

0/0

apresentavam um limear mais baixo de sensibilidade à convulsão induzida

farmacologicamente que animais do tipo selvagen (WALZ et al 1999).

O modelo experimental de ácido caínico usado por WALZ em 1999 foi

ampliado com o uso de várias doses desta droga nos animais tipo selvagem

Prnp

+/+

) e knockouts (ZPrnp

0/0

) e ainda em animais Tg20, que expressam 6x mais

PrP

do que animais selvagens (Fisher et al, 1996). Além disso, foram avaliadas

outras linhagens de animais

knockouts para Prnp.

A Figura 5A mostra os experimentos de convulsão induzida por doses

crescentes de ácido caínico em machos tipo selvagem, Z

Prnp

+/+

e C57/BL6J, em

knockouts ZPrnp

0/0

e em camundongos que superexpressam PrP

, Tg20. Os animais

Prnp

+/+

receberam doses intraperitoniais de 10, 12,5 e 15 mg de ácido caínico/kg.

Na dose 10mg/kg, 10% dos animais Z

Prnp

+/+

apresentaram convulsão (3/30), em

12,5mg/kg, 80% (16/20) e em 15mg/kg 100% (10/10). Os animais tipo selvagem da

linhagem pura C57/BL6J foram analisados nas doses de 10 e 12,5 mg de ácido

caínico/kg animal. Quando tratados com a dose de 10mg/kg, 30% dos animais (3/10)

apresentaram convulsão enquanto que 100% (10/10) deles têm convulsão quando

recebem 12,5mg/kg de ácido caínico. Portanto, os animais Z

Prnp

+/+

de background

misto (C57/BL6J x 129Sv) apresentam sensibilidade semelhante ao ácido caínico

que aqueles de

background puro (C57/BL6J).

Nossos dados anteriores apontavam que 80% dos animais knockout para PrP

Prnp

0/0

) tinham convulsão com uma dose de 10mg/kg (WALZ et al. 1999). Os

resultados apresentados na Figura 5A confirmam esta tendência onde 100% dos

animais Z

Prnp

0/0

apresentam convulsão com esta dose (20/20). Entretanto, um dado

novo mostra que estes animais são mais sensíveis do que esperávamos uma vez que a

dose de 7,5 mg/Kg já é capaz de induzir convulsão em 100% dos animais (10/10).

Apenas na dose de 5 mg/Kg não são observadas convulsões no animal Z

Prnp

0/0

(0/10).

Foram analisados ainda camundongos Tg20 que expressam cerca de seis

vezes mais PrP

que os do tipo selvagem (Figura 5A). Nas doses de 10 (n=10), 12,5

(n=10), 15 (n=10), 17,5 (n=10) e 20 mg/Kg (n=10) de ácido caínico nenhum animal

apresentou convulsão. Esta só ocorreu quando a dose usada foi de 25mg/Kg, onde

40% dos animais apresentaram convulsão (6/15).

Portanto, a comparação entre os animais Z

Prnp

0/0

com os do tipo selvagem

Prnp

+/+

na dose 10mg/Kg mostrou que a ausência de expressão de PrP

torna os

animais mais sensíveis às convulsões induzidas por ácido caínico (p<0,001 – Teste

de Qui-Quadrado). Por sua vez, a superexpressão de PrP

nos camundongos Tg20

torna-os muito mais resistentes às convulsões induzidas por esta droga (10mg/Kg) do

que os animais Z

Prnp

+/+

ou C57/BL6J (p<0,001 – Teste de Qui-Quadrado).

Na tentativa de mostrar se havia diferença na sensibilidade à convulsão em

fêmeas, usamos as doses de 10 e 12,5 mg/kg de ácido caínico em camundongas

Prnp

+/+

e ZPrnp

0/0

. A Figura 5B mostra que na dose de 12,5mg/Kg todas as fêmeas

Prnp

0/0

(10/10) tiveram convulsão e 90% (9/10) das ZPrnp

+/+

apresentaram este

fenótipo. Por outro lado, na dose de 10mg/Kg 100% (10/10) das fêmeas Z

Prnp

0/0

tiveram convulsão enquanto nenhuma (0/10) das ZPrnp

+/+

apresentaram este fenótipo

(p<0,001. – Teste de Qui-Quadrado). Portanto, tanto machos quanto fêmeas que não

expressam PrP

apresentam uma maior sensibilidade a convulsão induzida por ácido

caínico que animais tipo selvagem.

Legenda: (A) Camundongos machos das linhagens ZPrnp

0/0

, C57Bl6J, ZPrnp

+/+

e Tg20 foram

tratados com concentrações crescentes de KA via intraperitonial. Os valores representam a

porcentagem os animais que entraram em convulsão (pelo menos estágio III na escala de Racine). Os

números colocados ao lado de cada ponto representam o número de animais por grupo. (B)

Camundongas fêmeas das linhagens ZPrnp

0/0

e ZPrnp

+/+

foram tratadas com as concentrações

indicadas de KA como descrito em (A).

Figura 5 – Curva dose resposta de KA em animais ZPrnp

0/0

, C57Bl6J, ZPrnp

+/+

Tg20.

A seguir avaliamos uma segunda linhagem de animais knockout para o gene

Prnp denominada Edbg (MANSON et al. 1994). Os animais usados no experimento

são gerados a partir do acasalamento de dois heterozigotos para a depleção de

Prnp

gerando numa mesma prole os três genótipos – tipo selvagem (

EPrnp

+/+

), knockout

Prnp

-/-

) e heterozigoto (EPrnp

+/-

). Na Figura 6A avaliamos presença de convulsão

pela administração de 10 mg/Kg ácido caínico em machos e fêmeas com cada um

dos genótipos.

A avaliação de 15 machos E

Prnp

+/+

mostrou que apenas 7% (1/15) deles

apresentaram convulsão, enquanto que 20% (4/20) dos animais E

Prnp

+/-

e 73%

(11/15) dos animais E

Prnp

-/-

apresentaram este fenótipo. Resultados semelhantes

foram obtidos para as fêmeas onde 17% das E

Prnp

+/+

(2/12)

apresentavam convulsão

contra 35% (7/20) das

EPrnp

+/-

e 82% (14/17) das EPrnp

-/-

. A diferença entre animais

Prnp

+/+

e EPrnp

-/-

foi estatisticamente significativa (p=0,002 para machos e fêmeas

Teste de Qui-Quadrado). Entretanto, a comparação entre os animais E

Prnp

+/+

Prnp

+/-

não foi estatisticamente significativa (p=0,287 para machos e 0,274 para

fêmeas - Teste de Qui-Quadrado). Além disso, a presença de convulsão é

significativamente maior em animais E

Prnp

-/-

comparados aos animais EPrnp

+/-

(p =

0,003 para machos e 0,002 para fêmeas). Desta forma, os animais E

Prnp

-/-

apresentam chance 38,5 e 23,3 vezes (machos e fêmeas respectivamente) maior de

apresentarem convulsão quando comparados com os E

Prnp

+/+

. Da mesma forma, os

animais E

Prnp

-/-

apresentam 11,0 e 8,7 vezes mais risco de desenvolverem crises

convulsivas quando comparados com os camongongos E

Prnp

+/-

(machos e fêmeas

respectivamente). As Tabelas 3 a 6 mostram os cálculos estatísticos (RRE e p) de

cada grupo.

Tabela 3 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com KA usando o animal E

Prnp

+/+

como parâmetro.

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE p

Não Sim

EPrnp

+/+

14 (93,3%) 1 (6,7%) 1,0 -

EPrnp

-/-

4 (26,7%) 11 (73,3%) 38,5 0,002

EPrnp

+/-

16 (80,0%) 4 (20,0%) 3,5 0,287

Tabela 4 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com KA usando o animal E

Prnp

+/-

como parâmetro.

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE P

Não Sim

EPrnp

+/+

14 (93,3%) 1 (6,7%) 0,286 0,287

EPrnp

-/-

4 (26,7%) 11 (73,3%) 11,0 0,003

EPrnp

+/-

16 (80,0%) 4 (20,0%) 1,0 -

Tabela 5 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

fêmeas

tratadas com KA usando o animal E

Prnp

+/+

como parâmetro.

Tabela 6 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

fêmeas

tratadas com KA usando o animal E

Prnp

+/-

como parâmetro.

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE p

Não Sim

EPrnp

+/+

10 (83,3%) 2 (16,7%) 1,00 -

EPrnp

-/-

3 (17,6%) 14 (82,4%) 23,3 0,002

EPrnp

+/-

13 (65,0%) 7 (35,0%) 2,7 0,274

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE p

Não Sim

EPrnp

+/+

10 (83,3%) 2 (16,7%) 0,371 0,274

EPrnp

-/-

3 (17,6%) 14 (82,4%) 8,7 0,006

EPrnp

+/-

13 (65,0%) 7 (35,0%) 1,0 -

Esses dados estão de acordo com os obtidos para os animais ZPrnp

0/0

(Figura

5) e mostram que a remoção do gene

Prnp induz a uma maior sensibilidade à

convulsão independente do sexo e das cepas dos animais. Além disso, a presença de

apenas uma cópia do gene

Prnp é suficiente para resgatar o fenótipo de maior

sensibilidade a ácido caínico tanto nos machos como nas fêmeas.

Foram analisadas ainda as duas cepas de animais

knockouts pós-natal Tg46*

(que tem expressão de PrP

semelhante ao tipo selvagem) e Tg37* (que apresenta 3x

mais PrP

no cérebro) (Figura 4 e MALLUCCI et al. 2002). Todos os animais foram

avaliados após completarem 16 semanas uma vez que o gene

Prnp é “desligado”

entre a nona e décima segunda semanas pós-natal. Os animais foram genotipados e

desta forma separados em 2 grupos: CreTg46 ou CreTg37 (animais que deixaram de

expressar PrP

apenas nos neurônios, após 12 semanas) e comparados com animais

da mesma prole que não receberam a Cre recombinase e que portanto, continuam

expressando PrP

, respectivamente Tg46* e Tg37*. Na Figura 6B mostramos os

resultados obtidos com machos que receberam a dose de 10mg de ácido caínico/Kg.

A avaliação dos animais Tg46* mostrou que 58% deles (7/12) apresentaram

convulsão contra 80% (8/10) dos camundongos CreTg4 não havendo diferença

significativa entre estes grupos (p=0,277 Teste de Qui-Quadrado).

O tratamento da linhagem Tg37* com ácido caínico levou 27% dos

camundongos (3/11) à convulsão enquanto que 100% (10/10) dos animais da cepa de

knockout pós-natal correspondente, CreTg37, apresentam este fenótipo. A análise

dos dados mostrou que os animais que deixam de expressar PrP

apenas nos

neurônios no período pós-natal CreTg37 apresentam uma sensibilidade maior ao

ácido caínico do que seus respectivos controles Tg37* que mantêm a expressão desta

proteína (p=0,001).

Sabe-se que os animais Tg37 expressam três vezes mais PrP

que os Tg46

(Figura 4 e MALLUCCI et al. 2002), entretanto nenhuma diferença entre a

sensibilidade a ácido caínico foi encontrada entre estes grupos (Figura 6B) (p=0,133

teste de Qui-Quadrado).

Legenda: (A) Camundongos machos ou fêmeas das linhagens EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

ou (B)

machos das linhagens Tg46*, CreTg46, Tg37* e CreTg37 foram tratados com 10mg/kg de KA via

intraperitonial. Os valores representam a porcentagem os animais que entraram em convulsão (pelo

menos estágio III na escala de racine). Os números colocados abaixo das barras representam o número

de animais por grupo. A análise estatística foi feita usando Teste de Qui-Quadrado e os valores de

p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Figura 6 – Convulsão induzida por KA nas linhagens EPrnp e knockouts pós-natal.

4.3 DESCRIÇÃO DA SEMILOGIA DAS CRISES CONVULSIVAS

Todos os animais formam observados por 120 minutos após a injeção da

droga e tiveram suas crises classificadas pela escala de racine. Os resultados estão

colocados na tabela 7.

Nas cepas Z

Prnp

+/+

, ZPrnp

0/0

e C57/BL6J as convulsões foram caracterizadas

por uma seqüência de manifestações comportamentais progressivas na escala de

Racine de I a V. Nestes grupos todos os animais atingiram a escala V de Racine,

tendo crises límbicas generalizadas.

Dos animais Z

Prnp

+/+

que tiveram convulsão (n=38), 97% entraram em

Status Epileticus, sendo o primeira manifestação clínica num tempo médio de 47 min

após a injeção da droga e apresentaram crises recorrentes durante o período de

observação. Dos animais C57/BL6J que tiveram convulsão (n=13), o tempo médio

para a primeira manifestação convulsiva foi de 52 min. após a injeção da droga,

100% deles entraram em

Status Epileticus e tiveram crises recorrentes durante o

período de observação. Dos animais Z

Prnp

0/0

que apresentaram convulsão (n=50),

96% entraram em

Status Epileticus, a primeira manifestação foi em média após 36

min da injeção da droga e tiveram crises recorrentes durante o período de

observação.

Os animais Tg20 que convulsionaram não seguiram o padrão da escala de

Racine. Todos iniciaram a primeira manifestação já no estágio V, em um tempo

médio de 63 min. Os 6 animais que convulsionaram entraram em

Status Epileticus,

sendo que um morreu após sucessivas crises generalizadas. Além disso, dois animais

analisados na dose 25mg/Kg que não haviam convulsionado, morreram menos de 24

h após o experimento.

Nas cepas E

Prnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

as convulsões foram caracterizadas

por uma seqüência de manifestações comportamentais progressivas na escala de

Racine de I a V. Dos 3 animais E

Prnp

+/+

que tiveram convulsão, 66% entraram em

Status Epieticus e tiveram crises recorrentes durante o período de observação. Dois

animais deste grupo atingiram a escala V de Racine e um deles permaneceu na escala

III. O tempo médio para a primeira manifestação clínica foi de 53 min. Dos animais

Prnp

-/-

que apresentaram convulsão (n=25), 88% entraram em Status Epileticus e

tiveram crises recorrentes durante o período de observação. Neste grupo 19 animais

atingiram a escala V de Racine, enquanto que 6 animais permaneceram no estágio

III. O tempo médio para a primeira manifestação clinica foi de 50 min. Dos 11

animais E

Prnp

+/-

que tiveram convulsão, 72% entraram em Status Epileticus e

tiveram crises recorrentes durante o período de observação. Neste grupo 9 animais

atingiram a escala V de Racine, e 2 animais permaneceram no estágio III. O tempo

médio para a primeira manifestação clínica foi de 55 min.

Dos animais CreTg46 que apresentaram convulsão (n=8) 100% entraram em

Status Epileticus, sendo a primeira manifestação clínica num tempo médio de 36 min

após a injeção da droga e apresentaram crises recorrentes durante o período de

observação. Já o seu respectivo controle Tg46, dos animais que apresentaram

convulsão (n=7) 100% entraram em

Status Epileticus, sendo a primeira manifestação

clínica num tempo médio de 40 min após a injeção da droga e apresentaram crises

recorrentes durante o período de observação.

Dos animais CreTg37 que apresentaram convulsão (n=10), 100% entraram

Status Epileticus, sendo a primeira manifestação clínica num tempo médio de 39

min após a injeção da droga e apresentaram crises recorrentes durante o período de

observação. Já os seus respectivos controles Tg37, que apresentaram convulsão

(n=3) 100% entraram em

Status Epileticus, sendo a primeira manifestação clínica

num tempo médio de 40 min após a injeção da droga e apresentaram crises

recorrentes durante o período de observação.

Nos grupos de animais Tg37*, Tg46*, CreTg37 e CreTg46 as convulsões

foram caracterizadas por uma seqüência de manifestações comportamentais

progressivas na escala de Racine de I a V, sendo que todos os animais que

apresentaram convulsão atingiram a escala V de Racine, tendo crises límbicas

generalizadas.

Tabela 7 - Descrição da semiologia das crises convulsivas induzidas pelo tratamento

com KA nos camundongos usados neste estudo.

Animais

Dose de ácido

caínico (mg/kg)

Número de

animais com

convulsão

% Status

Epileticus

Tempo médio da

primeira crise

(min.)

Observações

ZPrnp

+/+

10, 12,5 e 15 38 97 47

C57Bl6J

10 e 12,5 13 100 52

ZPrnp

0/0

5, 7,5 e 10 50 96 36

Tg20

25 6 100 63 Direto ao estágio V

3 óbitos em 24 horas

EPrnp

+/+

10 3 66 53 2 no estágio V

1 no estágio III

EPrnp

-/-

10 25 88 50 19 no estágio V

6 no estágio III

EPrnp

+/-

10 11 72 55 9 no estágio V

2 no estágio III

CreTg37

10 10 100 39

Tg37*

10 3 100 40

CreTg46

10 8 100 36

Tg46*

10 7 100 40

4.4 MODELO DE CONVULSÃO INDUZIDA QUIMICAMENTE POR

PENTILENOTETRAZOL EM CAMUNDONGOS

A sensibilidade a convulsão foi avaliada em todos os animais descritos

anteriormente utilizando 40mg PTZ/Kg animal. A Figura 7A mostra os experimentos

nos animais tipo selvagem - Z

Prnp

+/+

e C57/BL6J, animais nocaute (ZPrnp

0/0

) e

Tg20, todos machos. Nos animais Z

Prnp

+/+

, foram analisados 13 animais, sendo que

92% deles apresentaram convulsão com 23% de mortalidade. Nos animais C57/BL6J

foram analisados 10 animais dos quais 90% convulsionaram, e destes, 20%

morreram. Foram avaliados 13 animais Z

Prnp

0/0

onde 100% convulsionaram e 85%

deles morreram. Não houve diferença significativa quanto ao aparecimento de

convulsão entre estes grupos. Entretanto os animais Z

Prnp

0/0

apresentam um risco

18,33 vezes maior de morte após crise convulsiva que os Z

Prnp

+/+

(Tabelas 8 e 9;

p=0,004, teste de Qui-Quadrado).

No grupo de Tg20, apenas 10% dos animais convulsionaram (n=10) e

nenhum animal morreu. Portanto, estes animais apresentam uma maior resistência à

convulsão que os animais tipo selvagem Z

Prnp

+/+

ou C57/Bl6J (p<0,001, teste de

Qui-Quadrado).

A Figura 7B mostra o experimento de convulsão induzida por PTZ com

animais

Edbg machos. Foram analisados 16 animais EPrnp

+/+

, dos quais 25%

convulsionaram e 6% morreram. Dos 16 animais E

Prnp

-/-

100% convulsionaram e

destes 47% morreram. Dos 25 animais E

Prnp

+/-

, 40% tiveram convulsão e 16%

destes morreram. Analisando o parâmetro convulsão, as diferenças entre os animais

Prnp

+/+

e EPrnp

-/-

e entre EPrnp

+/-

e EPrnp

-/-

foram estatisticamente significativas

(p<0,001 para os dois grupos) e entre E

Prnp

+/+

e EPrnp

+/-

a diferença não foi

estatisticamente significativa (p=0,742, teste de Qui-Quadrado).

Quando o parâmetro analisado foi morte, vemos que à semelhança do

observado para convulsão, os animais E

Prnp

-/-

apresentaram um risco 12,6 vezes

maior de ir a óbito após a convulsão do que os E

Prnp

+/+

(tabela, 10; p = 0,03) e 4,2

vezes maior se comparados aos

EPrnp

+/-

(tabela 11, p = 0,037). Não houve diferença

entre a mortalidade dos animais E

Prnp

+/+

e EPrnp

+/-

(tabelas 10 e 11; p = 0,40).

Na Figura 7C foram avaliados animais

knockout condicionais e respectivos

controles, todos machos na dose de 40mg de PTZ/Kg de animal. Dos 11 animais

CreTg46 analisados, todos convulsionaram e 20% foram a óbito e igualmente 100%

dos animais Tg46* (n=10), convulsionaram e 20% morreram. Portanto, não houve

diferenças quanto à convulsão ou morte (tabela 12; p = 0,69) entre estes dois grupos.

Já na linhagem de

knockout pós-natal Tg37*, 60% dos animais convulsionaram e

10% deles morreram (n=10) enquanto que o animal CreTg37 que deixou de

expressar PrPP

nos neurônios, 100% dos camundongos convulsionaram e 75%

morreram (n=12). Desta forma, este último animal

knockout condicional apresenta

maior sensibilidade à convulsão (p = 0,001) e um risco 27 vezes maior de morte após

convulsão que os seu respectivos controle (Tabela 13; p=0,008). Não existem

diferenças entre os animais Tg46* e Tg37* quanto às convulsões (p=0,087) e

mortalidade por PTZ (tabelas 12 e 13; p = 0,53).

Este grupo de resultados mostra que independente do

background genético e

da construção feita para a remoção do gene

Prnp, animais que não expressam PrP

são mais susceptíveis à convulsão induzida farmacologicamente. Além disso, uma

vez que animais que deixam de expressar PrP

apenas em neurônios no período pós-

natal também apresentam maior sensibilidade a convulsões, podemos admitir que

este fenótipo envolve um mau funcionamento neuronal.

Legenda: (A) Camundongos machos das linhagens ZPrnp

+/+

, ZPrnp

0/0

C57Bl6J e Tg20 (B) EPrnp

+/+

EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

ou (C) Tg46*, Cre-Tg46, Tg37* e Cre-Tg37 foram tratados com 40mg/kg de PTZ

via intraperitonial. Os valores representam a porcentagem os animais que entraram em convulsão

(pelo menos estágio III na escala de racine) ou a mortalidade . Os números colocados abaixo das

barras representam o número de animais por grupo. A análise estatística foi feita usando o Teste de

qui-quadrado e os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Figura 7 – Convulsão induzida por PTZ em diferentes linhagens de camundongos

knockout para Prnp ou transgênicos que superexpressam Prnp.

Tabela 8 - Análise estatística dos animais ZPrnp

+/+

, ZPrnp

0/0

e C57/BL6J machos

tratados com PTZ que morreram usando o animal Z

Prnp

+/+

como parâmetro.

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE p

Não Sim

ZPrnp

+/+

10 (76,9%) 3 (23,1%) 1,0 -

ZPrnp

0/0

2 (15,4%) 11 (84,6%) 18,33 0,004

C57/BL6J 8 (80,0%) 2 (20%) 0,833 0,859

Tabela 9 - Análise estatística dos animais ZPrnp

+/+

, ZPrnp

0/0

e C57/BL6J machos

tratados com PTZ que morreram usando o animal C57/BL6J como parâmetro.

Tipo de Animal Convulsão (%) RRE p

Não Sim

ZPrnp

+/+

10 (76,9%) 3 (23,1%) 1,2 0,859

ZPrnp

0/0

2 (15,4%) 11 (84,6%) 22,0 0,005

C57/BL6J 8 (80,0%) 2 (20%) 1,0 -

Tabela 10 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com PTZ que morreram usando o animal E

Prnp

+/+

como parâmetro.

Tipo de Animal ÓBITO (%) RRE p

Não Sim

EPrnp

+/+

14 (93,3%) 1 (6,7%) 1,0 -

EPrnp

-/-

8 (53,3%) 7 (46,7%) 12,25 0,03

EPrnp

+/-

21 (84,0%) 4 (16,0%) 2,67 0,40

Tabela 11 - Análise estatística dos animais EPrnp

+/+

, EPrnp

-/-

e EPrnp

+/-

machos

tratados com PTZ que morreram usando o animal E

Prnp

+/-

como parâmetro.

Tipo de Animal ÓBITO (%) RRE p

Não Sim

EPrnp

+/+

14 (93,3%) 1 (6,7%) 0,375 0,40

EPrnp

-/-

8 (53,3%) 7 (46,7%) 4,59 0,043

EPrnp

+/-

21 (84,0%) 4 (16,0%) 1,0 -

Tabela 12 - Análise estatística dos animais nocautes pós-natal e seus respectivos

controles machos tratados com PTZ que morreram usando o animal Tg46* como

parâmetro.

Tipo de Animal ÓBITO (%) RRE p

Não Sim

Tg 46 * 8 (80,0%) 2 (20,0%) 1,00 -

CreTg46 8 (72,7%) 3 (27,3%) 1,5 0,69

Tg 37* 9 (90%) 1 (10,0%) 0,44 0,53

CreTg37 3 (25,0%) 9 (75,0%) 12,0 0,016

Tabela 13 - Análise estatística dos animais nocautes pós-natal e seus respectivos

controles machos tratados com PTZ que morreram usando o animal CreTg37 como

parâmetro.

Tipo de Animal ÓBITO (%) RRE P

Não Sim

Tg 46 * 8 (80,0%) 2 (20,0%) 2,2 0,53

CreTg46 8 (72,7%) 3 (27,3%) 3,3 0,33

Tg 37* 9 (90%) 1 (10,0%) 1,00 1,00

CreTg37 3 (25,0%) 9 (75,0%) 27,0 0,008

5 RESULTADOS II - HUMANOS

5.1 PADRONIZAÇÃO DA TÉCNICA DE DHPLC

(CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE FASE REVERSA

DENATURANTE) PARA DETECÇÃO DE POLIMORFISMOS NO

GENE PRNP

O uso da técnica de DHPLC é muito vantajoso para a detecção de variantes

alélicas nos genes de interesse e representa um ganho importante por ser uma técnica

mais rápida e menos dispendiosa que o seqüenciamento (XIAO e OEFNER 2001). A

técnica foi empregada para analisar 553 amostras de DNA humanos.

Na padronização da técnica de DHPLC para a pesquisa de polimorfismos no

gene de

PRNP foram modificamos os iniciadores utilizados inicialmente no

seqüenciamento. Para as reações de seqüenciamento a seqüência aberta de leitura

(ORF) de

PNRP era dividida em duas metades que se sobrepunham na região central.

Desta forma, o códon 129 estava contemplado quando se seqüenciava cada uma das

metades. A mudança visou diminuir a sobreposição destes dois fragmentos de tal

forma que se excluísse o códon 129, altamente polimórfico da segunda metade

amplificada da ORF de

PRNP. Desta maneira a presença deste polimorfismo não

interferiria na detecção, por exemplo, de polimorfismos no códon 171.

Os produtos de PCR obtidos da amplificação de

PRNP com estes dois novos

pares de iniciadores foram submetidos a uma análise cromatográfica (DHPLC). Os

detalhes a respeito desta técnica e os perfis de saída do DHPLC são mostrados no

trabalho realizado pelo nosso grupo (CASTRO et al. 2004).

As amostras foram inicialmente avaliadas quanto à qualidade de amplificação

numa reação realizada a 50ºC, como pode ser visto na Figura 8. Nesta temperatura já

é possível verificar a presença de alterações que envolvam deleções ou inserções,

neste caso a depleção de um

octarepeat (indicado por uma seta), presente em

aproximadamente 10% da população.

Em seguida as amostras foram analisadas para se verificar a presença ou não

de polimorfismos e mutações. Como pode ser visto na Figura 9, nesta análise feita a

65ºC, foram encontrados cromatogramas específicos para o polimorfismo no códon

129 em heterozigose (M129V) e em homozigoze que apresenta um pico único. Esta

sida de pico único pode representar uma amostra M129M ou V129V. Todas as

amostras que apresentam este perfil único de saída são misturadas a um DNA

protótipo no caso M129M. Se o cromatograma obtido então continuar sendo de um

pico único, comprovamos a presença de metionina em homozigose no códon 129

para esta amostra. Caso o perfil obtido seja semelhante ao da amostra M129V,

comprovamos que a amostra que inicialmente tinha um pico único era de um

homozigoto V129V.

É possível ainda verificarmos que o perfil obtido pelo cromatograma é

bastante específico e pode determinar a presença de mais que um polimorfismo na

mesma seqüência. No caso o perfil intermediário na Figura 9 representa um

polimorfismo silencioso no códon 117 associado à heterozigoze no códon 129.

A especificidade do padrão dos picos está também apresentada na Figura 10

onde vemos a presença de um polimorfismo silencioso no códon 124 (G124G). Este

padrão foi determinado depois da publicação do artigo de CASTRO et al. (2004). A

Figura 11 mostra o perfil obtido para o produto amplificado do fragmento

correspondente à segunda metade da ORF do gene

PRNP. Nesta análise feita a 61ºC,

podemos verificar a presença do polimorfismo do códon 171 (N171S) em

heterozigose quando comparado a uma amostra selvagem.

B20

B21

PRNP 1 -50.C

Time (Minutes)

654

Legenda: Exemplo de cromatograma obtido por DHPLC em uma análise realizada a 50

C do produto

amplificado da primeira metade de PRNP, demonstrando que a amplificação foi de boa qualidade.

Nesta temperatura já é possível detectar alterações maiores na seqüência amplificada como a amostra

que possui depleção de um octarepeat em heterozigose (indicado por uma seta).

Figura 8 – Perfil de DHPLC para o protótipo e depleção de um octarepeat em

PRNP.

Absorb (mV)ance

B20

B23

B28

PRNP 1 -65.C

Time (Minutes)

654

Absorbance (mV)

M129V

A117A sil + M129V

Homozigota

Legenda: Exemplo de cromatograma do DHPLC em uma análise realizada a 65

C do produto

amplificado da primeira metade de PRNP. Neste cromatograma, pode-se verificar que uma amostra

homozigota, uma que possui o polimorfismo no códon 129 em heterozigoze (M129V) e ainda uma

amostra com o polimorfismo no códon 129 associado ao polimorfismo silencioso do códon 117

(A117A sil).

Figura 9 – Perfil de DHPLC das variantes alélicas A117A sil e M129V de PNRP.

B26

B27

PRNP 1 -65.C

Time (Minutes)

654

Absorbance (mV)

B26

B27

PRNP 1 -65.C

Time (Minutes)

654

Absorbance (mV)

M129V

G124G

Legenda: Exemplo de cromatograma do DHPLC com as amostras analisadas a 65

C do produto

amplificado da primeira metade de PRNP onde se verificou a presença de uma alteração no códon 124

- polimorfismo silencioso G124G.

Figura 10 - Perfil de DHPLC das variantes alélicas G124G sil. e M129V de PRNP.

EPI 20

EPI 31

PRNP 2 -61.C

Time (Minutes)

654

Legenda: Exemplo de cromatograma obtido por DHPLC em uma análise realizada a 61

C do

produto amplificado da segunda metade de PRNP. Neste cromatograma, pode-se comparar o perfil

encontrado de uma amostra selvagem, sem alteração com uma amostra onde foi encontrada a variante

alélica N171S.

Figura 11 - Perfil de DHPLC da variante alélica N171S de PRNP.

bsorban V)ce (m

PRNP 2 -61.C

EPI 20

EPI 31

Time (Minutes)

654

A an V)bsorb ce (m

N171N

N171S

Durante a padronização da técnica de DHPLC todos os perfis obtidos para os

diferentes polimorfismos e mutações eram confirmados também por sequenciamento

e digestão por endonucleases. A enzima foi usada principalmente para a confirmação

dos casos com alteração silenciosa no códon 117.

A Figura 12 mostra os esferogramas obtidos para amostras M129M, M129V

e V129V e a Figura 13 mostra os padrões para os polimorfismos N171N e N171S.

B C

Legenda: Eletroesferogramas específicos obtidos do seqüenciamento da região do códon 129 de

PRNP. Na figura A, apresenta uma amostra M129M, na figura B, uma amostra com a variante M129V

e na figura C, uma amostra com a variante V129V.

Figura 12 - Eletroesferogramas do seqüenciamento de PRNP na região do códon

129.

A B

Legenda: Eletroferogramas específicos obtidos do seqüenciamento da região do códon 171 de PRNP.

Na figura A, apresenta uma amostra N171N e na figura B, uma amostra N171S.

Figura 13 - Eletroesferogramas do seqüenciamento de PRNP na região do códon

171.

Numa terceira abordagem para reforçar os resultados obtidos nas duas

técnicas usadas acima utilizamos endonucleases específicas (Figura 14). A digestão

da ORF de

PRNP com a endonuclease PvuII (Figura 14A) gera duas bandas na

seqüência protótipo de 331 e 466 pares de bases (linha 2). A linha 3 mostra uma

amostra não digerida e a linha 4 a presença de um polimorfismo silencioso em

heterozigose no códon 117 (GCA por GCG), onde um dos alelos perde o sítio de

clivagem para esta enzima, o que leva a ocorrência de uma terceira banda

equivalente ao produto não clivado.

Já a digestão pela enzima NspI que reconhece o códon 129 está mostrada na

Figura 14B. As amostras de indivíduos homozigotos M129M apresentam 3 bandas,

uma de 366, outra de 356 e uma última de 75 pb (linha 2). A presença do alelo

polimórfico no códon 129 (ATG-GTG) abole um dos sítios de restrição, gerando

uma banda de 430 pb e a perda da banda de 75 pb. A linha 3 mostra a digestão de um

DNA que possui o polimorfismo do códon 129 em heterozigose e a linha 4 uma

amostra V129V em homozigose.

A digestão pela endonuclease BbvI , vista na Figura 14C, identifica variantes

alélicas no códon 171. A seqüência contendo AAC em homozigose no códon 171

(N171N) gera 3 fragmentos de 251, 206 e 95pb (linha 2), enquanto a presença do

alelo polimórfico (N171S – AAC - AGC) cria um novo sítio resultando em novos

fragmentos de 166 e 46 pb (linha 3).

Portanto, o emprego destas três técnicas assegura a avaliação adequada dos

polimorfismos no gene

PRNP.

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

800bp

500bp

400bp

300bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3 4

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

400bp

300bp

200bp

100bp

1 2 3

Legenda Análise dos polimorfismos na seqüência de PRNP usando enzimas de restrição. A ORF do

gene PRNP foi amplificada e digerida com enzimas de restrição. (A) PvuII, linha 1 = controle de

100pb, linha2 = amostra sem o polimorfismo no códon 117, linha 3 = controle da digestão sem o uso

da enzima (uncut) e linha 4 = amostra de um portador do polimorfismo silencioso no códon 117. (B)

NspI, linha 1 = controle de 100pb, linha 2 = amostra M129M, linha 3 = amostra M129V e linha 4 =

amostra V129V. (C) BbvI, linha 1 = controle de 100pb, linha 2 = amostra N171N, linha 3 = amostra

N171S.

Figura 14 - Digestão da ORF de PRNP com enzimas de restrição para caracterização

de variantes alélicas nos códons 117, 129 e 171.

5.2 AVALIAÇÃO DE POLIMORFISMOS NO GENE PRNP EM

PACIENTES PORTADORES DE SÍNDROMES EPILÉTICAS E EM

INDIVÍDUOS NORMAIS

A prevalência dos polimorfismos no gene

PRNP de pacientes portadores de

epilepsia (n = 270) foi comparada com a observada nos controles (N = 202). Os

resultados desta análise são apresentados na tabela 14. A freqüência observada do

genótipo Ala/Ala

sil

do códon 117 foi de 4,5% nos controles e 6,7% nos pacientes

(p=0,31). Da mesma forma não houve diferença estatisticamente significativa na

freqüência observada na alteração do códon 171 (N171S) entre controles (0%) e

pacientes (1,5%) (p=0,14). Houve uma tendência para maior prevalência da depleção

octarepeat entre os pacientes quando comparado aos controles, após o ajuste para

sexo e genótipo no códon 117 e 129. Quando analisado o códon 129, observou-se

que os pacientes apresentaram um risco relativo estimado (RRE) para a presença do

alelo variante em homozigose (V129V) cerca de 3 vezes maior que o grupo controle

(IC 95% 1,36 – 6,55). O ajuste para sexo e genótipo do 117 e depleção do

octarepeat não modificou o resultado (p = 0,007).

Na tabela 15 são apresentadas as prevalências dos alelos variantes em

pacientes com epilepsia focal. A freqüência observada do genótipo Ala/Ala

sil

códon 117 foi de 6,5% entre os pacientes, semelhante à observada no grupo controle

(p=0,40). Também a prevalência da depleção do

octarepeat entre pacientes com

epilepsia focal (8,3%) foi semelhante à observada nos controles (p = 0,19).

Após o ajuste houve uma tendência para uma maior freqüência do genótipo

V129V entre pacientes com epilepsias focais quando comparados aos controles

(RRE de 2,67, IC95% 1,13-6,34, p = 0,02). Não houve diferença estatisticamente

significativa na freqüência observada do genótipo no códon 171 entre controles (0%)

e pacientes (1,8%), (p = 0,10).

A freqüência de variantes alélicas de

PRNP observada entre pacientes

portadores de epilepsias generalizadas primárias ou idiopáticas está apresentada na

tabela 16. Após o ajuste, não houve diferença nas freqüências das variantes alélicas

PRNP dos códons 117, 129 e 171 entre pacientes e controles (p>0,15). Entretanto,

houve uma tendência para maior prevalência da depleção do

octarepeat no grupo de

pacientes (RRE 2,82, IC 95% 0,89 – 8,91, p = 0,08) em comparação aos controles.

Portanto, a amostra analisada de pacientes com epilepsia apresenta uma maior

freqüência da variante alélica V129V quando comparado com o grupo controle. Esta

observação é mantida quando se avalia o subgrupo de pacientes com epilepsias

focais, mas não se confirma no grupo de pacientes com epilepsias generalizadas ou

idiopáticas.

Tabela 14 - Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95% para

epilepsia (n= 270) de acordo com a presença das variantes alélicas do gene

PRNP.

Expostos (%) RRE Bruto RRE Ajustado

Códon Genótipo

Controles

N = 202 (%)

Casos

N = 270

RRE (IC 95%)

Nível de

“p”

RRE (IC 95%)

Nível de

“p”

117 Ala/Ala 193 (95,5) 252 (93,3)

1,0 1,0

Ala/Ala

sil

9 (4,5) 18 (6,7)

1,53 (0,67 – 3,48) 0,31 1,48 (0,63 – 3,45)

0,36

Met/Met 112 (55,4) 129 (47,8) 1,0 1,0

129 Met/Val 81 (40,1) 110 (40,7) 1,18 (0,84 – 1,73) 0,40

1,16 (0,78 – 1,72)

0,45

Val/Val 9 (4,5) 31 (11,5) 2,99 (1,36 – 6,55) 0,006 2,98 (1,35 – 6,58)

0,007

171 Asn/Asn 202 (100) 266 (98,5) 1,0

Asn/Ser 0 4 (1,5) N.A. 0,14 N.A. N.A.

Depleção Ausente 192 (95) 243 (90) 1,0 1,0

OctaR Presentee 10 (5) 27 (10) 2,13 (1,0 – 4,51) 0,15 2,23 (1,04 – 4,74)

0,04

a = RRE ajustado para sexo, genótipo do códon 129 e presença da depleção do octarepeat.

b = RRE ajustado para sexo, genótipo do códon 117 e presença da depleção do octarepeat.

c = RRE ajustado para sexo, genótipos dos códons 117 e 129.

Tabela 15 - Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95% para epilepsia

focal (n = 168) de acordo com as variantes alélicas do gene PRNP.

Expostos (%) Bruto RRE Ajustado

Códon Genótipo

Controles

N = 202 (%)

Casos

N = 168

RRE (IC 95%)

Nível de

“p”

RRE (IC 95%)

Nível de

“p”

117 Ala/Ala 193 (95,5) 157 (93,5) 1,0 1,0

Ala/Ala

sil

9 (4,5) 11 (6,5) 1,5 (0,61 – 3,72) 0,40 1,44 (0,57 – 3,64)

0,44

Met/Met 112 (55,4) 79 (47,0) 1,0 1,0

129 Met/Val 81 (40,1) 72 (42,9) 1,26 (0,82 – 1,94) 0,29 1,25 (0,81 – 1,94)

0,31

Val/Val 9 (4,5) 17 (10,1) 2,68 (1,14 – 6,31) 0,02 2,67 (1,13 – 6,34)

0,02

171 Asn/Asn 202 (100) 165 (98,2) 1,0

Asn/Ser 0 (0) 3 (1,8) N.A. 0,10 N.A. N.A.

Depleção Ausente 192 (95) 154 (91,7) 1,0 1,0

OctaR Presente 10 (5) 14 (8,3) 1,74 (0,75 – 4,04) 0,19 1,78 (0,76 – 4,16)

0,18

a = RRE ajustado para sexo e genótipo do códon 129 e presença da depleção do octarepeat.

b = RRE ajustado para sexo e genótipo do códon 117 e presença da depleção do octarepeat.

c = RRE ajustado para sexo e genótipos dos códons 117 e 129.

Tabela 16 - Risco Relativo Estimado (RRE) e intervalo de confiança de 95% para

epilepsia generalizada idiopática (n = 40) de acordo com a presença das variantes

alélicas do gene

PRNP.

Expostos (%) Bruto RRE Ajustado

Códon Genótipo

Controles

N = 202 (%)

Casos

N = 40

RRE (IC 95%)

Nível

de “p”

RRE (IC 95%)

Nível de

“p”

117 Ala/Ala 193 (95,5) 9 (4,5) 1,0 1

Ala/Ala

sil

9 (4,5) 4 (10) 2,38 (0,67 – 8,16) 0,17 2,50 (0,71 – 8,73)

0,15

Met/Met 112 (55,4) 19 (47,5) 1,0 1,0

129 Met/Val 81 (40,1) 19 (47,5) 1,38 (0,89 – 2,78) 0,36 1,23 (0,60 – 2,53)

0,57

Val/Val 9 (4,5) 2 (5) 1,31 (0,26 – 6,54) 0,74 1,15 (0,22 – 5,90)

0,87

171 Asn/Asn 202 (100) 40 (100) N.A. N.A.

Asn/Ser 0 (0) 0 (0) N.A. N.A.

Depleção Ausente 192 (95) 35 (87,5) 1,0 1,0

Octa R Presente 10 (5) 5 (12,5) 2,74 (0,88 – 8,51) 0,08 2,82 (0,89 – 8,91)

0,08

a = RRE ajustado para sexo, genótipo do códon 129 e presença da depleção do octarepeat.

b = RRE ajustado para sexo, genótipo do códon 117 e presença da depleção do octarepeat.

c = RRE ajustado para sexo e genótipos dos códons 117 e 129.

6 DISCUSSÃO I

Nos últimos anos tem se discutido muito a relevância biológica de PrP

, e o

uso de animais geneticamente modificados no gene

Prnp tem trazido muitas

evidências relevantes no conhecimento desta proteína. Há alguns anos se descrevem

alterações comportamentais nestes animais, entretanto dados observados por alguns

grupos não foram reproduzidos por outros. Além disso, existe uma grande discussão

sobre o controle adequado do

background genético dos animais e a forma com que a

depleção do gene foi executada. Vale lembrar que o terceiro animal

knockout para o

gene

Prnp gerado desenvolvia ataxia e degeneração de células de Purkinje no

cerebelo com 8 semanas pós-natal (SAKAGUCHI et al. 1996). De fato, foi

posteriormente demosntrado que a ataxia não era ocasionada pela retirada de

Prnp,

mas pela superexpressão de Doppel (Dpl), um gene que está localizado 16Kb

downstream de Prnp (MOORE et al. 1999). O promotor deste gene é muito fraco em

cérebro, mas quando a depleção de

Prnp estende-se ao terceiro exon, que é o caso

destes animais e não daqueles gerados por BÜELER et al. (1992) e MANSON et al.

(1994), o sítio aceptor de

splicing é removido, levando a geração de um mRNA

quimérico contendo os dois exons não codificantes de

Prnp e o exon do gene de Dpl.

Nestas condições Dpl passa a estar sobre controle do promotor de

Prnp e, portanto,

altamente expresso no cérebro causando morte neuronal particularmente no cerebelo

por mecanismos ainda pouco conhecidos (MOORE et al. 1999; LI et al. 2000).

Portanto, no presente trabalho estudamos um dos fenótipos mais expressivos

observados nos animais

knockout de Prnp que é seu baixo limiar a convulsões

induzidas farmacologicamente (WALZ et al. 1999). Nossa estratégia principal e

inédita na literatura foi verificar se este fenótipo era mantido em diferentes linhagens

de animais

knockout para Prnp e se ele tinha uma relação direta com as

concentrações de PrP

. Esta abordagem dá, portanto, mais credibilidade aos

resultados de maneira que eles não sejam interpretados como um evento ocasional

presente esporadicamente numa determinada linhagem de camundongos.

Nossos dados mostram que a sensibilidade aos agentes convulsivantes

manteve-se em todos os animais

knockouts utilizados no estudo, mostrando que não

se tratava de um evento linhagem específico associado ao tipo de depleção ou

backgroud genético. Além disso, o comportamento surpreendente do animal Tg20

frente às drogas usadas neste trabalho e o fato do animal heterozigoto resgatar o

fenótipo do camundongo

knockout, mostram que PrP

tem um papel protetor contra a

indução de crise convulsiva causada farmacologicamente.

Um importante modelo usado neste trabalho foram os

knockouts condicionais

pós-natal CreTg37 e CreTg46, onde a primeira linhagem apresentou o mesmo padrão

de sensibilidade à convulsão que os animas

knockouts constitutivos ZPrnp

0/0

Prnp

-/-

. Portanto, mostrando que o fenótipo alterado não depende de alterações

ocorridas durante a embriogênese, mas de um mau funcionamento neuronal.

Entretanto, apesar dos animais

knockouts CreTg46 apresentarem uma tendência à

maior sensibilidade à convulsão que seus respectivos controles Tg46*, as diferenças

não foram significativas. Desta forma, é importante tentarmos entender o porquê das

diferenças entre estas duas linhagens de

knockouts condicionais com relação à

sensibilidade aos agentes convulsivantes.

As linhagens Tg46* e Tg37* diferem entre si por uma maior expressão (cerca

de 3 vezes, Figura 4) de PrP

na última. Esperávamos que a linhagem Tg37 fosse

mais resistente às convulsões que a Tg46 à semelhança do que vimos entre os Tg20 e

seu controle. Entretanto, elas respondem aos agentes convulsivantes da mesma

forma. Talvez seja necessária uma diferença bastante alta na concentração de PrP

entre os grupos para que o efeito protetor seja detectado. No caso dos Tg20 ela é

mais que 6vezes maior que a do animal controle e no caso dos Tg37 ela é de 3 vezes

a de Tg46. Esta hipótese é reforçada pelo fato de não encontrarmos diferenças entre

animais tipo selvagem e aqueles onde há só uma cópia do gene

Prnp (EPrnp

+/-

)e que,

portanto expressam metade da concentração de PrP

(Figura 4)

Além disso, os animais

knockout CreTg46 não apresentam diferença na

sensibilidade à convulsão quando comparados ao seu controle tipo selvagem Tg46*

contrariamente ao encontrado entre os

knockout CreTg37 versus Tg37*. Uma das

possibilidades para se explicar este resultado seria que tanto a quantidade de PrP

expresso quanto a sua presença em neurônios e nas células da glia podem participar

de forma aditiva neste efeito protetor. Por exemplo, é sabido que astrócitos de

animais

knockout para PrPP

apresentam uma menor captação de glutamato (BROWN

et al. 1999). Portanto nos animais

knockouts constitutivos, as diferenças quanto à

sensibilidade à convulsão podem ser uma somatória do mau funcionamento tanto dos

neurônios como das células da glia. No caso do animal CreTg46 a depleção de PrP

apenas nos neurônios não causou impacto suficiente que permitisse apresentação de

fenótipo no teste aplicado. Por outro lado, o animal CreTg37 também teve depleção

de PrP

só em neurônios mas isso somado a alta expressão de PrP

no seu controle

Tg37* permitiu o aparecimento do fenótipo.

É interessante ainda observar que os animais controle das linhagens ZrchI

(ZPrnp

+/+

), os C56Bl/6J e os knockouts condicionais Tg46* e Tg37* desenvolvem

convulsão igualmente quanto tratados com a mesma dose de PTZ, isto é quase todos

os animais apresentam convulsão. Por outro lado, os camundongos da linhagem

Edbg (E

Prnp

+/+

) são bem mais resistentes às crises. Neste caso, o background

genético destes animais (dominantemente C57Bl/10) pode ser o responsável pela

diferença. Desta forma, apenas a linhagem de animais Edbg permitiu que se

observassem diferenças quanto a maior sensibilidade a convulsão induzida por PTZ

quanto camundungos

knckouts para Prnp quando comparados ao controle.

O tratamento com PTZ leva a uma alta mortalidade em decorrência de uma

convulsão tônica evoluindo para parada cardiorespiratória (WALZ et al. 1999).

Portanto, uma vez que a morte está associada com a sensibilidade à convulsão ela

também pode ser usada como parâmetro neste estudo.

Os mecanismos moleculares envolvidos com a maior sensibilidade à

convulsão, ou maior hiperexcitabilidade, apresentadas pelos

knockouts de Prnp

podem estar relacionadas às várias alterações eletrofisilógicas já descritas nestes

animais. Camundongos ZrchI assim como os Edbg apresentam comprometimento da

potencialização de longo prazo (

long term potentiation) causada provavelmente pela

presença de inibição anormal de GABA-A no hipocampo (COLLINGE et al. 1994;

MANSON et al. 1994; WHITTINGTON et al. 1995), que foi resgatada pela re-

expressão de PrP

por um transgene (WHITTINGTON et al. 1995). Entretanto, estes

achados não foram reproduzidos por outro grupo (LLEDO et al. 1996). Por outro

lado, demonstramos recentemente que camundongos ZrchI apresentam uma alta

excitabilidade no giro dentado do hipocampo demonstrada por um baixo limiar

necessário para gerar potencialização de longo prazo. Este evento foi associado à

superexpressão de receptores de NMDA dos tipos NR2A e NR2B (MALLON et al.

2005). Além disso, outra alteração apresentada pelos animais

knockouts constitutivos

Prnp foi perda da condutância de I

HAP

(Afterhyperpolarization) causada

provavelmente por alterações nas correntes de K

ativadas por Ca

(COLLING et al.

1996), interessantemente esta alteração foi reproduzida mais recentemente nos

knockouts pos-natal CreTg46 (MALLUCCI et al. 2002).

Algumas alterações bioquímicas observadas nos animais

knockout de Prnp

também convergem para explicar seu alto padrão de excitabilidade neuronal. A

atividade de ectopeptidases está diminuída em sinaptossomas de animais

knockout de

Prnp o que atenua a hidrólise de ADP levando a um decréscimo nas concentrações

de adenosina, que funciona como um anticonvulsivante endógeno, na fenda sináptica

(PEREIRA et al. 2001). Embora a captação de glutamato pareça normal em

sinaptossomas de animais ZrchI (THAIS et al. 2006), sua captação pelos astrócitos é

comprometida (BROWN e MOHN 1999), o que em última análise pode levar a um

aumento deste neurotransmissor excitatório na fenda sináptica e conseqüentemente

uma maior excitabilidade.

É sabido que o fluxo de Ca

no espaço intracelular representa um dos

primeiros estágios dos eventos epiléticos (SPECKMANN et al. 1993) e que os

potenciais de

afterhyperpolarization (IAHP) são dependentes do influxo de cálcio

via canais de cálcio voltagem-dependentes do tipo L (VDGC-L). Interessantemente,

a homeostase de Ca

também está alterada em células hipocampais de animais

knockout Prnp (HERMS et al. 2000; BRINI et al. 2005). Recentemente, os baixos

potenciais de IAHP previamente observados em animais

knockouts de Prnp foram

explicados por estes apresentarem uma redução do Ca

citosólico. Esta foi

ocasionada por um comprometimento no influxo de cálcio causado provavelmente

pela diminuição na atividade da subunidade β2 de VGCC -L, que é responsável pelo

transporte da subunidade α1 de VGCC-L para a membrana plasmática

(FUHRMANN et al. 2006).

Interessantemente, nosso grupo mostrou que o tratamento de neurônios

hipocampais com o peptídeo de laminina que representa o sítio de interação a PrP

(peptídeo γ-1), leva a um aumento nas concentrações citosólicas de Ca

em células

tipo selvagem o que não ocorre em neurônios de animas

knockout de Prnp (Beraldo

et al. em preparação). O aumento de Ca

observado é dependente tanto do

recrutamento de cálcio de estoques celulares (particularmente do retículo

endoplasmático) como de Ca

extracelular. Portanto, é possível que a interação de

PrP

a laminina também module a atividade dos VGCC tipo-L.

Além disso, sabemos que PrP

está envolvido em mecanismos de proteção

neuronal contra estresse oxidativo (revisado por BROWN 2005) e sua interação com

STI1 protege neurônios retinianos (ZANATA et al. 2002; CHIARINI et al. 2002) e

hipocampais (LOPES et al. 2005) da morte celular programada. É sabido ainda que

ácido kaínico pode levar a morte neuronal por ativar plasmina que tem como

substrato principal no cérebro a laminina. Por outro lado, as interações de PrP

com

STI1 ou com Laminina também estão envolvidas com mecanismos de plasticidade

neuronal (GRANER et al. 2000a e LOPES et al. 2005). Portanto, os mecanismos de

morte neuronal e neuroplasticidade relacionados à epileptogenese permanecem como

um ponto importante a ser investigado.

Finalmente, os dados obtidos neste trabalho confirmam que modificações

moleculares, bioquímicas e eletrofisiológicas previamente observadas pela depleção

de PrP

podem refletir num fenótipo alterado, pela primeira vez consistentemente

demonstrado em diferentes modelos de animais

knockouts de Prnp. Obviamente que

em condições naturais não existem indivíduos onde PrP

não é expresso, entretanto o

gene que codifica esta proteína é bastante polimórfico, particularmente em humanos,

e é possível que variantes alélicas podem codificar proteínas com maior ou menor

atividade. Portanto, é importante expandir este estudo no sentido de observar se há

alguma correlação entre a presença de determinadas variantes alélicas no gene

PRNP

e as epilepsias.

7 DISCUSSÃO II

Os dados obtidos a partir de animais

knockouts de Prnp nos conduziram a

avaliar a possível associação entre a presença de variantes alélicas de

PRNP e

epilepsias humanas.

Uma etapa crucial para o desenvolvimento deste trabalho foi a padronização

de uma técnica rápida e eficiente para detecção de polimorfismos e/ou mutações no

gene de

PRNP. Inicialmente, usamos três técnicas distintas, o seqüenciamento direto,

o DHPLC e endonucleases de restrição uma vez que resultados controversos foram

encontrados inicialmente quando se comparava o seqüenciamento direto e os

produtos de clonagem destes DNAs. Uma possível explicação para estes resultados

discrepantes deve-se ao fato de que a seqüência de

PRNP é rica em nucleotídeos

citosina e guanina (KRETZSCHMAR et al. 1986) o que dificulta seu

seqüenciamento direto, uma vez que a incorporação do fluorocromo a cada um destes

resíduos cria um impedimento estérico para a incorporação do próximo marcador

(PARKER et al. 1995).

A ORF do gene

PRNP que possui aproximadamente 800bp foi dividida em

duas porções, onde os iniciadores usados para sua amplificação foram desenhados de

maneira em que houvesse sobreposição entre as duas seqüências amplificadas. Desta

forma, teríamos para cada amostra dois eletroferogramas com aproximadamente

400bp cada um, obtendo assim um seqüenciamento mais limpo. Inicialmente, esta

abordagem foi usada tanto para o seqüenciamento direto quanto para a análise

cromatográfica das amostras. Com esta abordagem, a segunda metade de

PRNP

amplificada permitia a detecção de quase todos os polimorfismos e mutações. No

entanto, devido a grande quantidade de polimorfismos presentes na ORF, era muito

difícil distinguir por DHPLC um perfil alterado composto de vários polimorfismos,

por exemplo, no códon 129 quando associado com alterações no códon 171.

Portanto, para melhor caracterizar as variantes alélicas por cromatografia e tornar

esta técnica de escolha para uma varredura do gene de

PRNP em todos os nossos

trabalhos, decidimos investir em sua melhor padronização.

Foram desenhados novos iniciadores de tal forma que a região de

sobreposição entre as seqüências amplificadas era menor e mantinha em fragmentos

separados os polimorfismos dos códons 129 e 171. Esta abordagem gerou picos

cromatográficos mais limpos e com perfis típicos que permitiam distinguir os

diferentes polimorfismos e inclusive, a presença de mais que uma alteração. A

digestão por enzimas de restrição específicas para os sítios onde se encontram os

principais polimorfismos, confirmou todos os seqüenciamentos e os padrões de

cromatografia. A análise cromatográfica de

PRNP mostrou-se uma ferramenta rápida

e eficaz para detecção de polimorfismos e mutações no gene de PrP

(CASTRO et al.

2004).

A robustez da técnica de DHPLC foi comprovada recentemente quando um

perfil bem diferente de todos que havíamos padronizado foi encontrado. O

seqüenciamento deste DNA confirmou a presença de um polimorfismo silencioso no

códon 124 (G124G). O fato da alteração ter sido facilmente detectada por DHPLC

mostrou mais uma vez que a técnica pode ser usada em qualquer estudo para uma

varredura de polimorfismos sem incorrer no risco de perder possíveis alterações que

não estejam padronizadas por DHPLC. Entretanto, em casos como este, é necessário

realizar o seqüenciamento da ORF para verificar de qual alteração se trata.

No presente trabalho continuamos um estudo iniciado anteriormente onde

avaliamos polimorfismos em pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial

associada à Esclerose Hipocampal (WALZ et al. 2003) e com malformações do

desenvolvimento cortical (WALZ et al. 2004). Nestes estudos demostramos que

existia uma associação entre o polimorfismo N171S e a epiletogênese. Estudos

posteriores em outras populações não foram capazes de reproduzir estes dados

(CAVALLERI et al. 2005).

Na tentativa de avaliar se outras formas de epilepsia poderiam também estar

associadas a polimorfismos em

PRNP iniciamos este estudo onde analisamos 202

indivíduos normais e 270 casos de epilepsia dos quais 168 são epilepsias focais, 40

são de epilepsias generalizadas e 70 casos que não temos os dados clínicos coletados,

mas incluem-se em um dos grupos citados.

Fizemos, portanto uma análise preliminar dos dados para que este trabalho

pudesse ser concluído parcialmente. Entretanto, continuaremos investindo na coleta

dos dados clínicos para finalização deste estudo.

Quando todos os pacientes foram agrupados verificamos uma maior

freqüência da variante alélica V129V nestes que nos controles normais, que foi

mantida quando se analisou os pacientes com epilepsias focais e perdida nos

pacientes com epilepsias generalizadas. Nenhuma associação foi encontrada para a

variante N171S e tão pouco para as outras variantes alélicas.

Interessantemente, uma tendência de associação da variante V129V já tinha

sido mostrada inicialmente com os 100 pacientes com epilepsia do lobo temporal

mesial associada à Esclerose Hipocampal (WALZ et al. 2003) e com malformações

do desenvolvimento cortical (WALZ et al. 2004).

O códon 129 de

PRNP está estrategicamente localizado na primeira α-hélice

de PrP

o que o torna importante na manutenção da estrutura desta proteína (RIEK et

al. 1998). Nós especulamos que a composição do aminoácido nesta posição pode

estar diretamente relacionada com a função da proteína ou que esta interfira com

outros domínios de PrP

com atividade biológica.

Esta proposta vai de acordo com os dados mostrados na literatura onde

variantes aléticas do códon 129 já foram associadas com melhor desempenho

cognitivo em pacientes idosos, em indivíduos com síndrome de Down, com doença

de Alzheimer (BERR et al. 1998; RUJESCU et al. 2003; DEL BO et al. 2003 e 2006;

GACIA et al. 2006). Uma melhor memória de longa duração foi ainda associada com

o alelo 129 metionina em adultos jovens normais (PAPASSOTIROPOULOS et al.

2005). Além disso, alterações na freqüência alélica do códon 129 também já foram

correlacionadas com quadros neurológicos e psiquiátricos como Doença de Wilson

(GRUBENBECHER et al. 2006) afasia primária progressiva (LI et al. 2005) e com

as medidas neuropsicológicas e psicopatológicas de desordens psiquiátricas

(MARTORELL et al. 2006).

O polimorfismo N171S foi associado com uma doença psiquiátrica

(SAMAIA et al. 1997), e com alguns tipos de epilepsia (WALZ et al. 2003 e 2004).

No presente trabalho esta correlação não foi encontrada para as formas de epilepsia

avaliadas. Esse polimorfismo poderia estar, portanto associado a um tipo específico

de epilepsia. Entretanto, nossos dados não foram reproduzidos por outro grupo

(CAVALLERI et al. 2005) quando as mesmas formas de epilepsia que estudamos em

WALZ et al. 2003 e 2004 foram avaliadas. Portanto, estes dados devem ser

reavaliados criteriosamente.

A associação de algumas formas de epilepsia com polimorfismos no gene

PRNP pode ser importante na identificação de grupos de risco e eventualmente na

identificação de novos alvos terapêuticos para estas doenças.

8 CONCLUSÕES

9 Animais knockouts para Prnp são mais sensíveis às crises convulsivas

induzidas por dois protocolos distintos (KA e PTZ) do que seus respectivos

controles, independentemente do

background genético, da contrução usada na

depleção do gene e da fase da vida do animal que o gene deixou de ser

expresso;

9 A sensibilidade a convulsão é dependente das concentrações de PrP

cérebro, uma vez que os animais que expressam 6x mais proteína são mais

resistentes à crises convulsivas induzidas quimicamente;

9 A presença de apenas um alelo de Prnp resgata o fenótipo de maior

sensibilidade a crises convulsivas apresentado pelo animal

knockout;

9 Knockouts pós-natal são mais sensíveis às crises convulsivas do que os

respectivos controles, indicando que a presença de PrP

durante o

desenvolvimento não altera o quadro de sensibilidade;

9 A ausência de PrP

nos neurônios foi suficiente para aumentar a sensibilidade

à crises convulsivas, independentemente da presença da proteína em outras

regiões, como na glia;

9 A técnica de DHPLC para a detecção de variantes alélicas no PRNP é segura,

confiável, reprodutível e economicamente mais viável que o seqüenciamento;

9 A variante alélica V129V de PRNP parece estar associada com o

aparecimento das síndromes epiléticas.

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aguzzi A. Between cows and monkeys.

Nature 1996; 381:734.

Basler K, Oesch B, Scott M, et al. Scrapie and cellular PrP isoforms are encoded by

the same chromosomal gene.

Cell 1986; 46:417-28.

Beck K, Hunter I, Engel J. Structure and function of laminin: anatomy of a

multidomain glycoprotein.

FASEB J 1990; 4:148-60.

Berkovic SF, Jackson GD. The hippocampal sclerosis whodunit: enter the genes.

Ann Neurol 2000; 47:557-8.

Berr C, Richard F, Dufouil C, et al. Polymorphism of the prion protein is associated

with cognitive impairment in the elderly: the EVA study.

Neurology 1998; 51:734-7.

Bolton DC, McKinley MP, Prusiner SB. Molecular characteristics of the major

scrapie prion protein.

Biochemistry 1984; 23:5898-906.

Brini M, Miuzzo M, Pierobon N, Negro A, Sorgato MC. The prion protein and its

paralogue Doppel affect calcium signaling in Chinese hamster ovary cells.

Mol Biol

Cell 2005; 16:2799-808.

Brown DR, Qin K, Herms JW, et al. The cellular prion protein binds copper in vivo.

Nature 1997a; 390:684-7.

Brown DR, Schulz-Schaeffer WJ, Schmidt B, et al. Prion protein-deficient cells

show altered response to oxidative stress due to decreased SOD-1 activity.

Exp

Neurol 1997b; 146:104-12.

Brown DR, Mohn CM. Astrocytic glutamate uptake and prion protein expression.

Glia 1999; 25:282-92.

Brown DR, Wong BS, Hafiz F, et al. Normal prion protein has an activity like that of

superoxide dismutase.

Biochem J 1999; 344 Pt 1:1-5. Erratum in: Biochem J 2000;

345 Pt3:767.

Brown DR. Neurodegeneration and oxidative stress: prion disease results from loss

of antioxidant defence.

Folia Neuropathol 2005; 43:229-43.

Büeler H, Fischer M, Lang Y, et al. Normal development and behaviour of mice

lacking the neuronal cell-surface PrP protein.

Nature 1992; 356:577-82.

Butler D. Did UK 'dump' contaminated feed after ban?

Nature 1996; 381:544-5.

Castilla J, Saa P, Hetz C, Soto C. In vitro generation of infectious scrapie prions.

Cell 2005; 121:195-206.

Castro RM, Landemberger MC, Walz R, et al. High capacity and low cost detection

of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC.

J Neurosci Methods

2004; 139:263-9.

Caughey B, Race RE, Ernst D, et al. Prion protein biosynthesis in scrapie-infected

and uninfected neuroblastoma cells.

J Virol 1989; 63:175-81.

Cavalleri GL, Lynch JM, Depondt C, et al. Failure to replicate previously reported

genetic associations with sporadic temporal lobe epilepsy: where to from here?

Brain 2005; 128:1832-40.

Cervenakova L, Brown P, Goldfarb LG, et al. Infectious amyloid precursor gene

sequences in primates used for experimental transmission of human spongiform

encephalopathy. Proc Natl Acad Sci U S A 1994; 91:12159-62. Erratum in: Proc

Natl Acad Sci U S A 1995; 92:3631.

Cervenakova L, Buetefisch C, Lee HS, et al. Novel PRNP sequence variant

associated with familial encephalopathy.

Am J Med Genet 1999; 88:653-6.

Chen S, Mange A, Dong L, et al. Prion protein as trans-interacting partner for

neurons is involved in neurite outgrowth and neuronal survival.

Mol Cell Neurosci

2003; 22:227-33.

Chen ZL, Strickland S. Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmin-

catalyzed degradation of laminin.

Cell 1997; 91:917-25.

Chiarini LB, Freitas AR, Zanata SM, et al. Cellular prion protein transduces

neuroprotective signals.

EMBO J 2002; 21:3317-26.

Coitinho AS, Freitas ARO, Lopes MH, et al. Cellular prion interaction with Laminin

mediates memory consolidation by PKA and MAPK.

J Neuroscience in press.

Colling SB, Collinge J, Jefferys JG. Hippocampal slices from prion protein null

mice: disrupted Ca(2+)-activated K+ currents.

Neurosci Lett 1996; 209:49-52.

Collinge J, Whittington MA, Sidle KC, et al. Prion protein is necessary for normal

synaptic function.

Nature 1994; 370:295-7.

Del Bo R, Comi GP, Giorda R, et al. The 129 codon polymorphism of the prion

protein gene influences earlier cognitive performance in Down syndrome subjects.

J Neurol 2003; 250:688-92.

Del Bo R, Scarlato M, Ghezzi S, et al. Is M129V of PRNP gene associated with

Alzheimer's disease? a case-control study and a meta-analysis.

Neurobiol Aging

2006; 27:770.e1-770.e5.

Doh-ura K, Tateishi J, Sasaki H, et al. Pro/Leu change at position 102 of prion

protein is the most common but not the sole mutation related to Gerstmann-

Straussler syndrome.

Biochem Biophys Res Commun 1989; 163:974-9.

Doh-ura K, Kitamoto T, Sakaki Y, Tateishi J. CJD discrepancy.

Nature 1991;

353:801-2.

Ellis V, Daniels M, Misra R, Brown DR. Plasminogen activation is stimulated by

prion protein and regulated in a copper-dependent manner.

Biochemistry 2002;

41:6891-6.

Engel J Jr. Introduction to temporal lobe epilepsy.

Epilepsy Res 1996; 26:141-50.

Engel J, Pedley AT.

Epilepsy: a comprehensive textbook. Philadelphia: Lippincott-

Raven; 1998. Introduction: What is epilepsy ?; p.1-7.

Finckh U, Muller-Thomsen T, Mann U, et al. High prevalence of pathogenic

mutations in patients with early-onset dementia detected by sequence analyses of

four different genes.

Am J Hum Genet 2000; 66:110-7.

Fink JK, Peacock ML, Warren JT Jr, Roses AD, Prusiner SB. Detecting prion protein

gene mutations by denaturing gradient gel electrophoresis.

Hum Mutat 1994; 4:42-

50.

Fischer M, Rulicke T, Raeber A, Sailer A, et al. Prion protein (PrP) with amino-

proximal deletions restoring susceptibility of PrP knockout mice to scrapie.

EMBO J 1996; 15:1255-64.

Fuhrmann M, Bittner T, Mitteregger G, et al. Loss of the cellular prion protein

affects the Ca(2+) homeostasis in hippocampal CA1 neurons.

J Neurochem 2006;

98:1876-85.

Gacia M, Safranow K, Styczynska M, et al. Prion protein gene M129 allele is a risk

factor for Alzheimer's disease.

J Neural Transm 2006 Aug 8; [Epub ahead of print].

Gajdusek DC. Unconventional viruses and the origin and disappearance of kuru.

Science 1977; 197:943-60.

Gauczynski S, Peyrin JM, Haik S, et al. The 37-kDa/67-kDa laminin receptor acts as

the cell-surface receptor for the cellular prion protein.

EMBO J 2001; 20:5863-75.

Gasset M, Baldwin MA, Lloyd DH, et al. Predicted alpha-helical regions of the prion

protein when synthesized as peptides form amyloid.

Proc Natl Acad Sci U S A

1992; 89:10940-4.

Ghetti B, Piccardo P, Spillantini MG, et al. Vascular variant of prion protein cerebral

amyloidosis with tau-positive neurofibrillary tangles: the phenotype of the stop

codon 145 mutation in PRNP.

Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:744-8.

Goldfarb LG, Mitrova E, Brown P, Toh BK, Gajdusek DC. Mutation in codon 200 of

scrapie amyloid protein gene in two clusters of Creutzfeldt-Jakob disease in

Slovakia.

Lancet 1990; 336:514-5.

Goldfarb LG, Brown P, McCombie WR, et al. Transmissible familial Creutzfeldt-

Jakob disease associated with five, seven, and eight extra octapeptide coding repeats

in the PRNP gene.

Proc Natl Acad Sci U S A 1991; 88:10926-30.

Goldfarb LG, Brown P, Little BW et al. A new (two-repeat) octapeptide coding

insert mutation in Creutzfeldt-Jakobdisease.

Neurology 1993; 43:2392-4.

Gonzalez-Iglesias R, Pajares MA, Ocal C, Espinosa JC, Oesch B, Gasset M. Prion

protein interaction with glycosaminoglycan occurs with the formation of oligomeric

complexes stabilized by Cu(II) bridges.

J Mol Biol 2002; 319:527-40.

Graner E, Mercadante AF, Zanata SM, et al. Laminin-induced PC-12 cell

differentiation is inhibited following laser inactivation of cellular prion protein.

FEBS Lett 2000a; 482:257-60.

Graner E, Mercadante AF, Zanata SM, et al. Cellular prion protein binds laminin and

mediates neuritogenesis.

Brain Res Mol Brain Res 2000b; 76:85-92.

Grubenbecher S, Stuve O, Hefter H, Korth C. Prion protein gene codon 129

modulates clinical course of neurological Wilson disease.

Neuroreport 2006;

17:549-52.

Harris DA, Falls DL, Johnson FA, Fischbach GD. A prion-like protein from chicken

brain copurifies with an acetylcholine receptor-inducing activity.

Proc Natl Acad

Sci U S A 1991; 88:7664-8.

Harris DA. Cell biological studies of the prion protein.

Curr Issues Mol Biol 1999;

1:65-75.

Hauser WA, Rich SS, Lee JR, et al. Risk of recurrent seizures after two unprovoked

seizures.

N Engl J Med 1998; 338:429-34.

Herms JW, Korte S, Gall S, Schneider I, Dunker S, Kretzschmar HA. Altered

intracellular calcium homeostasis in cerebellar granule cells of prion protein-

deficient mice.

J Neurochem 2000; 75:1487-92.

Hetz C, Maundrell K, Soto C. Is loss of function of the prion protein the cause of

prion disorders?

Trends Mol Med. 2003; 9:237-43.

Hsiao K, Baker HF, Crow TJ, et al. Linkage of a prion protein missense variant to

Gerstmann-Straussler syndrome.

Nature 1989; 338:342-5.

Hsiao K, Dlouhy SR, Farlow MR, et al. Mutant prion proteins in Gerstmann-

Straussler-Scheinker disease with neurofibrillary tangles.

Nat Genet 1992; 1:68-71.

Jackson GS, Collinge J. The molecular pathology of CJD: old and new variants.

Mol

Pathol 2001; 54:393-9.

Kale R. Bringing epilepsy out of the shadows.

BMJ 1997; 315:2-3.

Keshet GI, Bar-Peled O, Yaffe D, et al. The cellular prion protein colocalizes with

the dystroglycan complex in the brain.

J Neurochem 2000; 75:1889-97.

Kitamoto T, Ohta M, Doh-ura K, Hitoshi S, Terao Y, Tateishi J.Novel missense

variants of prion protein in Creutzfeldt-Jakob disease or Gerstmann-Straussler

syndrome.

Biochem Biophys Res Commun 1993; 191:709-14.

Kretzschmar HA, Stowring LE, Westaway D, et al. Molecular cloning of a human

prion protein cDNA.

DNA 1986; 5:315-24.

Lee KS, Magalhaes AC, Zanata SM, et al. Internalization of mammalian fluorescent

cellular prion protein and N-terminal deletion mutants in living cells.

J Neurochem

2001; 79:79-87.

Legname G, Baskakov IV, Nguyen HO, et al. Synthetic mammalian prions.

Science

2004; 305:673-6.

Leucht C, Simoneau S, Rey C, Vana K, Rieger R, Lasmezas CI, Weiss S. The 37

kDa/67 kDa laminin receptor is required for PrP(Sc) propagation in scrapie-infected

neuronal cells.

EMBO Rep 2003; 4:290-5. Erratum in: EMBO Rep 2003; 4:439.

Li A, Sakaguchi S, Shigematsu K, et al. Physiological expression of the gene for

PrP-like protein, PrPLP/Dpl, by brain endothelial cells and its ectopic expression in

neurons of PrP-deficient mice ataxic due to Purkinje cell degeneration. Am J Pathol

2000; 157:1447-52.

Li X, Rowland LP, Mitsumoto H, et al. Prion protein codon 129 genotype prevalence

is altered in primary progressive aphasia.

Ann Neurol 2005; 58:858-64.

Liao YC, Tokes Z, Lim E, et al. Cloning of rat "prion-related protein" cDNA.

Lab

Invest 1987; 57:370-4.

Liesi P, Narvanen A, Soos J, et al. Identification of a neurite outgrowth-promoting

domain of laminin using synthetic peptides.

FEBS Lett 1989; 244:141-8. Erratum in:

FEBS Lett 1989; 251:283.

Lledo PM, Tremblay P, DeArmond SJ, Prusiner SB, Nicoll RA. Mice deficient for

prion protein exhibit normal neuronal excitability and synaptic transmission in the

hippocampus.

Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:2403-7.

Locht C, Chesebro B, Race R, Keith JM. Molecular cloning and complete sequence

of prion protein cDNA from mouse brain infected with the scrapie agent.

Proc Natl

Acad Sci U S A 1986; 83:6372-6.

Lopes MH, Hajj GN, Muras AG, et al. Interaction of cellular prion and stress-

inducible protein 1 promotes neuritogenesis and neuroprotection by distinct signaling

pathways.

J Neurosci 2005; 25:11330-9.

Ma J, Lindquist S. Wild-type PrP and a mutant associated with prion disease are

subject to retrograde transport and proteasome degradation.

Proc Natl Acad Sci U S

A 2001; 98:14955-60.

Mallon AP, Auberson YP, Stone TW. Selective subunit antagonists suggest an

inhibitory relationship between NR2B and NR2A-subunit containing N-methyl-D: -

aspartate receptors in hippocampal slices.

Exp Brain Res 2005; 162:374-83.

Mallucci GR, Ratte S, Asante EA, et al. Post-natal knockout of prion protein alters

hippocampal CA1 properties, but does not result in neurodegeneration.

EMBO J

2002; 21:202-10. Erratum in: EMBO J 2002; 21:1240.

Mallucci G, Dickinson A, Linehan J, Klohn PC, Brandner S, Collinge J. Depleting

neuronal PrP in prion infection prevents disease and reverses spongiosis.

Science

2003; 302:871-4.

Mallucci G, Collinge J. Update on Creutzfeldt-Jakob disease.

Curr Opin Neurol

2004; 17:641-7.

Manson JC, Clarke AR, Hooper ML, et al. 129/Ola mice carrying a null mutation in

PrP that abolishes mRNA production are developmentally normal.

Mol Neurobiol

1994; 8:121-7.

Martins VR, Linden R, Prado MA, Walz R, Sakamoto AC, Izquierdo I, Brentani RR.

Cellular prion protein: on the road for functions.

FEBS Lett 2002; 512:25-8.

Martorell L, Valero J, Mulet B, et al. M129V variation in the prion protein gene and

psychotic disorders: Relationship to neuropsychological and psychopathological

measures.

J Psychiatr Res 2006 Aug 30; [Epub ahead of print]

Mastrianni JA, Iannicola C, Myers RM, DeArmond S, Prusiner SB. Mutation of the

prion protein gene at codon 208 in familial Creutzfeldt-Jakob disease.

Neurology

1996; 47:1305-12.

Mathern GW, Babb TL, Vickrey BG, et al. The clinical-pathogenic mechanisms of

hippocampal neuron loss and surgical outcomes in temporal lobe epilepsy.

Brain

1995; 118:105-18.

McKinley MP, Bolton DC, Prusiner SB. A protease-resistant protein is a structural

component of the scrapie prion.

Cell 1983; 35:57-62.

McKinley MP, Braunfeld MB, Bellinger CG, Prusiner SB. Molecular characteristics

of prion rods purified from scrapie-infected hamster brains.

J Infect Dis 1986;

154:110-20.

Mead S, Stumpf MP, Whitfield J, et al. Balancing selection at the prion protein gene

consistent with prehistoric kurulike epidemics.

Science 2003; 300:640-3.

Medori R, Tritschler HJ, LeBlanc A, et al. Fatal familial insomnia, a prion disease

with a mutation at codon 178 of the prion protein gene.

N Engl J Med 1992;

326:444-9.

Meggio F, Negro A, Sarno S, et al. Bovine prion protein as a modulator of protein

kinase CK2.

Biochem J 2000; 352 Pt 1:191-6.

Mercadante A.

Caracterização e implicações fisiológicas das interações da

proteína prion celular com o seu receptor de 60-66 kDa e com a Laminina. São

Paulo; 2000. [Tese de doutorado-Instituto de Química-Universidade de São Paulo]

Montrasio F, Cozzio A, Flechsig E, Rossi D, et al. B lymphocyte-restricted

expression of prion protein does not enable prionreplication in prion protein

knockout mice.

Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98:4034-7.

Moore RC, Lee IY, Silverman GL, et al. Ataxia in prion protein (PrP)-deficient mice

is associated with upregulation of the novel PrP-like protein doppel.

J Mol Biol

1999; 292:797-817.

Nitrini R, Rosemberg S, Passos-Bueno MR, et al. Familial spongiform

encephalopathy associated with a novel prion protein gene mutation.

Ann Neurol

1997; 42:138-46.

Oesch B, Westaway D, Walchli M, et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30

protein.

Cell 1985; 40:735-46.

Papassotiropoulos A, Wollmer MA, Aguzzi A, et al. The prion gene is associated

with human long-term memory.

Hum Mol Genet 2005; 14:2241-6.

Parchi P, Castellani R, Capellari S, et al. Molecular basis of phenotypic variability in

sporadic Creutzfeldt-Jakob disease.

Ann Neurol 1996; 39:767-78.

Parker LT, Deng Q, Zakeri H, Carlson C, Nickerson DA, Kwok PY. Peak height

variations in automated sequencing of PCR products using Taq dye-terminator

chemistry.

Biotechniques 1995; 19:116-21.

Peoc'h K, Manivet P, Beaudry P, et al. Identification of three novel mutations

(E196K, V203I, E211Q) in the prion protein gene (PRNP) in inherited prion diseases

with Creutzfeldt-Jakob disease phenotype.

Hum Mutat 2000; 15:482.

Pereira GS, Walz R, Bonan CD, et al. Changes in cortical and hippocampal

ectonucleotidase activities in mice lacking cellular prion protein.

Neurosci Lett

2001; 301:72-4.

Perry RT, Go RC, Harrell LE, Acton RT.SSCP analysis and sequencing of the

human prion protein gene (PRNP) detects two different 24 bp deletions in an atypical

Alzheimer's disease family.

Am J Med Genet 1995; 60:12-8.

Petchanikow C, Saborio GP, Anderes L, et al. Biochemical and structural studies of

the prion protein polymorphism.

FEBS Lett 2001; 509:451-6.

Piccardo P, Dlouhy SR, Lievens PM, et al. Phenotypic variability of Gerstmann-

Straussler-Scheinker disease is associated with prion protein heterogeneity.

Neuropathol Exp Neurol 1998; 57:979-88.

Pocchiari M, Salvatore M, Cutruzzola F, et al. A new point mutation of the prion

protein gene in Creutzfeldt-Jakob disease.

Ann Neurol 1993; 34:802-7.

Prusiner SB. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie.

Science1982;

216:136-44.

Prusiner SB. Molecular structure, biology, and genetics of prions.

Adv Virus Res

1988; 35:83-136.

Prusiner SB. Molecular biology of prion diseases.

Science 1991; 252:1515-22.

Prusiner SB. Natural and experimental prion diseases of humans and animals.

Curr

Opin Neurobiol 1992; 2:638-47.

Prusiner SB. Genetic and infectious prion diseases.

Arch Neurol 1993; 50:1129-53.

Prusiner SB. Prion diseases and the BSE crisis.

Science 1997; 278:245-51.

Prusiner SB. Prions.

Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95:13363-83.

Rachidi W, Vilette D, Guiraud P, et al. Expression of prion protein increases cellular

copper binding and antioxidant enzyme activities but not copper delivery.

J Biol

Chem 2003; 278:9064-7.

Riek R, Wider G, Billeter M, et al. Prion protein NMR structure and familial human

spongiform encephalopathies.

Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95:11667-72.

Roesler R, Walz R, Quevedo J, et al. Normal inhibitory avoidance learning and

anxiety, but increased locomotor activity in mice devoid of PrP(C).

Brain Res Mol

Brain Res

1999; 7:349-53.

Rudd PM, Merry AH, Wormald MR, Dwek RA. Glycosylation and prion protein.

Curr Opin Struct Biol 2002; 12:578-86.

Rujescu D, Hartmann AM, Gonnermann C, et al. M129V variation in the prion

protein may influence cognitive performance.

Mol Psychiatry 2003; 8:937-41.

Sakaguchi S, Katamine S, Shigematsu K, et al. Accumulation of proteinase K-

resistant prion protein (PrP) is restricted by the expression level of normal PrP in

mice inoculated with a mouse-adapted strain of the Creutzfeldt-Jakob disease agent.

J Virol 1995; 69:7586-92.

Sakaguchi S, Katamine S, Nishida N, et al. Loss of cerebellar Purkinje cells in aged

mice homozygous for a disrupted PrP gene.

Nature 1996; 380:528-31.

Salvatore M, Genuardi M, Petraroli R, Masullo C, D'Alessandro M, Pocchiari M.

Polymorphisms of the prion protein gene in Italian patients with Creutzfeldt-Jakob

disease.

Hum Genet 1994; 94:375-9. Erratum in: Hum Genet 1995; 95:605.

Samaia HB, Mari JJ, Vallada HP, Moura RP, Simpson AJ, Brentani RR.A prion-

linked psychiatric disorder.

Nature 1997; 390:241.

Samaia HB, Brentani RR. Can loss-of-function prion-related diseases exist?

Mol

Psychiatry

1998; 3:196-7.

Sauer B, Henderson N. Site-specific DNA recombination in mammalian cells by the

Cre recombinase of bacteriophage P1.

Proc Natl Acad Sci U S A 1988; 85:5166-70.

Schmitt-Ulms G, Legname G, Baldwin MA, et al. Binding of neural cell adhesion

molecules (N-CAMs) to the cellular prion protein.

J Mol Biol 2001; 314:1209-25.

Sejima H, Ito M, Kishi K, Tsuda H, Shiraishi H. Regional excitatory and inhibitory

amino acid concentrations in pentylenetetrazol kindling and kindled rat brain.

Brain

Dev 1997; 19:171-5.

Soto C, Castilla J. The controversial protein-only hypothesis of prion propagation.

Nat Med 2004; 10 Suppl:S63-7.

Speckmann EJ, Straub H, Kohling R. Contribution of calcium ions to the generation

of epileptic activity and antiepileptic calcium antagonism.

Neuropsychobiology

1993; 27:122-6.

Stahl N, Borchelt DR, Hsiao K, Prusiner SB. Scrapie prion protein contains a

phosphatidylinositol glycolipid.

Cell 1987; 51:229-40.

Steinlein OK. Genes and mutations in idiopathic epilepsy.

Am J Med Genet 2001;

106:139-45.

Thais ME, Carqueja CL, Santos TG, et al. Synaptosomal glutamate release and

uptake in mice lacking the cellular prion protein.

Brain Res 2006; 1075:13-9.

Timpl R, Dziadek M. Structure, development, and molecular pathology of basement

membranes.

Int Rev Exp Pathol 1986; 29:1-112.

Tsai MT, Su YC, Chen YH, Chen CH. Lack of evidence to support the association of

the human prion gene with schizophrenia.

Mol Psychiatry 2001; 6:74-8.

Yamada M, Itoh Y, Fujigasaki H, et al. A missense mutation at codon 105 with

codon 129 polymorphism of the prion protein gene in a new variant of Gerstmann-

Straussler-Scheinker disease.

Neurology 1993; 43:2723-4.

Wadsworth JD, Asante EA, Desbruslais M, et al. Human prion protein with valine

129 prevents expression of variant CJD phenotype.

Science 2004; 306:1793-6.

Walz R, Amaral OB, Rockenbach IC, et al. Increased sensitivity to seizures in mice

lacking cellular prion protein.Epilepsia 1999; 40:1679-82.

Walz R, Castro RM, Velasco TR, et al. Cellular prion protein: implications in

seizures and epilepsy.

Cell Mol Neurobiol 2002; 22:249-57.

Walz R, Castro RM, Velasco TR, et al. Surgical outcome in mesial temporal

sclerosis correlates with prion protein gene variant.

Neurology 2003; 61:1204-10.

Walz R, Castro RM, Landemberger MC, et al. Cortical malformations are associated

with a rare polymorphism of cellular prion protein.

Neurology 2004; 63:557-60.

Warner RG, Hundt C, Weiss S, Turnbull JE. Identification of the heparan sulfate

binding sites in the cellular prion protein.

J Biol Chem 2002; 277:18421-30.

Westaway D, Goodman PA, Mirenda CA, et al. Distinct prion proteins in short and

long scrapie incubation period mice.

Cell 1987; 51:651-62.

Whittington MA, Sidle KC, Gowland I, et al. Rescue of neurophysiological

phenotype seen in PrP null mice by transgene encoding human prion protein.

Nat

Genet 1995; 9:197-201. Erratum in: Nat Genet 1995; 9:451.

Windl O, Giese A, Schulz-Schaeffer W, et al. Molecular genetics of human prion

diseases in Germany.

Hum Genet 1999;105:244-52.

Zanata SM, Lopes MH, Mercadante AF, et al. Stress-inducible protein 1 is a cell

surface ligand for cellular prion that triggers neuroprotection.

EMBO J 2002;

21:3307-16.

Zimmermann K, Turecek PL, Schwarz HP. Genotyping of the prion protein gene at

codon 129.

Acta Neuropathol (Berl) 1999; 97:355-8.

Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269

High capacity and low cost detection of prion protein gene

variant alleles by denaturing HPLC

Rosa Maria R.P.S. Castro

a,b

, Michele C. Landemberger

a,b

, Roger Walz

c,d,e

Carlos G. Carlotti, Jr.

c,f

, Nancy Huang

, Danielle R. Cunha

, Ricardo Moura

Otávia L. Caballero

a,b

, Américo C. Sakamoto

, Ricardo Nitrini

Ricardo R. Brentani

a,b

, Vilma R. Martins

a,b,∗

Ludwig Institute for Cancer Research, São Paulo Branch, São Paulo SP, Brazil

Centro de Tratamento e Pesquisa Hospital do Cˆancer, São Paulo, SP, Brazil

CIREP, Center for Epilepsy Surgery, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Center for Epilepsy Surgery, Hospital Governador Celso Ramos, Florianópolis, SC, Brazil

Centro de Ciˆencias da Saúde, Faculdade de Medicina, UNIVALI, Itaja´ı, SC, Brazil

Departamento de Anatomia e Cirurgia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil

Disciplina de Neurologia, Hospital das Cl´ınicas da Faculdade de Medicina USP, São Paulo, SP, Brazil

Received 16 March 2004; accepted 6 May 2004

Abstract

Mutationsin the humanprion proteingene(PRNP) areresponsiblefor hereditarydiseases called transmissiblespongiform encephalopathies

(TSE) and a polymorphic site at codon 129 determines sensitivity to infectious forms of these maladies. More recently, codon 129 has been

related to cognition performance in the elderly, in Alzheimer disease (AD) and in Down syndrome. Furthermore, a rare polymorphism at

codon 171 was described in 23% of patients with mesial temporal lobe epilepsy related to hippocampal sclerosis (MTLE-HS), the most

common form of surgically remediable epileptic syndrome. Thus, a method that permits fast and efﬁcient screening of PRNP mutations and

polymorphisms in patients, in high risk populations, and in family members is desirable. In the present study, we established the conditions

for analysis of the PRNP open reading frame using denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC), whereby unpuriﬁed PCR

products were subjected to denaturing and reannealing steps leading to heteroduplex formation. We described speciﬁc proﬁles for the PRNP

polymorphisms at codons 129 (M/V), 117 (A/A silent), 219 (E/K), 171 (N/S), and the octarepeat deletion using ampliﬁed DNA from 562

samples. The chromatograms for TSE-associated mutations at codons 102 (P/L), 183 (T/A), and 210 (V/I) were also determined. Speciﬁcity

of the DHPLC proﬁle for each PRNP variant allele was conﬁrmed in 100% of the samples by direct and cloned DNA sequencing in addition

to endonuclease digestion when applicable. Therefore, the present study shows that DHPLC is a rapid, highly accurate and efﬁcient technique

for the detection of PRNP genetic variants.

Keywords: Prion protein gene; Prion; Prion diseases; Mutations; Polymorphisms; Denaturing high-performance liquid chromatography

1. Introduction

Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are a

group of fatal human neurodegenerative disorders which

can occur in sporadic, familial and acquired forms. The

hallmark of TSE is the accumulation in the central nervous

∗

Corresponding author. Present address: Ludwig Institute for Cancer

Research, São Paulo Branch, Rua Antonio Prudente 109-4A, Liberdade

01509-010, SP, Brazil. Tel.: +55-11-3388-3220; fax: +55-11-3207-7001.

E-mail address: [email protected] (V.R. Martins).

system of PrP

, which is an abnormally folded isoform

of the encoded cellular prion protein (PrP

)(Prusiner,

1998). PrP

is encoded by a single exon of a single

gene, PRNP, for which some genetic variants have been

described and are speciﬁcally associated with familial

forms of TSEs such as Creutzfeldt–Jakob disease CJD),

Gerstmann–Straussler–Scheinker disease (GSS) and fatal

familial insomnia (FFI). The pathogenic mutations include

single point variations that are located mostly in the central

and C-terminal region of PrP

such as those from codons

102 (Doh-ura et al., 1989; Hsiao et al., 1989), 183 (Nitrini

doi:10.1016/j.jneumeth.2004.05.001

264 R.M.R.P.S. Castro et al./ Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269

et al., 1997) and 210 (Pocchiari et al., 1993; Ripoll et al.,

1993) in addition to deletions and insertions located in the

N-terminal domain (Campbell et al., 1996; Capellari et al.,

1997; Goldfarb et al., 1993; Laplanche et al., 1995; Owen

et al., 1989). In many cases, the diagnosis of these diseases

is very difﬁcult and PRNP sequencing must be performed

in order to validate the presence of a hereditary prion

disease.

A highly frequent PRNP polymorphism at codon 129 is

well known to play a role in modulating disease outcome

since its association with a mutation at position 178 seems

to be a key determinant between CJD and FFI (reviewed

by Gambetti et al., 2003). Homozygosis for methionine

at codon 129 also plays an important role in susceptibil-

ity to the new variant of Creutzfeldt–Jakob disease (vCJD)

(Zimmermann et al., 1999), which was described to be trans-

mitted to humans, particularly to young adults, through the

ingestion of meat from cattle infected with bovine spongi-

form encephalopathy (Collinge et al., 1996). Thus, PRNP

sequencing became important mainly in patients younger

than 50 years to discriminate between vCJD and some early

familial forms of TSE (reviewed by Collinge, 2001). In ad-

dition, population screening might be important to deﬁne

higher risk groups.

The octarepeat domain of the human PrP

molecule is

also polymorphic and four or ﬁve repeats of the peptide

PHGGGWGQ can be found in normal populations (Palmer

and Collinge, 1993). It is believed that these variant alleles

are not related to susceptibility to prion diseases; however,

insertional mutations from two to nine octarepeats are as-

sociated with CJD (Campbell et al., 1996). A third PRNP

polymorphic site at codon 219 is found at very high fre-

quency in the Japanese population and has been reported to

delay the onset of GSS (Tanaka et al., 1997).

PRNP variant alleles have been recently related to other

human diseases, a ﬁnding consistent with partial or total PrP

loss of function (Martins et al., 2002). The Val/Val polymor-

phism at codon 129 is indicative of a worse cognition in the

elderly (Berr et al., 1998), in patients with Alzheimer disease

(Berr et al., 2003) and in Down syndrome (Del Bo et al.,

2003). In addition, a very rare polymorphism at codon 171

where an asparagine is changed to a serine, previously found

in a familial form of schizoaffective disorder (Samaia et al.,

1997), is present in 23% of patients with mesial temporal

lobe epilepsy related to hippocampal sclerosis (MTLE-HS)

and the serine variant allele indicates a poorer surgical out-

come for seizure cure (Walz et al., 2003). Therefore, these

data indicate that variant alleles in PRNP are associated with

human diseases whose prevalence is much higher than that

of prion diseases.

Optimization of conventional techniques and the develop-

ment of new tools for genotyping PRNP have been reported

to be essential to avoid mistakes that may delay both the

correct molecular diagnosis of the diseases and the classiﬁ-

cation of a normal population in cohort studies. Previously

described methods are time consuming and excessively ex-

pensive to be used for routine analysis. Additionally, several

polymorphic and mutation sites found in the PRNP open

reading frame (ORF) are located within a large domain of

CpG islands (Lee et al., 1998) which complicates direct se-

quencing of genomic DNA (Parker et al., 1995).

In the present study we describe the use of denatur-

ing high-performance liquid chromatography (DHPLC) to

screen variant alleles in PRNP. This technique is based on

the automated detection of heteroduplexes in short DNA

segments by ion-pair reverse phase high-performance liq-

uid chromatography under partially denaturing conditions

(Oefner et al., 1992). Therefore, single base substitutions,

deletions or insertions can be easily detected. The major

advantage of this method is the low cost and the speed of

analysis whereby after a single PCR the unpuriﬁed product

can be analyzed within approximately 16min. Once the

proﬁles are established DNA sequencing of PCR fragments

is unnecessary.

Using two pairs of primers we ampliﬁed two overlapping

PRNP segments comprising the entire ORF and submitted

them to DHPLC analysis. We determined speciﬁc proﬁles

for the polymorphic sites at the octarepeat domain and at

codons 117, 129, 171 and 219 in addition to point mutations

at codons 102, 183 and 210. Each proﬁle was conﬁrmed

by direct and cloned product sequencing and by restriction

endonuclease when applicable.

2. Materials and methods

2.1. Samples and DNA extraction

A total of 567 individuals were included in the study.

Blood samples were collected from 177 adult healthy con-

trols, three members of a family presenting GSS with a mu-

tation at codon 102 of the cellular prion protein (P102L),

and two patients with CJD, one with a mutation at codon

183 (T183A) and the other with a mutation at codon 210

(V210I). We also analyzed DNA from 385 samples obtained

at the Center for Epilepsy Surgery, Faculdade de Medic-

ina de Ribeirão Preto USP (CIREP), from patients with

MTLE-HS, different forms of abnormalities of cortical de-

velopment, gliosis, glial brain tumors, focal epilepsy with

normal MRI, idiopathic generalized epilepsies, Rasmussen’s

syndrome, undiagnosed epileptic syndromes, and from fam-

ily members of these patients.

DNA was directly extracted from 3mL of whole blood

using the Puregene Genomic DNA Isolation Kit (Gentra

Systems, USA).

2.2. PCR conditions

Primers were designed to amplify two different overlap-

ping fragments of the PRNP ORF (GenBank accession num-

ber AY008282). Their sequence and positions in PRNP are

shown in Fig. 1.

R.M.R.P.S. Castro et al. / Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269 265

Fig. 1. Primers used in this study (based on GenBank sequence

AY008282). PRNP ORF was divided into two fragments in order to ob-

tain the best performance in DHPLC analysis.

Ampliﬁcation reactions were carried out using touch

down PCR (Don et al., 1991) in a total volume of 50␮L

containing 100 ng of genomic DNA, 100 mM Tris–HCl, pH

8.3, 500mM KCl

, 25mM MgCl

, 200␮M dNTPs (Invit-

rogen, Carlrsbad, CA, USA ), 0.5␮M of each primer (In-

vitrogen, Carlsbad, CA, USA), and 5U of AmpliTaq Gold

enzyme (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Ampliﬁcations were performed using a DNA Thermal Cy-

cler PTC-100 (MJ Research Inc., MA, USA) as follows,

for fragment 1: 10min at 95

◦

C, then 10 cycles consisting

of 1 min at 94

◦

C, 1 min at 64

◦

C and 1 min at 72

◦

C; 10

cycles consisting of 1min at 95

◦

C, 1min at 62

◦

C and

1min at 72

◦

C, and 15 cycles consisting of 1 min at 95

◦

1min at 60

◦

C and 1min at 72

◦

C. For fragment 2: 10min

at 95

◦

C, and then 10 cycles consisting of 1min at 94

◦

1min at 62

◦

C and 1 min at 72

◦

C; 10 cycles consisting of

1min at 95

◦

C, 1 min at 60

◦

C and 1 min at 72

◦

C, and 15

cycles consisting of min at 95

◦

C, 1min at 58

◦

C and 1 min

at 72

◦

C(Don et al., 1991).

2.3. DHPLC

DNA ampliﬁed in two different reactions (fragments 1

and 2) as described above was submitted to a denaturing

step by heating at 95

◦

C for 5min followed by a gradual

re-annealing by cooling to 60

◦

C(2

◦

C/min) to enhance het-

eroduplex formation. Fifteen microliters of each re-annealed

PCR product were applied to an automated HPLC appara-

tus equipped with a DNASep column (Wave-nucleic acid

fragment analysis system—Transgenomic Inc., Omaha, NE,

USA). Parameters of gradient and ﬂow rate were adjusted

with the Wavemaker system control software (Transgenomic

Inc, Omaha, NE, USA). DNA was eluted in a linear ace-

tonitrile gradient of buffers A and B. Buffer A consisted

of 0.1M triethylammonium acetate (TEAA) (Transgenomic

Inc., Omaha, NE, USA) and buffer B of 0.1M TEAA and

25% acetonitrile (JT Baker, NJ, USA). The start and end

points of the gradient obtained by mixing eluents A and B

were adjusted using the algorithm provided by the Wave-

maker software (Transgenomic Inc., Omaha, NE, USA).

Elution of DNA was detected by 260 nm UV absorbance

and the chromatograms were analyzed based on patterns of

peak number and relative weight. First, the amplicons were

analyzed under non-denaturing conditions at 50

◦

C to estab-

lish the volume of sample injection for the mutation analysis

that ranged from 8 to 10␮L. The temperature for optimal

resolution of heteroduplex and homoduplex DNA was de-

termined by a DHPLC melting algorithm using the Wave-

maker software (Transgenomic Inc., Omaha, NE, USA) and

also by analyzing the melting behavior of each PCR frag-

ment while the temperature was varied by 1

◦

C increments.

Each sample in which only one peak was identiﬁed was

further analyzed by preparing equimolar mixtures with PCR

products from known wild-type samples to generate poten-

tial heteroduplex species. After the addition of the wild-type

sample, denaturation, re-annealing, and re-injection into the

DNASep column the appearance of heterozygous elution

proﬁles conﬁrmed the presence of a homozygous mutant

genotype. The corresponding homozygous for the wild type

proﬁle appeared as only one peak. The ﬂowchart for this

strategy is shown in Fig. 2.

2.4. DNA sequencing

PCR products were sequenced with the Dynamic

terminator sequenced kit (Amersham Biosciences, Piscat-

away, NJ, USA) according to manufacturer instructions. Se-

quencing reactions were separated on ABI Prism-377 (Ap-

plied Biosystems, Foster City, CA, USA).

2.5. Endonuclease digestion

PCR for the entire open reading frame of PRNP was

carried out in a total volume of 50␮L using the forward

primer of fragment 1 and the reverse primer of fragment

2(Fig. 1) under the same conditions and at an annealing

temperature of 63

◦

C. The PCR products were puriﬁed by

precipitation with 400␮L of 2-propanol (PA, Merck, Ger-

many) for precipitation of the DNA and elimination of the

PCR mix followed by a second precipitation with 400␮Lof

70% ethanol (Merck, Germany). The DNA was dissolved at

20ng/␮L in sterile water. Restriction endonucleases PvuII,

NspI, and BbvI were used to analyze codons 117, 129, and

171 respectively (Fink et al., 1994; Windl et al., 1999). En-

zymes were supplied by New England Biolabs and Amer-

sham Biosciences and were used according to manufacturer

recommendations. Digestion was carried out by incubation

at 37

◦

C for 16h followed by enzyme inactivation at 65

◦

Digestion products were analyzed by electrophoresis on 8%

polyacrylamide gels and DNA was stained with silver.

2.6. Cloning of the PCR products

The complete PRNP coding region from DNA samples

containing each type of polymorphism or mutation was

ampliﬁed using the same conditions as described above

and products were cloned in the PCR 2.1 vector using the

TA-cloning kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). DNA pu-

riﬁed from transforming colonies was sequenced to conﬁrm

the presence of variant alleles.

266 R.M.R.P.S. Castro et al./ Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269

Fig. 2. Flowchart of DHPLC strategy for PRNP analysis. PRNP ORF was ampliﬁed in two separate overlapping fragments and the PCR products

submitted to DHPLC. Analysis of each amplicon was done using non-denaturing conditions at 50

◦

C and at partial denaturing temperatures (65

◦

C for

fragment 1 and 61 and 63

◦

C for fragment 2). DHPLC proﬁle presenting a single sharp peak indicates homoduplex formation (homozygous sample)

while heteroduplex formation (heterozygous sample) is characterized by double or triple peaks and a heterozygous mutant/polymorphic genotype. In the

ﬁrst case (homoduplex) the sample must be mixed with a PCR product from a control (wild type) sample and re-analyzed by DHPLC. The appearance

of a single sharp peak (homoduplex) conﬁrms that the sample analyzed is wild type while a heteroduplex formation (double or triple peaks) characterizes

a homozygous mutant/polymorphic genotype. In bold, the ﬁnal ﬁndings that guide to the conclusions of the DHPLC analysis.

3. Results

The PRNP ORFs of a total 567 genomic DNA samples

were submitted to DHPLC analysis and to direct sequenc-

ing. We had no previous information about the presence of

any PRNP polymorphism in 562 DNAs. We also tested DNA

samples from GSS and CJD patients with mutations previ-

ously described at codons 102, 183 and 210, respectively.

Despite the large number of epileptic syndromes evaluated

here, their association with PRNP polymorphisms was not

the scope of the present study.

The samples yielding similar DHPLC proﬁles were

grouped together and compared to their sequencing results.

Polymorphic sites at codons 117, 129 and 171 were also

conﬁrmed by speciﬁc endonuclease digestion.

In order to establish the DHPLC patterns for polymor-

phic and mutation sites at PRNP we divided the ORF into

two overlapping amplicons using the primers described in

Fig. 1. The strategy applied for each reaction is schemat-

ically presented in Fig. 2 where a preliminary analysis of

each amplicon was always done using non-denaturing con-

ditions at 50

◦

C in order to quantify and verify the quality

of the PCR product. Under these conditions, the presence of

an octarepeat deletion within fragment 1 was promptly ob-

served due to a speciﬁc DHPLC proﬁle of the shorter PCR

product when compared to the wild type sample (Fig. 3).

This pattern was conﬁrmed in all 40 samples characterized as

heterozygote for the octarepeat deletion by direct sequenc-

ing (Table 1). When fragment 1 amplicon was submitted to

◦

C the wild type samples showed a single peak of par-

tially denatured homoduplex DNA, whereas the presence of

polymorphic or mutation sites led to distinct proﬁles with

two or more peaks (Fig. 4). These peaks are caused by par-

tially denatured heteroduplex molecules that are retained in

the column for shorter times and are speciﬁc for each het-

erozygous site. Speciﬁcity of the proﬁles was conﬁrmed for

Fig. 3. PRNP fragment 1 DHPLC sizing analysis. Ampliﬁcation prod-

ucts from PRNP fragment 1 (codons 8–148) analyzed by DHPLC using

non-denaturing conditions at 50

◦

C (sizing) show different proﬁles for a

sample with an octarepeat deletion compared with a wild type sample.

R.M.R.P.S. Castro et al. / Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269 267

Table 1

Number of PRNP variant alleles identiﬁed using DHPLC in 567 DNA samples

Fragment 1 Fragment 2

Octarepeat

delection

P102L M129V A117A

silent

Del Oct + M129V P102L + M129V M129V + A117A

silent

V129V N171S T183A V210I E219K

22 2 221 13 18 1 18 57 44 1 1 2

13 A117A

silent

samples, 221 samples with M129V, 22 sam-

ples with octarepeat deletion and two samples with P102L

mutation (Table 1). In addition, different proﬁles are found

when two polymorphic sites are present in this fragment.

The occurrence of an octarepeat deletion or an A117A

silent

polymorphism in heterozygosis with M129V produced pro-

ﬁles which differed from those observed for each single

Fig. 4. DHPLC elution proﬁles of homo and heteroduplexes from PRNP

fragment 1 (codons 8–148) polymorphic and mutation sites at 65

◦

The chromatograms show a homoduplex control (wild type) sample

and samples containing heteroduplexes characterized by speciﬁc proﬁles

for mutation at codon 102 (P102L) and polymorphisms at codons 117

(A117A

silent

), 129 (M129V) and the octarepeat deletion (Del Oct). The

combination of two polymorphic sites also produced a speciﬁc proﬁle

which was different from that presented by each polymorphism alone

(Del Oct + M129V, P102L + M129V and A117A

silent

+ M129V).

polymorphism (Fig. 4) and were conﬁrmed in 18 samples

of both combinations (Table 1).

It is important to note that the presence of a proﬁle with a

sharp peak does not necessary characterize a wild type sam-

ple but rather the presence of a homoduplex, which means

that a polymorphism/mutation may be present in homozygo-

sis. Therefore, when the ﬁrst screening analysis shows ho-

moduplex formation, mixing the sample with a PCR prod-

uct from a wild type sequence is mandatory (Fig. 2). Using

this approach, a second round of DHPLC from mixed sam-

ples (sample of interest plus wild type control) conﬁrmed

253 wild type samples (for fragment 1) and 57 V129V

samples which then produced in this mixed reaction a het-

eroduplex proﬁle of the M129V samples. Furthermore, there

were no heterozygotes for octarepeat deletion or A117A

silent

polymorphisms in our samples. However, the presence of

these variants should produce speciﬁc heteroduplex pro-

ﬁles, analogous to those presented in Fig. 4, after mixing

with wild type samples and running in a second round of

DHPLC.

The second PRNP amplicon (codons 138 to stop codon

plus 53bp) was submitted to DHPLC analysis at 63

◦

(Fig. 2) and a single peak of partially denatured homodu-

plex DNA was also observed for the wild type sample. DNA

presenting heterozygous polymorphic or mutation sites at

codons 171, 183 or 210, respectively, showed different re-

tention times on the DHPLC column (Fig. 5). The pattern

speciﬁcity was conﬁrmed in 44 samples with the N171S

polymorphism characterized by direct sequencing and re-

striction digestion with BbvI. However, only two samples,

one containing the mutation at codon 183 (T183A) and the

other at codon 210 (V210I), were available for analysis.

The conditions initially used for fragment 2 were unable to

discriminate between polymorphic sites at codons 171 (N/S)

and 219 (E/K) (Fig. 5) but a reduction of the denaturation

temperature to 61

◦

C permitted us to obtain speciﬁc proﬁles

for each of these sites (Fig. 6). Nevertheless, the pattern

speciﬁcity for the other mutations (codons 183 and 210) was

lost at this temperature (61

◦

C).

In summary, our results showed 100% coincidence of the

direct sequencing and restriction enzyme analysis (when ap-

plied) with DHPLC when PRNP ORF was ampliﬁed in two

fragments and analyzed at 65

◦

C for PRNP fragment 1 and

at 61

◦

C and 63

◦

C for fragment 2. Therefore, DHPLC pro-

duced highly reproducible proﬁles allowing the identiﬁca-

tion of PRNP polymorphisms and mutations based on dif-

ferences in chromatogram shape.

268 R.M.R.P.S. Castro et al./ Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269

Fig. 5. DHPLC elution proﬁles of homo and heteroduplexes from PRNP

fragment 2 (codons 138 to stop plus 53 bp) polymorphic and mutation

sites at 63

◦

C. The chromatograms show a homoduplex control (wild type)

sample and samples containing heteroduplexes characterized by speciﬁc

proﬁles for the polymorphism at codon 171 (N171S) and mutations at

codons 183 and 210.

4. Discussion

There is a continuing need for improved, efﬁcient, rapid

and low cost technology for the detection of PRNP polymor-

phisms and mutations. DHPLC has been used successfully

for the detection of mutations and polymorphisms in sev-

eral genes including those related to cancer predisposition

(reviewed by Xiao and Oefner, 2001).

DHPLC analysis performed according to the conditions

described here resulted in a straightforward detection of the

variant alleles in codons 102, 117, 129, 171, 183, 210 and

219 and identiﬁed one octarepeat deletion independently of

direct DNA sequencing analysis. An identical pattern of re-

tention times within the column was observedfor all samples

Fig. 6. DHPLC elution proﬁles from PRNP fragment 2 at 63

◦

C and 61

◦

C. The DHPLC elution proﬁle of heteroduplexes polymorphic sites at codons

171 (N171S) and 219 (E219K) showed a better resolution at 61

◦

C (panel B) than at 63

◦

C (panel A).

with the same genetic alteration and no false results were

detected, a fact indicating high sensitivity and speciﬁcity.

Nevertheless, more variant alleles than those evaluated here

have been described for PRNP (reviewed by Mastrianni and

Roos, 2000) and a careful evaluation of DHPLC conditions

for each nucleotide change or combination of changes dif-

ferent from those described here will be required.

While direct sequencing may be the most efﬁcient way to

identify variant alleles, sometimes problems may occur, in

particular when a CG-rich region is analyzed (Parker et al.,

1995), which is the case for the 5



region of the PRNP ORF.

In this situation, it is necessary to clone the PCR products

and sequence a large number of colonies, an expensive and

time consuming approach. On the other hand, endonuclease

digestion can be an interesting alternative but it is restricted

to the analyses of variant alleles that create or suppress a

cleavage site for the enzyme.

In contrast, DHPLC is an excellent detection strategy of

lower cost, excellent resolution and easy analysis. The ma-

jor requirement is the quality and quantity of PCR products

(A260 >2mV) and the size of the ampliﬁcation product that

should be less than 700bp (reviewed by Xiao and Oefner,

2001). It is also recommended to check the column condi-

tions and the oven temperatures frequently, as well as to run

controls with known nucleotide changes in every run to en-

sure the reproducibility of the assay. Hence, two PCR pro-

cedures (fragment 1 and 2) are necessary for PRNP ORF

evaluation and the proﬁle of each PCR product is completed

in 8min. Therefore, the entire ORF analysis will be ready

in 16min for heterozygous samples. In the case of homozy-

gous samples, the PCR product must be mixed with a con-

trol sample, must be submitted to a denaturation step and

run again in the DHPLC, a procedure that takes 16 addi-

tional minutes Therefore, with the cost of two PCR reactions

(not included the equipment cost) and in about 30min an

entire PRNP ORF can be analyzed. The automated DHPLC

equipment can be loaded with 192 samples.

In conclusion, the DHPLC technique under optimized

conditions is a rapid, highly accurate and useful tool to

determine polymorphisms and mutations in PRNP. This

approach will permit the screening of relatives from fam-

ilies with hereditary prion diseases, high risk populations

R.M.R.P.S. Castro et al. / Journal of Neuroscience Methods 139 (2004) 263–269 269

for vCJD (Collinge, 2001) and for worse cognition in the

elderly (Berr et al., 1998), in Alzheimer (Berr et al., 2003)

and Down syndrome (Del Bo et al., 2003) and for sus-

ceptibility to epileptic syndromes. It will also permit the

prediction of a poorer surgical outcome in patients with

Hippocampal Sclerosis (Walz et al., 2003).

Finally, one major sanitary problem is related to prion

diseases in cattle and sheep and how variant alleles at

their PRNP sequence are linked to infection susceptibility

(Goldmann et al., 1994; Hunter, 1997). The use of DHPLC

and an adaptation of the conditions described here will also

permit the prompt evaluation of a large number of animals.

Acknowledgements

This work was supported by grant from FAPESP (Fun-

dação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo #

99/07124-8). R.M.R.P.S. Castro and M.C. Landemberger are

research fellows supported by CAPES and FAPESP, respec-

tively.

References

Berr C, Richard F, Dufouil C, Amant C, Alperovitch A, Amouyel P. Poly-

morphism of the prion protein is associated with cognitive impairment

in the elderly: the EVA study. Neurology 1998;51(3):734–7.

Berr C, Helbecque N, Sazdovitch V, Mohr M, Amant C, Amouyel P,

et al. Polymorphism of the codon 129 of the prion protein (PrP)

gene and neuropathology of cerebral ageing. Acta Neuropathol Berl

2003;106:71–4.

Campbell TA, Palmer MS, Will RG, Gibb WR, Luthert PJ, Collinge J.

A prion disease with a novel 96-base pair insertional mutation in the

prion protein gene. Neurology 1996;46:761–6.

Capellari S, Vital C, Parchi P, Petersen RB, Ferrer X, Jarnier D, et al.

Familial prion disease with a novel 144 bp insertion in the prion

protein gene in a Basque family. Neurology 1997;49:133–41.

Collinge J, Sidle KC, Meads J, Ironside J, Hill AF. Molecular analysis of

prion strain variation and the aetiology of new variant CJD. Nature

1996;383(6602):685–90.

Collinge J. Prion diseases of humans and animals: their causes and

molecular basis. Annu Rev Neurosci 2001;24:519–50.

Del Bo R, Comi GP, Giorda R, Crimi M, Locatelli F, Martinelli-Boneschi

F, et al. The 129 codon polymorphism of the prion protein gene

inﬂuences earlier cognitive performance in Down syndrome subjects.

J Neurol 2003;250:688–92.

Doh-ura K, Tateishi J, Sasaki H, Kitamoto T, Sakaki Y. Proleu change

at position 102 of prion protein is the most common but not the

sole mutation related to Gerstmann–Straussler syndrome. Biochem

Biophys Res Commun 1989;163:974–9.

Don RH, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. Touchdown PCR

to circumvent spurious priming during gene ampliﬁcation. Nucl Acids

Res 1991;19:4008.

Fink JK, Peacock ML, Warren Jr JT, Roses AD, Prusiner SB. Detecting

prion protein gene mutations by denaturing gradient gel electrophore-

sis. Hum Mutat 1994;4:42–50.

Gambetti P, Parchi P, Chen SG. Hereditary Creutzfeldt–Jakob disease and

fatal familial insomnia. Clin Lab Med 2003;23:43–64.

Goldfarb LG, Brown P, Little BW, Cervenakova L, Kenney K, Gibbs Jr

CJ, et al. A new (two-repeat) octapeptide coding insert mutation in

Creutzfeldt–Jakob disease. Neurology 1993;43:2392–4.

Goldmann W, Hunter N, Smith G, Foster J, Hope J. PrP genotype and

agent effects in scrapie: change in allelic interaction with different

isolates of agent in sheep, a natural host of scrapie. J Gen Virol

1994;75(Pt 5):989–95.

Hsiao K, Baker HF, Crow TJ, Poulter M, Owen F, Terwilliger JD, et al.

Linkage of a prion protein missense variant to Gerstmann–Straussler

syndrome. Nature 1989;338:342–5.

Hunter N. PrP genetics in sheep and the applications for scrapie and BSE.

Trends Microbiol 1997;5(8):331–4.

Laplanche JL, Delasnerie-Laupretre N, Brandel JP, Dussaucy M, Chate-

lain J, Launay JM. Two novel insertions in the prion protein gene

in patients with late-onset dementia. Hum Mol Genet 1995;4:1109–

11.

Lee IY, Westaway D, Smit AF, Wang K, Seto J, Chen L, et al. Complete

genomic sequence and analysis of the prion protein gene region from

three mammalian species. Genome Res 1998;8:1022–37.

Martins VR, Linden R, Prado MA, Walz R, Sakamoto AC, Izquierdo I,

et al. Cellular prion protein: on the road for functions. FEBS Lett

2002;512:25–8.

Mastrianni JA, Roos RP. The prion diseases. Semin Neurol 2000;20:337–

52.

Nitrini R, Rosemberg S, Passos-Bueno MR, da Silva LS, Iughetti P,

Papadopoulos M, et al. Familial spongiform encephalopathy associated

with a novel prion protein gene mutation. Ann Neurol 1997;42:138–

46.

Oefner PJ, Bonn GK, Huber CG, Nathakarnkitkool S. Comparative study

of capillary zone electrophoresis and high-performance liquid chro-

matography in the analysis of oligonucleotides and DNA. J Chro-

matogr 1992;625:331–40.

Owen F, Poulter M, Lofthouse R, Collinge J, Crow TJ, Risby D, et al.

Insertion in prion protein gene in familial Creutzfeldt–Jakob disease.

Lancet 1989;1:51–2.

Palmer MS, Collinge J. Mutations and polymorphisms in the prion protein

gene. Hum Mutat 1993;2:168–73.

Parker LT, Deng Q, Zakeri H, Carlson C, Nickerson DA, Kwok PY. Peak

height variations in automated sequencing of PCR products using Taq

dye-terminator chemistry. Biotechniques 1995;19:116–21.

Pocchiari M, Salvatore M, Cutruzzola F, Genuardi M, Allocatelli CT,

Masullo C, et al. A new point mutation of the prion protein gene in

Creutzfeldt–Jakob disease. Ann Neurol 1993;34:802–7.

Prusiner SB. Prions. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:13363–83.

Ripoll L, Laplanche JL, Salzmann M, Jouvet A, Planques B, Dussaucy

M, et al. A new point mutation in the prion protein gene at codon

210 in Creutzfeldt–Jakob disease. Neurology 1993;43:1934–8.

Samaia HB, Mari JJ, Vallada HP, Moura RP, Simpson AJ, Brentani RR.

A prion-linked psychiatric disorder. Nature 1997;390(6657):241.

Tanaka Y, Minematsu K, Moriyasu H, Yamaguchi T, Yutani C, Kitamoto

T, et al. A Japanese family with a variant of Gerstmann–Straussler–

Scheinker disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1997;62(5):454–

Walz R, Castro RMRPS, Velasco TR, Alexandre Jr V, Lopes MH, Leite

JP, et al. Surgical outcome in mesial temporal sclerosis correlates with

prion protein gene variant. Neurology 2003;61:1204–9.

Windl O, Giese A, Schulz-Schaeffer W, Zerr I, Skworc K, Arendt S,

et al. Molecular genetics of human prion diseases in Germany. Hum

Genet 1999;105:244–52.

Xiao W, Oefner PJ. Denaturing high-performance liquid chromatography:

a review. Hum Mutat 2001;17:439–74.

Zimmermann K, Turecek PL, Schwarz HP. Genotyping of the prion protein

gene at codon 129. Acta Neuropathol Berl 1999;97:355–8.

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