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CAROLINA CAMARGO DE OLIVEIRA
ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA E DAS RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS PELO CANOVA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Biologia Celular e Molecular, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Biologia Celular e
Molecular.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Dorly de Freitas Buchi
Co-orientador: Prof Dr Marco Aurélio Krieger
CURITIBA
2006
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ii
CAROLINA CAMARGO DE OLIVEIRA
ALTERAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA E DAS RESPOSTAS FISIOLÓGICAS DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS PELO CANOVA
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Biologia Celular e Molecular, Setor de
Ciências Biológicas, Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial à obtenção do
título de Doutor em Biologia Celular e
Molecular.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Dorly de Freitas Buchi
Co-orientador: Prof Dr Marco Aurélio Krieger
CURITIBA
2006
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iii
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar gostaria de agradecer aos camundongos, pois sem eles esse
trabalho não seria possível.
Em segundo lugar a Dorly por me orientar sempre que possível, tanto dentro do
laboratório quanto fora dele. Por toda sua dedicação quando estava lendo e
corrigindo meus trabalhos durante feriados, pelas muitas conversas e ataques de
risos em viagens a congressos, enfim, por tudo que passamos nesses 7 anos de
convivência.
Ao Felipe, por estar sempre ao meu lado, por me incentivar, acreditar no meu
potencial e por compartilhar comigo todos os bons e maus momentos da vida.
A todos que passaram pelo laboratório, desde os alunos de iniciação científica
aos de mestrado e doutorado, que me auxiliaram em meus experimentos, que
estavam presentes nas brincadeiras e broncas, fazendo de nossa convivência diária
uma experiência agradável...
Em especial à Simone, por toda a sua ajuda, pela amizade, pelas discussões
científicas, em fim, por tudo o que passamos juntas nesses anos.
Agradeço também a todos os meus amigos e amigas, que estando longe ou
perto, sempre foram amigos no melhor sentido da palavra. Não nomeá-los-ei, pois
todos sabem o que cada um significa para mim!
Gostaria de agradecer também:
Ao Canova do Brasil pelo apoio financeiro, pela doação dos medicamentos e
por confiarem a nós uma parte tão importante, a credibilidade e comprovação
científica.
Às secretárias Gerizalda do departamento de Biologia Celular e Marlene do
programa de pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, pelo auxílio nas
questões administrativas.
Ao pessoal do biotério da UFPR: Izelen, Júlio, Luís, Cândido e demais
funcionários por todo o apoio técnico.
Ao Centro de Microscopia Eletrônica, especialmente a Matilde e Regina pela
ajuda prestada e ao Prof Ney pelos ensinamentos fundamentais para a utilização
dos microscópios de varredura e transmissão.
iv
Ao Centro de Diagnóstico Marcos Enrietti, por permitir a utilização do leitor de
microplacas, especialmente à Mara por dispor de seu tempo e boa vontade para me
auxiliar na utilização desse equipamento.
Ao Prof Dr Sílvio Sanches Veiga, por permitir o uso de seu laboratório e
equipamentos, e aos seus alunos por sanarem minhas dúvidas sempre que precisei.
À Profª Drª Maria Benigna M. de Oliveira por permitir o uso de seus
equipamentos e reagentes quando necessário.
Ao pessoal do IBMP, em especial ao Marco por me co-orientar, à Viviane e ao
Christian pelo auxílio nos experimentos de expressão gênica.
A CAPES pela bolsa de estudos concedida durante o período da realização de
minha tese e à Secretaria de Ciência e Tecnologia pela concessão de recursos para
a pesquisa, tornando financeiramente viável todos experimentos.
Enfim agradeço a todos que, de uma forma ou de outra, colaboraram com esse
trabalho.
v
Em um largo rio, de difícil travessia, havia um barqueiro que atravessava as pessoas de um lado para
o outro. Em uma das viagens, iam um advogado e uma professora. Como quem gosta de falar muito,
o advogado pergunta ao barqueiro: Companheiro, você entende de leis? Não – responde o barqueiro.
E o advogado compadecido: É pena, você perdeu metade da vida! A professora muito social entra na
conversa: Seu barqueiro, você sabe ler e escrever? Também não – responde o remador. Que pena! –
condói-se a mestra – Você perdeu metade da vida! Nisso chega uma onda bastante forte e vira o
barco. O canoeiro preocupado, pergunta: Vocês sabem nadar? Não! – responderam eles
rapidamente. Então é uma pena – concluiu o barqueiro – Vocês perderam toda a vida!
“Não há saber mais ou saber menos: Há saberes diferentes.”
Paulo Freire
vi
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES IX
LISTA DE TABELAS X
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS XI
RESUMO XII
ABSTRACT XIII
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
2.1. H
OMEOPATIA 3
2.2. S
ISTEMA IMUNITÁRIO 5
2.2.1. M
ACRÓFAGOS (Mφ) 7
2.2.1.1. Processo de ativação de Mφ 10
2. JUSTIFICATIVA 12
3. OBJETIVOS 13
3.1. O
BJETIVO GERAL 13
3.2. O
BJETIVOS ESPECÍFICOS 13
4. MATERIAL E MÉTODOS 14
4.1. A
NIMAIS 14
4.2. T
RATAMENTO IN VIVO 14
4.3. T
RATAMENTO IN VITRO 15
4.4. C
ULTIVO CELULAR 15
4.5. C
ITOQUÍMICA ULTRAESTRUTURAL PARA NAD(P)H OXIDASE 15
4.6. D
ETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
) 16
4.7. D
ETECÇÃO DE ANION SUPERÓXIDO (O
2
-
) 18
vii
4.8. DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) 19
4.9. I
MUNOMARCAÇÃO PARA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL (INOS) 20
4.10. A
NÁLISE ESTATÍSTICA 20
4.11. L
ARANJA DE ACRIDINA 21
4.12. D
ETECÇÃO DE CD 74 (II) EM CITOMETRIA DE FLUXO 21
4.13. D
ETECÇÃO DE CD 74 (II) EM MET 21
4.14. M
ENSURAÇÃO DE CITOCINAS NO SOBRENADANTE 22
4.15. E
XPRESSÃO GÊNICA 22
4.16. I
MUNOFENOTIPAGEM 23
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 24
5.1. P
RODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO (ROS) E DE NITROGÊNIO (RNS) 25
5.2. L
ARANJA DE ACRIDINA 36
5.3. D
ETECÇÃO DE CD74(II) 39
5.4. D
ETECÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS 42
5.5. E
XPRESSÃO GÊNICA 44
5.5.1.P
ROCESSOS TRANSCRICIONAIS E TRADUCIONAIS 55
5.5.2. D
INÂMICA E ESTRUTURA CELULAR 56
5.5.3. R
ESPOSTA IMUNITÁRIA 58
5.5.4. P
ROTEÍNAS RELACIONADAS AO ESTRESSE: CITOPROTETORES 59
5.5.5. E
NZIMAS 61
5.5.6. R
ECEPTORES DE QUIMIOCINAS E SEUS LIGANTES 63
5.5.7. O
UTROS RECEPTORES 64
5.5.8. G
ENES INDUZIDOS POR IFN 65
6. CONCLUSÃO 66
7. BIBLIOGRAFIA 67
ANEXO 1 – ANIMAIS E TRATAMENTO 81
ANEXO 2 – PREPARO DO CULTIVO CELULAR 82
ANEXO 3 – CITOQUÍMICA ULTRAESTRUTURAL PARA NAD(P)H OXIDASE 83
ANEXO 4 – DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
) 84
ANEXO 5 – DETECÇÃO DE ANION SUPERÓXIDO (O
2
-
) 85
viii
ANEXO 6 – DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO) 86
ANEXO 7 – IMUNOMARCAÇÃO PARA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL (INOS) 87
ANEXO 8 – FIXAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (MET) 88
ANEXO 9 – PROCESSAMENTO PARA MET 89
ANEXO 10 – CONTRASTAÇÃO PARA MET 90
ANEXO 11 – LARANJA DE ACRIDINA PARA MICROSCOPIA CONFOCAL 92
ANEXO 12 – DETECÇÃO DE CD74 (II) EM CITOMETRIA DE FLUXO 93
ANEXO 13 – DETECÇÃO DE CD74 (II) EM MET 94
ANEXO 14 – MENSURAÇÃO DE CITOCINAS EM SOBRENADANTE 95
ANEXO 15 – EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL DE CÉLULAS ANIMAIS 96
ANEXO 16 – DOSAGEM DE RNA/DNA PELA DENSIDADE ÓTICA (DO) 98
ANEXO 17 – GEL DE RNA 99
ANEXO 18 – IMUNOFENOTIPAGEM 101
ANEXO 19 – APROVAÇÃO CEEA 102
ix
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1
COMPONENTES DO MEDICAMENTO CANOVA............................ 1
FIGURA 2
DIFERENCIAÇÃO, DISTRIBUIÇÃO E ATIVAÇÃO DE
MACRÓFAGOS IN VIVO................................................................... 8
FIGURA 3
PAPEL DOS MACRÓFAGOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA E
INFLAMATÓRIA - MECANISMOS DE AÇÃO................................... 9
FIGURA 4
MORFOLOGIA DE MACRÓFAGOS................................................. 24
FIGURA 5
CITOQUÍMICA ULTRAESTRUTURAL PARA NAD(P)H OXIDASE.. 27
GRÁFICO 1
PRODUÇÃO DE H
2
O
2
....................................................................... 28
GRÁFICO 2
PRODUÇÃO DE O
2
-
.......................................................................... 30
GRÁFICO 3
PRODUÇÃO DE NO.......................................................................... 32
FIGURA 6
IMUNOMARCAÇÃO PARA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE
INDUZÍVEL (iNOS)............................................................................ 33
FIGURA 7
DESENHO ESQUEMÁTICO RESUMINDO OS EFEITOS DO
CANOVA............................................................................................ 35
FIGURA 8
MARCAÇÃO COM LARANJA DE ACRIDINA................................... 38
GRÁFICO 4
DETECÇÃO DE CD74 (Ii)................................................................. 40
FIGURA 9
IMUNOMARCAÇÃO PARA CD74 (Ii)................................................ 41
GRÁFICO 5
PRODUÇÃO DE CITOCINAS........................................................... 43
GRÁFICO 6
SAM PLOT DE COMPARAÇÃO DOS GRUPOS.............................. 46
GRÁFICO 7
SAM PLOT DE COMPARAÇÃO DOS GRUPOS.............................. 47
FIGURA 18
IMUNOFENOTIPAGEM DAS CÉLULAS PERITONEAIS DE
CAMUNDONGOS.............................................................................. 54
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS
N X H................................................................................................. 48
TABELA 2
DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS
N X HS............................................................................................... 48
TABELA 3
DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS
H X HS............................................................................................... 49
TABELA 4
DEGs AUMENTADOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS............................................................................ 49
TABELA 5
DEGs DIMINUÍDOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS............................................................................ 50
xi
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AIDS – Síndrome da Imuno Deficiência Adquirida
APC – Célula Apresentadora de Antígenos
CA – Canova
DEGs – genes diferencialmente expressos
FDR – taxa de falsa seleção
GM-CSF – Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos/Macrófagos
H
2
O
2
– Peróxido de hidrogênio
IFN-γ – Interferon γ
IL – Interleucina
iNOS – Oxido Nítrico Sintase induzível
Mφ – Macrófago(s)
M-CSF – Fator Estimulador de Colônia de Monócitos/Macrófagos
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MHC - Complexo Principal de Histocompatibilidade
NK – Natural Killer
NO – Óxido Nítrico
NO
2
-
– Nitrito
NOS – Óxido Nítrico Sintases
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio
SOD – Superóxido desmutase
TGF-β – Fator de Transformação de Crescimento β
Th1 - Linfócitos T helper 1
Th2 - Linfócitos T helper 2
TNFα – Fator de Necrose Tumoral α
xii
RESUMO
Canova (CA) é um medicamento derivado das tinturas de: Aconitum, Bryonia, Thuya,
Lachesis e Arsenicum diluídos em água destilada e menos de 1% de álcool.
Preparado a partir de técnicas homeopáticas, não apresenta toxicidade nem efeitos
colaterais. CA tem sido indicado a pacientes onde o sistema imunitário está
debilitado, e vem apresentando bons resultados na clínica. Experimentos anteriores
em nosso laboratório comprovaram que macrófagos tratados com CA
apresentam-se
ativados. Portanto, com esse trabalho pretendemos elucidar algumas modificações
celulares ocorridas durante o tratamento com CA. Foram utilizados dois tipos de
tratamento: camundongos tratados (in vivo) e macrófagos peritoneais de
camundongos tratados com CA (in vitro). Os macrófagos foram coletados e
processados para experimentos de detecção da atividade enzimática, assim como
seus produtos (microscopia eletrônica de transmissão – MET, leitura de absorbância
e marcação com laranja de acridina), detecção de CD74 (Ii) através de citometria de
fluxo e MET, produção de citocinas através de citometria de fluxo e expressão
gênica, através do isolamento de RNA e sua hibridização em Gene Chips
®
. Os
macrófagos tratados com CA apresentaram aumento da atividade da NADH oxidase
e da óxido nítrico sintase induzível (iNOS), aumentando conseqüentemente a
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO)
respectivamente. Observou-se o aumento da quantidade de vesículas ácidas e a
diminuição da expressão do CD74 (Ii). Foram observadas diminuições na produção
das interleucinas 2 (IL-2) e 4 (IL-4). Genes diferencialmente expressos (DEGs) foram
observados nas células de camundongos tratados com CA. Esses genes estão
principalmente relacionados com: processos de transcrição/tradução, estrutura/
dinâmica celular, resposta imunitária, citoproteção, processos enzimáticos e
receptores/ligantes. A partir dessas análises podemos concluir que o CA provoca
reações celulares que envolvem desde ativação da produção de determinadas
moléculas até alterações no perfil de expressão de genes relacionados com a
ativação de macrófagos.
Palavras-Chave: Canova, macrófagos, metabolismo oxidativo, expressão gênica.
xiii
ABSTRACT
Canova (CA) is a medication composed of Aconitum, Bryonia, Thuya, Lachesis and
Arsenicum in distilled water containing less than 1% ethanol. It is produced with
homeopathic techniques and is neither toxic nor presents collateral effects. CA is
being used by patients where the immune system is depressed, presenting good
clinical results. Previous studies demonstrated that CA activates macrophages.
Therefore with this work we try to elucidate some cellular modifications triggered by
CA. Two treatment types were performed: mice treated (in vivo) and mice
macrophages treated with CA (in vitro). Peritoneal cells were collected and
processed to enzymatic activity detection and release of its products (transmission
electron microscopy – MET, absorbance reading, and acridine orange staining),
CD74 (Ii) expression by flow citometry and MET, cytokine production by flow
cytometry and gene expression, by RNA isolation and its hybridization into Gene
Chips
®
. Macrophages triggered with CA increased NAD(P)H oxidase activity as well
as that of inducible nitric oxide syntase (iNOS), consequently producing reactive
oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) respectively. We observed an increase
in acid vesicles and a decrease in CD74 (Ii) expression. We also found a decrease in
interleukin 2 (IL-2) and 4 (IL-4) production. Differently expressed genes (DEGs) were
observed in cells from the treated group. These genes are mainly involved in
transcription/translation, cell structure and dynamics, immune response,
cytoprotection, enzymatic process and receptors/ligands. From these analyses we
can conclude that CA triggers cellular reactions that involve activation of specific
molecules production and alterations in gene expression profile related with
macrophages activation.
Key words: Canova, macrophages, oxidative metabolism, gene expression
1
1. INTRODUÇÃO
O Canova (CA) é um medicamento comercial formulado a partir de técnicas
homeopáticas Hahnemannianas. Esse medicamento possui em sua composição
Aconitum napellus 11 dH (Ranunculaceae), Thuya occidentalis 19 dH
(Cupresaceae), Bryonia alba 18 dH (Curcubitaceae), Arsenicum album 19 dH
(arsenic trioxide), Lachesis muta 18 dH (Viperidae) e menos de 1% de álcool diluídos
em água destilada. Originário da Argentina, foi trazido ao Brasil pelo Laboratório
Canova do Brasil que detém a patente internacional do medicamento desde 8 de
maio de 2001, o que garante os direitos de produção e comercialização do Canova
no Brasil e em outros países. Sua preparação e comercialização são regidas pela
Lei n° 6360 de 23/09/76, em seu artigo 23, alíneas I e II, parágrafo único, e
regulamentada pelo decreto n° 79094 de 05/01/77, em seu artigo 28, alíneas I e IV,
parágrafo único, que determinam que sejam fornecidos ao Ministério da Saúde,
informações e dados elucidativos sobre seus produtos (Canova do Brasil, 2006). O
medicamento é manipulado e vendido por farmácias autorizadas. O CA é produzido
é comercializado nas formas de gotas, inalante e flaconetes, sob rigoroso controle
de qualidade, sendo vendido apenas sob prescrição médica.
FIGURA 1 – COMPONENTES DO MEDICAMENTO CANOVA.
A ação do CA vem sendo estudada desde 1997. Constatou-se que esse
medicamento estimula o sistema imunitário através da ativação de macrófagos (Mφ),
favorecendo a resposta imunológica do próprio organismo em vários estados
patológicos. Estudos in vitro demonstraram que o medicamento CA não apresenta
toxicidade nem mutagenicidade identificável em nível cromossômico (Seligmann et
al., 2003). Piemonte e Buchi em 2002, demonstraram que o CA ativa macrófagos
A
conitum na
p
ellu
s
Arsenicum album
Bryonia alba Lachesis muta
Thuya occidentalis
2
tanto in vitro quanto in vivo em experimentos realizados com células peritoneais de
camundongos. Esses experimentos também mostraram uma significante diminuição
na produção do Fator de Necrose Tumoral α (TNFα). A produção de óxido nítrico
encontra-se aumentada em Mφ tratados com CA na presença ou ausência de
microrganismos. A atividade fagocítica também é modificada pelo medicamento. Mφ
tratados in vitro apresentam aumento na atividade fagocítica de microrganismos não
infectivos (Saccharomyces cerevisiae e Trypanosoma cruzi epimastigotas) e
diminuição na atividade fagocítica dos microorganismos infectivos T. cruzi
tripomastigotas e Leishmania amazonensis (Godoy, 2002). O CA estimula o sistema
endosomal/lisosomal, aumentando a atividade da enzima fosfatase ácida (Lopes et
al., 2006). Efeitos modulatórios também foram encontrados em infecção
experimental tanto in vitro quanto in vivo por L. amazonensis, controlando a
progressão e limitando a sua disseminação (Pereira et al., 2005). Estudos com
camundongos portadores de Sarcoma 180 tratados com CA mostraram a redução
da massa tumoral e o aumento significativo do infiltrado linfocitário, do tecido
granuloso e de fibrose peritumoral. O aumento dos linfócitos T CD4, B e natural killer
(NK) também foi observado nesses animais (Sato et al., 2005). O estudo in vitro de
células de medula óssea de camundongos demonstrou que as células aderentes
CD11b
+
apresentaram morfologia de células ativadas após o tratamento com CA. A
presença do medicamento também permitiu a formação de ninhos de células em
proliferação e/ou diferenciação (Abud et al., 2006). Estudos clínicos realizados com
pacientes HIV positivos demonstraram a diminuição das doenças oportunistas pelo
CA, devido à sua capacidade modulatória do sistema imunitário, assim como o
aumento na qualidade de vida desses pacientes (Sasaki et al., 2001; Di Bernardi,
2005; Stroparo, 2005).
Devido ao seu caráter imunomodulador, o CA é indicado para pacientes
portadores de doenças depressoras do sistema imunitário, como por exemplo
hepatite, neoplasias e síndrome da imuno deficiência adquirida (AIDS). Estudos com
esse medicamento tornam-se necessários para contribuir no conhecimento de sua
ação no sistema imunitário.
3
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Homeopatia
A homeopatia é um sistema terapêutico criado pelo médio alemão Samuel
Christian Hahnemann (1755-1843) no final do século 18. O termo homeopatia é
originado de Pathos, vocábulo grego que corresponde a sofrimento, e Homoios que
significa semelhante (Ruiz, 1999). A homeopatia utiliza uma série de substâncias
derivadas de plantas, animais, minerais, substâncias químicas sintéticas ou drogas
convencionais, todas em quantidades mínimas, usando um processo de preparação
especial (Jonas e Jacobs, 1996) com repetidas diluições e sucussões (agitação
vigorosa) (Jonas, Kaptchuk, Linde; 2003). O poder curativo, segundo Hahnemann,
se manifestaria com a menor dose possível do medicamento dinamizado, de modo
que a dose contivesse, quase que exclusivamente, só a força medicamentosa pura,
livremente desenvolvida, do tipo não material, produzindo apenas dinamicamente
efeitos tão poderosos que nunca seriam obtidos com a substância medicamentosa
pura, mesmo que ingerida em grandes quantidades (Ruiz, 1999).
Para os céticos, a homeopatia é um método de tratamento arcaico e
inofensivo, com modo de ação não plausível. Em contraste, experiências individuais
e coletivas de homeopatas profissionais nos mostram um quadro convincente da sua
efetividade na clínica (Mathie, 2003). Estudos têm sido desenvolvidos visando um
melhor entendimento da homeopatia. Em termos bioquímicos é convencionalmente
entendido como atuam as drogas convencionais, porém a homeopatia apresenta um
enorme desafio intelectual, se não um completo impasse. Muitos cientistas têm
sugerido que os efeitos clínicos dos medicamentos homeopáticos são devidos
apenas ao efeito placebo. Entretanto, estudos rigorosos, com replicatas de forma
duplo-cega e aleatórias, têm sido realizados mostrando diferenças significativas
entre homeopatia e placebo (Vickers e Zollman, 1999).
Alguns dos primeiros experimentos laboratoriais com diluições homeopáticas
muito baixas foram realizados por um proeminente patologista britânico, William
Boyd, que realizou uma série de experimentos laboratoriais na década de 30,
demonstrando os efeitos dos preparados homeopáticos do elemento mercúrio nos
padrões de crescimento do lêvedo (Boyd, 1941, 1946, 1947, 1954 apud Jonas e
4
Jacobs, 1996). A Atropa belladonna (belladonna), que possui como princípio ativo a
atropina, muito usada na medicina convencional, também tem sido estudada
(Walach et al., 2001). Homeopaticamente, a belladonna é muito utilizada em
processos inflamatórios, aumentando o sistema imunitário (Pedalino et al., 2004).
Mitra, Kundu e Khuda Bukhsh em 1998, demonstraram que o Arsenicum album em
forma homeopática potentizada atua reduzindo a acumulação de arsênico em
órgãos vitais. A Bryonia sp é outro medicamento bem conhecido e estudado por sua
atividade anti-reumática e expectorante (Krauze-Baranowska e Cisowski, 1995).
Naser et al. em 2005, demonstraram a atividade antiviral e imunoestimuladora da
Thuya occidentalis.
A homeopatia é um sistema de tratamento que coloca em ação os
mecanismos de cura do próprio corpo, de forma abrangente. Devido à alta diluição,
não apresenta efeitos tóxicos, produzindo pouco ou nenhum efeito colateral. A meta
da terapia homeopática é promover e orientar a reação de autocura inata do corpo.
Não é o medicamento em si que cura a doença, mas a reação dos mecanismos de
cura do corpo ao medicamento que leva à melhora. Um organismo que elimina uma
doença por conta própria tem mais chance de continuar saudável, realmente
curando o problema e evitando a recorrência. Esse tipo de tratamento se dá de
acordo com a velocidade de reparo natural do próprio corpo, portanto, pode levar
mais tempo do que os tratamentos aos quais estamos acostumados. Os tratamentos
convencionais são rápidos, mas também afetam as partes saudáveis do corpo,
muitas vezes produzindo efeitos colaterais indesejados (Jonas e Jacobs, 1996).
Várias são as propostas de explicação para o mecanismo de ação da
homeopatia. Essas incluem teorias baseadas no comportamento complexo de
sistemas dinâmicos, mecânica quântica, teoria da informação e até parapsicologia e
mágica (Fisher, 2003). Devido à falta de explicações científicas para seu modo de
ação, a homeopatia é considerada por muitos médicos pesquisadores e cientistas
como, no máximo, placebo terapia, apesar do fato que muitos pacientes têm relatado
seus efeitos benéficos (Widakowich, 2000).
À medida que os dados se acumulam e que os debates surgem, algumas
explicações começam gradualmente a ser corroboradas enquanto que outras são
extintas (Fisher, 2003). Os possíveis mecanismos de ação ainda permanecem como
teorias infundadas e seria importante se fossem provadas. Entretanto, o principal
5
agora seria evidenciar se a homeopatia realmente exerce efeito e qual sua
especificidade. A chave do sucesso para qualquer estudo é obter resultados a partir
de observações clínicas que reflitam propriamente a saúde da pessoa como um
todo, o que tipifica a homeopatia. A qualidade de vida do paciente, por exemplo,
deve ser tão importante quanto marcadores bioquímicos ou outros determinantes
físicos do status de saúde. Afinal, em terapias holísticas como a homeopatia, um
sintoma único normalmente não corresponde a uma doença, e sendo assim, é
inapropriado nesse tipo de estudo observar apenas as conseqüências específicas da
doença (Mathie, 2003).
Fazem-se necessárias então pesquisas melhores e em maior número, livres
de crenças ou descrenças no sistema em questão (Jonas, Kaptchuk e Linde, 2003).
Talvez nossos pensamentos tenham sido dominados pela linearidade dos modelos
derivados da farmacologia convencional. E sendo assim, nós podemos estar
procurando por efeitos como na medicina alopática, ou pior, estamos apenas
satisfeitos com esses tipos de efeitos. Uma coisa é certa, devemos melhorar,
desenvolver e transmitir a efetividade da homeopatia (Fisher, 2003).
2.2. Sistema imunitário
O organismo é constantemente ameaçado pela possível invasão de vários
tipos de microrganismos como bactérias, vírus e parasitas, os quais quando violam a
integridade do corpo podem prejudicar o delicado balanço interior. Para combater
essas infecções, durante o processo evolutivo, um sistema imunitário altamente
sofisticado foi desenvolvido, sendo responsável pelos mecanismos de defesa do
organismo (Parkin e Cohen, 2001).
O sistema imunitário é composto por uma rede altamente interativa de órgãos
linfóides, diferentes tipos de células, fatores humorais e citocinas espalhados pelo
corpo (Wood e Austyn, 1993). Dentre as células do sistema imunitário estão os
linfócitos, que reconhecem e respondem especificamente a antígenos estranhos, os
fagócitos (macrófagos e neutrófilos) além das células NK. Barreiras físicas e
químicas (pele, epitélio mucoso, etc) e as proteínas sanguíneas (complemento)
também fazem parte do sistema imunitário. A organização anatômica e a capacidade
6
de intercambiar com o sangue, linfa e tecidos são muito importantes para a geração
da resposta (Abbas, Lichtman e Pober, 2000).
Quando alguma barreira do nosso corpo é violada, o sistema imunitário é
ativado e a resposta imunitária resultante geralmente leva à destruição e remoção do
organismo estranho (Wood e Austyn, 1993). Para o sistema trabalhar corretamente
três componentes são essenciais:
• sistema de reconhecimento, para identificar a presença de um corpo estranho.
Esse reconhecimento ocorre em nível molecular através de várias moléculas de
reconhecimento;
• sistema de remoção/eliminação, para matar ou eliminar a ameaça. Esse sistema
ocorre em nível molecular e celular;
• sistema de comunicação, para coordenar as atividades de vários elementos,
tanto de reconhecimento quanto de remoção/eliminação (Playfair, 1995).
O sistema imunitário pode responder a uma imensa variedade de organismos
diferentes e uma enorme diversidade de respostas é possível (Wood e Austyn,
1993). De uma maneira mais ampla, os diferentes tipos de resposta imunitária
enquadram-se em duas categorias: respostas inatas (ou não adaptativas) e
respostas específicas (adaptativas ou adquiridas) (Roitt, Brostoff e Male, 1999).
A inata possui capacidade de distinção limitada, respondendo de maneira
semelhante a qualquer agente. É responsável pela defesa inicial tendo papel
importante na indução das respostas específicas. A imunidade específica possui alta
especificidade para distintas moléculas além da memória imunológica, o sistema
imunitário adquirido “lembra” de cada encontro com um antígeno estranho, de modo
que os encontros subseqüentes estimulam mecanismos de defesa crescentemente
eficazes. Linfócitos e os anticorpos são seus componentes principais. Esse tipo
facilita os mecanismos protetores da inata, tornado-a mais eficaz além de
acrescentar um alto grau de especialização aos relativamente estereotipados
mecanismos da inata. As interações entre as imunidades são bidirecionais.
Evidencialmente, os dois tipos de respostas são complementares. Como resultado
da ação das células envolvidas na primeira linha de defesa (local da resposta
inflamatória) os produtos da quebra dos antígenos são levados por uma célula
apresentadora de antígenos (APC), através do sistema linfático aferente, ao
linfonodo mais próximo. Nesse, linfócitos T ou B que migraram para o linfonodo
7
interagem com o antígeno apresentado, originando moléculas efetoras como os
anticorpos e células efetoras como células T citotóxicas. Através do sistema linfático
eferente essas células e moléculas alcançam a circulação sistêmica de onde elas
podem extravasar até o local da infecção para eliminar efetivamente a fonte da
infecção (Marsh e Kendall, 1996). Em outro tipo de interação, alguns fagócitos
podem capturar antígenos e apresentá-los aos linfócitos T, que por sua vez liberam
fatores solúveis (citocinas) que ativam os fagócitos, e estes então destroem os
patógenos capturados (Roitt, Brostoff e Male, 1999).
2.2.1. Macrófagos (M
φ
)
O macrófago foi descrito por Metchnikoff no final do século dezenove, como
uma célula com capacidade fagocitária. A compreensão da importância dessas
células e sua ativação clássica foram descritas a partir de estudos de MacKaness et
al. no início dos anos 60, onde foi demonstrada sua atividade antimicrobial (Gordon,
2003).
Os Mφ são originados de células tronco hematopoiéticas pluripotentes, as
quais são capazes de produzir diferentes células em resposta a uma variedade de
sinais. O crescimento e a diferenciação dos Mφ é dependente de citocinas
determinadoras de linhagens como, por exemplo, o fator estimulador de colônia de
monócitos/macrófagos (M-CSF), o fator estimulador de colônia de
granulócitos/macrófagos (GM-CSF) e interações com o estroma em órgãos
hematopoiéticos (Gordon, 2003). Os precursores mielóides comprometidos se
diferenciam para formar os monócitos sanguíneos. Essas células imaturas irão
adquirir características de Mφ residentes assim que emigrarem da circulação para os
tecidos (Hume, 2006).
Os Mφ estão envolvidos em muitos processos diferentes, como por exemplo,
remodelamento tecidual durante a embriogênese, cicatrização, remoção de células
mortas ou danificadas após injúria ou infecção, hematopoiese e homeostase. Outra
função dos Mφ é a de servirem como células apresentadoras de antígenos para o
reconhecimento inicial e remoção de células senescentes, microrganismos e células
tumorais (Klimp et al., 2002).
8
FIGURA 2 – DIFERENCIAÇÃO, DISTRIBUIÇÃO E ATIVAÇÃO DE MACRÓFAGOS
IN VIVO. Fonte: Gordon, 2003.
A idéia de que os Mφ são importantes na resposta imunitária foi reforçada nos
anos 70, quando foi descoberto que Mφ apresentavam moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC) de classe II, que são necessárias para o
reconhecimento de antígenos pela célula T (Unanue e Allen, 1987). Além disso, são
importantes na interação bidirecional das respostas imune inata e específica. As
funções dos Mφ na resposta inata complementam suas contribuições nas respostas
adquiridas humoral e celular, nas quais eles regulam a ativação de linfócitos B e T.
Os Mφ apresentam funções nas fases de reconhecimento, ativação e efetora da
imunidade específica. Entre essas se encontra a de célula processadora e
apresentadora de antígenos, produtora de citocinas como a IL-1, IL-6, IL-10, IL-12,
IL-18, TNF-α além da função de fagocitose de células apoptóticas e necróticas.
Agindo diretamente ou sob influência de outras células do sistema imunitário, os Mφ
capturam patógenos, eliminam invasores e os encaminham para os
subcompartimentos apropriados dos órgãos linfóides (Gordon, 1999).
9
FIGURA 3 – PAPEL DOS MACRÓFAGOS NA RESPOSTA IMUNITÁRIA E
INFLAMATÓRIA - MECANISMOS DE AÇÃO Fonte: adaptado de Roitt, Brostoff e Male,
1999.
INFLAMAÇÃO E FEBRE
IL-10, IL-6, TNFα,
Prostaglandinas
Fatores do complemento
Fatores de coagulação
REORGANIZAÇÃO TECIDUAL
Elastase, colagenase
Hialuronidase
Fator de crescimento de fibroblastos
Fatores angiogênicos
ATIVAÇÃO DE LINF
Ó
CITOS
Apresentação de antígenos
Produção de IL-1
ATIVIDADE ANTITUMORAL
Fatores citotóxicos
H
2
O
2
, C3a, proteases
Arginase, NO, TNFα
LES
Ã
O TECIDUAL
H
2
O
2
, C3a, TNFα
Hidrolases ácidas
ATIVIDADE ANTIMICROBIAN
A
OXIGÊNIO DEPENDENTE
H
2
O
2
, O
2
-
NO, OH
-
OXIGÊNIO INDEPENDENTE
Proteínas catiônicas
Hidrolases ácidas
lisozimas
10
2.2.1.1. Processo de ativação de M
φ
Normalmente, a ativação de Mφ não é uma propriedade constitutiva, mas sim
uma propriedade adquirida por essas células após a exposição a um estímulo. Esse
processo pode ser definido como aquisição de novas moléculas e capacidades
celulares que são requeridas na execução das complexas funções associadas à
ativação (Ohmori e Hamilton, 1994).
Até alguns anos atrás, Mφ ativados eram simplesmente definidos como
células que secretavam mediadores inflamatórios e eliminavam patógenos
intracelulares. Hoje em dia, Mφ ativados podem ser um grupo de células bem mais
heterogêneo, com fisiologias diferentes e que executam funções imunológicas
distintas (Mosser, 2003). A morfologia celular também varia consideravelmente com
os diferentes estados funcionais. Quando as células passam de residentes para
ativadas, elas modificam sua morfologia adquirindo núcleo grande e eucromático,
pronunciadas projeções celulares, aumentada capacidade de proliferação,
habilidades para aderir e espalhar-se em substratos, de fagocitose, de fusão de
lisossomos com vacúolos endocíticos e de produção de espécies reativas de
nitrogênio e oxigênio (North, 1978). Uma notável conseqüência da ativação de
macrófagos é o grande aumento da expressão de moléculas de classe II do MHC
pelas células. Isto presumivelmente potencializa sua interação com células T helper
ativadas durante a resposta imunitária adaptativa (Wood e Austyn, 1993).
Hoje em dia, pelo menos três populações distintas de Mφ ativados são
descritas, e cada tipo celular parece exercer papeis biológicos diferentes. O primeiro
e mais bem descrito é o Mφ ativado clássico, cujo papel é de célula efetora na
resposta imunitária celular (Mosser, 2003). Esse tipo celular torna-se ativado após a
exposição ao interferon γ (IFN-γ), produzido por linfócitos T helper-1 (Th1) e células
NK e por uma rede de citocinas envolvendo a IL-12 e a IL-8, produzida por APCs
(Gordon, 2003). Além disso, o TNF age como um sinal secundário nesse tipo de
ativação. Mφ ativados clássicos possuem habilidade aumentada de matar e degradar
microrganismos devido ao aumento da produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS) e do aumento da atividade da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS),
produzindo, conseqüentemente, óxido nítrico (NO) (Mosser, 2003).
11
O segundo tipo, o alternativamente ativado, parece estar envolvido na
imunosupressão e reparo tecidual (Mosser, 2003). São normalmente induzidos por
IL-4 e glicocorticóides assim como por outras citocinas como IL-10, IL-13 e por fator
de transformação de crescimento β (TGF-β), produzindo efeitos semelhantes. Os Mφ
alternativamente ativados expressam características fenotípicas e moleculares que
diferem consideravelmente dos Mφ ativados clássicos. Preferencialmente, eles
expressam receptores para manose, β-glucana, scavanger tipo 1 e CD163. Apesar
do aumento na capacidade endocítica, esse tipo celular não apresenta aumento nas
funções de eliminação de microorganismos, pois a produção de NO e ROS
encontra-se suprimida (Goerdt e Orfanos, 1999).
O mais recente tipo adicionado a essa lista é o Mφ ativado do tipo III, o qual
tem função antiinflamatória e preferencialmente induz resposta imune do tipo
humoral a antígenos. Normalmente são ativados após a ligação de receptores FcγR
com conseqüente produção de IL-12 e IL-10. Os Mφ desse tipo induzem as células T
helper-2 (Th2) a produzir IL-4 (Mosser, 2003).
A maioria dos métodos usados para identificar a ativação dessas células é
baseada em algumas funções que estão aumentadas em Mφ ativados, como por
exemplo, síntese e secreção de enzimas. Uma vez que muitas dessas atividades
funcionais requerem aumento da síntese protéica, pode-se considerar que o
aumento do RNA celular possa ser usado como parâmetro para identificar células
com capacidades funcionais aumentadas. RNA sintetizado por Mφ implica no
aumento da fagocitose por esses células e atividades bactericidas associadas com o
desenvolvimento da imunidade célula-mediada, e processamento de antígenos
(Stadler e Weck, 1978).
12
2. JUSTIFICATIVA
Hahnemann, fim de fevereiro de 1842, escreveu: “Parece que a funesta
preocupação principal da velha medicina é de tornar senão mortal pelo menos
incurável, a maioria das doenças crônicas, por meio de constantes enfraquecimentos
e martírios do doente debilitado e já bastante sofredor, acrescentando-lhe novas
doenças medicamentosas destruidoras”. Ainda hoje, início do terceiro milênio, a
maioria dos tratamentos médicos, apesar de efetivos no controle das doenças,
muitas vezes produzem efeitos colaterais indesejados.
O Canova está sendo utilizado no tratamento de doenças como o câncer e a
AIDS e vem apresentando resultados clínicos positivos, aumentando a qualidade de
vida dos pacientes, sem produzir efeitos colaterais. Devido a esses fatores tem-se a
necessidade de um estudo mais detalhado sobre a atuação desse medicamento no
organismo.
13
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Este trabalho tem como objetivo ampliar os conhecimentos sobre a ação do
CA no organismo.
3.2. Objetivos Específicos
Em macrófagos peritoneais de camundongos tratados in vitro e in vivo com
CA:
⇒ Verificar a atividade da enzima NAD(P)H oxidase através de marcações
eletrondensas em microscopia eletrônica de transmissão (MET);
⇒ Quantificar a produção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) utilizando a técnica
do vermelho de fenol;
⇒ Quantificar a produção de anion superóxido (O
2
-
) utilizando a técnica de
redução do citocromo c;
⇒ Quantificar a produção de óxido nítrico (NO) através da detecção de nitrito no
sobrenadante utilizando reagente de Griess;
⇒ Detectar a enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) através de MET;
⇒ Detectar a ativação in vitro dessas células utilizando laranja de acridina;
⇒ Detectar e quantificar a expressão do CD74 (Ii) em macrófagos tratados in
vivo;
⇒ Detectar e quantificar a produção de citocinas (TNF-α, IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-5)
em macrófagos de camundongos tratados in vivo;
⇒ Avaliar a expressão gênica, com o auxilio de microarranjos de DNA, a fim de
verificar a expressão simultânea de diversos genes em macrófagos de
camundongos tratados in vivo;
14
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados camundongos (Mus musculus) com mais ou menos 3 meses
de idade, pesando entre 25-30 g, cedidos pelo Biotério do setor de Ciências
Biológicas (SCB) da UFPR. O número de animais utilizados por grupo em cada
experimento foi determinado dependendo do número de células necessárias em
cada experimento. Todas as recomendações da lei nacional (n° 6638, 5 de
novembro de 1979) para manuseio de animais foram respeitadas e o projeto foi
aprovado pela comissão de ética em experimentação animal (CEEA) do SCB da
UFPR (anexo 19).
4.2. Tratamento in vivo
Os animais utilizados para ensaios in vivo foram tratados durante sete dias. O
número de animais tratados por grupo dependia do número de células necessárias
em cada experimento. Foram utilizados camundongos divididos nos seguintes
grupos:
• grupo tratado com Canova (CA): foram administradas injeções subcutâneas de 7
µl/g de Canova a cada 24 horas; OBS: o Canova foi sucussionado (agitado
vigorosamente) antes de cada aplicação;
• grupo tratado com solução hidro-alcoólica sucussionada (HS): foram administradas
injeções subcutâneas de 7 µl/g de solução hidro-alcoólica sucussionada estéril (água
destilada mais 0,01% de álcool neutro) a cada 24 horas;
• grupo normal ou controle (N): não foi administrada nenhuma substância nestes
animais.
No experimento de expressão gênica foram utilizados os grupos citados
acima, e mais o seguinte grupo:
• grupo tratado com solução hidro-alcoólica (H): foram administradas injeções
subcutâneas de 7 µl/g de solução hidro-alcoólica estéril (água destilada mais 0,01%
de álcool neutro) a cada 24 horas;
15
4.3. Tratamento in vitro
Em cultura de macrófagos peritoneais coletados a partir de camundongos
normais não tratados, após 2 horas de cultivo, foram adicionados 10% da solução
pesquisada em relação à quantidade de meio. Passadas mais 24 horas foi
adicionado dose reforço de 1% das soluções.
4.4. Cultivo celular
Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical. O peritôneo
foi exposto e foram administrados 10 ml de “Phosphate Buffer Solution” (PBS)
gelado estéril. Com uma seringa, o lavado foi retirado e foi transferido a um tubo
Falcon estéril, acondicionado em gelo para impedir a aderência das células à parede
do tubo. Quando necessário, os tubos foram centrifugados durante 2 minutos a 1500
rpm, o sobrenadante desprezado e os pellets ressuspendidos. Uma alíquota foi
retirada e as células contadas em Câmara de Neubauer. O número de células variou
dependendo do experimento.
4.5. Citoquímica ultraestrutural para NAD(P)H oxidase
Para cada experimento do tratamento in vivo, foram utilizados pelo menos 5
camundongos para cada grupo, e após o período de tratamento, as células foram
coletadas, colocadas para aderir durante 15 minutos a 37
o
C 5%CO
2
, e prontamente
processadas.
Para o tratamento in vitro, as células coletadas, plaqueadas em garrafas de
cultivo e tratadas com dose reforço, como descrito no item 4.3. Após o cultivo de 48
horas, as células foram processadas.
As células (5 x 10
6
células por garrafa) foram processadas conforme protocolo
(anexo 3). As garrafas foram incubadas com o substrato da enzima (NAD(P)H) e
cloreto de cério (CeCl
3
) em tampão Tris Maleato. Células de todos os grupos foram
também incubadas em solução onde não foi adicionado o substrato da enzima.
Esses grupos foram chamados de controle da enzima. Ao final, as células foram
16
raspadas das garrafas de cultivo e centrifugadas, sempre respeitando os grupos,
sem misturá-los. Foi realizada então a pós-fixação em tetróxido de ósmio 1% em
tampão cacodilato de sódio 0,1M pH 7,2, durante aproximadamente uma hora no
escuro. Foi realizada desidratação em acetona (70, 90 e 100%), infiltração em
mistura de epon:acetona em série decrescente e emblocagem em epon. Após a
polimerização em estufa à 60
o
C, os blocos foram cortados em ultramicrótomo e
observados sem contrastação no microscópio eletrônico de transmissão Jeol 1200
EXII, do Centro de Microscopia Eletrônica (CME) da UFPR. As imagens foram
adquiridas através do analisador de imagens Gatan. Foram observados cortes de
células em gradinhas de cobre de 300 mesh. Estes foram obtidos através de cortes
aleatórios, em intervalos de 0,5µ. A observação do material foi realizada de forma
“duplo cego”, ou seja, as gradinhas estavam em códigos e o observador
desconhecia a origem do material. As fotos foram obtidas através do sistema de
análise de imagens GATAN.
4.6. Detecção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
)
A coleta do lavado foi realizada como descrito acima (item 4.4) e foram
realizados os dois tipos de tratamento. O lavado foi distribuído com o auxílio de uma
micropipeta em placas de cultivo de 96 poços. Foram utilizados 5x10
5
macrófagos
por poço, que foram incubados por quinze minutos a 37
o
C 5% de CO
2
para a adesão
nas placas. Para os experimentos in vitro, após esse tempo, o sobrenadante foi
desprezado e foi adicionado meio de cultura “Dulbecco´s Modified Eagle Medium”
(DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal contendo penicilina 1 U/ml,
estreptomicina 1 µg/ml, e anfotericina 2,5 µg/l. O cultivo foi realizado em estufa de
CO
2
a 37
o
C durante 48 horas após o devido tratamento. Para os experimentos in
vivo, após os 15 minutos de aderência, as células foram processadas segundo cada
protocolo específico. Foram realizados 3 experimentos em triplicata para cada
tratamento.
A produção de H
2
O
2
foi quantificada pelo método baseado na oxidação do
vermelho de fenol pela H
2
O
2
, dependente de peroxidase, segundo o método de Pick
e Mizel, 1981 (anexo 4). Após o tempo de cultura ou os 15 minutos de aderências do
17
tratamento in vivo, as células foram lavadas duas vezes com HBSS (37°C). Foram
adicionados 100µl de meio de incubação contendo vermelho de fenol a 1M e 15
U/ml de peroxidase dissolvidos em Hank’s Buffer Salt Solution (HBSS) em todos os
poços. Posteriormente, nos poços inferiores, foi ainda adicionado miristato forbol
acetato (PMA) na concentração de 1µl/ml. O PMA foi utilizado como controle
positivo, uma vez que é conhecido como potencializador da produção de H
2
O
2
pelos
macrófagos. Foram ainda preparados dois brancos, um para cada tempo, contendo
100µl do meio de incubação, sem a adição de PMA. Cada grupo foi então analisado
com e sem a presença de PMA. As placas de cultivo foram levadas a estufa a 37°C.
Para que fosse possível medir a variação da produção de H
2
O
2
proporcional
ao tempo de incubação, primeiramente foram retirados os 100µl do poço branco 1 e
de todos os poços referentes ao experimento de 60 minutos, sendo transferidos para
outra placa contendo 10µl de solução aquosa de NaOH 1N em cada poço
correspondente. Logo após a retirada do meio de incubação, a placa foi recolocada
na estufa a 37°C, onde permaneceu por mais trinta minutos.
A oxidação do vermelho de fenol foi quantificada através de leitura da
absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de
620 nm. Os resultados foram obtidos em densidade óptica e estão apresentados em
nmoles de H
2
O
2
/10
6
células.
Para a obtenção de um padrão, foi feita uma curva de concentração de H
2
O
2
utilizando peroxidase (HRPO tipo VI-A, 1310U/ml – Sigma) com a concentração final
de 15U/ml.
Foram feitas três soluções de H
2
O
2
nas diluições 1:10, 1:100 e 1:1000. A
concentração dessas soluções foi determinada através de sua absorbância em 240
nm, sendo o resultado utilizado em um coeficiente de 39,58 M
-1
cm
-1
. Diluições
apropriadas da solução estoque foram usadas para a determinação da H
2
O
2
produzida pelos macrófagos em cultura, segundo o método de Pick e Keisari, 1980.
A absorbância dessas diluições foi lida em leitor de microplacas utilizando filtro de
comprimento de onda de 620 nm e o resultado foi utilizado para confeccionar a
curva padrão.
18
4.7. Detecção de anion superóxido (O
2
-
)
A coleta do lavado foi realizada como descrito acima (item 4.4) e foram
realizados os dois tipos de tratamento. O lavado foi distribuído com o auxílio de uma
micropipeta em placas de cultivo de 96 poços. Foram utilizados 5x10
5
macrófagos
por poço que foram incubados por quinze minutos a 37
o
C 5% de CO
2
para a adesão
nas placas. Para os experimentos in vitro, após esse tempo, o sobrenadante foi
desprezado e foi adicionado meio de cultura “Dulbecco´s Modified Eagle Medium”
(DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal contendo penicilina 1 U/ml,
estreptomicina 1 µg/ml, e anfotericina 2,5 µg/l. O cultivo foi realizado em estufa de
CO
2
a 37
o
C durante 48 horas após o devido tratamento. Para os experimentos in
vivo, após os 15 minutos de aderência, as células foram processadas segundo cada
protocolo específico. Foram realizados 3 experimentos em triplicata para cada
tratamento.
A produção de O
2
-
foi quantificada pelo método baseado na redução
extracelular do citocromo c, segundo o método de Sasada, Pabst e Johnston, 1983
(anexo 5). Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com “Hank’s
Buffer Salt Solution” (HBSS) a 37°C. Foram adicionados 100µl de meio de incubação
contendo citocromo c 80µM dissolvidos em HBSS em todos os poços.
Posteriormente, em determinados poços foi ainda adicionado PMA na concentração
de 1ng/ml. O PMA foi utilizado como controle positivo, uma vez que é conhecido
como potencializador da produção de O
2
-
pelos macrófagos. Foram ainda
preparados brancos para cada tempo, contendo 100µl do meio de incubação, sem a
adição de PMA. Cada grupo foi então analisado com e sem a presença de PMA. As
placas de cultivo foram levadas a estufa a 37°C.
Para que fosse possível medir a variação da produção de O
2
-
proporcional ao
tempo de incubação, foi realizada uma curva de concentração (2, 4, 6, 15 e 30
minutos). Primeiramente foram retirados os 100µl do poço branco 1 e de todos os
poços referentes ao experimento de 2 minutos, sendo transferidos para outra placa.
Logo após a retirada do meio de incubação, a placa foi recolocada na estufa a 37°C,
onde permaneceu pelos tempos testados.
19
A redução do citocromo c foi quantificada através de leitura da absorbância
em leitor de microplacas (BIORAD) utilizando filtro de comprimento de onda de 550
nm. A quantidade de citocromo c reduzido, correspondente à quantidade de O
2
-
liberado, foi calculada usando um coeficiente de extinção molar diferencial de 21.000
M
-1
cm
-1
e estão apresentados em nmoles de O
2
-
/10
6
células.
4.8. Detecção de óxido nítrico (NO)
A produção de NO de macrófagos tratados com Canova foi medida por
Godoy, 2002. Porém faltavam os resultados com controle positivo. Esse experimento
foi então repetido, porém agora com o controle positivo e com 48 horas de cultivo.
A coleta do lavado foi realizada como descrito no item 4.4. e foram realizados
os dois tipos de tratamento. Foram realizados 3 experimentos em triplicata para cada
tratamento. O plaqueamento foi realizado em placas de cultura de 96 poços. Foram
utilizados 5x10
5
macrófagos por poço que foram incubados por quinze minutos a
37
o
C 5% de CO
2
para a adesão nas placas. Para o tratamento in vitro, foi adicionado
DMEM, as células foram divididas e tratadas conforme o grupo e foram incubadas
por 48h em estufa 37
o
C 5%CO
2
. Para o tratamento in vivo as células foram
cultivadas por 48h sem adição do medicamento.
A avaliação da produção de óxido nítrico foi determinada após 48 horas de
cultivo, indiretamente a partir da determinação da concentração de nitrito (NO
2
-
), o
qual é um produto estável da reação de produção de NO, no sobrenadante das
culturas (anexo 6). Alíquotas de 100µl de cada sobrenadante foram transferidas para
placas de 96 poços e misturadas em igual proporção com o reagente de Griess*
que, na presença de nitrito, reage para produzir uma cor lilás. A densidade óptica
(D.O.) de cada amostra foi então determinada em leitor de microplacas (BIORAD)
em 550nm.
A concentração de nitrito presente no sobrenadante das amostras foi
calculada com base nos valores de D.O. obtidos para cada concentração (10µM-
80µM) de uma curva padrão, confeccionada com a utilização de uma solução de
nitrito de sódio diluído em meio de cultura, em concentração conhecida.
*(Naftiletilenodiamino 0,1% em ácido fosfórico 5% e Sulfonamina p-aminobenzeno
1% em ácido fosfórico 5% na proporção de 1:1)
20
4.9. Imunomarcação para óxido nítrico sintase induzível (iNOS)
A partir das células tratadas in vivo e in vitro foi realizada a detecção da
enzima iNOS (anexo 7). As células foram fixadas com glutaraldeído 0,05% e
paraformoldeído 2% em PBS. As células foram então incubadas com cloreto de
amônio 50nM em PBS. Aproximadamente 2 x 10
7
células foram incubadas com 1µl
de anticorpo anti iNOS (Sigma) de camundongo, diluído 1:100 em Triton-X/PBS
0,01%, durante 1 hora a temperatura ambiente. As células foram então lavadas em
PBS e incubadas com Proteína A – gold 10 nm (Sigma) em Triton-X/PBS 0,01%,
durante 30 minutos a temperatura ambiente. As células foram refixadas em
glutaraldeído 2,5% e paraformoldeído 4% em PBS por 30 minutos, processadas para
MET, contrastadas e observadas no microscópio eletrônico de transmissão Jeol
1200 EXII, do CME da UFPR, da mesma forma como descrito para a citoquímica
ultraestrutural para NAD(P)H oxidase (item 4.5).
4.10. Análise estatística
A análise estatística foi realizada a partir da análise de variância (ANOVA:
fator único) dos valores obtidos. O ANOVA foi realizado para garantir se havia ou
não homogeneidade entre os dados. Foi utilizado também o teste de Tukey. Esse
teste é realizado visando encontrar a diferença mínima entre as médias para que
exista diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Para isso, foi aplicada
a seguinte fórmula:
To = q RQME /
Onde q é o valor encontrado na tabela de valores da amplitude total
estudentizada (q) para α = 5%, segundo o número de tratamento (k) e os graus de
liberdade do resíduo (grau de liberdade do erro); QME é o MQ do erro, e R é o
número de repetições (VIEIRA, 1980).
21
4.11. Laranja de acridina
Para microscopia confocal os macrófagos foram tratados in vitro e in vivo, e
após, incubados com solução de laranja de acridina 5 µg/ml, durante 20 minutos a
37
o
C 5% CO
2
(anexo 11). As lamínulas foram colocadas sobre uma gota de PBS
estéril na lâmina. Logo após foram observadas em microscópio confocal (BIORAD)
utilizando lazer de Argônio (488nm).
4.12. Detecção de CD 74 (Ii) em citometria de fluxo
Para verificar a expressão do CD 74 (cadeia invariante do MHC de classe II)
foram utilizadas células tratadas in vivo. As células foram processadas segundo
protocolo (anexo 12). As células foram fixadas e permeabilizadas com BD
Cytofix/Cytoperm kit (BD Bioscience), incubadas com anticorpo monoclonal anti
CD74 (Ii) conjugado com FITC (BD Bioscience) – 0,5 µg/10
6
células – por 40 minutos
a temperatura ambiente e no escuro, foram lavadas e observadas em citômetro de
fluxo (FACScalibur). Os dados obtidos no citômetro foram analisados
estatisticamente através de ANOVA e Tukey , como descrito no item 4.10.
4.13. Detecção de CD 74 (Ii) em MET
A partir das células tratadas in vivo e in vitro foi realizada a detecção do CD
74 (anexo 13). As células foram fixadas e permeabilizadas com BD Cytofix/Cytoperm
kit (BD Bioscience), lavadas e incubadas com anticorpo monoclonal anti CD74 (Ii)
purificado (BD Bioscience) – 0,5 µg/10
6
células – por 30 minutos a temperatura
ambiente. Novamente as células foram lavadas e incubadas com proteína A – gold
10nm (Sigma), também por 30 minutos. Em seguidas as células foram processadas
para MET, contrastadas e observadas no microscópio eletrônico de transmissão Jeol
1200 EXII, do CME da UFPR, da mesma forma como descrito para a citoquímica
ultraestrutural para NAD(P)H oxidase (item 4.5).
22
4.14. Mensuração de citocinas no sobrenadante
O procedimento para a análise de citocinas produzidas pelos macrófagos e
liberadas no sobrenadante da cultura, foi realizado de acordo com o protocolo do
fabricante do kit – “Mouse Th1/Th2 cytokine CBA” – BD Pharmingen (anexo 14). A
partir desse kit são detectadas as seguintes citocinas: interleucina 2 (IL-2),
interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), fator de necrose tumoral α (TNFα),
interferon γ (IFNγ).
Após 48 horas de cultivo em placa de 96 poços (5 x 10
5
células/poço) ou 15
minutos de adesão das células tratadas in vivo, foi retirado o sobrenadante celular e
centrifugado para retirar qualquer célula presente. O sobrenadante foi incubado com
os “beads” de captura do kit e com os anticorpos contra as citocinas TNF-α, IFN-γ,
IL-5 IL-4, IL-2 (“mouse Th1/Th2 PE detection reagent”) conjugados com o ficoeritrina
(PE) por 2 horas no escuro. Foi adicionado a cada tubo do experimento 100µl da
solução de lavagem e leitura (“washing buffer”) e centrifugado a 1.300 rpm por 5
minutos. O sobrenadante foi descartado e foi adicionado mais 200µl de “washing
buffer”. A solução resultante foi homogeneizada e analisada imediatamente em
citômetro de fluxo (FACSCalibur).
4.15. Expressão gênica
Para esse experimento os camundongos foram tratados in vivo e os
macrófagos foram coletados segundo o item 4.4., porém “RNase free”. Isso pôde ser
obtido através de limpeza com álcool 70% ou com uma solução de água e
dietilpirocarbonato (DEPC) 1:1000 (desde a bancada, luvas, pipetas, tubos até
reagentes utilizados deviam ser “RNase free”).
Após a coleta das células dos animais tratados, os RNAs foram extraídos das
células dos vários grupos através de um kit da marca Qiagen (RNeasy mini kit).
Foram seguidas as recomendações e os protocolos fornecidos pelo fabricante do kit
(anexo 15). Foram utilizadas 1x10
7
células por grupo. Foram realizados três
experimentos independentes. Uma vez que os RNAs estavam eluídos em água
DEPC, foi medido o volume final de cada grupo com o auxilio de micropipeta. Foi
calculada a concentração total de RNA nesse volume (anexo 16 e 17). Os RNAs
23
foram então mandados para os Estados Unidos, onde a partir dos RNAs obtido dos
diversos grupos, foram sintetizados cDNAs e então cRNAs. Os RNAs foram
hibridizados em GeneChips
®
MG74Av2 (Affymetrix). A hibridização foi realizada
seguindo as instruções do fabricante do chip. O chip foi lavado em estação fluídica
(GeneChip
®
Fluidics Station 400) e escaneado em Scanner GeneArray
®
(Affymetrix)
equipado com laser de argônio. A captura e análise inicial das imagens da
hibridização foram realizadas com o auxílio do software MicroArray Suite 5.0 – MAS
(Affymetrix). Ao final desse processo foi criado um arquivo tipo CEL, contendo os
valores de intensidade de cada “probe” presente no GeneChip
®
. Os dados obtidos
dos três experimentos independentes foram analisados estatisticamente no Instituto
de Biologia Molecular do Paraná (IBMP) através do método de RMA (“Robust Multi-
Array method” - Irizarry et al., 2003). A determinação da expressão diferencial foi
realizada utilizando o método de SAM (“Significance Analysis of Microarray” -
Tusher, Tibshirani e Chu, 2001). Os critérios para a seleção dos genes
diferencialmente expressos (DEGs) foram de possuir “fold change” de no mínimo 2
vezes e taxa de falsa seleção (FDR – “false discovery rate”) de 5%. Ou seja, o gene
selecionado devia ter no mínimo aumentado ou diminuído em 2 vezes a sua
expressão, e dentre os genes selecionados, no máximo 5% poderiam ter sido
erroneamente selecionados.
4.16. Imunofenotipagem
Sabe-se que a grande maioria das células encontradas no peritôneo de
camundongos são macrófagos. A fim de se ter um controle maior dos experimentos
de expressão gênica, foi realizada a imunofenotipagem das células peritoneais de
camundongos, tratados ou não com CA (anexo 18). As células, após o tratamento in
vivo, foram coletadas, lavadas com PBS e incubadas com anticorpo monoclonal anti
CD45, CD11b e CD3 conjugados com PE (0,5 µg/10
6
células), por 40 minutos a
temperatura ambiente e no escuro. Em seguida, as células foram lavadas e
observadas em citômetro de fluxo (FACScalibur).
24
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os Mφ possuem papel essencial na defesa do organismo contra agentes
infecciosos e células tumorais. Vários trabalhos mostram que, para exercer
corretamente a função de defesa, os Mφ devem ser ativados. Estudos recentes com
o medicamento CA descreveram sua atividade em macrófagos. Aproximadamente
86% dos Mφ tratados com CA possuem morfologia de células ativadas em
microscopia de luz, eletrônica de transmissão e eletrônica de varredura (Piemonte e
Buchi, 2002). Os nossos resultados agora encontrados para esses experimentos,
realizados in vitro ou in vivo, foram semelhantes. Os procedimentos para realização
de todos os experimentos estão listados em anexo. Foram utilizados 3 grupos :
Canova (CA), solução hidro-alcoólica sucussionada (Hs) e controle ou normal (N).
A maioria das células dos grupos controle apresentava morfologia de
residente, ou seja, núcleo pequeno, escuro, oval ou reniforme, citoplasma pouco
vacuolizado e poucos grânulos citoplasmáticos densos (Fig. 4A), com poucas células
ativadas. O grupo CA por sua vez, apresentou Mφ ativados (Fig. 4B) definidos por
alterações morfológicas, como descrito por Piemonte e Buchi em 2002. Mφ ativados
são maiores, com núcleo grande, lobulado, claro com muita eucromatina e nucléolo
evidente, citoplasma bastante claro e vacuolizado, apresentando várias projeções
citoplasmáticas.
FIGURA 4 – MORFOLOGIA DE MACRÓFAGOS. Fig. 4A - Mφ residente encontrado
nos grupos controles, observado em microscopia eletrônica de transmissão (MET).
Fig. 4B - Mφ ativado encontrado no grupo CA também observado em MET.
Eletronmicrografias provenientes de três experimentos independentes em triplicata.
4A
4B
25
5.1. Produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (RNS)
A capacidade de resposta aumentada em Mφ ativados é resultado, em parte,
da aumentada capacidade dessas células em produzir determinadas moléculas.
Quando estimulados por vários tipos de agentes, os Mφ produzem e liberam ROS e
grandes quantidades de óxido nítrico (Formam e Torres, 2001). Esses oxidantes são
gerados pelas enzimas NAD(P)H oxidase e iNOS respectivamente (Babior, 2000).
Nesse trabalho foi investigado in vivo e in vitro a atividade das enzimas NADPH
oxidase e iNOS, bem como a produção de O
2
-
, H
2
O
2
e NO por macrófagos
peritoneais de camundongos.
Durante a ativação dos Mφ ocorre o chamado “burst oxidativo” (Pick e Keisari,
1980) onde o consumo de oxigênio molecular (O
2
) pela célula aumenta. Ocorre a
produção de NAD(P)H, outros intermediários redutores são ativados e vários
produtos de oxigênio são produzidos. Nesse caminho encontra-se em atividade uma
enzima multicomponente, a NAD(P)H oxidase (Wood e Austyn, 1993). NAD(P)H
oxidase é uma cadeia transportadora de elétrons que usa NAD(P)H como doador de
elétrons para reduzir O
2
em O
2
-
(Segal e Abo, 1993). O O
2
-
é convertido a H
2
O
2
espontaneamente ou pela ação da superóxido desmutase (SOD) (Pick e Keisari,
1980). Assim, a aumentada capacidade de Mφ peritoneais de camundongo ativados
secretarem ROS deve-se ao aumento da afinidade de sua oxidase por NAD(P)H
(Tsunawaki e Nathan, 1984). A NAD(P)H oxidase encontra-se normalmente
dormente em Mφ residentes, porém ela pode ser rapidamente ativada após
estímulos. Quando a célula é ativada, as subunidades citosólicas migram para as
membranas onde se ligam às subunidades associadas às membranas formando a
oxidase ativa. Esse processo resulta na produção de ROS intracelularmente em
vesículas e liberadas extracelularmente (Babior, 2000).
A detecção da atividade da NAD(P)H oxidase foi observada através de
citoquímica ultraestrutural, observada em MET. Essa técnica é baseada na reação
do H
2
O
2
gerado com o cloreto de cério, resultando em um precipitado de peridróxido
de cério (Ce-[OH]
2
OOH) (Briggs et al., 1975). A observação dos cortes das células
processadas para a detecção da enzima NAD(P)H oxidase, permitiu a identificação
dos grupos experimentais. Os Mφ foram observados sem contrastação para garantir
26
que os produtos eletrondensos fossem indicativos positivos da atividade enzimática.
Foi observada marcação positiva (precipitado de cério) para a enzima NAD(P)H
oxidase tanto no grupo controle quanto no grupo tratado dos experimentos in vitro
(Oliveira, 2002) e in vivo.
O produto da enzima foi observada tanto na membrana plasmática quanto em
estruturas semelhantes a vesículas ou cortes de invaginações das células. Quando o
substrato da enzima foi omitido do meio de incubação (grupo controle da enzima),
não foi observado produto de reação em nenhum grupo testado (Fig. 5A). A geração
de produto de reação é fortemente dependente da presença de NAD(P)H exógeno,
sendo claramente uma reação específica. Depósitos ocasionais de precipitado foram
detectados no grupo controle. Quando encontrados, localizavam-se em vesículas e
na superfície externa da membrana plasmática dos poucos Mφ ativados encontrados
nesse grupo (Fig. 5B). Porém, a marcação observada nesse grupo não foi tão
intensa quanto no grupo tratado. No grupo tratado a maioria das células apresentou
intensa marcação eletrondensa positiva, sugerindo uma maior atividade da enzima
NAD(P)H oxidase neste grupo. Depósitos do produto da reação foram encontrados
principalmente dentro de vesículas (Fig. 5C e 5D). Através dessa técnica não foi
encontrado H
2
O
2
em nenhuma organela como, por exemplo, mitocôndrias. Na
superfície externa da membrana plasmática também foi encontrado material
eletrondenso, porém em quantidades semelhantes aos Mφ do grupo controle. Esse
dado foi confirmado através da detecção de H
2
O
2
no sobrenadante dos Mφ, o qual
mostrou que, estatisticamente, não havia diferença entre a produção de H
2
O
2
pelos
Mφ controle e tratado (Graf. 1A). Mesmo fazendo-se uma comparação somente
entre os grupos com PMA (controle positivo), não foi encontrada diferença
significativa (Graf. 1B). Quando foram comparados os grupos testados com os
controles positivos foi encontrada diferença significativa. O resultado da produção de
H
2
O
2
baseia-se na oxidação, dependente de peroxidase, do vermelho de fenol pelo
H
2
O
2
descrita por Pick e Mizel em 1981. Esses dados foram obtidos a partir do
tratamento in vitro sendo semelhantes aos obtidos com o tratamento de células in
vivo – Graf. 1A’ e 1B’ (Oliveira, 2002).
27
FIGURA 5 – CITOQUÍMICA ULTRAESTRUTURAL PARA NAD(P)H OXIDASE. Os
Mφ provenientes de tratamento in vitro e in vivo foram incubados com o substrato da
enzima (NAD(P)H) e com cloreto de cério. Após a incubação, foram fixados e
processados para MET. Essas células foram observadas sem contrastação para
garantir que os precipitados eletrondensos eram provenientes da atividade
enzimática. Fig. 5A – ausência de produto de reação no grupo controle da enzima,
confirmando a especificidade da reação. Fig. 5B – célula do grupo controle
mostrando reação positiva (muitas vesículas sem precipitado). Fig. 5C e 5D –
células do grupo tratado mostrando intensa marcação, principalmente dentro de
vesículas. Flecha – produto da reação representativo da atividade da NAD(P)H
oxidase. Eletronmicrografias provenientes de três experimentos independentes em
triplicata.
5D
5B
5C
5A
28
GRÁFICO 1 – PRODUÇÃO DE H
2
O
2
. Os Mφ provenientes de tratamento in vitro e in
vivo foram incubados com solução de vermelho de fenol e peroxidase. PMA foi
utilizado como indutor da produção de H
2
O
2
. A quantidade de H
2
O
2
produzido foi
quantificada no sobrenadante da cultura. Esse foi lido em leitor de microplacas
utilizando filtro de comprimento de onda de 620nm. Graf. 1A – produção de H
2
O
2
,
em 60 e 90 minutos, por Mφ tratados ou não com CA in vitro. Graf. 1B – produção
de H
2
O
2
, em 60 e 90 minutos, por Mφ tratados ou não com CA in vitro adicionados
de PMA (indutor da produção de H
2
O
2
). Graf. 1A’ e 1B’ – comparação com
resultados prévios (Oliveira, 2002). Média + desvio padrão relativos a três
experimentos independentes em triplicata, analisados com ANOVA e teste de Tukey.
Produção de H
2
O
2
in vitro
0
2
4
6
8
10
12
14
16
60 minutos 90 minutos
nmol H
2
O
2
/10
6
células
N HS CA
1A
Produção de H
2
O
2
in vivo
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
60 minutos 90 minutos
nmol H
2
O
2
/10
6
células
N HS CA
1A’
Produção de H
2
O
2
in vitro
0
5
10
15
20
25
30
35
60 minutos 90 minutos
nmol H
2
O
2
/10
6
células
N + PMA HS + PMA CA + PMA
1B
Produção de H
2
O
2
in vivo
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
60 minutos 90 minutos
nmol H
2
O
2
/10
6
células
N + PMA HS + PMA CA + PMA
1B’
29
A maior fonte de H
2
O
2
nas células é gerada a partir da conversão espontânea
de O
2
-
ou via ação da enzima SOD, que cataliza a formação de H
2
O
2
a partir do O
2
-
(Jones, Hancock e Morice, 2000). A atividade da enzima NAD(P)H oxidase é a maior
fonte de produção de O
2
-
em Mφ, porém outras vias também podem gerar esse
radical, como por exemplo, através da iNOS. A produção de O
2
-
por Mφ é crítica para
a defesa do organismo. A natureza citotóxica do O
2
-
e das moléculas provenientes
das suas interações contribuem não somente para a morte de organismos invasores,
como também no dano tecidual e na inflamação (Xia e Zweier, 1997).
Quando O
2
-
é produzido e liberado da célula, o método mais confiável para
sua mensuração é o da redução do citocromo c (Forman e Torres, 2001). A
detecção de O
2
-
no sobrenadante da cultura foi realizada em Mφ tratados in vitro e
Mφ de camundongos tratados in vivo, segundo método descrito por Johnston,
Godzik e Cohn em 1978. Foi realizada uma curva de tempo visando monitorar
temporalmente esse radical. Um intervalo entre 5 e 30 minutos foi utilizado no
experimento in vitro (Graf. 2A e 2A’). Foi observada uma produção crescente desse
anion até cerca de 15 minutos. A partir desse ponto a concentração começou a
diminuir. Quando comparada estatisticamente, os grupos controle e Canova, a
diminuição após 15 minutos foi significativa. Após a estimulação com PMA, a
concentração de O
2
-
produzido pelos Mφ tratados com CA foi menor em todos os
tempos testados provavelmente pela interação com outros radicais produzidos. Para
o tratamento in vivo foram testados apenas os tempos de 15 e 30 minutos. Os
resultados foram semelhantes aos do tratamento in vitro, onde o grupo tratado
apresentou diminuição na produção de O
2
-
(Graf. 2B e 2B’).
O estado de aumento moderado dos níveis intracelulares de ROS é
conhecido como estresse oxidativo (Alonso-Magdalena et al., 2003). O papel das
ROS produzidas pelo “burst oxidativo” tem sido implicado na defesa do organismo
(Nygren et al., 2001), e como segundos mensageiros nas vias de sinalização de Mφ.
A produção das ROS pode ser induzida por vários estímulos em Mφ. Sendo assim
essas espécies reativas podem modular a função dos Mφ durante uma grande
variedade de respostas fisiológicas (Forman e Torres, 2001) como, por exemplo, a
modulação dos níveis de antioxidantes, a indução da expressão de novos genes e a
modificação de proteínas (Li e Karin, 1999).
30
GRÁFICO 2 – PRODUÇÃO DE O
2
-
. Após tratamento in vitro e in vivo os Mφ foram
incubados com solução contendo citocromo c. A mensuração da redução do
ferricitocromo c pelo O
2
-
foi obtida através de leitura do sobrenadante da cultura em
leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de 550nm. Graf. 2A e
2A’ – curva de tempo produção de O
2
-
por Mφ tratados ou não com CA in vitro. Graf.
2B e 2B’ – produção de O
2
-
em 15 e 30 minutos, por Mφ tratados ou não com CA in
vivo. Graf. 2A’ e 2B’ – controle positivo com PMA (indutor da produção de O
2
-
).
Média + desvio padrão relativos a três experimentos independentes em triplicata,
analisados com ANOVA e teste de Tukey *P < 0,05.
Produção de O
2
-
in vitro
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
2 min 4 min 6min 15 min 30min
N+PMA HS+PMA CA+PMA
nmol O
2
-
/10
6
células
2A’
*
*
*
*
*
Produção de O
2
-
in vitro
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
2 min 4 min 6min 15 min 30min
N HS CA
nmol O
2
-
/10
6
células
2A
*
*
Produção de O
2
-
in vivo
0
200
400
600
800
1000
15 minutos 30 minutos
N+PMA HS+PMA CA+PMA
nmol O
2
-
/10
6
células
2B’
*
*
Produção de O
2
-
in vivo
0
100
200
300
400
15 minutos 30 minutos
N HS CA
nmol O
2
-
/10
6
células
2B
*
*
31
O óxido nítrico é um mensageiro molecular produzido na oxidação da L-
arginina por uma família de enzimas chamadas óxido nítrico sintases (NOS)
(Rawlingson, 2003). É um produto citotóxico produzido por Mφ ativados e, junto com
ROS, tem sido implicado em várias funções regulatórias (Wink e Mitchell, 1998).
Uma delas é a ação direta sobre parasitas, causando efeitos tóxicos e inibitórios em
vários processos celulares como crescimento e multiplicação. A capacidade de inibir
a produção de NO tem sido demonstrada por vários parasitas intracelulares como
Leishmania sp (Liew, Wei e Proudfoot, 1997), Toxoplasma gondii (Seabra, de Souza
e Damatta, 2002) e Trypanosoma cruzi (Pakianathan e Kuhn, 1994). O NO e as ROS
são produzidos sob uma grande variedade de condições biológicas e são críticos na
defesa do organismo não só por danificarem patógenos e células tumorais, mas
também por serem reguladores do sistema imunitário (Nathan e Shiloh, 2000; Han et
al., 2001).
Experimentos em nosso laboratório mostraram um aumento estatisticamente
significativo na produção de NO pelos Mφ tratados com CA (Godoy, 2002). Como
nesses experimentos estavam faltando os resultados com o controle positivo eles
foram repetidos.
A avaliação da produção de NO foi determinada após 48 horas de cultivo, ou
em Mφ de camundongos tratados in vivo, indiretamente a partir da determinação da
concentração de nitrito (NO
2
-
), o qual é um produto estável da reação de produção
de NO, no sobrenadante das culturas (Green et al., 1982). Os resultados
encontrados foram semelhantes, ou seja, um aumento na produção de NO por
macrófagos tratados com Canova. Os resultados obtidos no controle positivo tratado
com CA são cumulativos com o CA, ou seja, o aumento da produção de NO pelo
LPS e IFNγ somou-se o efeito do Canova (Graf. 3A e 3B).
Verificou-se que o aumento da produção de NO encontrada no grupo tratado
com CA, foi acompanhada pelo aumento da detecção da enzima iNOS, tanto in vitro
quanto in vivo. A enzima foi marcada através de anticorpo contra iNOS e proteína A
conjugada com ouro coloidal 10nm e observada em MET. A enzima foi encontrada
no citoplasma, localizada principalmente próxima a vesículas e mitocôndrias (Fig.
6B, C e D).
32
GRÁFICO 3 – PRODUÇÃO DE NO. Após tratamento in vitro e in vivo o
sobrenadante dos Mφ foi incubado com o reagente de Griess. O LPS e IFN-γ foram
utilizados como indutores da produção de NO. A mensuração da quantidade de
nitrito produzida foi obtida através de leitura em leitor de microplacas utilizando filtro
de comprimento de onda de 550nm. Graf. 3A – produção de NO
2
-
por Mφ tratados
ou não com CA in vitro. Graf. 3B – produção de NO
2
-
por Mφ tratados ou não com
CA in vivo. Média + desvio padrão relativos a três experimentos independentes em
triplicata, analisados com ANOVA e teste de Tukey *P < 0,05.
Produção de NO in vivo
0
2
4
6
8
10
12
14
16
N N+LPS + IFN-y HS HS+LPS + IFN-y CA CA+LPS + IFN-y
Concentração de NO
2
-
µM
3B
*
*
*
Produção de NO in vitro
0
20
40
60
80
100
120
140
N N+LPS + IFN-y HS HS+LPS + IFN-y CA CA+LPS + IFN-y
Concentração de NO
2
-
µM
3A
*
*
*
*
33
FIGURA 6 – IMUNOMARCAÇÃO PARA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL
(iNOS). Os Mφ provenientes de tratamento in vitro e in vivo foram incubados com
anticorpo anti iNOS e proteína A complexada com ouro coloidal 10nm. Após a
incubação, foram fixados e processados para MET. Figuras referentes à Mφ tratados
com CA. Fig. 6A – Detecção da iNOS próxima ao núcleo, Fig. 6B – próxima à
mitocôndria, e Fig. 6C and 6D – dentro de vesículas. Flechas apontando para ouro
10nm representando a localização da iNOS. Eletronmicrografias provenientes de
três experimentos independentes em triplicata.
6A
6B
6C
6
D
34
Com esses experimentos demonstrou-se que Mφ tratados com CA
apresentaram aumento da atividade da enzima NAD(P)H oxidase assim como a
iNOS, produzindo conseqüentemente ROS e NO respectivamente. Os mecanismos
envolvidos na fagocitose normalmente agem sinergisticamente. ROS são muito
instáveis e são altamente reativos. Quando há um grande aumento na produção de
NO, esse passa a estar envolvido no processo inflamatório, interagindo com várias
substâncias (Murakami e Traber, 2003), como por exemplo os radicais de oxigênio,
com os quais reage muito rapidamente (Darley-Usmar, Wiseman e Halliwell, 1995).
As interações biológicas e químicas do NO e ROS com várias moléculas biológicas
tem importantes conseqüências nos mecanismos de diferentes condições
imunológicas e patológicas.
Mφ produzem O
2
-
e NO em quantidades quase equimolares. Em células que
produzem tanto O
2
-
quanto NO ocorre à reação, perto do limite de difusão (6,7x10
9
mol
-1
s
-1
), entre essas duas moléculas, resultando na formação do peroxinitrito
(ONOO
-
) (Forman e Torres, 2001). Assim, o local de ação do ONOO
-
deve ser nas
proximidades das fontes de O
2
-
(Wink e Mitchell, 1998; Nathan e Shiloh, 2000). A
superóxido desmutase (SOD) é conhecida como o sistema protetor antioxidante
celular mais potente contra os efeitos do O
2
-
. Entretanto, sabe-se que sob condições
onde a produção de NO está aumentada, o NO compete eficientemente com a SOD
pelo O
2
-
, formando o ONOO
-
(Virag et al., 2003). O ONOO
-
é uma molécula oxidante
extremamente potente que contribui para o dano celular, incluindo a peroxidação
lipídica, nitrosilação de diferentes moléculas, interação com canais de sódio e
interação com diferentes metais de transição (Forman e Torres, 2001).
A ativação da NAD(P)H oxidase levou ao aumento de produtos dentro de
vesículas, como observado nas figuras 5C e 5D. A detecção da iNOS ocorreu
próxima a locais contendo vesículas, como observado nas figuras 6C e 6D. Uma vez
que o NO é uma molécula pequena e não carregada e pode atravessar a membrana
vesicular (Rawlingson, 2003), pode-se presumir que em Mφ tratados com CA está
ocorrendo a formação de ONOO
-
dentro de vesículas. Esse fato pode ser
correlacionado com a diminuição considerável da produção de O
2
-
em células
tratadas, após 15 minutos (Graf. 2A e 2B). O citocromo c reduzido pode ser
reoxidado por oxidantes como o ONOO
-
, aparentemente diminuindo as taxas de
redução do citocromo c (Tarpey e Fridovich, 2001). Sendo assim, o fato de se
35
detectar maior atividade da NAD(P)H oxidase nas células tratadas, não implica
necessariamente na detecção do H
2
O
2
, uma vez que o O
2
-
é uma molécula tóxica,
instável e altamente reativa, que antes de ser dismutado em H
2
O
2
pode se combinar
com o NO, formando ONOO
-
(Murphy et al., 1998). Provavelmente devido a essa
interação os níveis de produção de H
2
O
2
por Mφ tratados com o CA
não estão
aumentados em relação ao controle.
O ONOO
-
é uma molécula de vida curta, muito mais reativa que seus
precursores. Ele reage rapidamente com enzimas, macromoléculas e lipídios,
influenciando várias funções celulares. A formação de ONOO
-
a partir de O
2
-
e NO
pode ser muito útil em algumas situações. Fagócitos podem gerar ONOO
-
para
ajudar a destruir patógenos. E, em algumas circunstâncias, pode agir como defesa
antioxidante prevenindo o aumento da concentração de O
2
-
e H
2
O
2
(Murphy et al.,
1998; Linares et al., 2001; Szabó, 2003). Sendo assim, o medicamento CA provoca
nos Mφ ativação celular, modificando a produção de moléculas reativas (Fig. 7),
promovendo o aumento das defesas do organismo.
FIGURA 7 – DESENHO ESQUEMÁTICO RESUMINDO OS EFEITOS DO CANOVA.
O CA aumentou a atividade da NAD(P)H oxidase e iNOS, aumentando
conseqüentemente, seus produtos. O NO pode reagir com o O
2
-
formando ONOO
-
.
= formação; = provável formação; = inibição.
NAD
(
P
)
H oxidase
O
2
H
2
O
2
iNOS
NO
OONO
-
O
2
-
NO
+
Núcleo
36
5.2. Laranja de acridina
Atividade metabólica alterada em células ativadas pode ser revelada através
de técnicas de fluorescência. Normalmente células vivas em cultura são estudadas
morfologicamente através de microscopia de contraste de fase ou de interferência,
pois estas proporcionam contraste suficiente do objeto de estudo. Porém essas
técnicas não fornecem informações suficientes sobre o estado funcional das células
e organelas. Entretanto, com a microscopia de fluorescência pode-se estudar os
processos vitais de células e organelas (Söderström, 1977).
Observou-se uma grande quantidade de vesículas ácidas em Mφ tratados
com CA quando marcados por laranja de acridina. O laranja de acridina é um
corante fluorescente utilizado para monitoração de mudanças citoplasmáticas
associadas com ativação celular (Nairn e Rolland, 1980). Ele pode ser utilizado
como coloração supravital de células, onde durante a exposição de células vivas a
baixas concentrações de laranja de acridina, devido ao pH baixo dentro dos
lisossomos, esse corante é preso nessas organelas, emitindo luminescência
vermelha. Pode também ser usado para estimar a eficiência da bomba de próton dos
lisossomos. Além disso, possibilita a coloração diferencial de RNA e DNA: laranja de
acridina mostra uma considerável mudança na sua absorbância e emissão de
espectro quando ligada a ácidos nucléicos de dupla fita, comparada à fita simples. A
fluorescência é verde quando a laranja de acridina intercala com DNA, e vermelha,
quando com RNA (Darzynkiewicz, 1994).
Foram observados Mφ corados com laranja de acridina na concentração de 5
µg/ml. Os Mφ foram tratados in vitro e observados em microscópio confocal. A
maioria das células dos grupos controle (N e HS) apresentou morfologia de células
residentes, como esperado, quando observados em Contraste Diferencial de
Interferência (DIC) (Fig. 8A). O grupo CA apresentou grande parte das células com
morfologia de ativados (Fig 8B).
Mφ ativados têm grande capacidade fagocítica, sendo assim apresentam
grande quantidade de vesículas. Quando observados em microscopia confocal, os
Mφ tratados com CA apresentaram grande número de projeções citoplasmáticas
onde foram observadas inúmeras vesículas de baixo pH (Fig. 8D e 8E). Células com
37
essa morfologia foram observadas em grande quantidade apenas nesse grupo. Nos
grupos controles essas células foram raramente observadas e a maioria não
continha grande quantidade de vesículas ácidas (Fig. 8C).
Como já foi descrito, o tratamento com CA aumenta a capacidade endocítica
dos Mφ (Lopes et al., 2006), assim como a produção de moléculas envolvidas na
defesa contra patógenos (de Oliveira et al., 2006). A observação de vesículas ácidas
dentro das projeções corrobora o fato do CA aumentar a capacidade de defesa
dessas células, pois assim a eficiência da destruição de patógenos é aumentada.
Quanto mais próximas da membrana plasmática estiverem as vesículas, mais rápido
elas se unirão aos endossomas, e mais rápida será a digestão. O próximo passo é
quantificar essas vesículas, uma vez que, talvez, o CA esteja apenas modificando a
distribuição dessas, e não aumentando sua quantidade.
Foram observados também corpos lipídicos margeando a membrana
plasmática (Fig. 8D). Lopes, em 2004, demonstrou que Mφ tratados com CA
apresentam diminuição de corpos lipídicos. O consumo dessas organelas ricas em
ácido aracdônico pode estar relacionado com a síntese de mediadores inflamatórios
e com a biogênese de membranas. Quando ativados, os Mφ aumentam seu volume
citoplasmático e lançam muitas projeções (Fig. 8D e 8E). Nesse caso, as reservas
lipídicas provavelmente estão sendo incorporadas à membrana plasmática quando
da formação de projeções.
38
FIGURA 8 – MARCAÇÃO COM LARANJA DE ACRIDINA. Os Mφ provenientes de
tratamento in vitro foram incubados com 5 µg/ml de laranja de acridina e observados
em microscópio confocal, com objetiva de 60x. Fig. 8A – Mφ controle observados em
DIC. Seta verde – Mφ residente. Barra: 20 µm. Fig. 8B – Mφ tratados observados em
DIC. Seta vermelha – Mφ ativado. Barra: 20 µm. Fig. 8C – Mφ residente do grupo
controle corado com laranja de acridina. Barra: 5 µm. Fig. 8D e 8E – Mφ ativados do
grupo CA corado com laranja de acridina. Observa-se uma grande quantidade de
vesículas ácidas dentro das inúmeras projeções citoplasmáticas. Seta branca –
corpo lipídico. Barra: 5 µm. Dados relativos a três experimentos independentes em
triplicata.
8C 8D
8E
8B 8A
39
5.3. Detecção de CD74(Ii)
O complexo principal de histocompatibilidade (MHC) possui papel crítico no
sistema imunitário através da apresentação de antígenos. A função das proteínas do
MHC de classe II é formar complexos contendo peptídeos antigênicos exógenos na
superfície de células apresentadoras de antígenos (APCs) os quais são
reconhecidos por linfócitos T. A cadeia invariante associada ao MHC de classe II –
CD74(Ii) – possui importante papel nesse processo, influenciando a expressão de
moléculas do MHC de classe II e a apresentação de antígenos (Badve et al., 2002).
A formação das moléculas do MCH II é iniciada no retículo endoplasmático, pela
associação das cadeias α e β com a cadeia invariante. A cadeia invariante ocupa o
sítio de ligação de antígenos do heterodímero de MHC II, impedindo a ligação com
antígenos. Apenas após a sua clivagem é que os antígenos podem se ligar ao MHC
II para apresentação (Pieters, 1997).
A detecção do CD74 (Ii) foi realizada em células do lavado peritoneal de
camundongos tratados in vivo. Diferenças significativas foram observadas no grupo
CA quando comparado com o grupo controle. A análise através de citometria de
fluxo mostrou diminuição de células expressando CD74 (Ii) no grupo CA (Graf. 4). A
observação em MET foi similar. Encontrou-se mais células marcadas no grupo
normal que no grupo CA (Fig. 9A – 9D).
Trabalhos recentes sobre o mecanismo envolvido na resposta imunitária
antitumoral indicam que o CD74 (Ii) é uma das moléculas envolvidas com
imunosupressão, uma vez que o aumento da expressão dessa molécula inibe a
apresentação de antígenos pelas moléculas do MHC de classe II (Ishigami et al.,
2001). Através da inibição do CD74 (Ii) e o aumento de proteínas de classe I e II
pode-se induzir uma potente resposta imunitária antitumoral (Wang et al., 2005).
Sendo assim, a diminuição da expressão do CD74 (Ii) nas células tratadas com CA
pode potencializar a resposta antitumoral. De fato, Sato et al. em 2005
demonstraram o aumento da resposta imunitária de camundongos portadores de
sarcoma 180 tratados com CA. Entretanto, muitos outros experimentos envolvendo
moléculas do MHC devem ser realizados para tentar elucidar os efeitos do CA sobre
essas moléculas.
40
GRÁFICO 4 – DETECÇÃO DE CD74 (Ii). Após tratamento in vivo os Mφ foram
permeabilizados, fixados e incubados com anticorpo monoclonal anti CD74 (Ii)
conjugado com FITC e analisados em citômetro de fluxo FACSCalibur. O grupo CA
apresentou diminuição estatisticamente significativa de CD74 (Ii). Média + desvio
padrão relativos a três experimentos independentes em triplicata, analisados com
ANOVA e teste de Tukey *P < 0,05.
CD74 (Ii)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
NHSCA
% de células
*
41
FIGURA 9 – IMUNOMARCAÇÃO PARA CD74 (Ii). Os Mφ provenientes de
tratamento in vivo foram incubados com anticorpo anti CD74 (Ii) e proteína A
complexada com ouro coloidal 10nm. Após a incubação as células foram fixadas e
processadas para MET. O grupo CA, aparentemente, apresentou menos marcação
que o grupo normal. Fig. 9A – Mφ do grupo N com morfologia de residente. Fig. 9C
– Mφ do grupo CA com morfologia de ativado. Fig. 9B e 9D – células do grupo N
apresentando marcação para CD74 (Ii). Flechas apontando para ouro 10nm
representando a localização do CD74 (Ii). Eletronmicrografias provenientes de três
experimentos independentes em triplicata.
9C
9A
9B
9D
42
5.4. Detecção da produção de citocinas
Outra característica de Mφ ativados é capacidade de produzir citocinas. As
citocinas influenciam o comportamento biológico das próprias células produtoras e
de diferentes tipos celulares. Elas possuem papel decisivo em determinar o status
imunitário de um determinado organismo. A integridade do sistema imunitário é
controlada por respostas celulares que estimulam a produção de citocinas (Rees,
1992). Como o CA ativa Mφ, provavelmente ele atua na produção de citocinas.
Para a detecção das citocinas produzidas pelos Mφ tratados ou não com o CA
foi utilizado um kit específico para detecção de citocinas – Mouse Th1/Th2 cytokine
cytometric bead array (CBA) kit da BD Pharmingem. O sobrenadante dos Mφ foi
incubado com os anticorpos e os “beads”, e lido em citômetro de fluxo FACSCalibur.
Aparentemente o tratamento com CA não modifica a produção de citocinas por Mφ
após 48 horas de cultivo (Graf. 5A). Piemonte e Buchi em 2002 mostraram a
diminuição da produção de TNFα in vitro pelo CA. Porém esse estava muito
aumentado no grupo controle. Provavelmente os animais estavam com alguma
patologia. Nossos experimentos mostraram que a produção de TNFα, pelas células
tratadas in vitro, apresentou tendência de diminuição, porém não apresentou
diferença estatisticamente significativa (Graf. 5A’). Já no tratamento in vivo não
foram observadas mudanças, provavelmente devido à interação dos Mφ com outros
tipos celulares.
Os Mφ obtidos de camundongos tratados in vivo com CA apresentaram
diminuição da produção de IL-2 e IL-4. Não foram encontradas diferenças na
produção das outras citocinas testadas IL-5, IFNγ (Graf. 5B) e TNFα (Graf. 5B’).
Cote-Sierra et al. em 2004 demonstraram que a neutralização in vivo de IL-2 inibe a
produção de IL-4 em dois modelos experimentais. A IL-4 possui papel importante em
regular atividades inflamatórias em Mφ. Observou-se a diminuição da produção de
IL-4, e também o aumento da atividade da NADPH oxidase por Mφ tratados com CA,
fato esse suportado pela literatura. Zhou, Lin e Murtaugh em 1995, demonstraram
que a IL-4 é uma das citocinas regulatórias de Mφ. Eles descreveram a diminuição
da produção de anion superóxido em Mφ devido à supressão da atividade da
NADPH oxidase pela IL-4.
43
GRÁFICO 5 – PRODUÇÃO DE CITOCINAS. Após tratamento in vitro e in vivo o
sobrenadante dos Mφ foi utilizado para incubação com os beads de detecção de
citocinas do kit mouse Th1/Th2 cytokine CBA. As amostras marcadas foram lidas em
citômetro de fluxo FACSCalibur. Graf. 5A – produção de IFN-y, IL-5, IL-4 e IL-2 por
Mφ tratados ou não com CA in vitro. Graf. 5A’ – produção de TNF-α por Mφ tratados
ou não com CA in vitro. Graf. 5B – produção de IFN-y, IL-5, IL-4 e IL-2 por Mφ
tratados ou não com CA in vivo. Graf. 5B’ – produção de TNF-α por Mφ tratados ou
não com CA in vivo. Média + desvio padrão relativos a três experimentos
independentes em triplicata, analisados com ANOVA e teste de Tukey *P < 0.05.
Produção de citocinas
in vitro
0
1
2
3
4
5
6
7
8
IFN-yIL-5IL-4IL-2
Concentração em pg/ml
N HS CA
5A
Produção de citocinas
in vivo
0
1
2
3
4
5
6
7
IFN-y IL-5 IL-4 IL-2
Concentração em pg/ml
N HS CA
5B
*
*
*
Produção de TNF alfa in vivo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NHSCA
Concentração em pg/ml
5B’
Produção de TNF alfa in vitro
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
NHSCA
Concentração em pg/ml
5A’
44
A IL-2 está envolvida no desenvolvimento da resposta imunitária antígeno
específica e não específica. Ela influencia o comportamento de outros tipos
celulares, e vários trabalhos têm demonstrado que a IL-2 é um fator de crescimento
essencial para a função de células B, eosinófilos, monócitos e macrófagos (Rees,
1992). Sbarba et al. em 1996 demonstraram que a IL-2 estimula downregulation do
receptor do fator estimulador de colônia de Mφ (M-CSF.R). O fator estimulador de
colônia de Mφ (M-CSF) é o principal fator de crescimento de fagócitos
mononucleares, suportando sua sobrevivência e estimulando a proliferação e
diferenciação. Observou-se a diminuição in vivo da produção de IL-2 por Mφ tratados
com CA. A efetividade da população de Mφ depende do balanço entre suas
respostas a estímulos proliferativos ou de ativação. Essas respostas tendem a ser
antagonistas, e a proliferação de células ativadas é usualmente reduzida. Sendo
assim a diminuição de IL-2 do meio celular facilita a eficácia dos Mφ tratados com
CA, os quais tendem a assumir estados específicos funcionais. Observou-se
também a diminuição da produção de IL-2 pelo grupo HS. Observou-se que
soluções hidro-alcoólicas sucussionadas apresentam alguns efeitos em Mφ porém
esses dados não foram publicados.
5.5. Expressão gênica
Uma vez que o medicamento CA ativa Mφ e altera a produção de ROS, NO e
citocinas resolveu-se averiguar se esse medicamento atua em nível gênico. O
padrão de genes expressos em uma célula pode fornecer informações detalhadas
sobre seu estado funcional (DeRisi, Iyer e Brown, 1997). Os experimentos de
expressão gênica foram realizados apenas com tratamento in vivo. Para isso, foram
utilizados 4 grupos: Canova (CA), solução hidro-alcoólica (H), solução hidro-alcoólica
sucussionada (Hs) e controle ou normal (N), em 3 experimentos distintos. Após a
análise estatística observou-se que os Mφ do grupo CA apresentaram modificações
no perfil de genes expressos quando comparados com os grupos controles. Esses
experimentos apenas delinearam um perfil de ação do CA, e sendo assim, muita
pesquisa ainda deve ser feita para corroborar os dados obtidos.
45
O CA estimula mudanças transcricionais em Mφ
A grande plasticidade e diversidade das respostas imunitárias derivam da
modulação da expressão gênica das células (Ohmori e Hamilton, 1994). Observou-
se nos experimentos de expressão gênica que os grupos N, H, HS quando
comparados entre si não apresentam muitas diferenças significativas. Poucos foram
os genes diferencialmente expressos (DEGs) encontrados com as interações N x H
(Graf. 6A), N x HS (Graf. 6B) e H x HS (Graf. 7A). Para se analisar esses gráficos,
deve-se ter em mente que, os genes que se apresentam entre as linhas azuis não
apresentam diferenças na sua expressão. Genes que apresentam diferença de
expressão entre os grupos analisados estão fora das linhas azuis. Como nesse
experimento os critérios para a seleção dos DEGs foram de possuir fold change de
no mínimo 2 vezes e FDR de 5%, apenas alguns poucos genes (de todos os que se
encontravam fora das linhas azuis) foram considerados como diferencialmente
expressos. Os DEGs encontrados nas comparações entre esses grupos são
visualizados nas tabelas 1, 2 e 3. Esses estão envolvidos principalmente no ciclo
celular e na transdução de sinal.
Após comparação entre os grupos controles, observamos que não haviam
grandes diferenças significativas entre eles. Portanto resolvemos utilizar o grupo HS
para comparar com o grupo CA, pois qualquer variação encontrada seria resposta
apenas do medicamento. Diferenças estatisticamente significativas foram
encontradas quando esses dois grupos foram comparados (Graf. 7B). Foram
encontrados 147 DEGs, 45 aumentados (tabela 4) e 102 diminuídos (tabela 5). Na
tentativa de facilitar a análise dos DEGs encontrados, foi analisada apenas a relação
entre o grupo CA x HS. Para a discussão foram escolhidos alguns genes, sendo que
a maioria deles estão de alguma forma relacionados com pesquisas anteriores.
46
GRÁFICO 6 – SAM PLOT DE COMPARAÇÃO DOS GRUPOS. Após tratamento in
vivo o RNA total dos Mφ foi isolado e utilizado para hibridização em GeneChips
®
MG74Av2 (Affymetrix). A análise estatística foi realizada com o método de SAM.
Graf. 6A - sam plot de comparação dos grupos N x H. Graf. 6B - sam plot de
comparação dos grupos N x HS. Pontos vermelhos – genes com expressão
aumentada no grupo N.
SAM Plotsheet
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
-15 -10 -5 0 5 10 15
Expected Score
Observed Score
Significant: 26
Median number of false positives: 1.31
False Discovery Rate (%): 5.03
6A
SAM Plotsheet
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
-15 -10 -5 0 5 10 15
Ex p e ct e d Sco r e
Observed Score
Significant: 2
Median number of false positives: 0
False Discovery Rate (%): 0
6B
47
GRÁFICO 7 – SAM PLOT DE COMPARAÇÃO DOS GRUPOS. Após tratamento in
vivo o RNA total dos Mφ foi isolado e utilizado para hibridização em GeneChips
®
MG74Av2 (Affymetrix). A análise estatística foi realizada com o método de SAM.
Graf. 7A - sam plot de comparação dos grupos H x HS. Graf. 7B - sam plot de
comparação dos grupos CA x HS. Pontos vermelhos – genes com expressão
aumentada. Pontos verdes – genes com expressão diminuída.
SAM Plot
-10
-5
0
5
10
15
-8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8
Exp e c te d
Observed
Si
g
nificant: 145
Median # false signif icant: 7,14152
Delta 0,38814
Fold Change 2,00000
7B
SAM Plotsheet
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
-15 -10 -5 0 5 10 15
Expected Score
Observed Score
Significant: 6
Median number of false positives: 0.46
False Discovery Rate (%): 7.61
7A
48
TABELA 1 – DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS N X H
Fold change Sinalização celular e transdução de sinal Sigla
2,03
ras homology gene family, member B Rhob
2,51
endothelin receptor type B Ednrb
3,95
chemokine orphan receptor 1 Cmkor1
3,75
Thrombomodulin Thbd
6,39
chemokine (C-X-C motif) receptor 4 Cxcr4
Citoesqueleto / adesão celular
2,51
activated leukocyte cell adhesion molecule Alcam
2,83
secreted phosphoprotein 1 Spp1
Resposta imune
2,07
Haptoglobin Hp
Metabolismo
2,10
arylsulfatase A Arsa
11,58
glycerophosphodiester phosphodiesterase domain containing 3 Gdpd3
Transporte
2,56
hemoglobin alpha, adult chain 1 Hba-a1
Ciclo celular
3,01
FBJ osteosarcoma oncogene Fos
3,55
dual specificity phosphatase 1 Dusp1
2,83
serum/glucocorticoid regulated kinase Sgk
2,49
apoptosis inhibitor 6 - CD5 antigen-like Cd5l
2,06
regulator of G-protein signaling 2 Rgs2
2,11
PERP, TP53 apoptosis effector Perp
Transcrição
2,43
nuclear factor, interleukin 3, regulated Nfil3
2,00
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of
chromatin, subfamily a, member 2
Smarca2
2,06
Sjogren syndrome antigen B Ssb
Outros
2,06
CDNA sequence BC023892 BC023892
2,08
RIKEN cDNA 2310015N07 gene 2310015N07Rik
2,22
serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B, member 6a Serpinb6a
2,01
cDNA sequence BC025546 BC025546
2,02
RIKEN cDNA 1500016H10 gene ---
2,03
CD24a antigen Cd24a
TABELA 2 – DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS N X HS
Fold change Resposta immune Sigla
6,47
chemokine (C-X-C motif) receptor 4 Cxcr4
0,45
glycoprotein 49 A /// leukocyte immunoglobulin-like receptor, subfamily B,
member 4
Gp49a ///
Lilrb4
49
TABELA 3 – DEGs ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS GRUPOS H X HS
Fold change Sinalização celular e transdução de sinal Sigla
0,38
Endothelin receptor type B Ednrb
Resposta imune
0,49
peptidoglycan recognition protein 1 Pglyrp1
0,46
Haptoglobin Hp
Transcrição - transcription
0,48
nuclear factor, interleukin 3, regulated Nfil3
Outros
0,38
coactosin-like 1 (Dictyostelium) Cotl1
0,49
expressed sequence AA536743 AA536743
TABELA 4 – DEGs AUMENTADOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Continua)
Fold change Sinalização celular e transdução de sinal Sigla
2,70
metallothionein 1 Mt1
7,80
metallothionein 2 Mt2
2,07
Olfactory receptor 71 Olfr71
5,49
suppressor of cytokine signaling 3 Socs3
2,15
suppressor of cytokine signaling 3 Socs3
Citoesqueleto / adesão celular
2,34
actin, beta, cytoplasmic Actb
2,05
dynein, cytoplasmic, intermediate chain 1 Dncic1
2,15
Talin Tln
2,61
syndecan 4 Sdc4
Resposta imune
2,42
histocompatibility 2, class II antigen E beta H2-Eb1
4,57
heme oxygenase (decycling) 1 Hmox1
5,60
HLA-B-associated transcript 9 Bat9
Metabolismo
2,54
mevalonate kinase Mvk
2,70
GM2 ganglioside activator protein Gm2a
Transporte
4,67
adaptor protein complex AP-2, alpha 2 subunit Ap2a2
6,18
hemoglobin alpha, adult chain 1 Hba-a1
17,46
hemoglobin alpha, adult chain 1 Hba-a1
3,92
hemoglobin, beta adult major chain Hbb-b1
2,19
thioredoxin reductase 3 Txnrd3
Ciclo celular
3,60
growth arrest and DNA-damage-inducible 45 beta Gadd45b
2,15
Talin Tln
2,19
RIKEN cDNA 1700051C09 gene 1700051C09Rik
50
TABELA 4 – DEGs AUMENTADOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Conclusão)
Fold change Transcrição Sigla
2,55
ribosomal protein S28 Rps28
6,46
Small nuclear ribonucleoprotein B Snrpb
2,16
centaurin, gamma 3 Centg3
7,14
heat shock protein 1A Hspa1a
5,60
heat shock protein 1B Hspa1b
4,66
splicing factor 3a, subunit 2 Sf3a2
3,43
sequestosome 1 Sqstm1
Outros
2,23
fatty acid desaturase 1 Fads1
3,03
mitochondrial ribosomal protein S18A Mrps18a
2,09
protease, serine, 25 Prss25
Função desconhecida
2,30
P53-variant (p53) ---
2,25
Aspartyl aminopeptidase Dnpep
2,14
Hypothetical gene supported by BC030401 (LOC380819), mRNA ---
3,14
Zinc finger, CCHC domain containing 7 Zcchc7
2,23
solute carrier family 39 (zinc transporter), member 4 Slc39a4
4,65
RIKEN cDNA 9430029L20 gene 9430029L20Rik
2,59
RIKEN cDNA A430104N18 gene A430104N18Rik
3,92
DNA segment, Chr 14, Wayne State University 89, expressed D14Wsu89e
2,12
ephrin A3 Efna3
2,39
erythroid differentiation regulator 1 Erdr1
2,01
expressed sequence R74740 R74740
2,19
RNA binding motif protein 9 Rbm9
2,56
Secretin Sct
TABELA 5 – DEGs DIMINUÍDOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Continua)
Fold change Sinalização celular e transdução de sinal Sigla
0,43
annexin A1 Anxa1
0,29
expressed sequence AW111922 AW111922
0,42
expressed sequence AW111922 AW111922
0,43
protein tyrosine phosphatase, receptor type, O Ptpro
0,43
RAB9, member RAS oncogene family Rab9
0,38
RAS p21 protein activator 4 Rasa4
Citoesqueleto / adesão celular
0,34
activated leukocyte cell adhesion molecule Alcam
0,39
integrin alpha M Itgam
51
TABELA 5 – DEGs DIMINUÍDOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Continuação)
Fold change Resposta imune Sigla
0,48
bone marrow stromal cell antigen 1 Bst1
0,40
chemokine (C-C motif) ligand 5 Ccl5
0,49
chemokine (C-C) receptor 2 Ccr2
0,43
CD1d1 antigen Cd1d1
0,31
chemokine (C-X-C motif) receptor 4 Cxcr4
0,49
dual specificity phosphatase 1 Dusp1
0,45
guanylate nucleotide binding protein 1 Gbp1
0,36
guanylate nucleotide binding protein 2 Gbp2
0,37
histocompatibility 2, Q region locus 7 H2-Q7
0,47
interferon inducible protein 1 Ifi1
0,42
interferon gamma inducible protein Ifi47
0,29
interferon activated gene 202B Ifi202b
0,36
interferon activated gene 205 Ifi205
0,46
interferon gamma induced GTPase Igtp
0,50
proteosome (prosome, macropain) subunit, beta type 9 (large
multifunctional protease 2)
Psmb9
Metabolismo
0,46
aldehyde dehydrogenase 9, subfamily A1 Aldh9a1
0,47
adenylosuccinate synthetase 2, non muscle Adss2
0,47
glucose-6-phosphate dehydrogenase X-linked G6pdx
0,41
glyoxalase 1 Glo1
0,43
glycogenin 1 Gyg1
Transporte
0,45
RIKEN cDNA 1110032D12 gene 1110032D12Rik
0,49
ADP-ribosylation factor-like 6 interacting protein 5 Arl6ip5
0,41
ATPase, Ca++ transporting, ubiquitous Atp2a3
0,50
chloride channel 3 Clcn3
0,40
cytochrome b-245, beta polypeptide Cybb
0,49
electron transferring flavoprotein, alpha polypeptide Etfa
0,48
fatty acid binding protein 7, brain Fabp7
0,49
sorting nexin 10 Snx10
0,45
syntaxin 3 Stx3
0,47
syntaxin binding protein 3 Stxbp3
0,38
thioredoxin domain containing 7 Txndc7
0,34
thioredoxin domain containing 7 Txndc7
Ciclo celular
0,38
MAD2 (mitotic arrest deficient, homolog)-like 1 (yeast) Mad2l1
0,41
antigen identified by monoclonal antibody Ki 67 Mki67
0,36
schlafen 1 Slfn1
0,49
schlafen 2 Slfn2
0,46
schlafen 4 Slfn4
0,49
transforming growth factor, beta 2 Tgfb2
52
TABELA 5 – DEGs DIMINUÍDOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Continuação)
Fold change Transcrição Sigla
0,46
RIKEN cDNA 1110054N06 gene 1110054N06Rik
0,36
Cbp/p300-interacting transactivator, with Glu/Asp-rich carboxy-
terminal domain, 2
Cited2
0,40
cleavage stimulation factor, 3' pre-RNA subunit 2 Cstf2
0,48
DEAH (Asp-Glu-Ala-His) box polypeptide 36 Dhx36
0,47
Eukaryotic translation initiation factor 3, subunit 6 Eif3s6
0,46
fragile X mental retardation syndrome 1 homolog Fmr1
0,43
GA repeat binding protein, alpha Gabpa
0,47
pre B-cell leukemia transcription factor 3 Pbx3
0,50
p300/CBP-associated factor Pcaf
0,37
SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of
chromatin, subfamily a, member 2
Smarca2
0,23
signal transducer and activator of transcription 1 Stat1
0,44
TAF9 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-
associated factor
Taf9
0,39
transcription elongation factor A (SII) 1 Tcea1
0,48
tripartite motif protein 30 Trim30
0,37
Wilms' tumour 1-associating protein Wtap
0,48
zinc finger protein 62 Zfp62
0,47
zinc finger protein 265 Zfp265
Outros
0,44
formyl peptide receptor, related sequence 2 Fpr-rs2
0,44
macrophage receptor with collagenous structure Marco
0,45
mitochondrial ribosomal protein L36 Mrpl36
0,39
X-linked myotubular myopathy gene 1 Mtm1
0,44
numb gene homolog (Drosophila) Numb
0,44
Pyruvate dehydrogenase kinase, isoenzyme 3 Pdk3
0,40
Quaking Qk
0,50
ribophorin II Rpn2
0,35
Succinate dehydrogenase complex, subunit A, flavoprotein (Fp) Sdha
0,42
sestrin 1 Sesn1
0,37
signal sequence receptor, gamma Ssr3
0,48
striatin, calmodulin binding protein 3 Strn3
0,32
T-cell specific GTPase Tgtp
0,43
Ubiquitin-conjugating enzyme E2E 1, UBC4/5 homolog (yeast) Ube2e1
0,40
vesicle-associated membrane protein 3 Vamp3
53
TABELA 5 – DEGs DIMINUÍDOS ENCONTRADOS NA COMPARAÇÃO DOS
GRUPOS CA X HS (Conclusão)
Fold change Função desconhecida Sigla
0,48
--- ---
0,44
Diabetic nephropathy-related gene 1 mRNA, partial sequence ---
0,41
Transcribed sequence with moderate similarity to protein
sp:P00722 (E. coli) BGAL_ECOLI Beta-galactosidase
---
0,41
--- ---
0,49
Transcribed sequences ---
0,49
RIKEN cDNA 0610010K14 gene 0610010K14Rik
0,44
RIKEN cDNA 1110021E09 gene 1110021E09Rik
0,44
RIKEN cDNA 2310015N07 gene 2310015N07Rik
0,45
RIKEN cDNA 2610042L04 gene 2610042L04Rik
0,44
RIKEN cDNA 2610205H19 gene 2610205H19Rik
0,47
RIKEN cDNA 6330442E10 gene 6330442E10Rik
0,45
RIKEN cDNA 9130022A11 gene 9130022A11Rik
0,49
expressed sequence AI265322 AI265322
0,46
expressed sequence AI788669 AI788669
0,44
expressed sequence AW112010 AW112010
0,41
DNA-damage-inducible transcript 4 Ddit4
0,46
heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H2 Hnrph2
0,49
influenza virus NS1A binding protein Ivns1abp
0,37
LIM domain only 7 Lmo7
0,48
open reading frame 18 ORF18
0,36
ring finger protein 138 Rnf138
A ativação de Mφ é caracterizada, entre outros critérios, por mudanças
celulares e ultraestruturais. Uma vez que muitas dessas atividades funcionais
requerem aumento da síntese protéica, o conteúdo de RNA celular pode ser usado
como parâmetro para identificar células com atividades funcionais aumentadas.
Sendo assim a análise da expressão gênica de Mφ tratados com CA pode fornecer
informações detalhadas sobre seu estado funcional, além de contribuir para o
entendimento do seu modo de ação. O RNA extraído das células do lavado
peritoneal era proveniente principalmente de Mφ (Fig.10), uma vez que foi realizada
a imunofenotipagem das células do lavado.
54
Imunofenotipagem
0
20
40
60
80
100
CD45 CD11b CD3
% Células
N HS CA
FIGURA 10 – IMUNOFENOTIPAGEM DAS CÉLULAS PERITONEAIS DE
CAMUNDONGOS. Após tratamento in vivo o lavado peritoneal foi incubado com
anticorpos monoclonais anti CD45 (leucócitos em geral), CD11b
(monócitos/macrófagos) e CD3 (linfócitos T, principalmente) conjugados com PE e
analisados em citômetro de fluxo FACSCalibur. Observou-se que os
monócitos/macrófagos são as células mais abundantes no lavado. Não houve
diferença estatisticamente significativa entre os grupos. Dados relativos a três
experimentos independentes em triplicata, analisados com ANOVA.
55
Através dos experimentos de expressão gênica foi possível verificar que o CA
estimula mudanças transcricionais nos Mφ. O tratamento induziu o aumento e a
diminuição da expressão de alguns genes, observada através do fold change. A
análise do fold change detecta apenas genes que são diferencialmente expressos,
devido apenas à variação biológica (Irizarry et al., 2003). Para o melhor
entendimento da ação do CA em Mφ, grupos foram criados baseados na função dos
genes.
5.5.1.Processos transcricionais e traducionais
Muitas mudanças celulares que acompanham a ativação dos Mφ dependem
da modulação específica da expressão gênica. Em eucariotos a expressão é
controlada em vários níveis incluindo mecanismos transcricionais, pós-
transcricionais, traducionais e modificações pós-transcricionais (Ohmori and
Hamilton, 1994). O grupo CA apresentou aumento na expressão de genes
relacionados com proteínas envolvidas na transcrição, processamento de RNA
(splicing), regulação gênica e tradução.
Elementos regulatórios são conhecidos por agir através do reconhecimento
de uma seqüência específica e pela ligação a fatores protéicos específicos (Ohmori
and Hamilton, 1994). A Centaurina gamma-3 (Centg3) é uma proteína necessária à
regulação gênica, e sua transcrição estava aumentada no grupo CA.
A maioria dos genes de eucariotos contém seqüência não codificantes
(introns) que devem ser removidas do transcrito primário antes da tradução em
proteínas (Kambach, Walke e Nagai, 1999). O splicing do mRNA, onde os introns
são removidos dos pré-mRNAs, é mediado por um grande número de
ribonucleoproteínas denominadas “small nuclear ribonucleoprotein” (snRNP) e não-
snRNP. Essas ajudam no reconhecimento do local de splicing, dirigem as mudanças
conformacionais e regulam a atividade dos fatores de splicing. Essa união de
moléculas é denominada spliceossoma (Bond e James, 2000). Observou-se o
aumento da expressão gênica da snRNP-B. As snRNPs nos spliceossomas contém
algumas proteínas que são comuns a todas as snRNPs. A proteína B é uma delas.
Também foi observado o aumento da expressão do fator de splicing 3a (SF3a) pelo
56
CA. A SF3a reconhece a região 3’ dos locais de splicing assim que ocorre a
formação do spliceossoma (Tanackovic e Krämer, 2005).
Na tradução, a seqüência de códons no mRNA dirige a síntese da cadeia
polipeptídica. Esse processo ocorre no ribossomo, e o movimento do tRNA e do
mRNA no ribossomo é um processo complicado que combina alta velocidade e
acurácia. O ribossomo é uma partícula grande e consiste de duas subunidades em
todas as espécies (Ramakrishnan, 2002). O ribossomo de mamíferos é composto de
4 espécies de RNAs e aproximadamente 80 proteínas diferentes (Chan, Olvera e
Wool, 1991). A expressão gênica da proteína ribossomal S28 e da proteína
mitocondrial ribossomal S18A estavam aumentadas no grupo CA.
Mudanças nos perfis transcricionais e traducionais são conseqüências da
aumentada atividade dos Mφ. Sendo assim, o aumento da regulação de genes
envolvidos nesses processos era esperado.
5.5.2. Dinâmica e estrutura celular
As integrinas fazem parte de uma família de proteínas que conectam os
componentes da matriz extracelular com moléculas do citoesqueleto. Interações
integrinas-ligante são acompanhadas pela ativação e agrupamento das integrinas na
superfície celular, além da transdução dessa ativação para sinais em vias
intracelulares. Essas vias são relacionadas com uma grande variedade de eventos
como crescimento, diferenciação, ativação, migração e secreção celular (Hynes,
1992). O CA aumentou a expressão de genes relacionados a moléculas ligadas a
interações intra e extracelulares.
Piemonte e Buchi em 2002 mostraram que Mφ tratados com CA
apresentavam redistribuição dos receptores para fibronectina (integrina α
5
β
1
) e de
filamentos de actina no citoesqueleto. Nos experimentos de expressão gênica foi
observado o aumento da expressão da β actina, corroborando os dados anteriores.
O citoesqueleto de actina e sua conexão com integrinas é altamente dinâmico e
sujeito a muitos processos regulatórios. Existe uma ligação íntima entre integrinas e
a sinalização por fatores de crescimento e citocinas, assim como uma dependência
funcional mútua entre integrinas e filamentos de actina. A interação de ligantes com
integrinas leva ao agrupamento das integrinas e recrutamento de filamentos de
57
actina e proteínas sinalizadoras nos domínios citoplasmáticos das integrinas
(Brakebusch e Fässler, 2003).
Proteínas ligantes de actina, como a talina, por exemplo, agem como
plataformas de transdução de sinal mediado pelas integrinas (Brakebusch e Fässler,
2003). Observou-se o aumento da expressão gênica para a talina. A talina é um
componente importante da adesão focal que se liga a múltiplas moléculas de
adesão. Ela fisicamente se justapõe a integrinas e a actina intracelular, tanto
diretamente através do ligação simultânea ao domínio citoplasmático da integrina
quanto indiretamente através da ligação a actina. Em adição ao seu papel estrutural,
a talina também parece atuar na regulação da ativação da integrina, na organização
da adesão, na estabilização da ligação integrina-actina e na mediação da
sinalização via integrina. Ela também é requerida na conexão matriz extracelular-
integrina-actina (Nayal, Webb e Horwitz, 2004).
Outra proteína envolvida na adesão que apresentou aumento na expressão
gênica foi o sindecan-4. O sindecan é uma proteoglicana heparan sulfato
transmembrana que está envolvida na formação e função da adesão focal. Ela
parece ser um co-receptor no processo de adesão a uma grande variedade de
ligantes extracelulares, modificando as respostas mediadas por integrinas. Apesar
disso, as integrinas parecem ser os receptores primários das respostas via sindecan-
4 (Woods e Couchman, 2001).
A dinâmica do citoesqueleto é um importante processo celular no
“espraiamento” e motilidade celular, assim como na endocitose. O intenso tráfego
intracelular necessário para permitir a interação dos fagossomas com os lisossomas
é dependente de microtúbulos (Jahraus et al., 1994; Desjardins et al., 1994). O
movimento bidirecional dos fagossomas ao longo dos microtúbulos é mediado por
dineína e cinesina citoplasmáticas (Rabinowitz et al., 1992; Blocker et al., 1997). O
tratamento com o CA induz o aumento da cadeia intermediária da dineína, A dineína
participa em várias atividades celulares, incluindo transporte de organelas,
organização do citoesqueleto e na mitose (Straube et al., 2001). A cadeia
intermediária parece ter papel importante no direcionamento da molécula da dineína
para o seu local apropriado na célula (Vaughan et al., 1996). Experimentos
anteriores demonstraram que o CA aumenta a habilidade de “espraiamento” dos Mφ
e favorece uma resposta imunológica celular contra microorganismos através do
58
aumento da eficiência da via fagocítica (Lopes et al., 2006). Sendo assim, o aumento
da capacidade de Mφ unir fagossomos com lisossomos é essencial para uma
fagocitose eficiente.
Moléculas do MHC de classe II são glicoproteínas transmembrana essenciais
na apresentação de antígenos gerados em vesículas intracelulares em Mφ e outras
APCs aos linfócitos T durante a resposta imunitária (Yun, DeCarlo e Hunter, 1999).
O CA aumentou a expressão do antígeno E beta do MHC de classe II.
Esses dados demonstram que o CA além de aumentar a adesão celular,
aumenta as conseqüências funcionais dos Mφ, como a capacidade fagocítica e a
capacidade de apresentar antígenos via MHC de classe II.
5.5.3. Resposta imunitária
Muitos supressores da sinalização de citocinas (SOCS) e proteínas SH2
induzíveis por citocinas (CIS) regulam a resposta de células imunitárias a citocinas.
Além disso, são reguladores fisiológicos chave do sistema imunitário (Kubo, Hanada
e Yoshimura, 2003). O supressor da sinalização de citocinas 3 (SOCS 3) estava
aumentado nos Mφ tratados com CA. SOCS3 é um regulador positivo de APCs e
está envolvido na diferenciação de células T, além de regular a função das células T
através da regulação negativa da IL-2 (Kubo et al., 2003). As observações de
diminuição da produção da IL-2 pelas células tratadas corroboram a indução do
SOCS 3 pelo CA.
Os receptores de efrinas (Eph) são a maior família de proteínas tirosina
cinase transmembrana com domínio extracelular capaz de reconhecer sinais do
microambiente celular e influenciar a interação célula-célula e a migração celular.
Alem disso, eles afetam a motilidade e adesão celular através da modulação da
atividade de integrinas (Surawska, Ma e Salgia, 2004). Os receptores de Eph e as
efrinas ativam vias de transdução de sinal através da ligação de vários tipos de
proteínas citoplasmáticas que regulam a adesão e organização da actina no
citoesqueleto (Poliakov, Cotrina e Wilkinson, 2004). A expressão do gene da Eph A3
encontra-se aumentada nos Mφ tratados com CA. A Eph A3 pode ter papel
importante na função linfóide (Surawska, Ma e Salgia, 2004). Assim, Mφ com
59
expressão aumentada desse receptor podem apresentar uma melhor transdução de
sinal.
CD1 pertence a um grande grupo de moléculas não clássicas que são
estruturalmente relacionadas com as moléculas clássicas de apresentação de
antígeno do MHC de classe I. Em camundongos, o CD1 é codificado por 2 genes, o
CD1d1 and CD1d2 (Bradbury et al., 1988). Observou-se que o CA diminuiu a
expressão do CD1d1. A deficiência de CD1d1 leva à diminuição drástica na
produção de IL-4 (Mendiratta et al., 1997). A observação da diminuição na produção
de IL-4 pelas células tratadas com CA deve-se provavelmente a diminuição da
expressão do CD1d1.
5.5.4. Proteínas relacionadas ao estresse: citoprotetores
Macrófagos tratados com CA apresentam atividade aumentada tanto da
enzima NAD(P)H oxidase quanto da iNOS, produzindo conseqüentemente ROS e
NO (de Oliveira et al., 2006). Para proteger células e tecidos da toxicidade de
radicais oxidativos, as células devem induzir a expressão de genes citoprotetores.
Observou-se que o CA aumentou a expressão de genes que codificam proteínas
normalmente expressas em condições de estresse como proteína “heat shock”
Hsp70-1 (1A e 1B), metalotioneinas (MT-1 e MT-2), heme oxigenase-1 (HO-1),
tioredoxina redutase (TR-3), “growth arrest and DNA-damage-inducible” 45 beta
(GADD45β), regulador de diferenciação eritróide (EDR) e sequestossoma
(SQSTM1). Antioxidantes celulares parecem ser cruciais para diminuir o estresse
oxidativo (Poss e Tonegawa, 1997).
Dos sistemas enzimáticos antioxidantes conhecidos, talvez os mais
estudados são os que metabolizam diretamente os precursores dos radicais livres
como as superóxidos dismutases, catalases e glutationas peroxidases. Além dessas,
as proteínas heat shock (HSP) também são altamente induzidas durante a resposta
ao estresse (Poss e Tonegawa, 1997). As HSPs englobam um grande grupo de
proteínas (Bachelet, Adric e Polls, 1998) que medeiam várias funções citoprotetoras
e “housekeeping” agindo como imunoreguladoras (Pockely, 2003). O CA aumentou a
expressão gênica da Hsp70 (1A e 1B). Sabe-se que a indução da Hsp70 em Mφ é
dependente da ativação da enzima NADPH oxidase e subseqüente geração de ROS
60
(Bachelet, Adric e Polls, 1998). Metalotioneinas (MT) e heme-oxigenase (HO)
também estão envolvidas no sistema de defesa contra o estresse oxidativo (Takeda,
Fujita e Shibahara, 1995). Observou-se que ambas isoformas (MT-1 e MT-2)
estavam sendo expressas nos Mφ tratados com CA. As MT recentemente foram
descritas como tendo papel de “scavenger” (Sato e Bremner, 1993). A heme-
oxigenase-1 (HO-1) e os seus produtos são conhecidos por mediar potentes efeitos
antiinflamatórios em monócitos e/ou Mφ, protegendo essas células do dano e
modulando a iniciação da resposta imunitária (Otterbein et al., 2003). Observou-se o
aumento da expressão do gene que codifica a HO-1 nas células tratadas com CA.
Durante o estresse, a HO-1 é altamente induzida, e ela é considerada um dos
indicadores mais confiáveis do estresse oxidativo celular (Poss e Tonegawa, 1997).
Se Mφ apresentam superexpressão da HO-1, a resposta proinflamatória (e.x.
produção de TNFα) é marcadamente inibida, enquanto que a resposta
antiinflamatória (por exemplo, a produção de IL-10) é aumentada (Minamino et al.,
2001).
Outras enzimas conhecidas por participarem na regulação redox são as
tioredoxinas redutases (TR). É sabido que a sinalização redox é alcançada através
da união de ROS com processos de óxido-redução. Três isozimas TR foram
identificadas em humanos e camundongos (Sun et al., 1999). Observou-se o
aumento da expressão do gene da TR-3. As TRs agem reciclando o sistema redox
com resultado do aumento da sua expressão após remoção dos ROS pelas enzimas
antioxidantes (Sun et al., 1999).
Proteínas GADD45-like medeiam as vias p38/JNK em resposta ao estresse
do ambiente celular (Takekawa e Saito, 1998). O CA aumentou a expressão do
GADD45β nos Mφ. A JNK é crucial para induzir a morte celular programada iniciada
por estímulo, e o mecanismo pelo qual o NF-κB protege as células é por diminuição
da cascata JNK através da ativação transcricional da GADD45B (De Smaele et al.,
2001). As duas vias, p38 e JNK, são implicados na regulação do ciclo celular. A
parada temporária do ciclo celular pode promover a sobrevivência celular (Takekawa
e Saito, 1998). O aumento transcricional de genes pró sobrevivência, como o
GADD45β, é muito importante uma vez que o CA ativa Mφ, induzindo a produção de
muitos agentes citotóxicos, como NO por exemplo.
61
O regulador de diferenciação eritróide (EDR) é uma proteína liberada em
diversas condições de estresse celular, muitas delas levando a uma resposta
imunitária (Dörmer, Spitzer e Möller, 2004). O CA aumentou a expressão do EDR.
Apesar da reposta ao peróxido de hidrogênio não ser suficiente para se assumir o
papel primário de antioxidante do EDR (Dörmer, Spitzer e Möller, 2004; Adler et al.,
1999), nesse trabalho podemos assumir que o EDR pode estar agindo como
scavenger.
A formação do sequestossoma representa uma resposta de defesa
removendo proteínas anormais de uma maneira inerte biologicamente, o qual pode
ser eventualmente reutilizado pela célula após o término do estresse (Stumptner et
al., 2002). O CA aumentou a expressão do gene do sequestossoma 1 (SQSTM1)
nos Mφ. SQSTM1 é codificado por uma resposta imediata ativada geneticamente por
uma grande variedade de sinais extracelulares que envolvem proliferação e
diferenciação celular, e particularmente, o estresse oxidativo (Stumptner et al., 2002;
Ishii et al., 1999).
Como discutido anteriormente, ROS estão sendo produzidos pelos Mφ
tratados com CA. Sendo assim, muitas moléculas citoprotetoras estão sendo
produzidas. Essas observações corroboram o conceito que o CA ativa o
metabolismo oxidativo dos Mφ, e conseqüentemente, participando na via de
sinalização redox aumentando a expressão de genes citoprotetores.
5.5.5. Enzimas
A mevalonato cinase (MK) é uma enzima essencial na via do mevalonato, a
qual produz vários isoprenóides celulares. Essa enzima faz parte de um grande
grupo de compostos essenciais envolvidos em diversos processos celulares,
incluindo transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial, na tradução e
glicosilação de proteínas, na proliferação e diferenciação celular (Houten, Wanders e
Waterham, 2000). O CA aumentou a expressão gênica da MK. A deficiência na MK
em doenças leva a desregulação do sistema imunitário, sendo assim, o aumento da
expressão dessa enzima pode ter um importante significado biológico.
Aminopeptidases catalisam a remoção seqüencial de aminoácidos da região
N terminal de peptídeos e proteínas. A maioria das aminopeptidases são
62
metaloenzimas. Além de função no metabolismo de peptídeos e proteínas, as
aminopeptidases podem ter funções mais específicas. Essas incluem ativação e
inativação de peptídeos biologicamente ativos, remoção de metionina de proteínas
recém sintetizadas e, possivelmente, auxiliando a apresentação de antígenos pelo
sistema MHC de classe I (Wilk, Wilk e Magnusson, 1998). O CA aumentou a
expressão da aspartil aminopeptidase (Dnpep). A Dnpep tem papel importante no
metabolismo de peptídeos e proteínas intracelulares. Mφ ativados normalmente
apresentam aumento nas funções de proteólise e peptidólise para acompanhar o
aumento do processamento e apresentação de antígenos, regulando assim, o
sistema imunitário. Além do processamento e apresentação de antígenos, a
proteólise pode ser importante para a inativação de certas proteínas. A serina
protease (Prss25) foi aumentada pelo CA, e ela também está envolvida na proteólise
e peptidólise. A transcriptase reversa (RT) do vírus da imunodeficiência adquirida
humana tipo 1 (HIV-1) tem papel central no ciclo replicativo do vírus. A degradação
da HIV-1 RT pela interação direta com uma serino protease da célula hospedeira
leva a uma infecção não produtiva (Château et al., 2001). Aumentando os níveis de
serino-proteases em Mφ, o CA pode aumentar a resposta imunitária contra viroses.
O CA também aumentou a expressão do gene da proteína ativadora
gangliosídica G
M2
(Gm2a) em Mφ. A G
M2
é requerida para a ativação da fosfolipase
D (PLD). A PLD catalisa a hidrólise da fosfatidilcolina, gerando mediadores lipídicos
utilizados no controle de vários processos patológicos e fisiológicos. Nesses se
incluem o tráfego intracelular de proteínas, transporte vesicular, projeções
citoplasmáticas, motilidade celular, mitogênese, oncogênse e inflamação (Nakamura
et al., 1998). O aumento dessas funções pelo CA é essencial para uma melhor
resposta imunitária.
Ácidos graxos e seus derivados influenciam uma grande variedade de
processos celulares incluindo a síntese de fosfolipídios, fusão de vesículas,
modificação e exportação de proteínas, ativação e desativação enzimática,
sinalização celular, permeabilidade de membrana, patogênese bacteriana e controle
transcricional (Black e DiRusso, 2003). A expressão gênica da enzima ácido graxo
desaturase 1 (FADS1) foi aumentada pelo CA. Essa enzima regula a insaturação de
novo de ácidos graxos introduzindo dupla ligação entre carbonos definidos na cadeia
(Marquardt et al., 2000). Com o aumento da função dessa enzima, o CA
63
provavelmente está promovendo tanto a degradação quanto o acúmulo de ácidos
graxos, ou seja, está interferindo no metabolismo dos ácidos graxos.
A expressão do gene da fosfatase de especificidade dupla (Dusp1) foi
diminuída pelo CA. A Dusp1 é conhecida por inativar in vitro à proteína cinase
ativadora “mitogen-activated” (MAP). O sistema MAP cinase 1,2/proteína cinase C é
uma rede de sinalização intracelular que regula a maquinaria celular (Alessi, Smythe
e Keyse, 1993). Sendo assim, diminuindo a expressão desse gene, o CA pode
deixar a MAP cinase disponível para algum processo onde ela seja necessária.
As enzimas discutidas acima são essenciais no processo de ativação de Mφ,
uma vez que elas participam em vários processos relacionados desde a morfologia
celular até reações bioquímicas.
5.5.6. Receptores de quimiocinas e seus ligantes
As quimiocinas fazem parte de uma família de citocinas pró-inflamatórias que
atraem e ativam uma grande variedade de células. Duas famílias principais de
quimiocinas foram identificadas, a CC e a CXC, baseando-se na posição dos dois
primeiros resíduos de cisteína. Os efeitos das quimiocinas são mediados via
interação dos receptores com proteínas G associadas (Mellado et al., 2001). A
expressão dos genes da CC-quimiocina RANTES (CCL5) e dos receptores CCR2 e
CXCR4 foi diminuída pelo CA.
Várias publicações da última década têm demonstrado a importância dos
receptores de quimiocinas na entrada do vírus do HIV. Dois receptores de CC
quimiocinas, CCR3 e CCR5, assim como o receptor da quimiocina CXCR4 têm se
mostrado necessários na infecção pelo HIV-1 (Frade et al., 1997). O CCR5 e o
CXCR4 agem sinergisticamente com o CD4 em um mecanismo multi passo que
permite a ligação e a entrada do vírus HIV-1 (Singer et al., 2001). Outro receptor de
CC quimiocina, CCR2, foi descrito como sendo co-receptor na infecção pelo HIV
(Frade et al., 1997). A CC quimiocina RANTES (CCL5) pode aumentar a infecção
pelo HIV nas células alvo de maneira dependente de CD4 e de co-receptores e até
mesmo independente da rota de entrada do vírus. Ela auxilia a interligação de
glicosaminoglicanas, como o heparan sulfato, no vírus e na membrana celular
(Trkola et al., 1999). Receptores e ligantes diminuídos pelo CA podem interferir na
64
entrada do vírus e propagação da infecção através da redução da densidade de
receptores e co-receptores disponíveis na superfície celular. Recentemente foi
observado o aumento da qualidade de vida de pacientes HIV positivos, com o
aumento das células CD4 positivas. Esse fato pode estar relacionado com a
alteração da expressão das moléculas e receptores citados.
O CA, como foi demonstrado, aumenta as defesas antioxidantes. Os
antioxidantes são conhecidos por diminuir a expressão do CCR2, CCR5 e CXCR4
(Saccani et al., 2000). Sendo assim, a diminuição dessas proteínas pode ser
explicada pela regulação redox induzida pelo CA.
5.5.7. Outros receptores
O receptor para formil peptídeo (Fpr) é um receptor acoplado a proteína G
que medeia as respostas quimiotáticas fagocíticas, aumentando a migração celular e
a liberação de mediadores pró-inflamatórios (Le, Oppenheim e Wang, 2001). O CA
diminuiu a expressão do gene relacionado com a seqüência 2 do Fpr (Fpr-rs2)
apesar de seu papel na resposta imunitária. A Fpr-rs2 de murinos é estruturalmente
e funcionalmente similar a humana FPRL1 (Hartt et al. 1999). Agonistas tanto para o
FPR quanto para o FPRL1 foram descritos. A anexina I e o envelope protéico do
HIV-1 contém domínios que interagem com receptores FPR (Le, Oppenheim e
Wang, 2001). Observou-se que a expressão da anexina A1 foi diminuída pelo CA. A
anexina I é utilizada por fagócitos como receptor para o reconhecimento de células
apoptóticas (Fan et al., 2004).
O receptor com estrutura semelhante ao colágeno (MARCO) pertence à
classe A de receptores scavenger de moléculas. Ele possui como característica a
possibilidade de ligação com várias moléculas diferentes incluindo componentes da
superfície celular de bactéria. O receptor MARCO pode formar um sistema de
backup através do qual o organismo pode armar rapidamente mais células com
receptores para fagocitose mais eficientes (Kraal et al., 2000). O CA diminuiu a
expressão gênica do receptor MARCO em Mφ.
Como a diminuição desses receptores, que estão diretamente envolvidos na
resposta imunitária, influencia os efeitos imunomodulatórios do CA é ainda
65
desconhecido. Sendo assim mais trabalhos devem ser realizados para tentar
elucidar suas funções e atuações nas células tratadas.
5.5.8. Genes induzidos por IFN
Interferons são citocinas que possuem efeitos antivirais e inibem a
proliferação de células tumorais. Eles induzem um grande número de genes em
suas células alvo. Apesar de não ter sido encontrada alterações na produção de
IFN-γ nas células tratadas com CA, observou-se à diminuição da expressão de
genes regulados pelo interferon. Esses foram os genes ativados por interferon 205 e
202A, proteína induzível por interferon gama, proteína 1 induzível por interferon,
GTPase induzível por interferon gama, e as proteínas 1 e 2 ligadoras de guanilato.
Essas mudanças ocorrem por motivos ainda desconhecidos e também necessitam
de mais estudos.
66
6. CONCLUSÃO
As pesquisas realizadas durante o doutorado permitiram concluir que o
tratamento com o Canova:
• aumenta a atividade da enzima NAD(P)H oxidase;
• quantitativamente não altera a produção de H
2
O
2
;
• diminui a produção de O
2
-
;
• aumenta a atividade da enzima iNOS;
• aumenta a produção de NO;
• aumenta a quantidade de vesículas ácidas no citoplasma dos Mφ;
• diminui a expressão do CD74(Ii);
• diminui a produção da IL-2 e IL-4 após tratamento in vivo;
• altera o perfil da expressão gênica.
A partir das análises aqui apresentadas podemos concluir que o CA provoca
reações celulares que envolvem desde ativação da produção de determinadas
moléculas até alterações no perfil de expressão de genes relacionados com a
ativação de macrófagos. Sendo assim, foi possível propor algumas explicações de
como o CA aumenta as funções imunitárias do organismo, através de sua atuação
em Mφ, podendo ser considerado um modificador de resposta biológica.
67
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80
ANEXOS
81
ANEXO 1 – ANIMAIS E TRATAMENTO
Animais:
⇒ Camundongos (Mus musculus) albinos suíços, de aproximadamente 3 meses
de idade, pesando entre 25-30 g (cedidos pelo biotério do Setor de Ciências
Biológicas da UFPR);
⇒ O número de animais utilizados por grupo em cada experimento deverá ser
determinado dependendo do número de células necessárias em cada experimento;
⇒ Todas as recomendações da lei nacional (n° 6638, 5 de novembro de 1979)
para manuseio de animais devem ser respeitada.
Tratamento:
⇒ Ensaios in vivo – animais tratados durante sete dias. O número de animais
tratados por grupo depende do número de células necessárias em cada
experimento. Porém em sua grande maioria foram utilizados 5 animais por grupos.
Utilizar os seguintes grupos:
• grupo tratado com Canova (CA): administrar injeções subcutâneas de 7 µl/g de
Canova a cada 24 horas; OBS: o Canova deve ser sucussionado antes de cada
aplicação;
• grupo tratado com solução hidro-alcoólica (H): administrar injeções
subcutâneas de 7 µl/g de solução hidro-alcoólica estéril (água destilada mais 0,01%
de álcool neutro) a cada 24 horas;
• grupo tratado com solução hidro-alcoólica sucussionada
(Hs): administrar
injeções subcutâneas de 7 µl/g de solução hidro-alcoólica sucussionada estéril (água
destilada mais 0,01% de álcool neutro) a cada 24 horas;
• grupo controle ou normal
(N): não administrar nenhuma substância nestes
animais.
⇒ Ensaios in vitro – em cultura de macrófagos peritoneais coletados a partir de
camundongos normais não tratados, após 2 horas de cultivo, adicionar 10% da
solução pesquisada em relação à quantidade de meio. Passadas mais 24 horas,
adicionar dose reforço de 1% das soluções.
82
ANEXO 2 – PREPARO DO CULTIVO CELULAR
⇒ Coletar as células da cavidade peritoneal de camundongos com 10 ml de
“Phosphate Buffer Solution” (PBS) ou “Hank’s Buffer Salt Solution” (HBSS) a 4
o
C,
⇒ Contar as células em câmara de Neubauer,
⇒ Em ambiente estéril, adicionar as células em garrafas ou placas de cultivo,
⇒ Incubar as células por quinze minutos a 37
o
C 5% de CO
2
para a adesão, OBS:
após esse período, apenas macrófagos ficam aderidos.
⇒ Lavar as células com PBS a 37
o
C e adicionar meio de cultura “Dulbecco´s
Modified Eagle Medium” (DMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal
contendo penicilina 1 U/ml, estreptomicina 1 µg/ml, e anfotericina 2,5 µg/l,
⇒ Levar a estufa de CO
2
a 37
o
C pelo tempo determinado de cultura (24 ou 48
horas).
83
ANEXO 3 – CITOQUÍMICA ULTRAESTRUTURAL PARA NAD(P)H OXIDASE
segundo Briggs et al., 1975
⇒ Cultivar as células em garrafas de cultivo de 25 cm
3
(5 x 10
6
células por
garrafa), OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir por
15 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒ Lavar o meio de cultivo das células com tampão Tris Maleato 0,1M pH 7,5
contendo 7% de sacarose a 4°C
⇒ Dividir em grupos de controle do tratamento (N) e tratado com Canova
(C). Os
grupos foram ainda subdivididos para a utilização do controle da enzima (CE).
2 N 1N
4 garrafas 1 NCE
2 C 1 C
1 CCE
Organograma mostrando a divisão dos grupos. Onde: N – grupo normal; C –
Canova
; CE – grupo controle da enzima com 3-amino-1, 2,4 triazol (AT), inibidor da
catalase celular, e sem NAD(P)H (substrato da enzima).
⇒ Pré-incubar em solução contendo tampão Tris Maleato 0,1M, pH 7,5 com 7%
de sacarose e 1 mM de AT durante 10 minutos. Desprezar,
⇒ Lavar com tampão Tris Maleato 0,1M, pH 7,5 com 7% de sacarose,
⇒ Incubar durante vinte minutos à 37
o
C. Os grupos N e C incubar em solução
contendo tampão Tris Maleato 0,1M, pH 7,5 com 7% de sacarose, 10 mM de AT, 1
mM CeCl
3
, 0,71 mM de NAD(P)H. O grupo CE incubar em solução contendo tampão
Tris Maleato 0,1M, pH 7,5 com 7% de sacarose, 10 mM de AT, 1 mM CeCL
3
,
sem a
adição de NAD(P)H,
⇒ Lavar duas vezes com tampão Tris Maleato 0,1M, pH 7,5 com 7% de
sacarose,
⇒ Fixar as células
⇒ Processar para microscopia eletrônica de transmissão (MET)
OBS: na pós-fixação de células onde foi efetuado o processamento para NAD(P)H
oxidase, não utilizar ferrocianeto de potássio. Observar o material sem contrastação.
84
ANEXO 4 – DETECÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
)
segundo Pick e Mizel, 1981
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3-5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 15 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒ Lavar o meio de cultivo com “Hank´s Buffered Salt Solution” (HBSS) a 37
o
C,
⇒ Adicionar meio de reação (MR) contendo vermelho de fenol a 1M e 15 U/ml de
peroxidase (HRPO tipo VI-A, 1310U/ml – Sigma) dissolvidos em HBSS (com ou sem
drogas testadas),
⇒ Como controle positivo adicionar ao MR forbol miristato acetato (PMA) na
concentração de 1µl/ml. Como branco utilizar apenas o MR.
⇒ Após o tempo desejado (60 e 90 minutos), retirar o sobrenadante e passar
para uma placa nova de 96 poços contendo 10µl de solução aquosa de NaOH 1N
em cada poço,
⇒ A oxidação do vermelho de fenol deverá ser quantificada através de leitura da
absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de
620 nm. Os resultados serão obtidos em densidade óptica e deverão ser
comparados com uma curva padrão de concentrações variáveis de H
2
O
2
.
Curva:
⇒ Diluir o H
2
O
2
a 1:10, 1:100 e 1:1000 em água destilada e obter a concentração
dessas soluções através de sua absorbância em 240 nm (em espectrofotômetro,
utilizando cubeta de quartzo e lâmpada de deutério),
⇒ Utilizar a absorbância encontrada na solução 1:1000 na fórmula C = A/ε (Onde
A = absorbância, ε = 39,58 M
-1
cm
-1
e C = concentração),
⇒ Preparar uma solução mãe (concentração de 1 mmolar) a partir da solução de
H
2
O
2
1:100 em vermelho de fenol 1M diluído em HBSS,
⇒ Preparar soluções nas concentrações de 1, 10, 25 e 50 nmoles e colocá-los
em banho maria à 37
o
C,
⇒ Adicionar peroxidase na concentração final de 15U/ml e após 15 minutos
adicionar 10 µl de NaOH a 1M,
⇒ Ler em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de onda de 620
nm utilizando como branco apenas a solução mãe.
85
ANEXO 5 – DETECÇÃO DE ANION SUPERÓXIDO (O
2
-
)
segundo Johnston, Godzik e Cohn, 1978
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3-5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 15 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒ Lavar o meio de cultivo com “Hank´s Buffered Salt Solution” (HBSS) a 37
o
C,
⇒ Adicionar meio de reação contendo citocromo c 80 µM dissolvido em HBSS
(com ou sem drogas testadas), OBS: P.M. citocromo c = 12327
⇒ Como controle positivo adicionar ao meio de reação PMA na concentração de
1µl/ml, OBS: utilizar um poço como branco, contendo o meio de reação sem as
células.
⇒ Após a incubação retirar 100µl do meio de reação e passar para uma placa
nova e ler a absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de
onda de 550nm.
⇒ Na leitura os poços devem ser zerados com o branco = HBSS + citocromo c
Cálculo:
⇒ Para determinar a concentração de O
2
-
correspondente à concentração de
citocromo c reduzido usa-se o Coeficiente de Extinção Molar (ε = 2.1 x 10
4
M
-1
cm
-1
):
⇒ C = A/ε
86
ANEXO 6 – DETECÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO (NO)
segundo Green et al., 1982
⇒ Cultivar em placas de 96 poços (3-5 x 10
5
células/poço) pelo tempo
determinado, OBS: caso o tratamento seja in vivo adicionar as células e deixar aderir
por 15 minutos em estufa 37
o
C com 5% de CO
2
.
⇒ Como controle positivo adicionar a alguns poços LPS (50ng/ml) e IFN-
(26U/ml).
⇒ Retirar 100µl do sobrenadante e transferir para uma outra placa,
⇒ Adicionar 100µl do reagente de Griess (1:1 de Solução A: naftiletilenodiamino
0,1% em ácido fosfórico 5% e Solução B: Sulfonamina p-aminobenzeno 1% em
ácido fosfórico 5%), OBS: As soluções separadas podem ser estocadas na geladeira
por 1 mês, misturar apenas no momento da utilização.
⇒ Incubar 10 minutos a temperatura ambiente,
⇒ Ler a absorbância em leitor de microplacas utilizando filtro de comprimento de
onda de 550nm, OBS: utilizar um poço como branco, contendo apenas o reagente
de Griess.
⇒ Calcular a concentração de NO, utilizando curva padrão de nitrito de sódio (10
– 80 µM).
87
ANEXO 7 – IMUNOMARCAÇÃO PARA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZÍVEL
(iNOS)
⇒ Cultivar as células em garrafas de cultivo de 25 cm
3
(5 x 10
6
células por
garrafa), OBS: caso o tratamento seja in vivo, fixar as células em tubos tipo
eppendorff de 1 mL,
⇒ Fixar as células com glutaraldeído 0,05% e paraformoldeído 2% em PBS,
⇒ Raspar as células e adicioná-las em tubos tipo eppendorff de 1 ml,
⇒ Lavar e incubar as células em cloreto de amônio 50nM em PBS,
⇒ Incubar as células (2 x 10
7
) com anticorpo contra iNOS (Sigma) de
camundongo, diluído 1:100 em Triton-X/PBS 0,01%, durante 1 hora a temperatura
ambiente,
⇒ Lavar 2 vezes as células com PBS,
⇒ Incubar com Proteína A – gold 10 nm (Sigma) em Triton-X/PBS 0,01%,
durante 30 minutos a temperatura ambiente,
⇒ Refixar as células em glutaraldeído 2,5% e paraformoldeído 4% em PBS por
30 minutos,
⇒ Processar para MET,
⇒ Contrastar para MET,
⇒ Observar em MET.
88
ANEXO 8 – FIXAÇÃO PARA MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
(MET)
⇒ Fixar em glutaraldeído 1%, paraformoldeído 4% em tampão Cacodilato de
Sódio 0,1 M, pH 7,2 contendo 5% de sacarose durante uma hora a 4
o
C,
OBS: Nesse ponto do processamento pode-se parar o experimento armazenando-se
as células em geladeira, por tempo indeterminado. Certificar-se que o líquido fixador
esteja cobrindo todo o fundo da garrafa,
⇒ Nos casos de processamento para enzimas, pode-se lavar as células em
tampão Cacodilato de Sódio 0,1 M, pH 6,0 contendo 5% de sacarose, para retirar o
precipitado inespecífico do cloreto de cério, antes de processar para MET,
⇒ Preparar o material para MET.
89
ANEXO 9 – PROCESSAMENTO PARA MET
⇒ Raspar as garrafas de cultivo com canudinho de plástico cortados em forma
de pazinha, ou com “scrap”,
⇒ Centrifugar os macrófagos por aproximadamente 5 minutos a 1500 rpm,
OBS: tomar o cuidado de usar sempre tubos, pipetas e ponteiras siliconizadas.
Após todos os próximos passos, o material deve ser centrifugado e o
sobrenadante desprezado (lavado).
⇒ Passar as células para tubos siliconizados de 1 ml (tipo eppendorff),
⇒ Lavar 2 vezes em tampão Cacodilato de Sódio 0.1M, pH 7.2,
⇒ Em capela, pós-fixar as células em tetróxido de Ósmio a 1% em tampão
Cacodilato de Sódio 0.1M, pH 7.2, deixando por ½ ou 1 hora no escuro (tubos
devem ser envolvidos em papel alumínio),
⇒ Lavar novamente com tampão cacodilato duas vezes,
⇒ Passar pela bateria de desidratação:
⇒ Lavar em acetona 70% por 15 minutos,
OBS: O experimento pode ser parado neste ponto e continuado no dia seguinte.
⇒ Adicionar novamente acetona 70% por 15 minutos,
⇒ Lavar em acetona 90% por 15 minutos,
⇒ Lavar em acetona 100% por 15 minutos,
⇒ Após a desidratação, transferir o material para cápsula BEEM, e lavar em
acetona 100%,
⇒ Infiltrar o material em solução de acetona 2: epon 1(Mistura I). Deixar
OVERNIGHT,
⇒ No dia seguinte infiltrar na Mistura II: acetona 1: epon 1, deixar OVERDAY,
⇒ A mistura III (acetona 1: epon 2) deve ser infiltrada e deixada OVERNIGHT,
OBS: Em todas as etapas que exigem ser paradas, o material deve ser armazenado
em geladeira devidamente fechado com parafilme.
⇒ Após essa etapa deve-se infiltrar epon puro e deixar OVERDAY. Emblocar e
etiquetar. Deixar em estufa a 60°C por 3 ou 4 dias,
⇒ Obter cortes aleatórios, em intervalos de 0,5µ, em ultramicrótomo e em
gradinhas de cobre de 300 mesh.
90
ANEXO 10 – CONTRASTAÇÃO PARA MET
Preparo das soluções:
Acetato de Uranila
⇒ Acetato de Uranila – 5g
⇒ Água destilada – 100ml
A solução deve ser filtrada e deixada no escuro. Normalmente a solução somente
é utilizada 24 horas após seu preparo.
Citrato de Chumbo (solução de Reynolds)
⇒ Nitrato de Chumbo – 0,665g
⇒ Citrato de Sódio – 0,88g
⇒ Água destilada fervida – 15mL
⇒ NaOH 1N – 4mL
⇒ Água destilada – 50mL
Dissolver cada um dos componentes em 15mL de água destilada fervida
misturando, posteriormente, as duas soluções em um balão volumétrico de 50mL.
Como resultado da mistura das duas soluções iniciais obtemos um líquido branco e
leitoso. Agitar vigorosamente a mistura por 30 minutos. Adicionar então 4mL de
NaOH, recém preparada e agitar. A solução deverá ficar transparente e límpida.
Completar o volume para 50mL com água destilada. O pH deve ficar próximo de 12.
OBS: A solução de Citrato de Chumbo deve ser distribuída em tubos de ensaio
pequenos, com tampa de rosca que devem ser selados com parafilme e guardados
na geladeira. Normalmente reservamos um único tubo que deve ficar na bancada de
uso. Quando este tubo apresentar uma fina camada branca na superfície da solução
ou nas paredes do tubo, deve-se descartá-lo e pegar um tubo novo. Normalmente a
solução só poderá ser utilizada no dia seguinte ao seu preparo.
Contraste:
⇒ Para o contraste usar uma placa de Petri forrada externamente com papel
alumínio. Cobrir uma das partes internamente com parafilme e com papel filtro.
Marcar nesse papel os números das gradinhas a serem contrastadas. OBS: A parte
91
brilhante da gradinha é a que contém o material e fica virada para cima, em contato
com a gota.
⇒ Pingar uma gota de Acetato de Uranila sobre a gradinha deixando-a agir por
15 a 20 minutos. Lavar com água destilada, escorrendo pela pinça, sobre um becker
limpo. O Acetato de Uranila não pode ser agitado e a solução deve ser retirada do
meio do frasco.
⇒ Pingar a solução de Reynolds sobre o material, sendo o processo idêntico ao
anterior. Essa solução deve ser límpida, transparente; caso esteja opaca deve ser
desprezada.
92
ANEXO 11 – LARANJA DE ACRIDINA PARA MICROSCOPIA CONFOCAL
⇒ Cultivar as células (1 x 10
6
células/poço) em placas de 24 poços contendo
lamínula estéril;
⇒ Após 48 horas de cultivo ou 15 minutos de adesão das células tratadas in vivo,
retirar o meio de cultura e adicionar solução de laranja de acridina (5 µg/ml) em PBS;
⇒ Incubar por 20 minutos a 37
o
C 5% CO
2
.
⇒ Retirar as lamínulas e colocá-las sobre uma gota de PBS estéril em lâmina;
⇒ Observar em microscópio confocal utilizando lazer de Argônio (488nm).
93
ANEXO 12 – DETECÇÃO DE CD74 (Ii) EM CITOMETRIA DE FLUXO
⇒ Fixar as células com BD Cytofix/Cytoperm kit (BD Bioscience), conforme
instruções do fabricante;
⇒ Lavar e incubar com anticorpo monoclonal anti CD74 (Ii) conjugado com FITC
(BD Bioscience) – 0,5 µg/10
6
célula – por 40 minutos a temperatura ambiente, no
escuro;
⇒ Lavar e observar em citômetro de fluxo (FACScalibur).
94
ANEXO 13 – DETECÇÃO DE CD74 (Ii) EM MET
⇒ Fixar as células com BD Cytofix/Cytoperm kit (BD Bioscience), conforme
instruções do fabricante;
⇒ Lavar e incubar com anticorpo monoclonal anti CD74 (Ii) purificado (BD
Bioscience) – 0,5 µg/10
6
célula – por 30 minutos a temperatura ambiente;
⇒ Lavar e incubar com proteína A – gold 10nm (Sigma) por 30 minutos;
⇒ Lavar e processar para MET;
⇒ Contrastar;
⇒ Observar.
95
ANEXO 14 – MENSURAÇÃO DE CITOCINAS EM SOBRENADANTE
Mouse Th1/Th2 cytokine CBA – BD Pharmingen
OBS: O procedimento para a análise das citocinas interleucina 2 (IL-2), interleucina 4
(IL-4), interleucina 5 (IL-5), fator de necrose tumoral α (TNFα), interferon γ (IFNγ)
produzidas pelos macrófagos e liberadas no sobrenadante da cultura, foi realizada
de acordo com o protocolo do fabricante do kit
⇒ Após 48 horas de cultivo em placa de 96 poços (5 x 10
5
células/poço) ou 15
minutos de adesão das células tratadas in vivo, retirar o sobrenadante celular e
centrifugar para retirar as células presentes. A mensuração das citocinas é feita no
sobrenadante.
⇒ Misturar as cinco soluções contendo os beads de captura do kit;
⇒ Adicionar 2,5 µl de solução de beads em tubos de citômetro;
⇒ Adicionar 50 µl do sobrenadante de cada poço aos tubos contendo a solução
de beads;
⇒ Adicionar 2,5 µl dos anticorpos contra as citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-5 IL-4, IL-2
(mouse Th1/Th2 PE detection reagent) conjugados com o ficoeritrina (PE);
⇒ Incubar por 2 horas no escuro;
⇒ Adicionar a cada tubo do experimento 100µl da solução de lavagem e leitura
(washing buffer);
⇒ Centrifugar 1.300 rpm por 5 minutos;
⇒ Descartar o sobrenadante e adicionar 200µl de washing buffer;
⇒ Homogeneizar a solução em “vortex” e analisar imediatamente em citômetro
de fluxo (FACSCalibur);
⇒ Analisar usando o programa BD CBA software e comparar uma curva de
concentração de citocina fornecida no kit.
96
ANEXO 15 – EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL DE CÉLULAS ANIMAIS
RNeasy mini kit – Qiagen
Observações importantes antes de iniciar o processo:
⇒ É essencial usar o número correto de células para se obter uma concentração
e pureza altas de RNA com as colunas do RNeasy. O MInI Kit suporta 5x10
6
até
1x10
7
;
⇒ Células podem ser guardadas a –70
o
C para uso posterior, ou podem ser
utilizadas logo após serem coletadas. O número de células deve ser obtido antes de
serem congeladas. Essas devem ser descongeladas rapidamente a temperatura
ambiente (ou calor da mão) e podem ser processadas – passo 2. O lisado
homogeneizado em tampão RLT – passo 3, pode ser guardado a –70
o
C por vários
meses. Para processar o lisado, esse deve ser descongelado durante 15-20 minutos
em banho maria a 30
o
C;
⇒ Geralmente não é necessária a digestão com DNase;
⇒ O tampão RLT pode formar precipitado quando guardado. Caso necessário,
esquenta-lo;
⇒ Adicionar 10 µl de β-mercaptoetanol para cada ml de tampão RLT antes de
usar;
⇒ Ao tampão RPE adicionar 4 volumes de etanol 100% (MERCK);
⇒ Todas as centrifugações devem ser feitas a temperatura ambiente.
Procedimentos:
⇒ Coleta dos macrófagos segundo protocolo (RNase free);
⇒ Centrifugar em tubo Falcon 15 ml por 3 minutos a 2500RPM para formação do
pellet;
⇒ Contar as células com auxilio da câmara de Neubauer;
⇒ Lisar as células pela adição de tampão RLT;
97
Células em pellets:
Tampão RLT µl Número de células no pellet
350 Até 5x10
6
600 6x10
6
a 1x10
7
Células em monocamadas:
Tampão RLT µl Diâmetro da placa (cm)
350 ≤ 6
600 6 – 10
⇒ Homogeneizar as células por pipetagem;
⇒ Adicionar 1 volume (igual ao da tabela) de etanol 70% ao lisado e misturar
bem através de pipetagem. Não centrifugar;
⇒ Aplicar 700 µl à coluna, incluindo qualquer precipitado que tenha se formado,
em tubo de 2 ml. Centrifugar por 15 segundos a 8000 g (≅10000 RPM). Caso sobre
amostra no tubo original repetir o processo. Descartar o que passou;
⇒ Adicionar 700 µl de tampão RW1 à coluna. Centrifugar por 15 segundos a
8000 g (≅10000 RPM) para lavar a coluna. Descartar o que passou;
⇒ Adicionar 500 µl de tampão RPE à coluna. Centrifugar por 15 segundos a
8000 g (≅10000 RPM) para lavar a coluna. Descartar o que passou;
⇒ Adicionar novamente 500 µl de tampão RPE à coluna. Centrifugar por 2
minutos na velocidade máxima para secar a membrana da coluna. Descartar o que
passou;
⇒ Para eluir, transferir a coluna para um novo tubo de coleção (do Kit). Pipetar o
volume apropriado de água RNase free diretamente na membrana (30 – 50 µl).
Deixar 1 minuto a temperatura ambiente e centrifugar por 1 minuto a 8000g (≅10000
RPM). Repetir esse passo para obter maior concentração de RNA final.
98
ANEXO 16 – DOSAGEM DE RNA/DNA PELA DENSIDADE ÓTICA (DO)
⇒ Diluir a amostra na proporção de 1:200, ou seja, 1 µl de amostra para 199 µl
de água DEPC;
⇒ Ler em espectrofotômetro, múltipla leitura de comprimentos de onda (WL):
WL1 WL2 WL3 WL4
310nm 280nm 260nm 230nm
Sujeira Proteína RNA/DNA Nucleotídeos livres
⇒ Deve ser usada cubeta de quartzo de 200 µl, a lâmpada de ultravioleta (UV)
deve estar ligada e para o branco deve ser usada água DEPC.
Cálculo para a concentração de RNA (C):
Onde:
2 = fator de correção da passagem de luz. A luz passa ½ do normal, devido ao fato
da cubeta ter apenas 200 µl
200 = diluição
40 = DO relativa ao RNA (caso quisesse calcular de DNA, esse valor seria 50)
C = DO x 2 x 200 x 40 (ng/
µ
l)
99
ANEXO 17 – Gel de RNA
⇒ Observações importantes antes de iniciar o processo:
⇒ Todo o material utilizado deve ser tratado para retirada de qualquer RNase.
Isso inclui a cuba de corrida. O tratamento pode ser conseguido através de:
Lavagem com álcool 70%; Lavagem com água DEPC na proporção de 1:1000
autoclavada; Lavagem com solução de água oxigenada 3% por 10 minutos a
temperatura ambiente,
⇒ Todo o material após o tratamento deve ser lavado com água DEPC.
Soluções:
Tampão 10x MOPS (ácido 3-[N-morfolino] propano ácido sulfônico)
200mM MOPS (sigma M1254) ---------------------------20,9 g
50mM acetato de sódio pH 7,0 (PM 136,1) -------------3,4 g
10mM EDTA (solução 0,5M) -------------------------------10 ml
⇒ O tampão deve ser autoclavado, e deve ser mantido em geladeira protegido
da luz por papel alumínio.
⇒ O acetato deve ser dissolvido antes de acertar o pH, e esse deve ser preciso,
pois RNA degrada facilmente em outro pH.
Tampão de amostra (TA) - preparar na hora do uso
500 µl 100 µl
Formaldeido 37% --------------------------------------100 µl-----------------20 µl
Formamida 80% deionizada ------------------------300 µl-----------------60 µl
Tampão 10x ----------------------------------------------50 µl-----------------10 µl
Corante ----------------------------------------------------50 µl-----------------10 µl
Corante (armazenar por vários meses à 4
o
C)
Tampão 1x
25% de glicerol
Azul de bromofenol (pitada com a ponteira)
100
Gel (RNA formaldehyde gel)
150 ml 100ml 50ml
Agarose 1,2% ---------------------1,8 g-----------1,5g------------0,75 g
Água DEPC -----------------------110 ml---------73 ml----------36,6 ml
Tampão 10 x -----------------------15 ml---------10 ml--------------5 ml
Formaldeido ------------------------26 ml---------18 ml--------------9 ml
⇒ Liquefazer a agarose em água DEPC no microondas, adicionar o tampão 10x.
Resfriar até aproximadamente 60
o
C e adicionar o formaldeido sob capela.
Preparação da amostra:
⇒ Calcular o volume de amostra a ser aplicada no gel, sendo que deve este deve
conter 5 ou 3 µg/µl de RNA
Onde:
C = concentração de RNA em ng/µl
⇒ Adicionar 1 volume de TA;
⇒ Adicionar 2 µl de brometo de etídio a 10 µg/ml;
⇒ Aplicar aproximadamente 20 µl no gel (o gel deve estar submerso em tampão
10x)
⇒ Correr a 70 mV por aproximadamente 1 hora;
⇒ Observar o gel em luz UV.
V = 5000 ou 3000 ng / C
101
ANEXO 18 – IMUNOFENOTIPAGEM
⇒ Retirar o lavado peritoneal;
⇒ Lavar e incubar com anticorpo monoclonal anti CD45, CD11b e CD3
conjugados com PE (BD Bioscience) – 0,5 µg/10
6
células – por 40 minutos a
temperatura ambiente, no escuro;
⇒ Lavar e observar em citômetro de fluxo (FACScalibur).
102
ANEXO 19 – APROVAÇÃO CEEA
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