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FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA
COMPARAÇÃO ENTRE PEÇONHAS DE VÍBORAS DO GÊNERO
Bothrops DA REGIÃO MERIDIONAL, COM ESPÉCIES SIMILARES DO
BRASIL CENTRAL, PARA AVALIAÇÃO DO GRAU DE TOXICIDADE
(SERPENTES, VIPERIDAE)
Angelo Laurence Covatti Terra
Orientador Professor Dr. Thales de Lema
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PORTO ALEGRE – RS-BRASIL
2005
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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO S
FACULDADE DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOLOGIA
LINHA DE PESQUISA EM SISTEMÁTICA E BIODIVERSIDADE
COMPARAÇÃO ENTRE PEÇONHAS DE VÍBORAS DO GÊNERO
Bothrops DA REGIÃO MERIDIONAL, COM ESPÉCIES SIMILARES
DO BRASIL CENTRAL, PARA AVALIAÇÃO DO GRAU DE
TOXICIDADE
(REPTILIA, SERPENTES)
Angelo Laurence Covatti Terra
Orientador: Prof. Dr. Thales de Lema
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
PORTO ALEGRE – RS-BRASIL
2005
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS...................................................................................................................i
RESUMO ...................................................................................................................................ii
ABSTRACT..........................................................................................................................................iii
APRESENTAÇÃO...................................................................................................................................iv
1 INTRODUÇÃO...........................................................................................................1
2 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................................3
2.1 Venenos........................................................................................................3
2.2 Eletroforese...................................................................................................3
2.3 Dosagem de Proteína...................................................................................3
2.4 Atividade Fosfolipásica PLA2........................................................................4
2.5 Atividade Proteínolítica na Caseína..............................................................5
2.6 Atividade Coagulante no Plasma..................................................................5
2.7 Letalidade......................................................................................................6
3 RESULTADOS..........................................................................................................7
3.1 Eletroforese...................................................................................................7
3.2 Dosagem de Proteína...................................................................................7
3.3 Atividade Fosfolipásica PLA2........................................................................8
3.4 Atividade Proteínolítica na Caseína..............................................................8
3.5 Atividade Coagulante no Plasma..................................................................8
3.6 Letalidade......................................................................................................9
4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES..............................................................................10
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................................13
LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................15
LISTA DE TABELAS ................................................................................................................16
Agradecimentos
Agradecemos especialmente a Dra. Maria de Fátima Domingos Furtado pela
orientação, ajuda e liberação das amostras de veneno referência; ao mestrando
André Zelanis, pelo direcionamento e paciência durante os ensaios, pela amizade e,
principalmente, pela acolhida quando estive em São Paulo. À Marisa Maria Teixeira
da Rocha, pela indicação de bibliografia e ajuda com os equipamentos. Aos demais
pesquisadores, estagiários, funcionários e amigos do Instituto Butantã, por me
receberem e ajudarem em minhas visitas a São Paulo. Também agradecemos à
Moema Leitão de Araújo, NOPA, pela liberação de amostras de veneno do RS. A
todos colegas, amigos e professores do Laboratório de Herpetologia da PUCRS, em
especial ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Thales de Lema, pela orientação,
amizade e por aceitar orientar-me sendo veterinário e não biólogo; ao Prof.
Dr.Marcos Di Bernardo, por ser uma das pessoas que sempre acreditou no meu
potencial; à Gláucia Maria Funk Pontes, pela ajuda nas coletas de veneno; ao
colega e amigo, Nelson Rufino de Albuquerque, pela indicação de bibliografia,
formas de redação da dissertação e amizade sempre presente; à querida amiga,
Márcia Ferret Renner, que desde o início foi prestativa, motivadora e fundamental
para que eu continuasse no mestrado quando tive momentos difíceis; a Felipe Gobbi
Grazziotin, pela ajuda com o conteúdo do trabalho. A toda equipe do Instituto de
Toxicoclogia da PUCRS, na pessoa da Profa. Flávia Valadão Thiesen, pelo uso dos
laboratórios; ao amigo, Fernando Sagebin, responsável pelos laboratórios do
Instituto antes citado, pelo companheirismo, amizade e orientação e ajuda na
solução de problemas surgidos durante os ensaios; à querida Ariane da Cruz
Teixeira, técnica dos laboratórios citados, por manter tudo sempre organizado e
funcionando; e aos demais funcionários e estagiários do mesmo que ajudaram na
parte laboratorial aqui no RS. À CAPES pela bolsa que possibilitou que eu
continuasse cursando o mestrado, num momento que seria impossível pelos meus
próprios recursos. Em especial à minha família, minha mãe Marilia, pelo exemplo de
perseverança e dedicação; a meu pai Eduardo e minha irmã Franciele, pelo amor e
paciência, e à minha namorada Cristina, pela dedicação e companheirismo.
Finalmente, resta-me agradecer a Deus, Senhor de nosso destino, por ter me
dado a inteligência, determinação e coragem para a realização desta pesquisa e
conquista de melhor nível profissional.
i
RESUMO
Foram analisadas amostras de veneno em forma de “pool”, extraídos de duas espécies de
Bothrops (B. alternatus, B. jararaca). O “pool” regional foi composto de venenos exclusivamente do
Rio Grande do Sul coletados de exemplares provenientes de várias partes do estado. O “pool”
nacional foi composto de venenos de exemplares provenientes, principalmente, de São Paulo e
adjacências (estados de Espírito Santo, Minas Gerais e Paraná) e usado como veneno-referência.
Foram analisadas: atividade letal; ação proteolítica sobre caseína; enzimas fosfolipásicas; ação
coagulante no plasma humano; dosagem da quantidade de proteínas; e perfil eletroforético. As
análises entre as amostras foram feitas comparando-se as ações bioquímicas e a composição
protéica entre as espécies que compõe cada “pool”, bem como inter regionalmente, entre os “pools”.
Quando comparadas pela eletroforese, as amostras regionais apresentaram particularidades quanto à
composição protéica do veneno compartilhando miotoxinas fosfolipásicas com 14 KDa, que são
pouco observadas nas amostras do “pool” nacional sugerindo ser esta ação mais “regionalizada” para
estas peçonhas. Entretanto, observam-se outras fosfolipases miotóxicas com peso molecular
diferente (16KDa) presente em todas as amostras, sugerindo a similaridade bioquímica ainda
compartilhada, apesar das diferenças regionais entre as amostras.Também se verificou maior
atividade fosfolipásica e teor protéico nas amostras regionais. O “pool” regional teve maior atividade
proteolítica e coagulante no plasma quando comparado com o “pool” nacional, reforçando a
possibilidade de maior toxicidade no “pool” regional.
PALAVRAS CHAVE: Bothrops alternatus, B. jararaca, . Análise peçonha, pools de antígenos,
atividades dos venenos.
ii
ABSTRACT
Comparison among pitvipers poisons of the genus Bothrops (Serpentes: Viperidae) from
southern region, with similar species from Central Brazil, for toxicity evaluation.
Were analyzed poison samples as a pool from different proceedings, one from Rio Grande do
Sul area, South Brazil (regional pool), and another mainly from São Paulo area, Central Brazil
(national pool). The national pool was made by venom samples from Espírito Santo, Minas Gerais,
São Paulo and Paraná states. Were analyzed: lethal, proteolytic (on casein), coagulant (on human
plasma), and phospholipasic enzyme activities, the quantity of protein and the electrophoretic patterns
were analyzed too. The analyses between the samples were made by comparison of biochemical
actions and protein composition into a species, and inter-regionally between the pools. The
comparison by electrophoresis, regional samples showed particularities in their venom protein
composition sharing phospholipasic miotoxinas, with 14 KDa, that were poorly observed in the national
pool, suggesting this action been more regionalized for this venom. However, we can observe miotoxic
phospholipases, with different molecular weigh (16 KDa), present in all of the samples, suggesting a
biochemical similarity still shared although the regional differences between the samples. The major
phospholipasic activity and protein quantity were verified in regional samples. The regional pool has
more proteolytic and coagulant activities, when we compare with the national pool, that’s reinforces
the possibility of those actions were more regionalized in B. alternatus and B. jararaca venoms.
Key words: Bothrops alternatus, B. jararaca, Venom analysis, antigen pools, venom activities.
iii
APRESENTAÇÃO
Este trabalho compara os venenos de ofídios do gênero Bothrops em forma de
“pool”. O “pool” regional (RS) é composto por amostras de veneno seco de animais
exclusivamente do Rio Grande do Sul, enquanto o “pool” nacional (BR) é formado
por amostras de veneno de animais do Brasil central.Os venenos foram comparados
em sua composição protéica, atividade sobre substratos específicos, potencial de
letalidade e perfil eletroforético.Sabe-se que no “pool” usado para produzir o
antiveneno que vai atuar nacionalmente, não constam amostras de animais do
RS.Também se ressalta que a composição deste “pool” é fator determinante na
eficácia da soroneutralização esperada do antiveneno, Procurou-se diferenciar as
particularidades de cada “pool” e verificar diferenças significativas em suas
composições que justificassem a produção de antivenenos com perfis mais
regionalizados visando tratar com maior eficácia os acidentes com ofídios deste
gênero e conhecer mais sobre a evolução e diferenciação da espécie. Este trabalho
será submetido à Revista Brasileira de Toxicologia, cujas normas seguem em
anexo.
iv
COMPARAÇÃO ENTRE PEÇONHAS DE VÍBORAS DO GÊNERO
Bothrops DA REGIÃO MERIDIONAL, COM ESPÉCIES SIMILARES
DO BRASIL CENTRAL, PARA AVALIAÇÃO DO GRAU DE
TOXICIDADE
(REPTILIA, SERPENTES)
Angelo L. C. Terra¹ e Prof. Dr. Thales de Lema²
.
Órgão financiador: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-
CAPES
¹ Programa de Pós-graduação em Biociência, Área Zoologia, Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul, Campus Central, Av. Ipiranga, 6681 - Porto Alegre, Brasil. Fone/Fax: (051) 3320-
3568 ramal: 4411 E-mail: angelolct@terra.com.br
² Laboratório de Herpetologia-Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Campus
Central, Av. Ipiranga, 6681- Porto Alegre, Brasil. Fone/Fax: (051) 3320-3568 ramal: 4411 E-mail:
crothal[email protected]
ABSTRACT
Comparison among pitvipers poisons of the genus Bothrops (Serpentes: Viperidae) from
southern region, with similar species from Central Brazil, for toxicity evaluation.
Were analyzed poison samples as a pool from different proceedings, one from Rio Grande do
Sul area, South Brazil (regional pool), and another mainly from São Paulo area, Central Brazil
(national pool). The national pool was made by venom samples from Espírito Santo, Minas Gerais,
São Paulo and Paraná states. Were analyzed: lethal, proteolytic (on casein), coagulant (on human
plasma), and phospholipasic enzyme activities, the quantity of protein and the electrophoretic patterns
were analyzed too. The analyses between the samples were made by comparison of biochemical
actions and protein composition into a species, and inter-regionally between the pools. The
comparison by electrophoresis, regional samples showed particularities in their venom protein
composition sharing phospholipasic miotoxinas, with 14 KDa, that were poorly observed in the national
pool, suggesting this action been more regionalized for this venom. However, we can observe miotoxic
phospholipases, with different molecular weigh (16 KDa), present in all of the samples, suggesting a
biochemical similarity still shared although the regional differences between the samples. The major
phospholipasic activity and protein quantity were verified in regional samples. The regional pool has
more proteolytic and coagulant activities, when we compare with the national pool, that’s reinforces
the possibility of those actions were more regionalized in B. alternatus and B. jararaca venoms.
Key words: Bothrops alternatus, B. jararaca, Venom analysis, antigen pools, venom activities.
1. INTRODUÇÃO
O gênero Bothrops Wagler, 1824 é de ocorrência neotropical e compreende
31 de espécies (CAMPBELL e col., 1989) ocorrentes na parte cisandina do
continente sul americano sendo que, as espécies Bothrops alternatus (Duméril,
Bibron et Duméril, 1854) e Bothrops jararaca (Wied, 1824), são de ocorrência centro-
meridional para oriental, atingindo tanto o Brasil como países vizinhos do Prata
(LEMA, 2004). São víboras de fosseta loreal (subfamília Crotalinae) que têm grande
importância em saúde pública porque são possuidoras de peçonha muito ativa,
sendo as responsáveis por grande número dos acidentes ofídicos ocorrentes no
Brasil sul. Ambas são amplamente distribuídas em todo continente americano
incluindo ilhas (CAMPBELL e col., 1989). Segundo LEMA, 1994, as serpentes do
gênero B. alternatus, conhecida vulgarmente como “cruzeira” ou “urutu”, ocorrem em
áreas abertas, e B. jararaca, conhecida vulgarmente como “jararaca”, ocorre
amplamente em áreas florestadas oriental e meridional. Como todo Viperidae,
possuem aparelho de inoculação do tipo solenotodonte e cujas presas são retráteis,
ao contrário daquelas da família Elapidae, com dentição proteroglifodonte, com
presas fixas (HABERMEHL, 1981). Uma função da peçonha é paralisar e matar a
presa e outra promover a digestão inicial (HABERMEHL, 1981). Também podem ser
citadas ações lubrificantes e antidegradantes nas peçonhas destes animais bem
como, nas secreções venenosas de várias espécies de ofídios da família Colubridae
com dentição maxilar opistóglifa (RENNER, 1999), ou mesmo áglifa. Os acidentes
ofídicos envolvendo estes animais têm importância médica em virtude de sua grande
1
freqüência e gravidade, sendo o ofidismo o maior causador de intoxicações
exógenas por animais na América Latina (CAMPBELL e col., 1989).
No Brasil causaram 600 óbitos entre 1986 e 1999 (RIO DE JANEIRO, 2001). Foram
notificados à Fundação Nacional de Saúde (FUNASA), no período de janeiro de
1990 a dezembro de 1993, 81.611 acidentes por serpentes peçonhentas, o que
representa uma média de 20.000 casos/ano para o país (BRASIL, 2001). Registrou-
se entre os anos de 1985 e 1999 um total de 160.256 casos de acidentes (RIO DE
JANEIRO, 2001) foram também registrados, 9.524 acidentes só no Rio de Janeiro
entre 1990 e 2001 (RIO DE JANEIRO, 2001) e no Rio Grande do Sul, 1.494 casos
de acidentes em 2004 (RIO GRANDE SUL, 2004). Considerando-se que as espécies
de Bothrops são responsáveis por 90% dos acidentes no Brasil (MELGAREJO e col.,
2003) e 66% no estado do Rio Grande do Sul (RIO GRANDE SUL, 2004) e, ainda,
que no “pool” utilizado para imunizar os cavalos no Instituto Butantan para obtenção
de antiveneno botrópico, não estão presentes em amostras de peçonhas coletados
de animais oriundos do Rio Grande do Sul (FURTADO, comun. pess., 2005), seria
importante uma análise para reconhecer ações específicas destas peçonhas
regionais do Rio Grande do Sul. Caracterizando as particularidades de cada
peçonha seria possível entender melhor a diferenciação e a evolução das espécies
Bothrops. Conforme é citado por GRAZZIOTIN (2004), há divergência e
diferenciação entre os exemplares de B. jararaca, conforme análise biomolecular
baseada no DNA mitocondrial, mostrando diferentes características nos genomas de
exemplares procedentes de diferentes regiões do Brasil, o que corrobora com a
probabilidade de diferenciação nas ações das peçonhas de serpentes procedentes
de áreas fisiográficas diferenciadas, proposta neste trabalho. Através dos ensaios
realizados, procurou-se mostrar características de cada peçonha. Cada teste tem
uma função nesta caracterização: o perfil eletroforético torna possível visualizar o
“tamanho” ou o “peso molecular” das proteínas presentes nas peçonhas
comparando-as com um padrão já conhecido. A dosagem de proteínas compara a
quantidade de proteínas a mais que a peçonha testada tem em relação ao padrão
(albumina) tendo como objetivo quantificar esta diferença já que a quantidade de
proteínas e enzimas presentes nas peçonhas está diretamente ligada ao seu
potencial tóxico (BALDO, e col., 2003). As enzimas fosfolipásicas são responsáveis
por ações miotóxicas (NISENBOM e col.), sua atividade será mostrada ao submeter
um substrato específico a ação das peçonhas e verificar qual degradou mais o
substrato e, portanto é mais ativa para esta enzima. Ações proteolíticas e
coagulantes no plasma são comuns em peçonhas de serpentes do gênero Bothrops
tendo graus de atividade moderadamente presentes (ROCHA, 2005). A
determinação de uma dose letal capaz de matar 50% da população testada é a
forma de mostrar qual das peçonhas é mais letal, ou seja, qual mata mais indivíduos
com uma dose menor. Estes ensaios ajudarão a compreender melhor a diferença
que se observou entre as peçonhas.
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Peçonhas
Foram utilizadas amostras das peçonhas secas a vácuo (“pool” RS) e
liofilizadas (“pool” BR) de Bothrops jararaca e Bothrops alternatus do Rio Grande do
Sul procedente do serpentário do Núcleo de Ofiologia de Porto Alegre (NOPA) da
Fundação Zoobotânica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre. Amostras das peçonhas
de espécies equivalentes dos estados de São Paulo, Paraná, Minas Gerais e
Espírito Santo, foram cedidas pelo Instituto Butantan, São Paulo. Para a avaliação
da DL50 IP aguda, foram utilizados 120 exemplares de Mus domesticus domesticus
Rutty, 1772 (Muridae), fornecidos pelo biotério da Fundação Estadual de Produção e
Pesquisa em Saúde (FEPPS), Porto Alegre.
2.2 Eletroforese (SDS-PAGE)
Com o objetivo de separar as proteínas, cada amostra de peçonha (20 µl) foi
colocada e corrida individualmente em um “spot” no gel de acrilamida, em gradiente
de 7,5%, seguindo o método de LAEMMLI (1970). Para comparação utilizou-se o
padrão de peso molecular (Pharmacia). As proteínas são: 94 KDa (fosfolipase B), 67
KDa (albumina sérica bovina), 43 KDa (ovoalbumina), 30 KDa (anidrase carbônica),
20,1 KDa (inibidor de tripsina de soja) e 14,4 KDa (lactoalbumina). O corante para
revelação usado foi o Silver Staining (corante prata).
2.3 Dosagem de proteína
A quantificação das proteínas presentes nas amostras, foi feita seguindo
MARKWELL e col., (1978) e usando como referência, FURTADO e col., (1991). Para
o reagente “A” foi usado 20g de carbonato de sódio, 4g de hidróxido de sódio, 1,6g
de tartarato de sódio, 10g de dudecil sulfato de sódio, dissolvidos em 1 litro de água
destilada. O reagente “B” é o sulfato de cobre. O reagente “C” é uma associação de
1:100 dos reagentes B e A, respectivamente. Feitas em duplicata (n=2), cada
amostra de 1ml de peçonha foi adicionado 3 ml do reagente “C”, incubado por 30
minutos a temperatura ambiente. Adicionou-se 2 ml de reagente fenólico (reagente
de Folin Ciocalteau) e deixado em repouso por 45 minutos em temperatura
ambiente. A leitura foi feita no espectofotômetro a 660 nm. Os valores da dosagem
de proteína foram obtidos por regressão linear do resultado médio (n=2) da leitura
sobre a concentração de veneno e calculados em escala logarítmica.
2.4 Atividade Fosfolipásica PLA
2
Seguiu-se o método de HOLZER e col., (1996) para comparar
quantitativamente a ação das fosfolipases presentes nas amostras. As amostras
feitas em triplicata foram diluídas em solução salina a 0,85% para o volume final de
100 µl e adicionados 900 µl de tampão de ensaio (10nM de Tris, 10nM de cloreto de
cálcio e 100 nM de cloreto de sódio); adicionou-se 100 µl de substrato
cromatogênico para PLA2 (ácido 4-nitro, 3-octomoiloxi benzóico). Acrescentou-se 47
mg do substrato a 50 ml de acetonitrila na concentração final de 3nM. A dissolução
foi feita com a utilização do agitador magnético, incubando-se por 20 min a 37ºC; as
amostras ficaram acondicionadas em gelo até o uso de Triton X 100 2,5%, 100µl por
tubo para bloquear a reação. Após, agitou-se com agitador magnético sendo que,
após 5 a 10 minutos em repouso à temperatura ambiente, foi feita leitura no
espectofotômetro a 425 nm. A atividade foi expressa pela média (n=3) das leituras
multiplicada pela constante (25,8) e dividida pela concentração da peçonha (0,3
mg/ml) para cada amostra de peçonha.
2.5 Atividade proteinolítica na caseína
Conforme LOMONTE e col., (1983) pode-se quantificar a atividade proteolítica
das amostras usando a caseína como substrato. Usou-se, para cada 1 ml de cada
amostra de peçonha, na concentração de 100 µg/ml sendo adicionado 1 ml de um
substrato composto de uma solução de caseína 1%. Amostras em triplicata (n=3)
foram incubadas por 30 minutos a 37ºC. A reação foi interrompida adicionando-se
3ml de TCA 5% (ácido tricloroacético), com repouso por 30 minutos. Seguiu-se
centrifugando as amostras com as absorbâncias dos sobrenadantes lidas no
espectofotômetro a 280 nm. A atividade proteolítica foi expressa em U/mg e obtida
pela fórmula:
U/mg = Abs 280 nm X 100
mg de veneno
Obs: a absorbância lida é uma média entre as três leituras (n=3) em cada amostra.
2.6 Atividade Coagulante no Plasma
Para determinar dose mínima coagulante no plasma (DMC-P), que é a menor
quantidade em mg de peçonha seca ou liofilizada/litro de solução teste, capaz de
coagular em 60 seg, a 37ºC, uma solução padronizada de plasma humano citratado,
THEAKSTON e col., (1983) e FURTADO (comum. pess., 2005) sugerem usar 1mg
de peçonha seca diluído em 1ml de solução salina a 0,85%. Retiram-se 400 µl dessa
solução inicial e são feitas 6 diluições seriadas (n=6) até chegar a 1:64 de
concentração da solução original. No fibrômetro (Fibro Systen TM - modelo 5 marca
BBL), a 100 µl de cada amostra diluída foram adicionados 200 µl de plasma a 37ºC,
sendo uma amostra para cada uma das cubetas, nas diferentes concentrações. Os
valores da DMC-P foram obtidos por regressão linear do tempo de coagulação sobre
a quantidade de veneno e calculados em escala logarítmica.
2.7 Dose Letal Média
Segundo SILES-VILLARROEL e col., (1978/79), determina-se uma dose
mínima capaz de matar metade da população testada e se estabelece um
comparativo de toxicidade entre as amostras de peçonha analisadas inoculado 0,5
ml (ROCHA, 2005) de cada peçonha diluída em diversas doses por via intraperitonial
(i.p) em M. domesticus domesticus. Inocularam-se grupos de sete camundongos
(n=7) por amostra de peçonha. Utilizaram-se doses crescentes (tabela 4) de
peçonha diluída em solução salina a 0,85 (tabela 5). Os animais foram observados
por 24 e 48h, e contaram-se quantos animais morreram por grupo. Dados foram
compilados e cálculos foram feitos com a análise de PROBITOS, conforme FINNEY
(1971). Esta metodologia reduziu o número de animais que foram utilizados.
3 RESULTADOS
3.1 Eletroforese
Na primeira zona (Z1) que se situa entre 67 e 43 KDa, observou-se banda
fraca na amostra de B. jararaca regional e bandas fortes em B. alternatus regional e
nas demais amostras do “pool” nacional. Na zona seguinte (Z2), entre 40 e 20 KDa,
observaram-se bandas fortes em B. jararaca de ambos os “pools” e pouco presente
em B. alternatus de ambas as regiões. Nesta zona também são encontradas
geralmente Bothroalternin (27 KDa), esta análise mostrou bandas fortes em todas as
amostras. Na zona intermediária (Z Int.), entre a segunda e a terceira zona (20 a 16
KDa), foram observadas bandas fortes nas amostras de B. alternatus de ambos os
“pools” e fracas em ambas as amostras de B. jararaca. Na quarta e última zona (Z
4), 14,4 KDa, bandas fortes em todas as amostras. Conforme figura 1.
3.2 Dosagem de proteínas
Verificaram-se valores mais altos na dosagem proteínas nas peçonhas do
“pool” regional. Obtiveram-se valores de 200,5 µg para B. jararaca RS e 177,15 µg
para B. jararaca BR (P= 0, 443, teste t Student). Já para B. alternatus RS obteve-se
162,55 µg e para B. alternatus BR 136,43µg de proteína (P= 0, 410445, teste t
Student). Apesar de ter valores mais altos para o “pool” regional em ambas as
espécies de Bothrops , estatisticamente não se obteve significante diferença. Tabela
1.
3.3 Atividade fosfolipásica PLA2
Foi observada nas amostras regionais ação entre 13,786 e 16,336
nmol/min/mg de veneno, enquanto que nas amostras do “pool” nacional as ações
ficaram entre 5,9 e 8,8 nmol/min/mg, Para B. jararaca há uma tendência de
superioridade do "pool" regional em relação ao nacional, mas sem atingir
significância estatística (P = 0, 055, teste t Student). Já em B. alternatus há uma
significante superioridade do "pool" regional em relação ao nacional, (P = 0, 0095,
teste t Student). Figura 2.
3.4 Atividade proteinolítica na caseína
As amostras regionais precisaram de mais unidades de veneno para degradar
a 1 mg de caseína durante o ensaio (128,67 u/mg para B. jararaca e 59,13 u/mg
para B.alternatus), tanto quando comparadas entre as espécies quando entre
regiões, com as do “pool” nacional. Para B. jararaca observou-se uma tendência de
superioridade do "pool" regional em relação ao nacional, mas sem atingir
significância estatística (P = 0, 0588, teste t Student). Já em B. alternatus há uma
significante superioridade do "pool" regional em relação ao nacional, (P = 0, 011853,
teste t Student
). Tabela 2.
3.5 DMC-P: Dose Mínima Coagulante no Plasma
Observou-se que as amostras regionais (RS) precisaram de maior
quantidade (em mg) de peçonha seca para coagular uma solução padronizada de
plasma humano citratado, quando comparadas entre as espécies e entre as regiões,
com as do “pool” nacional (BR). Sugere-se então, que as amostras regionais (RS)
têm menor atividade coagulante sobre o plasma humano citratado quando
comparadas às do “pool” nacional (BR). Tabela 3.
3.6 Dose letal média
Observamos DL50 muito próximas, entre as espécies. A amostra de B.
alternatus BR foi a mais alta (85,49 µg) sugerindo tendência à superioridade de
letalidade desta peçonha em relação às demais testadas neste ensaio. Tabela 6.
4 DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
De acordo com os ensaios feitos, observaram-se diferenças nas peçonhas, o
que poderá causar ações diferentes no caso de um acidente real. Quando se
analisou a quantidade de proteína, os valores foram aparentemente superiores nas
amostras do “pool” regional (RS), porém estatisticamente muito próximos; obteve-se
para B. jararaca (P= 0, 443, teste t Student) e B. alternatus (P= 0, 410445, teste t
Student) não havendo então significante diferença entre as quantidades de proteínas
de ambos os “pools”.
Na análise da atividade fosfolipásica para B. jararaca observou-se
equivalência entre os “poosl” (P = 0, 055, teste t Student) com tendências de
superioridade em B. jararaca RS. Já em B. alternatus há uma significante
superioridade do "pool" regional em relação ao nacional, (P = 0, 0095, teste t
Student). Sugere-se então, maior atividade fosfolipásica nas peçonhas regionais de
B. alternatus.
Quando observados os valores do “pool” nacional mostraram menores valores
para atividades proteolíticas sobre a caseína, mas analisando estatisticamente em B.
jararaca observou-se uma tendência de superioridade do "pool" regional em relação
ao nacional, mas sem atingir significância estatística (P = 0, 0588, teste t Student)
.
Já em B. alternatus há uma significante superioridade do "pool" regional em relação
ao nacional, (P = 0, 011853, teste t Student). Sugere-se que as enzimas
proteinolíticas das peçonhas regionais (RS) são mais ativas que as do “pool”
nacional para ambas as Bothrops sendo intensamente mais ativas em B. alternatus
RS. Para atividade coagulante no plasma não houve a possibilidade de análise
estatística de vários ensaios. Esta análise foi realizada apenas uma vez, pois o
equipamento (Fibrômetro) e o substrato (plasma humano citratado), que foram
gentilmente cedidos pelo Instituto Butantã, são de difícil concessão e obtenção junto
aos outros locais onde estes foram solicitados. Os valores do “pool” regional foram
maiores sugerindo maior atividade coagulante no plasma humano quando
comparado aos do “pool” nacional.
Quando comparadas eletroforeticamente, as amostras variaram muito, tendo na
primeira zona (Z1) forte presença de proteínas hemorrágicas (Bothropasin e
Alternagin, com 55 KDa) no “pool” nacional e em B. alternatus do RS, e fraca em B.
jararaca (RS), sugerindo diferenciação na composição do veneno. Na segunda zona
(Z2), onde temos enzimas inibidoras das serioproteinases da cascata de coagulação
e proteolíticas (Botrocetin, Bothrojaracin, e Brothronbin com 28 KDa), conforme
citado em ROCHA (2005), foram observadas bandas fortes em B. jararaca de ambos
os “pools” e pouco presente em B.alternatus de ambas as regiões sugerindo esta
ação ser intra-específica para B. jararaca. Nesta zona também são encontradas
Bothroalternin (inibidor de trombina com 27 KDa), (Rocha, 2005), mostrou bandas
fortes em todas as amostras, sugerindo esta ação ser ainda compartilhada por
ambas as espécies de Bothrops em várias regiões do país. Na zona intermediária (Z
Int.), composta por fosfolipases com atividades miotóxicas (NISENBOM e col), foram
observadas bandas fortes nas amostras de B.alternatus de ambos os “pools” e
fracas em ambas as amostras de B. jararaca, sugerindo esta ação intra-específica
para B. alternatus em todas as regiões. Na última zona (Z 4), onde encontra-se
fosfolipases A2 com ação miotóxica (NISENBOM e col.), foram encontradas bandas
fortes em todas as amostras, mostrando que há o compartilhamento destas enzimas
em ambas as espécies de todos os “pools”. A dose letal para matar metade da
população inoculada de M. domesticus domesticus demonstrou que apesar dos
valores mais elevados do “pool” nacional de B. alternatus em relação aos demais, as
amostras de B. jararaca e de B. alternatus não mostraram grandes diferenças nos
valores sugerindo apenas tendência de superioridade na letalidade de B. alternatus
BR em relação ao “pool” regional. Sugere-se então, que a letalidade das peçonhas
não foi significante para diferenciar o grau de toxicidade entre as amostras. Quando
comparamos os dados, concluiu-se que, apesar de compartilharem algumas ações,
os venenos de B. jararaca e B. alternatus tem particularidades nas suas
composições. Isso implicaria em manifestações clínicas diferenciadas (quanto ao
grau de danos ao organismo no caso de acidente) para cada espécie dentro das
regiões testadas. As hemorraginas presentes nas peçonhas dos viperídeos são as
responsáveis pelas ações hemorrágicas, estas ações foram mencionadas por HATTI
e col., 1999, como sendo um dos efeitos mais letais nos casos de acidentes.
Reações inflamatórias intensas são características do gênero Bothrops como citado
por FARSKY e col., 2000, onde é relatado que as fosfolipases e as
metaloproteinases típicas destas peçonhas juntamente com outros componentes
ainda não identificados ativam intensamente o sistema de complemento e aumentam
a migração de células inflamatórias para o local da picada complicando o quadro em
caso de acidente. É descrito por PETRICEVICH e col., 2000, alterações nos padrões
normais de citocinas e óxido nítrico sérico aumentando consideravelmente os níveis
de TNF-alpha, IL-1, IL-6, IL-10 and IFN-gamma em camundongos inoculados
intraperitonialmente com peçonha de B. jararaca e outras do mesmo gênero.
Também é importante ressaltar que a capacidade de neutralização dos antivenenos
está diretamente associada à composição destes (FURTADO, 2005, comum. pess),
logo, teoricamente, um soro que não contemplasse amostras provenientes das
regiões onde ocorreu o acidente seria “menos eficaz”. Também é citado em
RATANABANANGKOON, K, 2003 que a produção de anti-venenos polivalentes
contemplando uma gama maior de espécies seria mais eficaz quando não é possível
determinar o ofídio causador ou existem inúmeras espécies que poderiam ter
causado o acidente. A terapia com corticóides e ainti-histamínicos (inibidores de H1
e H2) como auxiliares na recuperação de pacientes que sofreram acidente por ofídio
peçonhento e receberam o anti-veneno, também é citada por CUPO, P e col, 1991.
É relatado por ROCHA 2005, não haver variações significativas nas ações das
peçonhas de B. alternatus quando comparadas pelas diferenças nas procedências
geográficas. Sugere-se então, ser possível que um antiveneno feito a partir de um
“pool” composto por peçonhas de regiões limitadas aja com total eficácia em
qualquer local do país. Seria possível, o tratamento de acidentes que ocorreram em
outras regiões geograficamente diferentes daquela em que os animais que foram
usados para fazer o antiveneno viviam, porém, quando analisamos as amostras de
B. jararaca e também de B. alternatus testadas sob a forma de “pool” regional e
“pool” nacional, pareceu que as variações individuais seriam amenizadas, ou seja,
particularidades de cada indivíduo coletado (tais como idade, sexo, período
reprodutivo e localização ambiental dentro da região), não interferissem na ação total
final do “pool” testado. Foram verificadas diferenças em composição e possivelmente
nas prováveis ações das peçonhas. Sugere-se então, que o anti-veneno tivesse um
perfil “mais regionalizado”, ou seja, fossem acrescentados ao “pool” de peçonha que
será utilizado para fabricação do anti-veneno de distribuição nacional, amostras de
peçonhas provenientes de regiões mais próximas e afins, onde o anti-veneno será
utilizado. O ideal seria que fossem incluídas amostras de peçonhas de animais de
toda a área de ocorrência das espécies, mas devido à dificuldade de obter estas
amostras pela grande extensão territorial, pela impossibilidade de envio dos animais
e/ ou venenos aos órgãos que fazem os anti-venenos, e com o alto custo de uma
produção regional, contamos com a soroneutralização cruzada que é obtida pela
maioria dos “pools” de veneno botrópico, agindo com eficácias diferentes, porém
vitais no tratamento de acidentes com estes animais nas diversas regiões do país.
Neste trabalho foram utilizados ensaios que tiveram como objetivo caracterizar as
diferenças nos perfis bioquímicos e de toxicidade entre as peçonhas testadas.
Sugerem-se para complementar o estudo outros testes tais como: a cromatografia
de troca iônica tal como sugerido por BALDO e col., 2000 e a quantificação dos
níveis séricos da enzima creatina-quinase (CK) conforme proposto por GUTIÉRREZ
e col., 1980, para uma melhor caracterização das peçonhas do gênero Bothrops.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Perfil eletroforético mostrando as bandas presentes em cada zona do gel, dividido por
pesos moleculares determinados. As setas indicam onde se localizam as bandas dentro de cada
zona.
B. jararaca (p= 0,054958)
B. alternatus (p= 0,009487)
Figura 2:: Quantidade de substrato formado pela interação da enzima PLA2 com o substrato
cromatogênico fornecido, foi expressa em nmol/min/mg de peçonha.
Atividade Fosfolipásica
5,9
16 , 3 3 6
8,8
13,7 86
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
B. jararaca RS B. jararaca BR B.alternatus RS B.alternatus BR
Amostras
Atividade Fosfolipásica Específica
(nmols/min/mg de veneno)
94 KDa
67 KDa
43 KDa
30KDa
20,1 KDa
14 KDa
B. J RS B. J BR B. A RS B. A BR
Z 1
Z 2
Z Int.
Z 4
BJ RS = B. jararaca do RS
BJ BR= B. jararaca do
“pool” do Butantã
BA RS = B. alternatus do
RS
BA BR= B.alternatus do
“pool” do Butantã
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Expressa diretamente a relação entre os anéis aromáticos da albumina
sérica bovina (BSA) usada para calibração da curva padrão de análise com 100 µg
(padrão BSA) e a quantidade de anéis aromáticos presentes nas peçonhas.
B. jararaca (p= 0,443)
B. alternatus (p= 0,41044)
Tabela 2: Relação entre a quantidade de unidades de peçonha (U) em cada
amostra necessária para degradar 01 mg de caseína, presente na solução usada no
ensaio. BR, amostra nacional; RS, amostra regional.
B. jararaca (p= 0,05688)
B. alternatus (p= 0,011853)
Espécie Dosagem de Proteína Desvio
Bothrops jararaca RS 200,05 µg 74,45
Bothrops jararaca BR 177,15 µg 66,3
Bothrops alternatus RS 162,55 µg 22,15
Bothrops alternatus BR 136,43 µg 5,62
Espécie Atividade caseínolítica Desvio
B. jararaca RS 128,7 u/mg 3,3201
B. jararaca BR 119,8 u/mg 2,8160
B. alternatus RS 59,1 u/mg 3,0501
B. alternatus BR 38,9 u/mg 2,5482
Tabela 3: Quantidade de peçonha seco ou liofilizada/litro necessário para coagular
01 litro de solução teste, em 60 seg, a 37ºC, para cada amostra que compões os
“pools” regional (RS) e nacional (BR).
Tabela 4: Doses de peçonha inocolada nos camundongos (M. d. domesticus) nos
diferentes “pools” para determinação da DL50.
Espécie Atividade Coagulante no Plasma
B. jararaca RS 19,3 mg/litro
B. jararaca BR 12,06 mg/litro
B. alternatus RS 37,5 mg/litro
B. alternatus BR 17,6 mg/litro
B. jararaca RS B. jararaca BR B. alternatus RS B. alternatus BR
35 µg 43,2µg 60µg 75µg
69µg 51,84µg 72µg 94µg
96µg 62,82µg 86µg 117µg
Tabela 5: Quantidades de peçonha total diluída, quantidade de sol. Salina para
diluição da peçonha, Fd = fatores de diluição para determinação da DL50.
B. jararaca RS B. jararaca BR B. alternatus RS B. alternatus BR
3mg totais 2mg totais 3mg totais 4mg totais
Fd: 1,4 Fd: 1,2 Fd: 1,2 Fd: 1,25
3ml sol. salina 4ml sol. salina 3ml sol. salina 4ml sol. salina
Tabela 6: Dose mínima em µg de peçonha necessária para matar 50% da
população de M. domesticus domesticus para cada amostra inoculada no ensaio.
Espécie Letalidade (DL 50)
Limite Superior de
Confiança 95%
Limite inferior de
confiança 95%
B. jararaca RS 52, 40µg 66, 28 41, 42
B. jararaca BR 50, 84 µg 59, 38 43, 54
B. alternatus RS 68, 38µg 80, 39 58, 17
B. alternatus BR 85, 49 µg 103, 52 70, 61
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hipóteses não baseadas nos mesmos. Deverão ser enfatizados os novos e importantes aspectos observados e
discutidas as concordâncias e divergências com outros achados já publicados.
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substancialmente para a elaboração do trabalho.
Referências Bibliográficas - devem ser dispostas em ordem alfabética, sem numeração. Alguns exemplos: a)
artigos de periódicos - ROMBERG, R.W., LIEWEN, L. - Comparison of the hydrolyses rates of morfhine-3-
glucuronide and morfhine-6-glucuronide with acid and beta-glucoronidase. J.Anal.Toxicol., Niles v.19, n.3,
p.157-162, 1995.; b) livros e outras monografias - YEH, S.Y. - Report of the commitee on problems on drug
dependence. New York. New York Academy of Sciency, 1973.; c) cápitulo de livro - TOBIN, T. Horses, heroes
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microbiano em medicamentos e cosméticos. São Paulo.1992. [Tese de doutorado - Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da USP]; e) trabalhos de congresso ou similar (desde que publicado) - CUNHA, R. Viroses
neotrópicas. In: Congresso Brasileiro de Veterinária, 5°, São Paulo, 1960. Anais. São Paulo, 1961. p.197-220.
As citações no texto devem ser indicadas pelo sobrenome do primeiro autor, seguido do ano de publicação
entre parênteses. No caso de dois autores, citar os dois e no caso de vários autores, citar o primeiro seguido de
e col. Exemplos: (SILVA, 1977); (SILVA e MARTINS, 1977); (SILVA e col., 1977). A exatidão das referências
bibliográficas é de responsabilidade do(s) autor(es).
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