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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL
Cordia curassavica (JACQ.) ROEM. & SCHULT.:
Influência de fatores ambientais no crescimento e na
produção de metabólitos.
FLÁVIA SIMÃO LAPA
Florianópolis
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL
Cordia curassavica (JACQ.) ROEM. & SCHULT.:
Influência de fatores ambientais no crescimento e na
produção de metabólitos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Vegetal da
Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial à obtenção do grau de
Mestre em Biologia Vegetal.
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Maria Terezinha S. Paulilo
Co-orientadora:
Prof.ª Dr.ª Miriam de Barcellos Falkenberg
FLÁVIA SIMÃO LAPA
Florianópolis, junho 2006.
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“Todo conhecimento tem uma finalidade. Saber
por saber, por mais que se diga ao contrário, não
passa de um contra-senso”
Miguel de Unamuno
4
Dedico esta dissertação aos meus pais,
ao meu marido e ao meu filho...
5
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela vida; às professoras Maria Terezinha Silveira Paulilo e Miriam
de Barcellos Falkenberg pela orientação e compreensão; aos pesquisadores do Centro de
Pesquisas Químicas Biológicas e Agronômicas da Unicamp e à professora Dra. Maike
Petersen da Universidade Marburg, pelos materiais cedidos para a realização desta pesquisa;
aos colegas, pelo tempo que disponibilizaram; aos agricultores das Associações de
Desenvolvimento das Microbacias Rio D’una e Rio das Cachoeiras, que aguardaram a
conclusão desta etapa; aos tios, sogros, avós e irmãos, que apoiaram, rezaram e
acompanharam; aos meus pais, pelo caráter que me deram; ao Fabrício por me ajudar e
incentivar e ao Kaio por me aguardar.
Obrigada.
6
RESUMO
A Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult. (Boraginaceae) tem como sinonímia
científica Cordia verbenacea DC. e é conhecida popularmente como erva baleeira.
Popularmente utilizada para tratamento de reumatismo, inflamação e promover a cicatrização.
É uma espécie ocorrente no Domínio da Mata Atlântica e vegeta preferencialmente em
terrenos arenosos e ensolarados, como restingas, dunas e praias. As principais substâncias
presentes na C. curassavica com ação antiinflamatória são a artemetina e o α-humuleno,
porém sabe-se que além dessas existem outras substâncias antiinflamatórias presentes nesta
planta, como o ácido rosmarínico, que é um metabólito secundário comum na família
Boraginaceae, mais facilmente encontrado em extratos alcoólicos do que no óleo essencial. O
ambiente de crescimento da planta pode influenciar na composição de seus compostos
químicos de uso medicinal e na quantidade de material vegetal. Este estudo procurou verificar
a influência de três intensidades de luz (100%, 70% e 20% da luz solar) e de substratos com
dois níveis de fertilidade (areia de duna e um substrato composto de solo argiloso, areia de rio
e composto orgânico termofílico) no crescimento, composição e quantidade de compostos
químicos em C. curassavica. Os resultados indicaram que maior intensidade de luz: (1)
aumentou a massa seca da raiz e diminuiu a área foliar; (2) aumentou o rendimento relativo
dos extratos éter de petróleo e etanólico e o rendimento relativo total; (3) aumentou ou
diminuiu, dependendo da substância, apenas duas substâncias das nove detectadas na
cromatografia de camada delgada; (4) aumentou a atividade biológica (avaliada pela
toxicidade dos extratos etanólicos para larvas de Artemia salina). O substrato mais fértil: (1)
aumentou a massa seca total e a área foliar e proporcionou maior valor da taxa de crescimento
relativo para as plantas; (2) aumentou o rendimento relativo dos extratos éter de petróleo e
etanólico e o rendimento relativo total; (3) não influenciou a intensidade ou número de
metabólitos detectados em cromatografia de camada delgada (CCD), no extrato etanólico,
nem interferiu na atividade biológica desse extrato. Face ao exposto, este estudo mostra que a
alta intensidade de luz solar aumenta a produção de metabólitos em C. curassavica, mas não a
biomassa de folhas. Enquanto que solos de maior fertilidade aumenta a produção de
metabólitos e da biomassa de folhas - órgão utilizado para extração de metabólitos neste
estudo.
7
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Massa seca e área foliar de plantas de Cordia curassavica
crescidas sob diferentes intensidades de
luz......................................................
19
Tabela 2. Taxa média de crescimento relativo (TCR), razão média de área
foliar (RAF) e relação raiz:parte aérea (R:PA) de plantas de
Cordia curassavica crescidas sob diferentes intensidades de
luz....................
20
Tabela 3. Valores de massa seca e área foliar de plantas de Cordia
curassavica crescidas sob diferentes
substratos.......................................................
21
Tabela 4. Taxa média de crescimento relativo (TCR), razão média de área
foliar (RAF) e relação raiz:parte aérea (R:PA) de plantas de C.
curassavica crescidas sob diferentes
substratos...................................
21
Tabela 5. Rendimentos relativos dos extratos de plantas crescidas em
diferentes intensidades
luminosas........................................................
22
Tabela 6. Rendimentos relativos de extratos de plantas de Cordia
curassavica crescidas em diferentes
substratos........................................................
23
Tabela 7. Intensidade das diferentes substâncias detectadas na cromatografia
em camada delgada, para extratos etanólicos preparados a partir
de plantas de Cordia curassavica crescidas em diferentes
intensidades
luminosas..........................................................................................
...
24
Tabela 8. Intensidade das diferentes substâncias detectadas na cromatografia
em camada delgada, para extratos etanólicos preparados a partir
de plantas de Cordia curassavica crescidas em diferentes
substratos.....
25
Tabela 9. Número de metabólitos majoritários visualizados em CCD dos
extratos etanólicos de plantas de Cordia curassavica crescidas em
diferentes intensidades luminosas ou
substratos..................................
26
Tabela
10.
Dados individuais do número de metabólitos visualizados, em
cada amostra, na CCD do extrato etanólico de folhas de Cordia
curassavica, cultivadas em diferentes intensidades
luminosas............
27
Tabela
11.
Dados individuais do número de metabólitos visualizados, em
cada amostra, na CCD do extrato etanólico de folhas de Cordia
curassavica, cultivada em substratos
diferentes..................................
28
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema representativo da seqüência da preparação dos extratos
brutos. EP: éter de petróleo; CL: clorofórmio; ET: etanol ...............
14
Figura 2. Esquema representativo da preparação das diluições dos extratos
para obtenção das concentrações finais.............................................
17
Figura 3. Seqüência das etapas para o bioensaio com Artemia salina.............
18
Figura 4. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos de
plantas cultivadas em diferentes intensidades de luz. Placa de gel
de sílica eluída em clorofórmio, metanol e água na proporção
30:11:2 e observada após revelação com anisaldeído-sulfúrico.......
29
Figura 5. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos de
plantas cultivadas em diferentes substratos. Placa de gel de sílica
eluída em clorofórmio, metanol e água na proporção 30:11:2 e
observada após revelação com anisaldeído-sulfúrico.......................
30
Figura 6. Concentração Letal Média (CL
50
) de extratos etanólicos de plantas
cultivadas em 100% de luz, 70% de luz e 20% de luz......................
31
Figura 7. Concentração Letal Média (CL
50
) de extrato etanólico de plantas
cultivadas em areia de duna e solo (composto orgânico, areia de
rio e solo argiloso)............................................................................
32
9
SUMÁRIO
Resumo .......................................................................................................................... VI
Lista de tabelas .............................................................................................................VII
Lista de figuras ............................................................................................................VIII
1. Introdução
1.1. Importância das plantas medicinais ....................................................................01
1.2. Importância da qualidade das plantas medicinais ...............................................02
1.3. Metabólitos ativos ...............................................................................................03
1.4. Fatores que influenciam o crescimento de plantas e a produção de metabólitos 04
1.5. Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult. .....................................................05
2. Objetivos 09
2.1. Objetivo geral .....................................................................................................09
2.2. Objetivos específicos ..........................................................................................09
3. Materiais e Métodos
3.1. Local e época dos experimentos .........................................................................10
3.2. Material vegetal ..................................................................................................10
3.3. Obtenção de plântulas .........................................................................................10
3.4. Condições de crescimento de plantas em diferentes intensidades de luz ...........11
3.5. Condições de crescimento de plantas em diferentes substratos ..........................12
3.6. Avaliação de parâmetros morfológicos e fisiológicos ........................................12
3.6.1. Determinação de massa seca e área foliar ...................................................12
3.6.2. Determinação da taxa de crescimento relativo, da razão de área foliar e da razão
raiz/parte aérea ............................................................................................12
3.7. Obtenção de extratos brutos e rendimento de folhas ..........................................13
3.8. Determinação da composição química qualitativa e quantitativa dos extratos
brutosetanólicos ..............................................................................................................15
3.9. Avaliação da toxicidade de extratos vegetais .....................................................15
3.10. Análise estatística .............................................................................................18
10
4. Resultados
4.1. Efeitos de diferentes intensidades de luz no crescimento de plantas ..................19
4.2. Efeitos de diferentes substratos no crescimento de plantas ................................20
4.3. Efeitos de intensidades de luz nos rendimentos relativos dos extratos vegetais 22
4.4. Efeitos do substrato nos rendimentos relativos dos extratos vegetais ................23
4.5. Cromatografia em camada delgada (CCD) de extrato etanólico ........................24
4.5.1. Intensidade das manchas na CCD para extratos de plantas cultivadas em
diferentes intensidades luminosas ..............................................................24
4.5.2. Intensidade das manchas na CCD para extratos de plantas cultivadas em
diferentes substratos ..................................................................................25
4.5.3. Número de metabólitos majoritários detectados na CCD dos extratos etanólicos
das folhas crescidas em diferentes intensidades de luz ou substratos ............................25
4.6. Atividade biológica do extrato etanólico: toxicidade para larvas de Artemia salina
31
5. Discussão
5.1. Efeitos de diferentes intensidades de luz no crescimento de plantas ..................33
5.2. Efeitos de diferentes substratos no crescimento de plantas ................................34
5.3. Efeitos de diferentes intensidades de luz na composição e atividade dos extratos de
Cordia curassavica .....................................................................................35
5.3.1. Rendimento de extratos ...............................................................................35
5.3.2. Produção de metabólitos majoritários .........................................................37
5.3.3. Toxicidade dos extratos ...............................................................................38
5.4. Efeitos de diferentes substratos na composição e atividade dos extratos de Cordia
curassavica. ................................................................................................39
5.4.1. Rendimento de extratos ...............................................................................39
5.4.2. Produção de metabólitos majoritários .........................................................40
5.4.3. Toxicidade dos extratos ...............................................................................41
6. Conclusões ..................................................................................................................42
7. Referências Bibliográficas ..........................................................................................44
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. Importância das plantas medicinais
Plantas têm sido tradicionalmente usadas por populações de todos os continentes no
controle de diversas doenças e pragas (TYLER, 1994).
No Brasil observa-se um crescimento do consumo de plantas medicinais e de
medicamentos à base de plantas em todas as classes sociais. A demanda maior de
medicamentos fitoterápicos consumidos é para tratamento de problemas do sistema
nervoso central, do trato digestivo e de doenças respiratórias (NOGUEIRA & WOLFF,
2001).
Dentro do mercado mundial de produtos biotecnológicos que movimenta entre 470 a 780
bilhões de dólares anuais o setor de medicamentos alopáticos movimenta de 75 a 150
bilhões de dólares/ano, o setor de fitoterápicos, de 20 a 40 bilhões de dólares/ano e o de
cosméticos de 2,6 a 2,8 bilhões de dólares/ano (ARNT, 2001). No Brasil, o comércio de
plantas medicinais movimenta cerca de 800 milhões de dólares (NOGUEIRA & WOLFF,
2001).
Com a demanda pela utilização de plantas medicinais na cura ou prevenção de
doenças, o cultivo dessas plantas torna-se uma alternativa cada vez mais importante na
agricultura nacional (CORRÊA JÚNIOR et al., 1994)
A transformação de plantas em medicamentos esbarra na dificuldade de obtenção, de
matéria prima na qualidade e na quantidade necessária para a fabricação (ANTÔNIO,
1997). O extrativismo de plantas medicinais nas florestas é a principal forma de obtenção
de matéria prima para fitoterápicos. Como conseqüência ocorrem problemas ambientais
que têm colocado em risco a integridade e a manutenção dos ecossistemas. Ademais,
algumas espécies nativas estão sofrendo erosão genética acelerada, principalmente pela
12
perda de variabilidade, conseqüência direta do alto volume de extração em seus ambientes
naturais (ORELLANA et al., 1994). A coleta de plantas medicinais não é tão simples
quanto foi em épocas passadas, dadas a importância que o conhecimento da biodiversidade
vem tendo atualmente, a preocupação que a sociedade vem com o meio ambiente e a
legislação específica que governos vêm adotando. Hoje, em muitas situações, são
necessárias permissões dos órgãos governamentais responsáveis para a extração de plantas
(MING, 1996).
Foi regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária na Resolução-RDC
N° 48, de 16/03/2004 (BRASIL, 2000). Para o registro de novos fitoterápicos, essa Resolução
exige dados botânicos, agronômicos, microbiológicos, químicos e farmacológicos, além de
outras informações que contribuam para evidenciar a eficácia e a segurança do seu uso. Os
fitoterápicos já registrados disporiam de um período de tempo para adaptar-se às novas
normas e renovar o registro.
1.2. Importância da qualidade das plantas medicinais
Embora a RDC 48/2004 seja dirigida aos fabricantes de fitoterápicos, ela vem dando
nova dimensão às relações comerciais entre os produtores rurais, as firmas distribuidoras, os
laboratórios e as farmácias.
A qualidade de um medicamento começa com a matéria-prima usada para fabricá-lo,
portanto a qualidade de um fitoterápico começa no campo. Num sistema de cultivo de planta
medicinal a qualidade é determinada por sua base genética e pelo ambiente onde se
desenvolve (MAGALHÃES, 2001).
O uso de plantas medicinais como matéria-prima para a fabricação de medicamentos
só se firmará legalmente se tiver matéria-prima em quantidade e qualidade necessária. Para
13
isso é preciso ter plantas devidamente identificadas e com produção uniforme, obter matéria-
prima sem contaminantes e poder quantificar os metabólitos ativos presentes (MONTANARI,
2001; MAGALHÃES, 2001).
1.3. Metabólitos ativos
As substâncias químicas produzidas pelas plantas são conhecidas como metabólitos
primários e secundários. Os metabólitos primários são encontrados em todas as células
vegetais, por serem essenciais para vida de qualquer planta, exemplos são os açúcares
simples, os aminoácidos, as proteínas e os ácidos nucléicos. Os metabólitos secundários não
são considerados essenciais, porém são importantes para a sobrevivência e a propagação das
plantas que os produzem. Muitos deles funcionam como sinais químicos que permitem à
planta responder a estímulos ambientais, outros funcionam em defesa da planta contra
herbívoros, patógenos ou competidores, enquanto alguns fornecem proteção contra a radiação
solar e outros contribuem para a dispersão de pólen e sementes (RAVEN et al., 2001). Dentre
os metabólitos secundários é que se encontram os metabólitos ativos, ou seja, com atividade
farmacológica (SANTOS, 1999), denominados de princípios ativos.
Através da pesquisa fitoquímica é possível identificar as substâncias químicas de
espécies vegetais ou avaliar a sua presença. Quando não se conhece previamente o conteúdo
do material a ser analisado, costuma-se submeter o material vegetal a sucessivas extrações,
com solventes de polaridade crescente, conseguindo-se assim, uma extração fracionada, em
que as diferentes frações contêm compostos de polaridade também crescente. Por exemplo,
quando se deseja extrair substâncias como lipídeos, ceras, pigmentos e furanocumarinas se
utiliza o éter de petróleo ou hexano como solvente da extração. Quando se deseja obter bases
livres de alcalóides, antraquinonas livres, óleos voláteis, glicosídeos cardiotônicos, utiliza-se
clorofórmio, tolueno ou ainda diclorometano como solvente na extração. Já quando o objetivo
da extração é obter heterosídeos utiliza-se etanol ou metanol como solvente na extração.
14
Porém, sabe-se que praticamente todos os constituintes de interesse para a análise fitoquímica
apresentam alguma solubilidade em etanol (MACHADO et al., 1999).
1.4. Fatores que influenciam o crescimento de plantas e a produção de metabólitos
Fatores ambientais como a disponibilidade de água, de luz e de nutrientes, influenciam
no crescimento de plantas. Com alteração do regime de luz ou nutricional, as espécies
costumam mostrar alterações morfo-fisiológicas para maximizar o ganho de massa seca nas
novas condições. Entre estas alterações morfo-fisiológicas estão variações na distribuição de
biomassa entre raiz e parte aérea, na taxa de assimilação líquida de carbono e na razão de área
foliar (OSUNKOYA et al., 1994). Sob regime de luz não limitante as espécies tendem a
favorecer o crescimento de raiz, a apresentar maiores taxas de crescimento e de assimilação
líquida de carbono (OSUNKOYA et al., 1994), a aproveitar melhor um aumento nutricional
(PEACE & GRUBB, 1982). Sob regimes nutricionais não limitantes as espécies,
normalmente, apresentam maior crescimento, com menor razão raiz/parte aérea
(GUNATILLEKE et al., 1997).
A natureza e a quantidade de metabólitos produzidos durante o desenvolvimento do
vegetal podem ser afetadas pela luz, pela temperatura, pela precipitação, pelos ventos fortes,
pela altitude, pelo solo, pela época de coleta, pela idade da folha, por eventos fenológicos,
pelo acúmulo de nitrogênio foliar, pela herbivoria, por injúria física e outras formas de
estresse (EVANS, 1991; VITTI & BRITO, 1999; SIMÕES & SPITZER, 1999; LARCHER,
2000; CALIXTO, 2001; GOUINGUENÉ & TURLINGS 2002; GUENTHER, 1997).
LINCOLN & LANGENHEIM (1978) estudaram Satureja douglasii (Benth.) Briq. sob
diferentes intensidades luminosas e observaram que com baixa intensidade luminosa houve
redução do conteúdo de monoterpenos por peso seco. CROTEAU (1992) observou que o
conteúdo de óleo essencial de Hedeoma drummondii Benth. foi reduzido em 50% sob
15
luminosidade baixa. BERNÁTH (1992) verificou que a sombra reduz a concentração do
mentol e do óleo volátil de Mentha piperita L. Estudos realizados com milho demonstraram
também que a fertilização afeta fortemente a emissão de substâncias voláteis
(GOUINGUENÉ & TURLINGS, 2002).
1.5. Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult.
Essa planta é popularmente conhecida por erva-baleeira, erva-balieira, salicilina,
salicina, caraminha, caramoneira-do-brejo, balieira branca, catinga-preta, balieira-cambará,
camaradinha
1
. As folhas dessa planta são empregadas popularmente no litoral de São Paulo,
Paraná e Santa Catarina na elaboração de extrato alcoólico para curar reumatismo, inflamação
e promover cicatrização (AKISUE et al., 1983; SERTIÉ et al., 1991).
Cordia curassavica pertence à família Boraginaceae e tem como sinonímias
científicas: Cordia verbenacea DC., Cordia salicina DC, Cordia curassavica auctt. bras. Ex
Fresen, Cordia cylindristachia auctt. bras. Ex Fresen, Lithocardium fresenii Kuntze,
Lithocardium salicinum Kuntze e Lithocardium verbaceum Kuntze (LORENZI, 2002). A
maioria dos artigos nacionais encontrados refere-se à espécie como Cordia verbenacea,
utilizando como referência SMITH (1970). Cabe, entretanto, destacar que este autor não era
um especialista no grupo taxonômico, ao contrário de SÁNCHEZ (1995), que em seu trabalho
de revisão do gênero Cordia adotou o binômio Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult.
como o mais correto, considerando C. verbenacea DC. como sua sinonímia. Dentro da
tradição de adotar as posições de especialistas que revisem os grupos, a posição de Sánchez
foi aceita também por taxonomistas brasileiros.
1
Esses dois últimos nomes também são usados para espécies de Lippia l. e de Lantana l.
16
Ocorre em altitudes que variam do nível do mar até os 2.000 m de altitude. Cresce
abundantemente sobre solos arenosos e pedregosos em praias, formando parte da vegetação
secundária de matas subxerofíticas alteradas (SÁNCHEZ, 1995). É encontrada desde a
América Central até o sul do Brasil, sendo característica da restinga litorânea do Ceará até o
RGS. Na região Sul, ocorre comumente em restingas subarbustivas ou arbustivas, onde cresce
na duna frontal, ou em dunas internas e planícies arenosas enxutas, bem como em costões
rochosos junto às restingas. Raramente pode ser observada mais para o interior do continente,
em pequenos morros, desenvolvendo-se nas capoeiras, em solos úmidos (SMITH, 1970).
C. curassavica é um arbusto aromático, possui cheiro forte e característico, mas não
desagradável (AKISUE et al., 1983; LORENZI, 2002). Para algumas pessoas o cheiro lembra
o aroma dos cubinhos de caldo de carne, razão pela qual a planta é chamada em inglês de
“maggy plant” (MONTANARI, 2000). Arbustos de 0,5 a 4 metros, eretos, com ramos
dispostos helicoidalmente. Suas folhas são simples, alternas, coriáceas, aromáticas, com 5-9
cm de comprimento, a margem denteada, superfície superior verde-escura e áspera e
superfície inferior branca e tomentosa. Inflorescências terminais em espiga, às vezes
agrupadas em panículas; cálice gamossépalo, campanulado, verde, cerca da metade do
comprimento das pétalas, lobos triangulares; corola gamopétala, infundibuliforme, branca, 4-7
mm (SMITH, 1970, SÁNCHEZ, 1995). Os frutos são cariopses esféricas, de coloração
vermelha quando maduras (AKISUE et al., 1983; LORENZI, 2002). Trata-se de um táxon
muito variável quanto ao tamanho das folhas e inflorescências; todos os morfótipos têm em
comum a corola pentalobulada com limbo patente ou revoluto (SÁNCHEZ, 1995).
C. curassavica vegeta preferencialmente em terrenos arenosos como restingas, dunas e
praias. Floresce durante os oito meses mais quentes do ano. Seu florescimento e frutificação
são irregulares. As flores são muito visitadas por abelhas africanisadas, himenópteros, moscas
e borboletas. Seus pequenos frutos vermelhos são comestíveis e muito procurados por
17
pássaros de diversas espécies que, involuntariamente, fazem a dispersão das sementes. É
comum a incidência de formigas cortadeiras, que causam sérios danos à planta. Larvas de
coleópteros da família Carabidae, que se alimentam do limbo das folhas, também podem
causar danos à planta (MONTANARI, 2000).
A propagação pode ser por sementes, por estacas e por micropropagação
(MAGALHÃES, 1997; MATTOS, 1996; FIGUEIRA et al., 2001). As sementes devem ser
coletadas no estádio de frutos vermelhos, pois logo após ocorre a ovoposição generalizada de
um micro-himenóptero, cuja larva destrói o embrião (MAGALHÃES, 1997). A semeadura
pode ser realizada em tubetes, após remoção do arilo das sementes, que inibe a germinação.
Segundo MONTANARI (2000), as sementes germinam de 20 a 50 dias após a semeadura.
Por ser uma espécie em início de domesticação, ainda não existem cultivares nem
tecnologias de cultivo desenvolvidas para C. curassavica, e ainda não são conhecidos os
melhores climas, solos, pH e as necessidades de adubação para ela. Entretanto, de acordo com
observações realizadas no Centro de Pesquisas Químicas Biológicas e
Agronômicas/UNICAMP, a espécie necessita de solo fértil, levemente ácido e com boa
drenagem para se desenvolver bem (MONTANARI, 2000).
Vários pesquisadores já estudaram ou vêm estudando as características químicas e o
potencial medicinal da C. curassavica. LINS et al. (apud KAUFFMANN, 2002) isolaram do
extrato etanólico o β-sitosterol e duas flavonas, sendo uma delas a artemetina. VELDE et al.
(1982), estudando o extrato acetônico das folhas, isolaram dois novos triterpenos,
denominados cordialina A e cordialina B. IOSET et al. (2000) identificaram quatro
naftoquinonas (cordiaquinonas A, B, J e K) nos extratos diclorometânicos das raízes de C.
curassavica.
18
Testes realizados em cobaias para avaliar as atividades biológicas dos extratos da C.
curassavica, e em especial da artemetina, revelaram que houve significativa inibição da
inflamação (BASILE et al., 1989; SERTIÉ et al., 1991). As cordiaquinonas A, B, J e K,
apresentaram atividade antifúngica contra Cladosporium cucumerinum, Candida albicans e
toxicidade para larva do mosquito Aedes aegypti.
Este trabalho pretendeu investigar o efeito dos fatores ambientais luz e nutrientes na
produção de biomassa e na produção de substâncias químicas extraíveis por éter de petróleo,
clorofórmio e etanol em folhas de C. curassavica. Também pretendeu investigar o efeito da
luz e nutrientes na toxicidade do extrato etanólico de folhas. O conhecimento da influência
dos fatores luz e nutrientes no crescimento e produção de metabólitos em C. curassavica
poderá contribuir para que pequenos produtores obtenham melhor produtividade no cultivo
desta espécie, o que lhes poderá trazer benefícios comerciais e financeiros ao produzirem
plantas medicinais de melhor qualidade.
19
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Analisar a influência dos fatores ambientais luz e nutrientes no crescimento e na
produção da planta Cordia curassavica, tendo em vista a obtenção de informações sobre
melhores condições de cultivo desta planta, para obtenção de maior quantidade de biomassa e
produtos do metabolismo secundário.
2.2. Objetivos específicos
Considerando a influência de três intensidades de luz e dois níveis nutricionais do
substrato no crescimento das plantas, avaliar a:
i. massa seca, área foliar, taxa de crescimento e alocação de biomassa entre órgãos;
ii. rendimento relativo de extratos em éter de petróleo, clorofórmio e etanol;
iii. perfil quali-quantitativo em cromatografia em camada delgada do extrato etanólico; e
iv. toxicidade do extrato etanólico para larvas de Artemia salina Leach..
20
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Local e época dos experimentos
Os experimentos foram realizados no Departamento de Botânica da UFSC, na cidade
de Florianópolis/SC, durante os meses de março a outubro de 2005.
3.2. Material vegetal
As plantas cultivadas e analisadas no âmbito deste trabalho foram obtidas a partir de
sementes provenientes de frutos de Cordia curassavica (Jacq.) Roem. & Schult., cedidos pelo
Profº Drº Pedro Melilo do CPQBA (Centro de Pesquisas Químicas Biológicas e
Agronômicas) da UNICAMP Paulínea/SP, originários de plantas lá cultivadas.
As sementes foram coletadas aleatoriamente em 12 hectares de cultivo de C.
curassavica existente no CPQBA. As matrizes do CPQBA não sofreram nenhum processo
específico de melhoramento genético. O único tipo de adubação realizado foi a calagem uma
vez ao ano e quando época de estiagem é realizado a irrigação. Este cultivo já existe a 15 anos
e ao longo dos anos sempre foram coletadas as sementes mais vigorosas para germinação e
levadas a campo as mudas mais bem formadas.
3.3. Obtenção de plântulas
Os frutos foram submersos por 12 h em água, para amolecimento da polpa, sendo
posteriormente passados em peneira metálica malha 50 (fubá) Belgo®, de forma a isolar o
21
pericarpo da semente. As sementes desnudas foram lavadas em água corrente para retirar o
restante do pericarpo aderido. A seguir, foram desinfetadas em solução de hipoclorito de
sódio a 10%, durante 15 minutos e lavadas em água previamente fervida e resfriada. As
sementes foram colocadas para germinar a temperatura ambiente, em placas de Petri
revestidas com papel filtro umedecido com solução do fungicida Benlate
®
500 (benzimidazol)
na concentração de 100 mg/mL.
As plântulas obtidas da germinação, a qual teve a duração de 10 a 30 dias, foram
sendo transplantadas para bandejas contendo areia lavada, onde permaneceram por 30 dias até
serem transplantadas para as condições definitivas de crescimento.
3.4. Condições de crescimento de plantas em diferentes intensidades de luz
As plântulas, com cerca de 12 cm de parte aérea, foram transplantadas para sacos
plásticos de 4 L, contendo substrato composto de material argiloso
2
, areia de rio e composto
orgânico termofílico (obtido na compostagem da UFSC), na proporção de 1:1:1. Os sacos,
contendo uma planta cada, foram colocados sob abrigos de 1m x 1m x 1m, confeccionadas
com tela sombrite, as quais permitiam a passagem de cerca de 70%
3
e 20%
4
de luz solar
incidente. Nos tratamentos em que o nível de luz foi de 100%, as plantas foram colocadas a
céu aberto. Os abrigos de sombrite foram colocados, a céu aberto e distanciadas entre si,
evitando o auto-sombreamento.
Para cada nível de luz foram utilizadas três unidades amostrais, cada uma contendo
seis plantas, totalizando dezoito plantas por tratamento. A disposição das unidades amostrais
foi feita ao acaso, através de sorteio.
2
Comercialmente vendido para utilização em jardins.
3
Conhecido comercialmente como Sombrite 30%.
4
Conhecido comercialmente como Sombrite 80%.
22
A primeira coleta foi feita logo antes das plantas serem colocadas nos diferentes
tratamentos e a segunda, após 72 dias de crescimento das plantas nas diferentes intensidades
de luz. A cada coleta utilizaram-se nove plantas de cada tratamento, totalizando-se 27 plantas.
3.5. Condições de crescimento de plantas em diferentes substratos
As plântulas, com cerca de 6 cm de parte aérea, foram transplantadas para sacos
plásticos de 4 L, contendo dois tipos de substrato: 1) material argiloso
5
, areia de rio e
composto orgânico termofílico (obtido na compostagem da UFSC), na proporção de 1:1:1 e 2)
solo arenoso, coletado no Rio Tavares, Florianópolis/SC, habitat natural de C. curassavica.
Os sacos, contendo uma planta cada, foram colocados a pleno sol.
Para cada tipo de substrato foram utilizadas três unidades amostrais, cada uma
contendo seis plantas de cada substrato.
A primeira coleta foi feita logo antes das plantas serem colocadas nos diferentes
tratamentos e a segunda coleta, após 201 dias de crescimento das plantas nos diferentes
substratos. A cada coleta utilizaram-se nove plantas.
3.6. Avaliação de parâmetros morfológicos e fisiológicos
3.6.1. Determinação de massa seca e área foliar
A massa seca foi determinada por pesagem, após a secagem do material vegetal por 72
horas a 80˚C em estufa. A área foliar foi determinada desenhando o contorno das folhas em
papel. O contorno em papel de cada folha foi recortado e pesado. Este peso foi comparado por
regra de três ao peso de 1 cm
2
do mesmo papel.
5
Comercialmente vendido para utilização em jardins.
23
3.6.2. Determinação da taxa de crescimento relativo, da razão de área foliar e da razão
raiz / parte aérea.
A taxa de crescimento relativo (TCR) e a razão de área foliar (RAF) foram calculadas
utilizando-se as equações abaixo, segundo HUNT (1982).
(
)
(
)
1212
lnln ttmmTCR −÷−=
(
)
(
)
[
]
{
}
2
2211
÷÷+÷= mAmARAF
Em que,
=
2
m
massa seca da planta na segunda coleta;
=
1
m
massa seca da planta na primeira coleta;
(
)
=−
12
tt
intervalo de tempo entre as coletas;
=
1
A
área foliar da primeira coleta;
=
2
A
área foliar da segunda coleta.
A razão raiz/parte aérea (R:PA) foi obtida, dividindo-se a massa seca de raiz pela
massa seca da parte aérea.
3.7. Obtenção de extratos brutos e rendimento de folhas
Todos os extratos dos tratamentos de intensidade de luz foram obtidos a partir de
material vegetal da segunda coleta, aos 72 dias para o tratamento de luz e aos 201 dias para o
tratamento de substrato. Esta diferença de dias ocorreu devido ao baixo desenvolvimento das
plantas cultivadas em solo arenoso, aos 72 dias de tratamento, o que dificultaria os resultados
e aumentaria o erro.
Foram utilizadas nove plantas por tratamento para obtenção de extratos. De cada
planta foram retiradas três folhas sadias inseridas logo abaixo da última folha com expansão
máxima. As três folhas de cada planta foram pesadas e picadas, correspondendo a uma
amostra. Cada amostra foi colocada em éter de petróleo (EP) na proporção de 1:20 (g/mL),
por 48 horas em local escuro, à temperatura ambiente. O extrato obtido em éter de petróleo foi
filtrado, com o auxílio de algodão, e armazenado em frascos de vidro de cor âmbar, vedados
com filme plástico e colocados em local escuro à temperatura ambiente. O material vegetal,
24
após extração em éter de petróleo, foi colocado em clorofórmio (CL) por 48 horas. O extrato
clorofórmico obtido foi filtrado e armazenado como descrito acima. O resíduo vegetal, depois
da extração em clorofórmio foi colocado por 48 horas em etanol (ET), procedendo-se a seguir
da mesma maneira descrita acima (KAUFMANN, 2002). A figura 1 mostra um esquema
representativo da preparação dos extratos.
Figura 1. Esquema representativo da seqüência da preparação dos extratos brutos das folhas.
EP: éter de petróleo; CL: clorofórmio; ET: etanol
Os solventes éter de petróleo, clorofórmio e etanol foram retirados das soluções
extrativas através de evaporador rotatório modelo Laborota 4000 (Heidolph®) com bomba à
vácuo Marconi® , com temperatura variando entre 40 e 60°C. A massa seca restante após
evaporação do solvente constituiu o extrato bruto. O rendimento bruto de cada amostra foi
calculado dividindo-se a massa do extrato bruto pela massa de folhas de cada amostra. O
rendimento relativo, que corresponde à quantidade de extrato bruto que seria obtido a partir de
100 g de folhas, foi calculado multiplicando-se a massa do extrato bruto por 100 e dividindo-
se o produto obtido pela massa das folhas de cada amostra.
Folhas frescas
Resíduo de folhas
Extrato EP
Maceração em éter petróleo
Maceração em clorofórmio
Resíduo de folhas
Extrato CL
Maceração em etanol
Extrato ET
25
3.8. Determinação da composição química qualitativa e quantitativa do extrato bruto
etanólico.
As determinações das composições químicas qualitativa e quantitativa dos extratos
brutos foram realizadas segundo FALKENBERG et al. (2003), com algumas adaptações.
Os extratos brutos etanólicos foram ressuspendidos em etanol, na proporção de 1:20
(m/V), a mesma proporção da solução extrativa. Os extratos foram aplicados em placa de gel
de sílica F254 para proceder-se à cromatografia em camada delgada (CCD). Os volumes das
alíquotas foram padronizados, 10 µL de cada extrato, e aplicados com o auxílio de tubo
capilar padronizado. Ao lado das aplicações das alíquotas do extrato etanólico de C.
curassavica foi aplicada alíquota de solução padrão de ácido rosmarínico, cedido pela Prof
a
Dr
a
Maike Petersen, da Universidade de Marburg, Alemanha.
Após eluição cromatográfica das substâncias contida nas alíquotas no sistema de
eluentes clorofórmio: metanol: água (30:11:2), as placas foram avaliadas sob luz ultravioleta
(UV) de 254 e 365 nm, sendo marcadas a lápis as manchas que apareceram em cada um
destes comprimentos de onda. Em seguida as placas foram borrifadas com o revelador
anisaldeído-sulfúrico e avaliadas sob luz UV de 254 e 365 nm, sendo marcadas as manchas
que apareceram em cada um destes comprimentos de onda.
3.9. Avaliação da toxicidade de extratos vegetais
Fármacos naturais ou sintéticos são quase sempre tóxicos em altas doses, por isso a
avaliação da toxicidade de extratos vegetais para organismos de pequeno tamanho pode ser
usada como indicativo de atividade biológica (capacidade de interferir em sistemas
26
biológicos). Muitos grupos de pesquisa têm realizado o bioensaio com cistos de Artemia
salina Leach. (Artemiidae), um microcrustáceo cosmopolita, pertencente à subclasse
Branchiopoda. Após o bioensaio determina-se a concentração letal média (CL
50
-
concentração que mata 50% dos animais expostos). Este bioensaio consiste na administração
de doses de forma a obter-se uma concentração que não mata nenhum dos animais tratados,
uma concentração que mata todos os animais tratados e uma terceira concentração
intermediária (MC LAUGHLIN, 1991). A dose que mata 50% dos animais tratados (DL
50
) é
obtida por análise de regressão linear do número de indivíduos mortos para cada uma das três
concentrações (BRITO, 1996). A quantificação da atividade em termos de DL
50
permite
inferir sobre a concentração de substâncias potencialmente ativas.
Neste trabalho foi avaliada apenas a toxicidade do extrato etanólico de C. curassavica,
através do bioensaio de Artemia salina, segundo MEYER et al. (1982).
Uma alíquota de cada extrato bruto etanólico foi pesada, ressuspendida em etanol e
diluída de forma a obter soluções de diferentes concentrações (figura 2).
Os cistos de A. salina foram colocados em um aquário sob aeração e controle de
temperatura em torno de 25 °C. Após 48 horas de incubação, cerca de 500 mL de água do
aquário contendo as larvas foram retirados para o bioensaio.
A cada tubo de ensaio contendo extrato bruto seco (para se obter concentrações de 50,
100 e 200 µg de extrato /mL de água do mar), foram adicionados 50 µL de dimetilsulfóxido
(DMSO). Com o auxílio de uma pipeta foram transferidas 10 larvas (suspensas em água do
mar) para cada tubo de ensaio. O volume do tubo foi completado para 5 mL com água do mar.
As larvas foram deixadas por 24 horas nestas soluções, quando então foi feita a contagem do
número de larvas sobreviventes. Foram consideradas mortas aquelas larvas que
permaneceram imóveis por mais de 10 segundos após agitação suave dos tubos (figura 3).
27
Extrato bruto Balão volumétrico I Balão volumétrico II
(cerca de 50 mg)
25 mL 5 mL
Volumes pré-calculados destas soluções (ver cálculo abaixo) foram colocados em tubos de ensaio e
deixados na capela ou em banho maria a 40 °C para a total evaporação do solvente. Da mesma maneira foram
preparados tubos de ensaio controle, contendo somente etanol. Para cada concentração os testes foram
realizados em triplicata.
Os cálculos abaixo ilustram a preparação das diluições dos extratos contidos nos tubos, os quais
apresentaram ao final, concentrações de 50, 100 e 200 µg de extrato /mL de água do mar, partindo de uma
alíquota de extrato bruto (EB) de, por exemplo, 58 mg.
58 mg EB→25 mL etanol (balão I)
X → 1 mL solução
*
X = 2,32 mg EB
2,32 mg EB → 5 mL etanol (balão II)
0,25 mg EB → A solução
**
A = 0,54 mL solução/tubo
Preparação da concentração de 100 µg/mL
2,32 mg EB → 5 mL etanol (balão)
0,5 mg EB → A solução
A =1,08 mL solução/tubo
Preparação da concentração de 200 µg/mL
2,32 mg EB → 5 mL etanol (balão)
1,0 mg EB → A solução
A = 2,16 mL solução/tubo
Figura 2. Esquema representativo da preparação das diluições dos extratos para obtenção
das concentrações finais.
*
X: representa alíquota de solução etanólica do extrato bruto (EB) a ser transferida para o balão volumétrico II.
**
A: representa o volume da 2ª diluição (balão volumétrico II) a ser transferida para cada tubo de ensaio da
série de 50 µg/mL. O volume de A contém 0,25 mg de EB (= 250 µg) que estão ao final, dissolvidos em 5 mL
de água do mar, ou seja, 250 µg/5 mL equivalem a 50 µg/mL de água do mar.
4) Transferência de
1 mL da solução
2) Transferência
balão de 25 mL
3) Completar com
etanol até 25 mL
5) Completar com
etanol até 5 mL
1) Ressuspensão
com Etanol
A
28
Figura 3. Seqüência das etapas para o bioensaio com Artemia salina Leach.
3.10. Análise estatística
A comparação entre duas médias foi feita utilizando-se teste t de Student e entre três
médias, utilizando-se análise de variância, seguida de teste de Tukey. Os cálculos foram
realizados com auxílio do programa Statistica (STATISOFT, 2001).
Para dados qualitativos da cromatografia foi utilizado o teste não paramétrico de
Mann-Whitney, com auxílio do programa Statistica, sendo os resultados comparados dois a
dois (100% com 70% e 100% com 20%). Os dados do bioensaio com A. salina foram
analisados pelo teste de qui-quadrado (χ
2
), tabela de contigência 2X2, utilizando a correção de
Yates, sendo considerados significativos para α = 0,05 (portanto mais tóxicos que o controle)
os valores de χ
2
maiores ou iguais a 3,84 (CENTENO, 1990). Para análise estatística da CL
50
dos extratos etanólicos foi utilizando o aplicativo computacional PROBIT (USEPA, 2000),
considerando-se as três concentrações (LHULLIER, 2005).
29
4. RESULTADOS
4.1. Efeitos de diferentes intensidades de luz no crescimento de plantas
Houve um maior incremento de biomassa nas raízes quando as plantas estavam em
maior exposição à luz. Em 100% de luz a massa seca das raízes foi 1,43 g. Em 20% de luz a
massa seca das raízes foi 0,78 g (tabela 1).
A área foliar em 100% de luz foi menor do que plantas crescidas em ambiente de
menor irradiância, como em 20% de luz. Em 100% de luz a área foliar foi de 399,65 cm
2
, em
70% de luz a área foliar foi de 558,69 cm
2
e em 20% de luz a área foliar foi 682,67 cm
2
(tabela 1).
Tabela 1. Massa seca e área foliar de plantas de Cordia curassavica crescidas sob diferentes
intensidades de luz.
Zero (0) dias de tratamento refere-se aos dados de plantas antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos
de luz. Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem
estatisticamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Dados entre parênteses mostram o
desvio padrão referente a média.
A taxa média de crescimento relativo (TCR), não foi influenciada pela intensidade de
luz. A intensidade de luz influenciou a razão média de área foliar (RAF), sendo maior na
intensidade de luz mais baixa e menor nas duas intensidades de luz mais altas. A razão raiz/
parte aérea foi maior a 70% de luz que a 20% de luz, mas similar a 100% de luz (tabela 2).
Dias de
tratamento
Níveis
de luz
Folha
(g)
Caule
(g)
Parte Aérea (g) Raiz
(g)
Total
(g)
Área Foliar
(cm
2
)
0
------- 0,05
(±0,02)
0,02
(±0,008)
0,07
(±0,03)
0,01
(±0,006)
0,08
(±0,04)
27,97
(±10,13)
100% 2,48 a
(±0,74)
1,12 a
(±0,40)
3,60 a
(±1,11)
1,43 a
(±0,49)
5,03 a
(±1,54)
399,65 b
(±120,66)
72
70% 2,59 a
(±0,84)
1,21 a
(±0,45)
2,67 a
(±1,91)
1,25 ba
(±0,53)
5,06 a
(±1,81)
558,69 ba
(±237,30)
20% 2,25 a
(±0,71)
1,22 a
(±0,53)
3,47 a
(±1,20)
0,78 b
(±0,38)
4,25 a
(±1,50)
682,67 a
(±180,57)
30
Tabela 2. Taxa média de crescimento relativo (TCR), razão média de área foliar (RAF) e
relação raiz:parte aérea (R:PA) de plantas de Cordia curassavica crescidas sob
diferentes intensidades de luz.
Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente entre
si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Dados entre parênteses mostram o desvio padrão
referente a média (R:PA) razão raiz/parte aérea.
4.2. Efeitos de diferentes substratos no crescimento de plantas
Plantas crescidas em diferentes substratos mostraram diferença em relação às massas
secas e área foliar. Plantas crescidas em substrato misto (composto por material argiloso,
composto orgânico termofílico e areia de rio) apresentaram maior massa seca total e de órgãos
e maior área foliar em relação às crescidas em areia de duna (tabela 3).
A TCR e a RAF foram diferentes para plantas crescidas em substrato misto e em areia
de duna. O maior valor da TCR foi para plantas crescidas em substrato misto, as quais
assimilaram em média (TCR) 0,034 g de matéria seca por dia de crescimento, enquanto que
plantas crescidas em areia de duna assimilaram em média (TCR) 0,025 g de matéria seca por
dia de crescimento. O maior valor de RAF foi obtido em plantas crescidas em areia de duna,
com valor da RAF de 195,05 cm
2
.g
-1
, enquanto em substrato misto o valor da RAF foi de
187,65 cm
2
.g
-1
. A razão raiz/parte aérea não foi afetada pelo tipo de substrato (tabela 4).
Intervalo de tempo
(dias)
Níveis de luz TCR
(g.g
-1
.dia
-1
)
RAF
(cm
2
.g
-1
)
R:PA
(g)
100% 0,056 a
(±0,004)
208,52 b
(±5,06)
0,4 ab
(±0,07)
0 - 72 70% 0,056 a
(±0,005)
225,25 b
(±14,35)
0,5 a
(±0,29)
20% 0,054 a
(±0,006)
254,38 a
(±22,47)
0,2 b
(±0,09)
31
Tabela 3. Valores de massa seca e área foliar de plantas de Cordia curassavica crescidas sob
diferentes substratos.
Zero (0) dias de tratamento refere-se aos dados de plantas antes de serem submetidas aos diferentes tratamentos.
Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente entre
si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t de Student. Dados entre parênteses mostram o desvio padrão
referente a média.
Tabela 4. Taxa média de crescimento relativo (TCR), razão média de área foliar (RAF) e
relação raiz:parte aérea (R:PA) de plantas de C. curassavica crescidas sob diferentes
substratos.
Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente entre
si ao nível de 5% de probabilidade pelo test t de Student. Dados entre parênteses mostram o desvio padrão
referente a média. (R:PA) razão raiz/parte aérea.
Dias de
tratamento
Substratos Folha
(g)
Caule
(g)
Parte Aérea
(g)
Raiz
(g)
Total
(g)
Área Foliar
(cm
2
)
0 ------- 0,007
(
±
0,003)
0,005
(±0,002)
0,013
(±0,004)
0,002
(±0,001)
0,014
(±0,005)
4,67
(±0,96)
Substrato
misto
4,37 a
(±1,95)
3,98 a
(±1,77)
8,35 a
(±3,63)
4,38 a
(±1,29)
12,73 a
(±4,71)
559,54 a
(±337,58)
201
Areia de
duna
0,95 b
(±0,72)
0,50 b
(±0,32)
1,45 b
(±1,01)
0,82 b
(±0,38)
2,27 b
(±1,35)
135,37 b
(±103,93)
Intervalo de tempo
(dias)
Tipos de
substratos
TCR
(g.g
-1
.dia
-1
)
RAF
(cm
2
.g
-1
)
R:PA
(g)
Solo
0,034 a
(±0,003)
187,65 b
(±5,85)
0,56 a
(±0,17)
0 - 201
Areia de
duna
0,025 b
(±0,003)
195,05 a
(±8,66)
0,67 a
(±0,33)
32
4.3. Efeitos da intensidade de luz nos rendimentos relativos dos extratos vegetais
Os dados de rendimento relativo são vistos na tabela 5. O rendimento relativo do extrato
clorofórmico de folhas não foi alterado pela variação da intensidade luminosa, mas a
intensidade de luz influenciou o rendimento relativo do extrato em éter de petróleo e em
etanol. O rendimento relativo do extrato em éter de petróleo foi maior a 100% de luz que a
70% e 20% de luz. Para o extrato etanólico, observou-se que a 100% e 70% de luz o
rendimento relativo foi, aproximadamente, três vezes maior que a 20% de luz.
O rendimento relativo total (soma das médias dos rendimentos relativos dos extratos
éter de petróleo, extratos clorofórmicos e extratos etanólicos) foi influenciado pela
intensidade luminosa, sendo maior o rendimento relativo total quanto maior a intensidade
luminosa.
Tabela 5. Rendimentos relativos dos extratos de plantas crescidas em diferentes intensidades
luminosas.
Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente entre
si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Dados entre parênteses mostram o desvio padrão
referente a média.
Luz Extr. clorofórmico
Rend. Relativo
g ext. bruto/100 g planta
Extr. éter de petróleo
Rend. Relativo
g ext. bruto/100 g planta
Extr. etanólico
Rend. Relativo
g ext. bruto/100 g planta
Rend. Relativo Total
g ext. bruto/100 g planta
100%
0,59 a
(±0,47)
3,17 a
(±0,89)
2,36 a
(±0,96)
6,12 a
(
±1,00)
70%
0,45 a
(±0,14)
1,61 b
(±0,99)
2,20 a
(±0,26)
4,26 b
(
±0,78)
20%
0,51 a
(±0,18)
1,28 b
(±0,76)
0,77 b
(±0,31)
2,56 c
(±0,70)
33
4.4. Efeitos do substrato nos rendimentos relativos dos extratos vegetais
O rendimento relativo do extrato clorofórmico também não foi influenciado pela
variação do substrato. Já o rendimento relativo do extrato em éter de petróleo e em etanol foi
influenciado pelo tipo de substrato, observando-se que em solo os rendimentos relativos
foram maiores do que em areia de duna (tabela 6).
O rendimento relativo total (soma das médias dos rendimentos relativos dos extratos
éter de petróleo, extratos clorofórmicos e extratos etanólicos) apresentou diferença
significativa entre os tratamentos, mostrando ser influenciado pelo tipo de substrato. Plantas
cultivadas em solo obtiveram rendimento relativo maior do que plantas crescidas em areia de
duna (tabela 6).
Tabela 6. Rendimentos relativos de extratos de plantas de Cordia curassavica crescidas em
diferentes substratos.
Letras comparam médias dentro das colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente entre
si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t de Student. Dados entre parênteses mostram o desvio padrão
referente a média.
Substratos Extrato clorofórmico
g ext. bruto/100 g planta
Extrato éter de petróleo
g ext. bruto/100 g planta
Extrato etanólico
g ext. bruto/100 g planta
Rendimento
Relativo Total
g ext. bruto/100 g planta
Solo
1,24 a
(± 0,15)
4,30 a
(± 1,11)
8,15 a
(± 1,74)
13,69 a
(±2,83)
Areia de duna
0,79 a
(± 0,65)
2,25 b
(± 1,71)
5,04 b
(± 2,08)
8,00 b
(±2,69)
34
4.5. Cromatografia em camada delgada (CCD) de extrato etanólico
4.5.1. Intensidade das manchas na CCD para extratos de plantas cultivadas em
diferentes intensidades luminosas.
Quando comparados os tratamentos 100% e 20% de luz, apenas a substância VI
apresentou intensidade significativamente diferente, sendo que a 100% de luz a concentração
da substância VI foi maior. Quando comparados os tratamentos 100% e 70%, houve diferença
estatisticamente significante apenas em relação à substância II, a qual foi mais intensa a 70%
de luz. Apenas dois extratos de plantas cultivadas, a 70% de luz apresentaram na CCD
manchas que pudessem ser atribuídas ao ácido rosmarínico, aplicado como padrão (tabela 7).
Tabela 7. Intensidade das diferentes substâncias detectadas na cromatografia em camada
delgada, para extratos etanólicos preparados a partir de plantas de Cordia
curassavica crescidas em diferentes intensidades luminosas.
Valores à esquerda e em negrito representam a intensidade da mancha: 0 mancha ausente, +1 mancha presente
em baixa intensidade, +2 mancha presente em intensidade média, +3 mancha presente em intensidade alta, +4
mancha presente em intensidade muito alta. Valores entre parênteses representam a quantidade de amostras, sob
mesmo tratamento, que apresentaram a mesma intensidade para cada substância. Para análise estatística foi
utilizado o teste de Mann-Whitney comparando os tratamentos 100% com 70% de luz e 100% com 20% de luz.
(
*
p = 0,014 ,
**
p = 0,046).
LUZ Subst
I
Subst
II
Subst
III
Subst
IV
Subst
V
Subst
VI
Subst
VII
Subst
VIII
Subst
IX
Ac.
rosm
100%
+1 (7)
+3 (2)
+1 (9)
*
0 (9)
0 (4)
+1 (2)
+3 (3)
0 (4)
+1 (2)
+3 (3)
0 (2)
+1 (1)
+2 (2)
+3 (4)
**
0 (5)
+1 (4)
0 (7)
+1 (2)
0 (7)
+1 (2)
0 (9)
70% +1 (1)
+2 (8)
+1 (3)
+3 (3)
+4 (3)
*
0 (8)
+1 (1)
0 (4)
+1 (3)
+3 (1)
+4 (1)
0 (7)
+1 (1)
+3 (1)
0 (3)
+1 (2)
+3 (4)
0 (9) 0 (6)
+1 (2)
+3 (1)
0 (8)
+1 (1)
0 (7)
+1 (2)
20%
+1 (6)
+3 (2)
0 (4)
+1 (1)
+3 (3)
0 (6)
+1 (2)
0 (5)
+1 (3)
0 (8)
0 (4)
+1 (3)
+2 (1)
**
0 (4)
+1 (4)
0 (8)
0 (8)
0 (8)
35
4.5.2. Intensidade das manchas na CCD para extratos de plantas cultivadas em diferentes
substratos
Não houve diferença estatisticamente significante para a intensidade das manchas das
substâncias em plantas crescidas em diferentes substratos (tabela 8).
Tabela 8. Intensidade das diferentes substâncias detectadas na cromatografia em camada
delgada, para extratos etanólicos preparados a partir de plantas de Cordia
curassavica crescidas em diferentes substratos.
Valores à esquerda e em negrito representam a intensidade da mancha: 0 mancha ausente, +1 mancha presente
em baixa intensidade, +2 mancha presente em intensidade média, +3 mancha presente em intensidade alta.
Valores entre parênteses representam a quantidade de amostras, sob mesmo tratamento, que apresentam a mesma
intensidade para cada substância. Para análise estatística foi utilizado o teste de Mann-Whitney comparando os
tratamentos solo misto e areia de duna.
4.5.3. Número de metabólitos majoritários detectados na CCD dos extratos etanólicos
das folhas de plantas crescidas em diferentes intensidades de luz ou substratos
Não houve diferença estatisticamente significante em relação ao número de
metabólitos detectados na CCD do extrato etanólico de folhas de C. curassavica em nenhum
experimento (tabela 9).
Solo Subst
I
Subst
II
Subst
III
Subst
IV
Subst
V
Subst
VI
Subst
VII
Subst
VIII
Subst
IX
Subst
X
Ac
rosm
Solo 0 (3)
+1 (5)
+3 (1)
0 (4)
+1 (5)
0 (7)
+1 (2)
0 (7)
+1 (2)
0 (6)
+2 (2)
+3 (1)
0 (8)
+3 (1)
0 (3)
+1 (5)
+3 (1)
0 (2)
+1 (2)
+2 (3)
+3 (2)
0 (6)
+1 (3)
+1 (4)
+3 (5)
0 (6)
+1 (3)
Areia de
duna
0 (2)
+1 (7)
0 (8)
+1 (1)
0 (9) 0 (9) 0 (5)
+1 (1)
+2 (3)
0 (9) +1 (9) 0 (5)
+2 (4)
0 (5)
+1 (4)
+1 (5)
+3 (4)
0 (8)
+1 (1)
36
Tabela 9. Número de metabólitos majoritários visualizados em CCD dos extratos etanólicos
de plantas de Cordia curassavica crescidas em diferentes intensidades luminosas ou
substratos
Letras comparam médias dentro de cada experimento. Letras minúsculas referem-se ao experimento de luz e
letras maiúsculas referem-se ao tratamento de substrato. Valores seguidos da mesma letra não diferem
estatisticamente entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey (comparando três médias) e pelo
teste t de student (comparando duas média). Dados entre parênteses mostram o desvio padrão referente a média.
Pode-se observar, entretanto, uma grande heterogeneidade em relação ao número de
metabólitos presentes em cada amostra.
As tabelas 10 e 11 mostram o número de metabólitos presentes em cada amostra.
Tratamento Número de metabólitos majoritários
100% de luz 5 a
(±2,24)
70% de luz 4,67 a
(±2,24)
20% de luz 2,75 a
(±1,91)
Tratamento Número de metabólitos majoritários
Solo 5,56 A
(±3,00)
Areia de Duna 4,33 A
(±1,87)
37
Tabela 10. Dados individuais do número de metabólitos visualizados, em cada amostra, na
CCD do extrato etanólico de folhas de Cordia curassavica, cultivadas em
diferentes intensidades luminosas.
Na coluna Amostra, número e letra entre parênteses representam, respectivamente, a unidade amostral e o
indivíduo.
Intensidades de Luz
Amostras
Nº Metabólitos
100% 1 (3B) 7
2 (3C) 2
3 (3F) 6
4 (4C) 7
5 (4D) 7
6 (4E) 4
7 (5B) 2
8 (5E) 3
9 (5F) 7
Média
5
Desvio padrão
± 2,24
70% 1 (6D) 7
2 (6E) 8
3 (7D) 4
4 (7E) 2
5 (7F) 2
6 (8A) 7
7 (8B) 3
8 (8C) 4
9 (6F) 5
Média
4,7
Desvio padrão
± 2,24
20% 1 (1D) 1
2 (1E) 3
3 (1F) 3
4 (2C) 5
5 (2D) 6
6 (9C) 1
7 (9E) 1
8 (9A) 2
Média
2,75
Desvio padrão
± 1,91
38
Tabela 11. Dados individuais do número de metabólitos visualizados, em cada amostra, na
CCD do extrato etanólico de folhas de Cordia curassavica, cultivada em
substratos diferentes.
Substratos Amostras Nº Metabólitos
solo 1 3
solo 2 7
solo 3 9
solo 4 1
solo 5 9
solo 6 8
solo 7 2
solo 8 6
solo 9 5
média 5,56
desvio padrão ± 3,00
areia duna 10 3
areia duna 11 6
areia duna 12 2
areia duna 13 3
areia duna 14 3
areia duna 15 6
areia duna 16 7
areia duna 17 6
areia duna 18 3
média 4,33
desvio padrão ± 1,87
Em plantas de C. curassavica crescidas em diferentes intensidades de luz foi possível
visualizar, em CCD do extrato etanólico, a existência de nove substâncias químicas (figura 4),
enquanto que em plantas crescidas em substratos diferentes foi possível detectar dez
substâncias químicas (figura 5).
39
Subst I
Subst II
Subst III
Subst IV
Subst V
Subst VI
Subst VIII
ácido
rosmarínico
Subst VII
Subst IX
Figura 4. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos de plantas cultivadas em diferentes intensidades de luz.
Placa de gel de sílica eluída em clorofórmio, metanol e água na proporção 30:11:2 e observada após revelação
com anisaldeído-sulfúrico.
Legenda:
Linha tracejada representa substâncias que apresentaram extinção de fluorescência sob luz ultravioleta em 254 nm. Linha contínua representa substâncias
que apresentaram fluorescência sob luz ultravioleta em 366 nm, antes da revelação com anisaldeído-sulfúrico. Linha contínua entre parênteses representa
substâncias que apresentaram fluorescência sob luz ultravioleta em 366 nm após revelação com anisaldeído-sulfúrico. Manchas assinaladas com (*)
provavelmente correspondem ao ácido rosmarínico, que apresentou fluorescência azul e coloração verde-amarelada após a revelação da placa.
*
*
40
Subst X
Subst VII
Subst VI
Subst V
Subst IV
Subst III
Subst II
Subst I
Subst IX
Subst VIII
ácido
rosmarínico
Figura 5. Cromatografia em camada delgada de extratos etanólicos de plantas cultivadas em diferentes substratos. Placa de
gel de sílica eluída em clorofórmio, metanol e água na proporção 30:11:2 e observada após revelação com anisaldeído-
sulfúrico.
Legenda:
Linha tracejada representa substâncias que apresentaram extinção de fluorescência sob luz ultravioleta em 254 nm. Linha contínua representa substâncias
que apresentaram fluorescência sob luz ultravioleta em 366 nm, antes da revelação com anisaldeído-sulfúrico. Linha contínua entre parênteses representa
substâncias que apresentaram fluorescência sob luz ultravioleta em 366 nm após revelação com anisaldeído-sulfúrico. Manchas assinaladas com (*)
provavelmente correspondem ao ácido rosmarínico, que apresentou fluorescência azul e coloração verde-amarelada após a revelação da placa.
*
*
*
*
41
4.6. Atividade biológica do extrato etanólico: toxicidade para larvas de Artemia salina
A intensidade luminosa mostrou ter influência na toxicidade do extrato etanólico
de C. curassavica. Houve diferença significativa na CL
50
do extrato de plantas crescidas
nas diferentes intensidades luminosas. Plantas crescidas sob 100% e 20% de luz
mostraram toxicidade similar. Para extrato de plantas cultivadas a 100% de luz, a
toxicidade foi maior que a 70% (figura 6).
100% 70% 20%
99,12 b
(±15,72)
121,35 a
(±3,83)
105,54 ba
(±11,22)
0
50
100
150
200
Intensidades luminosas
CL 50 (ug/ml)
Figura 6. Concentração Letal Média (CL
50
) de extratos etanólicos de plantas cultivadas
em
100% de luz, 70% de luz e 20% de luz.
Letras comparam médias entre as colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente
entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey. Folhas coletadas aos 72 dias de crescimento.
42
A toxicidade dos extratos das plantas parece não ter sido afetada de forma
estatisticamente significativa pelos diferentes substratos utilizados (figura 7).
105,91 a
(±32,63)
127,97 a
(±7,12)
0
50
100
150
200
SOLO AREIA DE DUNA
Substratos
CL 50 (ug/ml)
Figura 7. Concentração Letal Média (CL
50
) de extrato etanólico de plantas cultivadas
em areia
de duna e solo (composto orgânico, areia de rio e solo argiloso).
Letras comparam médias entre as colunas. Valores seguidos da mesma letra não diferem estatisticamente
entre si ao nível de 5% de probabilidade pelo teste t de Student. Folhas coletadas aos 201 dias de
crescimento
.
43
5. DISCUSSÃO
5.1 Efeitos de diferentes intensidades de luz no crescimento de plantas
Aclimatação à variação na irradiância é dependente da capacidade da planta em
alterar tanto a alocação de massa seca como a capacidade fotossintética, de maneira a
obter o maior ganho de carbono na irradiância dada (OSUNKOYA et al., 1994).
C. curassavica em baixa irradiância mostrou menor razão R:PA e maior RAF
que plantas em irradiância mais alta, aclimatação esta que reflete um aumento potencial
para a captura de luz e é importante para manter o crescimento e a sobrevivência das
plantas em baixa irradiância (GIVNISH, 1988). Em alta intensidade de luz, diminuiu a
área foliar e aumentou a razão R:PA, alteração que reflete a aclimatação a alta
irradiância, pois estes dois ajustamentos levam, no primeiro caso à diminuição da
transpiração e no segundo, ao aumento de captação de água.
A taxa de crescimento relativo, TCR, é produto da taxa de assimilação líquida,
TAL
6
, pela razão de área foliar, RAF, (HUNT, 1982). O aumento da RAF em baixa
irradiância possibilitou às plantas a apresentarem TCR similar às plantas sob alta
irradiância, compensando a baixa TAL ocorrida em intensidade de luz mais baixa.
6
Expressa a capacidade fotossintética
44
5.2 Efeitos de diferentes substratos no crescimento de plantas
Na natureza a C. curassavica vegeta preferencialmente em terrenos arenosos,
como restingas, dunas e praias (MONTANARI, 2000), em local exposto à luz solar
plena.
Neste experimento plantas de C. curassavica cultivadas a pleno sol em substrato
composto de solo argiloso, composto orgânico termofílico e areia de rio obtiveram
maiores índices de crescimento em relação às plantas crescidas em areia de duna. O que
está de acordo com MONTANARI (2000), o qual observou que C. curassavica
necessita de solo fértil para se desenvolver bem.
Este resultado está de acordo com dados obtidos pelo Centro de Pesquisas
Químicas Biológicas e Agronômicas da UNICAMP, os quais mostraram que para se
desenvolver bem C. curassavica necessita de solo fértil, levemente ácido e com boa
drenagem (MONTANARI, 2000). Também em experimento realizado por
MONTANARI et al. (1992), a matéria seca de plantas de C. curassavica aumentou com
a adubação nitrogenada.
A principal fonte de nutriente fornecido pelo composto orgânico termofílico é o
nitrogênio (LINDENBERG, 1990). Na planta o nitrogênio faz parte da molécula de
clorofila, indispensável à fotossíntese; é constituinte das proteínas vegetais; auxilia a
formação de folhagens e no rápido crescimento da planta; é precursor de metabólitos
primários (como a purina, a pirimidina e coenzimas) e secundários (alcalóides).
Embora as espécies possam ser sensíveis à diminuição de nutrientes, em geral,
apresentam plasticidade para compensar as limitações na disponibilidade nutricional
45
alterando sua morfologia ou fisiologia (ELLIOT & WHITE, 1994; OSUNKOYA et al.,
1994).
Geralmente, em plantas com baixa disponibilidade nutricional, a razão raiz/parte
aérea é mais alta para favorecer a absorção de nutrientes (POORTER, 1999), mas C.
curassavica não mostrou sensibilidade para alterar este parâmetro.
5.3 Efeitos de diferentes intensidades de luz na composição e atividade dos extratos
de C. curassavica
5.3.1. Rendimento de extratos
Metabólitos lipofílicos são extraídos por solventes apolares, como éter de
petróleo e clorofórmio, enquanto metabólitos hidrofílicos são melhor extraídos por
solventes polares, como etanol e água (HARBORNE, 1984). A extração realizada
iniciou com o solvente mais lipofílico (éter de petróleo), seguindo-se a extração com um
solvente de polaridade intermediária (clorofórmio) e finalizando com a extração por um
solvente mais polar (etanol). Este tipo de extração seqüencial, com aumento gradual da
polaridade, permite que metabólitos de polaridades variadas sejam extraídos
separadamente do material vegetal e é, por isto, muito utilizado em estudos de
investigação fitoquímica, e quando se realiza extrações em grande escala.
O maior rendimento do extrato éter de petróleo em 100% de luz, quase o dobro
em relação a 70% de luz (tabela 5), sugere que a pleno sol haja maior produção de
metabólitos apolares ou lipofílicos. Embora os rendimentos relativos dos extratos
clorofórmicos não tenham apresentado diferença estatisticamente significante em
função da luz, estes extratos possivelmente apresentariam, caso não tivesse sido adotada
a extração seqüencial, os mesmos componentes extraídos com éter de petróleo, além de
outros compostos de média polaridade. Assim, KAUFFMANN (2002) obteve em
46
extrações não-seqüenciais de folhas de C. curassavica maior rendimento relativo com
diclorometano (que tem polaridade semelhante à do clorofórmio) do que com éter de
petróleo, para amostras coletadas em três locais diferentes.
O maior rendimento de componentes lipofílicos sugere a possibilidade de que
também componentes do óleo volátil da planta tenham sua produção aumentada. Um
componente do óleo essencial, o α-humuleno, foi utilizado para padronização do
fitoterápico à base de C. curassavica produzido pelo laboratório Aché (RAMOS, 2005).
CARVALHO Jr. et al. (2004) identificaram os 12 componentes (de 43
detectados) presentes em maior concentração no óleo de Cordia curassavica. O
rendimento do óleo foi em torno de 0,2 mL de óleo essencial por 100 g de material
vegetal.
Na época da elaboração do projeto não era de conhecimento público a
importância do α-humuleno, como substância antiinflamatória presente na
C.curassavica. Portanto a análise dos óleos não chegou a ser cogitada na ocasião.
Considerando que o α-humuleno estava presente no óleo em um percentual inferior a
5%, percebe-se que este metabólito não é majoritário em C. curassavica e que mesmo a
sua detecção cromatográfica nos extratos lipofílicos não seria fácil, uma vez que nos
extratos, além de componentes voláteis, também são encontrados os fixos (não-
voláteis).
O baixo rendimento de óleo essencial e a conseqüente exigência de grandes
quantidades de material vegetal, bem como o fato de ser esta extração bem mais
complexa, que a extração com solventes orgânicos, inviabilizou a inclusão da análise de
α-humuleno no âmbito do presente trabalho.
Os rendimentos dos extratos etanólicos de plantas a 100% de luz foram maiores
em relação a 70% e 20% de luz, mas a diferença foi estatisticamente significante apenas
47
em relação a 20%. Isto sugere que a produção de metabólitos mais polares também
aumenta com a exposição à luz.
Considerando-se as somas dos três rendimentos, o tratamento com 100% de luz
rendeu em média 6 g de extratos diversos por 100 g de folhas frescas, enquanto os
tratamentos de 70% e 20% de luz renderam, respectivamente, em torno de 4,3 g e 2,6 g
de extratos a partir de 100 g de folhas frescas (tabela 5). Estes valores evidênciam que a
produção de metabólitos para C. curassavica aumenta com a exposição da planta a altas
intensidades de luz.
5.3.2. Produção de metabólitos majoritários
A maior produção de metabólitos parece refletir-se também na tendência de
produção de maior número de substâncias em concentrações detectáveis por CCD nos
extratos etanólicos (tabela 9). É importante ressaltar que os volumes e concentrações
das soluções extrativas aplicadas nas placas foram os mesmos, ou seja, a aplicação das
amostras foi padronizada. Embora a análise estatística não tenha apontado diferenças
significativas, possivelmente pelo alto desvio padrão, verifica-se que nos tratamentos
com maior exposição à luz, os extratos apresentavam de 8 a 9 substâncias presentes em
pelo menos uma amostra do grupo, enquanto no tratamento com 20% de luz, no
máximo 6 substâncias foram detectadas em pelo menos uma amostra do grupo.
Além disso, a análise do número de metabólitos detectados em cada planta
individualmente (tabela 10) permitiu visualizar que no tratamento de 20% de luz, houve
3 amostras nas quais apenas 1 metabólito foi visualizado na CCD e uma amostra em que
foram visualizado 6 metabólitos. No tratamento de 70% de luz, duas amostras
apresentaram 2 metabólitos, enquanto em apenas uma amostra foram visualizados 8
metabólitos.
48
No tratamento com100% de luz houve amostras de extratos com 2 metabólitos e
amostras com 7 metabólitos. Pode-se considerar que essa heterogeneidade no número de
metabólitos detectados provenha, ao menos em parte, da variabilidade genética uma vez
que as plantas foram obtidas a partir de sementes. Na literatura consultada não foram
encontrados outros estudos semelhantes, com esta ou outras espécies vegetais.
Entretanto a tendência à grande variabilidade intraespecífica de C. curassavica já foi
sugerida por FIGUEIRA et al. (2001), que não observaram “correlação entre indivíduos
semelhantes e o teor de óleo obtido”. Foram observadas características como porte,
ramificação e florescimento.
Cabe ainda esclarecer que o número relativamente baixo de substâncias visíveis
em CCD deve-se ao fato de ter-se optado pelo uso de soluções com extrato de planta em
baixa concentração, justamente para se poder visualizar melhor aqueles metabólitos
presentes nos extratos em maior concentração (majoritários). A aplicação de soluções
mais concentradas dificultaria a descrição e diferenciação das manchas.
5.3.3. Toxicidade dos extratos
O extrato etanólico de C. curassavica foi escolhido para a realização do
bioensaio com larvas de A. salina por diversos motivos. Primeiro, dos três extratos
preparados, o etanólico é o mais polar e, conseqüentemente o único que seria possível
de solubilização total em água do mar. Em testes realizados com extratos de diversas
espécies (FALKENBERG et al., 1999) a solubilidade de extratos apolares mostrou-se
muito reduzida em água do mar, requerendo a preparação de soluções de concentrações
bem inferiores àquelas preconizadas por MEYER et al. (1982). Outro motivo foi o fato
do extrato etanólico ser utilizado na medicina popular (AKISUE et al., 1983; SERTIÉ et
al., 1991) e ser, em princípio, aquele no qual se esperaria encontrar o ácido rosmarínico.
49
Esta substância apresenta muitos grupamentos polares, e é um metabólito comum na
família Boraginaceae (à qual pertence o gênero Cordia) e Lamiaceae (restrito aqui à
subfamília Nepetoideae), para o qual foram comprovadas diversas atividades biológicas,
como antiviral, antiinflamatória, etc (PETERSEN & SIMMONDS, 2003). Esta
substância é considerada uma das responsáveis pelas propriedades do alecrim –
Rosmarinus officinalis (BRUNETON, 1991). TICLI et al. (2003) isolaram-na do extrato
metanólico de C. curassavica.
O ensaio com A. salina é considerado relativamente inespecífico, porém é um
indicador de potencial atividade biológica. Por ser de baixo custo, simples e requerer
pequena quantidade de extrato é comum sua utilização em estudos investigatórios
iniciais. Este ensaio evita que um número maior de animais vertebrados seja sacrificado,
o que também seria necessário a aprovação do Comitê de Ética e provavelmente maior
quantidade de plantas cultivadas.
Os extratos etanólicos das folhas de C. curassavica mostraram-se tóxicos para
larvas de A. salina, sendo que os extratos de plantas cultivadas em 100% de luz
apresentaram maior toxicidade (menor valor de CL
50
) que os demais. Estatisticamente
os valores de CL
50
foram diferentes apenas dos extratos de plantas cultivadas em 70%
de luz. A ausência de diferença estatisticamente significativa entre as CL
50
dos extratos
de 100% e 20% de luz surpreende, considerando-se que nos demais aspectos avaliados,
os extratos de 20% apresentaram menor rendimento relativo e menor número de
metabólitos detectáveis em CCD. Isto poderia ser explicado pela hipótese da presença
de substâncias com alta potência, em concentrações relativamente baixas no extrato
20%, que não chegam a ser visualizados nas condições experimentais. Outra
possibilidade, complementar à anterior, seria que estas mesmas substâncias pudessem
50
estar sendo, também no extrato de plantas crescidas em 100% de luz, as responsáveis
pela toxicidade verificada.
5.4. Efeitos de diferentes substratos na composição e atividade dos extratos de C.
curassavica
5.4.1. Rendimento de extratos
Houve diferenças estatisticamente significantes entre os rendimentos relativos
dos extratos em função do tipo de substrato usado no cultivo (tabela 6). Esta diferença
novamente não ocorreu apenas em relação aos extratos clorofórmicos, possivelmente
pelas mesmas razões já expostas na discussão do item 5.3.1. A média dos rendimentos
dos extratos clorofórmicos de solo foi cerca de 50% superior à média do rendimento em
areia de duna, mas estas últimas amostras apresentaram elevado desvio padrão, o que
pode também ter contribuído para a falta de significância estatística. Os outros
rendimentos relativos obtidos tiveram o maior valor em plantas cultivadas em solo
composto (areia de rio, composto orgânico termofílico e solo argiloso). Outros autores
observaram um aumento de artemetina e de hidroxiartemetina com o incremento de
adubo no solo de cultivo (MONTANARI et al., 1992).
Percebe-se que, de maneira geral, os rendimentos relativos dos extratos no
experimento de substratos foram maiores que nos experimentos de luz. Isto pode ser
explicado pelo fato de que os tempos de coleta foram bem diferentes: 72 dias nos
tratamentos de luz e 201 dias nos de substratos. Como a produção de metabólitos tende
a ser maior próxima à floração (MONTANARI, 2000), entende-se que as plantas após
201 dias estivessem mais próximas deste evento.
5.4.2. Produção de metabólitos majoritários
51
Como pode ser visto nas tabelas 9 e 11 e figura 5, não houve diferença
estatisticamente significante na média do número de metabólitos majoritários
visualizados nas análises dos extratos etanólicos para CCD. Neste experimento com
variação de substratos, também se percebeu a variabilidade intra-grupo, uma vez que os
extratos das amostras cultivadas em solo apresentaram de 1 a 9 metabólitos majoritários
que foram visualizados, enquanto nas amostras cultivadas em areia de duna, este
número variou de 2 a 7.
Três amostras de plantas cultivadas em solo apresentaram na CCD manchas que,
pelo comportamento cromatográfico, correspondem possivelmente ao ácido rosmarínico
(figura 5), enquanto apenas uma amostra do grupo de plantas cultivadas em areia de
duna apresentou tal substância.
Cabe ressaltar que a posição destas manchas no cromatograma (atributo
conhecido como Rf, que relaciona a distância percorrida pela mancha desde o ponto de
aplicação da amostra com a distância total até o fronte do solvente) não se reproduziu
perfeitamente, em comparação com o Rf do padrão aplicado de ácido rosmarínico.
Entretanto o Rf é passível de alteração em função de fatores como a concentração da
própria substância e a presença de outras substâncias em uma amostra complexa. À
parte das variações de Rf, a reação do ácido rosmarínico com o anisaldeído-sulfúrico
produziu um derivado de cor verde-amarelada, o que ocorreu com apenas algumas
substâncias em Rf próximo ao do ácido rosmarínico. Não se pode excluir a
possibilidade de que os metabólitos em questão sejam outras substâncias muito
semelhantes ao ácido rosmarínico, ao invés do próprio.
5.4.3. Toxicidade dos extratos etanólicos
52
Não houve diferença estatisticamente significante entre os valores de CL
50
dos
extratos provenientes dos diferentes substratos.
Entre as amostras cultivadas em areia, a amostra 16 apresentou o menor valor de
CL
50
(83 µg/mL) sendo a única do grupo em que foi visualizada a substância II em Rf
0,35, com fluorescência azul após revelação com anisaldeído-sulfúrico. Assim, é
possível que esta substância, visualizada também nos extratos de várias amostras
cultivadas em solo, esteja envolvida na toxicidade para larvas de Artemia salina. A
mesma substância foi detectada também nos experimentos de luz (figura 4), sendo mais
encontrada em amostras do tratamento com 100% de luz (codificada como substância
V). O fato de que os extratos do tratamento com 100% de luz terem apresentado menor
valor médio de CL
50
(portanto maior toxicidade) reforça a hipótese acima levantada.
6. CONCLUSÕES
A finalidade deste estudo foi identificar fatores que aumentam a produtividade
no cultivo de Cordia curassavica. A pesquisa tem por objetivo analisar a influência de
fatores ambientais no crescimento e na produção de metabólitos dessa planta.
A pesquisa estudou três variações da intensidade de luz (100%, 70% e 20%) e
dois substratos de cultivo (a do habitat natural – areia de duna e um substrato
enriquecido composto de solo argiloso, areia de rio e composto orgânico termofílico).
53
Os resultados da pesquisa indicam que:
i. A espécie mostrou sensibilidade para diminuir a transpiração em maior
intensidade de luz (diminuiu a área foliar e a RAF), e aumentar a captação de luz
em locais sombreados (aumentou a área foliar e a RAF).
ii. A espécie não mostrou sensibilidade para alterar a produção de metabólitos
extraíveis em clorofórmio em relação à variação de luz.
iii. A espécie mostrou sensibilidade para alterar a produção de metabólitos
extraíveis em éter de petróleo e em etanol, cujos rendimentos relativos
aumentaram com o aumento de luz.
iv. Das 9 substâncias detectadas na CCD apenas a intensidade da substância II e da
substância VI foram afetadas de forma estatisticamente significativa pela
diferença de intensidade luminosa.
v. A variação na intensidade de luz não afetou, de forma estatisticamente
significativa, o número de metabólitos majoritários detectáveis na CCD.
vi. A variação na intensidade de luz gerou níveis de toxicidades diferentes: cortes
de luz diminuem a toxicidade; porém parece que as relações de toxicidade não
são crescentes com cortes de luz maiores.
vii. C. curassavica embora nativa de ambiente de restinga (solo nutricionalmente
pobre) foi capaz de aumentar a produção de biomassa com o aumento de
disponibilidade de nutrientes.
viii. O aumento da nutrição mineral aumentou a produção de metabólitos (aumento
do rendimento relativo total).
ix. O número de metabólitos majoritários presentes nos extratos etanólicos e as
toxicidades desses extratos não diferiram de forma estatisticamente significativa
entre areia e solo fertilizado, verificando-se grande heterogeneidade dentro dos
tratamentos.
Os resultados dessa pesquisa sugerem que C. curassavica deve ser cultivada:
(1) a pleno sol, pois nessa condição há maior crescimento da planta, maior
produção de biomassa, maior produção de metabólitos e o maior efetividade do extrato
etanólico.
(2) em solo fertilizado, tento em vista que houve maior crescimento da planta,
maior produção de biomassa, embora a produção de metabólitos e a efetividade do
extrato etanólico não sofreram alterações em relação a adubação.
54
Os resultados alcançados podem colaborar para o aumento da produção da
espécie em pequena escala por pequenos produtores e consequentemente, um sucesso
maior em termos de qualidade e de comercialização para os mesmos.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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