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1
Marisa Barbosa de Aguiar
Estudo estrutural por RMN do
Peptídeo Policatiônico Polybine I de
Veneno da Vespa Social Polybia
paulista
Dissertação para obtenção do Título
de Mestre em Biofísica Molecular,
área de concentração: Biofísica
Molecular.Instituto de Biociências,
Letras e ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista”Júlio
de Mesquita Filho” – Unesp.
Orientador:
Prof. Dr. Valmir Fadel
São José do Rio Preto
2006
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
2
Agradecimentos
Ao Professor Dr. Valmir Fadel, pela ótima orientação e pela paciência de me
ensinar, tornando possível a realização desse trabalho.
Ao Professor Dr. Walter Filgueira de Azevedo Júnior, pela oportunidade de
trabalhar no seu grupo de pesquisa.
Aos professores Dra. Claudia Elisabeth Munte e Dr. João Ruggiero Neto por
participarem da minha banca de defesa e pelas críticas e sugestões feitas ao meu
trabalho de mestrado.
Aos demais professores do departamento de Física, pelos ensinamentos e
pela atenção.
A Márcia Perez, pela amizade e ajuda e, sobretudo por fazer o papel de uma
co-orientadora.
À amiga Fermanda Canduri pela ajuda em momentos de dificuldade, pela
paciência e pelas conversas.
Aos colegas do Laboratório de Sistemas Biomoleculares, pela ajuda em
muitos momentos e pela amizade.
Aos demais colegas do departamento de física, pela boa convivência.
Ao Pepeu, a sua esposa Márcia e ao seu filhinho pepeuzinho (Bruno), pela
acolhida e por substituir a falta da minha família e pela amizade.
Às amigas Denise, Janaína, Lívia e Lara pelo companheirismo e pelas as
conversas tanto seriam como divertidas.
Às amigas Érika, Laura, Nádia, Miriam pela boa vizinhança e pelas noites de
orgias alimentares.
Ao meu amigo Diego e companheiro, por ter enfrentado as dificuldades junto
comigo e pela paciência.
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3
Aos amigos de Brasília, Bia, Jucelino, Andréia e Lorena, pela ajuda e pela
vivência harmoniosa.
Aos meus irmãos Marcone e Marcelo pela amizade, pelos conselhos e pela
ajuda em todos os momentos.
A minha mãe, pelo apoio incondicional e pela mulher maravilhosa que é.
Ao meu gordinho pelo seu amor, pelo fomento e pela dedicação à família.
À CAPES pelo suporte financeiro.
E a Deus.
4
Índice Geral
AGRADECIMENTOS ______________________________________________________1
ÍNDICE GERAL___________________________________________________________4
ÍNDICE DE FIGURAS______________________________________________________6
ÍNDICE DE TABELAS _____________________________________________________9
LISTA DE TERMOS E ABREVIAÇÕES _____________________________________10
1. RESUMO ______________________________________________________________12
2. ABSTRACT____________________________________________________________13
3. INTRODUÇÃO_________________________________________________________14
3.1 A
SPECTOS DA
V
ESPA
S
OCIAL
P
OLYBIA PAULISTA
______________________________15
3.2 C
OMPONENTE DE BAIXO PESO MOLECULAR DO VENENO DA VESPA SOCIAL
P
OLYBIA
PAULISTA
_________________________________________________________________16
3.3 – I
NTERAÇÃO DE
P
EPTÍDEOS COM
M
EMBRANA
L
IPÍDICA
_______________________19
3.4 – E
SPECTROSCOPIA DE
RMN______________________________________________21
3.4.1- D
ESLOCAMENTO
Q
UÍMICO
_______________________________________________25
3.4.2 - A
COPLAMENTO ESCALAR
_______________________________________________29
3.4.3 – NOE ______________________________________________________________30
3.5 – E
XPERIMENTOS DE
RMN
EM LÍQUIDOS
____________________________________33
3.5.1 - P
ULSO DE
90° ________________________________________________________34
3.5.2 - P
ULSO DE
180° _______________________________________________________34
3.5.3 - A
QUISIÇÃO DE UM ESPECTRO
____________________________________________35
3.5.4 – P
RÉ
-
SATURAÇÃO DA
Á
GUA
_____________________________________________36
3.5.5 – P
ROCESSAMENTO DOS DADOS
___________________________________________36
3.5.5.1 - Correção de Fase____________________________________________________37
3.5.5.2 - Filtragem do Solvente________________________________________________37
3.5.5.3 - Correção de linha ___________________________________________________37
3.5.6- 1D RMN ____________________________________________________________38
3.5.7 - 2D RMN____________________________________________________________39
3.6 - P
ROCEDIMENTO PARA A DETERMINAÇÃO DAS ESTRUTURAS DOS PEPTÍDEOS EM
SOLUÇÃO
. ________________________________________________________________41
3.6.1- I
DENTIFICAÇÃO DOS SISTEMAS DE SPINS
____________________________________41
3.6.2 - A
SSINALAMENTO DOS
NOE
S
____________________________________________42
3.6.3
- A
SSINALAMENTO SEQÜENCIAL
___________________________________________42
3.6.4 - C
ÁLCULO ESTRUTURAL
________________________________________________43
4. MATERIAIS E MÉTODOS_______________________________________________45
5
4.1 – S
ÍNTESE E
P
REPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE
P
OLYBINE
I
E
II ___________________45
4.2 – P
RÉ
-A
NALISE DA AMOSTRA ATRAVÉS DO
D
ICROÍSMO
C
IRCULAR
_______________46
4.3 – P
REPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA
RMN____________________________________48
4.4 – C
OLETA DOS ESPECTROS POR
RMN_______________________________________48
4.5 – P
ROCESSAMENTO DOS DADOS E
I
DENTIFICAÇÃO DOS DESLOCAMENTOS QUÍMICOS
__49
4.6 – C
ÁLCULO
E
STRUTURAL
________________________________________________50
5-RESULTADOS E DISCUSSÃO____________________________________________51
6-CONCLUSÃO __________________________________________________________72
7-BIBLIOGRAFIA ________________________________________________________74
APÊNDICE A ____________________________________________________________80
P
ADRÕES DE
E
SPETROS
T
OCSY PARA OS
20
AMINOÁCIDOS
_________________________80
APÊNDICE B ____________________________________________________________83
T
RANSFORMADA DE
F
OURIER
________________________________________________83
APÊNDICE C ____________________________________________________________85
NMRV
IEW PARA
E
SPECTROSCOPIA
H
OMONUCLEAR
_____________________________85
C
OMO VISUALIZAR OS ESPECTROS NO PROGRAMA
NMRV
IEW
______________________85
A
BRINDO O
NMRV
IEW
:______________________________________________________88
I
NSERINDO O ESPECTRO NO
NMRV
IEW
__________________________________________88
A
RRUMANDO O ESPECTRO PARA ANÁLISE
_______________________________________90
C
ORREÇÃO DE FASE ATRAVÉS DO
NMRV
IEW
____________________________________91
T
RABALHANDO COM O ESPECTRO
_____________________________________________93
Escolhendo uma região do espectro ____________________________________________93
Os botões do teclado que utilizamos p movimentar o espectro _______________________93
A
SSINALAMENTO DOS
Á
TOMOS
_______________________________________________94
ANEXO _________________________________________________________________99
(S
CRIPTS DO
NMRV
IEW
)____________________________________________________99
6
Índice de Figuras
Figura 1. Foto da vespa Polybia paulista 15
Figura 2. Proteína G, heterotrimérica 19
Figura 3. Possíveis mecanismos de ação da Polybia paulista 21
Figura 4. Modelo clássico do próton exposto a um campo magnético externo 22
Figura 5. Mostra o deslocamento do nível energético 23
Figura 6. Descrição do sinal do espectro 26
Figura 7. Espectro padrão 1D 27
Figura 8. Espectro padrão 2D 27
Figura 9. Estrutura geral de um α-aminoácido 28
Figura 10. Desdobramento de sinal por acoplamento escalar 30
Figura 11. Transições entre os estados 31
Figura 12. Desenho do equipamento de RMN 33
Figura 13. Pulso de 90° 34
Figura 14. Pulso de 180° 34
Figura 15. Sinal em modo absorvente e dispersivo 37
Figura 16. Seqüência de pulso do espectro 1D 38
Figura 17. Aparência do espectro homonuclear 2D 39
Figura 18. Experiência de RMN 39
Figura 19. Representa os diferentes tipos de espectros 2D 40
Figura 20. Fotografia do supercondutor OXFORD 600 48
Figura 21. Gráfico com a medida do Ponto Isoelétrico 52
Figura 22. Espectro de CD da Polybine I 53
Figura 23. Espectro de CD da Polybine I com variação de pHs 53
7
Figura 24. Espectro de CD da Polybine I com variação de TFE 55
Figura 25. Espectro 1D da Polybine I 57
Figura 26. Espectro 2D [
1
H-
1
H]-COSY 59
Figura 27. Espectro 2D [
1
H-
1
H]-TOCSY 59
Figura 28. Espectro 2D [
1
H-
1
H]-NOESY 60
Figura 29. Representação de distâncias NOE 61
Figura 30. Gráfico com analise do deslocamento químico 62
Figura 31. Modelo estrutural da polybine I na forma não acetilada 66
Figura 32. Modelo estrutural da polybine I na forma acetilada 67
Figura 33. Modelo estrutural da dinâmica molecular (não acetilada) 70
Figura 34. Gráfico da dinâmica molecular (não acetilada) 70
Figura 35. Modelo estrutural da dinâmica molecular (acetilada) 71
Figura 36. Gráfico da dinâmica molecular (acetilada) 71
Figura 1B. Linhas de comando do script var_com.com 86
Figura 2B. Linhas de comando do script x.y.com 87
Figura 3B. Interface gráfica dos menus principais do NMRView 88
Figura 4B. Passos da abertura de um espectro 89
Figura 5B. Cursores e menu secundário 89
Figura 6B. Espectro 2D com menu secundário ativo 90
Figura 7B. Mostrando como se define as características do espectro 90
Figura 8B. Espectro 2D sem correção de fase 90
Figura 9B. Espectro 2D com a posição dos cursores para a correção de fase 91
Figura 10B. Janela que realiza a correção de fase: gráfico com correção 92
Figura 11B. Janela que realiza a correção de fase:gráfico com correção 92
Figura 12B. Espectro 2D com a fase acertada 93
Figura 13B. Mostra esquema para ampliar uma região do espectro 93
8
Figura 14B. Esquema para a detecção automática dos picos 94
Figura 15B. Janela com as listas de picos 95
Figura 16B. Formato do arquivo nome.seq. 95
Figura 17B. Mostra como se carrega a seqüência. 96
Figura 18B. Mostra os passos para fazer o assinalamento dos resíduos 97
Figura 19B. Mostra os passos para obter as distâncias. 98
9
Índice de tabelas
Tabela 1 – Seqüências primárias de alguns peptídeos 18
Tabela 2 – Valores de sensibilidade relativa dos átomos 23
Tabela 3 – Dados experimentais de Dicroísmo Circular 54
Tabela 4 – Lista dos deslocamentos químicos 63
Tabela 5 – Caracterização do conjunto das 10 estruturas da Polybine I acetilada e
não-acetilada 65
10
Lista de Termos e Abreviações
1D Espectro em uma dimensão
2D Espectro em duas dimensões
Ac
Grupo acetil
FID ( Free Induction Decay)
Sinal medido nos instrumentos de RMN,
ocasionado das oscilações do componente na
amostra após os pulsos de excitação.
CD
Dicroísmo Circular (Circular Dichroism)
COSY ( Correlated Spectroscopy)
Espectro em 2D que mostra o acoplamento
escalar(J) entre os spins através de até três
ligações químicas.
Deslocamento Químico ( Chemical
Shift)
Diferenças de freqüências de ressonância dos
spins numa molécula.
DQF (Double Quantum Filtered)
E simplesmente uma versão da família de
experimentos baseados em filtração direta no
estado quântico –p.
DSS
4,4-dimetil-4-silapenato-1-sulfonato
Fator giromagnético (γ)
A razão entre a freqüência de ressonância de um
núcleo e a intensidade do campo magnético
aplicado.
f
H
Fração de α-hélice
Freqüência de Larmor
Freqüência de ressonância de um spin inserido
num campo magnético.
GDP Guanosina-5’difosfato
GTP Guanosina-5’trifosfato
Homogeneidade
Uniformidade de um campo magnético num certo
volume.
LNLS
Laboratório Nacional de Luz Síncroton
11
LPC
Lisofosfatidilcolina
NOE (Nuclear Overhauser effect)
Alteração da intensidade da magnetização
longitudinal pelo acoplamento dipolar entre spins.
NOESY(Nuclear Overhauser effect
spectroscopy)
Espectro de RMN bidimensional que examina
acoplamento dipolar entre spins através do
espaço.
PDB (Protein Data Bank File)
Formato do arquivo que são armazenad
os os
dados de estrutura de peptídeos e proteínas.
RF
Onda eletromagnética com freqüência na faixa
de rádio (30kHz ~300MHz).
RMN Ressonância Magnética Nuclear
ROESY (Rotating frame Overhauser
effect spectroscopy)
Experimento que monitora a relaxação
cruzada
entre spins que estão em spin-locked
pela
aplicação de pulsos de rf.
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
Spin
Propriedade quântica fundamental da matéria.
T
1
(Relaxação spin –rede ou
longitudinal)
Núcleos que ressoam com seus núcleos vizinhos
e dissipam energia em sincronismo.
T
2
(Relaxação spin –spin ou
Transversal)
Núcleos que podem mudar sua energia trocando
energia entre eles sem mudar a energia total da
amostra.
TFE
2,2,2 – Trifluoretanol
TFP Tampão Fosfato de Potássio
TOCSY (Total Correlated
Spectroscopy)
Experimento de RMN bidimensional que expia
acoplamento escalar (J) entre spins através de
múltiplas ligações químicas.
Wet (water suppression enhanced
through T1 effects)
Técnica para suprimir o sinal da água através do
aumento da relaxação T1.
12
1. Resumo
Os venenos de vespas socias são ricos em peptídeos biologicamente ativos
que causam alguns males ao ser humano como: dores prolongadas, edema,
eritema, reações alérgicas e sistêmicas. Possuem em sua composição vários tipos
de aminas biogênicas, peptídeos e proteínas. Dentre eles, o que chama mais
atenção na atividade farmacológica do veneno são os peptídeos policatiônicos. São
diversas as atividades desses peptídeos como: neurotoxicidade, hemólise, liberação
de histamina de mastócitos e antibatericida.
Neste trabalho, foram estudados peptídeos catiônicos da família Polybine,
sintetizados pelo Departamento de Biologia, Unesp, Rio Claro-SP. Os peptídeos
Polybine I e II foram sintetizados na forma acetilada e não-acetilada para o estudo
detalhado da sua estrutura. Com este objetivo, utilizamos as técnicas de Dicroísmo
Circular (CD), para uma análise da estrutura secundária da amostra e
espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para o estudo da
estrutura tridimensional do peptídeo em solução.
13
2. Abstract
Social wasp venoms are rich of biologically active peptides that may cause
some malady to human such as prolonged pains, edema, erythema, allergies and
systemic reactions. They have, in its composition, many kinds of biogenic amines,
series of polycationics peptides and proteins. Among them, the most interesting thing
in pharmacological activity are the polycationics peptides. These peptides show
several activities like neurotoxicity, hemolytic activity, histamine releasing activity and
antimicrobial activity.
In this project, cationic peptides of the Polybine family synthesized by the
Department of Biology, CEIS/IBRC, UNESP, Rio Claro, SP were studied. The
cationic peptides Polybine I and II were synthesized in acetylad and non-acetylad
forms to the detailed study of the structure. This way, CD spectroscopy were
performed to analyze secondary structure of the sample and, to analyze tree-
dimension structure, NMR spectroscopy were used.
14
3. Introdução
Os insetos são os animais mais numerosos e amplamente distribuídos do
planeta, abrangendo mais de 675 mil espécies conhecidas. Entre os insetos se
encontram, além de outras ordens, a ordem Himenóptera onde estão incluídas as
abelhas, as vespas e formigas. Os Himenópteros, devido ao desmatamento das
florestas, habitat natural desses insetos, se deslocam para as cidades, fazendo seus
ninhos em habitações humanas como refúgio (PEREIRA, 2003). Desta maneira é
crescente o número de acidentes com este tipo de inseto. Em um levantamento de
acidentes com himenópteros registrado no Hospital das Clínicas em São Paulo,
observaram que as vespas foram responsáveis por aproximadamente 32,6% dos
acidentes, seguidas das abelhas com 28,2% e as formigas 26,8%. O veneno
inoculado pela ferroada desses insetos causam dores prolongadas, edemas,
eritema, reações alérgicas e sistêmicas (SOUZA, 2002). Este é um dos motivos pela
qual a industria farmacêutica investiga o seu veneno. O outro motivo é a produção
de novas drogas para o combate de alguns tipos de doenças (p. ex. infecciosas e
câncer), já que alguns dos componentes do veneno estão envolvidos em
mecanismos que interferem em processos de sinalização celular.
Portanto, este trabalho tem como principal objetivo estudar a nova família de
peptídeos policatiônicos Polybines, através do uso da técnica de espectroscopia de
RMN, e compreender o mecanismo de ação e a função de algumas ações biológicas
desses peptídeos, presente no veneno da vespa social Polybia paulista.
15
3.1 Aspectos da Vespa Social Polybia paulista
A filogenia das vespas pode ser interpretada pela divisão de três grandes
superfamílias que vão se subdividindo em outras. Essas superfamílias estão
divididas em: Bethyloidea, Sphecoidea e Vespoidea. A superfamília Vespoidea é
dividida em três famílias: Masaridae, Eumenidae e Vespidae. A super família
Vespidae e composta em três subfamílias: Stenogastrinae, Vespinae e Polistinae. A
subfamília Polistinae é dividida em três grupos: Ropalidini, Polybiini e Polistini, sendo
esta encontrada apenas no Brasil. A Polybiini é composta por 23 gêneros e 405
espécies sendo que apenas três gêneros pertencem aos continentes africano e
asiático, o restante é distribuído na América do sul. O gênero Polubia pertence ao
grupo Polybiini e se localiza no Brasil com uma concentração maior na região
sudeste (PEREIRA, 2005).
A vespa Polybia paulista faz parte do gênero Polubia. O gênero Polubia
representa vespas altamente sociais ou enxameantes, nome dado em razão da
emissão periódica de enxames quando há superpopulação de indivíduos no ninho.
Esse tipo de vespa tem como característica ter um ou mais favos, envolvidos por
uma cobertura denominada envelope protetor, sendo essa característica que
diferencia as espécies do gênero Polubia das outras.
Figura 1: Foto da vespa Polybia paulista à direita e a esquerda o seu ninho.
16
3.2 Componente de baixo peso molecular do veneno da
vespa social Polybia paulista
A espécie Polybia paulista (Figura 1) contém em seu veneno diversos tipos de
aminas biogênicas, peptídeos e proteínas. Os componentes peptídicos desses
venenos são classificados em três grupos principais: (1) Cininas, análogas à
bradicinina, responsáveis por dores, contração da musculatura lisa e redução da
pressão sanguínea; (2) Mastoparanos, tetradecapeptídeos hidrofóbicos, que são
degranuladores de mastócitos; e (3) Peptídeos quimiotáticos, tridecapeptídeos
hidrofóbicos, com atividade quimiotática. O grupo do mastoparano, por exemplo,
pode apresentar também atividades antimicrobiana, tendo como característica
principal à estrutura anfifílica em α-hélice (SOUZA, 2002).
Os peptídeos policatiônicos Polybine I e II possuem duas funções biológicas
conhecidas:
1. Degranulação de mastócitos:
promove a liberação de mediadores pré-
formados e geração de novos metabólitos derivados de lipídeos.
Um
exemplo de mediadores pré-formados é a histamina (determinando
prurido, vasodilatação, permeabilidade vascular, contração da musculatura
lisa, secreção mucosa, quimiocinese de leucócitos, produção de
prostaglandinas, secreção ácida gástrica e imunorregulação) e um
exemplo de metabólicos derivado de lipídeos:
prostaglandina D2 (PGD2)
(propriedades de vasodilatação, inibição da agregação de plaquetas,
vasopermeabilidade, contração de músculos lisos) (www.
scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S000427492003000500010).
17
2. Atividade quimiotática
: movimento celular sendo direcionado para perto ou
para longe de uma fonte de alguma substância química no seu ambiente.
Um exemplo bem-estudado consiste no movimento quimiotático de certas
células sanguíneas brancas (neutrófilos) na direção de uma fonte de
infecção bacteriana (VOET, 2000).
Os Polybines não apresentam similaridade seqüencial com nenhum outro
peptídeo conhecido (Tabela1), dessa forma, constituem uma nova família de
peptídeos inflamatórios de veneno de vespa, possuindo in vivo na sua seqüência
primária o N-terminal acetilado. Entre os peptídeos inflamatórios é muito rara a
ocorrência natural de modificações químicas in vivo do grupo α-amino do N-terminal,
apesar da maioria destas toxinas apresentarem o C-terminal amidado. Portanto, os
polybines apresentam, dentre esses, a primeira descrição de peptídeos
policatiônicos com o N-terminal bloqueado. Dessa maneira, foram sintetizados os
peptídeos polybine I e II na forma acetilada e não acetilada, visando uma análise
diferenciada da sua forma estrutural, correlacionando às atividades biológicas.
Estes peptídeos policatiônicos, geralmente, possuem atividades associadas a
conformações em α-hélice tal como hemólises e antibioses. Já os Polybines têm
predição de pouca ou nenhuma extensão de conformação de α-hélice, fazendo com
que, aparentemente, essa seja a razão para explicar a ausência de hemólise e
atividade antimicrobiana nesses peptídeos (RIBEIRO et at., 2004).
18
Tabela 1:
Seqüências primárias de alguns mastoparanos e peptídeos quimiotáticos para
comparação com os peptídeos polybines. A cor verde indica resíduos polares, em vermelho os
carregados negativamente e em azul os carregados positivamente.
Nome Seqüência Primária Vespa
Polybines
Polybine I
Àc-SADLVKKIWDNPAL-NH
2
Polybia paulista
Polybine II
Àc-SVDMVMKGLKIWPL-NH
2
Polybia paulista
** * * * * * **
Mastoparanos
Mastoparano
INWKKMAATALKMI-NH
2
Parapolybia indica
Mastoparano X
INWKGIAAMAKKLL-NH
2
Vespa xanthoptera
Mastoparano C
INLKALLAVAKKIL-NH
2
Vespa crabro
** * * * * **
Peptídeos quimiotáticos
Ves-CP-T
FLPILGKILGGLL-NH
2
Vespa tropica
Ves-CP-M
FLPILGKLLSGLL-NH
2
Vespa mandarina
Vês-CP-A
FLPMIAKLLGGLL-NH
2
Vespa analis
*** * * *** **
19
3.3 – Interação de Peptídeos com Membrana Lipídica
É de vital importância o estudo do mecanismo de ação dos peptídeos
retirados dos venenos, porque estes, podem substituir substâncias que se ligam a
receptores específicos da superfície celular, anulando ou bloqueando o ligante
natural. Com isso abriu-se um vasto campo na pesquisa das estruturas secundárias
e terciárias, e também das funções desses compostos, tanto em meio aquoso, como
ligados a membranas-modelo ou biológicas, objetivando a produção de novas
drogas. Os peptídeos podem tanto estabilizar quanto desestabilizar membranas
(LORENZI, 2002).
Não se sabe ainda como os peptídeos policatiônicos Polybine interagem com
a membrana lipídica, mas as propostas conhecidas para obter a liberação de
histamina dos mastócitos por peptídeos que não são mastoparanos é por exocitose
por ligação de peptídeos a proteína G (RIBEIRO et al, 2004). Neste mecanismo há
uma interação direta do peptídeo policatiônico com a proteína G heterotrimérica,
através de um mecanismo independente de receptor descrito à frente (MOUSLI et al,
1990).
Figura 2: Proteína G, heterotrimérica: subunidade alfa, representada pela cor azul ligada a
GDP, em vermelho e as subunidade beta e gama, representadas pelas cores amarelo e verde.
20
Existem muitos tipos de proteínas G, cada uma é específica para um conjunto
específico de receptores e para um conjunto de proteínas-alvo que surge na
“cascata” de reações químicas posteriormente à ativação da proteína G. Todas elas,
contudo, possuem uma estrutura similar entre si. Elas são compostas por três
subunidades α,β,γ. No estado não estimulado, a subunidade α tem GDP ligado a ela
como mostra a figura 2, e a proteína G não é funcional. Quando um ligante
extracelular, por exemplo, os peptídeos degranuladores de mastócitos, ligam-se ao
receptor ou diretamente à proteína G, essa é ativada, fazendo com que a
subunidade α troque GDP por GTP. Isto faz com que a subunidade-α da proteína G
se separe da subunidade-βγ, dividindo-se em duas moléculas (uma subunidade α e
um complexo βγ), podendo a partir daí ativar reações químicas na membrana
plasmática. Provavelmente, dessa forma, é obtida a lise do mastócito e,
conseqüentemente a liberação de histamina (VOET, 2000).
A liberação de histamina pelo mastócito pode ser induzida por uma variedade
de componentes estruturalmente diversos, incluindo poliaminas sintéticas ou
naturais, peptídeos como os mastoparanos e os desgranuladores de mastócitos (p.
ex. as polybines), hormônios como bradicimina e anafulataxinas, os neuropeptídeos
como substância P, e os neuropeptídeos Y (BEHZAD et al, 1995).
A interação dos peptídeos com as proteínas G (mecanismo de estimulação
celular) são realizadas de duas formas diferentes. Para explicar essas formas de
interação, usaremos como exemplo a substância P(neuropeptídeos que ativam
receptores NK
1,
NK
2
e NK
3
presentes na membrana celular). O primeiro mecanismo
implica na passagem pela membrana plasmática, começando com uma interação na
superfície celular com resíduos de acido siálico, ou seja, esses neuropeptídeos
interagem com as cargas negativas (atração eletrostática) na superfície lipídica e
atravessam a membrana por interação hidrofóbica, onde se ligam ao C-terminal da
21
subunidade-α da proteína G (mecanismo independente de receptor), ou eles
interagem com receptores que estão inseridos na camada lipídica. Esses receptores
específicos irão se ligar ao C-terminal da subunidade α da proteína G (mecanismo
dependente de receptor), conforme ilustrado na figura 3 (MOUSLI et al, 1990).
Figura
3:
Possíveis mecanismos de ação da Polybia paulista. À esquerda o mecanismo
independente de receptor, onde o peptídeo se liga diretamente à subunidade α da proteína G e
a direita o dependente do receptor que se liga a um receptor especifico da proteína para ativá-
la.
3.4 – Espectroscopia de RMN
A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear é reconhecidamente
uma técnica muito importante para a investigação a nível molecular, permitindo obter
informações estruturais e dinâmicas para qualquer estado da matéria. Em particular
é um método para determinar estruturas tridimensionais de moléculas no estado
líquido. O interessante em resolver estruturas de peptídeos através de RMN está no
fato de serem componentes de baixo peso molecular e o método permite estudá-los
em solução aquosa, mantendo características semelhantes às de seu estado natural
22
nos organismos. Peptídeos são constituídos por átomos de carbono, oxigênio,
nitrogênio e hidrogênio, sendo este último o mais abundante dentre eles e muito
importante para a aplicação da técnica de RMN.
O fenômeno da ressonância magnética é explicado compreendido através da
mecânica quântica. No entanto, muito das idéias básicas podem ser moldadas numa
estrutura semi-clássica, sendo esta uma forma didática para esclarecê-las.
Os núcleos atômicos possuem propriedades magnéticas importantes para o
uso na espectrometria de RMN. Se esses núcleos atômicos possuírem os prótons e
os nêutrons em quantidades ímpares, apresentarão um momento angular intrínseco
chamado “spin”. Quando os prótons são sujeitos a um campo magnético externo,
devido ao seu momento angular, o momento dipolo magnético
m
µ
não se alinha com
o campo como a agulha de bússola; ele gira e precessiona como um pião ao redor
da direção do campo magnético ( Figura 4).
A freqüência de precessão, é chamada de
freqüência de Larmor:
00
B
r
r
γω
=
, onde γ é a razão
giromagnética, e
0
B é o campo magnético externo. A
freqüência ω é expressa em termos da velocidade
angular e a energia de interação é:
Figura 4: Representa o modelo
clássico de um próton exposto a
um campo externo.
Essa interação do próton com o campo externo resulta num desdobramento
dos níveis de energia (figura 5). O número de níveis quantizados depende do spin I,
dado pela série I, I-1, I-2,...,-I, ou seja, no núcleo existem 2I+1 possíveis orientações.
No caso do núcleo do átomo de hidrogênio, ele terá somente duas orientações
possíveis devido ao seu momentum angular intrínseco – spin ½ , fazendo dele um
alvo importante para RMN. Além disso, o fator giromagnético característico do
0
BE
m
⋅−=
µ
23
núcleo e a presença do vetor dipolo magnético de elevada intensidade, aumenta a
sua sensibilidade para interferir e para responder a campos magnéticos externos
(Tabela 2).
Tabela 2:
Valores da sensibilidade de alguns isótopos interessantes para a técnica de RMN.
Núcleo Sensibilidade relativa Fator giromagnético
( 10
7
rad T
-1
s
-1
)
H
1
1,0 26,7520
H
2
0,0096 4,1066
C
13
0,016 6,7283
Na
23
0,093 7,0801
P
31
0,066 10,841
F
19
0,830 25,181
Figura
5:
Desdobramento do nível energético para um átomo de hidrogênio. Contêm também
as possíveis posições dos prótons em relação à energia. s= +1/2 fica paralelo ao campo no
nível de energia menor e s= -1/2 fica antiparalelo no nível de energia maior. À direita do eixo
variável não existe campo aplicado.
Até agora se mostrou o que acontece com um único átomo de hidrogênio
exposto a um campo externo, mas quando se lida com uma quantidade muito
grande deles tem-se uma soma de momentos de dipolos que chamaremos de
magnetização (
M
r
) :
24
∑
=
j
i
V
M
µ
r
r
1
A partir de agora, veremos o comportamento dos núcleos de hidrogênio
numa visão macroscópica, quer dizer, lidaremos com todos os núcleos
representados por um vetor magnetização. Esse vetor magnetização (
M
r
), quando
submetido a um campo variável (
1
B
) aplicado perpendicularmente ao eixo Z
(representa a direção do campo externo
0
B
), tira a magnetização do seu estado de
equilíbrio. O campo
1
B
é aplicado por pulsos de radio freqüência (RF) de curta
duração, onde os prótons de baixa energia passam para níveis de maior energia.
Esses prótons excitados com o tempo, tendem a voltar ao seu estado de equilíbrio.
Este sinal é medido por uma bobina, e é chamado de sinal de decaimento de
indução livre (Free Induction Decay - FID). Normalmente dois mecanismos de
relaxação estão envolvidos: a relaxação longitudinal (spin-rede),
1
T
e a relaxação
transversa (spin-spin),
2
T
.
•
Relaxação longitudinal ou T1
Descreve a recomposição da componente longitudinal
(
)
zM
0
quando há uma
mudança na orientação da magnetização, implicando em troca de energia com o
ambiente (rede). A restauração da população de equilíbrio dos estados
α
e
β
é
governado pela distribuição de Boltzmann:
(
)
kT
EE
e
N
N
αβ
β
α
−
=
25
•
Relaxação transversal ou T2
Ocorre no plano perpendicular à direção do campo
0
B
,descrevendo o
desaparecimento da magnetização transversal (
(
)
yxM ,
), onde os dipolos
magnéticos
i
µ
interagem entre si com freqüências levemente distintas, defasando
com o tempo.
Quando ocorrem as relaxações descritas acima aparecem neste processo os
principais fenômenos físicos que podem distinguir e fornecer informações sobre a
molécula. Esses fenômenos constituem a formação dos espectros e são: o
deslocamento químico, o acoplamento spin-spin e o acoplamento dipolar.
3.4.1- Deslocamento Químico
Nos espectro de RMN os sinais aparecem em escala crescente de freqüência,
da direita para a esquerda. Do lado esquerdo estão em campo baixo e os da direita
estão em campo alto como mostrado na Figura 6.
Em uma molécula, os núcleos de hidrogênio estão em regiões de maior
densidade eletrônica que outros, devido, por exemplo a estarem em ambientes com
intensidade de campos magnéticos ligeiramente diferentes. Com isso, os prótons
possuem posições diferentes no espectro o que è conhecido como deslocamento
químico. Portanto, o deslocamento químico de cada próton vai depender do seu
ambiente magnético, onde serão influenciados por campos magnéticos gerados por
elétrons, por campos magnéticos que resultam de outros prótons vizinhos e por
outros fatores como: dipolo da hélice e corrente do anel (ring currents).
26
Figura
6:
Descreve o sinal do espectro numa escala crescente da direita para a esquerda.
Os deslocamentos químicos são medidos em relação à absorção de prótons
de compostos de referência. Um composto de referencia é o DSS, o qual é pouco
blindado e os sinais estão numa região do espectro onde poucos átomos de
hidrogênio absorvem. Assim, o seu sinal não influência nos sinais dos átomos de
hidrogênio da amostra. O deslocamento químico de um próton, quando expresso em
hertz, é proporcional à intensidade do campo magnético externo. Como
normalmente utilizam-se espectrômetros de diferentes intensidades de campo
magnético, é necessário expressar os deslocamentos químicos em uma forma que
seja independente da intensidade do campo externo. O deslocamento químico é
expresso em unidades de partes por milhão (ppm) e é medido em referência a um
composto padrão para indicar o zero da escala do espectro como descrito abaixo:
Os átomos de hidrogênio quando ligados a outros átomos dos aminoácidos
darão freqüências diferentes no espectro. Por exemplo, os hidrogênios ligados ao
carbono quiral (C
α
) terão um deslocamento químico similar às outras ligações do
mesmo tipo (Figuras 7 e 8). A ligação C
α
- H forma a base da estrutura das
biomoléculas que estarão ligados aos grupos funcionais (Figura 9).
6
10×
−
=
DSS
DSSamostra
ν
νν
δ
27
F
IGURA
7:
Espectro padrão 1D dos prótons que fazem parte do sistema de spin de cada
resíduo.
Figura 8:
Espectro padrão COSY, onde estão localizados em lugares específicos, os prótons
que fazem parte do sistema de spin de cada resíduo.
28
Foram obtidos padrões de medidas em solução aquosa para os 20
aminoácidos utilizando peptídeos modelos que foram tabelados por Bundi e
Wunthrich em 1979 (Bundi e Wuthrich, 1979). Mais recentemente esses padrões de
deslocamentos químicos, com distribuição estatística, baseados em dados
experimentais, podem ser encontrados no BMRB (Biological Magnetic Resonance
Bank). Os prótons de cada aminoácido formam um sistema de spins, ou seja, é um
grupo de spins que são conectados por acoplamento spin-spin ou acoplamento
3
J.
Visto que esse acoplamento pode ser observado entre átomos de hidrogênio que
estão separados por três ou menos ligações covalentes, cada aminoácido forma um
único sistema de spin. As exceções são a Metionina, onde o grupo funcional
3
CH
ε
não esta conectado com o fragmento
22
CHCHCH
γβα
−−
, os 3 resíduos
aromáticos, onde os anéis não estão conectados com
2
CHCH
βα
−
e os resíduos:
Arginina, Glutamina, Asparagina e a Histidina pela presença de nitrogênio na cadeia
lateral ( WÜTHRICH, 1986).
Figura
9:
Estrutura geral de um α-aminoácido. Os grupos R diferenciam os 20-aminoácidos-
padrão.
29
3.4.2 - Acoplamento escalar
O acoplamento J é responsável pelo desdobramento de sinal, causado pelo
efeito dos campos magnéticos dos prótons sobre os átomos vizinhos, levando à
divisão da linha de ressonância dos núcleos, somente quando os conjuntos de
prótons possuem deslocamentos químicos diferentes. Como já falamos
anteriormente, os prótons do núcleo de hidrogênio só podem estar orientados em
duas maneiras diferentes num campo magnético externo: a favor do campo ou
contra ele. Então, o momento magnético de um próton, num átomo adjacente, só
pode afetar de duas maneiras o campo magnético de um próton onde o sinal é
observado. A ocorrência desses dois efeitos levemente diferentes causa o
surgimento de um pico num campo um pouco mais alto (em relação ao campo do
sinal) e outro pico num campo um pouco mais baixo. A separação desses picos é
chamado de constante de acoplamento
(
)
ab
J
. Como o acoplamento é causado
inteiramente por forças internas, as magnitudes das constantes de acoplamento não
são dependentes da magnitude do campo aplicado (SOLOMONS, 1996). Na Figura
10 podemos observar a divisão da linha de ressonância entre prótons vizinhos.
A divisão das linhas de ressonância, causada pelo acoplamento J, é aditivo,
de maneira que se um núcleo está acoplado a dois outros núcleos cada linha de
ressonância resultante da divisão provocado pelo acoplamento com o primeiro
núcleo será então dividida pelo segundo acoplamento.
30
Figura 10:
Desdobramento de sinal devido ao acoplamento escalar com um próton não-
equivalente de um átomo de hidrogênio. Análise teórica em (a) e aparência real do espectro
em (b).
3.4.3 – NOE
(Zerbe, 2005; Ven, 1995)
Em um sistema de dois spins (I e S) temos os seguintes estados quânticos
ββ
βα
αβ
αα
,,, e transições entre eles acontecem. Transições que possuem
mudanças de estado de somente um spin são chamados de single-quantum
coherences (
1
W
) e levam à observação dos sinais durante o período de detecção.
Há mais dois tipos de transições diferentes double-quantum coherences (
2
W
) e
zero-quantum coherences (
0
W
) que não são diretamente observáveis mas
possuem uma importante função para a descrição teórica do NOE. Essas transições
determinam a relaxação-cruzada,
IS
σ
.
2
W
ocorrendo após S estar saturado, provoca
uma alteração positiva na intensidade I. Se
0
W
ocorre, provoca uma alteração
negativa em I. O sinal do NOE é positivo para moléculas pequenas e negativo para
moléculas grandes.
0
W
é uma transição cuja freqüência é a diferença entre o
31
deslocamento químico dos núcleos (da ordem de kHz) enquanto que a freqüência
de
2
W
corresponde à soma dos deslocamentos químicos (da ordem GHz). Estas
transições são provocadas por movimentos moleculares de mesma freqüência; para
moléculas pequenas em solução a freqüência é da ordem de 10
11
Hz e para
moléculas grandes a freqüência é da ordem de 10
7
Hz.
Figura
11:
Transições entre os estados
α
e
β
. Na parte superior a transição W
1
e na parte
inferior as transições W
0
e W
2
.
O efeito NOE (Nuclear Ovehauser Enhacement) é um dos fenômenos
utilizados, no qual se obtêm informações para o cálculo estrutural de uma proteína
usando RMN, juntamente com informações de acoplamento escalar. O NOE é
provocado pela interação dipolo-dipolo entre spins através do espaço quando existe
uma distância mínima para surgir interação magnética entre os dipolos, enquanto
32
que o acoplamento escalar interage através de ligações químicas. O fator de medida
do NOE
η
é definido como:
no qual
I
e
0
I
são intensidades observadas da ressonância com e sem irradiação
do spin S, respectivamente, e
IS
σ
é a relaxação-cruzada, definida como :
onde caracteriza-se o grau de transições dipolo-dipolo que dá a origem do NOE e
depende das distâncias inter-moleculares e o
IS
ρ
a relaxação-longitudinal é a
constante de relaxação dipolar direta do spin I para o spin S. A eficiência através do
qual o NOE é transmitido do spin I para o spin S depende da distância dos 2 prótons
envolvidos e das propriedades relacionadas ao movimento das moléculas em
solução.
{ }
(
)
{ }
IS
IS
I
S
I
I
Sf
I
II
Sf
ρ
σ
γ
γ
η
=
−
==
0
0
02
WW
IS
−=
σ
(
)
6−
= rtf
c
η
33
3.5 – Experimentos de RMN em líquidos
No moderno espectrômetro de RMN a magnetização transversal é gerada por
uma série de um ou mais pulsos de RF. A evolução no tempo da magnetização gera
uma corrente variando com o tempo na sonda (probe) (Figura 12). A corrente é
amplificada e digitalizada para um receptor e gravado pelo espectrômetro de RMN.
O FID é o termo referente ao sinal adquirido durante o período de aquisição de
dados. As propriedades da magnetização que gera o sinal captado durante a fase
de aquisição, obviamente é dependente da maneira como ela foi excitada. Existe
uma grande quantidade de diferentes seqüências de pulsos utilizadas com
diferentes objetivos. Os pulsos adquiridos nas seqüências dos experimentos de
RMN são definidos pelo tempo de duração do campo variável (B
1
) e a potência
(atenuação - d
β
) desse campo. Os pulsos básicos mais conhecidos são
demonstrados nos tópicos logo abaixo.
Figura 12: Desenho esquemático, contendo os componentes que fazem parte do
equipamento de RMN.
34
3.5.1 - Pulso de 90°
°°
°
O pulso de 90
°
consiste na aplicação de um pulso onde o vetor magnetização
se desloca do seu ponto de equilíbrio, levando a magnetização ao plano transversal
como exposto na Figura 13.
Figura 13: Movimento da magnetização M durante a aplicação de um pulso de 90
°
.
3.5.2 - Pulso de 180°
°°
°
A proposta do pulso de 180
°
é a inversão da magnetização:
z
B
r
1
B
o
180
y
x
-z
M
r
Figura 14: Movimento da inversão magnética. Pulso de 180
°
.
B
1
M
z
M
x
35
Um pulso de 180
°
é geralmente aplicado após os spins terem-se movido com
freqüências distintas entre eles, causando uma defasagem no sistema. Portanto, a
inversão é feita para a reconstrução da magnetização original, refocando a evolução
do deslocamento químico da magnetização transversal. Esse processo é conhecido
como spin echo. Ele cancela os efeitos de precessão de Larmor e/ou acoplamento
J.
3.5.3 - Aquisição de um espectro
(Zerbe, 2005)
Depois de efetuarmos alguns passos como: verificar a temperatura correta,
posicionar a amostra no equipamento (spinner) e inseri-la no magneto. Ativamos o
campo. É importante estabilizar o campo magnético. Esse processo é chamado de
locking e consiste em monitorar a freqüência da linha do deutério para adquirimos
parâmetros observáveis do campo magnético externo do equipamento.
Considerando que as freqüências de precessão são proporcionais à intensidade do
campo magnético, o mesmo necessita ser homogêneo em toda a extensão da
amostra para obter a capacidade de observar pequenas diferenças de freqüência
(pequenos acoplamentos). Por isso é necessário fazer o shimming, que consiste
em ajustar à homogeneidade do campo magnético. Para a detecção dos sinais
temos no equipamento de RMN uma sonda (probe), onde encontramos um circuito
ressonante composto basicamente por dois componentes: um capacitor (c) e uma
bobina (ou indutância, L). Para melhorar a sensibilidade e o comprimento dos pulsos
a leitora da sonda (probehead) precisa passar por uma afinação de transmissão da
freqüência e a impedância deve ser equilibrada. Esse processo e conhecido como
TUNE e MACH. Em seguida, e realizado a calibração dos comprimentos e potência
dos pulsos e depois se coloca os parâmetros para definir qual é o tipo de espectro
36
desejado, e em seguida se adquire o FID. Depois dos dados adquiridos do FID é
feito o processamento desses dados.
3.5.4 – Pré-saturação da Água
(Cavanagh, 1996)
A espectroscopia de RMN em líquidos sofre com a radiação do solvente. A
técnica mais comum usada para a supressão de solvente é a pré-saturação do sinal
do solvente durante o decaimento (recycle delay) usando um campo fraco de rf. A
implementação da técnica de pré-saturação é muito simples e eficaz. As principais
desvantagens são que os sinais do solvente (principalmente os H
α
na proteína)
podem ser saturados pelo campo de rf e a transferência de saturação pode,
particularmente, saturar bastante os prótons. A qualidade da supressão da água
obtida pela pré-saturação depende essencialmente da homogeneidade do campo
magnético e, portanto da qualidade do Shimming.
Os tempos de irradiação na ordem de 1-2 s usando campos de rf com
amplitudes de aproximadamente 50 Hz usualmente promovem adequadamente a
supressão da água. Para cada nova amostra, o shimming, a freqüência de irradiação
e o poder de irradiação devem ser ajustados para otimizar a supressão de água.
Atualmente, outras técnicas estão implementadas nos espectrômetros e são
também largamente utilizadas como: watergate e wet.
3.5.5 – Processamento dos dados
A abordagem mais comum do processamento dos dados é converter os
sinais digitalizados que estão no domínio do tempo em um espectro no domínio da
freqüência, aplicando a Transformada de Fourier (apêndice B). Existem outras
técnicas de processamento que podem ser aplicados antes ou depois da
37
transformada de Fourier para maximizar as informações disponíveis no espectro
(Cavanagh, 1996). Algumas dessas importantes técnicas estão descritas abaixo.
3.5.5.1 - Correção de Fase
A
transformada de Fourier pode ser decomposta em uma parte real e uma
imaginaria do sinal. Na prática a parte real e imaginaria do sinal são armazenadas
numa localização separada na memória, onde a parte real mostra os sinais
absorventes e a parte imaginária os dispersivos. A correção de fase otimiza todos
os sinais absorventes deixando os sinais dispersivos invisível, ou seja, o sinal terá
somente a parte real (Zerbe, 2005).
Figura
15:
Sinal em modo absorvente e dispersivo.
3.5.5.2 - Filtragem do Solvente
A presença de artefatos perto da linha de ressonância do solvente no
espectro pode encobrir informações importantes. Portanto, para limparmos essa
região utilizamos funções pré-definidas como: SOL e POLYtime (Anexo – scripts do
NMRView). A primeira e uma função de convolução no domínio do tempo e a outra é
aplicada uma função polinomial.
3.5.5.3 - Correção de linha
Os problemas com linhas de base distorcidas podem causar erro na
integração dos picos e perda de informações no procedimento de identificação dos
38
picos. Em geral, distorções de linha de base são causadas por desajuste dos
primeiros pontos dos FID, esse problema acontece quando a intensidade do sinal é
larga e pode ser corrigido suprimindo os primeiros pontos do sinal RMN. Há outros
problemas de linhas de base que podem ser reparados como: direção e curvatura
pela aplicação de subtração dos dados através de funções polinomiais.
3.5.6- 1D RMN
O experimento em 1D é o mais simples, utiliza a espectroscopia de RMN
pulsada por transformada de Fourier, consistindo apenas de duas partes:
preparação e detecção.
Figura 16: Seqüência de pulso do espectro 1D.
Basicamente, no período de preparação, os núcleos são excitados com
somente um único pulso de
°
x
90 gerando logo em seguida um FID (Figura 16). O
período de detecção grava o sinal, no domínio do tempo. O sinal, adquirido no
domínio do tempo em uma ou mais acumulações (repetições) aumentando a
relação sinal/ruído, é transformado (via transformada de Fourier) para o domínio
das freqüências, resultando no espectro (Figura 7). Atualmente existem vários
experimentos de RMN 1-D desenvolvidos para o estudo das propriedades químicas
e físicas da matéria. Em relação aos peptídeos e as proteínas, os espectros 1-D de
prótons se tornam extremamente complexos e difíceis de serem analisados, em
39
função da grande quantidade de spins presente nas amostras. Espectros 1D nos
permitem simplesmente analisar a amostra de uma maneira geral.
3.5.7 - 2D RMN
A introdução dessa ferramenta é essencial para elucidar a estrutura de uma
molécula (peptídeos e proteínas), utiliza-se a dispersão de sinais em duas
dimensões ortogonais e a identificação de correlações. A transformação dos dados
no domínio do tempo para o da freqüência é obtida pela transformada de Fourier
bidimensional (ZERBE, 2005).
O experimento de RMN em 2-dimensões é caracterizado pela introdução de
um segundo eixo de freqüência, no qual permite a correlação entre as freqüências
dos spins.
Figura 17: Aparência do espectro homonuclear COSY. (C) picos-cruzado indicam a
correlação entre freqüências dos spins e (D) picos diagonais mostram essencialmente o
espectro 1D.
A seqüência de pulsos presente nos espectro 2D contém quatro períodos
diferentes como demonstrado na Figura 18.
Figura 18:
Esquema de intervalos de tempos para uma experiência de RMN em 2D.
40
Preparação
: serve para criar a magnetização transversal. No caso de um espectro
COSY, TOCSY e NOESY é aplicado um pulso de 90
°
para a excitação.
Evolução: é utilizado para monitorar a coerência
1
de interesse. No COSY, as
coerências evoluem sob ação da precessão de Larmor e do acoplamento escalar. Já
no NOESY, ao invés do acoplamento escalar, o monitoramento é feito através dos
deslocamentos químico
I
Ω
e
S
Ω
. Este período de evolução é utilizado para a
segunda codificação temporal necessária para a obtenção de um espectro 2D.
Mistura: neste período ocorre a transferência de magnetização do spin A para o spin
B. As possíveis transferências podem contar com: Acoplamento Escalar (COSY e
TOSCY) e Acoplamento Dipolar (NOESY e ROESY).
Detecção: neste período é incluída, simplesmente, a aquisição do FID.
Figura 19: Representa os diferentes tipos de espectro 2D utilizados na análise de estrutura de
proteínas.
1
Coerência: são as transições que ocorrem entre os spins nas experiências de RMN.
41
3.6 - Procedimento para a determinação das estruturas dos
peptídeos em solução.
Os procedimentos básicos para a determinação das estruturas de RMN de
pequenas proteínas de 100 ou menos resíduos são baseados no método
determinado por Wuthrich et at (Wuthrich, 1986), esses procedimentos estão sendo
apresentados da seguinte ordem:
3.6.1- Identificação dos sistemas de spins
As ressonâncias de cada resíduo podem ser identificadas através de
experimentos correlacionando as ressonâncias de prótons via acoplamento spin-
spin, ou seja, que possuam o mesmo sistema de spin. Os experimentos 2D em RMN
que fazem essas identificações são os espectros COSY e TOCSY. O espectro
COSY é usado para correlacionar regiões (fingerprint) e medir acoplamento escalar.
Essas regiões de interesse são H
N
– H
α
(fingerprint do esqueleto) e é ponto de
partida para a identificação dos sistemas de spins dos resíduos no espectro TOCSY;
a região H
β
– H
α
; regiões onde possuem picos para identificar ressonâncias dos
anéis aromáticos das cadeias da fenilalanina, tirosina, triptofano e histidina e picos
que identifiquem grupos metil (isoleucina, valina, leucina). Esses espectros são
usados para identificar sistemas de spins individuais (aminoácidos), onde os
deslocamentos químicos correspondentes a cada sistema de spins é baseado nos
padrões de espectros COSY, TOCSY e NOESY presentes no apêndice A.
42
3.6.2 - Assinalamento dos NOEs
Os picos inter-residuais são observados através do espectro NOESY, onde os
picos cruzados NOE aparecem através de distâncias entre átomos de hidrogênio A e
B localizados no resíduo na posição i e j, respectivamente e denotado por
(
)
jid
AB
,
.
Essas distâncias são definidas na direção do N-terminal para o C-terminal da cadeia
polipeptídica. Esta notação pode ser aplicada para as seguintes distâncias:
(
)
(
)
( ) ( ) ( )
( ) ( ){ }
( )
( )
( )
( ) ( ){ }
Ji
ji
JiN
NNJINN
JiN
HHdjid
ijdHHdjid
NHHdjid
ijdNHNHdjid
NHHdjid
βα
αα
β
α
αβ
αααα
β
α
,min,
,,,
,min,
,,,
,,
=
==
=
==
=
3.6.3 - Assinalamento seqüencial
Com os picos cruzados intraresiduais (espectro COSY e TOCSY) e inter-
residuais (espectro NOESY), temos então, a identificação dos resíduos presentes da
cadeia polipeptídica. A identificação dos resíduos em relação a sua estrutura
primaria é chamada de assinalamento seqüencial. Com o assinalamento
seqüencial, podemos ordenar os sistemas de spin na seqüência correta da cadeia
polipeptídica. Isso é feito com o uso das conexões seqüenciais d
αN
(i,i+1), sempre
presentes no espectro NOESY e ROESY de RMN, por representarem distâncias
sempre menores que 5 Å, independentemente da estrutura da cadeia
polipeptídica.
43
3.6.4 - Cálculo estrutural
(Cavanagh, 1996; Cüntert, 1998; Fadel,
2003)
A análise da estrutura por espectroscopia de RMN é feita por parâmetros
como: o deslocamento químico, acoplamento escalar e relaxação dipolar. O
acoplamento escalar e interações dipolares formam a base de dados para o cálculo
estrutural das proteínas. Dentre esses, o mais importante para a determinação da
estrutura é o NOE. A constante de interação é proporcional ao inverso da sexta
potência da distância entre a interação de dois prótons. Numa aproximação inicial de
intensidades de picos-cruzados NOE, o conhecimento de algumas distâncias bem
definidas na estrutura como, por exemplo, prótons vicinais em anéis aromáticos ou
geminais em grupos metileno, é utilizado para a calibração do espectro. A obtenção
das distâncias internucleares do espectro NOESY e feita pela relação:
onde S
ref
e S
i
são as intensidades de picos-cruzado integrados. Na prática, somente
os picos de um espectro NOESY com reduzido tempo de mistura
m
τ
respeitam esta
proporcionalidade. Mas, como são de pequena intensidade e com relação sinal/ruído
inadequadas, adquirem-se espectros utilizando um tempo de mistura maior. Sobre
essas condições as intensidades dos Picos-cruzado NOESY não são diretamente
proporcionais as constantes de relaxação-cruzada entre a interação de spins porque
a magnetização é transferida entre spins em múltiplos passos via “spins diffusion”
2
.
Portanto, para incluir o efeito “spin diffusion” no calculo estrutural e atribuído limites
de erro inferior e superior as distâncias. Esse método é baseado na proposta de
2
Spin diffusion - é uma transferência indireta de um spin para outro via outros spins na vizinhança.
44
Kalbitzer & Hengstenberg (Kalbitzer & Hengstenberg, 1993). A Minimização e o
Refinamento da Estrutura são passos finais para a obtenção da estrutura da
proteína; são análises mais detalhadas depois da realização do calculo estrutural.
Esses passos podem ser concluídos por recursos interativos (incluindo fixação
estéreo, presença de pontes de sulfeto, interações eletrostáticas e deslocamento
químico).
45
4. Materiais e Métodos
4.1 – Síntese e Preparação das amostras de Polybine I e II
A descrição da síntese de peptídeos neste trabalho foi retirada do artigo,
Ribeiro et at, 2004.
Os peptídeos foram preparados por um protocolo de síntese de fase sólida,
usando os produtos químicos: N-9 Fluorofenilmetoxi-carbonil (FMOC) e resina
Novasyn TGS (Nova Biochem). Para o preparo do peptídeo apresentando o N-
terminal acetilado, foi adicionado anidrido acético à resina contendo o peptídeo,
mantendo-se sob agitação por uma hora para promover a acetilação.
Para promover a clivagem do complexo resina-peptídeo, essa foi tratada com
ácido trifluoroacético, 1,2-etanoditiol, anisol, fenol e água (82,5: 2,5: 5: 5: 5 por
volume) do complexo em temperatura ambiente por 2 horas. Em seguida, foi
realizada uma filtragem para remover a resina. Adicionou-se éter etil a 4°C ao
material solúvel, causando a precipitação do peptídeo, coletado após centrifugação
1000 X g por 15 min. O peptídeo precipitado foi solubilizado em água e
cromatografado em RP-HPLC, usando uma coluna (shiseido C18, 250mm X 10mm,
5um) sob eluição com 40% (v/v) de acetonitrila em água contendo 0,1% (v/v) de
ácido trifluoroacético a uma vazão de 2ml/min.
Os homogeneizados e seqüências dos peptídeos sintéticos (ambos acetilado
e não-acetilado) foram monitorados por HPLC analítico e análise de ESI-MS.
46
4.2 – Pré-Analise da amostra através do Dicroísmo Circular
Os espectros de dicroísmo circular dos Polybines foram obtidos utilizando um
espectropolarímetro Jasco-710 (JASCO Internacional Co. Ltd, Tokyo, Japan). Foram
coletados na região do UV distante, no intervalo de comprimento de onda de 190 à
250 nm, à 25° C. A velocidade de varredura foi 20 nm/min, utilizando uma largura de
banda de 1,0 nm, sensibilidade de 20 miligraus, tempo de resposta de 1 s e 0,1 nm
de resolução. Os espectros finais foram obtidos a partir da média de 16
acumulações e se usou cubeta de quartzo de caminho óptico de 0,5 cm.
Os espectros foram coletados em várias concentrações de 2, 2, 2-
Trifluoretanol (TFE) adquirido da Merck e de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) da
Phamarcia. Alternativamente, foi utilizada Lisofosfatidilcolina (LPC). Os peptídeos
Polybine foram dissolvidos em água e em tampão fosfato de Potássio (10mM) em
pH 6 a 9.
Fazendo a correção da linha de base, a elipticidade observada, θ (miligraus),
foi convertida em elipticidade molar média, [Θ] (graus cm
2
/mol), usando a relação:
[ ]
lcn
θ
×
=Θ
100
Onde
l
é o caminho óptico da cubeta em centímetros,
c
é a concentração do
peptídeo em milimolar e n é o número de resíduos do peptídeo.
Assumindo um modelo de dois estados, proposto por Rohl & Baldwin(Rohl &
Baldwin, 1998), a elipticidade residual observada em 222 nm (
obs
222
Θ
em graus
cm
2
/dmol resíduo) foi convertida em porcentagem de
α
-hélice
(
)
H
f
usando a
equação :
47
onde
[
]
C
222
Θ é a elipticidade em 100% de random coil já com correção de
temperatura (T em °C):
[
]
=Θ
C
222
( 640 – 45T)
e
[
]
H
222
Θ é a elipticidade residual para uma estrutura helicoidal dada por:
[
]
=Θ
H
222
( )
−+−
n
x
T
112542500
onde x é o numero de carbonila não ligada, sendo que para peptídeos com o C-
terminal amidado usamos x= 3 e x=4 para aqueles carboxilados, correspondentes
ao n° de carbonilas do peptídeos não ligados numa h élice completa.
[ ]
[
]
[
]
(
)
[ ] [ ]
( )
CH
cobx
f
222222
222222
Θ−Θ
Θ−Θ
=Θ
48
4.3 – Preparação da amostra para RMN
A amostra foi preparada em Tampão Fosfato de Potássio a 10mM, pH 6 com
40% (v/v) de 2,2-trifluoretanol (TFE), para um volume final de 600 µl com uma
concentração de 1mM. Foi adicionada, também, uma quantidade de 2,2 Dimethl-2 –
Silapentane-5-Sufanate (DSS) para a calibração dos deslocamentos químicos.
Visando à conservação dessa amostra, foi adicionada ainda uma pequena
quantidade de Azida de Sódio (antifungicida) e 5% de
OD
2
( água deuterada ) para
usar como referência no processo de Locking.
4.4 – Coleta dos espectros por RMN
As coletas dos espectros foram realizadas nas instalações do Laboratório
Nacional de Luz Sincroton – LNLS, onde utilizamos o espectrômetro Varian INOVA-
600AS, mostrado na figura 20, operando à freqüência de próton de 600 MHZ.
Figura 20:
Fotografia do supercondutor Oxford 600 da Variam.
49
Os dados do deslocamento químico foram expressos em partes por milhão
(ppm) com relação ao pico do solvente de DSS, utilizado como padrão de referência
e os espectros foram coletados a 25
°C. O espectro 2D [
1
H-
1
H]-COSY foi adquirido
com 1024 pontos para t
2
e 256 pontos para t
1
e outros espectros foram adquiridos
com 1024 pontos para t
2
e 512 pontos para t1, com 8 acumulações por FID e uma
janela espectral de 12 ppm. A princípio foram coletados espectros 1D para
confirmação da integridade da amostra e posteriormente partimos para a coleta dos
espectros em 2 dimensões. Para a identificação através de acoplamento J dos
sistemas de spins de cada resíduos foram coletados espectros 2D [
1
H-
1
H]-COSY
(AUE et al, 1976), 2D [
1
H-
1
H]-COSY-DQF (RANCE et al, 1983), 2D[
1
H-
1
H]-TOCSY e
2D[
1
H-
1
H]-TOCSY (GRIESINGER, 1996) com supressão de solvente por pré-
saturação e wet (water suppression enhanced through T1 effects), com uma tempo
de mistura
ms
m
300
=
τ
. Para a análise do assinalamento seqüencial e a obtenção
dos vínculos para o cálculo estrutural dos peptídeos foram coletados espectros
2D[
1
H-
1
H]-NOESY ( WIDER, 1984) com tempo de mistura
ms
m
300
=
τ
e 2D [
1
H-
1
H]-
ROESY ( BAX et al, 1985) com diferentes tempos de mistura
ms
m
150
=
τ
e
ms
m
100
=
τ
.
4.5 – Processamento dos dados e Identificação dos
deslocamentos químicos
O processo de identificação dos deslocamentos químicos nos espectros 2D foi
realizado depois do ajuste da fase e da linha de base, utilizando o programa
NMRVIEW (JOHNSON et al, 1994). Com os espectros 2D ajustados, determinamos
o assinalamento das linhas de ressonância de acordo com os princípios da
50
espectroscopia homonuclear proposta por Wuthrich (Wuthrich, 1986). Identificamos o
sistema de spins para cada resíduo com os espectros 2D [
1
H-
1
H]-COSY, e 2D[
1
H-
1
H]-TOCSY, utilizando os programas NMRVIEW, CARA e o XEASY (BARTELS,
1995). Para a identificação seqüencial dos aminoácidos foram analisados os
espectros 2D [
1
H-
1
H]-NOESY e 2D [
1
H-
1
H]-ROESY. Os volumes dos picos cruzados
NOE foram integrados utilizando o programa CARA.
4.6 – Cálculo Estrutural
As distâncias calculadas através dos volumes NOE foram utilizadas para o
cálculo estrutural usando o protocolo padrão (simmulated annealing) do programa
CNS (BRUGER et al, 1998). O programa, a princípio, gerou um total de 100
estruturas, depois realizou uma minimização de energia, tirando as 10 estruturas de
menor energia para a representação da estrutura calculada em formato PDB. Foi
utilizado o programa MOMOL (KORADI et al. 1996) para analise estrutural e
obtenção dos modelos.
51
5-Resultados e Discussão
Antes de empregar a técnica de RMN, foram obtidos espectros de CD para
ambos os peptídeos estudados. O CD é muito utilizado para o estudo de estruturas
secundárias de proteínas e peptídeos, permitindo assim avaliar se a amostra possui
estruturas de hélice-α, folha-β ou estrutura desordenada, seja ela, em solução
aquosa ou contendo outro solvente específico. O CD foi utilizado neste trabalho com
o intuito de verificar as condições da amostra, dependência da estrutura com a
variação de pH e a escolha do indutor de estrutura. O primeiro conjunto de espectros
medidos no CD foi feito em H
2
O e TFE (40%), visando observar se a amostra estava
em boas condições, ou seja, estruturada e comparar as duas formas de cada
peptídeo. Observamos no espectro mostrado na Figura 22 que a amostra tem boa
aparência devido ao surgimento de sinais positivos e/ou negativos que resulta numa
estrutura ordenada (http:// www.ap-lab.com/circular_dichroism.htm). De acordo com
Susan et al (2000) o bloqueio dos dois terminais (forma acetilada), poderia dar mais
estabilidade a estrutura e um poder de ação maior. A comparação das duas formas
utilizando espectros de Dicroísmo Circular não revelou nenhuma diferença entre as
formas acetilada e não acetilada. Portanto, essa estruturação contida no espectro
(Figura 22) não comprova se realmente o bloqueio dos dois terminais ratifica as
informações citadas anteriormente.
Em RMN a melhor condição para se obter bons sinais no espectro é ter pH
abaixo da neutralidade, ou seja, um pH ácido. O ponto isoelétrico (PI), do peptídeo
Polybine I foi determinado através de dados teóricos, obtendo um gráfico do número
de carga pelo pH como demonstrado na Figura 21.
52
Figura 21:
Gráfico com a medida do Ponto isoelétrico (PI) do peptídeo Polybine I.
Isso nos auxiliou na escolha dos pHs que deferíamos utilizar nos espectros de
CD, para conseguir um pH adequado para ser usado nas amostras de RMM.
Observando a faixa que vai do pH 5 ou 8 (Figura 21), a Polybine I possui
praticamente carga líquida neutra. Isso já era esperado devido a presença de
resíduos Asp (negativo) e Lys (positivo). Foram feitos espectros de CD no tampão
fosfato de potássio nos pHs 6 e 8. A escolha foi feita através do gráfico mostrado na
Figura 21, devido a faixa de estabilidade de carga.
No que se refere a mistura do tampão com o TFE não constatamos nenhuma
variação no pH, o que não afetou a amostra durante as medidas de CD. Antes de
realizar a variação do TFE obtivemos um espectro com SDS, TFE e LPC,
substâncias que induzem a mudança conformacional da estrutura. Esses espectros
foram utilizados para sabermos, dentre essas substâncias, qual seria a melhor
opção para as medidas de RMN. O espectro (Figura 23) revelou que o TFE e o SDS
mostraram mesmo comportamento conformacional na estrutura secundaria.
Portanto, ambos poderiam ser utilizados nas medidas de RMN.
53
Figura 22:
Espectros de CD da Polybine I nas formas acetilada e não-acetilada a 25° C.
Figura 23:
Espectros de CD da Polybine I com variação de pHs em SDS, TFE e LPC em
Tampão Fosfato de Potássio (TFP) a 25°C.
54
A Polybine I não-acetilada apresentou uma única banda negativa em 198nm e
uma banda positiva a 189 nm, em H
2
O, mostrando estrutura desordenada. Quando
dissolvido em solução aquosa de TFE, ou na presença de bicamadas fosfolipídicas,
a banda negativa se deslocou para 205 nm e indícios de formação de uma outra
banda negativa, aproximadamente, a 222 nm indicando mudança conformacional de
estrutura secundária. Em relação aos padrões de α-hélice (bandas negativas em
208 e 220nm) e folha-β (banda negativa em 214 nm) a Polybine I se caracterizou
com hélice.
Realizamos a variação de TFE para mostrar qual seria a porcentagem que
estabilizaria a mudança conformacional da estrutura. Estas medidas revelaram que
deveria ser utilizada uma porcentagem de 40% de TFE nas amostras que foram
usadas no espectrômetro de RMN, pois estas apresentaram estabilidade acima de
40% (Figura 24). A Polybine I obteve uma fração α-hélice de aproximadamente 30%
(Tabela 3).
Tabela 3.
Dados de Dicroísmo Circular com a elipticidade molar e fração
α
-hélice.
Polybine I-não acetilada
(50µM)
[Θ]
222
f
H
TFP (pH 6) -3411,253 0,0960924
TFE (30%) -7534,970 0,231507
TFE (40 %) -9151,940 0,284605
TFE (60%) -10041,300 0,313810
TFE (80%) -9950,480 0,310828
55
Figura 24:
Espectros de CD dos peptídeos Polybine I na forma não-acetilada em várias
concentrações de TFE, Tampão Fosfato de Potássio (10mM), pH 6,0 e temperatura de 25°C.
Para a confirmação das informações obtidas anteriormente em CD, foram
coletados espectros 1D-
1
H para ambas as formas, acetilada e não-acetilada antes
da coleta dos espectros 2D. Os aspectos gerais dos espectros 1D revelaram uma
boa estabilidade na estrutura dos peptídeos devido a quantidade e aparência das
linhas de ressonância se compararmos com a Figura 8. O espectro 1D da Polybine I
acetilada revelou duplicidade na linha de ressonância no próton HE1(10,1 ppm) do
anel do triptofano (Figura 25). Uma analise posterior da amostra acetilada através de
espectroscopia de massa, mostrou perda de parte da acetilação da amostra usada
na coleta dos espectros de RMN. Conseguimos analisar os dados do espectro da
amostra acetilada contendo ambas as formas quando determinamos a porcentagem
de perda da amostra acetilada, fazendo uma proporção entre os volumes, no qual
revelou aproximadamente 65% de perda de peptídeos acetilados na amostra.
Os primeiros dados analisados foram dos espectros da amostra não-acetilada
e posteriormente os espectros com ambas as formas. Inicialmente analisamos os 2D
56
[
1
H-
1
H]-COSY, no qual identificamos na região do HN-Hα 12 resíduos dentre os 14
da seqüência primária da Polybine I não-acetilada. Os resíduos Ser1 e a Pro12 não
apresentaram picos nessa região (Figura 26-a), devido a interação da água com o
N-terminal da Ser1 e a ausência do NH da Pro12. Mas foi identificado,
posteriormente, o próton H
α
do resíduo da Pro12 em outra região quando se fez a
identificação dos sistemas de spins no espectro 2D [
1
H-
1
H]-TOSCY.
57
Figura 25:
Espectro 1D-
1
H da Polybine I em ambas as formas. Acetilada acima e não-
acetilada abaixo em Tampão Fosfato de Potássio, pH 6,0, 1mM a 25° C.
58
Já no espectro 2D [
1
H-
1
H]-COSY contendo as formas acetilada e não
acetilada foram identificados na região do HN-Hα 16 resíduos (Figura 26-b),
aparecendo o resíduo da Ser1 devido ao bloqueio do N-terminal da forma acetilada.
No espectro 2D [
1
H-
1
H]-TOSCY da figura 27-b é possível verificar a presença das
duas formas. Tanto a forma acetilada como a não acetilada apresentaram
deslocamentos químicos idênticos nos resíduos Leu4, Asn11 e Ala13 (Figura 27-b)
esse resultado pode ser comprovado por picos Noe pela ligação de resíduos com o
mesmo sistema de spin, mas que possuem deslocamentos químicos distintos em
ambas as formas, por exemplo, a Leu4 se liga a Ala2 da forma acetilada e ao
mesmo tempo, também, se liga ao resíduo Asp3 da forma não acetilada na região
do HN-Hα. O assinalamento dos picos NOE foi realizado no espectro 2D [
1
H-
1
H]-
NOESY (Figura 28). Foram assinalados no espectro sem acetilação 392 picos e
deles 149 vínculos de distância máxima (upl – upper limit constraits). E no espectro
da amostra acetilada foram assinalados 594 picos, sendo que 110 vínculos para a
forma acetilada e 154 para a forma não –acetilada. Essas distâncias extraídas foram
usadas no cálculo estrutural.
A perda da acetilação na amostra dificultou o assinalamento da polybine I
acetilada, devido a pouca quantidade de picos NOE. Os gráficos da figura 28
mostram que a polybine I não acetilada possui uma quantidade maior de picos,
principalmente, seqüenciais se comparado com a forma acetilada. A quantidade de
distâncias de longo alcance praticamente não existe, principalmente, pelo tamanho
do peptídeo (Figura 29-a).
59
Figura 26:
Região HN-H
α
do espectro 2D [
1
H-
1
H]-COSY da Polybine I a 1mM, pH 6,0 a
25
°
C em TFP a 10 mM.
Em amarelo os picos com a forma não acetilada, em lilás a forma
acetilada e em verde para ambas as formas. (a) amostra sem acetilação e (b) amostra
acetilada.
Figura 27:
Região HN-H
α
do espectro 2D [
1
H-
1
H]-TOCSY da Polybine I a 1mM, pH 6,0 a
25
°
C em TFP a 10 mM. Em amarelo os picos com a forma não acetilada, em lilás a forma
acetilada e em verde para ambas as formas. (a) amostra sem acetilação e (b) amostra acetilada.
60
Figura 28:
Região HN-H
α
do espectro 2D [
1
H-
1
H]-NOESY da Polybine I não - acetilada a
1mM, pH 6,0 a 25
°
C. A seqüência de setas demonstra as conecções inter-residuais através do
espaço entre o próton ligado ao carbono alfa de um resíduo e o próton ligado ao nitrogênio do
resíduo subseqüente ( d
αN
( i, i+1)).
61
Figura 29:
Representação de distâncias NOE: a esquerda contém informações da Polybine I
não-acetilada e a direita da Polybine I acetilada. (a) representa a distribuição de restrições em
função das distâncias NOE, (b) representa a distribuição de restrições em função de cada
resíduo; em branco restrições intra-residual, em cinza claro restrições seqüenciais, em cinza
escuro distâncias residuais (medium-range) e (c) representa os limites de distância superior
com distâncias de curto e médio alcance.
(a)
(b)
(c)
62
O deslocamento químico de cada resíduo poderá ser verificado na tabela 4.
Esses deslocamentos químicos nos deram informações de estrutura secundária
através do método CSI (Chemical Shift Index). De acordo com o protocolo
desenvolvido por Wishart et al (WISHART et al, 1992) os deslocamentos químicos
do ·dos prótons-
α obtidos dos dados dos espectros da Polybine I menos os
deslocamentos químicos padrão (∆δ) deram informações de estrutura secundária
através de valores fixos: -1, 0,1. Se a variação for seguida por quatro -1
consecutivos sem interrupção de 1, indicará a presença de hélice. Se o grupo for de
3 ou mais 1 consecutivos sem interrupção por –1 esse terá padrão de fita-β. Os
outros grupamentos são considerados como coil. Na Polybine I não acetilada indicou
estrutura em coil, enquanto que na Polybine I acetilada os resíduos de 1 a 9
apresentaram hélice, mostrando que a tendência é que a polybine I acetilada seja
mais estruturada (Figura 31).
Figura 30:
Gráfico da analise dos deslocamentos químicos da Polybine I. (A) Polybine I não
acetilada e (B) Polybine I acetilada.
63
Tabela 4.
Lista dos deslocamentos químicos com unidade em ppm dos prótons da Polybine I
nas formas não acetilada e acetilada.
Poly_sa Poly_ac
nº do
resíduo δ padrão δ
1
δ
2
∆δ
1
∆δ
2
1 Ser H 8,29 - 7,591
- -
1 Ser HA 4,49 - 4,340
- -0,150
1 Ser HB2 3,88 - 3,918
- -
1 Ser HB3 3,86 - 3,785
- -
1 Ser HG 5,33 - -
- -
2 Ala H 8,18 8,802 8,416
- -
2 Ala HA 4,26 4,390 4,089
0,130 -0,171
2 Ala HB 1,37 1,466 1,348
3 Asp H 8,32 8,313 8,023
- -
3 Asp HA 4,6 4,512 4,398
-0,088 -0,202
3 Asp HB2 2,73 2,757 2,723
- -
3 Asp HB3 2,69 2,658 2,723
- -
4 Leu H 8,22 7,872 7,829
- -
4 Leu HA 4,31 4,207 4,128
-0,103 -0,182
4 Leu HB2 1,63 1,694 1,572
- -
4 Leu HB3 1,55 1,694 1,572
- -
4 Leu HG 1,51 - -
- -
4 Leu HD1 0,77 0,981 0,847
- -
4 Leu HD2 0,74 0,920 0,803
- -
5 Val H 8,28 7,544 7,597
- -
5 Val HA 4,17 3,848 3,655
-0,322 -0,515
5 Val HB 1,99 2,136 1,994
- -
5 Val HG1 0,84 1,025 0,925
- -
5 Val HG2 0,82 0,928 0,801
- -
6 Lys H 8,19 7,743 7,603
- -
6 Lys HA 4,27 4,138 4,078
-0,132 -0,192
6 Lys HB2 1,78 1,860 1,799
- -
6 Lys HB3 1,76 1,722 1,640
- -
6 Lys HG2 1,38 1,465 1,475
- -
6 Lys HG3 1,36 1,465 1,344
- -
6 Lys HD2 1,61 1,538 -
- -
6 Lys HD3 1,6 1,538 -
- -
6 Lys HE2 2,92 3,010 3,975
- -
6 Lys HE3 2,92 3,010 3,976
- -
6 Lys HZ 7,49 - -
- -
7 Lys H 8,19 7,850 7,778
- -
7 Lys HA 4,27 4,192 4,073
-0,078 -0,197
7 Lys HB2 1,78 1,829 1,771
- -
7 Lys HB3 1,76 1,691 1,662
- -
7 Lys HG2 1,38 1,449 1,465
- -
7 Lys HG3 1,36 1,449 1,466
- -
7 Lys HD2 1,61 1,509 -
- -
7 Lys HD3 1,6 1,509 -
- -
7 Lys HE2 2,92 2,983 -
- -
7 Lys HE3 2,92 2,983
- -
Poly_sa Poly_ac
64
nº do
resíduo δ padrão δ
1
δ
2
∆δ
1
∆δ
2
7 Lys HZ 7,49 -
- -
8 Ile H 8,28 7,820 7,771
- -
8 Ile HA 4,18 3,969 3,843
-0,211 -0,337
8 Ile HB 1,8 1,847 1,786
- -
8 Ile HG12 1,18 1,131 -
- -
8 Ile HG13 1,23 1,517 -
- -
8 Ile HG2 0,8 0,828 -
- -
8 Ile HD1 0,69 0,728 0,703 e 0,590
- -
9 Trp H 8,28 7,824 7,922
- -
9 Trp HA 4,7 4,605 4,472
-0,095 -0,228
9 Trp HB2 3,2 3,383 3,270
- -
9 Trp HB3 3,15 3,291 3,166
- -
9 Trp HD1 7,15 7,256 7,148
- -
9 Trp HE1 10,1 9,726 9,568
- -
9 Trp HE3 7,34 7,658 7,825
- -
9 Trp HZ2 7,29 7,455 7,330
- -
9 Trp HZ3 6,87 7,145 7,453
- -
9 Trp HH2 7 7,218 -
- -
10 Asp H 8,32 7,891 7,826
- -
10 Asp HA 4,6 4,978 4,603
0,378 0,003
10 Asp HB2 2,73 2,815 2,698
- -
10 Asp HB3 2,69 2,815 2,633
- -
11 Asn H 8,35 7,787 7,662
- -
11 Asn HA 4,68 4,964 4,810
0,284 0,130
11 Asn HB2 2,81 2,940 2,813
- -
11 Asn HB3 2,77 2,761 2,622
- -
11 Asn HD21 7,32 7,549 7,394
- -
11 Asn HD22 7,16 6,643 6,522
- -
12 Pro H2 8,51 - -
- -
12 Pro HA 4,39 4,428 4,838
0,038 0,448
12 Pro HB2 2,07 2,366 2,205
- -
12 Pro HB3 2,03 2,046 1,913
- -
12 Pro HG2 1,93 - 2,202
- -
12 Pro HG3 1,91 - 2,202
- -
12 Pro HD2 3,64 3,887 4,347
- -
12 Pro HD3 3,62 3,828 3,773
- -
13 Ala H 8,18 8,059 7,946
- -
13 Ala HA 4,26 4,273 4,156
0,013 -0,104
13 Ala HB 1,37 1,429 1,310
- -
14 Leu H 8,22 7,643 7,475
- -
14 Leu HA 4,31 4,313 4,291
0,003 -0,019
14 Leu HB2 1,63 1,756 1,577
- -
14 Leu HB3 1,55 1,648 1,508
- -
14 Leu HG 1,51 1,427 -
- -
14 Leu HD1 0,77 0,885 -
- -
14 Leu HD2 0,74 0,885 0,781
- -
65
Realizou-se através do programa CNS o cálculo de 100 modelos para cada
peptídeo, os quais foram submetidos a um processo de minimização de energia,
obtendo 10 confôrmeros que foram superpostos utilizando o programa MOLMOL. As
estruturas finais de ambas as formas da Polybine I apresentaram um N-terminal
rígido, enquanto o C-terminal permaneceu desestruturado pela presença dos
resíduos Asn11 e Pro12. A asparagina tem uma cadeia lateral curta que contém
átomos eletronegativos como N e O, podendo formar ligações de hidrogênio com os
átomos eletronegativos da cadeia principal, impedindo assim, possíveis pontes de
hifdrogenio (i, i+4), que estabilizam uma hélice e a prolina, devido
à sua estrutura
cíclica, quebra a seqüência das α-hélices. As estruturas em ambas as formas
apresentaram, dentre os 10 confôrmeros superpostos, pequena volta nos resíduos
de 5 a 8, fazendo uma ligação de prótons i, i+4, indicando volta de α-hélice.
Tabela 5.
Caracterização do conjunto das 10 estruturas da Polybine I acetilada e não-
acetilada. O cálculo e a minimização foram realizados com o programa CNS.
Polybine I não-
acetilado
Polybine I
acetilado
Distâncias NOE
149
110
Violações NOE
> 0,2
1
4
RMSD para os átomos da cadeia
principal
2,97,±0,83
Α
&
2,75±0,67
Α
&
RMSD para os átomos pesados
4.05±0,97
Α
&
4,33±0,97
Α
&
RMSD da cadeia principal dos
resíduos de 2 a 10.
0,95±0,32
Α
&
0,90±0,41
Α
&
RMSD dos átomos pesados dos
resíduos de 2 a 10.
2,17±0,53
Α
&
2,41±0,75
Α
&
Energias (kcal/mol
-1
)
Total
77,6±8,9 112,8±5,6
Ligação
3,2±0,45 6,5±0,6
Ângulo
29,3±4,4 30,1±2,6
Impropia
2,1±0,7 1,85±0,4
Van der Waals
22,8±4,5 27,65±2,5
NOE
20,2±2,5 46,6±4,3
66
Figura 31
. Modelo estrutural da superposição de 10 confôrmeros da polybine I na forma não-
acetilada. A estrutura acima representa os átomos da cadeia principal e os átomos C
β
da
cadeia lateral e abaixo a estrutura em
ribbons.
67
Figura 32
. Modelo estrutural da superposição de 10 confôrmeros da polybine I na forma
acetilada. A estrutura acima representa os átomos da cadeia principal e os átomos C
β
da
cadeia lateral e abaixo a estrutura em
ribbons.
68
Foram resolvidas duas estruturas para a Polybine I não acetilada, uma da
amostra não acetilada e a outra da amostra acetilada, cada uma com 10
confôrmeros superpostos representando a estrutura. Esses dois grupamentos não
tiveram distinção entre eles. Num desses grupos apareceu hélice em um dos
confôrmeros, as outras permaneceram com conformação em coil, no entanto,
identificamos uma possível ligação de ponte de hidrogênio entre o carbono do
resíduo Leu4 e o nitrogênio do resíduo Ile8 com uma distância média de 2,48
Α
&
(padrão-2,5 a 3,5
Α
&
). Já na Polybine I acetilada também foi feita a superposição de
10 confôrmeros em que 50 % apresentaram hélice. Esse resultado nos sugere que a
forma nativa da Polybine I com os seus terminais bloqueados seja mais estável do
que somente como o C-terminal amidado. Esse resultado também foi comentado
anteriormente na analise de estrutura secundaria analisando os deslocamentos
químicos.
Para a confirmação desses resultados o aluno de doutorado Carlos Emídio,
do Departamento de Física da Unesp de São José do Rio Preto, realizou estudos
por dinâmica molecular.
A dinâmica molecular foi feita com o intuito de reproduzir as condições
experimentais: numa caixa contendo TFE e água na proporção de 40/60%, o
peptídeo foi simulado nas condições não acetilado e acetilado, partindo, para cada
uma dessas condições, de uma hélice Ideal e da estrutura calculada por
ressonância magnética obtidos neste trabalho, representado pelo pdb de mínima
energia dentre os 10 confôrmeros calculados. Simulamos a presença de um banho
térmico a 300K através do acoplamento de temperatura berendsen e a pressão
também foi mantida constante, em 1 atm. Conflitos estéricos iniciais nas
configurações iniciais foram removidos através de uma minimização de energia com
1000 passos de steepest descent. A posição dos solventes foi reajustada antes da
69
dinâmica molecular com uma dinâmica de restrição de posição (50 ps) no peptídeo.
A dinâmica de produção, em que observamos as mudanças conformacionais
tiveram 3000 ps de duração, usando campo de força do gromos 45a3 e as
interações de longa-distância corrigidas com campo de reação.
Os resultados de dinâmica nos mostraram que realmente a polybine I não
acetilada não possui estabilidade na sua estrutura variando sempre na formação de
hélice e coil em todo o tempo de dinâmica mesmo partindo de uma estrutura
totalmente em hélice. Em relação a Polybine I acetilada a formação de hélice foi
conservada em todo o tempo de dinâmica para ambas as condições.
70
Figura 33
. Modelo estrutural da dinâmica molecular da Polybine I não - acetilada em tempos
diferentes. (1) representa a dinâmica molecular partindo do pdb dos dados de RMN e (2)
representa a dinâmica molecular de uma hélice perfeita. (a)0ns, (b) 1ns e (c) 3ns.
1)
Figura 34
. Representa os gráficos dos resíduos em
α
-hélice pelo tempo de dinâmica
molecular da Polybine I não acetilada. (1) representa a dinâmica molecular partindo do pdb
dos dados de RMN e (2) representa a dinâmica molecular de uma hélice perfeita.
(a)
(a)(a)
(a)
(b)
(b)(b)
(b)
(c)
(c)(c)
(c)
1)
2)
1) 2)
71
Figura 35
. Modelo estrutural da dinâmica molecular da Polybine I acetilada em tempos
diferentes. (1) representa a dinâmica molecular partindo do pdb dos dados de RMN e (2)
representa a dinâmica molecular de uma hélice perfeita. (a)0ns, (b) 1ns e (c) 3ns.
Figura 36
. Representa os gráficos dos resíduos em
α
-hélice pelo tempo de dinâmica
molecular da Polybine I acetilada. (1) representa a dinâmica molecular partindo do pdb dos
dados de RMN e (2) representa a dinâmica molecular de uma hélice perfeita.
1)
2)
(a)
(a)(a)
(a)
(b)
(b)(b)
(b)
(c)
(c)(c)
(c)
(a)
(a)(a)
(a)
(b)
(b)(b)
(b)
(c)
(c)(c)
(c)
1)
2)
72
6-Conclusão
A descoberta de uma nova família de peptídeos policatiônicos, os Polybine,
despertou uma curiosidade entre esse tipo de peptídeo, devido ao bloqueio do N-
terminal com acetil. Dentre essas toxinas é muito rara a ocorrência de modificações
químicas do grupo α-amino do N-terminal, geralmente por essas toxinas possuírem
somente o C-terminal amidado. Esses peptídeos, no entanto, apresentam na sua
forma nativa os dois terminais bloqueados e possuem um poder de degranulação de
mastócitos e quimiotático superior ao peptídeo sintético com somente o C-terminal
bloqueado. Há um grande interesse em compreendermos a razão pela qual esse
fenômeno acontece, podendo se revelar um grande potencial para a atividade
inflamatória. Portanto a proposta desse projeto de mestrado foi resolver as
estruturas nas formas acetilada e não acetilada através da técnica de
espectroscopia de ressonância magnética nuclear e observar estas duas formas.
A técnica de dicroísmo circular utilizada como complemento nos revelou uma
média de 30% de formação de fração de hélice. E se compararmos esses resultados
com os obtidos em RMN (28,6%), se observa similaridade, mostrando coerência de
resultados entre as duas técnicas. Em relação ao poder de ação biológico da
polybine I acetilada, sugerimos que isso ocorra devido a uma maior estabilidade
conformacional, sendo que o conjunto de confôrmeros apresentou voltas de α-hélice
(50%) do modelo que representa a estrutura. A estrutura não acetilada apresentou
em sua maioria, confôrmeros em coil mostrando menor estabilidade na estrutura.
E possível sugerir também, que o grau de estabilidade dessas estruturas
esteja relacionada a interações de resíduos carregados da seqüência primaria. Os
resíduos carregados podem tanto estabilizar a hélice como desestabilizá-la,
73
dependendo da posição que se encontram pode haver formação de ponte salina ou
não (MARQUESE & BALDWIN, 1987). No caso da polybine I a pouca formação de
α-hélice (resíduos 5 a 8) pode estar ligado a esses resíduos carregados. Na
seqüência primaria da Polybine I existem os seguintes resíduos carregados: Asp 3 e
10, Lys6 e 7, no qual a formação de ponte salina desses resíduos acontecem
quando possuem as seguintes posições i, i+3 ou i, i+4 para ponte salina simples e
para ponte salina formando um tripleto as posições i+4, i+8 ou i+3,i+6 na estrutura
secundaria (IQBALSYAH & DOIG, 2005). Portanto a Polybine I tem tendência a
formação de ponte salina, mas na analise das estruturas observamos que a uma
disputa entre as Lisinas na interação com o Aspatato. Se observarmos a figura 30
podemos perceber que a formação de hélice é bem maior do que o modelo de
estrutura representado pelos confôrmeros nas figuras 31 e 32. Podemos sugerir,
então, que as posições das lisinas possam estar desestabilizando a formação de
hélice entre os resíduos de 1 a 10.
74
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2005.
80
APÊNDICE A
Padrões de Espetros Tocsy para os 20 aminoácidos
81
82
83
APÊNDICE B
Transformada de Fourier (Zerbe, 2005)
A intensidade do sinal captado pelo receptor está representada por números
em relação ao tempo, mas são convertidos para um espectro que possui a
intensidade do sinal no domínio da freqüência e para isso é preciso usar a
transformada de Fourier.
A teoria da Transformada de Fourier determina que cada função periódica
pode ser decomposta numa série de funções seno e co-seno de freqüências
diferentes:
( )
∑∑
∞
=
∞
=
++=
11
0
cos
2
n
n
n
n
nxasennxb
a
xf
A decomposição de Fourier demonstra que freqüências estão presentes com
uma certa intensidade. Usando a integral da equação abaixo:
( ) ( ) ( ) ( ) ( )
[ ]
( ) ( ) ( )
( ) ( ) ( )
dxtxxftb
dxtxxfta
dtttbttaf
sen
2
1
cos
2
1
sencos
2
1
∫
∫
∫
∞
∞−
∞
∞−
∞
∞−
=
=
+=
π
π
ωω
π
ω
e utilizando a relação de Euler pode-se reescrever como:
( ) ( )
dtetff
ti
ω
π
ω
−
∞
∞−
∫
=
2
1
Esta é a forma para transformar a função do sinal f(t) de uma ressonância
num espectro f(
ω). A transformada de Fourier é indicada por duas funções de
84
entrada ortogonal chamada de componente real e imaginária. A detecção de ambas
as magnetizações é chamada de detecção de quadratura.
( ) ( )
[ ]
( )
[ ]
( ) ( )
tdttfitdttf
ffdtetf
ti
ωω
ωω
ω
sencos
ImRe
∫∫
∫
∞
∞−
∞
∞−
∞
∞−
+=
+=
O sinal de FT-RMN é amostrado como pontos discretos agora podendo ser
utilizado num espectro.
( )
N
ikn
N
K
kn
ed
N
f
π
2
1
0
1
−
−
=
∑
=
85
APÊNDICE C
NMRView para Espectroscopia Homonuclear
(Assinalamento das ressonâncias)
NMRView é um programa com plataforma UNIX e linux para visualizar e
analisar os dados obtidos através de medidas de RMN. Foi escrito pelo Dr. Bruce
Johson nos Laboratórios de pesquisa da MERCK.
O objetivo maior desse programa e auxiliar nos processamentos dos dados
coletados para se ter arquivos de entrada para programas de cálculos estruturais.
Para se obter o programa é necessário entrar no endereço: www.NMRView.com e
baixá-lo.
Como visualizar os espectros no programa NMRView
O primeiro passo é converter os dados coletados do aparelho de RMN num
arquivo que possa ser lido pelo programa. Para isso, utilizaremos dois scripts do
programa NMRView que serão criados e gerados dentro do diretório contendo os
arquivos de coleta: fid e o procpar. O primeiro script (var_conv.com) contém as
linhas de comando para converter os dados coletados para uma forma que é
utilizado pelo NMRView e o segundo script (x.y.com) processa os dados para obter o
espectro que será visualizado e utilizado pelo NMRView.
86
O var_conv.com é um script que deve ser criado e editado dentro do diretório
dos espectros coletados (diretório de trabalho) com as linhas de comando no
formato da figura 1B. O significado dessas linhas estão expostas no tópico no anexo
“Scripts do NMRView”. Dentro do arquivo criado; verifique os parâmetros: ni, np, sw
e reffrp, no arquivo procpar, dentro do diretório dos espectros coletados e efetue a
mudança como mostra a Figura 1B. Depois de realizado as mudanças e executado
o script, ao final desta operação, o arquivo de saída servirá como entrada para o
processamento dos dados.
Figura 1B: Linhas de comando do script var_conv.com.
np
SW
ni
Arquivo de entrada
Arquivo de
saída
reffrq
ni * 2
np/2
87
No mesmo diretório criaremos e editaremos um script para processarmos os dados
através do script xy.com com as linhas de comando mostrado na figura 2B. Antes de
executarmos este script é necessário colocar o nome do seu arquivo de entrada e
saída e zerar a fase em x (Figura 2). Terminado esta etapa poderemos, então, abrir
o espectro no programa NMRView. Retornaremos a executar esse script quando
estivermos fazendo a correção de fase e linha de base do espectro.
Figura 2B:
Linhas de comando do script x.y.com
Entrar com o nome do
arquivo de entrada, gerado
no script anterior.
Gerar este script com a fase
zerada, pra depois corrige-la
adequadamente utilizando o
NMRView.
Entrar com o nome
de saída do arquivo
que abrirá o espectro
no NMRView.
88
Abrindo o NMRView:
Abra um terminal entre com os comandos NMRView ou nv5. Na tela do
computador aparecerão os menus principais do NMRView como na Figura 3B.
Figura 3B:
Interfase gráfica dos menus principais do NMRView
Inserindo o espectro no NMRView
No painel de controle, como está sendo mostrado na Figura acima, clique em
Dataset; dentro desse ícone, entre em “Open and Draw Dataset ”(esse recurso
carrega e abre, ao mesmo tempo, o espectro numa janela dentro do programa).
Logo em seguida, aparecerá uma nova janela, onde selecionaremos o diretório;
neste se encontram os dados e abriremos o espectro (Figura 4B).
Painel de Controle
Janela de
comando
.
Terminal
89
Figura 4B: Passos para a abertura de um espectro no programa NMRView.
Maximizando a janela espectral, com o mouse, aparecerão dois cursores.O
botão esquerdo do mouse movimenta o cursor preto, o botão do meio o cursor
vermelho e o esquerdo os menus secundários.
Figura 5B: Cursores e menu secundário.
Clike aqui para selecionar o
espectro( .nv ) antes de abri-lo.
Seleciona o
diretória
90
Arrumando o espectro para análise
No menu secundário “Attributes“(Figura 6B) abriremos uma janela onde
poderemos definir a cor dos picos, dimensão e o nível do espectro (Figuras 7B).
Depois de ter selecionado as características do seu espectro clique em “DRAW “ e o
espectro aparecerá como na Figura 8B.
Figura 6B
: Espectro 2D com o menu secundário ativo.
Figura 7B:
Mostrando como definir as características do espectro como: cor dos picos e nível
Figura 8B
: Espectro 2D sem a correção de fase.
91
Correção de fase através do NMRView
A correção de fase começa pela seleção de picos da diagonal com os
cursores preto e vermelho da janela espectral, cada um num extremo. Arraste
primeiramente o cursor preto até um pico da diagonal na região HN e selecione no
menu secundário o ícone “Extract” como mostra a Figura 10 B.
Figura 9B
: Espectro 2D com o posicionamento dos cursores para a correção de fase e com o
menu secundário ativo na função
Extract
.
Se a correção que o espectro precisa e no eixo X (Figura 10B), selecione-o, e
em seguida, aparecerá uma janela com um gráfico da região onde posicionamos o
cursor clique no ícone Phaser. Nesta interfase existe um ícone chamado Piv (a
marcação do Pivô é necessária somente para a correção de fase em P0), que
aparece na cor verde, clique nele e depois vá com o mouse, em cima do pico que
pegaremos como referência como descrito na Figura 10B.
Selecione o botão P0 e movimente com o cursor os picos, até que eles fiquem
posicionados como demonstrado no gráfico da Figura 12B. Ao corrigir P0 anote o
valor, zere P0 e feche a janela, voltando assim, para a janela espectral. Faça o
mesmo procedimento para a correção de fase em P1 agora relacionando o pico no
outro extremo do espectro com o cursor vermelho; só que antes de corrigi-lo,
coloque o valor encontrado de P0. Ao final, anote os valores de P0 e P1 e zere
esses valores na janela ande se encontram, feche o programa e volte ao seu
diretório de trabalho. Coloque os valores encontrados de P0 e P1 na linha de
comando do script xy.com como indicado na Figura 2B e execute novamente o
92
script para obtermos um novo espectro pois, o NMRView não aplica as correções de
fase .
Figura 10B:
Janela que realiza a correção de fase: gráfico sem correção.
Figura 11B
: Janela que realiza a correção de fase: gráfico com correção.
Ferramenta utilizada para movimentar os
picos e corrigir a fase do espectro em P0 e
P1.
93
Figura 12B
: Espectro 2D com a fase acertada
Trabalhando com o espectro
Escolhendo uma região do espectro
Para selecionar uma região na janela espectral, posicione os cursores na área
que queremos visualizar ampliadamente. No menu secundário, vá ao ícone “view” e
escolha a função”Expand”; se quiser retornar à posição inicial clique em
”Full”(Figura 14B).
Figura 13B:
Mostra o esquema para ampliar o espectro 2D numa dada região, através do
ícone “View”. Está ferramenta permite observar o espectro de diversas formas.
Os botões do teclado que utilizamos p movimentar o espectro
1
– move para baixo e para a esquerda;
2
– move para baixo;
3
– move para baixo e para a direita;
94
4
– move para a esquerda;
5
– desloca-se para o centro do ultimo pico marcado;
6
– move para a direita;
7
– move para cima e para a esquerda;
8
– move para cima;
9
– move para cima e para a direita;
- Zoom out (aumenta o campo de visão);
+
Zoom in ( aumenta o campo de visão).
Assinalamento dos Átomos
O assinalamento dos átomos se inicia pela detecção automática dos picos no
espectro. Esse procedimento é realizado indo no menu secundário, selecionando o
ícone “Peak” e depois a função “Pick”; aparecerá uma janela, na qual poderemos
escolher a forma como os picos serão picados automaticamente. Salve essa lista de
picos no menu principal, no ícone “Assign” “Peak”(Figura 15B).
Figura 14B:
Esquema para a detecção automática dos picos.
95
Figura 15B
: Janela onde salvamos e abrimos as listas de picos (File) e definimos os picos. No
ícone “int” você pode integrar os picos e obter os volumes.
O segundo passo para o assinalamento é
carregar a seqüência no programa. Abra um novo
terminal e entre no seu diretório de trabalho.
Dentro deste diretório crie um arquivo com
extensão nome.seq com o formato apresentado
na Figura 16B.Depois volte ao programa
NMRView e no menu principal, entre em
“Molecules”(Figura 17B).
Figura 16B:
Formato do arquivo nome.seq
96
Figura 17B:
Mostra como carregar a seqüência do peptídeo ou proteína no NMRView .
Com a lista carregada começaremos a identificar o sistema de spin e os picos
NOE. Para registrar os picos identificados é preciso entrar novamente na janela
descrita na Figura 15B onde salvamos a lista de pico. Os passos para registrar e
assinalar os picos estão descritos na Figura 18B. Terminada essa etapa, o ultimo
passo é obter os volumes (Figura 18B) e calibrar o espectro (Figura 19B). O cálculo
estrutural e a análise da estrutura deverão ser realizados em outros programas
como: DYANA, CNS e MOLMOL.
97
Figura 18B
:
Mostra os passos para fazer o assinalamento dos resíduos.
Para inserir o valor nesta janela
e só clicar com o botão do
meio
do mouse e teclar enter. Se o
“upate” ficar vermelho tecle
enter novamente.
1.
Leia a lista de picos: “File”
–
“Read
List”.
2. Em “List” selecione a lista já lida.
3.
Insira o numero, o tipo de átomo (Lab
) e o nome do resido (RNname).
4. Registre os deslocament
os químicos
no painel do assinalamento (ao lado).
5.
Obtenha os volumes: Int
–
Get
Seleciona o pico a
ser identificado!
Salve a lista do assinalamento
ao terminar de colocar os
deslocamentos químicos nas
janelas (write ppm)!
98
Figura 19B:
Mostra os passos para obter as distâncias através de picos NOE.
1.
Selecione a lista de
picos(Peaklist) de picos que já
deverá ter sido lido como
mostrado anteriormente.
2. Clique em Extract all .
3.
Escolha se você quer se seu
espectro seja calculado pelo
volume ou intensidade.
4.
Entre em “Calibrate”.Escolha o
método que irá calibrá-lo.
5. Escolha o fo
rmato do arquivo
de saída e salve (write).
99
Anexo
(Scripts do NMRView)
2
Var_conv.com
#!/bin/csh
Indica que este é um macro que pode ser executado sobre UNIX
Var2pipe –in fid
Chama o executável “ var2pipe” ( NMRpipe format conversion) com o arquivo “fid” como entrada.
Noswap
Flag para ativar ou não byte-swapping. É uma variável dependente da plataforma operacional.
-xN 2048 -yN 512
-xT 1024 -yT 256
Número de pontos totais ( xN e Yn ) e pontos válidos ( xT e yT ). Para estes valores e os abaixo, cada coluna corresponde a uma
dimensão. Para dados 2D temos então duas colunas. Os valores iniciados por “x” correspondem à primeira dimensão e os “y” à
segunda dimensão.
Os valores xN e xT são obtidos da variável “ np” definida na coleta de dados, correspondendo ao número de pontos coletados
em cada FID, “np” corresponde ao número total de pontos coletados (reais + imaginários). Cada FID possui np/2 pontos reais e
np/2 pontos imaginários. Portanto xT = np/2 e xN = np. Os valores yN e yT são obtidos da variável de coleta “ni” que é relativo
à quantidade de FIDs adquiridos. A variável ni indica o número de pontos imaginários na segunda dimensão, portanto, yT = ni
e yN = ni*2.
xMODE Complex -yMODE Complex
Indica o modo de coleta, “Complex” se foram adquiridos pontos reais e complexos ou “ Real “ se somente pontos reais foram
adquiridos.
xSW 8000.00 -ySW 8000.00
É obtido da variável de coleta “sw”
xOBS 599.894030 -yOBS 599.894030
Indica a freqüência de ressonância do núcleo excitado. É obtido da variável de coleta “reffrq”
xCAR 4.690 -yCAR 4.690
Corresponde à freqüência central do espectro. Usualmente é a freqüência de ressonância da água e é obtido de valores tabelados,
para cada temperatura. Deveser corrigido os dados coletados após o espectro ter sido referenciado.
xLAB H1 -yLAB H2
Corresponde aos núcleos excitados em cada dimensão ( H1 : Hidrogênio na dimensão 1 e H2 na dimensão 2).
ndim 2 -aq2D States
Número de dimensão e modo de filtragem de coerência por excitação em e detecção em diferentes fases (states ou TPPI, p. ex).
out tocsy.pfid –verb –ov
Indica o arquivo de saída dos dados convertidos. A opção “-verb” faz com que seja impressa na tela linhas indicativas das
operações executadas e “ov “ força um novo arquivo a sobrescrever o antigo existente.
Obs: o símbolo # no inicio da linha impede a execução daquela linha de comando
2
xy.com
#|
||
| nmrpipe –fn SOL \ ou POLYtime
Invoca uma função de processamento interna pré-definida (-fn). SOL: filtra o solvente. Aplica um função de
convolução no domínio do tempo para subtração do solvente.
|
||
| nmrpipe –fn GMB –lb -4.0 –gb 0.08
GM: Gauss-to-lorentz. Apodiza os dados com uma função mista Gauss-exponencial. “lb” especifica o deicaimento da
exponencial, geralmente usa-se o negativo da largura de linha em Hz e “ –gb” um fator gaussiano, geralmente uma fração de
1.
|
||
| nmrpipe –fn ZF –size 2048
ZF: Zero Fill. Completa os dados com zeros. O ponto inicial da introdução de zeros pode ser introduzido manualmente (-size)
ou automaticamente (-auto).
|
||
| nmrpipe –fn FT
FT: Fourier Transform. Aplica uma transformada de Fourier direta ou inversa em vetores complexos ou reais de qualquer
tamanho.
|
||
| nmrpipe –fn PS –p0 88.7 –p1 16.0 –di
PS: Phase Correct. Corrige os valores de fase em primeira (p0) e em segunda ordem (p1). Os valores a serem introduzidos
aqui devem ser obtidos corrigindo a fase do espectro do primeiro FID, via NMRView. “di” remove os dados imaginários
após o processamento.
#|
||
| nmrpipe –fn EXT –left –sw
EXT extrai uma dada região dos dados espectrais. Usando para descartar regiões vazias do espectro durante o processamento.
A região pode ser especificada em termos gerais como à direita (-right), à esquerda ( -left) ou central (-mind) ou por pontos
específicos. “-sw” ajusta os dados de freqüência, como tamanho de janelas, para se ajustarem à nova região.
|
||
| nmrpipe –fn TP
TP inverte linhas ( eixo X_ por colunas ( eixo Y) e vice cersa de dados complexos ou reais . A partir deste ponto as funções
aplicadas agem na Segunda dimensão.
#|
||
| nmrpipe –fn LP –lb –ord 10 –pred 64
LP: Linear Predition. Prevê ou corrige dados no começo, meio ou fim do vetor de dados. “-fb” define forward-backward
predição que prediz pontos antes e depois da região usada para o cálculo. “ –ord” define o número de coeficiente usado na
predição e “-pred” define o número de pontos a ser predito.
|
||
| nmrpipe –fn SP –off 0.38 –end 0.98 –pow 1 –c 0.5
SP: Sine Bell. Apodiza os dados com uma função seno ajustável.”-off” ajusta o ponto inicial ( sin(off*pi)), “end” o ponto
final ( sin(end*pi), “pow” é a potencia do seno e “-c” é a escala.
#|
||
| nmrpipe –fn REV –auto
REV: Reverse. Reverse a ordem dos dados em cada vetor
#|
||
| nmrpipe –fn POLY –auto 1
POLY: Polynomial Subtract. Subtrai dos dados uma função polinomial. No domínio da tempo é usada para subtração de
solvente.
#|
||
| nmrpipe –fn POLY –auto 2
POLY: Polynomial Subtract. Subtrai dos dados uma função polinomial. No domínio da freqüência é usada para correção de
linha de base. “-auto” corrige automaticamente a linha de base.
|
||
| nmrpipe –fn POLY –auto –xn 12.0ppm –x1 5.5ppm
“-x1” indica o ponto inicial e “-xn” indica o ponto final da região onde a função será aplicada.
|
||
| pipe2xyz –nv –out polysa_tocsy_presat_300_25.nv
Executa o aplicativo “pipe2xyz” e grava a matriz de dados “file.nv”
2
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