( PDF ) Bioinformática estrutural aplicada ao estudo de proteínas alvo do genoma do Mycobacterium tuberculosis

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Bioinformática Estrutural Aplicada ao Estudo de Proteínas Alvo

do Genoma do Mycobacterium tuberculosis.

Nelson José Freitas da Silveira

Orientador: Prof. Dr. Walter Filgueira de Azevedo Júnior

São José do Rio Preto

Estado de São Paulo – Brasil

Agosto – 2005

Tese apresentada para obtenção do título de

Doutor em Biofísica Molecular, área de

concentração em Biofísica Molecular do

Departamento de Física do Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas d

Universidade Estadual Paulista “Julio de

Mesquita Filho” – UNESP.

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Silveira, Nelson José Freitas da.

Bioinformática estrutural aplicada ao estudo de proteínas alvo do

genoma do Mycobacterium tuberculosis / Nelson José Freitas da Silveira

– São José do Rio Preto : [s.n.], 2005

117 f. : il. ; 30 cm.

Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Júnior

Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista. Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Biologia molecular. 2. Bioinformática estrutural. 3. Proteínas

Estrutura. I. Azevedo Júnior, Walter Filgueira de. II. Universidade

Estadual Paulista. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III.

Título.

CDU – 577.112

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iii

“Jamais considere seus estudos como uma obrigação, mas como uma

oportunidade invejável para aprender a conhecer a influência libertadora da

beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer pessoal e para proveito da

comunidade à qual seu futuro trabalho pertencer”.

Albert Einstein

À toda minha família, em especial

minha mulher Eluy e minha filha

Isabela pelo amor e companheirismo.

Agradecimentos

Ao Prof. Walter Filgueira de Azevedo Jr. pela orientação dedicada na realização

deste trabalho, pela amizade e companheirismo na convivência diária e pela

confiança em mim depositada.

À Profa. Eloiza Helena Tajara da Silva, pela sua dedicação a um treinamento

pessoal e científico em bioinformática, proporcionado com seu contato com o Prof.

Walter a orientação que resultou em um trabalho de doutoramento, parceria e

amizade.

Aos Profs. Walter Filgueira de Azevedo Jr., José Márcio Machado, Valmir Fadel,

Paula Rahal Liberatore e Fernanda Canduri pelas sugestões para complementação

deste trabalho durante o exame geral de qualificação.

Aos membros da banca de defesa da tese Profs. Walter Filgueira de Azevedo Jr.,

Paulo Sérgio Lopes de Oliveira, Paula Regina Kuser Falcão, Jorge Chahine, José

Roberto Ruggiero, Andréia Machado Leopoldino, Osmar Norberto de Souza e

Fernanda Canduri por aceitarem a colaborar para o enriquecimento do trabalho e

meu crescimento pessoal, fortalecendo o caráter científico desenvolvido.

A todo o corpo docente do Departamento de Física, pelos ensinamentos e dedicação

transmitidos nas disciplinas cursadas, pela amizade, pelo tempo cedido ao

esclarecimento de dúvidas e solução de problemas e pela receptividade acolhedora e

harmoniosa.

Aos colegas da pós-graduação pela convivência, pelas conversas no café e

churrascos e principalmente pela integração científica e disseminação de

conhecimentos.

Aos colegas do grupo do Laboratório de Sistemas Biomoleculares, os quais foram

de importância relevante para a conclusão deste trabalho, fazendo de cada seminário

um ambiente de discussão em grupo favorecendo o aprendizado e pelas conversas,

piadas que sempre descontraíram nos momentos difíceis.

Aos funcionários Barbosa, Paulinho e Ilva pelos favores e prestação de serviços de

suporte ao bom funcionamento do departamento.

Aos meus pais Nelson (in memorian) e Sebastiana, meus irmãos Luiz e Patrícia,

pelo apoio e incentivo que sempre recebi, tendo sempre como conselho, a calma

necessária e a obstinação por aquilo que deseja.

vii

À minha mulher Eluy e minha filha Isabella pelo apoio, incentivo, alegria e suporte,

gerando estrutura e ambiente familiar favorecendo o sucesso de meu trabalho.

Ao assessor ad hoc da FAPESP, o qual desde a concessão da bolsa tem emitido

pareceres sobre os relatórios sempre com informações e sugestões de grande

importância para o enriquecimento do trabalho.

À FAPESP (processo nº 02/10239-6) pela bolsa concedida e pelo apoio financeiro,

possibilitando a aquisição de material necessário ao desenvolvimento e conclusão do

trabalho, além das viagens a congressos.

À Deus por me conceder serenidade, saúde e a possibilidade de realizar tudo o que

desejo, sempre em direção à paz.

Índice Geral

Índice de Figuras....................................................................................................

Índice de Tabelas....................................................................................................

Glossário de Termos e Abreviaturas......................................................................

Resumo...................................................................................................................

Abstract...................................................................................................................

1. Introdução...........................................................................................................

1.1 Genoma do Mycobacterium tuberculosis................................................................. 13

1.2 Mycobacterium tuberculosis multidroga resistente................................................. 18

1.3 Vias metabólicas...................................................................................................... 21

1.4 Alvos para desenho de drogas baseado em estrutura............................................... 23

1.5 Bioinformática estrutural aplicada ao estudo de proteínas alvo............................... 26

2. Objetivos............................................................................................................

3. Materiais e Métodos...........................................................................................

3.1 Modelagem molecular............................................................................................. 30

3.1.1 Procura e seleção de templates.......................................................................................

3.1.2 Alinhamento template/alvo............................................................................................

3.1.3 Construção do modelo....................................................................................................

3.1.4 Avaliação dos modelos...................................................................................................

3.2 Aplicações da modelagem molecular comparativa.................................................. 35

3.3 Possíveis erros em modelagem molecular comparativa........................................... 38

3.4 Modelagem em larga escala do genoma do M. tuberculosis................................... 40

3.5 Busca por templates e algoritmo de alinhamento.................................................... 44

3.6 Modelagem molecular comparativa usando um cluster Beowulf............................ 46

3.7 Softwares de análise estrutural e validação de modelos.......................................... 48

3.8 Perl/CGI................................................................................................................... 50

3.9 Banco de dados MySQL.......................................................................................... 53

3.10 Programas, servidores e links no DBMODELING................................................ 56

4. Resultados e Discussão.......................................................................................

4.1 Conteúdo de dados no DBMODELING.................................................................. 59

4.2 Dados para referência sobre estruturas de M. tuberculosis...................................... 61

4.3 Acesso e interface do banco de dados...................................................................... 64

4.4 Precisão dos modelos gerados.................................................................................. 71

4.5 Análises realizadas para uma estrutura contida no DBMODELING....................... 76

4.5.1 Alinhamento das seqüências primárias e qualidade dos modelos..................................

5. Conclusões..........................................................................................................

6. Desenvolvimentos Futuros.................................................................................

7. Bibliografia.........................................................................................................

APÊNDICE A – Descrição dos softwares utilizados.............................................

I. MODELAGEM MOLECULAR................................................................................. 98

II. ALINHAMENTO (NEEDLEMAN-WUNSCH)...................................................... 103

III. PROCHECK……………………………………………………………………… 108

IV. VERIFY 3D………………………………………………………………………. 113

V. RMSD........................................................................................................................ 114

APÊNDICE B – Produção bibliográfica................................................................

117

Índice de Figuras

Figura 1

. Distribuição geográfica da localização dos níveis de mortalidade causados pelo

tuberculosis no mundo..................................................................................................................

Figura 2

. Via do ácido chiquímico na seqüência de sete passos metabólicos..............................

Figura 3

. Interação das áreas que têm contribuído para a formação e o desenvolvimento da

bioinformática...............................................................................................................................

Figura 4

. Precisão e aplicação de modelos estruturais de proteínas............................................

Figura 5

. Possíveis erros em modelagem molecular comparativa...............................................

Figura 6. Fluxograma do algoritmo criado para automatizar a modelagem comparativa de

estruturas de proteínas...................................................................................................................

Figura 7

. Arquivo de entrada para gerar o alinhamento pelo MODELLER................................

Figura 8

. Arquivo de entrada da modelagem, indicando o número de modelos a serem

gerados e a semente aleatória........................................................................................................

Figura 9

. Arquitetura do cluster...................................................................................................

Figura 10

. Cluster utilizado para executar a ferramenta desenvolvida para modelagem

molecular e análise em larga escala..............................................................................................

Figura 11

. Diagrama esquemático de como a programação CGI interage com o banco de

dados de M. tuberculosis...............................................................................................................

Figura 12. Relação entidade-relacionamento para as tabelas do banco de dados

DBMODELING............................................................................................................................

Figura 13

. Dados estatísticos sobre a modelagem........................................................................

Figura 14

. Gráfico representando a estimativa de dados que serão acrescentados ao

DBMODELING.............................................................................................................................

Figura 15

. Interface de entrada para as ferramentas do grupo do Laboratório de Sistemas

Biomoleculares (BMSys)...............................................................................................................

Figura 16

. Interface de entrada para o DBMODELING..............................................................

Figura 17

. Visualização da interface após a seleção do organismo..............................................

Figura 18

. Interface de busca por uma via metabólica ou enzima específica...............................

Figura 19

. Links direcionando as enzimas de interesse para as informações estruturais.............

Figura 20

. Dados estruturais da enzima selecionada para pesquisa.............................................

Figura 21

. Análise dos resultados de uma proteína alvo para os 1000 modelos gerados.............

Figura 22. Histograma representando as regiões mais favoráveis do gráfico de Ramachandran.

Figura 23

. Histograma mostrando a freqüência de proteínas com relação aos intervalos dos

valores de RMSD de sobreposição C

– C

...................................................................................

Figura 24. Gráfico de dispersão dos dados do Procheck e RMSD da geometria ideal................

Figura 25

. Reação catalisada pela Glucose-1-fosfato timidilil-transferase (RmlA).....................

Figura 26

. Alinhamento das seqüências de aminoácidos da MtRmlA e da PaRmlA...................

Figura 27

. Gráfico de Ramachandran da modelagem da enzima MtRmlA..................................

Figura 28

. Estrutura 3D da enzima MtRmlA e PaRmlA, respectivamente..................................

Figura 29

. Gráfico gerado pelo programa VERIFY 3D da enzima MtRmlA...............................

Figura 30

. Sobreposição do modelo da MtRmlA com o template 1FXO_A mostrando as

diferenças conformacionais entre as estruturas.............................................................................

Figura 31

. Passos para construção de um modelo utilizando modelagem comparativa por

satisfação de restrições espaciais...................................................................................................

Figura 32

. Mudança conformacional pela minimização da função objetivo................................

100

Figura 33

. Alinhamento de seqüências por algoritmo de programação dinâmica........................

104

Figura 34

. Método para calcular o escore ótimo no algoritmo de programação dinâmica..........

107

Figura 35. Matriz de valores de alinhamento BLOSUM62..........................................................

108

Figura 36

. Representação dos ângulos de torção em uma cadeia polipeptídica...........................

110

Figura 37.

Diagrama de Ramachandran.......................................................................................

112

Figura 38. Representação estrutural da molécula de Glicina (a) e de Prolina (b)........................

113

Índice de Tabelas

Tabela 1

. Alvos moleculares para o diagnóstico de resistência do M. tuberculosis......................

Tabela 2

. Programas e servidores web usados nos alinhamentos, construção e avaliação dos

modelos...........................................................................................................................................

Tabela 3

. Qualidade dos modelos estruturais usando as análises do gráfico de

Ramachandran................................................................................................................................

Tabela 4

. Cálculo do RMSD de sobreposição C

-C

....................................................................

Tabela 5

. Dados estatísticos para a região mais favorável do gráfico de Ramachandran.............

Tabela 6. Análises da estrutura do template e do modelo.............................................................

Tabela 7

. Dados gerais apresentados no banco de dados sobre o modelo e o template.

análises...........................................................................................................................................

Glossário de Termos e Abreviaturas

3D – Tridimensional.

Ângulos diedros – Um ângulo formado por quatro pontos i, j, k, l (por exemplo, átomos).

Ele é definido como o ângulo entre os planos normais ijk e jkl.

BMSys – Laboratório de Sistemas Biomoleculares

(http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br).

CCP4 – Collaborative Computational Project Nº 4.

Constrições e Restrições – Constrição restringe uma característica espacial, tal como a

distância entre dois átomos, para um simples valor em particular. A restrição permite um

intervalo maior de valores, possível com a variação da probabilidade.

CGI – Common Gatway Interface.

Docking

– Um método utilizado para detectar sítios de ligação em proteína e avaliar

interações proteína-proteína ou proteína-ligante, utilizando para cálculo a energia livre de

ligação entre as moléculas. É dividido em docking rígido e flexível.

DBMS – Database Management System.

DBMODELING

– Banco de dados relacional que utiliza a plataforma SQL/MySQL e

programação Perl/CGI com o objetivo de disponibilizar modelos moleculares de proteínas

alvo de genomas como Mycobacterium tuberculosis, Xylella fastidiosa, etc.

dTDP – desoxi-timidina di-fosfato.

dTMP – desoxi-timidina mono-fosfato.

dTTP – desoxi-timidina tri-fosfato.

Glc – Glucose.

G-1-P – Glucose-1-fosfato.

HTML – Hypertext Markup Language.

KEGG – (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Banco de dados de vias

metabólicas.

Minimização de energia – Técnica que muda a conformação de uma molécula, no sentido

de diminuir sua energia tanto quanto possível.

Método da função alvo variável – Uma técnica de otimização determinística que envolve

a otimização de uma função objetivo, iniciando com um pequeno subconjunto de restrições

para otimizar, e finaliza com a função objetivo total, incluindo todas as restrições.

MPI – Message Passing Interface. Protocolo utilizado na paralelização de softwares.

MetaCyc

– Banco de dados de vias metabólicas e reações químicas.

MtRmlA - Glucose-1-fosfato timidilil-transferase de Mycobacterium tuberculosis

ORF – (Open Reading Frame). Forma de leitura para estimar as possíveis seqüências

codificantes de cada gene extraído do genoma.

Pdf (Função Densidade de Probabilidade) – Uma função que especifica a probabilidade

para cada valor possível da característica restrita (por exemplo, a distância entre dois

átomos), dado alguma característica conhecida (por exemplo, uma distância equivalente em

uma estrutura relacionada). Esta é a formulação matemática mais geral de uma restrição

espacial.

PaRmlA – Glucose-1-fosfato timidilil-transferase de Pseudomonas aeruginosa.

PDB – (Protein Data Bank) É uma coleção de estruturas 3D de proteínas determinadas

principalmente por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear. É acessível

em http://www.rcsb.gov/pdb

Potencial de Lennard-Jones – Um termo de energia que é freqüentemente usado para

descrever uma interação entre um par de partículas: E = A/d

– B/d

, onde A e B são

constantes positivas e d é a distância entre as partículas. Após cada modelo gerado pelo

MODELLER este potencial é usado em conjunto com o CHARMM para minimização da

energia do modelo.

Programação dinâmica – Método que busca solução ótima dividindo o problema original

em problemas menores, por isso ideal na utilização em computadores de arquiteturas

paralelas.

Perl – (Practical Extraction and Reporting Language). Linguagem de programação.

RmlA – Glucose-1-fosfato timidilil-transferase

RMSD – Mede a diferença estrutural entre duas estruturas sobrepostas. É definido como:

∑

, onde a soma é executada sobre os N pares de átomos equivalentes, um de cada

estrutura, e

é a distância entre os dois átomos no i-ésimo par.

Restrições estreoquímicas – Estas restrições espaciais estão implicadas pela topologia

covalente da molécula. Elas incluem restrições sobre os comprimentos de ligação, ângulos

diedros, ângulos de ligação, planaridade de anéis e quiralidade de centros quirais.

RDBMS –

Relational Database Management System.

RMN

– Ressonância Magnética Nuclear.

Seqüência Alvo – Seqüência primária de proteína utilizada na modelagem para

determinação de sua estrutura.

Screening virtual – Método que contribui para o processo de descobrimento de novas

drogas. Utiliza biblioteca de ligantes com o objetivo de selecionar novos compostos

candidatos a drogas contra uma determinada proteína utilizando simulações de

docking.

SQL –

System Query Language.

Swiss-Prot – Banco de dados de seqüências primárias.

Threading – Método sensitivo para se detectar relação remota seqüência/estrutura e para

alinhar uma seqüência com uma estrutura.

Template – Estrutura resolvida experimentalmente presente no PDB utilizada como molde

na modelagem comparativa.

Resumo

O seqüenciamento de genomas em larga escala estão nos munindo com várias

informações biológicas sobre centenas de organismos. O entendimento das

diferentes funções de proteínas expressas por genes obtidos nos projetos de

seqüenciamento, nos leva à era pós-genômica, com a caracterização das estruturas

3D de proteínas. A determinação de estruturas de proteínas nem sempre é possível

devido a limitações nas técnicas de cristalografia de raios X e RMN, tornando a

utilização da modelagem molecular comparativa muito útil. O principal interesse no

estudo de vias metabólicas identificadas em genomas de patógenos, é o fato de que

algumas destas vias não estão presentes em humanos, o que as tornam alvos

seletivos para desenho de drogas, diminuindo o impacto das drogas em humanos. O

DBMODELING é um banco de dados relacional, criado para evidenciar a

importância dos métodos de modelagem molecular aplicadas ao genoma do

Mycobacterium tuberculosis. A motivação deste trabalho é o fato de que o M.

tuberculosis é a causa de morte de milhões de pessoas no mundo, assim a

caracterização estrutural de proteínas alvo para propor novas drogas tornou-se

essencial. Há atualmente no banco de dados mais de 260 modelos de proteínas do

genoma do M. tuberculosis e outros genomas de interesse também serão

acrescentados. Este banco de dados contém uma descrição detalhada da reação

catalisada, do gene e da qualidade estrutural de cada proteína, e suas coordenadas

atômicas estão disponíveis para download, podendo ser acessadas em

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools. Este trabalho aumenta a

certeza de que a modelagem comparativa é uma ferramenta útil em bioinformática

estrutural, uma vez que não se tem acesso às estruturas determinadas

experimentalmente, podendo ser valiosa na anotação de seqüências genômicas,

contribuindo para a genômica estrutural e funcional, e simulações de docking

proteína-ligante.

Abstract

The large-scale genome sequencing are providing us with several information

about hundreds of organisms. Understanding of different protein functions expressed

by genes obtained in the sequencing projects, lead us to the post-genomic era, with

characterization of protein 3D structure. The determination of protein structure, is

not always possible, due to limitations in X-ray crystallography and NMR

techniques. This fact makes the utilization of comparative modeling very useful. The

main interest in the study of metabolic pathways is the fact that some of these

pathways are not present in human, which make them selective targets for drug

design, decreasing the impact of drugs in humans. DBMODELING is a relational

database, created to highlight the importance of molecular modeling methods

applied in the

Mycobacterium tuberculosis

genome. The motivation of this work is

the fact that M. tuberculosis is the cause of the deaths of milions of people in the

world, thus the protein target structural characterization to propose new drugs

became essential. There are currently in the database more than 260 protein models

of the M. tuberculosis genome, and other genomes of interest will be added. This

database contains a detailed description of reaction catalized, of gene and structural

quality of each protein, and their atomic coordinates are available to download, can

be accessed at http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools. This work

increase the conviction that comparative modeling is an useful tool in structural

bioinfomatics, once that we have not access to the experimentally structures

determinated, can be valuable in annotating genome sequence, contributing to the

structural and functional genomics, and protein-ligand docking simulations.

1. Introdução

1.1 Genoma do

Mycobacterium tuberculosis

Projetos de genoma estrutural têm como um de seus objetivos finais fornecer

estruturas tridimensionais, determinadas experimentalmente ou por modelagem

molecular comparativa de proteínas, para todas as proteínas passíveis de estudo, que

estão codificadas no genoma. Espera-se que as estruturas das proteínas,

determinadas experimentalmente e os modelos computacionais, produzam avanços

no entendimento da função molecular e no mecanismo de milhares de proteínas

(BRENNER, 2001; TAYLOR, 2002; LIU et al., 2002).

A tuberculose é uma doença infecciosa crônica que vem afligindo a

humanidade há mais de 5 milênios. Seu agente etiológico, o Mycobacterium

tuberculosis, ou bacilo de Koch, é o patógeno que, provavelmente, mais mortes

causou até o momento (ISEMAN, 1994). Nos países mais desenvolvidos, o impacto

da doença sobre a população foi reduzido pelas melhorias radicais nas condições de

vida que ocorreram em meados do século XIX, e tornou-se ainda melhor pela

implementação da quimioterapia efetiva nos últimos 50 anos. Nos países ainda em

desenvolvimento, ao contrário, a tuberculose manteve-se como um sério problema

de saúde pública (KOCHI, 1991).

Apesar da disponibilidade da efetiva quimioterapia de caminho curto (DOTS)

e a vacina Bacilo Calmette-Guérin (BCG), o bacilo da tuberculose continua a

reclamar mais vidas que outros agentes infecciosos (SNIDER et al., 1994).

Recentemente, tem aumentado a incidência da tuberculose nos países em

desenvolvimento (Figura 1), aumentando a emergência generalizada de resistência

às drogas e criando e uma sinergia mortal com o vírus da imunodeficiência humana

(HIV), provocando a morte de milhares de pessoas no mundo. Em 1993, a

gravidade da situação levou a Organização Mundial de Saúde (OMS) a declarar a

tuberculose uma emergência global em uma tentativa de intensificar a consciência

pública e política.

O perfil característico do bacilo inclui um crescimento lento, dormência,

complexo envelope celular, patogênese intracelular e homogeneidade genética

(WHEELER & RATLEDGE, 1994).

Figura 1. Distribuição geográfica das taxas de incidência de tuberculose estimadas pela OMS. No leste d

Europa e África, estão aumentando as mortes após quase 40 anos de declínio. Outro fato importante é

resença da bactéria em níveis alarmantes nos

aíses em desenvolvimento

(

OMS

)

O envelope celular do M. tuberculosis, uma bactéria Gram-positiva, contém

uma camada adicional mais afastada do peptidoglicano que é excepcionalmente rico

em lipídios incomuns, glicolipídios e polissacarídeos (BRENNAN & DRAPER,

1994). Vias biosintéticas originais geradas a partir de componentes da parede

celular tais como ácidos micólicos, fenoltiocerol, arabnogalactano, e vários destes

devem contribuir para a longevidade micobacterial, causando reações inflamatórias

ao hospedeiro.

Com o seqüenciamento genético e a identificação e anotação das ORFs (Open

Reding Frames) do M. tuberculosis (COLE et al., 1998) abre-se uma nova linha de

frente com o advento da bioinformática, na identificação das estruturas 3D das

proteínas codificadas pelos genes seqüenciados. Foram codificadas 3.924 ORFs em

todo o genoma do M. tuberculosis, dentre as quais, podemos identificar alvos

moleculares para desenho de drogas baseado em estrutura, utilizando como seleção

de alvos, vias metabólicas presentes na bactéria, porém ausentes em humanos. Esta

seleção possibilitará (por métodos de modelagem molecular comparativa de

proteínas), realizar simulações de docking contra possíveis inibidores de enzimas

pertencentes às vias específicas selecionadas. A combinação de genômica e

bioinformática tem o potencial para gerar a informação e conhecimento que

possibilitará a concepção e o desenvolvimento de novas terapias e intervenções

necessárias para lidar com esta doença aerotransportada e para elucidar a biologia

incomum deste agente etiológico, M. tuberculosis (COLE et al., 1998). A

combinação das inovações nos campos da biologia estrutural e bioinformática,

fornece uma sinergia para o descobrimento de novos alvos para desenho de drogas.

Com isso, foi formado o TB Structural Genomics Consortium (http://www.doe-

mbi.ucla.edu/TB).

O principal objetivo do consórcio é determinar as estruturas de mais de 400

alvos de drogas do genoma do M. tuberculosis e analisar suas estruturas no contexto

da informação funcional. Os alvos potenciais para drogas foram selecionados

utilizando uma variedade de métodos de bioinformática. Os métodos para

determinação dos alvos incluem perfil filogenético de proteínas e o uso de vias

bioquímicas para selecionar genes relacionados de procariotos essenciais

(GOULDING et al., 2003). Foi realizada a re-anotação completa do genoma do M.

tuberculosis da linhagem H37Rv quatro anos após a primeira submissão (CAMUS

et al., 2002). As informações sobre a nova anotação do genoma foram incorporadas

no banco de dados público TubercuList (http://genolist.pateur.fr/TubercuList). Na

anotação da seqüência original do M. tuberculosis, da linhagem H37Rv, foram

identificados 3.924 genes (COLE et al., 1998) e na re-anotação foram incluídos 82

genes.

A nova anotação genômica do M. tuberculosis incorporou muitas mudanças à

classificação funcional de proteínas preditas. Atualmente, está predita a função para

2058 proteínas (52% do proteoma) e mais de 150 destas proteínas foram

experimentalmente provadas em pesquisa micobacterial. O número de proteínas

hipotéticas conservadas foi mudado de 910 em 1998 para 1051 atualmente (um total

de 376 possíveis proteínas não mostrou similaridade com proteínas conhecidas de

outros organismos e algumas delas devem ser específicas de M. tuberculosis).

Atualmente, mais de 400 proteínas de M. tuberculosis foram detectadas

experimentalmente, a maioria por estudos de proteômica (WELDINGH et al., 1998;

JUNGBLUT et al., 1999; MOLLENKOPF et al., 1999; ROSENKRANDS et al.,

2000; BETTS et al., 2000).

Segundo o relatório anual da World Health Organization de 2001, estima-se

que ocorreram cerca de 8,4 milhões de novos casos de tuberculose no mundo em

1999, o que representa um aumento de cerca de 20% em relação ao ano de 1997.

Este aumento é devido à ocorrência da tuberculose em pacientes co-infectados com

o vírus da AIDS. Outro fator que está relacionado com o aumento de casos de

tuberculose é a emergência de cepas resistentes aos antimicrobianos utilizados para

o seu tratamento. O abandono do tratamento ou a prescrição de regimes

inapropriados para o tratamento da tuberculose resulta na seleção de cepas

resistentes aos fármacos de primeira linha utilizados no seu tratamento.

O principal agente anti-tuberculose entre outros é a Isoniazida, ou hidrazida

do ácido isonicotínico (INH) e é, provavelmente, o mais antigo fármaco sintético

efetivo contra o M. tuberculosis (WHO, 1998). Foi descrita pela primeira vez em

1912 (MEYER & MALLY, 1912), mas só foi reconhecida como potente agente

contra o M. tuberculosis em 1951 (FOX, 1951). Sua concentração inibitória mínima

muito baixa (0,02 – 0,05 mg/ml) indubitavelmente contribui para sua eficácia. Um

outro fator responsável pela sua potência pode ser o fato de que a droga age em

diversos alvos na célula micobacteriana. A inibição da síntese de ácidos micólicos

(WINDER, 1982), enfraquecendo a parede bacteriana, foi uma das primeiras ações

descritas da INH sobre o bacilo causador da tuberculose. Esses ácidos gordurosos e

insaturados de cadeia longa contribuem para a impermeabilidade do envelope

celular e, por serem restritos as micobactérias, configuram um alvo seletivo para os

fármacos (CAMPOS, 1999).

1.2 Mycobacterium tuberculosis multidroga resistente

Pouco depois da introdução da INH no arsenal terapêutico contra a

tuberculose, observou-se que algumas cepas isoladas altamente resistentes a ela não

continham a enzima catalase-peroxidase, e que eram freqüentemente não virulentos

para a cobaia (MIDDLEBROOK et al., 1954). Sabe-se hoje que a toxicidade da INH

ao bacilo resulta de uma reação peroxidativa catalisada pela enzima catalase-

peroxidase, a qual é codificada pelo gene KatG (HEYM et al., 1995; YOUNG,

1994). A ausência desse gene em isodados de M. tuberculosis altamente resistentes a

INH pode ser uma evidência de uma ligação entre a enzima catalase-peroxidase e a

resistência a INH (ZHANG et al., 1992). Uma outra forma de desenvolvimento da

resistência a INH pode se dar por mutações que levem à expressão reduzida do gene

ou à redução da atividade peroxidativa. A tabela 1 traz alguns alvos moleculares

para diagnóstico de resistência do M. tuberculosis.

O M. tuberculosis resistente é um sério problema por dois motivos principais:

1) como há poucos fármacos efetivos disponíveis, uma infecção pelo bacilo

resistente pode levar a uma doença potencialmente intratável; 2) embora a menor

parte dos infectados venha a adoecer (5-10%), a doença é altamente contagiosa.

Portanto, se houver um número elevado de doentes tuberculosos portadores de

germes resistentes a duas ou mais drogas potentes do arsenal terapêutico contra a

doença, a probabilidade desse número aumentar exponencialmente é grande, e

estaremos de frente a um sério problema com poucas possibilidades de solução.

Tabela 1. Alvos moleculares para o diagnóstico de resistência do M. tuberculosis.

Fármaco Gene Produto do gene Freqüência de

mutações associadas à

resistência

Isoniazida

KatG

Catalase-peroxidase 47-58%

InhA

Biosíntese de ácidos graxos 21-28%

mabA

Enzimas EnvM e FabG 21-28%

ahpC

Alquil-hidroperóxido redutase C 10%

Rifampicina

rpoB

Subunidade da RNA polimerase 96-98%

Estreptomicina

RpsL

Proteína ribossômica S12 52-59%

Rrs

RRNA 16S 8-21%

Etambutol

EmbA

- -

EmbB

- -

Bactérias possuem diferentes mecanismos de defesa, provocando resistência a

alguns antibióticos. De um modo geral, esses mecanismos de defesa podem ser

divididos em três grupos: 1) mecanismos de “barreira” (a parede celular tem a

capacidade de variar sua permeabilidade a diferentes compostos) (NIKAIDO, 1994);

2) a degradação ou inativação de enzimas (produzem enzimas que degradam ou

modificam fármacos) (KWON et al., 1995); 3) a modificação do “alvo” do fármaco

(mutações pontuais em genes específicos modificam a especificidade da droga pela

enzima codificada). A resistência aos fármacos usados no tratamento da tuberculose

depende desse terceiro mecanismo de resistência. A tuberculose multidroga

resistente reflete a acumulação de etapas de mutações individuais de diversos genes

independentes (HEYM et al., 1994), e não a aquisição em bloco de resistência a

múltiplas drogas.

Os mecanismos de resistência identificados até o momento são resultantes de

mutações pontuais em genes codificadores das proteínas que são os alvos destes

agentes anti-tuberculose (BASSO & BLANCHARD, 1998; BASSO et al., 1998).

Cepas de M. tuberculosis resistentes às drogas anti-tuberculose de primeira linha

têm sido identificadas globalmente. A estimativa anual da tuberculose no Brasil é de

120.000 novos casos. Um aspecto preocupante da situação brasileira é que taxas

superiores a 45% de pacientes previamente tratados apresentam multi-resistência

(definida como resistente a isoniazida e rifampicina) adquirida, tornando imperiosa a

busca de novos alvos para o desenvolvimento de novas drogas.

Dentre as prioridades para o combate à tuberculose, o desenvolvimento de

novas drogas para substituírem àquelas comprometidas pela resistência é premente

para o desenvolvimento de um tratamento quimioterápico eficaz. O principal

objetivo da quimioterapia é atacar alvos peculiares aos microrganismos como, por

exemplo, vias metabólicas ausentes no organismo humano. Tal fato, teoricamente,

minimizaria o efeito tóxico destas drogas antimicrobianas para a espécie humana.

Sob este aspecto, as enzimas da via do ácido chiquímico representam bons exemplos

da utilidade de tal abordagem aplicada aos constituintes enzimáticos de uma rota

biossintética presente em microrganismos e plantas, e inexistente no organismo

humano.

Um dos principais fatores que pode levar à resistência do M. tuberculosis é o

tratamento irregular. Durante a quimioterapia, ciclos de destruição bacteriana

(durante a administração das drogas) se alternam com ciclos de crescimento bacilar

(quando a droga é suspensa). Em cada um desses ciclos ocorre seleção, favorecendo

os mutantes resistentes em detrimento dos sensíveis. O recrudescimento da

população bacteriana ao tamanho da população inicial, pré-início da quimioterapia,

pode ocorrer com a presença de proporções crescentes de bacilos resistentes ao

início de cada ciclo. Diferentes mecanismos, incluindo o efeito bactericida precoce

das drogas usadas, a “monoterapia” durante a esterilização de populações

bacterianas especiais (bacilos semi-dormentes) e inatividade metabólica da

micobactéria pós-exposição ao fármaco favoreceriam a seleção de mutantes

resistentes.

Diante deste cenário, incluímos política de saúde pública inadequada, o que

provocou ao aumento do número de casos de tuberculose em escala mundial. Para

combater a tuberculose faz-se necessário o desenvolvimento de novas drogas,

preferencialmente usando-se alvos moleculares ausentes em humanos.

1.3 Vias metabólicas

Nas células as reações enzimáticas não ocorrem isoladamente, mas são

organizadas em seqüências de múltiplas etapas denominadas rotas ou vias, nas quais

o produto de uma reação serve como substrato da reação subseqüente. Por sua vez,

diferentes vias se inter-relacionam, formando uma rede integrada e objetiva de

reações químicas, coletivamente denominada metabolismo. É conveniente investigar

o metabolismo examinando suas vias componentes. Cada via é composta de

seqüências multienzimáticas e, cada enzima, por sua vez, pode exibir importantes

características catalíticas ou regulatórias. A figura 2 mostra a via metabólica do

ácido chiquímico, utilizada como alvo potencial para desenho de drogas baseado em

estrutura, devido esta via estar presente em M. tuberculosis, porém ausente em

humanos.

Da seqüência genômica, está claro que o bacilo da tuberculose tem o

potencial de sintetizar todos os aminoácidos essenciais, vitaminas e cofatores de

Figura 2. Via do ácido chiquímico na seqüência de sete passos metabólicos, iniciando no

osfoenolpiruvato e eritrose-4-fosfato até a conversão para corismato. A via é composta de 7 enzimas, as

quais são: 3-deoxi-D-arabino-ácido heptulosonico 7-fosfato Sintase (DAHPS), 3-Desidroquinato Sintase

(DHQS), 3-Desidroquinato Desidratase (DHQD), Chiquimato-5-Desidrogenase (CD), Chiquimato

Quinase (CQ), 5-Enoilpiruvilchiquimato 3-fosfato Sintase (EPSPS) and Corismato Sintase (CS).

enzimas, embora algumas das vias envolvidas devem diferir daquelas estabelecidas

em outras bactérias. O M. tuberculosis pode metabolizar uma variedade de

carboidratos, hidrocarbonetos, álcoois e ácidos carboxílicos (COLE et al., 1998).

Desta forma, a tuberculose ou qualquer outra doença causada por um

microrganismo que contém, por exemplo, a via do ácido chiquímico, poderá em

princípio, ser tratada com inibidores das enzimas da rota do ácido chiquímico que

impossibilitarão a produção do ácido corísmico - precursor chave para a biossíntese

de PABA (ácido p-aminobenzóico, precursor do tetrahidrofolato), ácido p-

hidroxibenzóico (precursor da coenzima Q ou ubiquinona), micobactinas e dos

aminoácidos aromáticos essenciais para a vida do bacilo.

1.4 Alvos para desenho de drogas baseado em estrutura

Uma extraordinária característica do M. tuberculosis que complica muito o

tratamento é a “persistência”, a habilidade do organismo para ir a um estado de

semidormência por muitos anos, fazendo com que durante este tempo mais drogas

tenham sua eficácia limitada (PASCOPELLA et al., 1994). Também, diferentes

variedades de M. tuberculosis mostram diferentes virulências clínicas devido às

variações genéticas no “fator de virulência” de proteínas que estão ainda somente

identificadas parcialmente. Entender a persistência, a reativação de um estado

persistente e a virulência, são os maiores desafios para os quais um entendimento

fundamental do metabolismo do organismo pode ter importância direta para desenho

de drogas baseado em estrutura.

O desenvolvimento de novas drogas deve ser facilitado pela identificação de

genes essenciais para a viabilidade do bacilo, bem como fatores de persistência e

fatores de virulência que contribuem para a patogênese. Outro alvo atrativo para

desenho de drogas envolve produtos de genes de vias metabólicas importantes tal

como a via do ácido chiquímico presente no M. tuberculosis.

O desenho de drogas baseado em estrutura tornou-se uma tecnologia

altamente desenvolvida e utilizada nas maiores empresas farmacêuticas. A

modelagem molecular comparativa ou por homologia é uma chave característica de

um esforço integrado no descobrimento de novas drogas, porque ela permite que

estas informações genômicas sejam utilizadas no desenvolvimento de ligantes alvos

ou na engenharia de especificidade de ligantes (VEERAPANDIAN, 1997).

Uma das mais importantes técnicas utilizadas em conjunto com a modelagem

molecular em biologia estrutural é o docking de um ligante a um receptor, tal como

uma proteína. Se a estrutura do receptor é conhecida, então a aplicação é

essencialmente de um desenho de droga baseado em estrutura. Estes métodos têm

alguns objetivos relacionados, tais como: procurar identificar a localização do sítio

ativo do ligante e talvez a geometria do ligante no sítio ativo. Uma outra meta é a

classificação de uma série de ligantes relacionados em termos de sua afinidade ou

avaliar a energia livre de ligação absoluta tão precisamente quanto possível

(FOSTER, 2002).

Atualmente, modelos comparativos estão sendo usados em conjunto com

screening virtual para identificar novos inibidores. Uma série de trabalhos

demonstra o sucesso no uso de modelos estruturais para auxiliar no desenho racional

de drogas contra parasitas. Modelos comparativos foram usados em simulações de

docking, identificando uma baixa constante de inibição para inibidores não

peptídicos de proteases em malária e Schistosoma (RING et al., 1993).

Adicionalmente, modelos comparativos foram usados para justificar a afinidade de

ligantes pelo sítio de ligação em E. histolytica (QUE et al., 2002). A única maneira

prática de explorar interações proteína-ligante para um número maior de sistemas é

o uso de modelos moleculares de estruturas de proteínas, estabelecendo um limite

mínimo de identidade com o template de 40%, podendo variar de acordo com a

aplicação a que o modelo será submetido (Figura 4). Uma aproximação alternativa,

implementada no programa MODELLER (ŠALI & BLUNDELL, 1993), procura

satisfazer restrições estruturais expressas como função densidade de probabilidade

(f.d.p.), as quais são derivadas de outras proteínas homólogas.

Computadores rápidos e a disponibilidade de computadores configurados

como clusters de custo relativamente baixo tem aumentado a velocidade na qual as

drogas podem ser identificadas e avaliadas in silico. O primeiro ciclo para o desenho

de novas drogas inclui a determinação da estrutura da proteína alvo por um dos três

principais métodos usados para desenho de drogas: cristalografia de raios X, RMN

ou modelagem molecular comparativa de estruturas de proteínas. Uma vez que o

alvo foi identificado, é necessário se obter informações sobre a precisão estrutural.

Todas as estruturas devem ser avaliadas por vários programas para determinar

desvios do comprimento de ligação com relação à geometria ideal, (as quais não

devem ser maiores que 0,015 Ǻ ou 3º para ângulos de ligação. Átomos planares não

devem estar mais que 0,015 Ǻ fora do plano e não deve haver centros quirais

incorretos. Finalmente, no mínimo 90% dos ângulos φ e ψ da cadeia principal

devem cair na região mais favorável do gráfico de Ramachandran) garantindo maior

precisão aos modelos (ANDERSON, 2003).

As estruturas 3D de novas proteínas alvo relevantes terapeuticamente estão se

tornando disponíveis numa razão dramaticamente crescente através da determinação

de estruturas por cristalografia de raios X, RMN ou por modelagem molecular

comparativa. Devido ao crescimento do conhecimento estrutural, os experimentos

de docking estão se tornando essenciais no desenho racional de drogas. Este

interesse é atribuído ao screening virtual a bancos de dados de ligantes por métodos

computacionais levando à identificação de novos alvos terapêuticos.

1.5 Bioinformática estrutural aplicada ao estudo de proteínas alvo

A bioinformática vem sendo utilizada bem antes dos grandes projetos genoma

e das tecnologias que a tornaram uma área tão importante atualmente. A partir da

década de 80, com o aprimoramento das técnicas de seqüenciamento e de novas

tecnologias, o termo bioinformática foi lançado como uma nova área do

conhecimento científico, representando a interação da biologia com a informática.

Esta nova área passou a fazer parte de todos os projetos biológicos como forma de

analisar grandes quantidades de dados, possibilidade de armazenamento em bancos

de dados e apresentação de tais resultados em interfaces acessíveis via web,

tornando a pesquisa mais interativa e dinâmica. Uma definição mais ampla da

bioinformática seria a aplicação de ferramentas de computação para análise, captura

e interpretação de dados biológicos. É uma área interdisciplinar e absorve a ciência

da computação, matemática, biologia, física e medicina (Figura 3) (BAYAT, 2002).

Um dos grandes desafios da bioinformática começa a aparecer na era pós-

genômica, na qual a proteômica se torna um dos principais alvos de estudo

juntamente com o entendimento estrutural e funcional de proteínas.

A pesquisa de proteínas em bioinformática utiliza-se de anotações de

proteínas e bancos de dados de eletroforese bidimensional. Após a separação,

identificação e caracterização de uma proteína, o próximo desafio na bioinformática

é a predição de sua estrutura. Biólogos estruturais usam a bioinformática para

manusear o vasto e complexo conjunto de dados de cristalografia de raios X e RMN

Figura 3. Interação das áreas que têm contribuído para

formação e o desenvolvimento da bioinformática (BAYAT,

2002).

para predizer modelos 3D de moléculas de proteínas por modelagem molecular

comparativa (BURLEY et al., 1999).

O rápido aumento no número de estruturas 3D disponíveis em bancos de

dados como o PDB (Protein Data Bank) (BERMAN et al., 2000), levou à criação de

uma sub-disciplina da bioinformática: a bioinformática estrutural. O principal foco

desta sub-disciplina é a representação, armazenamento, recuperação, análise e

visualização da informação estrutural a níveis atômicos. Assim, a predição de

estruturas 3D de proteínas permanece uma área de grande interesse, sendo que a

principal categoria de predições de estruturas de proteínas tem sido a modelagem

molecular comparativa, baseada na alta homologia de uma seqüência por uma

estrutura conhecida (SÁNCHEZ & ŠALI, 1997).

Os projetos de seqüenciamento de genomas completos têm nos fornecido

uma enorme quantidade de dados, possibilitando a análise em larga escala das

estruturas 3D obtidas através do método de modelagem molecular comparativa

daquelas estruturas não determinadas por cristalografia de raios X e RMN, tal como

o genoma do M. tuberculosis. Contudo, a bioinformática atuando em diversas áreas,

nos dá opções de análise de dados de genômica e proteômica, munindo-nos de

grande quantidade de dados armazenados em bancos de dados públicos, podendo ser

utilizados no cruzamento de dados, obtendo inúmeras informações relevantes ao

avanço em pesquisas biológicas e tecnológicas.

2. Objetivos

O objetivo do presente trabalho foi desenvolver ferramentas computacionais

com o auxílio da computação de alto desempenho, integrando softwares de

modelagem molecular comparativa e de análise de estruturas 3D de proteínas para o

estudo estrutural do genoma completo do M. tuberculosis, disponibilizando os

resultados estruturais em um banco de dados público, o DBMODELING. O banco

de dados contém informações sobre vias metabólicas, enzimas, anotações, genes,

coordenadas atômicas, seqüências primárias e dados sobre as análises e a

modelagem. Todos os modelos foram checados com sofwares de análises químicas

de proteínas e softwares que avaliam a geometria da proteína, garantindo a precisão

com dados apresentados na interface do banco de dados. O DBMODELING pode

ser acessado no

site

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

3. Materiais e Métodos

3.1 Modelagem molecular

A seqüência primária de uma proteína determina sua estrutura tridimensional,

contudo o algoritmo que permita, com precisão absoluta, determinar a estrutura

tridimensional de uma proteína partindo-se de sua seqüência ainda está por ser

determinado. A modelagem molecular comparativa tem o potencial de gerar

modelos confiáveis. A condição necessária é que a semelhança entre a seqüência

designada e as estruturas do modelo sejam detectáveis e que o alinhamento correto

entre elas possa ser construído. Esta aproximação para a modelagem da estrutura é

possível porque uma pequena mudança na seqüência da uma proteína normalmente

resulta em uma pequena mudança em sua estrutura tridimensional (LESK, 2001).

Todas as aproximações baseadas nas restrições para modelagem molecular

comparativa de proteínas, extraem as distâncias e as restrições dos ângulos diedros a

partir do alinhamento da seqüência alvo com as estruturas relacionadas, adicionando

restrições implícitas pela topologia covalente (restrições estereoquímicas) e

calculam o modelo pela minimização das violações de todas as restrições. Desta

forma, as duas principais diferenças entre as várias aproximações estão na derivação

e satisfação das restrições espaciais (ŠALI, 1995). A precisão do método está em

assumir que se há semelhança detectável entre duas seqüências lineares, a

semelhança estrutural pode ser assumida e a função potencial guiará o modelo no

caminho dos templates em direção à estrutura correta. A modelagem molecular

comparativa é composta de quatro passos seqüenciais descritos a seguir (SÁNCHEZ

& ŠALI, 1997).

3.1.1 Procura e seleção de templates

A modelagem inicia-se pela procura de templates em um banco de dados de

estruturas de proteínas (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb), usando-se como parâmetro

de entrada uma seqüência primária de estrutura não determinada experimentalmente

(alvo) para que esta seja alinhada com possíveis seqüências homólogas de estruturas

conhecidas depositadas no PDB (templates). Nesta etapa, foram adquiridos os

bancos de dados de seqüências primárias de proteínas contidas no PDB e o banco de

seqüências primárias de M. tuberculosis

(http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/) para que fossem feitos os

alinhamentos por pares do proteoma do M. tuberculosis com o banco de dados

extraído do PDB.

Uma vez obtida uma lista de templates potenciais usando-se um ou mais

métodos de busca, é necessário selecionar os templates que são apropriados para o

problema de modelagem em particular. Normalmente selecionamos os modelos que

possuem identidade mais elevada, isto é, porcentagem mais alta de resíduos

idênticos e um menor número de gaps no alinhamento. Para a construção de um

complexo proteína-ligante, a escolha do template que contém um ligante semelhante

é provavelmente mais importante que a resolução do modelo. Por outro lado, se o

modelo será usado para analisar a geometria do sítio ativo de uma enzima, é

preferível usarmos um modelo de alta resolução.

3.1.2 Alinhamento template/alvo

Uma vez selecionado o template, um método deve ser utilizado para executar

o alinhamento template/alvo. O alinhamento é um dos principais passos na

modelagem, pois é dele que são extraídas as restrições espaciais para a construção

do modelo. Portanto, usuários de métodos de modelagem molecular comparativa

podem utilizar variadas faixas de identidade, sempre relacionando o modelo gerado

a partir de uma identidade seqüencial com sua utilização. Para seqüências de

proteínas proximamente relacionadas com identidade superior a 40% de identidade

residual, o alinhamento será mais preciso. Regiões de baixa similaridade local de

seqüências, são comuns quando a identidade total da seqüência está abaixo de 40%

(SAQI et al., 1998), podendo o modelo gerado a partir deste alinhamento ser

utilizado para outros fins que não o docking ou a inferência de características

evolutivas comuns. Alinhamentos abaixo de 30% começam a apresentar muitas

falhas com grandes extensões de gaps e erros nos alinhamentos.

No alinhamento executado pelo MODELLER é utilizado o comando

ALIGN2D, o qual é baseado no algoritmo de programação dinâmica, proposto por

Needleman e Wunsch para alinhamento global de seqüências (NEEDLEMAN &

WUNSCH, 1970).

3.1.3 Construção do modelo

Uma vez realizado o alinhamento entre a seqüência do alvo e do template, o

modelo é construído utilizando-se a modelagem molecular comparativa por

satisfação das restrições espaciais implementadas no programa MODELLER (ŠALI

& BLUNDELL, 1993) e usa distância geométrica e técnicas de otimização para

satisfazer as restrições espaciais obtidas do alinhamento. O programa MODELLER

deriva muitas distâncias e restrições de ângulos diedros no alinhamento da seqüência

alvo com o modelo da estrutura 3D. As restrições espaciais na seqüência alvo são

obtidas da análise estatística das relações entre várias características da estrutura da

proteína (pdf). Um banco de dados com 105 famílias incluindo alinhamentos de 416

proteínas com estrutura 3D conhecida foi construído para obter as tabelas

quantificando as relações, tais como distâncias equivalentes entre C

– C

, ou entre

ângulos diedros equivalentes da cadeia principal de duas proteínas relacionadas.

Estas relações são expressas pela distribuição densidade de probabilidade

condicional e podem ser usadas diretamente como restrição espacial. As restrições

derivadas do template para a composição do conjunto de restrições total do modelo,

violando a própria estereoquímica, compõem a função objetivo. Finalmente, o

modelo é obtido pela otimização da função objetivo no espaço cartesiano. Vários

modelos ligeiramente diferentes podem ser calculados variando a estrutura inicial.

Outros fatores como seleção de template e um alinhamento preciso, têm um grande

impacto na construção do modelo e em sua precisão, especialmente para modelos

baseados em uma identidade seqüencial abaixo de 40% (Apêndice A.I).

3.1.4 Avaliação dos modelos

A qualidade do modelo predito determina a informação que pode ser extraída

dele. Assim, estimar a precisão do modelo 3D da proteína é essencial para

interpreta-lo. O modelo pode ser avaliado como um todo bem como em regiões

individuais, com base na similaridade entre as seqüências do template e do alvo,

observando resíduos importantes em regiões da proteína como o sítio ativo e sua

conservação (SÁNCHEZ & ŠALI, 1998). Um requerimento básico para um modelo

é ter uma boa qualidade estereoquímica. Os programas mais utilizados são o

PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1998) e WHATCHECK (HOOFT et al., 1996).

As características de um modelo que são checadas por estes programas incluem

comprimento de ligação, ângulo de ligação, ligação peptídica e planaridade de anéis

da cadeia lateral, quiralidade, ângulos de torção da cadeia principal e cadeia lateral e

choques entre pares de átomos não ligados.

Há também métodos para testar modelos 3D que implicitamente carregam

muitas características espaciais compiladas de estruturas de proteínas a alta

resolução. Estes métodos são baseados nos perfis 3D e potenciais estatísticos de

força (SIPPL, 1990; LUTHY et al., 1992). Os programas que implementam estas

aproximações incluem o VERIFY3D (LUTHY et al., 1992), PROSAII (SIPPL,

1993), HARMONY (TOPHAM et al., 1994) e ANOELA (MELO & FEYTMANS,

1998). Os programas avaliam o ambiente químico de cada resíduo em um modelo

com respeito ao ambiente químico esperado como encontrado em estruturas de raios

X à alta resolução.

3.2 Aplicações da modelagem molecular comparativa

A necessidade da modelagem molecular comparativa de estruturas de

proteínas se encaixa nos mais variados tipos de pesquisa. Por exemplo, modelos

comparativos podem ser úteis em desenhos para testes de hipótese sobre função de

proteínas mutantes (BOISSEL et al., 1993; WU et al., 1999), identificar sítio ativo e

ligações (RING et al., 1993), modelar um substrato específico (XU et al., 1996),

simular docking de proteína-proteína ou proteína-ligante (VAKSER, 1997), facilitar

a substituição molecular na determinação de estruturas de raios X (HOWELL et al.,

1992), refinar modelos baseados em restrições de RMN (MODI et al., 1996) e

confirmar uma relação estrutural remota (GUENTHER et al., 1997; MIWA et al.,

1999).

As aplicações de modelos moleculares determinados por modelagem

molecular comparativa estão diretamente relacionadas à precisão dos modelos com

relação à identidade entre o alvo e o template, estabelecendo uma escala que varia

de acordo com sua identidade e o r.m.s.d. determinado (Figura 4). Alta precisão em

modelos comparativos é baseada na identidade seqüencial acima de 50% com

relação aos seus templates. Tais modelos tendem a ter um r.m.s.d. de

aproximadamente 1 Å para átomos da cadeia principal, o qual é comparável à

precisão de estruturas determinadas por RMN e estruturas obtidas por difração de

raios X a média ou a baixa resolução. Precisão média em modelos comparativos é

baseada em uma identidade de 30-50%. Estes modelos tendem a ter

aproximadamente 90% da cadeia principal modelada com um r.m.s.d. de 1,5 Å. Há

um empacotamento de cadeias laterais mais freqüentes, erros de distorção de core e

modelagem de loop e há ocasionalmente erros nos alinhamentos. Finalmente,

modelos de baixa precisão são aqueles obtidos com identidade inferior a 30%. Os

erros nos alinhamentos aumentam rapidamente quanto menor a identidade e tornam-

se mais significantes, originando erros nos modelos gerados. Assim, quando um

modelo é gerado com um alinhamento insignificante com relação a uma estrutura

conhecida, ele deve ter um enovelamento totalmente incorreto. Outros fatores como

seleção do template e alinhamento preciso normalmente tem um grande impacto na

precisão dos modelos, especialmente para modelos gerados com identidade acima de

40% (PIEPER et al., 2004).

Figura 4. O diagrama acima descreve a precisão e aplicação de modelos estruturais de proteínas.

O eixo vertical indica os diferentes intervalos da aplicabilidade da modelagem molecula

comparativa de estruturas de proteínas, a precisão correspondente dos modelos estruturais e suas

aplicações de acordo com a porcentagem de identidade relacionada ao r.m.s.d. (MARTI-

RENOM et al., 2002)

3.3 Possíveis erros em modelagem comparativa

Com a diminuição da identidade entre a seqüência alvo e o template, os erros

na modelagem aumentam, podendo ser divididos em cinco categorias (SÁNCHEZ

& ŠALI, 1997) (Figura 5). Um caminho informativo para testar métodos de

modelagem de estrutura de proteínas é fornecido pelo EVA-CM (EYRICH et al.,

2001) e LiveBench (BUJNICKI et al., 2001).

a) Erros no empacotamento das cadeias laterais. Como as seqüências divergem, o

empacotamento das cadeias laterais muda a estrutura da proteína. Erros em cadeias

laterais são críticos se ocorrem em regiões que estão envolvidas na função da

proteína, tais como sítios ativos e sítios de interação com ligantes.

b) Distorções e mudanças em regiões corretamente alinhadas. Como uma

conseqüência da divergência de seqüências, há mudanças na conformação da cadeia

principal, mesmo que o enovelamento geral permaneça o mesmo. Portanto, é

possível que em alguns segmentos de um modelo alinhados corretamente, o template

seja localmente diferente do alvo, resultando em erros naquela região. As diferenças

estruturais são algumas vezes não devido a diferenças na seqüência, mas sim uma

conseqüência de artefatos na determinação da estrutura em diferentes ambientes (ex.

empacotamento de subunidades em um cristal). O uso de vários templates pode

minimizar esta variedade de erros (SRINIVASAN & BLUNDELL, 1993;

SÁNCHEZ & ŠALI, 1997).

c) Erros em regiões sem template. Segmentos da seqüência alvo que não têm região

equivalente na estrutura do template (ex. inserções e loops) são as regiões mais

difíceis de modelar. Se a inserção é relativamente curta, menor que 9 resíduos,

alguns métodos podem predizer corretamente a conformação da cadeia principal

(VAN VLIJMEN & KARPLUS, 1997; FISER et al., 2000). As condições para o

sucesso na predição são o alinhamento correto e um ambiente precisamente

modelado em torno da inserção.

d) Erros devido a alinhamentos ruins. A maior fonte de erros em modelagem

molecular comparativa são os alinhamentos ruins, especialmente quando a

identidade seqüencial entre o template e o alvo está abaixo de 30%. Uma forma de

minimizar estes erros é utilizar várias seqüências para construir um alinhamento

múltiplo, atribuindo identidade em regiões da seqüência onde o alinhamento com

apenas um template gerava gaps. (SÁNCHEZ & ŠALI, 1997).

e) Modelos incorretos. Este é um problema potencial quando proteínas

distantemente relacionadas são usadas como templates (< 25% de identidade

seqüencial). Distinguir entre um modelo baseado em um template incorreto e um

modelo baseado em um alinhamento incorreto com um template correto é difícil.

Em ambos os casos, os métodos de avaliação irão predizer um modelo irreal. A

conservação da chave funcional ou estrutural de resíduos na seqüência alvo aumenta

a confiança em um dado enovelamento.

3.4 Modelagem em larga escala do genoma do M. tuberculosis

Devido ao excelente progresso na biologia, existe a necessidade de descrever

e entender a função de muitas proteínas em mais detalhes. Embora funções de

proteínas sejam melhores determinadas experimentalmente (OLIVER, 1996),

algumas vezes podem ser preditas pela comparação da seqüência de uma proteína

com proteínas de funções conhecidas (OLIVER, 1996; KOONIN & MUSHEGIAN,

1996; DUJON, 1996). Isto é possível porque seqüências de proteínas similares

tendem a ter funções similares, embora exceções também ocorram (ORENGO et al.,

1994). O sucesso e a utilidade da assinatura computacional de função de proteínas,

Figura 5. Possíveis erros em modelagem molecular comparativa. a) Erros no empacotamento

das cadeias laterais.

Distorções e mudanças em regiões corretamente alinhadas.

Erros e

regiões sem template. d) Erros devido a alinhamentos ruins. e) Modelos incorretos (Marti-

Renom et a

2002

)

recentemente aumentou dramaticamente, devido ao grande número de projetos de

seqüenciamento de genomas (MIKLOS & RUBIN, 1996), procurando atribuir

estruturas 3D e inferir funções às proteínas identificadas nestes genomas.

Devido à importância do genoma do M. tuberculosis para a saúde pública e

por ser uma doença negligenciada, houve a necessidade de se criar uma ferramenta

computacional automatizada que pudesse, com a utilização da modelagem molecular

comparativa de proteínas, determinar todos os modelos possíveis para este genoma.

Como o genoma de M. tuberculosis é composto de aproximadamente 3.924 ORFs, a

automatização da modelagem foi executada em um cluster Beowulf, com o objetivo

de se minimizar o tempo de busca por templates e da modelagem. Os modelos

depositados no DBMODELING apresentaram uma boa qualidade estereoquímica

(mais de 85% na região mais favorável do gráfico de Ramachandran).

O método de modelagem molecular comparativa de proteínas gera modelos

de estruturas de proteínas mais precisos e detalhados, maximizando sua utilidade em

aplicações tais como interpretação da existência de dados funcionais, desenho de

ligantes e construção de proteínas mutantes para teste de novas hipóteses funcionais

(JOHNSON et al., 1994). O fluxograma apresentado na figura 6 foi implementado

em um cluster Beowulf com sistema operacional UNIX/Linux Conectiva 9.0 e

configuração de hardware composta de 16 nós com Athlon XP 2100+, 1Gb de

RAM, 80Gb HD e placas de rede 3Com de 100 Mbits conectadas a um Switch

3Com SuperStack 3300 10/100 Mbits. O programa Parmodel (UCHÔA et al.,

2004) foi utilizado para distribuir eficientemente as tarefas para todos os nós do

cluster, sem ter que adaptar os programas individuais para execução em paralelo

(http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools/parmodel). Todos os modelos

estão acessíveis no DBMODELING (DA SILVEIRA et al., 2005) (Apêndice B) no

site http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools. Os passos do fluxograma

da figura 6 têm como objetivo, otimizar o tempo e generalizar o processo de

modelagem em larga escala para genomas diversos.

Figura 6. Fluxograma do algoritmo criado para automatizar a modelagem comparativa de estruturas

de proteínas, onde os círculos amarelos representam as etapas de modelagem utilizadas no

MODELLER (ŠALI & BLUNDELL, 1993).

3.5 Busca por templates e algoritmo de alinhamento

Para a busca por estruturas template, descrita no passo I da figura 6, para a

modelagem molecular comparativa das ORFs de M. tuberculosis, foi utilizado o

algoritmo de programação dinâmica para alinhamento de seqüências proposto por

Needleman e Wunsch em 1970 (NEEDLEMAN & WUNSCH, 1970)

(http://emboss.sourceforge.net/download/) (Apêndice A.II). Cada uma das 3924

ORFs foi submetida a um script desenvolvido em Perl, o qual utiliza as seqüências

primárias de todas as estruturas depositadas no PDB (Protein Data Bank) e as

alinham contra cada seqüência do proteôma de M. tuberculosis, extraindo todos os

templates que possuírem identidade residual acima de 30% (limite inferior atribuído

no script para estabelecer relação de homologia mínima entre a seqüência alvo e o

template). Todo o processo de busca e seleção de templates, foi executado

particionando o arquivo de ORFs pelo número de nós do cluster e disparando

processos para iniciar o alinhamento de cada parte do arquivo com todas as

seqüências de estruturas do PDB. Após a realização do alinhamento, o programa

identifica automaticamente a identidade de todos os templates (> 30%), extraindo

apenas o de maior identidade. Posteriormente, outro script é acionado

automaticamente executando o acesso ao site do PDB e baixando a estrutura do

template a ser utilizado. No momento em que o template é baixado, é feita uma

filtragem do arquivo de coordenadas atômicas, excluindo dados desnecessários e

formatando-o para ser utilizado como entrada no programa MODELLER (ŠALI &

BLUNDELL, 1993).

Nesta etapa, após a busca por templates, são geradas as entradas utilizadas no

programa de modelagem molecular comparativa na forma necessária para a

paralelização da modelagem (Figuras 7 e 8), dividindo o arquivo de entrada que

estabelece o número de modelos a ser gerado e implantando uma semente aleatória

em cada arquivo para que os modelos não se repitam ao serem executados em nós

diferentes (Figura 9).

A partir deste passo há a integração com o programa Parmodel, que utilizará

todos os dados gerados inicialmente para executar a modelagem em paralelo em um

cluster Beowulf com 16 nós.

READ_MODEL FILE = ´1HMS.pdb´

SEQUENCE_TO_ALI ALIGN_CODES = ´1HMS´

READ_ALIGNMENT FILE = ´blbp.seq´, ALIGN_CODES = ´blbp´, ADD_SEQUENCE = on

ALIGN2D

WRITE_ALIGNMENT FILE = ´blbp-1HMS.ali´, ALIGNMET_FORMAT = ´PIR´

WRITE_ALIGNMENT FILE = ´blbp-1HMS.pap´, ALIGNMET_FORMAT = ´PAP´

Figura 7. Arquivo de entrada para gerar o alinhamento pelo MODELLER

INCLUDE

SET ALNFILE = ´blbp-1HMS.ali´

SET KNOWNS = ´1HMS´

SET SEQUENCE = ´blbp´

SET STARTING_MODEL = 1

SET ENDING_MODEL = 1000/nº nós

RAND SEED = -1247

CALL ROUTINE = ´model´

Figura 8. Arquivo de entrada da modelagem, indicando o

número de modelos a serem gerados e a semente aleatória.

3.6 Modelagem molecular comparativa usando um cluster Beowulf

A ferramenta desenvolvida para modelagem molecular comparativa em larga

escala só foi possível com a implementação dos processos de modelagem utilizando

a tecnologia de clusters, que integrou a capacidade de gerar dados e analisá-los com

a rapidez necessária ao desenvolvimento da pesquisa. A figura 9 mostra a

arquitetura do cluster Beowulf utilizada no Laboratório de Sistemas Biomoleculares

e uma foto do mesmo no laboratório onde o projeto foi desenvolvido (Figura 10).

A partir do segundo passo do fluxograma da figura 6 para a modelagem em

larga escala de genomas completos, os processos são executados utilizando as

rotinas de modelagem do Parmodel (UCHÔA et al., 2004). Estas rotinas visam

agilizar todo o processo de modelagem molecular e análise de estruturas 3D de

Figura 10. Foto do cluster utilizado para executar a ferrament

desenvolvida para modelagem molecular e análise em larg

escala do genoma do M. tuberculosis.

Figura 9. Arquitetura do cluster mostrando a distribuição dos

nós e a interligação da rede.

proteínas. Esta agilidade é obtida de duas formas: integrar automaticamente todas as

etapas do processo de modelagem molecular para que não haja nenhuma intervenção

do usuário no decorrer deste processo e paralelizar a etapa de modelagem para que

possa se obter uma diminuição significativa no seu tempo de processamento. O

Parmodel está acessível publicamente, utilizando uma interface amigável ao usuário

no site http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools/parmodel.

A paralelização da modelagem molecular comparativa utilizando o

MODELLER, foi realizada utilizando uma biblioteca de linguagem C, o MPI

(Message Passing Interface), que controla a distribuição dos processos de

modelagem pela divisão dos arquivos de entrada do MODELLER no cluster

Beowulf. Isto permite paralelizar a execução do MODELLER e diminuir o tempo de

processamento das rotinas de modelagem. A arquitetura do cluster Beowulf utilizada

no Laboratório de Sistemas Biomoleculares foi inteiramente projetada aos interesses

da bioinformática estrutural, adaptando todos os programas e construindo

ferramentas que tornassem o cluster o mais específico possível para a pesquisa

estrutural de proteínas.

Após a seleção dos templates e a criação das entradas para realizar a

modelagem, é executado o alinhamento template-alvo, do qual é obtido o

alinhamento a ser utilizado no terceiro passo da modelagem como arquivo de

entrada para o MODELLER. Antes de iniciar o passo que executará a construção

dos modelos, um script verifica se há alguma modelagem sendo realizada no

momento. Isto porque, caso esteja sendo realizada alguma modelagem e outra

modelagem for submetida, ocorrerá uma perda no desempenho do programa. Assim,

é verificada a existência da execução de alguma modelagem. Caso haja alguma

modelagem sendo executada, então os parâmetros de entrada necessários à execução

do programa serão gravados em uma fila de espera e os arquivos que o usuário

submeteu permanecerão no diretório que foi criado. Ao término de cada modelagem,

o programa verificará a existência de alguma modelagem nesta fila. Caso não haja

modelagens sendo feitas, o script executará um programa em C implementado com

rotinas MPI, iniciando a execução da modelagem distribuindo o número total de

modelos solicitados pelos 16 nós para o próximo elemento da fila. Para cada

proteína de M. tuberculosis, foi gerado e analisado um total de 1000 modelos,

ampliando o espectro de análise com o objetivo de se obter melhores modelos.

3.7 Softwares de análise estrutural e validação de modelos

Logo que a modelagem é finalizada, a avaliação de cada modelo é feita

automaticamente utilizando programas como: PROCHECK (LASKOWSKI et al.,

1993) (Apêndice A.III), WHATCHECK (HOOFT et al., 1996), VERIFY3D

(BOWIE et al., 1991; LUTHY et al., 1992) (Apêndice A.IV) e X-PLOR

(BRÜNGER, 1992) para avaliarmos o RMSD da geometria ideal de cada proteína

(Apêndice A.V). Algumas das propostas dos programas PROCHECK e

WHATCHECK são (i) determinar erros grosseiros nas estruturas, tais como cadeias

laterais deslocadas, (ii) checar anormalidades locais da estereoquímica e (iii)

produzir critérios para a qualidade estereoquímica global (EU 3-D VALIDATION

NETWORK, 1998). O WHATCHECK (HOOFT et al., 1996) oferece informações

sobre a formação de regiões centrais hidrofóbicas, a acessibilidade de resíduos e

átomos a moléculas de solvente (água), a distribuição espacial de grupos iônicos, a

distribuição das distâncias atômicas e das ligações de hidrogênio da cadeia principal

para cada modelo no banco de dados. Portanto, ele retrata a estereoquímica,

comprimentos de ligações, ângulos diedros, entre outras quantidades na forma de

um relatório gerado no formato “pdf”, descrevendo todas as análises executadas com

a enzima pesquisada e há um link para o PROCHECK com as porcentagens da

região mais favorável até a região não permitida, além da figura do gráfico de

Ramachandran. As características de um modelo que são checadas por estes

programas incluem comprimento de ligação, ângulo de ligação, ligações peptídicas e

planaridade dos anéis das cadeias laterais, quiralidade, ângulos de torção de cadeias

laterais e cadeia principal e choques entre pares de átomos não ligados na estrutura.

O VERIFY3D mede a compatibilidade da estrutura 3D com sua seqüência

primária, usando um perfil 3D. Cada posição do resíduo na estrutura é caracterizada

pelo seu ambiente químico e é representado por uma fileira de 20 números no perfil.

Estes números são as preferências estatísticas (chamadas 3D-1D escores) de cada

um dos 20 aminoácidos para este ambiente químico (MARTI-RENOM et al., 2004).

Os ambientes dos resíduos são definidos por três parâmetros: a área do resíduo que

está no interior da proteína, a fração de área de cadeia lateral que está ocupado por

átomos polares (O e N) e a estrutura secundária local. O link no banco de dados de

M. tuberculosis possibilita gerar um gráfico para a enzima de interesse com a análise

do escore 3D-1D para cada aminoácido, o escore do perfil 3D S para sua seqüência

de aminoácidos e o escore ideal S

ideal

, que é calculado a partir do comprimento da

proteína. Logo, estruturas que possuem erros em seus enovelamentos têm

tipicamente escores menores que 0,45 S

ideal

. Um escore próximo ou acima do S

ideal

indica uma estrutura confiável (LUTHY et al., 1992). Esses softwares de avaliação

química de modelos gerados por modelagem molecular molecular comparativa, nos

dão maior confiabilidade nas estruturas geradas, possibilitando propor simulações de

docking contra bibliotecas de ligantes (screening virtual) com o objetivo de

selecionar alvos terapêuticos para desenho de drogas baseado em estrutura.

3.8 Perl/CGI

A programação e a bioinformática estão relacionadas, tanto na obtenção de

dados, quanto no desenvolvimento de ferramentas que resolvam os problemas e

obstáculos encontrados na pesquisa em desenvolvimento. A elaboração de

ferramentas para acessar bancos de dados e realizar tarefas importantes para a

otimização da modelagem e análise de proteínas, tornou-se possível com a utilização

de programação em linguagem Perl (Practical Extraction and Reporting Language),

a qual é uma linguagem muito utilizada em bioinformática por sua facilidade na

manipulação de strings, conexão a bancos de dados e acesso via web.

Existem inúmeras vantagens em se utilizar esta linguagem, principalmente

devido a sua eficiência, pois é necessário menos tempo para extrair dados e

manipula-los, comparada ao C ou Java. Os dados biológicos são armazenados em

bancos de dados e arquivos de texto enormes. É possível analisar e classificar esses

dados manualmente, mas levaria muito tempo, por isso, cientistas e programadores

desenvolvem ferramentas para automatizar o processo. A Perl, com sua capacidade

altamente desenvolvida para detectar padrões em dados, e especialmente seqüências

de caracteres de texto, é a melhor opção para desenvolvimento dos scripts. A

riqueza dos códigos Perl existentes para a bioinformática, a integração sem

problemas do código com sistemas baseados em Unix, a portabilidade para várias

plataformas e uma comunidade de usuários incrivelmente entusiástica tornam a Perl

a linguagem de scripts preferida para aplicativos de bioinformática.

A Perl é gratuita e já vem incorporada ao Linux quando instalado, além de ser

uma das linguagens de programação que mais favorece a criatividade. Esta

linguagem de programação é muito rica, onde os tipos e as estruturas são simples de

usar e compreender, tendo diversos recursos que enriquecem a linguagem, tais

como: depuradores, perfis, referências cruzadas, compiladores, interpretadores,

bibliotecas e editores direcionados para a sintaxe. Assim, a conexão com bancos de

dados fica facilitada e o desenvolvimento de programas simplificado, mas com

objetividade e utilidade (WALL et al., 2000).

A finalidade de bancos de dados biológicos públicos é permitir que a

comunidade científica compartilhe dados com simplicidade. Nada é mais simples e

direto do que a Web. Portanto, é quase um pré-requisito ao desenvolver um banco

de dados, pensar em como tornar os dados disponíveis na Web. Há muitas

tecnologias que permitem a comunicação entre páginas da Web e bancos de dados.

A mais antiga é denominada programação CGI (Common Gateway Interface). Um

programa ou script CGI é um aplicativo de software que reside em um servidor da

Web. Quando o programa CGI é chamado por um usuário remoto do servidor da

Web, o aplicativo é executado no servidor e, em seguida, passa as informações de

entrada do formulário de volta ao usuário remoto na forma de uma página da Web,

conforme mostrado na figura 11. Os programas CGI são acessados utilizando-se o

protocolo HTTP (Hypertext Transport Protocol), exatamente como as páginas Web

em HTML (Hypertext Marckup Language). Quando o servidor recebe uma

solicitação de HTTP, em vez de apenas exibir o código CGI em seu navegador,

como faria com uma página da Web normal, o servidor executa o programa CGI. A

CGI é uma tecnologia relativamente madura e é suportada por todos os principais

servidores da Web.

Os programas CGI geralmente consistem de algumas seções (Figura 11).

Primeiro há uma seção do programa que coleta entradas do usuário a partir de um

formulário Web, tal como selecionar o banco de dados a ser pesquisado. Isso é

seguido por uma seção do programa que carrega a entrada do usuário em uma

variável e executa algo com base nesta entrada. O programa CGI pode conter o

código completo para fazer o processamento da entrada, mas é mais provável que o

programa formate a entrada apropriadamente e a repasse para um programa

separado residente no servidor, depois colete a saída daquele programa quando a

execução terminar. A função final do programa CGI é retornar a saída do processo

que foi executado no servidor para o usuário, na forma de uma página Web, que

pode conter saída textual ou links para arquivos de resultados disponíveis para

downloads ou ambos.

A figura a seguir mostra um desenho esquemático da integração entre CGI e

o banco de dados, utilizando a linguagem de programação Perl para interação com o

banco de dados criado para o genoma do M. tuberculosis e a forma com a qual o

CGI solicita as informações ao servidor, organizando suas diferentes vias

metabólicas e suas respectivas enzimas.

3.9 Banco de dados MySQL

O banco de dados é uma ferramenta de fundamental importância na

bioinformática, tanto na busca como no armazenamento de informações biológicas.

Há dois tipos de sistemas de gerenciamento de banco de dados: sistemas de

indexação de arquivos simples e DBMSs (Database Management Systems)

Figura 11. Diagrama esquemático de como a programação CGI interage com o banco

de dados de M. tuberculosis, organizando e filtrando os dados devolvidos ao usuário.

relacionais. Optar por um sistema de indexação de arquivos simples ou um sistema

de banco de dados relacional é uma decisão importante que terá implicações de

longo prazo para a capacidade e utilidade do banco de dados. Um banco de dados de

arquivos simples é simplesmente uma coleção ordenada de arquivos semelhantes,

geralmente em conformidade com um formato padrão de conteúdo. Os bancos de

dados de arquivos simples podem ser pesquisados devido à indexação. Um índice

extrai um atributo específico de um arquivo e alinha o valor do atributo no índice

com um nome de arquivo e uma localização.

Os bancos de dados relacionais são apenas uma forma de coletar todas as

informações sobre algo e armazená-las em um computador. Em um banco de dados

de arquivos simples, todas as informações sobre o objeto de estudo são armazenadas

em um grande arquivo de texto estruturado. Em um banco de dados relacional, as

informações são armazenadas em um conjunto de tabelas. Os dados em uma tabela

de banco de dados relacional são organizados em linhas, onde cada linha representa

um registro no banco de dados. Uma linha pode conter várias informações separadas

(campos). Cada campo no banco de dados pode conter uma informação distinta. Não

pode consistir em um conjunto ou lista que possam ser divididos em partes menores.

A função do RDBMS (Relational Database Management System) é fazer conexão

entre tabelas relacionadas, localizando rapidamente os elementos comuns que

estabelecem esses relacionamentos. A rede de tabelas e relacionamentos que

compõe um banco de dados é denominada esquema de banco de dados. Para que um

banco de dados mantenha sua utilidade com o passar do tempo, é melhor

desenvolver o esquema com cuidado antes mesmo de pensar em começar a popular

o banco de dados. O MySQL é um DBMS relacional de médio porte que possibilita

ao usuário criar, manter e gerenciar bancos de dados eletrônicos, além de ser

gratuito e estar disponível para download no site do MySQL

(http://www.mysql.com/download). O banco de dados foi instalado em um sistema

operacional Linux-Conectiva 9.0, em um AthlonXP 2100+ com 80 Gb de HD, 1 Gb

RAM e placa de rede 3Com de 100 Mbits, tendo grande capacidade para

armazenamento de dados e rapidez nos processos de busca e aquisição das

informações.

Desde o advento da World Wide Web, os bancos de dados biológicos se

tornaram uma parte vital da literatura biológica. Saber localiza-los e fazer download

de informações dos repositórios centrais de dados biológicos é atualmente uma

habilidade tão importante para os pesquisadores quanto à pesquisa na literatura

tradicional. A Figura 12 mostra o relacionamento entre as tabelas do banco de dados

de vias metabólicas e enzimas.

3.10 Programas, servidores e links no DBMODELING

Alguns dados como vias metabólicas, foram obtidos de sites confiáveis e de

constante atualização, garantindo a precisão dos dados apresentados no

DBMODELING. A tabela 2 mostra alguns sites de interesse em biologia estrutural

para obtenção e análise de dados utilizados no presente banco de dados. A tabela se

divide em 3 partes, as quais apresentam informações sobre a utilidade, a

caracterização em S ou P (Servidor ou Programa) e o endereço eletrônico,

respectivamente.

Figura 12. O diagrama descreve a relação entidade-relacionamento para as tabelas do banco

de dados DBMODELING. Cada tabela é relacionada a um código (code_pwy, code_enz e

code_gene). Para cada via metabólica selecionada há somente um código code_pwy, o qual

selecionará sua enzima de forma a não cometer redundâncias linkando à tabela de

informaçãoes e resultados sobre cada enzima. O diagrama descreve o relacionamento das

tabelas para o conjunto de dados apresentados na interface web sem redundâncias.

Laboratório de Sistemas Biomoleculares (BMSys)

Grupo S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/node4_english.php

Publicações S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/publications.php

Pesquisas S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/pesquisa/pesquisa_english.php

Ferramentas S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Alinhamento

Needleman-Wunsch P

http://laboheme.df.ibilce.unesp.br/cgi-bin/db_modeling

Construção do modelo

MODELLER P

http://salilab.org/modeller

Avaliação e validação dos modelos

Procheck P

http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck /procheck.html

Verify3D S

http://www.doe-mbi.ucla.edu/Service/Verify_3D

Whatcheck S

http://www.sander.emb.-heidelberg.de/whatcheck

Links a outros bancos de dados e softwares para referência cruzada

KEGG S

http://www.genome.jp/kegg

MetaCyc S

http://biocyc.org

TBdb S

http://www.doe-mbi.ucla.edu/TB

TubercuList S

http://genolist.pasteur.fr/TubercuList

Swiss-Prot S

http://bo.expasy.org

PDB S

http://www.rcsb.org/pdb

ProtGif S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Parmodel S

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools/parmodel

Dowloads

Seqüência primária

em fasta

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Coordenadas

atômicas

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Imagem 3D da

proteína

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Inputs para o

MODELLER

http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools

Todos os programas e servidores apresentados na tabela acima compõem o

DBMODELING, garantindo sua utilidade e sua confiabilidade. A apresentação de

resultados, requer a avaliação por diversos programas para fornecer ao usuário um

Tabela 2. Programas e servidores web usados nos alinhamentos, construção e avaliação dos modelos. A

rimeira coluna indica para onde o link está direcionado ou sua função. A segunda coluna mostra se é

rograma (P) ou aplicativo em servidor (S) e a terceira coluna o endereço web de cada programa e servidor.

grau de confiabilidade maior possível quanto a estrutura 3D que está pesquisando,

dando-lhe não só os resultados obtidos pelos programas mas o significado sobre a

qualidade estrutural do modelo. Alguns softwares são utilizados dinamicamente,

gerando resultados imediatos com relação à proteína de interesse, apresentando via

web relatórios e gráficos das análises dos ambientes químicos das proteínas

(WHATCHECK, VERIFY3D), além das análises dos ângulos φ e ψ estabelecendo a

posição dos ângulos de torção dentro da cadeia protéica e verificando possíveis

choques estereoquímicos entre átomos das cadeias laterais (PROCHECK). Todos os

links no DBMODELING fornecem informações adicionais sobre as seqüências das

proteínas, vias metabólicas, anotações funcionais e informações estruturais sobre

proteínas já resolvidas de M. tuberculosis. Também estão incluídas informações

sobre a qualidade da estrutura (Excelente, Bom e Regular) (Tabela 3), que é

indispensável para a utilização da estrutura em simulações de docking a modelos

obtidos por modelagem molecular comparativa, além da identidade residual e o

RMSD da geometria ideal obtido pelo programa X-PLOR.

Tabela 3. Qualidade dos modelos estruturais usando as análises do gráfico de Ramachandran

Qualidade estrutural dos

modelos

% de resíduos na região mais favorável do gráfico de

Ramachandran

Excelente >95

Bom 90-95

Regular 85-90

* Todos os modelos classificados abaixo de 85% não foram depositados na atual versão deste banco de dados

4. Resultados e Discussão

4.1 Conteúdo de dados no DBMODELING

Com a execução do programa de alinhamento contra a base de dados de

seqüências primárias de estruturas resolvidas depositadas no PDB (BERMAN et al.,

2000; WESTBROOK et al., 2003), selecionamos todas as proteínas possíveis de

serem modeladas por modelagem molecular comparativa, ou seja, todas as proteínas

que apresentaram identidade residual acima de 30% entre o template e o alvo. A

figura 13 representa os dados inseridos no banco de dados de M. tuberculosis, que

estão presentes na atual configuração do banco de dados. Também é apresentando a

quantidade de estruturas e vias metabólicas presentes no banco de dados, além de

dados relacionados à exclusão de modelos devido à baixa qualidade estereoquímica.

O DBMODELING está aumentando o número de estruturas 3D e de vias

metabólicas identificadas, utilizando bancos de dados específicos como PDB

(WESTBROOK et al., 2003), KEGG (OGATA et al., 1999) e MetaCyc (KARP et

al., 2002), respectivamente. As ferramentas construídas para identificação de

templates e modelagem serão utilizadas na atualização estrutural para garantir o

melhor template para cada proteína do banco de dados, além de identificar novas

proteínas devido ao grande volume de estruturas depositadas no PDB. O número de

estruturas neste banco de dados pode ser alterado freqüentemente pelo aumento do

número de estruturas de proteínas de M. tuberculosis que são depositadas no PDB,

as quais são excluídas do banco no momento da atualização.

3924

319

198

284

102

267

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

Número de Proteínas

Estaística de dados disponíveis no DBMODELING

Número de ORFs

Estrutural relacionadas no PDB

Número de estruturas resolvidas disponíveis no PDB

Número de estruturas resolvidas que faziam parte do banco de dados e foram extraídas

Total de estruturas modeladas

Total de estruturas excluídas pela baixa qualidade estéreoquímica

Total de vias metabólicas

Total de modelos estruturais no DBMODELING

Uma estimativa realizada (Figura 14), refletiu o aumento na identificação de

proteínas relacionadas depositadas no PDB, as quais possibilitaram a seleção de

novos templates para novos modelos que serão acrescentados no DBMODELING

assim que passarem pelos processos de modelagem, análise, anotação e verificação

quanto ao fato de suas estruturas estarem ou não resolvidas e depositadas no PDB.

O objetivo do DBMODELING é fornecer acesso a um conjunto de modelos

de M. tuberculosis determinados por modelagem comparativa, de forma

automatizada. Este banco de dados é atualizado freqüentemente para refletir o

Figura 13. Dados estatísticos sobre a modelagem, mostrando a quantidade de enzimas inseridas no

anco de dados, bem como a quantidade de excluídas pela qualidade estereoquímica e as j

resolvidas experimentalmente.

aumento do número de seqüências e estruturas no banco de dados, bem como

melhoras nos métodos, utilização de novos softwares usados na análise dos modelos,

atualização de anotações funcionais e de vias metabólicas e agregar novas

ferramentas de visualização e referências cruzadas para outros bancos de dados.

4.2 Dados para referência sobre estruturas de M. tuberculosis

Há várias proteínas de M. tuberculosis as quais tiveram suas estruturas

determinadas por difração de raios X ou RMN. As coordenadas atômicas destas

proteínas estão disponíveis no M. tuberculosis Structural Genomics Consortium

Figura 14. Gráfico representando a estimativa de dados que serão acrescentados ao

DBMODELING. Em azul é representado o genoma total do M. tuberculosis, em vinho

quantidade de estruturas relacionadas no PDB e em amarelo o número de estruturas resolvidas de

.tuberculosis e depositadas no PDB.

(http://www.doe-mbi.ucla.edu/TB) (TERWILLIGER et al., 2003). A estratégia do

consórcio é determinar as estruturas 3D de proteínas do M. tuberculosis e colocá-las

sob domínio público. Há atualmente 198 estruturas de M. tuberculosis com

coordenadas atômicas depositadas no PDB e no site do consórcio para consultas

sobre os grupos que as determinaram e publicações. O foco do DBMODELING é

disponibilizar a maior quantidade possível de modelos estruturais e suas respectivas

vias metabólicas, podendo utilizar os dados das estruturas resolvidas pelo consórcio

para atualização e talvez como templates para modelagem de novas estruturas. Além

disso, alvos atrativos para desenho de drogas envolvem produtos de genes

pertencentes a vias metabólicas importantes, tais como a via do ácido chiquímico.

Outro importante link para informações funcionais relacionadas ao genoma do M.

tuberculosis é o TubercuList (http://genolist.pasteur.fr/TubercuList) (CAMUS et al.,

2002), também utilizado para atualizações do DBMODELING, devido à

confiabilidade dos dados.

Com a estimativa de aumento do número de estruturas resolvidas de M.

tuberculosis, há a necessidade de se refazer uma busca no DBMODELING com o

objetivo de se identificar modelos tenham sido resolvidos por métodos

experimentais e incluí-los em uma tabela com os cálculos dos valores de RMSD C

para cada estrutura, estimando a precisão, validando protocolos utilizados. A

tabela 4 representa o RMSD de sobreposição C

-C

para as estruturas contidas

anteriormente no DBMODELING, excluídas por terem sido resolvidas

experimentalmente.

Tabela 4. Cálculo do RMSD de sobreposição C

-C

Códigos dos genes

de M.t.

Códigos de acesso

do PDB

Resolução

Cristalográfica (Å)

RMSD C

-C

(Å)

Rv0009 1w74 2.60 0,55

Rv0137c 1nwa 1.50 1,49

Rv0467 1f8m 1.80 0,66

Rv0489 1rii 1.70 1,03

Rv0733 1p4s RMN 0,77

Rv1379 1w30 1.90 1,17

Rv1389 1s4q 2.16 0,73

Rv1484 1enz 2.70 0,80

Rv1542c 1idr 1.90 1,03

Rv1837c 1n8i 2.10 0,96

Rv1886c 1f0p 1.90 1,15

Rv2002 1nff 1.80 1,12

Rv2150c 1rlu 2.08 0,93

Rv2445c 1k44 2.60 0,77

Rv2537c 1h05 1.50 0,55

Rv2539c 1l4u 1.80 0,66

Rv2697c 1mq7 1.95 1,21

Rv2711 1b1b 2.60 0,98

Rv2763c 1dg8 2.00 0,68

Rv2773c 1c3v 2.39 1,13

Rv2965c 1tfu 1.99 0,93

Rv2995c 1w0d 1.65 0,57

Rv3106 1lqt 1.05 1,57

Rv3247c 1g3u 1.95 0,13

Rv3307 1g2o 1.75 1,55

Rv3465 1upi 1.70 0,15

Rv3608c 1eye 1.70 0,44

Rv3803c 1r88 1.71 0,78

Rv3846 1gn4 2.50 0,89

4.3 Acesso e interface do banco de dados

O DBMODELING fornece uma interface com menus amigáveis, uma vez

que todas as informações podem ser impressas em um único passo. Uma pequena

representação da estrutura terciária de cada proteína está incluída para se obter uma

primeira impressão do modelo estrutural (Figura 20). Pode ser feito o download das

coordenadas atômicas no formato PDB e de sua seqüência primária em formato

fasta. O banco de dados pode ser pesquisado por enzimas ou vias metabólicas, como

palavras chave, selecionando a tabela do banco e como opções “AND”, “OR” e

“ONLY ONE KEYWORD”, para refinar a busca (Figura 18). A interface de busca

permite combinar todas estas diferentes descrições para pesquisas mais complexas.

Para cada modelo, o DBMODELING fornece interfaces web, sendo organizadas em

forma de tabelas.

Os campos são definidos com links para a seqüência alvo e informações

complementares no Swiss-Prot (BAIROCH & APWEILER, 1999), para o PDB

(WESTBROOK et al., 2003; ABOLA et al., 1987) através do código do template,

informação estrutural, análises e informações sobre a modelagem, tais como

entradas usadas no MODELLER para cada um dos modelos. O DBMODELING

inclui links para bancos de dados de vias metabólicas como o KEGG (OGATA et

al., 1999) e o MetaCyc (KARP et al., 2002).

Todos os arquivos de entrada para a modelagem utilizando o programa

MODELLER estão disponíveis na página, mostrando o alinhamento e as

porcentagens de identidade e similaridade do alvo com relação ao template. Uma

imagem inicial da proteína é apresentada e direcionada por um link, a um software

de geração de imagens animadas executado pela ferramenta PROTGIF,

desenvolvida no próprio laboratório, disponibilizando diversos recursos para

visualização e animação de proteínas.

A figura 15 nos dá uma visão geral das ferramentas desenvolvidas no

Laboratório de Sistemas Biomoleculares (BMSys)

(http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools), objetivando o

desenvolvimento biotecnológico para auxiliar os projetos em andamento do grupo

de pesquisa e de grupos externos, possuindo acesso público à comunidade científica.

O DBMODELING é um banco de dados que compõe um conjunto de ferramentas

de acesso aberto de interesse estrutural, dedicado ao genoma do M. tuberculosis e de

futuros outros genomas que representem alvos potenciais para desenho de drogas

baseado em estrutura como: Xylella fastidiosa, Plamodium falciparum, etc., os quais

poderão ser selecionados na página oficial do DBMODELING (Figura 16),

promovendo acesso à pesquisa de genomas de interesse restrito a um ou mais grupos

de pesquisa.

Figura 15. Interface de entrada para as ferramentas do grupo do Laboratório de Sistemas Biomoleculares

(BMSys).

Logo após acessar a página de ferramentas e clicar no link de entrada para o

DBMODELING o usuário irá para a interface oficial do banco de dados (Figura 16),

podendo selecionar o organismo para pesquisa ou navegar no site do grupo em

busca das publicações e pesquisas em andamento. Esta página dá ao usuário uma

visão geral sobre os objetivos deste banco de dados e cita a inserção de futuros

genomas completos em seu conteúdo, estabelecendo os mesmos protocolos de

construção e análise de modelos citados no fluxograma da figura 6.

Figura 16. Interface de entrada para o DBMODELING com a opção para selecionar o organismo de interesse

contido no banco de dados e links para as principais publicações envolvidas no desenvolvimento do banco.

Após selecionar o organismo, o usuário terá uma apresentação completa de

todas as vias metabólicas identificadas para os modelos gerados, tendo como

principal ferramenta agregada ao banco, uma busca recursiva de dados específicos

de interesse do pesquisador. Nesta interface (Figura 17), é possível utilizar a

pesquisa dentro do banco de dados, fornecendo como entrada o nome da via

metabólica ou da enzima de interesse, especificar onde a palavra-chave está inserida

(Via metabólica ou Enzima) e selecionar AND, OR ou Only one keyword para se

obter melhor desempenho na busca e filtrar os dados recebidos (Figura 18).

Figura 17. Visualização da interface após a seleção do organismo, relacionando todas as vias metabólicas

identificadas para os modelos gerados com links para suas respectivas enzimas.

O resultado da busca será apresentado ao lado das vias metabólicas, citando a

via relacionada à enzima consultada. A apresentação deve ser feita sem

redundâncias, e estabelecendo links nas enzimas direcionados para os dados

estruturais disponíveis (Figura 19).

Figura 18. Interface de busca por uma via metabólica ou enzima específica, com opções de refinamento d

esquisa a ser feita.

A figura 20 apresenta informações sobre a enzima a qual o usuário selecionou

clicando no link com o nome da enzima. Todos os dados de análise estrutural estão

disponíveis neste site, tais como download da seqüência primária da enzima e das

coordenadas atômicas do modelo, resultados dinâmicos apresentados em tempo real

na página utilizando os softwares VERIFY3D, PROCHECK E WHATCHECK,

entradas de dados para modelagem, resultados das análises para todos os modelos

gerados utilizando um robusto protocolo de modelagem (Figura 21), o método

utilizado para alinhamento e busca por templates, além do mapa de Ramachandran

determinado usando o PROCHECK e dados de RMSD da geometria ideal gerados

com o programa X-PLOR, extraindo parâmetros de comparação estrutural

Figura 19. Links direcionando as enzimas de interesse para as informações estruturais.

(comprimento de ligação, ângulos de ligação, ângulos diedros e ângulos

impróprios).

Links para outros bancos como KEGG, MetaCyc, TBdb, TubercuList, Swiss-

Prot e PDB também estão disponíveis para anotação, verificação estrutural e

atualização, bem como identidade e similaridade entre as seqüências da proteína

alvo e do template, escore do alinhamento global utilizando programação dinâmica,

o nome da enzima, a reação catalisada pela enzima e a cadeia polipeptídica com a

qual o modelo foi gerado.

Figura 20. Dados estruturais da enzima selecionada para pesquisa.

4.4 Precisão dos modelos gerados

Para facilitar a avaliação da qualidade das estruturas foi criado um simples

esquema de classificação para os modelos depositados, como indicado anteriormente

na tabela 3. A precisão da modelagem comparativa de proteínas está relacionada à

porcentagem de identidade na qual o modelo é baseado, estabelecendo uma

correlação entre as similaridades estrutural e seqüencial das duas proteínas (MARTI-

RENOM et al., 2000; SÁNCHEZ & ŠALI, 1998; KOEHL & LEVITT, 1999).

Todos os modelos no banco de dados foram construídos usando alinhamentos que

apresentaram uma identidade maior que 30%, a qual gerou modelos com média e

alta precisão.

Figura 21. Análise dos resultados de uma proteína alvo para os 1000 modelos gerados,

selecionando aquele que obtiver 85% ou mais de resíduos na região mais favorável do gráfico de

Ramachandran. A sexta e a sétima coluna representa o Fator-G e a função objetiva obtidos d

modelagem, respectivamente.

Como descrito anteriormente, o principal objetivo deste banco de dados é

fornecer modelos estruturais para serem usados em simulações de docking e desenho

de drogas baseado em estruturas. Sendo a precisão dos modelos altamente

dependente da identidade entre as seqüências do alvo e do template, é recomendado

fortemente que qualquer simulação de docking seja focada em modelos estruturais

os quais apresentarem maior identidade possível e forem classificados como sendo

de excelente qualidade estereoquímica. A figura 4 citada anteriormente, descreve

uma escala para utilização de modelos comparativos de acordo com sua identidade

com o template e a melhora gradativa no r.m.s.d. C

-C

entre a seqüência alvo e o

template de acordo com o aumento da identidade. O histograma da figura 22 mostra

a freqüência dos dados obtidos das estruturas modeladas com relação à região mais

favorável do gráfico de Ramachandran, com base nos intervalos da tabela 3.

A tabela 5 nos dá uma visão estatística geral sobre a qualidade estrutural dos

modelos presentes no banco de dados com relação à qualidade estereoquímica,

apresentando os intervalos de qualidade, as freqüências absoluta e relativa, a

porcentagem de ocorrência e cada um dos intervalos e a média para todas as

estruturas.

Tabela 5. Dados estatísticos para a região mais favorável do gráfico de Ramachandran.

Intervalos (%) Freqüência

Absoluta

Freqüência

Relativa

Porcentagem

(%)

Porcentagem

Média dos

Valores (%)

Excelente (> 95)

83 0,27 27,0 96,6

Bom (90-95)

193 0,63 63,0 92,9

Regular (85-90)

29 0,10 10,0 88,6

Total

305 1,00 100,0 93,5

Figura 22. Histograma representando as regiões mais favoráveis do gráfico

de Ramachandran para todas as estruturas do banco de dados geradas com o

rograma Procheck.

Dados estatísticos gerados a partir do RMSD C

– C

de sobreposição das

estruturas modeladas e que posteriormente foram resolvidas experimentalmente por

cristalografia de raios X ou RMN, mostraram uma alta concordância entre dados

teóricos e experimentais. Tal concordância é expressa pelo gráfico da figura 23,

mostrando a freqüência de medidas de RMSD para 29 estruturas presentes no

DBMODELING que foram posteriormente resolvidas, cuja média é de 0,88 Å.

Outro dado de extrema importância que corrobora a precisão dos modelos

presentes no banco de dados é a dispersão dos dados estimados pelo programa

Procheck (porcentagem total de resíduos na região mais favorável no gráfico de

Ramachandran) para cada estrutura com relação aos dados de RMSD da geometria

Figura 23. Histograma mostrando a freqüência de proteínas com relação aos

intervalos dos valores de RMSD de sobreposição C

– C

ideal (Ângulos de ligação) obtidos pelo programa X-PLOR. Os dados apresentados

pelo gráfico de dispersão da figura 24 mostram uma evidência que relaciona a alta

qualidade estereoquímica aos baixos valores dos ângulos de ligação com relação à

geometria ideal. Isto é observado pela inclinação da reta de tendência de dispersão

dos dados, ratificando os métodos de análise e o protocolo utilizado na modelagem

das proteínas no DBMODELING.

Figura 24. Gráfico de dispersão dos dados do Procheck e RMSD da geometria ideal com relação

todas as estruturas de proteínas contidas no DBMODELING. A inclinação da reta nos remete a cre

em uma tendência importante, que é o decréscimo dos desvios dos ângulos de ligação da cadei

rincipal com o aumento do número de resíduos na região mais favorável do gráfico de

Ramachandran, mostrando a importância e precisão dos métodos utilizados.

4.5 Análises realizadas para uma estrutura contida no DBMODELING

Para ilustrar a aplicação do DBMODELING no estudo estrutural de proteínas

alvo para desenho de drogas antituberculose, discutiremos o modelo da glucose-1-

fosfato timidilil-transferase de M. tuberculosis (MtRmlA), a qual é a primeira

enzima na via biossintética da dTDP-L-rhamnose.

Após a seleção da enzima MtRmlA, é apresentado na página do banco de

dados a imagem da proteína e uma relação de dados de análises mostrados nas

tabelas 6 e 7. O primeiro passo é verificar a precisão do modelo selecionado no

DBMODELING, observando a identidade, a qualidade estereoquímica, o perfil 3D

da enzima, o RMSD C

– C

e o RMSD da geometria ideal.

A síntese da desoxi-timidina di-fosfato (dTDP)-L-rhamnose, um importante

componente da parede celular de muitos microorganismos, é um alvo para

intervenção terapêutica. A RmlA é inibida pela dTDP-L-rhamnose, regulando a

produção de L-rhamnose em bactérias (BLANKENFELDT et al., 2000). Devido a

sua importância, a RmlA é um alvo potencial para drogas principalmente por ser

uma proteína envolvida na síntese da parede celular de micobactérias, e por seu

produto enzimático, dTDP-Glc, não ser encontrado em humanos (MA et al., 1997).

A L-rhamnose é derivada de uma base de glucose em quatro passos, iniciando

com a glucose-1-fosfato (G-1-P) e desoxi-timidina tri-fosfato (dTTP), resultando na

desoxi-timidina di-fosfato (dTDP)-L-rhamnose. As enzimas que catalisam a

conversão são glucose-1-fosfato timidilil-transferase (RmlA, E.C. 2.7.7.24), dTDP-

D-glucose 4,6-desidratase (RmlB), dTDP-6-desoxi-D-xylo-4-hexulose 3,5-

epimerase (RmlC) e dTDP-6-desoxi-L-lyxo-4-hexulose redutase (RmlD).

Na reação catalisada pela RmlA, a enzima combina dTTP com G-1-P para

produzir dTDP-D-glucose e pirofosfato (Figura 25). A reação é efetivamente

tranferir desoxi-timidina mono-fosfato (dTMP) para G-1-P. Pelo fato de não estar

presente no organismo humano, a RmlA torna-se um candidato altamente atrativo na

busca de inibidores contra a biossíntese da L-rhamnose.

4.5.1 Alinhamento das seqüências primárias e qualidade dos modelos

O alinhamento da MtRmlA foi realizado contra a cadeia A da enzima RmlA

isolada de Pseudomonas aeruginosa (PaRmlA) selecionada como template (Código

de acesso no PDB: 1FXO) (BLANKENFELDT et al., 2000) e resolvida a 1,66 Å de

resolução. O alinhamento entre as seqüências primárias da MtRmlA e da PaRmlA

Figura 25. Reação catalisada pela Glucose-1-fosfato timidilil-transferase (RmlA)

(Figura 26) apresenta 60,1% de identidade e 74,7% de similaridade, indicando que a

enzima PaRmlA é um template que irá gerar modelos de alta precisão. A qualidade

estereoquímica do modelo da MtRmlA foi analisada pelo programa PROCHECK

(Tabela 6) e apresentados na página de informações do DBMODELING mostrado

na figura 27, juntamente com o gráfico de Ramachandran, dados como RMSD da

geometria ideal e a média do G-factor. A identidade de 60,1% pertence a uma faixa

de alta precisão para modelos comparativos, e em conjunto com a excelente

qualidade estereoquímica e o baixo RMSD C

– C

, com o valor de 0,151 Å, torna o

modelo ideal para utilização em simulações de docking.

Figura 26. Alinhamento das seqüências de aminoácidos da MtRmlA e da PaRmlA

Marcados com asterisco

estão os resíduos idênticos, apresentando apenas quatro gaps em toda a extensão da seqüência e um

identidade de 60,1% utilizando o algoritmo de programação dinâmica para alinhamento de seqüências

roposto po

Needleman e Wunsch em 1970 (Needleman & Wunsch, 1970).

O modelo da estrutura de MtRmlA (Figura 28A) foi avaliado ainda pelo

VERIFY 3D para verificar a confiabilidade na compatibilidade seqüência/estrutura e

estes valores indicam que a estrutura do modelo final tem compatibilidade entre a

seqüência primária do modelo e a estrutura 3D construída, pois os valores gerados

para o modelo final ficaram acima do limite de 0,45 S

Ideal

(Tabela 6). A figura 29

descreve os resultados do VERIFY 3D dinamicamente na interface web do banco de

dados para cada enzima solicitada.

As estruturas do modelo e do template foram sobrepostas, considerando

somente a sobreposição C

– C

com o auxílio do programa LSQKAB do pacote

CCP4 (COLLABORATIVE COMPUTATIONAL PROJECT Nº 4, 1994). Com a

Figura 27. Gráfico de Ramachandran da modelagem da enzima MtRmlA da via metabólica da biosíntese do

corismato. Na região mais favorável em vermelho concentram-se 97,3% dos resíduos e na região favorável

apenas 2,7%, não apresentando resíduos nas regiões desfavoráveis.

sobreposição é possível verificar se há possíveis alterações no posicionamento das

cadeias laterais dos resíduos ou se há alguma alteração na conformação da estrutura

da proteína, além de determinar o RMSD da sobreposição (Tabela 7).

Figura 28

. A) estrutura 3D da enzima Glucose-1-fosfato timidilil-transferase de M. tubercuolsis (Rv0334)

e da estrutura 3D da enzima Glucose-1-fosfato timidilil-transferase de P. aeruginosa em B), pertencentes

à via biossintética do dTDP-rhamnose.

Ângulos de

Ligação (°)

1,843

2,232

RMSD da geometria ideal

Comprimento de

Ligação (Å)

0,021

0,019

Região não

permitida

(%)

0,4

Região

generosamente

permitida (%)

0,0

Região

permitida (%)

7,3

2,5

PROCHECK

Região mais

favorável (%)

92,3

97,1

Escore

ideal

0,93 IS

1,01 IS

Escore

Ideal

133,24

131,40

3D Profile

Escore

Total

123,34

133,08

Enzima

1FXO_A

RV0334

Total

-0,03 (0,06)

Geometria

Covalente

-0,19 (0,17)

G-Factor

Ângulos de

Torção

0,06 (-0,01)

Gene

rfbA

Nº de

aminoácidos

288 (292)

Similaridade (%)

74,7

Identidade (%)

60,1

Template

(código de

acesso no PDB)

1FXO_A

Enzima

RV0334

Escore Total: é a soma dos escores 3D-1D (preferências estatísticas) de cada resíduo presente na proteína.

Escore Ideal: S

ideal

= exp(-0.83+1.008 x ln(L)); onde L é o número de aminoácidos.

Escore S

ideal

: é a compatibilidade da seqüência com sua estrutura 3D. Este escore é obtido pela divisão do

Escore Total pelo Escore Ideal (Escore Total / Escore Ideal). Escore S

ideal

deve estar acima de 0.45S

ideal

Idealmente, os escores devem estar acima de – 0.5. Os valores abaixo de –1.0 devem ser investigados.

* Entre parêntesis estão os valores obtidos para a estrutura 3D do template.

Tabela 7. Dados gerais apresentados no banco de dados sobre a o modelo e o template selecionado para análises.

Tabela 6. Análises da estrutura do template e do modelo.

Após a sobreposição C

-C

, o programa também gera um arquivo de

coordenadas atômicas da sobreposição. Este arquivo de coordenadas atômicas pode

ser utilizado como entrada no programa MolMol (KORADI et al., 1996) em

conjunto com o modelo obtido para gerar imagens, visualizar e analisar estas

estruturas com base em sua sobreposição (Figura 30).

Figura 29. Gráfico gerado pelo programa VERIFY 3D da enzima MtRmlA, onde o eixo

horizontal corresponde ao número de aminoácidos da seqüência e o eixo vertical ao escore total

3D-1D para cada aminoácido.

Contudo, a utilização de modelos estruturais de proteínas em simulações de

docking contra possíveis inibidores, torna-se mais confiável com análises do

ambiente químico das estruturas e conservação das características estruturais

observadas com as sobreposições C

-C

e da geometria ideal. Um banco de dados de

estruturas de proteínas obtidas por modelagem molecular comparativa de alta

qualidade, utilizando vias metabólicas como objeto de seleção de proteínas alvo para

desenho de drogas, é sem dúvida um grande passo no desenvolvimento de novos

fármacos e terapias com drogas menos agressivas à pacientes acometidos com

Figura 30. Sobreposição do modelo da MtRmlA (Rv0334) em azul com o template PaRmlA (código

de acesso do PDB: 1FXO_A) em amarelo, mostrando as diferenças conformacionais entre as

estruturas e a localização do N-terminal e C-terminal. As faixas de gaps apresentadas no alinhamento

estão re

resentas em verde.

patógenos como o M. tuberculosis, o qual estabelece seletividade a determinadas

drogas.

5. Conclusões

A modelagem molecular comparativa de proteínas em larga escala, na qual

bancos de dados inteiros de seqüências ou genomas completos são usados como

entrada em algoritmos de modelagem automatizada, tem sido utilizado por diversos

grupos de pesquisa em bioinformática estrutural. Pelo uso de poderosos sistemas de

computadores com múltiplos processadores, estes esforços têm permitido a criação

de grandes bancos de dados de modelos de proteínas determinadas por modelagem

molecular comparativa. O DBMODELING tem acesso público aos dados estruturais

e às publicações. Este estudo de proteínas alvo do genoma do M. tuberculosis

enfatiza que a modelagem molecular é uma ferramenta de uso intensivo em biologia

estrutural e que ela pode ser muito valiosa na anotação de seqüências de genomas e

contribuir para a genômica estrutural e funcional. Além do mais, a sobreposição de

modelos estruturais presentes no DBMODELING mostrou estar de acordo com as

estruturas cristalográficas usadas como templates, validando o protocolo de

modelagem e as análises realizadas.

A disponibilidade de modelos precisos tem aplicação em problemas

biologicamente significantes tais como especificidade de substratos e ligantes e

áreas como desenho de drogas. O desenho de drogas baseado em estrutura tornou-se

uma tecnologia altamente desenvolvida que está em uso ativo nas maiores empresas

farmacêuticas do mundo. Modelos moleculares de proteínas que são alvos

preferenciais para desenho de drogas têm sido utilizados contra bases de dados de

ligantes, com o objetivo de estimar sua afinidade usando screening virtual e

simulações de docking, além de avaliar a energia livre de ligação absoluta da

interação proteína-ligante tão precisamente quanto possível.

A utilização destes modelos implica em grau de precisão, no qual a

identidade, o r.m.s.d., as análises de ambiente químico da proteína são de extrema

importância, tendo que obedecer a alguns parâmetros de precisão (Figura 4 e Tabela

3). Tais critérios foram estabelecidos na seleção dos modelos e inseridos no

DBMODELING para fornecer ao usuário modelos precisos para uso em simulações

de docking e identificação de alvos terapêuticos.

O DBMODELING está acessível no site do Laboratório de Sistemas

Biomoleculares (BMSys) em http://www.biocristalografia.df.ibilce.unesp.br/tools.

6. Desenvolvimentos Futuros

Posteriormente, o DBMODELING aumentará a quantidade de organismos e

ferramentas de análise da qualidade estrutural para refletir a importância do estudo

de proteínas pertencentes a vias metabólicas específicas como alvos potenciais para

desenho e seleção de drogas tais como as enzimas da via metabólica do ácido

chiquímico e outros alvos potenciais.

O desenvolvimento de ferramentas é constante e dinâmico, podendo no futuro

ser agregadas ao banco de dados ferramentas de docking e de análise proteína-

ligante para proteínas selecionadas no DBMODELING, além de dados químicos das

reações catalisadas, integração de novos bancos de dados para referências cruzadas e

plugins para visualização 3D animada da proteína em tempo real. O potencial futuro

deste banco de dados tem importância relevante para a pesquisa estrutural de

proteínas e vias metabólica de diversos genomas de interesse biotecnológico e

farmacêutico.

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APÊNDICE A – Descrição dos softwares utilizados

I. MODELAGEM MOLECULAR

A modelagem molecular comparativa ou por homologia constrói um modelo

tridimensional para uma proteína desconhecida baseada em uma ou mais proteínas

de estruturas conhecidas relacionadas (templates).

O método consiste de três etapas: 1) alinhamento da seqüência alvo com a

seqüência do template e segmentos relacionados; 2) extração das restrições espaciais

das seqüências usando o alinhamento; e 3) satisfação de restrições para obter um

modelo tridimensional (figura 31).

Figura 31. Passos para construção de um modelo utilizando modelage

comparativa por satisfação de restrições espaciais.

As restrições espaciais da seqüência a ser modelada são obtidas de análises

estatísticas de relações entre várias características de estrutura protéica. Estas

relações foram descritas como uma função densidade de probabilidade condicional

(pdf) P(f|I) para a característica da restrição espacial f, dado diversas variáveis I que

foram encontradas para as características a serem preditas. Há três tipos de

restrições, depende da origem e da natureza da informação I (ŠALI & BLUNDELL,

1993; FISER et al., 2002).

No primeiro tipo, as restrições são obtidas para aqueles resíduos do alvo que

são alinhados com os resíduos do molde. Esta homologia é derivada das restrições

limitada às distâncias entre os átomos da cadeia principal e cadeia lateral, bem como

os ângulos diedros da cadeia principal (Φ, Ψ e Ω) e os ângulos diedros da cadeia

lateral (χ

). Estas restrições foram obtidas de uma análise estatística de 105 famílias

alinhadas que incluem 416 proteínas definidas estruturalmente (ŠALI &

OVERINGTON, 1994). Por exemplo, uma restrição numa certa distância entre dois

Cα-Cα equivalentes em duas estruturas de proteína relacionadas é bem descrita por

uma soma pesada de duas funções Gaussianas que correspondem às duas distâncias

do molde, respectivamente (ŠALI & BLUNDELL, 1993; FISER et al., 2002).

A segunda classe de restrições reflete as preferências estatísticas extraídas das

estruturas de proteínas conhecidas em geral e são relacionadas aos potenciais

estatísticos de força média (FISER et al., 2002). As restrições dependem somente

dos tipos restritos de átomos ou resíduos e não da estrutura do molde. Estas

restrições são aplicadas à cadeia principal e aos ângulos diedros da cadeia lateral dos

100

resíduos alvos que não são alinhados com os resíduos do molde e para as distâncias

entre todos os pares de átomos não ligados. São usados porque foram encontrados

para resultar em modelos mais exatos do que os termos correspondentes do campo

de força molecular (FISER et al., 2000).

O terceiro tipo de restrição é obtido a partir do campo de força molecular do

CHARMM-22 (MACKERELL et al., 1998) e inclui restrições de ligações químicas.

Estas restrições de forças moleculares reforçam estereoquimicamente o modelo

correto. Depois que todas as pdfs são calculadas, seus logarítmos são somados para

obter uma função objetiva que dependa do modelo e dê sua probabilidade.

Finalmente, o modelo que contem todos os átomos não hidrogenados é calculado

otimizando a função objetiva no espaço cartesiano (Figura 32). A otimização é

realizada pelo método da função alvo variável que emprega gradientes conjugados e

a mecânica molecular com simulated annealing (ŠALI & BLUNDELL, 1993;

FISER et al., 2002).

Figura 32. Mudança conformacional pela minimização da função

objet

vo.

101

A probabilidade finita atual de um evento

xxx

≤

é obtida pela

integração de p:

∫

=<≤

)()(

dxxpxxxp (1)

Uma pdf útil para restringir certa característica x pode ser escrita como:

p(x/a,b,...,c) (2)

Isto é uma pdf condicional que nos dá a densidade de probabilidade para x,

quando a,b,...,c são conhecidos. Isso pode ser visto como uma pdf para x que

também depende dos valores de outras variáveis.

Para que uma pdf seja útil na modelagem, todas as características associadas

(x/a,b,...,c) exceto x devem ser conhecidas no momento da predição. Além disso, x

deve ser uma característica espacial no momento da predição. A característica

conhecida mais importante é aquela do mesmo tipo de x e associada com posições

equivalentes nas estruturas conhecidas relacionadas.

Após a determinação das pdfs individuais baseadas nas restrições espaciais, é

formada a pdf molecular a partir do produto das pdfs características, onde f

representa as características individuais. A pdf molecular deve fornecer uma

probabilidade de ocorrência de alguma destas características simultaneamente.

Então o modelo para a estrutura tridimensional desconhecido poderá corresponder

ao máximo da pdf molecular.

102

)(

fpP

∏

Sendo assim, maximizando a função P pode-se encontrar o modelo mais

provável para a estrutura 3D da seqüência, dado seu alinhamento com as estruturas

conhecidas.

Finalmente, o modelo é obtido pela otimização da função objetiva, em um

espaço cartesiano. Diversos modelos ligeiramente diferentes podem ser calculados,

variando a estrutura inicial, e a variabilidade entre estes modelos pode ser usada para

estimar a baixa ligação sobre os erros em regiões correspondentes do enovelamento.

Logo, a função que é realmente otimizada é uma transformação da pdf

molecular de P:

)ln(

−

onde todas as características são expressas em termos de coordenadas atômicas no

espaço cartesiano. A função

F é chamada de função objetivo. O mesmo conjunto de

coordenadas cartesianas que maximiza

P também minimiza F, pelo fato de que se

substitui a multiplicação de termos em

P pela adição de termos em F, o que reduz o

problema de ponto flutuante.

A saída é um modelo 3D para a seqüência alvo contendo todas as cadeias

principais e cadeias laterais dos átomos sem o hidrogênio. Além da construção do

modelo o MODELLER (ŠALI & BLUNDELL, 1993) pode executar tarefas

auxiliares adicionais, incluindo um alinhamento de duas seqüências de proteínas ou

de seus perfis, alinhamento múltiplo de seqüências e/ou de estruturas de proteínas,

103

cálculo de árvores filogenéticas, e modelagem de novo de alças nas estruturas de

proteínas (JACOBSON & ŠALI, 2004).

II. ALINHAMENTO (NEEDLEMAN-WUNSCH)

Needleman e Wunsch conceituaram o problema de alinhamento como sendo

um problema de programação dinâmica (NEEDLEMAN & WUNSCH, 1970).

Conhecido por algum tempo como algoritmo heurístico de homologias, a

importância do método proposto por Needleman e Wunsch é que este método foi o

primeiro a introduzir a noção de uma matriz de percurso – idéia central na versão

moderna do algoritmo de alinhamento global de seqüências por programação

dinâmica.

O algoritmo de programação dinâmica é um algoritmo geral para otimização

de problemas. É também um algoritmo fundamental para o entendimento dos

conceitos de alinhamento de seqüências. A figura 33 ilustra o princípio do algoritmo

de programação dinâmica. As duas strings a serem comparadas são colocadas nos

eixos horizontal e vertical da matriz, a qual foi chamada de matriz caminho. Sem

mudanças na ordem das letras, o alinhamento é feito da esquerda para a direita em

ambas as strings. Obviamente, há muitos caminhos alternativos e o problema de

encontrar o alinhamento de seqüências ótimo torna-se equivalente a encontrar o

caminho ótimo na matriz caminho. A estrutura em árvore mostrada na figura 33b é

uma ilustração de todos os possíveis caminhos, iniciando no canto superior esquerdo

da matriz caminho e resultando em um leque de três vias em cada nó. Este algoritmo

104

apresenta como problema importante o fato de o número de operações a realizar

crescer como produto do comprimento das duas seqüências a serem alinhadas.

Assim, o problema do alinhamento de seqüências é um típico problema de

otimização combinatorial em computação.

O alinhamento de seqüências requer encontrar a melhor solução entre todas

as possibilidades de acordo com um critério dado, ao invés de encontrar qualquer

uma das muitas soluções como em resolver um quebra-cabeças. Um algoritmo de

programação dinâmica encontra uma boa solução dividindo o problema original em

menores problemas e solucionando-os depois, tornando-se um algoritmo ideal para

se usar em paralelização computacional, pois não existe dependência seqüencial. O

Figura 33. Alinhamento de seqüências por algoritmo de programação dinâmica. O algoritmo

envolve a busca pelo caminho ótimo na matriz caminho a), o qual é equivalente a buscar um

solução ótima na árvore de busca b).

105

objetivo é maximizar a pontuação geral para o alinhamento. Para isso, o número de

pares de resíduos de alta pontuação deve ser maximizado e o número de espaços e

pares de baixa pontuação deve ser minimizado. Contudo, a beleza do algoritmo de

programação dinâmica é que mais ramos são sistematicamente cortados de acordo

com a função escore. Devido o algoritmo avaliar eficientemente todas as

possibilidades, o problema do alinhamento de seqüência por pares pode ser

resolvido rigorosamente.

O alinhamento usado para identificar os templates e gerar os modelos foi o

alinhamento global, o qual inclui todos os caracteres de cada uma das duas

seqüências que estão sendo comparadas; o alinhamento ótimo é aquele com o mais

alto escore possível. O alinhamento global é útil para comparar duas seqüências

homólogas. Este alinhamento possui dependência quadrática, ou seja, para duas

seqüências de comprimentos n e m, o tempo gasto na execução do alinhamento é

proporcional a n*m.

O alinhamento global considera a seqüência completa de bases ou

aminoácidos. Nesse tipo de alinhamento, as penalidades tanto para os espaços de

abertura como para os espaços na extensão são bastante altos. Portanto, formações

de blocos durante os alinhamentos são inexistentes e o que se observa são pequenas

regiões ou alguns poucos espaços (gaps) espalhados ao longo da seqüência,

preservando assim, o maior número possível de resíduos alinhados. Esse tipo de

alinhamento é apropriado para seqüências que possuem grande similaridade em todo

106

seu comprimento, já que o alinhamento é otimizado em toda sua extensão,

favorecendo sua utilização em modelagem molecular comparativa de proteínas.

A função escore a ser otimizada é a soma dos pesos de cada posição do

alinhamento. Os pesos são definidos pela matriz de substituição entre os 20

aminoácidos e também pela penalidade do espaço (gap). Idealmente, eles devem

refletir processos biológicos de mutações ou inserções/deleções.

Para a determinação do escore de alinhamento ótimo, devemos considerar

Ws,t como sendo o peso para a substituição da letra s pela letra t ou vice-versa, a

qual é um elemento da matriz de substituição simétrica, e seja d o peso para um

simples gap. De acordo com o algoritmo de programação dinâmica, o valor ótimo da

função escore em cada nó é determinado por três possibilidades: diagonal, vertical e

horizontal como mostra a figura 34a. A equação 1 representa esta maximização da

função escore para uma matriz D:

i,j

= max(D

i-1,j-1

+ w

s(i),t(j)

, D

i-1,j

+ d, D

i,j-1

+d) Eq. 1

107

Embora a programação dinâmica consuma tempo, ela encontra soluções mais

rigorosas e é mais sensitiva para detectar similaridades sutis. É dito ser o método

final para busca por similaridade de seqüências de aminoácidos, porque a função

escore reflete similaridades entre aminoácidos (KANEHISA, 2000).

A matriz de alinhamento utilizada no programa foi a BLOSUM 62. A matriz

BLOSUM é calculada a partir de comparações entre seqüências com identidade

máxima de 62% podendo ser extrapolada também para uma matriz BLOSUM 80, o

que significa uma identidade máxima de 80% entre as seqüências, logo, a escolha de

matrizes diferentes implicará em resultados ligeiramente distintos.

As matrizes BLOSUM (Figura 35) são derivadas do banco de dados Blocks

(http://blocks.fhcrc.org), um conjunto de alinhamentos contínuos de regiões de

seqüência em famílias de proteínas relacionadas. Um método por agrupamento

ordena as seqüências de cada bloco em grupos de relação à próxima e as freqüências

Figura 34. Método para calcular o escore ótimo no algoritmo de programação dinâmica. a)

enalidade do espaço (gap) é constante. b) A penalidade do espaço é uma função linear co

relação ao comprimento do espaço.

108

de substituições entre eles dentro de uma família determinam a probabilidade de

uma substituição significativa.

III. PROCHECK

O PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1993) analisa a geometria global da

estrutura ou cada resíduo individualmente, utilizando para isso parâmetros

estereoquímicos derivados de estruturas de alta resolução ou bem refinadas

(MORRIS et al., 1992) que constituem sua base de dados. Os parâmetros

estereoquímicos usados são aqueles descritos em detalhes em MORRIS et al.

(1992). As verificações também fazem uso do comprimento e ângulo de ligação

ideal, derivados de uma análise detalhada (ENGH & HUBER, 1991) de estruturas de

pequenas moléculas em Cambridge Structural Database (CSD) (ALLEN

et al

1979). Estes parâmetros utilizados como informações estereoquímicas checadas pelo

ura 35. Matriz de valores de alinhamento BLOSUM62.

109

PROCHECK são: ligações covalentes, planaridade de grupos planares (aromáticos,

ligações peptídicas, etc.) ângulos diedros, quiralidade, interações não covalentes,

ligações de hidrogênio da cadeia principal e pontes de dissulfeto.

O PROCHECK requer como entrada um arquivo de coordenadas atômicas da

estrutura da proteína a ser avaliada no formato “pdb” e produz representações

coloridas em PostScript (ADOBE SYSTEM INC., 1985) facilmente, interpretadas,

descrevendo a estrutura de uma proteína, e também comparando duas estruturas de

proteínas relacionadas, juntamente com uma lista detalhada de resíduo por resíduo.

Dando uma avaliação da qualidade total da estrutura, em comparação às estruturas

bem refinadas da mesma definição, e destaca também as regiões que podem

necessitar uma investigação adicional. Dentre as várias análises fornecidas pelo

PROCHECK, foram utilizadas no DBMODELING o diagrama de Ramachandran e

o G-factor.

G. N. Ramachandran descreveu as conformações disponíveis para os

aminoácidos em uma cadeia polipeptídica. A conformação da cadeia peptídica é

simplesmente descrita pelos valores dos ângulos diedros na estrutura principal da

proteína (ângulo descrito pelo nitrogênio e carbono alfa (N - C

) e o ângulo descrito

pelo carbono alfa e carbono (C

– C)) (Figura 36). Estes ângulos são denominados

ângulos de torção

φ e

ψ, respectivamente (GIBAS & JAMBECK, 2001). Por

convenção, ambos,

e ψ, são definidos como 0° na conformação na qual as duas

ligações peptídicas conectadas a um único carbono α estão em um mesmo plano. Em

princípio,

φ e ψ podem ter qualquer valor entre -180° e +180°, porém muitos valores

110

de φ e ψ são proibidos pelas interferências estéricas entre átomos pertencentes ao

mesmo esqueleto polipeptídico e pelas cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos.

A conformação na qual

e ψ são, ambos, iguais a 0° é proibida por esta razão. Esta

convenção é meramente usada como ponto de referência para descrever os ângulos

de torção.

A cadeia não é livre para girar ao redor do terceiro tipo de ligação na

estrutura principal da proteína, a ligação peptídica, por ser uma ligação parcialmente

dupla e, portanto quimicamente restrita a ser planar; sendo assim, os valores de

ψ para cada aminoácido fornecem uma descrição completa da estrutura principal da

proteína.

G. N. Ramachandran usou modelos computacionais de pequenos peptídeos

para variar sistematicamente os ângulos de torção

φ e ψ com o objetivo de encontrar

Figura 36. Representação dos ângulos de torção em uma cadeia polipeptídica.

111

conformações estáveis. Para cada conformação, a estrutura foi examinada para

verificar a proximidade existente dos contatos entre os átomos. Os átomos foram

tratados como esferas rígidas com as dimensões que correspondem a seus raios em

van der Waals. Conseqüentemente, os ângulos de torção

e ψ que fazem com que

as esferas colidam correspondem a conformação estericamente não permitida

(região não permitida) para a cadeia principal de um polipeptídeo

(RAMAKRISHNAN, 2001).

O diagrama de Ramachandran (RAMACHANDRAN et al., 1963) indica a

distribuição dos ângulos

φ e ψ dos resíduos pertencentes a uma determinada

estrutura. Em 1993, Laskowski e colaboradores (LASKOWSKI et al., 1993) usaram

a estrutura cristalográfica de 118 proteínas resolvidas a resolução melhor que 2,0 Å

e R-factor melhor que 20% para definição de regiões permitidas e não permitidas no

gráfico

x ψ. A análise das estruturas a alta resolução levou à definição das

seguintes regiões: permitidas, adicionalmente permitidas, generosamente permitidas

e proibidas. A análise que leva em consideração as novas regiões do gráfico

φ x ψ,

foram implementadas no programa PROCKECK (LASKOWSKI et al., 1993) e

encontra-se disponível para uso on-line no programa Parmodel (UCHÔA et al.,

2004). Nos seus critérios uma estrutura de boa qualidade deve ter 90% ou mais de

seus resíduos nas regiões mais favoráveis (Figura 37). No diagrama abaixo, as áreas

em branco correspondem a regiões onde existem os choques estereoquímicos na

proteína. Estas regiões não permitidas estericamente são para todos os aminoácidos

112

exceto a glicina (Gly) que é o aminoácido que possui a cadeia lateral mais simples,

possuindo apenas um hidrogênio, podendo assim, assumir qualquer ângulo de torção

e ψ nos quadrantes do diagrama de Ramachandran e a prolina, a qual possui uma

ligação cíclica, impedindo o ângulo

φ de se movimentar livremente, deixando-a com

pouca liberdade de torção (Figuras 38a e b). As regiões vermelhas correspondem à

conformação onde nenhum choque estereoquímico é observado, ou seja, são as

regiões permitidas e aonde se encontram as hélices-α e folhas-β. As áreas em

amarelo mostram as regiões limite onde um raio ligeiramente mais curto de van der

Waals é usado no cálculo. Isto faz com que tenha uma região adicional que

corresponda a hélices esquerda e direita.

Figura 37. Diagrama de Ramachandran. A região mais favorável está expressa e

vermelho, a região permitida está em amarelo, a região generosamente permitida e

amarelo claro e a não permitida em branco. As regiões vermelhas no canto superio

esquerdo, no centro esquerdo e no centro direito representam as formações de folhas-

β paralelas e anti-paralelas, hélices-α à direita e hélices-α à esquerda respectivamente.

113

IV. VERIFY 3D

O VERIFY-3D (BOWIE et al., 1991; LUTHY et al., 1992; KABSCH &

SANDER, 1983) mede a compatibilidade entre a seqüência de aminoácidos de uma

proteína e o modelo da sua estrutura tridimensional, usando um perfil 3D. Para

tanto, o programa utiliza a seguinte metodologia: 1) reduz a estrutura 3D a uma

seqüência de ambientes químicos (um para cada resíduo) categorizados entre 18

possibilidades de acordo com a área do resíduo exposta ao solvente, com a fração de

contatos feitos com átomos polares e a estrutura secundária local (perfil 3D), 2)

utilizando uma matriz (chamada matriz 3D-1D (BOWIE et al., 1991)) que descreve

a probabilidade de se encontrar cada um dos 20 aminoácidos em cada uma das 18

classes de ambientes químicos, o programa determina a probabilidade, por resíduo,

de acordo com o tipo do aminoácido e a natureza do ambiente químico calculado no

passo anterior. A matriz 3D-1D é previamente conhecida e derivada de uma análise

de estruturas conhecidas de boa qualidade (BOWIE et al., 1991; LUTHY et al.,

1992).

Figura 38. a) Representação estrutural da molécula de Glicina (Gly)

e b) da molécula de Prolina.

114

O resultado é uma medida da compatibilidade entre a seqüência e sua

estrutura 3D descrita pelo seu perfil tridimensional. LUTHY et al. (1992)

determinaram empiricamente o índice global esperado de S

calc

= exp (-0.83+1.008 x

ln(L)) de compatibilidade entre a seqüência e a estrutura 3D onde L é o

comprimento da seqüência e S

calc

representando, então, a soma das probabilidades

individuais dos resíduos. LUTHY et al. (1992) também sugere um limite de

0.45xS

calc

para a confiabilidade da compatibilidade seqüência/estrutura. Valores

menores que 0.45xS

calc

indicam uma estrutura incorreta, valores em tomo de

0.45xS

calc

podem estar corretas, porém possuem qualidade questionável, e valores

acima de 0.45xS

calc

indicam uma estrutura correta. O VERIFY-3D requer como

entrada um arquivo de coordenadas atômicas no formato “pdb”.

V. RMSD

O RMSD pode ser calculado de duas maneiras: (i) uma função de todos os

átomos de uma proteína (ENGH & HUBER, 1991 – Equação 2) e (ii) uma função de

algum subconjunto dos átomos, como a estrutura principal da proteína ou posições

de C

apenas (KABASH & SANDER, 1983 – Equação 3). O parâmetro mais

comum que expressa a diferença entre duas estruturas protéicas é o RMSD, ou

desvio médio quadrático, em posições atômicas entre as duas estruturas.

Quando o RMSD é calculado como uma função de todos os átomos de uma

proteína, podemos adotar a definição de que o RMSD serve para analisar a medida

da variação da posição de cada átomo de uma estrutura com relação a um vetor

115

aceito, e é denominado RMSD da geometria ideal (KEARSLEY, 1989). O RMSD

da geometria ideal utiliza como parâmetros o comprimento e ângulo de ligação

ideal, derivados de uma análise detalhada (ENGH & HUBER, 1991) de estruturas de

pequenas moléculas em Cambridge Structural Database (CSD) (ALLEN et al.,

1979). O programa utilizado para executar os cálculos de comprimento e ângulos de

ligação foi o programa X-PLOR (SCHWIETERS et al., 2003; BRUNGER, 1992).

Quando o RMSD é calculado como uma função de algum subconjunto dos

átomos é comum a utilização de um subconjunto de átomos da proteína, quando

duas estruturas protéicas são comparadas, elas não serão idênticas entre si em

seqüência e, por isso, os únicos átomos entre comparação de posição (um-a-um) que

podem ser efetuados são os átomos da cadeia principal (C

- C

). Neste contexto,

abordar a orientação de uma estrutura molecular se toma importante. Uma vez que

as estruturas de proteínas são geralmente descritas em coordenadas atômicas

cartesianas, e surgem como uma orientação incorporada em relação ao espaço. O

RMSD é uma função da distância entre os átomos em uma estrutura e os mesmos

átomos em outra estrutura. Portanto, se uma molécula começar em uma posição

diferente do sistema de coordenadas de referência com relação à outra molécula, o

RMSD entre as duas proteínas será calculado independentemente.

()

Nddrmsd

CCjCC

∑

−−

−=

αα

Ndrmsd

∑

Eq. 2

Eq. 3

116

Para computar RMSDs significativos, as duas estruturas em consideração

devem primeiro ser superpostas, desde que possível. A superposição das estruturas

de proteínas começa geralmente com uma comparação de seqüências. A comparação

de seqüências define as relações um-a-um entre os pares de átomos onde o RMSD é

computado. As relações átomo-a-átomo, para fins de comparação de estruturas,

podem ocorrer entre resíduos que não estão na mesma posição relativa na seqüência

de aminoácidos. As inserções e deleções da seqüência podem forçar duas seqüências

a ficarem sem registro entre si, enquanto a arquitetura central das duas estruturas

permanece similar.

Uma vez definida as relações átomo-a-átomo entre duas estruturas, com um

programa de sobreposição como o LSQKAB do pacote CCP4 (COLLABORATIVE

COMPUTATIONAL PROJECT N° 4., 1994) alcançamos uma superposição ótima

entre as duas estruturas, isto é, a superposição com o menor RMSD possível. A

sobreposição de um par de átomos pode perfeitamente deixar outro par de átomos à

parte. Os algoritmos de superposição otimizam a orientação e a posição espacial de

duas moléculas (translação e rotação) entre si. Uma vez efetuadas as superposições

ótimas de todos os pares de estruturas, os valores de RMSD que são computados

como resultado, podem ser comparados entre si, já que as estruturas foram

removidas para a mesma estrutura de referência antes de fazer os cálculos de RMSD

(GIBAS & JAMBECK, 2001).

117

APÊNDICE B – Produção bibliográfica

Citação:

Da Silveira, N.J.F., Uchôa, H.B., Pereira, J.H., Canduri, F., Basso,

L.A., Palma, M.S., Santos, D.S. & De Azevedo Jr., W.F. (2005)

Molecular models of protein targets from Mycobacterium

tuberculosis. J. Mol. Model. 11:160-166.

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