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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE / RESISTÊNCIA AO BENZNIDAZOL EM
POPULAÇÕES DE Trypanosoma cruzi SUBMETIDAS A DIFERENTES FORMAS
DE MANUTENÇÃO NO LABORATÓRIO.
AUTORA: FABIANE MATOS DOS SANTOS
ORIENTADORA: Maria Terezinha Bahia
CO-ORIENTADORA: Vanja Maria Veloso
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, como parte integrante dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas, área de concentração: Imunobiologia
dos Protozoários.
Ouro Preto, março de 2006
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Instituições que colaboraram financeiramente para este projeto:
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG - processo CBB-
538/03)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq - processo
478.779/03-8)
Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP)
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SANTOS, FM DEDICATÓRIA
III
Ao meu pai, pelo amor incondicional e dedicação eterna.
À minha mãe pela paciência, carinho, apoio...
Às minhas irmãs, Fernanda e Flávia, Fábio, Dayane, vó Hercília, Tia Alice e Tia
Angélica... por sempre torcerem e me incentivarem.
SANTOS, FM ARADECIMENTOS
IV
A Deus.
Agradeço a Terezinha pelo meu ingresso no laboratório de Parasitologia, por
sempre ter me orientado e acompanhado com tanta sabedoria e equilíbrio. Um grande
exemplo em minha vida.
À Vanja, muito especial para mim. Sempre me incentivando, ensinando e
ajudando em tudo o que eu prescisava. Pessoa maravilhosa, que nunca me esquecerei.
Ao Sérgio Caldas, agradeço pelo companherismo e sincera amizade, muito
presente em todos os momentos durante este trabalho.
Stêfany Bruno e Géo Crepalde, obrigada pela convivência, amizade e grande
ajuda.
À Marta e ao Alexandre, pelos ensinamentos transmitidos, e aos demais
professores do Curso de Pós-Graduação.
Aos alunos que tanto colaboraram com os finais de semana, feriados... da nossa
escala de biotério, tão amada, meu muito obrigada: Ivo, Lívia Diniz, Lívia Metri,
Tassiane, Rafael, Dani M, Lorena, Ricardo...
A todos os alunos do laboratório de Parasito (também aqueles que partiram e
deixaram saudades), pela convivência e por permitirem que momentos às vezes difíceis
sejam mais suaves: Paulo, Jaila, Girley Francisco, Léo, Silvana, Isabel, Rodrigo, Jack,
Dani S, Lílian(s), Mariana, Arnaldo, Lisiane, Bruno, Sapo, Ramon, Marcela, Nilza...
À Cristina, pela amizade e cuidado com a criação dos camundongos. Aos demais
funcionários do biotério que colaboraram com o trabalho.
À Maria Chaves, por ter feito todo o processamento em parafina dos órgãos de
camundongos necropsiados.
Ramiro e Ana, tão importantes para o andamento dos trabalhos do laboratório,
que sempre nos fizeram sentir muito suas ausências nas férias e greves.
À Cida, sempre muito prestativa e agradável, e aos demais colegas do mestrado.
Enfim, agradeço a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a
realização deste trabalho.
De modo especial, agradeço a minha família e a Neida e Geraldo, grandes
colaboradores com a minha vida.
SANTOS, FM ABSTRACT
V
The aim of this study was to induce the resistance in vivo to benznidazole using
Trypanosoma cruzi populations sensitive to the drug. To do so, Swiss mice were
infected with five (Be-62A and B, and Be-78C, D and E) T. cruzi isolates obtained from
different chronic Chagasic dogs infected with Be-62 and Be-78 T. cruzi strains, both
100% sensitive to benznidazole. Four benznidazole-resistant T. cruzi population was
selected after 2 to 11 successive cycles of treatment with benznidazole. After the
stability in the resistance phenotype T. cruzi populations were maintained for six to 12
months without drug pressure: (1) through successive blood passage in not-treated mice,
and (2) in acellular culture, LIT medium. New changes in benznidazole resistance level
were showed after maintenance of the parasite without drug pressure. All benznidazole-
resistant T. cruzi populations maintained through successive blood passages in mice
continued to present 100% of benznidazole resistance. However, a greater difficulty was
observed in detecting the therapeutics failure, indicating an increase of benznidazole
parasite sensitive subpopulations in each benznidazole resistant T. cruzi isolated. On the
other hand, the 100% benznidazole resistant Be-78C and E started to present 50% and
20% of susceptibility after the maintenance for one year and six months in culture
medium, respectively. Theses results corroborate the hypothesis that the manipulation
of the T. cruzi may influence the susceptibility phenotype of benznidazole in T. cruzi.
This work demonstrates the in vivo resistance induction to benznidazole in T.
cruzi strains 100% sensitive to the benznidazole (Be-62 and Be-78) for the first time,
and makes an experimental model available for the study of mechanisms of drug
resistance in T. cruzi.
SANTOS, FM RESUMO
VI
O objetivo deste estudo foi avaliar a possibilidade de indução de resistência ao
benznidazol de populações do Trypanosoma cruzi consideradas 100% sensíveis ao
fármaco. Para isto, foram utilizados camundongos Swiss infectados com cinco (Be-62A,
Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E) populações do T. cruzi, obtidas de diferentes cães
chagásicos crônicos infectados com as cepas do T. cruzi Be-62 e Be-78, ambas 100%
sensíveis ao benznidazol. Quatro diferentes populações resistentes do T. cruzi foram
selecionadas após dois a 11 ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol. Para
avaliar a estabilidade do fenótipo de resistência ao benznidazol as populações do T.
cruzi foram mantidas durante seis a 12 meses sem a pressão do fármaco: (1) através de
passagens sangüíneas sucessivas em camundongos não tratados, e (2) em meio de
cultura acelular, meio LIT. Novas alterações do nível de resistência ao benznidazol
foram detectadas após a manutenção do parasito sem a pressão do fármaco. Todas as
populações do T. cruzi benznidazol-resistentes mantidas através de passagens
sangüíneas sucessivas em camundongos continuaram a apresentar 100% de resistência
ao fármaco. Entretanto, a maior dificuldade encontrada na detecção da falha terapêutica
indica o aumento de subpopulações do T. cruzi sensíveis ao benznidazol dentro de cada
isolado. Por outro lado, os isolados Be-78C e E (100% resistentes), passaram a
apresentar 50% e 20% de susceptibilidade ao benznidazol após serem mantidos por um
ano e seis meses em meio de cultura acelular, respectivamente. Estes resultados
colaboram com a hipótese de que a forma de manipulação do T. cruzi pode influenciar o
fenótipo de resistência ao benznidazol.
Este trabalho demonstrou a indução de resistência in vivo em populações do T.
cruzi (Be-62 and Be-78) consideradas 100% sensíveis ao benznidazol pela primeira vez,
e torna disponível um modelo experimental para o estudo de mecanismos de resistência
ao benznidazol no T. cruzi.
SANTOS, F.M. SUMÁRIO
VII
DEDICATÓRIA............................................................................................................ III
AGRADECIMENTOS................................................................................................... IV
ABSTRACT................................................................................................................... V
RESUMO....................................................................................................................... VI
LISTA DE FIGURAS E TABELAS.............................................................................. IX
LISTA DE GRÁFICOS.................................................................................................. X
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................... XIII
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 1
1.1 A doença de Chagas............................................................................................... 2
1.2 O Trypanosoma cruzi............................................................................................. 3
1.3 Quimioterapia experimental e humana da doença de Chagas com benznidazol e
nifurtimox......................................................................................................................... 8
1.4 As cepas de Trypanosoma cruzi Berenice-62 e Berenice-78............................... 14
2. OBJETIVOS............................................................................................................... 18
2.1 Objetivo geral....................................................................................................... 19
2.2 Objetivos específicos............................................................................................ 19
3. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 20
3.1 Populações do Trypanosoma cruzi....................................................................... 22
3.2 Manutenção das populações do Trypanosoma cruzi............................................ 22
3.3 Determinação da Susceptibilidade e Indução de Resistência ao Benznidazol..... 23
3.4 Critério de Cura.................................................................................................... 24
3.4.1 Exames parasitológicos............................................................................... 24
3.4.2 Exames sorológicos..................................................................................... 25
3.5 Caracterização biológica....................................................................................... 26
3.5.1 Análise da virulência e da patogenicidade.................................................. 26
3.5.1.1 Infectividade....................................................................................... 27
3.5.1.2 Curva de parasitemia.......................................................................... 27
3.5.1.3 Mortalidade......................................................................................... 27
4. RESULTADOS.......................................................................................................... 29
4.1 Caracterização biológica das cepas parentais Berenice-62 e Berenice-78 e das
populações isoladas de cães: Be-62A e Be-62B, e Be-78C, Be-78D e Be-78E............. 30
4.2 Indução de resistência ao benznidazol................................................................. 32
SANTOS, F.M. SUMÁRIO
VIII
4.3 Caracterização biológica das populações Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E
mantidas em ciclos sucessivos de tratamento e das populações 100% resistentes ao
benznidazol dos isolados Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E após mantidos na
ausência do fármaco....................................................................................................... 44
5. DISCUSSÃO.............................................................................................................. 53
6. CONCLUSÃO............................................................................................................ 64
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 67
SANTOS, F.M. LISTA DE FIGURAS E TABELAS
IX
Figura 1 - Delineamento Experimental. ......................................................................21
Tabela 1 – Cepas do Trypanosoma cruzi, condições de inoculação, tempo de infecção,
formas clínicas dos cães, e percentual de resistência ao benznidazol das cinco
populações do Trypanosoma cruzi isoladas dos cães e estudadas neste trabalho.......... 22
Figura 2 – Diagnóstico com gel de poliacrilamida 6%, obtido após a eletroforese dos
produtos de amplificação, por PCR, das regiões de ~330pb dos minicírculos do kDNA
do Trypanosoma cruzi, encontrado no sangue de animais tratados e não curados.........33
Tabela 2 - Percentual de positividade dos animais em testes sorológicos comparados
aos resultados positivos dos testes parasitológicos (Testes Sorológicos +/ Testes
Parasitológicos +) realizados em camundongos inoculados com os isolados Be-62A e
Be-62B de Trypanosoma cruzi... .................................................................................34
Tabela 3 – Percentual de positividade dos animais em testes sorológicos comparados
aos resultados positivos dos testes parasitológicos (Testes Sorológicos +/ Testes
Parasitológicos +) realizados em camundongos inoculados com os isolados Be-78C, Be-
78D e Be-78E de Trypanosoma cruzi..........................................................................36
SANTOS, F.M. LISTA DE GRÁFICOS
X
Gráfico 1- Curvas de parasitemia realizadas em camundongos Swiss inoculados com
5000 tripomastigotas sanguíneos da cepa Be-62 parental de Trypanosoma cruzi e com
os isolados Be-62A e B, após a 1
a
passagem sangüínea em camundongos....................31
Gráfico 2 - Curvas de parasitemia realizadas em camundongos Swiss inoculados com
5000 tripomastigotas sangüíneos da cepa Be-78 parental de Trypanosoma cruzi e com
os isolados Be-78C, D e E, após a 1
a
passagem sangüínea em camundongos. ............. 32
Gráfico 3 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sanguíneos da população Be-62B de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.................................................. 35
Gráfico 4 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sanguíneos da população Be-78C de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.................................................. 37
Gráfico 5 – Curvas de parasitemia obtidos de camundongos infectados com 5000
tripomastigotas sanguíneos da população Be-78C de Trypanosoma cruzi, durante o 1
o
e
o 10
o
ciclos de tratamento com benznidazol...................................................................38
Gráfico 6 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sanguíneos da população Be-78D de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.................................................. 39
Gráfico 7 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sanguíneos da população Be-78E de
SANTOS, F.M. LISTA DE GRÁFICOS
XI
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.................................................. 40
Gráfico 8 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sanguíneos das populações Be-78C, D e
E de Trypanosoma cruzi mantidos através de passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos não tratados e em meio de cultura acelular durante seis e 12 meses após a
indução de resistência ao benznidazol............................................................................ 41
Gráfico 9 – Curvas de parasitemia obtidos de camundongos infectados com 5000
tripomastigotas sanguíneos da população Be-78C de Trypanosoma cruzi, e tratados com
benznidazol após a manutenção durante seis e 12 meses através de passagens
sangüíneas sucessivas em camundongos não tratados (A) e em meio LIT (B).............. 43
Gráfico 10 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-62B, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
, 10
o
e 16
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 13
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular............................................................................................................................ 46
Gráfico 11 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78C, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
e 10
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 10
o
CST após
manutenção por seis e 12 meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular........................................................................................................................48
Gráfico 12 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78D, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
, 10
o
e 18
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 18
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular........................................................................................................................50
SANTOS, F.M. LISTA DE GRÁFICOS
XII
Gráfico 13 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78E, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
e 11
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 11
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular........................................................................................................................52
SANTOS, F.M. LISTA DE ABREVIATURAS
XIII
ABREVIATURAS
Be-62 - Berenice-62
Be-78 - Berenice-78
Bz - Benznidazol
CA - Cultura acelular
CST - Ciclos sucessivos de tratamento
EDTA - Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay
Hc - Hemocultura
IgG - Imunoglobulina G
ITS - Internal trinscribed spacers
LIT - Liver infusion tryptose
LSSP-PCR - Low-stringency single primer PCR
Nfx - Nifurtimox
pb – Pares de base
PBS - Phosphate buffered saline
PCR - Polymerase chain reaction
PFGE - Pulsed-field gel electrophoresis
PSS - Passagem sangüínea sucessiva
RAPD - Randomly amplified polymorphic DNA
RFLP - Restriction fragment length polymorphism
T. cruzi - Trypanosoma cruzi
TM - Tripomastigota metacíclico
TS - Tripomastigota sangüíneo
Z - Zimodema
1. INTRODUÇÃO
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
2
1.1 A doença de Chagas
A doença de Chagas é uma das mais importantes doenças tropicais entre os
países da América Latina. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde,
aproximadamente 16 a 18 milhões de indivíduos encontram-se infectados e 100 milhões
apresentam o risco de contraírem a doença, sendo considerada endêmica em 21 países
do continente americano (WHO, 2005).
O agente etiológico da doença de Chagas é um protozoário flagelado – o
Trypanosoma cruzi, Chagas, 1909 – que pode ser transmitido entre os homens através
de algumas espécies de triatomíneos vetores (SCHOFIELD, 1994).
Segundo Dias (1984), a fase aguda da doença de Chagas se caracteriza por uma
infecção de gravidade variável. Na maior parte dos indivíduos esta fase da doença é
assintomática, entretanto, alguns pacientes podem desenvolver quadros clínicos graves,
insuficiência cardíaca e meningoencefalite. A mortalidade pode ocorrer nesta fase da
doença em aproximadamente 10% das crianças.
Os indivíduos sobreviventes à fase aguda, podem desenvolver a doença de
Chagas crônica, com a presença ou não de sintomas clínicos, não apresentando
parasitemia patente (RASSI & LUQUETTI, 1992). No Brasil, após 10 a 20 anos de
infecção, cerca de 20 a 30% dos indivíduos infectados desenvolvem uma
miocardiopatia de severidade variável, e 8 a 10% apresentam uma forma digestiva
caracterizada por dilatações patológicas do esôfago e/ou cólon (megaesôfago e
megacólon). Contudo, 50 a 60% dos indivíduos permanecem aparentemente
assintomáticos por longos períodos de tempo ou durante toda a vida, caracterizando a
forma indeterminada da infecção (BRENER & GAZZINELLI, 1997).
As alterações eletrocardiográficas são geralmente as primeiras evidências
clínicas de progressão da doença de Chagas, embora sejam detectadas normalmente em
adultos com pelo menos 10 anos de infecção pelo T. cruzi. Entretanto, recentemente,
taxas elevadas na prevalência de alterações eletrocardiográficas têm sido relatadas em
crianças de 7 a 12 anos de idade infectadas pelo T. cruzi. Isto é indicativo da existência
de áreas endêmicas no Brasil com uma progressão particularmente acelerada da doença
(ANDRADE e cols., 1998).
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
3
1.2 O Trypanosoma cruzi
O Trypanosoma cruzi é um protozoário pertencente à ordem Kinetoplastida e
família Trypanosomatidae que circula amplamente na natureza entre hospedeiros
vertebrados (homem e outros mamíferos) e invertebrados, representados por espécies de
insetos triatomíneos da ordem Hemiptera e família Reduviidae (STOTHARD e cols.,
1999).
O ciclo de vida do T. cruzi envolve a existência de estágios evolutivos distintos
que apresentam propriedades morfológicas, funcionais e bioquímicas diferentes
(BRENER, 1973; DE SOUZA, 1984). Assim sendo, na fase do ciclo que ocorre em
hospedeiros vertebrados existem basicamente duas formas evolutivas diferentes do
parasito: amastigotas (sem flagelo livre) e tripomastigotas (com flagelo livre); ao passo
que nos hospedeiros invertebrados são encontradas principalmente epimastigotas e
tripomastigotas, ambas com flagelo livre e diferenciadas pela posição relativa do
cinetoplasto em relação ao núcleo da célula.
Entre as formas de transmissão aos seres humanos e a outros hospedeiros
vertebrados, destaca-se o mecanismo de infecção causado diretamente pelo inseto vetor
através de suas fezes contendo tripomastigotas metacíclicos, forma infectante para o
hospedeiro vertebrado. Os ciclos de transmissão do T. cruzi que envolvem a
participação dos triatomíneos foram descritos como: (a) não interpostos ou
descontínuos, onde existem ciclos silvestres e domésticos em localidades separadas,
como exemplo na Bahia, Brasil; (b) interpostos ou contínuos, onde o mesmo vetor e
cepas similares de T. cruzi ocorrem em ciclos silvestres e domésticos adjacentes, como
em regiões da Venezuela; (c) enzoótico, no qual a transmissão silvestre é abundante,
mas a transmissão doméstica ainda não foi estabelecida, exemplos na Bacia Amazônica
e Estados Unidos (MILES, 1998).
A transmissão vetorial pelo Triatoma infestans foi interrompida em vários países
da América do Sul (Uruguai em 1997, Chile em 1999, e em oito dos doze estados
endêmicos do Brasil em 2000) através de programas de controle com o uso de
inseticidas para eliminar triatomíneos domiciliados. A incidência de casos novos de
infecção pelo T. cruzi diminuiu em mais de 70% em todo o continente americano
(MONCAYO, 2003). Entretanto, o risco do processo de domiciliação por espécies de
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
4
triatomíneos silvestres do ciclo enzoótico representa uma ameaça ao controle da
transmissão alcançado nesses países. Além disso, novos casos continuam surgindo,
principalmente pelas vias de transmissão congênita ou transfusional, e por surtos
endêmicos ocasionais de transmissão oral (BLANCO e cols., 2000; CAMANDAROBA
e cols., 2002).
O T. cruzi é uma população heterogênea composta por um “pool” de cepas que
circulam nos ciclos doméstico e silvestre, entre hospedeiros humanos, vetores e animais
reservatórios (MURTA & ROMANHA, 1999). A diversidade das formas clínicas da
doença de Chagas humana e as diferenças biológicas entre as cepas de T. cruzi
ressalvam a hipótese de que o T. cruzi seja uma espécie heterogênea. Vários estudos
têm demonstrado que as cepas de T. cruzi diferem em relação à virulência,
patogenicidade, histiotropismo, e na susceptibilidade a fármacos em animais
experimentais, e na infectividade para triatomíneos (STOTHARD e cols., 1999). Esta
heterogeneidade poderia ser relacionada, pelo menos parcialmente, à propagação clonal
do parasito, que pode possibilitar que mutações acumulem em diferentes subpopulações
do T. cruzi (TIBAYRENC e cols., 1990).
Apesar de grande diversidade, um extensivo estudo sobre as características
biológicas de 138 cepas de T. cruzi, isoladas de diferentes áreas geográficas do Brasil e
outros países da América Central e do Sul, permitiu a classificação de tais cepas em três
biodemas (ANDRADE & MAGALHÃES, 1997). Biodema é um termo criado para
agrupar populações de T. cruzi que apresentam padrões de comportamento biológico
semelhantes.
Contudo, a complexa estrutura das populações de T. cruzi inspirou esforços
maiores pela busca de marcadores moleculares capazes de correlacionar as
características genéticas do parasito e sua relação com o hospedeiro.
A primeira confirmação da diversidade genética do T. cruzi ocorreu pela
caracterização fenotípica dos isolados através da eletroforese de isoenzimas. Miles e
cols. (1977, 1978) classificaram isolados naturais de T. cruzi provenientes dos estados
brasileiros da Bahia e Pará em três grupos distintos denominados zimodemas (Z1, Z2 e
Z3). Posteriormente, Romanha (1982) e Carneiro e cols. (1990) caracterizaram isolados
de T. cruzi provenientes de indivíduos com doença de Chagas crônica residentes na
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
5
região endêmica de Bambuí, Minas Gerais, e puderam observar a presença de quatro
zimodemas distintos (ZA, ZB, ZC e ZD).
Posteriormente, Tibayrenc e cols. (1986) e Tibayrenc & Ayala (1988)
conseguiram identificar 43 zimodemas ou “clonets” ao analizarem perfis isoenzimáticos
com 15 marcadores de isoenzimas em um total de 645 amostras de T. cruzi, 121
isoladas em 1986 e 524 amostras isoladas em 1988, sendo todas provenientes de uma
variedade de hospedeiros vertebrados e invertebrados com ampla distribuição
geográfica. Entretanto, não foi possível estabelecer ligações entre os zimodemas e
aspectos da patologia, transmissão, epidemiologia, ou distribuição geográfica da doença
de Chagas.
Em 1988, Tibayrenc & Breniére verificaram que os clones naturais 19, 20, 39 e
32 eram ubíquos, estando presentes em 53,7% dos isolados, nos mais diversos
hospedeiros e localidades. Os clones 19, 20, 39 e 32 foram, então, denominados clones
principais.
Tem sido demonstrado que os clones biológicos classificados como pertencentes
aos zimodemas 1, 2 ou 3 diferiram também em outras características, tais como em
perfis dos fragmentos de minicírculos do DNA do cinetoplasto (esquizodemas),
conteúdo de DNA, virulência para animais experimentais, taxas de crescimento
extracelular e intracelular in vitro, resposta à quimioterapia experimental, perfil
antigênico, metabolismo oxidativo e composição elementar de ferro, zinco e potássio.
(NOZAKI & DVORAK, 1993; MILES, 1998).
Após caracterização pelas isoenzimas, outras pesquisas baseadas em marcadores
moleculares de DNA e RNA têm também revelado elevada variabilidade genética entre
populações do T. cruzi. Morel e cols. (1980), com a determinação do perfil
eletroforético do k-DNA (DNA do cinetoplasto), total de DNA extra-nuclear do
parasito, digerido por enzimas de restrição (RFLP – Restriction fragment length
polymorphism), conseguiram revelar um grande número de padrões distintos entre
cepas de T. cruzi, e até mesmo uma elevada diversidade entre clones pertencentes a um
mesmo zimodema.
Macedo e cols. (1992), revelaram impressões digitais do DNA nuclear ao
utilizarem sondas de mini-satélites. Foram verificados padrões de bandas típicos bem
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
6
correlacionados com perfis de esquizodemas e que demonstraram uma grande
heterogeneidade de clones e cepas do T. cruzi.
Através da técnica de LSSP-PCR (Low-stringency single primer PCR) a
variabilidade de seqüências de bases no fragmento de 330pb da molécula de minicírculo
do k-DNA foi estudada diretamente em parasitos presentes em tecidos de camundongos
infectados e de indivíduos chagásicos crônicos (VAGO e cols., 1996a; 1996b).
A técnica de RAPD (Randomly amplified polimorphic DNA) tem sido usada
em estudos de variabilidade genética e identificação de marcadores genéticos pela
análise do polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente. Steindel e cols. (1993) e
Tibayrenc e cols. (1993), observaram uma correlação direta entre os perfis
isoenzimáticos (zimodemas) e os padrões de bandas múltiplas geradas pelo RAPD.
Esses autores determinaram o zimodema ao qual uma cepa pertencia e também
verificaram diferenças entre cepas de um mesmo grupo enzimático.
As análises moleculares que incluem os genes que codificam as seqüências do
mini-exon e os espaços intergênicos ribossomais têm sido amplamente utilizadas. Souto
& Zingales (1993) classificaram cepas de T. cruzi pela amplificação da seqüência
gênica do RNA ribossomal e seqüência gênica do mini-exon. Utilizando esta
metodologia foi possível agrupar cepas de T. cruzi em dois grupos, denominados grupo
I e II, de acordo com os produtos de amplificação (SOUTO e cols., 1996).
Posteriormente, foi demonstrada a existência de uma subclasse dentro do grupo 2,
caracterizada pela deleção ou inserção de uma região não transcrita do mini-exon com
aproximadamente 50pb (FERNANDES e cols., 1998).
Em tripanossomatídeos, os espaços transcritos de genes ribossomais (rDNA)
são altamente conservados e têm sido úteis em análises filogenéticas. As regiões
codificadoras dos genes RNA ribossomais (rDNA) dos tripanossomatídeos são
tipicamente encontradas como unidades repetidas em “tandem” (tandemly- repeated
units), separadas por espaços internos transcritos (ITS) que exibem elevada
variabilidade. Produtos distintos de PCR (Reação em cadeia da polimerase)
correspondentes aos espaços internos transcritos (ITS) de isolados de T. cruzi
provenientes do Piauí e Amazonas, possibilitaram agrupar esses isolados em duas
linhagens com baixos níveis de similaridades (FERNANDES e cols., 1999).
Considerando que os dez isolados provenientes do Piauí (ciclo de transmissão
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
7
doméstico), analisados e classificados como T. cruzi II, foram menos polimórficos que
os isolados originados do Amazonas (ciclo de transmissão silvestre) e classificados
como T. cruzi I, a maior complexidade do ciclo de transmissão silvestre pode ser
correlacionada com a maior diversidade genética dos parasitos no grupo T. cruzi I
(FERNANDES e cols., 1999).
Sendo assim, as análises utilizando como marcadores nucleares polimórficos os
genes que codificam o RNA ribossomal e o mini-exon, sugerem o agrupamento de
cepas de T. cruzi em três grandes grupos (1, 2 e 1/2). A linhagem genética 1 parece
corresponder com o zimodema 2 de Miles e cols. (1977 e 1978), e a linhagem genética
2 parece similar ao zimodema 1 (MILES e cols., 1977 e 1978); (STOTHARD e cols.,
1998; FERNANDES e cols., 1999). Mais recentemente, Brisse e cols. (2000)
identificaram cinco subdivisões filogenéticas menores dentro de uma das linhagens e
sugeriram a existência de seis grupos principais de T. cruzi, então chamados, linhagens
I, IIa, IIb, IIc, IId, IIe.
O desenvolvimento da técnica de eletroforese em gel de campo pulsátil (PFGE)
possibilitou a identificação e separação de cromossomos intactos, uma vez que a
cromatina do T. cruzi é fracamente condensada durante mitose e distintos cromossomos
podem não ser visualizados pelos métodos de microscopia (MACEDO e cols., 2004).
O exame de marcadores de micro-satélites do genoma de T. cruzi demonstrou
ser uma importante ferramenta para as análises de estrutura de populações do parasito,
com utilidade valiosa para revelar se uma cepa é constituída por população monoclonal
ou policlonal, além de utilizações em investigações filogenéticas (OLIVEIRA e cols.,
1998 e 1999).
O polimorfismo evidenciado em dois diferentes genes nucleares (trypanothione
reductase – TR e dihydrofolate reductase-thymidylate synthase – DHFR-TS) e em uma
região do DNA mitocondrial com genes parcialmente codificados no maxicírculo
(cytochrome oxidase subunit II – COII e NADH deydrogenase subunit I - NDI), levou
Machado & Ayala (2002) a sugerirem a divisão de cepas do T. cruzi em quatro
diferentes classes, denominadas A, B, C, e D. Na classe A foram incluídas todas as
seqüências de DNA de cepas pertencentes ao zimodema 1 (Z1). Entretanto, seqüências
de DNA obtidas de cepas classificadas como Z2 e Z3 não foram monofiléticas e foram
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
8
agrupadas em duas (dados mitocondriais) ou três (dados nucleares) classes distintas (B,
C, e D).
A demonstração da diversidade genética e biológica do T. cruzi permitiu em
abril de 1999, no Simpósio Internacional ocorrido no Rio de Janeiro em comemoração
aos 90 anos da descoberta da doença de Chagas, a proposta de uma nomenclatura
comum para este parasito. Assim, após caracterização biológica e molecular, as cepas
de T. cruzi devem ser classificadas como T. cruzi I, T. cruzi II ou T. cruzi.
Neste simpósio, os participantes procuraram uniformizar as classificações
propostas anteriormente por diversos autores. Desta maneira, as cepas serão
classificadas como: (1) T. cruzi I, quando pertencerem ao Zimodema 1 - Z1 - (MILES e
cols., 1977, 1978), Tipo III (ANDRADE, 1974), Linhagem 2 (SOUTO e cols., 1996),
Grupo 1 (TIBAYRENC, 1995), Ribodema II/III (CLARK & PUNG, 1994); (2) T. cruzi
II quando pertencerem ao Zimodema 2 - Z2 - (MILES e cols., 1977, 1978), Zimodema
A (ROMANHA e cols., 1979), Tipo II (ANDRADE, 1974), Linhagem 1 (SOUTO e
cols., 1996), Grupo 2 (TIBAYRENC, 1995), Ribodema I (CLARK & PUNG, 1994) e
(3) T. cruzi para as cepas aparentemente híbridas, como por exemplo o Zimodema B -
ZB (ROMANHA e cols., 1979), que não foram caracterizadas ou com caracterização
incerta (MOMEN, 1999).
1.3 Quimioterapia experimental e humana da doença de Chagas com
benznidazol e nifurtimox
Até 1970, ainda não havia nenhum medicamento disponível para o tratamento da
doença de Chagas, quando então dois fármacos nitro-heterocíclicos foram introduzidos,
nifurtimox (Nfx) e benznidazol (Bz). Entretanto, todas as drogas recomendadas para o
tratamento da tripanossomíase americana apresentam limitações, que incluem a variável
eficácia, toxicidade, requerimentos para longos cursos de administração, resistência e
efeitos colaterais, combinados a outros fatores (CROFT, 1999).
A quimioterapia específica para a doença de Chagas é baseada em nitrofuranos e
nitroimidazoles - nifurtimox (Lampit®, Bayer, recentemente descontinuado) ou
benznidazol (Rochagan®, Rodanil®, Roche), respectivamente. O nifurtimox atua
através da redução do grupo nitro em radicais nitroanions instáveis que produzem
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
9
metabólitos oxigenados reduzidos altamente tóxicos, como, anions superóxidos,
peróxido de hidrogênio (DOCAMPO, 1990). O T. cruzi tem sido considerado deficiente
em mecanismos de detoxificação para metabólitos oxigenados, particularmente o
peróxido de hidrogênio, sendo mais sensível ao “stress oxidativo” que as células dos
vertebrados. Por sua vez, estudos experimentais sugerem que as bases bioquímicas para
a atividade tripanocida do benznidazol envolvem modificações covalentes de
macromoléculas pela nitrorredução de radicais intermediários e vários componentes
celulares, como DNA, lipídios e proteínas do T. cruzi (DIAZ DE TORANZO e cols.,
1988; DOCAMPO, 1990).
O nifurtimox e o benznidazol apresentam alta eficácia no tratamento da fase
aguda da doença de Chagas, sendo observados índices que variam de 40% a 76% de
cura parasitológica (ANDRADE e cols., 1992; CANÇADO, 1999; CANÇADO, 2002).
A quimioterapia com benznidazol também é eficaz no tratamento de crianças,
provavelmente na fase crônica recente da doença de Chagas. Sosa-Estani e cols. (1998),
na Argentina, verificaram 62% de cura em triagem clínica para testar a eficácia e
tolerância do benznidazol em crianças na fase indeterminada da infecção pelo T. cruzi.
Nesse estudo, o critério de cura foi estabelecido pela negativação de testes sorológicos
após quatro anos do tratamento com benznidazol. No Brasil, Andrade e cols. (2004)
verificaram 88,7% de negativação dos testes sorológicos e nenhuma alteração
eletrocardiográfica em crianças infectadas pelo T. cruzi, após seis anos de tratamento
com benznidazol. Esses resultados reforçam a necessidade de rápido diagnóstico e
tratamento de crianças e adolescentes na fase crônica recente da infecção pelo T. cruzi,
principalmente em áreas endêmicas.
Entretanto, o esquema terapêutico com benznidazol e com nifurtimox apresenta
baixa eficácia no tratamento da doença de Chagas crônica. Além disso, ambos os
fármacos apresentam significativos efeitos colaterais, como anorexia, vômitos,
polineuropatia periférica e dermopatia alérgica, que podem levar à interrupção do
tratamento (CANÇADO, 2002).
A resistência natural do T. cruzi aos nitro-derivados (benznidazol e nifurtimox)
tem sido correntemente sugerida como um importante fator para explicar as baixas taxas
de cura detectadas em pacientes chagásicos tratados (FILARDI & BRENER, 1987).
Estes autores estudaram a susceptibilidade ao nifurtimox e ao benznidazol de 47 cepas
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
10
de T. cruzi isoladas de diferentes hospedeiros, incluindo vetores silvestres e
reservatórios. Foi observado um amplo percentual de eficácia das drogas, que variou de
0-100%, sendo esses resultados de quimioterapia aparentemente correlacionados com a
distribuição geográfica de algumas cepas do T. cruzi.
Controvérsias permanecem sobre a eficiência da quimioterapia tripanocida,
especialmente em indivíduos crônicos assintomáticos. De acordo com a hipótese da
importância da presença do parasito na persistência das lesões durante a fase crônica da
doença de Chagas, a administração terapêutica pode diminuir a carga parasitária em
tecidos infectados, e dessa forma reduzir a severidade dos processos inflamatórios
associados com as formas crônicas da tripanossomíase americana (URBINA &
DOCAMPO, 2003). Entretanto, a maior limitação do uso clínico de benznidazol e
nifurtimox ocorre com a forma crônica da tripanossomíase americana, uma vez que
aproximadamente 80% dos pacientes tratados não são parasitologicamente curados.
Muitos clínicos permanecem com fortes reservas quanto ao tratamento de pacientes
crônicos devido aos riscos desfavoráveis e incertos benefícios que apresentam os
nitrofuranos (nifurtimox) e nitroimidazoles (benznidazol) (URBINA & DOCAMPO,
2003).
Braga e cols. (2000) observaram 0% de cura parasitológica em indivíduos com
infecção crônica pelo T. cruzi e tratados durante 30 a 60 dias com benznidazol ou
nifurtimox. Trinta e quatro indivíduos chagásicos crônicos, com pelo menos dois entre
três testes sorológicos positivos para a infecção, e dezessete indivíduos controles com
testes sorológicos negativos para o T. cruzi formaram os grupos de estudo. Os testes de
PCR com primers de DNA de T. cruzi monitoraram a eficácia do tratamento, e a técnica
de PCR competitiva que foi usada para quantificar o número de parasitos no sangue
revelou médias não significativas entre chagásicos tratados e não-tratados. Sendo assim,
o resultado deste estudo realizado no Brasil demonstrou que o tratamento da doença de
Chagas crônica com drogas nitroderivadas é insatisfatório.
De acordo com Murta e cols. (1998), os insucessos terapêuticos verificados no
tratamento da doença de Chagas podem ser relacionados, em parte, à susceptibilidade
ou resistência ao fármaco entre determinadas populações do T. cruzi que apresentam
diferentes características genéticas.
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
11
Em um estudo envolvendo a classificação de 30 cepas de T. cruzi quanto à
susceptibilidade ao tratamento com nifurtimox e benznidazol, Andrade e cols. (1985)
conseguiram correlacionar características morfológicas e perfis de isoenzimas de cepas
previamente classificadas como tipo I, II ou III com as taxas de cura parasitológicas
observadas. As cepas classificadas como tipo I demonstraram alta susceptibilidade,
cepas tipo II revelaram média para elevada susceptibilidade, e cepas tipo III foram
altamente resistentes a ambas as drogas (ANDRADE e cols., 1985).
Andrade e cols. (1992) compararam resultados de tratamentos com Bz e Nfx em
pacientes e camundongos infectados com cepas correspondentes de T. cruzi a fim de
melhor compreender o papel da cepa do parasito na susceptibilidade e resistência ao
fármaco. A correlação entre resultados de tratamento em pacientes e camundongos foi
de 81,8% (9 de 11 casos). Esses resultados terapêuticos comparativos entre duas
diferentes espécies de hospedeiros sugerem fortemente que a cepa do parasito é um
fator chave na influência dos resultados de quimioterapia. Nesse contexto, os autores
ressaltaram a importância da caracterização de um número significativo de cepas em
uma dada região geográfica para testar a susceptibilidade aos compostos tripanocidas e
aumentar as chances de sucesso terapêutico.
Vários autores têm demonstrado que diferenças geográficas podem interferir na
eficácia dos esquemas terapêuticos (RASSI & LUQUETTI, 1992). Toledo e cols.
(1997) verificaram diferentes níveis de susceptibilidades, que variaram de 0-100% em
camundongos inoculados com dezoito cepas de T. cruzi provenientes do estado do
Paraná e de diferentes regiões endêmicas do Brasil, e tratados com benznidazol. A
variação no percentual de susceptibilidade ao fármaco foi observada em cepas de T.
cruzi isoladas de ambos os ciclos doméstico e silvestre. Contudo, apenas diferenças
geográficas correlacionadas com a predominância de determinadas cepas de T. cruzi
podem não ser suficientes para explicar as divergências nas taxas de cura após
tratamento na doença de Chagas.
Uma vez que variações naturais da susceptibilidade aos fármacos entre as várias
cepas de T. cruzi tem sido proposto como possível explicação para as falhas
terapêuticas, vários estudos têm tentado estabelecer correlações entre as diferentes
susceptibilidades quimioterápicas de cepas de T. cruzi e sua diversidade genética. Nesse
sentido, Toledo e cols. (2003; 2004) correlacionaram a susceptibilidade aos fármacos
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
12
com a diversidade genética do T. cruzi, através do tratamento com Bz e itraconazol
durante as fases aguda e crônica da infecção experimental em camundongos BALB/c.
Foram analisados um total de vinte clones de T. cruzi representantes de toda a
diversidade filogenética do parasito, incluindo os genótipos ubiqüistas 20 e 19 (T. cruzi
I), 39 e 32 (T .cruzi II). Os clones de T. cruzi classificados como pertencentes ao grupo
genético T. cruzi I foram mais resistentes a ambos benznidazol e itraconazol, enquanto
que membros do grupo T. cruzi II foram parcialmente resistentes a ambos os compostos.
Por outro lado, Villarreal e cols. (2004) não conseguiram estabelecer correlações entre
as susceptibilidades in vitro ao Bz de dezoito clones de T. cruzi, amplamente
diversificados, com as suas caracterizações genéticas realizadas por RAPD e
eletroforese de isoenzimas.
Murta e cols. (1998) caracterizaram molecularmente 45 cepas de T. cruzi,
sensíveis ou naturalmente resistentes aos nitroderivados Bz e Nfx. Análises dos perfis
de RAPD e de isoenzimas classificaram as cepas em três grupos, enquanto que perfis de
genes que codificam a P-glycoprotein (TcPGP) e a enzima hypoxanthine-guanine
phosphoribosyltransferase (HGPRT) dividiram as cepas de T. cruzi analisadas em dois
grupos. Cepas classificadas como grupo I ou II pelo RAPD ou zimodemas Z1 ou Z2
pelas análises de isoenzimas foram tanto susceptíveis como naturalmente resistentes aos
nitroderivados. Contrariamente, as cepas classificadas no grupo III pelo RAPD e
zimodema ZB pela análise de isoenzimas foram apenas susceptíveis aos fármacos e
demonstraram polimorfismos para os genes de TcPGP e HGPRT. Esse fato possibilitou
a identificação de marcadores moleculares da susceptibilidade ao Bz e Nfx em cepas de
T. cruzi.
Entre os mecanismos de resistência verificados pelo T. cruzi está o transporte de
fármacos através da membrana. Os transportadores cassette (ABC) ligados a moléculas
de ATP estão envolvidos no transporte ativo de uma variedade de moléculas através das
membranas, em um processo dependente de energia e contrário a um gradiente de
concentração (HIGGINS, 1992). Entre os membros da superfamília ABC estão
incluídos as P-glycoproteins (PGP) e as multidrug resistance-associated proteins
(MRP), as quais estão envolvidas no fenótipo de resitência aos fármacos em células
cancerosas (GERMANN, 1996). Membros da família de genes da P-glycoprotein (pgp)
têm sido descritos em diferentes protozoários patogênicos, sendo que a função de alguns
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
13
genes pgp mediando a resistência aos fármacos foi observada em Leishmania sp.,
Plasmodium falciparum e Entamoeba histolytica (ULLMAN, 1995). Murta e cols.
(2001) analisaram os níveis de expressão de genes PGP, a amplificação e mudanças de
expressão de genes tcpgp 1 e tcpgp 2, bem como a localização cromossômica desses
genes em 27 cepas e clones de T. cruzi sensíveis ou naturalmente resistentes ao Bz e
Nfx ou que tiveram resistência ao Bz induzida in vitro ou selecionada in vivo. Os
resultados desse estudo demonstraram que o fenótipo de resistência aos fármacos em T.
cruzi não está associado com a expressão de genes PGP.
De modo interessante, Veloso e cols. (2001) observaram uma alteração na
susceptibilidade ao Bz em isolados da cepa Berenice-78 (Be-78), caracterizada por
Toledo e cols. (1995) como 100% sensível a este composto. Camundongos inoculados
com os isolados Be-78C e Be-78D, provenientes de cães infectados durante sete e dois
anos com a cepa Be-78, apresentaram susceptibilidades de 50 e 70% ao Bz,
respectivamente, após 25 passagens sangüíneas em camundongos. Uma seleção de
clones resistentes que podem diferir de algum modo da cepa original foi sugerida para
explicar a persistência de parasitos no hospedeiro vertebrado após tratamento
prolongado (ANDRADE e cols., 1977). Contudo, os isolados de T. cruzi analisados por
Veloso e cols. (2001) foram provenientes de cães nunca submetidos a tratamento. Por
sua vez, Deane e cols. (1984) demonstraram que o tempo e o método de isolamento no
hospedeiro vertebrado agem como métodos seletivos, podendo eliminar completamente
uma ou mais populações de T. cruzi que antes coexistiam no mesmo hospedeiro.
A identificação de possíveis diferenças bioquímicas entre cepas isoladas de
camundongos tratados, de modo a investigar a influência da quimioterapia nas
características bioquímicas de cepas de T. cruzi foi realizada por Marreto & Andrade
(1994). Nesse trabalho, foi observada a estabilidade no perfil de isoenzimas entre
parasitos de uma mesma cepa isolados de animais tratados ou não tratados. Este estudo
revelou ausência de seleção clonal ou alterações genéticas dos parasitos após ação dos
compostos antiparasitários Bz e Nfx. Contudo, a investigação da possibilidade de uma
seleção de diferentes clones de T. cruzi pela ação de fármacos tripanocidas parece
importante não apenas para a quimioterapia, mas também para avaliar a estabilidade dos
perfis bioquímicos e moleculares de cepas de T. cruzi.
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
14
Murta & Romanha (1998) demonstraram a indução in vivo da seleção de
populações e clones de T. cruzi resistentes ao Bz, tornando disponível um modelo
experimental para o estudo de mecanismos de resistência a drogas em T. cruzi. Clones
resistentes da cepa Y de T. cruzi (parcialmente resistente ao Bz e Nfx, FILARDI &
BRENER, 1987) foram selecionados após 25 passagens sucessivas (8 meses) em
camundongos tratados com uma única e alta dose do fármaco (500 mg de Bzl/ Kg de
peso corporal). Os autores sugeriram que a resistência das cepas de T. cruzi pode estar
diretamente relacionada com as taxas de clones sensíveis / resistentes em uma
população.
Camandaroba e cols. (2003) avaliaram a susceptibilidade ao Bz de sete clones
isolados da cepa Colombiana de T. cruzi, protótipo do biodema III e zimodema 1,
altamente resistente aos quimioterápicos. Os clones obtidos demonstraram alta
similaridade com a cepa parental e elevada resistência, sugerindo a predominância de
um clone principal, muito resistente à quimioterapia nesta cepa.
O estudo de clones e cepas de T. cruzi resistentes aos quimioterápicos tem sido
realizado por caracterizações de isolados altamente ou parcialmente resistentes
(MARRETO & ANDRADE, 1994; MURTA & ROMANHA, 1998;
CAMANDAROBA e cols., 2003). Contudo, no presente trabalho foi avaliado os níveis
de susceptibilidade / resistência ao Bz em populações de T. cruzi isoladas de cães
chagásicos crônicos infectados com cepas 100% sensíveis ao fármaco (Berenice-62 e
Berenice-78) e posteriormente mantidas sob diferentes formas no laboratório (passagens
sucessivas em camundongos tratados e não tratados e em meio de cultura acelular).
1.4 As cepas de Trypanosoma cruzi Berenice-62 e Berenice-78
Chagas (1909) descreveu o primeiro caso clínico humano da tripanossomíase
americana ao isolar o parasito do sangue da paciente Berenice e reproduzir seu ciclo
biológico nos hospedeiros vertebrado e invertebrado. Carlos Chagas descreveu sintomas
na paciente que hoje são considerados como característicos da fase aguda da doença.
Salgado e cols. (1962) examinaram novamente a paciente Berenice e a
consideraram normal no que se refere às formas clínicas clássicas da tripanossomíase
americana. Nesta ocasião, a cepa Berenice foi isolada por xenodiagnóstico e
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
15
posteriormente denominada Berenice-62 (BRENER, 1965). Em 1978, uma segunda
amostra do sangue da paciente Berenice foi isolada por xenodiagnóstico com ninfas de
Dipetalogaster maximus.
Em 1986, Lana & Chiari utilizando o camundongo como modelo experimental,
observaram características biológicas, bioquímicas e moleculares distintas entre a
amostra isolada da paciente Berenice em 1978 (Be-78) e a cepa Berenice-62 (Be-62),
inclusive nos perfis de isoenzimas e de k-DNA digeridos por enzimas de restrição
(LANA e cols. 1996). Os autores discutiram a possibilidade de que a paciente Berenice
tenha sofrido uma reinfecção.
Brener (1965) e Brener e cols. (1974) descreveram o predomínio de formas
delgadas ao longo de toda a infecção na cepa Be-62. Por outro lado, Lana & Chiari
(1986) observaram a ocorrência de um predomínio de formas largas na cepa Be-78
durante todo o período patente da infecção. A cepa Be-78 apresentou baixa virulência
para camundongos albinos e C
3
H isogênicos, com baixos níveis de parasitemia e 100%
de sobrevivência à fase aguda da infecção. A cepa Be-62 inoculada também em
camundongos albinos e C
3
H isogênicos induziu infecções com altos níveis de
parasitemia, pico no sétimo dia de infecção e mortalidade de todos os animais no 13
o
dia de infecção.
Cruz e cols. (2005) utilizando análises de micro-satélites também demonstraram
diferenças entre as cepas parentais de T. cruzi Be-62 e Be-78. Contudo, os autores
sugeriram que ambas as cepas são constituídas por populações monoclonais, uma vez
que cada cepa parental com seus respectivos clones demonstrou o mesmo perfil de
amplificação, com apenas um ou dois picos em todos os sete loci analisados.
Posteriormente, Veloso e cols. (2005) demonstraram a variabilidade genética e
biológica entre a cepa parental Be-78 e quatro isolados de cães na fase crônica da
doença de Chagas e infectados com a cepa Be-78. Após 25 passagens sangüíneas
sucessivas em camundongos não tratados, dois isolados (Be-78B e Be-78D)
apresentaram reversão das características genéticas avaliadas (perfis de isoenzimas e
RAPD), tornando-se similares à cepa parental Be-78. Esses resultados sugerem que
subpopulações do parasito com diferentes genótipos poderiam estar presentes em baixos
percentuais na cepa parental Be-78 e terem sido selecionadas após longa permanência
desta cepa de T. cruzi em hospedeiro vertebrado. Os resultados da caracterização
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
16
isoenzimática demonstraram claramente a presença de pelo menos três subpopulações
na cepa Berenice-78.
Utilizando o cão como modelo experimental, Lana e cols. (1992), Caliari e cols.
(1995) também revelaram diferenças marcantes em todos os parâmetros biológicos e
parasitológicos considerados. A detecção do parasito, através da hemocultura e do
xenodiagnóstico, ao longo da fase crônica foi muito dependente da cepa de T. cruzi
inoculada. Cães inoculados com a cepa Be-78 apresentaram xenodiagnóstico e/ou
xenocultura positivos pelo menos uma vez ao longo do período observado, enquanto
que somente um cão infectado com a cepa Be-62 apresentou hemocultura positiva. A
realização de eletrocardiograma ao longo da infecção demonstrou que as alterações
eletrocardiográficas tiveram início a partir da segunda semana de infecção, e durante a
fase crônica 100% dos animais apresentaram alterações, que foram mais freqüentes nos
animais infectados com a cepa Be-78.
Com relação à susceptibilidade aos agentes quimioterápicos, Brener e cols.
(1976) verificaram que os animais inoculados com a cepa Be-62 apresentaram maior
percentual de cura em relação aos demais inoculados com as cepas Y, CL e FL. Toledo
e cols. (1995) verificaram 100% de cura ao tratarem com Bz camundongos infectados
com as cepas Be-62 e Be-78. Após seis meses do tratamento a sorologia foi negativa em
todos os animais tratados com Bz.
Por outro lado, Veloso e cols. (2001) verificaram alterações no percentual de
susceptibilidade ao Bz em populações de T. cruzi isoladas de cães chagásicos crônicos
infectados com a cepa Be-78 (2 a 10 anos de infecção). Apenas o isolado Be-78B foi
semelhante à cepa Be-78 parental, com índices de cura de 100%, ao passo que os
isolados Be-78C e Be-78D foram respectivamente, 50% e 30% resistentes ao Bz. Estas
populações foram tratadas com Bz após 25 passagens sangüíneas em camundongos.
A melhor compreensão sobre a indução de resistência ao Bz em uma população
do T. cruzi (previamente susceptível ao Bz) poderia contribuir, também, para o melhor
entendimento dos baixos índices de cura observados em humanos, portadores da doença
de Chagas crônica. Este projeto propõe determinar o grau de resistência ao Bz de
populações do T. cruzi isoladas de cães cronicamente infectados, depois de submetidas
à pressão ou não do Bz.
SANTOS, F.M. INTRODUÇÃO
17
Neste sentido, a determinação da susceptibilidade ao Bz em populações do T.
cruzi isoladas de animais infectados com as cepas Be-62 e Be-78 do T. cruzi,
susceptíveis ao Bz, mantidas por meio de passagens sucessivas em camundongos
tratados até alcançar estabilidade no parâmetro susceptibilidade/resistência ao
composto, poderá também melhor esclarecer o processo de susceptibilidade/resistência
ao fámaco de diferentes populações do T. cruzi.
2. OBJETIVOS
SANTOS, FM OBJETIVOS
19
2.1 Objetivo geral
Avaliar a ocorrência de alteração da susceptibilidade ao benznidazol em
populações do Trypanosoma cruzi isoladas de cães cronicamente infectados com as
cepas Berenice-62 (Be-62A e Be-62B) e Berenice-78 (Be-78C, Be-78D e Be-78E),
consideradas sensíveis ao Bz, após diferentes formas de manutenção no laboratório.
2.2 Objetivos específicos
2.2.1 Avaliar a estabilidade da resistência ao Bz das populações de T. cruzi isoladas
de cães, através da determinação: (a) do grau de resistência ao Bz em
populações mantidas através de ciclos sucessivos de tratamento em
camundongos, até a estabilização do grau de resistência. (b) da estabilidade do
fenótipo de resistência ao Bz após a manutenção em passagens sangüíneas
sucessivas (PSS) em camundongos não tratados e em meio de cultura acelular
(CA).
2.2.2 Caracterizar as populações de T. cruzi que apresentarem alteração no grau de
resistência ao Bz, comparativamente às cepas parentais, analisando os seguintes
parâmetros:
a) Infectividade para camundongos;
b) Curva de parasitemia;
c) Mortalidade.
3. MATERIAL E MÉTODOS
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
21
Figura 1 - Delineamento Experimental
3.5 Critério de Cura
Cães experimentalmente infectados com
as cepas Berenice-78 e Berenice-62 do
Trypanosoma cruzi
Isolamento de populações de
T. cruzi dos cães chagásicos crônicos
através da hemocultura
Manutenção das populações isoladas de
cães através de ciclos sucessivos de
tratamento com Bz em camundongos
Determinação da
Susceptibilidade ao BZ
Tratamento com Bz (100 mg/kg
de peso corporal) - 20 dias
Controle de cura
Exame de lâmina de sangue a
fresco, imunossupressão com
ciclofosfamida, hemocultura,
sorologia e PCR
Caracterização
Biológica
Infectividade
Virulência
Mortalidade
Manutenção dos parasitos do último
CST em passagens sangüíneas
sucessivas em camundongos (PSS) não
tratados e em meio LIT por 6 a 12 meses
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
22
3.1 Populações do Trypanosoma cruzi
Foram utilizadas as cepas Berenice-62 e Berenice-78 (LANA & CHIARI, 1986)
(T. cruzi II), isoladas em diferentes períodos da paciente Berenice, considerada o
primeiro caso clínico descrito da doença de Chagas humana. Estas cepas vêm sendo
mantidas congeladas em nitrogênio líquido e através de passagens sangüíneas
sucessivas em camundongos do biotério central da Universidade Federal de Ouro Preto.
Três populações do T. cruzi, isoladas de diferentes cães sem raça definida e
experimentalmente infectados com a cepa Berenice-78; e duas populações de T. cruzi
isoladas de cães infectados com a cepa Berenice-62 do T. cruzi, através de hemocultura,
realizada de acordo com a técnica de Chiari e cols. (1989) modificada por Luz e cols.
(1994). As informações sobre estas populações estão apresentadas na Tabela 1. Os cães,
após a inoculação, foram mantidos no canil do Biotério Central da Universidade Federal
de Ouro Preto.
Tabela 1 – Cepas do Trypanosoma cruzi, condições de inoculação, tempo de infecção,
formas clínicas dos cães e percentual de resistência ao benznidazol das cinco
populações do T. cruzi isoladas dos cães e estudadas neste trabalho.
TS = tripomastigota sangüíneo
TM = tripomastigota metacíclico
3.2 Manutenção das populações do Trypanosoma cruzi
Após o isolamento, as amostras do T. cruzi foram crescidas em meio LIT a 28ºC,
criopreservadas e inoculadas em camundongos Swiss. A seguir, foram mantidas por
Cão
Cepa de
T. cruzi
Fonte do
inóculo
Tempo
de
infecção
(anos)
Forma
clínica
População
isolada
Percentual
de
resistência
ao Bz
1 Be-62 TM 10 Indeterminada
Be-62A 50%
2 Be-62 TM 10 Indeterminada
Be-62B 60%
3 Be-78 TS 7 Indeterminada
Be-78C 90%
4 Be-78 TS 2 Indeterminada
Be-78D 70%
5 Be-78 TM 10 Cardíaca Be-78E 90%
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
23
meio de ciclos sucessivos de tratamento com Bz em camundongos fêmeas, com 30 dias
de idade, utilizando-se um inóculo de 5 × 10
3
tripomastigotas.
Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas, com 30 dias de idade, pesando
aproximadamente 20g, nascidos e mantidos no Biotério Central da Universidade
Federal de Ouro Preto.
3.3 Determinação da Susceptibilidade e Indução de Resistência ao Benznidazol
Para a indução da resistência ao Bz, as populações do T. cruzi foram mantidas
em ciclos sucessivos de tratamento com Bz. As populações de T. cruzi foram inoculadas
via intraperitoneal (5 × 10
3
tripomastigotas/0,1mL de sangue) em grupos de 16
camundongos Swiss. Na 1
a
passagem sangüínea dos parasitos em camundongos, grupos
de 10 camundongos Swiss foram tratados com Bz e grupos de 6 camundongos Swiss
controles infectados e não tratados foram caracterizados biologicamente. Após 10 dias
do tratamento, os camundongos que permaneceram negativos ao exame de sangue a
fresco foram imunossuprimidos com ciclofosfamida para avaliação dos percentuais de
reativação da parasitemia e obtenção de 5 × 10
3
tripomastigotas sanguíneos para serem
inoculados em novos camundongos Swiss, e submetidos a outro esquema terapêutico,
dando prosseguimento aos ciclos sucessivos de tratamento com Bz.
Os ciclos sucessivos de tratamento (CST) foram realizados até a verificação da
estabilidade do grau de resistência ao Bz. Foi considerada resistente a população que
apresentou 100% de resistência em pelo menos quatro CST. A partir de então, os
parasitos isolados do último CST passaram a ser mantidos em passagens sangüíneas
sucessivas em camundongos não tratados e em meio de cultura acelular. Após seis e 12
meses, foram inoculados em novos grupos de 16 camundongos para avaliações de
alterações na susceptibilidade ao Bz e nos perfis biológicos de virulência e
patogenicidade de cada população do T. cruzi.
O tratamento com Bz [2-nitroimidazol (N-benzil-2-nitro-1-imidazolacetamida)]
(Roche) foi realizado em camundongos Swiss depois de confirmada a infecção pelo T.
cruzi, com início até 10 dias após infecção, por via oral e na dose de 100mg de Bz/Kg
de peso corporal durante 20 dias consecutivos.
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
24
3.4 Critério de Cura
Para critério de cura pós-tratamento com Bz foram realizados: exame de sangue
a fresco (antes e após imunossupressão com ciclofosfamida), hemocultura, sorologia e
PCR. Foram considerados curados todos os animais que apresentaram exame de sangue
a fresco, antes e após imunossupressão com ciclofosfamida, hemocultura e sorologia
negativos. Foi realizada PCR para controle de cura apenas nos camundongos que
apresentaram exame de sangue a fresco e hemocultura negativos, mas a sorologia
continuou positiva, sendo então considerados curados, nestes casos, aqueles
camundongos com resultados de PCR negativos.
Para a realização da sorologia foram coletados sangue dos animais antes do
início da imunossupressão, 30 dias após o término da imunossupressão e seis meses
após o tratamento. O teste sorológico utilizado foi a ELISA. Para a realização da
hemocultura e da PCR o sangue foi coletado 30 dias após o término do tratamento.
3.4.1 Exames parasitológicos
O exame de sangue a fresco foi realizado diariamente a partir do 4
o
dia de
infecção até a observação de pelo menos quatro dias consecutivos sem detecção de
parasitos no sangue periférico dos animais tratados. Após 10 dias de término do
tratamento com benznidazol, os camundongos que permaneciam negativos no exame de
sangue a fresco durante o tratamento, eram imunossuprimidos com cilofosfamida. O
sangue dos animais continuava sendo examinado diariamente para a observação da
reativação da parasitemia. A imunossupressão foi realizada por via intraperitoneal com
0,05mL de ciclofosfamida em cada camundongo negativo, durante um período máximo
de três esquemas sucessivos de quatro dias (o terceiro de apenas três dias), e com
espaçamento de três dias entre eles. O esquema de imunossupressão era interrompido
em camundongos que apresentavam exame de sangue a fresco positivo.
A hemocultura para controle de cura foi realizada aos 30 dias após término do
tratamento nos animais que apresentaram o exame de sangue a fresco negativo antes e
após imunossupressão com ciclofosfamida. Para tal 0,4 a 0,6 ml de sangue foram
coletados assepticamente no seio venoso retro-orbital e distribuídos em dois tubos de
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
25
15mL (Falcon) contendo 3mL de LIT. Os tubos foram incubados em estufa a 28oC e
homogeneizados a cada 48h. As hemoculturas foram examinadas aos 30, 45 e 60 dias
após a sua realização.
A técnica de PCR utilizada foi a de Britto e cols. (1995) modificada por Gomes
e cols. (1998). Para a realização dos testes foram coletados 200µl de sangue de cada
animal pelo plexo venoso retro-orbital e adicionados ao dobro de solução de Guanidina-
HCl/EDTA 6,0M, pH 8,0 (ÁVILA e cols., 1991). As amostras de sangue foram
estocadas por uma semana a temperatura ambiente, fervidas a aproximadamente 100ºC
por sete minutos e estocadas à temperatura ambiente até o momento do uso,
modificando desse modo o protocolo de Britto e cols. (1993).
A extração do DNA foi feita com Fenol: Clorofórmio (1:1), precipitada com
acetato de sódio 3,0M e álcool absoluto gelado, e lavada duas vezes com álcool 70%
gelado, com uma modificação em Gomes e cols. (1998). Após a extração, o DNA foi
amplificado utilizando iniciadores específicos descritos por Ávila e cols. (1990), os
quais anelam nas microrregiões conservadas do minicírculo do k-DNA para
amplificação dos fragmentos da região variável.
Foram realizados 35 ciclos de amplificação realizados em termociclador
automático (MinCycler TM). As condições da reação foram: desnaturação do DNA a
95ºC por um minuto (a 1
a
etapa foi por cinco minutos), anelamento dos iniciadores a
65ºC por um minuto e extensão a 72º C por um minuto (último ciclo, 10 minutos).
Nas etapas de preparo do DNA e mistura da reação da PCR sempre foram
utilizados controles negativos com amostras de sangue de camundongos não infectados
e controles positivos de camundongos infectados na fase aguda da doença.
Os produtos amplificados pela PCR foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida a 6% e revelados pela prata (SANTOS e cols., 1993).
3.4.2 Exames sorológicos
Foram coletados 0,4 - 0,5 mL de sangue no seio venoso retro-orbital dos animais
tratados e transferidos para tubos de microcentrífuga de 1,5mL. Após centrifugação, de
3.000rpm durante 10 minutos, o sobrenadante (soro) foi estocado a -20ºC. As coletas
foram feitas antes da imunossupressão, 30 dias após a imunossupressão e seis meses
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
26
após o tratamento. A ELISA foi realizada segundo metodologia descrita por Voller e
cols. (1976) utilizando antígenos da forma epimastigota da cepa Y do T. cruzi, obtidos
de cultivo acelular em meio LIT. Como conjugado foi utilizada uma anti-
imunoglobulina de camundongo, da classe IgG, obtida de soro imune de cabra e
marcada com peroxidase (SIGMA, Chemical Company, USA).
O teste foi executado em microplacas de poliestireno de 96 orifícios com fundo
chato. Cada orifício da placa foi tratado com 100µl do extrato antigênico de
epimastigotas, extraídos por NaOH de acordo com Vitor & Chiari (1987) na
concentração ideal definida previamente por titulação, diluído em solução tampão
carbonato (pH 9,6), seguindo-se incubação durante 18h a 4
o
C. Em seguida, foram
adicionados 100µl do soro diluído 1:40 em PBS Tween 0,05%, incubados a 37ºC por 45
minutos, e posteriormente, foi adicionado o conjugado, uma anti-IgG de camundongo
marcada com peroxidade. As placas foram incubadas por 45 minutos a 37
o
C, e a seguir
foi adicionado o substrato (3µg de O-fenilenodiamino-OPD em 15mL de solução de
ácido cítrico e 3µl de H
2
0
2
30 vol). Entre cada etapa as placas foram submetidas a
quatro lavagens. A reação foi interrompida com ácido sulfúrico 4,0N (32µl por orifício)
e a leitura realizada em leitor de microplaca (BIO RAD, Modelo 3550) com filtro de
490nm.
Em cada placa foram adicionados 10 soros controles negativos e dois controles
positivos. A absorbância discriminante foi calculada tomando-se a média da
absorbância dos 10 soros negativos somados a dois desvios padrão.
3.5 Caracterização biológica
As populações isoladas de cães foram inoculadas em camundongos Swiss e
submetidas a estudos comparativos, de acordo com os parâmetros descritos abaixo.
3.5.1 Análise da virulência e da patogenicidade
Os experimentos foram realizados de acordo com o delineamento experimental
(Figura 1). Foram inoculados seis camundongos Swiss com 5 × 10
3
tripomastigotas
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
27
sangüíneos, via intraperitoneal, para a avaliação da infectividade, curva de parasitemia e
mortalidade em cada fase.
3.5.1.1 Infectividade
A infectividade de cada isolado foi verificada pela presença ou não de parasitos
no sangue periférico dos camundongos, por exame de sangue a fresco. Também foi
realizada a hemocultura para confirmação de infecção naqueles camundongos que
permaneceram negativos no exame de lâmina de sangue a fresco até 10 dias depois de
infectados. As hemoculturas eram examinadas aos 30, 45 e 60 dias após terem sido
realizadas.
3.5.1.2 Curva de parasitemia
Para a avaliação da parasitemia, 5µl de sangue foram coletados diariamente dos
vasos sangüíneos da ponta da cauda do animal, a partir do 4
o
dia de infecção e a
quantificação da parasitemia foi realizada segundo a técnica descrita por Brener (1962).
A parasitemia foi avaliada até a observação de quatro dias consecutivos sem detecção
de parasitos no sangue periférico. As curvas de parasitemia obtidas representam a média
de parasitos do grupo de animais examinados.
Foi traçada a curva de parasitemia dos seis animais controles não tratados e dos
10 animais tratados a cada cinco passagens sangüíneas sucessivas, durante os ciclos
sucessivos de tratamento, até a estabilidade dos níveis de susceptibilidade/resistência ao
fármaco. Também foram realizadas as curvas de parasitemia dos animais controles não
tratados e animais tratados infectados com parasitos provenientes de seis e 12 meses de
manutenção em passagens sangüíneas sucessivas e meio de cultura acelular.
3.5.1.3 Mortalidade
A taxa de mortalidade total foi calculada pela detecção de todos os
camundongos não tratados com Bz que morreram devido à infecção, durante a
SANTOS, FM MATERIAL E MÉTODOS
28
realização da curva de parasitemia. Os animais ficaram sob observação por um período
de 120 dias após a inoculação. Os resultados estão expressos em percentagem.
4. RESULTADOS
SANTOS, FM RESULTADOS
30
4.1 Caracterização biológica das cepas parentais Berenice-62 e Berenice-78
e das populações isoladas de cães: Be-62A e Be-62B, e Be-78C, Be-78D e Be-78E
As curvas de parasitemia obtidas de camundongos inoculados com a cepa
parental Be-62 de T. cruzi e com os isolados Be-62A e B (isolados de cães com 10 anos
de infecção) na 1
a
passagem sangüínea em camundongos, estão apresentadas no gráfico
1. Foram observados 100% de infectividade nos animais inoculados com a cepa parental
e com os respectivos isolados.
Os camundongos inoculados com a cepa Be-62 parental de T. cruzi e com o
isolado Be-62A e B apresentaram período pré-patente de 5, 7 e 8 dias, respectivamente.
O período de patência da parasitemia foi de 12 e 13 dias entre os animais inoculados
com os isolados Be-62A e B, respectivamente. Os animais inoculados com a cepa
parental Be-62 apresentaram 100% de mortalidade até o 20
o
dia de infecção. Não foi
observada mortalidade entre os camundongos inoculados com os diferentes isolados.
O pico médio de parasitemia apresentado pelos camundongos inoculados com a
cepa parental Be-62 ocorreu no 11
o
dia de infecção com 195.833 tripomastigotas/0,1mL
de sangue. Também nos isolados Be-62A e B, o número máximo de parasitos
observados no sangue dos animais foi verificado entre o 11
o
e 12
o
dia de infecção, tendo
sido detectados 3.333 tripomastigotas/0,1mL de sangue.
SANTOS, FM RESULTADOS
31
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-62
Be-62A 1ªp
Be-62B 1ªp
Gráfico 1- Curvas de parasitemia realizadas em camundongos Swiss inoculados com
5000 tripomastigotas sangüíneos da cepa Be-62 parental de Trypanosoma cruzi e com
os isolados Be-62A e B, após a 1
a
passagem sangüínea em camundongos.
As curvas de parasitemia obtidas de camundongos inoculados com a cepa
parental Be-78 de T. cruzi e com os isolados Be-78C, D e E (isolados de cães com dois
a 10 anos de infecção) estão apresentadas no gráfico 2. Foram observados 100% de
infectividade nos animais inoculados com a cepa parental e com os respectivos isolados.
O período pré-patente foi de 5, 8, 9 e 12 dias após a inoculação nos animais com
a cepa parental Be-78, e com os isolados Be-78C, D e E, respectivamente. O período de
patência da parasitemia também foi variável entre a cepa parental e os diferentes
isolados do T. cruzi, sendo detectados parasitos no sangue periférico durante 24, 66, 14
e 20 dias nos animais inoculados com a cepa parental Be-78 e com os isolados Be-78C,
D e E, respectivamente.
Também foi observada uma variação dos níveis de parasitemia entre a cepa Be-
78 parental e os seus respectivos isolados. Os camundongos infectados com a cepa
parental apresentaram o pico de parasitemia no 17
o
dia de infecção, quando foram
detectados 95.000 tripomastigotas/0,1mL de sangue. Por outro lado, não foram
detectados picos definidos de parasitemia no sangue dos animais inoculados com os
diferentes isolados avaliados. O nível máximo de parasitemia foi observado no 25
o
dia
de infecção (84.167 tripomastigotas/0,1mL de sangue), no 10
o
dia de infecção (4.167
SANTOS, FM RESULTADOS
32
tripomastigotas/0,1mL de sangue), e no 21
o
dia de infecção (3.333, tripomastigotas/
0,1mL de sangue), entre os animais inoculados com os isolados Be-78C, D e E,
respectivamente. Não foi observada mortalidade entre os animais infectados com a cepa
parental e com os respectivos isolados de T. cruzi até o 120
o
dia de infecção.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78
Be-78C 1ªp
Be-78D 1ªp
Be-78E 1ªp
Gráfico 2 - Curvas de parasitemia realizadas em camundongos Swiss inoculados com
5000 tripomastigotas sangüíneos da cepa Be-78 parental de Trypanosoma cruzi e com
os isolados Be-78C, D e E, após a 1
a
passagem sangüínea em camundongos.
4.2 Indução de resistência ao benznidazol
Para a indução da resistência ao Bz os diferentes isolados do T. cruzi foram
mantidos em ciclos sucessivos de tratamento (CST). Após o tratamento os
camundongos foram imunossuprimidos com ciclofosfamida, e os parasitos obtidos após
a reativação da parasitemia foram inoculados em novos camundongos e, assim
sucessivamente.
A determinação da cura parasitológica foi realizada pelos exames: sangue a
fresco (antes e após imunossupressão com ciclofosfamida), hemocultura, sorologia e
PCR. Os animais que não apresentaram a reativação da parasitemia foram submetidos à
coleta de sangue para a realização da hemocultura, sorologia e PCR. Quando os
SANTOS, FM RESULTADOS
33
resultados da hemocultura e da sorologia eram discordantes (sorologia positiva e
hemocultura negativa), a cura parasitológica foi definida pela PCR. Uma população do
T. cruzi foi considerada 100% resistente ao fármaco quando os resultados de todos os
testes utilizados no controle de cura foram positivos em pelo menos quatro CST.
A figura 2 ilustra um gel de poliacrilamida 6%, revelado pela prata, obtido após
a eletroforese dos produtos de amplificação, por PCR, das regiões de ~330 pb dos
minicírculos do kDNA do T. cruzi, encontrado no sangue de animais tratados e não
curados. Podem ser observados os resultados de 10 camundongos positivos inoculados
com tripomastigotas sangüíneos provenientes de CST com BZ no 10
o
CST do isolado
Be-78D e no 5
o
CST do isolado Be-78E e, com tripomastigotas metacíclicos
provenientes da manutenção em meio LIT por seis meses do isolado Be-78E.
Entre as populações do T. cruzi mantidas em CST foram observados variações,
especialmente no número de CST necessários para que as diferentes populações
adquirissem 100% de resistência ao fármaco.
Na tabela 2 estão apresentados os resultados da avaliação do controle de cura
dos animais inoculados com os isolados Be-62A e Be-62B mantidos por CST. Apesar
de 50% dos animais inoculados com o isolado Be-62A e tratados com Bz terem
apresentado PCR positiva, não foi possível continuar os experimentos, pois todos os
testes de exame de sangue a fresco e hemocultura foram negativos. Por outro lado, o
isolado Be-62B apresentou níveis crescentes de testes positivos, mostrando 100% de
resultados persistentemente positivos em todos os testes utilizados no controle de cura a
partir do 11
o
CST.
Figura 2 – Diagnóstico com gel de poliacrilamida 6%, obtido após a eletroforese dos
produtos de amplificação, por PCR, das regiões de ~330pb dos minicírculos do kDNA
do Trypanosoma cruzi, encontrado no sangue de animais tratados e não curados.
PM
C+ B C-
C+
300 pb
330 pb
SANTOS, FM RESULTADOS
34
Tabela 2 – Percentual de positividade dos animais em testes sorológicos comparados
aos resultados positivos dos testes parasitológicos (Testes Sorológicos +/ Testes
Parasitológicos +) realizados em camundongos inoculados com os isolados Be-62A e
Be-62B de Trypanosoma cruzi.
TS – Testes sorológicos
TP – Testes parasitológicos
A discriminação dos resultados de cada teste utilizado para o controle de cura
dos animais inoculados com o isolado Be-62B mantido em CST está apresentada no
gráfico 3. Neste gráfico pode ser observado que após o 11
o
ciclo de tratamento todos os
Isolados
Manutenção
Be-62A
(% TS/ %TP)
Be-62B
(% TS/ %TP)
1
o
CST
85,7 / 50 100 / 60
2
o
CST
- 100 / 90
3
o
CST
- 100 / 90
4
o
CST
- 100 / 77,8
5
o
CST
- 100 / 100
6
o
CST
- 100 / 100
7
o
CST
- 100 / 100
8
o
CST
- 100 / 100
9
o
CST
- 100 / 100
10
o
CST
- 83,3 / 90
11
o
CST
- 100 / 100
12
o
CST
- 100 / 100
13
o
CST
- 83,3 / 100
14
o
CST
- 100 / 100
15
o
CST
- 100 / 100
16
o
CST
- 100 / 100
SANTOS, FM RESULTADOS
35
animais apresentaram reativação da parasitemia após a imunossupressão com
ciclofosfamida, não sendo mais necessário a utilização dos outros testes para a
determinação da cura terapêutica.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de reultados positivos
1ºCST 3ºCST 5ºCST 7ºCST 9ºCST 11ºCST 13ºCST 15ºCST
Be-62B
Reativação natural Imunossupressão Hemocultura PCR
Gráfico 3 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sangüíneos da população Be-62B de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.
Na tabela 3 estão apresentados os resultados da avaliação do controle de cura
dos animais inoculados com os isolados Be-78C, Be-78D e Be-78E, mantidos por CST.
Foi observado 100% de resultados positivos em todos os testes utilizados no controle de
cura dos animais a partir do 2
o
, 15
o
e 6
o
CST para os isolados Be-78C, Be-78D e Be-
78E, respectivamente.
SANTOS, FM RESULTADOS
36
Tabela 3 – Percentual de positividade dos aniamais em testes sorológicos comparados
aos resultados positivos de testes parasitológicos (Testes Sorológicos +/ Testes
Parasitológicos +) realizados em camundongos inoculados com os isolados Be-78C, Be-
78D e Be-78E de Trypanosoma cruzi.
NR = Não realizado
TS = Testes sorológicos
TP = Testes parasitológicos
No gráfico 4 estão representados os resultados individuais dos diferentes testes
utilizados no controle de cura dos camundongos inoculados com o isolado Be-78C de T.
Isolados
Manutenção
Be-78C
(% TS/ %TP)
Be-78D
(%TS / %TP)
Be-78E
(% TS/ %TP)
1
o
CST
100 / 90 100 / 70 100 / 90
2
o
CST
100 / 100 NR / 90 100 / 75
3
o
CST
100 / 100 100 / 62,5 100 / 14,3
4
o
CST
100 / 100 100 / 100 100 / 88,9
5
o
CST
100 / 100 100 / 100 100 / 90
6
o
CST
100 / 100 100 / 100 100 / 100
7
o
CST
100 / 100 85,7 / 90 100 / 100
8
o
CST
100 / 100 100 / 90 100 / 100
9
o
CST
100 / 100 100 / 100 100 / 100
10
o
CST
100 / 100 100 / 100 100 / 100
11
o
CST
- 100 / 100 100 / 100
12
o
CST
- 100 / 100 -
13
o
CST
- 100 / 100 -
14
o
CST
- 100 / 90 -
15
o
CST
- 100 / 100 -
16
o
CST
- 100 / 100 -
17
o
CST
- 100 / 100 -
18
o
CST
- 100 / 100 -
SANTOS, FM RESULTADOS
37
cruzi durante os CST. É importante observar que a partir do 5
o
ciclo de tratamento com
Bz apenas o exame de sangue a fresco foi suficiente para a detecção da falha
terapêutica.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de resultados positivos
1ºCST 3ºCST 5ºCST 7ºCST 9ºCST
Be-78C
Reativação natural Imunossupressão Hemocultura PCR
Gráfico 4 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sangüíneos da população Be-78C de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.
O gráfico 5 mostra o aumento de resistência da população Be-78C no decorrer
dos CST, onde pode ser observado que no 1
o
CST a parasitemia foi suprimida após
quatro dias de tratamento com Bz. Por outro lado, no 10
o
CST não foi observada a
supressão da parasitemia durante o período de tratamento, todos os camundongos
tratados apresentaram parasitemia patente durante todo o curso do tratamento. É
importante ressaltar que nos experimentos realizados com as populações Be-62B, Be-
78D e Be-78E, apesar de ter sido observada a indução de 100% de resistência ao Bz,
sempre foi observada a supressão da parasitemia dois a três dias após o início do
tratamento específico.
SANTOS, FM RESULTADOS
38
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 20 40 60 80 100 120
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78C 1ºCST
Be-78C 10ºCST
Gráfico 5 – Curvas de parasitemia obtidos de camundongos infectados com 5000
tripomastigotas sangüíneos da população Be-78C de Trypanosama cruzi, durante o 1
o
e
o 10
o
ciclos de tratamento com benznidazol.
No gráfico 6 estão demonstrados os resultados dos diferentes testes utilizados no
controle de cura dos animais infectados com o isolado Be-78D do T. cruzi, e submetidos
a CST com o Bz. Apesar de ter sido detectada a indução de 100% de resistência ao Bz,
esta ocorreu mais lentamente em relação à população Be-78C. Além disso, não foi
observada reativação espontânea da parasitemia após o tratamento.
SANTOS, FM RESULTADOS
39
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de resultados positivos
1ºCST 3ºCST 5ºCST 7ºCST 9ºCST 11ºCST 13ºCST 15ºCST 17ºCST
Be-78D
Reativação natural Imunossupressão Hemocultura PCR
Gráfico 6 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sangüíneos da população Be-78D de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.
No gráfico 7 foram representados os percentuais de resistência ao Bz (resultados
positivos nos testes parasitológicos de controle de cura) observados em camundongos
inoculados com parasitos provenientes de CST da população Be-78E. Neste isolado foi
observado, inicialmente, a redução dos níveis de resistência ao Bz, não sendo possível
manter esta população através de CST até o 4
o
esquema de tratamento com Bz em
camundongos. Para inóculo dos camundongos do 4
o
CST foi realizada passagem
alternativa com tripomastigotas provenientes da hemocultura positiva de um
camundongo do 3
o
ciclo de tratamento, pois não houve reativação da parasitemia entre
os camundongos após o 3
o
CST, nem mesmo com a utilização de imunossupressão.
Entretanto, no 4
o
CST foi observado um aumento do nível de resistência ao fármaco,
ocorrendo reativação da parasitemia induzida pela imunossupressão, entre seis
camundongos. Neste caso, foi possível a manutenção dos parasitos em CST. A partir do
6
o
CST este isolado passou a apresentar 100% de resistência ao Bz. Além disso, a partir
do 9
o
CST todos os camundongos tratados passaram a apresentar reativação da
SANTOS, FM RESULTADOS
40
parasitemia após a imunossupressão com ciclofosfamida, não sendo necessária a
utilização de nenhum outro teste para a determinação da cura terapêutica.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de resultados positivos
1ºCST 3ºCST 5ºCST 7ºCST 9ºCST 11ºCST
Be-78E
Reativação natural Imunossupressão Hemocultura PCR
Gráfico 7 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sangüíneos da população Be-78E de
Trypanosoma cruzi, isolados de camundongos imunossuprimidos com ciclofosfamida
após ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol.
Para verificar a estabilidade da resistência ao Bz, induzida por CST, as
populações do T. cruzi consideradas 100% resistentes passaram a ser mantidas através
de passagens sangüíneas sucessivas (PSS) em camundongos não tratados, e em meio de
cultura acelular (CA). Após seis e 12 meses de manutenção foi realizada nova
determinação do grau de resistência ao fármaco, sendo os resultados obtidos
apresentados no gráfico 8. Após seis meses de manutenção, com exceção do isolado Be-
78E mantido em meio de cultura acelular, todos os isolados continuaram a apresentar
100% de resistência ao Bz. Entretanto, na maioria dos isolados foi detectada uma maior
dificuldade em se determinar a falha terapêutica, pois com exceção do isolado Be-78C,
foi necessário a utilização da hemocultura e/ou PCR como critério de cura. Além disso,
nos animais infectados com parasitos do isolado Be-78C, mantido em meio de cultura
SANTOS, FM RESULTADOS
41
acelular, foi observada a supressão da parasitemia durante o período de tratamento, e
não foi detectada a reativação natural da parasitemia após o término do tratamento.
Por outro lado, quando o isolado Be-78C, 100% resistente ao Bz, foi mantido
durante 12 meses por passagens sangüíneas sucessivas em camundongos ou em meio de
cultivo acelular foi verificada nova alteração no grau de resistência ao fármaco. O
isolado Be-78C mantido por PSS em camundongos continuou apresentando 100% de
resistência ao Bz, entretanto, não foi observada a reativação natural da parasitemia em
nenhum dos camundongos tratados. Além disso, apenas 50% dos animais inoculados
com o parasito mantido por 12 meses em meio LIT apresentaram cura parasitológica,
indicando nova alteração do grau de resistência ao Bz desta população do T. cruzi.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de resultados positivos
B
e
-
6
2
B
6
P
S
S
B
e
-
6
2
B
6
C
A
B
e
-
7
8
C
6
P
S
S
B
e
-
7
8
C
6
C
A
B
e
-
7
8
C
1
2
P
S
S
B
e
-
7
8
C
1
2
C
A
B
e
-
7
8
D
6
P
S
S
B
e
-
7
8
D
6
C
A
B
e
-
7
8
E
6
P
S
S
B
e
-
7
8
E
6
C
A
Reativação natural Imunossupressão Hemocultura PCR
Gráfico 8 – Resultados dos diferentes testes utilizados no controle de cura obtidos de
camundongos inoculados com tripomastigotas sangüíneos das populações Be-62B, Be-
78C, D e E de Trypanosoma cruzi mantidos através de passagens sangüíneas sucessivas
em camundongos não tratados e em meio de cultura acelular durante seis e 12 meses
após a indução de resistência ao benznidazol.
6 PSS e 12 PSS – parasitos mantidos 6 e 12 meses através de passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos não tratados
6 CA e 12 CA – parasitos mantidos 6 e 12 meses em meio de cultura acelular (meio LIT)
SANTOS, FM RESULTADOS
42
A alteração dos níveis de resistência ao Bz da população Be-78C pode ser
observada, também, pela quantificação da parasitemia durante e após o período de
tratamento. Nos animais infectados com parasitos mantidos durante seis meses por PSS
em camundongos não foi observada a supressão da parasitemia durante todo o período
de tratamento (gráfico 9A). Entretanto, nos animais infectados com parasitos mantidos
durante 12 meses por PSS em camundongos, foi observada a supressão da parasitemia
no 14
o
dia após o início do tratamento, não tendo sido observada a reativação
espontânea da parasitemia após o término do tratamento.
De forma interessante, quando os parasitos da população Be-78C foram
mantidos em cultura acelular durante seis meses e um ano foi observado a supressão da
parasitemia no 9
o
e no 5
o
dia após o início do tratamento (gráfico 9B). Estes dados
mostram uma maior redução do nível de resistência ao Bz quando os parasitos são
mantidos em meio LIT.
SANTOS, FM RESULTADOS
43
A
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100 120 140
Dias após a nfecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78C 6MPSS
Be-78C 12MPSS
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25 30 35
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78C 6MCA
Be-78C 12MCA
B
Gráfico 9 – Curvas de parasitemia obtidos de camundongos infectados com 5000
tripomastigotas sangüíneos da população Be-78C de Trypanosoma cruzi, e tratados com
benznidazol após a manutenção durante seis e 12 meses através de passagens sucessivas
em camundongos não tratados (A) e em meio LIT (B).
SANTOS, FM RESULTADOS
44
4.3 Caracterização biológica das populações Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-
78E mantidas em ciclos sucessivos de tratamento e das populações 100% resitentes
ao benznidazol dos isolados Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E após mantidos na
ausência do fármaco
Para verificar se o aumento da resistência ao Bz seria acompanhado de
alterações nas outras propriedades biológicas de cada uma das populações do T. cruzi
avaliadas, foi realizada uma curva de parasitemia em camundongos não tratados a cada
cinco CST. Nestes experimentos, além das taxas de infectividade, foram avaliados os
períodos pré-patentes e de patência da parasitemia, o perfil das curvas de parasitemia, e
a taxa de mortalidade. De maneira geral não foram detectadas alterações importantes
nos parâmetros avaliados no decorrer dos CST.
Do mesmo modo, também foram avaliadas as propriedades biológicas das
populações provenientes do último CST de cada isolado (100% resistentes ao Bz)
depois de mantidos por seis e 12 meses em passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos não tratados e em meio de cultura acelular. As propriedades biológicas
também foram avaliadas pelas taxas de infectividade, períodos pré-patentes e de
patência da parasitemia, taxas de mortalidade e pelos perfis das curvas de parasitemia
realizadas em camundongos não tratados. De um modo geral, ocorreram pequenas
alterações nos perfis biológicos analisados quando parasitos anteriormente mantidos em
CST, passaram a ser mantidos na ausência de tratamento específico.
O gráfico 10 mostra as curvas de parasitemia obtidas em camundongos Swiss
inoculados com tripomastigotas sangüíneos provenientes do 1
o
, 5
o
, 10
o
e 16
o
CST do
isolado Be-62B. As taxas de infectividade foram de 100%, 66,7%, 100% e 83,3%, nos
camundongos inoculados com parasitos provenientes dos respectivos CST: 1
o
, 5
o
, 10
o
e
16
o
. O período pré-patente verificado nos grupos de animais infectados no 1
o
, 5
o
, 10
o
e
16
o
CST foi de oito, sete, cinco e seis dias e o período de patência foi de 13, nove, 15 e
10 dias para os grupos de animais infectados no 1
o
, 5
o
, 10
o
e 16
o
CST, respectivamente.
O pico de parasitemia ocorreu no 11
o
dia (3.333 tripomastigotas/0,1mL de sangue), no
17
o
dia (6.667 tripomastigotas/0,1mL de sangue), no 10
o
dia (4167
tripomastigotas/0,1mL de sangue) e no 12
o
dia (5.833 tripomastigotas/0,1mL de sangue)
após a infecção dos animais inoculados com parasitos provenientes do isolado Be-62B
SANTOS, FM RESULTADOS
45
no 1
o
, 5
o
, 10
o
e 16
o
CST, respectivamente. Não foi observada a morte de nenhum animal
até o 120
o
dia após a infecção.
Da mesma forma, não foi observada alteração nos parâmetros biológicos
avaliados quando camundongos Swiss foram inoculados com tripomatigotas
provenientes do 16
o
CST, após manutenção por seis meses de PSS em camundongos
não tratados e em CA no meio LIT (Gráfico 10B). A taxa de infectividade foi de 100%
em todos os animais dos grupos PSS e CA. Foi observado um período pré-patente de
sete dias nos grupos de camundongos inoculados com parasitos provenientes de PSS e
CA. O período de patência da parasitemia foi de oito e 12 dias nos grupos PSS e CA,
respectivamente. O pico de parasitemia ocorreu no 11
o
(PSS) e no 12
o
(CA) dia de
infecção, com 3.333 tripomastigotas/0,1mL de sangue. Também não foi observada
morte de nenhum animal.
SANTOS, FM RESULTADOS
46
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25 30 35
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1 mL de sangue
Be-62B 1ªp em CST
Be-62B 5ªp em CST
Be-62B 10ªp em CST
Be-62B 16ªp em CST
A
0
1
2
3
4
0 5 10 15 20 25 30
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-62B 6MPSS
Be-62B 6MCA
B
Gráfico 10 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-62B, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
, 10
o
e 16
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 16
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular.
O gráfico 11A mostra as curvas de parasitemia realizadas em camundongos
Swiss inoculados com tripomastigotas sangüíneos do 1
o
, 5
o
e 10
o
CST realizado com o
SANTOS, FM RESULTADOS
47
isolado Be-78C. Foi observado 100% de infectividade em todos os animais inoculados
com os diferentes CST do isolado Be-78C. Os períodos pré-patentes foram de oito, 11 e
oito dias, com período patente de 67, 64 e 70 dias, nos animais inoculados com
parasitos do 1
o
, 5
o
e 10
o
CST, respectivamente. O maior nível de parasitemia ocorreu no
25
o
dia de infecção (84.167 tripomastigotas/0,1mL de sangue) no 1
o
CST, no 33
o
dia
após a infecção (196.667 tripomastigotas/0,1mL de sangue) entre os camundongos
inoculados com parasitos do 5
o
CST, e no 45
o
dia de infecção, com 238.000
tripomastigotas/0,1mL de sangue no último CST. Foi observado 17% de mortalidade
entre os animais do 1
o
e 10
o
CST, e nenhuma morte entre os camundongos do 5
o
CST,
avaliados até 120 dias após infecção.
O gráfico 11B mostra as curvas de parasitemia obtidas de animais inoculados
com tripomatigotas provenientes do 10
o
CST, após a manutenção por seis e 12 meses
em PSS e CA. A taxa de infectividade foi de 100% nos animais inoculados com as
diferentes manutenções dos parasitos do 10
o
CST (PSS e CA por seis e 12 meses).
Foram observados períodos pré-patentes de cinco a sete dias nos grupos de animais
inoculados com tripomastigotas provenientes de seis e 12 meses de manutenção em PSS
e CA. Entre os camundongos inoculados com tripomastigotas obtidos da manutenção
em PSS foi observada uma redução do período de patência da parasitemia, de 85 para
42 dias quando o parasito foi mantido por seis e 12 meses, respectivamente. Por outro
lado, o pico de parasitemia foi maior nos animais inoculados com tripomastigotas
provenientes de 12 meses em PSS (2.386.000 tripomastigotas/0,1mL de sangue) em
relação aos mantidos por seis meses de PSS (915.500 tripomastigotas/0,1mL de
sangue).
Já nos camundongos inoculados com parasitos provenientes do 10
o
CST
mantidos por seis e 12 meses em cultura acelular foi observado o mesmo período de
patência da parasitemia (52 dias). Entretanto, foi detectado um decréscimo da
parasitemia com o decorrer da manutenção em meio LIT, com pico máximo de 996.400
tripomastigotas/0,1mL de sangue após seis meses, e 16.000 tripomastigotas /0,1mL de
sangue após 12 meses de manutenção.
As taxas de mortalidade avaliadas por 120 dias após infecção foram de 0%, 67%, 17% e
0% no grupo de animais inoculados com parasitos do 10
o
CST mantidos seis e 12 meses
em PSS de camundongos não tratados e em CA, respectivamente.
SANTOS, FM RESULTADOS
48
0
50
100
150
200
250
300
0 20 40 60 80 100
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/ 0,1mL de sangue
Be-78C 1ªp em CST
Be-78C 5ªp em CST
Be-78C 10ªp em CST
A
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 20 40 60 80 100
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/ 0,1mL de sangue
Be-78C 6MPSS
Be-78C 6MCA
Be-78C 12MPSS
Be-78C 12MCA
B
Gráfico 11 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78C, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
e 10
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 10
o
CST após
manutenção por seis e 12 meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular.
SANTOS, FM RESULTADOS
49
O gráfico 12A mostra as curvas de parasitemia obtidas de camundongos
inoculados com tripomastigotas provenientes do 1
o
, 5
o
, 10
o
e 18
o
CST do isolado Be-
78D. Os camundongos inoculados com parasitos do 5
o
CST apresentaram 83,3% de
infectividade, ao passo que nos demais CST avaliados, as taxas de infectividades foram
de 100%. Os períodos pré-patentes foram de seis a nove dias entre os animais infectados
com parasitos dos diferentes CST. Em todos os experimentos foram observados,
também, períodos de patência da parasitemia semelhantes, que foram quatro, 21, 24 e
16 dias para o 1
o
, 5
o
, 10
o
e 18
o
CST, respectivamente. O pico de parasitemia ocorreu
entre o 10
o
e o 12
o
dia de infecção, tendo sido detectados 4.167, 2.667, 4.167 e 6.667
tripomastigotas/0,1mL de sangue no grupo de animais inoculados com parasitos do 1
o
,
5
o
, 10
o
e 18
o
CST, respectivamente. Foi observada mortalidade apenas no grupo de
camundongos inoculados no 1
o
CST do isolado Be-78D, com 17% dos camundongos
mortos dentro do período avaliado (120
o
dia de infecção).
No Gráfico 12B foram traçadas as médias das curvas de parasitemia detectadas
nos camundongos inoculados com parasitos do último CST do isolado Be-78D
mantidos por seis meses em PSS em camundongos não tratados e em CA. Foi observada
100% de infectividade entre todos os animais. O período pré-patente foi de cinco a seis
dias entre os camundongos inoculados com as diferentes manutenções dos parasitos
provenientes do 18
o
CST. Os períodos de patência observados foram iguais a 21 dias em
ambos os grupos, PSS e CA. O pico da parasitemia ocorreu no 11
o
dia de infecção em
ambas as curvas traçadas, tendo sido detectados 25.000 e 18.000 tripomastigotas/0,1mL
de sangue entre os animais inoculados com parasitos provenientes do 18
o
CST e
mantidos por seis meses de PSS em camundongos não tratados e em CA,
respectivamente. A taxa de mortalidade foi de 17% no grupo PSS e de 0% no grupo
CA, avaliada até 120 dias após o inóculo dos camundongos.
SANTOS, FM RESULTADOS
50
0
2
4
6
8
0 5 10 15 20 25 30 35
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78D 1ªp em CST
Be-78D 5ªp em CST
Be-78 D 10ªp em CST
Be-78D 18ªp em CST
A
0
10
20
30
0 5 10 15 20 25 30 35
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78D 6MPSS
Be-78D 6MCA
B
Gráfico 12 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78D, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
, 10
o
e 18
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 18
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular.
SANTOS, FM RESULTADOS
51
O gráfico 13A mostra as curvas de parasitemia traçadas no grupo de animais
inoculados com parasitos provenientes do 1
o
, 5
o
e 11
o
CST do isolado Be-78E de T.
cruzi. A taxa de infecção foi de 100% entre todos os animais. Os períodos pré-patentes
observados foram de 12, seis e 11 dias, entre os animais inoculados com parasitos do 1
o
,
5
o
e 11
o
CST, respectivamente. O período de patência observado foi de 20 dias na 1
a
passagem sangüínea e de 25 e sete dias no grupo de camundongos inoculados com
parasitos do 5
o
e 11
o
CST do isolado Be-78E. O pico máximo de parasitemia foi
detectado no 21
o
dia (3.333 tripomastigotas/ 0,1mL de sangue), no 8
o
dia (5.000
tripomastigotas/ 0,1mL de sangue) e entre o 12
o
e 16
o
dia (1.333 tripomastigotas/ 0,1mL
de sangue) após a infecção de camundongos com tripomastigotas do isolado Be-78E
provenientes do 1
o
, 5
o
e 11
o
CST. Não foi verificada a morte dos animais até o 120
o
dia
de infecção.
No Gráfico 13B foram traçadas as curvas com as médias de parasitemia
detectadas em camundongos inoculados com parasitos provenientes do 11
o
CST do
isolado Be-78E mantidos em PSS de camundongos não tratados e em CA por seis
meses. A taxa de infectividade observada foi de 100% entre todos os animais. Foi
observado igual período pré-patente, de oito dias, entre ambos os grupos de animais
(PSS e CA). O período patente foi de 12 e cinco dias entre os grupos PSS e CA,
respectivamente. O pico da parasitemia foi verificado no 10
o
dia de infecção em ambos
os grupos de camundongos, tendo sido detectados 4.000 e 2.500 tripomastigotas/0,1mL
no grupo de animais inoculados com parasitos provenientes das manutenções por seis
meses em PSS e em cultura acelular, respectivamente. Foi observado 17% de
mortalidade em ambos os grupos de animais inoculados com parasitos do 11
o
CST
mantidos seis meses em PSS e em CA, avaliados por um período de 120 dias após a
infecção pelo T. cruzi.
SANTOS, FM RESULTADOS
52
0
1
2
3
4
5
0 10 20 30 40
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78E 1ªp em CST
Be-78E 5ªp em CST
Be-78E 11ªp em CST
A
0
1
2
3
4
5
0 5 10 15 20 25 30
Dias após a infecção
Nº de tripomastigotas × 10³/0,1mL de sangue
Be-78E 6MPSS
Be-78E 6MCA
B
Gráfico 13 – Curvas de parasitemia em camundongos Swiss inoculados com 5000
tripomastigotas do isolado Be-78E, provenientes: (A) da 1
a
passagem sangüínea em
camundongos e do 5
o
e 11
o
ciclos sucessivos de tratamento; (B) do 11
o
CST após
manutenção por seis meses em camundongos não tratados e em meio de cultura
acelular.
5. DISCUSSÃO
SANTOS, FM DISCUSSÃO
54
Recentemente foi demonstrada a indução natural de resistência ao benznidazol
em populações do T. cruzi isoladas de cães portadores de infecções crônicas (inoculados
com as cepas parentais Be-62 e Be-78 do T. cruzi). Foi observado que após o
isolamento estas populações passaram a apresentar 50 a 90% de resistência ao Bz em
camundongos (CALDAS, S.; SANTOS, F. M. e cols, dados não publicados). Neste
trabalho estas populações foram caracterizadas através da análise de parâmetros
biológicos, utilizando o camundongo como modelo experimental. Em seguida, os
parasitos foram mantidos através de diferentes formas no laboratório: através de ciclos
sucessivos de tratamento com Bz; em passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos não tratados; e em meio de cultivo acelular, por um período de
aproximadamente quatro anos. Durante este período, os isolados foram sendo
novamente caracterizados utilizando os mesmos parâmetros biológicos.
A avaliação dos parâmetros biológicos, na primeira passagem dos isolados em
camundongos, revelou diferenças marcantes entre as cepas parentais e os seus
respectivos isolados. Foram observadas reduções nos níveis de parasitemia e
mortalidade entre os isolados Be-62A e Be-62B em relação à cepa parental Be-62,
embora os perfis das curvas de parasitemia tenham sido semelhantes. Entre os isolados
da cepa parental Be-78 foi observada uma redução marcante dos níveis de parasitemia
nos animais infectados com os isolados Be-78D e Be-78E. Entretanto, os animais
inoculados com o isolado Be-78C apresentaram níveis de parasitemia semelhantes ao
observado com a cepa parental. Desta forma, pode ser observado que a maioria dos
isolados apresentaram uma redução da virulência em relação às cepas parentais.
Resultados semelhantes foram observados por diversos autores. Lana & Chiari (1986)
descreveram diferenças biológicas marcantes entre duas cepas isoladas da mesma
paciente em diferentes períodos de tempo com as cepas Be-62 e Be-78. Veloso e cols.
(2001, 2005) demonstraram também que infecções crônicas de longa duração em cães
induziram alterações nos padrões de resposta à quimioterapia com Bz, e nas
características biológicas e genéticas do parasito, em relação às cepas parentais. Os
autores demonstraram a redução da virulência para camundongos em duas populações
isoladas de cães experimentalmente infectados com a cepa Colombiana, e em duas
populações isoladas de cães infectados com a cepa Berenice-78, após 25 passagens
sangüíneas em camundongos. Os resultados apresentados por Lauria-Pires e cols. (1996,
SANTOS, FM DISCUSSÃO
55
1997) demonstraram diferenças entre populações de T. cruzi isoladas de humanos, com
doença de Chagas crônica, ao observarem padrões distintos de comportamento entre o
isolado parental e linhagem subclonal subseqüente, indicando que cada paciente
chagásico pode ser infectado com várias subpopulações de T. cruzi.
Por outro lado, Deane e cols. (1984) demonstraram que o tempo e o método de
isolamento do parasito do hospedeiro vertebrado podem agir como fatores seletivos
entre populações de T. cruzi, que podem coexistir no mesmo hospedeiro. Entretanto,
neste trabalho o isolamento do T. cruzi de todos os cães inoculados com as cepas Be-62
e Be-78 foi realizado através da mesma metodologia (hemocultura). Desse modo, todas
as populações isoladas de cães inoculados com a cepa Be-62 ou Be-78 sofreram o
mesmo processo seletivo durante o isolamento. Desta forma, não poderia ser este o fator
determinante nas diferenças comportamentais observadas entre as cepas parentais e as
populações isoladas de cães. A diversidade biológica observada entre as populações
isoladas de cães pode ser atribuída ao potencial genético de cada hospedeiro vertebrado
em selecionar clones do parasito que são mais adaptados a cada ambiente. Esta hipótese
pode ser reforçada pelos resultados de Lana & Chiari (1986) e Lana e cols. (1992) que
demonstraram ser a cepa Be-62 mais virulenta para camundongos em relação à Be-78, e
sendo a cepa Be-78 mais patogênica para cães.
Também foi demonstrada a ocorrência de alterações do nível de resistência ao
Bz nos isolados B2-62A e B, e Be-78C, D e E, em relação às cepas parentais. Os
isolados apresentaram 50% a 90% de resistência ao Bz quando inoculados em
camundongos e submetidos ao tratamento específico na primeira passagem sangüínea
(CALDAS, S.; SANTOS, F. M. e cols., dados não publicados). Os resultados deste
trabalho demonstram a ocorrência de indução natural de resistência ao Bz em
populações do T. cruzi durante uma infecção crônica de longa duração em cães
(CALDAS, S.; SANTOS, F. M. e cols., dados não publicados). Esses resultados são
interessantes, principalmente se for considerado que as cepas parentais foram
classificadas como sensíveis ao Bz por diversos autores. Filardi & Brener (1987)
demonstraram 93% de cura entre camundongos inoculados com a cepa Be-62 de T.
cruzi tratados com Bz. Por sua vez, Toledo e cols. (1995) verificaram 100% de cura
pelo tratamento com Bz entre camundongos inoculados com as cepas parentais Be-62 e
Be-78 de T. cruzi. Anteriormente, Veloso e cols. (2001) haviam verificado alteração do
SANTOS, FM DISCUSSÃO
56
grau de resistência ao Bz em duas, das cinco populações avaliadas. Neste estudo,
camundongos inoculados com os isolados Be-78B, C e D, após 25 passagens
sangüíneas em camundongos, apresentaram 100%, 50% e 70% de cura após o
tratamento com Bz (Veloso e cols., 2001). As diferenças entre os níveis de resistência
observados por Veloso e cols (2001) podem estar relacionadas ao momento da
determinação da susceptibilidade ao Bz (1
a
e 25
a
passagem sangüínea em
camundongos) ou à metodologia de controle de cura utilizada.
Neste trabalho, após realização do primeiro ciclo de tratamento em
camundongos, as populações que apresentaram algum nível de reativação da
parasitemia detectados pelo exame de sangue a fresco (antes e após imunossupressão
com ciclofosfamida) ou pela hemocultura, foram mantidas por CST com Bz em
camundongos Swiss. Apenas a população Be-62A (proveniente de cão inoculado há 10
anos) não apresentou reativação da parasitemia após o tratamento. Os 50% de
resistência ao Bz apresentados pelos camundongos inoculados com este isolado foram
verificados exclusivamente por PCR. Nas demais populações (Be-62B, Be-78C, Be-
78D e Be-78E) sempre foi observada a reativação da parasitemia (natural ou induzida
pela imunossupressão com ciclofosfamida) tornando possível a manutenção dos
parasitos em CST com Bz. Estes resultados estão de acordo com Andrade e cols. (1977)
que sugeriram a possibilidade da ocorrência de uma seleção de clones resistentes, que
poderiam diferir, em algum momento, da população original, explicando a persistência
de parasitos no hospedeiro vertebrado após tratamento prolongado. Desse modo, neste
trabalho, os parasitos resistentes ao tratamento com Bz, realizado durante 20 dias
consecutivos, foram sendo submetidos a novos CST em camundongos até que foram
observados índices com 100% de resistência ao Bz em todos os camundongos
inoculados com as populações Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E de T. cruzi.
Outros autores demonstraram anteriormente a possibilidade de indução de
resistência in vivo ao Bz, utilizando populações do T. cruzi parcialmente resistentes ao
Bz. Silva e cols. (1989) estudaram o perfil isoenzimático da cepa Y do T. cruzi isolada
de camundongos tratados e não curados com o Bz ou Nfx. Foi mostrado um aumento da
resistência das populações isoladas em relação à cepa parental, após o tratamento com o
mesmo medicamento e resistência cruzada entre Bz e Nfx. Entretanto, não houve
SANTOS, FM DISCUSSÃO
57
modificações do perfil isoenzimático destes isolados em relação à cepa Y. Também
Marreto & Andrade (1994) não detectaram alterações nos perfis isoenzimáticos, que
poderiam indicar a ocorrência de seleção clonal ou alterações genéticas dos parasitos,
em camundongos inoculados com as cepas Peruana, 21 SF e Colombiana e tratados com
Bz e Nfx.
Neste trabalho foi possível induzir 100% de resistência ao Bz em quatro, das
cinco populações do T. cruzi isoladas de cães. Entretanto, foram necessários números
variáveis de CST para a indução de 100% de resistência entre as diferentes populações
de T. cruzi. Foram necessários 11, 2, 9 e 6 CST para as populações Be-62B, Be-78C,
Be-78D e Be-78E de T. cruzi, respectivamente, até a verificação de 100% de resistência,
sendo que todas as populações persistiram resistentes ao Bz nos CST posteriores.
Também Murta & Romanha (1998) induziram 100% de resistência in vivo ao Bz após
25 ciclos sucessivos de tratamento com uma única e alta dose de Bz (500 mg de Bz/Kg
de peso corporal) em camundongos inoculados inicialmente com a cepa Y de T. cruzi
(parcialmente resistente ao Bz e Nfx, segundo FILARDI & BRENER, 1987).
Entretanto, apesar de ter sido verificado 100% de resistência em quatro das
populações estudadas, foi possível verificar uma maior proporção de parasitos
resistentes no isolado Be-78C em relação aos demais. Esta hipótese pode ser
evidenciada por: (1) o isolado Be-78C passou a apresentar reativação natural da
parasitemia a partir do 5
o
CST, e a supressão da parasitemia durante o tratamento não
foi observada no 10
o
CST; (2) o isolado Be-62B apresentou reativação da parasitemia
em 100% dos camundongos pelo exame de sangue a fresco durante imunossupressão
dos animais a partir do 11
o
CST; (3) os isolados Be-78D e E apresentaram reativação
da parasitemia pela imunossupressão em 70% a 100% dos animais, nos últimos quatro
CST, quando foi observada a estabilidade no nível de resistência ao Bz, tendo sido
necessário realizar a hemocultura para detectar os 100% de falha terapêutica. Estes
dados estão de acordo com os resultados de Murta e Romanha (1998), que sugeriram
estar a resistência das cepas de T. cruzi diretamente relacionada com as taxas de clones
sensíveis/resistentes em uma população do parasito.
Para verificar a estabilidade do fenótipo de resistência ao Bz, os parasitos
isolados do último CST das populações Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E foram
mantidos por seis a 12 meses por passagens sangüíneas sucessivas em camundongos
SANTOS, FM DISCUSSÃO
58
não tratados e, em meio de cultura acelular (LIT). Após esse período foi realizada nova
determinação da susceptibilidade ao Bz.
Após seis e 12 meses de manutenção em passagens sangüíneas em camundongos
não foram observadas alterações no grau de resistência ao Bz em nenhum dos isolados
avaliados. Resultados semelhantes foram observados por Murta & Romanha (1998), ao
manterem por nove passagens sangüíneas em camundongos não tratados, as populações
100% resistentes isoladas do 25
o
ciclo de “tratamento rápido” com Bz em camundongos
inoculados com a cepa Y do T. cruzi. Entretanto, mudanças foram verificadas quanto
aos métodos de controle de cura utilizados. No último CST realizado nas populações
Be-62B, Be-78D e Be-78E, todos os camundongos apresentaram reativação da
parasitemia pela imunossupressão com ciclofosfamida, ao passo que seis meses após a
manutenção em camundongos, na ausência de tratamento com Bz, apenas 60%, 80% e
60% dos animais tratados apresentaram a reativação da parasitemia após a
imunossupressão com ciclofosfamida. Além disso, após 12 meses de manutenção do
isolado Be-78C em passagens sangüíneas em camundongos não tratados foi observada a
supressão da parasitemia durante o tratamento, e nenhum dos camundongos tratados
apresentou a reativação natural da parasitemia após o término do tratamento.
É importante ressaltar que, anteriormente, os animais inoculados com a
população Be-78C apresentavam reativação natural da parasitemia (sem
imunossupressão) desde o 5
o
CST. Esses dados podem refletir que nestas populações
ocorreu, pelo menos, um aumento na proporção de populações sensíveis ao Bz, após
serem mantidas na ausência de pressão do fármaco, embora no mesmo tipo de
hospedeiro. Segundo Pacheco & Brito (1999) a capacidade para adaptar a novos
ambientes e hospedeiros é um reflexo da plasticidade genética do parasito.
Alterações mais evidentes em relação ao nível de sensibilidade ao Bz foram
verificadas quando os parasitos, 100% resistentes ao Bz, foram mantidos por seis a 12
meses em meio de cultura acelular (meio LIT). Esta alteração foi marcante no isolado
Be-78C, que apresentou 100% e 50% de resistência ao Bz após a sua manutenção por
seis e 12 meses em meio LIT, respectivamente. Também o isolado Be-78E apresentou
redução no grau de resistência quando os parasitos 100% resistentes foram mantidos
durante seis meses em cultura acelular, passando a apresentar 80% de resistência ao
SANTOS, FM DISCUSSÃO
59
fármaco. As populações de T. cruzi Be-62B e Be-78D, embora tenham permanecidos
100% resistentes ao Bz depois de mantidas seis meses em meio LIT, apresentaram 60%
de reativação da parasitemia após imunossupressão com ciclofosfamida. Esta alteração
do perfil de resistência ao Bz, após a manutenção em meio de cultura acelular, foi
descrita pela primeira vez, entretanto, vários autores têm relatado a diminuição da
virulência de uma população do T. cruzi após a manutenção por longos períodos em
meio LIT. De acordo com Lambrecht (1965) ocorre a perda da virulência quando
Trypanosama sp anteriormente patogênico é mantido em cultura, sendo que aqueles
parasitos sobreviventes e que multiplicam melhor no meio artificial acarretam
mudanças em toda a população do Trypanosoma sp.
Trabalhos na literatura relacionam as falhas terapêuticas da doença de Chagas
com a diversidade genética dos parasitos, caracterizando cepas de T. cruzi constituídas
por um único tipo de clone (monoclonais) ou por uma mistura de clones (policlonais)
como resistentes, parcialmente resistentes ou sensíveis à quimioterapia (FILARDI &
BRENER, 1984; FILARDI & BRENER, 1987; ANDRADE e cols., 1985; REVOLLO e
cols., 1998; TOLEDO e cols., 2003; TOLEDO e cols., 2004). Por outro lado, Vilarreal e
cols. (2004) não demonstraram correlação entre a distância filogenética de uma
população do T. cruzi e a resistência ao Bz, em experimentos realizados in vitro.
É interessante observar, que neste trabalho, populações das cepas Be-62 e Be-78
caracterizadas como sensíveis ao Bz, adquiriram 100% de resistência após sucessivos
ciclos de tratamento em camundongos. Além disso, a manutenção destas populações
sob diferentes formas induziu, em algumas situações, a diminuição no grau de
resistência, em experimentos realizados no mesmo modelo experimental. Segundo
Andrade e cols. (1977) e Murta & Romanha (1998) uma seleção de clones resistentes
pode ocorrer após os sucessivos ciclos de tratamento, e isso explicaria a total ausência
de cura evidenciada entre os camundongos dos quatro últimos CST com as populações
de T. cruzi deste trabalho. Porém, apenas a seleção de clones resistentes não explica a
ocorrência das alterações no perfil de resistência observadas após manutenções por seis
a 12 meses na ausência de pressão do fármaco. Segundo McDaniel & Dvorak (1993)
sob condições de “stress” ou pressões seletivas, cromossomos e minicírculos têm
mostrado evidência de plasticidade em T. cruzi e Leishmania. Esse talvez seja um
melhor argumento para justificar a ocorrência das alterações nos perfis de resistência ao
SANTOS, FM DISCUSSÃO
60
Bz apresentados principalmente pela manutenção em cultura acelular dos parasitos
isolados após os CST em camundongos.
Neste estudo foi utilizada a imunossupressão com ciclofosfamida após o
tratamento específico, pois esta metodologia possibilitou a reativação da parasitemia, o
que permitiu a manutenção do parasito em ciclos sucessivos de tratamento. Além disso,
esta metodologia foi eficiente no controle de cura, pois na maioria das vezes a
imunossupressão com ciclofosfamida induziu a reativação da parasitemia nos animais
não curados, fornecendo resultados mais rápidos que a hemocultura para o controle de
cura. Segundo Calabrese (1999) após a cura clínica evidenciada na fase aguda da
doença de Chagas, o equilíbrio entre os parasitos remanescentes e o hospedeiro pode ser
rompido com o uso de drogas imunossupressoras, o que então facilita a identificação
das falhas terapêuticas.
Naqueles camundongos que não apresentaram o exame de sangue a fresco
positivo após a imunossupressão com ciclofosfamida, foram realizadas a hemocultura, a
PCR e a sorologia, como critério de cura. Os resultados obtidos mostraram que a
hemocultura e a PCR foram capazes de demonstrar a presença do parasito em 100% dos
animais não curados. Estes resultados estão de acordo com Miyamoto e cols. (2006) que
demonstraram ser a PCR capaz de detectar o parasito em 100% dos camundongos
infectados pelo T. cruzi, independente do genótipo do parasito. Filardi & Brener (1987)
demonstraram que a hemocultura é um bom método para ser usado no controle de cura
de camundongos experimentalmente infectados e tratados na fase aguda da infecção,
mostrando uma concordância de 92,9% entre esta técnica e a sorologia convencional.
Neste trabalho foi demonstrado que a imunossupressão associada à PCR, é eficiente no
controle de cura da doença de Chagas experimental quando se utiliza o modelo murino.
Neste caso, esta metodologia proporcionaria resultados mais rápidos e econômicos, pois
a PCR poderá ser realizada apenas em um pequeno número de animais, ou seja,
naqueles que não apresentarem a reativação da parasitemia induzida pela
ciclofosfamida.
Para verificar se alterações nos níveis de resistência dos parasitos ao Bz são
acompanhadas por alterações em perfis biológicos, foram avaliadas curvas de
parasitemia em camundongos não tratados, e determinados os percentuais de
infectividade e mortalidade dos animais. Estas análises foram realizadas em intervalos
SANTOS, FM DISCUSSÃO
61
de cinco CST e após a manutenção dos parasitos provenientes do último CST por seis a
12 meses em camundongos não tratados e em meio LIT.
Não foram observadas diferenças entre os experimentos realizados no decorrer
dos CST de um mesmo isolado, em todas as populações mantidas em CST (Be-62B,
Be-78C, Be-78D e Be-78E). Porém, foi observada uma tendência de aumento dos níveis
de parasitemia no decorrer da manutenção do parasito em CST. Esta tendência foi mais
evidente nos experimentos realizados com o isolado Be-78C. As taxas de mortalidade
foram semelhantes durante os ciclos de tratamento de um mesmo isolado, e entre os
diferentes isolados, não tendo sido verificado mais que 17% de mortalidade em
camundongos não tratados em todos os experimentos realizados durante os CST dos
quatro isolados avaliadas. De forma diferente, Murta & Romanha (1998) observaram
durante 25 ciclos sucessivos de tratamento com Bz pelo “método rápido” em
camundongos inoculados com a cepa Y, inicialmente uma redução dos níveis de
parasitemia e das taxas de mortalidade, mas que foram revertidos na 25
a
passagem
tratada em camundongos e passaram novamente a serem semelhantes à cepa Y parental
(níveis mais elevados da parasitemia e 100% de mortalidade).
Após a manutenção dos isolados 100% resistentes ao Bz em passagens
sangüíneas sucessivas em camundongos não tratados e em meio LIT, foi observada
alteração dos níveis de parasitemia apenas no isolado Be-78C. Nos experimentos
realizados com este isolado, foi observado um pico de parasitemia de 238.000
tripomastigotas/0,1mL no 10
o
CST, de 2.386.000 tripomastigotas/0,1mL de sangue
após a manutenção de parasitos do 10
o
CST em camundongos não tratados por 12
meses, e de 16.000 tripomastigotas /0,1mL de sangue após a manutenção de parasitos
do 10
o
CST em meio de cultura acelular por 12 meses. Por outro lado, não foram
observadas alterações marcantes entre os níveis de parasitemia e demais parâmetros
biológicos quando parasitos provenientes do último CST em camundongos dos demais
isolados Be-62B, Be-78D e Be-78E foram mantidos durante seis meses sob as mesmas
condições. Também Magalhães e cols. (1985) não observaram alterações significativas
em características biológicas das cepas Y e Peruana de T. cruzi inoculadas em
camundongos depois de mantidas por passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos, pela infecção em triatomíneos vetores, e criopreservadas em nitrogênio
líquido. Entretanto, neste mesmo trabalho, Magalhães e cols. (1985) verificaram
SANTOS, FM DISCUSSÃO
62
redução da infectividade quando os parasitos foram mantidos em meio de cultura
acelular.
Por outro lado, Chiari (1974) não observou aparente alteração da capacidade de
parasitos da cepa Y infectar hospedeiros vertebrados, mesmo após longos períodos de
manutenção em cultura acelular. De forma semelhante, no presente estudo, as taxas de
infectividade entre os parasitos isolados no último CST depois de mantidos em meio
LIT após seis e 12 meses também se mantiveram inalteradas.
De um modo geral, as mudanças observadas nos níveis de resposta à
quimioterapia com Bz não foram acompanhadas por alterações nos perfis de
parasitemia, infectiviade e mortalidade, avaliados no decorrer dos CST e na ausência de
quimioterapia in vivo (camundongos) e in vitro (meio LIT). Segundo Lima e cols.
(1999) a virulência de cepas de T. cruzi pode ser alterada de acordo com sua
adaptabilidade ao hospedeiro, e o comportamento de subpopulações deve ser
considerado dentro de uma espécie tão heterogênea. Embora maiores estudos precisem
ser realizados para esclarecer o comportamento quimioterápico e biológico evidenciado
pelas populações analisadas sob diferentes meios de manutenção, é plausível que
subpopulações diferentes apresentem níveis de resistência ao Bz e características
biológicas também diferentes. Uma vez que isso não foi verificado neste trabalho, pode-
se investigar melhor a ocorrência da plasticidade genética do T. cruzi, em que o
ambiente poderia estar determinando a expressão ou não de um ou mais importantes
genes relacionados às respostas terapêuticas (resistência ou susceptibilidade).
A descoberta de genes “da resistência ou da sensibilidade”, responsáveis pela
expressão de proteínas específicas e cruciais para a ação de compostos tripanocidas
pode trazer grandes avanços para o sucesso terapêutico na doença de Chagas. Murta e
cols. (1998) caracterizaram molecularmente 27 cepas de T. cruzi previamente
classificadas como sensíveis ou naturalmente resistentes ao Bz e Nfx e 18 cepas
isoladas de diferentes regiões geográficas. Cepas classificadas como grupo III pelo
RAPD e zimodema ZB pela análise de isoenzimas foram todas sensíveis aos fármacos
(Bz e Nfx) e demonstraram polimorfismos para os genes que expressam a P-
glycoprotein (TcPGP) e hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT).
Posteriormente, Murta e cols. (2001) não identificaram associações entre o fenótipo de
resistência a esses compostos tripanocidas e o aumento na expressão ou amplificação de
SANTOS, FM DISCUSSÃO
63
genes codoficadores de P-glycoprotein, proteínas que têm sido associadas a resistência
de múltiplos fármacos.
Futuras caracterizações moleculares e análises de expressão gênica dos parasitos
poderão contribuir com a identificação de genes ligados aos fenótipos de resistência/
sensibilidade aos fármacos, uma vez que parasitos provenientes de cepas sensíveis (Be-
62 e Be-78 mantidas 2 a 10 anos em cães) expressaram graus variados de resistência ao
Bz, de acordo com as formas de manutenção estabelecidas neste trabalho.
É importante salientar que a presença do T. cruzi no homem tem sido relatada em
tecidos humanos mumificados há 9.000 anos (AUFDERHEIDE e cols., 2004) e, que
ainda não foi possível estabelecer definitivamente uma correlação entre as
características genéticas e as propriedades biológicas de uma população do T. cruzi,
dentre elas os mecanismos responsáveis pela resistência ou susceptibilidade aos
medicamentos até hoje utilizados para o tratamento da doença.
6. CONCLUSÕES
SANTOS, FM CONCLUSÕES
65
Os dados obtidos neste estudo permitem concluir que:
1. A manutenção das cepas Berenice-62 e Berenice-78 por um período de tempo
prolongado (dois a 10 anos) em cães conduziu, de um modo geral, à redução da
virulência e aumento da resistência ao benznidazol destes parasitos.
2. A manutenção dos parasitos em ciclos sucessivos de tratamento com benznidazol em
camundongos induziu a expressão do fenótipo de 100% de resistência nas
populações Be-62B, Be-78C, Be-78D e Be-78E.
3. O número necessário de ciclos sucessivos de tratamento para indução de 100% de
resistência ao benznidazol foi variável entre os diferentes isolados do T. cruzi. O
isolado Be-78C apresentou 100% de resistência ao benznidazol de modo mais
rápido, já no 2
o
CST, além de ter também apresentado níveis de virulência para
camundongos mais elevados que os demais isolados de cães infectados com a mesma
cepa parental.
4. A resistência ao beznidazol, induzida in vivo, é estável quando os parasitos são
mantidos livres da pressão do fármaco por passagens sangüíneas sucessivas em
camundongos.
5. A resistência ao beznidazol induzida in vivo pode ser alterada pela manutenção do
parasito, livre da pressão do fármaco, em meio de cultura acelular por um período
prolongado de tempo.
6. O exame de lâmina de sangue a fresco durante imunossupressão com ciclofosfamida,
associada à PCR, mostrou-se um bom método para detecção de falhas terapêuticas no
modelo murino, com resultados rápidos e econômicos.
7. Não foi possível estabelecer correlações entre as características biológicas e a
resposta à quimioterapia com benznidazol, para as diferentes populações das cepas
Be-62 e Be-78 isoladas de cães.
SANTOS, FM CONCLUSÕES
66
8. A manutenção dos parasitos, provenientes de cepas de T. cruzi sensíveis ao
benznidazol, em ciclos sucessivos de tratamento, disponibilizou um modelo
experimental para o estudo de mecanismos de resistência a este fármaco.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
68
ANDRADE, A. L. S. S.; ZICKER, F.; RASSI, A.; RASSI, A. G.; OLIVEIRA, R. M.;
SILVA, S. A.; ANDRADE, S. S.; MARTELLI, S. M. T. Early electrocardiographic
abnormalities in Trypanosoma cruzi-seropositive children. Am. J. Trop. Hyg., v. 59, p.
530-534, 1998.
ANDRADE, A. L. S. S.; MARTELLI, C. M. T.; OLIVEIRA, R. M.; SILVA, S. A.;
AIRES, A. I. S.; SOUSSUMI, L. M. T.; COVAS, D. T.; SILVA, L. S.; ANDRADE, J.
G.; TRAVASSOS, L. R.; ALMEIDA, I. C. Short report: benznidazole efficacy among
Trypanosoma cruzi infected adolescents after a six-year follow-up. Am. J. Trop. Med.
Hyg., v. 71(5), p. 594-597, 2004.
ANDRADE, S. G. Caracterização de cepas de trypanosoma cruzi isoladas no recôncavo
baiano. (Contribuição ao estudo da patologia geral da doença de Chagas em nosso
meio). Rev. Patol. Trop., v. 3, p. 65-121, 1974.
ANDRADE, S. G.; ANDRADE, Z. A. & FIGUEIRA, R. M. Estudo experimental sobre
a resistência de uma cepa do Trypanosoma cruzi ao Bay 2502. Rev. Inst. Med. Trop.
São Paulo, v. 19, p. 124-129, 1977.
ANDRADE, S. G.; MAGALHÃES, J. B. & PONTES, A. L. Evaluation of
chemotherapy with benznidazole and nifurtimox in mice infected with Trypanosoma
cruzi strains of different types. Bulietin of the World Health Organization, v. 63(4), p.
721-726, 1985.
ANDRADE, S. G.; RASSI, A.; MAGALHÃES, J. B.; FILLHO, F. F.; LUQUETTI, A.
O. Specific chemotherapy of Chagas disease: a comparison between the response in
patients and experimental animals inoculated with the same strains. Trans. R. Soc. Trop.
Med. Hyg., v. 86, p. 624-626, 1992.
ANDRADE, S. G. & MAGALHÃES, J. B. Biodemes and zymodemes of Trypanosoma
cruzi strains: correlations with clinical data and experimental pathology. Rev. Soc.
Bras. Med. Trop., v. 30, p. 27-35, 1997.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
69
AUFDERHEIDE, A. C.; SALO, W.; MADDEN, M.; STREITZ, J.; BUIKSTRA, J.;
GUHL, F.; ARRIAZA, B.; RENIER, C.; JR-WITTMERS, L. E.; FORNACIARI, G.;
ALLISON, M. A 9,000-year record of Chagas’ disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v.
101, p. 2034-2039, 2004.
ÁVILA, H.; GONÇALVES, A. M.; NEHME, N. S.; MOREL, C. M.; SIMPSON, L.
Schizodeme analysis of Trypanosoma cruzi stocks from South and Central America by
analysis of PCR – amplified minicircle variable region sequences. Mol. Biochem.
Parasitol., v. 42, p. 175-188, 1990.
ÁVILA, H. A.; SIGMAN, D. S.; COHEN, L. M.; MILLIKAN, R. C. & SIMPSON, L.
Polymerase chain reaction amplification of Trypanosoma cruzi kinetoplast minicircle
DNA isolation from whole blood lysates: diagnosis of chronic Chagas' disease. Mol.
Biochem. Parasitol., v. 40, p. 211-222, 1991.
BLANCO, S. B.; SEGURA, E. L.; CURA, E. M.; CHUIT, R.; TULIÁN, L.; FLORES,
I.; GARBARINO, G.; VILLALONGA, J. F.; GÜRTLER, R. E. Congenital transmission
of Trypanosoma cruzi: an operational outline for detecting and treating infected infants
in north-western Argentina. Trop. Med. and Internat. Health, v. 5(4), p. 293-301, 2000.
BRAGA, M. S.; LAURIA-PIRES, L.; ARGAÑARAZ, E. R.; NASCIMENTO, R. J.;
TEIXEIRA, A. R. L. Persistent infections in chronic Chagas’ disease patients treated
with anti-Trypanosoma cruzi nitroderivatives. Rev. Inst. Med. Trop. de São Paulo, v.
42, p. 157-161, 2000.
BRENER, Z. Therapeutic activity and criterion of cure in mice experimentally infected
with Trypanosoma cruzi. Rev Inst Med Trop São Paulo, v. 4, p. 389-396, 1962.
BRENER, Z. Comparative studies of different strains of Trypanosoma cruzi. Ann. Trop.
Med. Parasit., v. 59, p. 19-26, 1965.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
70
BRENER, Z. Biology of Trypanosoma cruzi. Ann. Rev. Microbiol., v. 27, p. 347-383,
1973.
BRENER, Z.; CHIARI, E. & ALVARENGA, N. J. Observation on Trypanosoma cruzi
strains maintained over an 8 – year period in expermentally inoculated mice. Rev. Inst.
Med. Trop. São Paulo, v. 16(1), p. 39-46, 1974.
BRENER, Z.; COSTA, A. G. & CHIARI, C. A. Differences in the susceptibility of
Trypanosoma cruzi strains to active chemotherapeutic agents. Rev. Inst. Med. Trop. São
Paulo, v. 18(6), p. 450-455, 1976.
BRENER, Z. & GAZZINELLI, R. T. Immunological control of Trypanosoma cruzi
infection and pathogenisis of Chagas’ disease. Allergy and Immunology, v. 114, p. 103-
110, 1997.
BRISSE, S.; DUJARDIN, J. C.; TIBAYRENC, M. Identification of six Trypanosoma
cruzi lineages by sequence-characterised amplified region markers. Mol. Biochem.
Parasitol., v. 111, p. 95-105, 2000.
BRITTO, C.; CARDOSO, M. A.; WINCKER, P. & MOREL, C. M. A simple protocol
for cleavage of Trypanosoma cruzi kinetoplast DNA present in blood sample and its use
in polymerase chain reaction (PCR)-based diagnosis of chronic Chagas' disease. Mem
Inst Oswaldo Cruz, v. 88, p. 171-172, 1993.
BRITTO, C., CARDOSO, M. A.; MONTEIRO VANNI, C. M.; HASSLOCHER-
MORENO, A.; XAVIER, S. S.; OELEMANN, W.; SANTORO, A.; PIRMEZ, C. &
WINCKER P. Polymerase chain reaction detection of Trypanosoma cruzi in human
blood samples as a tool for diagnosis and treatment evaluation. Parasitology, v. 110, p.
241-247, 1995.
CALABRESE, K S. Immunosuppressive drugs as a tool to explore immunopathology in
experimental Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94, p. 273-276, 1999.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
71
CALIARI, M. V.; LANA, M.; LEITE, V. H.; TAFURI, W. L. Morphological and
morphometric study of atrial specific granules and other secretory components in dogs
experimentally infected with Trypanosoma cruzi. Int. J. Exp. Pathol., v. 76(4), p. 299-
307, 1995.
CAMANDAROBA, E. L. P.; LIMA, C. M. P. & ANDRADE, S. G. Oral transmission
of Chagas disease: importance of Trypanosoma cruzi biodeme in the intragastric
experimental infection. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 44(2), p. 97-103, 2002.
CAMANDAROBA, E. L. P.; REIS, E. A. G.; GONÇALVES, M. S.; REIS, M. G.;
ANDRADE, S. G. Trypanosoma cruzi: susceptibility from the highly resistant
Colombian strain. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. São Paulo, v. 36(2), p. 201-209, 2003.
CANÇADO, J. R. Criteria of Chagas disease cure. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94(1),
p. 331-336, 1999.
CANÇADO, J. R. Long term evaluation of etiological treatment of Chagas’disease with
benznidazole. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 44, p. 29-37, 2002.
CARNEIRO, M.; CHIARI, E.; GONÇALVES, A. M.; PEREIRA, A. A. S.; MOREL, C.
M.; ROMANHA, A. J. Changes in the isoenzyme and Kinetoplast DNA patterns of
Trypanosoma cruzi strains induced by maintenance in mice. Acta Trop., v. 47, p. 35-45,
1990.
CHAGAS, C. Nova tripanossomíase humana. Estudos sobre a morfologia e o ciclo
evolutivo do Schizotrypanum cruzi, n. gen., n. sp., agente etiológico da nova entidade
mórbida do homem. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 1, p. 159-218, 1909.
CHIARI, E. Infectivity of Trypanosoma cruzi metacyclic trypomastigotes from cultures
kept in laboratory for different periods of time. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 16,
p. 61-67, 1974.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
72
CHIARI, E.; DIAS, J. C. P.; LANA, M. & CHIARI, C. A. Hemocultures for the
parasitological diagnosis of human chronic Chagas’disease. Rev. Soc. Bras. Med. Trop.,
v. 22, p. 19-23, 1989.
CLARK, C. G. & PUNG, O. J. Host specificity of ribosomal DNA variation in sylvatic
Trypanosoma cruzi from North America. Mol. Biochem. Parasitol., v. 66, p.175-179,
1994.
CROFT, S. L. Pharmacological approaches to antitrypanosomal chemotherapy. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz, v. 94(2), p. 215-220, 1999.
CRUZ, R.E.; MACEDO, A.M.; BARNABÉ, C.; FREITAS, J.M.; CHIARI, E.;
VELOSO, V.M.; CARNEIRO, C.M.; BAHIA, M.T.; TAFURI, W.L.; LANA, M.
Further genetic characterization of the two Trypanosoma cruzi Berenice strains (Be-62
and Be-78) isolated from the first human case of Chagas disease (Chagas, 1909). Acta
Trop., v. 97(3), p. 239-46., 2005.
DEANE, M. P.; SOUSA, M. A.; PEREIRA, N. M.; GONÇALVES, A. M.; MOMEN,
H.; MOREL, C. M. Trypanosoma cruzi: Inoculation schedules and re-isolation methods
select individual strains from doubly infected mice, as demonstrated by schizodeme and
zymodeme analyses. J. Protozool., v. 31, p. 276-280, 1984.
DE SOUZA, W. Cell Biology of Trypanosoma cruzi. Int. Ver. Cytol., v. 86, p. 107-283,
1984.
DIAS, J. C. P. Acute Chagas’ disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 79, p. 85–92, 1984.
DIAZ DE TORANZO, E. G.; CASTRO, J. Á.; FRANKE DE CAZZULO, B. M.;
CAZZULO, J. J. Interaction of benznidazole reactive metabolites with nuclear and
Kinetoplastic DNA, proteins and lipids from Trypanosoma cruzi. Experientia, v. 44, p.
880-891, 1988.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
73
DOCAMPO, R. Sensitivity of parasites to free radical damage by antiparasitic drugs.
Chem. Biol. Interact., v. 73, p. 1-27,1990.
FERNADES, O.; STURM, N. R.; DERRE, R.; CAMPBELL, D. A. The mini-exon
gene: a genetic marker for zymodeme III of Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem.
Parasitol., v. 95, p. 129-133, 1998.
FERNANDES, O.; SANTOS, S. S.; JUNQUEIRA, A. C. V.; JANSEN, A. M.;
CUPOLILLO, E.; CAMPBELL, D. A.; ZINGALES, B.; COURA, J. R. Populational
heterogeneity of Brasilian Trypanosoma cruzi isolates revealed by the mini-exon and
ribosomal spacers. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94(1), p.195-197, 1999.
FILARDI, L. S. & BRENER, Z. A rapid method for testing in vivo the susceptibility of
different strains of Trypanosoma cruzi infections. Ann. Trop. Med. Parasitol., v. 76, p.
293-297, 1984.
FILARDI, L. S. & BRENER, Z. Susceptibility and natural resistance of Trypanosoma
cruzi strains to drugs used clinically in Chagas' disease. Trans. R. Soc. Trop. Méd.
Hyg., v. 81, p. 755-759, 1987.
GERMANN, U. A. P-glycoprotein – a mediator for multidrug resistance in tumour
cells. Eur. J. Cancer, v. 32, p. 927-944, 1996.
GOMES, M. L.; MACEDO, A. M.; VAGO, A. R.; PENA, S. D. J.; GALVÃO, L. M. C.
& CHIARI, E. Trypanosoma cruzi: Optimization of Polymerase Chain Reaction for
Detection in Human Blood. Exp. Parasitol., v. 88, p. 28-33, 1998.
HIGGINS, C. F. ABC transporters: from microorganisms to man. Annu. Rev. Cell.
Biol., v. 12, p. 2855-2865, 1992.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
LAMBRECHT, F. L. Biological variations in trypanosomes and their relation to the
epidemiology of Chagas' disease. Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, v. 7, p. 346-352,
1965.
LANA, M. & CHIARI, E. Caracterização biológica comparativa das cepas Berenice-62
e Berenice-78 de Trypanosoma cruzi, isoladas da mesma paciente em diferentes
períodos. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 81(3), p. 247-253, 1986.
LANA, M., CHIARI, E. & TAFURI, W. L. Experimental Chagas’disease in dogs. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz, v. 87, p. 59-71, 1992.
LANA, M.; CHIARI, C. A.; CHIARI, E.; MOREL, C. M.; GONÇALVES, A. M.;
ROMANHA, A. J. Characterization of two isolates of Trypanosoma cruzi obtained
from the patient Berenice, the first human case of Chagas’disease described by Carlos
Chagas in 1909. Parasitol. Res., v. 82, p. 257-260, 1996.
LAURIA-PIRES, L. & TEIXEIRA, A. R. L. Virulence and pathogenicity associated
with diversity of Trypanosoma cruzi stocks and clones derived from Chagas’disease
patients. Am. J. Trop. Med. Hyg., v. 55, p. 304-310, 1996.
LAURIA-PIRES, L.; SANTANA, J. M.; TAVARES, F. S.; TEIXEIRA, A. R. L.
Diversity of Trypanosoma cruzi stocks and clones derived from Chagas disease
patients: I-Behavioral characterization in vitro. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 30, p.
187-192, 1997.
LIMA, V. S.; MANGIA, R. H. R.; CARREIRA, J. C.; MARCHEWSKI, R. S.;
JANSEN, A. M. Trypanosoma cruzi: Correlations of biological aspects of the life cycle
in mice and triatomines. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94, p. 397-402, 1999.
LUZ, Z. M.; COUTINHO, J. R.; CANÇADO, J. R. & KRETTLI, A. U. Hemoculture:
sensitive technique in the detection of Trypanosoma cruzi in chagasic patients in the
chronic phase of Chagas disease. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., v. 27, p. 143-148, 1994.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
75
MACEDO, A. M.; MARTINS, M. S.; CHIARI, E. & PENA, S. D. J. DNA
fingerprinting of Trypanosoma cruzi: a new tool for characterization of strains and
clones. Mol. Biochem. Parasitol., v. 55, p. 147-154, 1992.
MACEDO, A. M.; MACHADO, C. R.; OLIVEIRA, R. P.; PENA, S. D. J. Genetic
structure of populations and relevance of genetic variability to the pathogenisis of
Chagas’disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 99(1), p. 1-12, 2004.
MACHADO, C. A. & AYALA, F. J. Sequence variation in the dihydrofolate reductase-
thymidylate synthase (DHFR-TS) and trypanothione reductase (TR) genes of
Trypanosoma cruzi. Mol. Biochem. Parasitol., v. 121, p. 33-47, 2002.
MAGALHÃES, J. B.; PONTES, A. L.; ANDRADE, S. G. Behavior of the Y and
Peruvian strains of Trypanosoma cruzi in mice, after passage through various media.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 80, p. 41-50, 1985.
MARRETO, J. P. M & ANDRADE, S. G. Biochemical behavior of Trypanosoma cruzi
strains isolated from mice submitted to specific chemotherapy. Rev. Soc. Bras. Med.
Trop. v. 27(4), p. 209-215, 1994.
MCDANIEL, J. P. & DVORAK, J. A. Identification, isolation, and characterization of
naturally-occurring Trypanosoma cruzi variants. Mol. Biochem. Parasitol., v. 57, p.
213-222, 1993.
MILES, M. A.; TOYÉ, P. J.; OSWALD, S. C.; GODFREY, D. G. The identification by
isoenzyme patterns of two distinct strain-groups of Trypanosoma cruzi, circulating
independently in a rural área of Brazil. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., v. 71, p. 217-
225, 1977.
MILES, M. A.; SOUZA, A. A.; POVOA, M. M.; SHAW, J. J.; LAINSON, R.; TOYÉ,
P. J. Isozymic heterogeneity of Trypanosoma cruzi in the first authocthonous pacients
with Chagas disease in Amazonian Brazil. Nature, v. 272, p. 819-821, 1978.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
76
MILES, M. A. New World Trypanosomiasis. In L Collier, A Balows, M Sussman (eds).
Microbiology and Microbial Infections. Chapter 15, v. 5, Parasitology. Topley &
Wilson’s. 1998.
MIYAMOTO, C. T.; GOMES, M. L.; MARANGON, A. V.; ARAÚJO, S. M.; BAHIA,
M. T.; LANA, M.; TOLEDO, M. J. O. Trypanosoma cruzi: Sensitivity of the
polymerase chain reaction for detecting the parasite in the blood of mice infected with
different clonal genotypes. Experimental Parasitology, (in press), 2006.
MOMEN, H. Taxonomy of Trypanosoma cruzi: a commentary on characterization and
nomenclature. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 94, p.181-184, 1999.
MONCAYO, A. Chagas Disease: Current epidemiological trends after the interruption
of vectorial and transfusionaçl transmission in the Southern Cone countries. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz, v. 98(5), p. 577-591, 2003.
MOREL, C.; CHIARI, E.; CAMARGO, E. Strains and clones of Trypanosoma cruzi
can be characterized by restriction endonuclease fingerprint of DNA minicircles. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, v. 77, p. 6810-6814, 1980.
MURTA, S. M. F. & ROMANHA, A. J. In vivo selection of population of Trypanosoma
cruzi and clones resistant to benznidazole. Parasitology, v. 116, p. 165-171, 1998.
MURTA, S. M. F.; GAZZINELLI, R. T.; BRENER, Z.; ROMANHA, A. J. Molecular
characterization of susceptible and naturally resistant strains of Trypanosoma cruzi to
benznidazole and nifurtimox. Mol. Biochem. Parasitol., v. 93, p. 203-214, 1998.
MURTA, S. M. F. & ROMANHA, A. J. Characterization of Trypanosoma cruzi. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz, v. 94(1), p. 177-180, 1999.
MURTA, S. M. F.; SANTOS, W. G.; ANACLETO, C.; NIRDE, P.; MOREIRA, E. S.
A.; ROMANHA, A. J. Drug resistance in Trypanosoma cruzi is not associated with
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
77
amplification or over expression of P-glycoprotein (PGP) genes. Mol. Biochem.
Parasitol., v. 117, p. 223–228, 2001.
NOZAKI, T. & DVORAK, J. Á. Intraspecific diversity in the response of Trypanosoma
cruzi to environmental stress. J. Parasitol., v. 79, p. 451-454, 1993.
OLIVEIRA, R. P.; BROUDE, N. E.; MACEDO, A. M.; CANTOR, C. R.; SMITH, C.
L.; PENA, S. D. J. Probing the genetic population structure of Trypanosoma cruzi with
polymorphic microsatellites. Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 95, p. 3776-3780, 1998.
OLIVEIRA, R. P.; MELO, A. I. R.; MACEDO, A. M.; CHIARI, E.; PENA, S. D. J.
The population structure of Trypanosoma cruzi: expanded analysis of 54 strains using
eight polymorphic CA-repeat microsatellites. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 1, p. 65-70,
1999.
PACHECO, R. S. & BRITO, C. M. M. Reflections on the population dynamics of
Trypanosoma cruzi: heterogeneity versus plasticity. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94, p.
199-201, 1999.
RASSI, A. & LUQUETTI, A. O. Therapy of Chagas' disease. In: WENDEL, S.,
BRENER, Z., CAMARGO, M.E. & RASSI, A., (Eds) Chagas' disease (American
Trypanosomiasis): Its Impact on Transfusion and Clinical Medicine. ISBT BRAZIL São
Paulo, Brazil, 237-256, 1992.
REVOLLO, S.; OURY, B.; LAURENT, J. P.; BARNABÉ, C.; QUESNEY, V.;
CARRIÈRE, V.; NOËL, S.; TIBAYRENC, M. Trypanosoma cruzi: impact of clonal
evolution of the parasite on its biological and medical properties. Experimental
Parasitology, v. 89, p. 30-39, 1998.
ROMANHA, A. J.; PEREIRA, A. A. S.; CHIARI, E. & KILGOUR, V. Isoenzyme
patterns of cultured Trypanosoma cruzi: changes after prolonged subculture. Comp.
Biochem. Physiol., v. 62, p. 139-142, 1979.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
78
ROMANHA, A. J. Heterogeneidade enzimática em Trypanosoma cruzi. 1982. 110 f.
Tese (Doutorado em Bioquímica) - Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 1982.
SANTOS, F. R.; PENA, S. D. J. & EPPLEN, J. T. Genetic and population study of a Y-
linked tetranucleotide repeat DNA polymorphism with a sample non-isotopic technique.
Hum. Genet., v. 90, p. 655-656, 1993.
SALGADO, J. A.; GARCEZ, P. N.; OLLIVEIRA, C. A. & GALIZZI, J. Revisão
clínica atual do primeiro caso humano descrito de Doença de Chagas. Rev. Inst. Med.
Trop. São Paulo, v. 4(5), p. 330-337, 1962.
SCHOFIELD, C. J. Tiatominae: Biologia y Control. p.5-30, 1994.
SILVA, R. C.; SANTIAGO, C. M. G.; PONTES, A. L. & ANDRADE, S. G.
Isoenzymatic pattern of Trypanosoma cruzi Y strain after specific chemotherapy. Mem
Inst Oswaldo Cruz, v. 84, p. 81-86, 1989.
SOSA-ESTANI, S.; SEGURA, E. L.; RUIZ, A. M.; VELAZQUEZ, E.; PORCEL, B.
M.; YAMPOTIS, C. Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the
indeterminate phase of Chagas’ disease. Am. J. Trop. Med. Hyg, v. 59(4), p. 526-529,
1998.
SOUTO, R. P. & ZINGALES, B. Sensitive detection and strain classification of
Trypanosoma cruzi by amplification of a ribossomal RNA sequence. Mol. Biochem.
Parasitol., v. 62, p. 45-52, 1993.
SOUTO, R.; FERNANDES, O.; MACEDO, A. M.; CAMPBELL, D.; ZINGALES, B.
DNA makers define two major phylogenetic lineages of Trupanosoma cruzi. Mol.
Biochem. Parasitol., v. 62, p. 45-52, 1996.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
79
STEINDEL, M.; DIAS NETO, E.; MENEZES, L. P.; ROMANHA, A. J.; SIMPSON,
A. J. G. Random amplified polymorphic DNA analysis of Trypanosoma cruzi strains.
Mol. Biochem. Parasitol., v. 60, p. 71-80, 1993.
STOTHARD, J. R.; FRAME, I. A.; CARRASCO, H. J.; MILES, M. A. On the
molecular taxonomy of Trypanosoma cruzi using riboprinting. Parasitology, v. 117, p.
243-247, 1998.
STOTHARD, J. R.; FRAME, I. A.; MILES, M. A. Genetic Diversity and genetic
exchange in Trypanosoma crui: dual drug-resistant “progeny” from episomal
transformants. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 94(1), p. 189-193, 1999.
TIBAYRENC, M.; WARD, P.; MOYA, A. & AYALA, F. J. Natural populations of
Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas’ disease, have a complex multiclonal structure.
Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 83, p. 115-119, 1986.
TIBAYRENC, M. & AYALA, F. J. Isoenzime variability in Trypanosoma cruzi, the
agent of Chagas’ disease, genetical, taxonomical, and epidemiological significance.
Evolution, v. 42, p. 277-292, 1988.
TIBAYRENC, M. & BRENIÉRE, S. F. Trypanosoma cruzi: major clones rather than
principal zymodemes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 83, p. 249-255, 1988.
TIBAYRENC, M.; KJELLBERG, F.; AYALA, F. J. A clonal theory of parasitic
protozoa: the population structures of Entamoeba, Giardia, Leishmania, Naegleria,
Plasmodium, Trichomonas and Trypanosoma and their medical and toxonomical
consequences. Proc Natl Acad Sci USA, v. 87, p. 2414-2418, 1990.
TIBAYRENC, M.; NEUBAUER, K.; BARNABÉ, C.; GUERRINI, F.; SKARECKY,
D.; AYALA, F. J. Genetic characterization of six parasitic protozoa: parity between
random-primer DNA typing and multilocus enzyme electrophoresis. Proc. Natl. Acad.
Sci USA, v. 90, p. 1335-1339, 1993.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
80
TIBAYRENC, M.; IN: BAKER, J.; MULLER, R. & ROLLINSON, D. E. Population
genetics of parasitic protozoa and other microorganisms. In Advances in Parasitology.
ED. Academic. Press London, p. 47-115, 1995.
TOLEDO, M. J. O.; GASPERI, M. V.; MARQUES DE ARAÚJO, S.; LANA, M.
Berenice-62 e Berenice-78 strains of Trypanosoma cruzi: comparison of their
susceptibility to benznidazole. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 90, p. 201, 1995.
TOLEDO, M. J. O.; GUILHERME, A. L. F.; SILVA, J. C.; GASPERI, M. V.;
MENDES, A. P.; GOMES, M. L.; ARAÚJO, S. M. Trypanosoma cruzi: chemotherapy
with benznidazole in mice inoculated with strains from Praná state and from different
endemic areas of Brazil. Rev. Inst. Med. Trop., v. 39(5), p. 283-290, 1997.
TOLEDO, M. J. O.; BAHIA, M. T.; CARNEIRO, C. M.; MARTINS-FILHO, O. A.;
TIBAYRENC, M.; BARNABÉ, C.; TAFURI, W. L.; LANA, M. Chemotherapy with
benznidazole and itraconazole for mice infected with different Trypanosoma cruzi
clonal genotypes. Am. Soc. Microbiol., v. 47(1), p. 223-230, 2003.
TOLEDO, M. J. O.; TAFURI, W. L.; BAHIA, M. T.; TIBAYRENC, M., LANA, M.
Genetic diversity and drug resistance in Trypanosoma cruzi, the agent of Chagas
disease. Rev. Adv. In. Antimicrob. Agents & Chemother., v. 4, p.11-22, 2004.
ULLMAN, B. Multidrug resistance and P-glycoprotein in parasitic Protozoa. J.
Bioenergy Biomembr., v. 27(1), p. 77-84, 1995.
URBINA, J. A & DOCAMPO R. Specific chemotherapy of Chagas disease:
controversies and advances. Trends in Parsitology, v. 19(11), p. 495-501, 2003.
VAGO, A. R.; MACEDO, A. M.; ADAD, S. J.; REIS, D. P.; CORREA-OLIVEIRA, R.
PCR detection of Trypanosoma cruzi DNA sequences in esophageal tissues of pacients
with chronic digestive Chagas’ disease. Lancet, v. 348, p. 891-892, 1996a.
SANTOS, FM REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
81
VAGO, A. R.; MACEDO, A. M.; OLIVEIRA, R. P.; ANDRADE, L. O.; CHIARI, E.;
GALVÃO, L. M. C.; REIS, D. A.; PEREIRA, M. E. S.; SIMPSON, A. J. G.; TOSTES,
S.; PENA, S. D. J. Kinetoplast DNA signatures of Trypanosoma cruzi strains obtained
directly from infected tissues. A. J. Pathol., v. 149 (6), p. 2153-2159, 1996b.
VELOSO, V. M.; CARNEIRO, C. M.; TOLEDO, M. J. O.; LANA, M.; CHIARI, E.;
TAFURI, W. L.; BAHIA, M. T. Variation in susceptibility to benznidazole inisolates
derived from Trypanosoma cruzi parental strains. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, v. 96(7), p.
1005-1011, 2001.
VELOSO, V. M.; ROMANHA, A. J.; LANA, M.; MURTA, S. M. F.; CARNEIRO, C.
M.; ALVES, C. F.; BORGES, E. C.; TAFURI, W. L.; MACHADO-COELHO, G. L. L.;
CHIARI, E.; BAHIA, M. T. Influence of the long-term Trypanosoma cruzi infection in
vertebrate host on the genetic and biological diversity of the parasite. Parasitol. Res., v.
96, p. 382-389, 2005.
VILLARREAL, D.; BARNABÉ, C.; SERENO, D.; TIBAYRENC, M. Lack of
correlation between in vitro susceptibility to Benznidazole and phylogenetic diversity of
Trypanosoma cruzi,the agent of Chagas disease. Experimental Parasitology, v. 108, p.
24-31, 2004.
VOLLER, A.; BIDWELL, D. E.; BARTLETT, A. Enzyme immunoassays in diagnostic
medicine. Theory and practice. Bull WHO, v. 53, p. 55-65, 1976.
VITOR, R. W. A & CHIARI, E. Avaliação de antígenos do Trypanosoma cruzi para a
Reação de Hemaglutinação Indireta. I. Diferentes extratos antigênicos. Rev. Inst. Med.
Trop. São Paulo, v. 29(3), p. 178-182, 1987.
WHO (WORLD HEALTH ORGANIZATION). Infectious Diseases Home Burdens and
Trends (2005). http://www.who.int/ctd/chagas/burdens.htm
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