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SINTHIA MARIA BENIGNO PUTTINI
Avaliação da resposta inflamatória desencadeada pelas
telas de polipropileno e politetrafluoretileno expandido
implantadas no espaço intraperitoneal. Estudo
experimental em camundongos.
Brasília – DF, 2006.
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SINTHIA MARIA BENIGNO PUTTINI
Avaliação da resposta inflamatória desencadeada pelas
telas de polipropileno e politetrafluoretileno expandido
implantadas no espaço intraperitoneal. Estudo
experimental em camundongos.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Médicas da Faculdade de Medicina da Universidade
de Brasília, como requisito parcial à obtenção do título de
Mestre.
Área de concentração: Medicina.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira.
Faculdade de Medicina
Universidade de Brasília
Brasília-DF 2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
PUTTINI, Sinthia Maria Benigno
Avaliação da resposta inflamatória desencadeada pelas telas de
polipropileno e politetrafluoretileno expandido implantadas no
espaço intraperitoneal. Estudo experimental em camundongos.
Sinthia Maria Benigno Puttini
Brasília, DF, 2006
79p.; 29 cm x 21 cm
Dissertação (Mestrado – Ciências Médicas)
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
Faculdade de Medicina - Universidade de Brasília
Orientador: Prof. Dr. Paulo Gonçalves de Oliveira
Unitermos: 1-polipropileno; 2-PTFEe; 3-inflamação; 4-intraperitoneal
5-imunohistoquímica
Dedico esta dissertação de mestrado a
minha filha que surgiu em um momento de
grande felicidade e foi a maior força para
que esta tarefa fosse concluída com êxito.
Agradecimentos
Ao Professor Paulo Gonçalves de Oliveira, meu orientador, pelo constante
incentivo e aconselhamento e por acreditar na minha capacidade, fazendo com
que esta grande oportunidade tivesse um final de sucesso.
Ao Professor Dr. André Luiz Vianna e Dr. Stenio Meirelles de Carvalho pelo
apoio e incentivo que me forneceram em toda a minha carreira médica e cirúrgica.
À Professora Anamélia Lorenzetti Bocca, pelo constante apoio, sugestões
e correções que tornaram possível a conclusão deste trabalho.
Ao Professor Dr. Florêncio Figueiredo pela colaboração na avaliação
histopatológica do experimento.
À Dra. Dunya Bachour, colega de mestrado e médica patologista, pelo
auxílio fundamental nos momentos finais e cruciais com a avaliação dos
resultados e confecção das fotomicrografias.
Aos funcionários do Labocien do UniCEUB, em especial ao Professor
Carlos Cruz Júnior, por tornar possível a confecção de toda a parte experimental
do estudo, desde o fornecimento dos animais até o ato cirúrgico e eutanásia.
Aos ex-alunos do curso de graduação da Medicina, Saulo e Thiago que
participaram ativamente do experimento, com entusiasmo e determinação.
Aos funcionários do Laboratório LIB BIÓPSIA, onde ocorreu a preparação
de todo o material que foi analisado, meus mais sinceros agradecimentos.
Aos meus pais, irmãos e marido, pela tolerância e compreensão para
comigo agora e sempre.
Aos meus amigos e colegas pelo constante incentivo e apoio durante todas
as fases de elaboração deste trabalho.
RESUMO
As telas de polipropileno (PP) e politetrafluoretileno expandido (PTFEe)
representam os biomateriais mais comumente utilizados no reparo de hérnias da
parede abdominal. O implante de próteses modifica o processo de cicatrização.
Além dos mecanismos celulares, vários mediadores químicos estão envolvidos no
processo de reparo tecidual. Apesar da resposta inflamatória desencadeadas pela
presença de telas implantadas no espaço intraperitoneal já ter sido descrita,
mediadores químicos envolvidos neste processo ainda não foram demonstrados.
O objetivo do estudo foi avaliar a resposta inflamatória desencadeada pela
presença destes biomateriais cirurgicamente implantados no espaço
intraperitoneal de camundongos. Foram utilizados 32 camundongos isogênicos
machos, distribuídos em 2 grupos: PP (implante de telas de PP) e PTFEe
(implante de telas de PTFEe) e sacrificados no 5º, 10º, 20º e 30º dia de pós-
operatório (DPO). Os fragmentos retirados foram preparados para análise
histopatológica utilizando coloração Hematoxilina/Eosina e imunohistoquímica
para demonstração de óxido nítrico sintase induzida (iNOS), superóxido
dismutase 1 (SOD1), ciclooxigenase 2 (COX2), fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) e inteleucina 8 (IL-8). As telas de PP determinaram reação cicatricial,
com total integração da tela aos tecidos adjacentes, enquanto as telas de PTFEe
determinaram intensa reação tipo corpo estranho, com encapsulamento da tela
pelo tecido conjuntivo e células gigantes distribuídas em torno da tela. A reação
inflamatória foi mais intensa no grupo PP nos parâmetros: neoformação vascular,
edema, necrose e fibrose. A migração celular de macrófagos e polimorfonucleares
foi mais intensa no grupo PTFEe com 5 dias e 10 dias respectivamente, mas com
30 dias, a presença destas células foi mais intensa no grupo PP. A expressão
das enzimas iNOS, SOD1, COX-2 e das citocinas TNF-α e IL-8 foi mais intensa
no grupo PP em relação ao grupo PTFEe. As enzimas e citocinas estudadas
estiveram presentes mesmo após 30 dias. A expressão de enzimas pró-
inflamatórias no processo de cicatrização decorrente da presença de biomateriais
sugere a presença de substâncias agressoras como radicais livres de oxigênio,
óxido nítrico e prostaglandinas que podem estar envolvidos nas complicações
relacionadas ao uso de telas. A forte presença das citocinas pró-inflamatórias
(TNF-α e IL-8) com 30 dias sugere que o processo de inflamação persiste
cronicamente e difere de acordo com o material implantado. Considerando os
parâmetros utilizados neste estudo, a resposta inflamatória desencadeada pelas
telas de polipropileno cirurgicamente implantadas no espaço intraperitoneal de
camundongos foi mais intensa que as telas de politetrafluoretileno expandido.
Unitermos: polipropileno, PTFEe, inflamação, imunohistoquímica.
ABSTRACT
Polypropylene and expanded polytetrafluoroethylene meshes represent the two
most common biomaterials used in the repair of abdominal wall hernias.
Prosthesis implanted into abdominal wall modify the scarring process. Beyond
cellular mechanisms, chemical mediators are involved in the normal repair
process. Although the inflammatory response to these biomaterials had been
described, chemical mediators involved in this process have not been
demonstrated yet. The aim of this study was to evaluate the inflammatory
response to these biomaterials implanted into the abdominal wall of mice. Thirty
two isogenic male mice were used, divided into two groups: PP (polypropylene
mesh) and PTFEe (expanded polytetrafluoroethylene mesh). Each group of 4
animals were killed with 5, 10, 20 and 30 days after operation. Specimens of
prosthesis and attached neoformed tissue were prepared for light microscopy
using haematoxylin-eosin stain and immunohistochemical to identify the inducible
nitric oxide synthase (iNOS), superoxide dismutase type 1 (SOD1),
cyclooxigenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alfa (TNF-α) and interleukin 8
(IL-8). The PP group showed total integration of the mesh to the tissue, occupying
all the internodal spaces while the PTFEe group showed foreign body reaction
with gigantic cells and the mesh appeared to be encapsulated by connective
tissue. The inflammatory response was significantly more strong in the PP group
about angiogenesis, edema, necrosis and fibrosis. The macrophage and
polymorphonuclear migration was bigger in the PTFEe group with 5 and 10 days
after operation, but with 30 days these cells were more pronounced in the PP
group. iNOS, SOD1, COX-2, TNF-α and IL-8 were more pronounced in the PP
group. The enzymes and citokines studied were expressed even after 30 days of
the operation. The presence of pro-inflammatory enzymes in the scarring process
to biomaterials suggest the presence of agressive substances like reactive oxygen
species, nitric oxide and prostaglandins that may be involved in the complications
related to meshes. The strong presence of pro-inflammatory cytokines with 30
days after operation suggests that the inflammatory process persist chronically
and is different according to the implanted material. In this study, the inflammatory
response to polypropylene mesh implanted into the abdominal wall of mice was
greater than that associated with PTFEe implantation.
Keywords: expanded polytetrafluoroethylene, polypropylene, inflammatory
response, immunohistochemical.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES e TABELAS
Figura 1 - Alojamento dos animais.....................................................................................21
Figura 2 – Injeção intramuscular do composto ketamina/xilazina no membro inferior
esquerdo do camundongo. ..............................................................................................22
Figura 3 – Fragmentos de 0,5x1,0cm das telas de polipropileno e polietrafluoretileno
expandido a serem implantadas nos animais do estudo. 1 = politetrafluoretileno
expandido; 2 = polipropileno..............................................................................................23
Figura 4 – Implante do fragmento de tela de polipropileno na parede abdominal dos
camundongos selecionados...............................................................................................23
Figura 5 – Implante do fragmento de tela de politetrafluoretileno expandido na parede
abdominal dos camundongos do grupo selecionado.........................................................24
Figura 6 – Fotomicrografia corado pela técnica de HE, 40x, demonstrando o infiltrado
inflamatório entre os poros da tela de polipropileno em contato íntimo com uma alça
intestinal.............................................................................................................................30
Figura 7 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pela presença das
telas implantadas apresentando: Foto 1 – Denso infiltrado mono e polimorfonuclear no
interior da tela de polipropileno no 5º DPO. Neoformação vascular já está presente. Foto
2 – Reação inflamatória no 10º DPO, com formação de células gigantes entre os poros da
tela de polipropileno. Foto 3 – Infiltrado inflamatório do 5º DPO com intensa migração de
polimorfonucleares e mononucleares desencadeado pela tela de PTFEe. Nota-se
predomínio de mononucleares. Foto 4 – Distribuição ordenada das células gigantes e da
resposta tipo corpo estranho ao redor da tela de PTFEe no 10º DPO. Foto 1, 3 e 4 – HE,
aumento original de 200x, Foto 2 – HE, aumento original de 100x ..................................37
Figura 8 - Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - Diminuição do infiltrado polimorfonuclear e predomínio de
mononucleares e neoformação vascular entre os poros da tela de polipropileno no 20º
DPO. Foto 2 – Infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear, com células
gigantes e fibrose marcante entre os poros da tela de polipropileno no 30º DPO. Foto 3 –
Predomínio do infiltrado mononuclear ao redor da tela de PTFEe no 20º DPO, porém de
menor intensidade em relação aos períodos anteriores. Foto 4 – Escassa presença de
células mononucleares ao redor da tela de PTFEe no 30º DPO. Fotos 1 e 2 – HE,
aumento original de 100x, Fotos 3 e 4 – HE aumento original de 200x
........................... 38
Figura 9 - Encapsulamento da tela de PTFEe pelo processo inflamatório. HE 40x..........39
Figura 10 - Neoformação do peritônio em relação à tela de polipropileno. HE 100x.........39
Figura 11 - Fotomicrografia do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - moderada marcação da enzima superóxido dismutase 1 no 5º
DPO do grupo polipropileno.Foto 2 - marcação leve no mesmo grupo com 30 dias. Foto 3
e 4 – marcação leve da enzima no grupo PTFEe no 5 e 30º DPO. Imunohistoquímica,
imunoperoxidase, aumento original de 200x.....................................................................41
Figura 12 - Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pela presença das
telas, apresentando: Foto 1 - intensa marcação da enzima óxido nítrico sintase induzida
no 5o DPO do grupo polipropileno. Foto 2 - marcação moderada no mesmo grupo com 30
dias. Foto 3 e 4 – marcação leve da enzima no grupo PTFEe no 5 e 30º DPO
respectivamente. Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de
200x...................................................................................................................................43
Figura 13 - Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - intensa marcação da enzima cicloxigenase 2 no 5º DPO do grupo
polipropileno. Foto 2 - marcação moderada no mesmo grupo com 30 dias. Foto 3 e 4 –
marcação intensa da enzima no grupo PTFEe no 5 e 30º DPO respectivamente.
Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de 200x (foto 1, 2, e 3), aumento
original de 100x (foto 4).....................................................................................................45
Figura 14 - Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - intensa marcação do fator de necrose tumoral alfa no 5º DPO do
grupo polipropileno. Foto 2 – intensidade marcante do TNF-α no mesmo grupo com 30
dias. Foto 3 – marcante intensidade do TNF-α no grupo PTFEe no 5º DPO. Foto 4 – leve
marcação da citocina no 30º DPO do grupo PTFEe. Imunohistoquímica,
imunoperoxidase, aumento original de 200x.....................................................................47
Figura 15 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 e 2 - intensa marcação da interleucina 8 do grupo polipropileno no
5o e 30º DPO respectivamente. Foto 3 – intensa marcação da interleucina no grupo
PTFEe no 5º DPO. Foto 4 – intensidade marcante da IL-8 no 30º DPO do grupo PTFEe.
Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de 200x.....................................48
Gráfico 1 – Avaliação do edema nos grupos estudados....................................................32
Gráfico 2 – Avaliação da neoformação vascular nos grupos estudados...........................33
Gráfico 3 – Avaliação da migração de polimorfonucleares nos grupos estudados...........34
Gráfico 4 – Avaliação da migração de monócitos nos grupos estudados.........................35
Gráfico 5 – Expressão da enzima superóxido dismutase tipo 1 (SOD1) nos grupos
estudados...........................................................................................................................40
Gráfico 6 – Expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos grupos
estudados...........................................................................................................................42
Gráfico 7 – Expressão da enzima cicloxigenase 2 (COX-2) nos grupos
estudados...........................................................................................................................44
Gráfico 8 – Expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) nos grupos
estudados...........................................................................................................................46
Gráfico 9 – Expressão da interleucina 8 (IL-8) nos grupos estudados..............................46
Tabela 1 – Anticorpos utilizados no experimento..............................................................28
Tabela 2- Quantificação de Aderências do grupo polipropileno (PP) e do grupo
Politetrafluoretileno expandido (PTFEe)............................................................................31
LISTA DE ABREVIATURAS
PP: polipropileno
PTFEe: politetrafluoretileno expandido
iNOS: óxido nítrico sintase induzida
SOD1: superóxido dismutase 1
COX-2: ciclooxigenase 2
HE: hematoxilina/eosina
DPO: dia de pós-operatório
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
NO: óxido nítrico
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido
IL-1: interleucina 1
TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
IL-8: interleucina 8
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA.............................................................................. 6
2.1 BIOMATERIAIS EM HÉRNIAS ..................................................................................7
2.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA RELACIONADA AO USO DE BIOMATERIAIS........10
3. OBJETIVO........................................................................................................ 17
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 19
4.1 ANIMAIS...................................................................................................................20
4.2 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO...........................................................................21
4.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA ......................................................................................25
4.3.1 MICROSCOPIA..................................................................................................25
4.3.2 IMUNOHISTOQUÍMICA.....................................................................................26
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA..........................................................................................28
4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................28
5. RESULTADOS................................................................................................. 29
5.1 AVALIAÇÃO CIRÚRGICA E EVOLUÇÃO PÓS-OPERTÓRIA.................................30
5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA..........................................................................32
5.3 AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA......................................................................40
6. DISCUSSÃO.................................................................................................... 49
7. CONCLUSÕES ................................................................................................ 59
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 61
9. ANEXOS .......................................................................................................... 76
1. INTRODUÇÃO
As hérnias da parede abdominal correspondem à protrusão de uma
víscera, um órgão ou parte dele para fora da cavidade abdominal através de um
defeito na parede músculo-aponeurótica, responsável pela contenção e estática
visceral (EUBANKS, 2001).
As hérnias inguinais são as principais hérnias da parede abdominal e
consomem vultosos recursos em cuidados com a saúde. Anualmente, são
realizados mais de um milhão de reparos de hérnias inguinais no mundo, com
custo elevado, representando importante problema para o cirurgião e os sistemas
de saúde (KINGSNORTH, 2003).
As hérnias incisionais são outro tipo de hérnias da parede abdominal e
correspondem a protrusões através de orifícios nesta parede que foram
enfraquecidas por intervenções cirúrgicas prévias (NETO, 1997). Mais de 10%
dos pacientes que necessitam de procedimento cirúrgico abdominal evoluem com
hérnia incisional. Sendo assim, de 1,3 milhões de laparotomias realizadas
anualmente nos Estados Unidos, 153.000 pacientes desenvolvem hérnias
incisionais e um terço destes pacientes apresentará sintomas. A recorrência
destas hérnias é o resultado adverso mais problemático que ocorre após o seu
reparo, devido à complexidade do seu tratamento. (FLUM et al, 2003).
Apesar das várias opções técnicas desenvolvidas até o momento,
nenhuma técnica de reparo de hérnias demonstrou-se superior para todos os
pacientes (EUBANKS, 2001; DELIGIANNIDIS et al, 2002). Em muitos casos, as
hérnias da parede abdominal não podem ser corrigidas por aproximação primária
das bordas da camada músculo-aponeurótica, necessitando da colocação de um
biomaterial. (KOLLER et al, 1997; DEYSINE, 1998).
2
O biomaterial pode ser definido como um implante que é colocado em
contato com o tecido e tem como objetivo recompor alguma parte lesada ou
auxiliar na sua recuperação. Pode agir de modo contínuo ou intermitente,
entrando em contato com fluidos corpóreos, mesmo que localizado fora do corpo
(PARK, 1979). Na prática do tratamento das hérnias, o biomaterial tem a
finalidade de substituir ou reforçar a parede abdominal.
O uso de próteses no reparo de hérnias está cada vez mais difundido
porque reduz substancialmente seus índices de recorrência (SHEEN, 2005). O
reparo de hérnias inguinais com uso de telas está relacionado à redução do risco
de recorrência entre 50% e 75% (GRANT, 2002). No âmbito das hérnias
incisionais, as taxas de recidiva são maiores com o fechamento primário, (10% a
50%) quando comparadas ao uso de próteses (3% a 17%). Os melhores
resultados para o tratamento de hérnias incisionais complexas são obtidos nos
reparos com o uso de próteses. (GIANLUPI e TRINDADE, 2004; CASSAR e
MUNRO 2002; LUIJENDICK, 2000). Nos Estados Unidos, mais de 90% dos
pacientes com hérnias da parede abdominal são submetidos à correção com o
uso de materiais protéticos (KINGSNORTH, 2003). Mundialmente, estima-se que
um milhão de próteses são utilizadas todo ano (SCHEIDBACH, 2004).
Dos vários materiais disponíveis para uso na correção de hérnias, as telas
de polipropileno e politetrafluoretileno expandido (PTFEe) são as mais
freqüentemente utilizadas. A tela de polipropileno permanece macia e flexível, não
é absorvida e não está sujeita à degradação ou enfraquecimento pela ação das
enzimas do tecido. Proporciona adequada armação para a deposição de colágeno
e incorporação aos tecidos adjacentes, além de ser de baixo custo (MORRIS e
HUGHES, 1998; BÉLLON et al, 1997). As telas de PTFEe desencadeiam mínima
3
reação inflamatória e menor quantidade de aderências mesmo na presença de
infecção (NAGY et al, 1996; CRISTOFORONI et al, 1996). Além disso, o material
é macio, flexível e complacente e não estira com o tempo.
O implante de biomateriais resulta em injúria tecidual e promove uma
reação inflamatória que, sem dúvida, é um fator importante envolvido no processo
de cicatrização e nas complicações associadas ao seu uso (ANDERSON, 1988;
KRAUSE et al, 1993; SAMLI et al, 2004).
Vários estudos experimentais demonstraram a resposta inflamatória e a
formação de aderências desencadeadas pela presença de telas inabsorvíveis na
parede abdominal (MURPHY et al, 1989; TYRREL et al, 1989; BLEICHRODT et
al, 1993; BÉLLON et al, 1995; BÉLLON et al, 1996; BEETS et al, 1996; KLINGE et
al, 1999; KAMA et al, 1999; KLINGE et al, 2002; SCHEIDBACH et al, 2004).
O processo cicatricial envolve uma complexa seqüência de eventos
celulares e bioquímicos com o objetivo de restaurar a integridade tecidual. Este
processo caracteriza-se pela homeostase, inflamação, formação de tecido de
granulação, reepitelização e remodelação da matriz extracelular. (HOWDIESHELL
et al, 2003; SAMLI et al, 2004). Além dos mecanismos celulares, vários
mediadores químicos estão envolvidos no processo de cicatrização tecidual.
Durante a fase inflamatória, a migração de células como neutrófilos, linfócitos e
macrófagos é fundamental para regular o processo de reparação, pois secretam
citocinas, linfocinas e fatores de crescimento, que atuam como sinalizadores
moleculares. Os neutrófilos são as primeiras células recrutadas, aparecendo
aproximadamente 24 horas após a lesão, com funções de fagocitose e
debridamento. Os macrófagos migram ao local da ferida em cerca de 48 a 96
horas, tornando-se a população celular predominante antes da migração e
4
proliferação dos fibroblastos. Sua ação antimicrobiana ocorre devido à geração de
radicais livres, como óxido nítrico e peróxido de hidrogênio. Uma importante
contribuição dos macrófagos para o processo cicatricial é a secreção de citocinas
e ativação de enzimas pró-inflamatórias, que ativam e recrutam outras células
envolvidas no processo cicatricial como outros macrófagos e linfócitos, regulam a
quimiotaxia e a proliferação de fibroblastos, promovem a síntese de colágeno,
além de estimular a migração de células endoteliais, também envolvidas no
processo de reparação tecidual. (COTRAN et al, 1994a; PARK e BARBUL, 2004).
Apesar de a resposta inflamatória desencadeada pela presença de telas
implantadas no espaço intraperitoneal ter sido descrita por alguns autores,
mediadores químicos como o óxido nítrico, enzimas pró-inflamatórias e
antioxidantes e citocinas envolvidas neste processo ainda não foram
demonstrados.
Sabendo que a presença de biomateriais modifica o resultado final do
processo de cicatrização (BROWN et al, 1985) e que a resposta inflamatória está
intimamente envolvida nas complicações relacionadas ao uso de telas, o presente
estudo pretendeu aprofundar o conhecimento da reação inflamatória
desencadeada pelo uso de telas implantadas no espaço intraperitoneal.
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
6
2.1 BIOMATERIAIS EM HÉRNIAS
Desde o século passado, o índice de recidivas após operações para
correção de hérnias da parede abdominal tem frustrado cirurgiões e despertado
interesse pela busca de um biomaterial que pudesse substituir ou reforçar as
fáscias aponeuróticas (DEBORD, 1998).
Já em 1890, BILLROTH expressava seu ideal de encontrar um material
que substituísse as fáscias (apud DEBORD, 1998). Até mesmo os autores
adeptos dos enxertos autólogos, homólogos e heterólogos reconheceram que
biomateriais sintéticos são, muitas vezes, indispensáveis (DEBORD, 1998).
O primeiro material sintético feito pelo homem para a correção de defeitos
da parede abdominal foi o fio de prata em forma de espiral. Foi utilizado por
PHELPS (1894), para reforço do assoalho do canal inguinal (apud DEBORD
1998). Em 1940, BURKE et al (apud KOONTZ, 1948) introduziram a tela de
tântalo, metálica, na correção destes defeitos. Este material metálico foi
considerado como o melhor material sintético para correção de hérnias na época.
No entanto, o sucesso no reparo de hérnias difíceis e a boa resistência a
infecções não foram suficientes para a manutenção de seu uso, pois os materiais
evoluíam com desgaste e fragmentação, levando ao seu progressivo abandono.
(KOONTZ 1962; BERLINER, 1989, DEBORD, 1998).
Em 1952, BABCOCK (apud DEBORD, 1998) introduziu a tela de aço
inoxidável, que foi aperfeiçoada por HAAS e RITTER para apresentar maior
flexibilidade. Apesar dos bons resultados, o aço inoxidável é pouco utilizado nos
dias atuais devido aos avanços nos métodos de diagnóstico por imagem, como a
7
ressonância nuclear magnética, pois o metal causa interferência na produção das
imagens (apud DEBORD 1998).
Durante a década de 1950, inúmeros materiais sintéticos não metálicos
foram testados quanto à possibilidade de serem utilizados como prótese e não
causar problemas na presença de infecção. Dentre os materiais testados
encontram-se: dacron, náilon, polietileno, teflon, polivinil, entre outros.
Em 1958, FRANCIS USHER introduziu a tela de polipropileno na prática
cirúrgica para a correção de defeitos da parede abdominal e demonstrou a
formação de tecido de granulação e completa cicatrização da ferida, mesmo na
presença de infecção (USHER, 1958; USHER, 1959). Além disso, o implante da
tela de polipropileno desencadeia reação inflamatória seguida pela deposição de
uma camada fibrosa que cresce através dos poros da tela, incorporando assim a
tela ao tecido adjacente. A descoberta da tela de polipropileno naquela década
proporcionou um grande avanço no reparo das hérnias da parede abdominal
sendo, até os dias atuais, o material sintético mais utilizado.
Desde então, materiais sintéticos vêm sendo utilizados com freqüência na
prática clínica e têm como finalidade substituir ou reforçar a parede abdominal. As
propriedades do material sintético “ideal” descritas por CUMBERLAND
(CUMBERLAND, 1952) e SCALES (SCALES, 1953) incluem inércia química,
ausência de reações alérgicas ou inflamatórias, ausência de carcinogenicidade,
estabilidade, facilidade de manuseio, resistência, durabilidade, flexibilidade, baixo
custo. Pesquisas são constantemente realizadas e novos materiais protéticos vêm
sendo desenvolvidos, mas, até o presente momento, não existe material sintético
que possua todas essas propriedades.
8
Existem mais de 80 tipos de biomateriais que podem ser utilizados no
reparo de hérnias da parede abdominal. Dos materiais sintéticos inabsorvíveis
que estão disponíveis para uso clínico, os mais freqüentemente utilizados são os
derivados de polipropileno (Marlex®, Prolene®, Surgipro®) e politetrafluoretileno
expandido (Gor-etex®, Trelex®). Dentre os materiais sintéticos absorvíveis,
destacam-se os derivados do ácido glicólico (Dexon®) e da poliglactina (Vicryl®).
As telas de polipropileno (PP) disponíveis podem ser monofilamentares
(Marlex®), bifilamentares (Prolene®) ou multifilamentares (Surgipro®). A tela de
Marlex® foi a primeira tela de polipropileno descrita para correção de hérnias da
parede abdominal e continua sendo o biomaterial mais utilizado (MORRIS e
HUGHES, 1998).
As telas de politetrafluoretileno expandido (PTFEe) são próteses sintéticas
inabsorvíveis, flexíveis e microporosas. Foram inicialmente utilizadas na década
de 1970 como enxertos vasculares sintéticos e somente em 1985 foi descrito o
seu uso no reparo de hérnias (MORRIS e HUGHES, 1998).
As telas de PTFEe vêm ganhando popularidade devido à mínima reação
inflamatória que desencadeiam, o que significa menor quantidade de aderências
às vísceras intestinais mesmo na presença de infecção (NAGY et al, 1996;
CRISTOFORONI et al, 1996). Atualmente é o segundo material mais utilizado
para correção cirúrgica de hérnias depois do polipropileno (BÉLLON et al, 1997).
A boa resistência a infecções foi demonstrada através de estudos em animais e
humanos nos quais foi obtido sucesso no tratamento de infecções sem a retirada
das próteses de PTFEe e, quando necessária, a remoção da prótese não
apresentaria empecilho (GILLION et al, 1997).
9
Novos estudos vêm sendo publicados anualmente sobre o uso de próteses
em correções de hérnias da parede abdominal, mas o consenso da literatura até o
momento é que o biomaterial ideal ainda não existe.
2.2 RESPOSTA INFLAMATÓRIA RELACIONADA AO USO DE BIOMATERIAIS
O implante de biomateriais promove uma resposta inflamatória que está
envolvida no processo de cicatrização. A forma e topografia da prótese
implantada determinam a composição da reação tecidual. Essa reação consiste
basicamente da migração e ativação de macrófagos, formação de células
gigantes na superfície do biomaterial, proliferação de fibroblastos, deposição de
colágeno e neovascularização (ANDERSON, 1988).
Alguns estudos mostraram que o comportamento nas primeiras horas dos
biomateriais implantados pode refletir a possível integração, em longo prazo, de
diferentes tipos de tela aos tecidos (BÉLLON et al, 2000).
A seqüência de eventos que ocorre após o implante de biomateriais na
parede abdominal inicia-se em poucos minutos. Leucócitos migram para o local
da prótese e se acumulam na tentativa de neutralizar o corpo estranho. Apesar da
fagocitose destas células ser ineficiente em degradar a prótese, macrófagos
coalescem e circundam todo o biomaterial. Reativações crônicas deste processo
inflamatório podem ocorrer, o que explicaria as complicações em longo prazo
(ZELLER, 1993).
Os macrófagos desempenham papel fundamental na resposta inflamatória
desencadeada pela presença de próteses. Diferenciam-se a partir dos monócitos
que migram da circulação sangüínea para os tecidos e tornam-se as células mais
10
envolvidas no processo inflamatório crônico e na resposta de cicatrização
relacionada aos implantes (BRODBECK et al, 2002). Os biomateriais atuam como
corpo estranho, ativando macrófagos e polimorfonucleares e provocando a
chamada explosão respiratória. Esta reação produz metabólitos ativos do
oxigênio, como ións superóxido e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), que atuam como
mediadores importantes da resposta imune celular (XIA e ZWEIER, 1997).
Macrófagos ativados produzem cinco vezes mais H
2
O
2
que macrófagos em
repouso (LENINGHER, 1988). A explosão respiratória é benéfica no combate a
agentes invasores como as bactérias, mas níveis elevados de radicais reativos do
oxigênio podem ter efeitos negativos como lesão tecidual e complicações devido
à reação inflamatória excessiva (SIES e GROOT, 1992). As células apresentam
mecanismo de defesa contra os radicais livres. A maioria destas células possui
enzimas que catalizam tais substâncias como superóxido dismutase (SOD),
catalase e inúmeras peroxidases. Os radicais superóxido gerados pelas células
inflamatórias, através da ação da oxidase, são catalizados em H
2
O
2
por diferentes
tipos de SOD (STEILING et al, 1999).
As superóxido dismutases são a principal linha de agentes antioxidantes
contra os radicais reativos do oxigênio (SIES e GROOT, 1992). Atualmente, são
conhecidas três isoformas da enzima. A SOD1 é a enzima dependente de zinco e
cobre (Cu/ZnSOD) e está localizada no citoplasma das células. A enzima
dependente de manganês (MnSOD ou SOD2) encontra-se dentro das
mitocôndrias de células aérobias e a isoforma SOD3 (EC-SOD) está presente no
meio extracelular, detectada no plasma, linfa e líquor (ZELKO et al, 2002).
Demonstrou-se que tanto a pele íntegra quanto a pele lesada expressam
os genes das enzimas antioxidantes em quantidades variáveis. Lesões de pele
11
determinam maior expressão das enzimas MnSOD e Cu/ZnSOD mas seus
valores retornam para níveis basais após 7 dias. Altos índices de radicais reativos
do oxigênio em feridas cutâneas podem ser responsáveis pelo aumento dos
níveis de SOD. (PEREIRA et al 1995; ZELKO et al, 2002). No entanto, ainda não
existem estudos que demonstrem a presença de enzimas antioxidantes como as
superóxido dismutases, no processo inflamatório desencadeado por telas
sintéticas usadas no reparo de hérnias.
Além da explosão respiratória, macrófagos ativados pela presença de
corpo estranho expressam a enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS), em
altas doses, produzindo o óxido nítrico (XIA e ZWEIER, 1997). Esta molécula está
envolvida no processo inflamatório (COTRAN et al, 1994a).
O óxido nítrico (NO) é sintetizado a partir da L-arginina, do oxigênio
molecular e do NADPH (Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido).
Devido a sua meia vida curta, in vivo, o gás só atua em células muito próximas ao
local onde é produzido. Esta atividade localizada explica a especificidade de suas
ações. O NO produzido pelos macrófagos atua como um radical livre, com
atividade citotóxica devido à oxidação de grupamentos sulfidrila nas proteínas,
causando depleção do glutation citossólico. Além disso, reage como o ânion
superóxido e forma o oxidante dióxido de nitrogênio e o radical reativo hidroxila
(SIES e GROOT 1992; COTRAN, 1994b).
Análise imunohistoquímica de tecido de granulação formado após o
implante de silicone na parede abdominal demonstrou a presença de iNOS e
sugeriu papel importante desta enzima na reparação dos tecidos e cicatrização de
feridas (POLLOCK et al, 2001). Além disso, a produção de iNOS por macrófagos
ativados por próteses ortopédicas foi demonstrada através de imunohistoquímica
12
e reação em cadeia de polimerase, e a sua presença pode ser fator importante na
manutenção da reação inflamatória desencadeada pelas próteses (MOILLANEN
et al, 1997). No entanto, ainda não foi demonstrada a presença de iNOS nos
macrófagos ativados por telas sintéticas inabsorvíveis usadas no reparo de
hérnias.
Além do óxido nítrico e dos radicais reativos do oxigênio, outras
substâncias, como as prostaglandinas, estão envolvidas no processo inflamatório.
Elas são produtos derivados do metabolismo do ácido araquidônico que, sob
estímulo de patógenos e citocinas, são translocadas para o citoplasma das
células por inúmeras fosfolipases A
2
. O ácido araquidônico liberado pelas
fosfolipases A
2
são convertidos pelas cicloxigenases (COXs) através de um
processo de duas etapas: a primeira refere-se à atividade da cicloxigenase, que
acrescenta oxigênio molecular ao ácido graxo insaturado do
ácido araquidônico
gerando mediadores
prostanóides (as prostaglandinas G
2
). Em seguida, as
prostaglandinas são rapidamente convertidas em prostaglandinas H
2
pela
atividade das peroxidases (SMITH et al, 1996; DUBOIS et al, 1998). Existem duas
isoformas de cicloxigenases, a COX-1, presente constitutivamente em vários tipos
células; e a COX-2 que está ausente em condições basais mas é induzida por
vários estímulos como
citocinas produzidas por leucócitos em resposta a danos
ou invasão microbiana, fatores de crescimento e lipopolissacárides (WU, 1995 e
MAJIMA et al, 1997).
A COX-2 é fator importante na geração da inflamação e injúria tecidual
(VANE et al, 1994; SEIBERT et al, 1994) devido à participação na produção dos
mediadores
prostanóides pró-inflamatórios, como algumas prostaglandinas e
leucotrienos. Citocinas como interleucina 1 (IL-1) e fator de necrose tumoral alfa
13
(TNF-α) já foram detectados como indutoras da produção de COX-2, sendo que
os macrófagos são os principais responsáveis pela expressão desta enzima nos
processos inflamatórios (BELVISI et al, 1997; KHAN et al, 2000). Além da
expressão da COX-2 em processos inflamatórios e de injúria tecidual, sua
presença foi detectada em células endoteliais, fibroblastos e macrófagos
envolvidos na reação tipo corpo estranho desencadeada por silicone e esponjas
em modelos animais (MAJIMA et al, 1997; McLEAN et al, 2002). Observou-se
também estímulo à angiogênese devido à expressão da COX-2 em tecidos
vasculares neoformados e em granulomas de corpo estranho (MAJIMA et al,
1997; AMANO et al, 2002), mas não há relatos na literatura sobre a expressão da
COX-2 pelas células envolvidas no processo inflamatório desencadeado pela
presença de telas.
Além de enzimas, os macrófagos ativados produzem citocinas, que têm a
função de modular outras células na resposta inflamatória. Na reação tipo corpo
estranho desencadeada pela presença de materiais protéticos, as citocinas estão
presentes como mediadores inflamatórios. As citocinas secretadas neste local
determinam a resposta final (inflamação ou cicatrização). Estas citocinas podem
ser divididas em duas categorias: Tipo Th1 e Tipo Th2. TNF-α e IL-1 são os
principais representantes da classe Th1. O TNF-α é produzido
predominantemente por macrófagos ativados e sua secreção pode ser estimulada
por dano tecidual, endotoxinas ou pela presença de biomateriais. O TNF-α induz
a expressão de outras citocinas e está envolvido na citoxicidade celular, podendo
induzir a apoptose, isto é, a morte celular programada (BRODBECK et al, 2002).
O TNF-α pode ter efeito sobre a própria célula, efeito local, pela estimulação de
células vizinhas e efeito sistêmico, agindo como hormônio. Quanto a sua atuação
14
no processo inflamatório, o TNF-α produz estimulação da aderência leucocitária,
atividade pró-coagulante, estimulação da síntese de prostaglandinas e de
citocinas pró-inflamatórias, fibrinogênese e estimulação da síntese de colágeno.
No endotélio, induzem uma série de mudanças como a ativação do endotélio,
aumento da produção de moléculas de adesão e mediadores químicos (citocinas,
quimiocinas, fatores de crescimento, óxido nítrico), promovendo a marginação e
migração dos leucócitos para o local da inflamação. (COTRAN et al, 1994a).
A maioria das operações induz resposta inflamatória e liberação de
citocinas inflamatórias. A gravidade da reação é determinada pela intensidade da
lesão. A presença de biomateriais associada ao trauma cirúrgico determina a
ativação de TNF-α. Esta citocina ativa a produção de radicais livres e enzimas
antioxidantes como as SODs, peroxidases e catalases (LOZANO et al, 2002).
DALU et al (2000) demonstraram que implante de polidimetilsiloxane
estimulou a produção de TNF-α por período maior que o grupo controle, com pico
de expressão da citocina com 14 dias, sendo detectada até 105 dias, mas o
estudo da produção de TNF-α desencadeada por telas de polipropileno ou PTFEe
ainda não foi descrito.
A interleucina 8 (IL-8) é uma interleucina que pertence a uma família de
pequenas proteínas estruturalmente semelhantes, denominadas atualmente de
quimiocinas e é um potente quimioativador de neutrófilos. É produzida por uma
variedade de células como monócitos, linfócitos, células do endotélio ou epitélio e
fibroblastos em resposta a diferentes estímulos. (ENGELHARDT et al, 1998;
RENNEKAMPFF et al, 2000). Em estudo realizado em modelo de reparo de pele
em humanos observou-se que IL-8 está presente no 1º dia após a injúria,
relacionado à migração de polimorfonucleares, mas não foi detectada após 4 dias,
15
quando a migração celular é predominantemente mononuclear (ENGELHARDT
et al, 1998).
XU et al (1999) determinaram a presença da IL-8 após o implante de osso
no músculo de camundongos até três semanas. Observaram que a produção da
IL-8 no 7º dia após o implante deveu-se aos polimorfonucleares, macrófagos e
fibroblastos e que a produção da citocina no 14º e 21º dia após o implante esteve
relacionada a células gigantes, células endoteliais e mesenquimais. Assim como o
TNF-α, a IL-8 ainda não foi estudada no processo inflamatório desencadeado por
telas de polipropileno e PTFEe implantadas no espaço intraperitoneal.
Possivelmente, o melhor conhecimento do papel dos mediadores químicos
envolvidos neste processo poderá contribuir para o entendimento do
comportamento biológico das próteses implantadas.
16
3. OBJETIVO
17
OBJETIVO GERAL
Avaliar a resposta inflamatória desencadeada pela presença de telas de
polipropileno e politetrafluoretileno expandido cirurgicamente implantadas no
espaço intraperitoneal de camundongos isogênicos.
OBJETIVO ESPECÍFICO
Avaliar e comparar a expressão de superóxido dismutase 1, óxido nítrico
sintase induzida, cicloxigenase 2, fator de necrose tumoral alfa e interleucina 8
pelo método de imunohistoquímica nos grupos estudados.
18
4. MATERIAL E MÉTODOS
19
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados 32 camundongos isogênicos, adultos, com três meses de
vida, machos, da linhagem C57/BL6, com peso variando entre 20 e 30g,
fornecidos pelo Biotério do Centro Universitário de Brasília – Brasília-DF. Os
animais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos. No primeiro grupo foi
utilizado tela de polipropileno – PP (Prolene® - Ethicon) e no segundo grupo tela
de politetrafluoretileno expandido – PTFEe (Gor-etex® - Gore).
Os animais foram subdivididos em grupos de quatro, de acordo com a data
do sacrifício. Grupo PP: 4 animais sacrificados no 5º dia de pós-operatório (DPO),
4 animais sacrificados no 10º DPO, 4 animais sacrificados no 20º DPO e 4
animais sacrificados no 30º DPO. Grupo PTFEe: 4 animais sacrificados no 5º
DPO, 4 animais sacrificados no 10º DPO, 4 animais sacrificados no 20º DPO e 4
animais sacrificados no 30º DPO.
Os animais foram alojados no Biotério do Centro Universitário de Brasília,
em ambiente conforme as diretrizes da COBEA (Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal), mantendo-se ciclo circadiano de 12h de claridade e 12h
de escuridão, temperatura média de 21 ± 2 ºC, sem ruídos externos. Foram
acondicionados em gaiolas individuais padronizadas, forradas com serragem e
cobertas com tela de ferro inoxidável, recebendo ração específica para a espécie
e água ad libitum até o procedimento (Figura 1). O experimento foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Uso de Animais do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade de Brasília – Brasília (DF).
20
Figura 1 – Alojamento dos animais
Previamente ao estudo, foi realizado um projeto piloto nas mesmas
condições do experimento atual, utilizando oito animais em cada grupo, com o
intuito de treinamento na técnica operatória e no preparo para análise
microscópica.
4.2 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO
Antes da operação, foi obedecido jejum de 6 horas, porém com livre
acesso à água. A anestesia foi realizada com ketamina 50mg/Kg e xilazina
5mg/Kg, por via intramuscular (Figura 2). As doses utilizadas seguiram as normas
de anestesia em animais de laboratório (CUNLIFFE-BEAMER e LES, 1987;
WIXSON e SMILER, 1997). Previamente à anestesia foi aplicado 0,01ml de
21
atropina a 1%, via subcutânea, a fim de reduzir os efeitos de hipersalivação
decorrentes do uso da ketamina.
Figura 2 – Injeção intramuscular do composto ketamina/xilazina no membro
inferior esquerdo do camundongo.
Após devidamente anestesiados, os camundongos foram colocados em
prancha operatória em decúbito dorsal, fixando-se as patas nas extremidades da
mesa. A anti-sepsia foi feita com polivinilpirrolidona-iodo (PVPI-tópico). Realizada
laparotomia mediana iniciada logo abaixo do apêndice xifóide e progredindo-se
em sentido caudal por 3cm e envolvendo todas as camadas da parede abdominal.
Fragmento de 0,5x1cm dos biomateriais foi implantado no espaço intraperitoneal
(Figuras 3, 4, e 5). As próteses foram fixadas à camada músculo-aponeurótica
com dois pontos de fio de polipropileno 5-0 (Prolene® - Ethicon) nas suas
extremidades. A síntese da parede abdominal anterior foi realizada com sutura
contínua de polipropileno 5-0 e a pele com sutura contínua de náilon 5-0
22
(Mononylon® - Ethicon). Não foi utilizado tratamento com antibióticos em
nenhuma fase do experimento.
1 2
Figura 3 – Fragmentos de 0,5x1,0cm das telas de polipropileno e
polietrafluoretileno expandido a serem implantadas nos animais do estudo. 1 =
politetrafluoretileno expandido; 2 = polipropileno.
Figura 4 – Implante do fragmento de tela de polipropileno na parede
abdominal dos camundongos selecionados.
23
Figura 5 – Implante do fragmento de tela de politetrafluoretileno expandido
na parede abdominal dos camundongos do grupo selecionado.
Após o procedimento cirúrgico, os animais foram mantidos em gaiolas
individuais devidamente identificadas, no mesmo local em que se encontravam no
pré-operatório, sob as mesmas condições ambientais e com livre acesso a água e
ração.
Os animais foram sacrificados nos 5º, 10º, 20º e 30º DPO por
deslocamento cervical.
As alterações macroscópicas avaliadas incluíram: presença/ausência de
aderências, seroma, hematoma, infecção, abscessos, fistulas, obstrução.
As aderências foram classificadas como: 0 = ausente, 1 = mínimas e
frouxas, 2 = moderadas e firmes.
O fragmento de tela implantado e o tecido circunjacente a ele foram
excisados, em bloco, através de incisão retangular, excluindo as bordas onde
foram fixados à camada músculo-aponeurótica com o fio de prolipropileno, e
24
preparados para análise morfológica e imunohistoquímica. Os fragmentos
implantados foram colocados em solução de formalina 10% tamponada.
4.3 ANÁLISE MORFOLÓGICA
4.3.1 MICROSCOPIA
Fragmentos do material englobando o tecido e a tela de cada um dos
animais sacrificados foram fixados em formalina 10% durante 6 horas e, em
seguida, passaram por um processo de desidratação em álcool 70% e clarificação
em xilol. O material foi incluído em blocos de parafina e a seguir realizados cortes
de 3 a 5 µm de espessura, utilizando um micrótomo. Os cortes foram dispostos
em lâminas e incubados a 58-60ºC para fixação. Em seguida foram lavados em
xilol para retirar o excesso de parafina e re-hidratados com concentrações
decrescentes de álcool (do absoluto ao 80%). Os cortes re-hidratados foram
corados com hematoxilina e eosina, desidratados com concentrações crescentes
de álcool (80% ao absoluto), lavados com xilol e cobertos com lamínulas.
O método de hematoxilina e eosina foi usado para observação da reação
inflamatória, de acordo com a rotina do Laboratório de Anatomia Patológica do
Laboratório de Imunopatologia de Brasília. Indicadores do processo inflamatório
foram avaliados em microscopia de luz e classificados quantitativamente em: 0
(ausente), 1 (leve), 2 (moderado), 3 (marcante) e 4 (intenso).
25
4.3.2 IMUNOHISTOQUÍMICA
Os blocos de parafina foram cortados em micrótomo com 4 a 5 micras de
espessura, colocados em lâminas de histologia previamente preparadas com poli-
L-Lisina.
As lâminas foram limpas com uma solução de álcool-éter, secas e nelas foi
aplicada uma fina camada da solução de poli-L-Lisina deixando-se secar
naturalmente. Em seguida, os cortes foram colocados nas lâminas e levados para
a estufa a 50°C para melhor fixação à lâmina. As lâminas foram devidamente
acondicionadas em caixas, separadas umas das outras com papel de seda até
que se procedesse às reações de imunohistoquímica.
Cortes de 5µm de biópsias previamente selecionadas foram
desparafinizadas em estufa a 50°C por 20 minutos seguido por 3 incubações em
xilol por 5 minutos cada. Em seguida, os tecidos foram re-hidratados em
graduação de álcoois, colocados em solução salina tamponada com fosfato (PBS)
e soro albumina bovina (BSA) 1 %. Os cortes foram então tratados com peróxido
de hidrogênio (H
2
O
2
, 20 vol.) a 3% em metanol por 30 minutos para o bloqueio da
peroxidase endógena. Posteriormente, os cortes foram re-hidratados em bateria
crescente de álcoois (95%, 70% e 50%) e lavados 3 vezes em PBS + BSA 1%.
Em seguida procedeu-se a digestão enzimática empregando-se tripsina a
0,1 % (No. T- 8128, Sigma) em PBS por 30 minutos a 37°C.
Após banho das lâminas em PBS+BSA a 1% (3 vezes), os sítios protéicos
inespecíficos de ligação do anticorpo primário foram bloqueados com proteína-
soro de leite a 3% (leite em pó desnatado Molico) em água destilada por 20
26
minutos e então incubadas 12 a 16 horas a 4°C com os anticorpos primários
monoclonais específicos em diferentes títulos (Tabela 1) por um período de 12 a
16 horas. Os cortes foram lavados em PBS + BSA 1% (3 vezes) e incubados com
o anticorpo secundário anti-IgG de camundongo produzido em cabra (No. Z-420,
Dako) numa diluição de 1:200 por 30 minutos à temperatura ambiente. Após
remoção do excesso desse anticorpo com 3 banhos em PBS + BSA a 1%, os
cortes foram incubados com o complexo peroxidase-anti-peroxidase (PAP) de
camundongo (No. P 850, Dako) à diluição de 1:75 por 30 minutos à temperatura
ambiente, seguidos por 3 banhos em PBS + BSA a 1%.
Para a revelação dos sítios antigênicos, utilizou-se o substrato DAB (3,3 -
Diaminobenzidina No. D 5637, Sigma Chemical Co) a 0,5% em PBS,
acrescentando-se 180 µl de H
2
O
2
a 20 vol. para cada 10 ml da solução deixando-
se as lâminas por 10 minutos no escuro. Após o controle da intensidade da
coloração da reação ao microscópio, a mesma foi interrompida com água
destilada. A contra-coloração foi feita com hematoxilina de Mayer por 5 minutos,
também controlando-se a coloração e interrompida com água destilada e
azulando-se os núcleos celulares com hidróxido de amônio a 0,5% por 1 a 2
segundos e interrompendo-se novamente com água destilada. Os cortes foram
então desidratados em 3 banhos de álcoois 95% e 3 banhos de álcoois
absolutos, diafanizados em 3 banhos de xilóis e as lâminas montadas em meio
permanente (Entellan).
Cortes selecionados foram analisados por imunohistoquímica para
demonstração da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS), superóxido
dismutase 1 (SOD1), cicloxigenase 2 (COX-2), Fator de Necrose Tumoral alfa
27
(TNF-α) e interleucina 8 (IL-8) e classificados quantitativamente em: 0 (ausente),
1 (leve), 2 (moderado), 3 (marcante) e 4 (intenso).
Tabela 1 – Anticorpos utilizados no experimento
Anticorpos Diluição Clone Código Fabricante
Policlonais de camundongo
anti-iNOS humano
1:100 C-20 SC652 Santa Cruz
Biotechnology,
Policlonais de coelho anti-SOD
humano
1:100 Santa Cruz
Biotechnology
Monoclonais de camundongo
anti-COX-2
1:100 C-16 SC1381 Santa Cruz
Biotechnology
Monoclonais de camundongo
anti-TNF-α
1:75 C-20 Santa Cruz
Biotechnology
Monoclonais de camundongo
anti-IL-8
1:250 C-20 SC988 Santa Cruz
Biotechnology
4.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados do ponto de vista estatístico utilizando-se o
teste U de Mann-Whitney. O nível de significância foi de 5% (p<0,05) (SIEGEL,
1975).
4.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
As citações seguiram as normas da Associação Brasileira de Normas e
Técnicas (ABNT)
28
5. RESULTADOS
29
5.1 AVALIAÇÃO CIRÚRGICA E EVOLUÇÃO PÓS-OPERTÓRIA
Os 16 camundongos do grupo polipropileno (PP) evoluíram sem
intercorrências no pós-operatório, com boa recuperação cirúrgica e
disponibilidade para alimentação. Nenhum camundongo apresentou deiscência
da pele ou da camada músculo-aponeurótica, sinais de infecção local ou
sistêmica, extrusão ou deslocamento do biomaterial implantado, abscesso ou
peritonite intra-abdominal. A tela aderiu satisfatoriamente à camada músculo-
aponeurótica e somente três animais apresentaram aderências (Figura 6), sendo
2 animais do grupo sacrificado com 20 dias e 1 animal do grupo sacrificado com
30 dias (Tabela 2). Não foi observado fístula estercoral ou obstrução intestinal em
nenhum dos animais.
Figura 6 – Fotomicrografia corado pela técnica de HE, 40x, demonstrando o
infiltrado inflamatório entre os poros da tela de polipropileno em contato íntimo
com uma alça intestinal.
30
Todos os camundongos do grupo politetrafluoretileno expandido (PTFEe)
evoluíram satisfatoriamente no pós-operatório, com boa recuperação cirúrgica e
disponibilidade para alimentação. Nenhum camundongo apresentou deiscência
da pele ou da camada músculo-aponeurótica, sinais de infecção local ou
sistêmica, extrusão ou deslocamento do biomaterial implantado, abscesso ou
peritonite intra-abdominal. Nos grupos sacrificados com mais de 10 dias a tela
apresentava-se bem incorporada ao tecido adjacente. Dois animais apresentaram
apenas aderências frouxas com as vísceras intra-abdominais (Tabela 2). Nenhum
animal apresentou aderências firmes, fístula estercoral ou obstrução intestinal.
Tabela 2- Quantificação de Aderências do grupo polipropileno (PP) e do grupo
Politetrafluoretileno expandido (PTFEe)
Grupo Polipropilneo Grupo politetrafluoretileno expandido
Animal Aderência Animal Aderência Animal Aderência Animal Aderência
1(5d) 0 9(20d) 2 17(5d) 0 25(20d) 0
2(5d) 0 10(20d) 0 18(5d) 0 26(20d) 1
3(5d) 0 11(20d) 2 19(5d) 0 27(20d) 0
4(5d) 0 12(20d) 0 20(5d) 0 28(20d) 0
5(10d) 0 13(30d) 1 21(10d) 0 29(30d) 1
6(10d) 0 14(30d) 0 22(10d) 0 30(30d) 0
7(10d) 0 15(30d) 0 23(10d) 0 31(30d) 0
8(10d) 0 16(30d) 0 24(10d) 0 32(30d) 0
5d = 5º DPO (dia de pós-operatório), 10d = 10º DPO, 20d = 20º DPO, 30d = 30º DPO.
0=ausência de aderências, 1=aderências frouxas, 2=aderências firmes.
31
5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
Os animais foram avaliados quanto ao edema, hemorragia, ulceração,
necrose, migração de polimorfonucleares, migração de células mononucleares,
neoformação de vasos, tecido de granulação e fibrose.
Gráfico 1 – Avaliação do edema nos grupos estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Edema
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
O edema foi caracterizado pelo espessamento do tecido conjuntivo
formado na reação tipo corpo estranho e esteve presente de forma moderada nos
animais do grupo PP do 5º ao 20º DPO e no grupo PTFEe, o edema se estendeu
apenas até o 10º DPO (Gráfico 1), sendo que no 20º DPO houve diferença
estatisticamente significante entre os grupos (p=0,02).
A hemorragia foi um aspecto detectável em intensidade mínima em 2
animais do 5º DPO do grupo PP e em 1 animal do grupo PTFEe no mesmo
período. Necrose foi observada apenas no grupo PP no período inicial da
32
avaliação (5º DPO) em leve intensidade, mas com diferença estatisticamente
significante entre os grupos (p=0,04).
Gráfico 2 – Avaliação da neoformação vascular nos grupos estudados
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Neoformação vascular
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
A neoformação vascular ocorreu desde o início no grupo PP e persistiu em
todo o período estudado (do 5º ao 30º DPO). No caso do grupo PTFEe, a
neovascularização foi menos acentuada e não esteve presente em todo o período
estudado, apenas no 10º e 20º DPO (Gráfico 2). Houve diferença estatisticamente
significativa entre os grupos no 5º, 10º e 30º DPO, sendo p=0,02.
33
Gráfico 3 – Avaliação da migração de polimorfonucleares nos grupos estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Polimorfonucleares
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitet
r
afluoretileno ex
p
andido
Quanto à migração de polimorfonucleares, observou-se que no grupo PP, a
migração foi intensa no 5º DPO, diminuiu nos demais períodos avaliados, mas
persistiu até o 30º DPO. No grupo PTFEe, a presença dos polimorfonucleares foi
semelhante ao grupo PP no 5º, 10º e 20º DPO. No 30º DPO detectou-se a
presença de polimorfonucleares apenas no grupo PP, com diferença
estatisticamente significante entre os grupos (p=0,02) (Gráfico 3).
34
Gráfico 4 – Avaliação da migração de monócitos nos grupos estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Mononucleares
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
A migração de mononucleares no grupo PP ocorreu em todo o período
estudado, com células do 5º ao 30º DPO em intensidade moderada. No grupo
PTFEe, a migração no 5º DPO foi intensa, com diferença estatisticamente
significante em relação ao grupo PP (p=0,02). Houve redução gradual nos demais
períodos sendo que no 20º e 30º DPO a presença de mononucleares foi
significativamente menor em relação ao grupo PP (p=0,02) (Gráfico 4).
Fibrose esteve presente no 30º DPO do grupo PP, com intensidade
marcante e com diferença estatisticamente significante (p=0,02), em relação ao
grupo PTFEe, que apresentou fibrose leve em apenas 2 animais. Tecido de
granulação foi detectado no grupo PTFEe no período de 30 dias, com intensidade
leve em apenas um animal.
Além da presença de células e da caracterização do processo inflamatório
envolvido, o estudo permitiu determinar a cinética deste processo (Figuras 7 e 8).
No grupo PP observou-se que o edema do tecido conjuntivo começa já nos
primeiros dias e não foi mais encontrado no final, quando se observou a formação
35
de tecido conjuntivo denso e fibrose, distribuídos aleatoriamente entre os poros da
tela. A migração de monócitos e polimorfonucleares ocorreu desde os primeiros
dias e diminuiu gradativamente com o tempo. A presença de mononucelares foi
mais intensa do que os polimorfonucleares após os 10 primeiros dias, com
formação de células gigantes distribuídas de forma aleatória ao redor e dentro da
tela. Com 30 dias a quantidade de células detectadas foi pequena e constituída
basicamente de macrófagos. A neoformação vascular que se iniciou de maneira
uniforme pela tela desde o início do estudo, se manteve até o 30º DPO.
As telas de PTFEe determinaram processo inflamatório diferente em
relação às telas de polipropileno. Inicialmente a tela de PTFEe promoveu uma
reação que envolveu a tela, encapsulando-a (Figura 9). Não se observou
processo inflamatório no interior das telas de PTFEe. Além disso, o processo
inflamatório foi menos intenso em relação às telas de polipropileno, mas a reação
tipo corpo estranho foi mais intensa do que no grupo PP (Figura 7). O edema
esteve presente somente até o 10º DPO. A quantidade de células
polimorfonucleares e mononucleares foi maior no início e distribuídas em torno da
tela, e não inseridas no seu interior, como nas telas de PP. Os macrófagos
também representaram as células mais importantes no processo inflamatório que
se desenvolveu e a formação de células gigantes foi mais marcante. A
neoformação vascular esteve presente em menor intensidade e por período de
tempo mais curto em relação às telas de polipropileno, caracterizando a reduzida
inflamação que este biomaterial desencadeou.
36
1 2
3 4
Figura 7 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pela
presença das telas implantadas apresentando: Foto 1 – Denso infiltrado mono e
polimorfonuclear no interior da tela de polipropileno no 5º DPO. Neoformação
vascular já está presente. Foto 2 – Reação inflamatória no 10º DPO, com
formação de células gigantes entre os poros da tela de polipropileno. Foto 3 –
Infiltrado inflamatório mono e polimorfonucleares no 5º DPO desencadeado pela
tela de PTFEe. Foto 4 – Distribuição ordenada das células gigantes e da resposta
tipo corpo estranho ao redor da tela de PTFEe no 10º DPO. Setas: células
gigantes. Foto 1, 3 e 4 – HE, aumento original de 200x, Foto 2 – HE, aumento
original de 100x.
37
1 2
3 4
Figura 8 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - Diminuição do infiltrado polimorfonuclear, predomínio de
mononucleares e neoformação vascular (seta) entre os poros da tela de
polipropileno no 20º DPO. Foto 2 – Infiltrado inflamatório predominantemente
mononuclear, com células gigantes e fibrose marcante entre os poros da tela de
polipropileno no 30º DPO (seta). Foto 3 – Predomínio do infiltrado mononuclear ao
redor da tela de PTFEe no 20º DPO, porém de menor intensidade em relação aos
períodos anteriores. Foto 4 – Escassa presença de células mononucleares ao
redor da tela de PTFEe no 30º DPO. Fotos 1 e 2 – HE, aumento original de 100x,
Fotos 3 e 4 – HE aumento original de 200x.
38
Figura 9 - Encapsulamento da tela de PTFEe pelo processo inflamatório. HE 40x.
Observou-se também que a presença dos biomateriais determinou a
neoformação de peritônio. A distribuição do peritônio neoformado ocorreu de
forma irregular no grupo PP, enquanto esta distribuição foi paralela e ordenada no
grupo PTFEe. A irregularidade na neoformação do peritônio no grupo PP esteve
relacionada à presença de hemorragia e necrose, porém de leve intensidade e
não esteve relacionada à aderência de alças intestinais (Figura 10).
Figura 10 – Neoformação do peritônio em relação à tela de polipropileno. HE
100x.
39
5.3 AVALIAÇÃO IMUNOHISTOQUÍMICA
A imunohistoquímica avaliou a presença das enzimas superóxido
dismutase 1 (SOD1), óxido nítrico sintase induzida (iNOS) e cicloxigenase 2
(COX2) e das citocinas fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e interleucina 8 (IL-
8).
Observou-se uma forte expressão da SOD1 no grupo PP no 5º DPO e
moderada no 10º DPO, com diferença estatisticamente significante entre os
grupos (p=0,02) nos dois períodos. No grupo PTFEe, a expressão foi leve, mas
presente em todos os períodos. A expressão no 20º DPO foi mais intensa neste
grupo que no grupo PP, com diferença estatisticamente significante (p=0,02). No
30º DPO, a expressão da enzima foi semelhante nos dois grupos (Gráfico 5,
Figura 11).
Gráfico 5 – Expressão da enzima superóxido dismutase tipo 1 (SOD1) nos grupos
estudados.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Expressão da SOD1
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
40
2
1
4
3
Figura 11 – Fotomicrografia do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - moderada marcação da enzima superóxido dismutase 1
no 5º DPO do grupo polipropileno. Foto 2 - marcação leve no mesmo grupo com
30 dias. Foto 3 e 4 – marcação leve da enzima no grupo PTFEe no 5º e 30º DPO
respectivamente. Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de 200x.
41
A expressão da iNOS foi maior no grupo PP em relação ao grupo PTFEe,
com diferença estatisticamente significativa entre os dois grupos no 5º, 10º e 30º
DPO (p=0,02). A expressão da enzima no grupo PTFEe foi leve e constante, mas
presente até 30º DPO (Gráfico 6, Figura 12).
Gráfico 6 – Expressão da enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) nos grupos
estudados.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Expressão da iNOS
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
42
1 2
3 4
Figura 12 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pela
presença das telas, apresentando: Foto 1 - intensa marcação da enzima óxido
nítrico sintase induzida no 5º DPO do grupo polipropileno. Foto 2 - marcação
moderada no mesmo grupo com 30 dias. Foto 3 e 4 – marcação leve da enzima
no grupo PTFEe no 5º e 30º DPO respectivamente. Imunohistoquímica,
imunoperoxidase, aumento original de 200x.
43
A COX-2 foi a enzima que mais se expressou. A intensidade desta
expressão foi intensa nos dois grupos até o 20º DPO, porém significativamente
maior no grupo PP no 10º e 20º DPO (p=0,02). No grupo PTFEe, a expressão
também foi intensa no 5º DPO, mas houve diminuição gradual da intensidade nos
dias 10 e 20 de pós-operatório, voltando a se expressar com intensidade
significativamente maior no 30º DPO em relação ao grupo PP (p=0,02) (Gráfico 7,
Figura 13).
Gráfico 7 – Expressão da enzima cicloxigenase 2 (COX-2) nos grupos estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Expressão da COX-2
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
44
1 2
3 4
Figura 13 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - intensa marcação da enzima cicloxigenase 2 no 5º DPO
do grupo polipropileno. Foto 2 - marcação moderada no mesmo grupo com 30
dias. Foto 3 e 4 – marcação intensa da enzima no grupo PTFEe no 5º e 30º DPO
respectivamente. Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de 200x
(foto 1, 2, e 3), aumento original de 100x (foto 4).
O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) teve expressão intensa e marcante
em todo o período no grupo PP. No grupo PTFEe, a expressão foi marcante no
5º e 10º DPO, com redução importante da sua expressão no 20º e 30º DPO, com
diferença estatisticamente significante entre os grupos nos dois últimos períodos
(p=0,02) (Gráfico 8, Figura 14).
45
Gráfico 8 – Expressão do fator de necrose tumoral alfa (TNF-
α
) nos grupos
estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Expressão do TNF-a
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
A inteleucina 8 (IL-8) teve expressão intensa e semelhante nos dois
grupos, com leve redução da expressão no 30º DPO no grupo PTFEe, quando
houve diferença estatisticamente significante em relação ao grupo PP (p=0,02)
(Gráfico 9, Figura 15).
Gráfico 9 – Expressão da interleucina 8 (IL-8) nos grupos estudados
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
5 DPO 10 DPO 20 DPO 30 DPO
Expressão da IL-8
Polipropileno
PTFEe
Intensidade
DPO = dia de
p
ós-o
p
eratório
;
PTFEe =
p
olitetrafluoretileno ex
p
andido
46
1 2
3 4
Figura 14 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 - intensa marcação do fator de necrose tumoral alfa no 5º
DPO do grupo polipropileno. Foto 2 – intensidade marcante do TNF-
α
no mesmo
grupo com 30 dias. Foto 3 – marcante intensidade do TNF-
α
no grupo PTFEe no
5º DPO. Foto 4 – leve marcação da citocina no 30º DPO do grupo PTFEe.
Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original de 200x.
47
1
3 4
2
Figura 15 – Fotomicrografias do processo inflamatório desencadeado pelas telas
apresentando: Foto 1 e 2 - intensa marcação da interleucina 8 do grupo
polipropileno no 5o e 30º DPO respectivamente. Foto 3 – intensa marcação da
interleucina no grupo PTFEe no 5º DPO. Foto 4 – intensidade marcante da IL-8 no
30º DPO do grupo PTFEe. Imunohistoquímica, imunoperoxidase, aumento original
de 200x.
48
6. DISCUSSÃO
49
O camundongo (mus musculus) C57/BL6 foi o animal escolhido por ser
uma espécie que se adapta a uma grande variedade de condições ambientais.
Além disso, são de linhagem isogênica, ou seja, todos os indivíduos são
geneticamente iguais entre si. Os camundongos isogênicos são obtidos através
do acasalamento irmão x irmã por mais de 20 gerações, daonde vêm as
seguintes vantagens: uniformidade genética entre os indivíduos, melhor
reprodutibilidade de resultados, perfil genético conhecido, homozigotos,
uniformidade fenotípica e histocompatibilidade. Além disso, os camundongos são
os animais de laboratório mais intensamente utilizados e, por isso, dispõe-se de
maior número de anticorpos para efetuar análises imunohistoquímicas. A
utilização de adultos machos evita as variações hormonais e de crescimento, a
fim de se obter maior homogeneidade na resposta inflamatória. A utilização de
camundongos isogênicos permite o desenvolvimento de experimentos com
reduzido número de animais devido à similaridade na resposta obtida, sem
comprometer os resultados da pesquisa (ATHANASOPOULOS et al, 2006;
LONDOÑO et al, 2005; SCHACHNER et al, 2004; SOUZA et al, 2000).
O ato operatório foi realizado por um pesquisador único, seguindo
sistematização técnica em todos os procedimentos, a fim de que não ocorressem
alterações decorrentes da execução do ato cirúrgico, preservando a
homogeneidade do estudo. Preferiu-se a anestesia intramuscular com ketamina e
xilazina por ser facilmente administrada, com poucos efeitos colaterais e
altamente efetiva em baixas dosagens. A administração prévia da atropina teve o
intuito de evitar a hipersalivação e possível obstrução das vias aéreas, com efeito
letal (CUNLIFFE-BEAMER e LES, 1987; WIXSON e SMILER, 1997).
50
A escolha das próteses baseou-se na importância dos materiais na prática
médica. Dentre as telas existentes atualmente, as que mais se aproximam dos
critérios de material ideal são as telas de polipropileno e politetrafluoretileno
expandido (DEBORD, 1998). Devido, pois, ao material disponível na literatura,
bem como a importância destes biomateriais no meio cirúrgico, foram escolhidos
como materiais para o implante neste experimento as telas de polipropileno
(Prolene®) e politetrafluoretileno expandido (PTFEe – Gor-etex®).
A opção do sacrifício nos dias 5, 10, 20 e 30 de pós-operatório foi
determinada a partir de um projeto piloto, onde foi observado que estes períodos
apresentavam melhor descrição da cinética da reação inflamatória. Este pré-
estudo foi realizado exatamente nas mesmas condições do experimento atual,
diferindo apenas nos dias de sacrifício, onde os animais foram sacrificados com 3,
5, 7, 10, 14, 20, 30 e 60 dias de pós-operatório. No dia 3, a resposta inflamatória
ainda era escassa, com pouca deposição de células e incorporação dos tecidos, o
que dificultaria a determinação de citocinas e enzimas inflamatórias pela técnica
de imunohistoquímica. Nos dias 5 e 7, as reações foram semelhantes, assim
como nos dias 14 e 20 de pós-operatório. A partir de 30 dias, o processo
cicatricial, com formação de fibrose já foi demonstrado com intensidade, não
havendo necessidade de manter o estudo por período maior de 30 dias, já que o
objetivo inicial do estudo seria determinar a presença de citocinas e enzimas
inflamatórias e antinflamatórias envolvidas no processo de cicatrização com o uso
de telas.
A avaliação macroscópica da cavidade peritoneal demonstrou que não
houve formação de abscessos, peritonite, fístulas ou outras complicações
infecciosas visíveis macroscopicamente em nenhum dos animais do experimento.
51
Este fato pode ter sido em decorrência do período em que foi realizada a
avaliação, no qual não haveria tempo suficiente para a formação de fístulas
intestinais. Outro fator importante seria a resistência apresentada pelos animais
em estudo em relação ao desenvolvimento de processos infecciosos. Além disso,
o implante de materiais sintéticos sem abertura de vísceras intra-abdominais é
considerado procedimento limpo e o estudo seguiu técnicas rigorosas de anti-
sepsia.
O desenvolvimento de aderências não foi significativo em nenhum dos
grupos estudados. Este fato também pode se dever ao período de avaliação,
onde a formação de aderências foi mínima, desfazendo-se facilmente à
manipulação. A ausência de aderências deve-se à falta de penetração de tecido
fibrocolágeno na face visceral da tela (SIMMERMACHER et al, 1994), sendo
menor ainda no grupo PTFEe, onde a resposta inflamatória é menos intensa e a
incorporação de colágeno insuficiente, provavelmente devido à microporosidade
do material, que dificulta a penetração de células inflamatórias e formação de
tecido conjuntivo dentro da tela.
A resposta inflamatória desencadeada pela presença de telas inabsorvíveis
na parede abdominal descrita em alguns estudos experimentais (TYRREL et al.,
1989; MURPHY 1989; BLEICHRODT, 1993; BÉLLON et al, 1995; BEETS et al
1996; BÉLLON, 1996; KAMA et al, 1999; KLINGE et al, 1999; KLINGE et al 2002;
SCHEIDBACH et al, 2004) manteve o mesmo padrão no presente estudo.
As telas de polipropileno induzem uma rápida resposta inflamatória, com
migração de monócitos e polimorfonucleares (DABROWIECKI et al, 1991;
PAPADIMITRIOU e PETROS, 2005). A partir do 3º dia de pós-operatório já se
inicia o processo de cicatrização, com pequena quantidade de leucócitos em
52
ambos os lados da tela e tecido de granulação acumulando-se em todos os
espaços internodais da tela, devido a sua macroporosidade (BÉLLON et al, 2000).
A angiogênese se inicia de maneira uniforme dentro da prótese, mas agregados
de neovascularização podem ser observados (SAMLI et al, 2004).
Proteinoglicanos e fibras colágenas também são observados no tecido conjuntivo
neoformado que envolve os implantes (PAPADIMITRIOU e PETROS, 2005). O
estudo desenvolvido apresentou as mesmas características dos trabalhos
descritos na literatura quanto ao processo inflamatório, no qual observa-se
marcante presença de células polimorfonucleares, macrófagos e neoformação
vascular com 5 dias de pós-operatório. O edema também esteve presente de
maneira moderada e uniforme neste período.
Estudos prévios determinaram que a neoformação do peritônio ocorre de
forma irregular e desorganizada, com uma superfície áspera, conforme foi
observado no experimento (BÉLLON et al, 2001). Áreas de hemorragia e necrose
correspondendo a áreas de aderências foram observadas em alguns estudos
(BÉLLON et al, 2001), apesar do presente experimento não ter demonstrado que
as áreas de necrose e hemorragia correspondessem ao local de aderências. A
presença de infecção nas telas de polipropileno piora ainda mais a irregularidade
na distribuição do tecido neoformado, com o aparecimento de áreas desnudas e
exposição dos filamentos da tela (BÉLLON et al, 2004), mas nenhum dos animais
estudados apresentou infecção.
Segundo DABROWIECKI et al (1991), em duas semanas, o acúmulo de
macrófagos é intenso e o número de células gigantes é crescente, mas a
quantidade de células inflamatórias encontra-se significativamente reduzida. O
experimento demonstrou que com 10 dias de pós-operatório a descrição
53
morfológica é semelhante à referida por DABROWIECKI et al (1991), onde a
quantidade de polimorfonucleares diminui e a quantidade de monócitos aumenta
consideravelmente, apresentando intensidade marcante, bem como o crescente
número de células gigantes. Neoformação vascular continua, com intensidade
significativamente maior no grupo PP em relação ao grupo PTFEe.
Um mês após o implante da tela de PP, BELLON et al (1994 e 1995)
demonstraram que o número de macrófagos diminuiu e houve aumento
progressivo de fibroblastos, com formação de tecido conjuntivo denso distribuído
de forma aleatória ao redor e no interior da tela, principalmente na superfície
interna, que está em contato com o peritônio. A resposta inflamatória está
presente ainda após 3 meses do implante e pode persistir por vários anos
(BEETS et al, 1996; KLINGE et al, 1999; SAMLI et al, 2004). No presente estudo
foi seguido o mesmo padrão de cinética do processo inflamatório, onde foi
evidenciado menor quantidade de células com 20 dias e 30 dias de pós-operatório
e marcante predomínio de mononucleares. Com 30 dias, o processo de fibrose já
se encontra instalado no grupo PP, com intensidade marcante e
significativamente maior em relação ao grupo PTFEe.
Devido a estes achados, a maioria dos estudos experimentais demonstra
que a tela de PP é incorporada adequadamente à parede abdominal após 2
semanas do implante (MORRIS-STIFF e HUGHES, 1998) e ocorre maior
incorporação de colágeno à tela (MURPHY et al, 1989). Entretanto, a densa
reação fibroblástica desencadeada por este biomaterial predispõe à formação de
aderências firmes quando estão em contato com as alças intestinais (JAMES et
al, 1991). Em estudo experimental em ratos utilizando telas de PP e PTFE para a
correção de defeitos infectados da parede abdominal observou-se maior formação
54
de aderências utilizando telas de PP bem como maior número de fístulas
intestinais (BLEICHRODT et al, 1993). Provavelmente devido ao curto período de
análise, a formação de aderências não foi significativa e não houve formação de
fístulas.
O PTFEe induziu resposta inflamatória menos intensa que o PP porém a
resposta tipo corpo estranho foi mais acentuada, o que explica o predomínio de
mononucleares em relação ao grupo PP no 5º DPO.
As telas de PTFEe induziram reação inflamatória e formação de tecido
conjuntivo e células gigantes distribuídos de maneira ordenada e paralela à tela
nas duas superfícies que entram em contato com a mesma, provocando o seu
encapsulamento. Esta particularidade na formação de tecido conjuntivo das telas
de PTFE deve-se à sua textura, baixa porosidade e hidrofobicidade, promovendo
o acúmulo de células nas bordas do biomaterial e escassa quantidade de células
no interior da tela (SIMMERMACHER et al, 1994; BÉLLON et al, 1995).
A cinética do estudo com as telas de PTFEe seguiu o mesmo padrão
descrito na literatura. O macrófago foi a célula mais importante envolvida no
processo de cicatrização e a formação de células gigantes foi mais intensa que no
grupo das telas de polipropileno. Não se observou necrose em nenhuma fase do
processo de cicatrização e o tecido de granulação esteve presente com 30 dias
de pós-operatório, quando as células quase não são mais detectadas. Fibrose foi
significativamente menor em relação ao grupo PP.
A formação de aderências relacionadas ao uso das telas de PTFEe é
menos intensa e menos freqüente àquelas relacionadas às telas de PP, pois o
crescimento de tecido fibro-colágeno e a formação de tecido conjuntivo é paralela
à prótese, demonstrando a incorporação insuficiente de colágeno à tela e sua
55
fraca integração à parede abdominal (KLINGE et al, 1999; SIMMERMACHER et
al, 1994; BÉLLON et al, 2001). O presente estudo demonstrou menor quantidade
e intensidade de aderências das telas de PTFEe em relação às telas de PP, mas
de forma não significativa, talvez devido ao curto período de tempo estudado.
Enzimas antioxidantes são os principais mecanismos de defesa contra os
radicais livres produzidos por macrófagos ativados pelo processo inflamatório,
quando a explosão respiratória pode ter efeito negativo sobre os tecidos
adjacentes (SIES e GROOT, 1992, STEILING et al, 1999). As superóxido
dismutases são a principal linha de agentes antioxidantes contra os radicais
reativos do oxigênio. Observou-se no presente estudo que a expressão da SOD1
foi mais intensa no grupo PP, no início do processo inflamatório, onde a explosão
respiratória é mais acentuada. Como as telas de PP determinam processo
inflamatório mais intenso que as telas de PTFE supõe-se que há necessidade de
maiores quantidades de SOD1 como agente antioxidante, no combate aos
radicais reativos do oxigênio. Além disso, diferentemente do processo de
cicatrização em pele íntegra (PEREIRA et al 1995; ZELKO et al, 2002), a
presença do biomaterial levou à expressão da enzima mesmo após 30 dias do
implante, demonstrando que o processo inflamatório relacionado ao uso de telas
persiste cronicamente, ainda que em menor intensidade.
A enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS), é responsável pela
produção do óxido nítrico (XIA e ZWEIER, 1997), que atua como radical livre, e
está relacionado à injúria tecidual no processo inflamatório (SIES e GROOT
1992). Este estudo demonstrou a presença da enzima iNOS nos macrófagos
ativados pelas próteses utilizadas. Nas reações às telas de PP a enzima se
expressou em quantidade significativamente maior e persistiu com intensidade
56
marcante até 30 dias. Em relação às telas de PTFE, a resposta inflamatória foi
menos intensa, bem como a expressão da enzima iNOS, que se apresentou em
pequena quantidade nos macrófagos ativados, demonstrando que a intensidade
da reação difere de acordo com o tipo de material implantado.
O superóxido e NO são os radicais livres mais estudados e desempenham
efeito importante nos tecidos inflamados. Este estudo permitiu determinar a
presença das enzimas SOD1 e iNOS demonstrando que o NO e íons superóxido
estão envolvidos no processo inflamatório desencadeado pelas telas estudadas e
podem estar relacionados às complicações que ocorrem com o uso destes
biomateriais.
A COX-2 é fator importante na geração da inflamação e injúria tecidual
(VANE et al, 1994; SEIBERT et al, 1994) devido a sua participação na produção
dos mediadores
prostanóides pró-inflamatórios, como prostaglandinas e
leucotrienos. No presente estudo, a COX-2 foi detectada em todos os períodos
analisados, presente no citoplasma dos macrófagos ativados, sendo
significativamente mais intensa nos animais com implante de telas de
polipropileno em relação ao PTFEe. Com 5 dias, a COX-2 também foi detectada
no citoplasma de polimorfonucleares, mas a partir de 10 dias, os macrófagos
predominaram como células inflamatórias e foram os responsáveis pela
expressão da COX-2. A partir deste resultado, sugere-se que as prostaglandinas
também estão envolvidas no processo inflamatório e de injúria tecidual que ocorre
com o uso de telas implantadas no espaço intraperitoneal e podem estar
relacionadas às complicações que ocorrem com o seu uso.
O TNF-α é produzido predominantemente por macrófagos ativados e sua
secreção pode ser estimulada por corpos estranhos (COTRAN et al, 1994a). O
57
experimento atual demonstrou a presença do TNF-α nos dois grupos em todo o
período estudado. Sua expressão foi marcante nos dois grupos, porém mais
intensa no grupo PP, provavelmente devido à maior resposta inflamatória que as
telas de polipropileno desencadearam em relação às telas de PTFEe. A partir dos
resultados pode-se dizer que as próteses utilizadas no estudo são ativadoras do
TNF-α mesmo após 30 dias do implante, como foi demonstrado com outros
biomateriais (DALU et al, 2000).
A interleucina 8 (IL-8) é potente quimioativador de neutrófilos, produzida
por uma variedade de células em resposta a diferentes estímulos e
(ENGELHARDT et al, 1998; RENNEKAMPFF et al, 2000) orientando as células
em direção ao local de inflamação. O presente estudo demonstrou a forte
expressão da IL-8 nos dois grupos, de forma semelhante e persistente,
demonstrando que a presença dos biomateriais manteve o processo inflamatório
ativo, mesmo após 30 dias e que várias células podem estar envolvidas na
expressão desta citocina.
Além das enzimas e citocinas estudadas neste experimento, outros
mediadores podem estar envolvidos no processo inflamatório desencadeado pela
presença de telas cirurgicamente implantadas no espaço intraperitoneal e novos
estudos são necessários para aprimorar o conhecimento da resposta inflamatória
que ocorre com o uso de telas na cavidade abdominal.
58
7. CONCLUSÕES
59
Nas condições em que foi realizado o presente estudo, a resposta
inflamatória desencadeada pelas telas de polipropileno cirurgicamente
implantadas no espaço intraperitoneal de camundongos foi mais intensa em
relação às telas de politetrafluoretileno expandido (PTFEe).
Os mediadores inflamatórios avaliados pela técnica de imunohistoquímica
foram detectados em ambos os grupos, porém com maior intensidade no grupo
com implante de telas de polipropileno em relação ao grupo politetrafluoretileno
expandido.
60
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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75
9. ANEXOS
76
Avaliação morfológica da resposta inflamatória no 5º e 10º dias de pós-
operatório
Grupo Polipropileno
DPO 5 DPO 5 DPO 5 DPO 5 DPO 10 DPO 10 DPO 10 DPO 10 DPO
Edema ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ +++
Hemorragia + + 0 0 0 0 0 0
Necrose + + + + 0 0 0 0
Polimorfonuclear +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +
Mononuclear ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++++ +++
Vasos neoformados ++ ++ + + ++ ++ + ++
Granulação 0 0 0 0 0 0 0 0
Fibrose 0 0 0 0 0 0 0 0
Grupo Politetrafluoretileno expandido
DPO 5 DPO 5 DPO 5 DPO 5 DPO 10 DPO 10 DPO 10 DPO 10 DPO
Edema ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Hemorragia 0 + 0 0 0 0 0 0
Necrose 0 0 0 0 0 0 0 0
Polimorfonuclear ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
Mononuclear ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++ ++ +++
Vasos neoformados 0 0 0 0 0 + 0 +
Granulação 0 0 0 0 0 0 0 0
Fibrose 0 0 0 0 0 0 0 0
NOTA:
DPO (Dia de pós-operatório)
Leve(+)
Moderada(++)
Marcante(+++)
Intensa(++++)
77
Avaliação morfológica da resposta inflamatória no 20º e 30º dias de pós-
operatório
Grupo Polipropileno
DPO 20 DPO 20 DPO 20 DPO 20 DPO 30 DPO 30 DPO 30 DPO 30 DPO
Edema ++ + ++ ++ 0 0 0 0
Hemorragia 0 0 0 0 0 0 0 0
Necrose 0 0 0 0 0 0 0 0
Polimorfonuclear + + + + + + + ++
Mononuclear +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
Vasos neoformados + ++ + + + + ++ +
Granulação 0 0 0 0 0 0 0 0
Fibrose 0 0 0 0 ++ +++ +++ +++
Grupo Politetrafluoretileno expandido
DPO 20 DPO 20 DPO 20 DPO 20 DPO 30 DPO 30 DPO 30 DPO 30 DPO
Edema 0 0 0 0 0 0 0 0
Hemorragia 0 0 0 0 0 0 0 0
Necrose 0 0 0 0 0 0 0 0
Polimorfonuclear + ++ + + 0 0 0 0
Mononuclear ++ ++ ++ + + + + +
Vasos neoformados + + 0 0 0 0 0 0
Granulação 0 0 0 0 + 0 0 0
Fibrose 0 0 0 0 0 0 + +
NOTA:
DPO (Dia de pós-operatório)
Leve(+)
Moderada(++)
Marcante(+++)
Intensa(++++)
78
Análise imunohistoquímica
SOD1 iNOS COX-2
TNF-α
IL-8
5 DPO
+++ ++++ ++++ ++++ ++++
10 DPO
++ ++++ ++++ +++ ++++
20 DPO
+ + ++++ +++ ++++
Grupo Poli-
propileno
30 DPO
+ ++ ++ +++ ++++
5 DPO
+ + ++++ +++ ++++
10 DPO
+ + +++ +++ ++++
20 DPO
++ + +++ + ++++
Grupo
Politretra-
fluoretileno
expandido
30 PDO
+ + ++++ + +++
NOTA:
DPO (Dia de pós-operatório)
Leve(+)
Moderada(++)
Marcante(+++)
Intensa(++++)
79
Livros Grátis
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