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Inibidor da atividade tireoperoxidase
encontrado em bócios humanos:
caracterização parcial
Flávia Martins Nobrega
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título
de Mestre em Ciências (Fisiologia).
Orientadores:
Profª Doris Rosenthal
Profª. Denise Pires de Carvalho
Rio de Janeiro
Fevereiro/2006
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Nobrega, Flávia Martins
Inibidor da atividade tireoperoxidase encontrado em bócios
humanos: caracterização parcial / Flávia Martins Nobrega. Rio de
Janeiro:UFRJ, IBCCF, 2006.
x, 61f. il.
Orientadora: Doris Rosenthal.
Co-orientadora: Denise Pires de Carvalho
Dissertação de Mestrado – UFRJ / IBCCF/ Ciências Biológicas –
Fisiologia, 2006.
Referências: f.51-61.
1. Inibidor. 2. Tireoperoxidase. 3. Bócios. 4. Tireóide. 5. Tireoglobulina. I.
Rosenthal, Doris. II Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências
Biológicas – Fisiologia. III. Título.
FICHA CATALOGRÁFICA
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A Deus por permitir que tudo isso fosse possível.
A minha orientadora Dra. Doris Rosenthal por ter me recebido em “sua
Este trabalho é dedicado a minha mãe, que
guerreira e lutadora sempre me fez sonhar e
acreditar que é possível. Aqui está a
recompensa. Muito obrigada por tudo!
AGRADECIMENTOS
casa”, abrindo-me as portas da UFRJ. Sua dedicação ao saber é estímulo
fundamental a qualquer trabalho, além de um exemplo a ser seguido. Muito
obrigado por ter aceitado esse desafio.
A Denise Pires de Carvalho que com seu extremo profissionalismo está
sempre nos incentivando. Sua alegria e otimismo fazem falta por aqui.
A amiga Renata Grozovsky por ser cúmplice e companheira. Obrigado
pelas inúmeras vezes em que o cair da noite no laboratório não foi o limite.
Você sempre esteve presente, até nas horas mais difíceis e, portanto também
faz parte deste trabalho.
As amigas Alba, Michelle Marassi, Sabrina, Renata Araújo e Valmara por
todo carinho e pelo tempo que passamos juntas.
A professora Tânia Ortiga pela contribuição e revisão deste trabalho.
Aos amigos e colegas do LFE Advaldo, Álvaro, Andréa Ferreira, Andréia,
Camilla Antonieta, Daniele, Elaine, Glória, Lívia, Luciene, Michelle Bento,
Mônica, Nathércia, Norma, Rodrigo, Tamar, Thiago, Vânia e Wagner pelo
companheirismo e pelo tempo compartilhado, sempre muito divertido.
Ao Maurício por todo carinho e cumplicidade. Obrigado por me incentivar
sempre. Eu adoro você!
Enfim, agradeço a toda minha família pai, irmãos, avós, tios, primos,
sobrinhos... Eu sei que vocês torcem muito por mim.
INIBIDOR DA ATIVIDADE TIREOPEROXIDASE ENCONTRADO EM
BÓCIOS HUMANOS: CARACTERIZAÇÃO PARCIAL
Flávia Martins Nóbrega
Orientadora: Doris Rosenthal
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação
em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho,
RESUMO
Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Fisiologia).
Vários tipos de doenças tireóideas apresentam deficiência na
organificação do iodo, devido à diminuição ou ausência na atividade da
tireoperoxidase (TPO). Há relatos da presença de uma substância inibitória da
atividade da TPO em alguns bócios. O presente trabalho teve como objetivo a
identificação do inibidor da atividade TPO em diferentes doenças tireóideas e a
caracterização bioquímica dessa molécula. Amostras de Bócios Multinodulares
Atóxicos (BMNA), Adenomas (AD) e Bócio Difuso Tóxico (BDT) foram
homogeneizadas e centrifugadas (105.000g). A fração Tg foi obtida por
solubilização (tampão fosfato 50mM, pH 7,4) após “salting-out” (50% sulfato
de amônio 4M) e usada para testes de inibição da atividade TPO de oxidação
do iodeto. A atividade inibitória foi expressa como mg de fração Tg capaz de
inibir 50% da atividade inicial (IC
50
). O inibidor foi encontrado em todos os
bócios avaliados, porém esteve ausente em, pelo menos, uma das áreas em 4
dos 6 BMNA, em um dos 3 AD e no BDT. Além de inibir a oxidação do iodeto, o
inibidor diminuiu significativamente a concentração de H
2
O
2
do meio. A
incubação da fração Tg com espermina 1mM (co-fator de fosfatase alcalina)
reverteu o efeito inibitório, quando este esteve presente. Concluímos que o
inibidor pode ser encontrado em diversos tipos de bócio e tem distribuição
heterogênea entre as diferentes áreas do mesmo bócio. Sugerimos que um
grupamento fosfato seja essencial à ação inibitória da TPO e que a mesma
possa ser devida a um mecanismo indireto, a redução do H
2
O
2
, co-fator
enzimático da TPO.
Palavras-chave: Inibidor, Tireoperoxidase, Bócios, Tireóide, Tireoglobulina.
Rio de Janeiro
Fevereiro, 2006.
IDENTIFICATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF
THYROPEROXIDASE ACTIVITY INHIBITOR FOUND IN HUMAN GOITERS
Flávia Martins Nobrega
Orientadora: Doris Rosenthal
Abstract da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas
(Fisiologia).
ABSTRACT
RESUMO
Deficient iodine organification is usual in many types of thyroid diseases,
due to absence or impaired activity of thyroperoxidase (TPO). The presence of
an inhibitory substance(s) in some goiters has been reported by several
groups. This work aims to evaluate the presence of a TPO activity inhibitor in
different thyroid diseases and to characterize its biochemical structure. Atoxic
multinodular goiters, adenomas, and toxic diffuse goiter samples were
homogenized and centrifuged (105.000 x g). The Tg fraction was obtained by
solubilization (phosphate buffer 50mM, pH7.4) after salting out (50%
ammonium sulfate 4M) and used to test the ability to inhibitory of TPO activity.
The inhibitory activity was expressed as Tg fraction (mg) able to inhibit 50% of
initial activity (IC
50
). The inhibitor was found in all goiters evaluated, but was
absent, at least, in one area at four out of six BMNA, one out of three AD, and
in BDT. The inhibitor not only decreased “in vitro” iodide oxidation, but also
decreased H
2
O
2
(the TPO cofactor) significantly. The Tg fraction incubation with
spermine 1mM (alkaline phosphatase cofactor) reversed the inhibitory effect.
Our data reveal that the inhibitor can be found in several types of goiters and
its distribuition is heterogeneous in a given thyroid gland. We suggest that a
phosphate group may be essential for the TPO inhibitory action and that this
may happen due to an indirect mechanism, the reduction of H
2
O
2
.
Key words: Inhibitor, Thyroperoxidase, Goiters, Thyroid, Thyroglobulin.
Rio de Janeiro
Fevereiro, 2006.
AD adenomas foliculares
AMPc monofosfato de adenosina cíclico
ASGPR receptor para asialoproteína
ATP adenosina trifosfato
BDT bócio difuso tóxico
BMNA bócio multinodular atóxico
DIT diiodotirosina
EGF fator de crescimento da epiderme
FAD flavina adenina nucleotídeo
FGF fator de crescimento de fibroblastos
FSH hormônio folículo-estimulante
GMPc guanosina monofosfato cíclico
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
ABSTRACT
GH hormônio do crescimento
HRP peroxidase de raiz forte
IGF fator de crescimento insulina-símile
IP
3
inositol trifosfato
IPG inositolfosfoglicano
LH hormônio luteinizante
MCT transportador monocarboxilato
MIT monoiodotirosina
MMI metilmazole
NADPH nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato
NCTP co-transportadores taurocolatos de Na
+
NIS co-transportador sódio/iodeto
OATP transportador de ânion orgânico
Pax 8 fator de transcrição de domínio pareado
PKA proteína cinase A
PKC proteína cinase C
PTU 6n-propil-tiouracil
rT
3
3,3’,5’ triiodotironina (T
3
reverso)
T
3
3,5,3’ triiodotironina
T
4
3,5,3’,5’, tetraiodotironina ou tiroxina
TBG globulina ligadora de hormônio tireóideo
Tg tireoglobulina
ThOX oxidase tireóidea
TPO tireoperoxidase
TRH hormônio liberador de tireotrofina
TSAb anticorpo estimulador tireóideo
TSH hormônio estimulador da tireóide ou tireotrofina
TSHR receptor para TSH
TTF fator de transcrição tireóideo
TTR transtiretina
Tyr tirosina
VEGF fator de crescimento endotelial vascular
VPF fator de permeabilidade vascular
ABREVIATURAS
ILUSTRAÇÕES
ABREVIATURAS
Pág.
Figura 1 Aspecto anatômico da glândula tireóide (visão
anterior)................................................................ 1
Figura 2 Representação esquemática de um folículo tireóideo ... 2
Figura 3 Representação esquemática do transporte de iodeto na
célula folicular ....................................................... 5
Figura 4 Representação esquemática da biossíntese dos
hormônios tireóideos na membrana apical da célula
folicular................................................................. 11
Figura 5 Endocitose de tireoglobulina iodada e liberação dos
hormônios tireóideos............................................... 13
Figura 6 Regulação da atividade do eixo hipotálamo-hipófise-
tireóide ................................................................. 17
Figura 7 Representação da regulação da função tireóidea pela
Tg folicular ............................................................ 20
Figura 8 Efeito inibitório da fração Tg .................................... 38
ILUSTRAÇÕES
Figura 9 Efeito inibitório das frações Tg e albumina ................. 39
Figura 10 Quantificação de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) .......... 40
Figura 11 Efeito inibitório das frações Tg na presença de
espermina ............................................................. 42
Tabela 1 Número de pacientes e áreas com os respectivos
diagnósticos .......................................................... 30
Tabela 2 Valores de IC
50
provenientes de BMNA ...................... 36
Tabela 3 Valores de IC
50
provenientes de BDT ......................... 36
Tabela 4 Valores de IC
50
provenientes de AD .......................... 37
SUMÁRIO x
I. INTRODUÇÃO ........................................................................ 1
1. ASPECTOS ANATOMOFUNCIONAIS .................................... 1
2. BIOSSÍNTESE DOS HORMÔNIOS TIREÓIDEOS................... 3
2.1 Transporte de iodeto 4
2.2 Tireoglobulina 6
2.3 Tireoperoxidase 7
2.3.1 Atividade catalítica da TPO 8
2.4 Sistema gerador de peróxido de hidrogênio 9
2.5 Liberação e transporte dos hormônios tireóideos 11
2.5.1 Transcitose 14
3. REGULAÇÃO DA FUNÇÃO TIREÓIDEA................................. 15
3.1 Eixo hipotálamo-hipófise-tireóide 15
3.2 Autorregulação 18
3.2.1 Iodo 18
3.2.2 Tireoglobulina folicular 18
3.3 Outros reguladores 20
4. BOCIOGÊNESE................................................................... 20
4.1 Etiopatogenia dos bócios 22
4.1.1 Adenomas foliculares (AD) 22
4.1.2 Bócio Difuso Tóxico (BDT) 22
4.1.3 Bócio Multinodular Atóxico (BMNA) 23
5. INIBIDORES DA TIREOPEROXIDASE ................................. 24
SUMÁRIO
II. OBJETIVOS .......................................................................... 28
III. MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................... 29
1. TECIDOS TIREÓIDEOS ...................................................... 29
2. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS .................................... 30
2.1 Fração solúvel 30
2.1.2 Purificação parcial por “salting out” 31
2.2 Fração particulada contendo a TPO 31
3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TIREOPEROXIDASE ............... 32
3.1 Oxidação do iodeto 32
3.2 Avaliação da potencial inibitório das frações Tg sobre
atividade tireoperoxidase
32
4. QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA .............................................. 33
5. QUANTIFICAÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
).. 33
6. EFEITO DA ESPERMINA SOBRE ATIVIDADE INIBITÓRIA ... 33
7. ANÁLISE ESTATÍSTICA...................................................... 34
IV. RESULTADOS ....................................................................... 35
1.EFEITO INIBITÓRIO DA FRAÇÃO Tg ................................... 35
2. QUANTIFICAÇÃO DE H
2
O
2
NA PRESENÇA DE INIBIDOR ..... 40
3. EFEITO DA ESPERMINA SOBRE A ATIVIDADE INIBITÓRIA 41
V. DISCUSSÃO .......................................................................... 43
VI. CONCLUSÕES ...................................................................... 50
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................ 51
I. INTRODUÇÃO
1. ASPECTOS ANATOMOFUNCIONAIS
A glândula tireóide tem papel primordial na manutenção da homeostase
corporal através da ação dos hormônios tireóideos, por ela produzidos (Lisi e
cols., 2003). A tireóide desenvolve-se a partir do endoderma e migra da boca
primitiva para a porção anterior do pescoço. Em seres humanos adultos
normais, a glândula pesa em torno de 15-20g, e é composta por dois lobos,
unidos pelo istmo, situando-se logo abaixo da cartilagem cricóide, ao nível do
segundo e do terceiro anel traqueal (Figura 1). Sendo o lobo direito
normalmente maior do que o esquerdo (Utiger, 2001).
Figura 1- Aspecto anatômico da glândula tireóide (visão anterior)
(www.geocities.com.br).
Histologicamente, a tireóide é composta de folículos que constituem 70%
do tecido tireóideo. O restante é constituído por, aproximadamente, 20% de
células endoteliais dos capilares e 10% de fibroblastos. Há ainda, a presença
de células parafoliculares ou células C, as quais são responsáveis pela
produção e secreção do hormônio calcitonina, caracterizadas pela presença de
grânulos eletrodensos no citoplasma (Larsen e cols., 1998).
Os folículos são considerados unidades morfofuncionais da tireóide. São
INTRODUÇÃO
compostos de uma camada simples de células epiteliais, as células foliculares
ou tireócitos que rodeiam o lúmen folicular, preenchido por um colóide protéico
(Figura 2). Variações na altura do epitélio folicular podem ocorrer, dependendo
do nível de estimulação recebida pela glândula. Quando estimulado, o epitélio
é colunar e é achatado quando não ativado (Larsen e cols., 1998). Cerca de
80% do colóide é constituído por tireoglobulina (Tg), o principal produto de
secreção das células epiteliais tireóideas e substrato essencial para síntese dos
hormônios tireóideos.
A membrana basolateral permite o contato dos folículos com os capilares
sanguíneos, já o contato com o lúmen folicular, é estabelecido pela membrana
apical que apresenta numerosas microvilosidades (Figura 2), aumentando a
área de interface entre as células e o colóide (Larsen e cols., 1998; Lisi e cols.,
2003).
A estrutura folicular permite que o tireócito funcione como uma célula
exócrina, já que secreta Tg para o lúmen folicular, uma célula absortiva, assim
como as células do epitélio intestinal, já que absorve a Tg folicular, e uma
célula endócrina que secreta os hormônios tireóideos na corrente sanguínea
(Suzuki e cols., 2000).
Colóide
Membrana
Basolateral
Membrana
Apical
Colóide
Membrana
Basolateral
Membrana
Apical
Colóide
Membrana
Basolateral
Membrana
Figura 2 – Representação
esquemática de um folículo
tireóideo.
A função de cada folículo não é sincronizada ao seu adjacente: folículos
quiescentes co-existem perto de folículos altamente funcionais.
Conseqüentemente, variações morfológicas entre os folículos são notadas em
decorrência do seu estado funcional (Suzuki e cols., 2000). A glândula tireóide
humana, como a de muitos outros mamíferos, é caracterizada por grande
heterogeneidade funcional e morfológica (Gérard e cols., 2002). A
heterogeneidade folicular existe mesmo sendo cada folículo exposto à mesma
concentração de TSH, sugerindo que pode ser causada por regulador(es) ainda
não identificado(s), não dependente(s) de TSH (Suzuki e cols., 2000).
2. BIOSSÍNTESE DOS HORMÔNIOS TIREÓIDEOS
A glândula tireóide é o local da síntese, armazenamento e secreção dos
hormônios tireóideos: 3,3’,5,5’-tetraiododotironina (tiroxina ou T
4
), de 3,3’,5-
triiodotironina (T
3
) e, em menor quantidade 3,3’,5’-triiodotironina reversa
(rT
3
). Os hormônios tireóideos, T
3
e T
4
, são críticos para a diferenciação, o
crescimento e o metabolismo celular em mamíferos, desempenhando
importante função no crescimento e desenvolvimento normais (Yen, 2001).
Estimulam o metabolismo basal, aumentando o consumo de oxigênio e, assim,
têm papel importante na manutenção da temperatura e da homeostase
corporal (Yen, 2001; Lisi e cols., 2003).
A síntese dos hormônios tireóideos requer a ação de um maquinário
complexo (Gérard e cols., 2003) portanto um estudo mais detalhado de seus
componentes torna-se necessário.
2.1 TRANSPORTE DE IODETO
O iodo é o elemento essencial à biossíntese dos hormônios da tireóide. O
iodeto proveniente da dieta é absorvido no trato gastrintestinal, sendo captado
pela tireóide, a partir da corrente sanguínea, por um transportador específico
existente na membrana basolateral dos tireócitos (Figura 3), o co-
transportador sódio-iodeto (NIS, Na
+
/I
-
symporter) (Kaminsky e cols., 1993). O
NIS também tem sido identificado em outras células que concentram iodeto
como as glândulas salivares e mamárias, mucosa gástrica e, ainda,
citotrofoblasto e sinciciotrofoblasto (Bidart e cols., 2000; De La Vieja e cols.,
2000).
A captação do iodeto pelas células foliculares ocorre por um mecanismo
de transporte ativo secundário, contra o potencial intracelular eletronegativo
do I
-
, mas a favor do gradiente eletroquímico gerado pelo Na
+
(Kaminsky e
cols., 1993). O transporte de dois Na
+
resulta na entrada de um I
-
. Portanto, a
atividade do NIS está intimamente relacionada à bomba Na
+
/K
+
ATPase na
membrana basolateral dos tireócitos (Eskandari e cols., 1997). Este transporte
é regulado positivamente pelo TSH (tireotrofina – hormônio estimulador da
tireóide) (Raspé & Dumont, 1995), como discutiremos adiante. Além disso, o
excesso de iodo é capaz de inibi-lo, enquanto a deficiência de iodo estimula a
captação de I
-
pelas células foliculares tireóideas. Tais mecanismos
estimulatório e inibitório ainda não estão bem elucidados, entretanto sabe-se
que ocorrem de forma independente do TSH (Utiger, 2001).
Mutações no gene NIS são associadas ao desenvolvimento de
hipotireoidismo congênito e a formação de bócio por deficiência em concentrar
iodo. Vários casos de adenomas e carcinomas tireóideos têm sido
documentados nos quais há diminuição da expressão gênica e protéica do NIS
(Filleti e cols., 1999; Spitzweg e cols., 2000).
A biossíntese hormonal é dependente da disponibilidade de iodo na
região apical da célula folicular. O iodo chega a essa região através da
pendrina, um transportador apical Cl
-
/I
-
(Figura 3). A pendrina é um produto
do gene PDS, com massa molecular de, aproximadamente, 86kDa; incluída na
grande família de transportadores aniônicos que contém 11 ou 12 domínios
transmembrana (Scott e cols., 1999; Royaux e cols., 2000). Na tireóide, está
expressa na membrana apical e também pode ser encontrada no rim e no
ouvido. Como descrito por Everett e cols. (1997), pacientes com Síndrome de
Pendred (síndrome autossômica recessiva do gene PDS), possuem mutações
na pendrina que levam a má formação coclear, e conseqüentemente, a surdez.
Entretanto, nem todos os indivíduos têm bócio, sugerindo a existência de
outros transportadores envolvidos no aporte de iodo à região apical do folículo
(Scott e cols., 1999).
Fato incomum para marcadores tireóideos, a expressão da pendrina não
é regulada pelo TSH e parece ser regulada diretamente pelo conteúdo de Tg no
folículo (Royaux e cols., 2000). Destaca-se sua relevância na síntese dos
hormônios tireóideos, já que o sítio catalítico da tireoperoxidase (enzima-chave
envolvida no processo), encontra-se na região extracelular da membrana
apical, voltado para o colóide (Vaisman e cols., 2004).
Figura 3- Representação esquemática do transporte de iodeto na célula folicular.
2.2 TIREOGLOBULINA (Tg)
A Tireoglobulina (Tg) é a proteína mais abundante da tireóide, sendo o
principal produto de secreção das células epiteliais foliculares. O RNAm da Tg
tem 8-8,5kb e codifica uma subunidade precursora com 330kDa e coeficiente
de sedimentação 12S. A partir destes monômeros, tem-se a formação da Tg
dimérica, como uma glicoproteína de 660kDa e coeficiente de sedimentação de
19S, que serve de suporte para a biossíntese dos hormônios tireóideos (Larsen
e cols., 1998). Esta macromolécula dimérica glicosilada corresponde a 85% do
total da Tg em glândulas normais. Um componente mais pesado, a Tg 27S,
com peso molecular de 1200kDa, representa a forma tetramérica, formada a
partir da Tg 19S, e corresponde a 5-15% da Tg madura em muitas espécies
(Carvalho e cols., 1987). Logo após a tradução, ainda no retículo
I
-
I
-
Na
+
Na
+
K
+
ATPase
Na
+
Colóide
NIS
I
-
Membrana basal
I
-
Na
+
Na
+
K
+
ATPase
Na
+
Colóide
NIS
P
I
-
Cl
-
endoplasmático, resíduos glicídicos são adicionados à proteína, sendo
posteriormente incorporada a vesículas endocíticas, no complexo de Golgi, que
migram para o lúmen folicular, sítio de estocagem da Tg. A Tg madura,
presente no complexo de Golgi, contém 10% de carboidratos e o grau de
glicosilação está associado à funcionalidade da proteína (Medeiros-Neto e cols.,
1996).
Há relatos sobre a ligação da Tg a uma proteína ligadora na membrana
apical, similar ao receptor de asialoproteína (ASGPR) descrito no fígado. Essa
ligação favoreceria o transporte vetorial da Tg recém-sintetizada para o lúmen
folicular. Porém, as características deste processo, bem como seu papel
funcional, ainda não estão bem elucidados (Consiglio e cols., 1979). Tem sido
demonstrado que o conteúdo de Tg no lúmen folicular, age como regulador da
função tireóidea (Ulianich e cols., 1999 e Kohn e cols., 2001).
O iodo é incorporado em regiões específicas da Tg – resíduos tirosil
hormonogênicos (Di Lauro e cols., 1985; Larsen e cols., 1998; Taurog, 2000).
Apesar do seu grande tamanho, a molécula de Tg possui apenas em torno de
134 resíduos tirosil, dos quais somente 4 a 8 resíduos são capazes de originar
moléculas de hormônios (Medeiros-Neto e cols., 1993).
Mutações genéticas que resultam em uma molécula protéica
estruturalmente defeituosa, prejudicam a capacidade funcional da Tg de servir
como matriz para a síntese hormonal. Anormalidades no RNAm, na síntese, no
transporte celular ou na glicosilação da Tg podem produzir bócio congênito e
vários graus de hipofunção tireóidea (Medeiros-Neto e cols., 1993).
2.3 TIREOPEROXIDASE (TPO)
A TPO é a principal enzima envolvida na iodação da Tg e no acoplamento
de resíduos iodo-tirosil durante a síntese dos hormônios tireóideos. É uma
hemoproteína glicosilada, com 933 aminoácidos e peso molecular de 103kDa,
sendo 10% desse peso equivalente aos resíduos glicídicos presentes em sua
estrutura. Encontra-se ancorada à membrana plasmática apical da célula
tireóidea, com seu domínio catalítico voltado para o colóide (Pohl e cols., 1993;
Taurog, 2000). Possui alta homologia com outras peroxidases como a
mieloperoxidase e a lactoperoxidase (Kimura e cols., 1989).
A conformação da TPO e a presença do grupamento heme em sua
estrutura são igualmente importantes para a função enzimática. Le Fourn e
cols., (2004), demonstraram que a glicosilação pós-traducional é pré-requisito
para a completa maturação e endereçamento da enzima à membrana apical,
assim como ocorre com a Tg.
O gene da TPO humana localiza-se no braço curto do cromossomo 2 e a
seqüência completa possui 3048 nucleotídeos. As células tireóideas contêm
outros RNAm da TPO de tamanhos variados, mas sua importância fisiológica e
fisiopatológica é ainda desconhecida, sendo provável que a maioria não possua
função enzimática (McLachlan & Rapoport, 1992). A expressão do gene da TPO
é restrita ao tecido tireóideo (Francis-Lang e cols., 1992) e controlada
positivamente pelo TSH, através de um sistema dependente de 3’, 5’-
adenosina monofosfato cíclico (AMPc)/proteína cinase A (Zarrilli e cols., 1990).
Além do TSH, outros fatores, tais como a insulina e fatores de crescimento
dependentes de insulina, também regulam os níveis de RNAm para TPO
(Isozaki e cols., 1989).
A ausência ou função anormal da TPO é reconhecida como causa de
disfunção tireóidea, bócio e hipotireoidismo (Fayadat e cols., 1999). Embora
carcinomas tireóideos diferenciados expressem RNAm TPO (Elisei e cols.,
1994), Gérard e cols. (2002) demonstraram que a expressão protéica da
enzima não é mantida em carcinomas papilíferos. Entretanto, em carcinomas
foliculares nos quais a expressão protéica era normal, a TPO estava distribuída
pelo citoplasma, diferindo da localização apical encontrada em doenças
benignas tireóideas. Porém nada foi relatado sobre atividade tireoperoxidase
citoplasmática.
2.3.1 ATIVIDADE CATALÍTICA DA TPO
A TPO desempenha uma importante função na biossíntese dos hormônios
tireóideos, catalisando a oxidação do iodeto, a iodação dos resíduos tirosil e o
acoplamento das iodotirosinas para gerar as iodotironinas (Figura 4)
(McLachlan & Rapopport, 1992). O mecanismo de iodação da Tg tem sido
estudado por vários autores e ocorre na interface celular do colóide com a
membrana apical, em acordo com a localização da TPO nesta membrana
(Taurog, 2000). Para sua ação, a TPO requer, como co-fator, o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
), um aceptor de elétrons essencial para as reações de
iodação e acoplamento catalisadas pela enzima (Taurog, 2000). Nunez &
Pommier (1982), postularam a existência de dois sítios catalíticos na TPO
oxidada, um favorecendo o I
-
e outro, a tirosila. O I
-
e Tyr sofrem oxidação
monoeletrônica, com formação dos radicais livres I
•
e Tyr
•
. Estes radicais se
unem, enquanto ligados à enzima, formando um complexo ternário, originando
a monoiodotirosina (MIT). Esta pode sofrer nova oxidação monoeletrônica e
reagir com I
•
, formando a diiodotirosina (DIT) (Taurog, 2000). A TPO catalisa
também o acoplamento entre duas iodotirosinas (Figura 4). Caso ocorra o
acoplamento de dois DITs haverá a formação da 3,5,3’,5’- tetraiodotironina,
T
4
, ou tiroxina; quando há o acoplamento de um MIT com um DIT, ocorre a
formação da 3,5,3’-triiodotironina (T
3
) ou 3,3’,5’-triiodotironina reversa, ou rT
3
(Larsen e cols., 1998).
Apesar dos diferentes métodos para quantificação da atividade
tireoperoxidase (geração de triiodeto, oxidação do guaiacol e iodação da
albumina), há concordância de que a atividade está geralmente aumentada em
adenoma tóxico e bócio difuso tóxico ou doença de Graves (Fragu e cols.,
1977; Moura e cols., 1989), enquanto esta é diminuída em tireoidite crônica
(doença de Hashimoto) (Mizukami & Matsubara, 1981). Resultados variados
têm sido encontrados em bócio multinodular atóxico, justificados pela
heterogeneidade morfológica, funcional e bioquímica características destes
bócios, como veremos adiante (Mazini-Repiso e cols., 1994).
2.4 SISTEMA GERADOR DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
)
A organificação do iodo tireóideo é dependente da tireoperoxidase,
sendo a geração de H
2
O
2
tireóidea um passo limitante na biossíntese hormonal
(Laurent e cols., 1991; Carvalho e cols., 1996). Entretanto, apesar da
relevância do H
2
O
2
na biossíntese dos hormônios tireóideos, a NADPH-oxidase
tireóidea foi apenas recentemente caracterizada em glândulas humanas
(Cardoso e cols., 2000; De Deken e cols., 2000).
A geração de H
2
O
2
não se restringe a fagócitos ou ao tecido tireóideo,
onde desempenha papel citotóxico e co-fator da biossíntese hormonal,
respectivamente, mas também pode ser observada em outros tecidos: cólon,
rins, baço, pulmão e linfonodo (Lambeth, 2002).
Existem vários sistemas enzimáticos geradores de H
2
O
2
como:
monoamina oxidase, xantina oxidase, NADH-citicromo b
5
redutase, NADPH-
citocromo c redutase, e superóxido desmutase. Inicialmente sugeriu-se que a
geração tireóidea de H
2
O
2
seria similar à encontrada nas células fagocitárias.
No leucócito polimorfonuclear, o H
2
O
2
é obtido pela ação da superóxido
desmutase, com formação de O
2
-
(Nakamura e cols., 1991). Entretanto, Dupuy
e cols. (1992) demonstraram que a geração tireóidea de H
2
O
2
ocorre de forma
direta, sem a formação deste intermediário.
O sistema gerador de H
2
O
2
tireóideo
localiza-se na superfície apical do
tireócito (Figura 4), utiliza NAPH como substrato (NADPH-oxidase) e é
dependente de cálcio (Nakamura e cols., 1991; Dupuy e cols., 1992; Dème e
cols., 2001).
Foram clonados dois cDNAs da NADPH-oxidase tireóidea humana, os
quais codificam duas proteínas com 177kDa, denominadas ThOX 1 e ThOX 2
(De Deken e cols., 2000). A enzima é formada por seis domínios
transmembrana e, em seu terminal NH
2
, há um domínio ectoperoxidase
transmembrana, voltado para o meio extracelular. A função deste domínio
ainda não foi estabelecida, mas acredita-se que ele possa evitar os efeitos
deletérios do excesso de H
2
O
2
na célula (Lambeth, 2002).
O terminal COOH da proteína, voltado para o citosol, contém o domínio
flavoprotéico da enzima, que é o sítio de ligação do NADPH e, adjacente a este
domínio está o sítio de ligação do cálcio. Uma vez ligado, o NADPH reduz o FAD
que por sua vez, transfere elétrons, via mecanismo desconhecido, para uma
molécula de O
2
, levando a formação direta de H
2
O
2
(Dupuy e cols., 1992).
Desta maneira, assim como a TPO e a Tg, o sistema gerador de H
2
O
2
(NADPH-
oxidase tireóidea) passou a ser considerado mais um marcador de
diferenciação celular tireóideo, já que sua síntese é estimulada por TSH (Raspé
& Dumont, 1995; Carvalho e cols., 1996). Assim como observado em outras
proteínas tireóideas, eventos de gilocosilação da NADPH-oxidase parecem estar
envolvidos com maturação e endereçamento para membrana apical. Cinco
sítios de N-glicosilação foram identificados em proteínas humanas (Morand e
cols., 2003).
Há uma grande variabilidade na expressão dos genes ThOX 1 e ThOX 2.
Com relação a expressão protéica, em bócio multinodular e adenoma de
células de Hurtle, a expressão é similar à encontrada em tecidos normais. A
expressão é diminuída em tecidos hiperfuncionantes e aumentada em tecidos
hipofuncionantes (Caillou e cols., 2001). Nota-se intensa variabilidade também
em carcinomas papilíferos e foliculares (Lacroix e cols., 2001). Apenas
recentemente foi padronizado o método para quantificação da atividade da
NADPH-oxidase tireóidea humana (Cardoso e cols., 2000).
Figura 4 – Representação esquemática da biossíntese dos hormônios tireóideos na
membrana apical da célula folicular.
2.5 LIBERAÇÃO E TRANSPORTE DOS HORMÔNIOS TIREÓIDEOS
A secreção dos hormônios tireóideos requer a endocitose de Tg iodada
(contendo MIT, DIT, T
3
e T
4
) pela membrana apical da célula folicular. A Tg é
recaptada da membrana apical, por endocitose/pinocitose, formando vesículas
endocíticas (Figura 5). Estas vesículas são incorporadas a fagolisossomas e a
Tg sofre clivagem proteolítica, liberando MIT, DIT, T
3
e T
4
(Dumonst & Vassart,
1995; Larsen e cols., 1998; Yen, 2001).
Colóide
Colóide
Citoplasma
Citoplasma
TPO
TPO
NADPH
NADPH
-
-
OXIDASE
OXIDASE
iodeto
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
DIT
DIT
MIT
MIT
Tg
Tg
Membrana
apical
H
H
2
2
O
O
2
2
I
I
-
-
O
O
2
2
NADPH
NADPH
NADP
NADP
+
+
Tg
Tg
tireoglobulina
T
T
3
3
T
T
4
4
Colóide
Colóide
Citoplasma
Citoplasma
TPO
TPO
NADPH
NADPH
-
-
OXIDASE
OXIDASE
iodeto
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
Tir
DIT
DIT
MIT
MIT
Tg
Tg
Membrana
apical
H
H
2
2
O
O
2
2
I
I
-
-
O
O
2
2
NADPH
NADPH
NADP
NADP
+
+
Tg
Tg
tireoglobulina
T
T
3
3
T
T
4
4
Há relatos de que proteínas, como o receptor para asialoproteína
(ASGPR) e gp330/megalina, possam ligar-se a Tg, interferindo no processo
endocítico. Essas têm em comum o fato de se ligarem a glicoproteínas (Suzuki
e cols., 2000). Sugere-se que além de estar envolvido com o transporte
vetorial da Tg para o lúmen folicular, (Consiglio e cols., 1979; Berndorfer e
cols., 1996), o receptor para asialoproteína (ASGPR), estaria envolvido num
processo de pinocitose seletiva: ao ligar-se à Tg com baixo conteúdo
hormonal, na membrana apical, favoreceria a endocitose de moléculas de Tg
rica em hormônios (Van den Hove e cols., 1982; Ulianich e cols., 1999; Suzuki
e cols., 2000). A megalina estaria envolvida num processo conhecido como
transcitose (Marino & McCluskey, 2000), abordado a seguir.
MIT e DIT oriundos da proteólise são rapidamente desiodados, por uma
iodotirosina-desalogenase específica (DEHAL1) (Figura 5). Essa desiodação
enzimática leva a formação de I
-
e Tyr que poderão ser reutilizados pela célula
folicular (Gnidehou e cols., 2004).
Após a clivagem proteolítica, as moléculas de T
3
e T
4
são liberadas na
corrente sanguínea (Figura 5). A quantidade de T
4
secretada é maior do que a
de T
3
, numa proporção de aproximadamente 14 moléculas de T
4
para 1 de T
3
,
no homem (Larsen e cols., 1998). Essa quantidade pode ainda variar
decorrente da desiodação intratireóida de T
4
a T
3
pelas enzimas iodotironina-
desiodases. Cerca de 80% do T
3
sérico total é oriundo da desiodação do T
4
a
T
3
, nos tecidos periféricos (Bianco e cols., 2002).
Embora as moléculas de T
3
e T
4
sejam lipofílicas, logo capazes de
atravessar a membrana por difusão passiva, existem evidências de
mecanismos de transporte para hormônios tireóideos. Este sistema de
transporte para T
3
e T
4
é saturável e dependente de ATP, mas não há
competição pelo mesmo sítio de ligação. Parecem estar envolvidos neste
transporte polipepitídeos co-transportadores de taurocolato e Na
+
(NTCP) e
membros da família de transportadores de ânion orgânico (OATP), que são
capazes de transportar hormônios tireóideos para dentro do hepatócito
(Friesema e cols., 1999).
Recentemente, foi clonado um transportador para aminoácidos
aromáticos, o MCT8, que pertence à família dos transportadores
monocarboxilatos (MCT). O transportador monocarboxilato 8 (MCT8) tem alta
atividade e especificidade para os hormônios tireóideos, é muito expresso no
fígado e cérebro, mas também é encontrado em outros tecidos (Friesema e
cols., 2003).
Cerca de 0,03% do T
4
total sérico está livre, estando o restante ligado a
proteínas carreadoras como a globulina ligadora de hormônios tireóideos (TBG)
(aproximadamente 80%), transtiretina (TTR) (15%) e albumina (5%). Já o
conteúdo de T
3
sérico livre corresponde a 0,3% do T
3
total, estando,
aproximadamente, 38% ligado a TBG; 35%, à albumina; 27%, à transtiretina.
De fato, o T
4
se liga com mais afinidade às proteínas séricas do que o T
3
, e, por
isso, tem uma taxa de depuração metabólica menor e meia-vida sérica mais
longa do que a de T
3
. Em humanos, a meia-vida sérica do T
4
é de sete dias,
enquanto a do T
3
é de apenas 1 dia (Yen, 2001).
São os hormônios livres que interagem com as células-alvo, gerando
respostas biológicas. O T
3
é considerado o hormônio tireóideo metabolicamente
ativo por ter afinidade com o receptor nuclear de 10 a 15 vezes maior do que o
T
4
(Yen, 2001).
2.5.1 TRANSCITOSE
Caso a Tg iodada não sofra clivagem proteolítica, ela pode ser reciclada
no colóide ou ainda, ligar-se a megalina, sendo transportada pela célula por
transcitose. Esta é a principal rota pela qual a Tg chega à corrente sanguínea,
caso a estrutura folicular tenha sido mantida intacta (Marinó & McCluskey,
NIS
NIS
exocitose
síntese
I
-
glicose
aminoácidos
I
-
proteólise
endocitose
T3
T4
MIT
DIT
T4
T4
T3
MIT
DIT
3
3
T
T
4
4
e T
e T
T3
5’ desiodase
NIS
NIS
exocitose
síntese
I
-
glicose
aminoácidos
I
-
proteólise
endocitose
Membrana basal
Tg
Tg
T3T3
MIT
DIT
T4T4
MIT
DIT
T4T4
T4
T3
T4
T3
MIT
DIT
MIT
DIT
3
3
T
T
4
4
e T
e T
T3T3
5’ desiodase
desiodação
DEHAL1
NIS
NIS
exocitose
síntese
I
-
glicose
aminoácidos
I
-
proteólise
endocitose
T3T3
T4T4
MIT
DIT
T4T4
T4
T3
T4
T3
MIT
DIT
MIT
DIT
3
3
T
T
4
4
e T
e T
T3T3
5’ desiodase
NIS
NIS
exocitose
síntese
I
-
glicose
aminoácidos
I
-
proteólise
endocitose
Membrana basal
Tg
Tg
T3T3
MIT
DIT
T4T4
MIT
DIT
T4T4
T4
T3
T4
T3
MIT
DIT
MIT
DIT
3
3
T
T
4
4
e T
e T
T3T3
5’ desiodase
T3T3
5’ desiodase
desiodação
DEHAL1
Figura 5- Endocitose
de tireoglobulina iodada
e liberação dos
hormônios tireóideos
2000).
Primeiramente identificada por Kerjaschki & Farquhar (1982), a megalina
é um receptor endocítico, composto de um domínio transmembrana, um
grande ectodomínio e uma pequena cauda citoplasmática, fazendo parte da
família de receptores para lipoproteínas com baixa densidade (Hjalm e cols.,
1996). No rim, está envolvida no transporte tubular de proteínas de baixo peso
molecular. Tem importante papel fisiológico no desenvolvimento do sistema
nervoso central, apesar de seu mecanismo de ação nesse sistema não estar
bem elucidado (Christensen & Birn, 2002). Na tireóide, a megalina é expressa
de forma TSH-dependente e encontrada na superfície apical dos tireócitos
(Marinó e cols., 2000).
Recentemente, Lisi e cols. (2003) demonstraram que a via da transcitose
serve para desviar moléculas de Tg com baixo conteúdo hormonal dos
lisossomos, favorecendo a degradação de moléculas de Tg rica em hormônios.
Usando anticorpo anti-megalina, demonstraram que quando se bloqueia a
megalina, inibindo a transcitose, a Tg com baixo conteúdo hormonal compete
com a Tg com alto conteúdo hormonal pela via lisossomal. Portanto, acreditam
que a via da transcitose, mediada pela megalina, é um processo seletivo para
descartar moléculas de Tg com baixo conteúdo hormonal e não apenas uma
rota para redução da liberação dos hormônios tireóideos, como sugerido por
Marinó & McCluskey (2000).
Quando há baixa disponibilidade de iodo, deficiência no transporte de
iodeto ou ainda, no acoplamento das iodotirosinas, prevalece a formação de
moléculas de Tg com baixo conteúdo hormonal. Assim, nessas condições, são
observadas altas concentrações de Tg sérica (Marinó & McCluskey, 2000).
3. REGULAÇÃO DA FUNÇÃO TIREÓIDEA
Os dois maiores reguladores fisiológicos da função tireóidea, de ação
direta nesta glândula, são o hormônio estimulador da tireóide (TSH ou
tireotrofina) e o iodeto. Entretanto, a tireóide também é influenciada por vários
outros hormônios ou fatores não-específicos, como o fator de crescimento
similar à insulina I e II, fator de crescimento epidérmico, norepinefrina, entre
outros (Utiger, 2001).
3.1 EIXO HIPOTÁLAMO-HIPÓFISE-TIREÓIDE
A constância na concentração circulante dos hormônios T
3
e T
4
é
resultante de um sistema regulatório dinâmico entre hipotálamo, hipófise e
tireóide (Figura 6) (Utiger, 2001). O tamanho e a função da glândula tireóide
são controlados por um mecanismo de retroalimentação negativa, no qual os
hormônios T
3
e T
4
inibem a secreção do TSH pelos tireotrofos hipofisários.
Quando a secreção dos hormônios tireóideos diminui, como nos defeitos do
metabolismo do iodo, deficiência de iodo ou após a administração de drogas
antitireóideas, há aumento na secreção de TSH e TRH, levando a ativação da
função e do crescimento tireóideo (Larsen e cols., 1998).
O hormônio liberador de tireotrofina (TRH), um tripeptídeo, sintetizado
por neurônios do núcleo paraventricular do hipotálamo, é liberado próximo ao
sistema porta hipotálamo-hipofisário, pelo qual chega à adenohipófise onde
estimula a secreção de TSH. O TRH liga-se a um receptor na membrana do
tireotrofo e, via fosfolipase C, aumenta os níveis de cálcio intracelular. Este,
juntamente com monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), agem como
mensageiros secundários para indução da transcrição gênica do TSH (Utiger,
2001). O TRH ainda modula a bioatividade do TSH, por aumentar a adição de
oligossacarídeos na molécula de TSH, uma vez que o grau de glicosilação do
TSH está diretamente relacionado a sua bioatividade. O TRH tem efeito
estimulador, enquanto a somatostatina, um tetradecapeptídeo, também
sintetizado e liberado pelo hipotálamo, inibe a liberação de TSH (Yamada &
Wilber, 1990) que pode ainda ser modulada por outros fatores periféricos ou
centrais, como: glicocorticóides, serotonina, hormônio do crescimento (GH),
noradrenalina, estrogênios e androgênios (Larsen e cols., 1998).
O TSH é um hormônio glicoprotéico, com peso molecular de
aproximadamente 28kDa, formado por duas cadeias, α e β, unidas por ligação
não-covalente. A subunidade α é comum ao hormônio luteinizante (LH), ao
folículo-estimulante (FSH) e a gonadotrofina coriônica. A subunidade β
corresponde à subunidade específica, responsável pela ligação do TSH ao seu
receptor na tireóide (Utiger, 2001). O TSH estimula todas as etapas da
biossíntese e secreção hormonal tireóidea, pela ativação de várias vias de
transdução de sinal. A atividade biológica é desencadeada pela ligação do TSH
ao seu receptor, ativando a proteína Gs que estimula a adenilato ciclase, com
conseqüente aumento da formação de AMPc. Este se liga à subunidade
regulatória da PKA, liberando a subunidade catalítica. Outros tipos de proteína
G podem ser ativados, o que leva à ativação da fosfolipase C, com formação
de IP
3
que aumenta cálcio intracelular, e diacilglicerol que ativa a PKC (Larsen
e cols., 1998).
Fisiologicamente, o TSH induz a expressão e ativação dos genes NIS, Tg,
TPO e NADPH-oxidase, além de aumentar o conteúdo de NADPH, utilizado na
geração de H
2
O
2
e estimula a endocitose de Tg. Logo, há aumento da secreção
de T
3
e T
4
(Larsen e cols., 1998). O TSH é dito responsável pela manutenção
das características da célula diferenciada,
por estimular a síntese dos
marcadores de diferenciação dos tireócitos como NIS, TPO, Tg e NADPH-
oxidase (Carvalho e cols., 1996). O gene PDS, que codifica a pendrina, não
está sob regulação do TSH e parece ser modulado pelo conteúdo de Tg
folicular (Kohn e cols., 2001).
Cronicamente, o TSH induz hiperplasia e hipertrofia da glândula tireóide,
levando à formação de bócio, o que mostra sua capacidade de estimular a
síntese de DNA, RNA e de proteínas estruturais tireóideas (Utiger, 2001).
Os hormônios tireóideos inibem diretamente a secreção de TSH e TRH,
além de diminuir a resposta dos tireotrofos ao TRH. Sabe-se que os hormônios
tireóideos diminuem a transcrição dos genes de ambas as subunidades do
TSH, e também diminuem a glicosilação do mesmo, o que reduz sua atividade
biológica (Utiger, 2001). Sabe-se que a maior parte do T
3
sérico é gerada
através da desiodação periférica do T
4
, pelas enzimas iodotironina desiodases.
Contudo, tanto o T
3
produzido pela tireóide, quanto aquele oriundo da
conversão de T
4
em tecidos periféricos, contribuem para o mecanismo de
feedback negativo (Bianco e cols., 2002).
Figura 6- Regulação da atividade do eixo hipotálamo-hipófise-tireóide. (Adaptado de
Reichlin, 1966).
3.2 AUTORREGULAÇÃO
Além da regulação da função tireóidea pelo eixo hipotálamo-hipófise-
tireóide, existe um mecanismo de autorregulação independente de TSH, que
serve para estabilizar a taxa de síntese hormonal frente às flutuações na
disponibilidade do iodeto (Larsen e cols., 1998).
3.2.1 IODO
O aumento da quantidade de iodo disponível para organificação promove
resposta bifásica: inicialmente, ocorre aumento da organificação, seguido de
diminuição até completo bloqueio desta etapa da biossíntese hormonal. A
diminuição do iodo organificado, em virtude do aumento de iodo intraglandular
é conhecido como efeito Wolff-Chaikoff (Wolff & Chaickoff, 1948). O excesso
de iodo também é capaz de inibir a resposta das células foliculares ao TSH
(Utiger, 2001). O principal mediador do efeito inibitório do iodo parece ser um
composto lipídico iodado cuja identidade não foi definida (Pereira e cols.,
1990). Recentemente, Cardoso e cols. (2001 e 2002) demonstraram que a
enzima bloqueada pelo aumento de iodo intraglandular, é a peroxidase
tireóidea (ThOX), e não a TPO, como anteriormente sugerido.
O iodo é capaz de inibir a hipervascularização e a hiperplasia,
características da doença de Graves (bócio difuso tóxico), motivo pelo qual é
utilizado no período pré-operatório (Michalkiewicz e cols., 1989).
3.2.2 TIREOGLOBULINA FOLICULAR
Recentes trabalhos têm demonstrado que o conteúdo de tireoglobulina
folicular é um potente regulador da função tireóidea (Ulianich e cols., 1999;
Royaux e cols., 2000; Kohn e cols., 2001). A Tg folicular age diminuindo a
atividade de TTF-1, TTF-2 e Pax-8, fatores de transcrição para genes tireóideos
(Figura 7). Ela é capaz de diminuir os níveis de RNAm destes fatores, bem
como, diminuir a ligação destes fatores de transcrição à regiões promotoras
dos genes-alvo (Ulianich e cols., 1999; Kohn e cols., 2001).
O conteúdo de Tg folicular suprime a expressão gênica de TPO, NIS e Tg,
agindo contrariamente ao TSH. Entretanto, age em sinergismo com o mesmo
ao suprimir a expressão gênica de TSHR (Figura 6). Tais efeitos são específicos
e não mimetizados por albumina, imunoglobulinas, manitol, iodo, ou T
3
/T
4
(Suzuki e cols., 2000). Nada ainda foi relatado sobre o efeito da Tg folicular na
peroxidase tireóidea.
O efeito supressor parece estar relacionado à capacidade da Tg de ligar-
se ao receptor de asialoproteína (ASGPR), localizado na membrana apical dos
tireócitos (Consiglio e cols., 1979; Ulianich e cols., 1999). A ligação ocorre
num fragmento de 60kDa na porção N-terminal da Tg, na qual existem
resíduos de serina/treonina. A fosforilação destes resíduos, assim como a
fosforilação do ASGPR eliminam o efeito supressor (Ulianich e cols., 1999).
A Tg folicular suprime a síntese do fator de crescimento endotelial
vascular-fator de permeabilidade vascular (VEGF-VPF), diminuindo a
disponibilidade de iodo ao tireócito (Suzuki e cols., 2000; Kohn e cols., 2001).
Entretanto, para que não haja deficiência no aporte de iodo à membrana
apical, a Tg folicular aumenta a expressão do gene PDS e este parece ser o
principal regulador da expressão gênica da pendrina (Royaux e cols., 2000).
A heterogeneidade folicular tem sido atribuída ao efeito supressor e/ou
estimulador do conteúdo de Tg folicular, já que age como um regulador
autócrino/parácrino dentro de cada folículo, limitando individualmente, o
tamanho do folículo, o crescimento e a função (Ulianich e cols., 1999).
Portanto, a Tg não é apenas um sítio inerte para formação dos
hormônios tireóideos, mas também um regulador dinâmico da função tireóidea
(Ulianich e cols., 1999).
Figura 7- Representação da regulação da função tireóidea pela Tg folicular (Kohn e
cols., 2001. TRENDS in Endocrinology & Metabolism, vol.12:10-16).
3.3 OUTROS REGULADORES
Outros hormônios têm sido mencionados como reguladores do
crescimento da glândula tireóide: hormônio do crescimento (GH), insulina,
fator de crescimento similar à insulina I e II (IGF-1, IGF-2, respectivamente),
hormônio gonadotrófico coriônico e hormônio luteinizante (LH). Os tireócitos,
como outras células, respondem a uma série de fatores autócrinos e parácrinos
que são mitogênicos ou co-mitogênicos, como por exemplo, fator de
crescimento da epiderme (EGF) e fator de crescimento de fibroblastos (FGF)
(Emoto e cols., 1991).
4. BOCIOGÊNESE
Define-se bócio como o aumento de volume da tireóide através de
hipertrofia e hiperplasia glandulares. As anormalidades no controle do
crescimento da tireóide e bócio são comuns à maioria das doenças da
glândula. Vários fatores de crescimento podem estar implicados, sendo o TSH
o mais importante. Pode ainda haver a formação de nódulos, a partir de
expansões clonais de populações celulares. Já é bem conhecido que a carência
de iodo favorece a formação de bócio (Medeiros-Neto, 1993).
Os bócios podem ser classificados segundo suas características
morfológicas e funcionais. Distinguem-se em difusos ou nodulares, tóxicos ou
atóxicos e hipocaptantes (frios), normocaptantes (mornos) ou hipercaptantes
(quentes). Os bócios difusos resultam de um crescimento uniforme e
generalizado da glândula (bócio simples), ao passo que os nodulares se
formam a partir de crescimento neoplásico verdadeiro (uninodulares ou bócios
adenomatosos) ou a partir de pseudonódulos delimitados por áreas de retração
fibrótica (multinodulares). Bócios difusos tendem a se tornar nodulares com o
passar do tempo, daí sua maior freqüência em pacientes idosos (Burow,
1981).
Os termos tóxico e atóxico referem-se à concomitância ou não de
hiperfunção. Classifica-se como tóxico o bócio que tem expressão clínica de
produção hormonal excessiva, os demais, com produção hormonal normal ou
diminuída, são considerados como atóxicos. Cintigraficamente, os nódulos
hipocaptantes ou “frios” concentram menos radiotraçador do que o resto do
perênquima, os hipercaptantes ou “quentes” concentram mais radiotraçador, e
normocaptantes ou “mornos” quando a concentração de radiotraçador não
difere da do resto da glândula (Rosenthal, 1975).
Apesar de relativamente comuns, os nódulos tireóideos têm risco
relativamente baixo de malignidade e a prevalência e o tipo de bócio pode
variar consideravelmente entre diferentes populações (Dumont e cols., 1992).
4.1 ETIOPATOGENIA DOS BÓCIOS
Quanto a etiopatogenia, abordaremos o bócio difuso tóxico (BDT),
característico da Doença de Graves, os adenomas foliculares e o bócio
multinodular atóxico (BMNA), utilizados neste estudo.
Como observado por Apel e cols. (1995), as hiperplasias tireóideas
podem ter origem monoclonal ou policlonal, porém sugeriram que adenomas
monoclonais em glândulas hiperplásicas refletem um estágio de progressão
neoplásica. Acreditam que o acúmulo de mutações somáticas favorece,
seletivamente, o crescimento de uma população celular.
4.1.1 ADENOMAS FOLICULARES (AD)
Os adenomas foliculares verdadeiros são neoplasias benignas uni- ou
oligoclonais da tireóide. Do ponto de vista histopatológico, esses nódulos são
formados por folículos de aspecto morfológico e funcional homogêneos,
encapsulados e circundados por parênquima tireóideo normal (Thomas e cols.,
1989). Os adenomas foliculares podem ser classificados em subtipos de acordo
com o tamanho, quantidade de folículos e o grau de celularidade, entretanto
essas variações não têm significado clínico (Rosai, 1991). Alguns adenomas,
principalmente nódulos autônomos, podem apresentar estruturas papilares,
sugerindo um diagnóstico errôneo de carcinoma papilífero (Schlumberger e
cols., 2002).
Os nódulos autônomos assemelham-se a lesões quentes, cincundados
por tecido frio e geralmente levam ao hipertireoidismo. A sua etiologia tem
sido atribuída à presença de mutações pontuais, ativadoras, no receptor de
TSH (Parma e cols., 1993; Van Sande e cols., 1995).
4.1.2 BÓCIO DIFUSO TÓXICO (BDT)
O bócio difuso tóxico (BDT) é o bócio característico da Doença de
Graves. Trata-se de uma doença auto-imune com incidência de 2,7% e 0,1%
em mulheres e homens adultos, respectivamente. É a causa mais comum de
hipertireoidismo entre pacientes com menos de 40 anos (Schlumberger e cols.,
2002).
A causa da doença de Graves é a presença de um estimulador tireóideo
de longa duração (TSAb), identificado como uma imunoglobulina do tipo IgG.
O TSAb constitui então, um anticorpo que se liga ao receptor de TSH (TSHR),
na membrana plasmática da célula tireóidea, mimetizando o efeito do TSH
nesta célula. De fato, este anticorpo, exerce efeito estimulatório mais
prolongado do que o próprio TSH, no tireócito. Em outras palavras, uma vez
ligado ao receptor de TSH, o TSAb estimula o crescimento celular e a
transcrição gênica (De Groot e cols., 1996).
Anticorpos estimuladores do TSHR detectados no soro de pacientes com
doença de Graves são capazes de estimular a adenilato ciclase, a captação de
iodeto, a síntese e a liberação de T
3
e T
4
pelos tireócitos. Com aumento sérico
dos hormônios tireóideos, há supressão da secreção de TSH, refletida com
níveis séricos deste hormônio indetectáveis (De Groot e cols., 1996).
Freqüentemente, na doença de Graves, há alteração do estado metabólico,
bioquímico e fisiológico do organismo (tireotoxicose), resultante do excesso de
hormônios tireóideos nos tecidos (Buescu, 1998).
Histologicamente, as células foliculares apresentam padrão típico de
células hiperestimuladas, ou seja, são hipertróficas. Os folículos são pequenos,
delimitados por células colunares, e possuem quantidades diminuídas de
colóide. O número de mitocôndrias, bem como a largura das cisternas de
Golgi, estão aumentados. Nota-se a presença de numerosos microvilos na
região apical (Utiger, 2001).
Apesar da baixa incidência de malignidade, a estimulação crônica da
tireóide aumenta o número de mitoses, aumentando a chance de ocorrerem
eventos mutagênicos que levam a carcinogênese (Mazzaferri, 1990).
4.1.3 BÓCIO MULTINODULAR ATÓXICO (BMNA)
Os bócios multinodulares atóxicos definem-se pelo aumento não
homogêneo da tireóide associado a eutireoidismo e não relacionado a
inflamação ou neoplasia. O termo é usualmente qualificado como bócio
esporádico ou bócio endêmico, comum em áreas com deficiência de iodo. São
caracterizados por grande variedade de aspectos clínicos, morfológicos e
funcionais (Buescu, 1998).
Apesar do BMNA ser a forma mais comum de bócio, suas causas ainda
não foram adequadamente definidas. Suspeita-se de uma predisposição
genética já que nem todos os habitantes de regiões deficientes de iodo
apresentam bócio. Em contrapartida, há relatos de bócios em regiões onde
não há carência de iodo. Apesar de estar relacionado ao eutireoidismo e do
conceito de bócio atóxico, sugere-se que o TSH seja responsável pela
manutenção do bócio, já que alguns autores observaram redução no seu
tamanho com doses supressivas de hormônio tireóideo (Schlumberger e cols.,
2002).
Kopp e cols. (1994) reportaram que em glândulas multinodulares pode
haver um ou mais de um nódulo monoclonal e que nódulos monoclonais e
policlonais podem co-existir na mesma glândula.
Histologicamente, os nódulos são de tamanho irregular, podendo
apresentar áreas de hemorragia e calcificação. Não são completamente
encapsulados e são pobremente demarcados do resto do parênquima, que
também apresenta alterações em sua arquitetura (Schlumberger e cols.,
2002).
Apesar da baixa incidência de malignidade desses bócios, o aumento na
taxa mitogênica aumenta a probabilidade de mutações e posterior progresso
para autonomia e/ou tumorigênese (Dumont e cols., 1992).
5. INIBIDORES DA TIREOPEROXIDASE
A TPO tem sido alvo de interesse para biologistas tireóideos há mais de
20 anos, tendo em vista seu papel essencial na biossíntese dos hormônios
tieóideos (Zhang & Arvan, 2000). Nunez e Pommier (1982), postularam a
existência de dois sítios catalíticos de ligação para segundo substrato na TPO,
um favorecendo o I
-
e o outro, a tirosila; este seria um sítio hidrofóbico e,
possivelmente, apto a ligar outros compostos, incluindo compostos orgânicos.
Estes relatos foram de grande importância para melhor compreensão dos
efeitos inibitórios sobre atividade tireoperoxidase com grande importância
clínica no controle de estados hipertireóideos.
Divi e Doerge (1996) elucidaram três mecanismos diferentes para
inibição das reações catalisadas pela TPO. O mecanismo de inativação
irreversível consiste na ligação covalente entre radicais reativos formados no
sítio ativo da TPO e aminoácidos catalíticos, promovendo a degradação da
enzima, o que ocorre, por exemplo, no caso da inibição pelo resorcinol e seus
derivados, presentes em alguns flavonóides. O mecanismo de inibição não-
competitivo é dito quando não há competição pelos sítios de ligação a TPO, ou
seja, os inibidores e o substrato ligam-se a sítios diferentes. Neste caso, a
inibição pode ser reversível ou irreversível, de acordo com o tipo de ligação
entre o inibidor e a enzima. Além disso, há o mecanismo competitivo, no qual
inibidores e substrato competem pela ligação no mesmo sítio catalítico da
enzima, como ocorre com os etilenotiourea.
Para melhor compreensão, os inibidores foram agrupados em 5
categorias: (a) iodo, (b) inibidores iônicos que interferem no mecanismo de
transporte do iodeto, (c) drogas antitireóideas, como os tiourelenos, (d)
flavonóides e (e) inibidores endógenos.
Apesar de recentemente Cardoso e cols., (2000), postularem ser a
NADPH-oxidase tireóidea a enzima bloqueada quando o iodo intraglandular
aumenta excessivamente, o efeito Wolff-Chaikoff foi inicialmente descrito como
resultante da inibição da atividade TPO por elevada concentração de iodo na
glândula. Esta inibição seria decorrente da formação de um composto
intermediário iodado (Wolff & Chaickoff, 1948). Tal fato teve grande
importância clínica levando à utilização de compostos iodados como o lugol
(solução saturada de KI) e o ácido iopanóico (66,7% de iodo) no tratamento
da tireotoxicose por bloquear a síntese hormonal. O iodeto diminui a
quantidade AMPc, gerado em resposta ao TSH, diminuindo a endocitose de Tg
e, portanto, independentemente do fato de ser a NADPH-oxidase a enzima-
alvo do iodeto, estes compostos continuam sendo comuns na prática clínica. O
iodo radioativo (
131
I) utiliza as partículas β para destruir o parênquima
tireóideo, não tendo ação específica sobre atividade tireoperoxidase.
Os inibidores iônicos interferem na concentração de iodo pela tireóide.
São ânions hidratados, monovalentes e com tamanho similar ao iodo, com
exceção do tiocianato, que não é concentrado pela glândula, mas que inibe a
organificação do iodeto (Delange, 1994). Fluoborato (BF
4
) e perclorato (ClO
4
-
)
são classificados como inibidores iônicos, sendo este último amplamente
utilizado como “descarga” para iodo inorgânico no teste diagnóstico de
organificação. Outros íons, como o Lítio, inibem a liberação dos hormônios
tireóideos, mas o mecanismo de ação é pobremente conhecido (Lazarus,
1998).
Clinicamente, as drogas antitireóideas mais utilizadas são as tionamidas:
propiltiouracil (PTU), metilmercaptoimidazol (MMI) e carbamizole. Interferem
com a incorporação de iodo nos resíduos tirosil e também inibem a formação
das iodotironinas (Taurog, 2000). O PTU, mas não o MMI, ainda é capaz de
inibir a atividade da enzima iodotironina-desiodase tipo 1 responsável pela
conversão de T
4
a T
3
, nos tecidos periféricos (Beech e cols., 1993). A principal
desvantagem do uso das tionamidas consiste no período de latência para
diminuição dos hormônios tireóideos circulantes, já que diminuem a
biossíntese mas não a secreção destes hormônios. Isso só acontece quando há
depleção na concentração de Tg iodada (De Groot e cols., 1996). Há
evidências de que a reação de acoplamento seja mais sensível a drogas
tireóideas do que a reação de iodação (Taurog, 2000).
Os flavonóides constituem uma classe de compostos naturais,
amplamente distribuídos no reino vegetal (Middleton, 1984). Alguns trabalhos
reportaram que, em animais de experiência, o consumo experimental de
flavonóides e xenobióticos reduziu a concentração tireóidea de iodo, bem como
a atividade TPO, produzindo bócio e alterações histológicas na glândula tireóide
(Cody e cols., 1989). Dentre os diversos flavonóides com atividade
antitireóidea já descritos, destaca-se a myricetina, naringina e biochanina A
(Divi & Doerge, 1996).
Em adição, Ferreira e cols. (2000) demonstraram que Kalanchoe
brasiliens, uma erva medicinal brasileira, rica em flavonóides, além de inibir a
atividade TPO, foi capaz de interagir com H
2
O
2
, essencial para reações
catalisadas por peroxidases, corroborando achados que sugeriram efeito
antioxidante de alguns flavonóides (Middleton, 1984).
O estudo de substância inibidora da atividade TPO tem sido objeto de
diversas pesquisas em nosso laboratório. Cardoso e cols. (2000)
demonstraram que alguns aminoácidos como cisteína, metionina e triptofano,
foram capazes de inibir a atividade TPO, entretanto, tirosina, histidina e
fenilalanina não têm o mesmo efeito. O mecanismo de inibição não foi
específico para TPO e parece ser o mesmo proposto por Taurog (2000) para
tiourulenos, como PTU e MMI.
Vários tipos de disfunções tireóideas caracterizadas por deficiência na
organificação do iodo têm sido descritas, nas quais a TPO está ausente inativa
ou é anormal (De Groot e cols., 1996). Alguns bócios dishormonogênicos e
outros multinodulares apresentaram uma significativa diminuição da atividade
TPO in vitro (Pommier e cols., 1976). Defeitos qualitativos e quantitativos da
TPO são freqüentemente identificados em diferentes doenças tireóideas.
A presença de substâncias endógenas, dialisáveis, inibidoras da atividade
TPO, foi primeiramente reportada na década de 60, em frações solúveis de
homogeneizados de glândulas bovinas e ovinas (Schussler e cols., 1961;
Klebanoff e cols., 1962), Em humanos, foi reportada por Pommier e col.
(1977) em preparações de Tg, oriundas de bócios “simples” e
dishormonogênicos. Posteriormente, em nosso laboratório, Rosenthal e cols.
(1990) também identificaram atividade inibitória da TPO em duas preparações
de bócios dishormonogênicos. A atividade inibitória era termoestável e
dialisável, assim como a reportada por Pommier (Pommier e cols., 1977),
porém, foi identificada em frações particuladas, solubilizadas, enriquecidas em
TPO (Rosenthal e cols., 1990). Quando analisados bócios dishormonogênicos
com defeito de organificação do iodo, a inibição foi encontrada tanto em
frações de TPO solubilizada, como em frações de Tg, mantendo-se quando a
preparação foi submetida a 100°C, porém sendo removida por diálise
prolongada (Carvalho e cols., 1994).
Há alguns anos, culturas de células tireóideas constituem um bom
modelo de estudo para análise da fisiologia e regulação glandular. Em
culturas primárias de tireócitos bovinos, foi também observada uma
diminuição na organificação do iodo, devido à presença de um inibidor solúvel
da atividade TPO (Bocanera e cols., 1999), possivelmente relacionado à
substância inibidora presente nos bócios humanos. Quando esta substância
foi purificada, identificou-se uma molécula de inositolfosfoglicano (IPG) que,
mesmo em alta temperatura, foi capaz de inibir a atividade TPO de maneira
não específica (Krawiec e cols., 2004). Como reportado nos bócios humanos,
(Pommier e cols., 1977; Carvalho e cols., 1994), a inibição não foi mantida
após diálise.
Vários autores têm sugerido que o IPG mimetiza a ação da insulina nos
adipócitos, na placenta e no fígado, agindo como mensageiro secundário para
os efeitos mitogênicos da insulina também em culturas de fibroblastos (Vasta
e cols., 1992). Sabe-se que a insulina também é capaz de estimular a
proliferação dos tireócitos, como descrito por Dumont e cols. (1992). É válido
ressaltar que Bocanera e cols. (1999) e Krawiec e cols. (2004), apesar das
tentativas, não conseguiram identificar o inibidor em glândulas humanas.
Atualmente, o pouco que se sabe acerca da inibição da atividade
tireoperoxidase em bócios humanos é que ela é mantida a 100°C, mas
perdida após diálise. E apesar de não haver relatos da estrutura química
da(s) substância(s) responsáveis pela inibição, tal fato fundamenta a
hipótese de tratar-se de substância(s) pequena(s). Embora tenha sido
relatada em bócios com defeito de organificação do iodo, a importância da
inibição da atividade TPO na regulação da função tireóidea ainda permanece
incerta e, portanto, torna-se necessária a melhor caracterização do inibidor
da TPO presente em bócios humanos, a fim de esclarecer seu possível papel
fisiológico.
II. OBJETIVOS
1) Estimar o efeito inibitório de amostras de bócios não dishormonogênicos
sobre a atividade tireoperoxidase.
2) Avaliar os possíveis mecanismos responsáveis pela inibição da atividade
TPO.
3) Caracterizar, mesmo que parcialmente, a estrutura bioquímica da(s)
molécula(s) inibidora(s).
4) Avaliar a importância desse efeito inibitório na fisiopatologia das diferentes
doenças tireóideas.
OBJETIVOS
III. MATERIAIS E MÉTODOS
1. TECIDOS TIREÓIDEOS
Utilizamos amostras de tireóides humanas provenientes do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho, obtidas em tireoidectomias eletivas. Os
diagnósticos foram determinados clinicamente e através de exames anátomo-
patológicos/histológicos feitos pelo serviço de patologia do mesmo hospital.
Cerca de 80% dos pacientes eram do sexo feminino, cuja idade variou entre
45 e 76 anos, com exceção de uma paciente com 27 anos de idade. A idade
variou entre 56 e 65 anos, entre os pacientes do sexo masculino. As amostras
foram congeladas imediatamente (nitrogênio líquido), após a retirada e
armazenadas a -20°C, até o processamento.
Tabela 1 – Número de pacientes e áreas com os respectivos diagnósticos
DIAGNÓSTICOS N° DE
PACIENTES
N° DE ÁREAS
ESTUDADAS
Bócio Difuso Tóxico (BDT) 1 5
Bócio Multinodular Atóxico (BMNA) 6 17
Adenoma Folicular (AD) 3 8
TOTAL
10 30
2. PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
2.1 FRAÇÃO SOLÚVEL
As amostras de tecidos foram dissecadas em placa de Petri, sobre gelo,
MATERIAIS E MÉTODOS
sendo removidas todas as áreas hemorrágicas, calcificadas e císticas, e o
tecido conjuntivo fibroso. Amostras de no máximo 1g foram homogeneizadas
em 3mL de tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,2, contendo 250 mM
Sacarose, 1mM EGTA e 200µM DTT (homogeneizador Ultra-Turrax). O
homogeneizado foi centrifugado a 3.000 xg, durante 15 minutos a 4°C (rotor
SS-34, Sorval). O sobrenadante foi submetido a nova centrifugação a 100.000
xg, por 30 minutos a 4°C (Beckman modelo L8M)
e separado em sobrenadante, ou fração solúvel, e precipitado que foi
descartado.
2.1.2 PURIFICAÇÃO PARCIAL POR “SALTING OUT”
A fração solúvel, contendo Tg, foi precipitada em 50% de sulfato de
amônio 4M, pH 7,2. Após a adição do sulfato de amônio, a mistura foi agitada
por 20 minutos, à temperatura ambiente e deixada a 4°C por no mínimo 24
horas, sendo posteriormente centrifugada a 27.000 xg, durante 30 minutos a 4
°C (rotor SS-34, Sorval). O sobrenadante foi desprezado e o precipitado
ressuspenso em 1 mL de tampão fosfato de sódio 50mM, pH 7,4, conforme
anteriormente feito em nosso laboratório (Cravalho e col., 1994).
Considerando que o excesso de sal contido na fração Tg parcialmente
purificada, poderia interferir na detecção da atividade tireoperoxidase de
oxidação do iodeto e, assim, na detecção da atividade inibitória (como
veremos adiante), utilizamos como controle a albumina sérica bovina,
submetida a “salting out” em 80% de sulfato de amônio 4M, pH 7,2 e, depois,
processada como a Tg (vide acima).
2.2 FRAÇÃO PARTICULADA CONTENDO A TPO
As amostras foram dissecadas como descrito acima. Quantidades de no
máximo 1g foram homogeneizadas em 3mL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH
7,2, contendo 1mM de KI (homogeneizador Ultra-Turrax). O homogeneizado
foi centrifugado a 105.000 xg, durante 60 minutos a 4°C, em ultracentrífuga
Beckman modelo L8-M. O sobrenadante foi descartado e a fração particulada
foi solubilizada com digitonina a 1% (2mL), sendo as amostras incubadas a 4°
C por 24 horas. Seguindo-se este período, as amostras foram centrifugadas a
105.000 xg por 60 minutos a 4°C (ultracentrífuga Beckman modelo L8-M). O
sobrenadante contendo a TPO solubilizada foi separado e armazenado a -20°C
até a realização da dosagem enzimática (Carvalho e cols., 1994)
3. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE TIREOPEROXIDASE
3.1 OXIDAÇÃO DO IODETO
O teste baseia-se na atividade de geração de triiodeto (I
-
3
) a partir da
oxidação do iodeto na presença de quantidades constantes de H
2
O
2
, geradas
pelo sistema glicose-glicose oxidase (Nakashima e Taurog 1978; Moura e col.,
1989).
Em uma cubeta de 3 mL, adicionou-se 1 mL de tampão fosfato de sódio
50 mM, pH 7,4, contendo 24 mM de KI e 11 mM de glicose, concentrações
crescentes, variando de 10 a 120 µL, da fração TPO. O volume final da reação
(2mL) foi completado com tampão fosfato de sódio 50 mM pH 7,4, e a reação
foi iniciada por adição de 10 µL de glicose-oxidase (1 mg/mL). O aumento da
absorbância a 353 nm (∆abs
353
) foi monitorado em espectofotômetro Hitachi
U-3300 acoplado a um computador (386-PC). O cálculo da atividade foi feito a
partir da variação da absorbância por minuto (∆abs
353
/min) em função do
volume de amostra utilizado, sendo usada a porção linear para determinar,
através da regressão linear, a velocidade de geração do triiodeto (I
-
3
)
em
função do volume utilizado nas preparações (∆abs
353nm
/min.µL).
3.2 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL INIBITÓRIO DAS FRAÇÕES Tg SOBRE
ATIVIDADE TIREOPEROXIDASE
O potencial inibitório das frações Tg foi avaliado usando-se a dosagem de
atividade TPO descrita acima, porém adicionando-se quantidades crescentes da
fração Tg, antes de completar o volume (2mL) e iniciar a reação pela adição de
glicose oxidase. Os resultados foram expressos como quantidade de Tg (mg de
proteína) capaz de inibir em 50% a atividade original da preparação TPO
(IC
50
). Quando não foi possível determinar o valor do Ic50, consideramos
atividade inibitória indetectável.
4. QUANTIFICAÇÃO PROTÉICA
A quantidade de proteína foi determinada de acordo com o método
descrito por Bradford (1976).
5. QUANTIFICAÇÃO DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO (H
2
O
2
)
A concentração de H
2
O
2
foi determinada pela diminuição progressiva da
fluorescência emitida pela escopoletina, quando esta é oxidada pela peroxidase
de raiz forte (HRP), que tem o H
2
O
2
como co-fator enzimático, sendo, portanto,
a fluorescência máxima emitida pela escopoletina medida na ausência de H
2
O
2
.
Esta oxidação ocorre praticamente na razão mol escopoletina por mol H
2
O
2
(Cardoso e cols. 2000).
Incubamos o volume da fração Tg correspondente aos valores de IC
50
,
expressos em mg de proteína, determinados pela geração de I
-
3
, com azida
sódica 0,1M, por 10 minutos, a fim de eliminarmos qualquer atividade TPO
residual na fração solúvel. Adicionamos H
2
O
2
nas concentrações 1.0, 2.5 e 4.0µ
M, completando o volume (1mL), com tampão fosfato 50mM, pH 7,4. O
mesmo procedimento foi utilizado para fração Tg sem atividade inibitória e
albumina. A seguir, transferimos alíquotas de 100µL provenientes das
diferentes misturas (em triplicata), para outro tubo de ensaio e adicionamos
solução reveladora contendo 5µM de escopoletina e 5µg HRP em tampão
fosfato 0,2M, pH 7,4 (1mL). A fluorescência foi medida em fluorômetro Hitachi
(F4000) (excitação: 360 nm e emissão: 460 nm) e assim determinamos a
concentração de H
2
O
2
na presença e na ausência da(s) substância(s)
inibidora(s)
6. EFEITO DA ESPERMINA SOBRE ATIVIDADE INIBITÓRIA
A espermina é uma poliamina com importante papel fisiológico no
crescimento e proliferação celular (Moinard e cols., 2005). Tem sido
amplamente utilizada no controle da tumorigênese, entretanto seu mecanismo
de ação é pouco conhecido (Seiler, 2005). Sabe-se que as poliaminas são
capazes de aumentar a atividade de proteína-fosfatases (Tung e cols., ) e
também que, dentre todas as poliaminas, a espermina é mais efetiva em
aumentar a atividade de fosfatase alcalina (Vittur e cols., 1986). Utilizamos a
espermina a fim de verificarmos a ação da fosfatase alcalina e, o possível
envolvimento de um grupamento fosfato na(s) substância(s) inibidora(s) da
atividade tireoperoxidase.
A fração solúvel, contendo Tg, foi submetida a “salting out” em 50% de
sulfato de amônio 4M, pH 7,2, sendo processada da mesma forma como a Tg
(vide acima). Porém, o precipitado foi ressuspenso em 1 mL de tampão Tris-
HCl, pH 9,2, contendo 1 mM MgCl
2
e 0.1 mM ZnCl
2
.
As amostras foram incubadas com 1 mM de espermina durante 12 horas
a 37°C. Após este período, a reação foi parada com 5mM de EDTA e as
amostras mantidas a 95°C por 10 minutos. O potencial inibitório foi avaliado
usando-se a dosagem de TPO, porém adicionando-se quantidades crescentes
das frações Tg incubadas com espermina. Os resultados foram expressos como
quantidade da fração Tg incubada com espermina, capaz de inibir em 50% a
atividade TPO inicial (IC
50
). Quando não foi possível determinar o valor do
Ic50, consideramos atividade inibitória indetectável.
7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para análise estatística dos resultados experimentais foi aplicado teste de
Kruskal-Wallis (ANOVA) associado a testes Dunn de comparação múltipla,
utilizando “GraphPad Prism”,versão 4.0.
IV. RESULTADOS
1. EFEITO INIBITÓRIO DA FRAÇÃO Tg
Nas tabelas 2, 3 e 4 encontram-se os valores individuais, expressos em
proteína (mg), da quantidade da fração Tg capaz de inibir em 50% a atividade
tireoperoxidase inicial (IC
50
). Como podemos observar, a análise do efeito
RESULTADOS
inibitório foi feita em, pelo menos, duas áreas diferentes de cada bócio
estudado.
O inibidor esteve presente em todos os bócios avaliados, entretanto em
4 dos 6 BMNA, o inibidor não foi encontrado em pelo menos uma das áreas
testadas, mostrando que a distribuição glandular desta substância é bastante
heterogênea. O mesmo padrão heterogêneo foi observado na amostra de BDT
e também em 1 dos 3 AD analisados (Tabelas 2, 3 e 4).
Entre os BMNA, os valores de IC
50
diferiram em até 67% entre alguns
bócios, variando de 0,26 a 0,80mg, mas não entre as diferentes áreas do
mesmo bócio (Tabela 2). Já entre as diferentes áreas do BDT estudado houve
diferença de até aproximadamente 60%, com valores de IC
50
variando entre
0,15 e 0,45 mg de ptn da fração Tg (Tabela 3). Observamos padrão bastante
heterogêneo no AD analisados, notando-se grande variabilidade dos valores de
IC
50
entre os diferentes bócios, e entre as diferentes áreas do mesmo bócio
(Tabela 4).
Em amostras de BDT, em 1 BMNA e em 1 dos AD, o IC
50
foi menor do
que 0,3 mg de ptn, caracterizando áreas com maior atividade inibitória. Essas
amostras foram submetidas a outros ensaios enzimáticos para melhor
caracterização do inibidor. O maior potencial inibitório foi encontrado em um
dos AD estudados (IC
50
= 0,12mg) (Tabela 5).
Tabela 2- Valores de IC
50
, determinados em ptn (mg), de diferentes áreas
provenientes de BMNA.
PACIENTES ÁREAS IC
50
(mg)
1 A 0.31
B 0.26
2 A ND
B 0.36
3 A 0.43
B 0.41
4 A 0.35
B ND
C 0.34
5 A ND
B 0.63
C 0.80
6 A 0.54
B ND
C ND
D 0.64
E 0.63
ND – Atividade inibitória não detectada
Tabela 3- Valores de IC
50
, determinados em ptn (mg), de diferentes áreas
provenientes de BDT.
PACIENTE ÁREAS IC
50
(mg)
1 A ND
B 0.24
C 0.45
D 0.26
E 0.15
ND – Atividade inibitória não detectada
Tabela 4- Valores de IC
50
, determinados em ptn (mg), provenientes de diferentes
áreas de AD.
PACIENTES ÁREAS IC
50
(mg)
1 A 0.30
B 0.84
C 0.28
2 A 0.12
B 0.53
C 0.016*
3 A 0.85
B ND
ND – Atividade inibitória não detectada
(*) – Maior potencial inibitório encontrado durante o estudo
Nos preocupamos em expor graficamente curvas obtidas de duas
diferentes áreas de um dado bócio (Tabela 2 - paciente 2), das quais uma não
apresentou atividade inibitória, para melhor ilustrar a diferença entre áreas
com e sem atividade inibitória (Figura 8A e B). Como podemos observar, as
curvas apresentaram perfis bem distintos. A curva correspondente à área cuja
fração Tg apresentou atividade inibitória decresceu a medida com que
adicionamos maior quantidade desta fração (Figura 8A). Já a curva
correspondente à área onde o inibidor esteve ausente, embora tenha tido uma
queda inicial, permaneceu constante mesmo com adição de maior quantidade
da própria fração (Figura 8B). Portanto, mais de 80% da atividade
tireoperoxidase é mantida na presença da fração Tg que não apresenta
potencial inibitório.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
ptn (mg)
Atividade relativa a atividade basal
A
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
ptn (mg)
Atividade relativa a atividade basal
Figura 8- Efeito inibitório da fração Tg. Atividade TPO inicial de um BDT, (considerada
100%), determinada pela geração de I
3
-
, na presença de fração Tg, obtida de
BMNA(2). (A) Fração Tg correspondente à área com atividade inibitória (área A). (B)
Fração Tg correspondente à área sem atividade inibitória (área B). Resultados
expressos em média ± EPM.
A fração Tg parcialmente purificada foi obtida por “salting out”. A fim de
verificarmos se a presença de sulfato de amônio estaria interferindo com os
nossos resultados de inibição da atividade tireoperoxidase, avaliamos o perfil
inibitório da fração Tg comparado ao perfil da atividade tireoperoxidase na
presença de albumina que foi submetida a “salting out” com maior
concentração de sulfato de amônio (80%).
Consideramos 100% a atividade inicial de um BDT. Como podemos
observar, o excesso de sal não interferiu com a detecção da atividade
inibitória, já que a preparação de albumina, após “salting out”, foi capaz de
aumentar a atividade tireoperoxidase em até 70% (Figura 9). Consideramos a
fração Tg sem atividade inibitória, aquela capaz de inibir a atividade inicial
TPO, em no máximo 20%, mantendo-se estável, mesmo com o aumento da
concentração de proteína da fração Tg em questão. Esse padrão não é
observado na fração Tg com alto potencial inibitório, já que a curva decresce
com aumento da concentração protéica da fração, chegando a inibir 80% da
B
atividade TPO inicial (Figura 9).
0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 1.8
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
Albumina
Tg sem atividade inibitória
Tg com atividade inibitória
*
ptn (mg)
Atividade relativa a atividade basal
Figura 9 – Efeito inibitório das frações Tg e albumina. Atividade TPO inicial de um
BDT (considerada 100%), determinada pela geração de I
3
-
, na presença das frações
Tg e albumina. Foram realizados três experimentos. Resultados expressos em
média±DP (*P<0,05).
2. QUANTIFICAÇÃO DE H
2
O
2
NA PRESENÇA DO INIBIDOR
A reação de oxidação do iodeto catalisada pela TPO requer como co-fator
o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), um aceptor de elétrons essencial para as
reações de iodação e acoplamento (Taurog, 2000). Para verificarmos se a
inibição não estaria ocorrendo pela diminuição ou falta do co-fator enzimático,
avaliamos a interação do inibidor com o H
2
O
2
. Porém, antes, incubamos o
volume(µL) da fração Tg correspondente aos valores de IC
50
(determinados em
mg) com azida sódica 0,1M, a fim de eliminarmos qualquer atividade
tireoperoxidase residual na fração solúvel.
A incubação com azida sódica, quando comparada ao controle, não
alterou, significativamente, a concentração de H
2
O
2
no meio, sendo, portanto
eficaz sua utilização como valor de referência para controle no experimento
(Figura 10). As frações Tg sem atividade inibitória, bem como albumina, não
foram capazes de alterar significativamente a concentração de H
2
O
2
, mesmo 4µ
M, a maior concentração de H
2
O
2
utilizada. Já a fração Tg com atividade
inibitória interagiu com o H
2
O
2
, diminuindo significativamente a proporção do
peróxido no meio em todas as concentrações utilizadas (Figura 10).
0
1
2
3
4
Controle
Controle com azida
Albumina
Tg sem atividade inibitória
Tg com atividade inibitória
*
*
*
1.0
µ
M
2.5
µ
M
4.0
µ
M
H
2
O
2
µ
M
Figura 10 – Quantificação de H
2
O
2
. Concentração final de H
2
O
2
no meio na presença
do inibidor após incubação com azida sódica 0,1M. Determinada pelo método de
oxidação da escopoletina. Foram obtidas triplicatas de dois experimentos. Resultados
expressos em média ± EPM (*p< 0,05).
3. EFEITO DA ESPERMINA SOBRE ATIVIDADE INIBITÓRIA
Utilizamos espermina 1mM a fim de verificarmos ação da fosfatase
alcalina sobre inibidor da atividade tireoperoxidase (Vittur e cols., 1986;
Krawiec e cols., 2004).
Após a incubação com espermina, o perfil apresentado pelas frações Tg
com e sem atividade inibitória foi similar ao reportado anteriormente nos
ensaios de inibição (Figura 11). Na ausência do inibidor, observamos uma
diminuição da atividade tireoperoxidase de no máximo 20%, característica da
fração Tg sem atividade inibitória, como observado anteriormente. A incubação
com a espermina em nada alterou este resultado (Figura 11A).
A fração Tg com atividade inibitória diminuiu em 80% a atividade inicial
TPO, o mesmo observado nos ensaios de inibição. Este efeito inibitório foi
revertido após incubação com espermina. O percentual de inibição foi de no
máximo 20%, assim como o representado pela fração Tg sem atividade
inibitória (Figura 11B). Ao compararmos as amostras nas quais houve adição
de EDTA, sugerimos que a capacidade de reverter a inibição parece relacionar-
se somente a presença da espermina, já que não observamos alteração com a
utilização do EDTA, tanto no controle (EDTA) quanto no incubado
(Espermina+EDTA) (Figura 11A e B).
Fração Tg sem atividade inibitória
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Controle
Espermina + EDTA
Espermina
EDTA
ptn (mg)
Atividade relativa a atividade basal
A
B
Fração Tg com atividade inibitória
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
Controle
Espermina + EDTA
Espermina
EDTA
ptn (mg)
Atividade relativa a atividade basal
Figura 11 – Efeito inibitório das frações Tg na presença de espermina. Atividade TPO
inicial de um BDT (considerada 100%), medida pela oxidação de iodeto após
incubação com espermina 1mM, por 12h a 37°C. Resultados expressos em média ±
DP. Foram realizados três experimentos. (A) Fração Tg sem atividade inibitória. (B)
Fração Tg com atividade inibitória.
V. DISCUSSÃO
A peroxidase tireóidea (TPO) é uma hemoglicoproteína, ancorada na
membrana apical dos folículos tireóideos que, na presença de H
2
O
2
, catalisa
oxidação do iodeto, iodação dos resíduos tirosil e o acoplamento das
iodotirosinas na molécula de tireoglobulina, levando à formação dos hormônios
tireóideos (Taurog, 2000).
A atividade tireoperoxidase geralmente está diminuída em tireoidite de
Hashimoto, porém a diminuição pode ser bem mais acentuada em bócios
dishormonogênicos (DeGroot e cols., 1996). Esta diminuição pode ser oriunda
de defeitos quantitativos ou qualitativos da TPO, porém alguns autores já
identificaram substâncias inibidoras da atividade TPO endógenas em alguns
bócios simples (Pommier e cols., 1977), bócios dishormonogênicos (Carvalho e
cols., 1994) e, ainda, em cultura primária de tireócitos bovinos (Bocanera e
cols., 1999).
O presente trabalho teve como objetivo caracterizar, mesmo que
parcialmente, a(s) substância(s) inibidor(as) da atividade TPO encontrada em
bócios humanos, para que possamos ter uma idéia de seu eventual papel na
DISCUSSÃO
função tireóidea.
Utilizamos amostras de tireóides humanas de pacientes submetidos a
tireoidectomia eletiva. De forma não surpreendente, cerca de 80% dos
pacientes eram do sexo feminino e mais de 90% tinha acima de 45 anos.
Como reportado na literatura, a incidência de disfunção tireóidea é maior em
mulheres do que em homens e parece aumentar com a idade (Schlumberger e
cols., 2002).
Analisamos adenomas foliculares, bócios multinodulares atóxicos e
bócio difuso tóxico. O inibidor esteve presente em todos os bócios avaliados
até agora (Tabela 2, 3 e 4). A atividade inibitória foi detectada na fração
solúvel, rica em Tg, corroborando os primeiros resultados obtidos a partir da
análise de bócios humanos. Pommier e cols. (1977) demonstraram a
presença de inibidor em preparações de Tg, oriundas de bócios simples e
dishormonogênicos, o que mais tarde foi confirmado por
Carvalho e col. (1994), que observaram atividade inibitória tanto em
frações Tg, como em frações enriquecidas em TPO.
Atualmente, são conhecidos diferentes métodos para quantificação da
atividade tireoperoxidase in vitro: iodação da albumina, iodação da tirosina,
oxidação do guaiacol e oxidação do iodeto (DeGroot e cols., 1996). Bocanera e
cols. (1999) identificaram inibição da atividade TPO, em cultura primária de
tireócitos bovinos, através dos métodos da iodação da tirosina e geração de I
-
3
,
mas não pela oxidação do guaiacol. Utilizamos a dosagem da TPO pelo método
de oxidação do iodeto, pois corresponde à metodologia que mais se aproxima
da reação que ocorre “in vivo”, quando comparada ao ensaio de oxidação do
guaiacol.
A análise do efeito inibitório foi feita em, pelo menos, duas diferentes
áreas de cada bócio (Tabelas 2, 3 e 4), já que alguns autores reportaram uma
grande variabilidade da atividade TPO em tireóides humanas, quando a enzima
foi extraída de diferentes partes da mesma glândula (Moura e cols., 1989).
O perfil inibitório foi determinado pela quantidade suficiente da fração
Tg, expressa em ptn (mg), capaz de inibir em 50% a atividade TPO inicial,
considerada 100%, de um BDT (IC
50
). Embora não saibamos a natureza
química da(s) substância(s) inibidora(s), estudos prévios em nosso laboratório
sugeriram que o inibidor poderia estar associado à Tg (Carvalho e cols., 1994;
Mouço, 1997). Logo, optamos por expressar os valores de IC
50
em função da
concentração protéica da fração Tg. Houve variabilidade dos valores de IC
50
entre os diferentes bócios e, entre as diferentes áreas de um mesmo bócio
(Tabela 2, 3 e 4), assim como anteriormente descrito para atividade TPO
(Moura e cols., 1989). Do ponto de vista quantitativo essa variabilidade foi
pequena, uma vez que como reportado na literatura não há diferença
significativa entre a expressão protéica de Tg nas diferentes disfunções
tireóideas.
A determinação dos valores de IC
50
tem sido o principal parâmetro
utilizado para avaliação do potencial inibitório (Carvalho e cols., 2000;
Ferreira e cols., 2000). Como podemos observar a capacidade inibitória foi
diferente entre as amostras processadas e avaliadas pelo mesmo procedimento
(Figura 8), embora a identidade da(s) substância(s) inibidora(s) permaneça
desconhecida.
Em mais da metade dos BMNA, no BDT e em um dos três adenomas, o
inibidor não foi encontrado em pelo menos uma das áreas analisadas (Tabelas
2, 3 e 4). Isso pode ser explicado pela grande heterogeneidade funcional e
morfológica, normalmente encontrada na glândula tireóide. Ë válido ressaltar
que utilizando anticorpos para TSHR, pendrina, NADPH-oxidase, TPO e NIS,
Gérard e cols. (2002) observaram marcação positiva em folículos ativos,
enquanto folículos hipofuncionantes, apresentaram marcação apenas para
TSHR. A distribuição do NIS foi bastante heterogênea entre os folículos da
mesma glândula, confirmando a hipótese de que folículos ativos e inativos co-
existem na mesma glândula, conforme sugerido por Suzuki e cols. (2000).
O processamento da tireóide para obtenção da fração solúvel enriquecida
em Tg inclui “salting out” em sulfato de amônio. A possível interferência do sal
na detecção da atividade inibitória TPO foi excluída, uma vez que utilizamos
como controle, uma fração de albumina submetida ao mesmo procedimento.
Esta fração foi capaz de aumentar atividade TPO (Figura 9), assim como
reportado por Carvalho e cols. (2000), que adicionalmente verificaram que
este efeito estimulatório era revertido pela incubação com enzimas
proteolíticas.
Quando avaliamos, isoladamente, frações Tg com e sem atividade
inibitória, observamos uma pequena queda na atividade inicial tireoperoxidase,
em ambas as frações, que só então passam a comportar-se de forma
diferenciada, com a adição de maior quantidade da fração Tg correspondente
(Figura 9). Não consideramos esta queda de caráter inibitório porque
acreditamos que represente apenas variabilidade do ensaio enzimático, já que,
mesmo que as condições experimentais estejam bem definidas, pequenas
variações são observadas em sistemas in vitro, e nem sempre representam
com fidelidade variações in vivo.
Recentes trabalhos têm mostrado que algumas substâncias exógenas,
como os flavonóides presentes em alguns vegetais, são capazes de inibir a
atividade TPO (Divi & Doerge, 1996). Ferreira e cols. (2000) demonstraram
que a erva medicinal brasileira K. brasiliensis, rica em flavonóides, além de
inibir a atividade TPO, interagiu com H
2
O
2
. Há muito se discute a
essencialidade da produção de H
2
O
2
na biossíntese hormonal tireóidea, como
co-fator das reações catalisadas pela TPO (Nakamura e cols., 1991). Cardoso e
cols. (2001) demonstraram que o aumento do iodo intraglandular tireóideo,
antes considerado responsável pela inibição da atividade TPO, é capaz de inibir
a NADPH-oxidase e, portanto, a produção tireóidea de H
2
O
2
, o que
compromete a biossíntese hormonal mesmo se a atividade TPO não estiver
alterada.
A possibilidade de um mecanismo de inibição indireto, pela interação do
inibidor com H
2
O
2
, foi avaliada pela quantificação de H
2
O
2
, na presença do
inibidor. O inibidor foi capaz diminuir significativamente, a quantidade de H
2
O
2
original, o que não foi observado na presença da fração Tg sem atividade
inibitória e de albumina (Figura 10). De fato, a concentração de H
2
O
2
gerada
pela glândula tireóide (NADPH-oxidase) in vitro, é similar à concentração
utilizada neste ensaio. Assim, é provável que o inibidor interaja com H
2
O
2
in
vivo reduzindo-o e, assim, diminua a atividade TPO.
Ainda assim, não podemos descartar a possibilidade de existir um
mecanismo direto de inibição da atividade TPO em bócios humanos, já que a
geração de H
2
O
2
pelo sistema glicose-glicose oxidase, utilizado nos ensaios de
inibição, ocorre na ordem de mM, ou seja, cerca de mil vezes maior do que a
concentração utilizada para quantificação de H
2
O
2
na presença do inibidor.
Dessa forma, a interação do inibidor(es) com o co-fator enzimático otimizaria o
efeito inibitório sobre atividade TPO.
A redução de H
2
O
2
ou outros mecanismos que diminuam a quantidade de
H
2
O
2
no meio, não são os únicos meios pelos quais inibe-se a atividade TPO.
Alguns aminoácidos com comprovada ação inibitória da atividade TPO, tais
como cisteína, metionina e triptofano, promovem inibição sem afetar a
concentração de H
2
O
2
, embora a metodologia utilizada tenha sido a mesma
(Carvalho e cols., 2000). Isso sugere que aminoácidos inibidores da atividade
TPO e inibidores encontrados em bócios humanos podem ter mecanismos de
inibição diferentes.
Divi & Doerge (1996) sugeriram três mecanismos de inibição diferentes:
inativação irreversível da enzima, mecanismo não-competitivo e mecanismo de
competição pelos sítios enzimáticos. Infelizmente, ainda não realizamos testes,
senão a quantificação de H
2
O
2
, que nos permitam avaliar qual destes
mecanismos corresponde ao inibidor da TPO. Isto será feito posteriormente.
Há anos culturas de células tem servido como um bom modelo para
estudo da regulação da função tireóidea. Baseados em tal fato, Bocanera e cols
(1999) identificaram, em fração solúvel de cultura primária de tireócitos
bovinos, a presença de inibidor da atividade TPO. Quando mais tarde
purificaram esta substância inibitória (Krawiec e cols., 2004), verificaram
tratar-se de uma molécula de inositolfosfoglicano, que tinha seu efeito
inibitório revertido pela incubação com espermidina. Sabe-se que as
poliaminas funcionam como co-fatores enzimáticos das proteínas fosfatases,
com importante papel fisiológico no crescimento e proliferação celular (Tung
H.Y., 1985). Entretanto, Vittur e cols. (1986) reportaram que a espermina é
mais eficiente do que a espermidina em estimular a atividade fosfatase. Uma
vez que sugeriram ser a espermina o principal co-fator da atividade fosfatase
alcalina, incubamos a fração Tg de caráter inibitório com espermina, para
verificarmos a importância de um possível grupamento fosfato na atividade
inibitória. A espermina foi capaz de reverter o efeito inibitório, quando este
esteve presente, sugerindo a participação de um grupamento fosfato essencial
à ação inibitória (Figura 11).
O fato da poliamina reverter o efeito inibitório corrobora os resultados
obtidos por Krawiec e cols. (2004) que sugeriram que o inibidor purificado a
partir da cultura primária de tireócitos era similar à substância inibidora da
atividade TPO encontrada em bócios humanos, uma vez que apresentaram
características em comum. O inibidor purificado a partir de cultura de tireócitos
bovinos teve sua atividade inibitória mantida, mesmo quando submetido a 100
°, porém perdida após diálise, como reportado em bócios humanos, por
Pommier e cols. (1977) e Carvalho e cols. (1990; 1994). Portanto, apesar de
não haver relatos sobre a estrutura química de inibidores da atividade TPO
encontrados em bócios humanos, esses resultados reforçam a hipótese de
tratar-se de substâncias similares, porém mais estudos são necessários para a
efetiva conclusão.
É válido ressaltar que Krawiec e cols. (2004), apesar das tentativas, não
conseguiram identificar o inibidor da TPO em glândulas humanas. No estudo
destes autores, a quantificação da atividade TPO foi feita pela iodação da
tirosina. Já em nosso laboratório é comum utilizarmos o método de oxidação
do iodeto para identificar inibidores da atividade TPO em bócios humanos.
Ainda não sabemos os mecanismos pelos quais o(s) inibidor(es) da
atividade TPO são formados em bócios humanos e sua presença ou ausência
não é previsível. Como podemos observar, o(s) inibidor(es) podem até mesmo
ser encontrados em tireóides estimuladas, como no bócio difuso tóxico (Tabela
3), corroborando estudos prévios em nosso laboratório (Mouço, 1997). Esses
resultados sugerem que a atividade inibitória não tenha impacto significante
sobre a produção hormonal tireóidea, uma vez que o BDT é característico da
doença de Graves, quando são observadas altas concentrações séricas de
hormônios tireóideos. Além disso, a atividade inibitória também foi reportada
em bócios multinodulares atóxicos (Tabela 2), característicos pela manutenção
do eutireoidismo.
Mesmo que não tenhamos avaliado tecidos paranodulares, ou seja,
presumivelmente normais, cremos que a presença do inibidor da atividade TPO
não seja fator determinante de malignidade, já que foi encontrado em doenças
tireóideas benignas. Apesar disso, seria importante caracterizar grupamentos
químicos responsáveis pela inibição, levando-se em consideração que várias
substâncias inativadoras da atividade tireoperoxidase poderiam induzir o
aparecimento de bócios, o que poderia ser fator coadjuvante no aparecimento
de carcinomas tireóideos (Divi & Doerge, 1996).
De fato, a diminuição da atividade TPO in vivo pela presença do inibidor
poderia diminuir a quantidade de iodo organificado intracelular, o que
proporcionaria maior resposta a estímulos proliferativos. O processo
representaria um efeito oposto ao efeito Wolff-Chaikoff, no qual o aumento do
iodo intraglandular organificado diminui a resposta do tireócito ao estímulo do
TSH. A isto adiciona-se o fato de que Corvilain e cols. (1994) sugeriram que a
inibição da via de sinalização do inositol fosfato poderia ser responsável pelo
efeito Wolff-Chaikoff.
Em que pese o papel mitogênico do inositolfosfoglicano, agindo como
mimetizador dos efeitos insulínicos reportado em vários tecidos (Vasta e cols.,
1992) e o fato da espermina estar sendo amplamente utilizada na prática
clínica para controle da tumorigênese (Moinard e cols., 2005), nada podemos
afirmar ainda sobre o papel fisiológico do inibidor da atividade TPO em
mecanismos de proliferação celular.
Futuramente pretendemos avaliar essa hipótese correlacionando
celularidade com a presença do inibidor. Para isso podemos dosar DNA das
amostras com atividade inibitória e compará-lo ao DNA das amostras nas quais
a inibição esteve ausente. Além disso, podemos avaliar a capacidade
proliferativa (em resposta ao TSH), de células em cultura, na presença e
ausência do inibidor, mas para isto é necessário obter mais características,
bem como purificar a(s) substância(s) inibidora(s), o que será feito a seguir.
Dessa forma, estes estudos revelam a importância dos mecanismos de
auto-regulação tireóideos e o quão pouco ainda se conhece acerca da
fisiologia tireóidea sob este aspecto.
VI. CONCLUSÕES
• A maior parte das amostras estudadas continha a atividade inibitória da
TPO na fração solúvel do homogeneizado.
• Em mais da metade dos BMNA, em um dos adenomas e no BDT, houve
pelo menos uma área na qual o inibidor não foi identificado.
CONCLUSÕES
• O inibidor da tireoperoxidase tem distribuição heterogênea entre os
diferentes bócios e entre as diferentes áreas do mesmo bócio, o que
reflete a heterogeneidade funcional e morfológica, normalmente
encontrada na tireóide.
• O inibidor da tireoperoxidase foi capaz de diminuir a concentração de
H
2
O
2
no meio, sugerindo um mecanismo de inibição indireto, através da
interação com o co-fator da tireoperoxidase.
• A espermina foi capaz de reverter a atividade inibitória. Uma vez que
esta poliamina é co-fator da fosfatase alcalina, este resultado sugere a
importância de um grupamento fosfato para a ação inibitória.
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