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Universidade de São Paulo
Instituto de Física
Estudo in vitro dos efeitos radiobiológicos no
DNA plasmidial com radiações ionizantes de
baixo LET
Felix Mas Milian
Orientador: Prof. Dr. Airton Deppman
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Airton Deppman (Orientador - IFUSP)
Prof. Dra. Maria Teresa Moura Lamy (IFUSP)
Prof. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira (ICB-USP)
Prof. Dr. Odilon Antonio Paula Tavares (CBPF)
Prof. Dr. Sérgio José Barbosa Duarte (CBPF)
Tese de doutorado apresentada ao Instituto
de Física para a obtenção do título de
Doutor em Ciências
São Paulo
2006
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pelo Serviço de Biblioteca e Informação
do Instituto de Física da Universidade de São Paulo
Milian, Felix Mas
Estudo in vitro dos efeitos radiobiológicos no
DNA plamidial com radições ionizantes de baixo LET.
São Paulo, 2006.
Tese (Doutorado) - Universidade de São Paulo.
Instituto de Física. Depto. Física Experimental
Orientador: Prof. Dr. Airton Deppman
Área de Concentração: Física Médica
Unitermos:
1.Física experimental; 2. Física Médica; 3. Biofísica;
4. Radiologia.
USP/IF/SBI-060/2006
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Dedicatória
Dedico estas páginas a todos los profesores, amigos y familiares
que ayudaron en mi educación durante estos vente y ocho años.
Especialmente a mi madre, mi padre y mi hermana, pilares de mi
formación y principal fuente de inspiración. A mi sobrino, como
un ejemplo de lo que es posible lograr con mucho esfuerzo y un
poco de suerte. Y por último, a los cubanos que deseamos la
prosperidad de nuestro país y de todas las familias cubanas.
"El deber de un hombre está allí donde es más útil."
José Martí
(Carta a su madre. Montecristi, 25 de marzo de 1895)
Dedico estas páginas a todos os professores, amigos e familiares
que ajudaram na minha educação durante estes vinte e oito anos.
Especialmente à minha mãe, meu pai e minha irmã, pilares da
minha formação e principal fonte de inspiração. A meu sobrinho,
como um exemplo do que é possível lograr com muito esforço e
um pouco de sorte. E por último, aos cubanos que desejam a
prosperidade do nosso país e de todas as famílias cubanas.
"El deber de un hombre está allí donde es más útil."
José Martí
(Carta a sua mãe. Montecristi, 25 de março de 1895)
Agradecimentos
Em primeiro lugar, desejo agradecer a todas aquelas pessoas que me deram a
oportunidade de participar deste trabalho: a Oscarito, João, Guzman, às agências
brasileiras CNPq e FAPESP e, especialmente, a meu orientador Dr. Airton Deppman
pela boa orientação para a realização desta tese.
Agradeço, também, às pessoas que ajudaram e participaram do desenvolvimento do
trabalho:
No Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da USP: à professora Dra. Ana Clara
Schenberg, Dra. Elizabeth Vicente, Dra. Kazui, Dra. Balan, Dra. Renata, Dr. Gabriel,
Dra. Lea, Dr. Ronaldo, Leninha, Norma e aos estudantes, todos que tão amavelmente
me receberam e ajudaram durantes estes anos. À minha prezada e prestativa Andréia
Gouveia, força e alma deste trabalho. E ao Rogério Silva, técnico do irradiador de
Césio, por sua paciência e disposição.
No Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, à Elizabeth Somessari e à Célia,
responsáveis pelo irradiador de Cobalto 60, por sua excelente atenção e paciência nas
dezenas de irradiações. Aos professores Helio, Paulão e Juanito, pela acolhida no
frutífero curso de simulação por Monte Carlo.
No instituto de Física: ao professor Dr. Nemitala Added, por seu essencial interesse e
participação nas irradiações com prótons, à Eliana, sempre disposta a ajudar, e ao Jorge,
pelos proveitosos conselhos.
Desejo agradecer também àquelas pessoas que, com seu bom trabalho e atenção, fazem
mais prazenteira a vida dos estudantes no IFUSP: à Tereza, secretária do LAL, à
Francisleine Mendez, Éber De Patto Lima e Rodolfo, funcionários da CPG, assim como
aos técnicos da oficina mecânica, Carlos e Wilson.
Por último, e não menos importantes, agradeço aos colegas, amigos e seres queridos de
Cuba e do Brasil, que me fazem manter sempre o bom humor, a calma, a esperança e os
sonhos. Ao Joel, Elaine, César, Dona Cida, Orlando e Fidel, primeiros amigos e família
no Brasil. À meus queridos amigos Maritza, Túlio, Kátia e Neivy parceiros no
sofrimento e na diversão. À Vicky, pessoa que aprecio muito e que sempre confiou na
minha capacidade. Ao meu estimado Fermín e sua família, sempre me estendendo sua
mão amiga, ajudando e dando ótimos conselhos. Aos queridos amigos do Coral-USP. A
minha querida Ana Maria, que com seu carinho e apoio nestes anos, já é parte
inseparável da minha vida. E, finalmente, à minha família e à minha madrinha Cacha,
que desde Cuba sempre estiveram comigo.
Resumo
O estudo da interação da radiação com moléculas de DNA tem se intensificado nos
últimos anos, determinando avanços nas técnicas experimentais e na compreensão
teórica desse fenômeno. No entanto, falta ainda um estudo sistemático e com boa
precisão da interação de diferentes radiações com o DNA em condições controladas.
Neste trabalho desenvolveu-se uma técnica experimental que permite o estudo daquela
interação com diferentes radiações, permitindo uma análise quantitativa dos efeitos da
radiação sobre o DNA, mais especificamente, da produção de single- e double–strand
breaks em moléculas de DNA plasmidial irradiados em solução aquosa com diferentes
concentrações de scavengers.
Para o desenvolvimento desse trabalho, foram realizados diversos testes para encontrar
as condições ideais para se reduzir as incertezas na quantificação das diferentes quebras
no DNA. Desenvolveu-se também um programa computacional que permite uma
análise precisa da imagem da eletroforese, que oferece ferramentas úteis para a análise
quantitativa. Com isso, reduziram-se as incertezas e flutuações experimentais, o que
permitiu o estudo da interação radiação-DNA em condições de concentrações de
scavengers muito baixas.
Os resultados são compatíveis com os dados experimentais, nas condições onde estes já
existiam, e compatíveis com o esperado teoricamente nas condições onde não existem
dados experimentais para a comparação.
Abstract
The interaction of radiation with DNA molecules has been intensively studied in the last
years, allowing improvements on the experimental techniques and on the theoretical
comprehension of the phenomena involved in that interaction under controlled
conditions. In this work, a new experimental technique has been developed which
enables one to study the radiation-DNA interaction for different radiations and with
reduced uncertainties, allowing a quantitative analysis of single- and double-strand
breaks on DNA in aqueous solutions with different scavenger concentrations.
To this end, many experimental tests were performed in order to find the best
experimental condition for reducing the uncertainties. A software was developed for
quantitative analysis of the electrophorese image, offering the most important tools for
accurate quantification of the DNA products. An important reduction on uncertainties
was achieved, allowing the extension of experimental studies to the low scavenger
concentration region.
The results are in good agreement with experimental data at those conditions where
these experiments were already performed, and in agreement with the theoretical model
where there are no experimental results to compare with.
I
SUMÁRIO
PARTE I. O TEMA.
INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1
CAPÍTULO 2. ESTADO DA ARTE. ...................................................................................6
2.1 Irradiação de DNA in vitro.......................................................................................6
CAPÍTULO 3. OBJETIVOS.................................................................................................16
3.1 Objetivo geral............................................................................................................16
3.2 Objetivos especificos................................................................................................16
PARTE II. METODOLOGIA
CAPÍTULO 4. FUNDAMENTOS TEÓRICOS. ..................................................................17
4.1 Interação das radiações ionizantes com a matéria.....................................................17
4.1.1 Radiação indiretamente ionizante....................................................................17
4.1.2 Radiação diretamente ionizante.......................................................................21
4.1.3 Deposição macroscópica de energia. Dose e LET. ........................................24
4.2 Interação das radiações com meio biológico ............................................................26
4.2.1 Estrutura do DNA............................................................................................26
4.2.2 Conformações do DNA...................................................................................28
4.2.3 Classificação dos danos no DNA....................................................................29
4.2.4 Mecanismos de interação com o DNA............................................................31
4.2.6 Escala de tempo...............................................................................................34
4.2.7 Captadores de radicais (scavengers) ...............................................................35
4.3 Quantificação dos danos no DNA.............................................................................37
4.3.1 DNA plasmideal..............................................................................................37
4.3.2 Gel de eletroforese...........................................................................................38
4.4 Análise dos danos e cálculo dos rendimentos de SSB e DSB...................................40
4.4.1 Equação geral para Teoria de Evento e Alvo (Hit and Target Theory) ..........40
4.4.2 Rendimento de quebras simples (G(SSB)). ....................................................41
4.4.3 Rendimento de quebras duplas (G(DSB)). .....................................................42
CAPÍTULO 5. MATERIAIS E MÉTODOS. .......................................................................44
5.1 Cultivo, extração e purificação do DNA. .................................................................44
5.2 Otimização da técnica de eletroforese em gel de agarose.........................................45
5.2.1 Materiais e métodos utilizados no estudo........................................................46
5.3 Efeito das frações iniciais de DNA SC e Cir nos G(SSB) e G(DSB) ......................46
5.3.1 Preparação das amostras..................................................................................47
Pág.
II
5.3.2 Irradiação das amostras ...................................................................................48
5.3.2 Gel de eletroforese e quantificação .................................................................49
5.4 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
60
Co. ............................49
5.4.1 Preparação das amostras..................................................................................50
5.4.2 Irradiação das amostras ...................................................................................52
5.4.3 Géis de eletroforese e quantificação................................................................53
5.5 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
137
Cs.............................54
5.5.1 Preparação das amostras..................................................................................54
5.5.2 Irradiação das amostras ...................................................................................55
5.5.3 Géis de eletroforese e quantificação................................................................57
5.6 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com prótons de 10 MeV. ...................57
5.6.1 Preparação das amostras..................................................................................58
5.6.2 Arranjo experimental e cálculo da dose ..........................................................58
5.6.3 Irradiação das amostras ...................................................................................61
5.6.4 Géis de eletroforese e quantificação................................................................62
PARTE III. RESULTADOS
CAPÍTULO 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................63
6.1 Resultados da otimização da técnica de eletroforese em gel de agarose ..................63
6.1.1 Quantificação das bandas de DNA..................................................................63
6.1.2 Efeito do Brometo de Etídio............................................................................64
6.1.3 Efeito da concentração de agarose ..................................................................65
6.1.4 Efeito da quantidade de DNA aplicada por poço do gel. ...............................66
6.1.5 Determinação do melhor número de integrações............................................67
6.1.6 Metodologia final otimizada. Discussão .........................................................68
6.2 Efeito das frações iniciais de DNA SC e Cir nos rendimentos de SSB e DSB.
Resultados e discussão....................................................................................................69
6.2.1 Géis de eletroforese e resultados da quantificação. ........................................69
6.2.2 Análise e discussão dos efeitos do DNA Cir inicial sobre o G(SSB). ............71
6.2.2 Análise e discussão dos efeitos do DNA Cir inicial sobre o G(DSB). ...........73
6.3 Quantificação de danos em amostras irradiadas com gama de
60
Co. .......................75
6.3.1 Géis e resultados da quantificação das amostras com 10 ng/µl de DNA. ......76
6.3.2 Géis e resultados da quantificação das amostras com 50 ng/µl de DNA. ......78
6.3.3 Géis e resultados da quantificação das amostras com 200 ng/µl de DNA. ....80
6.3.4 Géis e resultados da quantificação das amostras com 500 ng/µl de DNA. ....82
6.4 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiação com gama de
60
Co .................84
6.4.1 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 10 ng/µl de DNA................................84
III
6.4.2 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 50 ng/µl de DNA................................85
6.4.3 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 200 ng/µl de DNA..............................86
6.4.4 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 500ng/µl de DNA...............................88
6.4.5 Análise e discussão dos efeitos da concentração de DNA e de scavenger na
produção de SSB e DSB...........................................................................................89
6.5 Quantificação de danos em amostras irradiados com gama de
137
Cs. ......................93
6.6 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiação com gama de
137
Cs. ...............97
6.7 Quantificação de danos em amostras irradiadas com prótons de 10 MeV................100
6.8 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiações com prótons. .......................104
6.9 Comparação de G(SSB) e G(DSB) gerados pela gama de
60
Co,
137
Cs e prótons. ....106
CAPÍTULO 7. CONCLUSÕES............................................................................................111
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS..................................................................................114
APÊNDICES ........................................................................................................................119
APÊNDICE 1 Programa GelAnalis. Descrição. ............................................................120
APÊNDICE 2. Estimação do fator de correção para o Brometo de Etídio. ...................127
APÊNDICE 3. Região e equação de ajuste para o cálculo de G(DSB) .........................129
APÊNDICE 4. Simulação do Irradiador de gama de Cobalto 60. .................................133
APÊNDICE 5. Reagentes e soluções utilizadas no trabalho. .........................................149
1. Introdução
1
1. INTRODUÇÃO
Desde o descobrimento das radiações ionizantes, há mais de um século, os campos de
estudo e aplicação das mesmas têm se desenvolvido enormemente. Tal é o caso da
Radiobiologia. Uma vez conhecida a alta capacidade de penetração da radiação de baixo
poder de ionização, esta começou a ser amplamente utilizada nos diagnósticos médicos.
Por outro lado, por causa do efeito deletério que altas doses podem causar sobre os
tecidos vivos, as radiações são também utilizadas na Radioterapia e na Medicina
Nuclear para o tratamento de tumores. Nestes tratamentos, a radiação interage com o
tumor, destruindo as células malignas ou impedindo que cresçam e se reproduzam, mas
esta ação pode ser exercida também sobre os tecidos sadios afetados durante o
tratamento. Porém, os trabalhos científicos têm demonstrado que os tecidos tumorais
são mais sensíveis à radiação, já que estes não conseguem reparar os danos produzidos
de forma tão eficiente quanto nos tecidos normais, de forma que terminam sendo
destruído e bloqueado seu ciclo celular. Fenômenos como estes têm sido objetos de
estudo da Radiobiologia durante os últimos 50 anos.
Outro importante fenômeno que tem sido amplamente estudado são os efeitos nos
tecidos das radiações ionizantes com diferente Transferência Linear de Energia (LET).
É conhecido que, com o aumento do LET da partícula incidente, a eficiência biológica
relativa (RBE) aumenta até um ponto máximo, e depois começa a decair. Isto
demonstrou a existência de um volume sensível nas células dos tecidos o qual, uma vez
atingido na totalidade, o efeito da radiação não varia com o incremento do número de
danos por unidade de volume que a radiação pode gerar.
Os avanços tecnológicos do século passado permitiram o estudo detalhado dos
componentes celulares e o descobrimento da composição e conformação dos
cromossomos presentes no núcleo celular. Estes avanços também se refletiram nos
estudos da Radiobiologia que conseguiram chegar até níveis de complexidade cada vez
mais baixos para o estudo da interação da radiação com os seres vivos.
As pesquisas em Radiobiologia demonstraram que o DNA representa o alvo biológico
mais sensível dentro da célula. O DNA é encarregado de portar a informação genética
necessária para o controle do metabolismo da reprodução celular. Danos produzidos
nele podem gerar mutações em novas gerações de células ou simplesmente provocar a
1. Introdução
2
morte celular. É por causa disto que o estudo em detalhe do dano das radiações sobre o
DNA é de enorme importância.
Ainda hoje, os mecanismos presentes na interação da radiação ionizante com essa
molécula não são completamente conhecidos. Por isto, um grande número de
experimentos e simulações estão sendo realizados com o objetivo de definir com maior
exatidão os processos presentes nesta interação.
Muitos destes estudos são feitos com DNA in vitro, fora do ambiente celular. Estes
permitem determinar os processos envolvidos na indução de dano num nível mais
simples, em ambiente controlado, e sem a presença de mecanismos de reparo. Nestes
trabalhos são utilizados cromossomos e DNA plasmidial. Destes, o DNA plasmidial,
conformado só por milhares de pares de bases, sem presença de histonas ou outras
estruturas, representam a molécula de mais baixo nível de complexidade para os estudos
dos efeitos radiobiológicos.
O dano produzido pela radiação ionizante na molécula de DNA in vitro pode ser de
diferentes tipos. Estes diferem pela origem, complexidade e seu efeito biológico. O
dano da radiação pode acontecer tanto pela ionização direta do DNA ou pelo ataque de
radicais criados na radiólise da água ao redor dele. Entre os principais tipos de danos no
DNA estão as quebras simples e duplas nas cadeias, e os sítios de múltiplos danos locais
(LMDS, locally multiple damage sites).
As SSBs (single strand break) ou quebra simples da cadeia, representa a ruptura da
continuidade em uma das duas cadeias que conformam a estrutura do DNA. Produzidas
isoladamente, estas podem ser reparadas satisfatoriamente por mecanismos
intracelulares, e não modificam muito a estrutura helicoidal do DNA. De forma geral, as
SSBs não conduzem diretamente à morte celular.
As quebras duplas (DSB, double strand break) são representadas por duas SSBs opostas
localizadas em cada uma das duas cadeias que conformam o DNA. Estas podem ficar
separadas até 10 pares de bases uma da outra. Estes danos são mais difíceis de reparar
que as SSBs. Quando sua reparação é defeituosa esta pode gerar mutações, e nos casos
em que não são reparadas podem provocar a morte celular. As quebras duplas
apresentam um efeito biológico grande.
O termo LMDS foi introduzido por Ward (1994) para referir-se a duas ou mais lesões
pouco espaçadas dentro de duas voltas helicoidais em cadeias opostas do DNA.
Mencionadas também como clustered damage, elas possuem uma estreita vinculação
com o número de ionizações geradas no trajeto da radiação pelo meio e, portanto com a
1. Introdução
3
transferência linear de energia, LET (Lineal Energy Transfer) da radiação [Goodhead,
1994]. Por causa da sua grande complexidade e severidade, estas são muito difíceis de
reparar e representam o pior dano que a radiação pode provocar. O efeito biológico da
LMDS é maior que o da DSB [Goodhead, 1995].
Nos últimos trinta anos, diferentes técnicas de análise de danos em DNA in vitro têm
permitido realizar um grande número de estudos sobre a produção de SSB e DSB no
DNA pela radiação ionizante. De forma experimental, a única LMDS que é possível
detectar com precisão é a DSB. Porém novos métodos utilizando enzimas e programas
de simulação estão permitindo a estimativa dos danos múltiplos LMDS.
Os resultados obtidos com as irradiações de DNA in vitro refletem muitos dos
comportamentos encontrados com a irradiação das células e tecidos. Tal é o caso do
efeito causado nos tecidos pelo incremento da dose depositada pela radiação incidente.
Em irradiações com células encontrou-se que este aumento incrementava a morte
celular. Em irradiações com DNA, o aumento da dose provoca o aumento do número de
SSB e DSB por molécula de DNA, aumentando com isto a probabilidade de apresentar
danos irreparáveis que podem causar a morte celular.
Outro efeito observado com as irradiações de células está vinculado ao LET da partícula
incidente. Para doses iguais, as partículas de maior LET provocam uma maior morte
celular. Nos trabalhos com DNA in vitro, foi encontrado que as radiações de alto LET
produzem uma densidade de ionização ao longo da sua trajetória muito maior que as de
baixo LET. Desta forma, os danos gerados com alto LET estarão mais concentrados ao
redor da trajetória da partícula incidente, causando com isto danos do tipo LMDS que
são muito difíceis de reparar. Porém os danos das radiações de baixo LET são mais
dispersos pelo DNA e têm uma probabilidade maior de serem reparados. Isto explicaria
a diferença entre os efeitos da radiações de baixo e alto LET.
Esta dependência do efeito biológico com o LET foi levada em conta na dosimetria das
radiações com a introdução dos chamados fatores de qualidade utilizados na definição
de dose equivalente. No final, a dose equivalente recebida é resultado da multiplicação
da dose depositada pelo fator de qualidade da radiação. Para radiações com LET
menores ou iguais a 3.5 keV/µm este fator é igual à unidade, podendo chegar até 20
para radiações com mais de 175 keV/µm. Isso indica que, na dosimetria, radiações com
baixo LET, como são os raios-X e radiação gama, possuem os mesmos efeitos
biológicos para as mesmas condições de exposição, e só dependerão da dose depositada.
1. Introdução
4
Uma divergência com respeito a esta afirmação tem sido levantada recentemente, e será
introduzida a seguir.
Durante a última década, vários trabalhos com DNA in vitro têm tentado quantificar a
dependência das quebras com respeito ao LET. Na maioria deles, os estudos comparam
os danos gerados por uma radiação de baixo LET, provenientes de fontes de raios-X,
gama de
60
Co ou de
137
Cs, com irradiações com partículas alfa e íons de diferentes
energias obtidos em aceleradores. Porém, em nenhum deles, é feita uma comparação
quantitativamente rigorosa dos efeitos das radiações gama de baixo LET.
Geralmente, as condições de irradiação, o tipo de DNA e a metodologia utilizada por
cada grupo de trabalho são diferentes uma das outras. Portanto, muitos dos resultados
encontrados apresentam divergências relacionadas a diferenças nas técnicas
experimentais. Até recentemente, as possíveis diferenças entre esses resultados de
irradiações com gama não foram levados em conta e seus efeitos foram considerados
equivalentes. Com o passar do tempo, os novos desenvolvimentos tecnológicos têm
melhorado e produzido ferramentas e metodologias que têm diminuído os erros
associados nestes tipos de experimentos. Por isso, ainda hoje, múltiplas experiências
continuam sendo realizadas para quantificar com precisão a dependência dos danos no
DNA com o LET da partícula incidente.
Num trabalho recente, foi realizado pela primeira vez uma quantificação do efeito
radiobiológico em DNA in vitro entre gamas de fontes de
60
Co e
137
Cs, e prótons de
baixo LET de forma simultânea, com as mesmas condições experimentais [Leloup,
2005]. Neste trabalho, foi encontrada uma diferença entre os efeitos destes três tipos de
radiação que coloca em dúvida as considerações atuais para o cálculo da RBE e dose
equivalente das radiações com baixo LET, segundo a qual o efeito da radiação gama de
60
Co e
137
Cs é considerado equivalente. Os resultados mostraram que as irradiações com
gama de
137
Cs geraram um maior número de SSB e DSB que as irradiações com
60
Co.
Os autores sugerem que esta diferença pode ser causa de diferenças nos espectros de
energias dos elétrons secundários gerados por cada irradiação, mas apontam a
necessidade de maiores estudos dedicados ao tema.
Levando em conta a importância e o interesse para a Radiobiologia que representam a
análise e a quantificação dos danos no DNA in vitro com irradiações de baixo LET, foi
desenvolvido no presente trabalho, um conjunto de experimentos com irradiação de
DNA plasmidial com radiação gama de
60
Co,
137
Cs e prótons de 10 MeV em diferentes
condições. Neste trabalho, todo o DNA utilizado foi preparado, irradiado, e analisado
1. Introdução
5
com os mesmos métodos e procedimentos experimentais. Também foi utilizada uma
técnica de purificação de DNA que visou diminuir a presença de impurezas nas
amostras, melhorando a exatidão dos resultados. Nosso trabalho apresenta também uma
discussão sobre os métodos de quantificação e as mais prováveis fontes de erros na
quantificação das DSB.
A estrutura geral do trabalho foi dividida em três partes: ‘O TEMA’,
‘METODOLOGIA’ e ‘RESULTADOS’.
Na primeira parte, ‘O TEMA’, é descrito no capítulo dois o Estado da Arte sobre o
problema proposto. Nele são mostrados os principais trabalhos realizados na área. A
seguir, no capítulo três, são apresentados os objetivos do trabalho.
Na segunda parte, ‘METODOLOGIA’, expõe-se a teoria e a metodologia desenvolvida
para o estudo. Para isto, no capítulo quatro, são introduzidos os fundamentos teóricos
necessários para a compreensão do trabalho e no capítulo cinco, são detalhados os
materiais e métodos utilizados.
Na terceira parte, ‘RESULTADOS’, são mostrados e discutidos os resultados do
trabalho. De forma que, no capítulo seis, são descritos e discutidos os dados obtidos nas
irradiações com gama de
60
Co, gama de
137
Cs e prótons. As conclusões finais do
trabalho são apresentadas no capítulo sete.
Finalmente, nos apêndices, são incluídos alguns importantes trabalhos e resultados
complementares necessários para o desenvolvimento da pesquisa, e que se colocados no
texto principal, poderiam desviar a atenção do objetivo principal.
Capítulo2. Estado da Arte
6
CAPÍTULO 2. ESTADO DA ARTE.
2.1 Irradiação in vitro de DNA
A irradiação in vitro de DNA é uma metodologia amplamente utilizada para o estudo dos
mecanismos de produção de danos biológicos nos seres vivos. Uma vez demonstrado que
o DNA representa o alvo mais importante dentro da célula, numerosos estudos começaram
a ser realizados neste campo. Os principais objetivos destes trabalhos foram determinar e
quantificar os processos presentes na produção de danos no DNA pela radiação, sua
eficiência de reparação e os efeitos que isto gera nas células.
No início, os trabalhos estudaram a radioquímica do processo de interação das radiações
com o DNA. Uma vez isolado de células ou vírus, o DNA, marcado com carbono 14 ou
outros elementos, era irradiado em diferentes condições. Os danos eram caracterizados por
cromatografia analisando a distribuição e freqüência das espécies derivadas das reações
químicas com o DNA [Teoule et al. 1974, Dizdaroglu et al. 1975 e 1976, Stelter et al.
1975, Lafleur et al., 1975, Ryznar et al. 1975, Hissung et al. 1978, Ward et al. 1978]. Estes
trabalhos apresentaram importantes avanços na compreensão e determinação dos processos
químicos durante a radiólise do DNA.
Outros trabalhos dirigiram os esforços no estudo da dependência da produção de quebras
simples e duplas no DNA em função da dose e sua relação com a inativação das células
[Block et al. 1973, van der Schans 1973 e 1978, Lafleur et al. 1979]. Nestes estudos foram
utilizados DNA de bacteriófagos, que modificam sua forma de acordo com tipo de quebra
produzido pela radiação. Nestes trabalhos foi mostrado que o plasmídeo de DNA,
inicialmente em forma circular superenovelado passa à forma circular relaxado com a
indução de uma SSB, enquanto que a geração DSB, tanto na molécula circular
superenovelada como na circular relaxada, leva o plasmídeo de DNA à forma linear [van
der Schans 1969, 1973 e 1978]. Estes primeiros trabalhos foram realizados analisando os
plasmídeos de DNA irradiado em gradientes de sacarose. Porém, a centrifugação em
gradientes de sacarose mostrou um baixo poder de separação, especialmente para o DNA
em forma circular relaxada e linear. Isto fez com que inicialmente só fossem quantificados
os rendimentos de quebras relacionados com o DNA circular superenovelado.
Com a introdução da técnica de eletroforese em gel de agarose nos estudos de interação da
radiação com o DNA, foi possível a separação dos plasmídeos de DNA em circular
relaxado e linear e, portanto, a análise das quebras duplas em função da dose. Duas
Capítulo2. Estado da Arte
7
técnicas eram utilizadas para a quantificação dos plasmídeos de DNA no gel: a
espectrometria e fluorescência do corante Brometo de Etídio. Na espectrometria, a região
do gel com as três conformações de DNA era escaneada com luz UV de 260 nm e 310 nm.
O padrão a 260 nm indicava a presença de DNA e o padrão de 310 nm era considerado
como fundo. Subtraindo um do outro era possível quantificar as frações das moléculas em
cada forma [Provrik et al.1977, Chiu and Oleinick 1980, van Touw et al. 1985, Yamamoto
et al. 1985]. O principal problema desta técnica eram os altos níveis de fundo que
apresentavam. Na técnica de eletroforese com Brometo de Etídio, uma câmara fotográfica
capta a fluorescência do Brometo de Etídio ligado ao DNA submetido à luz UV de 254
nm. Neste caso os níveis de fundo são muito menores, porém existia o inconveniente da
dependência da ligação do Brometo com a forma do DNA [Lloyd et al. 1978, Hempel and
Mildenberger 1987]. No entanto, a introdução desta técnica melhorou muito a detecção de
SSB e permitiu a estimativa da probabilidade de indução de DSB.
Neste período, diferentes modelos tentaram descrever de forma matemática ou estatística
os padrões encontrados de quebras em função de dose e seus efeitos nas células [Freifelder
and Trumbo 1969, Block and Loman 1973, van der Schans 1978, van Touw 1985, Cowan
et al. 1987, 1990, Mark 1989]. Porém, nestes modelos, não foram considerados os danos
complexos que a radiação podia causar no DNA intracelular. Em vários trabalhos, Ward e
Goodhead sugeriram a existência de mecanismos que provocariam danos complexos no
DNA (LMDS, conhecido também como clustered damage). Estes seriam gerados pelo
ataque múltiplo numa região do DNA de radicais derivados da radiólise da água [Ward
1981, 1985, 1988, 1994a, 1994b, Goodhead 1994, 1995]. Estes trabalhos evidenciaram
uma possível relação entre a produção de LMDS, o LET da radiação, a capacidade de
scavenger da solução e seus efeitos biológicos. Os danos complexos deveriam ser mais
difíceis de serem reparados e provocariam mutações genéticas ou a morte celular.
Radiações de alto LET deveriam gerar uma maior densidade de radicais ao longo da sua
trajetória aumentando a probabilidade de produção de DSB e LMDS [Goodhead 1994,
1995]. Da mesma forma, o aumento da capacidade de captura de radicais ao redor do DNA
(scavenging capacity) deveria diminuir a produção dos danos no DNA.
Estas considerações provocaram a realização de numerosos experimentos de irradiação de
DNA em diversas condições a partir da década de noventa. O objetivo principal era a
quantificação das SSB e DSB em função das características do DNA, tipo de radiação
incidente e propriedades do meio.
Capítulo2. Estado da Arte
8
Entre os trabalhos mais relevantes está o estudo comparativo de irradiação de DNA com
nêutrons rápidos e gama, feito por Spotheim-Maurizot [Spotheim-Maurizot et al. 1990] no
qual começam a ser mostradas e quantificadas as diferenças nos mecanismos de produção
de quebras por radiações de diferentes LET. Ao mesmo tempo, Roots [Roots et al. 1990],
fez uma extensa revisão sobre a formação de quebras induzidas por feixes de partículas
altamente ionizantes (alto LET). O objetivo era comparar a produção de quebras em DNA
in vitro (minicromossomos) com as geradas no DNA celular. No estudo foram feitas
irradiações com núcleos de baixa energia que cobriam um espectro de Z desde o Helio até
o Urânio (LET de 16 keV/um até 1.6E5 keV/um). Estes foram comparados com
irradiações de baixo LET feitas com raios-X e raios gama de
60
Co. Os resultados de
produção de quebras em função do LET mostraram que também dependem do tipo de
núcleo utilizado e que diminuíam com o aumento do LET para cada íon. Isto indicava que
o LET não poderia ser o único parâmetro para caracterizar a produção de quebras no DNA.
Outra revisão mais extensa sobre este assunto foi feita anos depois por Taucher-Scholz e
Kraft [Taucher-Scholz and Kraft 1999], que utilizaram também partículas altamente
energéticas para irradiar plasmídeos de DNA em solução aquosa. Estes autores
compilaram uma extensa base de dados sobre a produção de SSB e DSB em função da
qualidade da radiação. O trabalho cobriu a faixa de LET entre 5 a 16000 keV/µm,
utilizando diferentes partículas (desde Helio até Urânio). Os resultados mostraram que a
produção dos danos depende da densidade dos eventos de ionização no caminho da
partícula, o que pode favorecer a produção de DSB, mas também as reações de
recombinação dos radicais. Outro fenômeno importante é a dependência com a velocidade
da partícula. Para íons altamente pesados, as seções de choque de produção de SSB e DSB
diminuíam com a velocidade para partículas com um mesmo LET. Estes trabalhos
mostram grande dependência da produção das quebras do padrão de ionização gerado no
caminho da radiação no meio aquoso.
Como mencionado no parágrafo anterior, na análise teórica da interação da radiação com o
DNA foram introduzidas técnicas de Monte Carlo para simular a produção dos eventos
físicos e químicos presentes na ionização dos meios aquosos ao longo do caminho das
partículas e seu efeito sobre o DNA. Diversos códigos de simulação foram gerados para a
modelação desta interação, como indicado na tabela 2.1 [Nikjoo et al. 2001].
Capítulo2. Estado da Arte
9
Tabela 2.1 Códigos de simulação de transporte de radiações em radiobiologia [Nikjoo et al. 2001]
Código Meio Partícula Energia Referencia
ATRACK todos e- & íons até GeV Buttd and Katz 1967
MOCA8 água (v, l) e- 10eV-100keV Paretzke 1987
OREC água (l) e- 10eV- 1 MeV Turner et al. 1983
p, alfa 0.3-4 MeV/u
STBRGEN água (l) e- 0.1-2 kEV Chatterjee and Holley 1993
íons 0.3- GeV
CPA100 água (l) e- 10eV-100 keV Terrissol and Beaudre 1990
DELTA água (v, l) e- 10eV -100 keV Zaider et al. 1983
p, alfa 0.3-4 MeV
ETRACK água (v) e- 10eV-10 keV Ito 1987
TRION água (v, l) e- 10eV-1 MeV Lappa et al. 1993
p, alfa 0.3- 4 MeV
KURBUC água (v) e- 10 eV-10 MeV Uehara et al. 1993
TRACEL água (v, l) e- 10 eV-1 MeV Tomita et al. 1997
PARTRAC água (v, l) e-, p & íons 0.3-GeV Dingfelder et al. 1998
MOCA14 água (v) p &alfa 0.3- 4 MeV Wilson and Nikjoo 1981
PITS Biológico íons 0.3-GeV, MeV/u Wilson and Nikjoo 2000
LEPHIST Água p 1keV-1MeV Uehara et al. 2001
Alguns dos códigos anteriores foram adaptados para o estudo da produção de quebras no
DNA. Tais são os casos dos códigos: ATRACK, PITS (derivado da série MOCA) e
PARTRAC. Cada um utiliza diferentes métodos e modelagens do DNA. Dentro deles um
dos mais utilizados é o código PARTRAC, que tem sido amplamente implementado nos
últimos anos para o estudo da interação com o DNA [Friendland et al. 1995, 1997, 1998,
1999, 2002, 2003, 2005]. Este código possibilita a simulação do transporte de elétrons,
fótons, prótons e íons em células e quantificar os prováveis danos diretos e indiretos no
DNA. Esse código incorpora um modelo realista do DNA no nível atômico, conseguindo
descrever completamente o genoma celular. No entanto, os parâmetros que são utilizados
neste e em outros códigos são ajustados a dados experimentais obtidos de irradiações de
DNA e células com radiação gama. Para isto, o PARTRAC trabalha com três níveis
diferentes de organização do DNA. Estes são: DNA linear (plasmídeos),
minicromossomos (SV40) e cromatina compacta (DNA celular). Os resultados
encontrados com este código descrevem relativamente bem os dados experimentais de
irradiação com gama destes três tipos de DNA, apesar das oscilações que os dados
apresentam [Vavolta et al. 2003].
Paralelamente ao desenvolvimento destes códigos, os estudos experimentais continuam
obtendo diversos dados sobre a interação das radiações ionizantes com o DNA em
Capítulo2. Estado da Arte
10
diferentes condições. Estes resultados são continuamente utilizados para o ajuste e
comparação destes códigos de simulação. Entre estes experimentos, existe uma linha que
estuda os efeitos das radiações sobre o DNA plasmidial. A principal diferença do DNA
plasmidial com respeito ao DNA minicromossomal está na estrutura no nível molecular. O
plasmídeo representa uma estrutura mais simples e pequena, sem a presença de histonas.
Isto faz com que o DNA plasmidial seja mais sensível aos efeitos da radiação [Vavolta et
al. 2003].
Diversos trabalhos têm estudado os rendimentos de produção de quebras simples e duplas,
G(SSB) e G(DSB), em DNA plasmidial com diferentes tipos de plasmídeos, radiações e
capacidade de captar radicais livres (capacidade de scavenging). A partir dos anos noventa,
uma grande quantidade de dados obtidos com irradiações de DNA plasmidial e
minicromossomal, irradiados com gama de
137
Cs e núcleos de Hélio, foram relatados pelo
grupo de Milligan [Milligan et al. 1993a, 1993b, 1996a, 1996b, Jones et al. 1993, 1994].
Nestes trabalhos, foram estudadas principalmente duas dependências: uma relacionando os
rendimentos de quebras do DNA in vitro com a concentração e o tipo de plasmídeo
utilizado, e a outra caracterizando o efeito do tipo de scavenger utilizado e sua capacidade
de scavenging na solução (concentração) sobre a produção de quebras no DNA. Os
resultados obtidos nestes trabalhos foram de extrema importância para a caracterização das
constantes de reação do radical hidroxila (*OH) com o DNA. Estes parâmetros foram
encontrados aplicando sobre os dados modelos cinéticos não homogêneos e muitos deles
são utilizados atualmente nos códigos de simulação mencionados anteriormente. Estes
trabalhos apresentaram os primeiros estudos do efeito do LET sobre o DNA plasmidial
utilizando γ de
137
Cs e núcleo de Hélio, mostrando que inclusive nesse nível de
simplicidade da molécula de DNA, a densidade de ionização no caminho da partícula
incidente pode ter uma influência muito importante.
Outros autores também utilizaram o DNA plasmidial para seus estudos de interação das
radiações com o DNA. Tal é o caso de Klismczak [Klimczak et al. 1993] que mediu os
rendimentos do número de SSB e DSB (G(SSB) e G(DSB)) gerados por radiação gama de
60
Co em função da concentração de scavengers *OH, utilizando misturas de água e álcool.
Neste trabalho, observou-se que estes rendimentos eram proporcionais à dose e que as
quebras letais diminuíam com o aumento da capacidade de scavenging. Outros trabalhos
estudaram a produção de quebras simples e duplas em plasmídeos induzidos por raios-X
do Al
k
e partículas alfa [Fulford et al. 2001]. Eles encontraram concordância entre os
resultados experimentais e as simulações. Porém, obtiveram uma diferença sistemática
Capítulo2. Estado da Arte
11
duas ou três vezes maior, para as simulações de DSB com respeito aos dados
experimentais.
Uma das principais limitações do trabalho com DNA plasmidial está na sua
radiosensibilidade a impurezas presentes no meio. Estas impurezas são introduzidas nos
processos de purificação do DNA. Entre estas impurezas estão às substâncias captadoras
de radicais, que chamaremos neste trabalho de scavengers. A presença de pequenos restos
de estas substâncias na solução pode variar a capacidade de scavenging do meio e
provocar variações nos resultados obtidos. Este fenômeno representa a principal causa pela
qual a maioria das irradiações de DNA é feita com capacidades de scavenging muito
superiores à das possíveis impurezas, dando uma maior estabilidade aos resultados obtidos
[Milligan et al. 1993]. Por esta razão, os avanços nas técnicas de purificação e na
metodologia de análise dos danos fazem com que os resultados de irradiações de
plasmídeos estejam continuamente sendo estudados e melhorados. De forma paralela,
vários trabalhos se voltam para o estudo das deficiências do processo de quantificação dos
danos por gel de eletroforese para obter melhoras na metodologia [Kusukawa et al. 1999,
Shuterland et al. 2001, Miller et al. 2001, White et al. 2001]. As mudanças e cuidados
sugeridos por estes grupos permitem aumentar a precisão e confiabilidade dos resultados
obtidos.
Atualmente, muitos grupos continuam dirigindo seus esforços ao estudo do efeito de
radiações de diferentes LET sobre o DNA plasmidial [Milligan et al. 2001, Brons et al.
2003, Zhao et al. 2003, Cassou et al. 2005, Culard et al. 2005, Konishi et al. 2005]. Muitos
deles dedicam-se ao efeito de radiações de alto LET como prótons e partículas alfa por
causa da crescente utilização desses tipos de radiações nos tratamentos contra o câncer. Os
resultados desses grupos têm sido comparados com os de irradiações de baixo LET para
caracterizar diferenças nos danos gerados por cada um deles [Collins et al. 2005, Leloup
2005, Tsoulou et al. 2005, Usami et al. 2005].
Recentemente, foram publicados resultados comparativos de produção de SSB, DSB e
clustered damage de DNA plasmidial irradiado com partículas de alto e baixo LET
[Leloup et al. 2005]. Nesse trabalho foram utilizados prótons de 1.03, 19.3 e 249 MeV
(25.5, 2.7, e 0.39 keV/um), núcleo de Helio de 26 MeV (25.5 keV/um) e raios gama de
60
Co e
137
Cs. Foi utilizado DNA plasmidial em soluções com duas capacidades de
scavenger diferentes. Este trabalho foi o primeiro a quantificar os efeitos radiobiológicos
em DNA plasmidial in vitro com radiações gama de
60
Co,
137
Cs, e prótons de baixo LET.
Os resultados mostraram uma diferença entre os danos produzidos pelas diferentes
Capítulo2. Estado da Arte
12
radiações gama. Em geral, os rendimentos obtidos para as irradiações com
60
Co foram
menores que para aquelas com
137
Cs e com prótons de 249 MeV. A explicação sugerida
para este fenômeno foi associada a estrutura dos caminhos destas radiações. O espectro de
energia dos elétrons secundários emitidos durante a passagem de cada uma delas pelo meio
é diferente, e portanto, os efeitos provocados também são diferentes [Leloup et al. 2005].
Ainda nesse trabalho é discutida a possível conseqüência desta diferença nos efeitos das
radiações gamas de
60
Co e
137
Cs nos cálculos de RBE. As atuais considerações que são
feitas comparando os efeitos dos diferentes raios gama do
60
Co e o
137
Cs como
equivalentes não seriam precisas e, portanto a conclusão foi que este fenômeno deve ser
medido mais sistematicamente e caracterizado com uma maior exatidão.
Nas tabelas 2.2 e 2.3 apresentamos uma série de dados de irradiações de plasmídeos
encontrados na literatura. Estes foram resultados de estudos que comparavam radiação de
alto e baixo LET. Com exceção do trabalho de Leloup e seus colaboradores (2005), os
outros trabalhos só realizaram irradiações ou com radiação gama de
60
Co ou de
137
Cs, uma
vez que as incertezas nos métodos não mostravam diferença entre estes tipos de radiações.
Tabela 2.2 Compilação de dados de irradiações de DNA plasmidial com gama de
60
Co.
Gama de
60
Co (LET 0.267 keV/µm)
Referência DNA (pb
‡
)
Conc.
[ng/µl]
Scavenger
S.Capac
*
.
[1/s]
SSB
[1/GyDa
†
]
DSB
[1/GyDa
†
]
Root et al.. 1990
SV40 DNA
(5243)
20 Tris-HCl, MgCl2 1.2E+06 2.3E-08 7.0E-10
O´Neill et al.. 1997 Tris-Hcl, Etanol 6.0E+08 4.0E-10 1.0E-11
Klimczak et al. 1993 pBR322 100 sem scavenger 6.5E+05 7.5E-08 2.3E-09
Tris+EDTA 1.9E+07 6.8E-09 5.1E-11
3.1E+07 6.5E-09 7.0E-11
Glicerol, Tris,
EDTA
8.8E+07 - 1.7E-11
2.21E+08 1.31E-09 8.54E-12
6.0E+08 5.6E-10 6.5E-12
9.8E+08 4.4E-10 4.3E-12
1.93E+09 3.78E-10 3.79E-12
5.75E+09 1.88E-10 3.14E-12
Leloup et al. 2005
pHAZE
(10327)
1000 Glicerol 3.8E+06 8.5E-09 1.6E-10
3.8E+08 5.5E-10 2.7E-11
‡ pares de bases (pb), † Dalton(Da)= 1.66E-27 kg. * scavenging capacity (S. Capac.).
Capítulo2. Estado da Arte
13
Tabela 2.3 Compilação de dados de irradiações de DNA plasmidial com gama de
137
Cs.
Gama de
137
Cs (LET 0.395 keV/µm)
Referência DNA (pb
‡
)
Conc.
[ng/µl]
Scavenger
S.Capac
*
.
[1/s]
SSB
[1/GyDa
†
]
DSB
[1/GyDa
†
]
Milligan et al. 1993a
pUC18
(2686)
20 DMSO 3.80E+06 1.8E-08
100 1.0E-08
500 1.2E-08
900 1.1E-08
1500 1.0E-08
SV40
(5243)
10 DMSO 3.8E+06 1.5E-08
50 1.2E-08
150 6.0E-09
200 1.0E-08
250 1.2E-08
300 1.3E-08
pEC
(10810)
50 DMSO 3.8E+06 5.2E-09
100 1.0E-08
2500 5.2E-09
Jones et al. 1993
SV40
(5243)
833 DMSO 5.7E+06 5.0E-09 8.5E-11
5.7E+07 9.0E-10 1.1E-11
3.8E+08 2.0E-10 5.0E-12
3.8E+09 1.0E-10 3.0E-12
7.6E+09 8.0E-11 2.0E-12
SV40
(5243)
1024 DMSO 3.8E+06 2.6E-10 6.0E-12
Milligan et al. 1996
pUC18,
pEC
500 DMSO 3.8E+05 5.0E-08 4.0E-10
4.0E-08 7.5E-11
3.8E+06 1.2E-08 1.1E-10
3.8E+07 3.0E-09 9.0E-12
3.8E+08 6.0E-10 6.0E-12
3.8E+09 2.0E-10 8.0E-13
Leloup et al. 2005
pHAZE
(10327)
1000 Glicerol 3.8E+06 1.8E-08 3.1E-10
3.80E+08 1.0E-09 2.00E-11
pEC
(10810)
50 DMSO 3.8E+06 5.2E-09
100 1.0E-08
2500 5.2E-09
‡ pares de bases (pb), † Dalton(Da)= 1.66E-27 kg. * scavenging capacity (S. Capac.).
Os dados de forma geral mostram uma diminuição na produção de SSB e DSB com o
aumento da capacidade de scavenging. Para irradiações com
60
Co, as SSB vão de 7.5E-8
Capítulo2. Estado da Arte
14
Gy
-1
Da
-1
até 1.9E-10 Gy
-1
Da
-1
para capacidades de scavenging de 6.5E5 s
-1
e 5.8E9 s
-1
,
respectivamente [Klimczak et al. 1993]. Para as irradiações com
137
Cs, temos desde 5.0E-8
Gy
-1
Da
-1
até 2.0E-10 Gy
-1
Da
-1
para capacidades de 3.8E5 s
-1
e 3.8E9 s
-1
, respectivamente
[Milligan et al. 1996]. É importante salientar nestes dados que as ordens de grandeza são
similares entre os tipos de irradiações, porém existem muitas incertezas que não permitem
definir diferenças entre elas.
O mencionado no parágrafo anterior é mostrado nas figuras 2.1 e 2.2. Os G(SSB) e
G(DSB) são representados em função da capacidade de scavenging da solução. È possível
notar grande flutuação entre os diversos experimentos, o que pode ser causado pelas
diferenças entre as metodologias utilizadas em cada experimento.
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7
G(SSB)[Gy
-1
Da
-1
]
capacidade de scavenging [s
-1
]
dados: γ of
60
Co
Root 1990 (SV40)
O´Neill 1997
Klimczak 1993 (pBR322)
Leloup 2005 (pHAZE)
dados:
γ of
137
Cs
Milligan 1993a (pUC18)
Milligan 1993a (SV40)
Milligan 1993a (pEC)
Jones 1993 (SV40)
Milligan 1996 (pUC18, pEC)
Leloup 2005 (pHAZE)
Figura 2.1 Rendimentos de produção de quebras simples em plasmídeos irradiados com
gama de
60
Co e
137
Cs (Tabela 2.2 e 2.3).
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-14
10
-13
10
-12
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7
G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
capacidade de scavenging [s
-1
]
dados: γ of
60
Co
Root 1990 (SV40)
O´Neill 1997
Klimczak 1993 (pBR322)
Leloup 2005 (pHAZE)
dados:
γ of
137
Cs
Jones 1993 (SV40)
Milligan 1996 (pUC18, pEC)
Leloup 2005 (pHAZE)
Figura 2.2 Rendimentos de produção de quebras duplas em plasmídeos irradiados com gama
de
60
Co e
137
Cs (Tabela 2.2 e 2.3).
Capítulo2. Estado da Arte
15
O presente trabalho de tese concentra-se no estudo do efeito das radiações de baixo LET
de gama de
60
Co e
137
Cs com o objetivo de caracterizar esta interação e as possíveis
diferenças reportadas na literatura. Irradiações com prótons de 10 MeV serão também
realizadas e analisadas no mesmo contexto. As irradiações são feitas com o mesmo tipo de
DNA nas mesmas condições e com a mesma metodologia, para melhor caracterizar a
interação das diferentes radiações com o DNA.
Capítulo3. Objetivos
Tese de Doutoramento. Felix Mas (11/04/2006)
16
CAPÍTULO 3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
1. Realizar um estudo in vitro do efeito das radiações de baixo LET,
especificamente gama de
60
Co e de
137
Cs, sobre o DNA plasmidial.
2. Medir e comparar com o efeito radiobiológico gerado por prótons de um LET
maior.
3. Analisar os Efeitos Biológicos Relativos (RBE) destas três radiações.
4. Determinar se existe alguma diferença a nível molecular para o RBE entre as
radiações de baixo LET.
3.2 Objetivos específicos
1. Desenvolvimento e otimização de uma técnica para a quantificação dos danos
produzidos no DNA pela radiação ionizante.
2. Realizar irradiações de DNA plasmidial com gama de
60
Co em diferentes
concentrações de scavenger e de glicerol para estudar os efeitos destes
parâmetros na produção de quebras simples e duplas.
3. Realizar irradiações de DNA com gama de
137
Cs nas mesmas capacidades de
scavenging no caso do
60
Co.
4. Realizar irradiações de DNA com prótons de 10 MeV nas mesmas condições
que nos dois casos anteriores.
5. Determinar os rendimentos das produções de SSB e DSB para as irradiações
com radiação gama de
60
Co, de
137
Cs e prótons de 10 MeV.
6. Finalmente, analisar os resultados e determinar as características dos efeitos
produzidos por estas três radiações sobre o DNA plasmidial in vitro.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
17
CAPÍTULO 4. FUNDAMENTOS TEÓRICOS.
4.1 Interação das radiações ionizantes com a matéria
A radiação ionizante se caracteriza por sua capacidade de excitar e ionizar os átomos do
meio com o qual interage. Exemplos de radiações ionizantes são os raios-X, radiação
gama, elétrons rápidos, partículas carregadas pesadas (prótons, deuterons e íons) e
nêutrons. Pela natureza de interação, as radiações podem se classificar em radiações
indiretamente ionizantes e diretamente ionizantes. A primeira denominação é aplicada
no caso de partículas eletricamente neutras cujas interações são principalmente por
colisões ou interações com os núcleos dos átomos do meio. A segunda é aplicada ao
caso de partículas carregadas eletricamente, as quais interagem com o campo
eletromagnético dos átomos.
4.1.1 Radiação indiretamente ionizante
Radiações indiretamente ionizantes, como os fótons, possuem um grande número de
possíveis mecanismos de interação com a matéria. Os mecanismos predominantes são
descritos a seguir:
Efeito fotoelétrico
No efeito fotoelétrico o fóton incidente é completamente absorvido pelo átomo alvo e
em seu lugar é liberado um elétron de uma de suas camadas externas. Esta interação é
feita com o átomo todo e não com elétrons livres.
A energia cinética do fotoelétron liberado é dada por:
b
EhT
−
=
ν
[4.1]
Aqui hν e a energia do fóton incidente e E
b
a energia de ligação do fotoelétron no
átomo. O átomo ionizado rapidamente, completa o buraco na camada ou com um
elétron livre do meio ou fazendo um rearranjo dos elétrons das outras camadas, gerando
assim um ou mais raios-X característicos. Em geral, estes raios-X são reabsorvidos
perto do ponto de origem. Em outros casos, a emissão de um elétron Auger carregando
a energia atômica de excitação substitui o raio-X característico.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
18
A ocorrência do efeito fotoelétrico é predominante para baixas energias do raio gama
incidente. Meios com alto número atômico Z possuem maior probabilidade para esta
interação. De forma aproximada uma expressão analítica para a seção de choque do
efeito fotoelétrico seria:
3
.
γ
τ
E
Z
Const
n
×≅
[4.2]
onde E
γ
representa a energia do raio gama. A potencia n varia entre 4 e 5 dentro da
região de energia de interesse para raios gama.
Efeito Compton
No efeito Compton, ou interação incoerente, é a interação do fóton incidente que ocorre
com elétrons fracamente ligados. O fóton é desviado um ângulo θ da sua direção
original, transferindo parte da sua energia ao elétron de recuo. O angulo de
espalhamento pode ter qualquer valor, e a energia transferida ao elétron varia de zero a
grandes frações da energia inicial do raio gama.
A relação entre o ângulo de espalhamento θ e a energia final do fóton obtida a partir das
leis de conservação da energia e o momento, e dada por:
()
θ
ν
ν
ν
cos11
2
−+
=
′
cm
h
h
h
o
[4.3]
onde hν é a energia do fóton incidente e hν´ a energia do fóton espalhado. O termo m
o
c
2
corresponde à massa em repouso do elétron (0.511 MeV).
A probabilidade de ocorrência do espalhamento Compton por átomo (σ
c
), depende do
número de elétrons disponíveis como alvos de espalhamento e portanto aumenta com Z.
Produção de Pares
A produção de pares é energeticamente possível para os casos onde a energia do raio
gama excede duas vezes a massa em repouso do elétron (1.02 MeV). A interação tem
lugar no campo coulombiano do núcleo e na realidade só para raios gama de altas
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
19
energias é que esta interação é predominante. Nesta interação o fóton é absorvido e
substituído por um par elétron– positron com energias cinéticas T- e T+
respectivamente.
A energia cinética media recebida em cada produção é:
2
022.1 MeVh
T
−
=
ν
[4.4]
Depois de freado o positron é aniquilado no meio e dois fótons de aniquilação são
gerados como produtos secundários da interação. Não existe uma expressão simples
para a probabilidade da produção de pares pelos núcleos (κ), mas sua magnitude varia
aproximadamente com o quadrado do número atômico Z do meio.
Coeficiente de atenuação linear
Todas estas formas de interação fazem com que o fóton tenha uma probabilidade de
interação µ com o meio em função do caminho percorrido, da energia e o meio que
atravessa, chamada coeficiente de atenuação linear. Esta probabilidade pode ser
determinada conhecendo as probabilidades de interação τ, σ
c
, κ
correspondente com os
efeitos fotoelétrico, Compton, produção de pares e Rayleigh respectivamente, obtendo:
σ
τ
µ
+
+
=
c
[4.5]
Assim o número de fótons transmitidos I, num material de espessura t, de uma
quantidade inicial I
o
será:
t
o
eII
⋅−
=
µ
[4.6]
Esta equação só é valida para uma boa geometria e para um feixe estreito. Na figura
4.1a é mostrada a dependência energética do coeficiente de atenuação linear para os
diferentes processos de interação dos fótons com os meios.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
20
(a) (b)
Figura 4.1 (a) Dependência energética do coeficiente de atenuação linear em função da energia. (b)
Predomínio dos efeitos fotoelétrico, Compton e produção de pares em função da energia e do número
atômico.
O predomínio de uma interação sobre outra depende em geral da energia do fóton e o Z
do material. A figura 4.1b mostra as regiões predominantes de cada tipo de interação.
O coeficiente de atenuação linear é limitado por sua variação com a densidade do meio.
Assim, é mais comum à utilização do coeficiente de atenuação de massa. Esse
coeficiente é definido como
ρ
µ
, onde
ρ
é a densidade do meio. A figura 4.2, mostra a
dependência do coeficiente de atenuação de massa em função da energia do fóton para
diferentes materiais. Para uma energia do fóton dada o coeficiente de atenuação de
massa sempre será o mesmo independentemente do estado físico do meio (líquido,
sólido ou gasoso).
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
21
Figura 4.2 Dependência do coeficiente de atenuação de massa em função da energia do fóton para
diferentes materiais
Para o caso de compostos mistos o coeficiente pode ser calculado como:
∑
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
=
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
i
i
i
m
w
ρ
µ
ρ
µ
[4.7]
onde o fator w
i
representa a fração de massa do elemento i na mistura ou no composto
químico. Com isto a quantidade de fótons transmitidos num material de espessura t e
densidade
ρ
e para boa geometria é
t
o
eII
⋅
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−
⋅=
ρ
ρ
µ
[4.8]
4.1.2 Radiação diretamente ionizante
O mecanismo de interação das partículas carregadas é diferente das neutras. Neste caso,
o campo elétrico coulombiano da partícula carregada interage continuamente em todo o
caminho percorrido por elas com o campo dos elétrons orbitais do meio. Em
dependência da proximidade do encontro com os elétrons, o impulso transmitido pela
partícula carregada pode excitar o elétron a uma camada superior do átomo (excitação)
ou removê-lo completamente do átomo (ionização). A velocidade da partícula incidente
é diminuída em cada processo de interação por causa da transferência de energia ao
elétron. A energia máxima que uma partícula carregada de massa m e energia E pode
transferir para um elétron de massa m
o
numa colisão simples é 4Em
o
/m. Isso representa
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
22
uma perda de energia pequena por colisão e implica em que a partícula primária
transfira sua energia inicial após muitas interações durante sua passagem pelo meio até
a parada total. Isto junto com o fato de que estas interações eletromagnéticas acontecem
em todas as direções faz com que as trajetórias das partículas carregadas pesadas
mantenham-se praticamente retas ao longo do seu passo pelo meio (exceto no seu ponto
final).
Os principais produtos da interação das partículas carregadas são átomos excitados e
pares de íons. Os pares de íons são formados pelo elétron livre e o íon positivo gerado
do átomo com o elétron removido. Em algumas interações os elétrons tirados dos
átomos podem escapar com energia cinética suficiente para provocar outras ionizações
através do mesmo mecanismo. Estes elétrons são denominados raios delta (delta rays) e
representam a forma indireta de como a energia das partículas carregadas é transferida
ao meio.
O poder que os diferentes meios possuem para interagir com as partículas carregadas
pode ser avaliado através do poder de freamento (Stopping Power). O poder de
freamento linear S é definido como o diferencial de energia perdida pela partícula
dentro do material por diferencial de comprimento do caminho,
dx
dE
S −= , [4.9]
O valor –dE/dx ao longo do caminho é chamado perda especifica de energia (specific
energy loss) ou taxa de perda de energia. A formula de Bethe representa uma expressão
clássica que a descreve:
NB
vm
ze
dx
dE
o
2
24
4
π
=− , [4.10]
onde
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
−
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−−≡
2
2
2
2
2
1ln
2
ln
c
v
c
v
I
vm
ZB
o
[4.11]
Nesta expressão, v e
ze são a velocidade e a carga da partícula primária, N e Z são o
número de átomos e o número atômico do átomo do meio, m
o
a massa em repouso do
elétron, e e a carga do elétron. O parâmetro I representa o potencial médio de excitação
e ionização do meio que é determinado experimentalmente para cada elemento. Para
partículas carregadas não relativistas (v<<c), somente o primeiro termo de B é
significativo. Esta equação é valida para diferentes tipos de partículas cujas velocidades
permaneçam grandes se comparadas com as velocidades dos elétrons orbitais.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
23
Da expressão é possível inferir que, para uma partícula não relativista -dE/dx varia
como 1/v
2
ou o inverso da energia cinética. Também que, partículas incidentes com
maior carga, ou materiais com maior número atômico e altas densidades, produzirão
uma maior perda específica de energia. A expressão de Bethe deixa de ser aplicável
para partículas com baixas energias, onde aumenta a probabilidade de troca de carga
entre a partícula e o meio, podendo se neutralizar a carga com a captura de elétrons.
A perda especifica de energia para partículas carregadas em função da distancia de
penetração tem um comportamento muito característico, é conhecida como curva de
Bragg. Inicialmente -dE/dx aumenta com a perda de energia como 1/E até um máximo,
e no final a curva cai a zero devido a redução da carga pela captura de elétron.Na figura
4.3, observa-se o perfil traçado pela deposição de energia em função da penetração no
meio, denominado pico de Bragg.
Figura 4.3 Exemplos de transferência linear de energia em função da distancia de penetração em tecido
para vários íons mostrando os picos de Bragg característicos.
Casos em que a partícula atravessa um meio com pequena espessura e só parte da sua
energia inicial é depositada, esta pode ser calculada como:
t
dx
dE
E
médio
⋅
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−=∆
[4.12]
onde t é a espessura do material e (-dE/dx)
médio
é a perda especifica média de energia da
partícula nesse meio. Se a perda de energia é pequena esta pode ser aproximada ao valor
tabulado para a energia da partícula incidente. Nos casos em que isto não acontece o
método de obtenção não é simples e devem ser levadas em conta outras considerações
para o cálculo da perda da energia cinética inicial.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
24
Nestes casos é utilizado o conceito de alcance que define o alcance médio que uma
partícula com energia inicial E
o
pode penetrar num determinado meio. Este parâmetro é
calculado em função da perda de energia, -dE/dx, como:
∫
−
=
o
E
dxdE
dE
R
0
)(
[4.13]
Em ocasiões o alcance ou a perda específica de energia para materiais feitos de misturas
ou compostos químicos não estão disponíveis. Nestes casos a regra de Bragg-Kleeman
pode ser aplicada e o termo –dE/dx por átomo da mistura será:
∑
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−=
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
−
i
i
i
i
m
m
dx
dE
N
W
dx
dE
N
11
[4.14]
Onde N é a densidade atômica, W
i
representa a fração atômica do i-ésimo componente
na mistura (subscrito m).
Assim, conhecendo o alcance em todos os materiais constituintes o alcance pode ser
achado como:
()
∑
=
i
iii
m
m
RAn
M
R [4.15]
onde R
i
é o alcance no elemento i, n
i
é o número de átomos por elemento i na molécula,
A
i
é o peso atômico do elemento i, e M
m
o peso molecular do composto.
4.1.3 Deposição macroscópica de energia. Dose e LET.
Para a medição do efeito produzido pela radiação ionizante a nível macroscópico se
utiliza o conceito de dose. A dose corresponde ao valor esperado de energia depositada
pela partícula incidente na matéria por unidade de massa pontual. Sua unidade no
sistema internacional é o Gray (Gy), onde Gy=J/kg.
Como será visto mais adiante o dano biológico está relacionado com a quantidade de
ionizações produzidas pela radiação no meio. Na passagem da radiação por um material,
parte da energia se consome nas ionizações dos átomos que liberam elétrons com
determinada energia cinética. A energia depositada é proporcional ao número de
ionizações, e portanto a dose fica diretamente relacionada com o dano biológico
produzido.
O dano biológico vai depender também do tipo de partícula e da energia. Assim é
necessário, para a análise do dano biológico das radiações, o conceito de Transferência
Linear de Energia (LET, Linear Energy Transfer). O LET descreve a quantidade de
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
25
energia que é depositada localmente pela radiação por diferencial de trajetória (-dE/dx)
o que é vinculado diretamente com termo de perda específica de energia explicada na
seção anterior. O LET vai depender do tipo de radiação, da energia e do meio.
Radiações como os raios-X e raios gamas são considerados como de baixo LET ou
ligeiramente ionizantes. Por outro lado nêutrons rápidos, prótons e partículas carregadas
pesadas são considerados de alto LET ou altamente ionizantes. Entretanto o fato de ter
fornecido uma mesma dose num meio com radiação de altas e baixas LET, não indica
que os efeitos biológicos sejam iguais. Em ambos os casos a energia depositada é a
mesma, mas a distribuição espacial dos processos de ionização será diferente. As
partículas de alto LET produzem um grande número de ionizações ao longo do seu
caminho, ao contrario das partículas de baixo LET onde esse número não é tão grande.
Figura 4.4 Diferenças na densidade de ionizações para partículas de baixo a alto LET [Goodhead 1994].
A figura 4.4 mostra uma representação dos elétrons secundários gerados ao longo do
caminho da radiação gama (baixo LET) e de partículas alfa (alto LET) num núcleo
celular. Também mostra como a distribuição das ionizações das partículas alfa é mais
concentrada ao longo do seu caminho. Isto faz com que a interação desta radiação com
o DNA seja mais efetiva, porém a distribuição espacial das ionizações não seja tão
homogênea como para a radiação de baixo LET.
A dependência entre a estrutura do caminho (track structure) das radiações e seu efeito
biológico a nível molecular continua sendo amplamente estudado.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
26
4.2 Interação das radiações com meio biológico
Os efeitos das radiações ionizantes nos materiais biológicos são conseqüências da
absorção da energia associada ao seu passo pelo meio. As principais interações são
ionizações, excitações e dissociações das moléculas do meio atravessado. No caso de
interação com matéria viva estes fenômenos podem produzir modificações à escala
atômica e molecular que provocam importantes conseqüências a nível biológico.
As células eucariotes possuem duas estruturas fundamentais: o citoplasma e o núcleo. O
núcleo representa a principal estrutura sensível a radiações. Ele guarda na
macromolécula de DNA as informações genéticas necessárias para as funções vitais. Os
efeitos das radiações na molécula de DNA podem provocar modificações no
funcionamento ou inclusive a morte da célula. Já, a dose necessária no citoplasma para
produzir um dano celular relevante é muito maior que para o núcleo celular. Por esta
causa o DNA representa o alvo mais sensível aos efeitos das radiações nos seres vivos.
4.2.1 Estrutura do DNA
Antes de estudar os efeitos das radiações no DNA é necessário conhecer sua
composição.
O DNA se classifica como um polímero de nucleotídeos. Cada nucleotídeo do DNA é
formado por três partes: uma base nitrogenada, um açúcar (desoxirribose) e um grupo
fosfato, figura 4.5.
Citosina: Timina: Adenina: Guanina:
CH2
Base nitrogenada
Desoxiribose
H
H
H
OH
H
H
O
HN
N
N
N
H
2N
O
N
N
N
N
NH
2
N
NCH3
O
O
N
N
NH
2
O
Bases nitrogenadas
Açúcar (desoxirribose)
C T A G
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
27
Figura 4.5 Estrutura química das partes do DNA. Bases nitrogenadas, açúcar. Estrutura e enlace dos
nucleotídeos.
Um nucleotídeo (desoxinucleotídio) consiste em uma molécula de desoxirribose com
um fosfato ligado em uma posição e uma das quatro bases nitrogenadas ligada à outra
posição. Os átomos de carbono do açúcar desoxirribose de um nucleotídeo são sempre
numerados do mesmo modo. A base está sempre ligada ao carbono 1 e o grupamento
fosfato está sempre ligado ao carbono 5, figura 4.5. Na molécula do DNA, milhares
destes nucleotídeos estão agrupados em uma cadeia, pela união dos grupos fosfatos,
ligados ao carbono 5 de uma molécula de desoxirribose, com o carbono número 3 de
uma segunda molécula desoxirribose.
a) b)
Figura 4.6. Modelo da molécula de DNA. (a) Representação da sua composição química. (b) Diferentes
desenhos do DNA
O
-
P
O
O
OCH
2
O
H
H
O
H
H
H
Base nitrogenada
Carbono
5
O
-
P
O
OCH2
O
H
H
OH
H
H
H
Base nitrogenada
Carbono
3
O
-
P
O
O
OCH
2
O
H
H
OH
H
H
H
Base nitrogenada
Pentose
Fosfato
Carbono
1
Carbono
5
(desoxiribose)
Nucleotídeos
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
28
As ligações formadas entre as moléculas de desoxirribose, através do grupo fosfato são
chamadas de ligações fosfodiéster. A estrutura do DNA tem forma de uma dupla hélice.
As pontes de hidrogênio entre os pares de bases complementares (adenina com timina e
guanina com citosina) mantêm o DNA em forma helicoidal, figura 4.6.
4.2.2 Conformações do DNA
O DNA encontra-se nos seres vivos de diferentes maneiras, dependendo do nível de
complexidade do organismo. Nos eucariotes o DNA encontra-se numa forma semi-
ordenada dentro do núcleo celular, agregado as proteínas estruturais (as histonas), e é
chamado cromatina (figura 4.7).
a)
Figura 4.7 Diferentes conformação do DNA. A) cromossomo em organismos eucariotos. B) DNA de
procariotos. C) Plasmídeos.
Nos organismos procariotos (bactérias), os quais não têm membrana nuclear, o DNA
encontra-se disperso no citoplasma, e ainda separados do DNA cromossômico por
pequenos anéis chamados de plasmídeos.
Determinar qual tipo de DNA será utilizado nos estudos de interação com as radiações é
muito importante já que os processos de formação de danos, as metodologias de análise
e os resultados obtidos apresentam significativas diferenças.
b)
c)
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
29
4.2.3 Classificação dos danos no DNA
O efeito direto e indireto das radiações sobre o DNA pode produzir principalmente dois
tipos de quebras: quebras simples chamadas SSB (Single Strand Break) e quebras
duplas chamadas (Double Strand Break), como ilustradas na figura 4.8. Existem
também as quebras complexas conhecidas como LMDS (locally multiple damaged site)
ou clustered damage que são geradas por partículas carregadas de alto LET [Ward
1994].
As SSB ocorrem com mais freqüência ao nível da união fosfodiester entre o fosfato e a
desoxirribose, mas também podem ocorrer sobre a ligação base-desoxirribose. Uma
grande parte destas modificações é feita pela ação dos radicais livres que serão
explicados posteriormente.
Figura 4.8 Quebras da cadeia do DNA. SSB e DSB provocadas por mecanismos diretos e indiretos.
A DSB corresponde à perda da continuidade das cadeias do DNA. Em média ocorrem
quando duas SSB são formadas em ambas as fitas, em sítios próximos, ao redor de
menos de 3 bases de distancia, embora possam ocorrer com até 10 pb de distância. Este
tipo de quebra pode ser produzido por uma só partícula (partículas de alto LET) ou pela
combinação de duas SSB em cadeias complementares, como ilustra a figura 4.9.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
30
Figura 4.9 Origem de quebra dupla provocada por duas quebras simples em cadeias opostas.
A energia requerida para a produção de uma SSB é de uns 10-20 eV. Uma dose entre 1
a 1.5 Gy de radiação eletromagnética gera aproximadamente umas 1000 SSB e entre 50-
100 DSB por célula. Mas esta dose só produz a morte de cerca de 50% das células de
mamífero no volume irradiado. Isto demonstra a existência de mecanismo de reparo nas
células.
Os mecanismos de reparo restabelecem a cadeia de DNA ao seu estado original.
Existem diversos tipos de reparo de DNA nos diferentes organismos vivos. Nos seres
humanos mecanismos permitem reparar SSB de forma relativamente rápida, na ordem
de minutos. Já no caso de DSB pela grande complexidade do dano, são necessárias
horas para fazer o reagrupamento da cadeia, resultando muitas vezes em erros ou
mutações que produzem a morte celular.
Figura 4.10 Comparação entre a produção de quebras por um elétron e uma partícula alfa. A radiação de
alto LET é capaz de produzir danos múltiplos em pequenas regiões do DNA.
DNA em estado inicial
DNA com
q
uebra sim
p
les
DNA com duas
q
uebra SSB em cadeias o
p
ostas
Produ
ç
ão de uma DSB
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
31
As quebras complexas ou clustered damage são conseqüência da alta densidade de
ionizações ao longo do caminho percorrido que caracterizam os núcleos pesados de alto
LET. Os elétrons secundários e os radicais gerados no entorno da molécula podem
provocar múltiplos danos que se concentram numa pequena região do DNA, como
ilustra a figura 4.10. Estas quebras são muito difíceis de reparar, e como conseqüência
pode resultar em mutações genéticas e/ou a morte celular. Em irradiações com fontes de
baixo LET este dano não é predominante.
4.2.4 Mecanismos de interação com o DNA
O dano das radiações no DNA pode ser de duas formas: de forma direta ou por ação
indireta. No caso da ação direta a interação da radiação é com os átomos que
conformam a molécula de DNA (denominamos de forma reduzida TH) produzindo
ionizações ou excitações por meio da interação coulombiana.
−+
++→+ eHTTHRad
*
No caso da interação indireta, a radiação interage com as moléculas e átomos que
formam o meio onde se encontra o DNA, produzindo principalmente radicais livres que
podem se difundir e interagir com a molécula de DNA. Na ação indireta o principal
meio de interação é água que representa 80% da célula, de modo que a radiólise da água
representa o principal mecanismo indireto de interação das radiações com o DNA
(figura 4.11).
Figura 4.11 Mecanismos de interação indireta e direta. Acima: A ionização do meio gera a produção de
radicais livres que provocam o dano no DNA. Abaixo: A ionização provoca o dano diretamente na cadeia
do DNA.
AÇÃO
INDIRETA
AÇÃO
DIRETA
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
32
Nos modelos que descrevem a radiólise da água, esta pode dividir-se em quatro etapas
[Atkins 2001]. A etapa física (até 10
-15
s), onde a energia depositada leva à ionização e à
excitação da molécula de água, com formação de
H
2
O
+
+ e
-
, e H
2
O
*
, respectivamente,
−+
+→ eOHOH
22
, (a)
∗
→ OHOH
22
. (b)
A seguir, na etapa físico-química (entre 10
-15
s e 10
-12
s), as espécies altamente instáveis,
formadas na etapa física, se descompõem rapidamente nas espécies radiolíticas
primárias
e
-
aq
, H
•
, HO
•
, O
2
-
e H
3
O
+
. Para isto, primeiro a molécula excitada H
2
O
*
se
decompõe, dando origem aos radicais livres hidroxila
HO
•
e hidrogênio H
•
,
••
+→ HOHOH
*
2
. (c)
O íon produzido no processo (a) sofre uma reação com a molécula de água formando a
espécie hidroxônio
H
3
O
+
e um radical hidroxila,
•++
+→+ HOOHOHOH
322
. (d)
Por outro lado, o elétron expulso na reação (a) é cercado por moléculas de água,
formando o elétron solvatado
e
-
aq
,
−−
→+
aq
eeOnH
2
. (e)
Após 10
-12
s as espécies radiolíticas estão formadas (clusters), e entra-se na etapa
química heterogênea, na qual, durante os 10
-6
s que se seguem, terão tempo de difundir-
se para a solução podendo também reagir entre si por numerosas vias. Algumas das vias
de recombinação são as reações do tipo radical-radical, que dão origem à formação de
produtos moleculares como o hidrogênio (H
2
), peróxido de hidrogênio (HOOH) e água,
2
HHH →+
••
, (f)
22
OHHOHO →+
••
, (g)
OHHOH
2
→+
••
. (h)
A presença de oxigênio no meio pode produzir outras reações químicas, como
−−
→+
22
OeO
aq
e (i)
22
HOOH →+
•
. (j)
Ao fim de um microssegundo, a distribuição de radicais e espécies moleculares atinge o
equilíbrio na solução, encontrando-se presentes com os seguintes rendimentos
radiolíticos (G, expressos em µmol J
-1
de energia absorvida):
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
33
Espécie G(µmol J
-1
)
e
-
aq
0,28
H
•
0,06
HO
•
0,28
H
2
0,047
H
2
O
2
0,073
O
2
-
0,0027
Depois de cerca de um microssegundo entra-se na fase química homogênea, onde as
espécies primárias podem continuar a reagir ou não entre si, mas também com qualquer
soluto presente na solução. Dos produtos da radiólise, o efeito mais letal nos meios
biológicos é produzido pelo radical hidroxila
HO
•
.
O radical hidroxila é uma espécie extremamente reativa. As suas reações com o DNA
podem resultar em quebras de cadeia (simples ou duplas), formação de ligações
cruzadas (base/base ou base/proteína), modificações do açúcar (formação de centros
abásicos) e modificações das bases. Há varias décadas, tem sido estudada a cinética das
reações deste radical com numerosos compostos em fase líquida. Apesar de ter sido
determinada a velocidade de reação do radical, os mecanismos presentes nestes
processos ainda não são totalmente conhecidos. De um modo geral, sabe-se que o
radical reage por três tipos de mecanismos: adição a uma ligação múltipla em sistemas
insaturados, abstração de um átomo de hidrogênio e oxidação monoelectrónica.
Nas reações com moléculas aromáticas como o DNA, a adição a uma ligação dupla
ocorre com muita maior probabilidade do que a abstração de um átomo de hidrogênio.
Da adição do radical
HO
•
, resulta um radical intermediário instável que pode evoluir
por diversas vias. Uma possibilidade é a eliminação de um íon hidróxido com a
formação de um íon radical-cátion, ou outra evolução pode ser a formação de um
radical neutro pela eliminação de uma molécula de água. No caso das bases do DNA, a
principal decomposição do produto intermediário é a eliminação formal de um átomo
de hidrogênio, o que dá origem a um produto de hidroxilação estável. Estes produtos
finais constituem modificações permanentes responsáveis pelos fenômenos de
mutações, como indicado na figura 4.12. Os íons radicais ou neutros podem dar origem
também a quebras de ligações carbono-carbono nas pontes de fosfatos ou na
desoxirribose provocando as quebras simples e duplas na cadeia do DNA. Estes íons
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
34
radicais ou radicais neutros podem também provocar transposições ou a formação de
radicais peróxidos quando a reação ocorre em presença de dioxigênio.
Figura 4.12 Esquema simplificado de reação do radical hidroxila com uma base de DNA. São mostrados
os produtos intermediários e os produtos finais. [Vieira 2006]
4.2.6 Escala do tempo
As rupturas produzidas pelos efeitos diretos e indiretos, logo depois da deposição inicial
de energia pela radiação, dão lugar a uma série de reações físico-químicas que podem
terminar criando diversas conseqüências biológicas. Estas reações respondem a uma
escala de tempo que é dividida inicialmente nas etapas física, físico-química e química.
Na etapa física acontece a transferência de energia ao sistema irradiado produzindo a
ionização e excitação dos átomos O tempo do processo e da ordem de 10
-18
a 10
-15
s. Na
etapa físico-química acontece a perda do excesso de energia presente no sistema.
Originam-se reações íon-molécula, a dissociação das espécies excitadas e a formação
dos radicais livres. A duração desta etapa e de 10
-15
a 10
-12
s. Na etapa química acontece
a difusão das espécies acumuladas e suas reações químicas A duração deste processo é
de 10
-12
até 1 segundo. Existem outras etapas que devem ser consideradas para seres
vivos e que são mostradas na tabela 4.1.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
35
Tabela 4.1. Domínio temporal da ação das radiações.
Tempo
Eventos
Etapa física 10
-18
Partícula ionizante atravessa a molécula
Ionização
Etapa físico-química 10
-15
Excitação: vibração molecular, dissociação
molecular, termalização dos
elétrons
Etapa química 10
-12
heterogênea
Difusão dos radicais livres
10
-10
Reação dos radicais livres com o soluto
10
-8
Formação dos produtos moleculares
Etapa química 10
-6
homogênea
Conclusão das reações químicas
Etapa bioquímica 1s Reações enzimáticas, processo de reparo.
Etapa Biológica 1h Inicio dos processos que podem gerar
instabilidade genómica, aberrações,
mutações, e morte celular.
Efeitos primários dias Morte das células tronco (stem cell), dano a
tecido sadio ou proliferação de células.
Efeitos tardios meses Fibroses, telangiectasia, danos na pele,
danos na medula espinal, e danos no
sistema sanguíneo.
Carcinogêneses anos Aparição de tumores e tumores secundários
associados.
muitos
anos
4.2.7 Captadores de radicais (scavengers)
Algumas sustâncias podem ser utilizadas para captar os radicais hidroxila produzidos na
radiólise da água. Variando sua concentração na solução, estas podem ser utilizadas
para o estudo dos mecanismos de reação do radical com outras moléculas do meio. A
principal reação neste caso é a abstração de um átomo de hidrogênio pelo radical
HO
•
.
Os resultados desta reação são radicais fracamente oxidantes e muito menos reativos do
que o radical hidroxila.
Os
scavengers são amplamente utilizados para estudar a geração de radicais hidroxila
pela radiação ionizante e seu efeito na molécula de DNA. A presença do mesmo na
solução durante a irradiação gera uma competição entre as reações radical-DNA e
radical-
scavenger.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
36
Esta competição entre DNA e o scavenger pelo radical hidroxila pode ser analisada
aproximadamente como uma reação de segundo-grau (Milligan 1993). A reação entre o
radical-
scavenger vai depender das constantes de reação do radical com o DNA (k
DNA
) e
com o scavenger (
k
scav
),
produtosscavHO
scav
k
⎯⎯→⎯+
•
. ,
produtosDNAHO
DNA
k
⎯⎯→⎯+
•
.
Aplicando a cinética de competição, temos que
DNA
scav
o
SSB
DNA
scav
o
SSBSSB
C
C
Gk
k
GG
⋅+=
11
,
onde
G
SSB
e G
o
SSB
representa o rendimento de produção de quebras simples no DNA na
presença e na ausência de
scavenger respectivamente, C
DNA
a concentração do DNA, e
C
scav
a concentração do scavenger.
Para esta aproximação, num gráfico de
1/G
SSB
em função de 1/C
DNA
, encontra-se uma
linha reta com intercepto
1/G
o
SSB
e pendente [k
scav
C
scav
]/[k
DNA
G
o
SSB
]. De forma
alternativa, representando
1/G
SSS
em função de C
scav
encontra-se uma linha com
intercepto
1/G
o
SSB
e inclinação [k
scav
]/[k
DNA
G
o
SSB
C
DNA
]. O valor de k
scav
pode ser
encontrado na literatura. Por meio de experimentos, podem ser calculados os
rendimentos de produção de quebras simples
G
SSB
para diferentes concentrações de
DNA e
scavenger. Desta forma, é possível quantificar de forma indireta a velocidade de
reação do radical hidroxila com o DNA (
k
DNA
) [Milligan et al. 1996].
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
37
4.3 Quantificação dos danos no DNA
4.3.1 DNA plasmidial
No estudo da interação das radiações com o DNA, é muito utilizado o DNA plasmidial
por sua facilidade para a determinação das SSB e DSB. Os plasmídeos são moléculas de
DNA circulares que ficam separadas do DNA cromossômico nas células que os
replicam. Depois de isolados, os plasmídeos encontram-se na forma circular
superenovelado (SC,
supercoiled). Quando acontece uma SSB em uma de suas fitas, as
tensões moleculares são rompidas e o DNA passa de SC para uma forma circular
relaxado (Cir,
relaxed circular). No caso de acontecer uma DSB, a continuidade da
cadeia se perde e os extremos da ruptura tendem se a afastar, passando para a forma
linear (Lin,
lineal), como esquematizado na figura 4.13.
Figura 4.13 Representação do DNA circular superenovelado (SC), circular relaxado (Cir.) e linear (Lin.).
Uma amostra contendo uma boa quantidade de plasmídeo em forma SC, ao ser
submetido à radiação ionizante, terá no final os plasmídeos numa diversidade de formas.
Em função da dose recebida, estes plasmídeos podem ser encontrados nas formas:
circular superenovelado (SC) que não foi afetado pela radiação, circular relaxado (Cir),
onde só aconteceram SSB, linear (Lin), onde se produziram DSB, e nos casos onde a
dose seja muito elevada, no DNA linear podem ser produzidas múltiplas DSB passando
a DNA degradado (D, também chamado fracionado), como indicado na figura 4.14.
Esta distribuição está diretamente relacionada com a geração de SSB e DSB dentro da
população de plasmídeos, conseguindo-se desta forma estudar os processos de produção
de SSB e DSB através das distribuições das formas SC, Cir e Lin, em função de
diferentes parâmetros.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
38
Figura 4.14 Esquema de transformação do DNA para a ocorrência das quebras simples e duplas
[Goodhead 1994].
4.3.2 Gel de eletroforese
As diferentes conformações dos plasmídeos presentes nas amostras irradiadas podem
ser separadas e quantificadas utilizando a técnica de eletroforese em gel de agarose.
Neste processo, um gel separa as moléculas de DNA de acordo a sua forma ou peso
molecular, e a fluorescência do corante Brometo de Etidio sob luz UV permite sua
localização e quantificação. A figura 4.15 mostra uma representação da eletroforese em
gel de agarose. A agarose no gel forma fibras helicoidais que se agregam em estruturas
superenoveladas formando uma malha tridimensional com canais com diâmetros entre
50 a 200 nm. Um pente colocado durante a solidificação do gel deixa uma distribuição
de poços onde as amostras de DNA são carregadas. O gel submergido em uma solução
tampão é submetido a uma diferença de potencial. O DNA migra em direção ao anodo
por causa da densidade de cargas elétricas residuais negativas que possui. No gel, a
matriz polimérica só permite os movimentos em uma direção e produz uma resistência à
passagem do DNA que depende, entre outros fatores, do tamanho da molécula. Desta
forma, moléculas de DNA de menor tamanho migrarão mais rápido que as maiores. A
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
39
mobilidade do DNA no gel dependerá também do tipo e concentração de agarose
utilizado, do campo elétrico aplicado e da presença ou não de Brometo de Etídio.
Figura 4.15 Desenho de montagem experimental para corrida de gel de eletroforese.
Para a quantificação das bandas de DNA que foram separadas no gel, utiliza-se o
Brometo de Etidio. Este composto químico se liga por forças de Van der Waal às bases
do DNA. Ao permanecer em um plano perpendicular ao das bases pode provocar a
diminuição da velocidade de migração do DNA. Por outro lado esta ligação permite o
deslocamento do comprimento de onda da fluorescência do DNA. Submetido à luz
ultravioleta de 254nm o DNA a absorve e transmite para o brometo que, a emite
novamente com comprimento de onda de 590nm. Esta radiação está no espetro da luz
visível na região do vermelho-alaranjado [Sambrook e Russell, 2001]. A emissão de luz
do brometo ligado ao DNA é de 20 a 30 vezes maior que o do não ligado permitindo
desta forma detectar pequenas quantidades de DNA na ordem de nanogramas. A
imagem da emissão do brometo é fotografada utilizando um filtro de luz laranja e
convertida a escala de cinzas. A intensidade luminosa de cada banda da imagem é
proporcional à quantidade de massa de DNA. Para géis previamente corados com
brometo, o DNA plasmidial em forma superenovelada migrará mais rapidamente,
seguido do linear e finalmente o circular, como mostra a figura 4.16.
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
40
Figura 4.16. Imagem de gel de eletroforese. O sentido da migração do DNA é do catodo ao anodo. À
direita é mostrada a separação do DNA em suas três conformações circular superenovelado (SC), circular
relaxado (Cir) e linear (Lin).
4.4 Análise dos danos e cálculo dos rendimentos de SSB e DSB
4.4.1 Equação geral para a Teoria de Evento e Alvo. (Hit and Target Theory)
A Teoria de Evento e Alvo (Hit and Target Theory) tem tido uma grande importância
histórica. Ela modela de uma forma aproximada todos os danos que a radiação causa
sobre células, tecidos e até as quebras do DNA. A teoria se baseia no uso de tratamentos
estatísticos Poissonicos para descrever as curvas de respostas em função da dose dos
fenômenos de interação com as radiações. Na teoria, as interações ao longo do caminho
da radiação são consideradas como eventos discretos e aleatórios.
A fórmula geral da teoria representa o caso no qual um número
n de eventos, são
necessários para produzir uma lesão em cada um dos
m alvos [Zimmer 1961]. Se o
número de eventos estocásticos produzidos é
h, então a fração de sobrevivência, F
n,m
para o caso de
n eventos por cada m alvos será
(
)
m
nmn
FF
1,,
11 −−= , [4.16]
onde
∑
−
=
−
⋅=
1
0
1,
!
n
r
r
h
n
r
h
eF
, [4.17]
representa a probabilidade Poissonica de que um alvo simples sobreviva até
n eventos.
Os casos de particular interesse são: a inativação por evento simples, alvo simples
(
single hit, single target, n=1, m=1) e a inativação por evento simples, e alvos múltiplos
(
single hit, multi-target, n=1, m>1).
Sentido de
migração
_
+
Cir.
Lin.
SC.
Poços
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
41
No caso da inativação n=1, m=1, a fração de sobrevida da estrutura biológica analisada,
substituindo na equação 4.17, fica
h
eF
−
=
1,1
. [4.18]
Neste caso a curva de resposta se caracteriza por uma linha com inclinação constante
num gráfico semilogarítmico. Definindo
h=D/D
37,
quando F
1,1
= e
-1
a fração de
sobrevida é 0.3679(37%), o que conduz ao conhecido fato de que, quando a dose é igual
a D
37
, em media existe um evento por alvo.
No caso da inativação com um evento simples para múltiplos alvos (
n=1, m>1) a fração
de sobrevivência F
1,m
será:
mh
m
eF )1(1
,1
−
−−= . [4.19]
Para um número grande de alvos, m, a equação [4.19] pode ser expandida usando o
teorema binomial para realizar uma boa aproximação, obtendo
h
m
emF
−
⋅=
,1
. [4.20]
4.4.2 Rendimento de quebras simples (G(SSB)).
O dano simples no DNA corresponde a um evento do tipo inativação por evento simples
e alvo múltiplo, já que só é necessária uma quebra para o DNA passar da forma SC para
Cir. Portanto, a fração de DNA SC, F
SC
em função da dose, D, pode ser encontrada
como
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
−=
37
exp
D
D
FF
o
SCSC
, [4.21]
onde F
o
SC
, representa a fração inicial de DNA SC. Neste caso, a dose D
37
indicará que,
em média, teremos uma quebra simples por alvo considerado. Portanto, por unidade de
dose, a probabilidade de termos uma quebra por alvo será 1/D
37
. No caso dos estudos
com DNA
in vitro, os alvos associados com 1/D
37
são o número de moléculas e o
número de pares de bases.
Os resultados dos rendimentos dados em números de moléculas com uma quebra
simples por unidade de energia (µmol J
-1
) são calculados como:
=⋅
⋅
⋅
=⋅=⋅
−
3737
1
11
__
][
DV
VC
Dsoluçãodamassa
NAmoleculasD
JmolG
DNA
SSB
ρ
µ
][][
][
])[(
37
3
3
1
GyDdmkg
dmmolC
JmolSSBG
DNA
⋅⋅
⋅
=⋅
−
−
−
ρ
µ
µ
[4.22]
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
42
onde C
DNA
representa a concentração do DNA em moles por decímetro cúbico e ρ é a
densidade da solução (geralmente considerada 1 g/cm
3
no meio aquoso).
Outra forma de apresentar os rendimentos de quebras simples é em unidades de Gray
por Dalton (Gy
-1
Da
-1
). Neste caso, a probabilidade de quebra por unidade de Gy é
normalizada por unidade de massa atômica de DNA. Para isto a probabilidade 1/D37 é
dividida pela massa molecular em Dalton do DNA estudado. Em média, a massa
molecular de um par de base, pb, da cadeia dupla do DNA tem 650 Da, portanto o peso
molecular total será: pb×650 Da, ficando o rendimento como
][650][
1
])[(
37
11
DapbGyD
DaGySSBG
⋅⋅
=⋅
−−
. [4.23]
Esta última expressão é a mais utilizada para apresentar os resultados, já que permite
comparar rendimentos encontrados com DNA diferentes e em distintas condições.
4.4.3 Rendimento de quebras duplas (G(DSB)).
Nos estudos de interação das radiações com o DNA, encontra-se que na medida em que
a dose recebida na amostra é incrementada o DNA SC presente na amostra vai
diminuindo exponencialmente. O DNA SC passa então a DNA circular, aumentando-se
a presença deste dentro da população com aumento da dose.
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
20
40
60
80
100
Percentagem na amostra
Dose (Gy)
SC
Cir
Lin
Figura 4.17. Representação do comportamento das percentagens do DNA nas diferentes com formações
dentro de uma amostra em função da dose. O DNA degradado não está sendo levado em conta. O DNA
SC apresenta um comportamento exponencial decrescente e o Lin um comportamento linear em função
da dose.
Por outro lado a produção de rupturas duplas, e portanto da presença de DNA linear, vai
depender do LET da radiação ionizante e do número de quebras simples presentes no
DNA circular. O aumento do número quebras no DNA circular aumenta a probabilidade
Capítulo 4. Fundamentos Teóricos.
43
de produção de quebras duplas. Na medida em que o número de quebras duplas
continua incrementando o DNA linear passa para DNA degradado. Nos casos em que a
presença de DNA degradado é baixa, a formação de rupturas duplas estimada de forma
aproximada como uma função linear em função da dose, os modelos estatísticos têm
demonstrado que a forma analítica para sua estimativa é complicada e depende de
numerosos parâmetros [Cowan 1987, Cowan 1990], figura 4.17.
No caso da determinação dos rendimentos das quebras duplas, estes são reportados na
literatura nas mesmas unidades que as quebras simples, porém existem diferenças nos
procedimentos de cálculo da probabilidade de quebras DSB por unidade de Dose, P
DSB
.
Um grupo de trabalhos da literatura calcula esta probabilidade ajustando a fração de
DNA sem quebras duplas (SC+Cir) a uma exponencial de primeira ordem [Roots et al.
1990, Klimczak et al. 1993] da forma
(
)
DPFFF
DSBCirSC
I
Lin
I
CirSC
⋅−⋅=−=
++
exp1
0
. [4.24]
Em outros casos, a exponencial é de segunda ordem [Taucher-Scholz and Kraft 1999]
da forma
(
)
[
]
20
exp1 DDPFFF
DSBCirSC
II
Lin
II
CirSC
⋅+⋅−⋅=−=
++
β
. [4.25]
Outros ajustam a fração de DNA linear a uma equação de primeiro grau [Jones et al.
1993, Milligan et al. 1996b] do tipo
0
LinDSB
III
Lin
FDPF +⋅= . [4.26]
Em outros casos, onde a forma da curva do DNA linear não tem um comportamento
linear, as curvas têm sido ajustadas a equações de segundo grau [Milligan et al. 1996a]
do tipo
02
LinDSB
IV
Lin
FDPDAF +⋅+⋅= . [4.27]
Nos casos anteriores, o termo P
DSB
é utilizado para calcular os rendimentos de quebras
duplas em unidades de µmol J
-1
e Gy
-1
Da
-1
de forma similar ao das SSB,
][
][][
])[(
3
13
1
−
−−
−
⋅
⋅⋅
=⋅
dmkg
GyPdmmolC
JmolDSBG
DSBDNA
ρ
µ
µ
ou [4.28]
][650#
][
])[(
1
11
Dapb
GyP
DaGyDSBG
DSB
⋅
=⋅
−
−−
. [4.29]
É de se esperar que as diferentes maneiras em que os rendimentos são calculados sejam
a causa das divergências observadas entre os resultados na literatura.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
44
CAPÍTULO 5. MATERIAIS E MÉTODOS.
Neste capítulo se apresentam materiais e métodos utilizados para o desenvolvimento
dos estudos realizados neste trabalho de Tese. A organização dos procedimentos
responde aos trabalhos de:
1. Cultivo e purificação do DNA.
2. Otimização da técnica de eletroforese em gel de agarose.
3. Efeito das frações iniciais de DNA Superenovelado e Circular nos rendimentos
de SSB e DSB.
4. G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
60
Co.
5. G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
137
Cs.
6. G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com prótons de 10 MeV.
5.1 Cultivo, extração e purificação do DNA.
O estudo da interação radiação-DNA requer uma grande quantidade de DNA
plasmideal, em sua maioria em forma circular superenovelada. O DNA deve estar livre
de impurezas como restos de proteínas, RNA, lipídios, etc. Diferentes kits de
purificação são comercializados atualmente com o objetivo de preparar o DNA para
diversos usos. Mas trabalhos têm demonstrado que muitos deles não proporcionam a
pureza necessária para este tipo de estudo [Milligan et al. 1993, Shao et al. 1999]. Neste
trabalho o DNA utilizado é o plasmídeo Bluescript II phagemid da Stratagene
®
(pBs
KS+) de 2961 pares de bases. Para a purificação foi utilizado um protocolo modificado
que permite obter grandes quantidades de DNA plasmideal com boas condições de
pureza [Gouveia 2004].
Para o processo de replicação foi utilizado o método de eletroporação. O DNA foi
isolado da Escherichia coli DH5 α. O RNA e as proteínas foram extraídos por meio de
centrifugação em gradientes isopícnicos de cloreto de césio. O resto dos elementos
químicos captadores de radicais foi removido por diafiltração em buffer de Tampão de
eluição (TE).
A concentração e a pureza do DNA foram estimadas por espectrofotometria medindo a
absorbância das amostras às ondas eletromagnéticas da região ultravioleta. No presente
trabalho, os principais comprimentos de onda cuja absorção é medida são: 260 nm, 280
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
45
nm, e 320 nm. Para 260 nm, a absorbância do DNA é máxima, a qual permite estimar a
concentração do mesmo na amostra. A absorbância em 280 nm indica a presença de
proteínas e a absorbância a 320 nm é utilizada para fazer correções de fundo. A
absorbância a 260 nm é dada em unidades de DO
260
(Densidade Óptica). Para o DNA de
fita dupla, uma unidade de DO
260
corresponde com uma concentração de 50 µg/ml.
Desta forma é possível estimar a concentração de DNA numa amostra. Para amostras
com baixa intensidade iônica e pH controlado a relação DO
260
/DO
280
fornece uma
estimativa da pureza do acido nuclêico. Graus de purezas aceitáveis para este tipo de
estudo devem estar entre 1.8 e 2.0 que correspondem a 50% a 100% de ácidos nuclêicos
[Sambrook and Russel, 2003]. As medidas foram feitas no espectrofotômetro modelo
“U-2000 Double-beam spectrophotometer” de la HITACHI do ICB1 da USP. Os
resultados obtidos nas medições da relação DO
260
/DO
280
para o plasmídeo utilizado no
trabalho estiveram todos acima de 1.92 (65%).
5.2 Otimização da técnica de eletroforese em gel de agarose.
Os trabalhos que utilizaram a técnica de eletroforese têm mostrado que corridas com
porcentagens de agarose altos, voltagens pequenas e tempos de corrida grandes, são
condições favoráveis para o aproveitamento do poder separador do gel de eletroforese
[Hugh W.White 2001]. Porém, neste trabalho, o número de amostras irradiadas é muito
elevado (da ordem de centenas). Neste caso as recomendações anteriores fazem com
que a técnica fique muito demorada. Portanto, foi necessário realizar uma otimização
que permitisse obter resultados de forma rápida e confiável.
Na bibliografia científica, pode se encontrar trabalhos que estudaram o efeito de alguns
fatores sobre a técnica de gel de eletroforese. Os principais fatores são: a concentração
de agarose, a temperatura de solidificação, o tempo de corrida, a voltagem aplicada, o
tamanho do poço de amostra e a concentração de DNA [Noriko Kusukawa 1999].
Outros têm estudado fatores relacionados com o processo de aquisição com câmeras
CCD e alinhamento das imagens como: a iluminação, tempo de exposição, alinhamento,
resolução e formato do arquivo da imagem [Max Dell Miller Jr 2001]. Em nosso
trabalho de otimização foram estudados os efeitos de alguns destes fatores a fim de
melhorar a exatidão dos resultados e agilizar o processo de analise. Utilizando o
programa GelAnalis [Apêndice 1], desenvolvido dentro do presente trabalho, outros
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
46
novos fatores foram estudados também. Entre eles: o modo de seleção das bandas de
DNA, a eliminação do fundo no gel, e os ajustes a distribuições de probabilidade.
5.2.1 Materiais e métodos utilizados no estudo
Para os trabalhos de otimização da técnica de analise, o DNA utilizado foi o mesmo das
irradiações (pBs KS+). Algumas mostras foram digeridas com a enzima Hind III para
obter DNA em forma linear. Também foi utilizado o Ladder de massa High DNA Mass
Ladder da Invitrogen
™
e 1Kb Plus DNA Ladder da GibcoBRL
™
. Toda a instrumentação
para a confecção dos géis foi da Eppendorf
®
.
Três concentrações diferentes de agarose foram estudadas: 0.7%, 0.8% e 1.0%. Imersos
em TBE 0.5x, foram corridos géis pré-corados com Brometo de Etídio a 0.5 µg/ml e
outros sem. Estes sem Brometo de Etídio foram corados posteriormente à corrida num
banho de água destilada com Brometo a 0.5 µg/ml. Diferentes voltagens, quantidade de
DNA por poço e tempos de corrida foram aplicados a fim de determinar as melhores
condições para a separação das bandas num tempo razoável.
As imagens digitais dos géis foram adquiridas utilizando o Eagle Eye CCD video
camera system do ICB da USP. A luminosidade da imagem era controlada pelo tempo
de exposição ao CCD. Este é medido em número de integrações, onde uma integração
equivale a 1/30 seg. Este foi outro parâmetro a estudar dentro do trabalho. As imagens
finais foram guardadas em escala de cinzas, formato BMP, e com 8 bits de resolução.
Para a quantificação das bandas foi utilizado o programa GelAnalis implementado
especificamente com este objetivo [Apêndice A1].
Os resultados do trabalho de otimização da técnica de eletroforese são apresentados no
capítulo 6, seção 6.1.
5.3 Efeito das frações iniciais de DNA SC e Cir nos G(SSB) e G(DSB).
O DNA uma vez purificado e extraído do gradiente de césio encontra-se na sua maior
parte em forma circular superenovelado (SC). No entanto, com o tempo, o DNA
mantido a uma temperatura superior a 4
o
C pode sofrer quebras nas suas cadeias,
diminuindo a fração de DNA SC e aumentando a presença de DNA circular relaxado.
Segundo o modelo probabilístico proposto por Cowan (1987), a diferença de frações
iniciais de DNA SC e Cir nas amostras não iria modificar os rendimentos de produção
de rupturas simples e duplas. Em seu modelo teórico, ele considera que este fenômeno
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
47
pode ser interpretado como um deslocamento para a esquerda da curva exponencial que
descreve a produção de quebras simples, mas mantendo o decaimento da curva
constante e, portanto a taxa de produção de quebras, figura 5.1.
-100 -50 0 50 100 150 200 250
0
20
40
60
80
100
Percentagem de SC
Dose [Gy]
100% SC
68% SC
30% SC
0 50 100 150 200 250
1
10
100
percentagem de SC
Dose [Gy]
100% SC
68% SC
30% SC
Figura 5.1 Modelo de quebras de Cowan. SC=exp[-(µ
0
+ µ*D)]. Onde µ
é independente da quantidade
inicial de DNA em forma SC.
As irradiações realizadas possuíam o DNA com diferentes frações de DNA SC por
causa do tempo transcorrido entre sua purificação e a data de irradiação. Por este fato
foi realizado um estudo com o objetivo de definir se efetivamente a diferença na
população inicial de DNA não modificava os rendimentos de produção de SSB e DSB.
Este trabalho foi feito no irradiador de
60
Co tipo Gammacell-200 situado no IPEN. Esta
escolha foi devido à disponibilidade de irradiação e a possibilidade de obter altas doses
em tempos razoáveis.
5.3.1 Preparação das amostras
Para o estudo se possuía dois estoques de Plasmídeo pBKs com DNA em forma SC e
Cir em concentração de 746 ng/µl e 400 ng/µl respectivamente, e livres de scavengers.
Estas concentrações foram medidas no espectrofotômetro. O primeiro estoque
apresentava uma degradação do DNA SC da ordem de 10%, o qual se encontrava em
forma circular. No segundo estoque, todo o DNA estava em forma circular.
Com os dois estoques anteriores foram preparados quatro tipos de amostras com
diferentes porcentagens de DNA SC e Cir. As amostras possuíam DNA numa
concentração de 100 ng/µl e Glicerol a 2 mM, para dar uma pequena estabilidade ao
DNA. Na tabela 5.1 é mostrada a forma de preparo das soluções.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
48
Tabela 5.1 Forma de preparo de amostras para o estudo
SC-Cir
Soluções 90%-10% 70%-30% 60%-40% 0%-100%
746 ng/µl (90%SC-10%Cir) 33,5 µl 19,7 µl 11,8 µl -
400 ng/µl (100% Cir) - 25,7 µl 40,4 µl 62,5 µl
Glicerol 0,00365% 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
Agua destilada 116,5 µl 104,6 µl 97,8 µl 87,5 µl
Total 250 µl 250 µl 250 µl 250 µl
As amostras foram denominadas 90%-10%, 70%-30%, 60%-40% e 0%-100%, onde os
números representam aproximadamente as porcentagem de DNA SC e Cir de cada
amostra.
5.3.2 Irradiação das amostras
Como foi utilizado Gammacell-200 do IPEN, um trabalho de simulação do irradiador
foi feito com o objetivo de determinar a distribuição da taxa de dose no interior da
câmara de amostras, com respeito à dose central [Apêndice 3]. Esta simulação foi
realizada devido a que a atividade na fonte anular do irradiador não está distribuída de
forma homogênea. O principal objetivo foi determinar se esta heterogeneidade da
atividade produzia diferenças nas doses recebidas nas amostras que eram irradiadas
simultaneamente numa geometria cilíndrica dentro do irradiador.
Os resultados mostraram uma boa simetria de irradiação num raio de até 8 cm do centro
da câmara e que a dispersão máxima da dose nos pontos de irradiação das amostras foi
de cerca de 3%. O cálculo da taxa de dose central coincidiu com o valor experimental
medido.
Este valor experimental é medido regularmente pelo Laboratório de Dosimetria do
Centro de Tecnologia das Radiações. Para isto, é utilizado o dosímetro Fricke
(dosímetro de referência) juntamente com os resultados de intercomparação junto ao
IDAS (International Dose Assurance, serviço oferecido pela IAEA).
Para a irradiação foram colocados 15 µl de todas as amostras em tubos da Eppendorf de
0.5 ml. Em total foram preparados 13 tubos por cada tipo de amostra.
As doses recebidas no Gammacell 220 de
60
Co foram 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70,
100, 130, 180 e 250 Gy. A taxa de dose central na câmara de irradiação, no dia de
irradiação foi de 3.67 kGy/h. Foi utilizado o suporte de amostras de quatro lugares e
tomou-se o cuidado de que as soluções se encontrassem no fundo do tubo da Eppendorf,
figura 5.2. Os porta amostras foram colocados no centro da câmara de irradiação por
meio de uma base de isopor.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
49
Figura 5.2 Suporte de amostra. Modelo para 4 amostras
5.3.2 Gel de eletroforese e quantificação
As amostras irradiadas foram imediatamente preparadas para sua corrida no gel de
eletroforese adicionando-se 2,5 µl de Stop Mix e 8 µl de água destilada. Com isto
obtivemos 25 µl de amostra a 60 ng/µl de DNA aproximadamente. Para as corridas
foram colocados 10 µl por poço do gel. O gel foi corrido segundo a metodologia
otimizada resultado da seção 5.2. Os géis de 0.7% de agarose e com 0.5 µg/ml de
Brometo foram corridos por 2 horas a um potencial de 5 V/cm. As imagens do gel
foram obtidas no EAGLE EYE, guardadas em formato BMP com resolução de 640x480
pixels e quantificadas utilizando o programa GelAnalis. A luminosidade das bandas SC
foi multiplicada pelo fator de enlace do Brometo igual a 1.7, determinado no Apêndice
2.
Os resultados do estudo dos efeitos das frações iniciais de DNA SC e Cir são
apresentados no capítulo 6, seção 6.2.
5.4 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
60
Co.
Neste estudo, foram realizadas irradiações de soluções contendo o DNA em diferentes
concentrações e com distintas quantidades de scavengers. Os objetivos foram definir os
efeitos que estes dois parâmetros geram sobre os G(SSB) e G(DSB) no plasmídeo de
DNA, irradiado com raios gama do
60
Co.
No trabalho foram irradiadas amostras de DNA em solução aquosa (livre de scavengers)
em concentrações de 10, 50, 200 e 500 ng/µl. Também foram feitas irradiações em
amostras com as mesmas concentrações de DNA e com presença de scavengers
(Glicerol) nas concentrações de 2, 20 e 200 mM. No total foram 16 ambientes
diferentes.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
50
5.4.1 Preparação das amostras
O DNA utilizado foi o pBKs. Uma vez conhecida sua concentração na amostra estoque
de 753(4) ng/µl, foram preparadas os estoques correspondentes as 16 condições de
ambiente diferentes para a irradiação. O scavenger utilizado neste caso foi o Glicerol, já
que sua capacidade de captura a 200 mM (3,8 x 10
8
s
-1
) é similar ao ambiente celular
[Klimczak et al. 1993]. O DMSO (dimethyl sulfoxide) não foi utilizado porque os
radicais secundários derivados dele são reativos com o DNA [Milligan et al. 1996].
No caso do Glicerol (peso molecular 92,10 g/mol), este se encontrava numa solução de
87% em água. Os cálculos mostraram que para preparar uma amostra de 300 µl de
volume total com 2 mM de Glicerol, a quantidade de Glicerol necessária era de 0.0439
µl, o qual é impossível de pipetar com os instrumentos disponíveis, por isto o glicerol
foi diluído varias vezes para garantir que o volume a pipetar tivesse o menor erro
possível. As amostras estoque foram preparadas em tubos da Eppendorf de 500 µl, e
para a irradiação foram adicionados 15 µl por dose em tubos da Eppendorf de 0.5 ml.
O volume final em cada amostra dependeu do número de doses que seriam submetidas,
preparando menores volumes para aquelas com menor concentração. No caso de
amostras sem scavengers a forma de preparação é mostrada na tabela 5.2
Tabela 5.2 Amostras sem Glicerol
Nome da
amostra
Vol.DNA
estoq. (753)
Massa
DNA
Vol. Sol.
Glicerol
Vol. H
2
O Vol.Final
Conc. DNA
final
10ng/µl-0mM
3.39 µl 2550 ng 0 µl 251.61 µl 255 10 ng/µl
50ng/µl-0mM
16.93 µl 12750 ng 0 µl 238.07 µl 255 50 ng/µl
200ng/µl-0mM
75.70 µl 57000 ng 0 µl 209.30 µl 285 200 ng/µl
500ng/µl-0mM
209.16 µl 157500 ng 0 µl 105.84 µl 315 500 ng/µl
Para a irradiação foram preparadas 15, 15, 17 e 19 amostras de 10, 50, 200 e 500 ng/µl
respectivamente. Todas com 15 µl. Estas quantidades respondem com a quantidade de
doses que foram dadas para cada concentração.
Para as amostras com 2 mM de Glicerol foi preparada primeiramente uma solução de
Glicerol diluído de forma tal que 100 µl de solução de Glicerol em 400 µl de volume
final total fossem equivalente a 2mM de Glicerol. A forma de preparo foi
10 µl (Glicerol 87%=8.7ul de Glicerol)
+ 585 µl H
2
O destilada ultra pura .
595 µl (Glicerol 1.462%=8.7 µl de Glicerol)
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
51
Com a solução anterior
20 µl (Glicerol 1.462 %=0.2924 µl de Glicerol)
+ 480 µl H
2
O destilada ultra pura .
500 µl (Glicerol 0.05848%=0.2924 µl)
Conhecendo a relação anteriormente mencionada de que 100 µl da solução a 0.05848%
de Glicerol em 400 µl de solução total corresponde a 2 mM de Glicerol, as amostras a
irradiar foram preparadas segundo a tabela 5.3.
Tabela 5.3 Mostras com 2 mM de Glicerol
Nome da
amostra
Vol.DNA
estoq. (753)
Massa
DNA
Vol. Glice.
0.05848%
Vol. H
2
O Vol.Final
Conc. DNA
final
10ng/µl-2mM
3.78 µl 2850 ng 71.25 µl 209.97 µl 285 10 ng/µl
50ng/µl-2mM
18.92 µl 14250 ng 71.25 µl 194.83 µl 285 50 ng/µl
200ng/µl-2mM
75.70 µl 57000 ng 71.25 µl 138.05 µl 285 200 ng/µl
500ng/µl-2mM
209.16 µl 157500 ng 209.16 µl 27.09 µl 315 500 ng/µl
Neste caso o número de amostras a irradiar foi 17, 17, 17 e 19 para 10, 50, 200 e 500
ng/µl respectivamente, todas com 15 µl.
No caso das amostras com 20 mM de Glicerol, a forma de preparo foi similar ao caso
anterior. A solução de Glicerol foi preparada mantendo a razão de 100 µl de solução de
Glicerol em 400 µl de volume final total sendo equivalente a 20 mM de Glicerol da
forma:
16.81 µl (Glicerol 87%=14.63 µl de Glicerol)
+ 83.19 µl H
2
O destilada ultrapura .
100 µl (Glicerol 14.63%= 14.63 µl de Glicerol)
Com a solução anterior
20 µl (Glicerol 14.63 %=2.926 µl de Glicerol)
+ 480 µl H
2
O destilada ultrapura .
500 µl (Glicerol 0.5852%=2.926 µl)
Conhecendo a relação de 100 µl de Glicerol a 0.5852% em 400 µl de solução final, que
representa 200 mM de Glicerol, as amostras foram preparadas segundo a tabela 5.4.
Tabela 5.4 Mostras com 20 mM de Glicerol
Nome da amostra
Vol.DNA
estoq. (753)
Massa
DNA
Vol. Glice.
0.5852%
Vol. H
2
O Vol.Final
Conc. DNA
final
10ng/µl-20mM
3.78 µl 2850 ng 71.25 µl 209.97 µl 285 10 ng/µl
50ng/µl-20mM
19.92 µl 15000 ng 75.00 µl 205.08 µl 300 50 ng/µl
200ng/µl-20mM
87.65 µl 66000 ng 82.50 µl 159.85 µl 330 200 ng/µl
500ng/µl-20mM
189.24 µl 142500 ng 71.25 µl 24.51 µl 285 500 ng/µl
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
52
Neste caso, o número de amostras a irradiar foi 17, 18, 20 e 21 para 10, 50, 200 e 500
ng/µl respectivamente, todas com 15 µl.
Seguindo a mesma metodologia as amostras com 200 mM de Glicerol foram preparadas
cumprindo com a razão de 100 µl de solução de Glicerol em 400 µl de volume final
total é equivalente a 200mM de Glicerol. Neste caso a solução foi
33.63 µl (Glicerol 87%=29.26 µl de Glicerol)
+ 466.37 µl H
2
O destilada ultrapura .
500 µl (Glicerol 5.852%=29.26 µl)
Conhecendo a relação de 100 µl de Glicerol a 5.852% em 400 µl de solução final,
representa 200 mM de Glicerol, as amostras foram preparadas segundo a tabela 5.5.
Tabela 5.5 Mostras com 200 mM de Glicerol
Nome da mostra
Vol.DNA
estoq. (753)
Massa
DNA
Vol. Glice.
5.852%
Vol. H
2
O Vol.Final
Conc. DNA
final
10ng/µl-200mM
4.78 µl 3600 ng 90.00 µl 265.22 µl 360 µl 10 ng/µl
50ng/µl-200mM
24.90 µl 18750 ng 93.75 µl 256.35 µl 375 µl 50 ng/µl
200ng/µl-200mM
107.57 µl 81000 ng 101.25 µl 196.18 µl 405 µl 200 ng/µl
500ng/µl-200mM
239.04 µl 180000 ng 90.00 µl 30.96 µl 360 µl 500 ng/µl
Neste caso o número de amostras a irradiar foi 17, 18, 20 e 21 para 10, 50, 200 e 500
ng/µl respectivamente, todas com 15 µl.
5.4.2 Irradiação das amostras
Para a irradiação foi utilizado o mesmo Gammacell-220 mencionado no ponto 5.3.2. As
condições de irradiação foram similares só que neste caso o suporte de amostras foi
substituído por um de 16 lugares, permitindo a irradiação simultânea das 16 amostras
(figura 5.3). Uma base de isopor permitia a colocação das amostras no centro da
câmara. A taxa de dose central na câmara no dia da irradiação foi de 3.63 kGy/h.
Antes de cada irradiação era comprovado que todas as soluções encontravam-se
completamente na parte inferior dos tubos da Eppendorf, garantindo que todos os
volumes irradiados foram de 15 µl.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
53
Figura 5.3 Suportes de amostras. Modelo para irradiação simultânea de 16 amostras.
A dose das amostras foi controlada pelo tempo de irradiação. A tabela 5.6 mostra as
doses e os tempos reais de irradiação onde foi levada em conta também a dose de
transição que representa a dose recebida nas amostras durante o trajeto da gaveta do
irradiador para acima e abaixo. Por esta causa alguns tempos de irradiação foram
menores que se fossem calculados sô com a taxa de dose central.
Tabela 5.6 Tempos de irradiação para cada dose.
Dose (Gy) 10 20 30 40 50 60 70 80 100
Tempo 6.8 s 16.7 s 29.8 s 39.7 s 49.6 s 59.5 s 69.4 s 79.3 s 99.2 s
Dose (Gy) 120 140 160 180 200 250 300 350 400
Tempo 119 s 139 s 159 s 179 s 198 s 249 s 298 s 347 s 397 s
Dose (Gy) 500 700 1000 1200 1500 2000 2500
Tempo 496 s 694 s 992 s 19.8 min 24.8 min 33.1 min 41.3 min
5.4.3 Géis de eletroforese e quantificação
Os géis de eletroforese e a quantificação foram feitos seguindo a metodologia
apresentada na seção 5.3.3.
Os resultados de G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA plasmidial com gama de
60
Co são apresentados no capítulo 6, seções 6.3 e 6.4.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
54
5.5 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com gama de
137
Cs.
Neste item é apresentada a metodologia utilizada para a realização das irradiações de
DNA com gama de
137
Cs. O principal objetivo foi a caracterização do dano produzido
no DNA pela radiação em diferentes capacidades de scavenging para serem comparados
com os danos gerados nas irradiações com gama de
60
Co. Neste caso a concentração de
DNA não foi variada já que esta não influi significativamente nos rendimentos de
geração de SSB e DSB (expressos em Gy
-1
Da
-1
). O anterior foi mostrado nos resultados
do item 5.4. No estudo foram encontrados os G(SSB) e G(DSB) (ver definição no
capítulo 4, seções 4.4.2 e 4.4.3) para o DNA em soluções sem scavenger e com 2 mM,
20 mM e 200 mM de Glicerol.
5.5.1 Preparação das amostras
Nas irradiações com
137
Cs foi utilizado o mesmo plasmídeo pBs KS+ das irradiações
com
60
Co. Neste caso a concentração de DNA na amostra estoque foi de 265 ng/µl, com
90% de ácidos nucléicos e 99% do plasmídeo em forma supercoiled. O scavenger
utilizado foi o Glicerol para manter as condições similares às irradiações com
60
Co. As
irradiações foram feitas em quatro ambientes diferentes para o DNA: sem scavenger,
com 2 mM de Glicerol, 20 mM e 200 mM. O Glicerol encontrava se numa solução
estoque a 87%. Foi necessário fazer varias dissoluções para atingir as concentrações
necessárias nas amostras a irradiar. A seguir são detalhados os passos para a preparação
das amostras.
As soluções estoques utilizadas foram:
• Solução DNA: 265 ng/µl
• Solução Glicerol 87% (1.26 g/cm
3
): neste caso a concentração de Glicerol foi
1.096g/cm
3
= 1.096*10
-3
g/µl. Peso molecular 92.10 g/mol.
O primeiro objetivo foi a preparação de três soluções de glicerol tais que 100 µl num
total de 450 µl representassem 2mM, 20 e 200mM. Desta forma sobrariam 350 µl para
colocar a água e o DNA. Os passos de preparação são mostrados na tabela 5.7.
Tabela 5.7 Mostras com 200 mM de Glicerol
Nome da
disolução
Solução glicerol
Conc. Inic.
Glicerol
Vol.
H
2
O
Vol.Final
Conc.Final
Glicerol
SOL-1 (200 mM)
75,63 µl Estoq.
(87%)
1.096E-3 g/µl 924,37 µl 1000 µl 8,289-5 g/µl
SOL-2 (20 mM)
100 µl de SOL-1 8,289-5 g/µl 900 µl 1000 µl 8,289-6 g/µl
SOL-3 (2 mM)
100 µl de SOL-2 8,289-6 g/µl 900 µl 1000 µl 8,289-7 g/µl
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
55
Posteriormente foram preparadas as amostras para a irradiação.
As amostras sem presença de scavenger foram preparadas diretamente na concentração
do estoque de DNA. Como os resultados das irradiações com
60
Co mostraram que as
amostras com as menores concentrações sofreram muitas quebras para doses baixas
fazendo impossível sua quantificação, foi decidido manter a maior concentração de
DNA (265 ng/µl). Como também foi demonstrado nos resultados descritos na seção 6.4
do capítulo 6, esta decisão não influiu significativamente nos resultados, uma vez
normalizados em quebras simples e duplas por unidade de dose e de Dalton.
As irradiações foram feitas em tubos da Eppendorf de 0.5 ml, similares aos usados no
caso do
60
Co. Nas amostras sem scavenger foram colocados 10 µl do estoque de DNA.
Nos casos de amostras com scavenger a concentração para a irradiação foi menor do
que a amostra estoque. O objetivo foi diminuir os tempos de irradiação necessários para
danificar todas as moléculas. Os 450 µl de estoque destes tipos de amostras foram
preparados como mostra a tabela 5.8.
Tabela 5.8 Mostras com 200 mM de Glicerol
Nome da
mostra
Vol.DNA estoq.
(265ng/µl)
Vol. Solução de
Glicerol
Vol. H
2
O Vol.Final
Conc. DNA
final
Cs-2mM
150 µl 100 µl de SOL-3 200 µl 450 µl 88,3 ng/µl
Cs-20mM
150 µl 100 µl de SOL-2 200 µl 450 µl 88,3 ng/µl
Cs-200mM
150 µl 100 µl de SOL-1 200 µl 450 µl 88,3 ng/µl
Para a irradiação foram colocados 30 µl de cada um dos estoques anteriores em tubos da
Eppendorf de 0.5 ml.
5.5.2 Irradiação das amostras
Para os trabalhos com gama de
137
Cs foi utilizado o irradiador modelo IBL 637 situado
no ICB-4 da USP. Desenhado para investigações biológicas, este possui uma câmara de
irradiação de forma cúbica com 40 cm de aresta. A fonte de
137
Cs é formada por quatro
tubos selados de aço inox que contêm o material radioativo. O bloco das fontes no
momento de irradiação fica a 25 cm da base da câmara e no final é guardado num
compartimento blindado, figura 5.4.
A geometria do irradiador permitiu que as amostras fossem colocadas num mesmo
plano horizontal no centro da câmara de irradiação.
A taxa de dose foi determinada pelo Laboratório de Dosimetria do IF-USP no dia 27 de
outubro de 2005 utilizando dosímetros de Termoluminescentes de LiFG [Okuno 2005].
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
56
A taxa de dose central na base da câmara foi de 1.31 Gy/min com 5% de erro. Este valor
coincide relativamente bem com o valor de 1.322 Gy/min calculado utilizando a
equação de desintegração e a taxa de dose no ano da sua construção e calibração (1990),
⎟
⎟
⎠
⎞
⎜
⎜
⎝
⎛
⋅−=
••
yr
tDD
o
15.30
2ln
exp , [5.1]
onde t é o tempo transcorrido (15 anos) e
o
D
•
, a taxa de dose inicial (1.866 Gy/min).
Utilizando esta mesma equação foi calculada a nova taxa de dose no mês da irradiação
(março 2006) obtendo uma taxa de dose de 1.29 Gy/min.
Figura 5.4 Irradiador IBL 637. A) Foto do irradiador. B) Curvas de isodose. C) Posições do irradiador.
A taxa de dose mencionada anteriormente (1.31 Gy/min) foi encontrada em uma revisão
da documentação do irradiador. Por causa da ausência do responsável da dosimetria a
taxa de dose tinha sido erroneamente reportada, com uma estimativa de 1.5 vezes maior
que a real, causada por uma má leitura do informe do Laboratório de Dosimetria do
IFUSP [Okuno 2005]. Por este motivo as doses reais e corrigidas depositadas nas
amostras foram calculadas dividindo a dose planejada por um fator 1.5. Baseados nas
observações das irradiações com
60
Co as doses planejadas inicialmente foram, 1, 2, 3, 4,
5, 7, 12,15,20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,120, 150, 200, 250, 300, 350, 400,
450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000,
4400, 4654 e 4900 Gy. Estas dependeram das condições das amostras. Aquelas que
possuíam maior concentração de Glicerol receberam doses maiores. As doses recebidas
foram cumulativas e as amostras foram retiradas do suporte à medida que alcançavam
as doses planejadas, figura 5.5.
A)
B)
C)
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
57
Figura 5.5 Geometria das amostras no irradiador de
137
Cs IBL-637. As amostras ficaram num plano
horizontal e foram retiradas à medida que acumulavam as doses predefinidas para cada uma.
5.5.3 Géis de eletroforese e quantificação
Posteriormente a irradiação, foram adicionados 20 µl de água destilada e 3 µl de Stop
Mix
para as amostras sem scavenger totalizando 33 µl em cada uma. Desta forma a
concentração final para a aplicação no gel foi de 80 ng/µl, recomendável para aplicação
no gel (resultados do ponto 5.2). Para o resto das amostras só foram adicionados 3 µl de
Stop Mix, obtendo uma concentração final de 80 ng/µl, igual ao das amostras sem
scavenger. Os géis de eletroforese e a quantificação foram feitos seguindo a
metodologia apresentada na seção 5.3.3.
Os resultados de G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA plasmidial com gama de
137
Cs são apresentados no capítulo 6, seções 6.5 e 6.6.
5.6 G(SSB) e G(DSB) para irradiações de DNA com prótons de 10 MeV.
A seguir são apresentados os procedimentos realizados para a irradiação do DNA
plasmidial com prótons. O principal objetivo desta irradiação foi obter dados
preliminares de rendimentos de quebras simples e duplas que permitissem realizar
comparações quantitativas com relação aos dados obtidos com radiação gama.
Por causa do reduzido tempo de máquina para realizar as irradiações, o DNA foi
irradiado somente em duas condições extremas. Estas foram: sem presença de
scavenger e com 200 mM de Glicerol. A concentração de DNA foi mantida constante.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
58
5.6.1 Preparação das amostras
O DNA utilizado para este trabalho foi o mesmo plasmídeo pBKs. Na data de
preparação das amostras o estoque de DNA foi o mesmo que o utilizado nas irradiações
com gama de
60
Co. Com ele foram preparadas dois tipos de amostras, uma sem
scavenger e a outra com Glicerol a 200 mM, ambas com DNA na concentração de 200
ng/µl. A preparação das duas soluções foram realizadas de forma similar às amostras
200ng/µl-0mM e 200ng/µl-200mM, apresentadas nas tabelas das irradiações com gama
de
60
Co da seção 5.4.1.
5.6.2 Arranjo experimental e cálculo da dose
As irradiações com prótons foram feitas no feixe externo do acelerador tipo Pelletron
situado no Instituto de Física da USP. Foi utilizado um porta-amostra desenhado
especificamente para esta irradiação [Echeimberg 2003].
O DNA foi depositado na parte central, e vedado com folhas de Makrofol. Logo o
conjunto foi parafusado e colocado num suporte, figura 5.6. Este suporte para porta-
amostra foi projetado para ser encaixado na antena presente no Pelletron, e manter os
alvos perpendiculares ao feixe espalhado de 20
o
, em relação ao eixo de incidência,
figura 5.7. Para isto um feixe de prótons com energia de 14 MeV atinge uma folha de
alumínio de 0,5 mm de espessura e, ao colidir com os núcleos de Al, sofre
espalhamento elástico. Segundo a equação de espalhamento de Rutherford, a 20
o
são
encontrados prótons com 10 MeV. Vários motivos levaram a esta configuração. Um foi
diminuir a taxa de dose e a elevação da temperatura levando em conta que a corrente
média do feixe central era de 600 nA, e o outro foi permitir controlar a dose nas
amostras utilizando um copo de Faraday no final do feixe. figura 5.7.
Figura 5.6. Porta-amostras e suporte. As amostras são depositadas no centro do porta-amostras e vedadas
com Makrofol.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
59
Para a estimativa da dose foi utilizada a metodologia desenvolvida por [Echeimberg
2003]. Medindo o número de prótons que chegam ao copo de Faraday (carga integrada)
é possível estimar por Rutherford o número de prótons que chegaram às amostras.
Multiplicando estes pela energia depositada e dividindo pela massa da amostra é
determinada a dose.
Figura 5.7. Montagem das peças na saída do feixe de prótons. As amostras ficam perpendiculares ao
feixe espalhado de 20
o
.
O suporte que é colocado na antena possui uma capacidade para seis porta-amostras.
Para a calibração do número de prótons que chegam às seis posições em função do
número de prótons que chegam ao Copo de Faraday, dois detectores de estado sólido
foram colocados em cada um destes lugares. Os resultados mostraram uma boa simetria
do feixe e que os prótons esperados a 20
o
, Np (calculados por Rutherford) apresentaram
um valor 7.14 maior que os medidos, atribuído à coleta de carga no copo de Faraday.
Levando em conta isto foi introduzido um fator de correção f
c
, igual a 0.14 (1/7.14)
multiplicando a
Np [Echeimberg 2003].
O número de prótons que chegam à amostra calculada a partir da carga integrada no
Copo de Faraday será:
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⋅⋅Ω⋅
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
Ω
⋅=⋅=
−
e
q
d
d
d
fNfn
i
Rut
cpcp
η
σ
, [5.2]
onde Ωd é o ângulo sólido determinado pela amostra,
(
)
Rut
dd
Ω
σ
representa a seção de
choque de espalhamento Rutherford para 20
o
,
η
é a densidade superficial de núcleos na
janela espalhadora de Alumínio por m
2
, q
i
é a carga integrada no copo de Faraday em
Coulomb, e
-
é a carga do elétron.
A energia depositada pelos prótons que chegam à amostra foi determinada por meio de
simulações. A curva de transferência linear de energia dos prótons foi obtida na
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
60
simulação do montagem de irradiação no GEANT 3.2.1. A energia depositada foi
estimada integrando a região do gráfico que representa o volume da amostra de DNA
[Echeimberg 2003].
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Região que contém
a amostra de ADN
<E
C
p
> = 10 MeV
m aterial H
2
O
Transferência linear de energia (LET) do próton versus a posição no
eixo de incidência
LET(keV.µm
-1
)
posição do próton (µ m)
Figura 5.8 Curva de transferência Linear de Energia para prótons de 10 MeV simulada com o GEANT
[Echeimberg 2003].
A equação final para o cálculo da dose é:
m
lLETn
D
p
][ ∆⋅⋅
=
, [5.3]
onde o termo entre colchetes representa a energia depositada, sendo LE
T
a
transferência linear de Energia média na região de comprimento l∆ no gráfico,
correspondente à espessura da amostra de DNA e m é massa da amostra. O valor de
LE
T
na região de irradiação foi de 5 keV/µm=8E-16 J/ µm (1eV=1.6E-19 J) e o l∆ de
0.26 mm. A massa da amostra
lS
∆
⋅
⋅
ρ
foi de 5.11x10
-6
kg, onde
ρ
é a densidade da
solução (≈ 10
-3
g/mm
-3
), S a área da seção transversal da amostra (circulo de 2.5 mm de
radio e área 19.6 mm
2
). O volume de cada amostra era aproximadamente 5 µl.
Substituindo os dados anteriores se obtém que
Gy
e
q
D
i
8
1007.4
−
×⋅
⎟
⎠
⎞
⎜
⎝
⎛
=
. [5.4]
A taxa de dose vai depender do número de prótons que chegam ao copo de Faraday na
unidade do tempo e, por conseguinte da corrente do Feixe. Esta corrente não é
totalmente estável durante o experimento, nem a taxa de dose, porém em média a taxa
de dose na irradiação foi de 11.9 Gy/min.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
61
5.6.3 Irradiação das amostras
As irradiações das amostras foram feitas em quatro grupos (A, B, C e D) com o objetivo
de repetir as doses três vezes. Amostras de 5 µl foram pipetadas nos porta-amostras e
fixadas no suporte, acoplado na antena do sistema de irradiação. Na tabela 5.9 aparecem
as amostras que foram colocadas em cada uma das posições do irradiador. O número
indica a dose recebida, a letra a ordem de irradiação e o número (1) se não apresentava
scavenger, o (2) se continham Glicerol. No momento em que uma amostra recebia a
dose planejada, a mesma era substituída por outra amostra. As doses maiores foram
dadas de forma cumulativa. A dose recebida foi controlada pela carga integrada no copo
de Faraday.
Tabela 5.9 Amostras e doses das quatro irradiações A, B, C e D feitas com prótons.
Irradiação A
Posição no
suporte
1 2 3 4 5 6
150-A1 150-A2
250-A1
400-A1 400-A1 400-A2 400-A2
250-A2
30-A1 30-A2
10-A1
40-A1 40-A1 40-A2 40-A2
10-A2
20-A1 20-A2
Amostras
50-A1
70-A1 70-A1 70-A2 70-A2
50-A2
Irradiação B
Posição no
suporte
1 2 3 4 5 6
30-B1 30-B1 30-B2 30-B2
10-B1 10-B1
40-B1 40-B2
10-B2 10-B2
20-B1 20-B1 20-B2 20-B2
50-B1 50-B1
70-B1 70-B2
50-B2 50-B2
150-B1 150-B1 150-B2 150-B2
Amostras
250-B1 250-B1
400-B1 400-B2
250-B2 250-B2
Irradiação C
Posição no
suporte
1 2 3 4 5 6
300-C1 300-C1
200-C1 200-C1
500-C2 500-C2
110-C1 110-C1
Amostras
90-C1 90-C1
700-C1 700-C2
200-C2 200-C2
Irradiação D
Posição no
suporte
1 2 3 4 5 6
300-D1
200-D1
500-D2
110-D1
Amostras
90-D1
700-D1 700-D1 700-D2 700-D2
200-D2
No término da irradiação de cada amostra o porta-amostra era lavado com água
destilada, secado e preparado com uma nova amostra.
Capítulo 5. Materiais e Métodos.
62
5.6.4 Géis de eletroforese e quantificação
Todas as amostras de 5 µl e 200ng/µl de DNA, foram completadas com 15 µl de água
destilada e 2 µl de Stop Mix, resultando num volume final de 22 µl. Os géis de
eletroforese foram corridos nas mesmas condições que no caso das irradiações com
gama, 10 µl por poço em géis de 0.7% de agarose, num potencial de 5 V/cm e durante
duas horas. As imagens guardadas em formato BMP foram analisadas utilizando o
programa GelAnalis.
Os resultados dos rendimentos de quebras simples e duplas com prótons são
apresentados no capítulo 6, seção 6.7.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
63
CAPÍTULO 6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.
Neste capítulo são apresentados os resultados obtidos em cada um dos trabalhos
desenvolvidos na tese. Primeiramente são mostrados os resultados do estudo de
otimização da técnica de eletroforese mencionado no epigrafe 5.2. Posteriormente são
mostrados os resultados e as análises para os estudos 5.3, 5.4, 5.5 e 5.6, envolvendo
irradiações com gama de
60
Co e
137
Cs e irradiações com prótons de 10 MeV.
6.1 Resultados da otimização da técnica de eletroforese em gel de agarose
Para realizar o estudo de otimização da técnica de eletroforese, os géis corridos e
fotografados eram quantificados com o programa GelAnalis, desenvolvido para este
propósito. Portanto, o primeiro passo foi estudar como realizar uma boa quantificação
das bandas utilizando o programa.
6.1.1 Quantificação das bandas de DNA
O processo de quantificação foi dividido em três partes: trabalho com o fundo, análise
das bandas, e relatório dos dados. No trabalho com o fundo foi removida a
luminosidade produzida pelo Brometo de Etídio presente no gel e que não estava ligado
ao DNA. Em nosso caso, este se encontrava na concentração de 0.5 µg/ml dentro do
gel. Em geral, o nível de fundo gerado pelo Brometo não ligado foi muito baixo, já que
sua fluorescência é de 20 a 30 vezes menor que o DNA ligado [Sambrook and Russell
2001]. Porém, nos casos em que a presença de DNA foi baixa e o número de
integrações é grande, a presença deste fundo se fez relevante. Para a remoção do fundo
foi utilizada principalmente a ferramenta do programa que permite eliminar um valor
fixo para todos os pixels da imagem. Nas ocasiões em que a distribuição do Brometo
não era homogênea, o fundo foi eliminado da imagem por meio de equações lineares
[Apêndice 1]. Os resultados mostraram que o melhor critério para a remoção foi tentar
minimizar os níveis de fundo sem chegar a afetar as conformações das bandas. Um
predomínio da cor negra na imagem final do gel indicava uma boa remoção.
Na análise das bandas, para os géis com boa remoção de fundo, o método de seleção da
banda por meio de regiões retangulares mostrou bons resultados. Nestes casos a
variação do tamanho do retângulo não introduziu nenhuma variação na luminosidade
óptica integrada. Já nos casos em que aconteceu uma leve superposição de bandas ou
Capítulo 6. Resultados e discussão.
64
existiu presença de algum fundo, a ferramenta de seleção automática por cor de
tolerância (veja Apêndice 1, seção 3), mostrou melhores resultados. Em certos casos
isolados, onde o DNA fracionado misturava-se com DNA linear, somente era possível
utilizar a ferramenta de ajuste simultâneo de picos (veja Apêndice 1, seção 3). Os dois
tipos de relatórios que o programa produz (veja apêndice 1, seção 4), foram guardados
em todo momento, permitindo desta forma analisar os passos feitos em cada
quantificação e importar os resultados em programas de análise como o Microsoft Excel
e Microcal Origin.
6.1.2 Efeito do Brometo de Etídio
Também foi estudado o efeito dos géis pré-corados e pós-corados com Brometo de
Etídio na quantificação das bandas de DNA. Os resultados obtidos das corridas
mostraram primeiramente que, para as amostras contendo os três tipos de DNA do
estudo (SC, Cir e Lin), os géis pré-corados apresentaram um maior poder de separação
nas mesmas condições de corridas, figura 6.1.
A melhoria na separação das bandas no caso dos géis pré-corados é devida à
intercalação do Brometo na molécula de DNA. O mesmo se liga num plano
perpendicular ao do eixo da molécula de DNA, aumentando desta forma a resistência
que o gel oferece à migração das moléculas. Por outro lado, esta resistência não será
igual para todos os tipos de DNA. O DNA SC tem uma aderência menor ao Brometo
[Anexo2] que o Cir e Lin, desta forma o DNA circular superenovelado migra a uma
velocidade maior aumentando desta forma a separação com respeito às outras bandas.
Isto pode ser observado também na figura 6.1.
Figura 6.1. Esquerda: Gel pré-corado com Brometo. Direita: Gel corado após corrida. O gel da esquerda
mostrou um maior poder de separação das bandas SC, Cir e Lin que o da direita.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
65
Na quantificação do Ladder de Massa (padrão de massa) nos géis previamente corados
(pré-corados) a linearidade da luminosidade com respeito à massa foi muito melhor que
no gel corado posteriormente (pós-corados), como mostra a figura 6.2. Uma possível
explicação é que, para os géis pré-corados, a eficiência de intercalação do Brometo é
muito maior, já que o DNA vai ao encontro do corante ao longo do seu caminho. No
outro caso, o corante é quem vai até o DNA por difusão para se intercalar. É possível de
observar esta deficiência na ligação através da quantificação das bandas do Ladder de
massa da figura 6.1. Esta quantificação é mostrada na figura 6.2. No gráfico é apreciável
como no caso das amostras pós-coradas há perda da linearidade à medida que a massa
de DNA aumenta.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
Luminosidade integrada da banda
Massa Ladder (ng)
Gel pré-corado
Gel pós-corado
Figura 6.2 Curva de calibração de luminosidade óptica integrada em função da massa. O gel pré-corado
mostrou uma melhor linearidade que o pós-corado com Brometo. Pontos ajustados a funções de segundo
grau.
6.1.3 Efeito da concentração de agarose
Para estudar o efeito da concentração de agarose foram corridos géis com concentrações
de 0.7%, 0.8% e 1.0%. Os resultados obtidos mostraram que os géis com 0.7%
conseguiram uma boa separação dos três tipos de DNA num tempo de duas horas. Já
para os géis com 1% o tempo necessário para uma boa separação foi de 3 horas. Estas
observações estiveram condicionadas à voltagem aplicada. Em todos os casos observou-
se que corridas com voltagens altas (entre 7.5 e 12 V/cm) podiam aumentar muito a
velocidade de migração do DNA, que terminava saindo do gel pelo extremo inferior
Capítulo 6. Resultados e discussão.
66
antes de se conseguir uma boa separação das bandas. Por outro lado, corridas com
voltagens muito pequenas (entre 2 a 4 V/cm) melhoravam o poder de separação, mas o
tempo de corrida aumentava muito (entre 4 e 6 horas). Os resultados mostraram que os
géis com 0.7% de agarose e com um potencial de 5 V/cm permitiam uma ótima
separação das bandas em 2 horas aproximadamente.
6.1.4 Efeito da quantidade de DNA aplicada por poço do gel.
Outro parâmetro que foi estudado na hora de correr o gel é a quantidade de DNA a
colocar por poço para ser separado pelo Gel. Uma quantidade muito elevada de DNA
pode fazer com que o tamanho das bandas seja muito grande e estas terminem se
sobrepondo uma à outra. Por outro lado, quantidades muito pequenas podem produzir
bandas muito estreitas, as quais aumentam os erros na quantificação. Por isso foi
estudada qual era a melhor quantidade de DNA a ser aplicada por poço.
Em nosso estudo foram utilizados dois tipos de pentes para gerar os poços no gel. Um
para géis pequenos produzindo 8 lugares e o outro para géis grandes produzindo 15
poços. As dimensões de cada poço foram 5x2x4mm e a altura em média dos géis
preparados de 6 mm.
Quatro amostras com concentrações diferentes de DNA foram aplicadas nos 15 poços
do Gel. Três tipos de amostras foram repetidas quatro vezes e uma só três. As amostras
tinham presença de DNA SC e Cir e as concentrações foram de 9, 45, 80 e 90 ng/µl, e o
volume aplicado foi de 10 µl
Figura 6.3 Gel com diferentes quantidades de DNA aplicadas. Foram aplicados 10 µl de soluções com 9,
45, 80 e 90 ng/µl de DNA.
Os resultados mostraram que para aplicações nos poços com as concentrações de 9
ng/µl e 45 ng/µl as separações das bandas foram as melhores, no entanto a relação entre
o fundo e a densidade ótica integrada das bandas foram as maiores, aumentando os erros
na quantificação. Por outro lado, para bandas com mais de 900 ng pode-se observar que
90 ng 450 ng 900 ng 800 ng
Capítulo 6. Resultados e discussão.
67
as bandas começam a se sobrepor, figura 6.3. Portanto foi decidido utilizar para o
trabalho aplicações de cerca de 800 ng de DNA por poço do gel para realizar a
separação das três conformações por eletroforese.
6.1.5 Determinação do melhor número de integrações
Outro fator importante antes de realizar a quantificação das bandas de DNA está
relacionado com o número de integrações (tempo de exposição) com que deve ser feita
a fotografia do gel de eletroforese. Para o estudo foram quantificadas as bandas do
Ladder de massa num gel fotografado com diferentes tempos de exposição. A seguir foi
analisada a linearidade da luminosidade em função da massa em cada banda, figura 6.4.
Os resultados mostraram que poucas integrações conservam de forma satisfatória a
linearidade. Por outro lado, com o incremento do número de integrações é possível
apreciar melhor o comportamento apresentado pelo fundo assim como a forma e
quantidade das bandas de DNA, figura 6.5.
Figura 6.4 Imagem de Ladder de massa com quatro integrações diferentes e luminosidade das bandas em
função das massas.
0 50 100 150 200 250 300
0
3500
7000
10500
14000
DOI total horizontal
posição na vertical (pixels)
Integrações
3 int.
5 int.
10 int.
15 int.
Figura 6.5 Perfil das imagens dos géis da figura 6.5 mostrando como com o aumento do número de
integrações o comportamento do fundo pode ser melhor apreciado, mas a saturação faz com que nem
todas as bandas aumentem sua DOI (densidade óptica integrada).
3
in
t
.
5
in
t.
1
0
in
t.
1
5
in
t
.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
Luimonidade
Massa de DNA (ng)
3 integ.
5 integ.
10 integ.
15 integ.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
68
A perda da linearidade da DOI em função da massa para o Ladder com o aumento do
número de integrações é provocada pela aparição de saturação da luminosidade nas
bandas de DNA. Isto é provocado pela impossibilidade dos CCD (Couple Charge
Device) da câmera de converter a luz que chega neles a um valor maior que 255. O
software do sistema de aquisição da imagem do gel permite observar se a fotografia
apresenta saturação, assim como o programa de quantificação também mostra se tem
saturação. Nas imagens da figura 6.4 é mostrada em vermelho a saturação das bandas.
Com o aumento do número de integrações a cor vermelha se faz predominante
indicando que existe perda de informação na imagem.
O critério final escolhido para a exposição das imagens foi escolher o maior número de
integrações em que a imagem não apresenta nenhuma saturação. Isto garantiu obter a
maior quantidade de informação do gel mantendo a linearidade entre a luminosidade e a
massa de DNA.
6.1.6 Metodologia final otimizada. Discussão
Os resultados da otimização da técnica de eletroforese permitiram obter uma
metodologia rápida, eficiente e precisa para a análise de um grande número de amostras
em pouco tempo.
Para realizar a separação das diferentes conformações finais do DNA irradiado foram
utilizados géis com 0.7% de agarose, corados previamente com Brometo de Etídio a
uma concentração de 0.5 µg/ml. Em todas as corridas os géis foram submetidos a um
gradiente de voltagem de 5 V/cm. Com este gradiente em duas horas os géis separavam
de 450ng a 800ng de DNA plasmidial em suas três conformações: circular
superenovelado, circular relaxado e lineal.
As imagens dos géis foram tomadas com o sistema Eagle Eye CCD video camera
system
®
com um tamanho de 640x480 pixels e 8bits de resolução. Antes de tomar as
fotografias dos géis, foi colocado primeiro um padrão de prova para ajustar a posição e
o foco da câmera CCD. Depois era colocado o gel a fotografar. A luminosidade das
bandas na fotografia final foi controlada através do número de intregações (1/30
segundos). As fotografias dos géis foram feitas com o maior número de integrações tal
que não causassem a saturação luminosa das bandas. As imagens finais foram
guardadas em formato de mapa de bit, BMP (BitMap Picture), sem compressão para
evitar a perda de informação das imagens comprimidas. Posteriormente, com as fotos e
o programa GelAnalis foram realizadas as quantificações das bandas do DNA. No
Capítulo 6. Resultados e discussão.
69
processo de quantificação primeiro foi removido o fundo. Para isso, tomou-se como
referência o perfil do fundo nas regiões do gel onde não existia DNA. A seguir as
bandas foram selecionadas por retângulos ou por cor de tolerância e quantificadas. Os
passos de quantificação e os resultados foram guardados em dois arquivos separados.
Posteriormente os dados da luminosidade foram importados no programa Microsoft
Excel e desta forma foi possível calcular as frações de DNA em cada conformação para
as diferentes amostras. As luminosidades de DNA SC foram multiplicadas pelo fator
1.7 para levar em conta a deficiência no enlace do Brometo de Etídio [Apêndice 2].
6.2 Efeito das frações iniciais de DNA SC e Cir nos rendimentos de SSB e
DSB. Resultados e discussão.
A seguir são mostrados os resultados do estudo sobre o efeito das frações iniciais de
DNA nas formas circular superenovelado e circular relaxado sobre os rendimentos de
quebras simples e duplas.
6.2.1 Géis de eletroforese e resultados da quantificação.
Abaixo são mostrados os géis de eletroforeses das amostras com diferentes
percentagens de DNA SC e Cir, assim como suas respectivas quantificações, figuras 6.6
a 6.9.
Amostras 90%-10%
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
100
SC
Lin
Cir
Percentagem
Dose (Gy)
Figura 6.6 Acima: Gel de irradiação com gama de
60
Co.para amostras com 90%SC+10%Cir inicial.
Doses: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 130, 180, 250 Gy. As linhas servem para guiar a vista.
Abaixo: Quantificação das bandas.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
70
Amostras com 70%-30%
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
SC
Lin
Cir
Percentagem
Dose (Gy)
Figura 6.7 Acima: Gel de irradiação com gama de
60
Co para amostras com 70%SC+30%Cir inicial.
Doses: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 130, 180, 250 Gy. As linhas servem para guiar a vista.
Abaixo: Quantificação das bandas.
Amostras 60%-40%
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
SC
Lin
Cir
Percentagem
Dose (Gy)
Figura 6.8 Acima: Gel de irradiação com gama de
60
Co para amostras com 60%SC+40%Cir inicial.
Doses: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 130, 180, 250 Gy. As linhas servem para guiar a vista.
Abaixo) Quantificação das bandas.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
71
Amostras 0%-100%
0 20 40 60 80 100 120 140
0
20
40
60
80
100
SC
Lin
Cir
Percentagem
Dose (Gy)
Figura 6.9 Acima: Gel de irradiação com gama de
60
Co para amostras com 0%SC+100%Cir inicial.
Doses: 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 70, 100, 130, 180, 250 Gy. As linhas servem para guiar a vista.
Abaixo: Quantificação das bandas.
6.2.2 Análise e discussão dos efeitos do DNA Cir inicial sobre o G(SSB).
Com os valores das frações de DNA circular superenovelado dos resultados da seção
anterior, é possível calcular os rendimentos de produção de rupturas simples e duplas
em unidades de µmol/J e Gy
-1
Da
-1
(veja capitulo 4, seção 4.4.2 e 4.4.3). Na figura 6.10
são mostrados os ajustes exponenciais e na tabela 6.1 são reportados os rendimentos
calculados destes ajustes.
0 20406080
1
10
100
Percentagem de SC
dose(Gy)
90%-10%
70%-10%
60%-40%
Figura 6.10 Frações de DNA SC com 90%, 70% e 60%, ajustados a função y=y
o
exp(-λ*D), irradiado
com raios gama de
60
Co.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
72
Os cálculos dos rendimentos foram feitos utilizando as equações 4.22, e 4.23, onde a
concentração de DNA foi 5.20E-2 µmol dm
-3
(100 ng/µl) e o número de pares de base
foi 2961 bp.
Tabela 6.1 G(SSB) em função da fração inicial de DNA SC.
Razão SC-Cir λ [Gy
-1
] D
37
[Gy] G(SSB) [µmol J
-1
] G(DSB)
[Gy
-1
Da
-1
] erro
90%-10% 3.45(0.10)E-2 28.74(0.85) 1.81(0.05)E-3 1.81(0.05)E-8
3.0%
70%-30% 3.58(0.13) E-2 27.92(1.01) 1.86(0.07)E-3 1.86(0.07)E-8
3.6%
60%-40% 3.67(0.15) E-2 27.13(1.11) 1.92(0.08)E-3 1.92(0.08)E-8
4.1%
Média 3.58(0.38)E-2 27.93(2.98) 1.86(0.20)E-3 1.86(0.20)E-8 10.7%
Nos gráficos da figura 6.11 são mostrados os valores de rendimento de quebras simples
nas duas unidades comumente utilizadas na bibliografia.
90% 70% 60%
1.0x10
-3
1.5x10
-3
2.0x10
-3
2.5x10
-3
3.0x10
-3
G(SSB)[µmol J
-1
]
Percentagem inicial de SC
Valor medio
90% 70% 60%
1.0x10
-8
1.5x10
-8
2.0x10
-8
2.5x10
-8
3.0x10
-8
G(SSB)[Gy
-1
Da
-1
]
Percentagem inicial de SC
Valor medio
Figura 6.11 Rendimentos de produção de quebras simples para diferentes quantidades iniciais de DNA
circular superenovelado.
Dos resultados é possível concluir que, efetivamente, como previsto pelo modelo de
[Cowan 1987], a variação na quantidade inicial de DNA SC não afeta a produção de
Capítulo 6. Resultados e discussão.
73
quebras simples. Os resultados mostram também que na medida em que a percentagem
inicial de SC diminui o erro na estimativa do G
SSB
aumenta. Isto faz com que não seja
recomendável utilizar porcentagens pequenas de DNA SC inicial. No entanto, para
porcentagens maiores do 70%, os resultados mostram-se confiáveis.
6.2.3 Análise e discussão dos efeitos do DNA Cir inicial sobre o G(DSB).
No trabalho também foi analisado o efeito das diferentes quantidades de DNA inicial
circular relaxado na produção das quebras duplas. Na figura 6.12 são mostradas as
porcentagem de DNA linear em função da dose para as amostras com diferentes
quantidades de DNA circular relaxado inicial.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
percentagem de DNA Linear
Dose [Gy]
90%-10%
70%-30%
60%-40%
0%-100%
Figura 6.12 Porcentagem de DNA linear em função da dose para amostras com 10%, 30%, 40% e 100%
de DNA circular relaxado inicial, irradiado com raios gama de
60
Co.
À primeira vista, é possível observar que as quatro curvas no início possuem diferentes
taxas de produção de DNA linear, tendo uma maior taxa aquelas amostras com maior
quantidade de DNA circular. No entanto, à medida que continua a produção de quebras
pela radiação (aumento da dose), é apreciável que a taxa de produção de DNA linear, e,
portanto de quebras duplas, tende a ser a mesma para os quatro tipos de amostras. Uma
possível explicação a isto é que no momento inicial as amostras com maior quantidade
de DNA são mais propensas à indução de quebras duplas. O DNA circular relaxado
inicial pode possuir várias SSB em diferentes partes da dupla cadeia, mas que não
chegam a converter-se em DSB. Nestas condições, a probabilidade de produzir uma
DSB é alta. À medida que a dose aumenta, são produzidos DSB neste DNA Cir inicial
que vai passando a Lin e simultaneamente uma nova geração de DNA circular relaxado
vai aparecendo como produto das taxa de quebras simples no DNA circular
Capítulo 6. Resultados e discussão.
74
superenovelado inicial, como já foi demonstrado na seção anterior. Esta taxa vai ser
igual em todas as amostras estudadas, portanto, depois de desaparecer a quantidade
inicial de DNA circular relaxado a geração nas amostras de DNA circular relaxado e de
DNA linear passa a ser um processo similar em todos os casos.
Na figura 6.13 é mostrado os ajuste das frações lineares das amostras a polinômios de
segundo grau.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
fração de DNA Linear
Dose [Gy]
90%-10%
70%-30%
60%-40%
0%-100%
Figura 6.13 Ajuste das frações lineares a polinômios de segundo grau (
2
DCDBAy ⋅+⋅+=
). Para os
cálculos de rendimentos de quebras duplas é utilizado o termo linear B da equação.
Os valores de rendimentos de quebras duplas, G(DSB), obtido a partir destes ajustes são
mostrados na tabela 6.2. Para os cálculos foram utilizadas as equações 4.28 e 4.29. O
resto dos parâmetros do cálculo foram similares aos do G(SSB).
Tabela 6.2 G
SSB
em função da fração inicial de DNA SC.
Razão SC-Cir Slope [Gy
-1
] G
DSB
[µmol J
-1
] G
DSB
[Gy
-1
Da
-1
] erro
90%-10% 3.92(0.21)E-3 2.04(0.11)E-4 2.04(0.11)E-9 5.4%
70%-30% 4.34(0.29)E-3 2.26(0.15)E-4 2.25(0.15)E-9 6.8%
60%-40% 6.76(0.40)E-3 3.52(0.20)E-4 3.51(0.20)E-9 5.8%
0%-100% 5.75(0.34)E-3 2.99(0.18)E-4 2.99(0.18)E-9 6.0%
Neste caso é possível notar que os resultados dos rendimentos de quebras duplas, para
amostras com menos de 30% de DNA circular relaxado inicial, são compatíveis. Para
quantidades maiores, a curva começa a perder a linearidade e o termo linear no ajuste
começa a ter uma importância menor provocando flutuações e se afastando do valor
real, como mostra a figura 6.14. Para observar melhor esta compatibilidade, foram
Capítulo 6. Resultados e discussão.
75
agregadas na figura 6.14, bandas que representa a zona de possíveis valores de G(DSB)
para as amostras com 10% e 30% de DNA circular relaxado inicial, respectivamente.
10% 30% 40% 100%
1.0x10
-4
2.0x10
-4
3.0x10
-4
4.0x10
-4
G(DSB)[µmol J
-1
]
Percentagem inicial de Cir
10% 30% 40% 100%
1.0x10
-9
2.0x10
-9
3.0x10
-9
4.0x10
-9
G(DSB)[Gy
-1
Da
-1
]
Percentagem inicial de Cir
Figura 6.14 Rendimentos de produção de quebras duplas para diferentes quantidades iniciais de DNA
Circular. As bandas em vermelho e azul representam a zona do possível valor de G(DSB) para as
amostras com 10% e 30% de DNA circular relaxado inicial, respectivamente.
Deste estudo pode-se concluir que a presença de DNA circular relaxado inicial nas
amostras em estudo em percentagens menores que 30% não produzem variações
significativas nos resultados de rendimentos de quebras simples e duplas. Porém, é
recomendável tentar reduzir a presença do mesmo para obter resultados com maior
exatidão.
6.3 Quantificação de danos em amostras irradiadas com gama de
60
Co.
Abaixo são apresentados os resultados das quantificações dos danos obtidos nas
irradiações de DNA com gama de
60
Co em diferentes condições de concentração e
capacidade de scavenging. Estes estão agrupados em função da concentração de DNA
de cada amostra.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
76
6.3.1 Géis e resultados da quantificação das amostras com 10 ng/µl de DNA.
As figuras 6.15 a, b,c,d e e mostram os géis corridos para as amostras de 10ng/µl.
a)
b)
c)
d)
e)
Figura 6.15. Imagens em escala colorida dos géis para amostras de 10 ng/µl; a) Sem scavenger e de 0 a
180 Gy. b) Com 2mM de Glicerol e de 0 a 180 Gy. c) Com 20 mM e de 0 a 180 Gy. d) Com 200 mM e de
0 a 180 Gy. e) Resto das doses para as mostras de 2 mM, 20 mM, e 200 mM de Glicerol.
Os géis foram quantificados usando o software GelAnalis. Os resultados das
quantificações são mostrados na figura 6.16. Os mesmos foram corrigidos pelo fator 1.7
do enlace do Brometo. O gel da amostra de 10 ng/µl sem scavenger não foi quantificado
já que todo o DNA foi quebrado para a primeira dose de 10 Gy.
200mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
Sem scavenger
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
2mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
2mM
|| 20mM || 200mM
200 250 300 || 200 250 300 || 200 250 300 350 400 500 700 1000 Gy
20mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
Capítulo 6. Resultados e discussão.
77
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 50 100 150 200 250 300
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.16 Resultados da quantificação dos géis de 10ng/µl. a) gel com 2 mM de Glicerol, b) com 20
mM de glicerol, c) com 200 mM. Foram adicionadas linhas para melhor seguimento dos pontos.
2 mM de Glicerol
20 mM de Glicerol
200 mM de Glicerol
c)
b)
a)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
78
6.3.2 Géis e resultados da quantificação das amostras com 50 ng/µl de DNA.
As figuras 6.17 a, b, c, d e e mostram os géis corridos para as amostras com 50ng/µl de
DNA.
a)
b)
c)
d)
e)
Figura 6.17 Imagens em escala colorida dos géis para amostras com 50 ng/µl de DNA; a) Sem
scavenger e de 0 a 180 Gy. b) Com 2 mM de Glicerol e de 0 a 180 Gy. c) Com 20 mM e de 0 a 180 Gy.
d) Com 200 mM e de 0 a 180 Gy. e) Resto das doses para as mostras de 20 mM, e 200 mM.
Sem scavenger
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
2mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
20mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
200mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
20mM
200mM
200 250 300 350 || 200 250 300 350 400 500 700 1000 1200 Gy
Capítulo 6. Resultados e discussão.
79
A quantificação dos géis é mostrada nos gráficos da figura 6.18. Neste caso, o gel sem
scavenger também não foi quantificado.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 200 400 600 800 1000 1200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.18 Resultados da quantificação dos géis de 50ng/µl. a) gel com 2 mM de Glicerol, b) com 20
mM de glicerol, c) com 200 mM. Foram adicionadas linhas para melhor seguimento dos pontos.
2 mM de Glicerol
200 mM de Glicerol
20 mM de Glicerol
a)
b)
c)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
80
6.3.3 Géis e resultados da quantificação das amostras com 200 ng/µl de DNA.
As figuras 6.19 a, b, c, d, e e f mostram os géis corridos para as amostras de 200ng/µl.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Figura 6.19 Imagens em escala colorida dos géis para amostras de 200 ng/µl. a) Sem scavenger e de 0 a
180 Gy. b) Com 2mM de Glicerol e de 0 a 180 Gy. c) Com 20mM e de 0 a 180Gy. d) Resto das amostras
com 2mM e 20mM. e) Com 200 mM e de 0 a 180 Gy. f) Resto das doses para as mostras de 200 mM.
Sem scavenger
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
2mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
20mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
20mM
2mM
200 250 300 350 400 500 200 250 300 Gy
200mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
200mM de Glicerol
200 250 300 350 400 500 700 1000 1200 1500 Gy
Capítulo 6. Resultados e discussão.
81
A quantificação dos géis é mostrada nos gráficos da figura 6.20.
0204060
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
20
40
60
80
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.20 Resultados da quantificação dos géis de 200ng/µl. a) Sem scavengers, b) Gel com 2 mM de
Glicerol, c) Com 20 mM de Glicerol, d) Com 200 mM. Foram adicionadas linhas para melhor seguimento
dos pontos.
.
Sem scaven
g
er
2 mM de Glicerol
20 mM de Glicerol
200 mM de Glicerol
a)
b)
c)
d)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
82
6.3.4 Géis e resultados da quantificação das amostras com 500 ng/µl de DNA.
As figuras 6.21 a, b ,c, d, e e f mostram os géis corridos para as amostras de 500ng/µl.
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Figura 6.21 Imagens em escala colorida dos géis para amostras com 500 ng/µl de DNA. a) Sem
scavenger e de 0 a 180 Gy, b) Com 2 mM de Glicerol e de 0 a 180 Gy. c)Com 20 mM e de 0 a 350Gy, d)
Resto das amostras com 2 mM e 20 mM. e) Com 200 mM e de 0 a 350 Gy. f) Resto das doses para as
mostras de 200 mM.
Sem scavenger
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
2mM de Glicerol
0 10 20 30 40 50 60 70 80 100 120 140 160 180 Gy
20mM de Glicerol
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 250 300 350 Gy
2mM
20mM
200 250 300 350 400 || 350 400 500 700 Gy
200mM de Glicerol
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 250 300 350Gy
200mM de Glicerol
400 500 700 1000 1200 1500 2000 2500 Gy
Capítulo 6. Resultados e discussão.
83
A figura 6.22 mostra os resultados da quantificação das bandas, pelo programa
GelAnalis.
020406080
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 50 100 150 200
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
20
40
60
80
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
0 500 1000 1500 2000 2500
0
20
40
60
80
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.22 Resultados da quantificação dos géis com 500 ng/µl de DNA. a) Sem scavengers. b) Gel
com 2 mM de Glicerol. c) Com 20 mM de Glicerol. d) Com 200 mM. Foram adicionadas linhas para
melhor seguimento dos pontos.
2 mM de Glicerol
20 mM de Glicerol
Sem scaven
g
er
a)
b)
200 mM de Glicerol
c)
d)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
84
6.4 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiação com gama de
60
Co
Ajustando os resultados das quantificações da seção anterior, e utilizando as equações
4.22, 4.23, 4.28 e 4.29, foram calculados os rendimentos de quebras simples e duplas
para cada condição do DNA e o ambiente irradiado.
6.4.1 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 10 ng/µl de DNA
Na figura 6.23 é mostrado o ajuste da percentagem de DNA circular superenovelado a
uma função exponencial. As contastes de decaimento assim como os G(SSB) para cada
ambiente, são reportados na tabela 6.3.
0 200 400 600 800 1000
1
10
100
2mM
20mM
200mM
Percentagem de SC
Dose (Gy)
Figura 6.23. Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com 10ng/µl de DNA e em
diferentes ambientes de scavengers.
Para o cálculo dos rendimentos em µmol/J a concentração de DNA utilizada foi 5.20E-3
µmol/dm
-3
equivalente a 10 ng/µl.
Tabela 6.3. G(SSB) para amostras com 10ng/µl
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB) [µmol J
-1
] G(SSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
10ng/µl-2sc
6.642(0.594)E-2
15.06(1.34) 3.45(0.31)E-4 3.46(0.31)E-8 9.0%
10ng/µl-20sc
1.408(0.045)E-2 71.02(2.27) 7.32(0.23)E-4 7.33(0.23)E-9 3.1%
10ng/µl-200sc
1.89(0.11)E-3
529.1(30.7) 9.83(0.57)E-4
9.84(0.57)E-10 5.8%
Na figura 6.24 são mostrados os ajustes das frações lineares em função da dose. Os
rendimentos de produção de quebras duplas são reportados na tabela 6.4.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
85
0 200 400 600 800 1000
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
Fração Linear
Dose(Gy)
2mM
20mM
200mM
Figura 6.24 Ajuste das frações lineares em função da dose para as amostras com 10ng/µl de DNA e em
diferentes ambientes de scavengers.
Tabela 6.4 G(DSB) para amostras de 10ng/µl
Amostra Slope [Gy
-1
]
G(DSB) [µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
10ng/µl-2sc
9.28(0.32)E-4 4.82(0.16)E-6 4.82(0.16)E-10
3.4%
10ng/µl-20sc
3.62(0.11)E-4
1.88(0.52)E-6 1.88(0.53)E-10
2.8%
10ng/µl-200sc
7.56(0.20)E-5
3.93(0.10)E-7 3.93(0.79)E-11
2.6%
6.4.2 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 50 ng/µl de DNA
Na figura 6.25 e na tabela 6.5 são mostrados os ajustes das percentagens SC assim como
os resultados dos rendimentos de quebras simples para as amostras com 50 ng/µl de
DNA.
0 200 400 600 800 1000 1200
1
10
100
2mM
20mM
200mM
Percentagem de SC
Dose (Gy)
Figura 6.25 Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com 50ng/µl de DNA.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
86
A concentração utilizada para os cálculos foi de 2.60E-2 µmol dm
-3
o equivalente a 50
ng/µl para um DNA com 2961 pb.
Tabela 6.5 G(SSB) para amostras com 50ng/µl
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB)[µmol J
-1
] G(SSB)[Gy
-1
Da
-1
]
erro
50ng/µl-2sc
4.072(0.164)E-2
24.56(0.99) 1.06(0.04)E-3 2.12(0.09)E-8 4.2%
50ng/µl-20sc
1.109(0.044)E-2 90.17(3.58) 2.88(0.11)E-4 5.78 (0.23)E-9 4.0%
50ng/µl-200sc
1.68(0.05)E-3
595.2(17.7) 4.37(0.13)E-5 8.75(0.26)E-10 3.0%
A seguir são mostrados, na figura 6.26, os ajustes para as frações lineares e os
resultados dos rendimentos de produção de quebras duplas, tabela 6.6.
0 200 400 600 800 1000 1200
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.16
0.18
0.20
2mM
20mM
200mM
Fração Linear
Dose(Gy)
Figura 6.26 Ajuste das frações lineares em função da dose para as amostras com 50ng/µl de DNA e em
diferentes ambientes de scavengers.
Tabela 6.6 G(DSB) para amostras de 50ng/µl
Amostra Slope [Gy
-1
]
G(DSB) [µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
50ng/µl-2sc
9.68(0.41)E-4
2.52(0.11)E-5
5.03(0.21)E-10
4.2%
50ng/µl-20sc
3.73(0.12)E-4
9.71(0.30)E-6
1.94(0.60)E-10
3.1%
50ng/µl-200sc
7.81(0.23)E-5
2.03(0.59)E-6
4.06(0.12)E-11
2.9%
6.4.3 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 200 ng/µl de DNA
Neste caso foi possível realizar a análise das amostras sem presença de scavenger. A
figura 6.27 e a tabela 6.7 mostram os ajustes e os resultados para as amostras com 200
ng/µl. A concentração de DNA para os cálculos neste caso foi 1.04E-1 µmol dm
-3
.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
87
-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
1
10
100
0 Sc
2mM
20mM
200mM
Percentagem de SC
Dose(Gy)
Figura 6.27 Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com 200 ng/µl de DNA.
Tabela 6.7 G(SSB) para amostras com 200ng/µl
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB) [µmol J
-1
] G(SSB)
[Gy
-1
Da
-1
]
erro
200ng/µl-0sc
1.66(0.19)E-1 6.02(0.69) 1.73(0.20)E-2 8.65(1.00)E-8 11.5%
200ng/µl-2sc
3.32(0.15)E-1
30.2(1.3) 3.45(0.15)E-3 1.73(0.08)E-8 4.5%
200ng/µl-20sc
1.00(0.03)E-2 100(3) 1.04(0.03)E-3 5.21(0.16)E-9 3.1%
200ng/µl-200sc
1.19(0.02)E-3
840(14) 1.24(0.02)E-4 6.20(0.10)E-10 1.7%
A seguir, na figura 6.28 e na tabela 6.8 são mostrados os ajustes para o DNA linear e os
rendimentos de quebras duplas para as amostras com 200 ng/µl.
0 100 200 300 400 500 600 700
0
5
10
15
20
Fração de Linear
Dose(Gy)
0mM
2mM
20mM
200mM
Figura 6.28 Ajuste das frações lineares em função da dose para as amostras com 200ng/µl de DNA e em
diferentes ambientes de scavengers.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
88
Tabela 6.8 G(DSB) para amostras de 200ng/µl
Amostra Slope [Gy
-1
]
G(DSB)
[µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
200ng/µl-0sc
4.37(0.25)E-3
4.54(0.14)E-4
2.27(0.13)E-9
5.8%
200ng/µl-2sc
1.05(0.46)E-3
1.09(0.18)E-4
5.44(0.24)E-10
4.4%
200ng/µl-20sc
4.58(0.18)E-4
4.76(0.04)E-5
2.38(0.93)E-10
3.9%
200ng/µl-200sc
8.41(0.56)E-5
8.75(0.05)E-6
4.37(0.29)E-11
6.7%
6.4.4 G(SSB) e G(DSB) para amostras com 500ng/µl de DNA
Neste caso também foi possível o análise de amostras sem presença de scavengers. A
figura 6.29 e a tabela 6.9 mostram os ajustes e os resultados dos rendimentos de quebras
simples para as amostras com 500 ng/µl de DNA.
0 400 800 1200 1600
1
10
100
0 SC
2mM
20mM
200mM
Percentagem de SC
Dose (Gy)
Figura 6.29 Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com 500ng/µl de DNA.
Para o cálculo dos rendimentos a concentração de DNA utilizada foi de 2.60E-1 µmol
dm
-3
.
Tabela 6.9 G(SSB) para amostras com 500ng/µl
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB) [µmol J
-1
] G(SSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
500ng/µl-0sc
7.521(0.734)E-2 13.3(1.3) 1.95(0.19)E-2 3.92(0.38)E-8 9.8%
500ng/µl-2sc
3.347(0.185)E-2
29.9(1.7) 8.70(0.48)E-3 1.74(0.10)E-8 5.5%
500ng/µl-20sc
1.085(0.031)E-2 92.2(2.6) 2.82(0.08)E-3 5.65(0.16)E-9 2.8%
500ng/µl-200sc
1.42(0.03)E-3
704(15) 3.69(0.08)E-4 7.40(0.16)E-10 2.1%
A figura 6.30 mostra o ajuste da fração de DNA linear em função da dose para as
amostras com 500 ng/µl. Na tabela 6.10 são reportados os rendimentos de quebras
duplas para estas amostras.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
89
0 200 400 600 800 1000
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
Fração de Linear
Dose(Gy)
0mM
2mM
20mM
200mM
Figura 6.30 Ajuste das frações lineares em função da dose para as amostras com 500ng/µl de DNA e em
diferentes ambientes de scavengers.
Tabela 6.10 G(DSB) para amostras de 500ng/µl
Amostra Slope [Gy
-1
]
G(DSB)
[µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
500ng/µl-0sc
1.82(0.12)E-3
4.74(0.30)E-4
9.47(0.61)E-10
6.4%
500ng/µl-2sc
9.33(0.51)E-4
2.43(0.13)E-4
4.85(0.27)E-10
5.5%
500ng/µl-20sc
4.37(0.27)E-4
1.14(0.07)E-4
2.27(0.14)E-10
6.1%
500ng/µl-200sc
8.16(0.59)E-5
2.12(0.15)E-5
4.24(0.30)E-11
7.2%
6.4.5 Análise e discussão dos efeitos da concentração de DNA e de scavenger na
produção de SSB e DSB
A figura 6.31 mostra os rendimentos de moléculas com quebras simples e duplas em
função da concentração de DNA para os diferentes ambientes. É possível observar que
com o aumento da quantidade de DNA na amostra aumenta o rendimento de moléculas
com quebras simples e duplas por unidade de energia. No entanto isto não acontece com
as amostras livres de scavenger. Neste caso, a variação é muito pequena. Este resultado
era esperado, já que foi observado por outros autores (Milligan 1993). A possível
explicação para isto é que nestas condições (ausência de scavenger), o efeito indireto é
altamente predominante. Este efeito vai depender da taxa de produção do radical
hidroxila. Portanto todos os radicais que conseguem escapar da zona de spurs (Jonah
and Miller 1977) vão interagir com o DNA independentemente da sua concentração. A
densidade de radicais será igual em todas as amostras sem scavenger e, portanto, a
Capítulo 6. Resultados e discussão.
90
probabilidade de quebras para qualquer concentração de DNA. Por outro lado à
presença de scavenger faz com que se estabeleça uma competição entre os DNA e os
captadores pela reação com os radicais produzidos na radiólise. Neste caso, o aumento
da concentração de DNA produz um aumento na taxa de reação radical-DNA,
diminuindo a taxa de reação radical-scavenger Isto explica o incremento nos
rendimentos de SSB e DSB com o aumento da concentração de DNA.
Figura 6.31 Rendimentos de moleculas com quebras simples e duplas em função da concentração do
plasmideo na amostra e para diferentes concentrações de scavenger.
Também é possível observar que com o aumento da concentração de scavenger,
mantendo a mesma concentração de DNA, temos uma diminuição das moléculas com
quebras. Neste caso, de forma similar, o incremento da quantidade de scavenger
aumenta a taxa de reação radical-scavenger, diminuindo a taxa de reação radical-DNA
e, portanto a produção de moléculas com danos.
Figura 6.32 Rendimentos de moleculas com quebras simples e duplas em função da concentração de
scavenger na amostra e para diferentes concentrações de plasmideo.
10 100
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
0 mM
2 mM
20 mM
200 mM
G(SSB) (µmol J
-1
)
Concentração de DNA (µg ml
-1
)
1 10 100
1E-5
1E-4
1E-3
0.01
10 ng/ul
50 ng/ul
200 ng/ul
500 ng/ul
G(SSB) (µmol J
-1
)
Concentração de Glicerol (mM)
1 10 100
1E-7
1E-6
1E-5
1E-4
1E-3
10 ng/ul
50 ng/ul
200 ng/ul
500 ng/ul
G(DSB) (µmol J
-1
)
Concentração de Glicerol (mM)
10 100
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
0 mM
2 mM
20 mM
200 mM
G(DSB) (µmol J
-1
)
Concentração de DNA (µg ml
-1
)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
91
A figura 6.32 mostra mais claramente como o aumento da concentranção de scavenger
diminui o número de moleculas com quebras simples e duplas de forma praticamente
linear num gráfico log-log.
Outro resultado importante e também esperado foi o rendimento de produção de quebras
por par de base (Gy
-1
Da
-1
). Neste caso os G(SSB) e G(DSB) são reportados
normalizados pelo número total de pares de base da molécula de DNA e pela dose,
representando, portanto o rendimento ou probabilidade de quebras por par de base e por
Gy. Esta forma de expressar os resultados é útil para realizar comparações com outros
experimentos da literatura, onde os DNA utilizados podem ter cadeias com
cumprimentos diferentes.
A figura 6.33 mostra os rendimentos de quebras simples e duplas normalizadas em
função da concentração de DNA. É possível observar que neste caso a variação dos
G(SSB) e G(DSB) em função da quantidade de DNA é pequena, mantendo-se constante
para amostras com iguais concentrações de scavenger. Isto mostra que na presença de
scavenger o número de moléculas danificadas vai ser quase linearmente proporcional à
concentração de DNA na amostra, o que já foi visto nas seções anteriores.
É observável que isto não ocorre no caso de amostras sem scavenger. Neste caso o
aumento da concentração de DNA faz que o número de quebras por molécula diminua.
Isto é evidente na figura 6.33, onde vemos que o incremento de DNA não produz
incrementos no número de moléculas danificadas, portanto o número de quebras por
moléculas vai diminuir à medida que aumenta sua concentração.
Figura 6.33 Rendimentos de produção de quebras simples e duplas em função da concentração de DNA
para diferentes concentrações de scavenger.
10 100
1E-11
1E-10
1E-9
1E-8
0mM
2mM
20mM
200mM
G(DSB) (Gy
-1
Da
-1
)
Concentração de DNA (µmol ml
-1
)
10 100 1000
1E-9
1E-8
1E-7
0mM
2mM
20mM
200mM
G(SSB)(Gy
-1
Da
-1
)
Concentração de DNA (µg ml
-1
)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
92
Na tabela 6.11 são apresentados a média e as incertezas, dos rendimentos obtidos para
as diferentes concentrações de plasmídeo, em função da capacidade de scavenging para
as irradiações com raios gama de
60
Co. A capacidade de scavenging sem a presença de
Glicerol foi aproximada a 10
5
s
-1
.
Tabela 6.11 Média dos G(SSB) e G(DSB) em função da capacidade de scavenging.
Capacidade
scavenging [s
-1
]
G(SSB)
[Gy
-1
Da
-1
]
erro
G(DSB)
[Gy
-1
Da
-1
]
erro
1.0E5 4.51(0.72)E-8 15.9% 1.18(0.11)E-9 9.4%
3.8E6 1.90(0.10)E-8 5.1% 4.58(0.21)E-10 4.6%
3.8E7 5.78(0.19)E-9 3.2% 1.86(0.07)E-10 3.8%
3.8E8 6.84(0.16)E-10 2.4% 3.52(0.15)E-11 4.1%
Na figura 6.34, os resultados obtidos neste trabalho são comparados com os encontrados
na literatura. Os rendimentos de quebras simples estão de acordo com os obtido pelos
outros grupos e só nas quebras duplas encontra-se um ligeiro incremento. Este aumento
da sensibilidade do DNA às quebras duplas pode estar relacionado com a melhora nas
condições do DNA utilizando o novo método de purificação, e a presença de DNA
circular relaxado nas amostras. Porém os resultados a 200 mM se aproxima muito aos
mais recentes, encontrados por [Leloup 2005].
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7
G(SSB)[Gy
-1
Da
-1
]
scavenging capacity [s
-1
]
dados:
γ of
60
Co
Root 1990 (SV40)
O´Neill 1997
Klimczak 1993 (pBR322)
Leloup 2005 (pHAZE)
Este trabalho
γ - Cobalto 60
Capítulo 6. Resultados e discussão.
93
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-13
10
-12
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
scavenging capacity [s
-1
]
data: γ of
60
Co
Root 1990 (SV40)
O´Neill 1997
Klimczak 1993 (pBR322)
Leloup 2005 (pHAZE)
Este trabalho
γ - Cobalto 60
Figura 6.34 Comparação dos G(SSB) e G(DSB) com a literatura para gama de
60
Co.
Com os resultados anteriores na seção 6.9 é realizada uma discussão comparando os
efeitos entre as irradiações com gama de
60
Co,
137
Cs e prótons.
6.5 Quantificação de danos em amostras irradiadas com gama de
137
Cs.
A seguir são mostrados os géis e resultados das quantificações das amostras de DNA
irradiadas com gama de
137
Cs. Os resultados foram ordenados pela capacidade de
scavenging da solução. As doses foram divididas por 1.5 tendo em conta o erro
encontrado na taxa de dose reportada durante a irradiação (seção 5.52). A luminosidade
do DNA SC foi multiplicada pelo fator de correção do enlace do Brometo, 1.7.
DNA sem scavenger
Os géis das figuras 6.35 e 6.36 mostram as bandas de DNA para doses entre 0 a 600 Gy.
Gel 1 Gel 2
Figura 6.35 Géis das amostras irradiadas sem a presença de scavengers. De esquerda a direita, Gel 1:
Ladder, 0, 1, 2, 3, 4, 5 e 5 Gy, Gel 2: 9, 12, 15, 20, 25, 30, 40 e 50 Gy.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
94
Gel 3 Gel 4
Figura 6.36 Géis das amostras irradiadas sem a presença de scavenger. De esquerda a direita, Gel 3: 70,
100, 150, 200, 250 e 300 Gy, Gel 4: 150, 200, 250, 300, 400, 500 e 600 Gy.
Na figura 6.37 é mostrada a quantificação dos géis para as amostras irradiadas com
gama de
137
Cs e sem presença de scavenger.
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose
(
G
y)
Figura 6.37 Quantificação dos géis 1, 2, 3 e 4 para as amostras irradiadas sem scavenger.
DNA com 2 mM de glicerol
Os géis das figuras 6.38 e 6.39 mostram as bandas de DNA para as doses de 0 a 1600
Gy das amostras com 2 mM de glicerol.
Gel 1 Gel 2
Figura 6.38 Géis das amostras irradiadas com 2 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 1: 0, 12, 20,
30, 40, 50, 60 e 70 Gy, Gel 2: 70, 80, 90, 100, 120, 150, 200 e 250 Gy.
Gel 3 Gel 4
Figura 6.39 Géis das amostras irradiadas com 2 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 3: 0, 300, 350
e 400 Gy; Gel 4: 350, 400, 500, 600, 800, 1000, 1200, 1400 e 1600 Gy.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
95
Na figura 6.40 é mostrada a quantificação dos géis para as amostras irradiadas com
gama de
137
Cs e 2 mM de glicerol.
0 100 200 300 400 500 600
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose
(
G
y)
Figura 6.40 Quantificação dos géis 1, 2, 3 e 4 para as amostras irradiadas com 2mM de glicerol.
DNA com 20 mM de Glicerol
Os géis das figuras 6.41 e 6.42 mostram as bandas de DNA para as doses de 0 a 3000
Gy das amostras com 20 mM de glicerol.
Gel 1 Gel 2
Figura 6.41 Géis das amostras irradiadas com 20 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 1: 0, 20, 40,
60, 80, 100, 120 e 150 Gy, Gel 2: 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 e 500 Gy.
Gel 3 Gel 4
Figura 6.42 Géis das amostras irradiadas com 20 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 3: 0, 0, 600,
800, 1000, 1200, 1400 e 1600 Gy, Gel 4: 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 2000, 2500 e 3000 Gy.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
96
Na figura 6.43 é mostrada a quantificação dos géis para as amostras irradiadas com
gama de
137
Cs e 20 mM de glicerol.
0 250 500 750 1000 1250 1500 1750
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.43 Quantificação dos géis 1, 2, 3 e 4 para as amostras irradiadas com 20 mM de glicerol.
DNA com 200 mM de Glicerol
Os géis das figuras 6.44 e 6.45 mostram as bandas de DNA para doses de 0 a 4900 Gy.
Gel 1 Gel 2
Figura 6.44 Géis das amostras irradiadas com 200 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 1: 0, 50,
100, 150, 200 e 300 Gy, Gel 2: 300, 400, 500, 600, 700, 800 e 900 Gy.
Gel 3 Gel 4
Figura 6.45 Géis das amostras irradiadas com 200 mM de glicerol. De esquerda à direita, Gel 3: 0, 800,
1000, 1200, 1400, 1600, 2000 e 2500 Gy, Gel 4: 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4400, 4654 e 4900 Gy.
Na figura 6.46 é mostrada a quantificação dos géis para as amostras irradiadas com
gama de
137
Cs e 200 mM de glicerol.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
97
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem (%)
Dose(Gy)
Figura 6.46 Quantificação dos géis 1, 2, 3 e 4 para as amostras irradiadas com 200 mM de glicerol.
6.6 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiação com gama de
137
Cs.
Com os resultados das quantificações, e utilizando as equações 4.22, 4.23, 4.28 e 4.29,
podem ser calculados os rendimentos de quebras simples e duplas para o DNA irradiado
em cada ambiente.
Na figura 6.47, são mostrados os ajustes das percentagens de DNA superenovelado a
uma função exponencial para as quatro condições de irradiação. As constantes de
decaimento, assim como os G(SSB) para cada ambiente, são reportadas na tabela 6.12.
Para os cálculos dos rendimentos em [µmol/J] foram utilizadas as concentrações 1.38E-
1 µmol dm
-3
e 4.58E-2 µmol dm
-3
correspondentes às concentrações de 265 ng/µl e 88
ng/µl respectivamente.
0 500 1000
1
10
100
Percentagem de SC
Dose(Gy)
0 mM
2 mM
20 mM
200 mM
Figura 6.47 Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com irradiadas em
diferentes ambientes de scavengers.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
98
Tabela 6.12 Rendimentos de quebras simples (G(SSB)).
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB) [µmol J
-1
] G(SSB)
[Gy
-1
Da
-1
]
erro
265ng/µl-0sc
7.60(0.13)E-2 13.1(0.2) 1.05(0.02)E-02 3.95(0.07)E-08 1.7%
88ng/µl-20sc
3.13(0.05)E-2 31.9(0.5) 1.43(0.03)E-03 1.63(0.03)E-08 1.7%
88ng/µl-20sc
6.61(0.17)E-3 151(4) 3.02(0.08)E-04 3.43(0.09)E-09 2.6%
88ng/µl-200sc
1.25(0.05)E-3 799(34) 5.72(0.25)E-05 6.50(0.28)E-10 4.3%
Para o cálculo dos rendimentos das quebras duplas as frações de DNA linear foram
ajustadas a funções lineares e com frações menores de 15% (discussão no Apêndice 4).
A figura 6.48 mostra os resultados dos ajustes. Com o coeficiente linear da equação,
foram calculados os rendimentos para quebras duplas que são mostrados na tabela 6.13.
0 500 1000 1500 2000
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
Fração de Lin
Dose (Gy)
0mM
2mM
20mM
200mM
Figura 6.48 Ajuste das percentagens SC em função da dose para as amostras com 200 ng/µl de DNA.
Tabela 6.13 Rendimentos de quebras duplas (G
SSB
) para amostras de 10ng/µl
Amostra Slope [Gy
-1
]
G(DSB)
[µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
265ng/µl-0sc
1.76(0.47)E-3
2.43(0.07)E-4
9.14(0.25)E-10 2.7%
88ng/µl-20sc
7.30(0.25)E-4
3.34(0.11)E-5
3.79(0.13)E-10 3.4%
88ng/µl-20sc
2.45(0.13)E-4
1.12(0.06)E-5
1.28(0.07)E-10 5.2%
88ng/µl-200sc
6.88(0.18)E-5
3.15(0.08)E-6
3.57(0.09)E-11 2.6%
Na figura 6.49 são comparados os dados com a literatura. Os resultados mostram estar
de acordo com os encontrados por outros grupos. Similarmente às irradiações com
60
Co,
as quebras duplas tiveram um valor maior. Isto pode estar relacionado com a alta pureza
do DNA, o que pode aumentar sua sensibilidade à radiação. Porém, nossos resultados
encontram-se próximos aos mais recentes reportados por [Leloup 2005].
Capítulo 6. Resultados e discussão.
99
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
10
-7
G(SSB)[Gy
-1
Da
-1
]
scavenging capacity [s
-1
]
dados: γ of
137
Cs
Milligan 1993a (pUC18)
Milligan 1993a (SV40)
Milligan 1993a (pEC)
Jones 1993 (SV40)
Milligan 1996 (pUC18, pEC)
Leloup 2005 (pHAZE)
Este trabalho
γ - Cesium 137
10
5
10
6
10
7
10
8
10
9
10
10
10
-13
10
-12
10
-11
10
-10
10
-9
10
-8
G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
scavenging capacity [s
-1
]
dados: γ of
137
Cs
Jones 1993 (SV40)
Milligan 1996 (pUC18, pEC)
Leloup 2005 (pHAZE)
Este trabalho
γ - Césio 137
Figura 6.49 Comparação dos G(SSB) e G(DSB) com a literatura para gama de
137
Cs.
Estes resultados serão discutidos junto aos obtidos nas irradiações com
60
Co e prótons
na seção 6.9.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
100
6.7 Quantificação de danos em amostras irradiadas com prótons de 10MeV.
No processo de quantificação dos danos no DNA nas irradiações com prótons,
aconteceu um incidente que retardou a quantificação em alguns meses. Como foi
apresentado na seção 6.1.2, o Brometo de Etídio presente no gel gera também uma
mudança na mobilidade do DNA de acordo com a sua conformação. A figura 6.1 mostra
como sem a presença de Brometo de Etídio no gel, a separação entre as bandas SC e Lin
praticamente não existe, dificultando a quantificação.
Durante a quantificação com prótons foi utilizada uma nova solução estoque de
Brometo de Etídio, já que a antiga tinha acabado. Mas não foi percebido que a nova
solução possuía o Brometo numa concentração dez vezes menor. Como resultado as
bandas SC e Lin começaram a aparecer juntas, dificultando sua quantificação. Só uns
meses depois de ir conferindo exaustivamente cada passo desde a preparação das
amostras até sua separação no gel de eletroforese foi encontrado o erro.
Independentemente disto as amostras foram quantificadas considerando a banda circular
superenovelado e linear como uma só, até que posteriormente pudessem ser separadas.
6.7.1 Quantificação de amostras sem scavengers.
A figura 6.50 mostra a quantificação das bandas SC+Lin e Cir feitas em dezembro de
2004 para cada uma das irradiações com prótons nas amostras sem scavenger. Neste
caso observa-se que as bandas SC e Lin foram quantificadas como uma só.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Protons em agua (Dezembro 2004)[SC+Linear]
Irrad A
Irrad B
Irrad C
Irrad D
Percentagem
Dose(Gy)
A)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
101
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Protons em agua (Dezembro 2004)[Circular]
Irrad A
Irrad B
Irrad C
Irrad D
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.50 Quantificação para irradiações com prótons de DNA sem scavenger realizada em 2004. A)
Quantificação SC+Lin devido a união das bandas. B) Quantificação das bandas de DNA circular.
Na figura 6.51 é mostrada a média com sua variância para o conjunto de dados
anteriores.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Protons com agua (Dezembro 2004)
SC+Lin
Cir
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.51 Valor médio para os resultados de irradiações com prótons de DNA sem scavenger do ano
2004.
Em maio de 2005 depois de encontrado o problema na confecção dos géis, foram
refeitas todas as análises das amostras. Neste caso, encontrou-se uma pequena
degradação no DNA que alterou ligeiramente os resultados encontrados. Na figura 6.52
isto é observável na diminuição do DNA SC inicial e alguns dos valores do DNA
circular. Na segunda quantificação, algumas amostras irradiadas em importantes doses
tinham acabado por causa das repetições tentando achar o problema na quantificação.
Este foi o caso das amostras para 10 Gy, 90 Gy, 110 Gy e 200 Gy. Para doses maiores,
o DNA passou à forma fracionada.
B)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
102
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Protons com agua
SC+Lin (Dez 2004)
Cir (Dez 2004)
SC (Mai 2005)
Cir (Mai 2005)
Lin (Mai 2005)
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.52 Dados de quantificação de 2004 e 2005 para amostras de DNA sem scavenger. Os dados de
2005 apresentam as três formas do DNA.
Para estimar o valor da fração de DNA SC nas amostras de 10 Gy e 20 Gy, os dados de
DNA linear para doses maiores a 30 Gy foram ajustados a uma função de segundo grau.
Para a estimativa dos dados de SC+Lin, foi subtraído o valor desta função em 10 Gy e
20 Gy respectivamente. Na figura 6.53 é mostrada a média dos resultados finais
utilizados para a análise.
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
0
20
40
60
80
100
SC
Cir
Lin
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.53 Resultados finais utilizados para a análise da irradiação com prótons do DNA sem
scavenger.
6.7.2 Quantificação de amostras com 200 mM de Glicerol.
Para as amostras de DNA com 200 mM irradiadas com prótons são reportados os dados
obtidos da quantificação realizada em 2005. A presença de Glicerol em uma alta
concentração nas amostras ajudou a manter a estabilidade do DNA (figura 6.54).
Capítulo 6. Resultados e discussão.
103
0 100 200 300 400 500 600 700
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Protons com 200 mM, maio 2005 [Supercoiled]
Irrad A
irrad B
Irrad C
Irrad D
Percentagem
Dose(Gy)
0 100 200 300 400 500 600 700
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Protons com 200 mM, maio 2005 [Circular]
Irrad A
irrad B
Irrad C
Irrad D
Percentagem
Dose(Gy)
0 100 200 300 400 500 600 700
0
10
20
30
40
50
60
Protons com 200 mM, maio 2005 [Linear]
Irrad A
irrad B
Irrad C
Irrad D
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.54 Quantificação para irradiações com de DNA com 200 mM de Glicerol. A) Quantificação do
DNA circular superenovelado. B) DNA circular relaxado. C) DNA linear. Os valores não estão corrigidos
com o fator 1.7 relacionado com a aderência do Brometo [Apêndice 2].
Os dados anteriores não foram corrigidos por 1.7, correspondente ao fator de aderência
do Brometo [Apêndice 2]. Fazendo a multiplicação e a normalização obtém-se os
resultados finais mostrados na figura 6.55.
A)
B)
C)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
104
0 100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
SC
Cir
Lin
Percentagem
Dose(Gy)
Figura 6.55 Resultados finais utilizados para a análise da irradiação com prótons do DNA com 200mM
de Glicerol.
Os resultados da quantificação obtidos para ambos os experimentos mostraram uma
reprodutibilidade aceitável apesar dos problemas apresentados na metodologia. Porém
se faz evidente a necessidade de uma maior sistematicidade para melhorar a precisão
destes dados.
6.8 Determinação de G(SSB) e G(DSB) para irradiações com prótons.
Com os dados mostrados anteriormente, foram calculados os rendimentos de quebras
simples e duplas para as irradiações com prótons. Neste caso, como, nos outros, foram
utilizadas as equações 4.22, 4.23, 4.28 e 4.29. Para o cálculo dos rendimentos em
[µmol/J], foi utilizada a concentração de DNA 1.04E-1 µmol dm
-3
, correspondente a
200 ng/µl. A figura 6.56 e a tabela 6.14 mostram os ajustes e os resultados do cálculo de
G(SSB) para os dois tipos de amostras irradiadas.
0 100 200 300
1
10
100
Percentagem SC
Dose(Gy)
0 mM
200 mM
Figura 6.56 Ajustes das percentagens de DNA circular superenovelado irradiados com prótons. Amostras
sem scavenger e com 200 mM de Glicerol.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
105
Tabela 6.14 G(SSB) para amostras sem scavenger e com 200 mM de glicerol irradiadas com prótons
Amostra λ [Gy
-1
] D
37
[Gy]
G(SSB) [µmol J
-1
] G(SSB)
[Gy
-1
Da
-1
]
erro
200ng/µl-0mM
1.18(0.10)E-1 8.5(0.7) 1.23(0.10)E-02 6.15(0.52)E-08 8.5%
200ng/µl-200mM
6.03(0.41)E-03 165.8(11.3) 6.27(0.42)E-04 3.13(0.21)E-09 6.8%
Para o cálculo dos rendimentos de quebras duplas, os dados das frações de DNA linear
foram ajustados a funções lineares. Por causa do reduzido número de dados, o critério
de ajuste foi estendido até os pontos menores que 20% de DNA linear. Com isto foi
possível obter uma estimativa melhor do valor do G(DSB).
Na figura 6.57 e na tabela 6.15 são mostrados o ajuste dos dados e os resultados obtidos
para os dois tipos de amostras irradiadas.
0 50 100 150 200 250
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
fração Lin
Dose (Gy)
0 mM
200 mM
Figura 6.57 Ajustes de frações de DNA linear para irradiações com prótons para amostras sem scavenger
e com 200 mM de Glicerol.
Tabela 6.15 G(DSB) para amostras irradiadas com prótons.
Razão SC-Cir Slope [Gy
-1
]
G(DSB) [µmol J
-1
] G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
erro
0mM 4.84(0.28)E-3 5.03(0.30)E-04 2.51(0.15)E-09 5.9%
200mM 3.08(0.52)E-04 3.20(0.53)E-05 1.60(0.27)E-10 16.7 %
Os resultados obtidos mostram o mesmo comportamento encontrado com as irradiações
com gama de
60
Co e de
137
Cs. A amostra com presença de scavenger mostrou uma
redução nos rendimentos das quebras simples e duplas. Estes resultados serão
comparados e discutidos na próxima seção.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
106
6.9 Comparação de G(SSB) e G(DSB) gerados pela gama de
60
Co,
137
Cs e
prótons.
A seguir são comparados os efeitos das irradiações com prótons e raios gamas de
60
Co e
137
Cs. As figuras 6.59 e 6.60 mostram os G(SSB) e G(DSB) em função da concentração
de Glicerol.
0 1 10 100
1E-10
1E-9
1E-8
1E-7
G(SSB) [Gy
-1
Da
-1
]
Concentração de Glicerol [mM]
γ -
60
Co
γ -
137
Cs
protons 10 MeV
Figura 6.59 Comparação dos G(SSB), para gama de
60
Co e
137
Cs, e prótons em função da concentração
de Glicerol.
0 1 10 100
1E-11
1E-10
1E-9
1E-8
G(DSB) [Gy
-1
Da
-1
]
Concentração de Glicerol [mM]
γ -
60
Co
γ -
137
Cs
protons 10 MeV
Figura 6.60 Comparação entre os G(DSB), para raios gama de
60
Co e
137
Cs, e prótons em função da
concentração de Glicerol.
Das figuras 6.59 e 6.60, é possível observar que os efeitos da gama de
60
Co e
137
Cs
diminuem de forma similar na medida em que a presença do scavenger aumenta, porém
Capítulo 6. Resultados e discussão.
107
esta diminuição não acontece do mesmo modo para as irradiações com prótons. Isto
poderia ser explicado levando-se em conta que, com o aumento da presença de
scavenger, a componente do efeito indireto na produção do dano no DNA diminui,
tornando-se mais relevante a componente direta do efeito da radiação. Para amostras
sem scavenger, a componente direta representa menos do 1% da produção de danos,
podendo chegar até o 35% para uma capacidade de scavenging de 3.8x10
8
s
-1
(equivalente a 200 mM de Glicerol), [Klimczak et al. 1993, Chapman et al. 1973]. O
efeito direto está diretamente relacionado ao padrão da trajetória da partícula e sua
deposição de energia (LET). Como o LET dos prótons (~5 keV/µm) é maior que o da
radiação gama (~0.3 keV/µm) o efeito direto será mais efetivo para prótons que para
gama. Isto explica como os resultados de quebras simples e duplas é maior para prótons
que para radiação gama com o aumento da concentração de scavenger.
Um dos objetivos principais deste trabalho concentra-se em determinar se existe alguma
diferença entre os efeitos radiobiológicos no DNA causado pelas radiações de baixo
LET. Analisando a razão de DSB/SSB é possível determinar a influência da partícula na
produção de danos biológicos. Radiações com altos valores de DSB/SSB apresentam
um alto efeito radiobiológico, já que isto indica que sua efetividade para gerar danos
irreparáveis ou mutagênicos (DSB) por quebras SSB induzidas é maior.
Na figura 6.61, são mostradas as razões de DSB/SSB para as irradiações utilizadas no
trabalho. Estas são comparadas com irradiações feitas por [Taucher-Scholz 1999] com
núcleos de carbono e oxigênio de alto LET.
0 2 20 200
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
0.150
DSB/SSB
Concentração de Glicerol (mM)
Este trabalho
γ -
60
Co (~0.27 keV/µm)
γ -
137
Cs (~0.40 keV/µm)
p -10MeV (~5 keV/µm)
Taucher-Scholz 1999
C (~30 keV/µm)
O (~30 keV/µm)
Figura 6.61 Razão de DSB/SSB para gama de
60
Co e
137
Cs, e prótons em função da concentração ds
Glicerol.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
108
Com exceção da irradiação com prótons sem Glicerol, os dados mostram que, dentro
das incertezas, não existe uma diferença significativa entre as razões das DSB/SSB para
os três tipos de radiação e para cada capacidade de scavenging em separado. O aumento
destas razões com o aumento da concentração de scavenger mostra como o efeito da
estrutura do caminho da radiação (efeito direto) se faz mais relevante por causa da
diminuição dos radicais *OH e o padrão de quebras mais homogêneo que estes podem
provocar. Já ao comparar estas razões com as das reportadas para as radiações de alto
LET, observa-se que a probabilidade de gerar quebras duplas é muito maior para os íons
de alto LET como o Carbono e o Oxigênio.
O Efeito Biológico Relativo (RBE) nos materiais biológicos pode ser definido como a
razão entre o efeito biológico produzido pela radiação de estudo dividido entre o efeito
de uma radiação de referência.
referência
radiação
Efeito
Efeito
RBE = .
Na literatura, esta definição é aplicada para o estudo do RBE em células, e também
pode ser aplicado nos estudos de DNA. Nas irradiações de plasmídeos in vitro, o efeito
mais significativo do ponto de vista biológico é a produção de DSB. Autores [Taucher-
Scholz 1999] definem o RBE nos estudos de DNA como
referência
radiação
DSBG
DSBG
RBE
)(
)(
= ,
onde, como G(DSB) de referência utilizado é o da radiação de mais baixo LET,
geralmente raios-X.
Neste caso utilizaremos como referência os G(DSB) obtidos para as irradiações com
raios gama de
60
Co, por serem os de menor LET. Na tabela 6.16 são mostrados os RBE
calculados para as irradiações realizadas neste trabalho junto com as calculadas da
literatura.
Tabela 6.16 RBE calculados para raios gama de Co e Cs, prótons e da referência [Leloup et al. 2005]
Concetração de
Glicerol
[mM]
RBE
γ-
60
Co
RBE
γ-
137
Cs
RBE
p-10 MeV
RBE
γ-
137
Cs
[Leloup 2005]
0 1.00(0.19) 0.78(0.11) 2.75(0.31) -
2 1.00(0.09) 0.83(0.14) - 1.94(0.80)
20 1.00(0.08) 0.69(0.09) - -
200 1.00(0.08) 1.01(0.10) 4.55(0.95) 0.74(0.16)
Capítulo 6. Resultados e discussão.
109
É possível observar que, com exceção dos RBE para 20 mM de Glicerol, todos os RBE
para irradiações feitas com
60
Co e
137
Cs são compatíveis, figura 6.62. A diferença
encontrada para 20 mM de Glicerol não impede poder afirmar que, de forma geral, os
efeitos de ambas as radiações sobre o DNA plasmidial podem ser considerados
equivalentes a nível molecular. É observado também que para a concentração de
Glicerol de 200 mM, ambos RBE são iguais. Considerando que, para esta concentração
s capacidade de scavenging é similar à encontrada na célula, é possível inferir que o
efeito de ambas as radiações a nível celular deverá ser o também mesmo.
Fazendo-se a mesma análise com as irradiações com prótons, observa-se que estes
possuem um efeito 2.8 (0.3) e 4.6 (1.0) vezes maior que o do
60
Co sem a presença de
scavenger e com 200 mM de Glicerol respectivamente. Isto evidencia a relação entre o
efeito biológico, o LET da radiação e as propriedades do material biológico. Para uma
radiação de um LET maior, neste caso os prótons, o RBE aumentou. Isso pode ser causa
da alta densidade de radicais ao longo do caminho que as radiações de alto LET
provocam. O aumento do RBE com o aumento da capacidade de scavenger estaria
relacionado com a efetividade na produção de danos diretos da radiação gama de
60
Co e
dos prótons, conhecendo que para esta capacidade de scavenging o efeito direto é
responsável por 35% dos danos [Chapman et al. 1973]. Neste caso a efetividade dos
prótons para produzir quebras duplas se mostra maior que a dos raios gama.
0220200
0.2
0.4
0.6
0.8
1
2
4
6
8
10
20
RBE (com relação a γ do
60
Co)
concentração de Glicerol [mM]
Este trabalho
γ -
60
Co (~0.27 keV/µm)
γ -
137
Cs (~0.40 keV/µm)
p 10 MeV (~5 keV/µm)
Leloup 2005
γ -
137
Cs (~0.40 keV/µm)
Figura 6.62 Efeitos Biológicos Relativos (RBE) do
137
Cs e prótons de 10 MeV, em relação a gama de
60
Co.
Capítulo 6. Resultados e discussão.
110
Desta forma, é possível concluir que para irradiação de DNA in vitro foram encontrados
padrões similares aos das irradiações de células e tecidos. Os efeitos biológicos relativos
das radiações de baixo LET também podem ser considerados como equivalentes a nível
molecular.
Capítulo7. Conclusões
111
CAPÍTULO 7. CONCLUSÕES
Neste trabalho foi desenvolvido um método experimental para o estudo da interação das
radiações com DNA plasmidial em solução aquosa. Para isso, os seguintes testes foram
realizados:
1) Efeito do Brometo de Etídio.
Estudou-se a linearidade da luminosidade em função da quantidade de DNA com géis
pré-corados e pós-corados (ver seção 6.1.2). Verificou-se que o gél pré-corado
apresenta maior linearidade. Por isto, adotamos géis pré-corados em nossas análises.
2) Efeito da concentração de agarose e da tensão para eletroforese
Estudou-se a melhor concentração de agarose e a tensão ótima a ser aplicadas no gel
de eletroforese. Verificou-se que as condições ótimas foram obtidas com 0.7% de
agarose e potencial de 5 V/cm (ver seção 6.1.3).
3) Efeitos da quantidade de DNA e do numero de integrações
Estudaram-se os efeitos da quantidade de DNA sobre o processo de quantificação das
bandas de eletroforese. Verificou-se que o melhor valor utilizado foi de 800 ng de
DNA em cada poço do gel.
No estudo do número de integrações, verificou-se que a condição ótima é aquela em
que se utiliza o máximo de integrações possíveis sem que ocorra saturação da
luminosidade. Esta condição pode ser obtida com ajuda do programa GelAnalis
desenvolvido neste trabalho ( ver seções 6.1.4, 6.1.5 e apêndice 1).
4) Efeito da fração de DNA circular nas amostras inicial nos G(SSB) e G(DSB).
Estudou-se o efeito da presença de DNA na forma circular na amostra a ser irradiada
sobre a quantificação das bandas. Verificou-se que não há efeito relevante sobre os
resultados, como previsto por Cowan [1985] (ver seção 6.2). Porém, amostras com
pequenas frações de DNA superenovelado apresentam incertezas maiores ( ver seção
6.2.2).
Estes testes permitiram encontrar as melhores condições de trabalho, e reduzir as
incertezas na quantificação das bandas de DNA a níveis aceitáveis para os objetivos
deste trabalho.
Após a otimização do método experimental e da análise, passamos aos estudos da
interação entre as radiações gama e prótons com o DNA em soluções diversas. As
irradiações com prótons foram feitas no acelerador Pelletron do IFUSP, com prótons de
E=10MeV. As irradiações com raios gama de
60
Co foram feitas no irradiador
Capítulo7. Conclusões
112
Gammacell-220 do CTR-IPEN. As irradiações com
137
Cs foram feitas no irradiador IBL
637 do ICB4 na USP.
Foram quantificadas, nas amostras irradiadas, as frações de DNA nas formas
superenovelada, circular relaxada e linear em função da dose aplicada, variando a
concentração de DNA e a concentração de scavenger nas soluções. O comportamento
dessas frações em função da dose se encontra dentro do esperado e em acordo com os
dados da literatura, com a rápida diminuição da fração de DNA-superenovelado, o
aumento e posterior diminuição da fração de DNA circular, e o aumento praticamente
linear da fração de DNA na forma linear, à medida que a dose aumenta.
Foram determinados os rendimentos de quebras simples (G(SSB)) e duplas (G(DSB)).
Verificou-se que G(SSB) diminui com a concentração de scavenger, como era esperado,
evidenciando a ação do scavenger sobre os radicais livres gerados na radiólise da água.
Verificou-se também que esse rendimento é equivalente para as irradiações com gama
de
60
Co e
137
Cs, dentro das incertezas experimentais, em acordo com as considerações
de RBE para células, mas em desacordo com resultados experimentais publicados
recentemente [Leloup et al. 2005]. O rendimento de quebras simples para prótons é
compatível com aquele para gama de
60
Co e
137
Cs nas irradiações sem adição de
scavenger. No caso de soluções com 200 mM de glicerol, o G(SSB) para prótons
resultou superior àqueles com gama. As incertezas não permitem uma analise
conclusiva nessa comparação. São necessárias irradiações com prótons para
concentrações intermediarias de Glicerol.
A análise do G(DSB) mostrou resultados semelhantes àqueles para G(SSB). Para todas
as soluções os G(DSB) para as irradiações realizadas com gama de
60
Co e
137
Cs são
compatíveis entre si. Na medida em que se aumenta a concentração de Glicerol o
rendimento diminui de forma linear. Para soluções sem scavenger e com 200 mM de
Glicerol, o G(DSB) para prótons se mostrou superior àqueles para raios gama. Este
resultado indica que a ação dos radicais livres e dos scavengers depende do processo de
ionização e da densidade de radicais formados. De fato, sendo o LET dos prótons (~5
keV µm
-1
) consideravelmente superior àqueles dos raios gamas (~0.3 keV µm
-1
), a
estrutura do rastro de radicais formados ao longo da trajetória das partículas é diferente
em cada caso. Observa-se que, com uma densidade maior de radicais, a ação dos
scavengers é menos eficiente. Isto pode estar relacionado ao aumento da relevância das
quebras diretas sobre as indiretas, resultado da adição de scavengers [Klimczak et al
1993 e Chapman et al 1973].
Capítulo7. Conclusões
113
De forma geral, os resultados obtidos em função da concentração de scavenger se
encontram em acordo com o esperado, conforme a literatura sobre o tema.
A análise do número de quebras por moléculas induzidas pela radiação (rendimentos em
Gy
-1
Da
-1
) em função da concentração de DNA mostrou que os G(SSB) e G(DSB)
permanecem constantes quando aumenta a concentração de DNA nas soluções contendo
scavengers (ver figura 6.33). No entanto, um comportamento diferente é observado no
caso de solução sem scavenger, onde o rendimento diminui com o aumento da
concentração de DNA. Isto pode ser resultado do próprio efeito scavenger do DNA na
interação com os radicais. Vale lembrar que, neste trabalho, foi utilizado um
procedimento experimental que resulta em alto grau de pureza do DNA [Gouveia 2004].
Isto, associado à redução das incertezas obtidas com a otimização da técnica de análise
feita neste trabalho, permitiu estender as medidas de quebras de DNA até concentrações
muito reduzidas de scavenger.
Foram realizados cálculos de RBE em DNA plasmideal com respeito às irradiações com
gama de
60
Co. Os resultados mostraram que não existe uma diferença significativa entre
os efeitos biológicos gerados pela radiação gama proveniente do
60
Co e do
137
Cs. De
forma que o efeito destas duas radiações pode ser considerado equivalente inclusive ao
nível molecular. Já o efeito biológico gerado pelos prótons de ~5 keV/µm foi bem
maior, apesar do grande erro associado. Novas irradiações com prótons permitirão
minimizar este erro, melhorar a precisão deste resultado e encontrar novos valores de
RBE para LET maiores.
Finalmente, este trabalho permitiu o desenvolvimento de uma técnica de alta precisão
para o estudo das quebras induzidas pela radiação em moléculas de DNA em solução
aquosa. A aplicação aos casos dos raios gama do
60
Co,
137
Cs e prótons de 10 MeV
permitiu reproduzir dados experimentais existentes e estender para condições ainda não
testadas experimentalmente, como aquelas com concentração nula de scavengers. Os
resultados são compatíveis com o esperado pelos modelos teóricos e com os dados
experimentais existentes. Os resultados obtidos neste trabalho se apresentam como uns
dos poucos que estudaram in vitro, e com boa precisão, o efeito radiobiológico das
radiações de baixo LET em DNA plasmidial. Os dados aqui mostrados poderão ser
utilizados em próximas análises teóricas, assim como em validações de modelos
biofísicos de interação da radiação com o DNA.
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119
APÊNDICES
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
120
APÊNDICE 1 Programa GelAnalis. Descrição.
1. Programa para quantificação de bandas.
O programa GelAnalis foi desenvolvido para realizar a quantificação das bandas de
eletroforese. Para sua implementação foi utilizada a linguagem de programação Delphi
por sua estrutura orientada a objeto e seus vastos recursos para a interface Windows.
Seu princípio de funcionamento baseia-se no trabalho com os pixels da imagem como
se fosse uma matriz. Os índices e o valor de cada um dos elementos matriciais é
definido pelas coordenadas X e Y de cada pixel e o nível de cor (0 a 255)
respectivamente. A origem de coordenadas é tomada no ângulo superior esquerdo. O
eixo X representa a posição horizontal, e o eixo Y a posição vertical.
O programa permite que a visualização destes pixels possa ser em escala de cinzas ou
em forma colorida. A imagem colorida responde a uma escala de cores que vai desde o
azul para o nível 1 até o vermelho para o nível 255. Para uma melhor visualização do
nível zero, este é representado com a cor negra.
Figura A1.1 Tela principal do programa GelAnalis.
O processo de quantificação foi dividido em três passos: trabalho com o fundo, análise e
relatório dos dados. Acionando os botões à esquerda na parte superior da tela, figura
A1.1, é possível ativar cada um destes passos. O programa permite medir a densidade
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
121
ótica integrada para cada banda do gel, mas realizando certa calibração também é
possível reportar os resultados em unidades de massa.
2.Trabalho com o fundo
O trabalho com o fundo refere-se à remoção da luminosidade que o Brometo não-ligado
a DNA ou RNA pode produzir. Para essa remoção, o programa apresenta dois métodos.
No primeiro é subtraído um valor constante de nível de cor de todos os elementos da
matriz (pixels) que representam a imagem. O segundo método permite definir, usando
equações lineares, uma função para a remoção do fundo, isto é, o valor a subtrair para
cada pixel da imagem vai depender da ordenada Y do mesmo. Este segundo método é
útil para os casos em que o fundo não apresenta um valor constante.
Para ajudar na determinação do nível de fundo o programa possui duas linhas guias.
Estas linhas podem se movimentar livremente na direção X (horizontal) utilizando os
botões de posicionamento (linhas verticais brancas na figura A1.1). Na seção do
trabalho com o fundo são mostradas três curvas de cores azul, verde e vermelha. As
curvas azul e verde representam os valores de cor dos pixels ao longo do eixo Y
(vertical) definido pelas posições das linhas guias. A curva vermelha mostra o valor da
cor média sobre toda a linha guia vertical. Posicionando as linhas guias entre as bandas
a quantificar, o programa reporta o valor médio do fundo na linha guia esquerda e a
curva vermelha do gráfico define o perfil médio da região definida. Caso o perfil do
fundo seja constante, é recomendável eliminar de todos os pixels o valor do fundo
médio reportado pelo programa. Em caso contrario, pode ser utilizado o conjunto de
equações lineares para simular o perfil do fundo no eixo vertical da forma:
⎪
⎪
⎩
⎪
⎪
⎨
⎧
+=→<<
+=→<<
+=→<<
=
− nnnn
Y
nymBckyyy
nymBckyyy
nymBckyy
Bck
1
2221
111
0
M
Para maior facilidade no programa a criação e ajustes destas equações são realizados
graficamente mediante a geração e movimentação de vértices no gráfico do fundo. O
número de equações é ilimitado e a movimentação dos vértices ajusta automaticamente
os parâmetros m
1..n
e n
1..n
, figura A1.2.
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
122
Figura A1.2. Perfil para remoção de fundo utilizando equações lineares.
Em nosso estudo, definimos como uma boa remoção de fundo os casos em que o nível
de fundo era o mais baixo possível sem chegar a afetar as formas das bandas. Um
predomínio da cor negra nas imagens dos géis nos indicava uma boa remoção, figura
A1.3.
Figura A1.3. Imagem do gel antes e depois da remoção do fundo.
3. Procedimento de análise
Para realizar a quantificação o programa possui dois modos de seleção das bandas. O
primeiro é o modo mais comum, no qual a banda é determinada por uma região
retangular definida por um vértice de inicio (X
o
,Y
o
) e um final (X
f
,Y
f
). Neste caso a
quantificação (Q) resulta na somatória dos valores de cor dos pixels da região.
∑
=
ff
oo
YX
YX
YX
PQ
,
,
,
O outro modo de seleção utiliza o procedimento conhecido como “magicwand” para a
determinação da fronteira com base num valor de tolerância (T). Para isto,
primeiramente é selecionado um pixel inicial na banda a quantificar. O programa,
mediante um ciclo, compara os oito pixels circundantes com o valor de tolerância T e
seleciona aqueles que possuem cor igual ou superior ao valor T (figura A1.4). A seguir
a mesma operação é realizada com os pixels selecionados na iteração anterior. A
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
123
condição de parada é que não existam novos pixels circundantes que possam ser
selecionados, figura A1.4.
121
0
2
114
4
116
3
124
1
110
5
113
88
6
100
95
N
N
97
N
3
102
89
N
88
N
95
N
97
N
92
N
91
N
89
N
86
N
90
N
77
88
N
96
N
94
N
87
N
Iteration: 1
Iteration: 2
Iteration: 3
Initial pixel
Selected region
1
Selected order
111
Pixel color value
a, b, c, d: analaized
pixels per iteration
c
a
b
d
X axis
Y axis
a) b)
N
Not selected pixels
Figura A1.4. a) Operação realizada por iteração. O valor dos pixels adjacentes é comparado com um
valor de tolerância. b) Exemplo de região selecionada em três iterações e com um valor de tolerância para
a seleção de 100. c) Exemplos de bandas de DNA selecionada com cor de tolerância 5 e 50
respectivamente.
Neste caso, a quantificação resulta na somatória dos valores de cor de todos os pixels
selecionados. O programa permite que esta somatória possa ser realizada de duas
formas. A primeira é somando os valores reais de cada um dos pixels (P
X,Y
) na região
selecionada. A segunda forma é somando as diferenças acima do valor de tolerância
(P
X,Y
-T). Esta segunda opção permite utilizar em certos casos o valor de tolerância T
como um valor de fundo local para uma banda de DNA específica.
Na análise das bandas de DNA, o programa mostra em histogramas a distribuição dos
pixels em função da cor e em função da concentração. Também, dois gráficos mostram
os histogramas de luminosidade óptica integrada em função da posição X e Y
respectivamente na região selecionada. Estes gráficos são úteis para a determinação da
cor de tolerância utilizada na seleção automática.
O programa possui um procedimento para o ajuste de múltiplos picos. que é útil no caso
de sobreposição de bandas. Foram utilizadas duas funções de distribuição aproximadas
devido ao grande número de parâmetro que definem as distribuições do DNA no Gel e
que não são conhecidos no momento da quantificação. Para os casos com perfil da
banda simétrico é utilizada a função Gaussiana. Para os casos assimétricos, a função
Extreme. O método de ajuste foi o de Gauss-Marquard.
c)
d)
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
124
Definido
wxxz
c
)( −=
onde x, x
c
e w são: a ordenada, a ordenada do valor máximo do
pico e a largura do pico respectivamente; as funções de ajuste foram:
)1(
)1(
2
)1(
1
2
2
1
1
:
+−−
+−−+−−
−
−−
⋅++⋅++⋅+=
N
N
Z
ZZ
Ze
N
ZeZe
o
eAeAeAyyExtreme L
22
2
2
1
2
2
2
2
1
:
N
Z
N
ZZ
o
eAeAeAyyGaussAmp
−−−
⋅++⋅+⋅+= L
Onde y
o
representa o nível de fundo, N é o número de picos e A é a altura dos picos. A
figura A1.5 mostra um exemplo de ajuste às duas funções. Este método de quantificação
permite ajustar até quatro picos simultaneamente.
Figura A1.5. Exemplo de ajuste de três bandas. Acima: função Extreme. Abaixo: função GaussAmp.
Nesta seção também é possível exportar os valores da região selecionada para seu
tratamento com outros programas de análises. Esta exportação pode ser realizada em
três formatos: matriz, coordenadas ou perfil. No formato “matriz”, o arquivo TXT
gerado possui um arranjo de números organizados em filas e colunas que contém o
valor da cor dos pixels selecionados. No formato “coordenadas” escreve em cada linha
do arquivo de saída as coordenadas e o cor de cada pixel da seleção. Por último o
formato “perfil” reporta o histograma de cor escrevendo no arquivo a luminosidade
integrada no eixo X (horizontal) em função da posição no eixo Y ( vertical) da região
selecionada.
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
125
4. Relatórios
O GelAnalis apresenta uma seção para o relatórios dos resultados. Nesta seção, na parte
superior, são mostrados todos os passos executados pelo usuário. Na parte inferior os
resultados das análises são escritos consecutivamente. Esta seção é mostrada na janela
principal do programa, figura A1.1, no ângulo superior direito. É permitido para o
usuário modificar e guardar cada um destes blocos. Esta facilidade é útil para realizar
discussões sobre os resultados obtidos com diferentes formas de análise. Isto permite
também que os resultados possam ser importados em outros programas de análise como
o Excel ou Microcal Origin.
5. Calibração dos resultados
Calibrações de luminosidade em massa podem ser realizadas no próprio programa. Para
isto é necessário um Ladder de massa na imagem do gel que possa ser utilizado como
referência. As luminosidades medidas para cada banda do Ladder são ajustadas à massa
reportada pelo fabricante. O ajuste da reta é realizado por mínimos quadrados. Após a
calibração os resultados das quantificações passam a ser dados em unidades de massa.
6. Provas de calibração do programa.
Durante o desenvolvimento do programa foram realizadas provas de seleção e
quantificação. As imagens de prova foram geradas utilizando o programa Adobe
Photoshop. As mesmas apresentavam um tamanho e distribuição de cores conhecidos.
Imagens de matrizes com formatos de cilindros, esferas, e cones foram geradas.
Figura A1.6. Padrão de prova com cones. Acima são mostradas as imagens em escala cinza e colorida.
No centro:em azul o perfil na linha central e em vermelho a cor media da região em função da coordenada
Y(horizontal). Abaixo: ajuste y = mx entre a luminosidade medida e a teórica. No ajuste m = 0.9985
(0.0002).
Os resultados de quantificação encontrados com o programa mostraram uma excelente
coincidência com os valores e perfiles desenhados. A figura A1.6 mostra a
0.0
2.0x10
5
4.0x10
5
6.0x10
5
8.0x10
5
0.0
2.0x10
5
4.0x10
5
6.0x10
5
8.0x10
5
Measured Luminosity
Theoretical Luminosity
Apêndice 1. Programa GelAnalis. Descrição.
126
quantificação dos pixels com o formato de cones. As pequenas diferenças entre os
valores calculados e os medidos foram por causa da representação discreta que estas
figuras geométricas apresentam na forma de pixels. No caso em que foram utilizados
prismas quadrados, os valores teóricos e medidos coincidiram exatamente.
7. Considerações finais
O programa GelAnalis mostrou ser uma boa ferramenta para realizar quantificações
rápidas e precisas de bandas de DNA em géis de eletroforese. Suas aplicações podem se
estender a qualquer problema que precise quantificar os tons de cinza em regiões de
imagens, como pode ser o caso de placas fotográficas expostas a radiação, colônias de
células etc. O programa gerado dentro do projeto foi registrado no Instituto da Proteção
Intelectual (INPI) em nome da Universidade de São Paulo.
Apêndice 2. Estimação do fator de correção para o Brometo de Etidio
127
APÊNDICE 2. Estimativa do fator de correção para o Brometo de Etídio.
Neste estudo foi determinado o valor do fator de aderência do Brometo de Etídio no
DNA supercoiled com respeito ao DNA circular e linear para nossas condições de
análise. A metodologia utilizada foi similar à utilizado por Milligan et al. (1993). O
método consistiu em utilizar o princípio de que a fluorescência das bandas de DNA em
gel de eletroforese é proporcional à sua massa. Desta forma, colocando quantidades
iguais de massa de DNA em conformações diferentes (supercoiled, circular e linear)
pode se encontrar o fator que fará com que as fluorescências das suas bandas sejam
iguais. Este fator é conhecido como fator de correção para o enlace do Etídio ao DNA
supercoiled (Correction Factor for Ethidium Binding).
Para a experiência foram utilizadas amostras inicialmente com DNA SC e Cir. Uma
metade da amostra foi digerida parcialmente com a enzima Hind III para diminuir o
DNA SC. No final, a amostra tinha DNA nas formas SC, Cir e Lin. O objetivo da
digestão parcial foi manter os níveis de fundo das amostras iniciais e finais similares.
Denominando F
SC
, F
Cir
, e F
lin
como as intensidades da fluorescência das bandas
supercoiled, circular e linear respectivamente, deve se cumprir que:
B
Lin
B
Cir
B
SC
A
Cir
A
SC
FFFfFFf ++⋅=+⋅
onde os supra índices A e B denotam as amostras não-digeridas e semidigeridas
respectivamente. Com isto é possível determinar o fator como:
B
SC
A
SC
A
Cir
B
Lin
B
Cir
FF
FFF
f
−
−+
=
No experimento, uma amostra aquosa de 800µl com DNA a 100ng/µl, foi dividida em
três partes iguais de 260 µl. Na amostra A, não foi realizada nenhuma modificação. A
amostra B, foi submetida a um choque térmico, para quebrar qualquer ligação entre os
DNA da solução. Por último, a amostra C foi digerida com a enzima Hind III com o
objetivo de linearizar parte do DNA SC (4 µl de enzima mais 4 µl de Buffer R, 1h30min
min. a 37
0
C, desativando com 20 min. a 65
0
C). Posteriormente, para manter as
concentrações iguais, os volumes das amostras foram igualados. As concentrações de
DNA em todas as amostras foram medidas novamente usando espectrofotômetro. Os
resultados das medições nos três casos foram similares. De todas as amostras foram
extraídos 41.2 µl (4000ng de DNA). Adicionou-se 8 µl de Stop Mix e 30.8 µl de água
destilada, totalizando 80ul com concentração final de 50ng/ µl.
Apêndice 2. Estimação do fator de correção para o Brometo de Etidio
128
Utilizando a metodologia apresentada no capítulo 5 (Materiais e Métodos) foi corrido e
fotografado um gel de eletroforese com cada uma das amostras aplicadas duas vezes em
lugares distantes do gel.
Das quantificações pôde-se concluir que a amostra à qual se aplicou o choque térmico
apresentou um incremento na fração circular com a diminuição do SC. A causa disto
provavelmente foi a indução de rupturas pelo calor aplicado, como foi observado por
Touw et al. (1985)
A figura A2.1 mostra a somatória da fluorescência na região selecionada em função da
distância de migração. Para cada amostra no gel, a região selecionada teve o mesmo
tamanho. A linha de divisão do DNA Linear do supercoiled foi determinada
aproximando a banda SC a uma função Gaussiana, onde a linha denota uma largura do
pico de 3σ (99%).
180 240
0
3000
6000
4
3
2
1
background
sample A
sample B
sample C
L in X
pixel Y
Figura A2.1. a) Gel com amostras sem digestão(A), com choque térmico(B) e semi-digerida (C). b)
Gráfico da densidade óptica integrada em função da distancia de migração para as amostras A, B e C. Os
números denotam: 1- pico de DNA circular, 2- pico linear, 3- pico supercoiled, 4- denota o ponto de
separação entre o DNA Lin e o SC.
Considerando a área à esquerda do ponto 4 como F
Cir
+F
Lin
e a da parte direita como F
SC
,
foi possível calcular o fator correção do enlace do Etídio, f. O procedimento foi
realizado várias vezes, obtendo um valor final de 1.74±0.15. O valor encontrado está de
acordo com o fator 1.7 reportado por Spotheim-Maurizot (1990) e por Stankus (1995).
Por outro lado, este fator não coincide com o 1.4 reportado por Milligan (1992), onde,
no entanto foram encontrados fatores entre 1.1 e 2.0, dependendo da concentração do
Brometo de Etídio e da densidade superhelicoidal do DNA.
Ladd. A1 B1 C1 A2 B2 C2
Setected region
(58x318 pixel)
(
a
)
(
b
)
Apêndice 3. Região e equação de ajuste para o calculo de G(DSB).
129
APÊNDICE 3. Região e equação de ajuste para o cálculo de G(DSB)
Como foi mencionado na seção 4.4.3 do capítulo 4, uma das causas das diferenças entre
os resultados reportados de G(DSB) pode estar vinculada as diferentes formas para o
cálculo de P
DSB
. Portanto, a definição da região de trabalho e a equação de ajuste é um
passo muito importante.
As principais equações utilizadas na literatura para determinar P
DSB
são
(
)
DPFFF
DSBCirSC
I
Lin
I
CirSC
⋅−⋅=−=
++
exp1
0
, [A3.1]
)](exp[1
20
DDPFFF
DSBCirSC
II
Lin
II
CirSC
⋅+⋅−⋅=−=
++
β
, [A3.2]
0
LinDSB
III
Lin
FDPF +⋅= , [A3.3]
02
LinDSB
IV
Lin
FDPDAF +⋅+⋅= . [A3.4]
Observando a forma das funções, é possível observar que deve existir um limite onde
sejam aproximadamente equivalentes. Expandindo em serie de Mac-Laurin as funções
A3.1 e A3.2,
(
)
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⋅−
=⋅−⋅=
∑
∞
=
+++
0
!
)exp(
n
n
DSB
o
CirSCDSB
o
CirSC
I
CirSC
n
DP
FDPFF , [A3.5]
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
=
∑
∞
=
++
0
)(
!
)0(
n
n
n
o
CirSC
II
CirSC
D
n
f
FF
, [A3.6]
onde f
(n)
(0) representa a derivada n-esima da função A3.2 com D=0. Considerando o
limite onde DP
DSB
⋅ é pequeno, e tomando só até o termo quadrático dos expansões,
teremos para a função A3.5,
(
)
=
⎥
⎦
⎤
⎢
⎣
⎡
⋅
+⋅−=
++
2
1
2
DP
DPFF
DSB
DSB
o
CirSC
I
cirSC
[A3.7]
(
)
(
)
22
21 DPDPF
DSBDSB
o
CirSC
⋅−⋅−=
+
.
Lembrando que
LinCirSC
FF −=
+
1 , é substituindo obtemos
2
DADPFF
DSB
o
Lin
I
Lin
⋅+⋅
′
+= , [A3.8]
onde
o
LinSCDSBDSB
FPP
+
⋅=
′
, e
(
)
o
cirSCDSB
FPA
+
⋅= 2
2
.
Da mesma forma para a função 4.31, obtemos:
2
DBDPFF
DSB
o
Lin
II
Lin
⋅+⋅
′
+=
, [A3.9]
onde
]2)2[(
2
β
−⋅=
+ DSB
o
LinSC
PFB .
Apêndice 3. Região e equação de ajuste para o calculo de G(DSB).
130
Da equação A3.8 e A3.9 pode-se observar a equivalência com as funções A3.3 e A3.4
para valores pequenos de
DP
DSB
⋅ . Esta equivalência é mostrada graficamente a seguir.
A figura A3.1 mostra três funções de produção de DNA linear obtidas pelas equações
A3.1-A3.3, onde F
Lin
=1-F
SC+Cir
. Para a construção P
DSB
foi considerado igual a 0.01 e β
igual 0.00015, valores médios dos resultados experimentais.
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Fração de linear
µ=D*P
DSB
exponencial linear [F
Lin
=exp(-µ)]
linear [F
Lin
=µ]
exp quadratica [F
Lin
=exp(-µ-Aµ
2
)
Figura A3.1 Frações de DNA linear com as mesmas P
DSB
, construídas com função linear, exponencial
linear e exponencial quadrática.
As figuras A3.2 a A3.4, mostram o valor de P
DSB
encontrado nos ajustes de cada uma
das três funções anteriores utilizando as equações A3.1-A3.4.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
6.0x10
-3
8.0x10
-3
1.0x10
-2
1.2x10
-2
Ajuste da função exponencial quadrática [F
Lin
=exp[-(µ+Aµ
2
)]
P
DSB
µ=D*P
DSB
função de ajuste
Linear
Quadratica
Exp. linear
Exp. quadrat.
Figura A3.2 Valores de P
DSB
em função de µ para o ajuste da função exponencial quadrática para as
equações de
I
Lin
F ,
II
Lin
F ,
III
Lin
F ,
IV
Lin
F .
Apêndice 3. Região e equação de ajuste para o calculo de G(DSB).
131
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0.0
5.0x10
-3
1.0x10
-2
1.5x10
-2
2.0x10
-2
Ajuste da função Linear [F
Lin
=µ]
P
DSB
µ=D*P
DSB
função de ajuste
Linear
Quadratica
Exp. linear
Exp. quadrat.
Figura A3.3 Valores de P
DSB
em função de µ para o ajuste da função linear para as equações de
I
Lin
F ,
II
Lin
F
,
III
Lin
F
,
IV
Lin
F
.
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
0.0
5.0x10
-3
1.0x10
-2
1.5x10
-2
2.0x10
-2
Ajuste da função exponencial linear [F
Lin
=exp(-µ)]
P
DSB
µ=D*P
DSB
função de ajuste
Linear
Quadratica
Exp. linear
Exp. quadrat.
Figura A3.4 Valores de P
DSB
em função de µ para o ajuste da função exponencial linear para as equações
de
I
Lin
F ,
II
Lin
F ,
III
Lin
F ,
IV
Lin
F .
Das figuras A3.1, A3.2, A3.3 e A3.4 é possível observar o demonstrado com a expansão
em séries. No limite em que
0→
µ
, os valores de P
DSB
convergem ao mesmo resultado.
Os gráficos anteriores mostram também como cada função de ajuste é ótima para certo
tipo de curva. No entanto, a função de ajuste quadrática (eq. A3.4) mostrou a menor
divergência nos três tipos de ajustes para valores de
µ menores que 0.2.
Isto permitiu definir a função e a região para realizar o ajuste da fração Linear de DNA.
Considerando que
37
DDDP
DSB
=⋅=
µ
, temos que uma dose limite para um bom ajuste
será
3737
2.0 DDD ⋅=⋅=
µ
. Na prática, muitas vezes, para este valor de dose o número
de pontos experimentais é muito pequeno, pelo que junto a este critério utilizaremos um
ajuste linear e a condição de que F
Lin
seja pequeno (menor que 15%), similar a alguns
Apêndice 3. Região e equação de ajuste para o calculo de G(DSB).
132
trabalhos da literatura [Milligan 1993a, 1993b, 1996a, 1996b]. Desta forma, os
resultados obtidos neste trabalho estarão mais próximos dos obtidos pelas diferentes
formas de análises presentes na bibliografia.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
133
APÊNDICE 4. Simulação do Irradiador de gama de
60
Co.
Como foi mencionado no capítulo 5, os métodos e procedimentos relacionados com a
parte física do trabalho são explicados neste capítulo, incluindo a simulação do
experimento, a determinação da taxa de dose e a irradiação das amostras.
A simulação do experimento e a determinação experimental da taxa de dose possuem
uma estreita vinculação e se complementam entre si. Para as irradiações com
60
Co foi
utilizado um irradiador modelo Gammacell220 da Atomic Energy of Canada instalado
no Centro de Tecnologias das Radiações (CTR) no IPEN. No ano 1997 o irradiador foi
recarregado mantendo 26 fontes de 16.6 Ci e adicionando 9 fontes, 8 delas com 1467 Ci
e 1 com 264 Ci. Nosso principal interesse com a simulação foi definir como esta
modificação muda o campo de irradiação dentro da câmara de amostras do irradiador, já
que de forma experimental fica muito difícil de determinar. No entanto, a taxa de dose
no centro da câmara encontra-se bem definida experimentalmente e tem sido utilizada
como controle do tempo de irradiação. Desta forma, a taxa de dose central experimental
foi utilizada como referência para validar os resultados das simulações.
Por outro lado, os métodos e procedimentos relacionados com a irradiação das amostras
incluem o detalhamento da preparação das amostras, a instalação experimental assim
como os tempos de irradiação e doses recebidas.
1. Gammacell-220. Descrição do Irradiador
O irradiador é composto por:
• uma fonte cilindrica de
60
Co, encerrada permanentemente dentro de uma
blindagem de chumbo,
•
uma gaveta cilíndrica,
•
um mecanismo que move a gaveta para acima a para abaixo ao longo da linha
central da fonte,
•
e o sistema eletrônico para seu funcionamento.
A gaveta do irradiador pode se encontrar em duas posições, uma onde a câmara de
amostras fica acima do irradiador permitindo desta forma o acesso para a colocação das
amostras, e outra posição onde a câmara fica no centro da fonte anular de
60
Co (posição
de irradiação). A figura A4.1 mostra o esquema do irradiador.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
134
Figura A4.1 Desenho do irradiador modelo Gammacell-220. Vistas superior, lateral e frontal.
1.1 Fonte cilíndrica de
60
Co.
A fonte cilíndrica de aço inox pode conter até 48 lápis de fontes de
60
Co, duplamente
selados, de 21.11 cm de comprimento. Estes ficam em uma formação cilíndrica de
20.91 cm de diâmetro, figura A4.2.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
135
Figura A4.2 Desenho da gaiola de fontes que pode conter até 48 lápis de fontes de
60
Co.
1.2 Gaveta
A gaveta de 149.86 cm de altura e 16.51 cm de diâmetro é dividida em três partes,
superior, câmara de mostras e parte inferior. A parte superior é um cilindro de aço
recheado com chumbo de 16.51 cm de diâmetro e 36.51 cm de cumprimento contendo
um tubo de aceso no centro de 3.17 cm de diâmetro interno. O tubo de acesso permite a
introdução de acessórios dentro da câmara de amostras. A câmara de amostra consiste
num cilindro de paredes delgadas de alumínio com diâmetro interior de 15.49 cm e
20.47 cm de altura. A porta de acesso tem 20.07 cm de altura e 15.24 cm de largura. A
parte inferior da gaveta é formada por um tubo de aço recheado de chumbo como a
parte superior de 30.5 cm de comprimento. Um tubo interno de 1.11 cm de diâmetro no
seu interior permite a drenagem de líquidos derramados na câmara de mostras.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
136
1.3 Suporte de amostras
Para garantir a uniformidade na dose recebida pelas amostras foram construídos
suportes com geometrias cilíndricas para os tubos da Eppendorft que continham as
amostras. Um dos suportes tem capacidade para 16 amostras o outro, para quatro. No
modelo de 16 lugares, as amostras ficam a um raio de 2.5 cm com respeito ao centro da
câmara, e no segundo modelo de 4 lugares o raio é de 2 cm. Estes suportes são
colocados sobre bases de isopor delgado para que as amostras fiquem no centro da
câmara.
1.4 Características radioativas do irradiador
O
60
Co se desintegra com um tempo de vida médio de 5.271 anos a Níquel 60 estável. O
60
Co emite dois raios gama de cascata com energias de 1.1732 MeV a 1.3325 MeV,
dando uma energia combinada de 2.5057 MeV.
A atividade total do irradiador dependerá da distribuição e atividade dos lápis assim
como do tempo transcorrido desde sua construção e calibração. O Gammacell-220 do
CTR-IPEN foi recarregado no dia 23-9-97, contendo naquele momento 26 fontes de
16.6 Ci, uma fonte de 264 Ci, e 8 fontes de 1467 Ci, totalizando 35 fontes é uma
atividade total de 12432 Ci. A atividade atual pode ser calculada como
()
tAA
o
⋅−⋅=
λ
exp onde λ é a constante de desintegração e t o tempo transcorrido em
anos. A constante de desintegração pode ser calculada como λ =ln2/τ, onde τ é o tempo
de vida médio para o
60
Co, obtendo λ =0.1315 ano
-1
.
2. Simulação da taxa de dose
Neste trabalho foi utilizado o código de transporte de radiação MCNP para a simulação
do campo de irradiação interno do irradiador Gammacel-220 do CTR no IPEN. Os
objetivos principais foram: o cálculo da taxa de dose central, a estimativa da
distribuição espacial interna da taxa de dose assim como suas variações relativas no
campo de irradiação. Desta forma seria possível estimar e fazer correções nas doses
recebidas nas amostras irradiadas de acordo com o ponto no qual foram colocadas
dentro da câmara de irradiação. Um dos motivos que nos levou a realizar este tipo de
simulação é a não homogeneidade no campo de radiação em todos os pontos da câmara
de amostras do irradiador, devido a diferenças entre as fontes radioativas que possui.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
137
2.1 MCNP. Métodos de cálculo de taxa de dose.
O programa de Monte Carlo MCNP é atualmente um dos códigos mais amplamente
utilizados para simulações na área de transporte de radiação envolvendo nêutrons,
fótons, elétrons, prótons entre outros. O mesmo consegue trabalhar com geometrias
tridimensionais e permite estimar uma grande quantidade de parâmetros da simulação.
Isto faz com que o código seja muito utilizado em aplicações como as de proteção
radiológica, modelagem de instalações nucleares, detectores e blindagem de radiação
entre outras.
O código utiliza para a simulação o método de Monte Carlo, o qual reproduz
teoricamente o processo estatístico de interação da radiação com a matéria. Neste
método são simulados sequencialmente os eventos probabilísticos individuais
produzidos no processo de interação da radiação. Na simulação do transporte de
radiação cada partícula é seguida desde a fonte, onde ocorre seu nascimento, ao longo
de sua vida até sua morte (escape, absorção, etc). Neste procedimento, as distribuições
de probabilidade são randomicamente amostradas usando-se dados de transporte de
radiação tabulados.
Para realizar cálculos, fazer medições e obter resultados de parâmetros específicos o
MCNP utiliza o procedimento denominado Tally. O MCNP possui 7 Tallies diferentes
(F1, F2, F4, F5, F6, F7, F8) e cada uma delas determina um parâmetro diferente.
Para o cálculo de taxa de dose normalmente é utilizada o Tally F6, mas utilizando
fatores de conversão de fluxo em dose podem ser utilizadas as Tallies F4 e F5, tabela 1.
Tabela 1 Tallies utilizadas para o cálculo da taxa de dose
Tally Quantidade Fn Unidade Fn Descrição
F4:P W*T
l
/V 1/cm
2
Estimativa do fluxo de fótons na célula
F5:P
W*p(µ)*exp(-λ)/(2πR
2
)
1/cm
2
Fluxo de fótons num detector pontual ou anel
F6:P
W*T
l
*σ
T
(E)*H(E)*ρ
a
/m
MeV/gm
Estimativa da energia depositada
Obs: A letra P depois do Fn indica que o cálculo é feito para fótons (Photons).
onde:
W = Peso da partícula.
W
s
= Peso da fonte.
E = Energia da partícula (MeV).
T
l
= Comprimento do track (cm).
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
138
V = Volume (cm
3
).
p(µ)
=
Função densidade de probabilidade. µ: co-seno
do ângulo entre a trajetória da partícula e o
detector.
λ
= Caminho livre médio total até o detector.
σ
T
(E)
= Seção de choque microscópica total (barns)
H(E) = Heating number (MeV/colisão)
ρ
a
= Densidade atômica (átomos/barn-cm).
m = Massa da célula
Os resultados que são reportados nas Tallies são normalizados por partícula emitida
pela fonte, pelo que para obter o resultado real os valores devem ser multiplicados pelo
número de partículas emitidas pela fonte. No caso das Tallies F4 e F5, o código reporta
o fluxo de fótons que passam pelo volume em estudo. Com os fatores de conversão de
fluxo em dose [RSICC 2000 (manual de MCNP apêndice H)] é possível determinar a
taxa de dose. Para converter a Tally F6 em unidades de rem/h ou Gy/h é preciso
multiplicar pelo fator de conversão de MeV/g em rem ou Gy. As equações finais para o
cálculo da taxa de dose foram:
)(*)(*4]/)[4( ErsãofatorConveBqAFhmremFD =
•
[A4.1]
)(*)(*5]/)[5( ErsãofatorConveBqAFhmremFD =
•
[A4.2]
segmremgmMeVfatorBqAFhmremFD 3600*)(*)(*6]/)[6( →=
•
[A4.3]
onde:
A(Bq): atividade da fonte = 1 Ci=3.7*10
10
Bq
fatorConversão(E): fator de conversão de fluxo em dose em função da energia. Apendix H
manual MCNP4C[3].
fator(MeV/gm
→
mrem): fator para conversão de MeV/gm a mrem. Valor = 1.60219*10
-5
massa(gm): massa da célula em gramas.
Para reportar os valores em Gy/h é necessário multiplicar os resultados em rem/h por
0.01 (para o ar, 1rem ≈ 1rad = 0.01Gy). No apêndice H do manual do MCNP existem
duas tabelas para os coeficientes de conversão de fluxo em dose em função da energia
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
139
do fóton. Uma é a ICRP-21 e a outra a ANSI 1977. Provas de calibração mostraram que
com a tabela ANSI eram obtidos resultados mais exatos.
2.2 Validação da simulação.
Para validar a simulação tínhamos como referência para o Gammacell-220 do IPEN que
a taxa de dose central medida no dia 8/7/2005 (A= 4370 Ci) era de 3,63 kGy/h, mas
para validar os resultados das dispersão da dose na câmara de amostras foram utilizados
os dados do manual do Gammacell-220 Excel da MDS-Nordio [Gammacell-220 Excel
2001]. No manual do modelo Excel são reportadas cinco taxas de doses centrais em
função da atividade nominal da fonte, Tabela 2.
Tabela 2. Atividade e taxa de dose central para o Gammacell-200 Excel
[Gammacell-220 Excel 2001].
Atividade nominal da fonte Taxa de dose central
TBq Ci (± 10%)
89.0 2400 2 kGy/h (0.2 Mrad/h)
222.5 6000 5 kGy/h (0.5 Mrad/h)
445.0 12000 10 kGy/h (1.0 Mrad/h)
667.5 18000 15 kGy/h (1.5 Mrad/h)
890.0 24000 20 kGy/h (2.0 Mrad/h)
Neste manual aparece também uma distribuição experimental do campo de dose para o
modelo Excel. Figura A4.3.
Figura A4.3 Distribuição típica de dose para o Gammacell 220 Excel. Plano vertical arbitrário ao longo
do eixo central. Todos os valores então em percentagens relativos à dose central.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
140
3 Simulação do irradiador de referência Gammacell-220 Excel.
3.1 Construção geométrica.
Para a construção do irradiador foram utilizadas numerosas superfícies. O principal
objetivo era tentar reproduzir o maior número de detalhes a fim de obter uma maior
exatidão no resultado final com respeito ao valor verdadeiro. As 48 fontes foram
construídas utilizando 48 cilindros cujas posições foram calculadas para ficarem à
mesma distância do eixo central Z=0. Também foram construídos os revestimentos de
aço inox da gaiola e dos cilindros da gaveta, assim como a câmara de amostras feita de
alumínio. A blindagem externa de chumbo também foi fielmente construída deixando a
possibilidade de futuros cálculos dosimétricos de exposição ocupacional. A figura A4.4
mostra os detalhes da geometria construída no MCNP. O interior da câmara de amostras
foi recheado com cubos de 0.5 cm de aresta para fazer os cálculos de fluxo por F4 e de
dose por F6.
Figura A4.4 Gammacell-220 Excel. a) Geometria do Gammacell em posição de irradiação. b) Detalhe
das fontes e a câmara de mostras. Azul - ar, Verde-chumbo, Laranja – Cobalto 60, Ciano - aço, Vermelho
- alumínio.
3.2 Definição de fontes
A definição de fontes utilizou o cartão SDEF definindo uma fonte de fótons cilíndrica
com diâmetro e extensão igual ao de todos os lápis de
60
Co e paralelas ao eixo Z. As
energias das partículas foram 1.1732 e 1.3325 MeV cada uma com peso 2. A posição da
A
B
C
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
141
fonte correspondeu com uma distribuição D4 dos possíveis 48 lugares onde o cilindro
pode ser colocado. Estas posições coincidem com o eixo das células de
60
Co na
geometria. Esta forma de construção permite variar facilmente as probabilidades de
emissão de cada fonte de acordo com sua atividade. Isto resultou muito útil para a
simulação do irradiador do IPEN onde nem todas as fontes possuem igual atividade. A
figura A4.5 mostra a distribuição da origem das partículas considerando 48 fontes com
igual atividade. É possível observar que a geração das partículas é totalmente
homogênea dentro da região definida pelas fontes de
60
Co.
Figura A4.5 Origem de partículas nas 48 posições com igual probabilidade.
3.3 Definição das Tallies
Para a simulação foram utilizadas as Tallies F4, F5 e F6. As Tallies F4 e F6 executadas
sobre as estruturas repetidas em forma de cubos de 0.5 cm uniformemente distribuídos
dentro da câmara de amostras. O cubo no centro da câmara tinha as coordenadas
X=0,Y=0 e Z=0. Dois tipos de cálculos foram feitos, um para os cubos encontrados no
planos X=0 e o outro para aqueles em Z=0. Os cálculos para o plano X=0 (Y=-6...6 e
Z=-10...10) reportaram a distribuição espacial da dose no plano vertical central e para
Z=0 (X=-6...6 e Y=-6...6.) foi encontrada a distribuição da dose no plano horizontal
central.
No caso da Tally F5, existiu uma limitação, já que só era possível colocar 20 detectores
por simulação, portanto foram realizadas varias simulações. Para determinar a
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
142
distribuição no plano X=0 foram realizadas 13 simulações correspondentes as
coordenadas Y=-6, -5, -4, ....., 4, 5, 6cm cada uma com Z variando entre -9cm a 9cm
com passo 1cm. Similarmente foram realizadas 13 simulações com Z=0 e X=-6, ..., 6.
3.5 Resultados da simulação de validação
As figuras A4.6 e A4.7 mostram os resultados das simulações da taxa de dose e da
dispersão com respeito à dose central para o irradiador tipo Excel utilizando a Tally F5.
Os cálculos realizados com as Tallies F4 e F6 resultaram muito demorados (da ordem
de semanas) e as flutuações estatísticas foram altas com respeito às divergências da dose
na câmara de amostras. O valor de atividade da fonte considerado foi de 6000 Ci.
Segundo a referência [Gammacell-220 Excel 2001] o valor de taxa de dose esperado era
de 5000 Gy/h. Para a simulação foram rodados 13 arquivos de entrada cada um com
300000 historias. Os tempo de simulação foi de arredor de 45 min, e os erros do 0.3%.
cm
[Gy/h]
F5-Excel
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
4000
4150
4300
4450
4600
4750
4900
5050
5200
5350
5500
5650
5800
5950
6000
Figura A4.6 Simulação da taxa de dose no irradiador Gammacell200-Excel da referência utilizando Tally
F5. Corte nos planos Z=0 (esquerda) e X=0 (direita). Taxa de dose central de 5139 (102) Gy/h.
A figura A4.8 mostra uma comparação entre os resultados das taxas de dose central
simuladas e o valor de 5 kGy da referência. È possível observar que de forma geral
todos os resultados estão de acordo com o valor de referência, mas os cálculos feitos
utilizando as Tallies F5 e F6 estão mais perto do valor verdadeiro. Os erros grandes nos
resultados com F4 e F6 são devido ao pequeno número de histórias corridas, mas para
sua redução seriam necessários muitos dias de cálculo. Uma comparação entre a
dispersão da taxa de dose com respeito à central simulada com F5 (figura A4.7) e a
distribuição de referência (figura A4.3) revela que ambas apresentam uma boa
coincidência, o que nos permitiu validar o procedimento de simulação.
[Gy/h]
cm
F5-Excel
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
4600
4800
5000
5200
5400
5600
5800
6000
6200
6400
6600
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
143
90
95
100
100
95
105
105
90
85
110110
85
[%]
cm
F5-Excel
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
70
73
75
78
80
83
85
88
90
93
95
98
100
103
105
108
110
113
115
118
120
Figura A4.7 Dispersão com respeito à dose central do irradiador do Gammacell200-Excel utilizando
Tally F5. Corte nos planos Z=0 (esquerda) e X=0 (direita). As unidades dos eixos são centímetros.
Unidades da escala de cores em percentagem.
F4:p F5:p F6:p
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Taxa de dose de referencia com 5% de erro.
Taxa de Dose (Gy/h)
Tallies
Figura A4.8 Comparação entre o valor de referência (vermelho) e as taxas de dose centrais calculadas
utilizando as Tallies F4:p, F5:p e F6:p (verde).
Podemos concluir que a construção geométrica, a definição de fontes e o procedimento
de cálculo de dose foram satisfatórios, o qual nos permitira realizar a simulação do
irradiador Gammacell 220 do IPEN, do qual não possuímos muitas referências, além da
taxa de dose central.
120
120
120
115
110
105
[%]
cm
F5-Excel
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
90
93
95
98
100
103
105
108
110
113
115
118
120
123
125
128
130
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
144
4. Simulação do irradiador do IPEN
4.1 Definição das fontes
Depois de ter testado os procedimentos de simulação com o irradiador tipo Excel, foi
simulada a taxa de dose para o irradiador Gammacell do IPEN. Neste caso só foram
modificadas as taxas de emissão das fontes de
60
Co seguindo a distribuição das 35
fontes com as quais foi calibrado no dia 23/9/1997. A figura A4.9 mostra a distribuição
dos pontos de origem das partículas. Observa-se que, neste caso, a distribuição não é
homogênea. As 8 fontes com 1467 Ci têm uma probabilidade maior de emitir que a de
264 Ci e as 26 de 16,6 Ci.
Figura A4.9 Distribuição espacial na simulação da origem das partículas na fonte anular. A distribuição
responde as intensidades e ao número de fontes presente no irradiador do IPEN (8 fontes de 1467 Ci, 1
fonte de 264 Ci e 26 fontes de 16.6 Ci, total 12432 Ci em 23/9/97).
4.2 Taxa de dose central de referência
A taxa de dose de referência para 2005 foi de 3.63 (0.18) kGy/h, que corresponde com
uma atividade )81315.0exp(12432
1
yryrA ⋅−⋅=
−
=4342 Ci
4.3 Resultados da simulação do Gammacell-220 do IPEN
As figuras A4.10 e a4.11 mostram os resultados das taxas de doses e sua variação
espacial dentro da câmara, obtido nas simulações utilizando a Tally F5. Como no caso
anterior, as simulações com F4 e F6 foram muito demoradas e imprecisas. Os numeros
de histórias, tempos e erros foram similares as do Gammacell200-Excel. Os resultados
de taxa de dose central mostrados na figura A4.10 e A4.12 também coincidem muito
bem com o valor experimental.
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
145
Um dos nossos objetivos com a simulação era verificar se a distribuição não homogênea
das fontes causava grandes variações na distribuição do campo de dose dentro da
câmara de irradiação e sobre as amostras. Comparando as figuras A4.7 e A4.11 é
possível apreciar certa variação espacial nas curvas de isodose no plano vertical, mas no
plano horizontal central ainda é mantida uma simetria cilíndrica num diâmetro de 6 cm
aproximadamente. Nesta região, a taxa de dose varia até 3% por acima do valor central.
Os suportes de amostras utilizados não superam os 5 cm de diâmetro pelo qual a dose
recebida terá um incremento de ate 3% aproximadamente.
[Gy/h]
cm
F5-IPEN
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
3000
3100
3200
3300
3400
3500
3600
3700
3800
3900
4000
4100
4200
4300
4400
Figura A4.10 Simulação da taxa de dose no irradiador Gammacell220 do IPEN utilizando Tally F5.
Corte nos planos Z=0 (esquerda) e X=0 (direita). Taxa de dose central 3753 (75) Gy/h.
Na figura A4.12 são comparados os resultados obtidos utilizando as Tallies F4, F5, e F6
com respeito ao valor experimental da taxa de dose central. Os resultados mostram uma
boa coincidência entre os resultados da simulação e os dados experimentais, apesar dos
grandes erros dos cálculos por F4 e F6.
[Gy/h]
cm
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
3600
3700
3800
3900
4000
4100
4200
4300
4400
4500
4600
4700
4800
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
146
90
93
95
98
100
100
98
95
93
103
103
90
105
105
88
88
108
108
85
85
1
10
11
0
83
[%]
cm
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-9
-10
-7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7
75
78
80
83
85
88
90
93
95
98
100
103
105
108
110
113
115
118
120
Figura A4.11 Dispersão com respeito à dose central do irradiador Gammacell220 do IPEN utilizando
Tally F5. Corte nos planos Z=0 (esquerda) e X=0 (direita).
F4:p F5:p F6:p
0
1000
2000
3000
4000
5000
Taxa de dose de referencia com 5% de erro.
Taxa de Dose (Gy/h)
Tallies
Figura a4.12 Comparação entre o valor de referência (vermelho) e as taxas de dose centrais calculadas
utilizando as Tallies F4:p, F5:p e F6:p (verde).
4.4 Conclusão
Como conclusão, é possível afirmar que a simulação do irradiador Gammacell-220 do
IPEN foi bem sucedida. A não homogeneidade das fontes não produz grandes variações
dentro da simetria da dispersão da dose no interior da câmara de amostras. E a taxa de
doses recebida no DNA colocado nos porta amostras construídos para as irradiações não
superam em mais de 3% a taxa de dose central.
125
120
115
115
115
120
120
120
110
105
103
[%]
cm
8
7
6
5
4
3
2
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
-8
-8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8
95
98
100
103
105
108
110
113
115
118
120
123
125
128
130
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
147
5 Código de entrada ao MCNP
Código de entrada ao MCNP da simulação do irradiador Gammacell-220 Excel e do
IPEN.
Irradiador GammaCell 220 Excel
c esferas de 2.4 cm de diametro epaciadas 0.5 cm
1 4 -8.9 (-1:-2:-3:-4:-5:-6:-7:-8:-9:-10:-11:-12: $fontes de
cobalto
-13:-14:-15:-16:-17:-18:-19:-20:-21:-22:
-23:-24:-25:-26:-27:-28:-29:-30:-31:-32:
-33:-34:-35:-36:-37:-38:-39:-40:-41:-42:
-43:-44:-45:-46:-47:-48) 82 -85 imp:p=1
2 1 -0.001205 51 -52 82 -85 #1 imp:p=1 $espaco de ar
3 2 -8.02 50 -51 82 -85 imp:p=1 $acero inox 1
4 2 -8.02 52 -53 82 -85 imp:p=1 $acero inox 2
5 2 -8.02 -53 80 -82 imp:p=1 $base de fonte
c 6 5 1 (-71 82 -85) (70:-83:84)(91:-84) imp:p=1
$aluminio da camara com buraco
6 5 -2.70 (-71 82 -85) (70:-83:84) imp:p=1 $aluminio da
camara
7 1 -0.001205 -50 71 82 -85 imp:p=1 $espacio de aire
10 0 -70 83 -84 fill=2 imp:p=10 $camara temporaria
11 2 -8.02 70 -71 90 -80 imp:p=1 $cubierta Drawer inferior
12 3 -11.34 -70 90 -80 imp:p=1 $blindagem drawer
inferior
13 2 -8.02 91 -71 85 -92 (-86:70) imp:p=1 $ drawer
superior
14 3 -11.34 91 -70 86 -92 imp:p=1 $chumbo de
drawer sup
c 15 1 1 -91 84 -92 imp:p=1 $tubo de acesso com
buraco
15 1 -0.001205 -91 85 -92 imp:p=1 $tubo de acesso
26 3 -11.34 -93 94 -95 71 (53:-80:85) imp:p=1 $blindagem
chumbo
27 3 -11.34 -98 71 95 -96 imp:p=1 $cone de chumbo
28 3 -11.34 -99 71 96 -97 imp:p=1 $protector superior
50 1 -0.001205 -100 (93:-94:95) (71:-90:92)#27 #28 imp:p=1
$chumbo externo
200 1 -0.001205 -120 imp:p=1 u=1
201 1 -0.001205 120 imp:p=1 u=1
300 0 130 -131 132 -133 134 -135 u=2 fill=1 lat=1 imp:p=1
100 0 100 imp:p=0
c SUPERFICIES
c fontes
1 c/z 9.813 0.000 0.640
2 c/z 9.729 1.281 0.640
3 c/z 9.479 2.540 0.640
4 c/z 9.066 3.755 0.640
5 c/z 8.498 4.907 0.640
6 c/z 7.785 5.974 0.640
7 c/z 6.939 6.939 0.640
8 c/z 5.974 7.785 0.640
9 c/z 4.907 8.498 0.640
10 c/z 3.755 9.066 0.640
11 c/z 2.540 9.479 0.640
12 c/z 1.281 9.729 0.640
13 c/z 0.000 9.813 0.640
14 c/z -1.281 9.729 0.640
15 c/z -2.540 9.479 0.640
16 c/z -3.755 9.066 0.640
17 c/z -4.907 8.498 0.640
18 c/z -5.974 7.785 0.640
19 c/z -6.939 6.939 0.640
20 c/z -7.785 5.974 0.640
21 c/z -8.498 4.907 0.640
22 c/z -9.066 3.755 0.640
23 c/z -9.479 2.540 0.640
24 c/z -9.729 1.281 0.640
25 c/z -9.813 0.000 0.640
26 c/z -9.729 -1.281 0.640
27 c/z -9.479 -2.540 0.640
28 c/z -9.066 -3.755 0.640
29 c/z -8.498 -4.907 0.640
30 c/z -7.785 -5.974 0.640
31 c/z -6.939 -6.939 0.640
32 c/z -5.974 -7.785 0.640
33 c/z -4.907 -8.498 0.640
34 c/z -3.755 -9.066 0.640
35 c/z -2.540 -9.479 0.640
36 c/z -1.281 -9.729 0.640
37 c/z 0.000 -9.813 0.640
38 c/z 1.281 -9.729 0.640
39 c/z 2.540 -9.479 0.640
40 c/z 3.755 -9.066 0.640
41 c/z 4.907 -8.498 0.640
42 c/z 5.974 -7.785 0.640
43 c/z 6.939 -6.939 0.640
44 c/z 7.785 -5.974 0.640
45 c/z 8.498 -4.907 0.640
46 c/z 9.066 -3.755 0.640
47 c/z 9.479 -2.540 0.640
48 c/z 9.729 -1.281 0.640
c porta fonte
50 cz 9. $diametro interno1 aço
51 cz 9.171 $diametro interno2 aço
52 cz 10.455 $diametro externo 1
53 cz 11. $diametro externo 2
c
c DRAWER
70 cz 7.745
71 cz 8.255
c planos DRAWER
80 pz -12.235
82 pz -10.735
83 pz -10.235
84 pz 10.235
85 pz 10.875
86 pz 12.375
c drawer inferior
90 pz -90
c drawer superior
91 cz 1.585
92 pz 47.385
c blindagem
93 cz 38
94 pz -39.37
95 pz 20.32
96 pz 39.37
97 pz 55.88
98 kz 59.03 0.9636
99 cz 19.3
c entonro
100 so 150
c estructura repetida
120 so 0.24
130 px -0.25
131 px 0.25
132 py -0.25
133 py 0.25
134 pz -0.25
135 pz 0.25
mode p
c fonte
SDEF RAD D1 AXS 0 0 1 EXT D2 ERG D3 PAR 2 POS D4
WGT 2
c radio
SI1 0 0.60
SP1 -21 1
c distribuicion para extension
Apêndice 4. Simulação do irradiador de gama de
60
Co
148
SI2 -10.735 10.375
SP2 0 1
c energias
SI3 L 1.1732 1.3325
SP3 D 1 1
c
SI4 L 9.813 0.000 0.640
9.729 1.281 0.640
9.479 2.540 0.640
9.066 3.755 0.640
8.498 4.907 0.640
7.785 5.974 0.640
6.939 6.939 0.640
5.974 7.785 0.640
4.907 8.498 0.640
3.755 9.066 0.640
2.540 9.479 0.640
1.281 9.729 0.640
0.000 9.813 0.640
-1.281 9.729 0.640
-2.540 9.479 0.640
-3.755 9.066 0.640
-4.907 8.498 0.640
-5.974 7.785 0.640
-6.939 6.939 0.640
-7.785 5.974 0.640
-8.498 4.907 0.640
-9.066 3.755 0.640
-9.479 2.540 0.640
-9.729 1.281 0.640
-9.813 0.000 0.640
-9.729 -1.281 0.640
-9.479 -2.540 0.640
-9.066 -3.755 0.640
-8.498 -4.907 0.640
-7.785 -5.974 0.640
-6.939 -6.939 0.640
-5.974 -7.785 0.640
-4.907 -8.498 0.640
-3.755 -9.066 0.640
-2.540 -9.479 0.640
-1.281 -9.729 0.640
0.000 -9.813 0.640
1.281 -9.729 0.640
2.540 -9.479 0.640
3.755 -9.066 0.640
4.907 -8.498 0.640
5.974 -7.785 0.640
6.939 -6.939 0.640
7.785 -5.974 0.640
8.498 -4.907 0.640
9.066 -3.755 0.640
9.479 -2.540 0.640
9.729 -1.281 0.640
c
**************************************************
******
c Para o irradiador Gammacell-220 Excel
c (distribuição homogênea)
c
SP4 D 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1 1 1
c
c
***************************************************
*****
c Para irradiador Gammacell-200 IPEN
c (distribuição não homogênea)
c
SP4 D 0.00 0.00 2.12 0.00 0.00 11.80 0.00
0.13 0.13 0.13 0.00 11.80 0.00 0.13
0.13 0.13 0.00 11.80 0.13 0.13 0.13
0.13 0.13 11.80 0.13 0.13 0.13 0.13
0.13 11.80 0.13 0.13 0.13 0.13 0.00
11.80 0.00 0.13 0.13 0.13 0.00 11.80
0.00 0.13 0.13 0.13 0.00 11.80
c
c
***************************************************
*****
c materiais
c ar
m1 6000 -0.0001 7014 -0.7553 8000 -0.2318 18000 -0.0128
c aço
m2 26000 61.8
6000 0.08
28000 20.0
25000 2
14000 1
15000 0.045
16000 0.03
c chumbo
m3 82000 1
c Cobalto
m4 27000 1
c alumínio
m5 13000 1
c Tallies
c fatores de conversão ANSI
DE4 0.01 0.03 0.05 0.07 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.8
1.0 1.4 1.8 2.2
DF4 3.96E-6 5.82E-7 2.90E-7 2.58E-7 2.83E-7
3.79E-7 5.01E-7 6.31E-7 7.59E-7 8.78E-7
9.85E-7 1.08E-6 1.17E-6 1.27E-6 1.36E-6
1.44E-6 1.52E-6 1.68E-6 1.98E-6 2.51E-6
2.99E-6 3.42E-6
DE14 0.01 0.03 0.05 0.07 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3
0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.8
1.0 1.4 1.8 2.2
DF14 3.96E-6 5.82E-7 2.90E-7 2.58E-7 2.83E-7
3.79E-7 5.01E-7 6.31E-7 7.59E-7 8.78E-7
9.85E-7 1.08E-6 1.17E-6 1.27E-6 1.36E-6
1.44E-6 1.52E-6 1.68E-6 1.98E-6 2.51E-6
2.99E-6 3.42E-6
F4:p (200<300[0:0 -12:12 -20:20]<10)
F14:p (200<300[-12:12 -12:12 0:0]<10)
F6:p (200<300[0:0 -12:12 -20:20]<10)
F16:p (200<300[-12:12 -12:12 0:0]<10)
SD4 0.057906 $volume da celula
SD14 0.057906
SD6 0.057906
SD16 0.057906
nps 3E8
print
c ptrac event=src max=10000 write=pos file=asc
Apêndice 5.Reagentes e soluções utilizadas no trabalho.
149
APÊNDICE 5. Reagentes e soluções utilizadas no trabalho.
A5.1 EDTA 0.5 M pH 8.0 (1000 ml)
1. EDTA 186.1 g
2.
H
2
O 800 ml
3.
Agitar vigorosamente.
4.
Ajustar pH com NaOH e ir adicionando água até 1000 ml.
A5.2 TBE 10X (1000 ml)
1. 108 g de Tris Base
2.
55 g de acido bórico
3.
40 ml de EDTA (0.5 M)
4.
Completar com H
2
O até 1000 ml.
A5.3 Stop Mix 10x (100ml)
1. 20 ml de EDTA (0.5 M)
2.
0.5 g Azul de Bromofenol
3.
50% Glicerol
4.
Completar com H
2
O até 100ml
A5.4 TBE 0.5X (Tampão)
1. 50 ml de TBE 10x
2.
950 ml de H
2
O
A5.5 Gel de eletroforese
1. 100 ml de TBE 0.5X
2.
0.7 g de agarose
3.
Aquecer até dissolução
4.
Adicionar Brometo de Etídio para concentração de 0.5 µg/ml.
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