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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP – DEPARTAMENTO DE PSICOLOGIA E EDUCAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PSICOBIOLOGIA
Avaliação farmacológica do congelamento, da antinocicepção e do
comportamento exploratório organizados na substância cinzenta
periaquedutal ventrolateral
MARIA CECÍLIA ZANOTO DE LUCA VINHAS
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto – USP, como parte das exigências
para a obtenção do título de Doutor em
Ciências. Área: Psicobiologia.
Ribeirão Preto
2006
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MARIA CECÍLIA ZANOTO DE LUCA VINHAS
Avaliação farmacológica do congelamento, da antinocicepção e do
comportamento exploratório organizados na substância cinzenta
periaquedutal ventrolateral
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto – USP, como parte das exigências
para a obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Área de Concentração: Psicobiologia
Orientador: Prof. Dr. Marcus L. Brandão
Ribeirão Preto
2006
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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Vinhas, Maria Cecília Zanoto de Luca.
Avaliação farmacológica do congelamento, da antinocicepção e do
comportamento exploratório organizados na substância cinzenta periaquedutal
ventrolateral / Maria Cecília Zanoto de Luca Vinhas; orientador Marcus Lira
Brandão – Ribeirão Preto, 2006.
129 f.
Tese de Doutorado – Área de Concentração: Psicobiologia – Faculdade
de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
1. Antinocicepção. 2. Congelamento. 3. SCPvl. 4. Midazolam. 5.
Labirinto em Cruz Elevado.
DEDICATÓRIA
Ao meu marido Tarcísio pelo apoio, compreensão e incentivo na realização dos nossos
sonhos.
Aos meus familiares e em especial à minha mãe que é um exemplo de bondade e
perseverança nas atitudes e na superação dos obstáculos.
E a todos os amigos que compartilham conosco a tarefa árdua do aprendizado.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Marcus Lira Brandão, pela paciência, orientação e por ter me recebido em seu
laboratório.
Ao Prof. Dr. Jesus Landeira Fernandez, pelas críticas e sugestões.
Ao Prof. Dr. Antônio Roberto Martins, pela assessoria, orientação e incentivo.
Ao Prof. Dr. Wiliam Alves do Prado, pelas sugestões para o aprimoramento e publicação
deste trabalho.
Aos colegas, funcionários, secretárias e amigos que conquistei durante estes anos. Obrigada
pela amizade, carinho e compreensão.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) pelo auxílio
financeiro.
“A última tentativa da razão é reconhecer que há uma infinidade de coisas que a
ultrapassam. Revelar-se-á fraca se não chegar a conhecer isso. É preciso saber duvidar onde é
preciso, afirmar onde é preciso, e submeter-se onde é preciso. Quem não faz assim não
entende a força da razão. Há os que pecam contra esses três princípios, ou afirmando tudo
como demonstrativo, não precisando ser conhecido por demonstrações; ou duvidando de tudo,
não precisando saber onde é necessário, submeter-se; ou submetendo-se a tudo, não
precisando saber onde é necessário julgar” (Blaise Pascal - Pensamentos).
RESUMO
DE LUCA-VINHAS, M. C. Z. Avaliação farmacológica do congelamento, da
antinocicepção e do comportamento exploratório organizados na substância cinzenta
periaquedutal ventrolateral. 2006. 129f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Filosofia
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Mecanismos opióides e serotoninérgicos na Substância Cinzenta Periaquedutal ventrolateral
(SCPvl) são recrutados pelo congelamento condicionado e pela antinocicepção. Contudo, não
está claro se o congelamento e a antinocicepção induzidos pela estimulação elétrica da SCPvl
são processos inter-relacionados. Para verificar esta hipótese, investigamos os efeitos do
antagonista opióide naltrexona, do antagonista de receptores 5-HT
2
cetanserina e do agonista
benzodiazepínico midazolam, injetados na SCPvl, sobre o congelamento e a antinocicepção
induzidos pela estimulação elétrica desta região. A antinocicepção foi avaliada pelo teste de
retirada da cauda e o da formalina. Para caracterizar o envolvimento da SCPvl no medo
incondicionado, os efeitos das injeções de midazolam na SCPvl sobre o comportamento
exploratório foram também estudados em grupos independentes de ratos submetidos ao teste
do Labirinto em Cruz Elevado (LCE). Os dados obtidos mostraram que: i) a estimulação
elétrica da SCPvl produziu congelamento, que foi bloqueado pelo midazolam, mas não pela
naltrexona e cetanserina; ii) a antinocicepção gerada no nível da SCPvl foi inibida pela
naltrexona, cetanserina e midazolam; iii) a ativação de mecanismos mediados por
benzodiazepínicos na SCPvl aumentou o comportamento exploratório dos ratos nos braços
fechados mas não alterou a esquiva dos braços abertos no LCE. Dessa forma, o congelamento
e a antinocicepção gerados na SCPvl são dissociados farmacologicamente. Enquanto a
antinocicepção constitui um processo multimediado, sensível à naltrexona, à cetanserina e ao
midazolam, o congelamento induzido pela estimulação elétrica da SCPvl foi revertido
somente pelo composto benzodiazepínico. As injeções de midazolam na SCPvl não causaram
efeito ansiolítico no LCE, sugerindo que os estímulos aversivos inerentes a esse teste parecem
não influenciar a região estudada.
Palavras-chave: Antinocicepção; Congelamento; SCPvl; Midazolam; Labirinto em Cruz
Elevado.
ABSTRACT
DE LUCA-VINHAS, M. C. Z. Pharmacological assessment of the freezing,
antinociception and exploratory behavior organized in the ventrolateral periaqueductal
gray. 2006. 129f. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2006.
Opioid and serotonergic mechanisms of the ventrolateral periaqueductal gray (vlPAG) are
recruited by conditioned freezing and antinociception. However, it is unclear whether freezing
and antinociception induced by stimulation of the vlPAG are interrelated. To address this
issue we looked at the effects of the opioid antagonist naltrexone, the 5-HT
2
antagonist
ketanserin, and the benzodiazepine agonist midazolam injected into the vlPAG on the freezing
and antinociception induced by electrical stimulation of this region. This antinociception was
evaluated by the tail-flick and formalin tests. To further characterize the involvement of the
vlPAG in unconditioned fear, the effects of intra-vlPAG injections of midazolam on the
exploratory behavior were also assessed in independent groups of rats submitted to the
elevated plus-maze test (EPM). The data obtained showed that: (i) electrical stimulation of the
vlPAG causes freezing blocked by midazolam but not by naltrexone and ketanserin; (ii)
antinociception generated at the level of the vlPAG is inhibited by naltrexone, ketanserin, and
midazolam; (iii) activation of benzodiazepine-mediated mechanisms in the vlPAG increases
the exploratory behavior of rats in the closed arms but not the avoidance behavior of open
arms of the EPM. Thus, freezing and antinociception generated in the vlPAG are dissociated
pharmacologically. Whereas antinociception is a multimediated process sensitive to
naltrexone, ketanserin and midazolam, the freezing induced by vlPAG stimulation was
reversed only by the benzodiazepine compound. As injections of midazolam into the vlPAG
do not cause anxiolytic effects in the EPM, the aversive stimuli inherent of this test seem to
bypass the vlPAG.
Key words: Antinociception; Freezing; vlPAG; Midazolam; Elevated plus-maze
SUMÁRIO
RESUMO 6
ABSTRACT 7
1 INTRODUÇÃO 11
1.1 ORGANIZAÇÃO ANATÔMICA E FUNCIONAL DA SUBSTÂNCIA CINZENTA
PERIAQUEDUTAL (SCP) 13
1.2 PARTICIPAÇÃO DA SCP NO COMPORTAMENTO DEFENSIVO 16
1.3 MEDO E ANTINOCICEPÇÃO 18
1.4 MODULAÇÃO DA DOR 19
1.4.1 Componentes da dor 20
1.4.2 Sistema descendente modulatório 23
1.5 MEDIAÇÃO NEUROQUÍMICA NO CONTROLE DA DOR NA SCP 25
1.5.1 Mediação Opióide
26
1.5.2 Mediação Serotoninérgica 29
1.5.3 Mediação GABAérgica
31
2 OBJETIVOS 36
3 MATERIAIS E MÉTODOS 38
3.1 ANIMAIS 39
3.2 EQUIPAMENTOS 39
3.3 CIRURGIA 42
3.4 DROGAS 42
3.5 MICROINJEÇÃO 43
3.6 TESTES 43
3.6.1 Limiar de congelamento 43
3.6.2 Teste da retirada da cauda 44
3.6.3 Teste da formalina 45
3.6.4 Teste do labirinto em cruz elevado 47
3.6.5 Teste do campo aberto 49
3.7 HISTOLOGIA 49
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA 50
4 RESULTADOS
51
4.1 HISTOLOGIA
52
4.2 EXPERIMENTO I: EFEITOS DE DROGAS SOBRE O CONGELAMENTO E
ANTINOCICEPÇÃO INDUZIDOS PELA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DA SCPVL 53
4.2.1 Limiar de congelamento 53
4.2. 2 Teste da retirada da cauda 55
4.2.3 Teste da formalina 57
4.3 EXPERIMENTO II: EFEITOS DA INJEÇÃO DE MIDAZOLAM NA SCPVL SOBRE O
COMPORTAMENTO EXPLORATÓRIO DOS RATOS NO LABIRINTO EM CRUZ
ELEVADO 59
4.3.1 Medidas tradicionais
59
4.3.2 Medidas etológicas
61
4.4 EXPERIMENTO III: EFEITOS DA INJEÇÃO DE MIDAZOLAM NA SCPVL SOBRE
A ATIVIDADE MOTORA DE RATOS SUBMETIDOS AO TESTE DO CAMPO
ABERTO 63
5 DISCUSSÃO 65
6 CONCLUSÕES 78
REFERÊNCIAS 80
ANEXOS 94
1 INTRODUÇÃO
Introdução
12
bases neurobiológicas do medo e da antinocicepção têm sido
freqüentemente estudadas em modelos animais de ansiedade. O emprego
desses modelos está baseado em estudos evolutivos que indicam que a ansiedade humana está
diretamente relacionada com as reações de defesa que os animais exibem em resposta aos
estímulos ou situações que sinalizam perigo (HETEM et al., 1996). Durante a expressão dos
comportamentos defensivos em resposta aos sinais de perigo, os circuitos neuroniais
associados liberam substâncias endógenas para promover antinocicepção, que serve para
minimizar o sofrimento físico provocado pela situação de confronto, o que, de certa forma,
favorece a luta para prevenir o dano físico e assegurar a sobrevivência do indivíduo.
Atualmente, parece haver concordância entre os pesquisadores dessa área que a
antinocicepção possa ser um componente da reação de defesa (BOLLES; FANSELOW,
1980).
Mesmo havendo ampla investigação científica para traçamento dos circuitos neuroniais
subjacentes às emoções, alguns aspectos continuam desconhecidos, principalmente aqueles
relacionados aos estímulos sensoriais. Pouco se sabe a respeito de como são interpretados ou
atuam na gênese dos comportamentos defensivos. Apesar do grande número de estruturas
encefálicas envolvidas com o comportamento emocional, poucas são as que participam de
forma tão evidente na integração dos aspectos sensoriais e motores do medo como a
substância cinzenta periaquedutal (SCP).
As
Introdução
13
1.1 ORGANIZAÇÃO ANATÔMICA E FUNCIONAL DA SUBSTÂNCIA
CINZENTA PERIAQUEDUTAL
A substância cinzenta periaquedutal (SCP) é uma região mesencefálica, que envolve o
aqueduto cerebral desde o locus coeruleus até a comissura posterior. É uma área anatômica
importante, que mantém conexões com muitas estruturas dos sistemas límbico, sensorial,
motor e autonômico.
A região ventrolateral da substância cinzenta periaquedutal (SCPvl) tem sido alvo de
grande interesse devido ao seu papel funcional principal estar relacionado com a
antinocicepção que decorre da sua estimulação elétrica ou química. As observações iniciais de
Melzack e Wall, na década de 60, foram cruciais para evidenciar as substâncias presentes
nesta região, com propriedades similares à morfina, com capacidade de induzir analgesia
suficiente para se realizar uma laparotomia exploratória. De fato, um grande número de
laboratórios tem demonstrado que essa região é um dos sítios de grande importância na
regulação da dor, sendo um local de ação para fármacos analgésicos como a morfina (BEITZ,
1982). Embora o papel da SCP esteja mais relacionado com a antinocicepção, esta região
também está envolvida em uma série de outras funções biológicas relacionadas às estruturas
com as quais se conecta no sistema nervoso central (BEITZ, 1982).
A SCPvl é composta por uma população densa de neurônios pequenos e uma grande
variedade de tipos celulares, como os neurônios multipolares, que possuem uma grande
arborização dendrítica, os neurônios fusiformes que contêm um ou mais processos
dendríticos, os estrelados que têm de 3-6 processos, e as células piramidais com rica
arborização dendrítica difusa. Embora todas as regiões da SCP contenham esses tipos de
células diferenciadas, o tamanho do soma dessas células aumenta conforme as mesmas se
distanciam do aqueduto (MANTYH, 1982a/b).
Introdução
14
Beitz em 1982, propôs que a SCP é constituída por um manto de células que circundam
o aqueduto cerebral e que, em roedores, existem subdivisões anatômicas que podem ter
funções específicas. Este autor propôs uma divisão da SCP em três regiões, relacionando-as
com as influências sensorial, límbica ou motora.
As aferências sensoriais, em geral, projetam-se para todas as regiões da SCP,
originando-se principalmente das lâminas IV e V do corno dorsal da medula espinhal, do
colículo superior e dos núcleos trigeminais. A SCP recebe também importantes projeções do
núcleo magno da rafe, núcleo reticular paragigantocelular, núcleo gigantocelular, núcleo
pontino reticular caudal e rostral, núcleo obscuro da rafe, núcleo mediano da rafe, núcleo
reticular gigantocelular ventral, núcleo pálido da rafe, núcleo pontino da rafe, núcleo
tegmental laterodorsal e núcleo dorsal da rafe (BEITZ, 1982; BEITZ et al., 1986).
A SCP emite poucas projeções diretamente para a medula espinhal (PECHURA; LIU,
1986). Porém, suas principais eferências relacionadas com a modulação da nocicepção estão
em conexão direta com o núcleo magno da rafe, dorsal da rafe, núcleo reticular
paragigantocelular e gigantocelular (FARDIN; OLIVERAS; BESSON, 1984a/b), núcleo
reticular parvocelular, núcleo reticular gigantocelular (BEITZ; MULLETT; WEINER, 1983).
Envia também projeções para as regiões adjacentes, como a formação reticular mesencefálica,
o núcleo pré-tectal e o colículo superior (MANTYH, 1982).
Em sua relação com o sistema límbico, as principais estruturas que se projetam para a
SCP são o hipocampo, o septo, o hipotálamo, a habênula e o núcleo interpeduncular
(NAUTA, 1961). A região ventral da SCP mantém conexões recíprocas diretas ou indiretas
com o sistema límbico, incluindo o tálamo lateral, o núcleo talâmico dorsomedial, a área
tegmental ventral e o hipotálamo lateral (BEITZ, 1982). As fibras que se originam no sistema
motor, projetam-se para a região ventral da SCP, e em menor grau, para a sua região
ventrolateral. Essas fibras compreendem as aferências do córtex motor, zona incerta, cerebelo
Introdução
15
e substância negra (BEITZ, 1982). Assim, a SCP, situa-se no meio de um processo de
integração entre o sistema límbico e o sistema motor, e pode influenciar o último através de
projeções para a zona incerta, núcleo centro mediano talâmico, núcleo parafascicular e
formação reticular (BEITZ, 1982).
Bandler e Shipley (1994) propuseram uma organização em colunas da SCP, ao longo do
eixo rostrocaudal, com funções distintas de acordo com a distribuição de fibras aferentes,
eferentes e interneurônios intrínsecos. Os autores sugeriram uma divisão em quatro colunas:
1) coluna dorsomedial, presente em toda extensão da SCP, acima do aqueduto cerebral; 2)
coluna dorsolateral, que se estende desde a porção rostral e intermediária da SCP, afunilando
no terço caudal; 3) coluna lateral, região imediatamente lateral ao aqueduto, localizada no
terço intermediário da SCP; 4) coluna ventrolateral, localizada entre a coluna lateral e o
núcleo dorsal da rafe, situada ventralmente ao aqueduto cerebral (Fig. 1).
Figura 1. Colunas neuroniais da SCP. A: coluna dorsomedial, B: dorsolateral, C: lateral e
ventrolateral (BANDLER; CARRIVE; DEPAULIS, 1991; CARRIVE, 1993; BANDLER; SHIPLEY,
1994).
Por se comunicar com grande número de estruturas encefálicas e apresentar uma
população neuronial bastante heterogênea (HAMILTON, 1973; REICHLING; KWIAT;
BASBAUM, 1998), a SCP possui um papel multifuncional com, pelo menos, cinco atividades
Introdução
16
funcionais: processamento e modulação da dor, medo e ansiedade, vocalização, lordose e
regulação autonômica. A estimulação das colunas dorsomedial e dorsolateral produz aumento
na pressão arterial e comportamento defensivo em ratos e gatos. Por outro lado, no gato, a
estimulação das colunas lateral e ventrolateral pode causar hipotensão e congelamento
(BEHBEHANI, 1995).
1.2 PARTICIPAÇÃO DA SCP NO COMPORTAMENTO DEFENSIVO
Panksepp (1982) propôs a existência de circuitos cerebrais específicos responsáveis pela
expressão das diversas emoções, tais como expectativa ou busca, medo, raiva e pânico. As
inúmeras informações sensoriais presentes no meio ambiente ou provenientes de estímulos
internos do organismo seriam responsáveis pela ativação desses circuitos cerebrais que
acionados, inibiriam ou estimulariam o aparecimento desses comportamentos. O circuito
responsável pelo medo constituiria a principal função de adaptação frente aos estímulos
externos ameaçadores à integridade física do animal e, provavelmente, estaria envolvido na
função evolutiva de redução da dor para manutenção da integridade física e sobrevivência do
indivíduo. Por isso, a ativação do sistema de defesa resulta em respostas de grande valor
adaptativo para o animal.
Evidências do envolvimento da SCP nas emoções advêm dos estudos que envolvem
situações ambientais com diferentes níveis de ameaça (BLANCHARD; BLANCHARD, 1989
e 1991). Em tais estudos, os pesquisadores classificam os comportamentos de defesa em três
níveis. O nível de maior expressão da defesa seria resultado da grande proximidade ou do
contado direto com o estímulo ameaçador. Neste caso, prevalece o comportamento de fuga e,
quando a mesma não é possível, a alternativa seria a de enfrentar o perigo com
comportamento de ataque defensivo.
Introdução
17
O nível de defesa intermediário ocorreria nas situações em que a fonte de perigo pode
ser identificada, porém a uma distância razoável do animal (BLANCHARD; BLANCHARD,
1989). Neste nível, ocorre um comportamento de esquiva, ou a inibição dos comportamentos
em curso, chegando até a imobilidade tensa ou congelamento (freezing). Este comportamento
seria uma estatégia adotada pelo animal para dificultar a sua localização pelo predador.
O terceiro nível de defesa ocorre quando o perigo é incerto e potencial, característico de
situações novas ou pelos estímulos de aprendizagem previamente associados a uma fonte de
ameaça. Nessas circunstâncias, os comportamentos resultantes são denominados de avaliação
de risco ou de investigação cautelosa (risk assessment), que consistem na orientação em
relação à fonte de ameaça potencial, inibição do movimento e aproximação cautelosa com
estiramento do corpo, dorso rebaixado e aumento da atenção (BLANCHARD;
BLANCHARD, 1991). Pode-se fazer um paralelo entre esse padrão de comportamento e o
distúrbio de ansiedade generalizada, no qual não há nenhum evento específico estressante que
possa ser associado à situação, apenas uma expectativa de ameaça (BLANCHARD;
BLANCHARD, 1991). Esse padrão comportamental parece estar relacionado com o medo
aprendido ou condicionado.
Adams (1979) também postulou que os padrões de defesa são organizados de forma
hierárquica. Baixa intensidade de estimulação é suficiente para produzir resposta de alerta,
enquanto alta intensidade promove fuga ou luta. Esses padrões de defesa são organizados por
meio de vias neuroniais que ligam os mecanismos motivacionais de defesa com as vias
motoras. Assim, experimentos que utilizam baixa intensidade de corrente elétrica, em sítios
específicos do SNC, são capazes de induzir piloereção, dilatação pupilar e vocalização.
Em 1994, Graeff procurou relacionar os comportamentos defensivos com as emoções
humanas de ansiedade, pânico e raiva como indicado na Tabela 1.
Introdução
18
Tipos de ameaça Potencial Distante Proximal
Estratégia
comportamental
Avaliação de risco Congelamento Ameaça/Fuga/Luta
Estruturas neuroniais Amígdala/ Sistema
Septo-hipocampal
Amígdala/
Periaquedutal
Ventral
Amígdala/
hipotálamo/
Periaquedutal dorsal
Emoção Ansiedade Medo Raiva/ Pânico
Tabela 1 – Relação entre os tipos de ameaça, respostas defensivas em animais de laboratório
e emoções humanas (GRAEFF, 1994).
1.3 MEDO E ANTINOCICEPÇÃO
Segundo Fanselow (1991), as respostas de congelamento e analgesia produzidas pelo
encontro presa-predador são reduzidas após a lesão da SCP. Os estímulos de perigo ativam
vias específicas na amígdala, que se projetam para SCP, promovendo o comportamento
defensivo, a analgesia e as respostas autonômicas. Esse pesquisador propôs a existência de
conexões diretas entre a amígdala e a SCPvl e intra-SCP, subjacentes às respostas defensivas
comportamentais observadas.
O modelo desenvolvido pelo pesquisador para caracterizar as regiões que participam de
forma integrada do comportamento defensivo está representado na figura 2, que mostra que os
estímulos que sinalizam perigo ativam a amígdala, que envia projeções para a coluna ventral
da SCP. A ativação da SCPvl produz congelamento e analgesia. Por outro lado, quando o
animal encontra o perigo, as projeções vindas da amígdala para a SCPl são ativadas
resultando em respostas de fuga associadas com vocalização e respostas autonômicas.
Conforme o modelo, há uma interação inibitória entre as regiões ventral e lateral da SCP.
Introdução
19
Figura 2. Esquema representativo do envolvimento diferenciado das regiões da substância
periaquedutal no medo e na percepção da dor. Os estímulos (condicionados ou incondicionados)
ativam a amígdala. Os estímulos incondicionados ativam diretamente a substância cinzenta
periaquedutal dorsal (SCPd). Dessa ativação resulta o comportamento defensivo (congelamento/fuga)
mediado por mecanismos serotoninérgicos (5-HT). A ativação da substância cinzenta periaquedutal
ventral (SCPv) pelos estímulos condicionados produz congelamento moderado e analgesia opióide
(BRANDÃO, 2005).
Fanselow (1991) sugeriu também, através de estudos farmacológicos e
comportamentais, que os estímulos aversivos incondicionados e condicionados provocam
analgesia não-opióide e opióide, respectivamente. Evidências disto são as respostas de
analgesia que resultam da desinibição dos neurônios tonicamente inibidos pelo ácido gama-
aminobutírico (GABA) na amígdala e SCP, ou da ativação, a partir da amígdala, de neurônios
ricos em peptídeos opióides localizados na SCP.
1.4 MODULAÇÃO DA DOR
O estudo da dor constitui um dos mais intrigantes desafios para o pesquisador da área
básica e aplicada. As experiências laboratoriais realizadas com animais podem, às vezes,
apresentar resultados conflitantes devido à complexidade da atividade neuronial, à variação
dos métodos de estudo aplicados e às diferenças anatômicas e funcionais no sistema nervoso
entre as espécies animais, o que dificulta a comparação dos resultados. Apesar disso, são
Introdução
20
inúmeros os relatos da participação de um grande número de vias nervosas e
neurotransmissores envolvidos na modulação da nocicepção tanto nos animais quanto no
homem.
Atualmente, já é possível identificar algumas substâncias que atuam como moduladores
e que são liberadas na medula espinhal ou em outras estruturas do sistema nervoso central, e
que podem modular a informação nociceptiva. Sabemos que o encéfalo não é passivo aos
sinais coletados do meio externo ou interno do indivíduo. Muitos aspectos das experiências
individuais interagem no processo de percepção da dor. Dessa forma, o sistema neuronial foi
desenvolvido ao longo do processo evolutivo para permitir que o organismo identifique e/ou
acione os processos mnemônicos a fim de controlar a sensibilidade e reagir de modo
adequado aos estímulos aversivos. Podemos evidenciar em doenças neuropáticas a fragilidade
desse sistema, principalmente quando há modificações morfofuncionais genéticas, como as
encontradas em alguns indivíduos em patologias que cursam com experiências dolorosas
persistentes. Por esta razão, há uma grande dificuldade para encontrar fármacos eficazes ou
potentes para o amplo espectro de patologias relacionadas com a dor crônica. Para
compreendermos o funcionamnto desse sistema, é necessário o conhecimento de alguns
aspectos básicos envolvidos.
1.4.1 Componentes da dor
Existem dois componentes relacionados com o fenômeno da dor: o componente
perceptivo-discriminativo e o aversivo-cognitivo-motivacional, também denominado
reacional por alguns autores. O componente perceptivo-discriminativo é discriminável no
tempo, espaço e intensidade (momento em que o organismo identifica o estímulo como
doloroso). O componente reacional compreende uma série de comportamentos defensivos que
vão desde a retirada reflexa do membro até as respostas emocionais do tipo luta/fuga. Esses
Introdução
21
comportamentos são geralmente acompanhados de fortes sensações subjetivas de desconforto
e de intensa motivação para aliviar ou terminar a dor (BRANDÃO, 2005).
Ainda não está bem estabelecida a melhor classificação da dor. Um modo simples de
caracterizar a dor é distinguir se é aguda ou crônica, tendo como base a resposta do indivíduo
em relação ao estímulo aversivo. A definição dos componentes fásico e tônico da dor é crucial
para o entendimento dessa distinção. A dor fásica é de curta duração e reflete o impacto
imediato causado pela injúria. Os danos traumáticos como, por exemplo, as queimaduras de
graus leves, provocam um mecanismo reflexo vigoroso, movimentos de proteção e
comportamentos característicos, como expressão verbal ou não-verbal. Na dor aguda existe
uma causa bem definida e com um curso temporal característico, e a dor desaparece tão logo
ocorre a cura da injúria. A dor aguda provocada por um dano tissular é constituída de dois
componentes, o fásico e o tônico. O rápido início da dor é referido como componente fásico,
enquanto que a fase insidiosa, persistente, é referida como componente tônico. O componente
tônico tem como finalidade propiciar o repouso, os cuidados e a proteção da área lesada, com
o intuito de promover a cura. A dor crônica também possui os dois componentes, fásico e
tônico. Entretanto, na dor crônica, o componente tônico pode persistir mesmo que ocorra a
cura da injúria. Para a grande maioria dos pacientes que apresentam dor crônica, mesmo que
haja a cura, o paciente ainda sente dor em resposta a estímulos que não deveriam ser
dolorosos. Por essa razão, os aspectos emocional e psicológico são mais importantes na dor
crônica que na aguda (BRANDÃO, 2005).
Introdução
22
Figura 3. Diagrama ilustrativo da dor aguda e crônica com seus componentes fásico e tônico
(BRANDÃO, 2005).
Em 1980, Bolles e Fanselow propuseram uma teoria interessante, baseada na idéia de
que a dor é necessária em alguns momentos e que, em outros, é melhor que seja inibida. O
modelo perceptivo-defensivo-recuperativo (PDR) assume que o medo e a dor são dois
sistemas competitivos, ou seja, de um lado a injúria e de outro a expectativa de dor ativam
sistemas motivacionais diferentes, que servem a funções distintas. A ativação do sistema
motivacional da dor produzida pela injúria induz comportamentos recuperativos (repouso,
cuidados com a área lesada), visando restabelecer o organismo. Por outro lado, o medo
produzido por estímulos dolorosos induz comportamento defensivo, que inibe a dor. Esse
modelo assume a existência de três aspectos distintos numa situação traumática. A primeira
fase, denominada perceptiva, é muito breve, quando o estímulo é detectado, codificado e
memorizado por aprendizagem associativa. Na segunda fase, o animal reage ao trauma e o
comportamento defensivo é mobilizado para autopreservação. A fase defensiva é
caracterizada pelo medo intenso e diminuição da sensibilidade dolorosa. Os autores defendem
que a dor não possui finalidade alguma no momento em que os animais exibem o repertório
Introdução
23
defensivo. A terceira fase é considerada como recuperativa que ocorre tardiamente. Esta fase
pode ser prolongada quando o perigo já passou e o medo foi dissipado. Os aspectos
recuperativos prevalecem nesta fase, tais como os cuidados corporais e repouso, havendo
inibição dos demais comportamentos. Os autores enfatizam que a base desse sistema é que a
dor e o medo constituem sistemas motivacionais diferentes, com diferentes tipos de
comportamentos, e supõem a existência de uma inibição recíproca entre esses dois sistemas.
O medo pode inibir a dor e a dor pode inibir o medo (BOLLES; FANSELOW, 1980).
1.4.2 Sistema descendente modulatório
A Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) define a dor como uma
"experiência sensorial e emocional desagradável associada a um dano tecidual, ou ainda,
descrita em termos que sugere tal dano". A dor pode ser manifestada mesmo na ausência do
estímulo que danifica o tecido, o que podemos verificar nos casos de neuropatia periférica ou
central e em algumas afecções psicopatológicas (TEIXEIRA, 2001).
Os principais tratos envolvidos com a transmissão nociceptiva são o espinotalâmico, o
espinorreticular, o proprioespinhal e o espinomesencefálico, que ascendem através do
quadrante ventrolateral da medula espinhal. Alguns tratos ascendem através do quadrante
dorsal, como é o caso da via da coluna dorsal-leminisco medial e do trato espinocervical
(SILVEIRA, 2006).
Reynolds (1969) demonstrou que a estimulação elétrica da coluna ventral da substância
cinzenta periaquedutal, em ratos, era capaz de produzir antinocicepção suficiente para a
realização de uma cirurgia abdominal sem o uso de anestésicos. Esses resultados indicaram a
presença de um mecanismo inibitório descendente da dor no SNC. Desta forma, as vias
descendentes podem contribuir significativamente para o controle da transmissão dos
impulsos dolorosos no corno dorsal da medula espinhal (RANG; RITTER; DALE, 1997).
Introdução
24
Pesquisas mais recentes demonstram que a SCPvl faz parte de um circuito do sistema
nervoso central que controla a transmissão nociceptiva no nível da medula espinhal. As
conexões anatômicas entre a SCPvl, o núcleo magno da rafe (NMgR) e a medula espinhal,
fazem pressupor que os estímulos nocivos ativam os neurônios do corno dorsal da medula,
que por sua vez, estimulam o NMgR, que exerce um controle inibitório sobre as células
transmissoras da dor no corno dorsal, resultando em uma redução da sensibilidade ao estímulo
doloroso. A modulação da dor na SCPvl provavelmente decorre da ativação do NMgR. Tanto
a SCPvl quanto a SG (substância gelatinosa) da medula são ricas em neurônios
encefalinérgicos, e antagonistas opióides como a naloxona, podem bloquear a analgesia
induzida pela estimulação elétrica da SCPvl, sugerindo a participação dos opióides como
transmissores deste sistema (BRANDÃO, 2005).
Os estudos de traçamento neuronial não demonstraram com clareza a existência de
projeções diretas entre a SCPvl e a medula espinhal, porém, descobriu-se a existência de
sinapses entre a SCPvl e o núcleo magno da rafe (NMgR) na região bulbar, que, por sua vez,
envia projeções para a medula espinhal através do funículo dorsolateral. Lesões no NMgR
reduzem os efeitos da estimulação elétrica da SCPvl. Grande parte das conexões descendentes
entre a SCPvl e a medula espinhal são indiretas, sendo que a principal via neuronial ativada
pela estimulação da SCPvl, projeta-se primeiramente para o NMgR. As fibras que percorrem
o funículo dorsolateral da medula espinhal formam conexões sinápticas com interneurônios
do corno dorsal da medula espinhal, sendo o principal neurotransmissor nessas sinapses, a
serotonina (5-HT). A figura 4 ilustra o sitema auto-analgésico.
Introdução
25
Figura 4. Sistema auto-analgésico representando o nível mesencefálico (SCPvl: substância cinzenta
periaquedutal ventrolateral, rica em encefalina); o nível bulbar (NMgR: núcleo magno da rafe e o
NGc: núcleo gigantocelular, recebem impulsos excitatórios da SCP e enviam projeções
serotoninérgicas para o corno dorsal da medula); nível espinhal: as projeções serotoninérgicas chegam
ao corno dorsal da medula pelo funículo dorsolateral, onde exercem um efeito inibitório sobre as
células transmissoras da dor (BRANDÃO, 2005).
Exite também uma via de natureza noradrenérgica proveniente do locus coeruleus, que
exerce um efeito inibitório semelhante sobre a transmissão nociceptiva no corno dorsal da
medula espinhal (BRANDÃO, 2005). Outros estudos mostram que a antinocicepção
decorrente da estimulação elétrica da SCPvl ativa mais de uma via descendente. De fato,
descobriu-se que a estimulação elétrica de outras estruturas, tais como o núcleo rubro e a
região parabraquial da ponte, também produzia antinocicepção (COHEN; MELZACK, 1986;
RANG; RITTER; DALE, 1997; PRADO, 2000).
1.5 MEDIAÇÃO NEUROQUÍMICA NO CONTROLE DA DOR NA SCP
Muitos estudos têm sido realizados a fim de se verificar a grande diversidade de
neurotransmissores no nível supraespinhal envolvidos nas reações aversivas e na
Introdução
26
antinocicepção induzidos pela estimulação elétrica e química da SCP. De maneira geral,
destacam-se os opióides endógenos (CARSTENS et al., 1987; BEITZ et al., 1987; NICHOLS;
THORN; BERNTSON, 1989), a serotonina (BEITZ et al., 1986; LAKOS; BASBAUM,
1988), e o GABA (DEPAULIS; MORGAN; LIEBESKIND, 1987; MOREAU; FIELDS,
1986; BEHBEHANI et al., 1990).
A antinocicepção pode resultar da ativação de inúmeras estruturas do SNC, tais como o
tálamo, a SCP, a área parabraquial, os núcleos da rafe, a substância periventricular e o núcleo
paragigantocelular, promovendo a liberação de neurotransmissores como a serotonina,
opióides, etc. A via inibitória descendente pode ser ativada por vários procedimentos,
destacando-se a estimulação elétrica, capaz de produzir respostas antinociceptivas e
emocionais quando aplicada a determinadas regiões encefálicas, principalmente a SCP
(REYNOLDS, 1969; HARRIS, 1996). Fardin, Oliveras e Besson, (1984a/b) também
demonstraram que a estimulação elétrica de vários sítios da SCP, exceto a coluna ventral e as
regiões vizinhas, produziam elevação do limiar de vocalização. Estas observações foram
posteriormente confirmadas por Besson; Fardin e Oliveras (1991).
1.5.1 Mediação Opióide
Os receptores opióides estão amplamente localizados no córtex frontal e parietal,
amígdala, hipocampo, corpo estriado, tálamo, SCP, núcleo dorsal da rafe, substância
gelatinosa e lâminas I e II da medula, e no núcleo do trigêmio, áreas envolvidas de alguma
forma com a dor e o medo.
Vários trabalhos confirmaram a participação dos opióides endógenos na modulação da
antinocicepção. Um exemplo clássico é que a antinocicepção produzida pela administração de
morfina na SCP pode ser parcialmente bloqueada pela naloxona (antagonista opióide)
(WATKINS; MAYER, 1982; KIYATKIN, 1989; NICHOLS; THORN; BERNTSON, 1989).
Introdução
27
O sistema de inibição da dor parece depender, pelo menos em parte, dos opióides endógenos.
Evidências que apóiam essa idéia derivam de estudos demonstrando que (1) a SCPvl é
especialmente sensível aos efeitos analgésicos da microinjeção da morfina; (2) a analgesia
produzida pela estimulação elétrica da SCPvl é atenuada pela administração de um
antagonista opióide, como a naloxona; e (3) o desenvolvimento de tolerância à analgesia
decorente da estimulação elétrica e da administração da morfina na SCPvl (SOPER;
MELZACK, 1982; MORGAN; LIEBESKIND, 1987; BUDAI; FIELDS, 1998).
Assim, as substâncias endógenas com propriedades analgésicas, que atuam no SNC,
ativam os sistemas descendentes, que por sua vez, suprimem as respostas ao estímulo nocivo
nos neurônios da medula espinhal. As substâncias analgésicas ativam esse sistema por se
ligarem aos receptores opióides na SCP. Em 1982, Abbott et al. observaram que lesões na
SCP, no NMgR ou no funículo dorsolateral atenuavam os efeitos analgésicos da
administração sistêmica da morfina. Morgan; DePaulis; Liebeskind (1985) confirmaram a
antinocicepção produzida pela estimulação elétrica da SCP tanto nos sítios onde não se
observava alteração comportamental, como nos sítios onde o efeito antinociceptivo era
mascarado por reações comportamentais. Estes estudos demonstraram que a antinocicepção
era produzida em toda extensão da SCP ventral e que a antinocicepção acompanhada de
aversão era produzida nas colunas dorsal e dorsolateral da SCP. Cannon et al., apud Hammer
e Kapp (1986) demonstraram que a administração de naloxona revertia os efeitos analgésicos
causados pela estimulação elétrica da região ventrocaudal da SCP. Contrariamente, Morgan e
Liebskind (1987) observaram que a antinocicepção dos sítios lateral e dorsal da SCP era
insensível aos efeitos da naloxona.
Os opióides endógenos também participam da modulação do comportamento defensivo
induzido pela estimulação elétrica da SCP. Jenck, Schmit e Karli (1983, 1986) demonstraram
que pequenas doses de morfina microinjetadas na SCPd de ratos atenuam os efeitos aversivos
Introdução
28
induzidos pela estimulação elétrica dessa região. Dados obtidos neste laboratório
evidenciaram que a morfina apresenta efeito similar ao clordiazepóxido ao atenuar reações
autonômicas, como o aumento da pressão arterial e da freqüência cardíaca provocada pela
estimulação elétrica da SCPd (BRANDÃO et al., 1985). Em 1993, Motta e Brandão
demonstraram que a microinjeção de baixas doses de morfina (10 nmoles) na SCPd aumenta
o número de entradas e o tempo de permanência nos braços abertos do labirinto em cruz
elevado (LCE), caracterizando um claro efeito ansiolítico. Por outro lado, a microinjeção de
doses mais altas (30 nmoles) promove efeitos ansiogênicos. Posteriormente, Motta, Penha e
Brandão (1995) demonstraram que a microinjeção do agonista de receptores do tipo μ,
DAMGO, promove o mesmo efeito da dose baixa de morfina, enquanto a microinjeção de
U50,488H, agonista de receptores κ, na SCPd, promoveu efeitos similares aos de altas doses
de morfina.
Os receptores opióides pertencem a uma superfamília de receptores acoplados à
proteína G e atuam na inibição da adenilato-ciclase, reduzindo o conteúdo de AMPc. Além
disso, a ativação desses receptores promove a abertura dos canais do potássio e inibe a
abertura dos canais de cálcio operados por voltagem. Desses efeitos, decorre uma redução na
excitabilidade neuronial (pois a maior condutância do potássio acarreta hiperpolarização da
membrana) e na liberação de neurotransmissores (em virtude da inibição da entrada do
cálcio). O efeito global é inibitório no nível celular, mas, os opióides também podem
aumentar a atividade de algumas vias neuroniais por inibirem a atividade dos interneurônios
inibitórios (RANG; RITTER; DALE, 1997).
Os opiódes também são potentes analgésicos quando administrados via intratecal. Além
disso, a injeção de morfina na SCP produz analgesia que pode ser prevenida pela seção da via
descendente para o bulbo rostroventral ou pelo bloqueio da síntese de serotonina (5-HT) com
p-clorofenilalanina, o que interrompe a via serotoninérgica do bulbo para o corno dorsal da
Introdução
29
medula espinhal. No nível medular, a morfina causa inibição da transmissâo dos impulsos
nociceptivos do corno dorsal da medula espinhal e suprime os reflexos medulares
nociceptivos nos pacientes com seção medular. Os opióides também são capazes de inibir a
liberação da substância P pelos neurônios da medula porque exercem um efeito inibitório pré-
sináptico sobre as terminações centrais dos neurônios aferentes nociceptivos (RANG;
RITTER; DALE, 1997).
Basbaum e Fields (1984) propuseram que os peptídeos opióides endógenos ativam os
neurônios de saída da SCP porque inibem os interneurônios inibitórios. Destacaremos mais
detalhadamente essa interação no item específico que envolve o sistema GABAérgico.
1.5.2 Mediação Serotoninérgica
Há evidências de sistemas de natureza não-opióide que participam da modulação da
nocicepção. Por exemplo, os efeitos analgésicos da estimulação no nível supraespinhal podem
ser reduzidos pela administração intratecal de antagonistas α-adrenérgicos e triptaminérgicos;
de forma inversa, a administração de agonista adrenérgico ou triptaminérgico produz um
aumento no limiar nociceptivo, que não é reduzido pela naloxona ou em sujeitos que se
tornaram tolerantes aos efeitos dos opióides (GOODMAN; GILMAN'S, 1985).
Desde a identificação dos neurônios serotoninérgicos no SNC, este neurotransmissor
tem sido relacionado com várias funções, como a percepção da dor, a regulação visceral, os
distúrbios psiquiátricos e o ocontrole motor (GRAEFF, 1997).
Um grande número de pesquisas tem investigado o papel dos receptores
serotoninérgicos na percepção da dor. Lesões em certos núcleos (áreas septais, tegmento
dorsal medial e núcleos da rafe) que contêm serotonina aumentam a sensibilidade aos
estímulos nocivos. Além disso, a estimulação do núcleo magno da rafe ativa o sistema
Introdução
30
serotoninérgico descendente para a medula cuja ativação induz analgesia (FELDMAN;
QUENZER, 1984).
Algumas estruturas cerebrais (SCP, hipotálamo, amígdala e colículos superior e
inferior) que medeiam os estados aversivos no encéfalo, têm sido relacionadas também com a
modulação da dor. Nesse laboratório, tem sido dada atenção especial ao estudo dessas áreas
cerebrais e ao envolvimento de mecanismos serotoninérgicos dessas estruturas com o medo e
a antinocicepção.
De forma interessante, muitas evidências referentes ao efeito analgésico da serotonina
são derivadas de estudos sobre a analgesia induzida pela morfina, os quais determinaram a
existência de uma consistente ligação entre serotonina e opióides. Por exemplo, a
administração de paraclorofenilanalina, que diminui os níveis de serotonina, foi capaz de
bloquear os efeitos analgésicos da morfina. Outro estudo também revelou que lesões na rafe
produziam um efeito similar (FELDMAN; QUENZER, 1984).
Sabe-se que a serotonina está envolvida em ambos os sistemas analgésicos, o dorsal e
o ventral da SCP. A destruição do núcleo magno da rafe (NMgR) ou das vias descendentes
para a medula espinhal bloqueia os efeitos da estimulação da SCP. Como o NMgR é rico em
neurônios serotoninérgicos, drogas que bloqueiam os receptores 5-HT ou diminuem sua
síntese inibem a analgesia induzida pela estimulação elétrica ou química da SCP. Além disso,
a aplicação iontoforética de 5-HT no corno dorsal da medula espinhal diminui a freqüência de
disparos nos neurônios responsáveis pelo processamento de estímulos nociceptivos
(GRAEFF, 1990).
Alguns resultados deste laboratório mostraram que a microinjeção local de cetanserina e
metisergida na SCPd inibe a antinocicepção induzida pela estimulação elétrica local
(COIMBRA; BRANDÃO, 1997; CASTILHO; AVANZI; BRANDÃO, 1999; CASTILHO;
BRANDÃO, 2001). Nosso trabalho evidenciou a participação tanto da mediação
Introdução
31
serotoninérgica quanto da opióide na modulação da antinocicepção produzida pela
estimulação elétrica da SCPvl (DE LUCA, et al., 2003). É possível que ambos os sistemas
antinociceptivos mediados pela SCPd (não-opióide) e pela SCPvl (opióide), utilizem a via
serotoninérgica a partir do núcleo dorsal da rafe (COIMBRA; BRANDÃO, 1997).
Vários trabalhos têm demonstrado a participação dos receptores do tipo 5HT
2A
no
comportamento defensivo de animais. Schütz, Aguiar e Graeff (1985) verificaram que, na
SCPd, a microinjeção de serotonina ou de zimelidina, bloqueador de recaptação de 5-HT,
aumentava também o limiar aversivo que induzia comportamento de fuga em ratos na caixa
de vai-e-vem. Os mesmos autores verificaram ainda que este efeito foi bloqueado pela
microinjeção prévia de cetanserina, um bloqueador de receptores 5-HT
2A
. Nogueira e Graeff
(1995), utilizando o mesmo modelo exprimental, observaram que o DOI [1-(2,5-dimethoxy-4-
iodophenyl) piperazine], agonista de receptores 5-HT
2A/2C
, aumentou de forma dose
dependente o limiar de corrente elétrica necessário para produzir respostas aversivas, assim
como o 8-OH-DPAT e o BAY R 1531[6-methoxy-4-(di-n-propylamino)-1,3,4,5-
tethrahydrobenz(c,d)indole], agonistas de receptores 5-HT
1A
. Tais efeitos antiaversivos foram
bloqueados pelos respectivos antagonistas desses receptores. Com base nesses resultados, tem
sido proposta a modulação por receptores 5-HT
1
e 5-HT
2
do comportamento defensivo
organizado na SCPd.
1.5.3 Mediação GABAérgica
Várias evidências sugerem que uma disfunção do sistema GABAérgico possa estar
subjacente aos distúrbios neurológicos e psiquiátricos, incluindo epilepsia, Coréia de
Huntington, discinesia, alcoolismo, esquizofrenia, distúrbios do sono, doença de Parkinson e
retardo mental. No que se refere ao presente trabalho, destaca-se que drogas que fortalecem a
Introdução
32
neurotransmissão GABA-benzodiazepínica têm se mostrado eficazes para o tratamento da
ansiedade. A tomografia por emissão de pósitrons realizada em pacientes com ataques de
pânico, mostrou um aumento nos receptores GABA
A
-benzodiazepínicos nas regiões
temporais bem como em todo cérebro (TIIHONEM, et al. apud WONG; BOTTIGLIERI;
SNEAD, 2003). Também tem sido relatado que nem todo sítio do receptor GABA
A
reconhece
os benzodiazepínicos. A subunidade α em particular é o sítio primário de ligação (figura 5).
Figura 5. Desenho representando um canal iônico do sistema GABA-benzodiazepínico com seus
sítios receptores para diferentes tipos de compostos.
Os principais efeitos dos benzodiazepínicos são: sedação, anticonvulsivante, relaxante
muscular, amnésico. A ação ansiolítica em homens e em uma variedade de modelos animais
se dá primariamente por aumentar a ação do GABA sobre os receptores GABA
A
. Os
receptores benzodiazepínicos estão concentrados em altas densidades no sistema límbico
(YARKSH, 1999). Estudos anatômicos, farmacológicos e eletrofisiológicos sugerem que os
neurônios GABAérgicos, em sua maioria interneurônios locais, são prevalentes na circuitaria
neuronal intrínseca na SCP (REICHLING, 1991). Aproximadamente metade dos neurônios da
SCP podem ser excitados por antagonistas GABAérgicos (BANDLER; CARRIVE;
DEPAULIS, 1991). O bloqueio da inibição GABAérgica pela microinjeção de bicuculina na
SCPd de ratos promove um comportamento defensivo similar ao observado após a
Introdução
33
estimulação elétrica desta estrutura (IMPERATO; DI CHIARA, 1981; DI SCALA;
SCHMITT; KARLI, 1984). Por outro lado, os agonistas GABA-benzodiazepínicos inibem os
efeitos da estimulação elétrica e química da SCPd (BRANDÃO et al., 1999). A microinjeção
de aminoácidos excitatórios, como o glutamato e o aspartato, na SCPd induz uma reação
defensiva caracterizada por saltos explosivos, rotações e corridas alternadas com imobilidade
(BANDLER; DEPAULIS; VERGENS, 1985; KRIEGER; GRAEFF, 1985). Isto implica que
grande parte do controle inibitório GABAérgico na SCP é tonicamente ativo e a inibição desta
rede neuronial representa um importante mecanismo de ativação dos neurônios de projeção da
SCP.
Também foi demonstrado que a neurotransmissão GABAérgica exerce um importante
papel na modulação das vias neuroniais relacionadas com a percepção da dor (MOTTA et al.,
2004). Entretanto, os efeitos dos benzodiazepínicos sobre a dor não estão claros. Em geral,
estes compostos não possuem efeitos sobre o limiar de percepção do estímulo mecânico e não
alteram os efeitos antinociceptivos dos opióides. Entretanto, após a administração intracranial,
esses agentes possuem efeitos antagônicos aos da morfina, um efeito consistente com o papel
dos interneurônios GABAérgicos encontrados na SCP e que exercem um controle dos
mecanismos excitatórios para as projeções bulbares (YAKSH; 1999).
Os interneurônios GABAérgicos inibem os neurônios de saída da SCP, que se
projetam para os núcleos bulbares e que ativam o sistema inibitório descendente. Basbaum e
Fields (1984) sugeriram que os opióides podem ativar os neurônios de projeção da SCP por
meio da inibição dos interneurônios GABAérgicos tonicamente ativos.
Conciliando dados de diversos estudos, Fields e Basbaum (2000) propuseram a
existência de três classes de neurônios no bulbo rostromedial: a) neurônios que iniciam seu
disparo exatamente antes da ocorrência da retirada reflexa do estímulo nocivo (células on); b)
aqueles que param imediatamente antes do reflexo de retirada (células off); c) neurônios que
Introdução
34
não alteram sua atividade na presença do reflexo de retirada (células neutras). As células on
estão constantemente excitadas pelos estímulos nocivos. As células off estão inibidas na
presença dos mesmos estímulos. Ambas as células (on e off) se projetam nas lâminas I, II e V
do corno dorsal da medula espinhal e também são excitadas pela estimulação elétrica da SCP
ou do bulbo, porém, somente as células off são excitadas pela morfina. Desta forma, as
células off são responsáveis por suprimir a transmissão nociceptiva. Inversamente, as células
on são inibidas pela administração sistêmica de opióides na SCP ou no bulbo (FIELDS;
BASBAUM, 2000).
In vitro, os receptores opióides μ hiperpolarizam diretamente os neurônios do bulbo
(células on) através do aumento da condutância ao K
+
e também pela redução do potencial
pós-sináptico mediado pelo sistema inibitório GABAérgico (através das células off). Esses
dados indicam que a ativação das células off pelos receptores opióides μ possui um efeito
indireto. De fato, as células off recebem projeções diretas GABAérgicas e os agonistas
opióides μ inibem a pausa das células off pela influência GABAérgica sugerindo uma
interação entre os mecanismos. De acordo com este modelo, os receptores opióides μ inibem
as células on e promovem uma desinibição das células off. Este circuito está presente na
SCPvl e no bulbo. A microinjeção de naloxona no bulbo bloqueia a inibição reflexa de
retirada da cauda produzida pela bicuculina ou morfina (FIELDS; BASBAUM, 2000).
Figura 6. Diagrama representativo da mediação opióide.
Introdução
35
Na medula espinhal dos mamíferos, o complexo GABA-benzodiazepínico é encontrado
em grande concentração nos interneurônios inibitórios do corno dorsal da medula espinhal
(lâminas I-III). Esses receptores estão presentes nos dendritos pré-sinápticos de neurônios de
segunda ordem e nas terminações nervosas das fibras aferentes Aδ e C que estão localizadas
predominantemente na lâmina II e III (TOLD; MCKENZIE, 1989; MALCANGIO;
BOWERY, 1996 apud MOTTA et al., 2004).
O papel regulatório do GABA sobre substratos neuroniais da aversão está apoiado em
diversos estudos que mostram que a injeção de agonistas GABA-benzodiazepínicos no teto
mesencefálico inibe os comportamentos de defesa induzidos pela estimulação elétrica dessa
região (Para revisão ver BRANDÃO et al., 1999).
Dados obtidos em nosso laboratório mostraram evidências consistentes de interação da
ação anti-aversiva dos benzodiazepínicos com os mecanismos GABAérgicos no teto
mesencefálico. A microinjeção de agonista GABAérgico no teto mesencefálico promoveu
efeitos antiaversivos similares aos tranqüilizantes menores. Ao contrário, os antagonistas
picrotoxina ou bicuculina induziram respostas autonômicas e fuga características do
repertório defensivo. O pré-tratamento com clordiazepóxido inibe as respostas de fuga
induzidas pela bicuculina, enquanto a prévia administração de bicuculina abole os efeitos
antiaversivos dos benzodiazepínicos (GOMITA et al., 1991). Esses dados sugerem que o
aumento da neurotransmissão GABAérgica nas estruturas mesecenfálicas causa efeitos
antiaversivos, enquanto o bloqueio de receptores GABA
A
induz a reação de defesa
(BRANDÃO et al., 1999).
2 OBJETIVOS
Objetivos
37
omo pudemos observar, a estimulação elétrica de algumas regiões cerebrais
envolvidas no sistema defensivo, como a SCP, ou a exposição de animais a
situações aversivas, promove reações de defesa e analgesia. Sabendo que a SCPvl possui um
papel dual nas reações defensivas e nos mecanismos antinociceptivos, neste estudo,
examinamos uma eventual associação funcional entre tais processos produzidos pela
estimulação elétrica desse sítio. Para isso, verificamos a influência da estimulação elétrica da
SCPvl na resposta de congelamento e no controle da nocicepção, e se estes processos
compartilham mecanismos neuroquímicos comuns.
Empregamos dois testes nociceptivos distintos a título de comparação, o teste da
retirada da cauda, que avalia o componente reflexo, e o da formalina, que avalia tanto a fase
fásica quanto a fase tônica da nocicepção.
Investigamos também a participação de mecanismos opióides, serotoninérgicos e
GABAérgicos da SCPvl no congelamento e na antinocicepção induzidos por sua estimulação
elétrica. Para isto, avaliamos os efeitos de injeções locais na SCPvl, de naltrexona, cetanserina
e midazolam, compostos que possuem propriedades bloqueadoras dos receptores opióides e 5-
HT
2A
, e agonista do sistema GABA-BZD, respectivamente.
Para caracterizar o envolvimento da SCPvl no medo incondicionado, o efeito do
midazolam, microinjetado na SCPvl, foi também estudado. O comportamento exploratório foi
avaliado em grupos independentes de animais submetidos ao labirinto em cruz elevado.
C
3 MATERIAIS
E MÉTODOS
Materiais e Métodos
39
3.1 ANIMAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos, com peso entre 250-320 g, provenientes do
Biotério Central do Campus da USP de Ribeirão Preto. Os mesmos foram alojados em gaiolas
de polipropileno (30 x 32 x 18 cm) forradas com serragem, contendo 3-5 animais, onde
receberam cuidados especiais, com livre acesso à comida e água. No biotério do Laboratório
de Neuropsicofarmacologia, em que os animais foram mantidos, havia o controle do ciclo
claro/escuro (12/12 h), com lâmpadas acesas às 7h da manhã, e da temperatura (23ºC +
1ºC).
Todos os experimentos foram realizados durante a fase de claro. Os animais foram
transportados individualmente até a sala experimental ou de cirurgia, em uma caixa de
polipropileno forrada com serragem, medindo 28 x 17 x 13 cm.
Os protocolos experimentais foram estruturados de acordo com os regulamentos e
cuidados na utilização de animais em laboratório, conforme a Sociedade Brasileira de
Neurociências.
3.2 EQUIPAMENTOS
Foram utilizados um aparelho estereotáxico (David-Kopf), uma arena circular de
acrílico transparente (60 cm de diâmetro por 50 cm de altura), com o assoalho dividido em 12
seções, para as medidas dos limiares aversivos e do comportamento exploratório. Também foi
utilizada outra arena circular de acrílico transparente (35 cm de diâmetro por 45 cm de altura),
para o teste de formalina, com espelhos planos localizados a 30 cm atrás da mesma para
melhor visualização dos comportamentos. Para o teste da retirada da cauda, um aparelho (Ugo
Basile-Itália) para a medida da latência dessa resposta foi utilizado. Para o procedimento de
estimulação elétrica, foram utilizados um osciloscópio (Pantec 5205-10MHz) e um
estimulador elétrico de corrente senoidal de 60 Hz e corrente constante (ESF-12, Marseillan -
Brasil).
Materiais e Métodos
40
Utilizamos o labirinto em cruz elevado convencional de paredes opacas de madeira,
consistindo de dois braços abertos e opostos (50 x 10 cm cada um), e outros dois braços
opostos do mesmo tamanho fechados por paredes laterais de 40 cm de altura. Os braços
abertos e fechados, elevados a 50 cm do solo, cruzam-se perpendicularmente, formando uma
cruz delimitada por uma área central de 10 x 10 cm. Nas laterais dos braços abertos foi fixada
uma lâmina de acrílico fazendo uma borda de 1 cm de altura, com o objetivo de evitar a queda
dos animais. O labirinto foi alojado numa sala experimental com controle do nível de
luminosidade (100 lux para a extremidade do braço aberto e 30 lux para o braço fechado). As
sessões foram monitoradas e gravadas através de uma filmadora montada acima do labirinto,
para registro dos comportamentos e análise através do programa The Observer (Noldus
Information Technology). As figuras seguintes ilustram os aparelhos utilizados.
Figura 7. Equipamentos utilizados durante a cirurgia e estimulação elétrica. Em A, aparelho
estereotáxico, e em B, arena , estimulador elétrico, osciloscópio e swível.
Materiais e Métodos
41
Figura 8. Equipamentos utilizados durante os testes nociceptivos. Em A, aparelho (Ugo Basile-Itália)
para o teste da retirada da cauda, e em B, arena circular e espelhos para o teste da retirada da cauda.
Figura 9. Equipamentos utilizados para o registro do comportamento exploratório. Em A, labirinto em
cruz elevado e em B, um circuito TV-vídeo acoplado ao computador para registro dos
comportamentos.
Materiais e Métodos
42
3.3 CIRURGIA
Após a administração intraperitoneal do anestésico tribromoetanol (ALDRICH,
Chemical Company, INC, USA) (250 mg/Kg, i.p.; volume: 1 ml/100 g), cada animal foi
colocado em um aparelho estereotáxico (David-Kopf, USA) com a barra dos incisivos a 2,5
mm abaixo da linha interaural, de forma que o crânio ficasse em posição horizontal entre
bregma e lambda. Após a limpeza do campo cirúrgico com iodo (Glicolabor, Brasil), o animal
recebeu injeção subcutânea de anestésico local (Cloridrato de lidocaína 3% - Harvey, Brasil),
a calvária foi exposta e o periósteo removido. Os quimitrodos foram direcionados seguindo as
coordenadas do Atlas de Paxinos e Watson (2005) para a SCPvl (anteroposterior: -0,7 mm,
lateral: -2,7 mm, profundidade: -6,3 mm, com angulação de 18º), com o lambda servindo
como referência. O quimitrodo consistia de uma cânula guia de injeção, de aço inoxidável
(d.e. 0.6 mm, d.i. 0.4 mm) isolada com polietileno (PE – 20), unida a um eletrodo de aço
inoxidável, de 160 µm de diâmetro. O mesmo foi fixado ao crânio por dois parafusos de aço
inoxidável, e colado com resina dental acrílica. No final da cirurgia, a cânula guia era selada
com um fio de aço inoxidável para protegê-la de obstrução. O quimitrodo foi unido a um pino
macho, paralelo à cânula e conectado a um cabo elétrico flexível para a passagem da corrente
elétrica durante a estimulação do tecido nervoso. No final da cirurgia, cada animal recebia
injeção (0,2 ml) de penicilina (60.000 UI/ml), por via intramuscular, para evitar infecção.
Os ratos operados permaneceram em recuperação por 06 dias em gaiolas de
polipropileno (30 x 32 x 18 cm) forradas com serragem, com água e comida à vontade.
3.4 DROGAS
Foram utilizadas as seguintes drogas: cloridrato de naltrexona (SIGMA) dissolvido em
0,9 % de salina, na dose de 26 nmoles; tartarato de cetanserina (RBI) dissolvido em solução
salina a 0,9 % e uma gota de tween, na dose de 5 nmoles; e maleato de midazolam (Roche)
Materiais e Métodos
43
dissolvido em solução salina a 0,9 %, nas doses de 10, 20 e 30 nmoles. A salina foi utilizada
como controle e todas as drogas foram microinjetadas num volume de 0,2 μl.
3.5 MICROINJEÇÃO
Após o período de recuperação, cada animal foi transportado em uma caixa de
polipropileno (30 x 17 x 13 cm), forrada com serragem, para a sala experimental (25ºC + 1ºC;
+
100 Lux). Os animais foram mantidos dentro da caixa de transporte, onde recebiam a
microinjeção intracerebral de veículo (salina) ou das drogas (cetanserina, naltrexona ou
midazolam) através de uma cânula de microinjeção introduzida até 1 mm abaixo do final da
cânula guia. A cânula de microinjeção foi conectada a uma seringa Hamilton por um tubo de
polietileno. Um volume de 0,2 μl de droga foi injetado durante 10 segundos. O deslocamento
de uma bolha de ar dentro do tubo de polietileno (PE – 20) foi utilizado para monitorar a
microinjeção. Ao final, a cânula interna era mantida no local por 20 segundos adicionais para
melhor difusão da droga.
3.6 TESTES
3.6.1 Limiar de congelamento
No sexto dia após a cirurgia, os animais foram separados em grupos, de acordo com os
tratamentos utilizados, e submetidos ao procedimento de determinação dos limiares aversivos
durante a estimulação elétrica da SCPvl. Este procedimento foi realizado imediatamente após
as três medidas de linha de base do teste da retirada da cauda.
Cada animal foi colocado em uma arena e recebia estimulação elétrica na SCPvl (15s,
60 Hz) a intervalos de um minuto. A cada minuto, a intensidade era aumentada em 5 μA. A
Materiais e Métodos
44
reação de congelamento foi definida como a menor intensidade de corrente elétrica aplicada
na SCPvl capaz de induzir imobilidade por pelo menos 6 segundos. Os animais que
ultrapassaram o limiar de congelamento de 200 μA (pico a pico) foram descartados dos
experimentos.
No oitavo dia pós-cirúrgico, o limiar de congelamento foi novamente determinado nos
mesmos animais de cada grupo antes e após a microinjeção dos fármacos, e previamente ao
teste da formalina.
Os animais foram agrupados de acordo com o tratamento farmacológico recebido:
cetanserina (KET), naltrexona (NTX) e midazolam (M). O grupo salina foi considerado
controle (SAL
+
). Cada grupo foi composto por pelo menos oito animais. O grupo sham
(SAL
-
) era submetido a todos procedimentos experimentais, mas não recebia estimulação
elétrica.
3.6.2 Teste da retirada da cauda
O teste da retirada da cauda foi realizado no 6º dia após a cirurgia. É um modelo
indicado para avaliar a resposta reflexa fásica de retirada da cauda. Neste teste, é medido o
tempo de reação de retirada da cauda frente a um estímulo de natureza térmica.
Cada animal foi colocado dentro de um tubo de acrílico, e no terço distal da cauda,
recebia o estímulo de calor radiante. O equipamento (Ugo-Basile) foi calibrado a fim de se
obter as latências da retirada da cauda (LRC) entre 2,5 a 3,5 segundos. Se dentro de 6
segundos o animal não apresentasse resposta da retirada da cauda, o teste era interrompido
pelo experimentador.
As LRCs foram registradas nos períodos 15, 10 e 5 minutos anteriores à estimulação
elétrica. Em seguida, os animais foram estimulados eletricamente na SCPvl para testar os
efeitos aversivos da estimulação elétrica desta região no limiar de congelamento. Logo após,
Materiais e Métodos
45
os mesmos receberam o tratamento (microinjeção dos fármacos) e, após o período de atuação
das drogas (10 min), foram estimulados novamente no limiar de congelamento.
As LRCs após a última estimulação elétrica da SCPvl no limiar aversivo de
congelamento também foram registradas. Esses parâmetros foram escolhidos de acordo com
estudos prévios realizados neste laboratório (CASTILHO et al., 1999; CASTILHO;
BRANDÃO, 2001; DE LUCA et al., 2003).
3.6.3 Teste da formalina
Quarenta e oito horas após o teste da retirada da cauda, cada animal, em seu respectivo
grupo, passou pelo mesmo procedimento de determinação do limiar aversivo e microinjeção
dos fármacos, e em seguida, foi submetido ao teste da formalina.
O teste da formalina é um modelo experimental bastante utilizado para avaliar as
respostas nociceptivas. Através deste modelo, podemos quantificar as respostas do animal
frente a um estímulo químico que causa dor moderada e contínua gerada pelo dano tissular
(aplicação de formaldeído na pata) (ABBOTT; MELZACK; LEBER, 1982; ABBOTT;
MELZACK; SAMUEL, 1982; MANNING; FRANKLIN, 1998).
A principal característica do teste da formalina, em roedores, refere-se à duas fases das
respostas comportamentais nociceptivas registradas pelo teste. A primeira fase (fásica ou
primária) se inicia imediatamente após a injeção da formalina, com um pico em 3-5 minutos,
relacionado à estimulação química direta dos nociceptores. A segunda fase (tônica ou
secundária) se inicia aproximadamente entre 15-20 minutos após a injeção de formalina e
termina por volta de 40-60 minutos (TJØLSEN et al., 1992).
A formalina (1,5%) foi diluída em salina e injetada com uma seringa de 1ml, com
agulha (13 x 4,5 mm) na face plantar da pata dianteira direita do animal, num volume de 0,05
ml. Esta dose foi capaz de induzir as respostas recuperativas. Essas respostas
Materiais e Métodos
46
comportamentais foram derivadas dos modelos descritos por Dubuison e Dennis (1977) e
Tjølsen et al. (1992). Os tempos decorridos em cada resposta recuperativa foram
multiplicados pelos seus respectivos pesos e somados, calculando-se assim, o índice de
nocicepção, segundo a fórmula: IN = 0R + 1R + 2R + 3R. IN indica o índice de nocicepção e
o R, o tempo decorrido das respostas recuperativas exibidas pelo animal em cada categoria
comportamental multiplicada pelos respectivos pesos. Dessa forma, um IN igual a zero não
indica nocicepção enquanto um índice de 900 indica o grau máximo de nocicepção num
período de 5 minutos (300 s).
As respostas comportamentais exibidas pelo animal foram agrupadas nas categorias
representadas na figura 10, sendo que os comportamentos de levantamentos e autolimpeza
foram agrupados na categoria (0).
Figura 10. Respostas recuperativas de nocicepção, após a injeção de formalina na pata dianteira
direita do animal Os valores estão assim representados: (0) a pata toca normalmente o solo com peso
normal do animal; (1) a pata toca ligeiramente o solo; (2) elevação da pata injetada; (3) o animal
lambe, morde ou sacode a pata. (Modificado de Melzack e Wall, The Challenge of Pain, pg. 143,
1991).
A fim de reduzir ao máximo o sofrimento do animal, de acordo com o Guia Ético Para
Investigação da Dor Experimental (ZIMMERMAN, 1983), os animais foram sacrificados
logo após o término do teste.
Materiais e Métodos
47
3.6.4 Teste do labirinto em cruz elevado
O labirinto em cruz elevado tem sido amplamente utilizado como modelo animal de
ansiedade. A maioria do repertório comportamental exibido por roedores submetidos a esse
teste, é o resultado da tendência natural desses animais de se aproximarem de estímulos
ambientais novos, de forma que a avaliação desses estímulos é crucial para a determinação do
modo como esses animais se aproximam de um ambiente seguro ou se esquivam de um
ambiente potencialmente perigoso. Neste sentido, o labirinto em cruz elevado (LCE) envolve
mecanismos aversivos condicionados, inatos, proximais e distais, de forma que os sinais
aversivos detectados à distância, podem funcionar como um estímulo capaz de ativar o
sistema de medo, que mantém o organismo distante do perigo representado pelos braços
abertos do labirinto (DEAKIN; GRAEFF, 1991).
A atividade exploratória do animal no LCE foi avaliada segundo quatro parâmetros
tradicionais:
• Número de entradas nos braços abertos: número de vezes que o animal atravessava
com as quatro patas para o interior desses braços;
• Número de entradas nos braços fechados: número de vezes que o animal atravessava
com as quatro patas para o interior desses braços;
• Total de entradas: foi obtido através da somatória do número total de entradas nos
braços abertos com o número total de entradas nos braços fechados do LCE, o que
refletia a atividade geral do animal (PELLOW et al., 1995).
• Percentual de entradas nos braços abertos: obtida através da relação entre o número
de entradas nos braços abertos e o total de entradas no labirinto:
% Entradas = 100 X número de entradas nos BA
BA + BF
Materiais e Métodos
48
Obs.: BA indica braços abertos e BF, braços fechados.
• Percentual de tempo nos braços abertos: obtido através da relação entre o tempo
gasto nos braços abertos do labirinto pelo tempo total do teste (5 min).
% Tempo = 100 X Tempo nos BA
Tempo Total do teste
Além das medidas clássicas, a atividade exploratória do animal foi analisada através de
nove categorias comportamentais:
• Exploração na extremidade (end-arm-exploration): postura exploratória na
extremidade dos braços abertos do labirinto;
• Levantamento (rearing): consiste na postura bípede do rato, apoiando-se com as
patas posteriores no assoalho do labirinto, estando completamente ereto ou semi-
arqueado;
• Espreitamento (peeping out): projeção da cabeça/ombros dos braços fechados para o
centro, sendo que as quatro pastas permanecem no braço fechado;
• Autolimpeza (grooming): é a seqüência de autolimpeza da espécie, começando pelo
focinho, indo até as orelhas e terminando pela limpeza do corpo inteiro;
• Esquadrinhamento (scanning): projeção da cabeça do animal sobre as beiradas de
um braço, farejando em qualquer direção;
• Mergulho da cabeça (head-dipping): movimento exploratório de cabeça/membros
anteriores nas laterais ou extremidades do labirinto, em direção ao “precipício”;
• Esticamento (stretched-attend-posture): uma postura exploratória na qual o animal
se estica e em seguida retoma a posição original, sem se locomover para frente;
Materiais e Métodos
49
• Rastejamento (flat-back-approach): locomoção exploratória onde o animal se estica
e cuidadosamente move-se para frente;
• Imobilidade (immobility): imobilidade por um período mínimo de 6 segundos.
3.6.5 Teste do campo aberto
A atividade exploratória do animal no campo aberto foi avaliada segundo quatro
categorias, levando-se em consideração o tempo gasto em cada categoria e a freqüência dos
comportamentos.
• Autolimpeza: pelo menos dez segundos de higiene corporal;
• Cruzamentos: resposta de cruzar com as quatro patas um dos quadrantes do assoalho
da arena;
• Levantamentos: resposta de erguer-se sobre as duas patas traseiras, mantendo a
dianteiras elevadas com ou sem apoio da parede da arena;
• Imobilidade: imobilidade por um período mínimo de 6 segundos.
Todos os comportamentos, em todos os testes, com exceção das latências de retirada da
cauda, foram gravados numa fita de vídeo por uma filmadora e os dados foram computados e
analisados através do programa The Observer.
3.7 HISTOLOGIA
Logo após o teste da formalina ou após o teste do labirinto em cruz elevado, cada animal
foi anestesiado com uretana (SIGMA) (250 g/l, i.p., volume = 0,5 ml/100 g) e perfundido, por
via intracardíaca, com solução salina preparada em tampão fosfato (0,1 M; PBS, pH = 7,4),
seguida por solução tamponada de paraformaldeído (0,1 M; pH = 7,2; 4%). O cérebro foi
Materiais e Métodos
50
removido e mantido em solução de paraformaldeído por aproximadamente 24 horas, depois
foi colocado em uma solução de sacarose (30%), permanecendo por pelo menos três dias até a
histologia.
A histologia do tecido neuronial foi realizada através do congelamento do cérebro em
um criostato (Reichert-Jung) por 1 h, no qual o mesmo foi secionado em fatias de 45-50 μm
de espessura e montado em lâminas gelatinizadas. Três dias depois, os cortes foram corados
com vermelho neutro e os sítios da estimulação elétrica e da microinjeção dos fármacos foram
identificados com auxílio de um microscópio óptico e comparados com o Atlas de Paxinos &
Watson (2005). Posteriormente, os cortes foram fotomicrografados.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados coletados foram apresentados como média + EPM. Foi realizada uma
análise de variância de duas vias com medidas repetidas (tratamento X tempo) para o teste da
retirada da cauda e o da formalina, com post-hoc de Bonferroni. Para os limiares aversivos foi
utilizada a análise de variância de uma via e post-hoc de Dunnett, bem como para a análise
das categorias comportamentais do teste do labirinto em cruz elevado e da arena. Foi utilizado
o programa GraphPad Prism4 para análise estatística. Um valor de p igual ou inferior a 0,05
foi considerado significativo.
4 RESULTADOS
Resultados
52
4.1 HISTOLOGIA
O exame histológico dos cortes cerebrais indicou que todos os eletrodos e cânulas
utilizados neste trabalho, localizaram-se dentro da SCPvl. A figura 11A mostra os sítios onde
os quimitrodos foram implantados. A figura 11B ilustra a fotomicrografia de um corte
histológico representando o caminho deixado pela implantação de um quimitrodo.
Figura 11. A . Os círculos fechados indicam a localização dos quimitrodos de acordo com o Atlas de
Paxinos e Watson (2005). Os pontos indicados na figura não correspondem ao total de animais
utilizados porque a grande maioria deles se sobrepuseram. B. Fotomicrografia mostrando um
quimitrodo localizado na substância cinzenta periaquedutal ventrolateral. vPAG: substância cinzenta
periaquedutal ventral. Aq: aqueduto; scp: pedúnculo cerebelar superior; DRN: núcleo dorsal da rafe;
dmPAG: periaquedutal dorsomedial; Barra = 500μm.
Resultados
53
4.2 EXPERIMENTO I: EFEITOS DE DROGAS SOBRE O CONGELAMENTO E
ANTINOCICEPÇÃO INDUZIDOS PELA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA DA SCPVL
4.2.1 Limiar de congelamento
A figura 12 apresenta as diferenças (média + EPM) entre os limiares de congelamento
antes e após a microinjeção das drogas na SCPvl durante os testes de retirada da cauda e o da
formalina. A análise de variância de uma via mostrou diferenças significativas entre os
tratamentos (F
4,55
= 6,0; p < 0,05). A análise post-hoc de Dunnett indicou que, enquanto a
microinjeção de naltrexona e cetanserina não foi capaz de alterar o limiar de congelamento
determinado pela estimulação elétrica desta região em relação ao grupo controle (SAL), o
midazolam, nas doses de 10 e 20 nmoles, aumentou esse limiar. Sendo assim, a microinjeção
desse composto causou efeitos significativos sobre o limiar de congelamento tendo, portanto,
um efeito antiaversivo.
Resultados
54
Figura 12. Efeito das microinjeções de salina, naltrexona (26 nmoles), cetanserina (5 nmoles) e
midazolam (10 e 20 nmoles) na SCPvl sobre o limiar de congelamento induzido pela estimulação
elétrica da SCPvl. Δ indica a média +
EPM da diferença dos limiares de congelamento (μA) medidos
antes e após a microinjeção das drogas neste sítio durante o teste da retirada da cauda e o da formalina.
SAL (n = 20), NTX (n = 10), KET (n = 10), M10 (n = 10) e M20 (n = 10). * p < 0,05 em relação ao
grupo controle (SAL). ANOVA de uma via seguida de Dunnett.
0
10
20
30
40
SAL NTX KET M10 M20
Limiares aversivos ( A)
*
*
Resultados
55
4.2. 2 Teste da retirada da cauda
As figuras 13A (naltrexona e cetanserina) e 13B (midazolam 10 e 20 nmoles) ilustram
os índices de antinocicepção (média + EPM) calculados em intervalos de 5 min antes da
administração das drogas (-10, -5 e 0 min) e ao longo de 30 minutos após a estimulação
elétrica da SCPvl. Como podemos observar, não houve diferenças significativas durante a
linha de base em ambos os gráficos. Por outro lado, como mostra a figura 13A, a análise de
variância de duas vias com medidas repetidas revelou um efeito significativo entre os
tratamentos (F
3,324
= 3,19; p < 0,05), na interação (tratamento x tempo) (F
27,324
= 3,0; p <
0,05) e entre os tempos (F
9,324
= 20,7; p < 0,05). A análise post-hoc de Bonferroni indicou que
essas diferenças foram entre o grupo SAL
+
em relação ao SAL
-
num intervalo de dez minutos
após a estimulação elétrica da SCPvl. Dessa forma, a estimulação elétrica da SCPvl na
intensidade de corrente elétrica capaz de induzir comportamento defensivo representado pelo
congelamento, inibiu o reflexo de retirada da cauda. Esse efeito foi reduzido por ambos os
antagonistas opióide e serotoninérgico, representados pelos grupos NTX e KET, que
apresentaram um índice de antinocicepção significativamente menor que o grupo SAL
+
no
intervalo onde a antinocicepção foi observada. Assim, a naltrexona e a cetanserina
produziram um bloqueio parcial da antinocicepção produzida pela estimulação elétrica da
SCPvl, mas esses grupos apresentaram alto índice de antinocicepção quando comparados com
o grupo controle não estimulado SAL
-
(todos os p’s < 0,05). A análise de uma via aplicada na
área sob a curva mostrou diferenças entre os tratamentos (F
3,36
= 3,38; p < 0,05). Esta análise
confirmou que os efeitos significativos foram devidos à redução da área no grupo SAL
-
em
relação ao SAL
+
.
Uma análise similar para o tratamento com midazolam revelou um efeito significativo
na interação entre tratamento e tempo (F
27,324
= 2,46; p < 0,05) e entre os tempos (F
9,324
=
9,89; p < 0,05), mas não mostrou diferenças entre os tratamentos (F
3,324
= 1,22; p > 0,05),
como podemos verificar na figua 13B. Como no experimento anterior, a análise post-hoc
indicou que os grupos SAL
+
e SAL
-
mostraram diferenças significativas logo após a
estimulação elétrica. Este efeito foi reduzido pelo tratamento com midazolam nas doses
testadas, no intervalo onde a antinocicepção foi observada (todos os p’s < 0,05). A análise de
uma via aplicada na área sob a curva mostrou diferenças nos tratamentos (F
3,36
= 4,9; p <
0,05). As diferenças foram devido a redução da área do grupo SAL
-
em relação ao SAL
+
.
Resultados
56
Figura 13. Latências de retirada da cauda (LRCs) (média + EPM) durante os fases pré (linha de base)
e pós estimulação elétrica da SCPvl. A. Animais que receberam microinjeção de salina, naltrexona (26
nmoles) e cetanserina (5 nmoles) e foram estimulados eletricamente neste sítio. SAL
+
(n = 11), SAL
-
(n = 8), NTX (n = 11) e KET (n = 10). B. Animais que receberam microinjeção de midazolam (10 e 20
nmoles) e foram estimulados eletricamente no mesmo sítio. Os animais do grupo SAL- receberam
microinjeção de salina, mas não foram estimulados eletricamente. SAL
+
(n = 9), SAL
-
(n = 11), M10
(n = 10) e M20 (n = 10). * p < 0,05 em relação ao grupo controle (SAL
-
). # em relação ao grupo que
recebeu estimulação elétrica na SCPvl (SAL
+
). Análise de duas vias com medidas repetidas seguida de
Bonferroni. EE = estimulação elétrica.
Teste da retirada da cauda
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
-10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
LRCs (s)
SAL+
SAL-
NTX
KET
A
*
*
*
*
#
#
#
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
-10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
Tempo (min)
LRCs (s)
SAL+
SAL-
M10
M20
*
*
EE
B
Resultados
57
4.2.3 Teste da formalina
A figura 14A (cetanserina e naltrexona) mostra os índices de nocicepção (média + EPM)
calculados em intervalos de 5 min ao longo de uma hora imediatamente após a estimulação
elétrica da SCPvl. A análise de variância de duas vias com medidas repetidas mostrou
diferenças significativas entre os tratamentos (F
3,420
= 3,09; p < 0,05) e entre os tempos (F
12,
420
= 120,0; p < 0,05), mas não houve interação significativa entre tratamento e tempo no teste
da formalina (F
36, 420
= 1,28; p > 0,05). A análise post-hoc de Bonferroni revelou que os
efeitos foram devido às diferenças entre os grupos SAL
+
e SAL
-
. Os demais grupos (NTX e
KET) não foram diferentes do controle (SAL
-
). A análise de uma via aplicada na área sob a
curva, mostrou diferenças nos tratamentos (F
3,35
= 3,1; p < 0,05), devido a redução da área sob
a curva no grupo SAL
-
em relação ao SAL+.
A mesma análise aplicada para o grupo do midazolam (Figura 14B) mostrou diferenças
significativas para o tempo (F
12,372
= 144; p < 0,05), sem efeitos significativos para os
tratamentos (F
3,372
= 2,09; p > 0,05) e para a interação (F
36, 372
= 1,02; p < 0,05). A análise de
uma via aplicada na área sob a curva mostrou diferenças nos tratamentos (F
3,31
= 2,9; p <
0,05), devido à redução da área sob a curva no grupo SAL
-
em relação ao SAL+.
A inspeção dessas figuras indicou que a injeção de formalina produziu respostas
nociceptivas bifásicas normalmente observadas em ratos (DUBUISSON; DENNIS, 1977). O
comportamento nociceptivo na fase fásica do teste (0-5 min após a injeção da formalina),
indicou que a estimulação elétrica desta região, no limiar de congelamento, não foi capaz de
alterar a sensibilidade dolorosa do animal nesta fase do teste. A análise posterior revelou que
os grupos SAL
+
e SAL
-
apresentaram diferenças significativas durante a fase tônica (15-25
min após a injeção de formalina), indicando um efeito antinociceptivo. Portanto, a
estimulação elétrica da SCPvl foi capaz de reduzir os comportamentos nociceptivos
exclusivamente durante a fase tônica do teste em ambos os experimentos.
Resultados
58
Figura 14. Índice de nocicepção (média + EPM), durante as fases fásica e tônica do teste da formalina
após a estimulação elétrica da SCPvl. A. Os animais do grupo SAL
+
, KET e NTX receberam
microinjeção de salina, cetanserina (5 nmoles) e naltrexona (26 nmoles), respectivamente, e foram
estimulados eletricamente no mesmo sítio. SAL
+
(n = 11), SAL
-
(n = 8), NTX (n = 10) e KET (n = 10).
B. Os animais dos grupos (M10 e M20) receberam microinjeção de midazolam nas doses de 10 e 20
nmoles e foram estimulados eletricamente no mesmo local. Os animais do grupo SAL
-
foram
microinjetados com salina, mas não foram estimulados eletricamente. SAL
+
(n = 9), SAL
-
(n = 9),
M10 (n =11) e M20 (n = 7). EE = estimulação elétrica. * p < 0,05 em relação ao grupo controle
(SAL
+
).
Teste da formalina
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Índice de nocicepção
SAL+ SAL-
NTX KET
*
A
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Tempo (min)
Índice de nocicepção
SAL+ SAL-
M10 M20
*
EE
B
Resultados
59
4.3 EXPERIMENTO II: EFEITOS DA INJEÇÃO DO MIDAZOLAM NA SCPVL SOBRE O
COMPORTAMENTO EXPLORATÓRIO DOS RATOS NO LABIRINTO EM CRUZ
ELEVADO
4.3.1 Medidas tradicionais
A figura 15 mostra os efeitos da salina e do midazolam (10 e 20 nmoles),
microinjetados na SCPvl, dez minutos antes da exposição dos animais ao LCE.
A análise de uma via mostrou diferenças entre os tratamentos para o número de
entradas nos braços fechados (F
2,27
= 3,60; p < 0,05). A análise post-hoc de
Dunnett mostrou que os efeitos foram devidos à dose de 20 nmoles de
midazolam. Há uma tendência para significância no total de entradas nos braços
abertos e fechados (F
2,27
= 2,6; p = 0,08). Entretanto, não há diferenças no
número de entradas nos braços abertos (F
2,27
= 0,82; p > 0,05), no percentual de
entradas nos braços abertos (F
2,27
= 0,09 p > 0,05) ou no tempo gasto nos braços
abertos (F
2,27
= 1,30 p > 0,05). Estes resultados mostraram que a injeção de
midazolam (20nmoles) na SCPvl não produziu efeitos ansiolíticos deste
composto nos animais expostos ao labirinto em cruz elevado.
Resultados
60
Figura 15. Efeitos da microinjeção de midazolam na SCPvl sobre o comportamento exploratório dos
ratos (média + EPM) expostos ao labirinto em cruz elevado (LCE). Superior: número de entradas em
ambos os braços. Inferior: percentual de entradas e tempo gasto nos braços abertos em relação ao total.
SAL = salina (n = 10), M10 = midazolam 10 nmoles (n = 10) e M20 = midazolam 20 nmoles (n = 10).
* p < 0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
SAL M10 M20
Entradas
Fechado Aberto
*
0
10
20
30
40
50
60
SAL M10 M20
Tratamento
%
Entradas Tempo
Resultados
61
4.3.2 Medidas etológicas
A figura 16 indica os efeitos da salina e do midazolam (10 e 20 nmoles), microinjetados
na SCPvl, dez minutos antes da exposição dos animais ao labirinto em cruz elevado (LCE).
Superior: a análise de uma via indicou diferenças na freqüência de levantamentos (LEV) (F
2,27
= 3,77 p < 0,05) e a análise post-hoc de Dunnett indicou que as mesmas foram devidas à dose
de 20 nmoles de midazolam em relação ao grupo controle. Na análise dos demais
comportamentos, não foram encontradas diferenças significativas. Inferior: a mesma análise
(com post-hoc de Dunnett) mostrou diferenças no tempo total de levantamentos (F
2,27
= 4,14;
p < 0,05), devidas à dose de 20 nmoles quando comparada com o grupo controle. Nos demais
comportamentos, não houve diferenças significativas entre os tratamentos.
Notamos que o midazolam na dose de 20 nmoles apresentou um aumento na freqüência
e no tempo de levantamentos, o que poderíamos sugerir um efeito ansiolítico deste composto
nas medidas etológicas, mas que não foi caracterizado pela análise das medidas tradicionais.
Resultados
62
SCPvl
0
5
10
15
20
25
30
35
40
AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
Freqüência
SAL
M10
M20
*
A
0
50
100
150
200
250
AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
Comportamentos
Tempo (s)
SAL
M10
M20
*
B
Figura 16. Efeitos da microinjeção de midazolam na SCPvl sobre o comportamento exploratório dos
animais (média +
EPM) no labirinto em cruz elevado (LCE). A: freqüência de comportamentos
exibidos pelo animal. B: tempo total (s) decorrido em cada categoria comportamental. Autolimpeza
(AL); Esquadrinhamento (ESQ); Mergulho de cabeça (MC); Esticamento (EST); Rastejamento
(RAST); Levantamento (LEV), Exploração na extremidade dos braços abertos (EEBA); Espreitamento
(ESP) e Imobilidade (IMOB). SAL = salina (n = 10), M10 = midazolam 10 nmoles (n = 10) e M20 =
midazolam 20 nmoles (n = 10). * p < 0,05 em relação ao grupo controle (SAL).
Resultados
63
4.4 EXPERIMENTO III: EFEITOS DA INJEÇÃO DE MIDAZOLAM NA SCPVL SOBRE
A ATIVIDADE MOTORA DE RATOS SUBMETIDOS AO TESTE DO CAMPO ABERTO
O teste do campo aberto foi utilizado para avaliar a atividade motora dos animais que
receberam injeção de doses mais altas de midazolam na SCPvl.
A figura 17 ilustra os efeitos da salina e do midazolam (20 e 30 nmoles), microinjetados
na SCPvl, dez minutos antes da exposição dos animais ao campo aberto. A análise de uma via
mostrou diferenças entre os tratamentos na freqüência de cruzamentos (F
2,30
= 3.35; p < 0,05)
e no tempo de imobilização (F
2,30
= 7,68; p < 0,05). A análise post-hoc de Dunnett indicou
que a microinjeção de midazolam na dose de 20 nmoles aumentou a freqüência de
cruzamentos, enquanto a dose de 30 nmoles causou aumento no tempo de imobilização. O
efeito da dose de 30 nmoles sugere um prejuízo da atividade motora. Sendo assim, esta dose
não foi empregada nos demais testes deste estudo.
Resultados
64
Figura 17. Efeitos da microinjeção de midazolam na SCPvl sobre o comportamento exploratório dos
animais (média + EPM) no campo aberto. Superior: freqüência de comportamentos exibidos pelo
animal. Inferior: tempo total (s) decorrido em cada categoria comportamental. SAL = salina (n = 17),
M20 = midazolam 20 nmoles (n = 7) e M30 = midazolam 30 nmoles (n = 7). * p < 0,05 em relação ao
grupo controle (SAL).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
A-LIMP CRUZ LEV IMOB
Freqüência
SAL M20 M30
*
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
A-LIMP CRUZ LEV IMOB
Comportamento
Tempo
SAL M20 M30
*
5 DISCUSSÃO
Discussâo
66
sistema nervoso dos animais, principalmente dos mamíferos, contém
sistemas especializados que modulam a nocicepção em resposta aos
estímulos nocivos (BASBAUM; FIELDS, 1978; 1984). A antinocicepção que se segue às
reações defensivas desencadeadas pela estimulação de substratos neurais capazes de eliciar o
medo em estruturas mesencefálicas foi muito discutida por décadas, e enormes avanços foram
alcançados na compreensão da neurobiologia do medo e da analgesia induzida pelo estresse.
O sistema cerebral aversivo, constituído pela SCPd, hipotálamo medial, colículos
superior e inferior e amígdala, é responsável pela elaboração da reação de defesa dos animais
frente a estímulos de perigo iminente (BLANCHARD; BLANCHARD, 1972; GRAEFF,
1990; DAVIS; RAINNIE; CASSEL, 1994; BRANDÃO et al., 1999). Aumentos graduais na
intensidade de estimulação elétrica da SCPd e do colículo inferior (CI) produzem respostas
aversivas, como, por exemplo, alerta, congelamento e reações de fuga (NOGUEIRA;
GRAEFF, 1995; COIMBRA; BRANDÃO, 1997; CASTILHO, AVANZI; BRANDÃO, 1999;
VIANNA et al., 2001a/b).
Muitos trabalhos descrevem a substância cinzenta periaquedutal como uma estrutura de
função heterogênea (CARRIVE, 1993), cuja estimulação de distintas colunas resulta em
alterações fisiológicas e comportamentais diversificadas. A estimulação da coluna
ventrolateral da SCP resulta em antinocicepção opióide, hipotensão e comportamento
defensivo (congelamento), enquanto a estimulação das colunas dorsomedial e dorsolateral
resulta em hipoalgesia não opióide, hipertensão e esquiva, fuga ou ataques defensivos
(BANDLER; SHIPLEY, 1994).
Vários laboratórios têm se dedicado ao estudo dos diversos componentes da reação de
defesa, incluindo a antinocicepção. O congelamento e a analgesia produzidos pelo encontro
de um rato com um gato são reduzidos após a lesão da amígdala (BLANCHARD;
BLANCHARD, 1972) ou da SCP (FANSELOW, 1991). Há várias evidências de que há uma
O
Discussâo
67
projeção importante da amígdala para SCP (SHIPLEY et al., 1991) e Fanselow (1991)
sustenta que os estímulos aversivos ativam vias específicas na amígdala que se projetam para
a SCP, têm como resultado os comportamentos defensivos, analgesia e respostas
autonômicas. Os estímulos que sinalizam situações ameaçadoras (como, por exemplo, quando
o rato vê o gato) ativam as regiões da amígdala que se projetam para a SCPvl. Dessa ativação,
resulta o congelamento e a analgesia (BEHBEHANI, 1995). Quando o animal entra em
contato com o perigo, as vias neuroniais da amígdala que se projetam para a SCPd são
ativadas, resultando em resposta de fuga associada com vocalização e respostas autonômicas.
A interação entre SCPd e SCPvl tem sido amplamente estudada. É possível que a estimulação
da SCPd iniba os neurônios da SCPvl (BEHBEHANI, 1995). Sugere-se que esta interação
inibitória seja em parte mediada pela ativação dos receptores opióides, uma vez que a
naloxona bloqueia os efeitos desta interação (FANSELOW; CALCAGNETTI;
HELMSTETTER, 1989; BEHBEHANI, 1995).
Vários estudos mostram que os circuitos neuroniais do medo e da ansiedade,
envolvendo a SCP, utilizam vários neurotransmissores, como a serotonina, a colecistocinina e
o GABA. O papel da serotonina nas funções da SCP é muito complexo, principalmente
porque a SCP contêm vários subtipos de receptores serotoninérgicos (PALÁCIOS, 1990).
Anatomicamente, a SCP contém corpos celulares e prolongamentos de axônios que contêm
serotonina distribuídos por toda a sua extensão (BEITZ, 1982; BEITZ; MULLETT;
WEINER, 1983).
Neste trabalho, verificamos que a estimulação elétrica da SCPvl promoveu
antinocicepção no teste da retirada da cauda, que foi reduzida por microinjeção de
antagonistas de receptores tanto opióides (naltrexona) quanto serotoninérgicos (cetanserina).
Tanto a cetanserina (5 nmoles) quanto a naltrexona (26 nmoles) promoveram uma diminuição
Discussâo
68
parcial dessa antinocicepção. Essas observações apóiam a hipótese de que ambos os
mecanismos opióides e serotoninérgicos participam da mediação desta resposta.
Os efeitos da estimulação da SCPvl foram também avaliados pelo teste da formalina.
Nossos dados não mostraram efeitos dos tratamentos sobre a antinocicepção durante a fase
fásica deste teste. Já na segunda fase, tanto a naltrexona quanto a cetanserina reduziram os
efeitos da estimulação elétrica da SCPvl. Dessa forma, verificamos que a sensibilidade ao
estímulo nocivo fásico, como medido pelo teste da retirada da cauda, pôde ser inibida pela
estimulação elétrica da SCPvl na intensidade de corrente capaz de induzir o congelamento,
mas que as fases fásica e tônica do teste da formalina foram diferencialmente sensíveis à
estimulação elétrica da SCPvl. Somente a fase tônica foi sensível aos efeitos antinociceptivos
da estimulação elétrica da SCPvl. Portanto, nossos resultados fornecem novas evidências de
que a estimulação elétrica da SCPvl, na intensidade de corrente que produz o congelamento,
foi capaz de inibir a fase tônica do teste da formalina.
Ao contrário do que observamos com a antinocicepção, o congelamento induzido pela
estimulação elétrica da SCPvl não foi afetado pelas injeções locais de naltrexona e cetanserina
nesta região. Esses resultados apóiam a idéia de que os substratos neurais responsáveis pelo
congelamento e antinocicepção representam sistemas motivacionais opostos. De acordo com
o modelo de Bolles e Fanselow (1980), o significado biológico da analgesia é prevenir o
aparecimento de comportamentos recuperativos no momento da reação de defesa do animal,
de forma que uma resposta nociceptiva não tem valor adaptativo durante situações que
ameaçam a sobrevivência do indivíduo.
Não está descartada a existência de um problema metodológico decorrente da
competição entre o congelamento e as respostas reflexas do teste da retirada da cauda, e os
comportamentos recuperativos do teste da formalina. Esta possibilidade existe na medida em
que o que é medido como antinocicepção pode decorrer da incompatibilidade das respostas
Discussâo
69
nestes testes com o congelamento produzido pela estimulação da SCPvl. Contrário a esta
possibilidade, entretanto, está o fato de que as drogas naltrexona e cetanserina reverteram o
aumento da latência da retirada da cauda e reduziram os comportamentos recuperativos da
formalina causados pela estimulação elétrica da SCPvl, mas não afetaram o congelamento. Se
o congelamento realmente impediu o comportamento recuperativo da formalina e a resposta
de retirada da cauda, os efeitos pró-nociceptivos causados por estes antagonistas deveriam
resultar num aumento do congelamento, o que não ocorreu; ambas drogas não alteraram o
limiar de congelamento. Portanto, a redução da antinocicepção induzida pela estimulação
elétrica da SCPvl, observada em ratos pré-tratados com naltrexona e cetanserina, deve-se
principalmente ao antagonismo da analgesia induzida por esta estimulação. Esses efeitos são
específicos, pois várias evidências indicam que os antagonistas opióides e serotoninérgicos
não afetam a linha de base da sensibilidade dolosora (NORTH, 1977; MICZEK;
THOMPSON; SHUSTER, 1985; NICHOLS; THORN; BERNTSON, 1989; FREITAS et al.,
2005).
Resumindo, esta fase do trabalho, que investigou os efeitos da estimulação elétrica da
SCPvl sobre o comportamento defensivo e a mediação química na antinocicepção, mostrou
que os mecanismos envolvidos no medo podem estar dissociados da analgesia. Esta
dissociação foi evidente no teste da retirada da cauda. As microinjeções de cetanserina e de
naltrexona não alteraram os limiares aversivos de congelamento, mas provocaram redução da
antinocicepção produzida pela estimulação elétrica da SCPvl. Além disso, os efeitos da
naltrexona e da cetanserina não alteraram significativamente o índice de nocicepção medido
no teste da formalina durante a fase fásica, mas inibiram a analgesia da estimulação elétrica
da SCPvl na fase tônica do mesmo teste. Estes resultados sugerem que os mecanismos
opióides e serotoninérgicos da SCPvl operam na modulação de vias descendentes de dor
susceptíveis de serem medidas pelo teste de retirada da cauda, e que a fase fásica do teste da
Discussâo
70
formalina deve recrutar mecanismos nociceptivos encefálicos não diretamente modulados
pela SCPvl.
Apoiando nossos achados, há evidências na literatura mostrando que os agentes
analgésicos opióides produzem antinocicepção pela ativação do sistema inibitório
descendente que suprime as respostas neuroniais do corno dorsal da medula espinhal aos
estímulos nocivos. Os analgésicos opióides ativam este sistema analgésico descendente
primariamente por se ligarem aos receptores opióides na SCP. Lesões na SCP, NMgR ou no
funículo dorsolateral interrompem a atividade deste sistema e atenuam o efeito analgésico da
administração sistêmica da morfina (BASBAUM et al., 1977; CHANCE; KRYNOCK;
ROSCRANS, 1978; PROUDFIT; ANDERSON, 1975; YAKSH; PLANT; RUDY, 1977 apud
ABBOTT; MELZACK; SAMUEL, 1982). É importante reconhecer que esses dados são
baseados em experimentos que usaram um estímulo breve e fásico, como o estímulo térmico
no teste da retirada da cauda (ABBOTT; MELZACK; LEBER, 1982; ABBOTT; MELZACK;
SAMUEL, 1982). Alguns experimentos indicam que o tipo de nocicepção pode ser crucial
para determinar os efeitos de drogas e recrutar mecanismos neuroquímicos subjacentes à
antinocicepção. O uso do teste da formalina produz nocicepção prolongada associada aos
danos teciduais e induz, na fase tônica, um padrão de respostas que difere
farmacologicamente da fase fásica. Por exemplo, drogas anti-serotoninérgicas, que diminuem
a antinocicepção causada pela morfina no teste da retirada da cauda, podem potencializar a
antinocicepção da morfina no teste da formalina (DENNIS; MELZACK, 1980; apud
ABBOTT; MELZACK, SAMUEL, 1982). Além disso, a antinocicepção produzida pela
estimulação da SCP requer uma intensidade de corrente bem menor no teste da formalina que
a requerida no teste da retirada da cauda (DENNIS; MELZACK, 1980; apud ABBOTT;
MELZACK, SAMUEL, 1982).
Discussâo
71
Para explicar a pequena discrepância observada nos efeitos de drogas nos testes da
retirada da cauda e da formalina, sumarizamos quatro diferenças já detectadas entre eles: (1) o
teste de retirada da cauda é primariamente mediado pelo reflexo espinhal ao estímulo nocivo,
enquanto o teste da formalina envolve movimentos mais complexos das patas e ajustes
corporais; (2) o teste da retirada da cauda envolve nocicepção breve pela ativação das fibras
mielinizadas de rápida condução (Aδ), característica da estimulação de nociceptores de
natureza térmica, e o da formalina induz resposta mais prolongada, envolvendo a ativação das
fibras C, não mielinizadas, além de produzir uma resposta ao estímulo químico que induz a
liberação de substâncias irritantes no local, como, por exemplo, a substância P; (3) a
nocicepção no teste de retirada da cauda surge rapidamente, enquanto que no da formalina é
mais demorada; (4) a nocicepção rápida leva a uma retirada da cauda antes da percepção da
dor alcançar os níveis mais altos, de forma que o reflexo de retirada pode ocorrer em um
limiar mais baixo da dor. Além disso, o teste da formalina produz uma dor persistente e
moderada devida aos danos tissulares. Portanto, as vias neuroniais da transmissão e o controle
inibitório podem ser diferenciados nestes testes. Assim, enquanto o teste de retirada da cauda
envolve mecanismos caudais e espinhais, o da formalina é mais complexo e envolve a
participação de regiões encefálicas mais rostrais (modificado de ABBOTT; MELZACK;
SAMUEL, 1982).
Nosso estudo também contribuiu para a postulada participação distinta dos mecanismos
opióides na antinocicepção induzida pela estimulação elétrica da SCP, dependendo da região
estimulada, dorsal ou ventral. Enquanto, neste estudo, o antagonista opióide (naltrexona)
inibiu claramente a antinocicepção induzida pela estimulação da SCPvl, tem sido mostrado
que este composto não afeta a antinocicepção produzida pela estimulação da coluna dorsal da
SCP (CASTILHO; BRANDÃO, 2001; CASTILHO; MACEDO; BRANDÃO, 2002). Dessa
forma, vários trabalhos sugerem que a analgesia induzida pelo estresse, particularmente a
Discussâo
72
analgesia condicionada produzida pelos estímulos que evocam o medo, é de natureza opióide
(FANSELOW et al., 1994; HELMSTETTER et al., 1998). De fato, a antinocicepção
condicionada observada após a exposição de ratos a um estímulo associado a choques nas
patas pode ser bloqueada por antagonistas opióides (HELMSTETTER; LANDEIRA-
FERNANDEZ, 1990; BELLGOWAN; HELMSTETTER, 1998). A antinocicepção gerada na
SCPvl é mediada através de projeções descendentes que passam pelos núcleos bulbares e
inibem os neurônios do corno dorsal da medula espinhal (BASBAUM; FIELDS, 1984). É
muito provável que a antinocicepção opióide induzida pela estimulação elétrica da SCPvl
possa ser decorrente da ativação dos mesmos circuitos neuroniais da SCPvl associados com o
medo condicionado.
Outra distinção entre a mediação química da reação de defesa organizada na SCP
ventral e dorsal diz respeito aos resultados obtidos com a cetanserina no presente trabalho. A
microinjeção do antagonista serotoninérgico não promoveu alteração no limiar de
congelamento. No entanto, trabalhos prévios mostram que a serotonina aumenta o limiar
aversivo produzido pela estimulação da SCPd e que este efeito pode ser bloqueado pelos
antagonistas de receptores 5-HT, metergolina ou cetanserina, e potencializado pela
zimelidina, sugerindo o envolvimento dos receptores 5-HT
2
nesta mediação (SCHÜTZ;
AGUIAR; GRAEFF, 1985; GRAEFF et al., 1986).
Coimbra, Tomaz e Brandão (1992) mostraram que a antinocicepção é uma resposta que
segue, usualmente, as reações defensivas induzidas pela estimulação de substratos neuroniais
de aversão no teto mesencefálico. Esta analgesia parece estar relacionada com a intensidade
do estímulo aversivo, pois a estimulação elétrica aplicada no limiar de congelamento produz
analgesia menos pronunciada que a induzida no limiar de fuga, ou pela microinjeção de
bicuculina. Esses resultados corroboram vários outros estudos mostrando que, embora haja
uma relação entre causa e efeito, nem sempre esta relação pode ser estabelecida, pois em
Discussâo
73
algumas áreas encefálicas, como a formação reticular, a substância cinzenta e o colículo
superior, a antinocicepção pode ser causada pela estimulação de fibras que nelas se projetam
em si e não pela estimulação elétrica das estruturas (OLIVERAS et al., 1974). Além disso,
outros trabalhos demonstraram que o estresse em intensidade moderada produz congelamento
e analgesia opióide, enquanto que um aumento da intensidade ou duração do estímulo
aversivo causa analgesia não opióide (MAYER, 1990; TERMAN et al., 1984, apud
COIMBRA; TOMAZ; BRANDÃO, 1992). Outros estudos mostram que as reações aversivas
e a analgesia induzidas pela estimulação da SCPd podem ser farmacologicamente dissociadas,
pois a microinjeção local de diazepam inibiu as respostas aversivas sem alterar a analgesia
induzida pela estimulação elétrica desta área (MORGAN; LIEBESKING, 1987).
No que diz respeito aos mecanismos de defesa, o presente trabalho evidencia que
enquanto a naltrexona ou a cetanserina não alteraram os limiares aversivos determinados pela
estimulação elétrica da SCPvl, a microinjeção de midazolam aumentou os limiares de
congelamento. A literatura apresenta várias evidências da ação antiaversiva de
benzodiazepinos na SCPd. Estudos prévios mostram que microinjeções de midazolam na
SCPd atenuaram os efeitos de sua estimulação elétrica aversiva (AUDI; GRAEFF, 1984).
Outros trabalhos também mostraram que injeções de benzodiazepínicos no teto mesencefálico
diminuíram os comportamentos de defesa condicionados e incondicionados induzidos pela
estimulação elétrica desta região (BRANDÃO; AGUIAR; GRAEFF, 1982; MELO;
CARDOSO; BRANDÃO, 1992; BRANDÃO; COIMBRA; BORGES, 1990; CASTILHO;
BRANDÃO, 2001). Além disso, injeções locais de clordiazepóxido e midazolam aumentam
os limiares aversivos determinados pela estimulação elétrica do teto mesencefálico de maneira
dose-dependente. Tais efeitos foram bloqueados pelo flumazenil, um antagonista competitivo
de receptores benzodiazepínicos (AUDI; GRAEFF, 1987).
Discussâo
74
A microinjeção, na SCP, de diazepam pode também aumentar o limiar de estimulação
elétrica nessa região, efeito este que foi bloqueado pela bicuculina (GOMITA et al., 1991). A
SCP é rica em neurônios GABAérgicos (REICHLING; BASBAUM, 1990a/b) tonicamente
ativos. O bloqueio dos receptores GABA
A
causa aumento na taxa de disparo dos neurônios da
SCP, produzindo aversão (GRAEFF et al., 1986; BEHBEHANI et al., 1990). Esses estudos
conferem aos mecanismos GABA-benzodiazepínicos um importante papel na regulação de
estados aversivos no teto mesencefálico, e um provável modo de ação nesta região para
drogas que atuam no sistema GABA-benzodiazepínico.
Os mecanismos GABAérgicos também exercem um controle na nocicepção da SCPvl.
Vários estudos mostraram que a microinjeção de agonistas e antagonistas GABAérgicos na
SCP, aumenta e inibe a transmissão da dor, respectivamente (ver revisão em FIELDS;
BASBAUM, 2000). Nossos resultados mostraram que a antinocicepção induzida pela
estimulação da SCPvl foi revertida pelo midazolam – um agonista indireto dos mecanismos
GABAérgicos. Assim, é possível que mecanismos opióides, serotoninérgicos e GABA-BDZ
se unam a outros processos neuroquímicos da SCPvl na mediação da antinocicepção aí
organizada. De fato, alguns trabalhos mostram que a antinocicepção induzida pela morfina na
SCPvl foi reduzida pela microinjeção de metisergida no mesmo sítio (SCHUL; FRENCK,
1991), indicando que os receptores na SCPvl podem modular a antinocicepção mediada pelos
opióides (HELMSTETTER et al., 1998; OLIVEIRA; PRADO, 2001).
Nossos resultados sugerem que mecanismos benzodiazepínicos podem regular o
comportamento defensivo induzido por estimulação elétrica da SCPvl. Esta regulação não
conta com a participação de mecanismos opióides e serotoninérgicos, enquanto a
antinocicepção causada pela estimulação elétrica desta região é controlada por estes
mecanismos. Em vista disto, sugerimos que as respostas comportamentais defensivas e a
Discussâo
75
antinocicepção induzidas pela estimulação elétrica da SCPvl são processos independentes
com mediação química distinta.
Resumindo esta segunda fase do trabalho, é possível que a antinocicepção e o
congelamento possam compartilhar os mesmos substratos anatômicos, no nível da SCPvl,
mas provavelmente possuem diferentes substratos neuroquímicos. De fato, a antinocicepção e
o congelamento foram farmacologicamente dissociados. A antinocicepção induzida pela
estimulação da SCPvl aplicada no limiar de congelamento, em ambos os testes, foi bloqueada
pela microinjeção dos antagonistas opióide e serotoninérgico, enquanto o congelamento
permaneceu inalterado. Por outro lado, o midazolam microinjetado no mesmo sítio, inibiu o
congelamento e a antinocicepção. Portanto, esses resultados apóiam a noção de que sistemas
neuroniais mutualmente exclusivos são responsáveis pelo congelamento e antinocicepção, e
que diferentes mecanismos neuroquímicos coexistem dentro da SCPvl. Vale lembrar que nos
animais tratados com o midazolam e estimulados eletricamente na SCPvl, foi aplicada
intensidade de corrente elétrica mais alta para induzir o comportamento emocional do que nos
animais que receberam microinjeção de salina, devido ao aumento do limiar de congelamento
causado pela droga e, mesmo assim, a antinocicepção permaneceu inibida. Ao lado disso, os
efeitos motores dessa droga na dose de 20 nmoles podem ser descartados, em vista da
ausência de efeitos significativos do midazolam sobre o comportamento recuperativo de ratos
não estimulados na SCPvl e submetidos ao teste da formalina. Ao contrário, esta dose de
midazolam promoveu um aumento no comportamento exploratório dos animais nos braços
fechados do labirinto em cruz elevado (LCE) e na freqüência de cruzamentos, como
verificado no teste do campo aberto.
Para caracterizar os efeitos anti-aversivos do midazolam microinjetado na SCPvl, os
animais tratados com midazolam foram submetidos ao teste do labirinto em cruz elevado
(LCE). O principal efeito do midazolam foi um aumento da atividade exploratória nos braços
fechados do LCE, sem qualquer alteração significativa nas entradas ou tempo gasto nos
Discussâo
76
braços abertos. Já nas medidas etológicas, observamos diferenças significativas no tempo e
freqüência de levantamento, o que poderia indicar efeito ansiolítico. Baseados nesses dados,
sugerimos que o LCE não é capaz de detectar os efeitos ansiolíticos do midazolam observados
no teste dos limiares. A microinjeção do midazolam na SCPvl não afeta a reatividade do
animal aos estímulos aversivos inerentes ao teste do LCE como os espaços abertos e a altura.
Vários laborátórios têm relatado que dependendo do tipo de estímulo ameaçador,
condicionado ou inato, a amígdala seleciona estes estímulos que ativarão diferentes vias na
SCP, ventral ou dorsal (BELLGOWAN; HELMSTETTER, 1998; VAZDARJANOVA;
CAHILL; MCGAUGH, 2001). O circuito responsável pela produção das respostas
incondicionadas, denominado de Sistema Cerebral Aversivo, compreende a SCPd, hipotálamo
medial e a amígdala, e é ativado por estímulos aversivos como altura e espaços abertos no
LCE (BRANDÃO et al., 1994; 1999). Os estímulos aversivos inerentes ao LCE não parecem
ativar a SCPvl, de forma que sua inativação pelo midazolam não resulta em efeito ansiolítico.
Cumpre destacar que no medo condicionado que resulta da ativação da SCPd, ocorre uma
postura tensa junto com alterações autonômicas (FANSELOW et al., 1994; DE OCA et al.,
1998; VIANNA et al., 2001c; CARRIVE et al., 1997; WALKER; CARRIVE, 2003).
Diferentemente do estímulo condicionado, a estimulação elétrica da SCPvl produz
imobilidade hiporreativa, característica do comportamento recuperativo das injúrias. Este
padrão de respostas comportamentais é muito similar ao obtido com aminoácidos excitatórios
microinjetados nesta estrutura (WALKER; CARRIVE, 2003). Alguns trabalhos têm mostrado
que o componente recuperativo do processo defensivo é retardado pela inativação da SCPv
(WALKER, CARRIVE, 2003). Sem dúvida, o aumento da atividade locomotora tem sido
relatado com a micromicroinjeção de muscimol na SCPv (WALKER, CARRIVE, 2003).
Assim, a resposta recuperativa pode ser a expressão da ativação da SCPvl. Em outras palavas,
a recuperação é um processo ativo desencadeado por sinais de segurança. Em contrapartida, é
provavel que alguma ativação da SCPvl seja requerida quando o animal repousa ou entra em
relaxamento. Drogas como o midazolam e o muscimol rompem estas respostas não pela ação
Discussâo
77
ansiolítica, mas por ativar os mecanismos GABAérgicos, diminuindo o funcionamento da
SCPvl. Dessa forma, o papel da SCPvl nos processos recuperativos pode não ser específico do
medo e pode estar relacionado às diversas formas de estresse, como a manipulação, restrição e
estresse inescapável (WALKER; CARRIVE, 2003).
6 CONCLUSÕES
Conclusões
79
presente estudo mostrou que:
• A antinocicepção, mas não o congelamento gerado por estimulação da SCPvl, é
regulada por mecanismos opióides e serotoninérgicos;
• O midazolam microinjetado na SCPvl inibiu o congelamento e a antinocicepção
induzidos pela estimulação elétrica desta região;
• A microinjeção de midazolam na SCPvl não alterou a esquiva dos braços abertos do
LCE.
Esses achados nos permitem sugerir que:
• O congelamento e a antinocicepção produzidos pela ativação da SCPvl são
dissociados farmacologicamente;
• O congelamento e a antinocicepção gerados pela estimulação da SCPvl estão sob
controle de mecanismos GABA-BDZ;
• A injeção local de midazolam (20 nmoles) na SCPvl não promove efeitos
ansiolíticos nos animais expostos ao LCE.
O
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between dorsolateral and ventrolateral regions. Learning and Memory, 12, 4109-4112,
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VIANNA, D. M. L.; LANDEIRA-FERNANDEZ, J.; BRANDÃO, M. L. Dorsolateral and
ventral regions of the periaqueductal gray matter are involved in distinct types of fear.
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VIANNA, D. M.; GRAEFF, F. G.; LANDEIRA-FERNANDEZ, J.; BRANDÃO, M. L.
Lesion of the ventral periaqueductal gray reduces conditioned fear but does not change
freezing induced by stimulation of the dorsal periaqueductal gray. Learning and Memory, 8,
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WALL, B. D.; MELZACK, R. P. Textbook of Pain. Eds Churchill Livinstone, 1999.
WALKER, P.; CARRIVE, P. Role of ventrolateral periaqueductal gray neurons in the
behavioral and cardiovascular responses to contextual conditioned fear and poststress
recovery. Neuroscience, 116, 897-912, 2003.
WATKINS, L. R.; MAYER, D. J. Organization of endogenous opiate and nonopiate pain
control systems. Science, 216, 1185-1192, 1982.
WONG, C. G. T.; BOTTIGLIERI, T.; SNEAD, O. C. GABA γ-hidroxybutiric acid and
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ZIMMERMAN, M. Ethical guidelines for investigation of experimental pain in conscious
animals. Pain, 16, 109-110, 1983.
ANEXOS
Tabela 2 – Intensidade de corrente elétrica (μA) necessária para induzir o congelamento antes
e após a microinjeção de salina na SCPvl durante o teste da retirada da cauda (C1 e C2) e o da
formalina (C3 e C4). Δ: variação dos limiares; Média da variação dos limiares.
Congelamento – grupo SAL
+
Animal C1 C2
Δ1
C3 C4
Δ2
Média
1 135 135 0 160 190 30 15
2 125 125 0 125 135 10 5
3 100 100 0 100 100 0 0
4 55 55 0 50 50 0 0
5 110 110 0 120 120 0 0
6 110 108 -2 80 50 -30 -16
7 120 120 0 115 115 0 0
8 118 110 -8 118 115 -3 -5,5
9 100 100 0 120 125 5 2,5
10 150 150 0 150 155 5 2,5
11 98 100 2 85 88 3 2,5
12 80 150 70
100 120 20
45
13 120 100 -20 100 120 20 0
14 50 50 0 50 50 0 0
15 40 40 0 100 100 0 0
16 40 40 0 180 180 0 0
17 60 60 0 50 50 0 0
18 140 140 0 140 150 10 5
19 100 95 -5 60 60 0 -2,5
20 130 125 -5 120 120 0 -2,5
MÉDIA 99,05 100,65 1,6
106,15 109,65 3,5 2,55
EPM 7,59 7,79 3,76
8,18 9,43 2,63 2,56
Anexos
95
Tabela 3 – Intensidade de corrente elétrica (μA) necessária para induzir o congelamento antes
e após a microinjeção de naltrexona (26 nmoles) na SCPvl durante o teste da retirada da cauda
(C1 e C2) e o da formalina (C3 e C4). Δ: variação dos limiares; Média da variação dos
limiares.
Congelamento – grupo NTX
Animal C1 C2
Δ1
C3 C4
Δ2
Média
1 130 125 -5 115 120 5 0
2 110 130 20 120 120 0 10
3 100 120 20 100 100 0 10
4 110 120 10 100 100 0 5
5 125 120 -5 110 115 5 0
6 80 80 0 50 50 0 0
7 120 120 0 130 138 8 4
8 80 87 7 80 102 22 14,5
9 50 55 5 120 115 -5 0
10 80 80 0 80 80 0 0
MÉDIA 98,5 103,7 5,2 100,5 104 3,5 4,35
EPM 8,03 8,15 2,89 7,69 7,77 2,36 1,71
Anexos
96
Tabela 4 – Intensidade de corrente elétrica (μA) necessária para induzir o congelamento antes
e após a microinjeção de cetanserina (5 nmoles) na SCPvl durante o teste da retirada da cauda
(C1 e C2) e o da formalina (C3 e C4). Δ: variação dos limiares; Média da variação dos
limiares.
Congelamento – grupo KET
Animal C1 C2
Δ1
C3 C4
Δ2
Média
1 45 52 7 70 70 0 3,5
2 115 120 5 120 120 0 2,5
3 40 40 0 140 150 10 5
4 115 115 0 120 120 0 0
5 50 65 15 100 100 0 7,5
6 130 140 10 130 135 5 7,5
7 115 115 0 130 135 5 2,5
8 80 100 20 100 100 0 10
9 80 92 12 120 125 5 8,5
10 120 125 5 120 130 10 7,5
MÉDIA 89 96,4 7,4 115 118,5 3,5 5,45
EPM 10,90 10,61 2,16 6,37 7,27 1,30 1,73
Anexos
97
Tabela 5 – Intensidade de corrente elétrica (μA) necessária para induzir o congelamento antes
e após a microinjeção de midazolam (10 nmoles) na SCPvl durante o teste da retirada da
cauda (C1 e C2) e o da formalina (C3 e C4). Δ: variação dos limiares; Média da variação dos
limiares.
Congelamento – grupo M10
Animal C1 C2
Δ1
C3 C4
Δ2
Média
1 100 130 30 60 100 40 35
2 80 100 20 80 80 0 10
3 110 140 30 90 110 20 25
4 100 120 20 60 60 0 10
5 100 120 20 60 80 20 20
6 80 120 40 80 90 10 25
7 125 130 5 100 100 0 2,5
8 90 100 10 60 80 20 15
9 60 80 20 70 100 30 25
10 120 120 0 110 130 20 10
MÉDIA 96,5 116 19,5 77 93 16 17,75
EPM 6,24 5,62 3,83 5,78 6,16 4,27 3,13
Anexos
98
Tabela 6 – Intensidade de corrente elétrica (μA) necessária para induzir o congelamento antes
e após a microinjeção de midazolam (20 nmoles) na SCPvl durante o teste da retirada da
cauda (C1 e C2) e o da formalina (C3 e C4). Δ: variação dos limiares; Média da variação dos
limiares.
Congelamento – grupo M20
Animal C1 C2
Δ1
C3 C4
Δ2
Média
1 150 150 0 140 145 5 2,5
2 115 120 5 118 118 0 2,5
3 100 140 40 50 130 80 60
4 70 123 53 80 125 45 49
5 115 155 40 50 50 0 20
6 80 150 70 100 150 50 60
7 80 80 0 100 80 -20 -10
8 75 80 5 80 80 0 2,5
9 100 150 50 100 140 40 45
10 200 210 10 180 200 20 15
MÉDIA 108,5 135,8 27,3 99,8 121,8 22 24,65
EPM 12,72 12,08 8,24 12,53 13,55 9,72 8,98
Anexos
99
Tabela 7 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de salina e da estimulação elétrica. Os
demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção de salina e da estimulação
elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da retirada da cauda.
LRCs – grupo SAL
+
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 2,7 3 2,4 4,3 3,6 2,4 1,7 2,3 1,9 1,8
2 3,3 2,4 3 5,1 2,4 2,9 2,3 2,8 2,3 2,4
3 2,9 3,2 2,6 6 6 5,6 5,3 4,1 4,1 3,6
4 2,8 2,4 2,5 4,4 3,9 2,8 2,6 2,4 2,9 2,4
5 3,3 3,2 3 6 4,9 3,9 3,3 2,7 2,5 3,3
6 3,1 3 3,3 3,6 4,1 2,9 3,5 2,9 3,5 3
7 3,1 3 3,4 6 4,6 3,8 3 3 3,5 2,9
8 3,4 3,2 2,7 6 3,7 3,9 2,3 3,5 3,4 2,9
9 3,3 2,6 2,6 4,1 4,6 3,4 4,2 3,5 3,4 2,2
10 2,2 2,5 2,7 5,8 1,5 1,3 1,5 1,3 1,5 1,3
11 3,1 2,7 2,4 4 3,7 3,1 3 2,4 2,8 2,8
MÉDIA 3,02 2,84 2,78 5,03 3,91 3,27 2,97 2,81 2,89 2,60
EPM 0,11 0,10 0,10 0,29 0,36 0,33 0,33 0,22 0,24 0,20
Anexos
100
Tabela 8 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de salina. Os demais valores (10 a 40)
foram registrados após a microinjeção de salina, porém, os animais não receberam
estimulação elétrica na SCPvl durante o teste da retirada da cauda.
LRCs – grupo SAL
-
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 3,4 2,7 2,3 3,6 2,4 2,6 2,4 2,6 2,1 1,9
2 2,6 2,8 3,4 3,8 2,4 2,3 3,6 3,3 3,2 3,1
3 3,5 3,1 3,2 3,6 2,8 3,1 3,3 3,1 2,8 3
4 3,3 3 3,4 2,5 2,1 2,4 2,4 2,5 2,8 2,4
5 3 3,1 3,1 3,5 2,5 2,9 3,3 2,9 2,9 2,5
6 2,7 2,9 2,4 3,1 2,6 2,6 2,4 2,7 2,6 2,9
7 2,6 2,7 2,9 2,3 2,7 3,1 2,9 2,9 3 2,8
8 2,7 3,3 2,9 3,3 3 2,3 2,8 3,2 3 3,5
MÉDIA 2,98 2,95 2,95 3,21 2,56 2,66 2,89 2,90 2,80 2,76
EPM 0,13 0,08 0,15 0,19 0,10 0,12 0,17 0,10 0,12 0,17
Anexos
101
Tabela 9 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de naltrexona (26 nmoles) e da
estimulação elétrica. Os demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção do
fármaco e da estimulação elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da
retirada da cauda.
LRCs – grupo NTX
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 3,3 2,8 2,3 3,8 3,5 1,3 2,1 1,8 1,6 1,7
2 2,9 2,5 2,8 3,4 3,8 2 1,6 1,6 2,2 1,9
3 3 2,6 3,2 3,5 2,7 3,3 2,9 2,6 2,7 2,8
4 2,6 3,5 2,8 3,9 4 3,9 2,4 2,5 2,3 2,5
5 2,8 3,3 3,1 3,7 2,9 3,2 3,9 3,1 3,6 3
6 3,2 2,6 3,3 4,2 4,1 3,7 3,3 2,4 3,6 2,6
7 2,9 2,6 2,6 3,1 2,8 2,6 2,8 2,5 3,2 2,8
8 2,6 2,4 2,9 2,1 1,4 1,6 1,7 2,6 2,8 2,3
9 2,3 2,9 2,7 4,6 3,2 3,8 3 2,9 3,2 3,2
10 3,2 2,5 3,2 6 4,8 2,8 2,1 3,1 3,4 2,5
11 3,3 2,5 2,3 4 3,2 2,9 3,4 2,9 3,4 2,4
MÉDIA 2,92 2,75 2,84 3,85 3,31 2,83 2,65 2,55 2,91 2,52
EPM 0,10 0,11 0,10 0,29 0,27 0,27 0,22 0,15 0,20 0,13
Anexos
102
Tabela 10 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de cetanserina (26 nmoles) e da
estimulação elétrica. Os demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção do
fármaco e da estimulação elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da
retirada da cauda.
LRCs – grupo KET
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 2,6 2,3 2,8 2,8 3,3 2,6 1,6 2 1,6 1,6
2 3 3,3 3,4 6 3 4,1 5 3 2,4 3,9
3 3,2 3,4 3,3 4,2 4,1 2,2 3,4 3,1 3,7 3
4 2,7 3 2,5 3,4 3 1,6 1,5 1,9 2,1 2
5 3,5 2,5 2,6 3,7 3,5 3,7 2,5 2,7 2,6 3,2
6 2,6 3,3 3,5 4,8 1,9 2,1 3,1 2,4 3 2,6
7 2,9 2,9 3,3 5,2 4,1 4,2 3,6 2,2 2,7 2,8
8 2,5 3,3 3,5 3,7 3,4 3,1 3,7 3 2,5 3
9 3,2 2 3,2 3,6 2,6 1,8 1,7 2 2,1 2,5
10 2,4 3,4 2,9 2,9 2 2,1 2,4 3 2,8 3,1
MÉDIA 2,86 2,94 3,10 4,03 3,09 2,75 2,85 2,53 2,55 2,77
EPM 0,11 0,16 0,12 0,32 0,24 0,30 0,35 0,15 0,18 0,20
Anexos
103
Tabela 11 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de salina e da estimulação elétrica. Os
demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção de salina e da estimulação
elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da retirada da cauda.
LRCs – grupo SAL
+
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 3,5 2,4 2,4 5,3 3,7 2,5 2,5 1,9 1,7 1,6
2 3,1 3,4 2,5 3,8 3 2 1,6 2,1 2,8 2,3
3 2,6 2,4 3,1 5,8 2,5 3,3 2,6 2,7 2,8 3
4 3,5 2,9 2,7 3,5 2,8 3,5 3,2 3,5 3,4 2,9
5 2,7 2,6 2,4 5,1 4,1 2,7 2,6 2,3 2,4 2,6
6 2,5 2,5 2,5 3,1 3 2,5 2,9 2,5 2,6 2,7
7 2,4 2,5 2,8 4,5 3,5 4,4 4,6 3,7 3,8 3,2
8 3,3 3,4 3,1 6 4,4 4 4,1 3,7 3,6 3,7
9 2,7 2,3 2,4 2,5 2,6 2,4 2,3 2,3 2,6 2,5
MÉDIA 2,92 2,71 2,66 4,40 3,29 3,03 2,93 2,74 2,86 2,72
EPM 0,14 0,14 0,10 0,41 0,22 0,27 0,31 0,24 0,22 0,20
Anexos
104
Tabela 12 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de salina. Os demais valores (10 a 40)
foram registrados após a microinjeção de salina, porém, os animais não receberam
estimulação elétrica na SCPvl durante o teste da retirada da cauda.
LRCs – grupo SAL
-
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 2,6 3,1 2,5 3 3 3,5 3,8 3,1 3,4 3,1
2 2,8 3,8 2,5 2,6 2,8 2,4 2,4 1,8 2,6 2,4
3 2,7 2,6 2,8 2,7 2,4 2,5 3,5 2,8 2,6 3,4
4 3,3 2,6 2,4 3 2,5 2,8 3 2,6 2,7 2,5
5 3,3 3,5 2,8 2,9 2,5 2,8 2,5 3,1 3,4 3,3
6 2,8 3,4 3,3 3,3 3,3 3,5 3,1 3,3 3,4 3,3
7 3 3,5 3,2 3,4 3,2 2,6 2,5 2,7 3 2,8
8 3,1 3,4 3,5 2,5 3,1 3,4 3,5 3,3 3,4 3,5
9 3 2,8 2,7 3,1 2,8 2,4 2,7 2,4 3,1 3
10 3,4 3,6 2,4 2,8 2,5 2,7 2,6 2,4 3,2 2,3
11 3,1 3,2 2,9 2,6 2,5 3,5 2,9 3,2 3,5 3,5
MÉDIA 3,01 3,23 2,82 2,90 2,78 2,92 2,95 2,79 3,12 3,01
EPM 0,08 0,12 0,11 0,09 0,10 0,14 0,14 0,14 0,10 0,13
Anexos
105
Tabela 13 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de midazolam (10 nmoles) e da
estimulação elétrica. Os demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção do
fármaco e da estimulação elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da
retirada da cauda.
LRCs – grupo M10
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 2,4 2,6 3,1 3,9 3,7 2,6 2,7 3,3 2,4 2
2 2,4 3,5 3,3 3,6 2,7 2,8 2,9 2,9 2,4 2,3
3 2,4 2,9 3,4 3,6 3,7 3,4 3,5 2,7 2,4 2,6
4 3,4 2,8 3,5 4 2,4 2,7 2,3 2,7 2,9 3
5 2,8 3 3,2 3,8 2,4 2,6 2,6 2,8 2,5 2,5
6 2,6 2,8 2,1 4,3 2,4 3,3 2,6 3,7 3,4 2,9
7 2,1 2,6 2,3 2,8 2,3 2,6 3,2 3,3 3,5 3
8 3,3 3 3,2 4,7 4,8 4,7 3,3 3,8 3,7 2,6
9 2,9 2,6 3,3 3,4 3,1 3,6 3,1 3,6 3 3,3
10 3 3,2 2,9 3,3 2,9 3,2 2,7 3 2,5 2,6
MÉDIA 2,73 2,90 3,03 3,74 3,04 3,15 2,89 3,18 2,87 2,68
EPM 0,13 0,09 0,15 0,17 0,26 0,21 0,12 0,13 0,16 0,12
Anexos
106
Tabela 14 – Latências de retirada da cauda (LRCs). Os valores (-10, -5 e 0) indicam as linhas
de base das LRCs registradas antes da microinjeção de midazolam (20 nmoles) e da
estimulação elétrica. Os demais valores (10 a 40) foram registrados após a microinjeção do
fármaco e da estimulação elétrica no limiar de congelamento na SCPvl durante o teste da
retirada da cauda.
LRCs – grupo M20
+
animal -10 -5 0 10 15 20 25 30 35 40
1 3,3 3,3 3,5 3,7 1,6 1,2 1,8 0,8 0,9 0,9
2 3,2 3,5 2,6 5,2 5,3 4 5,2 4,4 4,9 3
3 3,5 3,2 3,2 6 3,7 3,7 2,4 3,5 3,1 3,4
4 2,9 3,1 2,8 2,7 2 2,5 2,4 2,4 2,9 2,6
5 2,7 2,4 3,3 3,9 3,1 3,5 2,8 3,1 2,9 3,4
6 2,5 2,4 2,6 4 3,4 3,3 3,3 3,5 3,3 2,4
7 3,5 2,6 2,8 3,3 2,4 2,5 2,7 2,8 2,3 2,2
8 3,2 3,4 3,3 3,7 3,4 3,4 2,8 2,9 3,3 3,3
9 3,3 3,2 3,5 3,3 2,7 3,2 3,2 3,4 3,8 3,4
10 3,1 3 3,4 2,8 2,7 2,3 2,2 2,2 2,4 2,3
MÉDIA 3,12 3,01 3,10 3,86 3,03 2,96 2,88 2,90 2,98 2,69
EPM 0,10 0,13 0,11 0,33 0,33 0,26 0,29 0,31 0,33 0,25
Anexos 107
Tabela 15 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção de salina e estimulação elétrica
no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo SAL
+
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 486 420 281 610 615 475 493 552 603 500 577 450
2 0 368 301 238 270 453 610 633 621 623 576 641 548
3 0 570 520 388 350 400 454 398 277 583 629 599 542
4 0 471 90 456 672 584 645 635 616 600 598 601 553
5 1 562 368 258 309 379 435 585 404 597 587 569 544
6 0 609 566 288 269 356 403 663 611 496 655 504 534
7 0 753 295 168 355 306 538 487 654 601 404 453 604
8 0 574 203 52 140 510 591 569 699 528 600 635 548
9 0 506 327 543 606 723 709 674 601 605 600 605 580
10 0 356 184 241 494 574 650 667 638 624 661 584 603
11 0 262 55 59 274 483 486 590 613 540 373 304 598
MÉDIA 0,00 501,5 302,6 270,2 395,4 489,4 545,1 581,3 571,5 581,8 562,1 552,0 554,9
EPM 0,00 41,12 49,16 45,52 52,18 38,12 30,64 26,75 37,08 12,58 28,99 29,81 13,16
Anexos
108
Tabela 16 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção salina, sem a estimulação
elétrica da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo SAL
-
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 532 292 326 471 705 640 600 600 600 600 600 558
2 1 617 593 439 663 697 688 571 635 620 606 496 623
3 0 552 478 463 580 583 688 581 602 600 513 578 600
4 0 587 486 537 653 687 702 636 597 635 595 601 600
5 0 565 329 334 443 576 709 679 516 691 627 650 407
6 0 468 208 126 556 551 527 599 543 607 498 600 318
7 0 528 20 197 374 654 669 501 606 600 607 600 600
8 0 431 171 217 468 673 724 688 713 447 600 613 455
MÉDIA 0 535,0 322,1 329,9 526,0 640,8 668,4 606,9 601,5 600,0 580,8 592,3 520,1
EPM 0 21,54 67,16 50,80 36,62 21,64 22,14 21,51 20,84 24,41 16,82 15,52 39,88
Anexos
109
Tabela 17 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção de naltrexona e estimulação
elétrica no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo NTX
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 521 556 406 565 665 563 481 600 608 489 600 417
2 0 537 509 442 304 601 576 672 626 629 600 600 584
3 0 678 406 600 152 629 636 667 657 687 616 566 611
4 0 461 92 129 433 517 587 702 657 631 443 454 581
5 0 692 603 578 537 758 657 638 645 646 466 607 600
6 1 444 90 161 525 579 600 666 616 605 600 600 609
7 0 565 385 559 430 527 523 705 634 504 634 625 587
8 0 597 572 551 601 641 719 706 586 697 640 697 637
9 0 650 593 417 537 604 660 727 644 614 640 597 620
10 0 539 413 598 592 595 642 672 636 577 638 606 503
MÉDIA 0,00 568,4 421,9 444,1 467,6 611,6 616,3 663,6 630,1 619,8 576,6 595,2 574,9
EPM 0,00 27,06 60,63 54,99 45,30 21,87 18,09 21,90 7,44 17,32 24,83 18,96 20,91
Anexos
110
Tabela 18 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção de cetanserina e estimulação
elétrica no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo KET
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 597 385 374 562 551 607 624 564 546 537 511 598
2 0 433 294 586 538 229 633 428 500 662 483 528 550
3 0 211 105 91 165 264 500 534 600 598 600 600 699
4 1 282 95 292 256 542 600 604 585 451 121 256 532
5 0 643 448 481 672 497 694 636 606 622 629 603 601
6 0 636 283 307 500 575 699 537 601 587 611 619 631
7 0 676 605 403 642 599 541 704 697 535 614 611 620
8 0 280 229 261 567 592 602 534 578 529 622 622 623
9 0 586 365 431 495 561 526 737 689 621 570 629 621
10 0 456 574 494 584 512 611 610 638 484 600 600 593
MÉDIA 0,00 480,0 338,3 372,0 498,1 492,2 601,3 594,8 605,8 563,5 538,7 557,9 606,8
EPM 0,00 54,63 55,00 44,59 51,46 42,25 20,77 28,59 18,40 20,94 48,54 35,83 14,47
Anexos
111
Tabela 19 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção após a microinjeção de salina e
estimulação elétrica no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo SAL
+
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 475 264 446 540 568 653 632 632 617 600 513 600
2 0 301 291 447 484 652 630 668 600 600 526 603 563
3 0 599 209 137 203 448 533 575 637 658 604 612 600
4 0 587 367 128 495 491 669 652 462 642 654 446 588
5 1 544 180 216 423 454 464 713 595 600 603 601 600
6 0 612 320 230 231 442 630 459 581 638 609 600 554
7 0 516 399 427 474 497 582 643 594 644 590 621 614
8 0 483 462 396 457 582 640 674 600 520 600 612 600
9 0 468 155 566 597 502 701 646 691 623 615 605 549
MÉDIA 0 509 272 267 396 509 597 617 585 626 599 563 584
EPM 0 31,8 34,5 52,4 44,2 23,8 24,5 24,6 20,5 13,7 11,1 19,8 7,9
Anexos
112
Tabela 20 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção de salina, sem a estimulação
elétrica da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo SAL
-
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 622 569 380 469 255 421 475 604 600 600 600 600
2 0 498 465 547 436 563 709 666 655 600 616 600 646
3 0 638 267 419 528 625 680 683 620 608 635 609 600
4 0 636 380 622 606 690 674 706 624 640 546 464 602
5 1 675 320 421 583 656 613 425 650 634 610 469 560
6 0 607 332 356 475 643 604 732 722 649 606 561 588
7 0 391 239 604 721 547 725 634 701 647 619 600 534
8 0 632 162 469 657 544 711 702 634 637 654 600 581
9 0 452 275 482 584 691 644 652 676 618 613 623 600
MÉDIA 0 572 334 478 562 579 642 631 654 626 611 570 590
EPM 0 33,1 41 31,8 31,3 44,8 31,1 35,7 13,1 6,55 9,78 20,2 10,3
Anexos
113
Tabela 21 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção após a microinjeção de
midazolam (10 nmoles) e estimulação elétrica no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo M10
+
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 612 695 649 694 766 706 725 690 668 666 610 427
2 0 699 349 625 644 772 726 733 693 631 604 663 335
3 0 727 500 185 270 601 660 637 661 672 679 682 560
4 0 538 216 341 589 602 628 630 652 630 608 596 568
5 0 439 164 548 288 578 469 627 582 490 600 600 600
6 0 484 296 385 597 671 554 567 609 673 600 595 578
7 0 628 331 402 686 671 677 649 660 568 610 600 560
8 1 609 451 583 464 733 704 754 621 660 608 590 551
9 0 419 555 480 431 389 470 579 639 447 434 607 600
10 0 381 446 262 309 286 525 334 565 545 471 559 552
11 0 490 426 370 706 652 573 608 615 639 484 600 600
MÉDIA 0,00 547,8 402,6 439,1 516,2 611,0 608,4 622,1 635,2 602,1 578,5 609,3 539,2
EPM 0,00 34,78 46,13 45,48 51,37 45,72 28,60 34,30 12,42 23,67 24,01 10,32 25,02
Anexos
114
Tabela 22 – Índice de nocicepção calculado a partir dos escores registrados após a microinjeção após a microinjeção de
midazolam (20 nmoles) e estimulação elétrica no limiar de congelamento da SCPvl durante o teste da formalina.
Índice de nocicepção – grupo M20
+
animal 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
1 0 627 301 367 462 524 743 683 662 563 669 620 437
2 0 606 543 498 466 662 671 621 648 600 626 600 512
3 0 675 194 378 765 648 784 679 637 606 600 600 527
4 0 578 71 155 447 617 550 424 608 605 610 643 527
5 1 510 439 566 579 599 570 601 697 581 403 601 511
6 0 725 605 486 601 696 636 644 578 605 605 603 586
7 0 514 215 438 624 620 756 710 720 621 650 652 635
MÉDIA 0,00 605,0 338,3 412,6 563,4 623,7 672,9 623,1 650,0 597,3 594,7 617,0 533,6
EPM 0,00 30,01 74,33 50,35 43,45 20,64 34,92 36,13 18,50 7,25 33,34 8,37 23,62
Anexos
115
Tabela 23 – Freqüência da resposta de entradas no labirinto em cruz elevado após tratamento com salina. Medidas tradicionais.
Grupo SAL
ANIMAL ABERTO FECHADO %fechado %aberto total entradas
1 0 7 100,00 0,00 7,00
2 1 3 75,00 25,00 4,00
3 1 7 87,50 12,50 8,00
4 4 7 63,64 36,36 11,00
5 0 7 100,00 0,00 7,00
6 2 3 60,00 40,00 5,00
7 2 5 71,43 28,57 7,00
8 1 6 85,71 14,29 7,00
9 2 8 80,00 20,00 10,00
10 4 9 69,23 30,77 13,00
MÉDIA 1,70 6,20 79,25 20,75 7,90
EPM 0,45 0,63 4,43 4,43 0,86
Anexos
116
Tabela 24 – Freqüência da resposta de entradas no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (10 nmoles).
Medidas tradicionais.
Grupo M10
ANIMAL ABERTO FECHADO %fechado %aberto total entradas
1 2 6 75,00 25,00 8,00
2 2 6 75,00 25,00 8,00
3 4 13 76,47 23,53 17,00
4 1 3 75,00 25,00 4,00
5 3 8 72,73 27,27 11,00
6 3 8 72,73 27,27 11,00
7 9 11 55,00 45,00 20,00
8 0 8 100,00 0,00 8,00
9 0 8 100,00 0,00 8,00
10 5 11 68,75 31,25 16,00
MÉDIA 2,90 8,20 77,07 22,93 11,10
EPM 0,85 0,92 4,29 4,29 1,59
Anexos
117
Tabela 25 – Freqüência da resposta de entradas no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (20 nmoles).
Medidas tradicionais.
Grupo M20
ANIMAL ABERTO FECHADO %fechado %aberto total entradas
1 5 12 70,59 29,41 17,00
2 2 12 85,71 14,29 14,00
3 1 14 93,33 6,67 15,00
4 11 15 57,69 42,31 26,00
5 3 8 72,73 27,27 11,00
6 1 8 88,89 11,11 9,00
7 2 4 66,67 33,33 6,00
8 0 5 100,00 0,00 5,00
9 3 8 72,73 27,27 11,00
10 2 11 84,62 15,38 13,00
MÉDIA 3,00 9,70 79,30 20,70 12,70
EPM 0,99 1,16 4,18 4,18 1,90
Anexos
118
Tabela 26 – Tempo de resposta de permanência nos braços do labirinto em cruz elevado após tratamento com salina. Medidas
tradicionais.
Grupo SAL
ANIMAL ABERTO FECHADO SOMA %t fechado %t aberto
1 0 287,9 300 95,97 0,00
2 10,3 285,5 300 95,17 3,43
3 23,6 219,8 300 73,27 7,87
4 2,4 250,6 300 83,53 0,80
5 0 289 300 96,33 0,00
6 18 265 300 88,33 6,00
7 23,6 267,1 300 89,03 7,87
8 1,9 170 300 56,67 0,63
9 18,4 253,1 300 84,37 6,13
10 28 245,7 300 81,90 9,33
MÉDIA 12,62 253,37 300 84,46 4,21
EPM 3,47 11,53 0,00 3,84 1,16
Anexos
119
Tabela 27 – Tempo de resposta de permanência nos braços do labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (10
nmoles). Medidas tradicionais.
Grupo M10
ANIMAL ABERTO FECHADO SOMA %t fechado %t aberto
1 13,7 235,2 300 78,40 4,57
2 40 202,4 300 67,47 13,33
3 28,3 205,7 300 68,57 9,43
4 5,5 271,4 300 90,47 1,83
5 24,7 233,2 300 77,73 8,23
6 28,8 232,3 300 77,43 9,60
7 105,8 121,9 300 40,63 35,27
8 0 256 300 85,33 0,00
9 0 278 300 92,67 0,00
10 46,5 152,9 300 50,97 15,50
MÉDIA 29,33 218,9 300 72,97 9,78
EPM 9,89 15,81 0,00 5,27 3,30
Anexos
120
Tabela 28 – Tempo de resposta de permanência nos braços do labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (20
nmoles). Medidas tradicionais.
Grupo M20
ANIMAL ABERTO FECHADO SOMA %t fechado %t aberto
1 69,2 183,4 300 61,13 23,07
2 20,9 251,1 300 83,70 6,97
3 6,2 262,4 300 87,47 2,07
4 108,1 128,4 300 42,80 36,03
5 24,3 214 300 71,33 8,10
6 19,8 250 300 83,33 6,60
7 12,6 262,8 300 87,60 4,20
8 0 278 300 92,67 0,00
9 17,9 246,5 300 82,17 5,97
10 20,3 235,7 300 78,57 6,77
MÉDIA 29,93 231,23 300 77,08 9,98
EPM 10,47 14,27 0,00 4,76 3,49
Anexos
121
Tabela 29 – Freqüência de respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com salina. Medidas
etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST: rastejamento;
LEV: levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB: imobilização.
Grupo SAL
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 3 27 4 2 0 7 0 6 5
2 8 16 1 0 0 7 1 2 3
3 4 33 7 1 0 4 0 16 0
4 5 30 7 1 0 13 5 7 8
5 11 33 0 2 2 13 0 3 3
6 5 23 4 0 1 9 2 0 4
7 1 24 4 1 0 7 1 1 10
8 2 25 5 0 0 5 0 3 10
9 10 35 8 0 2 15 1 1 0
10 6 29 10 0 2 8 2 2 0
MÉDIA 5,5 27,5 5 0,7 0,7 8,8 1,2 4,1 4,3
EPM 1,05 1,82 0,98 0,26 0,30 1,16 0,49 1,49 1,24
Anexos
122
Tabela 30 – Freqüência de respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (10
nmoles). Medidas etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST:
rastejamento; LEV: levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB:
imobilização.
Grupo M10
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 4 32 6 1 1 11 0 6 4
2 3 31 5 2 1 9 2 6 2
3 11 40 12 1 0 12 3 5 0
4 6 27 2 1 0 3 0 4 13
5 13 37 9 1 5 12 3 2 2
6 4 34 6 1 3 15 4 1 3
7 3 47 20 1 3 14 18 1 0
8 3 22 1 1 1 11 0 5 1
9 6 32 0 0 4 17 0 7 0
10 3 41 13 5 3 19 3 2 0
MÉDIA 5,6 34,3 7,4 1,4 2,1 12,3 3,3 3,9 2,5
EPM 1,14 2,29 1,97 0,43 0,55 1,41 1,71 0,71 1,25
Anexos
123
Tabela 31 – Freqüência de respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (20
nmoles). Medidas etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST:
rastejamento; LEV: levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB:
imobilização.
Grupo M20
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 4 26 19 1 0 12 9 9 0
2 4 24 7 0 0 16 4 7 0
3 0 25 5 0 0 15 0 7 0
4 4 37 24 0 0 21 20 0 0
5 2 26 9 1 0 11 3 8 0
6 6 31 10 0 0 8 3 4 4
7 8 39 5 3 2 12 4 11 2
8 5 29 2 2 2 11 0 5 5
9 5 27 6 0 1 12 0 4 0
10 6 37 7 1 4 17 0 6 0
MÉDIA 4,4 30,1 9,4 0,8 0,9 13,5 4,3 6,1 1,1
EPM 0,70 1,77 2,17 0,33 0,43 1,19 1,96 0,97 0,60
Anexos
124
Tabela 32 – Duração (s) das respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com salina. Medidas
etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST: rastejamento; LEV:
levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB: imobilização.
Grupo SAL
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 32,7 189,7 11,3 3,3 0 22,9 0 22,9 14,2
2 154,7 108,5 6,6 0 0 19,4 1,8 3,9 5,1
3 30,1 218 15 1 0 5,9 0 30 0
4 58,9 142,6 13,5 1,1 0 28,3 19,4 11,4 19,3
5 13,9 235,6 0 2 3 29,7 0 5,2 10,6
6 90,6 164,1 4,1 0 0,9 19,7 5,1 0 15,5
7 8,7 142,7 10,6 1 0 13 5 1 118
8 20,5 186,9 9,6 0 0 7,8 0 2,3 72,9
9 96,6 141,1 8 0 2,3 50,1 1 0,9 0
10 45 220,5 13,5 0 2 12,8 2,7 3,5 0
MÉDIA 55,17 174,97 9,22 0,84 0,82 20,96 3,5 8,11 25,56
EPM 14,60 13,22 1,48 0,35 0,37 4,11 1,87 3,26 12,32
Anexos
125
Tabela 33 – Duração (s) das respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (10
nmoles). Medidas etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST:
rastejamento; LEV: levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB:
imobilização.
Grupo M10
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 49,4 172,4 8,9 1,3 0,6 20,9 0 5,9 40,6
2 25 227 5,2 5,8 1,1 14,1 6,1 10,5 5,2
3 59,5 202,2 8,8 0,4 0 15 10,1 4 0
4 22,6 132,3 3,1 0,7 0 3,5 0 3,2 132,3
5 76,1 178,3 9,9 1,6 6,7 16,4 6,4 2 2,6
6 32,6 184,6 6,1 1,1 2,4 27,4 11,7 0,7 33,4
7 3,1 201,6 27,3 2 3 21 39 3 0
8 31,4 224,6 2,1 0,7 2,7 31,2 0 6,5 0,8
9 36,9 212,5 0 0 3,4 37,9 0 9,3 0
10 6,8 208,1 25,5 5,7 3,4 36,4 11,6 2,5 0
MÉDIA 34,34 194,36 9,69 1,93 2,33 22,38 8,49 4,76 21,49
EPM 7,13 9,01 2,96 0,66 0,64 3,43 3,73 1,02 13,20
Anexos
126
Tabela 34 – Duração (s) das respostas comportamentais no labirinto em cruz elevado após tratamento com midazolam (20
nmoles). Medidas etológicas. AL: autolimpeza; ESQ: esquadrinhamento; MC: mergulho de cabeça; EST: esticamento; RAST:
rastejamento; LEV: levantamento; EEBA: exploração na extremidade dos braços abertos; ESP: espreitamento e IMOB:
imobilização.
Grupo M20
ANIMAL AL ESQ MC EST RAST LEV EEBA ESP IMOB
1 34,2 131 61,4 2,4 0 32,7 20,9 17,4 0
2 56 154 22,2 0 0 41,2 8,9 17,7 0
3 0 237,1 15,9 0 0 35,9 0 11,1 0
4 23,3 116,1 37,1 0 0 66 57,5 0 0
5 3,9 203,8 19 0,7 0 32,8 15 24,8 0
6 17,1 193,9 20,2 0 0 21 5,9 6,4 35,5
7 35,1 200,7 4 6,5 2,7 20,1 10 17,6 3,3
8 43 204,5 2,8 2,4 2,9 22,7 0 6,4 15,3
9 45,2 198,1 7,6 0 0,9 44,6 0 3,6 0
10 40,8 199,8 7,2 1,2 5,2 39,2 0 6,6 0
MÉDIA 29,86 183,9 19,74 1,32 1,17 35,62 11,82 11,16 5,41
EPM 5,80 11,91 5,67 0,65 0,58 4,33 5,56 2,49 3,67
Anexos
127
Tabela 35 – Freqüência e duração (s) de respostas comportamentais no campo aberto após tratamento com salina em 30
minutos.
Grupo SAL
AUTOLIMPEZA CRUZAMENTO LEVANTAMENTO IMOBILIZAÇÃO
ANIMAL FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR
1 21 331,1 79 122,4 32 70,5 41 738,2
2 21 327,7 69 150,9 14 21,5 20 636,8
3 11 198,2 78 58,9 21 33,4 93 618,7
4 9 128 33 45,2 9 19,9 32 724,4
5 18 171 67 38 46 97 78 1128,3
6 12 227 139 55,1 52 125,5 58 534,3
7 19 244,8 61 23,6 13 38,8 74 1113,4
8 12 121,25 58 21,4 30 121,6 49 967,1
9 16 147 98 31,9 31 62,2 35 935,5
10 36 632 69 25,7 44 150,5 61 542,6
11 10 157,6 99 36,8 58 159,7 60 888,7
12 16 272 75 27,2 38 117,3 48 917,6
13 12 153,7 127 54,2 42 130 47 687,4
14 7 67,5 91 30,5 62 107,3 43 1131,7
15 7 43,7 90 31,2 18 45,8 44 1132,8
16 14 304,2 56 18 19 36,9 49 1164
17 4 66,4 50 18,5 12 20,2 25 1272,2
MÉDIA 14,41 211,36 78,76 46,44 31,82 79,89 50,41 890,22
EPM 1,81 34,06 6,51 8,86 4,09 11,81 4,60 58,49
Anexos
128
Tabela 36 – Freqüência e duração (s) de respostas comportamentais no campo aberto após tratamento com midazolam (20
nmoles) em 30 minutos.
Grupo M20
AUTOLIMPEZA CRUZAMENTO LEVANTAMENTO IMOBILIZAÇÃO
ANIMAL FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR
1 13 158,4 130 63,8 44 84,6 25 876,7
2 34 358,6 255 82,5 34 55,8 94 619,3
3 20 449,7 60 19,8 19 24,6 56 1028
4 4 65,3 146 51,1 24 220,9 51 1025,8
5 12 165,6 151 45,7 50 127,8 44 995,7
6 13 250,7 44 11,6 21 61,1 42 1324,4
7 9 195,5 72 31 22 70,5 39 1134,7
MÉDIA 15,00 234,83 122,57 43,64 30,57 92,19 50,14 1000,7
EPM 3,65 49,44 27,43 9,43 4,66 24,51 8,19 82,37
Anexos
129
Tabela 37 – Freqüência e duração (s) de respostas comportamentais no campo aberto após tratamento com midazolam (30
nmoles) em 30 minutos.
Grupo M30
AUTOLIMPEZA CRUZAMENTO LEVANTAMENTO IMOBILIZAÇÃO
ANIMAL FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR FREQ DUR
1 5 91,6 83 25 35 60,9 59 1235,8
2 4 135,3 125 42,5 38 84,6 51 959,5
3 11 184,2 30 10,8 6 11,3 24 1349,5
4 4 53,3 56 17,6 12 23,2 68 1498,5
5 15 122,3 34 9,3 15 25,3 70 1467,3
6 16 253,4 83 29,1 22 61,1 48 1154,3
7 11 81 83 31,5 13 28,4 67 1348,5
MÉDIA 9,43 131,59 70,57 23,69 20,14 42,11 55,29 1287,6
EPM 1,94 25,82 12,56 4,51 4,60 10,11 6,13 71,12
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