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ESTUDO DA QUALIDADE FISIOLÓGICA,
BIOQUÍMICA E ULTRA-ESTRUTURAL,
DURANTE O DESENVOLVIMENTO E A
SECAGEM DE SEMENTES DE SOJA
PAULO DE ALBUQUERQUE SILVA
2006
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PAULO DE ALBUQUERQUE SILVA
ESTUDO DA QUALIDADE FISIOLÓGICA,
BIOQUÍMICA E ULTRA-ESTRUTURAL, DURANTE
O DESENVOLVIMENTO E A SECAGEM DE
SEMENTES DE SOJA
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Programa de
Pós - Graduação em Agronomia, área de
concentração Fitotecnia, para a obtenção do título
de “Doutor”.
Orientador
Prof. Dr. João Almir Oliveira
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos
da Biblioteca Central da UFLA
Silva, Paulo de Albuquerque
Estudo da qualidade fisiológica, bioquímica e ultra-estrutural, durante o
desenvolvimento e a secagem de sementes de soja / Paulo de Albuquerque Silva
. –
Lavras: UFLA, 2006.
55 p. : il.
Orientador: João Almir Oliveira.
Tese (Doutorado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Tolerância à dessecação. 2. Ultra estrutura. 3. Enzimas. 4. Proteinas
termotolerantes. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD-633.3421
PAULO DE ALBUQUERQUE SILVA
ESTUDO DA QUALIDADE FISIOLÓGICA, BIOQUÍMICA E
ULTRA-ESTRUTURAL, DURANTE O DESENVOLVIMENTO E A
SECAGEM DE SEMENTES DE SOJA
Tese apresentada à Universidade Federal de
Lavras, como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração Fitotecnia, para obtenção do título
de “Doutor”.
APROVADA, em 10 de outubro de 2006
Prof. Dr. João Almir Oliveira
UFLA
(Orientador
)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
Dr. Antônio Rodrigues Vieira EPAMIG
Prof. Dr. Renato Mendes Guimarães UFLA
Dra. Solange Carvalho Barrios Roveri José Pesquisadora CNPq
Dr. Edvaldo Aparecido Amaral da Silva Pesquisador CAPES
A minha mãe, Maria Nazaré (In memorian),
OFEREÇO
A minha querida Kênia,
Aos meus irmãos, Ângela, Iara, Sandra, Givago,
Eliane e Jerônimo,
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida.
A minha mãe, pela certeza de sua presença em tudo que acontece
em minha vida.
Aos meus irmãos, Ângela, Iara, Sandra, Givago, Eliane e
Jerônimo, por compreenderem a distancia e pelos incentivos.
A minha querida Kênia, pela companhia, carinho, compreensão e
ajuda na condução desse trabalho.
Ao Professor João Almir, pela amizade, confiança, ensinamentos e
orientação.
Aos Professores do LAS, Laene, Édila, Renato e aos
pesquisadores Antônio e Sttela, pelos ensinamentos e demonstração do
que é trabalho em equipe.
Ao Pesquisador Edivaldo Aparecido Amaral da Silva, pelas
correções na tese e revisão dos Abstracts.
À Elza, Dalva, Elenir e Andréa pela amizade e ajuda.
Aos meus grandes amigos, Lucrêcio, Zezinho, Renata, André,
Patrícia e Flávia, pela companhia.
Aos amigos de república, Tobias, Gustavo, João e Rooveth, pelo
convívio harmonioso.
A turma do LAS, doutorandos, mestrandos, bolsistas e estagiários,
pela convivência e ajuda na condução deste trabalho.
A Universidade Federal de Lavras (UFLA) e Coordenação de
Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Superior (Capes), pela
oportunidade de crescimento.
SUMÁRIO
Página
RESUMO.............................................................................................................i
ABSTRACT ......................................................................................................iii
ARTIGO 1: Qualidade fisiológica e sintese de proteínas resistentes ao calor
durante o desenvolvimento e secagem de sementes de soja ...............................1
RESUMO............................................................................................................1
ABSTRACT .......................................................................................................3
1 INTRODUÇÃO...............................................................................................4
2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................7
Teste de germinação..............................................................................8
Teste de emergência em condições controladas....................................8
Teste de frio...........................................................................................9
Teste de condutividade elétrica.............................................................9
Análise de proteínas resistentes ao calor.............................................10
Delineamento experimental e análise estatística.................................10
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................10
4 CONCLUSÕES .............................................................................................13
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................17
ARTIGO 2: Estudo de alguns sistemas enzimáticos durante o desenvolvimento
e secagem de sementes de soja .........................................................................20
RESUMO..........................................................................................................20
ABSTRACT .....................................................................................................21
1 INTRODUÇÃO.............................................................................................22
2 MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................24
Teste de germinação. ...........................................................................25
Teste de condutividade elétrica ...........................................................26
Analise de enzimas...............................................................................26
Delineamento experimental e análise estatística...............................26
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................27
4 CONCLUSÕES .............................................................................................32
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................32
ARTIGO 3: Análise ultra-estrutural e fisiológica durante o desenvolvimento e
secagem de sementes de soja ...........................................................................35
RESUMO..........................................................................................................35
ABSTRACT......................................................................................................37
1 INTRODUÇAO..............................................................................................38
2 MATERIAL E METODOS............................................................................39
Teste de Germinação............................................................................40
Teste de Emergência em condições controladas..................................41
Teste de frio..........................................................................................41
Teste de condutividade elétrica............................................................41
Microscopia eletrónica de varredura....................................................41
Delineamento experimental e análise estatística..................................42
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................42
4 CONCLUSÕES...............................................................................................45
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................53
i
RESUMO
SILVA, P.de A. Estudo da qualidade fisiológica, bioquímica e ultra-
estrutural durante o desenvolvimento e a secagem de semente de soja. Ufla,
2006. 56p. (Tese – Doutorado em Fitotecnia)
1
Durante o desenvolvimento e secagem, vários mecanismos de proteção atuam na
manutenção da qualidade fisiológica de sementes. Estudos de tolerância à
dessecação vem sendo objeto de estudo para o entendimento dos eventos
associados com a maturação de sementes ortodoxas, como a soja. Dentre os
diversos mecanismos atuantes na tolerância a dessecação, a atividade de
proteínas resistentes ao calor, associada com açúcares não redutores e sistemas
enzimáticos neutralizadores de radicais livres têm recebido uma atenção especial
no meio científico. A manutenção da integridade de membranas celulares talvez
seja a principal função destes mecanismos, sendo o seu estudo indicativo da
efetividade da proteção promovida por estes. Nesse trabalho foi estudada a
qualidade fisiológica, bioquímica e ultra-estrutrural durante o desenvolvimento e
secagem de sementes de soja. Avaliou-se a qualidade fisiológica por meio de
testes de germinação, emergência em condições controladas, teste de frio e
condutividade elétrica. Para as avaliações bioquímicas estudou-se a atividade de
proteínas resistentes ao calor, álcool desidrogenase (ADH), malato
desidrogenase (MDH), superóxido dismutase (SOD) e catalase (CAT). As
avaliações de ultra-estrutura foram feitas por meio de microscopia eletrônica de
varredura (MEV). Concluiu-se que A síntese de proteínas resistentes ao calor é
induzida pela diminuição no conteúdo de água das sementes, seja naturalmente
ou artificialmente, a partir de 60% de umidade. A síntese de proteínas resistentes
ao calor está diretamente relacionada com a qualidade fisiológica das sementes
1
Comitê Orientador: João Almir Oliveira – UFLA (Orientador), Édila Vilela de Resende
Von Pinho – UFLA e Stella Dellizete Veiga Franco da Rosa – EMBRAPA.
ii
de soja. A SOD é ativa durante o desenvolvimento e a secagem de soja. A
catalase só é efetiva após o ponto de maturidade fisiológica em sementes de
soja. A atividade da MDH é constante durante a secagem de sementes de soja,
porém, a atividade da ADH é intensificada. A semente de soja torna-se tolerante
à dessecação quando possui em torno de 30% de teor de água. A secagem em
sementes de soja com teor de água acima de 30%, provoca danos de membrana
que diminuem a qualidade fisiológica das sementes. Os maiores valores de
germinação em sementes de soja são alcançados quando estas atingem cerca de
30% de grau de umidade. Os maiores valores de vigor em sementes de soja são
alcançados quando estas atingem cerca de 40% de grau de umidade no campo.
iii
ABSTRACT
SILVA, P.de A. Physiological, biochemical and ultra structural studies
during the development and drying of soybean seeds. 2006. 56p. (Thesis –
Doctorate in Plant Science)
2
During the development and drying, several protection mechanisms act on the
maintenance of the physiological quality of the seeds. Studies on desiccation
tolerance allow the understanding of the events associated with the maturation of
orthodox seeds, such as soybean. Among the mechanism involved on
desiccation tolerance, the activity of heat-resistant proteins associated with non-
reducing sugars and enzymatic systems that neutralize free radicals have
received a special attention. Thus, this work studied the physiological,
biochemical and ultra-structural changes during soybean seed development and
drying. Physiological quality was evaluated by means of germination tests,
emergence under controlled conditions, cold test and electrical conductivity. For
the biochemical studies the activity of heat-resistant proteins, the enzymes
alcohol dehydrogenase (ADH), malate dehydrogenase (MDH), superoxide
dismutase (SOD) and catalase (CAT) were evaluated. The ultra structural study
was performed by means of scanning electron microscopy (SEM). The results
showed that synthesis of heat-resistant proteins was induced by the decreasing
water content of the seeds naturally or artificially starting from 60% of moisture
content. The heat-resistant protein synthesis was directly related to the
physiological quality of soybean seeds. Soybean seeds become tolerant to
desiccation when the seeds posses around 30% of moisture content.
The results
showed that SOD was active during development and drying of soybean
2
Guidance Committee: João Almir Oliveira – UFLA (Adviser), Édila Vilela de Resende
Von Pinho – UFLA and Stella Dellizete Veiga Franco da Rosa – EMBRAPA.
iv
seeds. The activity of MDH was constant during seed drying, whereas
the activity of ADH was higher. Catalase was only effective after
physiological maturity of soybean seeds. Drying of seeds with moisture
content above 30%, caused reduction of cellular volume, disorganization
of the cell walls and decrease in physiological quality of the seeds. Higher
values of germination were observed in seeds with 30% of moisture
content in the field, whereas higher values of vigor were observed in
seeds with 40% of moisture content in the field.
1
Tolerância à dessecação em sementes de soja
QUALIDADE FISIOLÓGICA E SÍNTESE DE PROTEÍNAS
RESISTENTES AO CALOR DURANTE O DESENVOLVIMENTO E A
SECAGEM DE SEMENTES DE SOJA
Preparado de acordo com as normas da Revista Brasileira de Sementes
RESUMO
As sementes ortodoxas, como a da soja, desenvolvem vários mecanismos de
proteção que permitem a diminuição no seu teor de água, sem que haja grandes
perdas na sua qualidade fisiológica. As proteínas resistentes ao calor vêm sendo
utilizadas como sinal do desenvolvimento de tolerância à dessecação em várias
espécies, já que essas diminuem os danos provocados por perda de água. Neste
trabalho foi estudado o desenvolvimento da tolerância à dessecação de sementes
de soja na fase final de seu desenvolvimento. Para isso, foram colhidas sementes
em diferentes estádios de desenvolvimento, que foram submetidas a diferentes
tratamentos de secagem. Depois de serem submetidas aos tratamentos, as
sementes foram avaliadas quanto a sua qualidade fisiológica por meio dos testes
de germinação, de frio, de emergência em condições controladas e de
condutividade elétrica. Para o estudo de tolerância à dessecação estudou-se a
síntese de proteínas resistentes ao calor por meio de eletroforese, durante o
desenvolvimento e a secagem artificial das sementes. Concluiu-se que a síntese
de proteínas resistentes ao calor é induzida pela diminuição no conteúdo de água
das sementes, seja naturalmente ou artificialmente, a partir de 60% de umidade.
A síntese de proteínas resistentes ao calor está diretamente relacionada com a
qualidade fisiológica das sementes de soja. Os maiores valores de germinação
em sementes de soja são alcançados quando estas atingem cerca de 30% de grau
2
de umidade no campo e os maiores valores de vigor em sementes de soja são
alcançados quando estas atingem cerca de 40% de grau de umidade no campo.
Termos para indexação: Germinação, eletroforese, tolerância à dessecação.
3
Desiccation tolerance in soybean seeds
PHYSIOLOGICAL QUALITY AND HEAT-RESISTANT
PROTEINS SYNTHESIS DURING DEVELOPMENT AND
DRYING OF SOYBEAN SEEDS
ABSTRACT
Orthodox seeds, such as soybean, develop a number of protection mechanisms
which allow decrease in their water content without occurring large loses in their
physiological quality. The heat-resistant proteins have been used as a signal for
development of desiccation tolerance in several species, since these proteins
decrease the damages caused by water loss. In this work, was studied the
development of desiccation-tolerance of soybean seeds in the late stage of
development. Therefore, seeds at different developmental stages were collected
and were submitted to different drying treatments. After that, the seeds were
evaluated regarding their physiological quality by means of germination, cold
test, emergence under controlled conditions and electric conductivity. Synthesis
of heat-resistant proteins was studied by means of electrophoresis during
development and artificial drying of seeds. The results showed that synthesis of
heat-resistant proteins was induced when the water contents of seeds decreased
naturally or artificially, from 60% of water content. The synthesis of heat-
resistant proteins is directly related with the physiological quality of soybean
seeds. The seeds with 30% of moisture content showed higher germination
percentage, whereas higher values of vigor was observed when seeds had 40%
of moisture content
Index terms: Germination, electrophoresis, desiccation-tolerance,
4
1 INTRODUÇÃO
A soja, nos últimos 10 anos, tornou-se a maior geradora de divisas do
agronegócio brasileiro, ocupando uma área de 21,24 milhões de hectares e com
produção, em 2005/2006, de, aproximadamente, 51 milhões de toneladas de
grãos. Novas aplicações, como a produção de biodíesel e H-bio, são sinais claros
da necessidade presente do aumento da produção desse grão. Todo complexo
agroindustrial da soja movimenta, no Brasil, mais 30 bilhões de dólares (IBGE,
2006).
A produção brasileira de sementes de soja, na safra 2005/2006, foi de,
aproximadamente, 1 milhão de toneladas. A demanda por sementes de
qualidade deve sofrer um incremento nos próximos anos, já que será necessária
uma grande expansão da área plantada para suprir a demanda de empresas do
setor energético, como a Petrobrás.
O estudo da ativação de mecanismos de tolerância à dessecação tem sido
usado como ferramenta para o conhecimento do desenvolvimento da semente,
seja para a antecipação da colheita, como já é feito no milho, ou a aplicação de
dessecantes, como é proposto para a soja.
Durante o desenvolvimento, as sementes passam pela fase de
histodiferenciação, em que há um aumento na massa fresca e na deposição de
reserva, acompanhado por um rápido aumento na massa seca durante a
maturação. O acúmulo de massa seca cessa e o de massa fresca diminui, a partir
do ponto de maturidade fisiológica. Após a histodiferenciação e antes da
secagem na maturação, as sementes adquirem a habilidade para germinar e
tolerar a dessecação. Em sementes em desenvolvimento, a concentração de ABA
diminui próximo ao final do desenvolvimento, enquanto a tolerância à
dessecação é aumentada (Pammanter et al., 1994)
Em soja, as fases de desenvolvimento são divididas em estágio
vegetativo (V1, V2... Vn) e estágio reprodutivo (R1, R2, R3,..., R8) (Fehr &
5
Caviness, 1979). No estágio reprodutivo, o R7 marca o ponto de maturidade
fisiológica, que é caracterizado pelo máximo acúmulo de matéria seca na
semente, com teor de água variando de 50% a 60% (Howell et al., 1959). Nesse
estágio a semente se desliga da planta–mãe. Cessando o aporte de nutrientes,
inicia-se um processo lento de perda de água, até atingir o estágio R8, com cerca
de 13% de água. Na transição do estágio R7 ao R8, o metabolismo de
mecanismos de tolerância à dessecação é intensificado e a semente passa a
tolerar altas temperaturas de secagem (Oliver & Bewley, 1997)
A grande dificuldade em trabalhos comparativos de taxas de secagem é
o conceito de conteúdo crítico de água, abaixo do qual a viabilidade é perdida.
Na maioria das espécies estudadas o tempo gasto para a perda de água, bem
comoa temperatura de secagem são ignorados e estes são, provavelmente, os
fatores mais importantes para o desenvolvimento de mecanismos de tolerância à
dessecação (Pammenter & Berjak, 1999)
A taxa de secagem influencia a resposta à desidratação de sementes
ortodoxas em desenvolvimento e tecidos vegetativos. Em ambos os casos, a
secagem lenta promove uma melhor tolerância à desidratação, presumivelmente,
devido ao tempo suficiente, que é concedido para a indução e a operação dos
mecanismos de proteção. Oliver & Bewley (1997) sugeriram que a secagem
rápida impede os processos de recuperação e é necessário mais tempo para os
reparos na reidratação. Com o objetivo de estudar os danos causados por
secagem, armazenamento ou mesmo estudo do desenvolvimento de sementes,
muitos pesquisadores vêm utilizando técnicas moleculares, a fim de obter
entendimento sobre atividades enzimáticas e protéicas na proteção da semente.
A eletroforese é uma técnica bastante difundida nos estudos
bioquímicos, devido a sua simplicidade, rapidez e alto valor informativo.
Segundo Alfenas et al. (1998), esta técnica baseia-se na separação de
macromoléculas ionizadas, de acordo com suas cargas elétricas, formas e pesos
6
moleculares, por meio da migração em um meio suporte e tampões adequados,
sob a influência de um campo elétrico. Dentre as moléculas estudadas por esta
técnica, destacam-se as proteínas tolerantes ao calor, como as LEAs, por
apresentarem papel importante na tolerância à dessecação em sementes
ortodoxas.
Segundo Kermode (1997), a regulação da expressão dos genes LEA,
provavelmente, envolve componentes de outras vias de tradução de sinais, além
do ABA. Proteínas LEA são tipicamente acumuladas durante as fases finais da
embriogênese ou em resposta a desidratação, baixa temperatura, salinidade ou
tratamento exógeno de ABA, indicando a sua função na desidratação celular.
São distribuídas amplamente entre as mono e dicotiledôneas e muitas e
diferentes formas moleculares foram isoladas.
Proteínas LEA são caracterizadas por uma composição parcial de
aminoácido altamente hidrofílica solúvel em água e por sua elevada estabilidade
a altas temperaturas. Foi proposto que estas proteínas possuem papel de proteção
das estruturas citoplasmáticas durante a desidratação. Elas foram divididas em
grupos co base em suas propriedades bioquímicas e nas semelhanças de função
(Ingram & Bartels 1996). As proteínas LEA do grupo 2, também chamadas
dehidrinas, são as mais estudadas, sendo encontradas associadas com algumas
moléculas. Devido a sua natureza anfipática, estas inibem a desnaturação de um
grande número de macromoléculas e estabilizam estruturas intracelulares sob
estresse hídrico severo. De acordo com Walters et al. (1997), essas proteínas
podem ainda associarem-se com açúcares, tamponando a perda de água durante
a secagem na maturação.
A habilidade ou a falta de algum fator para expressar LEAs ou proteínas
semelhantes a dehidrinas por si só não pode ser tomadas como indicativos de
que a semente de uma espécie em particular possa ou não resistir à desidratação.
Ou seja, a tolerância à dessecação é o resultado de uma interação de mais de um
7
mecanismo ou processo, embora a variável expressão das dehidrinas em
sementes recalcitrantes possa estimar alguma extensão da variável grau de
tolerância a dessecação, exibida sob um grau de circunstâncias particulares
(Pammenter & Berjak, 1999).
Dessa forma, no presente trabalho, foi estudada a presença de proteínas
resistentes ao calor como mecanismo de tolerância à dessecação, bem como a
qualidade fisiologica de sementes de soja durante seu desenvolvimento e
secagem.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Análise de Sementes (LAS)
e na área experimental do Departamento de Agricultura (DAG) da Universidade
Federal de Lavras (UFLA), no município de Lavras, MG.
O experimento de campo foi conduzido na safra 2005/2006. Após
análise de solo, foram feitas correções de fertilidade e pH, segundo
recomendações da Embrapa para Minas Gerais. Solo e adubação: o tipo de solo
predominante era Latossolo Vermelho Escuro. As características químicas e
físicas foram determinadas pelo Laboratório de Análise de Solo do
Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras. Com base
nos resultados obtidos, foram feitas correções de fertilidade e pH para uma
produtividade estimada de 2500 kg/ha. Cultivar: foi utilizada a Cultivar
MG/BR 46 (Conquista) recomendada para o estado de Minas Gerais. Instalação
e condução do experimento: em solo preparado de maneira convencional, as
parcelas foram instaladas com espaçamento de 0.45 m entre linha e 15 plantas
por metro linear. Cada parcela constituía-se de 20 linhas de 10 metros
totalizando 9 m
2
, sendo as 18 linhas centrais de cada parcela consideradas
úteis. Controles de plantas invasoras, de pragas e doenças foram feitas
sempre que necessários.
Colheita de sementes: o desenvolvimento de
8
mecanismos de tolerância à dessecação foi avaliado, utilizando-se sementes em
diferentes estágios fenológicos. Utilizou-se a escala de Caviness (Fehr &
Caviness, 1979) como critério para colheita e caracterização das vagens
colhidas, sendo a primeira colheita feita quando as sementes estavam no estágio
R6, que caracteriza-se por vagens com sementes verdes, porém, totalmente
formadas. A partir do R6, foram feitas colheitas a cada cinco dias, até que estas
atingissem cerca de 12% de conteúdo de água no campo. As vagens colhidas
foram debulhadas manualmente e as sementes levadas a secadores de pequena
escala, construídos de acordo com Navratil & Burris (1982). Foram utilizadas
temperaturas constantes de 35ºC e 45ºC, até que as sementes atingissem 12% de
grau de umidade e uma alternada iniciando com 35ºC, até que as sementes
alcançassem um conteúdo médio de água de 20%, quando, então, a temperatura
foi elevada para 45ºC, até as sementes alcançarem conteúdo de água em torno de
12%. No momento da colheita e após as sementes atingirem 20% e 12% de grau
de umidade, foram retiradas amostras de sementes para serem avaliadas quanto
ao conteúdo de água, qualidade fisiológica e desenvolvimento de tolerância à
dessecação por meio da avaliação de proteínas resistentes ao calor.
Determinação do grau de umidade: o grau de umidade inicial foi mensurado
utilizando-se o método da estufa a 130ºC, por 2 horas, com duas repetições para
cada avaliação, segundo as Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992). Os
resultados foram expressos em porcentagem. Teste de germinação: foram
utilizadas quatro repetições de 50 sementes, por tratamento, em rolos de papel
tipo “Germitest” à temperatura de 25ºC. A quantidade de água adicionada foi de
2,5 vezes o peso do papel, visando umedecimento adequado e uniformização do
teste. As contagens foram feitas no 4º e 7º dias após a semeadura. Teste de
emergência em condições controladas: a semeadura foi realizada em bandejas
plásticas contendo, como substrato, solo + areia, na proporção 1:2. Foram
utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento. Após a semeadura,
9
as bandejas foram mantidas em câmara de crescimento vegetal, à temperatura de
25
o
C, em regime alternado de luz e escuro (12 horas). Foi considerada a
porcentagem de plântulas normais aos 14 dias.
Condutividade elétrica: foi
utilizada a quantificação em massa, com quatro repetições de 50 sementes por
tratamento. As sementes foram pesadas com precisão de duas casas decimais e,
em seguida, colocadas em copos plásticos descartáveis com 75mL de água
deionizada. Após 24 horas de embebição à temperatura de 25ºC, a condutividade
elétrica foi determinada com auxílio de um condutivímetro com resultados
expressos em µS/cm/g, de acordo com o método descrito por Krzyzanowski et
al. (1999). Teste de frio: foram utilizadas caixas plásticas com uma mistura de
areia e terra (2:1), com quatro repetições de 50 sementes cada. Uma quantidade
de 4.000g da mistura areia e solo, juntamente com adição da quantidade de água
calculada para 70% da capacidade de retenção, foi colocada em cada caixa. Em
seguida, essas caixas foram colocadas em câmara previamente regulada a 10ºC,
onde permaneceram por cinco dias. Após esse período, as caixas foram
transferidas para uma câmara de germinação à temperatura de 25ºC por sete dias
para a emergência das plântulas. A avaliação foi realizada considerando somente
as plântulas normais emergidas (Krzyzanowski et al., 1999). Análises de
proteínas resistentes ao calor: foram utilizadas duas repetições de 11 eixos
embrionários de sementes colhidas em cada período. Os eixos embrionários
foram moídos em cadinho (sob gelo), adicionando-se tampão de extração
descrito por Alfenas (1998), na proporção de 10 partes de tampão para 1 de
amostra. As amostras foram centrifugadas a 16.000xg por 30 minutos, a 4ºC. O
sobrenadante foi separado e incubado em banho-maria a 85ºC, por 10 minutos.
Em, seguida repetiu-se a centrifugação como descrito anteriormente, recolheu-se
o sobrenadante e procedeu-se à corrida eletroforética descrita por Alfenas
(1998). A coloração dos géis foi feita utilizando-se solução de Coomassie Blue
0,05% por 12 horas e solução de ácido cítrico para descoloração. Delineamento
10
experimental e análise estatística: utilizou-se delineamento experimental em
blocos casualizados, com quatro repetições arranjados em esquema fatorial
(6x3x3), em que foram avaliadas 6 épocas de colheitas (65%, 60%, 50%, 40%,
30%, 22% de teor de água nas sementes), 3 temperaturas de secagem (35, 45 e
35/45 ºC), três tratamentos de secagem (sem secagem, secagem até 20% de teor
de água, secagem até 12% teor de água). Para as variáveis germinação,
emergência em condições controladas, condutividade elétrica e teste de frio
foram realizados estudos de regressão.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise de variância, observou-se diferença significativa para a
interação estádio de desenvolvimento e tratamento de secagem, para todas as
variáveis analisadas, não sendo observada diferença significativa entre as
temperaturas de secagem (Tabela 1).
A germinação foi crescente, durante os três tratamentos de secagem de
secagem, na medida que a umidade de colheita das sementes foi diminuindo. Os
mecanismos responsáveis pela tolerância à dessecação parecem não estar
presentes ou ativos nas sementes com 65% de teor de água, levando-as a perder
totalmente sua viabilidade após secagem. As bandas de proteínas LEA neste
estádio são, em sua maioria, ausentes (Figura 2 A), comparando-se com o
padrão de bandas no estádio tolerante à dessecação, que foi a partir de 30% de
umidade (Figura 2 E). Green et al., citados por Marcos Filho (1979), relataram
prejuízos na germinação e vigor de sementes de soja colhidas precocemente.
A partir de 60% de grau umidade, já pôde ser observado o surgimento de
bandas no final da secagem (Figura 2 B), fato que poderia explicar a manutenção
da germinação de uma pequena porcentagem de sementes, ainda que insipiente
(Figura 1). O surgimento destas bandas mostra que a secagem também induz à
síntese desta proteína. A indução do surgimento de LEA durante a secagem
11
também foi observada por Herter & Burris (1989) e Faria (2003), em sementes
de milho com alto conteúdo de água. Veiga (2005) observou o surgimento de
novas bandas quando as sementes de soja com 50% de grau de umidade foram
submetidas à secagem.
Com 50 % de grau de umidade, foi possível submeter as sementes a uma
secagem até 20% de teor de água, sem causar prejuízo para a germinação
(Figura 1). Segundo Kermode et al. (1989), o sinal indicativo da mudança de
estágio de desenvolvimento para germinação é a redução no teor de água nas
sementes. Nesse estádio e nos estádios posteriores, foi observada uma nova
banda robusta de proteína resistente ao calor (Figura 2 C) e, ao contrario das
bandas observadas nos estádios nos quais as sementes possuíam 65% e 60% de
grau de umidade (Figura 2 A e B), estas são presentes antes da secagem, o que
permitiu inferir a indução desta proteína antes da maturação da semente.
Blackman et al. (1995), estudando o desenvolvimento de tolerância à dessecação
em soja e Faria et al. (2004), em milho, encontraram resultados semelhantes,
concluindo que as LEAs são induzidas pelo desenvolvimento e, artificialmente,
por secagem.
A indução da germinação pela secagem foi efetivamente promovida
quando as sementes apresentavam em torno de 40% de grau de umidade (Figura
1), suportando, a partir de então, secagem até 12% de teor de água. Nesse
estádio, o valor médio de germinação das sementes submetidas à secagem
tornou-se superior ao das sementes sem secagem. O padrão das bandas (Figura
2 D) após a secagem tornou-se semelhante ao padrão encontrado em sementes
nos estádios finais de desenvolvimento (Figura 2 E e F), demonstrando, assim,
que este mecanismo de proteção já se encontrava totalmente ativo. Sun &
Leopold (1993), trabalhando com a cultivar Chippewa 64, consideram que os
eixos embrionários de sementes de soja atingem o ponto de maturidade aos 48
12
dias após o florescimento, quando estes possuem em torno de 38% de grau de
umidade.
Com 30% de teor de água, a proteção promovida pela proteína resistente
ao calor já estava presente antes mesmo da secagem (Figura 2 E). Foram
observados, nesse estádio, os maiores valores de germinação e vigor (Figura 1)
quando comparados aos observados em sementes nos estádios anteriores.
Zanakis et al. (1994) testando três cultivares de soja, obteve resultados
semelhantes, porém, os autores relataram que estas possuíam menor longevidade
do que sementes colhidas com 15% de teor de água.
O comportamento das curvas das equações de regressão para o teste de
emergência em condições controladas e teste de frio foi semelhante aos da
germinação (Figura 1). Observou-se, porém, que, nas sementes sem secagem, o
estresse causado nos testes induziram a ativação de genes ligados à germinação,
fazendo com que os valores de emergência em condições controladas e no teste
de frio aumentassem significativamente, quando comparados com o teste de
germinação. Esses resultados corroboram os resultados obtidos por Veiga
(2005).
De acordo com Howell et al. (1959), as sementes de soja atingem seu
ponto de maturidade fisiológica quando possuem entre 50% a 60% de umidade,
valores que diferem do encontrado nesta pesquisa que foi de, aproximadamente,
40% de teor de água (Figura 1). Porém, por não possuir os mecanismos de
proteção totalmente desenvolvido nesse estádio, a secagem provocou
decréscimo no vigor das sementes. O vigor das sementes foi crescente nos três
tratamentos de secagem e, assim como no teste de germinação, os valores de
maior vigor foram alcançados em sementes secadas quando apresentavam em
torno de 30% de teor de água, não diferindo das sementes com 20% (Figura 1).
Por meio das curvas das equações de regressão para o teste de
condutividade elétrica, foi observado o efeito danoso da secagem, quando as
13
sementes possuíam alto teor de água (Figura 1). A secagem provocou um
aumento significativo nos valores de condutividade, podendo este estar
relacionado com danos de membrana celular. Segundo Pammenter & Berjak
(1999), o dano mecânico associado com a redução do volume celular durante o
processo de secagem é o mais importante dano em tecidos muito hidratados.
Com o avanço do processo de maturação ocorre a organização estrutural dos
sistemas de membranas, diminuindo substancialmente os valores de
condutividade. Quando as sementes atingiram teor de água de 30%, os danos de
secagem já não foram observados, podendo essa ausência ser relacionada com o
desenvolvimento dos mecanismos de tolerância à dessecação como a LEA
(Figura 2 E). Comportamento semelhante foi observado em milho (Faria et al.,
2004; Powell, 1986) e soja (Veiga, 2005).
Segundo Bray (1993) e Dure(1993) as LEAs podem ligar íons e água,
minimizando os danos de secagem. Blackman et al. (1991) verificaram que, à
medida que proteínas LEA se acumulavam nas sementes de soja, menores eram
os valores de lixiviação de solutos após secagem.
4 CONCLUSÕES
A síntese de proteínas resistentes ao calor é induzida pela diminuição no
conteúdo de água das sementes, seja naturalmente ou artificialmente, a partir de
60% de umidade.
A síntese de proteínas resistentes ao calor está diretamente relacionada
com a qualidade fisiológica das sementes de soja.
Os maiores valores de germinação em sementes de soja são alcançados
quando estas atingem cerca de 30% de grau de umidade no campo.
Os maiores valores de vigor em sementes de soja são alcançados quando
estas atingem cerca de 40% de grau de umidade no campo.
14
FIGURA 1. Representação gráfica das equações de regressão para os resultados
dos testes de germinação (%), emergência em condições controladas
(%), condutividade elétrica (µS/cm/g) e teste de frio (%), em função
da secagem de sementes de soja cultivar MG/BR 46 (Conquista)
colhidas em diferentes estádios de desenvolvimento. A linha
tracejada representa os valores médios de sementes de soja colhidas
convencionalmente no campo, com teor de água de 12%. UFLA,
Lavras, MG, 2006.
Germinação
y( 1) = -0, 0415x
2
+ 2, 052x + 72, 98
R
2
= 0,9058
y( 2) = -0, 0822x
2
+ 4, 9674x + 29, 108
R
2
= 0,9824
y(3) = -0, 073x
2
+ 3, 8181x + 52, 25
R
2
= 0, 9717
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Um idade (%)
Germinação (%)
Emergência
y( 1) = -0, 0298x
2
+ 1, 864x + 72, 601
R
2
= 0,9749
y( 2) = -0, 0752x
2
+ 4,2967x + 40, 041
R
2
= 0, 991
y( 3) = -0, 0671x
2
+ 3, 3378x + 58, 909
R
2
= 0,9702
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Umidade (%)
Emergência (%)
Teste de Frio
y( 1) = -0, 0236x
2
+ 1, 698x + 70, 364
R
2
= 0,596
y( 2) = -0, 0867x
2
+ 5,0843x + 27, 786
R
2
= 0,964
y(3) = -0, 0705x
2
+ 3, 6002x + 53, 819
R
2
= 0, 9594
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Um idade (%)
Emergência (%)
(1)Sem secagem (2)Secagem até 20 % (3)Secagem até 12% -
-
C. elétrica
y (1)= 0,0197x
2
- 2,1056x + 71, 13
R
2
= 0,9753
y(2) = 0,2184x
2
- 12, 547x + 205, 05
R
2
= 0,9901
y(3) = 0,3148x
2
- 19,101x + 317,18
R
2
= 0,992
10
110
210
310
410
20 30 40 50 60 70
Umidade (%)
C. elet. (uS/cm/g)
15
FIGURA 2. Padrão eletroforético de proteínas resistentes ao calor em sementes
de soja MG/BR 46 (Conquista) colhidas com diferentes teores de
água (A- 65%; B-60%; C-50%; D- 40%, E- 30%; F- 20% e G-
12%(sc)), submetidas a três temperaturas de secagem (35ºC, 45ºC e
35-45ºC) e avaliadas em três momentos (sem secagem - ss,
secagem até 20% de umidade e secagem até 12% de umidade).
UFLA, Lavras, MG, 2006.
E
ss 20 % 12% 20% 12% 20 % 12%
35 ºC 45 ºC 35/45 ºC
A
B
C
D
E
ss 20 % 12% 20% 12% 20 % 12%
35 ºC 45 ºC 35/45 ºC
C
D
E
G
16
TABELA 1. Resumo da análise de variância dos resultados das avaliações para
qualidade fisiológica de sementes de soja cultivar BR46 (Conquista)
colhidas em diferentes estádios de desenvolvimento, submetidas a
diferentes temperaturas e tratamentos de secagem. UFLA, Lavras,
MG, 2006.
Germinação Emergência Teste de Frio C. elétrica
Estádios (A)
5
51151,34** 39195,71** 37931,51** 289271,2824**
Tratamento de
secagem (B) 2
2404,75** 18750,5** 28163,98** 416939,6713**
Temperatura de
secagem (C.) 2 72,91
ns
16,56
ns
9,06
ns
1133,5046
ns
A X B 10
2066,46** 3963,34** 6994,09** 84191,0824**
A X C 10 119,55
ns
34,58
ns
52,34
ns
424,5824
ns
B X C 4 20,99
ns
13,09
ns
13,59
ns
874,8796
ns
AXBXC
20
40,79
ns
18,05
ns
5,93
ns
427,674
ns
Bloco 3 320,35
ns
178,97
ns
86,76
ns
861,7207
ns
Resíduo
159 48,52 27,87 40,93 7681137
C V (%) 10,46 7,51 9,06 22,58
Fonte de
Variação
G. L.
Quadrados médios
** significativo, a 1% de probabilidade
ns não houve diferença significativa entre os tratamentos
17
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139-156, Apr. 1994.
20
Estudo de algumas enzimas durante o desenvolvimento e secagem de
sementes de soja
Preparado de acordo com as normas da Revista Ciência e Agrotecnologia
RESUMO
Durante o desenvolvimento e secagem, várias enzimas atuam na manutenção da
qualidade fisiológica de sementes. Dentre essas se destacam as que estão
envolvidas nos processos respiratórios, como a malato desidrogenase (MDH) e
a álcool desidrogenase (ADH) e as removedoras de radicais livres, como a
superóxido desmutase (SOD) e a catalase (CAT), que são capazes de realizar a
desintoxicação de O
2
-
e H
2
O
2
. Neste trabalho foi estudada a atividade de
enzimas envolvidas na respiração e enzimas protetoras, durante o
desenvolvimento e a secagem de sementes de soja. Para isso, foram colhidas
sementes em diferentes estádios de desenvolvimento, que foram submetidas a
diferentes temperaturas e tratamentos de secagem. Foram feitas avaliações
quanto à qualidade fisiológica das sementes, por meio dos testes de germinação
e de condutividada elétrica. As enzimas SOD, CAT, MDH e ADH foram
estudadas por meio de eletroforese. Concluiu-se que a SOD é ativa durante o
desenvolvimento e a secagem de soja. A catalase só é efetiva após o ponto de
maturidade fisiológica em sementes de soja. A atividade da MDH é constante
durante a secagem, porém, a atividade da ADH é intensificada.Os maiores
valores de germinação em sementes de soja são alcançados quando estas
atingem cerca de 30% de grau de umidade. A secagem, em sementes com
menos de 40% de grau de umidade, não provoca aumento nos valores de
condutividade elétrica.
Termos para indexação: superóxido dismutase, catalase, malato desidrogenase,
alcool desidrogenase
21
Study of enzymes during development and drying of soybean seeds
ABSTRACT
During the development and drying, several enzymes act on the maintenance of
the physiological quality of seeds. Among the enzymes there are those involved
with the respiratory mechanisms, such as malate dehydrogenase (MDH) and
alcohol dehydrogenase (ADH) and scavengers of free radicals such as
superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), which are capable of
performing the detoxification of O2- and H2O2. In this work, the enzyme
activity during development and drying of soybean seeds were studied.
Therefore, soybean seeds at different developmental stages were collected and
submitted to different temperatures and methods of drying. Evaluations of the
physiological quality of seeds were performed by means of germination and
electric conductivity tests. The enzymes SOD, CAT, MDH and ADH were that
SOD is active during development and drying of soybean seeds. The activity of
MDH was constant during seed drying, whereas the activity of ADH was higher.
Catalase is only effective after physiological maturity in soybean seeds. Higher
values of germination were observed when seeds reached 30% of moisture
content. Drying of seeds with 40% of moisture content did not show increase in
values of conductivity.
Index terms: superoxide dismutase, catalase, malate dehydrogenase, alcohol
dehydrogenase.
22
1 INTRODUÇÃO
A soja, nos últimos 10 anos, tornou-se a maior geradora de divisas do
agronegócio brasileiro. A cultura ocupa uma área de 21,24 milhões de hectares,
com produção em 2005/2006 de, aproximadamente, 51 milhões de toneladas de
grãos. A demanda por semente, na safra 2005/2006, foi de cerca de um milhão
de toneladas. Todo o complexo agroindustrial da soja movimenta, no Brasil,
mais de 30 bilhões de dólares (IBGE, 2006).
Além do desafio de produzir sementes de qualidade para atender à
demanda crescente, as unidades de beneficiamento ainda têm que solucionar o
problema de concentração de produção e operação das usinas. A utilização de
dessecantes para a antecipação de colheita é uma técnica que tem sido adotada
por diversos produtores, porém, o estádio do desenvolvimento para aplicação,
não está claro, sendo observadas recomendações divergentes.
Durante o desenvolvimento, as sementes passam pela fase de
histodiferenciação, e que há um aumento na massa fresca e deposição de reserva,
acompanhados por um rápido aumento na massa seca durante a maturação. O
acúmulo de massa seca cessa e o de massa fresca diminui, quando as sementes
atingem o ponto de maturidade fisiológica. Após a histodiferenciação e antes da
secagem na maturação, as sementes adquirem a habilidade para germinar e
tolerar a dessecação. Em sementes em desenvolvimento, a concentração de ABA
diminui próximo ao final do desenvolvimento, enquanto a tolerância à
dessecação é aumentada (Pammanter et al., 1994).
Em soja as fases de desenvolvimento são divididas em estágio
vegetativo (V1, V2... Vn) e estágio reprodutivo (R1, R2, R3,..., R8) (Fehr &
Caviness, 1979). No estágio reprodutivo, o R7 marca o ponto de maturidade
fisiológica, que é caracterizado pelo máximo acúmulo de matéria seca na
semente e com teor de água variando de 50% a 60% (Howell et al., 1959). Na
transição do estágio R7 ao R8, o metabolismo de mecanismos de tolerância à
23
dessecação é intensificado e a semente passa a tolerar altas temperaturas de
secagem (Oliver & Bewley, 1997).
A secagem lenta promove melhor tolerância à desidratação,
presumivelmente, devido ao tempo suficiente que é concedido para a indução e a
operação dos mecanismos de proteção. Oliver & Bewley (1997) sugeriram que a
secagem rápida impede os processos de recuperação e é necessário mais tempo
para os reparos na reidratação. Para o estudo de mecanismos de proteção em
sementes, várias técnicas têm sido utilizadas, destacando-se estudos
eletroforéticos de isoenzimas e proteínas e quantificação de açúcares por meio
de HPLC.
A eletroforese é uma técnica bastante difundida nos estudos
bioquímicos, devido a sua simplicidade, rapidez e alto valor informativo.
Segundo Alfenas et al. (1998), esta técnica baseia-se na separação de
macromoléculas ionizadas de acordo com suas cargas elétricas, formas e pesos
moleculares, por meio da migração em um meio suporte e tampões adequados,
sob a influência de um campo elétrico.
Dentre as proteínas, as enzimas desempenham um importante papel no
processo de deterioração de sementes e sua atividade pode ser indicativa da
perda de qualidade (Brandão Junior, 1996). Em função da desorganização das
membranas celulares, as sementes tendem a reduzir o vigor, o que pode ser
verificado pelo aumento da quantidade de lixiviados durante o processo de
embebição das sementes (Lin, 1988; Marcos Filho et al., 1990).
Por meio da atividade enzimática, também podem-se avaliar as
transformações degenerativas nas sementes. A alta atividade da enzima álcool
desidrogenase indica aumento na respiração anaeróbica, em função do acréscimo
no grau de hidratação das sementes e da deficiência no aporte de oxigênio
(Bock, 1999). O aumento na atividade celular ocorre às expensas das substâncias
de reserva das sementes, que são transformadas em energia para a manutenção
24
dos tecidos vivos das sementes e de novos compostos para o reparo de estruturas
danificadas pela deterioração (Bewley & Black, 1994). A enzima malato
desidrogenase catalisa a conversão de malato a oxaloacetato, tendo uma
importante função dentro do ciclo de Krebs, além de participar do movimento de
malato através da membrana mitocondrial e outros compartimentos celulares,
geralmente é de natureza constitutiva (Spinola et al., 2000).
Outro grupo de enzimas atua como mecanismos antioxidantes,
protegendo as células contra a ação de diversas formas de oxigênios ativos. As
enzimas capazes de realizar a desintoxicação de O
2
-
e H
2
O
2
são a superóxido
desmutase (SOD) e a catalase. As primeiras são um grupo de enzimas
encontradas no citoplasma celular e na matriz mitocondrial, que catalizam a
reação de desmutação de radicais superóxidos livres (O
2
-
) para oxigênio
molecular (O
2
) e peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). O peróxido de oxigênio
formado é decomposto pela catalase, cujas subunidades são formadas no
citoplasma, sendo a síntese completada no peroxissomo (MacDonald, 1999).
Neste trabalho foram estudadas a qualidade fisiológica e a atividade de
enzimas atuantes na respiração e nos mecanismos de proteção durante o
desenvolvimento e a secagem de sementes de soja.
2 MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Análise de Sementes (LAS)
e na área experimental do Departamento de Agricultura (DAG) da Universidade
Federal de Lavras (UFLA), no município de Lavras, MG na safra 2005/2006.
Após análise de solo, seguiram-se as recomendações da Embrapa para Minas
Gerais, para correções de fertilidade e pH. A área de cultivo possui
predominância de solo do tipo Latossolo Vermelho Escuro. As características
químicas e físicas foram determinadas pelo Laboratório de Análise de Solo do
Departamento de Ciência do Solo da Universidade Federal de Lavras.
25
Instalação e condução do experimento: foi utilizada a Cultivar MG/BR 46
(Conquista), recomendada para o estado de Minas Gerais. Em solo preparado de
maneira convencional, as parcelas foram instaladas com espaçamento de 0,45 m
entre linha e 15 plantas por metro linear. Cada parcela constou de 20 linhas de
10 metros, totalizando 9 m
2
, sendo as 18 linhas centrais de cada parcela
consideradas úteis. Foram feitos controles de invasoras, assim como de pragas e
doenças, sempre que necessário. A colheita de sementes foi realizada em
diferentes estádios fenológicos para a avaliação da atividade das enzimas
envolvidas na respiração e nos mecanismos de proteção e da qualidade
fisiológica durante a secagem. Utilizou-se a escala de Caviness (Fehr &
Caviness, 1979) como critério para a caracterização da primeira colheita, que foi
realizada quando as sementes estavam no estágio R6, que se caracteriza por
vagens com sementes verdes, porém, totalmente formadas. A partir do R6,
quando as sementes tinham aproximadamente 65% de teor de água, foram feitas
colheitas semanais quando as sementes possuíam 60%, 50%, 40%, 30%, 22% e
12% de grau de umidade. As vagens colhidas foram debulhadas manualmente e
as sementes levadas a secadores de pequena escala, construídos de acordo com
Navratil & Burris (1982). Foram utilizadas duas temperaturas de secagem, uma
de 35ºC e outra de 45ºC, até um conteúdo final de água das sementes em torno
de 12%. No momento da colheita e após atingirem 20% e 12% de teor de água,
foram retiradas amostras de sementes para serem avaliadas quanto à qualidade
fisiológica e a atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase,
malato desidrogenase (MDH) e álcool desidrogenase (ADH). Determinação do
grau de umidade: o grau de umidade inicial foi mensurado utilizando-se o
método da estufa a 130ºC por 2 horas, utilizando-se duas repetições para cada
avaliação, segundo as Regras para Análise de Sementes (Brasil, 1992). Os
resultados foram expressos em porcentagem. Teste de germinação: foram
utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento, semeadas em rolos
26
de papel tipo “Germitest” à temperatura de 25ºC. A quantidade de água
adicionada foi de 2,5 vezes o peso do papel, visando umedecimento adequado e
uniformização do teste. As contagens de plântulas normais foram feitas no 4º e
7º dias após a semeadura. Condutividade elétrica: foi utilizada a quantificação
em massa com quatro repetições de 50 sementes por tratamento. As sementes
foram pesadas com precisão de duas casas decimais e, em seguida, colocadas em
copos plásticos descartáveis com 75mL de água deionizada. Após 24 horas de
embebição à temperatura de 25ºC, a condutividade elétrica foi determinada com
auxílio de um condutivímetro, com resultados expressos em µS/cm/g, de acordo
com o método descrito por Krzyzanowski et al. (1999). Análise de isoenzimas:
duas amostras de sementes de cada tratamento foram masseradas em moinho
com refrigeração constante de 4ºC. Retiraram-se subamostras de 100mg, nas
quais foi adicionado o tampão de extração (Tris HCl 0,2 M pH 8) na quantidade
de 2,5 vezes o peso de cada amostra e 0,1% de β-mercaptoetanol. O material foi
colocado em geladeira overnight e, depois, centrifugado a 14.000 rpm por 30
minutos a 4ºC. Foram aplicados 50 µ L do sobrenadante no gel e promovida a
corrida eletroforética por quatro horas, a 150 V. Os géis foram revelados para
enzimas álcool desidrogenase (ADH), malato desidrogenase (MDH), catalase
(CAT) e superóxido dismutase (SOD), segundo Alfenas (1998). Delineamento
experimental e análise estatística: utilizou-se delineamento experimental em
blocos casualizados com quatro repetições arranjados em esquema fatorial
(6x3x3), e que foram avaliadas 6 épocas de colheitas (65%, 60%, 50%, 40%,
30%, 22% de teor de água nas sementes), 3 temperaturas de secagem (35, 45 e
35/45ºC), três tratamentos de secagem (sem secagem, secagem até 20% de teor
de água e secagem até 12% teor de água). Para as variáveis germinação e
condutividade elétrica foram realizados estudos de regressão.
27
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise de variância observou-se diferença significativa para a
interação estádio de desenvolvimento e tratamento de secagem, para todas as
variáveis analisadas, não sendo observada diferença significativa entre as
temperaturas de secagem.
Nos zimogramas para as enzimas ADH e MDH (Figura 1) foi possível
observar uma maior atividade respiratória aeróbica quando as sementes
possuíam em torno de 65% de teor de água, com a secagem induzindo um
aumento na atividade da MDH. Nesse mesmo estádio, a atividade da ADH foi
baixa quando comparada à observada em sementes colhidas nos demais estádios.
Essa alta atividade respiratória pode estar relacionada com o metabolismo de
desenvolvimento da semente, já que o ponto de maturidade fisiológica de
sementes de soja, segundo Howell et al. (1959) está entre 50% e 60% de teor de
água. Outra hipótese está relacionada à alta atividade respiratória em tecidos
lesionados, já que a secagem neste estádio ocasionou os maiores valores de
condutividade e os menores de germinação (Figura 2). Taiz & Zaiger (2004)
relataram que a atividade respiratória em tecidos vegetais é mais intensa em
órgãos de reserva em desenvolvimento, devido à necessidade do maior
suprimento energético.
Nos demais estádios, a atividade aeróbica foi reduzida e tornou-se
constante, não havendo variações significativas durante a secagem natural no
campo ou artificial. Farrant et al. (1997) observaram um declínio na atividade
respiratória em sementes de Phaseolus vulgares, associado à dediferenciação da
mitocôndria durante o processo de maturação, e uma diminuição nos conteúdos
de substratos respiratórios, diminuindo, assim, a geração descontrolada de
radicais livres durante a secagem. A secagem artificial nestes estádios provocou
um aumento na atividade da ADH.
28
MDH ADH
FIGURA 1. Padrões eletroforéticos das enzimas malato desidrogenase (MDH) e
álcool desidrogenase (ADH) em sementes de soja colhidas em
diferentes estádios de maturação(65%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%
e 12% de teor de água) e submetidas aà diferentes tratamentos de
secagem (a- Sem secagem, b- 20% de teor de água a 35ºC, c- 12%
de teor de água a 35ºC, d- 20% de teor de água a 35/45ºC, e- 12% de
teor de água a 35/45ºC, f- 20% de teor de água a 45ºC, g- 12% de
teor de água a 45ºC) UFLA, Lavras, MG, 2006.
Relacionando-se os valores de condutividade elétrica (Figura 2) e a
atividade de ADH (Figura 1), observa-se que, quando as sementes atingiram
cerca de 50% de teor de água, a atividade dessa enzima aumentou com a
secagem, coincidindo com o aumento significativo dos valores de condutividade
elétrica, também após a secagem. Quando as sementes atingiram 22% de grau de
umidade, não foram observadas diferenças nos padrões da atividade da ADH,
porém, para o teste de condutividade após 40% de grau de umidade já não foi
possível detectar estes danos por secagem.
A desestruturação de membranas sempre foi considerada como o
primeiro evento degenerativo de sementes, porém, atualmente, é aceita a idéia de
que danos moleculares e bioquímicos ocorram antes dos danos de membrana,
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sendo as avaliações de atividade enzimáticas mais sensíveis que o teste de
condutividade elétrica.
Segundo Brandão Junior et al. (2002), a via fermentativa é fundamental
para a manutenção e a viabilidade de sementes de café colhidas precocemente e
submetidas à secagem. Já Taiz & Zaiger (2004) afirmam que mais importante
que o fornecimento energético por meio da atividade respiratória exercida pela
ADH é a sua capacidade de converter o acetaldeído tóxico em etanol. Hrazdina
et al. (1992) relatam que a presença de acetaldeído causa danos celulares que
induzem à respiração fermentativa que por sua vez produz mais acetaldeído.
Assim a atividade da ADH em tecidos sadios é a de estabilizar esta reação em
cadeia.
FIGURA 2. Representação gráfica das equações de regressão para os resultados
dos testes de germinação (%) e condutividade elétrica
(µmhols/cm/g) em função da secagem de sementes de soja cultivar
MG/BR 46 (Conquista) colhida em diferentes estádios de
desenvolvimento. A linha tracejada representa os valores médios em
sementes colhidas no campo com teor de água de 12%. UFLA,
Lavras, MG, 2006.
Analizando-se os zimogramas da enzima superóxido dismutase (SOD)
(Figura 3), observa-se que a atividade foi intensa durante todos os estádios de
Germinação
y( 1) = -0, 0415x
2
+ 2, 052x + 72, 98
R
2
= 0,9058
y( 2) = -0, 0822x
2
+ 4, 9674x + 29, 108
R
2
= 0,9824
y(3) = -0,073x
2
+ 3, 8181x + 52, 25
R
2
= 0,9717
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Umidade (%)
Germinação (%)
C. elétrica
y (1)= 0,0197x
2
- 2,1056x + 71,13
R
2
= 0,9753
y(2) = 0,2184x
2
- 12,547x + 205,05
R
2
= 0,9901
y(3) = 0,3148x
2
- 19,101x + 317,18
R
2
= 0,992
10
110
210
310
410
20 30 40 50 60 70
Um idade (%)
C. elet. (uS/cm/g)
♦Sem secagem ■ Secagem até 20% de teor de água ▲ Secagem até 12 % de teor de água
30
maturação avaliados. Senaratna et al. (1986), trabalhando com eixos
embrionários de soja, afirmaram que a SOD é o mais notável exemplo de
neutralizador de radicais livres (“escavenges”), pois é efetiva ao menor sinal de
dano. Já Rosa et al. (2005) trabalhando com tolerância de sementes de milho a
altas temperaturas de secagem, não observaram diferença na atividade da SOD,
durante as diferentes temperaturas utilizadas.
No zimograma para catalase (Figura 3), observa-ser a ausência de
atividade nos estádios iniciais avaliados. Essa falta de mecanismo removedor de
radicais livres pode ser mais uma causa da baixa qualidade fisiológica das
sementes submetidas à secagem nesses estádios de desenvolvimento (Figura 2).
Rosa et al. (2005) encontraram resultados semelhantes em sementes de milho
submetidas à alta temperatura de secagem e pré-condicionamento à baixa
temperatura. Segundo Taiz & Zaiger (2004), apesar de sua grande efetividade
na neutralização do oxigênio reativo (O
2
-
), a SOD produz peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) que, apesar de menos reativo, em altas concentrações torna-se
tóxico. Assim, sua atividade isoladamente é pouco funcional na proteção da
semente, sendo necessária a formação de um sistema removedor de radicais
livres, conjuntamente com catalase, peroxidase e carotenóides, entre outros.
A atividade da catalase tornou-se efetiva quando as sementes atingiram
um teor de água em torno de 50%, coincidindo com o momento no qual as
sementes toleram secagem até 20% sem perder sua viabilidade inicial (Figura 2).
O pico máximo de atividade foi observado quando as sementes atingiram 40%
de umidade, estádio em que foi observada a indução de germinação pela
secagem. Sementes com conteúdos intermediários de água são potencialmente
mais susceptíveis a danos oxidativos mediados por radicais livres (Gaff, (1989);
Vertucci & Farrant (1995)). Esses autores consideram que, neste conteúdo de
água, o metabolismo é desordenado e a secagem na maturação, conjuntamente
com os mecanismos removedores de radicais livres é estratégia biologicamente
31
bem sucedida, permitindo a passagem da semente por esses conteúdos de água
sem que haja efeitos deletérios significativos.
A partir de 30% de grau de umidade a atividade foi decrescente o que
pode estar relacionado com menor dano ocasionado por secagem nestes estádios,
já que foram constatados os menores valores de condutividade e maiores valores
de germinação. Leprince et al. (1990) observaram atividade crescente da catalase
ao longo do processo de aquisição de tolerância à alta temperatura de secagem.
SOD CAT
Figura 3. Padrões enzimáticos da superóxido dismutase (SOD) e catalase
(CAT), em sementes de soja colhidas em diferentes estádios de
maturação (65%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% e 12% de teor de água)
e submetida a diferentes tratamentos de secagem (a-Sem secagem, b-
20% de teor de água a 35ºC, c-12% de teor de água a 35ºC, d-20% de
teor de água a 35/45ºC, e-12% de teor de água a 35/45ºC, f-20% de
teor de água a 45ºC, g-12% de teor de água a 45ºC).
Em geral, o melhor comportamento fisiológico e bioquímico ocorreu
quando as sementes alcançaram em torno de 30% de teor de água, com maiores
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valores de germinação, menores valores de condutividade e enzimas envolvidas
na respiração e proteção contra radicais livres atuando organizadamente.
4 CONCLUSÕES
A SOD é ativa durante o desenvolvimento e a secagem de sementes
soja.
A catalase só é efetiva após o ponto de maturidade fisiológica em
sementes de soja.
A atividade da MDH é constante durante a secagem de sementes de
soja, porém, a atividade da ADH é intensificada.
Os maiores valores de germinação em sementes de soja são alcançados
quando estas atingem cerca de 30% de grau de umidade.
A secagem em sementes com menos de 40% de grau de umidade não
provoca aumento nos valores de condutividade elétrica.
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35
Danos de secagem em sementes de soja.
ANALISE FISIOLÓGICA E ULTRA-ESTRUTURAL DURANTE O
DESENVOLVIMENTO E A SECAGEM DE SEMENTES DE SOJA
Preparado de acordo co as normas da Revista Brasileira de Sementes
RESUMO
Durante o desenvolvimento e a secagem, vários mecanismos de proteção atuam
na manutenção da qualidade fisiológica de sementes. Alguns desses mecanismos
mantêm a integridade de membrana celulares, o que é fundamental para o
perfeito funcionamento do metabolismo celular. O estudo de ultra-estrutura além
de permitir a visualização dos danos causados pela secagem na ausência de
mecanismos de proteção, permite, ainda, a observação do início da efetividade
destes mecanismos. Neste trabalho, foram estudados os danos durante o
desenvolvimento e a secagem de sementes de soja, por meio de microscopia
eletrônica de varredura e testes fisiológicos. Para isso, foram colhidas sementes
em diferentes estádios de desenvolvimento, que foram submetidas a diferentes
temperaturas e tratamentos de secagem. Foram feitas avaliações quanto à
qualidade fisiológica das sementes por meio dos testes de germinação, teste de
frio, teste de emergência em condições controladas e condutividada elétrica. Os
danos de membrana foram observados por meio de microscopia eletrônica de
varredura (MEV), utilizando-se microscópio LEO Evo40. Concluiu-se que as
sementes de soja tornam-se tolerantes a dessecação quando possuem em torno
de 30% de teor de água. A secagem em sementes de soja com teor de água
acima de 30% provoca danos de membrana que diminuem a qualidade
fisiológica das sementes. Os maiores valores de germinação em sementes de soja
são alcançados quando estas atingem cerca de 30% de grau de umidade no
36
campo e os maiores valores de vigor em sementes de soja são alcançados
quando estas atingem cerca de 40% de grau de umidade no campo.
Termos para indexação: MEV, tolerância à dessecação, testes fisiológicos.
37
Drying damages of soybean seeds
ULTRA-STRUCTURAL AND PHYSIOLOGICAL ANALYSIS DURING
THE DEVELOPMENT AND DRYING OF SOYBEAN SEEDS
ABSTRACT
During the development and drying, a number of protection mechanisms act on
the maintenance of physiological quality of seeds. Some of these mechanisms
maintain the integrity of cells, which is fundamental to the perfect functioning of
cell metabolism. The study of the ultra-structure enables visualization of
damages caused by drying in the absence of protection mechanisms. In this
work, occurrence of damages during the development and drying of soybean
seeds were studied by means of Scanning Electron Microscopy (SEM). In
addition, seeds were also evaluated regarding the physiological quality. Thus,
seeds in different developmental stages were collected and submitted different
drying temperatures and treatments. Evaluations were done concerning the
physiological quality of seeds by means of the germination test, cold test,
emergence test under controlled conditions and electrical conductivity. The
damages were viewed by means of scanning electron microscopy utilizing the
LEO Evo40 Microscope. The results showed that the soybean seeds become
desiccation tolerant when they possess around 30% of water content. Drying of
seeds with moisture content above 30%, caused reduction of cellular volume,
disorganization of the cell walls and decrease in physiological quality of the
seeds. Higher values of germination were observed in seeds with 30% of
moisture content in the field, whereas higher values of vigor were observed in
seeds with 40% of moisture content in the field.
Index Terms: SEM, desiccation tolerance, physiological tests.
38
1 INTRODUÇÃO
A soja, nos últimos 10 anos, tornou-se a maior geradora de divisas do
agronegócio brasileiro. A cultura ocupa uma área de 21,24 milhões de hectares
com produção em 2005/2006 de, aproximadamente, 51 milhões de toneladas de
grãos. A demanda por semente na safra 2005/2006 foi de, aproximadamente, um
milhão de toneladas. Todo complexo agroindustrial da soja movimenta, no
Brasil, mais de 30 bilhões de dólares (IBGE, 2006).
Além do desafio de produzir sementes de qualidade para atender a
demanda crescente, as unidades de beneficiamento ainda têm que solucionar o
problema de concentração de produção e operação das usinas. A utilização de
dessecantes para a antecipação de colheita é uma técnica que tem sido adotada
por diversos produtores, porém, o estádio do desenvolvimento para aplicação
não está claro, sendo observadas recomendações divergentes.
Durante o desenvolvimento, as sementes passam pela fase de
histodiferenciação, em que um aumento na massa fresca e na deposição de
reserva, acompanhado por um rápido aumento na massa seca durante a
maturação. O acúmulo de massa seca cessa e o de massa fresca diminui, quando
as sementes atingem o ponto de maturidade fisiológica. Após a
histodiferenciação e antes da secagem na maturação, as sementes adquirem a
habilidade para germinar e tolerar a dessecação. Em sementes em
desenvolvimento, a concentração de ABA diminui próximo ao final do
desenvolvimento, enquanto a tolerância à dessecação é aumentada (Oliver &
Bewley, 1997).
Em soja, as fases de desenvolvimento são divididas em estágio
vegetativo (V1, V2... Vn) e estágio reprodutivo (R1, R2, R3,..., R8) (Fehr &
Caviness, 1977). No estágio reprodutivo, o R7 marca o ponto de maturidade
fisiológica, que é caracterizado pelo máximo acúmulo de matéria seca na
semente e com teor de água variando de 50% a 60% (Howell et al., 1959). Na
39
transição do estágio R7 ao R8, o metabolismo de mecanismos de tolerância à
dessecação é intensificado e a semente passa a tolerar altas temperaturas de
secagem (Oliver & Bewley, 1997).
A secagem lenta promove melhor tolerância à desidratação,
presumivelmente devido ao tempo suficiente que é concedido para a indução e a
operação dos mecanismos de proteção. Oliver & Bewley (1997) sugeriram que a
secagem rápida impede os processos de recuperação e é necessário mais tempo
para os reparos na reidratação.
Estudos de ultra-estrutura conduzidos durante os últimos anos
contribuíram para a compreensão das diferentes respostas à desidratação
apresentadas por sementes recalcitrantes e ortodoxas. Membranas das organelas
celulares, o citoesqueleto e o núcleo esquelético são essenciais para o perfeito
funcionamento da célula e danos a essas estruturas durante a desidratação podem
levar à perda de viabilidade (Berjak & Pammanter, 2000).
Neste trabalho foram estudados os danos celulares por meio de testes
fisiológicos e microscopia eletrônica de varredura (MEV) durante o
desenvolvimento e a secagem de sementes de soja.
2 MATERIAL E MÉTODOS
As análises foram conduzidas no Laboratório de Análise de Sementes
(LAS) e no Laboratório de Microscopia Eletrônica e Análise Ultra-Estrutural
(LME) e o experimento de campo, na área experimental do Departamento de
Agricultura da Universidade Federal de Lavras (UFLA), no município de
Lavras, MG. Após análise de solo, seguiram-se as recomendações da Embrapa
para Minas Gerais para as correções de fertilidade e pH. A área de cultivo possui
predominância de solo do tipo Latossolo Vermelho Escuro. Instalação e
condução do experimento: foi utilizada a cultivar MG/BR 46 (Conquista),
recomendada para o estado de Minas Gerais. Em solo preparado de maneira
40
convencional, as parcelas foram instaladas com espaçamento de 0,45 m entre
linha e 15 plantas por metro linear. Cada parcela constou de 20 linhas de 10
metros, totalizando 9m
2
, sendo as 18 linhas centrais de cada parcela
consideradas úteis. Foram feitos controles de invasoras, assim como de pragas e
doenças sempre que necessário. A colheita de sementes foi realizada em
diferentes estádios fenológicos para a avaliação da qualidade fisiológica e ultra-
estrutural durante a secagem. Utilizou-se a escala de Caviness (Fehr & Caviness,
1979) como critério para a caracterização da primeira colheita, feita quando as
sementes estavam no estágio R6, que se caracteriza por vagens com sementes
verdes, porém, totalmente formadas. A partir do R6, quando as sementes tinham,
aproximadamente, 65% de teor de água, foram feitas colheitas semanais quando
as sementes possuíam 60%, 50%, 40%, 30%, 22% e 12% de grau de umidade.
As vagens colhidas foram debulhadas manualmente e as sementes levadas a
secadores de pequena escala, construídos de acordo com Navratil e Burris
(1982). Os secadores foram regulados para as temperaturas constantes de 35ºC e
45ºC, até atingir 13% de grau de umidade e temperaturas alternadas, iniciando
com 35ºC até um conteúdo médio de água das sementes de 20%, quando, então,
a temperatura foi elevada para 45ºC, até conteúdo de água em torno de 12%. No
momento da colheita e após atingirem 20% e 12% de teor de água, foram
retiradas amostras de sementes para serem avaliadas quanto à qualidade
fisiológica e incidência de danos de membrana por meio de microscopia
eletrônica de varredura. Determinação do grau de umidade: o grau de
umidade inicial foi mensurado utilizando-se o método da estufa a 130ºC por 2
horas, utilizando-se duas repetições para cada avaliação, segundo as Regras para
Análise de Sementes (Brasil, 1992). Os resultados foram expressos em
porcentagem. Teste de germinação: foram utilizadas quatro repetições de 50
sementes por tratamento, semeadas em rolos de papel tipo “Germitest” à
temperatura de 25ºC. A quantidade de água adicionada foi de 2,5 vezes o peso
41
do papel, visando a umedecimento adequado e a uniformização do teste. As
contagens de plantas normais foram feitas no 4º e 7º dias após a semeadura.
Teste de emergência em condições controladas: a semeadura foi realizada em
bandejas plásticas contendo como substrato solo + areia, na proporção 1:2.
Foram utilizadas quatro repetições de 50 sementes por tratamento. Após a
semeadura, as bandejas foram mantidas em câmara de crescimento vegetal à
temperatura de 25
o
C, em regime alternado de luz e escuro (12 horas). Foi
considerada a porcentagem de plântulas normais aos 14 dias. Teste de frio:
foram utilizadas caixas plásticas com uma mistura de areia e terra (2:1), com
quatro repetições de 50 sementes cada. Uma quantidade de 4.000g da mistura
areia e solo juntamente com adição da quantidade de água calculada para 70%
da capacidade de campo, foi colocada em cada caixa. Em seguida estas caixas
foram colocadas em câmara previamente regulada a 10 ºC, onde na qual
permaneceram durante cinco dias. Após esse período, as caixas foram
transferidas para uma câmara de germinação com temperatura de 25ºC, por sete
dias para a emergência das plântulas. A avaliação foi realizada considerando
somente as plântulas normais emergidas (Krzyzanowski et al., 1999).
Condutividade elétrica: foi utilizada a quantificação em massa, com quatro
repetições de 50 sementes por tratamento. As sementes foram pesadas com
precisão de duas casas decimais e, em seguida, colocadas em copos plásticos
descartáveis com 75mL de água deionizada. Após 24 horas de embebição à
temperatura de 25ºC, a condutividade elétrica foi determinada com auxilio de
um condutivímetro com resultados expressos em µS/cm/g, de acordo com o
método descrito por Krzyzanowski et al. (1999). Microscopia eletrônica de
varredura: os eixos embrionários foram extraídos e imersos em solução
fixativa (Karnovisk`s modificada), pH 7,2, por 24 horas. Em seguida foram
lavadas em tampão cacodilato por três vezes, durante 10 minutos. A pós-fixação
foi feita em tetróxido de ósmio 1% por uma hora. Após esse período, foram
42
feitas lavagens com água destilada e desidratação em gradiente de acetona a
25%, 50%, 75%, 90% e 100%, por três vezes. As amostras foram levadas para o
aparelho de ponto crítico, onde foi eliminado todo o resíduo de acetona, para
posterior montagem em stubs sob fita de carbono e revestimento com ouro. A
visualização das amostras foi feita em microscópio eletrônico de varredura LEO
Evo40. Delineamento experimental e análise estatística: utilizou-se
delineamento experimental em blocos casualizados com quatro repetições,
arranjados em esquema fatorial (6x3x3), em que foram utilizadas épocas de
colheitas (65%, 60%, 50%, 40%, 30%, 22 % de teor de água das sementes), 3
temperaturas de secagem (35, 45 e 35/45ºC), 3 tratamentos de secagem (sem
secagem, secagem até 20% de teor água e secagem até 12% de teor água). Para
as variáveis germinação, emergência em condições controladas, condutividade
elétrica e teste de frio, foram realizados estudos de regressão.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na análise de variância observou-se diferença significativa para a
interação estádio de desenvolvimento e tratamento de secagem, para todas as
variáveis analisadas, não sendo observada diferença significativa entre
temperaturas de secagem.
Na medida que o teor de água de colheita das sementes foi diminuindo, a
germinação foi aumentando para os três tratamentos de secagem, porém nas
sementes com 65% e 60% de teor de água (Figura 1) os mecanismos
responsáveis pela tolerância à dessecação parecem não estar presentes ou ativos,
levando a semente a perder drasticamente sua viabilidade após secagem.
Observou-se acentuada redução de volume celular que pode ter ocasionado a
ruptura de plasmodemata nos três sistemas de tecidos fundamentais (dérmico,
fundamental e vascular) (Figura 2 e 3), fazendo com que o conteúdo
citoplasmático seja lixiviado refletindo nos altos valores de condutividade
43
elétrica (Figura 1). Segundo Taiz & Zaiger (2004), a maioria das células vegetais
é interconectada por plasmodesmas que formam um continuum citoplasmático e
estes são responsáveis por transporte de solutos. Pammenter & Berjak (1999)
relataram que o dano mecânico associado com a redução do volume celular
durante o processo de secagem é o mais importante dano em tecidos muito
hidratados. Green et al. citados por Marcos Filho (1979), relataram prejuízos na
germinação e no vigor de sementes de soja colhidas precocemente. Faria (2006)
trabalhando com armazenamento de sementes de Inga vera, observou, por meio
de microscopia eletrônica de varredura, uma retração celular relacionada com a
baixa qualidade fisiológica. A diminuição do volume celular em sementes com
alta umidade e em estágio de desenvolvimento poderia estar relacionada com o
conteúdo de água “livre” e adsorvida, que é superior à água de constituição,
quando comparado a sementes desenvolvidas. Segundo Carvalho & Nakagawa
(2000) e Marcos Filho (2005) a água livre e adsorvida possui forças de atração
muito frágeis, sendo facilmente eliminadas da semente durante a secagem.
Com 50% de grau de umidade, foi possível submeter às sementes a uma
secagem até 20% de teor de água sem causar prejuízo para a germinação (Figura
7). Segundo Marcos Filho (2005), o prejuízo causado à configuração de
membranas durante a secagem prematura é minimizada quando são mantidos
teores de água em torno de 25%. Segundo Kermode et al. (1989), o sinal
indicativo da mudança de estágio de desenvolvimento para germinação é a
redução no teor de água nas sementes. Nesse estádio, observou-se uma
diminuição na profundidade do dano causado pela secagem (Figura 4), sendo
este mais intenso nos tecidos mais externos (dérmico e fundamental), podendo
ter sido causado pela maior exposição destes tecidos à temperatura de secagem.
A indução da germinação pela secagem foi efetivamente promovida
quando o teor de água das sementes estava em torno de 40% (Figura 1),
suportando, a partir de então, secagem até 12% de teor de água. Nesse estádio, o
44
valor médio de germinação das sementes submetidas à secagem tornou-se
superior ao das sementes sem secagem. As células mantiveram-se turgidas com
danos mínimos por secagem (Figura 5), sendo estes observados principalmente
nas células mais externas do córtex e epiderme. A menor incidência de danos
condicionou menores valores de condutividade elétrica. Sun & Leopold (1993),
trabalhando com a cultivar Chippewa 64, consideraram que os eixos
embrionários de sementes de soja atingem o ponto de maturidade aos 48 dias
após o florescimento, quando estes possuem em torno de 38% de grau de
umidade.
Com 30% e 22% de teor de água, foram observados os maiores valores
de germinação e vigor (Figura 1) comparados aos observados em sementes nos
estádios anteriores. Zanakis et al. (1994) testando três cultivares de soja,
obtiveram resultados semelhantes, porém, os autores relataram que estas
possuíam menor longevidade do que sementes colhidas com 15% de teor de
água. A partir desse estádio, as células mantiveram-se túrgidas após a secagem,
com aspecto semelhante ao das sementes secas naturalmente em campo (Figura
6 e 7). Os valores de condutividade elétrica (Figura 1) nesses estádios não
variaram com a secagem, relacionando-se diretamente com a diminuição dos
danos de membrana observados nas imagens.
Os resultados obtidos para o teste de emergência em condições
controladas e teste de frio foram semelhantes aos da germinação (Figura 1).
Observou-se, porém, que, nas sementes sem secagem, o estresse causado nos
testes induziu a ativação de genes ligados à germinação, fazendo com que os
valores de emergência em condições controladas e no teste de frio aumentassem
significativamente quando comparados com o teste de germinação, resultados
que corroboram os resultados obtidos por Veiga (2005).
De acordo com Howell et al. (1959), as sementes de soja atingem seu
ponto de maturidade fisiológica quando possuem entre 50% a 60% de umidade,
45
diferente do encontrado nesta pesquisa, que foi de, aproximadamente, 40% de
teor de água, como pôde ser observado nos testes fisiológicos (Figura 1) e
imagens de ultra-estruturas, porém, por não possuir os mecanismos de proteção
totalmente desenvolvidos neste estádio, a secagem provocou decréscimo nos
valores de vigor das sementes. O vigor das sementes foi crescente nos três
tratamentos de secagem, na medida que a umidade de colheita diminuía e, assim,
como no teste de germinação, os valores de maior vigor foram alcançados em
sementes secadas quando apresentavam em torno de 30% de teor de água, não
diferindo das sementes com 20% (Figura 1).
4 CONCLUSÕES
As sementes de soja tornam-se tolerantes à dessecação quando possuem
em torno de 30% de teor de água.
A secagem em sementes de soja com teor de água acima de 30%,
provoca danos de membrana que diminuem a qualidade fisiológica das
sementes.
Os maiores valores de germinação em sementes de soja são alcançados
quando estas atingem cerca de 30% de grau de umidade no campo.
Os maiores valores de vigor em sementes de soja são alcançados quando
estas atingem cerca de 40% de grau de umidade no campo.
46
FIGURA 1. Representação gráfica das equações de regressão para os resultados
dos testes de germinação (%), emergência em condições controladas
(%), condutividade elétrica (µS/cm/g) e teste de frio (%) em função da
secagem de sementes de soja cultivar MG/BR 46 (Conquista) colhidas
em diferentes estádios de desenvolvimento. A linha tracejada
representa os valores médios de sementes soja colhidas
convencionalmente no campo com teor de água de 12%. UFLA,
Lavras – MG, 2006.
Germinação
y( 1) = -0, 0415x
2
+ 2, 052x + 72, 98
R
2
= 0,9058
y( 2) = -0, 0822x
2
+ 4, 9674x + 29, 108
R
2
= 0,9824
y(3) = -0, 073x
2
+ 3, 8181x + 52, 25
R
2
= 0, 9717
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Um idade (%)
Germinação (%)
Emergência
y( 1) = -0, 0298x
2
+ 1, 864x + 72, 601
R
2
= 0,9749
y( 2) = -0, 0752x
2
+ 4,2967x + 40, 041
R
2
= 0, 991
y( 3) = -0, 0671x
2
+ 3, 3378x + 58, 909
R
2
= 0,9702
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Umidade (%)
Emergência (%)
Teste de Frio
y( 1) = -0, 0236x
2
+ 1, 698x + 70, 364
R
2
= 0,596
y( 2) = -0, 0867x
2
+ 5,0843x + 27, 786
R
2
= 0,964
y( 3) = -0, 0705x
2
+ 3, 6002x + 53, 819
R
2
= 0, 9594
0
20
40
60
80
100
20 30 40 50 60 70
Um idade (%)
Emergência (%)
(1)Sem secagem (2)Secagem até 20 % (3)Secagem até 12% -
-
C. elétrica
y (1)= 0,0197x
2
- 2,1056x + 71, 13
R
2
= 0,9753
y(2) = 0,2184x
2
- 12, 547x + 205, 05
R
2
= 0,9901
y(3) = 0,3148x
2
- 19,101x + 317,18
R
2
= 0,992
10
110
210
310
410
20 30 40 50 60 70
Umidade (%)
C. elet. (uS/cm/g)
47
FIGURA 2. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 65% de grau de umidade. A
imagem A representa eixos embrionários de sementes submetidas
à secagem artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento
médio 1500 X. UFLA, Lavras-MG, 2006.
A
B
48
FIGURA 3. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 60% de grau de umidade. A
imagem A representa eixos embrionários de sementes submetidas
à secagem artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento
médio 1250 X. UFLA, Lavras, MG, 2006.
B
A
49
FIGURA 4. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 50% de grau de umidade. A
imagem A representa eixos embrionários de sementes submetidas
à secagem artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento
médio 1250 X. UFLA, Lavras, MG, 2006.
B
A
50
FIGURA 5. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 40% de grau de umidade. A
imagem A representa eixos embrionários de sementes submetidas
à secagem artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento
médio 1250 X. UFLA, Lavras, MG, 2006.
B
A
51
FIGURA 6. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 30% de grau de umidade. A
imagem A representa eixos embrionários de sementes submetidas
à secagem artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento
médio 1150 X. UFLA, Lavras, MG, 2006.
B
A
52
FIGURA 7. Imagens obtidas por meio de microscópio eletrônico de varredura
mostrando danos causados por secagem em eixos embrionários de
sementes de soja colhidas com 20% de grau de umidade. A imagem
A representa eixos embrionários de sementes submetidas à secagem
artificial e B sementes secas naturalmente. Aumento médio 1250 X.
UFLA, Lavras, MG, 2006.
A
B
53
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