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Flavia Torres Presti
Caracterização da variabilidade genética em
espécies de psitacídeos ameaçados
Dissertação apresentada ao Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo, para
a
obtenção do Título de Mestre em Ciências, na áre
a
Biologia/Genética.
Orientadora: Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki
São Paulo
2006
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Presti, Flavia Torres
Análise da variabilidade genética em espécies
de psitacídeos ameaçados.
87 páginas
Dissertação de Mestrado – Instituto de Biociências
da Universidade de São Paulo. Departamento de
Genética e Biologia Evolutiva
1. Psitacídeos 2. Anodorhynchus 3. Cyanopsitta
4. microssatélites. I. Universidade de São Paulo.
Instituto de Biociências. Departamento de
Genética e Biologia Evolutiva
Comissão Julgadora:
____________________________ ___________________________
Prof. (a) Dr. (a) Prof. (a) Dr. (a)
________________________________
Profa. Dra. Cristina Yumi Miyaki
Ao Patrick por tudo o que você significa pra mim.
Venham até a borda, ele disse.
Eles disseram: Nós temos medo.
Venham até a borda, ele insistiu.
Eles foram, ele os empurrou...e
eles voaram.
Guillaume Apollinaire
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Cris Miyaki pela oportunidade, ajuda, paciência, carinho e muito mais. Muito
obrigada!
Ao Renato Caparroz (Renat´s) que muito me ensinou, me ouviu e acima de tudo, foi muito amigo.
À minha grande amiga Cibele Biondo (Ci) pelas sugestões, conselhos e ser minha companheira para
entender os microssatélites e ao Fábio pela amizade.
À Profa. Anita Wajntal por todas as contribuições nos seminários e amizade.
À Janaina Meyer (Jana) por toda ajuda no laboratório, que foi muito importante para a conclusão desse
trabalho.
À Neiva Guedes pela oportunidade de conhecer o Pantanal, ficar perto das araras, além das sugestões e
ensinamentos.
Ao Projeto Arara-azul (em especial ao Cézar, Lia e Grace) pelo trabalho no Pantanal e pelas amostras
utilizadas nesse trabalho.
Ao Paulo Antas pelas informações, ajuda e amostras.
Ao Museu Emílio Goeldi, Paulo Martuscelli, Carlos Yamashita, Zoológico de Brasília, Zoológico de
São Paulo, Claudia Baider e muitos outros que forneceram amostras.
Ao Projeto Arara-azul-de-lear (em especial ao Joaquim e Débora) pela oportunidade de conhecer a
Serra Branca e ver as araras. Foi uma experiência muito importante para o trabalho e para minha vida.
À Adriana Marques (Adri) pela amizade, ouvido e companheira de CEPÊ.
Ao Gustavo Cabanne por me ensinar muitas coisas de campo e me ajudar muito com os métodos de
análise.
Aos amigos e colegas do LGEMA Camila, Erikinha, Erwin, Fernando Horta, Fernando Nodari, Lú,
Poly, Rodrigo, Taninha e Zé pelas risadas, ajudas e muitas discussões. Vocês foram muito importantes!
Aos professores do Departamento que me ensinaram muito, em especial, ao Paulo Otto pelas análises e
por estar sempre à disposição para atender às minhas dúvidas e ao Diogo Meyer pelo conhecimento, atenção e
simpatia.
À Fernanda Jehee do Laboratório de Genética do Desenvolvimento Humano pela atenção e ajuda com os
microssatélites.
Aos estagiários que passaram pelo laboratório.
Às vizinhas de laboratório Gisele, Nádia e Jú pelas discussões, sugestões e por estarem ali sempre.
Aos funcionários do Departamento Lú, Luzia, Susy, Helenice, Maria de Lourdes e muitos outros pela
agradável convivência.
Ao meu avô Mario pela acolhida e carinho, aos meus pais pela confiança e amor, à Thais por toda ajuda
(essa eu estava devendo!), à Paula pela companhia nas férias e ao Patrick por TUDO.
Aos meus grandes amigos que, por muita sorte, ficaram perto Uruca, Lamby, Bixoca, Maska, Grsoscof,
Kaxcola, Sivira, Talita e Marcos pelas muitas conversas. E a aqueles que não estavam tão perto mas que sempre
me ajudaram Pranta, Gabi, Pri, Marcinha e muitos outros.
SUMÁRIO
Resumo .......................................................................................................................................
Abstract.......................................................................................................................................
01
02
Capítulo I - Introdução Geral...................................................................................................
Os psitacídeos....................................................................................................................
Os psitacídeos no Brasil.....................................................................................................
Ararinha-azul (Cyanopsitta spixii).....................................................................................
Arara-azul-de-lear (Anodorhynchus leari).........................................................................
Arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus)............................................................
Genética aplicada à conservação........................................................................................
Microssatélites...................................................................................................................
O uso de microssatélites em análise de parentesco............................................................
O uso de microssatélites em análise de estrutura populacional.........................................
Referências bibliográficas..................................................................................................
03
04
05
07
08
10
11
13
15
16
17
Objetivos.....................................................................................................................................
24
Capítulo II - Análise da variabilidade genética em Cyanopsitta spixii e Anodorhynchus
leari (Psitaciformes, Aves): implicações para reprodução em cativeiro e conservação.......
25
Capítulo III - Estrutura genética populacional em Arara-azul (Anodorhynchus
hyacinthinus) baseada na análise de locos de microssatélites................................................
45
Capítulo IV- Análise da similaridade genética de ninhegos de Anodorhynchus
hyacinthinus ...............................................................................................................................
67
Considerações finais...................................................................................................................
Conclusões gerais.......................................................................................................................
82
87
Resumo
O Brasil é o país mais rico do mundo em espécies de psitacídeos (cerca de 74), sendo 17
delas ameaçadas de extinção. Entre elas estão a Cyanopsitta spixii (extinta na natureza),
Anodorhynchus leari (criticamente ameaçada) e Anodorhynchus hyacinthinus (vulnerável). No
presente trabalho amostras de C. spixii e A. leari foram analisadas com marcadores nucleares
(microssatélites) e mitocondriais (citocromo b, região controladora e ATPase 8) para estimar a
similaridade genética entre indivíduos das duas espécies. Foram testados quatorze pares de
"primers" de microssatélites, sendo que onze geraram produtos de amplificação, mas somente
quatro se mostraram polimórficos e sem desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Nas seqüências
de DNA mitocondrial não foi encontrada variação. Índices de similaridade simples e de r utilizando
os quatro locos de microssatélites foram calculados para todos os pares de indivíduos. Apesar da
baixa variabilidade, foi possível obter a similaridade entre os indivíduos de C. spixii e A. leari. Tais
dados estão sendo utilizados na orientação da escolha dos casais reprodutores dos programas de
reprodução em cativeiro visando minimizar o endocruzamento e manter a heterozigosidade e a
diversidade gênica dos plantéis. Além disso, 86 indivíduos de Anodorhynchus hyacinthinus de
diferentes localidades do Brasil (Pantanal Norte, Pantanal Sul (dividido em quatro subregiões),
Norte e Nordeste) foram analisados com microssatélites visando avaliar sua estrutura genética
populacional. Valores de F
ST,
estimados a partir de seis locos polimórficos sugerem moderada
diferenciação entre quatro grupos (Pantanal Norte, Pantanal Sul, Norte e Nordeste). Essa
informação é importante em conservação, pois em espécies com estruturação, cada população pode
constituir uma unidade de manejo. Também analisamos 24 indivíduos de A. hyacinthinus de quatro
apreensões sem procedência conhecida utilizando o teste de atribuição (assignment test) e 100% dos
indivíduos das duas primeiras apreensões foram atribuídos ao Norte, 100% da terceira apreensão ao
Pantanal Sul e 75% da quarta apreensão ao Pantanal Norte. Assim, foi possível indicar a possível
origem desses indivíduos apreendidos e tal informação pode ser utilizada no planejamento de
estratégias de fiscalização. Adicionalmente, foram calculados índices de similaridade genética de
filhotes de mesmo ninho no mesmo ano (16 pares), em anos consecutivos (62 pares) e em anos
alternados (37 pares) visando compreender melhor o comportamento reprodutivo de A.
hyacinthinus. Os resultados corroboram as observações de campo de que a espécie é monogâmica,
que alguns casais se reproduzem anualmente e outros casais, em anos alternados no mesmo ninho.
1
Abstract
Brazil holds the highest number of species of psitacids in the world (approximately 74),
being 17 of them threatened or endangered. Among them are Cyanopsitta spixii (extinct in the
wild), Anodorhynchus leari (critically endangered), and Anodorhynchus hyacinthinus (vulnerable).
In the present study samples of C. spixii and A. leari were analyzed with nuclear (microsatellite)
and mitochondrial (cytochrome b, control region, and ATPase 8) markers to estimate the genetic
similarity between individuals. Fourteen pairs of microsatellite primers were tested, eleven of them
generated amplification products, but only four were polymorphic and presented no deviation from
the Hardy-Weinberg equilibrium. No variation was not found between the mitochondrial sequences.
Indices of similarity and r were calculated between all pairs of individuals using the four
microsatellite loci. Despite the low variability, similarity values for C. spixii and A. leari were
obtained. This data is being used to help choose the breeding pairs in captivity in an attempt to
minimize inbreeding and to maintain the heterozygosity and the genetic diversity of the species.
Moreover, microsatellites from 86 individuals of Anodorhynchus hyacinthinus of different localities
from Brazil (north Pantanal, south Pantanal (divided in four areas), north and northeast) were
analyzed to determine the species´ population genetic structure. Estimated F
ST
from six
polymorphic loci suggest moderate differentiation between four groups (north Pantanal, south
Pantanal, north and northeast). This information is important for conservation purposes, as in
species that present population structure, each population could be treated as a management unit.
We also analized 24 individuals from four apprehensions with unknown origin. We used
assignment tests and 100% of the individuals from the first two apprehensions were attributed to the
north, 100% of the third apprehension to the south Pantanal and 75% of the fourth apprehension to
the north Pantanal. Thus, it was possible to infer the possible origin of these apprehended
individuals and this information can be used to plan more effective surveilance actions.
Additionally, indices of genetic similarity of chicks from the same nest in the same year (16 pairs),
in following years (62 pairs), and in alternate years were calculated (37 pairs), in order to help us
understand better the reproductive behavior of A. hyacinthinus. The results corroborate the field
observations that the species is strictly monogamous, that some couples reproduce annually, and
that other couples do so in alternate years in the same nest.
2
Capítulo I
Introdução Geral
Capítulo I
A presente Dissertação está organizada em capítulos que correspondem a uma introdução
geral, aos estudos realizados com as três espécies e que estão sendo preparados para publicação e a
uma discussão geral.
Os psitacídeos
A ordem Psittaciformes, que agrupa as araras, papagaios, periquitos e afins, compreende
cerca de 350 espécies distribuídas principalmente na faixa do globo entre os trópicos de Câncer e
Capricórnio (Collar, 1997; Rowley, 1997). Cerca de 27% das espécies são consideradas vulneráveis
ou ameaçadas de extinção (BirdLife International, 2000) sendo a perda de habitat o principal fator
para o declínio de muitas das espécies. No entanto, há outros fatores que contribuem muito com
essa redução populacional, como a introdução de espécies predadoras e competidoras, a endogamia
e outros processos relacionados ao tamanho populacional reduzido e o corte de árvores utilizadas
para ninho (Juniper e Parr, 1998). Além disso, algumas espécies possuem características que as
tornam valiosas comercialmente, como sua capacidade de imitar a voz humana, sua inteligência e
sua exuberante plumagem colorida (Snyder et al., 2000).
Todas as espécies desta ordem apresentam o bico recurvado com um cerne na base e pés
zigodáctilos, com o quarto e o primeiro dedos voltados para trás (Forshaw, 1989). Essas
características compartilhadas tornam a ordem bastante distinta das demais ordens de aves. No
entanto, mesmo com vários estudos baseados na morfologia externa (Salvadori, 1891, Peters, 1937),
em caracteres anatômicos e ecológicos (Verheyen, 1956), na associação de dados anatômicos,
morfológicos e etológicos (Smith, 1975), em análises de alozimas (Christidis et al., 1991) e na
análise de seqüências de DNA (Miyaki et al., 1998; Tavares et al., 2004; de Kloet e de Kloet,
2005), a sistemática do grupo necessita ser mais explorada.
Atualmente a ordem é dividida em duas famílias: Cacatuide (que abriga as cacatuas e
calopsitas; Rowley, 1997) e Psittacidae (que agrupa as demais espécies que ocorrem nas Américas,
na África e Austrália; Collar, 1997). No entanto, estudos filogenéticos recentes apontam que essa
classificação deveria ser revista (de Kloet e de Kloet, 2005). Em relação aos psitacídeos
neotropicais, as análises filogenéticas baseadas em seqüências de DNA indicam que pertençam a
um grupo monofilético (de Kloet e de Kloet, 2005; Tavares et al., aceito; Figura 1).
4
Capítulo I
Figura 1. Reconstrução filogenética por análise Bayesiana de 6416 pares de base de seqüências de DNAs
mitocondrial e nuclear de psitacídeos. Os valores dos nós correspondem aos valores de "bootstrap" de
máxima verossimilhança acima de 50% e aos valores de probabilidade posterior da análise Bayesiana,
respectivamente. A barra indica os táxons neotropicais (modificado de Tavares, 2005).
Os psitacídeos no Brasil
O Brasil é o país mais rico do mundo em número de espécies de psitacídeos (cerca de 74) e é
onde vivem os maiores representantes da família, as araras. Nos primeiros mapas do país esta
riqueza já era plenamente evidenciada, sendo chamado de “Terra dos Papagaios” (Sick, 1997). É
interessante citar que foram descritas novas espécies recentemente. Por exemplo, Silveira et al.
(2005) descreveram Aratinga pintoi, que habita o baixo rio Amazonas e Gaban-Lima et al. (2002)
descreveram uma espécie (Pionopsitta aurantiocephala) endêmica da região do médio rio Tapajós
e, possivelmente, no baixo rio Madeira. Dentre as espécies que ocorrem no Brasil, 17 estão
ameaçadas de extinção variando em diferentes graus (BirdLife International, 2000); duas foram
5
Capítulo I
extintas após a chegada dos europeus no Brasil: a Arara-azul-de-glaucus (Anodorhynchus glaucus)
e a Ararinha-azul (Cyanopsitta spixii), uma encontra-se criticamente ameaçada de extinção
(Anodorhynchus leari), sete são ameaçadas, seis são classificadas como vulneráveis, e uma é
considerada como “quase-ameaçada” (BirdLife International 2000).
Os psitacídeos podem ser encontrados em todos os principais ecossistemas do Brasil.
Aproximadamente 17% das espécies existentes no mundo são endêmicas do Brasil, sendo que a
região de maior endemismo é a Floresta Atlântica. No entanto, a região Amazônica é a região mais
rica, tanto em número de indivíduos, como de espécies (Sick, 1997). Algumas espécies apresentam
atualmente uma distribuição bastante restrita, como é o caso da Arara-azul-de-lear (Anodorhynchus
leari) na caatinga da Bahia. Já outras apresentam uma ampla distribuição, ocorrendo em grande
parte do território nacional, como a Arara-vermelha (Ara chloroptera) ou o Papagaio-do-mangue,
Amazona amazonica (Sick, 1997).
A maioria das espécies é monogâmica, com o casal permanecendo unido por toda a vida
(Sick, 1997). O casal divide as tarefas de cuidado da prole, permanecendo no ninho a maior parte do
tempo. Utilizam principalmente ocos em troncos de árvores para a reprodução. Algumas espécies
também utilizam cavidades nas encostas de morros e montanhas, como a Ara chloroptera e a
Anodorhynchus leari; ou em cupinzeiros, como o Periquito-da-caatinga (Aratinga cactorum) ou o
Papagaio-verdadeiro (Amazona aestiva). A caturrita (Myiopsitta monachus) é o único psitacídeo
que constrói ninho utilizando gravetos (Sick, 1997).
O período reprodutivo no Brasil, que se estende de julho até março, pode variar de acordo
com a espécie e com as condições climáticas. O início e o término do período reprodutivo também
variam de acordo com a espécie, sendo que as menores normalmente se reproduzem mais cedo no
ano do que as espécies maiores. A postura pode variar de um a cinco ovos, dependendo da espécie.
A postura em Anodorhynchus hyacinthinus é de no máximo três ovos (Guedes, 1993), enquanto
para a Arara-canindé (Ara ararauna) já foram observados cinco ovos (Bianchi, 1998). O tempo de
incubação pode variar de 30 dias em espécies maiores a 18 dias para espécies menores, como
Forpus xanthopterygius (Sick, 1997).
Os psitacídeos procuram alimento tanto nas copas das árvores mais altas como em arbustos
frutíferos. Existem espécies que apresentam uma dieta especializada composta basicamente por
apenas um item alimentar, como a Anodorhynchus leari que se alimenta de licuri (Syagrus
coronata), embora outras fontes de alimento adicionais ou esporádicas são também citadas
(Yamashita, 1987; Lima, 2004). Por outro lado, existem espécies que apresentam uma dieta
bastante diversificada, como é o caso da Maitaca-verde, Pionus maximilliani (Sick, 1997).
6
Capítulo I
A maioria das espécies não apresenta dimorfismo sexual, ou seja, não possuem
características morfológicas externas que permitam a diferenciação entre machos e fêmeas, as
exceções são o Sabiá-cica (Triclaria malachitacea), o Tuim (Forpus xanthopterygius) e o Cuiú-cuiú
(Pionopsitta pileata) (Sick, 1997).
A seguir as três espécies de psitacídeos que são alvos do presente estudo são brevemente
apresentadas.
Ararinha-azul (
Cyanopsitta spixii
)
A Ararinha-azul (Cyanopsitta spixii, Figura 2) apresenta a cauda proporcionalmente mais
longa e as asas mais longas e estreitas quando comparadas com os outros psitacídeos, inclusive as
araras (Sick, 1997). Ela possui plumagem azul, sendo as asas e a cauda mais escuras, a região
abaixo dos olhos cinzento bem claro e a íris amarela. Possui bico negro provido de um grande dente
maxilar (Sick, 1997).
Flavia Presti
Figura 2. Exemplar de Cyanopsitta spixii
O primeiro espécimen de C. spixii foi coletado em 1819 por Johan Baptista von Spix,
próximo ao rio São Francisco, em Curaçá, na caatinga do extremo norte da Bahia (Juniper e
Yamashita, 1990). Em 1996, somente três ararinhas foram vistas nessa região (Roth, 1987). Em
1998 acreditava-se que todas haviam sido capturadas e que a espécie estava extinta na natureza
(Juniper e Yamashita, 1990). No entanto, no final da década de 80 foi encontrado um único
indivíduo associado a um grupo de maracanãs (Primolius maracana), na região onde o primeiro
espécimen foi encontrado (Juniper e Yamashita, 1990). Esse exemplar desapareceu em outubro de
2000.
7
Capítulo I
Atualmente, a situação dessas aves é muito crítica, pois não há mais nenhum representante
dessa espécie em vida livre e é considerada a ave mais ameaçada de extinção no mundo. Juniper e
Yamashita (1990) atribuem o declínio da população de C. spixii à redução do habitat, à competição
por ninho com abelhas africanas, à caça ilegal e à captura de filhotes. Durante as últimas décadas,
uma das principais causas do extermínio dessa espécie foi o intenso comércio ilegal.
Os poucos dados conhecidos indicam que ela era encontrada na mata ciliar associada a
riachos temporários próximos ao Rio São Francisco. Essa mata ciliar aberta possui árvores bem
mais altas do que as da caatinga ao seu redor e nessa mata predominam as caraibeiras (Tabebuia
caraiba), que C. spixii utilizava para nidificar. Sua dieta era composta de frutas e sementes,
sobretudo de Euphorbiaceae (Jatropha e Cnidoscolus; Sick, 1997).
O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) é
responsável pela conservação da espécie e coordena o programa de reprodução em cativeiro que
está em andamento, sendo este o único caminho para uma possível recuperação dessa espécie. Sabe-
se que atualmente existem cerca de 60 indivíduos pelo mundo. A última atualização do “Studbook”
(livro de registros internacional) foi realizada em 1996 e nele consta o registro de 39 indivíduos,
sendo somente nove originalmente provenientes da natureza e 30 nascidos em cativeiro (sendo 21
filhotes de um único casal). Atualmente, somente nove estão sob tutela do IBAMA e participam do
programa de conservação brasileiro. Em 2002, nosso laboratório foi convidado e aceitou participar
desse programa contribuindo com as análises genéticas.
Arara-azul-de-lear (
Anodorhynchus leari
)
A Arara-azul-de-lear (Anodorhynchus leari, Figura 3) é muito semelhante à Arara-azul-
grande (Anodorhynchus hyacinthinus); porém é nitidamente menor, de porte mais franzino. Possui
cabeça e pescoço azul-esverdeado, barriga azul-desbotado, com as costas e parte superior das asas e
da cauda azul-cobalto. Seu anel perioftálmico amarelo é relativamente claro, sua pálpebra é azul-
clara ou branca e a barbela é mais arredondada quando comparada à de A. hyacinthinus (Sick,
1997).
8
Capítulo I
Joaquim dos Santos
Figura 3. Exemplar de Anodorhynchus leari
Essa espécie ocorre no nordeste da Bahia, numa região chamada Raso da Catarina (Figura
4), que abrange os Municípios de Canudos, Euclides da Cunha e Jeremoabo. É a única arara dessa
região. Parte da área de ocorrência está dentro da "Estação Ecológica do Raso da Catarina", criada
em 1975 pela Secretaria do Estado do Meio Ambiente (SEMA). Utiliza como moradia e ninho as
aberturas formadas nas íngremes paredes de "canyons" de arenito (Figura 5). Sua alimentação
habitual são os cocos do licuri (Syagrus coronata).
Joaquim dos Santos
Flavia Presti
Figura 5. Cavidades no "canyon" utilizadas
por Anodorhynchus leari
Figura 4. Vista da Serra Branca, Raso da Catarina
Em 1986, a população de Anodorhynchus leari foi estimada por Carlos Yamashita em 60
indivíduos, vivendo em duas colônias no Raso da Catarina e mostravam sinais de carência alimentar
como barras falhadas nas penas e possível endogamia (Sick, 1997). Atualmente, A. leari é
considerada uma espécie criticamente ameaçada de extinção, apresentando uma população estimada
em 500 aves na natureza (dados não publicados do IBAMA).
Diante desse quadro, o IBAMA, que é responsável pela conservação da espécie, coordena o
programa de conservação in situ e a reprodução em cativeiro, ambos em andamento, para assegurar
9
Capítulo I
a viabilidade da população na natureza e evitar uma possível extinção da espécie. Nosso laboratório
também colabora com as análises genéticas do plantel cativo dessa espécie.
Arara-azul-grande (
Anodorhynchus hyacinthinus
)
A Anodorhynchus hyacinthinus (Figura 6) se destaca pela sua beleza e por ser o maior
psitacídeo existente, chegando a medir um metro da ponta do bico à ponta da cauda. Ela apresenta
plumagem azul-cobalto com colorido amarelo na porção mandibular e no anel perioftálmico. Seu
bico é desmensurado, maciço e curvo, sendo a maxila móvel e articulada ao crânio, o que aumenta a
sua potência (Forshaw, 1989; Guedes, 1993; Sick, 1997).
Figura 6. Exemplares de Anodorhynchus hyacinthinus
N
eiva Guedes
A alimentação é baseada em sementes, nozes e frutos. No Pantanal matogrossense sua
alimentação é especializada no fruto de duas palmáceas: bocaiúva (Acromia totai) e acuri (Schelea
phaleata). Em outras regiões como no Piauí, Tocantins e Maranhão, A. hyacinthinus se alimenta de
endocarpo e mesocarpo de piaçava (Atalea funifera) e catolé (Syagrus coronata). Já na região de
Carajás e Altamira se alimentam de inajá (Maximiliana regia), babaçu (Orbignya phalerata) e
tucuman (Astocarym sp) (Munn et al., 1989; Guedes, 1993).
Vivem em buritizais, nas matas ciliares e no cerrado adjacente. No Pantanal nidifica em
apenas uma espécie de árvore, o manduvi Sterculia apetala (Guedes, 1993; Pinho e Nogueira,
2003) (Figura 7). Elas aumentam pequenas cavidades feitas por pica-paus, ou provocadas pela
quebra de galhos, ou mesmo iniciadas pela ação de fungos e cupins para construir seu ninho. As
cavidades são reutilizadas todos os anos como locais de reprodução (Pinho e Nogueira, 2003),
10
Capítulo I
podendo ser utilizadas por mais de um casal, uma vez que possivelmente a maioria dos casais se
reproduza a cada dois anos, pois investem um ano no cuidado do filhote (Guedes, 1993). Ao
nascerem, os filhotes são totalmente dependentes dos pais, permanecendo longos períodos nos
ninhos, em média 107 dias, período ao qual ficam expostos a predação e mortalidade. Após o vôo
os jovens ainda são dependentes dos pais para alimentação e a separação somente ocorre após 12 a
18 meses. A. hyacinthinus voa em pares ou em grupo e no final da tarde se reúnem em locais
chamados “dormitórios” ficando evidente o alto grau de socialização que possuem (Figura 8). Os
casais, por exemplo, são extremamente fiéis e dividem as tarefas de cuidar dos filhotes (Guedes e
Harper, 1995).
Paulo Antas
Figura 8. Araras-azuis em dormitório
Projeto Arara -azul
Fi
g
ura 7. Filhote e ovo em ninho no manduvi
O número total de indivíduos em vida livre no Brasil está estimado em 5.000, distribuídos
em 3 regiões: no Pará (leste da região amazônica e oeste de Altamira), no nordeste do país (região
entre Tocantins, Piauí, Maranhão e Bahia) e no Pantanal Matogrossense, onde se encontra a maioria
dos indivíduos (Collar et al., 1997; Guedes e Harper, 1995). Embora a A. hyacinthinus não seja
muito rara atualmente, pode-se tornar ameaçada num futuro próximo, em conseqüência do intenso
tráfico ilegal (Guedes e Harper, 1995). Atualmente ela é considerada vulnerável (BirdLife
International 2000).
Genética aplicada à conservação
As primeiras revisões relacionadas a este tema foram publicadas no início da década de 80
(Soulé e Wilcox, 1980; Shonewald-Cox et al., 1983). Naquela época, os trabalhos resumiam-se
praticamente a estimativas de variabilidade genética e a sua extrapolação para a estimativa do
tamanho efetivo de populações ameaçadas (Solé-Cava, 2001). Contudo, anos mais tarde uma
grande diversidade de problemas começaram a ser abordada e esta área de conhecimento se
encontra em plena expansão.
11
Capítulo I
O desenvolvimento e o aperfeiçoamento de diversas técnicas da Biologia Molecular são os
principais responsáveis pelo rápido crescimento desta área de conhecimento, pois propiciou a
identificação e o acesso a diferentes marcadores moleculares. O termo marcador molecular pode ser
definido como qualquer loco gênico ou seus produtos que apresentam alguma variabilidade que nos
permita estudar algum problema biológico (Avise, 1994). Essa definição, apesar de simples, traz um
conceito muito importante para a Genética na Conservação, que é a variabilidade. A variabilidade
genética é a matéria prima para a ação da seleção natural e, portanto, para a evolução das espécies.
Diversas técnicas estão disponíveis para a detecção da variabilidade genética, ou seja, para a
detecção de polimorfismo genético. Podemos citar, por exemplo, a eletroforese de enzimas utilizada
por Harris (1966), Johnson et al. (1966) e Hubby e Lewontin (1966) nos estudos da variabilidade
genética em populações humanas e de drosófila. Atualmente, outras técnicas permitem acessar
diretamente a variabilidade presente nos ácidos nucléicos. Características intrínsecas do DNA
proporcionaram vantagens em relação ao estudo de aloenzimas quando utilizados em estudos de
genética na conservação. Uma delas é que esta molécula está presente em quase todos os tipos
celulares de todos os organismos e pode ser extraído de tecido vivo ou morto.
Dentre as técnicas moleculares, a metodologia descrita por Jeffreys e colaboradores em 1985
("DNA fingerprinting") detecta simultaneamente várias regiões do genoma conhecidas como
minissatélites. Essas seqüências são constituídas de repetições altamente variáveis quanto ao seu
número. Esta técnica revelou ser útil, entre outras aplicações, na estimativa da variabilidade
genética de diversas espécies de aves (Rave et al., 1995; Albertani et al., 1997), inclusive de
Cyanopsitta spixii (Caparroz et al., 2001a), no estudo da biologia da reprodução (Gibbs et al., 1994;
Caparroz et al., 2001b), na determinação do sexo em diversas espécies de psitacídeos (Miyaki et al.,
1993, 1995 e 1997a) e na análise de paternidade (Mathé et al., 1993, Miyaki et al., 1993, 1997b,
Albertani et al., 1997).
No entanto, os dados resultantes da utilização dessa técnica não são os mais adequados para
estudos populacionais, pois não é possível identificar os alelos. Um marcador que tem sido muito
utilizado nesses estudos é o DNA mitocondrial (DNAmt; Taberlet, 1996). Uma das maneiras de
estudar essa molécula é pelo seu seqüenciamento e, com o desenvolvimento da técnica de reação
em cadeia da polimerase (PCR), o seqüenciamento de DNA tornou-se tecnicamente mais acessível.
Um exemplo da utilização do seqüenciamento em estudos populacionais de psitacídeos é o trabalho
feito em nosso laboratório com o Papagaio-da-cara-roxa (Amazona brasiliensis). Essa espécie
ameaçada de extinção ocorre do litoral sul paulista até o litoral norte de Santa Catarina. Amostras
de indivíduos de São Paulo e do Paraná, que possuem vocalização diferente, não mostraram
diferenciação genética (Craveiro, comunicação pessoal). Tal resultado corrobora análises feitas com
12
Capítulo I
a mesma amostra de indivíduos, mas com outros marcadores moleculares (Caparroz, 1998; Faria,
2000).
Em um outro trabalho, Faria (2000) analisou amostras de indivíduos de Anodorhynchus
hyacinthinus do Pantanal e do Piauí com 3 locos de minissatélites, um loco de microssatélite e
seqüências mitocondriais. Foi encontrada uma leve diferenciação genética entre os grupos de cada
região. Já no caso da Arara-vermelha (Ara chloroptera), que não é considerada ameaçada, amostras
de indivíduos do Pantanal foram comparadas com indivíduos provavelmente do Norte/Nordeste do
país com os mesmos marcadores. Os resultados indicaram ausência de diferenciação populacional
(Faria, 2000).
Além disso, trabalhos utilizando DNAmt têm auxiliado na identificação das regiões mais
adequadas para implantação de unidades de conservação para o urso marrom (Taberlet e Bouvet,
1994), na identificação de unidades de manejo, isto é, populações diferenciadas geneticamente de
duas espécies de antílopes (Matthee e Robinson, 1999), na escolha de estratégias para a conservação
da onça-pintada (Eizirik et al., 2001), entre muitos outros.
Microssatélites
Experimentos no início dos anos 80 mostraram que os genomas eucariotos são densamente
povoados por diferentes classes de seqüências repetidas, algumas mais complexas e outras mais
simples (Hamada et al., 1982; Tautz e Renz, 1984). Seqüências simples repetidas SSR (“Simple
Sequence Repeats”) ou STR (“Short Tandem Repeat”), mais tarde denominadas de microssatélites,
são compostas de unidades de seqüências repetidas “em tandem” que podem variar de 1 a 10 pb.
Tais unidades de repetição são altamente variáveis quanto ao seu número e um microssatélite possui
cerca de 100 pb no total (Bruford et al., 1996). Microssatélites têm sido observados no genoma de
diversos organismos, como seres humanos (Litt e Luty, 1989), camundongos (Love et al., 1990),
bovinos e caprinos (Moore et al., 1991), entre muitos outros. São seqüências relativamente
freqüentes e distribuídas ao acaso, permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma. No
entanto, em aves, aparentemente ocorrem em menor freqüência em relação a outros organismos
(Hearne et al., 1992; Primer et al., 1997).
Esse marcador é facilmente amplificado por PCR, não necessitando de grande quantidade
inicial de DNA molde. Outra vantagem de seu uso em comparação a outros marcadores é o fato de
possuir polimorfismo elevado devido à alta variação no número de repetições, isso pode ocorrer até
entre alelos de um mesmo loco. Além disso, os locos possuem expressão co-dominante, ou seja,
ambos os alelos de um heterozigoto geralmente são facilmente visualizados e são multialélicos,
13
Capítulo I
facilitando a caracterização de diferentes populações pela análise de freqüência gênica (Bruford et
al., 1996).
A taxa de mutação dos microssatélites foi estimada entre 10
-4
a 10
-6
por geração (Dallas,
1992). Em geral, essas mutações correspondem a mudanças no número de repetições,
provavelmente causadas por “DNA slippage”, ou seja, erros da polimerase de DNA durante a
replicação (Schlotterer e Tautz, 1993; Schlotterer, 1998). Um dos modelos de mutação envolvido na
evolução dos microssatélites sugere que o ganho ou perda de uma ou mais unidades de repetição
depende se uma alça se forma na fita que está sendo sintetizada ou na fita molde, respectivamente
(Eisem, 1999). Um outro processo que também tem sido considerado como potencialmente
responsável pela variabilidade é o de recombinação entre moléculas de DNA (Hancock, 1999). Isso
poderia ocorrer de duas formas: 1) permuta desigual, causando uma perda em uma das moléculas de
DNA e uma inserção na outra molécula, sendo possível envolver moléculas do mesmo cromossomo
e em cromossomos diferentes ou 2) conversão gênica, pela transferência unidirecional de uma parte
de uma molécula para outra molécula (Armour et al., 1999). No entanto, o processo de mutação dos
microssatélites parece ser extremamente complexo (Anderson et al., 2000) e uma série de modelos
evolutivos tem sido propostos para explicar o processo de evolução dos microssatélites.
O modelo evolutivo mais utilizado é o Stepwise Mutation Model (SMM) descrito por Ohta e
Kimura (1973), no qual cada mutação gera um novo alelo pela adição ou subtração de uma única
unidade de repetição, com igual probabilidade em ambas as direções. Há alguns estudos que
indicam que a maioria das mutações realmente envolve a adição/subtração de uma única unidade de
repetição, com poucas mutações envolvendo duas ou mais unidades (Primmer et al., 1998; Xu et
al., 2000). Dentre os outros modelos, o denominado como modelo dos alelos infinitos (Infinite
Allele Model, IAM; Kimura e Crow, 1964) também é freqüentemente utilizado. Neste modelo, cada
mutação sempre gera um alelo novo a uma taxa constante, isto é, alelos idênticos compartilham o
mesmo ancestral, são idênticos por descendência e podem ter adição ou subtração de uma ou mais
unidades de repetição (Goldstein et al., 1995; Takezaki e Nei, 1996).
A maior limitação para o uso de microssatélites é a grande quantidade de trabalho necessário
para o desenvolvimento de "primers" para sua amplificação. O protocolo de obtenção dos
microssatélites envolve a construção de biblioteca genômica, a localização e isolamento de clones
contendo microssatélites, seu seqüenciamento, o desenvolvimento de um par de “primers” para cada
loco e o teste dos “primers” para caracterizar se o loco apresenta polimorfismo. Em alguns casos é
possível utilizar "primers" desenvolvidos para um determinado táxon em outra espécie e mesmo em
outros gêneros (“primers” heterólogos). Isso resulta em economia de tempo e de esforços no
desenvolvimento de bibliotecas genômicas. Além do esforço envolvido no seu desenvolvimento,
14
Capítulo I
outra limitação dos microssatélites são as mutações no local de hibridação do “primer”, gerando os
alelos nulos, decorrentes da ausência de amplificação de um dos alelos. Se um excesso de
homozigotos for detectado somente em um loco, suspeita-se da ocorrência de alelos nulos. Por isso,
é necessário realizar a análise de mais de um loco e também do seu padrão de segregação
(Schlotterer, 1998). Além disso, é comum obter bandas adicionais, originadas de “DNA slippage”
durante a reação de amplificação, sendo mais freqüente em repetições dinucleotídicas do que tri ou
tetranucleotídicas (Schlotterer, 1998).
Desde as primeiras publicações (em uma edição especial do periódico “Molecular Ecology”
de 1994), o uso de microssatélites em estudos de genética da conservação tem se proliferado
(Beaumont e Bruford, 1999). Os microssatélites vêm sendo utilizados, por exemplo, em estudos de
estrutura de populacional (Broders et al., 1999; Waits et al., 2000; Chan e Arcese, 2002), para
estimar grau de parentesco (Blouin et al., 1996; Burland et al., 2001) e na detecção de hibridação
(Beaumont e Bruford, 1999).
No caso de psitacídeos, Hughes et al. (1998) descreveram oito pares de “primers” que
reconhecem locos polimórficos de microssatélites em Forpus passerinus. Os mesmos “primers”
foram testados em outras cinco espécies neotropicais pertencentes a três gêneros diferentes
(Brotogeris jugularis, Aratinga pertinax, A. canicularis, Amazona auropalliata e A. albifrons) e
foram encontrados somente locos monomórficos.
Russello et al. (2001) desenvolveram “primers” para nove locos de microssatélites altamente
variáveis no papagaio Amazona guildingii. Esses “primers” também apresentaram produto de
amplificação em outras oito espécies (dos gêneros Amazona, Ara, Aratinga e Pionus), mas o nível
de polimorfismo não foi avaliado. Dos nove locos, cinco produziram bandas em Ara ararauna e,
segundo os autores, seria esperado obter sucesso de amplificação para as outras espécies de araras
(Russello et al., 2001).
Mais recentemente, Caparroz et al. (2003) desenvolveram “primers” para sete locos de
microssatélites de Arara-canindé (Ara ararauna). Dos sete, cinco se mostraram polimórficos para
essa espécie.
O uso de microssatélites em análises de parentesco
O conhecimento sobre o grau de parentesco entre os indivíduos é muito útil em estudos de
evolução e comportamento e tem se tornado um dos principais temas no campo da “ecologia
molecular” (Avise, 1994). Entretanto, muitas vezes o completo pedigree dos indivíduos não pode
ser determinado devido a limitações, como dificuldade na captura dos adultos ou, em alguns casos,
a família social não ser a família biológica (De Casteele et al., 2001). Por essas razões, estudos
genéticos estão sendo muito utilizados nessa abordagem. Muitos trabalhos têm demonstrado que
15
Capítulo I
microssatélites são muito eficientes para elucidar o sistema de acasalamento, usando dados de
parentesco entre os indivíduos. Alderson et al. (1999) estudando a ave Molothrus ater,
comprovaram a sua monogamia, assim como Martinez et al. (1998) observaram o mesmo tipo de
resultado para outra ave (Clamator glandarius). Um estudo com morcegos Plecotus auritus
mostrou que muitos indivíduos apresentavam alta probabilidade de serem filhotes de machos
provenientes de outras colônias, sugerindo a existência de dispersão mediada pelos machos
(Burland et al., 2001). Resultado oposto foi encontrado por Taylor et al. (1997) estudando o
marsupial Lasiorhinus krefftii no qual os machos e fêmeas da mesma colônia são igualmente mais
relacionados quando comparados com pares formados ao acaso de colônias diferentes, sugerindo
filopatria de ambos os sexos.
Outra aplicação das análises de parentesco é a escolha de casais fundadores para reprodução
em cativeiro. A população deve ser manejada com objetivo de reter o máximo de variação genética
a fim de gerar uma população viável a longo prazo. Um exemplo dessa abordagem é o estudo feito
por Jones et al. (2002), com dados de microssatélites para adicionar informações sobre o pedigree
dos indivíduos e auxiliar o manejo de uma espécie de ave ameaçada de extinção, Grus americana.
O uso de microssatélites em análises de estrutura populacional
Além da abordagem da identificação genética de indivíduos, a identificação genética de
populações é muito importante para a conservação de espécies, uma vez que estas podem ser
constituídas de unidades distintas. Quando uma população se divide em sub-populações isoladas, a
deriva genética pode levar à perda de alelos fazendo com que as freqüências alélicas das sub-
populações se tornem distintas e isso pode ser quantificado pelo índice F de Wright (1931). Esse
índice utiliza dados de freqüência alélica obtidos de distintas localidades para quantificar a
subdivisão da população e estimar o fluxo gênico (Hartl e Clark, 1997). O índice F também pode
ser estimado em termos da variância das freqüências dos alelos (F
ST
).
De maneira geral, populações de espécies em declínio podem se apresentar estruturadas,
pois a degradação ambiental leva à formação de refúgios onde pequenas populações persistem. Isso
foi observado em um estudo com microssatélites em Gulo gulo. Esse mamífero ocorre por todo o
Alasca e foi observada maior estruturação genética populacional na região sul, que foi mais
degradada pela ação antrópica (Kyle e Strobeck, 2001). Resultados semelhantes foram encontrados
por Caizergues et al. (2003) estudando o efeito da fragmentação do habitat na ave Tetrao tetrix.
Nesse trabalho foi encontrada significante diferenciação genética entre as localidades estudadas
devido à presença de barreiras causadas pela destruição da paisagem natural e a ação da deriva
genética. Em um outro exemplo, foi sugerido que a diferenciação genética em uma pequena
16
Capítulo I
população do mamífero Tamias amoenus provavelmente ocorreu devido ao forte efeito da deriva
(Schulte-Hostedde et al., 2001).
No caso de organismos que exibem organização social complexa, é importante conhecê-la,
pois esta leva à melhor compreensão de como a variação genética é dividida nas sub-populações
(mesmo em panmixia uma população pode formar grupos reprodutivos distintos). As informações
de diferenciação entre as sub-populações e as taxas de endocruzamento podem ajudar a entender
quais aspectos da biologia do organismo influenciam seu nível de variação genética (Sugg et al.,
1996).
Alguns índices de fixação podem ser utilizados para estimar estruturação ao nível de
organização social: F
IS
(variação dentro da sub-população) e F
IT
(variação total na população)
(Wright, 1978). Valores positivos de F
IS
e F
IT
indicam que nas sub-populações e na população,
respectivamente, existe endocruzamento. Esses índices ajudam a determinar a existência de
filopatria ou dispersão diferencial dos sexos (Sugg et al., 1996). Por exemplo, para a ave Lagopus
lagopus foi relatado grau de parentesco mais alto entre os machos do que entre as fêmeas, sugerindo
a existência de comportamento territorial e filopatria dos machos. Entretanto, o valor negativo do
coeficiente de endocruzamento revelou fluxo gênico promovido pela dispersão das fêmeas (Piertney
et al., 1998).
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22
Capítulo I
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23
Objetivos
O presente estudo tem por finalidades:
• Avaliar a variabilidade genética em Cyanopsitta spixii, Anodorhynchus leari e
Anodorhynchus hyacinthinus utilizando marcadores moleculares (microssatélites e
seqüências mitocondriais);
• Estimar a similaridade genética entre indivíduos de C. spixii e A. leari dos programas de
reprodução em cativeiro, para identificar casais com menor similaridade visando minimizar o
endocruzamento e manter a heterozigosidade e a diversidade dos plantéis;
• Caracterizar a estrutura populacional de A. hyacinthinus, para auxiliar o plano de
conservação da espécie e verificar a origem de indivíduos sem procedência conhecida;
• Estimar a similaridade genética entre filhotes de A. hyacinthinus encontrados no mesmo
ninho, visando testar a hipótese de monogamia para a espécie.
24
Capítulo II
Análise da variabilidade genética em
Cyanopsitta spixii
e
Anodorhynchus leari
(Psitaciformes, Aves): implicações para
reprodução em cativeiro e conservação
Capítulo II
Introdução
A ordem Psittaciformes compreende cerca de 350 espécies, sendo aproximadamente 27%
delas ameaçadas de extinção, variando em diferentes graus (Birdlife International, 2000). A
destruição de habitat é o principal fator para o declínio de muitas espécies. No entanto, há outros
fatores associados como tamanho populacional reduzido, retirada de indivíduos da natureza para
comércio e arte indígena, caça e coleta de ovos e de filhotes e retirada de árvores utilizadas como
ninho (Juniper e Parr, 1998; Snyder et al., 2000). As duas espécies de psitacídeos mais ameaçadas e
endêmicas do Brasil são alvo do presente estudo e algumas características da cada uma delas estão
descritas a seguir.
A ararinha-azul (Cyanopsitta spixii) está extinta na natureza e é considerada a espécie de ave
mais ameaçada do mundo, restando apenas 60 indivíduos cativos. Juniper e Yamashita (1990)
atribuem o declínio da população de C. spixii à redução do habitat, competição por ninho com
abelhas africanas, caça ilegal e captura de filhotes. Durante as últimas décadas, uma das principais
causas do extermínio dessa espécie foi o intenso comércio ilegal. O primeiro espécimen de C. spixii
foi coletado em 1819, próximo ao rio São Francisco, em Curaçá, na caatinga da Bahia (Juniper e
Yamashita, 1990). Em 1996, somente três ararinhas foram vistas nessa região (Roth, 1987). Em
1998 se acreditava que todas haviam sido capturadas e que a espécie estava extinta na natureza.
Mas no final da década de 80 foi encontrado um único indivíduo associado a um grupo de
maracanãs (Primolius maracana), na região onde o primeiro espécimen foi encontrado (Juniper e
Yamashita, 1990). Esse indivíduo desapareceu em outubro de 2000.
A Arara-azul-de-lear (Anodorhynchus leari) ocorre no Raso da Catarina (região na caatinga
da Bahia). Em 1986 a população de A. leari foi estimada por Carlos Yamashita em 60 indivíduos,
vivendo em duas colônias e mostravam sinais de carência alimentar como barras falhadas nas penas
e possível endogamia (Sick, 1997). Atualmente, A. leari é considerada uma espécie criticamente
ameaçada de extinção, apresentando uma população estimada em 500 aves na natureza (dados não
publicados do IBAMA). E existe pouca informação sobre a biologia dessa espécie.
O IBAMA é responsável pelos programas de reprodução em cativeiro das duas espécies e
também conta com um programa de proteção de A. leari na natureza. Para a C. spixii, o único
caminho para evitar a sua extinção é o sucesso do programa de reprodução em cativeiro.
Programas de reprodução em cativeiro têm sido usados no manejo de muitas espécies
ameaçadas de extinção (Kalinowski et al., 2000; Jones et al., 2002; Russello e Amato, 2004).
Acessar e manter a variabilidade genética são ações importantes nos programas para evitar o
endocruzamento e para manter a variabilidade genética das futuras gerações (Ballou e Foose, 1995;
Lacy et al., 1996). Para atingir esse objetivo, a seleção dos melhores casais fundadores é realizada
26
Capítulo II
baseada nos dados dos “studbooks” (livro de registro das espécies) onde constam informações sobre
o parentesco dos indivíduos e por meio do qual é possível tentar reconstruir a composição da
população ancestral (Ballou e Foose, 1995). Entretanto, os “studbooks” podem estar incompletos
(Morin e Ryder, 1991; Haig et al., 1994), desatualizados (como é o caso da C. spixii), ou mesmo
serem inexistentes (como ocorre com A. leari). No caso de A. leari, como a maioria dos indivíduos
cativos são provenientes de apreensões em ações de repressão ao tráfico de animais, não há
qualquer informação disponível sobre a origem na natureza e o parentesco entre indivíduos.
Os microssatélites são altamente polimórficos, possuindo uma elevada taxa de mutação (10
-4
a
10
-6
por geração), além de apresentarem expressão co-dominante e serem considerados como
seletivamente neutros (Hartl e Clark, 1997). Eles são marcadores muito úteis na identificação
individual e para estimar a similaridade genética entre indivíduos. Outra característica interessante é
a possibilidade da utilização de "primers" de microssatélites descritos para espécies
filogeneticamente próximas à espécie de interesse (Schlötterer et al., 1991). Um outro marcador útil
no estudo de relações entre indivíduos é o DNA mitocondrial que é utilizado na identificação de
matrilinhagens. Dentro do genoma mitocondrial de paitacídeos, o citocromo b, a região
controladora e a ATPase 8 possuem altas taxas de mutação e, portanto, podem apresentar alto grau
de polimorfismo (Tavares et al., 2004; Tavares, comunicação pessoal).
O objetivo do presente trabalho é estimar a similaridade genética entre indivíduos de C. spixii
e A. leari. Tais dados estão sendo utilizados na orientação da escolha dos casais reprodutores dos
programas de reprodução em cativeiro visando minimizar o endocruzamento e manter a
heterozigosidade e a diversidade gênica dos plantéis. Para atingir esse objetivo foram utilizadas
análises de microssatélites e de seqüências do DNA mitocondrial (citocromo b, região controladora
e ATPase 8).
Materiais e métodos
Amostras de sangue (0,1 ml) de 13 indivíduos de C. spixii e de 32 A. leari foram recebidas
do IBAMA. Atualmente, todos esses indivíduos estão em cativeiro. As amostras foram estocadas
em etanol absoluto a –20
o
C e foram depositadas no acervo do Laboratório de Genética e Evolução
Molecular de Aves (LGEMA) do Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo.
O heredograma disponível com alguns indivíduos de C. spixii está representado na Figura 1.
É possível que alguns dos indivíduos (números 2 a 12) sejam aparentados, pois todos foram
retirados da natureza. O mesmo deve ocorrer com a ave N, mas seu histórico é mal conhecido.
Todos os demais indivíduos nasceram em cativeiro. Como pode ser observado, poucos casais têm
27
Capítulo II
contribuído com o aumento do plantel. Já as relações entre os indivíduos de A. leari não são
conhecidas, pois todos são provenientes de apreensões no território nacional.
Indivíduos não amostrados
2
5
8
9
N
10 11 12
7
3
6
73 74
19
46
45
34
61
62
18
26
35
Indivíduos amostrados mortos
Indivíduos amostrados
Figura 1. Heredograma de alguns indivíduos de Cyanopsitta spixii. Os números correspondem ao
registro no “studbook”
As amostras de DNA total foram extraídas individualmente utilizando o protocolo padrão de
digestão com proteinase K seguida de purificação com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Bruford
et al., 1992).
Microssatélites
Quatorze locos de microssatélites foram testados (Tabela 1). Sete dos “primers” foram
obtidos a partir de uma biblioteca genômica desenvolvida por Caparroz et al. (2003) para Arara-
canindé (Ara ararauna). Dois destes locos (UnaCT35 e UnaCT84) ainda não foram publicados.
Outros cinco pares de “primers” foram desenvolvidos para uma espécie de papagaio (Amazona
guildingii) endêmico da Ilha de Saint Vincent no Caribe (Russello et al., 2001). Os outros dois
pares foram desenvolvidos para Anodorhynchus hyacinthinus pelo Dr. Scott K. Davis, da "Texas A
and M University", EUA (não publicados).
28
Capítulo II
Tabela 1. Seqüências dos “primers” de microssatélites
Loco
Seqüência dos primers (5’ → 3’)
Referência
UnaCT21 (CT21) F: CTTTCCCATACTTAGCCATA
R: AGACATTTCAAGACCGTGCC
Caparroz et al., 2003
UnaCT32 (CT32) F: TCTTGCTTATTCTTCCCCAG
R: ACCACCACCAGGAAGCACGG
Caparroz et al., 2003
UnaCT35 (CT35) F: TTCTATCCCTTTTTGTCAGC
R: TAGCTAGATTTTCTTCTCTG
Caparroz, não publicado
UnaCT43 (CT43) F: TCATCCTATCACCAGAAGGG
R: CTTGAGGACAGTGCAGAGGG
Caparroz et al., 2003
UnaCT74 (CT74) F: CTGGACTGCTGCTCTTAACA
R: AGCCTGAAGTGAACTGCATG
Caparroz et al., 2003
UnaCT84 (CT84) F: ACAGTGAAGCTTGAATCTTA
R: CCAAGTTTAGGAGGAAAAGG
Caparroz, não publicado
UnaGT55 (GT55) F: TCTGCCCTCTGTCTTATGCC
R: ACTTTGGTTTGTCCCTGC
Caparroz et al., 2003
AgGT07 (GT07) F: CAAACCATTTACACCC
R: GCTCTTGAGTTTTCCC
Russello et al., 2001
AgGT08 (GT08) F: GTGGCCTAACCTGAGAGTGG
R: ACATGTGCACACCTGATGG
Russello et al., 2001
AgGT12 (GT12) F: ACTCATGCAGGGGTTCTCAG
R: TTGTGGCTGGTAGAGGTGTG
Russello et al., 2001
AgGT21 (GT21) F: TCCCAGGCCAACACATTTAC
R: GCTTAGTGCATATCCCAAGCTA
Russello et al., 2001
AgGT81 (GT81) F: GGGGAACATCATTCTTCCAG
R: AGAAGGAGGGAAGCACATGA
Russello et al., 2001
MAC 436 (MAC) F: GCACCAAACACAACATCTTATTC
R: TTGGGACACCAATGTAATTTG
Davis, não publicado
HYA 1172 (HYA) F: GATCCTTTGCTTAAGACAGATGTC
R: GAGTGAAATACACATTCAGCTTCTG
Davis, não publicado
F – “forward”, R – “reverse”
Para o teste inicial de amplificação foram utilizadas amostras de dois indivíduos de cada
espécie em estudo e as reações de amplificação foram feitas em um volume final de 12,5 µl, sendo
6,3µl de água Milli Q, 1,2 µl de tampão (10X), 1,0 µl de dNTPs (2 mM), 0,4 µl de MgCl
2
(25 mM),
1 µl do “primer Forward” (10 µM), 1 µl do “primer Reverse” (10 µM), 0,1 µl de Taq polimerase (5
U/µl, Pharmacia) e 1,5 µl de DNA (20-50ng). As reações foram realizadas em termociclador nas
seguintes condições: desnaturação a 95ºC por 10 min, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min,
hibridação a 50
o
C – 60ºC por 40 seg e extensão a 72ºC por 40 seg, por fim, um ciclo de extensão a
72ºC por 10 min.
Para os locos que apresentavam uma banda única e nítida foram feitas novas reações nas
mesmas condições, exceto as quantidades dos “primers” e a inclusão de mais um “primer” M13 (10
µM) marcado com fluorescência (TET ou HEX, Applied Biosystems): 0,3 µl do “primer Reverse”
(10 µM), 0,2 µl de “primer” M13 (10 µM) marcado com fluorescência e 0,1 µl do “primer
Forward” com uma cauda 5´M13 (5´- CACGACGTTGTAAAACGAC, Boutin-Ganache et al.,
29
Capítulo II
2001) (10 µM). Para manter o volume final de 12,5 µl, o volume de água Milli Q foi aumentado
para 7,2 µl. Depois de amplificados, 1,5μl dos produtos foram carregados em gel de agarose 1,5%
para verificação da presença e quantidade do produto.
Cerca de 0,6μl do marcador molecular Genescan–500 TAMRA (Applied Biosystems)
(2fmol), 2,0 μl de formamida e 0,4 μl de dextran azul (50 mg/ml) foram misturados a uma alíquota
de 1,5μl de cada uma das amostras amplificadas. Cerca de 4,0 μl dessa mistura foi aplicada em gel
de acrilamida 7% e analisada em um seqüenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems). A
identificação do tamanho dos alelos foi feita com auxílio do programa Genotyper 2.1 (Perkin
Elmer). O polimorfismo de cada loco foi inicialmente testado em 10 indivíduos de cada espécie e os
locos que se mostraram polimórficos foram utilizados na genotipagem de todos os indivíduos.
O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado para cada loco pela comparação das freqüências
de heterozigotos esperada e observada e a presença de equilíbrio de ligação entre os locos foi
avaliada pela realização de um teste no qual são criadas tabelas de contingências para todos os pares
de locos e calculada a probabilidade para cada tabela usando a cadeia de Markov. Os dois testes
foram feitos com auxílio do programa Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995). Comparando as
freqüências de homozigotos esperado e observado foi avaliado se havia evidência de presença de
alelos nulos e de erro de genotipagem com auxílio do programa Micro-checker (Brookfield, 1996).
O grau de parentesco entre os indivíduos foi estimado por meio de dois índices. Um de
similaridade simples (X) expresso por X= 2 N
AB
/ N
A
+ N
B
, onde N
AB
é o número de alelos em
comum entre dois indivíduos A e B, N
A
e N
B
são o número de alelos presentes nos indivíduos A e
B, respectivamente. O segundo foi o índice r entre os indivíduos, que foi avaliado com auxílio do
programa Relatedness 4.2 (Queller e Goodnight, 1989). Aqui, para facilitar a sua descrição, o índice
foi decomposto em dois componentes. Quando estão sendo comparados os indivíduos hipotéticos x
e y, quando x é referência temos:
r
x
= Σ P
y
– P* e quando y é referência: r
y
= Σ P
x
– P*
Σ P
x
– P* Σ P
y
– P*
onde P* é a freqüência de cada alelo da população excluindo os indivíduos comparados. Px e Py são
as freqüências de cada alelo nos indivíduos comparados e seu valor pode ser 0, 0.5 ou 1 dependendo
se o indivíduo não apresentar o alelo, se for heterozigoto ou homozigoto, respectivamente. A
somatória diz respeito à soma dos valores obtidos para cada loco. Finalmente, para se obter o índice
r, os valores dos numeradores e denominadores são somados antes da divisão:
r = Σ P
y
– P* + Σ P
x
– P*
Σ P
y
– P* + Σ P
x
– P*
30
Capítulo II
Adicionalmente, o Prof. Dr. Paulo A. Otto, do Departamento de Genética e Biologia
Evolutiva do Instituto de Biociências da USP, desenvolveu um programa onde foram calculadas as
probabilidades par a par dos indivíduos serem irmãos contra a hipótese de não serem aparentados.
Acima de 90% as chances de serem irmãos são bem elevadas.
Seqüenciamento de DNA
Foi utilizado o seqüenciamento direto de produto de PCR para obter as seqüências de alguns
microssatélites amplificados. Isso foi realizado para confirmar a existência de microssatélite uma
vez que foram utilizados “primers” heterólogos. Um alelo por loco foi seqüenciado.
Essa estratégia de seqüenciamento também foi utilizada para obter as seqüências de genes
mitocondriais. Inicialmente foi sequenciado o citocromo b dos treze indivíduos de C. spixii
amostrados nesse trabalho. A região controladora foi testada em cinco indivíduos de C. spixii
(“studbook” 2, 5, 7, 10 e 45) e quatro indivíduos de A. leari (“studbook” 34 e 52 e amostras 410 e
620 registradas no LGEMA). Para sequenciar a ATPase 8 foram utilizadas amostras dos mesmos
indivíduos utilizados no sequenciamento da região controladora. Seqüências adicionais obtidas por
Miyaki et al. (1998) e Tavares et al. (2004) também foram utilizadas (Tabela 2).
Tabela 2. Espécies estudadas, número de registro e o número de acesso das seqüências no GenBank
Espécie Registro
a
Citocromo b Região controladora ATPase 8
Cyanopsitta spixii
7
a
10
a
U70764
c
AY286209
d
AF430817
d
AF430816
d
*
*
Anodorhynchus leari
410
b
620
b
AF370763
c
AF370764
d
AF430808
d
AF365432
d
*
*
a
Número de registro do "studbook";
b
Registro no LGEMA – USP;
c
Miyaki et al., 1998;
d
Tavares et al., 2004; *
seqüências não depositadas no GenBank e obtidas por Tavares, comunicação pessoal
As reações de amplificação foram feitas em um volume final de 10 µl, sendo 4,9µl de água
Milli Q, 1 µl de Tampão (10X), 1 µl de dNTPs (4 mM), 1 µl de cada “primer" (10 µM), 0,1 µl de
Taq polimerase (5 U/µl, Pharmacia) e 1 µl de DNA (20-50ng). As seqüências dos “primers” se
encontram nas tabelas 1 e 3 e as condições de amplificação foram as seguintes: 1) microssatélites:
desnaturação a 95ºC por 10 min, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min, hibridação a 50
o
C –
60ºC por 40 seg e extensão a 72ºC por 40 seg, por fim, um ciclo de extensão a 72ºC por 10 min; 2)
citocromo b e região controladora: desnaturação inicial a 95ºC por 5 min, seguida de 35 ciclos a
95ºC por 30 seg, 52ºC por 30 seg e 72ºC por 40 seg, seguido de extensão a 72ºC por 7 min; 3)
ATPase 8: desnaturação inicial a 95ºC por 10 min, seguida de um “touchdown” de 35 ciclos a 95ºC
31
Capítulo II
por 30 seg, com a temperatura de hibridação inicial de 65ºC e decrescida de meio grau por ciclo até
o vigésimo ciclo e 72ºC por 40 seg, seguido da extensão de 72ºC por 7 min.
Cerca de 5μl de cada produto foi purificado com a adição de 0,5μl de fosfatase alcalina de
camarão (1U/μl) e 0,4μl de exonuclease I (10U/μl) e incubado por 1 hora a 37ºC, seguido de 10
minutos a 80ºC.
Tabela 3. Seqüências dos “primers” utilizados para seqüenciamento
Região Primer
Seqüência dos primers (5’ → 3’)
Referência
Citocromo b ND5L 14754
HThr 16082
GGACCAGAAGGACTTGCCGACCTA
TCTTTTGGTTTACAAGACCAATG
Ribas, 2004
Kornegay et al., 1993
Região controladora Lglu 16737
CRH 522
TTGTTCTCAACTACGGGAAC
GTGAGGTGGACGATCAATAAAT
Eberhard et al., 2001
Eberhard et al., 2001
ATPase 8 CO2GQL
CO3HMH
GGACAATGCTCAGAAATCTGCGG
CATGGGCTGGGGTCRACTATGTG
Eberhard et al., 2004
Eberhard et al., 2004
Para a reação de seqüenciamento foi utilizado o kit “Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Kit” (Applied Biosystems). Para cada reação foi adicionada a seguinte mistura: 1,2 µl de solução
“Big Dye”, 1μl de “primer” (10μM) e 1,5 µl de produto de microssatélites ou 5 µl do produto
mitocondrial. As reações foram colocadas em termociclador nas seguintes condições: desnaturação
inicial a 96ºC por 1 min, seguida de 25 ciclos a 96ºC por 10 seg, 50ºC por 30 seg e 60ºC por 4 min,
seguido de extensão a 72º C por 10 min.
Antes do seqüenciamento, as amostras foram purificadas individualmente por precipitação,
de acordo com o seguinte protocolo: foram adicionados 4 μl de água e 16 μl de etanol 95%. A
solução foi misturada em agitador de tubos e mantida por 15 minutos à temperatura ambiente
(~25ºC). A amostra foi centrifugada por 30 minutos a 12000 rpm e o sobrenadante retirado com
auxílio de micropipeta do lado oposto ao precipitado de DNA. O precipitado foi lavado com cerca
de 200 μl de etanol 70% e a solução foi misturada em um agitador de tubos e novamente
centrifugada por 7 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi retirado com auxílio de micropipeta. A
amostra foi secada a 90ºC durante 2 minutos e mantida a -20ºC caso não fosse imediatamente
preparada para seqüenciamento.
O seqüenciador utilizado foi o ABI 377 (Applied Biosystems). O produto do
seqüenciamento foi dissolvido em 1,6μl de formamida:dextran azul 25mM EDTA (5:1),
ressuspenso e desnaturado por 2 minutos a 90ºC em banho seco. Foram carregados no gel 1,6μl de
cada amostra. As seqüências das duas fitas de DNA de cada amostra foram editadas e alinhadas no
programa Sequence Navigator (Applied Biosystems).
32
Capítulo II
Resultados
Microssatélites
Foram testados quatorze pares de primers de microssatélite, sendo que onze geraram
produtos de amplificação para as duas espécies (Tabela 4). Foram selecionados indivíduos
homozigotos das duas espécies para os locos UnaCT21, UnaCT32, UnaCT35, UnaCT43, UnaCT74,
UnaGT55, AgGT12 e MAC para terem seus alelos seqüenciados. O seqüenciamento revelou que
somente para o loco AgGT12 em A. leari não foi confirmada a presença de microssatélite.
Comparando as freqüências de heterozigotos esperada e observada foi possível avaliar que os locos
UnaCT43 (para C. spixii), MAC 436 (para A. leari) e UnaCT35 (para as duas espécies) não se
encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Tabela 4. Resultado dos testes com quatorze “primers” de microssatélites
CT21 CT32 CT35 CT43 CT74 CT84 GT55 GT07 GT08 GT12 GT21 GT81 MAC HYA
C. spixii
Amplificação
+ + + + + - + - + + + - + +
Polimorfismo P P P P P - P - M M M - M M
A. leari
Amplificação
+ + + + + - + - + + + - + +
Polimorfismo P M P P P - P - M Nc M - P M
+ presente, - ausente; P – polimórfico, M – monomórfico, Nc – não confirmada presença de microssatélites
Quatro locos para C. spixii (UnaCT21, UnaCT32, UnaCT74 e UnaGT55) e para A. leari
(UnaCT21, UnaCT43, UnaCT74 e UnaGT55) possuem de dois a sete alelos (Tabela 5) e não
apresentam evidências de apresentarem alelos nulos e de erro de genotipagem. Para cada indivíduo
foram feitas de duas a quatro réplicas da genotipagem. A heterozigosidade média observada em
cada loco de C. spixii variou de 0,365 (UnaGT55) a 0,718 (UnaCT21), com média entre todos os
locos de 0,509. Já para A. leari, ela variou de 0,548 (UnaCT21) a 0,652 (UnaGT55), com média
entre todos os locos de 0,586 (Tabela 5).
Tabela 5. Locos utilizados nas análises, número de alelos e heterozigosidade em Cyanopsitta spixii e em
Anodorhynchus leari
C. spixii
N
o
de alelos Heterozigosidade
A. leari
N
o
de alelos Heterozigosidade
CT21 5 0,718 CT21 3 0,548
CT32 2 0,442 CT43 3 0,642
CT74 5 0,657 CT74 6 0,616
GT55 2 0,365 GT55 7 0,652
33
Capítulo II
Índices de similaridade simples e de r, assim como as probabilidades de cada par de
indivíduos serem irmãos, foram calculados para todos os indivíduos de C. spixii (Tabela 6) e de A.
leari (Tabela 7). Como para C. spixii algumas relações de parentesco eram previamente conhecidas
(Figura 1) foram calculadas as médias dos índices de similaridade e de r entre os indivíduos com
parentesco conhecido (0,78 ± 0,06 e 0,237 ± 0,43, respectivamente). Tais médias são
significantemente maiores (P = 0,00088 < 0,005) do que as estimativas entre indivíduos sem
parentesco conhecido (0,59 ± 0,15 e –0,108 ± 0,39, respectivamente). Como esperado, as
probabilidades de parentesco próximo (irmãos) foram altas em pares de irmãos (indivíduos 73 e 74;
44 e 45) e pares de pai-filha (indivíduos 6 e 73; 6 e 74), variando de 62 a 77%.
Tabela 6. Índice de similaridade simples e índice r (abaixo da diagonal, respectivamente) e probabilidade de
serem irmãos (acima da diagonal) entre indivíduos amostrados de Cyanopsitta spixii
Indivíduos 2 (F) 3 (M) 5 (M) 6 (M) 7 (F) 10 (M) 18 (F) 26 (F) 45 (M) 44 (M) 73 (F) 74 (F) N (M)
2 (F) * 0,57 0,84 0,70 0,47 0,85 0,75 0,69 0,68 0,76 0,71 0,77 0,93
3 (M)
0,5
-0,023
* 0,41 0,63 0,86 0,93 0,57 0,59 0,57 0,28 0,30 0,74 0,35
5 (M)
0,75
-0,001
0,25
-0,791
* 0,77 0,37 0,74 0,65 0,69 0,46 0,74 0,78 0,77 0,89
6 (M)
0,5
-0,206
0,375
-0,339
0,625
0,095
* 0,50 0,63 0,70 0,81 0,89 0,78 0,86 0,87 0,35
7 (F)
0,5
-0,873
0,5
0,011
0,5
-0,873
0,375
-0,737
* 0,86 0,73 0,77 0,73 0,72 0,76 0,68 0,57
10 (M)
0,625
0,204
0,875
0,823
0,375
-0,591
0,375
-0,375
0,5
-0,023
* 0,57 0,59 0,57 0,28 0,30 0,74 0,70
18 (F)
0,875
0,499
0,5
-0,023
0,625
-0,501
0,5
-0,206
0,625
-0,405
0,5
-0,060
* 0,82 0,82 0,87 0,84 0,77 0,81
26 (F)
0,625
-0,376
0,375
0,022
0,625
-0,376
0,75
0,428
0,625
-0,294
0,5
-0,011
0,75
0,082
* 0,77 0,74 0,90 0,85 0,47
45 (M)
0,75
0,101
0,5
0,032
0,5
-0,797
0,5
-0,128
0,625
-0,270
0,5
-0,000
0,875
0,550
0,5
-0,246
* 0,80 0,75 0,70 0,76
44 (M)
0,75
0,371
0,375
-0,375
0,625
0,056
0,5
0,110
0,5
-0,507
0,375
-0,413
0,875
0,685
0,625
0,107
0,5
0,119
* 0,89 0,78 0,83
73 (F)
0,5
-0,189
0,375
-0,327
0,625
0,107
0,75
0,572
0,5
-0,428
0,375
-0,363
0,625
0,107
0,875
0,717
0,5
-0,393
0,75
0,559
* 0,86 0,50
74 (F)
0,625
-0,031
0,5
-0,037
0,625
-0,031
0,875
0,763
0,5
-0,642
0,5
-0,068
0,625
-0,031
0,875
0,676
0,5
-0,276
0,5
0,021
0,75
0,531
* 0,58
N (M)
0,875
0,702
0,375
-0,327
0,5
0,107
0,375
-0,495
0,375
-0,428
0,5
-0,168
0,75
0,405
0,5
-0,693
0,625
0,164
0,625
0,339
0,375
-0,481
0,5
-0,404
*
F - fêmea; M - macho
Índices baixos - pares com menor probabilidade de possuírem parentesco próximo (ISS ≤ 0,375 ou r ≤ -0,20 ou p ≤ 0,7)
Índices medianos – pares com probabilidade intermediária (0,35 ≤ ISS ≤ 0,625 ou –0,20 ≤ r ≤ 0,20 ou 0,7 < p < 0,9)
Índices altos – pares com maior probabilidade de possuírem parentesco próximo (ISS ≥ 0,625 ou r ≥ 0,20 ou p ≥ 0,9)
Os índices de similaridade entre os potenciais casais para reprodução de C. spixii sugerem
que a fêmea 73 e o macho N seriam um par bastante importante, pois apresentam os índices mais
baixos de similaridade simples (0,375) e de r (-0,4048) e apenas 50% de chance de serem irmãos e,
portanto, são possivelmente menos aparentados (Tabela 6). Até o momento, dentro desse grupo de
C. spixii, o par 26 e 44 foi o único que alcançou sucesso reprodutivo, tendo produzido dois filhotes
em 2005 e um em 2006. Os índices de similaridade simples e de r desse casal são 0,625 e 0,108,
34
Capítulo II
respectivamente (Tabela 6) e apresentam a probabilidade de 74% de serem irmãos. Esses valores
foram considerados como sendo intermediários dentro da amostragem analisada no presente
trabalho. O par 45 e 74, que possui forte ligação afetiva mas sem sucesso reprodutivo, apresenta
índices de similaridade e de r mais baixos do que o par anterior; sendo estes valores considerados
intermediários (0,5 e - 0,393, respectivamente). Entretanto, esse par apresenta probabilidade baixa
de serem parentes próximos (70%). O par 74 e N que foi recentemente estabelecido, apresenta
índices medianos (0,5 e – 0,404, respectivamente) e baixa probabilidade de serem irmãos (58%).
Da mesma forma, os índices de todos os possíveis pares de A. leari foram calculados e
classificados de acordo com a análise global dos valores da amostra (Tabela 7).
Também é importante que indivíduos que carregam alelos raros deixem descendentes
buscando manter esses alelos na da população. Assim, em C. spixii somente a fêmea 2 apresenta um
alelo raro para o loco UnaCT74 (alelo 260 com freqüência de 0,038) e seria importante que ela se
reproduzisse, preferencialmente com os machos 6 ou 45 (Tabela 6). Já entre os indivíduos de A.
leari, seria interessante buscar a reprodução das fêmeas 59 e 61 e dos machos 35 e 56 (Tabela 8).
Seqüenciamento
As seqüências dos genes mitocondriais analisadas (citocromo b, ATPase e região
controladora) não apresentaram nenhuma variação entre os indivíduos da mesma espécie. Assim,
esses dados não puderam ser utilizados na análise de parentesco. No entanto, esse resultado é
interessante pois mostra a baixa variabilidade genética das duas espécies.
35
Tabela 7. Índice de similaridade simples e índice r (abaixo da diagonal, respectivamente) e probabilidade de serem irmãos (acima da diagonal) entre indivíduos de
Anodorhynchus leari que participam do programa de reprodução
Indivíduos 23 (M) 24 (M) 25 (F) 34 (F) 35 (M) 36 (M) 37 (F) 38 (M) 39 (F) 40 (F) 41(M) 43 (F) 44 (F) 45 (F) 46 (F) 47 (M)
23 (M)
* 0,88 0,90 0,50 0,59 0,95 0,92 0,86 0,73 0,80 0,68 0,91 0,88 0,79 0,82 0,92
24 (M)
0,625
0,159
* 0,71 0,71 0,78 0,79 0,90 0,90 0,82 0,43 0,86 0,79 0,84 0,82 0,89 0,80
25 (F)
0,625
0,273
0,5
-0,184
* 0,68 0,61 0,99 0,56 0,71 0,79 0,64 0,73 0,78 0,84 0,69 0,79 0,87
34 (F)
0,375
-0,599
0,5
-0,378
0,375
-0,432
* 0,95 0,67 0,81 0,71 0,90 0,57 0,85 0,83 0,57 0,56 0,67 0,48
35 (M)
0,375
-0,502
0,5
-0,279
0,25
-0,789
0,75
0,576
* 0,74 0,90 0,78 0,87 0,65 0,89 0,78 0,66 0,48 0,74 0,57
36 (M)
0,875
0,723
0,625
-0,048
0,75
0,416
0,375
-0,633
0,375
-0,516
* 0,88 0,79 0,63 0,67 0,81 0,86 0,81 0,70 0,74 0,88
37 (F)
0,625
0,276
0,75
0,411
0,5
-0,516
0,5
-0,188
0,625
0,332
0,625
0,128
* 0,90 0,78 0,67 0,92 0,69 0,83 0,53 0,88 0,79
38 (M)
0,625
0,159
1,0
1
0,5
-0,184
0,5
-0,378
0,5
-0,279
0,625
-0,048
0,75
0,411
* 0,82 0,43 0,86 0,79 0,84 0,82 0,89 0,80
39 (F)
0,375
-0,310
0,75
0,478
0,5
0,089
0,5
-0,077
0,375
-0,218
0,375
-0,547
0,5
-0,134
0,75
0,478
* 0,18 0,75 0,46 0,82 0,79 0,88 0,55
40 (F)
0,375
-0,182
0,375
-0,546
0,25
-0,220
0,25
-0,336
0,25
-0,276
0,375
-0,149
0,25
-0,391
0,375
-0,546
0,25
-0,616
* 0,69 0,94 0,66 0,73 0,27 0,73
41 (M)
0,625
-0,366
0,75
0,313
0,5
-0,440
0,75
0,463
0,75
0,500
0,625
-0,353
0,75
0,427
0,75
0,313
0,375
-0,019
0,375
-0,329
* 0,83 0,76 0,71 0,83 0,69
43 (F)
0,5
0,293
0,375
-0,222
0,5
0,086
0,375
-0,049
0,25
-0,333
0,5
0,193
0,375
-0,276
0,375
-0,222
0,25
-0,520
0,25
0,037
0,375
-0,200
* 0,63 0,92 0,46 0,46
44 (F)
0,625
0,170
0,875
0,651
0,625
0,124
0,375
-0,633
0,375
-0,516
0,625
-0,031
0,625
0,128
0,875
0,651
0,75
0,484
0,5
-0,149
0,625
-0,015
0,25
-0,615
* 0,71 0,89 0,91
45 (F)
0,5
0,045
0,625
0,128
0,625
0,250
0,375
-0,411
0,25
-0,765
0,5
-0,147
0,5
-0,493
0,625
0,128
0,5
0,102
0,25
-0,208
0,5
-0,415
0,625
0,458
0,5
-0,147
* 0,79 0,71
46 (F)
0,625
0,439
0,625
0,130
0,5
0,225
0,125
-0,849
0,125
-0,757
0,625
0,354
0,375
-0,159
0,625
0,130
0,5
-0,069
0,5
0,137
0,375
-0,492
0,25
-0,345
0,75
0,569
0,375
-0,149
* 0,67
47 (M)
0,5
-0,146
0,875
0,723
0,4
0,042
0,375
-0,356
0,375
-0,275
0,5
-0,366
0,625
0,284
0,875
0,723
0,875
0,784
0,375
-0,507
0,625
0,191
0,25
-0,578
0,875
0,727
0,5
0,056
0,625
0,073
*
48 (M)
0,5
0,270
0,625
0,508
0,375
-0,051
0,125
-0,592
0,25
-0,251
0,375
0,024
0,625
0,551
0,625
0,508
0,625
0,438
0,125
-0,419
0,375
-0,130
0,125
-0,465
0,625
0,512
0,375
-0,042
0,5
0,238
0,75
0,710
49 (F)
0,625
-0,015
0,875
0,547
0,5
-0,445
0,5
-0,325
0,5
-0,212
0,625
-0,332
0,75
0,282
0,875
0,547
0,625
0,069
0,5
-0,096
0,75
0,130
0,5
0,069
0,75
0,112
0,75
0,293
0,5
-0,254
0,75
0,334
50 (F)
0,375
-0,566
0,625
0,194
0,375
-0,167
0,625
0,338
0,5
-0,038
0,375
-0,592
0,5
-0,395
0,625
0,194
0,5
0,155
0,375
0,013
0,75
0,476
0,5
0,140
0,5
-0,062
0,75
0,309
0,25
-0,454
0,5
0,115
51 (M)
0,5
-0,271
0,5
-0,007
0,5
-0,103
0,5
0,164
0,375
-0,185
0,5
-0,244
0,375
-0,538
0,5
-0,007
0,375
-0,203
0,5
0,368
0,625
0,262
0,5
0,175
0,5
0,004
0,625
0,129
0,375
-0,043
0,375
-0,258
52 (M)
0,375
-0,046
0,25
-0,515
0,625
0,385
0,375
-0,037
0,375
-0,280
0,375
-0,002
0,25
-0,381
0,250
-0,515
0,25
-0,294
0,25
-0,085
0,375
-0,160
0,25
0,128
0,250
-0,336
0,375
-0,067
0,375
0,093
0,250
-0,336
53 (M)
0,375
-0,758
0,625
0,211
0,375
-0,376
0,5
0,133
0,5
0,183
0,375
-0,820
0,5
0,087
0,625
0,211
0,625
0,377
0,5
0,026
0,75
0,486
0,25
-0,527
0,625
0,220
0,5
-0,130
0,375
-0,433
0,75
0,565
54 (F)
0,375
-0,582
0,5
-0,088
0,375
-0,652
0,5
0,109
0,625
0,371
0,375
-0,612
0,5
0,060
0,5
-0,088
0,5
0,147
0,375
0,005
0,625
0,204
0,000
-0,907
0,625
0,194
0,25
-0,861
0,375
-0,100
0,5
0,106
55 (F)
0,375
-0,550
0,75
0,546
0,375
-0,207
0,5
0,043
0,500
0,092
0,375
-0,571
0,5
0,198
0,75
0,546
0,75
0,631
0,375
-0,330
0,75
0,556
0,125
-0,692
0,75
0,551
0,375
-0,192
0,5
-0,131
0,875
0,808
56 (M)
0,75
0,618
0,625
0,331
0,5
0,208
0,375
-0,510
0,25
-0,613
0,625
0,338
0,375
-0,184
0,625
0,331
0,625
0,273
0,25
-0,315
0,375
-0,528
0,375
0,088
0,625
0,338
0,5
0,217
0,625
0,521
0,5
0,054
57 (F)
0,5
-0,356
0,5
-0,088
0,75
0,292
0,625
0,331
0,500
-0,048
0,5
-0,343
0,5
-0,410
0,5
-0,088
0,5
0,147
0,375
0,005
0,75
0,469
0,375
-0,214
0,625
0,194
0,5
-0,163
0,375
-0,100
0,5
0,106
58 (F)
0,375
-0,181
0,75
0,538
0,625
0,387
0,375
-0,167
0,25
-0,475
0,375
-0,370
0,5
-0,222
0,75
0,538
0,875
0,813
0,25
-0,495
0,5
0,096
0,375
-0,246
0,75
0,543
0,625
0,394
0,5
0,018
0,875
0,805
59 (F)
0,5
0,391
0,375
-0,204
0,5
0,216
0,375
0,095
0,25
-0,158
0,5
0,318
0,375
-0,095
0,375
-0,204
0,25
-0,464
0,25
0,-224
0,375
-0,015
0,875
0,874
0,25
-0,535
0,5
0,223
0,25
-0,316
0,250
-0,512
60 (F)
0,75
0,478
0,625
0,026
0,75
0,451
0,5
-0,027
0,375
-0,437
0,75
0,361
0,625
-0,366
0,625
0,026
0,5
-0,221
0,375
-0,103
0,625
0,055
0,625
0,420
0,625
0,041
0,625
0,190
0,5
0,177
0,5
-0,289
61 (F)
0,25
-0,771
0,375
-0,592
0,375
-0,386
0,625
0,345
0,625
0,383
0,25
-0,835
0,25
-0,610
0,375
-0,592
0,5
-0,045
0,5
0,347
0,5
-0,036
0,25
-0,365
0,5
-0,311
0,375
-0,366
0,25
-0,442
0,375
-0,314
63 (F)
0,25
-0,739
0,5
-0,130
0,25
-0,404
0,625
0,427
0,5
0,275
0,25
-0,789
0,375
0,001
0,5
-0,130
0,5
0,081
0,375
-0,179
0,625
0,336
0,125
-0,534
0,5
-0,118
0,25
-0,387
0,25
-0,611
0,375
0,234
64 (M)
0,5
-0,571
0,625
0,191
0,5
-0,171
0,625
0,336
0,625
0,375
0,5
-0,598
0,625
0,300
0,625
0,191
0,625
0,365
0,375
-0,319
0,875
0,737
0,25
-0,552
0,625
0,201
0,375
-0,386
0,375
-0,458
0,5
0,556
(continuação Tabela 7)
Indivíduos 48 (M) 49 (F) 50 (F) 51 (M) 52 (M) 53 (M) 54 (F) 55 (F) 56 (M) 57 (F) 58 (F) 59 (F) 60 (F) 61 (F) 63 (F) 64 (M)
23 (M)
0,93 0,81 0,47 0,67 0,73 0,43 0,50 0,53 0,94 0,68 0,80 0,94 0,94 0,27 0,28 0,61
24 (M)
0,93 0,87 0,84 0,79 0,41 0,83 0,73 0,88 0,84 0,74 0,87 0,66 0,81 0,57 0,77 0,83
25 (F)
0,69 0,63 0,64 0,73 0,91 0,67 0,68 0,75 0,86 0,89 0,83 0,86 0,88 0,59 0,51 0,81
34 (F)
0,43 0,55 0,72 0,66 0,64 0,59 0,77 0,75 0,74 0,82 0,75 0,89 0,81 0,81 0,96 0,82
35 (M)
0,62 0,64 0,66 0,59 0,57 0,67 0,87 0,81 0,69 0,77 0,69 0,86 0,76 0,98 0,67 0,87
36 (M)
0,86 0,72 0,64 0,80 0,85 0,60 0,66 0,69 0,89 0,81 0,71 0,91 0,91 0,42 0,43 0,76
37 (F)
0,95 0,86 0,57 0,49 0,57 0,82 0,75 0,87 0,80 0,60 0,64 0,79 0,69 0,42 0,70 0,90
38 (M)
0,93 0,87 0,84 0,79 0,41 0,83 0,73 0,88 0,84 0,74 0,87 0,66 0,81 0,57 0,77 0,83
39 (F)
0,91 0,76 0,81 0,74 0,51 0,82 0,91 0,87 0,94 0,81 0,91 0,30 0,75 0,90 0,76 0,82
40 (F)
0,34 0,86 0,89 0,95 0,64 0,82 0,83 0,36 0,55 0,84 0,25 0,66 0,77 0,93 0,53 0,53
41 (M)
0,70 0,80 0,83 0,79 0,64 0,83 0,73 0,88 0,48 0,85 0,81 0,89 0,84 0,49 0,71 0,91
43 (F)
0,34 0,90 0,90 0,90 0,83 0,60 0,33 0,40 0,86 0,74 0,53 1,0 0,89 0,75 0,25 0,51
44 (F)
0,93 0,78 0,74 0,81 0,59 0,83 0,85 0,88 0,86 0,86 0,87 0,46 0,83 0,74 0,77 0,83
45 (F)
0,69 0,91 0,91 0,88 0,65 0,86 0,50 0,75 0,84 0,64 0,83 0,84 0,75 0,76 0,51 0,67
46 (F)
0,95 0,84 0,81 0,74 0,51 0,88 0,81 0,92 0,79 0,81 0,91 0,30 0,75 0,67 0,84 0,88
47 (M)
0,82 0,74 0,66 0,84 0,95 0,53 0,83 0,61 0,91 0,84 0,64 0,30 0,87 0,71 0,43 0,53
48 (M)
* 0,90 0,36 0,26 0,16 0,78 0,70 0,84 0,89 0,36 0,83 0,20 0,59 0,43 0,71 0,78
49 (F)
0,5
0,271
* 0,92 0,89 0,58 0,91 0,65 0,83 0,79 0,66 0,82 0,79 0,74 0,75 0,63 0,77
50 (F)
0,25
-0,428
0,75
0,357
* 0,94 0,48 0,93 0,67 0,86 0,57 0,79 0,85 0,80 0,78 0,87 0,68 0,81
51 (M)
0,125
-0,654
0,625
0,107
0,875
0,795
* 0,59 0,89 0,76 0,80 0,75 0,85 0,79 0,80 0,89 0,91 0,58 0,73
52 (M)
0,125
-0,410
0,25
-0,501
0,375
-0,169
0,5
-0,128
* 0,51 0,52 0,34 0,34 0,84 0,58 0,93 0,88 0,59 0,51 0,73
53 (M)
0,5
0,153
0,75
0,373
0,75
0,575
0,375
0,193
0,25
-0,300
* 0,80 0,92 0,40 0,81 0,87 0,40 0,65 0,87 0,79 0,88
54 (F)
0,375
-0,006
0,5
-0,305
0,5
-0,092
0,625
-0,035
0,25
-0,471
0,625
0,356
* 0,86 0,78 0,81 0,76 0,50 0,69 0,88 0,67 0,80
55 (F)
0,625
0,350
0,625
0,211
0,625
0,436
0,5
0,102
0,25
-0,327
0,875
0,815
0,625
0,431
* 0,49 0,86 0,90 0,25 0,74 0,75 0,88 0,92
56 (M)
0,5
0,228
0,5
-0,032
0,375
-0,298
0,5
-0,063
0,25
-0,314
0,25
-0,645
0,375
-0,309
0,375
-0,316
* 0,60 0,85 0,76 0,92 0,76 0,32 0,40
57 (F)
0,25
-0,437
0,5
-0,305
0,75
0,563
0,75
0,586
0,625
0,265
0,625
0,356
0,625
0,118
0,625
0,431
0,375
-0,309
* 0,85 0,83 0,89 0,75 0,68 0,90
58 (F)
0,625
0,343
0,625
0,194
0,625
0,427
0,5
0,089
0,375
-0,073
0,625
0,436
0,375
-0,156
0,75
0,662
0,5
0,167
0,625
0,422
* 0,36 0,80 0,75 0,82 0,87
59 (F)
0,125
-0,429
0,375
-0,153
0,25
-0,042
0,375
-0,004
0,5
0,329
0,125
-0,618
0,0
-0,798
0,125
-0,620
0,375
0,065
0,375
-0,049
0,375
-0,228
* 0,93 0,57 0,40 0,64
60 (F)
0,25
-0,414
0,625
-0,214
0,625
0,247
0,75
0,528
0,5
0,194
0,375
-0,476
0,375
-0,523
0,375
-0,283
0,625
0,369
0,750
0,492
0,625
0,130
0,625
0,507
* 0,60 0,49 0,80
61 (F)
0,125
-0,560
0,5
-0,267
0,625
0,358
0,625
0,391
0,375
-0,161
0,625
0,369
0,625
0,352
0,5
0,068
0,375
-0,471
0,625
0,352
0,375
-0,136
0,125
-0,478
0,375
-0,240
* 0,59 0,59
63 (F)
0,375
-0,038
0,5
-0,048
0,5
0,250
0,375
-0,075
0,250
-0,192
0,75
0,630
0,5
0,243
0,75
0,502
0,125
-0,804
0,5
0,243
0,5
0,158
0,125
-0,482
0,25
-0,493
0,5
0,256
* 0,79
64 (M)
0,5
0,142
0,625
0,031
0,625
0,350
0,5
-0,028
0,375
-0,025
0,875
0,787
0,625
0,343
0,75
0,811
0,25
-0,673
0,75
0,562
0,625
0,426
0,25
-0,342
0,5
-0,259
0,5
0,141
0,75
0,624
*
F- fêmea; M- macho; Índices baixos - casais com menor probabilidade de possuírem parentesco próximo (ISS ≤ 0,375 ou r ≤ -0,20 ou p ≤ 0,7); Índices medianos – pares com
probabilidade intermediária (0,35 ≤ ISS ≤ 0,625 ou –0,20 ≤ r ≤ 0,20 ou 0,7 < p < 0,9); Índices altos – pares com maior probabilidade de possuírem parentesco próximo (ISS ≥ 0,625 ou r ≥
0,20 ou p ≥ 0,9)
Capítulo II
Tabela 8. Indivíduos de Anodorhynchus leari que apresentam alelos raros e sua freqüência
Indivíduo Loco Alelo
a
Freqüência
59 F CT74 259 0,047
61 F GT55 216
228
0,031
0,016
35 M CT21
GT55
263
224
0,094
0,031
56 M CT21 263 0,094
a
- tamanho em pb; F- fêmea; M- macho
Discussão
Dois de seis locos polimórficos para as duas espécies não se encontram em equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Como essa proporção não é muito alta, os grupos de aves analisadas não devem
estar em desequilíbrio de Hardy-Weinberg. Assim, a deficiência de heterozigotos encontradas
nesses locos para esses grupos pode estar associada à presença de alelos nulos.
Os locos testados que apresentaram polimorfismo nas espécies estudadas (Tabela 1)
foram isolados de Ara ararauna (Caparroz et al., 2003). Nenhum par de "primers" desenvolvido
para Amazona guildingii (Russello et al., 2001) amplificou mais de um alelo por loco. Esse
resultado era parcialmente esperado, uma vez que A. guildingii deve ser filogeneticamente mais
distante de Cyanopsitta spixii e de Anodorhynchus leari do que A. ararauna (Tavares, 2005). No
entanto, dois dos "primers" testados foram desenvolvidos para Anodorhynchus hyacinthinus
(HYA 1172 e MAC 436) e somente um deles se mostrou polimórfico em A. leari. Como esses
"primers" não foram exaustivamente testados pelo autor (Scott Davis, não publicados), podem
não ser tão adequados para análises genéticas. Esse tipo de resultado também foi encontrado por
Robertson et al. (2000) que testaram “primers” desenvolvidos para o psitacídeo australiano
Strigops habroptilis em diversas outras espécies de psitacídeos australianos, africanos e
neotropicais. Esses autores verificaram que o grau de polimorfismo e o número de locos
amplificados diminuem quanto mais distantes filogeneticamente são as espécies.
Foi verificada uma baixa variabilidade nos locos de microssatélites de C. spixii e A. leari
comparada com dados obtidos para Ara ararauna com os mesmos locos analisados no presente
trabalho (Caparroz, 2003). Além disso, não foi encontrada nenhuma variação nas seqüências de
DNA mitocondrial analisadas. Esses resultados são semelhantes aos encontrados por Zang et al.
(2004) que observaram somente dois haplótipos para os domínios II e III da região controladora
na ave ameaçada de extinção Nipponia nippon. Isso também foi encontrado em um urso polar
38
Capítulo II
ameaçado (Ursus maritimus) com pouco ou nenhum polimorfismo em estudos com DNA
mitocondrial (Cronin et al., 1991; Shields e Kocher, 1991).
A baixa variabilidade encontrada nesses grupos era esperada, dado o fato que suas
populações são muito pequenas. Alguns autores sugerem que as duas espécies têm sido raras há
muitas décadas (Ridgely, 1981; Sick, 1981; Lima, 2004) e isso explicaria a baixa variabilidade
encontrada. Em muitos outros estudos com aves (Bouzat et al., 1998; Zhang et al., 2004) e com
psitacídeos ameaçados (Hughes et al. 1998; Robertson et al., 2000) é verificado que a baixa
variabilidade está associada ao grau de ameaça das espécies. Entretanto, em um estudo de uma
espécie vulnerável de psitacídeo (Amazona guildingii) com microssatélites foi encontrada alta
variabilidade genética. Para essa espécie, foram encontrados oito locos polimórficos (alguns deles
testados no presente trabalho) em 72 indivíduos analisados. O número de alelos por loco variou
de dois a 10 (média de 4,9 alelos por loco) e heterozigosidade por loco variando de 0,41 a 0,86
(Russello e Amato, 2004). Esses resultados são muito semelhantes aos obtidos para Ara ararauna
(Caparroz, 2003), que é uma espécie não ameaçada de extinção. Nessa espécie foram encontrados
seis locos polimórficos (cinco desenvolvidos pelo autor e testados no presente estudo e um
desenvolvido por Russello et al., 2001) em 49 indivíduos. O número de alelos por loco variou de
três a 11 (média de 6,5 alelos por loco) e heterozigosidade por loco variando de 0,23 a 0,88.
Assim, a baixa variabilidade encontrada nas espécies estudadas no presente trabalho, pode ser
decorrente do grau de ameaça (pois apresentam uma situação mais crítica que Amazona guildingii
e Ara ararauna) do baixo número amostral (nove para Cyanopsitta spixii e 32 para
Anodorhynchus leari) ou pode ser conseqüência da utilização de “primers” heterólogos. A
identificação de novos locos de microssatélites desenvolvidos para as espécies de interesse, o
aumento no número de indivíduos amostrados e o teste de mais marcadores genéticos parece ser a
maneira mais adequada para melhorar a eficiência da análise.
Quando são encontradas baixa variabilidade e ausência de marcadores polimórficos para
um organismo que se quer estudar, geralmente a determinação de parentesco é prejudicada ou
não é sequer possível realizá-la. Esse problema ocorreu com um mamífero da Austrália (Taylor et
al., 1997). Isso pode representar uma grande limitação para a genética da conservação em casos
onde é importante conhecer as relações entre os indivíduos. Segundo Blouin et al. (1996), em
uma espécie de camundongos selvagens (Mus musculus), foi necessário utilizar 20 locos de
microssatélites para discriminar indivíduos não relacionados e irmãos (de mesmo pai e mãe) e
80% dos meio-irmãos de irmãos ou de camundongos não relacionados. Resultado semelhante foi
39
Capítulo II
encontrado por Alderson et al. (1999) para uma espécie de ave (Molothrus ater). Ao dobrar o
número de locos utilizados na análise inicial (de sete para 14 locos), foi verificado que o intervalo
de confiança das relações diminuíram consideravelmente. Além disso, quanto menor a
variabilidade, menor o poder dos marcadores moleculares em análises de parentesco (Taylor et
al., 1997). No presente estudo, os poucos pares de "primers" desenvolvidos para psitacídeos
neotropicais foram testados. Além disso, as estimativas de relação entre pares de indivíduos estão
baseadas na distribuição de freqüência alélica (Queller e Goodnight, 1989; Li et al., 1993;
Ritland, 1996; Lynch e Ritland, 1999) e portanto, dependem, além de ter locos variáveis, de obter
uma estimativa aproximada da freqüência alélica baseada na genotipagem de um número grande
de indivíduos da população (Van de Casteele et al., 2001; Russello e Amato, 2004). Infelizmente
o número de indivíduos aqui analisados de C. spixii e A. leari foi limitado e a freqüência alélica
estimada pode estar incorreta. Mesmo assim, vale ressaltar que foram estudados 22% dos
indivíduos da população total conhecida de C. spixii e 7% de A. leari.
Apesar da baixa variabilidade, foi possível estimar índices de similaridade entre as C.
spixii e A. leari e esperamos que estes dados possam efetivamente colaborar na recuperação
dessas duas espécies. Baseados nesses dados de similaridade, foi possível recomendar casais
geneticamente menos similares. No entanto, o sucesso do pareamento e da reprodução das aves
também depende de outros fatores como estado geral de saúde, idade e, principalmente,
compatibilidade comportamental. Em geral, em psitacídeos os casais se escolhem por afinidade e
tal ligação é muito forte, ao ponto de vários autores acreditarem que o casal permanece unido por
toda a vida (Sick, 1997; Galetti et al., 2002). Assim, nem sempre o par geneticamente menos
similar poderá ser formado.
O casal já formado de C. spixii que obteve sucesso reprodutivo apresenta índices de
similaridade considerados intermediários e os outros dois casais que estão sendo formados
apresentam índices relativamente baixos. Essa informação pode ser importante, uma vez que,
avaliado o sucesso desses pares poderemos começar a inferir a relação entre a similaridade
genética e o sucesso da reprodução dessas espécies.
Apesar da crítica situação de C. spixii e de A. leari, o sucesso de outros programas de
recuperação de populações de aves ameaçadas indica que esforços nos programas de reprodução
devem ser prioritários a fim de evitar sua extinção. Populações de Falco punctatus (Jones et al.,
1994), Gymnogyps californianus (Toone e Wallace, 1994) e Branta canadensis (Tegelström e
Sjöberg, 1995) foram drasticamente reduzidos, mas o manejo e a reprodução de indivíduos em
40
Capítulo II
cativeiro resultaram em populações estáveis e em crescimento. Esses resultados incentivam os
esforços investidos e futuros trabalhos em C. spixii e em A. leari para que um dia possamos ver
essas espécies fora do perigo da extinção.
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44
Capítulo III
Estrutura genética populacional em Arara-azul
(Anodorhynchus hyacinthinus) baseada na análise de locos de
microssatélite
Capítulo III
Introdução
A Arara-azul-grande (Anodorhynchus hyacinthinus) se destaca pela sua beleza e por ser o
maior psitacídeo existente. Embora não seja muito rara atualmente, é considerada vulnerável, pois
existe a possibilidade de tornar-se ameaçada em um futuro próximo, devido ao intenso tráfico ilegal
e a características próprias da espécie, que é altamente especialista quanto à alimentação e à
nidificação, além de muitos casais só se reproduzirem a cada dois anos (Guedes e Harper, 1995).
O número total de indivíduos em vida livre no Brasil está estimado em 5.000, distribuídos
em 3 regiões: no Pará (a leste da região amazônica e oeste de Altamira), no nordeste do país (região
entre Tocantins, Piauí, Maranhão e Bahia) e no Pantanal Matogrossense onde se encontra a maioria
dos indivíduos (Collar et al., 1997; Guedes e Harper, 1995). Como as três localidades não estão
conectadas e são compostas de ambientes bastante distintos, seria muito importante ter dados
comparativos desses grupos.
Em geral, a alimentação da A. hyacinthinus é baseada em sementes, nozes e frutos. No
Pantanal Matogrossense, sua alimentação é especializada em bocaiúva (Acromia totai) e acuri
(Schelea phalerata) (Guedes, 1993). Em outras regiões como no Piauí, Tocantins e Maranhão, ela
se alimenta de piaçava (Atalea funifera) e catolé (Syagrus coronata). Já na região de Carajás e
Altamira no Pará se alimentam de inajá (Maximiliana regia), babaçu (Orbignya phaleata) e
tucuman (Astocarym sp) (Munn et al., 1989; Collar et al., 1992).
Cerca de 95% dos ninhos no Pantanal Matogrossense estão localizados em uma única
espécie arbórea, o manduvi (Sterculia striata). Em outras regiões, A. hyacinthinus pode nidificar em
paredões rochosos, em buracos ou fendas formadas naturalmente (Munn et al., 1989; Guedes, 1993;
Sick, 1997). Apesar da grande capacidade de dispersão, as observações de campo sugerem que os
casais sejam sedentários e apresentem alta fidelidade aos sítios de nidificação (Guedes, 1993). Esse
comportamento pode resultar em uma estruturação populacional, formando grupos geneticamente
distintos. Isso foi descrito, por exemplo, em uma espécie de urso polar (Ursus maritimus), na qual
foi encontrada moderada estruturação genética em duas populações vizinhas, corroborando o
monitoramento de campo e mostrando que os indivíduos, apesar de se deslocarem de uma região a
outra, retornam à região onde nasceram para se reproduzirem (Paetkau et al., 1995).
A comparação da composição genética entre as populações permite avaliar o grau de
diferenciação entre elas e pode auxiliar na compreensão dos fatores que causam estas diferenças.
Esse tipo de estudo é muito importante para a conservação, uma vez que, caso a variabilidade
genética na espécie se apresente estruturada geograficamente, a estratégia de conservação deve
procurar preservar a diversidade em cada uma das áreas, pois podem existir adaptações locais que
se perderiam no caso de um manejo conjunto das populações. Por outro lado, se as populações não
46
Capítulo III
são diferenciadas geneticamente, seria viável concentrar a proteção da espécie em apenas uma área,
usando indivíduos dessa área para eventual recolonização das outras regiões se necessário (Haig,
1998). Portanto, conhecer a estrutura genética permite direcionar os esforços de conservação para
um uso mais eficiente dos recursos disponíveis, além de auxiliar na compreensão das forças
evolutivas que estão atuando na evolução da espécie.
Outra aplicação dos dados de estrutura populacional em conservação é determinar a origem
de indivíduos sem procedência conhecida. Isso é importante para realizar ações preventivas de
repressão e fiscalização e mesmo para programas de reprodução em cativeiro, evitando o
pareamento de casais de localidades geneticamente diferentes, levando a população cativa a sofrer
eventual efeito de depressão por exocruzamento.
Os microssatélites têm sido muito utilizados em estudos de estrutura populacional, pois são
altamente polimórficos e possuem uma alta taxa de mutação (10
-4
a 10
-6
por geração; Dallas, 1992).
Outra característica que faz com que esses marcadores sejam muito informativos nesse tipo de
estudo, é a expressão co-dominante, sendo possível distinguir os heterozigotos. Além disso, de
modo geral, os microssatélite são seletivamente neutros (Hartl e Clark, 1997).
No presente trabalho foram avaliadas a variabilidade e a estrutura genética populacional de
Anodorhynchus hyacinthinus. Além disso, amostras de filhotes dessa espécie que foram
apreendidos foram analisadas com a finalidade de determinar a origem desses indivíduos. Para
realizar esses estudos foram utilizados microssatélites amplificados com "primers" desenvolvidos
para espécies de psitacídeos neotropicais filogeneticamente próximas à A. hyacinthinus.
Materiais e métodos
Amostras estudadas
As amostras de Anodorhynchus hyacinthinus recebidas e/ou coletadas em diversas
localidades estão sendo apresentadas na tabela 1 e na figura 1. Foram utilizadas amostras de sangue
(0,1 ml) e fragmentos de peles de museu que estão estocadas no acervo do Laboratório de Genética
e Evolução Molecular de Aves do Departamento de Biologia do Instituto de Biociências da
Universidade de São Paulo (sangue em etanol absoluto a -20
o o
C e peles em tubos a -20 C).
47
Capítulo III
Tabela 1: Origem e número de amostras de Anodorhynchus hyacinthinus
Origem
1
Ano Coletor ou Mantenedor
N
2002
2000
2000-2002
2001-2002
Pantanal Matogrossense Sul (PS)
Miranda (1) 18
N.M.R.Guedes (Projeto Arara Azul)
Abobral (2) 5
Nhecolândia (3) 14
Rio Negro (4) 6
Pantanal Matogrossense Norte (PN)
Barão de Melgaço (5)
P. Antas
2002-2004
24
(RPPN Sesc Pantanal)
Museu Paraense Emílio Goeldi
1952
1
Alto Rio Xingu (6)
Região nordeste (NE)
Piauí
São Gonçalo do Gurgueia (7)
P. Martuscelli e C. Yamashita
1999
6
Tocantins
apreensão
2
Zoológico de Brasília
2003
3
(8)
Maranhão
2
apreensão
Zoológico do Rio de Janeiro
2004
2
(9)
Região norte (NO)
Pará
Redenção (10)
C. Baider (Projeto Pinkaiti)
1997
3
Rio Iriri (11)
1914
1
Museu Paraense Emílio Goeldi
1983/1990
2
Serra dos Carajás (12)
1985
1
Rio Sete de setembro (13)
-
1
Capitão Poço (14)
3
Apreensão
N.M.R.Guedes (Projeto Arara Azul)
2004
10
Corumbá/MT e Jaraguari/MS (AP1)
G. Marcicano
2005
4
Porto Alegre/RS (AP2)
N.M.R.Guedes (Projeto Arara Azul)
2005
2
Miranda/MS (AP3)
Zoológico de Boituva
2006
8
Rodovia Castelo Branco/SP (AP4)
1
em parênteses: número correspondente à localidade mostrada na figura 1;
2 3
sem localidade conhecida;
local da apreensão
Extração do DNA
Para as amostras de sangue, o DNA foi extraído individualmente utilizando o protocolo
padrão de digestão com proteinase K seguido de purificação com fenol: clorofórmio: álcool
isoamílico (25:24:1), segundo descrito por Bruford et al. (1992). Para as amostras de pele de museu,
o material foi deixado, inicialmente, em água Mili Q até hidratar e foi utilizado o "QIAamp Tissue
Kit" (Qiagen) com a adição de 30 µl de DTT (ditiothreitol, 100 mg/ml) ao tampão de lise (Cooper,
1994).
48
Capítulo III
14
11
12
13
NO
9
10
7
8
NE
6
5
PN
1 4
PS
23
Figura 1. Mapa da distribuição geográfica de Anodorhynchus hyacinthinus e pontos de amostragem.
● Amostras com procedência conhecida; ■ Amostras sem localização exata de procedência mas
provenientes dos estados correspondentes. NO - Região Norte; NE - Região Nordeste; PN -
Pantanal Norte; PS - Pantanal Sul. Os números correspondem às localidades descritas na tabela 1.
Seqüenciamento de DNA
Cinco amostras de sangue da região de Redenção - PA que supostamente eram de
Anodorhynchus hyacinthinus tiveram sua região controladora mitocondrial amplificada e
sequenciada com os primers Lglu 16737 (5´- TTGTTCTCAACTACGGGAAC -3´, Eberhard et al.,
2001) e CRH 522 (5´- GTGAGGTGGACGATCAATAAAT -3´, Eberhard et al., 2001) para a
confirmar sua identificação. As reações de amplificação foram feitas em um volume final de 10 µl,
sendo 4,9µl de água Milli Q, 1 µl de Tampão (10X), 1 µl de dNTPs (4 mM), 1 µl do “primer” Lglu
16737 (10 mM), 1 µl do “primer” CRH 522 (10 mM), 0,1 µl de Taq polimerase (5 U/µl, Pharmacia)
e 1 µl de DNA (20-50ng). As reações foram realizadas em termociclador nas seguintes condições:
49
Capítulo III
desnaturação a 95ºC por 5 min, 35 ciclos de desnaturação a 95º C por 30 seg, hibridação a 52
o
C por
30 seg e extensão a 72º C por 40 seg, por fim, um ciclo de extensão a 72º C por 10 min.
Cerca de 5μl do produto foi purificado com a adição de 0,5 μl de fosfatase alcalina de camarão
(1 U/μl) e 0,4 μl de exonuclease I (10 U/μl) e incubado por 1 hora à 37ºC, seguido de 10 minutos à
80ºC. Para cada reação foi adicionada em um tubo de microcentrífuga de 200 μl, a seguinte mistura:
1,5 µl de solução “Big Dye”, 1 μl de “primer” 10mM (apenas um tipo de “primer” em cada reação)
e 5 µl de DNA (20-50 ng) e as reações foram colocadas no termociclador (TC2400 Applied
Biosystems) nas seguintes condições: desnaturação a 95ºC por 1 min, 25 ciclos de desnaturação a
96º C por 10 seg, hibridação a 50
o
C por 30 seg e extensão a 60º C por 4 min, por fim, um ciclo de
extensão a 72º C por 10 min.
Antes de seqüenciar, as amostras foram purificadas individualmente, através de precipitação, de
acordo com o seguinte protocolo: foram adicionados 4 μl de água e 16 μl de etanol 95% no próprio
tubo de microcentrífuga onde ocorreu a reação. A solução foi misturada em agitador de tubos e
mantida por 15 minutos à temperatura ambiente (~25ºC). A amostra foi centrifugada por 30 minutos
a 12000 rpm e o sobrenadante retirado com auxílio de micropipeta do lado oposto ao precipitado de
DNA. O precipitado foi lavado com cerca de 200 μl de etanol 70% e a solução foi misturada em um
agitador de tubos e novamente centrifugada por 7 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi retirado
com auxílio de micropipeta. A amostra foi seca a 90ºC durante 2 minutos e mantida a -20ºC caso
não fosse imediatamente preparada para seqüenciamento.
O seqüenciador utilizado foi o ABI 377 (Applied Biosystems). O produto do seqüenciamento
foi dissolvido em 1,6 μl de formamida:dextran azul 25 mM EDTA (5:1), ressuspenso e desnaturado
por 2 minutos a 90ºC em banho seco. Foram carregados no gel 1,6 μl de cada amostra.
As seqüências das duas fitas de DNA de cada amostra de microssatélites foram editadas no
programa Sequence Navigator (Applied Biosystems). O BLAST foi utilizado para comparar as
seqüências da região controladora obtidas com as seqüências depositadas no GeneBank. Com o
auxílio do mesmo programa, as seqüências foram alinhadas e comparadas com as obtidas para as
espécies para as quais os “primers” foram desenvolvidos originalmente.
Microsatélites
Quatorze locos de microssatélites foram testados (Tabela 2). Sete dos “primers” foram
obtidos a partir de uma biblioteca genômica desenvolvida por Caparroz et al. (2003) para Arara-
canindé (Ara ararauna). Dois destes locos (UnaCT35 e UnaCT84) ainda não foram publicados.
Outros cinco pares de “primers” foram desenvolvidos para uma espécie de papagaio endêmico da
Ilha de Saint Vincent (Amazona guildingii) na América Central (Russello et al., 2001). Os outros
50
Capítulo III
dois pares foram desenvolvidos para Anodorhynchus hyacinthinus pelo Dr. Scott K. Davis, da
Texas A and M University, USA (não publicado).
Tabela 2. Seqüências dos “primers” de microssatélites
Loco Referência
Seqüência dos primers (5’ → 3’)
Caparroz et al, 2003 UnaCT21 (CT21) F: CTTTCCCATACTTAGCCATA
R: AGACATTTCAAGACCGTGCC
Caparroz et al, 2003 UnaCT32 (CT32) F: TCTTGCTTATTCTTCCCCAG
R: ACCACCACCAGGAAGCACGG
Caparroz et al, não
publicado
UnaCT35 (CT35) F: TTCTATCCCTTTTTGTCAGC
R: TAGCTAGATTTTCTTCTCTG
Caparroz et al, 2003 UnaCT43 (CT43) F: TCATCCTATCACCAGAAGGG
R: CTTGAGGACAGTGCAGAGGG
Caparroz et al, 2003 UnaCT74 (CT74) F: CTGGACTGCTGCTCTTAACA
R: AGCCTGAAGTGAACTGCATG
Caparroz et al, não
publicado
UnaCT84 (CT84) F: ACAGTGAAGCTTGAATCTTA
R: CCAAGTTTAGGAGGAAAAGG
Caparroz et al, 2003 UnaGT55 (GT55) F: TCTGCCCTCTGTCTTATGCC
R: ACTTTGGTTTGTCCCTGC
Russello et al, 2001 AgGT07 (GT07) F: CAAACCATTTACACCC
R: GCTCTTGAGTTTTCCC
Russello et al, 2001 AgGT08 (GT08) F: GTGGCCTAACCTGAGAGTGG
R: ACATGTGCACACCTGATGG
Russello et al, 2001 AgGT12 (GT12) F: ACTCATGCAGGGGTTCTCAG
R: TTGTGGCTGGTAGAGGTGTG
Russello et al, 2001 AgGT21 (GT21) F: TCCCAGGCCAACACATTTAC
R: GCTTAGTGCATATCCCAAGCTA
Russello et al, 2001 AgGT81 (GT81) F: GGGGAACATCATTCTTCCAG
R: AGAAGGAGGGAAGCACATGA
MAC 436 (MAC) F: GCACCAAACACAACATCTTATTC Davis, não publicado
R: TTGGGACACCAATGTAATTTG
HYA 1172 (HYA) F: GATCCTTTGCTTAAGACAGATGTC Davis, não publicado
R: GAGTGAAATACACATTCAGCTTCTG
F – “forward”, R – “reverse”
Para o teste inicial de amplificação foram utilizadas amostras de dois indivíduos e as reações
de amplificação foram feitas em um volume final de 12,5 µl, sendo 6,3µl de água Milli Q, 1,2 µl de
tampão (10X), 1,0 µl de dNTPs (2 mM), 0,4 µl de MgCl
2
(25 mM), 1 µl do “primer Forward” (10
µM), 1 µl do “primer Reverse” (10 µM), 0,1 µl de Taq polimerase (5 U/µl, Pharmacia) e 1,5 µl de
DNA (20-50ng). As reações foram realizadas em termociclador nas seguintes condições:
desnaturação a 95ºC por 10 min, 35 ciclos de desnaturação a 95º C por 1 min, hibridação a 50
o
C –
60º C por 40 seg e extensão a 72º C por 40 seg, por fim, um ciclo de extensão a 72º C por 10 min.
Para os locos que apresentavam uma banda única e nítida foram feitas novas reações nas
mesmas condições, exceto as quantidades dos "primers" e incluindo um “primer” M13 (10µM)
marcado com fluorescência (TET ou HEX, Applied Biosystems): 0,3 µl do “primer Reverse” (10
51
Capítulo III
µM), 0,2 µl de “primer” M13 (10µM) marcado com fluorescência e 0,1 µl do “primer Forward”
com uma cauda 5´M13 (5´- CACGACGTTGTAAAACGAC, Boutin-Ganache et al., 2001) (10 µM)
e o volume de água Milli Q foi aumentado para 7,2 µl. Depois de amplificados, 1,5μl dos produtos
foram carregados em gel de agarose 1,5% para verificação da presença e quantidade do produto.
Se o produto possuía boa quantidade e qualidade, cerca de 0,5μl do marcador molecular
Genescan–500 TAMRA (Applied Biosystem) (2fmol), 2,0 μl de formamida e 0,4 μl de dextran azul
(50 mg/ml) foram misturados a uma alíquota de 1,5 μl de cada uma das amostras amplificadas.
Cerca de 4,0 μl dessa mistura foi aplicada em gel de acrilamida 7% e analisada em um seqüenciador
automático ABI 377 (Applied Biosystems). A identificação do tamanho dos alelos foi feita com
auxílio do programa Genotyper 2.1 (Perkin Elmer). O polimorfismo foi testado em 10 indivíduos e
os locos que se mostraram polimórficos foram utilizados na genotipagem de toda as aves.
Como foram utilizados “primers” heterólogos, um alelo por loco foi seqüenciado para
confirmar a existência de microssatélite. As reações de amplificação foram feitas em um volume
final de 10 µl, sendo 4,9µl de água Milli Q, 1 µl de Tampão (10X), 1 µl de dNTPs (4 mM), 1 µl de
cada “primer" (10 µM; Tabela 1), 0,1 µl de Taq polimerase (5 U/µl, Pharmacia) e 1 µl de DNA (20-
50ng) e as condições de amplificação foram: desnaturação a 95ºC por 10 min, 35 ciclos de
desnaturação a 95ºC por 1 min, hibridação a 50
o
C – 60ºC por 40 seg e extensão a 72ºC por 40 seg,
por fim, um ciclo de extensão a 72ºC por 10 min. A reação de seqüenciamento e purificação do
DNA foi feito como já descrito no item “Seqüenciamento de DNA”. O BLAST foi utilizado para
comparar as seqüências dos microssatélites com as seqüências depositadas no GeneBank. Com o
auxílio do programa Sequence Navigator (Applied Biosystems) as seqüências obtidas dos produtos
de amplificação dos microssatélites foram alinhadas e comparadas com as obtidas para as espécies
para as quais os “primers” foram obtidos originalmente.
Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Equilíbrio de ligação
A comparação das freqüências de heterozigotos esperada e observada foi utilizada para
analisar se os locos e encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Esse cálculo foi realizado com
auxílio do programa Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995). O equilíbrio de ligação entre os
locos foi avaliado por um teste (Fischer exact test) no qual são criadas tabelas de contingências para
todos os pares de locos e calculada a probabilidade para cada tabela usando a cadeia de Markov
com auxílio do programa Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995). Comparando as freqüências de
homozigotos esperado e observado foi avaliado se havia evidência de presença de alelos nulos e de
erro de genotipagem com auxílio do programa Micro-checker (Brookfield, 1996). Todos os testes
52
Capítulo III
foram feitos com os 86 indivíduos (não incluindo os indivíduos das apreensões) e para cada grupo
de localidades diferentes.
Análise da variação genética
A diversidade de cada população foi avaliada segundo o número de alelos por loco e as
heterozigosidades observada e esperada. Tais parâmetros foram estimados com auxílio do programa
Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995). Já o grau de diferenciação entre os grupos de indivíduos
das diferentes localidades estudadas foi avaliado pela estimativa dos índices de fixação F
ST
e R
ST
.
Os valores de F
ST
foram estimados segundo descrito por Weir e Cockerham (1984), através da
análise da variância das freqüências gênicas observadas entre diferentes populações assumindo o
modelo de mutação de alelos infinitos (IAM; Kimura e Crow, 1964). Esses valores foram
calculados com auxílio do programa Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995). Os valores de R
ST
foram calculados segundo descrito por Slatkin (1995) assumindo o modelo de mutação “stepwise”
(ganho ou perda de apenas uma unidade de repetição por evento de mutação, Oha e Kimura, 1973)
com auxílio do programa R
ST
calc (Goodman, 1997).
Para verificar se o genótipo dos indivíduos pode ser agrupado à população de origem foi
realizado um teste de atribuição populacional (assignment test). Este teste envolve o cálculo da
verossimilhança de o genótipo de cada indivíduo pertencer a cada população e, subseqüentemente
atribui cada indivíduo à população para a qual o logaritmo da probabilidade de sua freqüência
genotípica esperada for maior (Waser e Strobeck, 1998). O poder de discriminação deste teste é
mais alto se as populações envolvidas são moderada ou altamente diferenciadas (Cornuet et al.,
1999) e elas devem estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg e os locos em equilíbrio de ligação.
Esse teste foi feito com auxílio do programa Arlequin 2.0 (Schneider et al., 2000)
Resultados
O indivíduo amostrado no Alto Rio Xingú-MT apresenta maior probabilidade de ser da
região Norte segundo o teste de atribuição. Esse resultado pode indicar que esse indivíduo migrou
de uma região para outra ou que falta poder estatístico para realizar o teste, ou seja, como os grupos
de indivíduos se encontram moderadamente estruturados (ver mais à frente), o teste poderia resultar
em uma atribuição incorreta. Assim, como não podemos testar essas hipóteses, esse indivíduo foi
retirado das análises populacioais.
Sequenciamento de DNA
Foram obtidas seqüências de aproximadamente 700pb da região controladora de amostras de
cinco indivíduos coletados em Redenção, Pará. Três das seqüências apresentaram alta similaridade
53
Capítulo III
com a região controladora de Anodorhynchus hyacinthinus (96-93% de identidade e "e-value" 0.0) e
as outras duas com a de Ara ararauna (99-93% de identidade e "e-value" 0.0). Essas amostras que
foram confirmadas como sendo de Anodorhynchus hyacinthinus foram adicionadas na análise
populacional do presente trabalho.
Microssatélites
Dos quatorze primers de microssatélites testados, dez geram produtos de amplificação
(Tabela 3). Foram selecionados indivíduos homozigotos para os locos UnaCT21, UnaCT32,
UnaCT43, UnaCT74, UnaGT55, AgGT08, MAC436 e HYA1172 para terem seus alelos
seqüenciados. Foi confirmada a presença de microssatélites para todos os locos. Os sete locos
polimórficos apresentam de dois a seis alelos, entretanto, no loco MAC436 foi observada
deficiência de heterozigotos, sendo excluído das análises posteriores.
Tabela 3. Resultado dos testes com quatorze “primers” de microssatélites
CT21 CT32 CT35 CT43 CT74 CT84 GT55 GT07 GT08 GT12 GT21 GT81 MAC HYA
+ + + + + - + - + - + - + +
Amplificação
P P M P P - P - M - M - P P
Polimorfismo
+ presente, - ausente; P – polimórfico, M – monomórfico
O número de alelos identificados por loco variou de dois a sete e suas freqüências variaram
de 0,028 (alelo 259 do loco UnaCT21) a 0,91 (alelo 224 do loco UnaCT43) (Tabela 4). A
heterozigosidade média de cada loco variou de 0,101 (UnaCT43) a 0,658 (UnaGT55), com média
entre todos os locos de 0,465 (Tabela 5). Esses seis locos de microssatélites analisados estão em
equilíbrio de ligação (p > 0,05), podendo ser considerados como marcadores independentes. Nos
testes de equilíbrio de Hardy-Weinberg, não foram observados desvios significativos (p > 0,05) na
heterozigosidade esperada para cada loco em cada uma das localidades estudadas. E ainda, não foi
identificada deficiência de heterozigotos em nenhum dos locos analisados, isto representa, segundo
Van Treuren (1998), um bom indicativo de ausência de alelos nulos.
54
Capítulo III
55
Tabela 4. Freqüência alélica relativa dos seis locos analisados em 82 Anodorhynchus hyacinthinus
amostrados em diferentes localidades. O número de indivíduos analisados em cada uma das
localidades é apresentado entre parênteses
Freqüência relativa
Loco Alelo PN
(24)
PS/MI
(18)
PS/NH
(14)
PS/AB
(5)
PS/RN
(6)
NO
(9)
NE
(11)
UnaCT21 259
261
263
269
271
285
289
-
0,39
0,20
-
0,32
0,045
0,045
0,028
0,611
0,139
-
0,22
-
-
0,04
0,67
0,12
-
0,17
-
-
-
0,70
0,10
-
0,20
-
-
-
0,83
0,17
-
-
-
-
0,062
0,50
0,31
0,12
-
-
-
-
0,41
0,45
0,045
0,091
-
-
UnaCT32 279
283
-
1,0
0,29
0,71
0,54
0,46
0,6
0,4
0,4
0,6
0,37
0,63
0,27
0,73
UnaCT43 220
222
224
226
248
0,02
0,02
0,91
-
0,04
-
-
1,0
-
-
-
0,04
0,96
-
-
-
-
1,0
-
-
-
-
1,0
-
-
-
-
0,78
0,22
-
-
-
0,95
0,05
-
UnaGT55 202
222
224
226
0,48
0,52
-
-
0,34
0,5
0,08
0,08
0,5
0,4
0,03
0,07
0,5
0,5
-
-
0,42
0,42
-
0,17
0,44
0,56
-
-
0,55
0,41
0,04
-
UnaCT74 256
264
266
268
270
272
276
-
-
0,16
0,08
0,04
0,02
0,7
-
-
0,22
0,06
-
-
0,72
-
-
0,43
0,14
-
-
0,43
-
-
0,30
0,10
-
-
0,6
-
-
0,25
0,08
-
-
0,67
0,06
-
0,25
0,19
0,06
-
0,44
-
0,04
-
0,23
0,04
0,04
0,64
HYA 1172 172
174
0,83
0,17
0,69
0,31
0,68
0,32
0,4
0,6
0,58
0,42
0,81
0,19
0,95
0,05
PN- Pantanal Norte; PS- Pantanal Sul; PS/MI - Miranda; PS/NH - Nhecolândia; PS/AB - Abobral;
PS/RN - Rio Negro; NO - Norte; NE - Nordeste
Tabela 5. Heterozigosidade observada para cada loco em cada localidade e as médias por loco e por
localidade
Loco PN PS/MI PS/NH PS/AB PS/RN NO NE Média
UnaCT21 0,652 0,722 0,692 0,600 0,334 0,500 0,818 0,654
UnaCT32 0,000 0,430 0,519 0,550 0,550 0,500 0,418 0,424
UnaCT43 0,168 0,000 0,071 0,000 0,000 0,381 0,090 0,101
UnaGT55 0,512 0,640 0,602 0,550 0,667 0, 518 0,550 0,658
UnaCT74 0,496 0,438 0,631 0,625 0,516 0,768 0,568 0,577
HYA 1172 0,294 0,441 0,456 0,550 0,533 0,321 0,090 0,383
Média 0,314 0,421 0,524 0,400 0,455 0,440 0,424
0,465
PN- Pantanal Norte; PS/MI - Miranda; PS/NH - Nhecolândia; PS/AB - Abobral; PS/RN - Rio Negro;
NO - Norte; NE - Nordeste
Capítulo III
Diferenciação genética
Para avaliar a estrutura populacional da espécie, foram realizadas comparações entre todas
as localidades amostradas, sendo que o Pantanal Sul foi subdividido em quatro áreas que distam de
aproximadamente 120 a 200 km. Os índices de fixação obtidos evidenciaram uma moderada
diferenciação genética entre algumas das localidades estudadas (PN x sub-regiões do Pantanal Sul,
PN x NO, PN x NE, NO x PS/MI, NO x PS/NH, NE x sub-regiões do Pantanal Sul), com valores de
F
ST
e R
ST
significativamente diferentes de zero (p < 0,05) (Tabela 6). Os índices entre as sub-
regiões do Pantanal Sul (PS/MI, PS/NH, PS/AB e PS/RN) foram negativos ou muito próximo a zero
(Tabela 6) e não são significantemente diferentes de zero (p > 0,05). Isso indica que dentro do
Pantanal Sul não há diferenças na composição das freqüências alélicas e, portanto, se comportaria
como uma grande população. Já as amostras do NO e NE apresentam um F
ST
não significantemente
diferente de zero (p > 0,05) diferente do encontrado para o R
ST
que é sigificantemente maior do que
zero (p > 0,05) (Tabela 6).
Tabela 6. Valores de F
ST
(abaixo da diagonal) e R
ST
(acima da diagonal) estimados entre A.
hyacinthinus de diferentes localidades. Em negrito estão os valores com p < 0,05
Localidade PN PS/MI PS/NH PS/AB PS/RN NO NE
PN -
0,0433 0,0434 0,0120 0,0502 0,0621 0,0138
0,0432 0,0530 0,0414
PS/MI - 0,0364 -0,062 -0,0328
0,1333
PS/NH 0,0258 - -0,0617 -0,191
0,0418 0,074
0,1710 0,0298
PS/AB 0,0184 -0,0227 - -0,0630 -0,0629
0,1007 0,0392
PS/RN -0,0206 -0,0108 -0,0501 - -0,0155
0,0617 0,0204 0,0318 0,0539 0,057
NO 0,0016 -
0,0499 0,0541 0,0936 0,1434 0,0834
NE 0,0019 -
PN- Pantanal Norte; PS/MI - Miranda; PS/NH - Nhecolândia; PS/AB - Abobral; PS/RN - Rio
Negro; NO - Norte; NE - Nordeste
Partindo do pressuposto que para o cálculo do teste de atribuição as população devem
apresentar algum grau de estruturação, as amostras do Pantanal Sul foram reunidas em um único
grupo. A correta atribuição ao grupo de origem ocorreu em 83% dos indivíduos amostrados no
Pantanal Norte, 81% dos indivíduos do Pantanal Sul, 50% do Norte e 80% do Nordeste (Tabela 7).
56
Capítulo III
Tabela 7. Número de indivíduos que foram atribuídos aos grupos pré-estabelecidos e porcentagem
de indivíduos que foram corretamente atribuídos ao seu grupo de origem (%). Entre parênteses
estão os números totais de indivíduos analisados
Grupo atribuído
Grupo de origem PN PS NO NE %
PN (24) 20 3 - 1 83
PS (38) 6 31 - 1 81
NO (9) - 2* 4 2** 50
•
NE (11) 1 1
••
- 8 80
PN- Pantanal Norte; PS - Pantanal Sul; NO - Norte; NE-
Nordeste; * Rio Iriri (museu) e Serra dos Carajás (museu); **
Redenção (C. Baider) e Capitão Poço (museu);
•
Piauí
(Martuscelli e Yamashita);
••
Piauí (Martuscelli e Yamashita)
Origem dos filhotes apreendidos
Foi realizada uma análise de F e R
ST ST
na qual as amostras foram separadas em oito grupos:
Pantanal Norte (PN), Pantanal Sul (PS), Norte (NO), Nordeste (NE) e os indivíduos das quatro
apreensões (AP1, AP2, AP3 e AP4) (Tabela 8). Dentre os quatro grupos já estudados (PN, PS, NO e
NE), novamente foram encontrados valores de F
ST
significantemente diferentes de zero (p < 0,05)
entre as quatro regiões, com exceção das regiões Norte e Nordeste que não apesentam índices
significantemente diferentes de zero (p > 0,05). Já o R
ST
apontou moderada estruturação entre as
regiões Norte e Nordeste. Somente os grupos do Pantanal Sul e do Nordeste apresentam índices de
R
ST
não significantemente diferentes de zero (p > 0,05). Para a apreensão 1, os resultados mostram
diferenciação significativa entre esse grupo e os do Pantanal Norte e do Pantanal Sul (p < 0,05),
enquanto não se apresentam diferenciados em relação ao grupo do Nordeste para os dois índices (p
> 0,05). Para a apreensão 2, o R
ST
aponta índices significantemente diferentes de zero (p > 0,05) na
comparação com todos os demais grupos com exceção da AP3; entretanto, os F
ST
entre essa
apreensão e a região Nordeste e a AP3 não são significantemente diferente de zero (p > 0,05; Tabela
8). Os índices de R
ST
para a apreensão 3 não são significantemente diferentes de zero (p > 0,05)
com todos os outros grupos. Já o F
ST
mostrou diferenciação significativa entre Norte, Nordeste,
AP1 e AP4 (p < 0,05). Para a apreensão 4 os índices de F
ST
indicam moderada estruturação (p <
0,05) com Pantanal Sul, Norte, Nordeste e com as outras três apreensões e o R
ST
com a região
Nordeste e AP2.
57
Capítulo III
Tabela 8. Valores de F
ST
(abaixo da diagonal) e R
ST
(acima da diagonal) estimados entre A.
hyacinthinus de origem conhecida (Pantanal Norte, Pantanal Sul e Norte/Nordeste) e grupos
apreendidos. Em negrito estão os valores com p < 0,05
Localidade PN PS NO NE AP1 AP2 AP3 AP4
PN -
0,0405 0,0621 0,0138 0,0445 0,1444
-0,0669 -0,0051
0,0910 0,0449 0,0456 0,0708
PS - 0,0071 -0,1647 -0,0083
0,0617 0,0522 0,053 0,0503 0,0742 0,0380
NO - 0,0181
0,0499 0,0778
NE 0,0019 - -0,0016
0,1942
-0,1998 -0,0457
0,1134 0,1485 0,2094
AP1 0,0146 -0,0008 - -0,1804 0,0009
0,0710 0,0558 0,1310 0,1896
AP2 0,0344 - -0,0279
0,1463
AP3 -0,0030 -0,0052
0,0554 0,0840 0,2046
-0,094 - -0,2098
0,0999 0,1460 0,0926 0,979 0,1088 0,2261 0,2726
AP4 -
PN- Pantanal Norte; PS - Pantanal Sul; NO/NE - Norte/Nordeste; AP - apreensão
O teste de atribuição foi realizado também assumindo quatro grupos com origem conhecida:
Pantanal Norte (PN), Pantanal Sul (PS), Norte (NO) e Nordeste (NE). Cada apreensão foi analisada
isoladamente com esse conjunto de grupos. Dentre todos os indivíduos apreendidos (24 no total),
somente dois deles (8%) apresentaram maior probabilidade de pertencerem a algum desses quatro
grupos do que de pertencerem ao seu próprio grupo (apreensão), em outras palavras, a maioria dos
filhotes foi atribuída ao seu grupo original. No entanto, quando a análise é realizada de modo que os
indivíduos das apreensões possam ser atribuídos somente aos quatro grupos (PN, PS, NO e NE),
todos os indivíduos das apreensões 1 e 2 possuem maior probabilidade de pertencer à região Norte,
já os da apreensão 3 possuem probabilidade maior de pertencer ao Pantanal Sul e 75% dos
indivíduos da apreensão 4 possuem maior probabilidade de pertencer ao Pantanal Norte (Tabela 9;
Figura 2).
Tabela 9. Número de indivíduos que foram atribuídos com maior proabilidade aos grupos pré-
estabelecidos e porcentagem de indivíduos que foram atribuídos à uma mesma população (%).
Entre parênteses estão os números totais de indivíduos analisados por apreensão
Grupo atribuído
Grupo de origem
PN PS NO NE %
AP1 (10) - - 10 - 100
AP2 (4) - - 4 - 100
AP3 (2) - 2 - - 100
AP4 (8) 6 - 1 1 75
PN- Pantanal Norte; PS - Pantanal Sul; NO - Norte; NE - Nordeste;
AP - apreensão
58
Capítulo III
Figura 2. Resultados do teste de atribuição entre os grupos estudados (a) Apreensão 1; (b)
Apreensão 2; (c) Apreensão 3 e (d) Apreensão 4.
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-30 -20 -10 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Pantanal Norte
PN
AP1
(a)
-25
-20
-15
-10
-5
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabiliddae de pertencerem ao Pantanal
Sul
Log da probabilidade de
pertencerem à AP1
PS
AP1
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao
Nort e
NO
AP1
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
-12 -10 -8 -6 -4 -2 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Nordeste
Log da probabilidade de
pertencerem à AP1
NE
AP1
(b)
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-60 -40 -20 0
Log da probabilidade de pertencerem ao
Pantanal Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP2
PN
AP2
-25
-20
-15
-10
-5
0
-15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao
Nordeste
NE
AP2
-25
-20
-15
-10
-5
0
-15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Pantanal
Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP2
NO
AP2
-25
-20
-15
-10
-5
0
-15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Nordeste
Log da probabilidade de
pertencerem à AP2
NE
AP2
59
Capítulo III
(c)
(d)
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
-40 -30 -20 -10 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP4
NO
AP4
-20
-15
-10
-5
0
-30 -25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Nordeste
Log da probabilidade de
pertencerem à AP3
NE
AP3
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Pantanal Sul
Log da probabilidade de
pertencerem à AP3
PS
AP3
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Pantanal Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP3
PN
AP3
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP3
NO
AP3
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Pantanal Sul
Log da probabilidade de
pertencerem à AP4
PS
AP4
-35
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem
ao Pantanal Norte
Log da probabilidade de
pertencerem à AP4
PN
AP4
-20
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
-25 -20 -15 -10 -5 0
Log da probabilidade de pertencerem ao Nordeste
Log da probabilidade de
pertencerem à AP4
NE
AP4
60
Capítulo III
Discussão
Diversidade genética
Foram encontrados de dois a sete alelos para os locos analisados no presente estudo com 86
Anodorhynchus hyacinthinus e a heterozigosidade média entre os locos foi de 0,465 (Tabela 5).
Enquanto os mesmos locos em 49 Ara ararauna (espécie para a qual foram desenvolvidos os
"primers" utilizados no presente trabalho) apresentaram três a 11 alelos e a heterozigosidade média
entre todos os locos foi de 0,604 (Caparroz, 2003). Portanto, a diversidade genética encontrada
nessa espécie foi maior do que a encontrada para A. hyacinthinus. Essa menor variabilidade em A.
hyacinthinus pode ser decorrente do uso de "primers" heterólogos ou ser uma característica da
espécie. A. hyacinthinus é considerada vulnerável e A. ararauna não (BirdLife International, 2000)
e isto está relacionado com a diferença no tamanho populacional dessas espécies, sendo o de A.
hyacinthinus (5000 indivíduos; Collar et al., 1997; Guedes e Harper, 1995) muito menor do que o
de A. ararauna (tamanho populacional desconhecido mas certamente muito maior que 5000).
Assim, a menor variabilidade genética em A. hyacinthinus seria esperada. Esse resultado também
está de acordo com valores de variabilidade genética obtidos com a técnica de "DNA
fingerprinting" que apontam 65,60% de variabilidade em A. hyacinthinus e 68,50% para A.
ararauna (Caparroz, 1998). Além disso, a maior variabilidade em A. ararauna do que em A.
hyacinthinus também foi encontrada na análise de minissatélites de loco único e de regiões entre
microssatélites (Faria, 2000).
Estrutura populacional
Os resultados dos índices de R
ST
obtidos no presente trabalho evidenciaram a existência de
moderada diferenciação genética entre os quatro principais grupos de origem conhecida: Pantanal
Norte, Pantanal Sul, Norte e Nordeste. No entanto, o F
ST
não indica que haja diferenciação entre a
região Norte e o Nordeste. Por outro lado, o teste de atribuição corrobora os dados de R
ST
,
sugerindo que esses dois grupos sejam distintos, sendo 80% dos indivíduos do Nordeste
corretamente atribuídos à este grupo e 50% ao Norte, com somente 25% destes atribuídos ao
Nordeste. Além disso, os grupos do Norte e Nordeste estão distantes de aproximadamente 1600
Km, sendo provável haver um isolamento devido à distância. A ausência de estruturação entre esses
grupos evidenciada pelo F
ST
não deve ser devido à existência de fluxo gênico, mas talvez devido a
um isolamento relativamente recente na história dessas duas populações e elas ainda não tiveram
tempo suficiente para se diferenciar. Essa falta de estruturação genética evidenciada pelo F
ST
entre
as regiões Norte e Nordeste também pode estar sendo influenciada por alguns fatores: baixo número
amostral, o ano em que os indivíduos foram amostrados e a procedência dos indivíduos. O número
61
Capítulo III
amostral do Norte e Nordeste separadamente é pequeno em relação à amostragem das outras regiões
e esse baixo número pode não permitir a detecção de diferenças entre os dois grupos pelo F
ST
.
Dentre as amostras de museu de A. hyacinthinus analisadas no presente estudo (todas do Pará), uma
é de 1914, uma é da década de 50 e as quatro últimas são da década de 80. Como a amostragem
total da região Norte é de apenas oito indivíduos, a freqüência alélica nessas seis amostras mais
antigas poderia ser diferente da atual e isso não pode ser testado com a limitada amostragem
disponível. Com relação à procedência dos indivíduos estudados, todas as amostras do Pantanal Sul
e Norte são provenientes de coletas em campo e, por isso, têm origem conhecida. Já para algumas
amostras da região nordeste pode haver algum engano na identificação da procedência, pois cinco
do total de 11 são provenientes de apreensões (Tabela 1). Assim, seria muito importante aumentar a
amostragem das regiões Norte e Nordeste.
As localidades amostradas no Norte e no Sul do Pantanal estão distantes de
aproximadamente 500 Km e não há nenhuma grande barreira física entre elas. No entanto, não
foram encontrados registros na literatura sobre a existência de A. hyacinthinus entre essas duas
regiões. Também foi realizado um levantamento de registros da espécie em museus e não foi
encontrado nenhum espécimen coletado nessa região intermediária. Os resultados de F
ST
, de R
ST
e
do teste de atribuição sugerem que há estruturação entre o Pantanal Norte e o Sul. No entanto, A.
hyacinthinus apresenta grande potencial de dispersão, sendo possível haver deslocamentos a
grandes distâncias, até mesmo entre as duas regiões de amostragem (Pantanal Norte e Pantanal Sul).
Assim, tal diferenciação poderia estar associada ao comportamento de filopatria natal da espécie, ou
seja, o retorno de aves ao local de nascimento para a reprodução (Guedes e Harper, 1995). Caso
haja grupos de A. hyacinthinus na área não amostrada entre essas duas regiões estudadas, será
fundamental incorporá-los em análises futuras. Como esperado, devido às pequenas distâncias (120
a 200 Km) não foi encontrada diferenciação genética entre as sub-regiões do Pantanal Sul (Miranda,
Nhecolândia, Abobral e Rio Negro). Isso sugere que os indivíduos possam realizar curtos
deslocamentos e se fixar, reproduzindo nesses novos locais. Resultado semelhante foi obtido para
uma espécie de papagaio, Amazona auropalliata, amostrado em nove localidades da Costa Rica.
Para essa espécie foi observado alto fluxo gênico e ausência de estruturação populacional (Wright
et al., 2005).
Teste de atribuição
Os resultados do teste de atribuição mostram que foi possível atribuir a maioria dos
indivíduos de A. hyacinthinus à sua respectiva população de origem. Kyle e Strobeck (2001)
estudando populações de um mamífero (Gulo gulo) com diferentes graus de difenciação verificaram
62
Capítulo III
que, quanto maior a estruturação, maior é a porcentagem de indivíduos atribuídos corretamente à
população de origem. Para as populações moderadamente diferenciadas, foram corretamente
atribuídos 47 a 74% dos indivíduos. Tais valores são semelhantes aos encontrados no presente
estudo. Resultados similares também foram obtidos por Paetkau et al. (1995), utilizando 8 locos de
microssatélites com a atribuição correta de 56 a 66% dos indivíduos a três populações de ursos
moderadamente diferenciadas. Esses autores sugerem que seriam necessários mais locos
polimórficos para aumentar a porcentagem de atribuições corretas. No caso de A. hyacinthinus seria
importante aumentar a amostragem de indivíduos do Norte e do Nordeste, bem como desenvolver
ou selecionar mais locos de microssatélites.
Indivíduos da apreensão
Na análise de atribuição considerando cada grupo de apreensão como sendo uma potencial
população, 92% dos indivíduos das apreensões (22 dos 24 indivíduos) não foram atribuídos a
nenhum dos quatro grupos de origem conhecida (PN, PS, NO e NE), podendo indicar que estas aves
poderiam ser provenientes de outra população que não foi amostrada no presente trabalho. Além
disso, há a possibilidade de haver irmãos nesses grupos de apreensão o que poderia resultar em uma
atribuição a esse grupo de origem com alta probabilidade. Os índices de similaridade simples
(expresso por X= 2 N / N
AB A
+ N , onde N
B AB
é o número de alelos em comum entre dois indivíduos
A e B, N
A
e N
B
são o número de alelos presentes nos indivíduos A e B, respectivamente) entre os
indivíduos da apreensão 1 (AP 1) variam de 0,41 a 0,92 com média de 0,67 ± 0,11; da apreensão 2
(AP2) variam de 0,58 a 0,92 com média de 0,67 ± 0,15; da apreensão 3 (AP3) 0,92 e da apreensão 4
(AP4) variam de 0,5 a 0,92 com média de 0,72 ± 0,12. Entre indivíduos possivelmente não
aparentados (filhotes de ninhos diferentes do Pantanal Norte) o índice varia de 0,2 a 1,0 com média
de 0,61 ± 0,15 (843 comparações). As médias encontradas entre os indivíduos de cada apreensão
são significativamente maiores (p < 0,05) do que a média entre os não aparentados. Assim, essa
maior similaridade pode estar influenciando os resultados do teste de atribuição.
Quando foi considerada apenas a existência das quatro populações analisadas, os indivíduos
das AP1 e AP2 apresentam probabilidades de pertencerem à região Norte mais elevadas do que a de
pertencerem a qualquer um dos outros grupos de origem conhecida (Figura 2). Esse resultado é
parcialmente corroborado pelo índice de F
ST
que não é significativo (p > 0,05) entre AP1 e Norte e
AP2 e Norte. O fato de os índices de R
ST
e F
ST
não serem significativos para o par AP1 e Nordeste
pode ser devido à amostragem limitada no NO/NE. Assim, o teste não alcançou poder estatístico
para distinguir as populações corretamente. Esses resultados sugerem que os indivíduos dessas
apreensões não sejam originários do Pantanal mas possivelmente foram capturados na região Norte.
63
Capítulo III
Apesar de esses filhotes (AP1 e AP2) terem sido apreendidos no Mato Grosso, Mato Grosso do Sul
e em Porto Alegre e de os traficantes terem informado à polícia que as aves eram provenientes do
Pantanal, os resultados das análises genéticas mostraram que os filhotes possuem maior
probabilidade de não pertencerem ao Pantanal do que terem origem no Norte/Nordeste do país. Esse
resultado está de acordo com observações de campo que indicam que esses filhotes apreendidos
estavam em estágio de desenvolvimento diferente daquele observado em filhotes sendo
monitorados no Pantanal pelo projeto Arara-azul (Guedes, comunicação pessoal). Assim, esse tipo
de análise pode auxiliar na investigação da rota tomada por esses traficantes.
A AP3 ocorreu em Miranda (uma das sub-regiões regiões amostradas no presente trabalho) e
existia a forte suspeita de que esses indivíduos foram capturados na região pois foram apreendidos
com uma moradora local. Os dados do teste de atribuição corroboram a hipótese, pois ambos
indivíduos foram atribuídos à essa região. Os dados de F
ST
corroboram parcialmente esses
resultados pois os valores foram não significativos (p > 0,05) em relação ao Pantanal Norte e Sul e
significativos para o Norte e Nordeste (p < 0,05). Já os índices de R
ST
foram não significativos (p >
0,05) entre as populações. Esses resultados não convergentes podem ser devido à pequena
amostragem da apreensão (2 indivíduos), pois os testes dependem das freqüências das popualções
pré-definidas. Os dados de F
ST
para a AP4 apontam diferenciação em relação a todos os grupos
estudados. Entretanto os índices de R
ST
só apontam diferenciação em relação ao Norte e à AP3. Já o
teste de atribuição mostrou que 75% dos indivíduos foram atribuídos ao Pantanal Norte. Essa
apreensão foi feita na rodovia Castelo Branco e é interessante mencionar que essa rodovia é uma
das vias de São Paulo para o Pantanal. Como não temos informação e nem amostragem da região
entre o Norte e o Sul do Pantanal, pode ser possível que esses indivíduos tenham sido capturado em
regiões não amostradas, mas mais próximo ao Pantanal Norte e isso pode explicar a falta de
resolução dos índices de F
ST
e R
ST
.
Apesar de os dados terem sido bastante informativos, seria importante aumentar o número
de amostras e obter amostras de outras localidades para incrementar o poder das análises.
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st
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Capítulo III
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65
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66
Capítulo IV
Análise da similaridade genética de ninhegos de
Anodorhynchus hyacinthinus
Capítulo IV
Introdução
No Brasil, apesar de ser o país mais rico do mundo em número de espécies de psitacídeos,
há poucos estudos sobre a biologia reprodutiva dessa família. Em geral, isso ocorre devido à
dificuldade em obter certos tipos de informação somente por observação direta no campo. Assim, os
estudos genéticos que envolvem a comparação da similaridade genética entre potenciais pais e
filhotes ou entre potenciais irmãos em relação à similaridade entre indivíduos não aparentados
podem contribuir para a melhor compreensão do comportamento reprodutivo de muitas espécies.
A maioria das espécies de psitacídeos é considerada monogâmica, vivendo rigorosamente
aos casais e, possivelmente, permanecendo unidos por toda a vida (Sick, 1997). No entanto, existem
poucas evidências científicas bem documentadas que corroborem tais observações. Entre os grandes
psitacídeos, poucos estudos genéticos abordam essa questão. Em Ara ararauna e em Ara
chloroptera (Caparroz et al., 2001) a similaridade genética entre filhotes encontrados no mesmo
ninho estimada por "DNA fingerprinting" foi maior do que a encontrada entre filhotes de ninhos
diferentes. Em um dos ninhos de A. chloroptera a similaridade genética observada entre os filhotes
foi menor do que a esperada entre irmãos (Caparroz et al., 2001). Como foi observado que esse
ninho foi disputado por dois casais de A. chloroptera, os autores sugeriram que cada filhote poderia
ser de cada um dos dois casais. Em outros estudos com outras espécies de aves, os dados genéticos
indicaram a monogamia, como é o caso de uma ave marinha Alle alle (Lifjeld et al., 2005). Por
outro lado, muitos trabalhos utilizando "DNA fingerprinting" e, mais atualmente, os microssatélites,
têm identificado altas taxas de acasalamento extra-par em diversas espécies de aves que antes eram
consideradas como estritamente monogâmicas (Westneat, 1990; Wetton et al., 1987; Birkhead et
al., 1990; Ibarguchi et al., 2000).
No presente trabalho, foram utilizados locos de microssatélites para avaliar a similaridade
genética entre filhotes de Anodorhynchus hyacinthinus amostrados em três anos consecutivos no
SESC-Pantanal e em sete anos no Pantanal Sul. Tais dados podem auxiliar na melhor compreensão
do comportamento reprodutivo desta espécie, o que pode contribuir na elaboração de estratégias de
conservação. Em geral, no Pantanal essa espécie nidifica apenas em uma espécie de árvore, o
manduvi Sterculia apetala (Guedes, 1993; Pinho e Nogueira, 2003). As cavidades são reutilizadas
todos os anos como locais de reprodução (Pinho e Nogueira, 2003), podendo ser utilizadas por mais
de um casal, uma vez que, possivelmente a maioria dos casais se reproduza a cada dois anos, pois
investem um ano no cuidado do filhote (Guedes, 1993).
Os microssatélites foram utilizados por serem altamente polimórficos, possuindo uma alta
taxa de mutação e expressão co-dominante, sendo possível distinguir os heterozigotos. Além disso,
68
Capítulo IV
de modo geral, os microssatélite são seletivamente neutros (Hartl e Clark, 1997) e há a
possibilidade de utilizar “primers” descritos para uma outra espécie próxima filogeneticamente da
espécie de interesse (Schlöterer et al., 1991).
Materiais e métodos
Foram recebidas amostras de sangue de 34 filhotes de Anodorhynchus hyacinthinus
monitorados pela equipe do Dr. Paulo Antas na RPPN do Sesc Pantanal no município de Barão do
Melgaço-MT das estações reprodutivas de 2001 a 2003 (Tabela 1). Também foram analisadas
amostras de 65 filhotes monitorados pelo Projeto Arara Azul (coordenado pela Profa. Neiva M.R.
Guedes) nas regiões de Miranda e Nhecolândia -MS de 1998 a 2004 (Tabela 1). As amostras estão
depositadas no acervo do Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves do Departamento
de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (em
etanol absoluto e congeladas). O DNA foi extraído individualmente utilizando o protocolo padrão
de digestão com proteinase K seguida de purificação com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico
(25:24:1) segundo descrito por Bruford et al. (1992).
Tabela 1. Número de filhotes de Anodorhynchus hyacinthinus amostrados por ano em cada ninho de
cada região no Pantanal. N- identificação do ninho
Barão Melgaço-MT
N
Ano
04 05 08 14 31 32 33 42 43 60 64 70 76 79
2001
2002
2003
1
1
1
-
1
1
1
1
-
1
1
-
1
-
1
1
2
-
2
1
1
1
-
1
1
1
-
1
1
1
-
-
2
1
1
-
2
1
-
1
1
-
Miranda/Nhecolândia -MS
N
Ano
62 118 142 180 182 202 205 206 249 259 2061 2088 2141 2151
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
-
-
2
1
-
1
-
-
-
1
-
2
-
-
2
1
1
-
-
-
-
1
1
1
2
1
2
1
-
-
2
1
-
1
2
1
-
1
1
-
1
1
1
1
1
1
-
1
-
-
1
1
-
1
1
1
-
-
1
-
-
1
1
-
-
-
-
1
2
1
-
-
-
-
1
2
1
-
-
1
1
-
2
1
-
-
-
2
1
2
1
-
-
-
-
2
-
-
Foram utilizados seis “primers” de microssatélites desenvolvidos por Caparroz et al. (2003)
para Arara-canindé (Ara ararauna) e um desenvolvido para Anodorhynchus hyacinthinus pelo Dr.
Scott K. Davis, da "Texas A and M University", EUA (não publicado) (Tabela 2). Entretanto um
dos locos (Una CT32) é monomórfico entre os indivíduos do Pantanal Norte e outro (UnaCT43)
para os do Pantanal Sul.
69
Capítulo IV
Tabela 2. Seqüências dos “primers” de microssatélites utilizados
Loco
Seqüência dos primers (5’ → 3’)
Referência
UnaCT21 (CT21) F: CTTTCCCATACTTAGCCATA
R: AGACATTTCAAGACCGTGCC
Caparroz et al., 2003
UnaCT32 (CT32) F: TCTTGCTTATTCTTCCCCAG
R: ACCACCACCAGGAAGCACGG
Caparroz et al., 2003
UnaCT43 (CT43) F: TCATCCTATCACCAGAAGGG
R: CTTGAGGACAGTGCAGAGGG
Caparroz et al., 2003
UnaCT74 (CT74) F: CTGGACTGCTGCTCTTAACA
R: AGCCTGAAGTGAACTGCATG
Caparroz et al., 2003
UnaGT55 (GT55) F: TCTGCCCTCTGTCTTATGCC
R: ACTTTGGTTTGTCCCTGC
Caparroz et al., 2003
HYA 1172 (HYA) F: GATCCTTTGCTTAAGACAGATGTC
R: GAGTGAAATACACATTCAGCTTCTG
Davis, não publicado
F – “forward”, R – “reverse”
Como esses "primers" já tinham sido testados nesta espécie (Capítulo III), as reações foram
feitas com os primers fluorescentes num volume final de 12,5 µl, sendo 7,2 µl de água Milli Q, 1,2
µl de tampão (10X), 1,0 µl de dNTPs (2 mM), 0,4 µl de MgCl
2
(25 mM), 0,3 µl do “primer
Reverse” (10 µM), 0,2 µl de “primer” M13 (10 µM) marcado com fluorescência (TET ou HEX,
Applied Biosystems), 0,1 µl do “primer Forward” com uma cauda 5´M13 (5´-
CACGACGTTGTAAAACGAC; Boutin-Ganache et al., 2001) (10 µM) , 0,1 µl de Taq polimerase
(5 U/µl, Pharmacia) e 1,5 µl de DNA (20-50ng). As reações foram realizadas em termociclador nas
seguintes condições: desnaturação a 95ºC por 10 min, 35 ciclos de desnaturação a 95ºC por 1 min,
hibridação a 50
o
C – 60ºC por 40 seg e extensão a 72ºC por 40 seg, por fim, um ciclo de extensão a
72ºC por 10 min.
Cerca de 0,6μl do marcador molecular Genescan–500 TAMRA (Applied Biosystems)
(2fmol), 2,0 μl de formamida e 0,4 μl de dextran azul (50 mg/ml) foram misturados a uma alíquota
de 1,5μl de cada uma das amostras amplificadas. Cerca de 4,0 μl dessa mistura foi aplicada em gel
de acrilamida 7% e analisada em um seqüenciador automático ABI 377 (Applied Biosystems). A
identificação do tamanho dos alelos foi feita com auxílio do programa Genotyper 2.1 (Perkin
Elmer).
O grau de parentesco entre os indivíduos foi estimado por meio do índice r entre os
indivíduos, que foi avaliado com auxílio do programa Relatedness 4.2 (Queller e Goodnight, 1989).
Aqui, para facilitar a sua descrição, o índice foi decomposto em dois componentes. Quando estão
sendo comparados os indivíduos hipotéticos x e y, quando x é referência temos:
r
x
= Σ P
y
– P* e quando y é referência: r
y
= Σ P
x
– P*
Σ P
x
– P* Σ P
y
– P*
70
Capítulo IV
onde P* é a freqüência de cada alelo da população excluindo os indivíduos comparados. Px e Py são
as freqüências de cada alelo nos indivíduos comparados e seu valor pode ser 0, 0.5 ou 1 dependendo
se o indivíduo não apresentar o alelo, se for heterozigoto ou homozigoto, respectivamente. A
somatória diz respeito à soma dos valores obtidos para cada loco. Finalmente, para se obter o índice
r, os valores dos numeradores e denominadores são somados antes da divisão:
r = Σ P
y
– P* + Σ P
x
– P*
Σ P
y
– P* + Σ P
x
– P*
Adicionalmente, o Prof. Dr. Paulo A. Otto do Departamento de Genética e Biologia
Evolutiva do Instituto de Biociências da USP desenvolveu um programa que calcula as
probabilidades par a par de os indivíduos serem irmãos contra a hipótese de não serem aparentados.
Valores acima de 0,8 foram considerados como tendo alta probabilidade de os pares serem irmãos,
entre 0,6 e 0,8 como probabilidades intermediárias e abaixo de 0,6 baixa probabilidade de
parentesco.
Resultados
Os genótipos dos filhotes encontrados no mesmo ninho e na mesma estação reprodutiva
foram obtidos e os índices de parentesco foram calculados para todos os pares de indivíduos do
mesmo ninho e de ninhos diferentes (Tabela 3).
Tabela 3. Genótipos dos indivíduos amostrados no mesmo ninho na mesma estação reprodutiva,
índice r e probabilidade de serem irmãos (P).
Par Ninho Filhote CT21* CT32* CT43* GT55* CT74* HYA*
r P
1 32 5286
5287
261/263
263/271
- 224/248
224/224
202/202
202/222
268/276
268/276
172/172
172/172
0.5769** 0,95
2 33 4853
4854
261/271
261/261
- 224/224
224/224
222/222
222/222
266/276
276/276
172/172
172/172
0.7796** 0,95
3 64 5513
5514
261/263
263/271
- 224/224
224/224
202/202
202/202
276/276
276/276
172/172
172/174
0,6293** 0,92
4 76 5295
5296
261/263
261/271
- 224/224
224/224
202/222
202/202
266/276
270/276
172/174
172/172
0.4391** 0,90
5 118 5108
5109
261/261
261/261
279/283
279/279
-
-
202/222
202/222
266/276
266/276
172/174
174/174
0,5742** 0,857
6 142 1345
1346
261/263
261/271
283/283
283/283
-
-
222/222
222/222
266/266
266/276
172/172
172/172
0,7113** 0,926
7 180 4112
4113
271/271
261/263
279/283
283/283
-
-
222/226
202/202
266/276
266/276
174/174
174/174
-0,0439 0,637
8 180 5327
5373
263/271
271/271
283/283
279/283
-
-
222/226
222/226
276/276
266/276
172/174
174/174
0,5739** 0,947
9 182 3295
3296
261/271
261/271
279/283
283/283
-
-
222/222
222/222
266/276
266/276
172/172
172/172
0,7973** 0,944
10 182 5581
5582
261/263
261/263
283/283
279/283
-
-
222/226
222/222
266/266
276/276
172/172
172/174
-0,2547 0,551
71
Capítulo IV
Continuação da Tabela 3
11 259 5338
5339
261/261
261/261
283/283
279/283
-
-
202/222
202/222
266/266
266/276
172/172
172/172
0,6460** 0,931
12 2061 5347
5382
261/271
261/261
279/283
283/283
-
-
202/222
222/222
276/276
276/276
174/174
174/174
0,5646** 0,927
13 2088 5348
5349
261/271
261/271
279/279
279/283
-
-
222/226
222/222
266/276
276/286
172/172
172/172
0,5258** 0,851
14 2141 4100
4101
261/261
261/263
279/283
279/283
-
-
202/202
202/202
276/276
276/276
172/172
172/174
0,6768** 0,872
15 2141 5378
5379
261/263
261/261
279/283
279/276
-
-
202/226
202/226
276/276
276/276
172/172
172/174
0,5692** 0,958
16 2151 5352
5353
261/263
261/261
283/283
283/283
-
-
202/226
222/226
266/270
276/276
172/174
174/174
0,2983 0,861
* tamanho dos fragmentos em pb; ** valores estatisticamente maiores que a média entre indivíduos de
ninhos diferentes
A partir dos índices r par a par foram calculadas as médias entre os filhotes de ninhos
diferentes e entre filhotes do mesmo ninho e da mesma estação reprodutiva (Tabela 4). Quanto
maiores forem as médias, maior é a probabilidade de parentesco.
Tabela 4. Médias e desvios-padrão dos índices r entre indivíduos de ninhos diferentes e entre
filhotes de mesmo ninho em diversas condições.
Relação r N
Filhotes de ninhos diferentes
0,00047±0,41
2912
Filhotes do mesmo ninho da mesma estação reprodutiva
0,482±0,31
16
Filhotes do mesmo ninho da mesma estação reprodutiva que não
compartilham alelos para um ou mais locos
-0,199±0,136
03
Filhotes do mesmo ninho da mesma estação reprodutiva que compartilham
pelo menos um alelo em todos os locos
0,627±0,083
13
N- número de comparações par a par
Todos os pares de indivíduos encontrados no mesmo ninho na mesma estação reprodutiva
(Tabela 4) apresentam as médias de índices r significativamente maiores (p<0,05) que as médias de
indivíduos de ninhos diferentes. Ainda, três dos pares (19%) não compartilham alelos em um ou
dois locos (pares 7, 10 e 16). Excluindo esses três pares a média aumenta para 0,627±0,083 (Tabela
4).
Os pares de filhotes encontrados no mesmo ninho mas em anos consecutivos também foram
genotipados, seus índices r foram estimados e as probabilidades de serem irmãos foram calculadas
(Tabela 5).
72
Capítulo IV
Tabela 5. Genótipos dos indivíduos amostrados no mesmo ninho em estações reprodutivas
consecutivas, índice r e probabilidade de serem irmãos (P).
Par Ninho Filhote CT21* CT32* CT43* GT55* CT74* HYA* r P
1 04 4850
5282
261/263
261/271
-
-
224/224
224/224
202/202
222/222
276/276
276/276
176/176
172/172
-0,095 0,34
2 04 5282
5507
261/271
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
222/222
276/276
276/276
172/172
172/172
0,6472** 0,95
3 05 5283
5508
261/261
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
202/222
266/270
276/276
172/174
172/174
0,261 0,82
4 08 4849
5281
263/263
263/263
-
-
224/224
224/224
202/202
202/222
266/276
276/276
172/174
172/172
0,4932** 0,82
5 14 4852
5284
271/271
285/289
-
-
224/224
224/224
202/222
202/202
268/276
276/276
172/172
172/174
-0,1348 0,37
6 32 4855
5286
263/263
261/263
-
-
224/224
224/248
202/222
202/202
270/276
268/276
172/172
172/172
0,1384 0,78
7 32 4855
5287
263/263
263/271
-
-
224/224
224/224
202/222
202/222
270/276
268/276
172/172
172/172
0,3815** 0,75
8 33 4853
5288
261/271
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
202/222
266/276
266/266
172/172
172/172
0,7070** 0,90
9 33 4854
5288
261/261
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
202/222
276/276
266/266
172/172
172/172
0,7810** 0,95
10 33 5288
5510
261/261
261/261
-
-
224/224
224/224
202/222
202/222
266/266
266/276
172/172
172/172
0,8153** 0,95
11 43 4856
5290
263/263
263/271
-
-
224/224
224/248
202/222
202/222
276/276
276/276
172/174
172/172
0,0079 0,79
12 60 4857
5292
261/271
261/263
-
-
224/224
224/224
222/222
222/222
266/276
266/276
172/172
172/174
0,5659** 0,87
13 60 5292
5512
261/263
263/263
-
-
224/224
224/224
222/222
222/222
266/276
276/276
172/174
172/174
0,6127** 0,91
14 70 5294
5515
285/289
263/271
-
-
220/222
224/224
202/202
202/202
268/272
276/276
172/172
172/174
-0,3305 0,42
15 76 5295
5517
261/263
261/263
-
-
224/224
224/224
202/222
202/222
266/276
270/276
172/174
172/172
-0,3130 0,50
16 76 5296
5517
261/271
261/263
-
-
224/224
224/224
202/202
202/222
270/276
270/276
172/172
172/172
0,4356** 0,88
17 79 5297
5518
261/261
261/263
-
-
224/224
224/224
202/222
202/202
276/276
276/276
172/172
172/172
0,6256** 0,90
18 62 3281
4129
261/271
261/271
283/283
283/283
-
-
202/202
202/202
266/276
266/276
172/172
174/174
0,3735** 0,888
19 62 3282
4129
261/263
261/271
283/283
283/283
-
-
202/202
202/202
266/268
266/276
174/174
174/174
0,7292** 0,941
20 142 1345
1779
261/263
261/271
283/283
283/283
-
-
222/222
202/226
266/266
266/276
172/172
174/174
-0,3501 0,582
21 142 1346
1779
261/271
261/271
283/283
283/283
-
-
222/222
202/226
266/276
266/276
172/172
174/174
-0,3169 0,692
22 142 1779
3289
261/271
261/271
283/283
279/283
-
-
202/226
222/222
266/276
266/276
174/174
172/174
-0,2911 0,758
23 180 1349
1780
263/271
271/271
283/283
283/283
-
-
222/226
222/226
266/274
266/276
172/174
174/174
0,6227** 0,952
24 180 1780
3293
271/271
261/263
283/283
283/283
-
-
222/226
202/222
266/276
266/276
174/174
174/174
0,1956 0,810
25 180 3293
4112
261/263
271/271
283/283
283/283
-
-
202/222
222/226
266/276
266/276
174/174
174/174
0,1956 0,810
26 180 3293
4113
261/263
261/263
283/283
283/283
-
-
202/222
202/202
266/276
266/276
174/174
174/174
0,7808** 0,955
27 180 4112
5111
271/271
261/271
283/283
283/283
-
-
222/226
202/222
266/276
266/276
174/174
174/174
0,4571** 0,892
28 180 4113
5111
261/263
261/271
283/283
283/283
-
-
202/202
202/222
266/276
266/276
174/174
174/174
0,6499** 0,870
73
Capítulo IV
Continuação da tabela 5
29 180 5111
5327
261/271
263/271
283/283
283/283
-
-
202/222
222/226
266/276
276/276
174/174
172/174
0,4977** 0,755
30 180 5111
5373
261/271
271/271
283/283
279/283
-
-
202/222
222/226
266/276
266/276
174/174
174/174
0,4571** 0,909
31 180 5327
5580
263/271
261/271
283/283
283/283
-
-
222/226
202/226
276/276
266/276
172/174
172/174
0,2195 0,822
32 180 5373
5580
271/271
261/271
279/283
283/283
-
-
222/226
202/226
266/276
266/276
174/174
172/174
0,1449 0,962
33 182 3295
4105
261/271
261/263
279/283
283/283
-
-
222/222
202/222
266/276
266/266
172/172
172/172
0,2542 0,873
34 182 3296
4105
261/271
261/263
283/283
283/283
-
-
222/222
202/222
266/276
266/266
172/172
172/172
0,5005** 0,892
35 182 5328
5581
261/261
261/263
283/283
283/283
-
-
202/222
222/226
266/276
266/266
172/172
172/172
0,4984** 0,889
36 182 5328
5582
261/261
261/263
283/283
279/283
-
-
202/222
222/222
266/276
276/276
172/172
172/174
-0,0883 0,631
37 202 3318
4111
261/261
259/261
279/283
279/283
-
-
222/222
202/222
266/276
266/268
172/172
172/172
0,3656** 0,882
38 202 5334
5618
261/261
261/261
279/283
283/283
-
-
218/222
202/222
266/276
266/266
172/172
172/172
0,6297** 0,879
39 205 1782
2276
261/263
261/261
279/279
283/283
-
-
202/222
202/222
268/276
266/276
172/174
172/172
-0,5282 0,578
40 205 2276
3302
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
202/222
202/202
266/276
266/276
172/172
172/172
0,8374** 0,938
41 205 3302
4102
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
202/202
202/222
266/276
276/276
172/172
172/172
0,7102** 0,930
42 206 2277
3303
263/271
261/263
283/283
279/283
-
-
222/222
202/202
276/276
276/276
174/174
174/174
0,2456 0,874
43 206 5121
5389
261/261
261/261
283/283
279/283
-
-
202/222
202/222
268/276
276/276
172/172
172/172
0,6274** 0,901
44 206 5389
5589
261/261
261/263
279/283
279/283
-
-
202/222
202/222
276/276
268/276
172/172
172/172
0,5246** 0,892
45 249 5337
5602
261/271
261/263
283/283
283/283
-
-
222/222
222/222
276/276
276/276
174/174
174/174
0,8500** 0,917
46 259 5131
5338
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
220/222
202/222
268/276
268/266
172/172
172/172
0,4178** 0,834
47 259 5131
5339
261/261
261/261
283/283
279/283
-
-
220/222
202/222
268/276
266/276
172/172
172/172
0,3954** 0,800
48 259 5338
5390
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
202/222
222/222
266/266
266/276
172/172
172/172
0,6629** 0,916
49 259 5339
5390
261/261
261/261
279/283
283/283
-
-
202/222
222/222
266/276
266/276
172/172
172/172
0,7850** 0,893
50 2061 5138
5347
261/271
261/271
283/283
279/283
-
-
202/222
202/222
268/276
276/276
174/174
174/174
0,5885** 0,930
51 2061 5138
5382
261/271
261/261
283/283
283/283
-
-
202/222
222/222
268/276
276/276
174/174
174/174
0,5715** 0,916
52 2061 5347
5610
261/271
261/261
279/283
279/279
-
-
202/222
222/222
276/276
268/276
174/174
174/174
0,4429** 0,943
53 2061 5382
5610
261/261
261/261
283/283
279/279
-
-
222/222
222/222
276/276
268/276
174/174
174/174
0,4630** 0,882
54 2088 3316
4108
261/271
261/261
283/283
279/283
-
-
222/222
222/222
266/266
276/276
172/172
172/172
0,2045 0,783
55 2088 5348
5612
261/271
261/271
279/279
279/283
-
-
222/226
222/222
268/276
276/276
172/172
172/172
0,5075** 0,947
56 2088 5349
5612
261/271
261/271
279/283
279/283
-
-
222/222
222/222
276/286
276/276
172/172
172/172
0,814** 0,961
57 2141 4100
5351
261/261
261/263
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
266/276
172/172
174/174
-0,2092 0,719
74
Capítulo IV
Continuação da tabela 5
58 2141 4101
5351
261/263
261/263
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
266/276
172/174
174/174
0,3282** 0,865
59 2141 5351
5378
261/263
261/263
279/283
279/283
-
-
202/226
202/226
266/276
276/276
174/174
172/172
-0,1091 0,721
60 2141 5351
5379
261/263
261/261
279/283
279/279
-
-
202/226
202/226
266/276
276/276
174/174
172/174
0,2909 0,949
61 2141 5378
5615
261/263
261/271
279/283
279/283
-
-
202/226
202/202
276/276
276/276
172/172
172/174
0,3720** 0,875
62 2141 5379
5615
261/261
261/271
279/283
279/283
-
-
202/226
202/202
276/276
276/276
174/174
172/174
0,5541** 0,901
* tamanho dos fragmentos em pb; ** valores estatisticamente maiores que a média entre indivíduos de
ninhos diferentes
Dos 59 pares de indivíduos amostrados no mesmo ninho em estações consecutivas, 15
(24%) não apresentam alelos em comum para um, dois ou três locos (pares 1, 3, 5, 9, 14, 18, 20, 21,
22, 24, 25, 39, 42, 54 e 57; Tabela 5). A partir dos índices r par a par foram calculadas as médias
entre os filhotes de mesmo ninho mas de estações consecutivas (Tabela 6).
Tabela 6. Médias e desvios-padrão dos índices r entre indivíduos de ninhos diferentes e entre
filhotes do mesmo ninho de estações consecutivas em diversas condições.
Relação r N
Filhotes de ninhos diferentes
0,00047±0,41
2912
Filhotes do mesmo ninho de estações consecutivas
0,3624±0,34
62
Filhotes do mesmo ninho de estações consecutivas que não compartilham
alelos para um ou mais locos
-0,0001±0,35
15
Filhotes do mesmo ninho de estações consecutivas que compartilham pelo
menos um alelo em todos os locos
0,478±0,25
47
N- número de comparações par a par
A média dos índices r entre filhotes do mesmo ninho em estações consecutivas é de
0,3624±0,34 (Tabela 6). Esses valores são significantemente mais elevados do que as médias
encontradas para filhotes de ninhos diferentes (p<0,05). Excluindo os indivíduos que não
apresentam alelos em comum para um ou mais locos a média do índice r entre filhotes do mesmo
ninho em estações consecutivas aumenta para 0,478±0,25, sendo significativamente maior que a
média para filhotes de ninhos diferentes.
Os pares de filhotes encontrados no mesmo ninho mas em estações reprodutivas alternadas
foram genotipadas, seus índices r foram estimados e as probabilidades de serem irmãos foram
calculadas (Tabela 7).
75
Capítulo IV
Tabela 7. Genótipos dos indivíduos amostrados no mesmo ninho em estações reprodutivas
alternadas, índices r e probabilidade de serem irmãos (P).
Par Ninho Filhote CT21* CT32 CT43* GT55* CT74* HYA*
r P
1 04 4850
5507
261/263
261/261
-
-
224/224
224/224
202/202
222/222
276/276
276/276
176/176
172/172
0,08809 0,79
2 31 4847
5509
261/271
261/271
-
-
224/224
224/224
222/222
222/222
276/276
276/276
172/172
172/172
1,00** 1,00
3 33 4853
5510
261/271
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
202/222
266/276
266/276
172/172
172/172
0,443** 0,90
4 33 4854
5510
261/261
261/261
-
-
224/224
224/224
222/222
202/222
276/276
266/276
172/172
172/172
0,7810** 0,95
5 42 4851
5511
261/263
261/271
-
-
224/224
224/224
202/222
202/202
266/276
270/276
174/174
172/172
0,2184 0,79
6 60 4857
5512
261/271
263/263
-
-
224/224
224/224
222/222
222/222
266/276
276/276
172/172
172/174
0,3275 0,82
7 62 4129
5386
261/271
261/271
283/283
279/279
-
-
202/202
202/222
266/276
266/276
174/174
172/172
-0,5091 0,591
8 118 3286
5108
259/261
261/261
279/283
279/283
-
-
202/222
202/222
266/276
266/276
174/174
174/174
0,2972 0,886
9 118 3286
5109
259/261
261/261
279/283
279/279
-
-
202/222
202/222
266/276
268/276
174/174
174/174
0,6367** 0,880
10 142 1345
3289
261/263
261/271
283/283
279/283
-
-
222/222
222/222
266/266
266/276
172/172
172/174
0,2625 0,881
11 142 1346
3289
261/271
261/271
283/283
279/283
-
-
222/222
222/222
266/276
266/276
172/172
172/174
0,5090** 0,923
12 180 1349
3293
263/271
261/263
283/283
283/283
-
-
222/226
202/222
266/274
266/276
172/174
174/174
-0,177 0,723
13 180 1780
4112
271/271
271/271
283/283
279/283
-
-
222/226
222/226
266/276
266/276
174/174
174/174
1** 0,991
14 180 1780
4113
271/271
261/263
283/283
283/283
-
-
222/226
202/202
266/276
266/276
174/174
174/174
0,0160 0,809
15 180 3293
5111
261/263
261/271
283/283
283/283
-
-
202/222
202/222
266/276
268/276
174/174
174/174
0,6990** 0,696
16 180 4112
5327
271/271
263/271
279/283
283/283
-
-
222/226
222/226
266/276
276/276
174/174
174/174
0,5739** 0,937
17 180 4112
5373
271/271
271/271
279/283
283/283
-
-
222/226
222/226
266/276
266/276
174/174
174/174
0,7465** 0,992
18 180 4113
5327
261/263
263/271
283/283
283/283
-
-
202/202
222/226
266/276
276/276
174/174
174/174
-0,0439 0,807
19 180 4113
5373
261/263
271/271
283/283
283/283
-
-
202/202
222/226
266/276
266/276
174/174
174/174
-0,0439 0,761
20 180 5111
5580
261/271
261/271
283/283
283/283
-
-
202/222
202/226
268/276
266/276
174/174
174/174
0,3038 0,812
21 182 4105
5328
261/263
261/261
283/283
283/283
-
-
202/222
202/222
266/266
266/276
172/172
172/172
0,6515** 0,925
22 202 1352
3318
261/261
261/261
279/283
279/283
-
-
202/202
222/222
276/288
266/276
172/172
172/172
0,1757 0,705
23 202 4111
5334
259/261
261/261
279/283
279/283
-
-
202/222
218/222
266/268
266/276
172/172
172/172
0,2853 0,832
24 205 1782
3302
261/263
261/261
279/279
283/283
-
-
202/222
202/202
268/276
266/276
172/174
172/172
-0,3983 0,624
25 205 2276
4102
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
202/222
202/222
266/276
276/276
172/172
172/172
0,8264** 0,916
26 205 4102
5381
261/261
263/271
283/283
283/283
-
-
202/222
222/226
276/276
276/276
172/172
172/172
0,2137 0,852
27 206 3303
5121
261/263
261/261
279/283
283/283
-
-
202/202
202/222
276/276
268/276
174/174
172/172
-0,2773 0,679
28 206 5121
5589
261/261
261/263
283/283
279/283
-
-
202/222
202/222
268/276
268/276
172/172
172/172
0,5364** 0,954
76
Capítulo IV
Continuação da tabela 7
29 259 5131
5390
261/261
261/261
283/283
283/283
-
-
220/222
222/222
268/276
266/276
172/172
172/172
0,6198** 0,833
30 2061 5138
5610
261/271
261/261
283/283
279/279
-
-
202/222
222/222
268/276
268/276
174/174
174/174
0,1726 0,918
31 2088 4108
5348
261/261
261/271
279/283
279/279
-
-
222/222
222/226
276/276
268/276
172/172
172/172
0,4029** 0,925
32 2088 4108
5349
261/261
261/271
279/283
279/283
- 222/222
222/222
276/276
276/286
172/172
172/172
0,6669** 0,918
33 2141 4100
5378
261/261
261/263
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
276/276
172/172
172/172
0,6806** 0,934
34 2141 4100
5379
261/261
261/261
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
276/276
172/172
174/174
0,6641** 0,930
35 2141 4101
5378
261/263
261/263
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
276/276
172/174
172/172
0,5899** 0,880
36 2141 4101
5379
261/263
261/261
279/283
279/283
-
-
202/202
202/226
276/276
276/276
172/174
174/174
0,5623** 0,921
37 2141 5351
5615
261/263
261/271
279/283
279/283
- 202/226
202/202
266/276
276/276
174/174
172/174
0,08376 0,75
* tamanho dos fragmentos em pb; ** valores estatisticamente maiores que a média entre indivíduos de
ninhos diferentes
Dentre os 37 indivíduos comparados, 12 (32%) não apresentam alelos em comum para um
ou dois locos (pares 1, 5, 6, 7, 14, 18, 19, 22, 24, 27, 30, 33; Tabela 7). Proporcionalmente, o
número de pares de filhotes de mesmo ninho que não compartilham alelos é maior em estações
reprodutivas alternadas (12 pares de filhotes do total de 37; Tabela 7) do que em estações
reprodutivas consecutivas (15 pares do total de 62; Tabela 5) do que na mesma estação (três pares
do total de 16, Tabela 3). A partir dos índices r par a par foram calculadas as médias entre os
filhotes de mesmo ninho mas de estações alternadas (Tabela 8).
Tabela 8. Médias e desvios-padrão dos índices r entre indivíduos de ninhos diferentes e entre
filhotes do mesmo ninho de estações alternadas em diversas condições.
Relação r N
Filhotes de ninhos diferentes
0,00047±0,41
2912
Filhotes do mesmo ninho de estações alternadas
0,366±0,36
37
Filhotes do mesmo ninho de estações alternadas que não
compartilham alelos para um ou mais locos
-0,0324±0,32
12
Filhotes do mesmo ninho de estações alternadas que compartilham
pelo menos um alelo em todos os locos
0,519±0,27
25
N- número de comparações par a par
A média dos índices r entre filhotes do mesmo ninho em estações alternadas é de
0,358±0,36, significantemente maior que as médias entre indivíduos de ninhos diferentes (p < 0,05).
77
Capítulo IV
Excluindo os filhotes que não compartilham alelos para um ou mais locos a média do índice r entre
filhotes do mesmo ninho de estações alternadas aumenta para 0,5214±0,27.
Comparando as médias dos índices entre filhotes do mesmo ninho na mesma estação
reprodutiva (0,482±0,31), em estações consecutivas (0,3624±0,34) e em estações alternadas
(0,366±0,36) não há nenhuma diferença significativa (p < 0,05) entre elas.
Discussão
Os filhotes do mesmo ninho da mesma estação reprodutiva apresentam a média do índice de
similaridade significativamente maior que a média entre filhotes de ninhos diferentes e 87,5% dos
pares de filhotes (14 dos 16) apresentam alta probabilidade de serem irmãos (P > 0,8). Tal resultado
estaria de acordo com as observações de campo que indicam monogamia estrita na espécie. Ou seja,
filhotes encontrados no mesmo ninho devem ser irmãos, enquanto filhotes encontrados em ninhos
diferentes não possuem tal parentesco próximo. Esse tipo de resultado também foi encontrado em
outro grande psitacídeo neotropical, a Ara ararauna (Caparroz., 2003). Nesse estudo foram
analisados microssatélites de 25 pares de filhotes do mesmo ninho e de 18 filhotes de ninhos
diferentes. Foram encontrados valores de similaridade maiores entre filhotes do mesmo ninho do
que entre as araras de ninhos diferentes. Dentre os filhotes encontrados no mesmo ninho e no
mesmo ano, três pares não apresentam alelos em comum em um ou dois locos. Se os pais forem
heterozigotos, é possível explicar esse resultado e, portanto, não podemos descartar a hipótese de
serem pares de irmãos, mesmo tendo probabilidades mais baixas. Como o caso do par de filhotes 7
do ninho 180 (Tabela 3) seria o mais extremo (pois possui dois locos (CT21 e GT55) sem alelos
compartilhados), vamos discutir mais detalhadamente a possibilidade de serem aparentados.
Supondo que esses filhotes sejam irmãos, os pais desse par necessariamente devem apresentar os
genótipos 261/271 e 263/271 para loco CT21 e 202/222 e 202/226 para o loco GT55. Os genótipos
desses dois locos no outro par de filhotes amostrado no mesmo ninho mas em outra estação
reprodutiva (par 8; Tabela 3), nos pares amostrados no mesmo ninho mas em anos consecutivos
(pares 23 a 32; Tabela 5) e nos pares amostrados no mesmo ninho mas em anos alternados (pares 12
a 20; Tabela 7), são compatíveis com os genótipos possíveis do casal parental. Esse resultado
estaria de acordo com a possibilidade de o par 7 (Tabela 3) ser constituído de irmãos, mesmo não
apresentando alelos em comum nesses dois locos. Além disso, as médias do índice r entre filhotes
amostrados no mesmo ninho (seja no mesmo ano, em anos consecutivos ou anos alternados) não
são significativamente diferentes. Isso indicaria que há a possibilidade de haver casais de A.
hyacinthinus que se reproduzem anualmente e, assim, é possível que haja um casal parental que se
78
Capítulo IV
reproduz anualmente no ninho 180. Portanto, é possível que os filhotes que constituem o par 7
sejam irmãos.
Apesar da grande capacidade de dispersão, as observações de campo também sugerem que
os casais de A. hyacinthinus sejam sedentários e apresentem alta fidelidade aos sítios de nidificação,
voltando ao mesmo ninho para se reproduzirem (Guedes, 1993). Dados de observação em campo
permitiram realizar a possível identificação de um casal cujo macho era cego de um olho e que se
reproduziu no ninho 8 em anos consecutivos (Antas, comunicação pessoal). Assim, era esperado
que o par de filhotes 4 apresentasse índice r alto e probabilidade alta de serem irmãos (Tabela 5).
Assim, nossos resultados sugerem que alguns casais devem se reproduzir no mesmo ninho em anos
consecutivos enquanto outros não. Por exemplo, os filhotes do ninho 33 apresentam altos índices de
similaridade genética e probabilidades de serem irmãos na mesma estação reprodutiva (Tabela 3) e
em estações consecutivas (Tabela 5). Em ambos os casos os valores observados são estatisticamente
maiores que a média entre indivíduos de ninhos diferentes. Isso pode indicar que seriam todos
filhotes do mesmo casal. Por outro lado, o par de filhotes 14 do ninho 70 apresenta baixa
probabilidade de serem irmãos (Tabela 5). Do mesmo modo, no ninho 142 há três pares de filhotes
(números 20 a 22 amostrados em 1998, 1999 e 2000; Tabela 5) com baixos índices e, portanto,
baixa probabilidade de serem irmãos. Já o ninho 205 apresenta um par (número 39 dos anos de
1998 e 1999; Tabela 5) com baixa probabilidade de ser constituído de irmãos e dois pares (números
40 e 41 amostrados em 1999, 2000 e 2001; Tabela 5) com índices altos de similaridade e, portanto,
alta probabilidade de serem irmãos.
Apesar de haver evidência de que alguns casais devem se reproduzir anualmente, há
observações de que, após o vôo, os filhotes de A. hyacinthinus permanecem com os pais por mais de
um ano, aprendendo a comer e a se defender e por isso, possivelmente muitos casais só se
reproduzem a cada dois anos (Guedes e Harper, 1995). Assim, também foi estimada a similaridade
entre filhotes encontrados no mesmo ninho em estações reprodutivas alternadas (Tabela 7). A média
dos índices r entre filhotes do mesmo ninho em anos alternados foi significantemente maior que a
média entre indivíduos de ninhos diferentes, mas não difere significativamente das médias entre
pares do mesmo ninho na mesma estação reprodutiva e em estações consecutivas. Dos 37 pares de
indivíduos, 27 (73%) apresentaram altas probabilidades de serem irmãos (P > 0,8). Entretanto,
desses 27 pares, somente os filhotes do ninho 142 apresentam baixa similaridade em anos
consecutivos (pares 20 e 21; Tabela 5), mas alta similaridade em anos alternados (pares 10 e 11;
Tabela 7). Dentre os outros pares, os filhotes de 24 deles, apresentam índices mais altos do que
aqueles encontrados entre filhotes do mesmo ninho em anos consecutivos. Finalmente, para dois
ninhos (números 31 e 118) não foram encontrados filhotes em anos consecutivos.
79
Capítulo IV
Dentre todos os ninhos monitorados, devemos destacar o ninho 180 onde foram encontrados
um ou dois filhotes durante sete anos seguidos (de 1998 a 2004). Todos os pares de filhotes
apresentam alta probabilidade de serem irmãos (mesmo ano, anos alternados e anos consecutivos),
sugerindo que o mesmo casal pode ter utilizado o ninho todos esses anos. Ou seja, não há evidência
de outro casal estar utilizando esse ninho. Em geral, os dados sugerem que um grande número de
casais com sucesso reprodutivo se reproduz anualmente. Tal capacidade poderia estar relacionada à
maturidade do casal. Sendo que os mais experientes poderiam ter a capacidade de se reproduzir
anualmente enquanto os mais novos o fariam em anos alternados. Dados de campo são necessários
para averiguar essa hipótese.
Apesar de os resultados serem interessantes, só pudemos utilizar cinco locos polimórficos de
microssatélites. Como é discutido na literatura, seria importante contar com dados de um número
maior de locos para aumentar a eficiência na determinação das relações de parentesco e diminuir a
variância dos índices. Segundo Blouin et al. (1996), em uma espécie de camundongos selvagens
(Mus musculus) foram necessários utilizar 20 locos de microssatélites para discriminar indivíduos
não relacionados de irmãos (de mesmo pai e mãe) e 80% dos meio-irmãos de irmãos ou de
camundongos não relacionados. Resultado semelhante foi encontrado por Alderson et al. (1999)
para uma espécie de ave (Molothrus ater). Ao dobrar o número de locos utilizados na análise inicial
(de sete para 14 locos), foi verificado que o intervalo de confiança das relações de parentesco
diminuíram consideravelmente. Portanto, o aumento no número de locos para análise seria
importante para alcançar um melhor resultado. Além disso, como o número de ninhos analisados
não é muito grande, os resultados devem ser tomados com certa cautela. No entanto, encontrar
ninhos na natureza é uma tarefa bastante trabalhosa e que demanda muito tempo e investimento. A
genotipagem de penas de adultos encontrados nos ninhos também seria de grande valia para
enriquecer os dados.
Referências Bibliográficas
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parasitic bird, the Brown-Headed Cowbird (Molothrus ater), using microsatellite DNA markers. Journal
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intraspecific brood parasitism in wild Zebra Finches Taeniopygia guttata, revealed by DNA
fingerprinting. Behavioral Ecology and Evolution 27: 315-324.
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by relatedness. Molecular Ecology 5: 393-401.
80
Capítulo IV
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Doutorado. Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo.
- Caparroz, R., Guedes, N.M.R., Bianchi, C.A., Wajntal, A. 2001. Analysis of the genetic variability and
breeding behaviour of wild populations of two macaw species (Psittaciformes: Aves) by DNA
fingerprinting. Ararajuba 9: 43-49.
- Caparroz, R., Miyaki, C.Y., Baker, A.J. 2003. Characterization of microsatellite loci in the Blue-and-
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81
Considerações Finais
Ellegren et al. (1995) e Goldstein e Pollock (1997) sugeriram que os microssatélites podem
ser mais longos e mais variáveis na espécie para qual foram desenvolvidos porque são selecionados
por esses atributos durante o processo de seleção. Comparando o tamanho dos alelos encontrados
em Ara ararauna (espécie para a qual foram desenvolvidos os "primers" utilizados) com os
encontrados nas três espécies estudadas no presente trabalho (Cyanopsitta spixii, Anodorhynchus
leari e Anodorhynchus hyacinthinus), em geral, não foi encontrada diferença de tamanho de alelos
em nenhum dos locos analisados (Tabela 1).
Tabela 1. Tamanho dos alelos (pb) encontrados em Ara ararauna, Cyanopsitta spixii,
Anodorhynchus leari e Anodorhynchus hyacinthinus.
Ara ararauna*
Cyanopsitta spixii Anodorhynchus leari Anodorhynchus hyacinthinus
Loco
CT21 245-273 238-246 238-244 240-270
CT32 258-276 266-268 264 260-264
CT43 199-219 205 201-229 201-229
CT74 232-260 237-251 237-269 237-257
GT55 183-191 189-191 191-205 183-207
HYA - 153 163-167 153-155
* Caparroz, 2003
Além disso, as seqüências dos locos analisados foram comparadas com as correspondentes
da espécie a partir da qual os “primers” foram desenvolvidos e não foi encontrada nenhuma
diferença nas unidades de repetição nos locos (Figura 1). Resultado semelhante foi encontrado para
uma espécie de foca (Monachus schauinslandi) onde uma seqüência de microssatélites
desenvolvida para uma outra espécie (Halichoerus grypus) foi clonada e seqüenciada e encontrado
somente 5-7% de diferenças e a mesma unidade de repetição (Kretzmann et al., 2001).
82
Considerações Finais
UnaCT21
5´TAACTCCCTCCAGCCAGCTTAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTTCTGTGTTTCTACAATATTTCTGTTCACTTCT
5´.AACTCC.TCCAGCCAGCTTAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT....TCTGTGTTTCTACAATATTTCTGTTCACTTCT
5´TAANACC.TCCAGCCAGCCTAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT.......CTGTGTTTCCACAATATTTCTGNTCACNTCT
5´TAAGACC.....GCCATTT...GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT.....CTGTGTTTGTACAATATTTCTGNTNACTTCT
UnaCT32
5´GTGTGCTTTTGTGTCTGCTTTGGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGGGAAATCTTAATGGTTAATTGCATCCTTCAACGTT
5´GTGTGCTTTTGTGTCTGCTTTGGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT..GAGGNAAATCTTAATGGTTAATTGCATCCTTCAACGTT
5´GTGTGCTTTTGTGTCTGCTTTGGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG....AGNAAAATCTNANNGGTNAATTGCNNCCNTCAACGTT
5´GTGTGCTTTTGTGTCTGCTTTGGGGGGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT....GAGGGAAATCTTAATGGTTAATTGCATCCTTCAACGTT
UnaCT43
5´CTTCCTGTAAAGAGTCTTTCACTGTATGAAGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT................TCTGAATTCCCC
5´CTTCCTGTAAAGAGTCTTTCACTGTATGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGT......................TCTGAATTCCCC
5´CTTCCTGTAAAGAGTCTTTCACTGTATGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCGTGTGTGTTCTAAATCCCCC
5´NTTCCTGGAAAGNGNCTTTCNCTGGNTGAAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT......................TCTGAATTCCCC
UnaGT55
5´TTTTAACATCTAAAATAACCAACAATACATACACACACACACACACACACACA ..TATATAT..ATAACCAATTTTGTGTGACA TATATA
5´.........................TACACACACACACACACACACACACACACACACA TATATATATATAACCAATTTTGTGTGANA
NG
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UnaCT74
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Figura 1. Seqüências parciais alinhadas dos produtos amplificados em Ara ararauna, Cyanopsitta
spixii, Anodorhynchus leari e Anodorhynchus hyacinthinus, respectivamente. Em negrito estão as
unidades de repetição dos microssatélites.
Adicionalmente, outros trabalhos que utilizaram “primers” heterólogos encontraram alta
variabilidade, ou seja, nem sempre existe relação entre o uso de “primers” heterólogos e baixa
variabilidade. Por exemplo, em um estudo de estrutura populacional do mamífero Ovis canadensis
foram utilizados nove locos de microssatélites desenvolvidos para outra espécie (Ovis aries) e um
loco desenvolvido para Bos taurus, sendo obtida uma alta variabilidade genética (Gutiérrez-
Espeleta et al., 2000). Além disso, em alguns casos a baixa variabilidade genética pode ser uma
característica do organismo em estudo. Por exemplo, a variabilidade encontrada no mamífero
Ovibus moschatus (Holm et al., 1999) foi baixa com o uso de “primers” heterólogos (dentre 15
“primers” apenas dois apresentaram polimorfismo com 2 e 3 alelos e heterozigosidades de 0,21 e
0,50) e ainda menor com “primers” específicos (dentre 6 “primers” apenas um loco apresentava
variabilidade tendo apenas dois alelos e heterozigosidade de 0,11). Quando os mesmo “primers”
heterólogos foram usados no cervídeo Rangifer tarandus (bem mais distante filogeneticamente que
Ovibus moschatus) foi encontrada variabilidade com cinco dos 15 “primers”, havendo 4 a 18 alelos
em 36 indivíduos (Holm, não publicado). Um outro exemplo é o estudo com 72 indivíduos de
Amazona guildingii utilizando oito locos de microssatélites desenvolvidos para a espécie e que
resultaram em dois a 10 alelos (Russello e Amato, 2004). Esses “primers” resultaram em produtos
83
Considerações Finais
de amplificação em outra espécie de papagaio (Amazona auropalliata) gerando de três a 25 alelos
(Wright et al., 2005). Apesar de serem espécies irmãs, essa comparação sugere que o nível de
variabilidade também pode estar relacionado a características da espécie, pois A. guildingii é
considerada mais ameaçada que A. auropalliata (BirdLife International, 2000).
Assim como nesses trabalhos, a maior variabilidade encontrada em Ara ararauna em
relação às outras espécies aqui estudadas deve estar relacionada ao grau de ameaça e à história
evolutiva das espécies. Em 49 A. ararauna o número de alelos identificados por loco variou de três
a 11 e a heterozigosidade média entre todos os locos foi de 0,604 (Tabela 1; Caparroz, 2003), sendo
essa variabilidade genética maior do que a encontrada para C. spixii, A .leari e A. hyacinthinus
(Tabela 2). C. spixii está extinta na natureza, A. leari está criticamente ameaçada, A. hyacinthinus é
considerada vulnerável e A. ararauna não está ameaçada (BirdLife International, 2000). Isto
também está relacionado com a diferença no tamanho populacional dessas espécies, sendo o de A.
ararauna bem maior do que o das três espécies abordadas no presente trabalho. Assim, a menor
variabilidade genética nas três primeiras espécies seria esperada. Esse resultado também está de
acordo com valores de variabilidade genética obtidos com a técnica de "DNA fingerprinting" que
apontam variabilidade de 68,50% para A. ararauna (Caparroz, 1998) e 65,60% de variabilidade em
A. hyacinthinus (Miyaki, comunicação pessoal). Além disso, a maior variabilidade em A. ararauna
do que em A. hyacinthinus também foi encontrada na análise de minissatélites de loco único e de
regiões entre microssatélites (Faria, 2000).
Comparando os dados obtidos para C. spixii, A. leari e A. hyacinthinus (Tabela 2), a última
espécie apresenta maior número de locos polimórficos e de número de alelos por loco. Entretanto, a
heterozigosidade média observada em A. hyacinthinus foi mais baixa do que a encontrada nas
outras duas espécies. Essa menor heterozigosidade parece estar relacionada à presença de dois locos
monomórficos para algumas populações e polimórficos para outras. Excluindo esses locos
(UnaCT32 e UnaCT43) do cálculo, a heterozigosidade média aumenta para 0,510 (valor muito
próximo ao encontrado para C. spixii). Ainda, excluindo o loco HYA 1172, que apresenta baixo
polimorfismo em A. hyacinthinus (dois alelos) e não é polimórfico nas outras duas espécies, a
heterozigosidade média aumenta para 0,568 (valor próximo ao encontrado para A. leari). Esses
dados também são concordantes com os resultados "DNA fingerprinting" que indicam variabilidade
genética mais elevada em A. hyacinthinus (65,60%; Miyaki, comunicação pessoal) do que em C.
spixii (37,80%; Caparroz et al., 2001). Além disso, como os níveis de variabilidade genética em A.
hyacinthinus são muito próximos aos de A. leari (que é uma espécie criticamente ameaçada), seria
possível que a população de A. hyacinthinus tenha sofrido uma redução populacional e se expandiu,
não tendo havido tempo suficiente para recuperar a variabilidade perdida com o gargalo. No
84
Considerações Finais
entanto, mesmo que essa hipótese possa ser verdadeira, como os locos analisados estão em
equilíbrio de Hardy-Weinberg, as populações de A. hyacinthinus não devem estar sofrendo a ação
de endocruzamento.
Tabela 2. Número de alelos e heterozigosidade por loco encontrados em A. ararauna, C. spixii, A.
leari e A. hyacinthinus.
1
A. ararauna
C. spixii A. leari A. hyacinthinus
Espécie
Loco
(49) (12) (32) (86)
UnaCT21 11* 5 / 0,718 3 / 0,548 7 / 0,654
UnaCT32 8* 2 / 0,442 - 2 / 0,424
UnaCT43 9 / 0,880 - 3 / 0,642 5 / 0,101
UnaGT55 4* 2 / 0,365 7 / 0,652 4 / 0,658
UnaCT74 4* 5 / 0,657 6 / 0,616 7 / 0,577
HYA1172 - - - 2 / 0,383
Heterozigosidade média
0,604 0,509 0,586 0,465
1
Caparroz, 2003; *Heterozigosidade não apresentada. Número de indivíduos analisados entre parêntese
Apesar de termos utilizado "primers" heterólogos, o polimorfismo encontrado nos
microssatélites pôde ser utilizado tanto na avaliação da similaridade genética entre indivíduos (C.
spixii e A. leari) quanto nas análises de estrutura populacional (A. hyacinthinus). Também
realizamos um teste de atribuição com os três locos em comum entre os três táxons (UnaCT21,
UnaGT55 e UnaCT74). Usando os genótipos de 102 indivíduos (12 C. spixii, 25 A. leari e 65 A.
hyacinthinus) foi calculada a probabilidade de cada indivíduo pertencer à sua espécie
correspondente utilizando o “assignment test” (Arlequin 2.0; Schneider et al., 2000). Todos os
indivíduos (100%) foram atribuídos corretamente à sua espécie. Esse resultado mostra a aplicação
desses marcadores em casos nos quais seja necessário identificar a espécie, como por exemplo,
amostras de embriões não eclodidos, restos de indivíduos não identificáveis morfologicamente ou
penas encontradas na natureza.
Referências Bibliografias
st
- BirdLife International. 2000. Threatened Birds of the World, 1 ed. Lynx Edicions and Birdlife
International, Barcelona.
- Caparroz, R. 2003. Filogeografia, Estrutura e Variabilidade Genética de Arara-canindé (Ara ararauna,
Psittaciformes: Aves) no Brasil Baseadas na Análise de DNA Mitocondrial e de DNA Nuclear. Tese de
Doutorado. Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo.
85
Considerações Finais
- Caparroz, R., Miyaki, C.Y., Bampi, M.I., Wajntal, A. 2001. Analysis of the genetic variability in a
sample of the remaining group of Spix´s Macaw (Cyanopsitta spixii, Psittaciformes: Aves) by DNA
fingerprinting. Biological Conservation 99: 307-311.
- Eldridge, M.D.B, King, J.M., Loupis, A.K., Spencer, P.B.S., Taylor, A.C., Pope, L.C., Hall, G.P. 1999.
Unprecedented low levels of genetic variation and inbreeding depression in an island population of the
black-footed rock-wallaby. Conservation Biology 13: 531-541.
- Ellegren, H., Primmer, C.R., Sheldon, B.C. 1995. Microsatellite evolution: directionality or bias in locus
selection? Nature Genetics 11: 360-362.
- Goldstein, D.B., Pollock, D.D. 1997. Launching microsatellite: a review of mutation processes and
methods of phylogenetic inference. Journal f Heredity 88: 335- 342.
- Gutiérrez-Espeleta, G.A., Kalinowshi, S.T., Boyce, W.M., Hedrick, P.H. 2000. Genetic variation and
population structure in desert bighorn sheep: implications for conservation. Conservation Genetics 1: 3-
15.
- Holm, L.E., Forchhammer, M.C., Boomsma, J.J. 1999. Low genetic variation in Muskoxen (Ovibos
moschatus) from western Greenland using microsatellites. Molecular Ecology 8: 675-679.
- Kretzmann, M.B., Gemmell, N.J., Meyer, A. 2001. Microsatellite analysis of population structure in the
endangered Hawaiian Monk Seal. Conservation Biology 15: 457-466.
- Russello, M.A., Amato, G. 2004. Ex situ population management in the absence of pedigree information.
Molecular Ecology 13: 2829-2840.
- Schneider, S., Roessli, D., Excoffier, L. 2000. Arlequin, version 2.0: A Software for Population Genetics
Data Analysis. Genetics and Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland.
- Wright, T.F., Rodriguez, A.M., Fleischer, R.C. 2005. Vocal dialects, sex-biased dispersal, and
microsatellite population structure in the parrot Amazona auropalliata. Molecular Ecology 14: 1197-
1205.
86
Conclusões Gerais
Os resultados obtidos pela análise de microssatélites em Cyanopsitta spixii,
Anodorhynchus leari e Anodorhynchus hyacinthinus nos permite concluir que:
• Os “primers” de microssatélites utilizados foram informativos para a análise de
similaridade genética e de diferenciação populacional;
• Apesar da baixa variabilidade encontrada em C. spixii e A. leari, foi possível estimar
índices de similaridade e, baseado nesses dados, recomendar casais geneticamente
menos similares, visando colaborar com a recuperação dessas espécies;
• A baixa variabilidade encontrada em A. hyacinthinus indica que seria possível que a
população tenha sofrido uma redução populacional e se expandiu, não tendo havido
tempo suficiente para recuperar a variabilidade perdida com o gargalo;
• A moderada diferenciação genética populacional encontrada em A. hyacinthinus
evidenciou três principais grupos: do Pantanal Norte, do Pantanal Sul e do Norte/
Nordeste;
• Foi possível atribuir a maioria dos indivíduos de A. hyacinthinus à sua respectiva
população de origem, assim, esse tipo de análise pode auxiliar na informação da
origem de aves apreendidas;
• Os dados de similaridade genética entre filhotes de A. hyacinthinus corroboram dados
de campo que sugerem monogamia estrita em A. hyacinthinus e que há casais que
utilizam e que se reproduzem no mesmo ninho anualmente enquanto outros o fazem
em anos alternados;
• O aumento da amostragem das três espécies seria importante para aumentar o poder
estatístico das análises realizadas.
87
Análise da variabilidade genética em espécies de psitacídeos ameaçados
Flavia Torres Presti
ERRATA
Agradecimentos
Adicionar: “À Maria (técnica do laboratório) por toda ajuda e amizade.”
Pag.1, linha 9
onde se lê "...Índices de similaridade simples e r..."
leia-se: "...Índices de similaridade simples, r e probabilidade de serem irmãos..."
Pag. 27, 4º parágrafo, linha 2
onde se lê: "...todos esses indivíduos estão em cativeiro..."
leia-se: " ...nove dos indivíduos de C. spixii (quatro dos indivíduos amostrados faleceram) e todos de A. leari se
encontram em cativeiro..."
Pag. 28, figura 1
onde se lê: "46"
leia-se: "44"
Pag. 34, 1º parágrafo, linhas 5 e 7
onde se lê: "...parentesco conhecido (0,78 ± 0,06...) ... sem parentesco conhecido (0,59 ± 0,15)..."
leia-se: "...parentesco conhecido (0,78 ± 0,15...) ... sem parentesco conhecido (0,55 ± 0,15)..."
Pag. 34, 1º parágrafo, linha 9
onde se lê: "...variando de 62 a 77%..."
leia-se: "...variando de 80 a 87%..."
Pag. 52, 4º parágrafo, linha 2
onde se lê: "...se os locos e encontram..."
leia-se: "...se os locos se encontram..."
Pag. 63, 1º parágrafo, linha 13
onde se lê: "...As médias encontradas entre os indivíduos de cada apreensão são significativamente maiores..."
leia-se: "... As médias encontradas entre os indivíduos das apreensões 2, 3 e 4 são significativamente maiores..."
Pag. 69, 3º parágrafo, linha 1
onde se lê: "...utilizados seis "primers"..."
leia-se: "...utilizados cinco "primers"..."
Pag. 75, 1º parágrafo, linhas 1, 2 e 3
onde se lê: "...Dos 59 pares...15 (24%) não apresentam alelos...(pares...42, 54, 57...)..."
leia-se: "...Dos 62 pares...18 (29%) não apresentam alelos...(pares...42, 53, 54, 57, 59...)..."
Pag. 87, item 4
onde se lê: "...evidenciou três principais grupos...Norte/Nordeste..."
leia-se: "...evidenciou quatro principais grupos...Norte e Nordeste..."
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