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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DE
QUATRO CEPAS DE Trypanosoma cruzi CHAGAS,
1909 (KINETOPLASTIDA, TRYPANOSOMATIDAE)
ISOLADAS DE PACIENTES CHAGÁSICOS
CRÔNICOS
MARIA APARECIDA DA SILVA
ORIENTADOR: PROF. DR. JOÃO ARISTEU DA ROSA
ARARAQUARA – SP
2004
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA E MOLECULAR DE
QUATRO CEPAS DE
Trypanosoma cruzi
CHAGAS,
1909 (KINETOPLASTIDA, TRYPANOSOMATIDAE)
ISOLADAS DE PACIENTES CHAGÁSICOS
CRÔNICOS
MARIA APARECIDA DA SILVA
ARARAQUARA – SP
2004
Tese apresentada ao Programa de Pós Graduação em
Análises Clínicas, Área de Análises Clínicas da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP,
para obtenção do título de Doutor em Análises
Clínicas.
Orientador: Prof. Dr. JOÃO ARISTEU DA ROSA
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BANCA EXAMINADORA
TITULARES:
Prof. Dr. JOÃO ARISTEU DA ROSA – Presidente e Orientador
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara – SP
Prof. Dr. JOÃO CLÓVIS DO PRADO JÚNIOR
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP – Ribeirão Preto – SP
Prof
a
. Dra. MÁRCIA APARECIDA SPERANÇA
Faculdade de Medicina de Marília – FAMEMA – Marília – SP
Prof
a
. Dra. MARA CRISTINA PINTO
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara – SP
Prof
a
. Dra. VERA LUCY DE SANTI ALVARENGA
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara – SP
SUPLENTES:
Prof. Dr. SÉRGIO DE ALBUQUERQUE
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – USP – Ribeirão Preto – SP
Prof. Dr. ANTONIO FLUMINHAN JÚNIOR
Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE – Presidente Prudente – SP
Prof. Dr. PAULO INÁCIO DA COSTA
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP – Araraquara - SP
A DEUS, fonte da minha vida
A meus pais, MÁRIO E HILDA,
Aos meus irmãos e sobrinhos,
pelo carinho, amor e estímulo
recebidos,
dedico este trabalho.
AGRADECIMENTOS
A DEUS, pela presença constante em minha vida e pela
força e persistência nos momentos difíceis.
Ao Professor Dr. JOÃO ARISTEU DA ROSA, pela amizade,
oportunidade, confiança e pelo otimismo durante a orientação
deste trabalho.
À Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, e à
diretoria da Faculdade de Farmácia e Bioquímica, pelo apoio e
concessão de dispensa para a realização deste trabalho.
Ao Dr. OCTÁVIO FERNANDES, por colocar seu
laboratório e seus conhecimentos à minha inteira disposição
para execução de uma etapa deste trabalho.
Ao Dr. ADEILTON BRANDRÃO e às Dras. REGINA HELENA
MANGIA e PATRÍCIA CUERVO pela oportunidade de realizar este
trabalho em seu laboratório e poder compartilhar de seus
conhecimentos.
À Dra. GISELE ALBORGUETTI NAI, pela realização dos
exames anatomopatológicos e pelo auxílio e disponibilidade nos
momentos solicitados.
Aos professores JOSÉ MARIA BERTÃO, MARA SÍLVIA
RIBEIRO DE MORAES, ANTONIO FLUMINHAN JÚNIOR, SILVÉRIO TEIXEIRA
DOS SANTOS e HERMANN BREMER NETO pela disponibilidade e
auxílio em fases importantes desse trabalho.
À amiga ANA RITA PALADINO TUMITAN, pelo incentivo e
pelo auxílio na coleta de material para exames
anatomopatológicos.
Aos técnicos de laboratório GILMAR ALVES DE
OLIVEIRA, JOSÉ TRICOTE e ZIZELDA MARY DA CRUZ PEDRO ALMEIDA,
pela dedicação e apoio na manipulação dos animais.
Aos técnicos de laboratório LÍDIA FERRO, RENATA DOS
SANTOS VOLPATO, CARLOS ALEXANDRE SANTANA DE OLIVEIRA,
LUCIMEIRE CONTRERAS e PAULINO JESUS QUATROCHE pela confecção
das lâminas para o exame anatomopatológico.
Às amigas MARIA ZENAIDE TITA FERNANDES e ISABEL
MARTINEZ, pelo esclarecimento e ajuda na parte experimental
deste trabalho.
Aos Drs. ARNALDO BUAINAIN, FRANCISCO MIGUEL BELDA
NETO, JOÃO FLÁVIO GIAZZI e ARLETE SCRASSOLO MARTINI, que
realizaram o isolamento das cepas.
Aos funcionários do Biotério Central da UNOESTE que
forneceram os animais utilizados em nossos experimentos.
Ao Professores LUIZ CARLOS WRUCK, SÉRGIO KRONKA,
DENISE Di GIOVANI LAMBERTI e WILSON LUÍS DE OLIVEIRA pelo
tratamento estatístico dos resultados deste trabalho.
Às amigas MÉRCIA DE CARVALHO ALMEIDA, NAIR TOSHIKO
TASHIMA, CLÁUDIA ALVAREZ CALVO ALESSI, SELMA DE BASTOS
ZAMBELLI FREITAS, FLÁVIA NORIS CHAGAS LELI, LUCIANA MOLEIRO
RIBAS BURGO, CÍCERA ANSELMO DA SILVA FORTUNATO e LUCIMAR
BATISTA, pelo incentivo e apoio.
Aos meus sobrinhos, ANDRÉIA DE FÁTIMA KUBACKI,
ANGELA CRISTINA KUBACKI, ANA FLÁVIA KUBACKI, VINÍCIUS HENRIQUE
GOMES, GUILHERME RENATO GOMES e LEONARDO AUGUSTO GOMES, por
existirem e por darem sentido à minha vida.
A todos que de alguma forma contribuíram para a
realização deste trabalho, seja pelo apoio técnico,
financeiro, psicológico ou espiritual.
Muito obrigada.
“Há homens que lutam um dia
e são bons
Há outros que lutam um ano
e são melhores
Há os que lutam muitos anos
e são muito bons
Porém, há os que lutam toda a vida
Esses são os imprescindíveis”
Bertolt Brecht
RESUMO
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado causador da doença de
Chagas que, segundo estimativas da OMS afeta 16-18 milhões de pessoas na
América Latina, causando danos sociais extremamente graves. A doença apresenta
formas clínicas variadas que incluem a forma indeterminada, cardiomiopatia e
alterações digestivas. Variações intraespecíficas nas diferentes cepas de
Trypanosoma cruzi estudadas foram demonstradas em nível morfo-biológico,
bioquímico e genético. Essa heterogeneidade poderia explicar a variabilidade nas
manifestações clínicas da doença de Chagas e as diferenças regionais de sua
morbidade. Com o objetivo de caracterizar quatro cepas de Trypanosoma cruzi
isoladas de pacientes chagásicos crônicos, residentes na região de Araraquara –
SP, parâmetros biológicos e moleculares foram avaliados. Para estudar o
comportamento biológico das cepas, três grupos de camundongos Swiss, não
isogênicos, pesando 10-12g foram infectados com formas sangüíneas das cepas em
estudo. Foram avaliados os seguintes aspectos: período pré-patente, curvas de
parasitemia, morfologia do parasita no sangue periférico, taxas de mortalidade e
lesões histopatológicas. Três cepas apresentaram parasitemia patente com períodos
pré-patentes variáveis, baixa parasitemia e formas tripomastigotas largas durante
todo o curso da infecção. Uma cepa apresentou parasitemia sub-patente. Nenhum
animal morreu durante o período do estudo. Exame histopatológico mostrou ninhos
de formas amastigotas no coração de animais infectados para duas cepas e
inflamação em vários órgãos para todas as cepas. Para a caracterização molecular o
DNA do parasita foi extraído de formas epimastigotas mantidas em meio LIT. Parte
do espaçador não transcrito do gene de mini-exon foi amplificado por PCR. Todas as
cepas geraram produtos com 250 pb. Os dados biológicos e moleculares permitiram
a classificação de todas as cepas como T.cruzi II.
Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, doença de Chagas, cepa, Biodema, PCR
multiplex, T.cruzi II.
ABSTRACT
Trypanosoma cruzi is a flagellate protozoan agent of Chagas disease that,
according to the OMS estimation, affect 16-18 milion of people in Latin America,
making serious social damage. The illness shows varied clinicals forms that include
indeterminate form, cardiomiopathy and digestive alterations. Intra-specific variations
among differents Trypanosoma cruzi strains studied have been demonstrated on
morpho-biological, genetic and biochemical levels. Such heterogeneity can explain
the variability of Chagas disease in clinical manifestations and in the regional
differences of the morbidity rate. This research has the objective to characterize four
strains of Trypanosoma cruzi isolated from humans patients, residents in Araraquara
– SP region, by evaluating biological and molecular parameters. In order to study the
biological behavior of Trypanosoma cruzi strains, three groups of albino Swiss mice,
weighting 10-12g were intraperitoneally inoculated with bloodstreams forms of the
strains in study. Pre-patent period, parasitaemia patterns, tripomastigote morphology,
mortality rate and tissue distribution of the protozoan were analysed. Three strains
showed patent parasitemy with variable pre-patent period, low parasitemy and broad
forms during the whole infection period. One strain showed sub-patent parasitemy.
Mortality rates were null. Histopathological analysis showed amastigotes forms in
heart for two strains and inflamatory process in several organs for all the strains. For
the molecular characterization, the parasite DNA was extracted from epimastigotes
forms kept in LIT medium. Part of the non-transcribed spacer of the mini-exon gene
was amplified by PCR. All the strains generated products with 250 pb. The molecular
and biological informations allowed to classify all the strains as T.cruzi II.
Keywords: Trypanosoma cruzi, Chagas disease, strain, Biodeme, PCR multiplex,
T.cruzi II.
SUMÁRIO
PÁGINA
1- INTRODUÇÃO .................................................................................... 12
1.1- Histórico ................................................................................. 13
1.2- Morfologia e Ciclo Biológico do Parasita ................................ 14
1.3- Aspectos Epidemiológicos ..................................................... 17
1.4- Patogênese e Aspectos Clínicos da Doença ......................... 21
1.5- Tipagem de Cepas de Trypanosoma cruzi ............................ 24
2- OBJETIVOS ....................................................................................... 33
2.1- Objetivo Geral ........................................................................ 33
2.2- Objetivos Específicos ............................................................. 33
2.2.1- Caracterização biológica ......................................... 33
2.2.2- Caracterização molecular ........................................ 33
3- MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 34
3.1- Caracterização Biológica ....................................................... 34
3.1.1- Período pré-patente e curvas parasitêmicas ........... 35
3.1.2- Taxa de mortalidade ................................................ 37
3.1.3- Morfologia dos parasitas no sangue periférico ........ 37
3.1.4- Estudo histopatológico ............................................ 37
3.1.5- Classificação das cepas .......................................... 38
3.1.6- Análise estatística dos dados .................................. 39
3.2- Caracterização Molecular ....................................................... 39
3.2.1- Extração do DNA ..................................................... 40
3.2.2- Reação em cadeia da polimerase (PCR) ................ 40
4- RESULTADOS .................................................................................... 43
4.1- Caracterização Biológica ....................................................... 43
4.1.1- PerÍodo pré-patente e curvas parasitêmicas ........... 43
4.1.2- Taxa de mortalidade ................................................ 51
4.1.3- Morfologia dos tripomastigotas sangüíneos ............ 51
4.1.4- Estudo histopatológico ............................................ 54
4.1.5- Classificação das cepas ......................................... 61
4.2- Caracterização Molecular ....................................................... 62
4.3- Denominação das Cepas ....................................................... 63
5- DISCUSSÃO ....................................................................................... 64
5.1- Caracterização Biológica ....................................................... 64
5.1.1- Evolução da parasitemia ......................................... 66
5.1.2- Morfologia das formas sangüíneas ......................... 70
5.1.3- Taxa de mortalidade ................................................ 72
5.1.4- Lesões histopatológicas .......................................... 73
5.1.5- Classificação das cepas .......................................... 74
5.2- Caracterização Molecular ....................................................... 76
6- CONCLUSÕES .................................................................................... 80
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 82
12
1- INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é uma das mais sérias doenças parasitárias da América
Latina, com um impacto econômico e social maior do que os efeitos combinados de
outras doenças parasitárias, como malária, leishmaniose e esquistossomose (DIAS
e SCHOFIELD, 1999).
Em 1993, o impacto sobre a economia foi calculado como uma perda
equivalente a 1,3% da dívida externa de toda a América do Sul. Em um estudo
divulgado pelo Banco Mundial, calculou-se que os anos de vida perdidos, ajustados
em função da incapacidade em escala global, representam 2,74 milhões de anos,
representando uma perda econômica aos países da América Latina onde a doença
é endêmica, equivalente a 6,5 bilhões de dólares por ano (BANCO MUNDIAL, 1993;
DIAS e SCHOFIELD, 1999).
A infecção é causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi que tem
uma grande quantidade de hospedeiros, infectando animais silvestres, domésticos e
o homem. Vários mamíferos das ordens Marsupialia (gambá, gambá-marta,
marmota, cuíca), Edentata (tamanduá, ouriço, preguiça), Chiroptera (morcego),
Carnívora (cachorro-do-mato, raposa-do-campo, furão, irara, coati), Lagomorpha
(lebre, coelho), Rodentia (cotia, paca, ratos-do-campo, preá, moco) e Primatas
(macacos-de-cheiro, bugio, sagüi) já foram encontrados infectados naturalmente por
Trypanosoma cruzi (SHERLOCK, 2000; SILVA et al., 2004). O protozoário é
transmitido ao hospedeiro vertebrado por insetos hematófagos, os triatomíneos,
conhecidos no Brasil sob as denominações populares de “barbeiro” ou “chupança”
(SCHUMUNIS, 1991).
A doença é característica de populações da área rural, com condições sócio-
econômicas que favorecem o contato do hospedeiro humano com triatomíneos e
que são determinantes na manutenção da transmissão em vários locais da América
Latina. Mudanças culturais e sociais têm permitido que a doença se estenda a áreas
urbanas mudando radicalmente os aspectos da epidemiologia e convertendo a
13
transmissão por transfusões sangüíneas em um fator importante dentro do aspecto
geral da gênese e manutenção da patologia (MARIN, 2003).
1.1- Histórico:
A doença de Chagas, também chamada de tripanossomíase americana foi
descrita pelo médico sanitarista brasileiro Carlos Justiniano Ribeiro das Chagas em
1909.
Em 1908, o governo brasileiro estava tentanto ligar o país de norte a sul,
unindo o Rio de Janeiro a Belém do Pará através da Estrada de Ferro Central do
Brasil, mas os trabalhos estavam paralisados em Minas Gerais devido a uma
epidemia de malária, que atacou os trabalhadores. Oswaldo Cruz enviou Carlos
Chagas e Belisário Pena àquela região. Eles estabeleceram-se em Lassance, dentro
de um vagão de trem que servia de consultório, laboratório e quarto de dormir
(WENDEL e BRENER, 1992).
Em Lassance, Chagas deparou-se com um quadro nosológico de difícil
interpretação. A população queixava-se de incômodo “baticum” (pulsação forte do
coração e das artérias) e apresentava sinais de insuficiência cardíaca, sendo
freqüente a morte súbita (CHAGAS FILHO, 1979).
Após um ano de exaustivos trabalhos, Carlos Chagas soube pelo Dr.
Cantarino Mota, engenheiro responsável pelas obras da estrada de ferro, da
presença de uma infinidade de insetos hematófagos, chamados de “barbeiros” ou
“chupões”, que ficavam alojados nas frestas das paredes de pau-a-pique e saiam à
noite para se alimentar, picando no rosto dos habitantes, daí o nome de “barbeiros”
(BIBLIOTECA VIRTUAL CARLOS CHAGAS, 2004).
Examinando o tubo digestivo desses insetos, Chagas encontrou um flagelado.
Intrigado pela possibilidade de que esse parasita pudesse representar um estádio
evolutivo de Trypanosoma minasense, que tinha previamente descrito em 1908,
infectando sagüis, mandou alguns insetos a Oswaldo Cruz, para que os alimentasse
em macacos livres da infecção. Depois de algumas semanas, os mesmos flagelados
foram observados no sangue dos animais e reconhecidos como uma nova espécie,
diferente de Trypanosoma minasense.
14
Inicialmente Chagas admitiu a existência no ciclo evolutivo de Trypanosoma
cruzi de duas formas de multiplicação: divisão binária e multiplicação esquizogônica.
Por isso, o parasita foi inicialmente classificado no gênero Schizotrypanum e
chamado Schizotrypanum cruzi em homenagem a Oswaldo Cruz. Mais tarde,
admitindo seu equívoco, Carlos Chagas renomeou o protozoário para Trypanosoma
cruzi (WENDEL e BRENER, 1992; CHAGAS FILHO, 2004).
Voltando a Lassance, Chagas verificou a presença de Trypanosoma cruzi em
um gato e em um cão, e logo depois, no tatu, que passou a considerar como
reservatório silvestre do parasita (CHAGAS FILHO, 2004).
No dia 14 de fevereiro de 1909, Chagas examinou uma menina de 2 anos de
idade chamada Berenice, que apresentava febre alta, a face e o corpo com edema
duro e ligeiro comprometimento do sistema nervoso. Examinando-lhe o sangue,
Chagas encontrou Trypanosoma cruzi. Era o primeiro caso da moléstia a que, mais
tarde, se daria o nome de doença de Chagas, e com ele consolidou-se,
praticamente, o ciclo da descoberta no qual foi conhecido primeiro o vetor, em
seguida o protozoário, agente causador da doença, os seus reservatórios
domésticos e silvestres e, por fim, um caso humano – tudo por um só pesquisador.
Foi o início de uma epopéia científica que até hoje tem exigido a atenção de
especialistas do Brasil, da América Latina, do mundo inteiro (WENDEL e BRENER,
1992; CHAGAS FILHO, 2004).
1.2 – Morfologia e Ciclo Biológico do Parasita:
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado da ordem Kinetoplastida,
família Trypanosomatidae, caracterizado pela presença de um flagelo e uma única
mitocôndria, na qual está situado o cinetoplasto, uma estrutura especializada que
corresponde a uma condensação do DNA extra-nuclear dentro de uma região bem
definida, que está presente em todos os membros da ordem Kinetoplastida (De
SOUZA, 1999; CEVALLOS e HERNÁNDEZ, 2004).
Seu ciclo de vida envolve a passagem alternada em hospedeiros vertebrados
e em invertebrados da classe Hemíptera, Família Reduviidae, Sub-Família
Triatominae (CEVALLOS e HERNANDEZ, 2004).
15
Em seu ciclo biológico, Trypanosoma cruzi apresenta fundamentalmente três
formas evolutivas: epimastigota, tripomastigota e amastigota. Essas formas são
identificadas morfologicamente pela posição do cinetoplasto em relação ao núcleo
da célula e pela presença ou ausência de um flagelo. Nas formas epimastigotas o
cinetoplasto e a bolsa flagelar encontram-se em posição anterior ao núcleo. Em
análises ultraestruturais, o cinetoplasto apresenta-se em forma de bastão constituído
por material filamentoso disposto como feixes de fibras firmemente empacotadas e
perpendicularmente orientado em relação ao eixo longitudinal do protozoário. Nas
formas tripomastigotas o cinetoplasto localiza-se posterior ao núcleo, apresenta-se
de forma arredondada e os filamentos não estão firmemente empacotados. O flagelo
emerge da bolsa flagelar que está localizada próxima ao cinetoplasto. As formas
amastigotas são células arredondadas, que não apresentam flagelo livre e o
cinetoplasto é de difícil visibilidade apresentando ultraestrutura semelhante a de
epimastigotas (CHIA-TUNG PAN, 1978; SOARES et al., 1989; De SOUZA, 1999).
Os tripanosomatídeos têm estruturas celulares únicas entre os protozoários.
Uma dessas estruturas é um conjunto de microtúbulos sub-peliculares formados por
polímeros lineares de α e β tubulina, que se encontram aderidos à membrana
citoplasmática, formando um citoesqueleto periférico de grande rigidez. Os
microtúbulos sub-peliculares se distribuem em toda a membrana citoplasmática,
exceto na área onde emerge o flagelo. Esta região, carente de microtúbulos é de
grande importância para a célula, já que é o único sítio onde se realizam
endocitoses ou exocitoses de macromoléculas, provavelmente porque os
microtúbulos sub-peliculares inibem ou impedem a fusão de membranas necessária
para os processos de endocitose e secreção celular (MARIN, 2003; CEVALLOS e
HERNÁNDEZ, 2004).
Outra estrutura especializada de Trypanosoma cruzi e de outros
tripanosomatídeos é o cinetoplasto, formado por uma malha ou rede de ácido
desoxirribonucléico (DNA) extra-nuclear, localizada em um ponto específico na única
mitocôndria destes protozoários. Esse material genético representa 10 a 30% do
DNA total celular, dependendo da espécie. O DNA do cinetoplasto está estruturado
pela concatenação de dois tipos de moléculas circulares de DNA: os minicírculos e
os maxicírculos (BARKER, 1989; SILVEIRA J.F., 2000; CEVALLOS e HERNÁNDEZ,
2004).
16
Os minicírculos formam a maior parte da estrutura, contando com 5.000 a
10.000 moléculas por célula. São moléculas circulares de DNA com
aproximadamente 1400 pares de base. Por muitos anos se especulou sobre sua
função, já que não continham informações genéticas evidentes (BARKER, 1989).
Nas décadas de 80 e 90 se evidenciaram pequenos ácidos ribonucléicos (RNA)
codificados pelos minicírculos que participam no processamento de RNAs
mensageiros mitocondriais. Os maxicírculos são moléculas de DNA de maior
tamanho, que contém de 30.000 a 50.000 pares de bases, sendo encontradas em
aproximadamente 50 cópias por célula. Representam o equivalente ao DNA
mitocondrial de outros eucariontes, pois codificam RNAs correspondentes a enzimas
da cadeia respiratória, RNAs ribossômicos e de transferência (SIMPSON et al.,
2000; SILVEIRA, J.F., 2000).
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado digenético, portanto seu ciclo
biológico envolve uma passagem obrigatória em dois hospedeiros: um inseto vetor e
o hospedeiro vertebrado mamífero. Durante o ciclo de vida, o parasita sofre
alterações morfológicas, ultraestruturais, funcionais e bioquímicas que resultam na
diferenciação em duas formas replicativas, epimastigota e amastigota, e uma forma
não replicativa e infectiva, os tripomastigotas (TYLER e ENGMAN, 2001).
Ao serem ingeridas pelo vetor, as formas tripomastigotas presentes no
sangue de vertebrados infectados, passam por uma seqüência de diferenciação ao
longo do tubo digestivo do inseto, transformando-se em formas epimastigotas.
Quando os epimastigotas atingem o reto diferenciam-se em tripomastigotas
metacíclicos, que são eliminados com as fezes e urina do vetor e podem penetrar no
hospedeiro vertebrado por soluções de continuidade da pele ou pelas mucosas
(KOLLIEN e SCHAUD, 2000).
No hospedeiro vertebrado as formas tripomastigotas devem necessariamente
penetrar no interior de células, onde se diferenciam em amastigotas. O processo de
invasão celular ocorre por um mecanismo parasitário único, no qual os microtúbulos
do citoesqueleto da célula de um mamífero são direcionados para recrutar
lisossomos até o ponto de acoplamento do parasita. Os lisossomos fundem-se com
a membrana plasmática, formando inicialmente uma junção com os parasitas e o
compartimento vacuolar, permitindo a entrada do parasita (TARDIEUX et al., 1992;
RODRIGUEZ et al., 1996).
17
A acidificação do vacúolo parasitóforo resultante da fusão lisossomal também
serve para ativar o parasita que secreta uma molécula do tipo “porin-like”
denominada Tc-Tox, que facilita a saída das formas tripomastigotas do vacúolo
(ANDREWS, 1993).
As formas tripomastigotas escapam do vacúolo e diferenciam-se em
amastigotas. Após um período de latência, as formas amastigotas sofrem várias
divisões binárias e dão origem às formas tripomastigotas sangüíneas que são
contidas em um pseudocisto. As formas tripomastigotas geralmente escapam do
pseudocisto e com o rompimento da célula parasitada são liberadas, podendo
infectar células vizinhas ou, através da corrente circulatória, atingir órgãos e tecidos
distantes, perpetuando o ciclo. Podem também ser ingeridas pelo inseto durante sua
atividade de hamatofagia, dando origem aos epimastigotas e reiniciando o ciclo
( ANDREWS, 1993; TYLER e ENGMAN, 2001).
1.3 – Aspectos Epidemiológicos:
Doença de Chagas é um infecção exclusiva do continente americano,
ocorrendo desde o sul dos Estados Unidos até a Argentina e Chile. A Organização
Mundial da Saúde (OMS) estimou em 1991 que 16 a 18 milhões de pessoas
estavam infectadas em toda a América e que outras 100 milhões de pessoas
estavam em risco de adquirir a infecção. Sem dúvida, iniciativas multinacionais de
erradicação têm tido resultados espetaculares, reduzindo significativamente a
prevalência da doença (CEVALLOS e HERNÁNDEZ, 2004)
Com o auxílio da OMS, a intervenção de entidades governamentais tem
conseguido consolidar ações diretas para a interrupção da transmissão da doença
de Chagas nas três grandes áreas geográficas endêmicas, com as seguintes
iniciativas:
a) Iniciativa do Cone Sul, iniciada em 1991 com o objetivo de eliminar a
transmissão da doença de Chagas na Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e
Uruguai.
b) Iniciativa Andina, na Colômbia, Equador, Peru e Venezuela.
18
c) Iniciativa da América Central, em Belize, Costa Rica, El Salvador,
Guatemala, Honduras, México, Nicarágua e Panamá (MARIN, 2003).
Com a Iniciativa do Cone Sul, a transmissão da doença de Chagas pelo vetor
e por transfusão de sangue, foi interrompida no Uruguai em 1997, no Chile em 1999
e em oito dos doze estados onde a infecção é endêmica no Brasil em 2000 e, dessa
forma, a incidência de novas infecções em todo o continente decresceu mais de
70%. Com os resultados dos outros programas de controle a expectativa é
assegurar a interrupção da transmissão da doença em 2005 (MONCAYO, 2003).
A doença de Chagas é uma zoonose transmitida em focos naturais ou
unidades ecológicas dentro de um ambiente geográfico bem definido (MONCAYO,
2003).
Na natureza, Trypanosoma cruzi se mantém principalmente em um ciclo
silvestre que envolve certas espécies de triatomíneos que atuam como vetores e
vários mamíferos silvestres. A invasão humana dos ambientes silvestres facilitou o
contato dos triatomíneos e dos animais silvestres infectados com o homem,
introduzindo assim um ciclo peri-doméstico. A desagregação do ambiente natural,
com o deslocamento de triatomíneos de seus ecótopos silvestres primitivos, é que
determinou a transmissão domiciliar da doença. Certas espécies de triatomíneos,
como Triatoma infestans e Rhodnius prolixus, têm maior propensão para invadir as
casas e, por isso, são freqüentemente os responsáveis pela transmissão da infecção
ao homem (SILVEIRA e REZENDE, 1994; CEVALLOS e HERNÁNDEZ, 2004).
A área endêmica brasileira, onde se encontram os insetos vetores, ocupa
quase um quarto do território nacional e abriga uma população exposta ao risco de
infecção, da ordem de 28 milhões de habitantes, estimando-se o número de pessoas
infectadas em 5 milhões (DIAS, 2000).
No Brasil, a doença de Chagas humana é encontrada nos estados do Rio
Grande do Sul, parte de Santa Catarina e Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Goiás e
estados do Nordeste. Na Região Amazônica, Trypanosoma cruzi circulava somente
entre animais e triatomíneos silvestres mas, nos últimos anos, estão sendo
detectados focos de transmissão natural da doença de Chagas humana (BARATA et
al., 1988; COURA et al, 1995; DIAS, 2000; LANA e TAFURI, 2000).
Tem havido uma considerável migração de indivíduos chagásicos dentro e
para fora das Américas, e este é um importante fator para a expansão da doença de
Chagas para áreas não endêmicas (LUQUETTI, 1994).
19
Os triatomíneos são insetos hematófagos primitivamente silvestres
classificados em 6 tribos com 19 gêneros. Entre as 137 espécies conhecidas
(GALVÃO et al. 2003), há aquelas mais e menos adaptadas ao domicílio, mais e
menos antropofílicas e com diferentes capacidade ou competência na veiculação de
Trypanosoma cruzi, tendo algumas espécies se adaptado secundariamente aos
ecótopos artificiais (SILVEIRA, A.C., 2000).
Desde a descrição da doença de Chagas, a via vetorial – penetração no
hospedeiro suscetível do protozoário presente nas fezes e urina de triatomíneos
infectados - tem sido considerada como o modo de transmissão mais importante. Ao
alimentar-se, os triatomíneos injetam saliva sob a pele do indivíduo que lhes fornece
o alimento, o que reduz a sensação de dor, porém tende a provocar prurido. O ato
de coçar torna-se então um meio eficiente de levar fezes e urina do inseto,
eliminadas durante o repasto, para o local da picada. Este é o principal mecanismo
de transmissão da doença quando não há controle das populações vetoras. Devido
ao controle de populações de triatomíneos, a infecção por esse mecanismo é
atualmente um evento de difícil ocorrência, dependente de fatores relacionados com
a densidade e a domiciliação dos vetores, a freqüência específica com a qual estes
se alimentam, a preferência pela fonte alimentar, a suscetibilidade à infecção e
proliferação do parasita, o intervalo entre a alimentação e a defecação, assim como
a taxa de infecção nas diferentes espécies vetoras (ZELEDÓN e RABINOVICH,
1981; SILVA et al., 2004).
Após o controle da transmissão vetorial, outras formas de transmissão,
conhecidas como formas alternativas, que também coexistiam com a forma vetorial,
ganharam destaque, estabelecendo-se como mecanismos de perpetuação de
Trypanosoma cruzi na população humana, dentre elas: transfusão sangüínea, via
congênita e outras (SILVA et al., 2004).
A transfusão sangüínea constitui-se na segunda via de transmissão em
importância. Oferece um risco estimado entre 12,5 e 25% para uma única transfusão
padrão de 500 mL de sangue total. Esse risco varia com a prevalência da doença na
região em que a transfusão é feita, podendo assim chegar a níveis bem mais
elevados. Com a intensa migração de populações de áreas rurais, em que a doença
era mais freqüente, para as urbanas, cresceu o risco dessa modalidade de
transmissão, devido ao fato de que o controle sorológico dos doadores não era
adequadamente realizado. Hoje a prevalência da infecção chagásica entre doadores
20
de sangue atinge valores próximos de zero em São Paulo. Entretanto, varia de 2 a
4% na América Latina em geral, podendo chegar a 63% em áreas endêmicas da
Bolívia e estão aumentando em áreas não endêmicas como os Estados Unidos
(WHO, 1991; WANDERLEY et. al., 1993; SCHUMUNIS, 1991; SILVA et. al., 2004).
A terceira modalidade de transmissão, em importância, é a congênita, por via
transplacentária. De acordo com Dias e Schofield (1999) essa forma de transmissão
acomete 4% dos nascidos de mães infectadas. A importância de detectar-se a
infecção por esse mecanismo está na possibilidade de tratamento específico e de
aconselhamento às mães quanto a futuras gestações (LUQUETTI, 1994; SILVA et
al., 2004).
Outra forma de transmissão descrita na literatura é a oral, por meio da
ingestão de alimentos contaminados por Trypanosoma cruzi, como por exemplo,
carnes de caça cruas ou mal cozidas contaminadas e mesmo outros alimentos,
durante cujo preparo possa ter ocorrido a contaminação com material dos próprios
vetores infectados (DIAS, 2000; SILVA et al., 2004).
Epidemias de doença de Chagas humana que foram atribuídas à infecção oral
foram registradas em Teutonia – RS e Catolé da Rocha – PB. Mais recentemente,
vários episódios foram identificados na Amazônia Brasileira (CAMANDAROBA et al.,
2002).
O aleitamento materno também é citado na literatura como via de
transmissão, quando a mãe se apresenta na fase aguda da doença e,
principalmente, se há fissuras nos mamilos (PINTO, 1942; SILVA et al., 2004).
Em transplante de órgãos, como na transfusão sangüínea, pode ocorrer a
transmissão quando se desconhece a condição de infectado chagásico do doador,
por falta do indispensável diagnóstico prévio. Teoricamente, a transmissão pode
ocorrer pelo transplante de qualquer órgão do doador infectado ao hospedeiro
suscetível. Entretanto, muitos casos têm sido relatados como resultado de
transplante renal, com raros casos atribuídos a transplantes de coração, pâncreas
ou medula óssea (DIAS e SCHOFIELD, 1999; SILVA et al., 2004).
Acidentes de laboratório entre pesquisadores e técnicos que trabalham com o
parasita, seja no sangue de animais, pessoas infectadas, meios de cultura ou vetor
também constitui uma maneira de infecção (DIAS, 2000).
21
1.4- Patogênese e Aspectos Clínicos da Doença:
O curso da infecção é bastante variável. Descrevem-se na literatura três fases
da doença de Chagas: aguda, indeterminada e crônica.
Depois da picada do triatomíneo infectado pode aparecer uma lesão local no
sítio de inoculação. Essa lesão recebe o nome de “chagoma” e consiste numa zona
endurecida eritematosa, com inflamação e hipertrofia dos gânglios regionais.
Quando a porta de entrada do parasita é a mucosa conjuntival, aparece um edema
indolor, unilateral, nas pálpebras e nos tecidos adjacentes chamada “sinal de
Romaña”. A fase aguda da doença é geralmente assintomática, com apenas 1 a 2%
dos pacientes apresentando sintomas em uma a duas semanas após a infecção
(MARIN, 2003).
As manifestações clínicas gerais incluem febre, linfadenopatia e
hepatoesplenomegalia. Essa fase se resolve espontaneamente em quatro a oito
semanas. Entretanto, em alguns pacientes, principalmente crianças ou indivíduos
imunodeficientes, quadros meníngeos graves e de insuficiência cardíaca podem
estar associados e ocorrer óbito (PRATA, 1968; SILVA et al., 2004).
Em indivíduos que adquirem a infecção por transfusão sangüínea,
particularmente em pacientes imunossuprimidos, a fase aguda pode ser fulminante
com dano cardíaco e do sistema nervoso central (RASSI et al., 1994).
A infecção congênita por Trypanosoma cruzi pode produzir aborto, morte
intra-uterina ou enfermidade aguda, caracterizada por febre, icterícia, anemia,
hepatoesplenomegalia e lesões cutâneas, a qual pode ser detectada no momento do
nascimento, ou várias semanas depois. A mortalidade da doença congênita é
secundária à miocardite, pneumonite ou encefalite (MARIN, 2003).
A fase subseqüente, conhecida como indeterminada, não apresenta
sintomatologia importante do ponto de vista clínico e pode durar vários anos. A maior
parte dos chagásicos persiste nessa fase indeterminadamente, enquanto outros
evoluem para a fase crônica. Aproximadamente 27% dos indivíduos infectados
podem desenvolver sintomas cardíacos (forma cardíaca), 6% danos digestivos
(forma digestiva) e 3% comprometimento do sistema nervoso periférico (forma
nervosa) (DIAS, 1989; WHO, 1991).
22
A miocardite chagásica crônica caracteriza-se, de maneira geral, por um
infiltrado de células mononucleares com destruição de fibras cardíacas no foco
inflamatório e comprometimento dos plexos nervosos levando a áreas de fibrose no
tecido cardíaco, fenômenos tromboembólicos e morte súbita. As manifestações
clínicas mais freqüentes são as palpitações, enjôos, síncope, dispnéia, edema e dor
precordial (ANDRADE e ANDRADE, 1979; MARIN, 2003).
A forma digestiva está caracterizada por alterações na secreção, motilidade,
absorção e, nos casos mais graves, pelo aumento do tubo digestivo devido a
alterações nos plexos nervosos (principalmente no plexo mioentérico), sendo o
megaesôfago e o megacólon as apresentações mais comuns (LOPES e
CHAPADEIRO, 1997).
Os sintomas e sinais do comprometimento esofágico são: disfagia,
regurgitação, epigastralgia, dor ao deglutir, hipersalivação, emagrecimento e
hipertrofia das parótidas. Já o megacólon se apresenta com constipação intestinal,
meteorismo, distensão abdominal e fecaloma (REZENDE e MOREIRA, 2000).
A origem dessas manifestações se deve principalmente à destruição de
células do sistema nervoso entérico. Os plexos intramurais são as estruturas mais
danificadas, no entanto, não se sabe bem os mecanismos pelos quais estes são
destruídos. Tem-se postulado que podem dever-se à imunidade celular e fatores
predisponentes, como a cepa do parasita e/ou características ou particularidades
genéticas do indivíduo (TEIXEIRA et al., 1980).
A prevalência e apresentação da forma digestiva da doença de Chagas
variam segundo a região endêmica em estudo. No Brasil afeta principalmente a
região central do país, enquanto em países como Colômbia, Venezuela e países da
América Central, a apresentação destes casos é muito rara (REZENDE e
LUQUETTI, 1994).
Os casos da forma nervosa da doença de Chagas seriam representados
pelos indivíduos com manifestações neurológicas e déficit mental, provavelmente
devido a seqüelas da fase aguda. Essa forma é encontrada com mais freqüência em
pacientes infectados com Trypanosoma cruzi e submetidos a imunossupressão, ou
em indivíduos com indicação de transplantes ou infectados com o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), mostrando a importância do estado imunológico no
controle dessa forma da doença (ROCHA et al., 1994).
23
Os mecanismos que promovem as lesões tissulares, levando à miocardiopatia
e/ou aos megas do sistema digestivo, não são totalmente conhecidos, porém
admite-se que estejam associados à imunidade celular (TEIXEIRA et al., 1980;
SANTOS e HUDSON, 1981).
Na fase aguda, os parasitas penetram nos miócitos originando destruição
mecânica e ruptura miofibrilar. No interstício se observa reação inflamatória com
neutrófilos, eosinófilos, linfócitos, histiócitos e macrófagos. As linfocinas liberadas
atraem e ativam os macrófagos, promovendo assim a liberação do fator de
agregação plaquetária e a conseqüente formação de trombos intravasculares e
vasculite intensa, o que leva a transtornos na microcirculação, gerando isquemia
local. No sistema nervoso autônomo, o estudo histopatológico mostra destruição de
gânglios intracardíacos, periganglionite, depleção neuronal e lesão das células de
Schwann (ROSSI e RAMOS, 1996; MARIN, 2003).
Na fase crônica, a destruição das miofibrilas é substituída por tecido fibrótico
e hipertrofia dos miócitos remanescentes. Ao contrário do que sucede na fase
aguda, o infiltrado inflamatório linfocitário é predominantemente mononuclear. A
presença de parasitas é escassa. Este fato tem levado à formulação das mais
diversas hipóteses que tratam de desvendar a verdadeira participação do parasita
na patogênese da doença. Há evidências de que a miopatia obedece a um processo
auto-imune com reação cruzada entre antígenos do parasita e antígenos do tecido
miocárdico do hospedeiro (KIERSZENBAUM, 1999). Exemplo disto é o mimetismo
entre a miosina humana e a proteína B13 de Trypanosoma cruzi, e a reação que
existe entre neurotransmissores muscarínicos colinérgicos e beta adrenérgicos com
proteínas do parasita (MARIN, 2003).
Contrariando em parte essa teoria, a utilização de técnicas
imunohistoquímicas e moleculares sugeriu a existência de uma estreita correlação
entre a presença do parasita ou de seu DNA e a lesão do miocárdio (HIGUCHI et al.,
1993; JONES et al., 1993).
Esses e outros achados revelam a dificuldade em se chegar a um consenso
sobre a fisiopatologia da doença de Chagas e parecem indicar que o conjunto deles
tem participação em maior ou menor proporção na mesma (MARIN, 2003).
24
1.5- Tipagem de Cepas de Trypanosoma cruzi:
A causa do aspecto clínico variável da doença de Chagas não é conhecida
(ARAÚJO e REMINGTON, 1981). A severidade e os sintomas da doença variam em
diferentes regiões geográficas. Foi sugerido que tais variabilidades podem ser
resultantes tanto da heterogeneidade entre isolados de Trypanosoma cruzi como da
resposta imune do hospedeiro (SOUTO et al., 1996).
O taxon Trypanosoma cruzi não é composto por uma espécie homogênea.
Nos anos sessenta, quando não se dispunha de ferramentas moleculares, Coura et
al. (1966) defenderam o uso do termo “complexo cruzi” para designar o protozoário,
baseado na variação morfológica, aspectos imunológicos, distinta virulência e
diferenças nos padrões individual e regional da doença de Chagas. Hoje está bem
estabelecido que Trypanosoma cruzi é uma espécie heterogênea consistindo de
várias sub-populações do parasita circulando entre vários hospedeiros vertebrados,
domésticos e silvestres e hospedeiros invertebrados (MOREL et al., 1986;
ZINGALES et al., 1998).
Desde o início das investigações sobre a doença de Chagas, tem sido
observado uma tendência dos pesquisadores que procuraram reproduzir
experimentalmente a doença, a conservarem os parasitas obtidos de casos
humanos, de animais naturalmente infectados ou do inseto vetor, como amostras
isoladas, as quais são mantidas em laboratório por meio de passagens em animais
suscetíveis ou por cultivo “in vitro”. Esses tripanossomas assim isolados passam a
constituir o que se designa na literatura como “cepa” de Trypanosoma cruzi
(ANDRADE, 1974)
Lumsden (apud ANDRADE, 1974) define “cepa” como uma população
derivada de um “isolado”, mantida em cativeiro em reprodução contínua por
passagens seriadas, quer mecânica ou cíclica, em cultura ou em animais de
laboratório.
Segundo Andrade e Magalhães (1997), cepas de Trypanosoma cruzi são
complexos de populações multiclonais que diferem em suas características
genéticas e biológicas e em seu comportamento no hospedeiro vertebrado.
Estudos experimentais mostram que diferentes cepas de Trypanosoma cruzi
podem determinar lesões tissulares peculiares na fase aguda, que são uma
25
conseqüência de um tropismo específico e predominante para diferentes tipos de
células de mamíferos, tais como macrófagos, células musculares cardíacas e
esqueléticas e neurônios (ANDRADE, 1985).
O enfoque inicial para estudar diferentes cepas de Trypanosoma cruzi foi
baseado em características isoladas, tais como virulência e patogenicidade, tropismo
tissular e morfologia do parasita no sangue periférico. Atualmente outros enfoques
são também utilizados, como composição antigênica do parasita, perfil
isoenzimático, caracterização do DNA nuclear e do cinetoplasto (ANDRADE et al.,
1981; ANDRADE et al., 1983; MOREL e SIMPSON, 1980; MOREL et al., 1980;
SOUTO et al., 1996).
Virulência é a capacidade do parasita de se multiplicar dentro do hospedeiro
experimental, a qual é influenciada por vários fatores. Patogenicidade é uma
característica mais intrínseca e está correlacionada com a habilidade para produzir
lesões tissulares e com a mortalidade (ANDRADE, 1974). Cepas altamente
virulentas, como as cepas Y e Peruviana, são, em geral, altamente patogênicas.
Entretanto, outras cepas, como a cepa Colombiana, apresenta um menor grau de
multiplicação e pode determinar proeminentes lesões tissulares (ANDRADE, 1985;
FEDERIC et al., 1964; KUMAR et al., 1969). Phillips (1960) trabalhando com a cepa
Sonya demonstrou que a patogenicidade foi independente dos níveis de
parasitemia.
Tropismo tissular é um dos mais importantes aspectos para a diferenciação
de várias cepas de Trypanosoma cruzi. O parasitismo preferencial de diferentes
cepas para tipos celulares específicos foi observado por Badinez (1945) que
descreveu o reticulotropismo e o miotropismo de diferentes cepas em porquinhos-
da-Índia e em cães. Andrade e Andrade (apud ANDRADE, 1985) descreveram as
lesões histopatológicas determinadas pela cepa Y (reticulotrópica) e pela cepa
Colombiana (miotrópica) mostrando que o tropismo natural de ambas as cepas foi
reforçado quando as defesas imunológicas do hospedeiro foram depletadas pela
administração de corticóides. Tropismo preferencial pelo miocárdio foi observado por
Andrade (1974) em várias cepas isoladas no Recôncavo Baiano (Bahia – Brasil).
Melo e Brener (1978) estudaram o tropismo de quatro cepas de Trypanosoma
cruzi e enfatizaram o macrofagotropismo das cepas Y e Berenice.
A avaliação da porcentagem de formas largas e formas delgadas de
tripomastigotas no sangue periférico de camundongos infectados tem mostrado que
26
diferentes cepas podem ser caracterizadas sob esse aspecto (BRENER e CHIARI,
1963). Formas delgadas predominam em cepas altamente virulentas e
macrofagotrópicas, enquanto formas largas predominam em cepas menos virulentas
e miotrópicas (ANDRADE, 1974).
Quando diferentes parâmetros, tais como, evolução da infecção, período pré-
patente, curvas de parasitemia, morfologia do parasita no sangue periférico,
tropismo tissular, lesões histopatológicas e grau de mortalidade são avaliados, as
várias cepas de Trypanosoma cruzi podem ser caracterizadas em poucos “tipos” ou
“biodemas”, de acordo com seu comportamento. Assim, diferentes cepas de
Trypanosoma cruzi tem sido divididas em três tipos de acordo com uma descrição
padrão baseada na morfologia do parasita no sangue periférico, e na virulência e
patogenicidade, refletidas no grau de mortalidade e lesões tissulares (ANDRADE,
1985; ANDRADE e MAGALHÃES, 1997).
Características morfológicas, imunológicas e comportamentais de
Trypanosoma cruzi, embora confirmem variação intra-específica, não são capazes
de produzir uma base satisfatória para identificação de cepas (MILES et al., 1980). A
diversidade biológica do protozoário tem sido também explorada com marcadores
bioquímicos, tais como isoenzimas ou fragmentos do DNA do cinetoplasto. Esses
estudos levaram a conceitos como “zimodema” que é definido como um conjunto de
isolados que compartilham o mesmo perfil isoenzimático e "esquizodema" que é um
grupo de isolados que exibem o mesmo padrão de tamanho de fragmentos do DNA
do cinetoplasto, quando este é digerido por enzimas de restrição (TIBAYRENC e
BRENIERE, 1988).
Diferenças isoenzimáticas entre isolados de Trypanosoma cruzi foram
inicialmente demonstradas por Toyé (1974) usando aspartato e alanina
aminotransferases.
Estudos iniciais de um pequeno número de loci revelaram uma discreta
variabilidade isoenzimática e estabeleceram três ou quatro grupos principais de
zimodemas de Trypanosoma cruzi (MILES et al., 1980; ROMANHA et al., 1979).
Estudos subsequentes usando quinze loci de isoenzimas permitiram a identificação
de pelo menos quarenta e três cepas distintas que não puderam ser agrupadas em
poucos grupos (MACEDO e PENA, 1998). Muitos desses diferentes genótipos
parecem ser excepcionais, já que eles foram identificados somente uma ou poucas
vezes. Pelo contrário, um limitado número deles que foram chamados de “clones
27
principais” são repetidamente isolados em locais geograficamente distintos e em
vários hospedeiros. Dos quarenta e três genótipos, quatro poderiam representar
esses ubiqüitários “clones principais” (TIBAYRENC e BRENIERE, 1988).
Heterogeneidade pronunciada foi confirmada pelo uso de isoenzimas como
marcadores genéticos, em isolados de Trypanosoma cruzi do Brasil, Venezuela e
Bolívia. Três principais zimodemas (Z1, Z2 e Z3) foram descritos com diferentes
distribuição e associação hospedeiro-vetor e sua distribuição geográfica pode estar
associada às diversas síndromes clínicas da doença de Chagas (MILES et al.,
1984).
Estudos gerais da zoonose no Brasil sugeriram que as localidades poderiam
ser classificadas, epidemiologicamente, como tendo ciclos de transmissão silvestres
e domésticos separados, sobrepostos ou transmissão enzoótica raramente
envolvendo o homem ( MILES et al., 1980).
Caracterização de isolados brasileiros de Trypanosoma cruzi por eletroforese
de seis isoenzimas (malato-desidrogenase, glicose-6-fosfato-desidrogenase,
aspartato-aminotransferase, alanina-aminotransferase, fosfoglucomutase e
glucosefosfato-isomerase) mostraram uma impressionante correlação entre a
distribuição epidemiológica dos zimodemas e o padrão de transmissão local. Cepas
caracterizadas no zimodema 2 foram isoladas somente no ciclo de transmissão
doméstico, causando doença aguda e crônica no homem e infectando uma
variedade de outros animais domésticos. Cepas caracterizadas no zimodema 1 e,
menos comumente, no zimodema 3, foram predominantemente silvestres, isoladas
de uma grande variedade de mamíferos e vetores, mas, quando introduzidas nas
casas foram capazes de causar doença aguda e, talvez crônica, no homem. Dessa
forma, conclui-se que há pelo menos três formas distintas de Trypanosoma cruzi
infectando o homem no Brasil, e que marcadores isoenzimáticos estáveis podem
estar correlacionados com características biológicas e com a enigmática distribuição
da doença humana (MILES et al., 1978).
Os diferentes zimodemas observados entre as cepas estão associados a
biodemas ou tipos específicos. Assim Tipo II corresponde ao zimodema 2 (Z2), Tipo
III corresponde ao zimodema 1 (Z1) e Tipo I é designada como uma variante de Z2
(ANDRADE e MAGALHÃES, 1997).
Em relação ao DNA, o primeiro avanço observado na variabilidade genética
em Trypanosoma cruzi foi a descoberta do polimorfismo no tamanho dos fragmentos
28
de restrição do DNA do cinetoplasto (kDNA). Em Trypanosoma cruzi o kDNA é
composto por dois tipos de moléculas que diferem em tamanho e função e são
denominadas de maxicírculos e minicírculos. Os minicírculos possuem quatro
regiões de 120 a 160 pares de bases (pb) bastante conservados entre si. Essas
regiões contém a origem de replicação do DNA e são também conservadas entre
diferentes isolados e cepas de Trypanosoma cruzi. As regiões variáveis têm cerca
de 280 a 320 pb. A variabilidade existente entre minicírculos pode ser detectada
digerindo-se o kDNA com enzimas de restrição, e tem sido de grande utilidade em
estudos taxonômicos. Diferenças encontradas nos pontos de restrição permitem o
agrupamento de cepas e isolados de Trypanosoma cruzi em grandes grupos
denominados esquizodemas. O protocolo padrão requer o isolamento de kDNA de
10
8
a 10
9
células, o que tem limitado seu uso (MACEDO e PENA, 1998; MOREL et
al., 1980). Embora considerados marcadores estáveis, a alta heterogeneidade de
algumas cepas pode levar à observação de perfis diferentes quando essas cepas
são mantidas em animais de laboratório ou em culturas in vitro, já que essas
condições podem favorecer a seleção de sub-populações do parasita (DEVERA et
al., 2003).
A identidade genética de cepas pode ser caracterizada também pela
exploração da variabilidade do DNA nuclear através da técnica do DNA fingerprinting
(MACEDO e PENA, 1998).
Jeffreys et al. (1985) foram os primeiros pesquisadores a demonstrar a
existência de um novo componente do genoma de seres eucariotas, os
minissatélites, que são compostos de pequenas seqüências de DNA arranjadas em
tandem e dispersas em um grande número de loci no genoma. Esses minissatélites
são hipervariáveis devido ao grande polimorfismo no número de repetições em
tandem entre indivíduos de uma mesma espécie. Sondas de DNA desenvolvidas
para hibridar com regiões hipervariáveis de minissatélites em humanos dão um perfil
específico individual em muitos organismos.
A aplicação da técnica do DNA fingerprinting ao Trypanosoma cruzi fornece
aproximadamente o mesmo nível de discriminação de cepas e clones da análise do
esquizodema, apresentando a vantagem de maior simplicidade operacional e uma
mais alta estabilidade com relação às condições de manutenção das cepas em
laboratório, ao estágio de desenvolvimento do protozoário, ao tempo de cultura e ao
método de isolamento do parasita. O protocolo requer também quantidades
29
consideráveis do DNA do parasita para análise (MACEDO et al., 1992; MACEDO e
PENA, 1998).
Uma técnica mais sensível do que o DNA fingerprinting é baseada na
amplificação de fragmentos do DNA usando primers aleatórios – Randomly Amplified
Polymorphic DNA (RAPD), já que somente 0,1 a 1 ng de DNA total do parasita,
obtido de menos de 10
6
células, são necessários para realização da técnica.
Entretanto, essa técnica não é capaz da mesma resolução genética da análise do
esquizodema ou do DNA fingerprinting (STEINDEL et al., 1993; MACEDO e PENA,
1998).
O perfil de RAPD foi usado para corroborar a divisão de Trypanosoma cruzi
em duas linhagens principais baseada na análise do gene que codifica o RNA
ribossomal (rDNA) e o gene de mini-exon (SOUTO et al., 1996).
Os RNAs mensageiros em tripanosomatídeos apresentam na extremidade 5’
uma seqüência extremamente conservada de 39 nucleotídeos, denominada de
seqüência líder (SL). Essa SL é codificada em blocos de unidades transcricionais
repetidas em tandem que aparentemente são transcritas em pequenos transcritos
primários contendo a SL na extremidade 5’ (mini-exon). Tem sido observado que o
tamanho e a estrutura geral, mas não a seqüência específica do gene da SL são
altamente conservados entre diferentes cepas de Trypanosoma cruzi (McCARTHY-
BURKE et al., 1989).
A composição do alinhamento das seqüências repetidas do mini-exon de
diferentes cepas de Trypanosoma cruzi mostram a presença de dois grupos
discretos de seqüências com exons de 39 pb idênticos e íntrons com 73 pb similares
(mais de 98% de identidade), mas com regiões intergênicas divergentes (menos do
que 59% de similaridade). Usando um pool de três oligonucleotídeos (dois deles
específicos para cada grupo de mini-exon e um comum a ambos os grupos) foi
possível agrupar cepas de Trypanosoma cruzi em dois grupos de acordo com os
produtos de amplificação. Cepas que produzem fragmentos com 300 pb foram
designadas como pertencentes ao grupo 1 e aquelas que produzem fragmentos com
350 pb pertencem ao grupo 2 (SOUTO et al., 1996).
A subunidade maior do ribossoma de Trypanosoma cruzi contém dois RNAs
de alto peso molecular (24Sα e 24Sβ) e seis RNAs de baixo peso molecular (S1-S6).
A comparação entre genes que codificam o rRNA 24Sα de Trypanosoma cruzi e
30
outros tripanosomatídeos mostram alta homologia, exceto para regiões discretas. O
domínio mais divergente (D7) é um segmento de cerca de 100 pb localizado na
extremidade 3’. Um dimorfismo foi observado quando DNAs de diferentes cepas de
Trypanosoma cruzi foram amplificados com primers específicos. Um grupo de cepas
gera produtos com 125 pb e são designadas como pertencentes ao grupo 1 e um
outro grupo gera produtos com 110 pb e são designadas como pertencentes ao
grupo 2. Um terceiro grupo de cepas gera ambos os produtos, sugerindo evento de
transferência genética do grupo 2 ao grupo 1, e são designados como grupo 1/2
(SOUTO et al., 1996).
Assim, a análise de famílias multigênicas, como as do gene do mini-exon e
do rRNA revelam um claro dimorfismo entre cepas de Trypanosoma cruzi, que
correspondem aos dois principais zimodemas propostos por Miles et al. (1980).
Cepas pertencentes ao grupo 2 correspondem ao zimodema 1 (Z1) e cepas
pertencentes ao grupo 1 correspondem ao zimodema 2 (Z2).
Com base nessa dicotomia, cepas de Trypanosoma cruzi são agora
classificadas em dois grupos denominados T.cruzi I e T.cruzi II, denominação
surgida de um consenso entre especialistas, que propuseram a unificação de várias
classificações baseadas em diferentes marcadores (SATELLITE MEETING, 1999).
A posição dos parasitas pertencentes ao zimodema 3 (Z3) foi estudada com o
uso do gene de mini-exon, e a conclusão mais importante foi que este constitui uma
sub-linhagem de T.cruzi I, coerente com observações epidemiológicas, nas quais
estes dois grupos de parasitas compartilham as mesmas áreas geográficas, e com
as conclusões de Miles et al. (1981) baseadas em eletroforese de enzimas que
revelam que embora sejam diferentes, eles estão estreitamente relacionados. A
posição do Z3 permanece sob debate, uma vez que outros autores utilizando
distintos alvos gênicos posicionam Z3 mais próximo de T.cruzi II (MARIN, 2003).
Recentemente, Fernandes et al. (2001), desenvolveram um “PCR multiplex”,
baseado no espaçador não transcrito do gene de mini-exon, que permite identificar
se um isolado pertence aos grupos I e II e também ao grupo correspondente ao
zimodema 3.
Apesar destes estudos permitirem um agrupamento em dois grandes grupos,
existe uma diversidade enorme nas populações de Trypanosoma cruzi, que poderia
explicar a variedade de formas da doença e a diferença nos tropismos dos diferentes
clones (MARIN, 2003).
31
Para o estudo desse polimorfismo, também se tem realizado diferentes
análises de regiões do genoma os quais podem, num futuro próximo, ajudar na
solução desse intrincado quebra-cabeça. Vago et al. (1996) estudaram a
heterogeneidade da região variável do kDNA utilizando LSSP-PCR (low-stringency
single specific primer-polimerase chain reaction). Oliveira et al. (1998) realizaram um
estudo filogenético com a amplificação do DNA de Trypanosoma cruzi, utilizando
primers desenhados a partir de oito loci de micro-satélites. Outro marcador que vem
sendo empregado nesse sentido é a análise dos fragmentos de restrição do gene
ribossômico, mais precisamente os espaçadores internos transcritos (ITS-RFLP) que
flanqueiam a região codificadora para a sub-unidade 5,8S. Esses estudos sinalizam
que as diferentes populações de Trypanosma cruzi podem ser agrupadas nos dois
grandes grupos, apesar de exibirem alto grau de polimorfismo intragrupo
(FERNANDES et al. 1999; CUERVO et al., 2002).
Pelos dados expostos acima conclui-se que a diversidade morfológica e
comportamental de Trypanosoma cruzi foi reconhecida logo após a descrição da
doença por Carlos Chagas em 1909. Desde então, uma grande variedade de
técnicas bioquímicas e moleculares revelaram uma grande diversidade genética em
diferentes cepas do parasita. Diferentes pesquisadores têm descrito essa
diversidade usando vários termos. A correlação entre essa diversidade e as
complexas manifestações clínicas e epidemiológicas da doença tem sido dificultada
pela falta de uma nomenclatura comum.
Atualmente, cada isolado de Trypanosoma cruzi é considerado uma “cepa” e
é designado de acordo com a sua procedência pelo nome do paciente ou do animal
do qual foi isolado, com o nome do pesquisador que a isolou ou do laboratório de
origem.
Dessa forma, surgiu a necessidade de se estabelecer critérios que permitissem
o agrupamento das amostras de acordo com caracteres pré-estabelecidos, de modo
a facilitar o entendimento do comportamento desse protozoário. Assim um grupo de
especialistas reunidos durante o Simpósio Internacional para comemoração do 90º
aniversário da descoberta da doença de Chagas, realizado no Rio de Janeiro em
1999, estabeleceram alguns parâmetros para o agrupamento das diferentes cepas.
A caracterização das diferentes cepas existentes em uma determinada área
geográfica é crucial para o estudo do papel da diversidade do parasita na
patogênese local da doença de Chagas. É provável que o predomínio de um dado
32
tipo de cepa em uma determinada área esteja relacionado com as principais
manifestações da doença naquela área.
Considerando os vários aspectos da infecção por Trypanosoma cruzi, a
presença do mesmo padrão biológico e bioquímico de cepa em uma área endêmica
poderia ser importante, não somente para observação do tipo predominante de
manifestações clínicas e envolvimento de órgãos, mas também em relação à
resposta à quimioterapia, já que se sabe que cepas de diferentes biodemas mostram
suscetibilidade diferente às drogas disponíveis para tratamento da doença
(ANDRADE, 1985).
O comportamento biológico, os padrões isoenzimáticos e o quadro patológico
observados no animal experimental podem se constituir em importantes elementos
para o estabelecimento de correlações entre as cepas do parasita e as
manifestações clínico-patológicas da doença de Chagas em diferentes áreas
geográficas.
Portanto, pretende-se com este estudo contribuir para a caracterização de
quatro cepas do protozoário isoladas de pacientes chagásicos crônicos residentes
na região de Araraquara-SP, já que a sistematização do estudo de “cepas” é
importante para que se possa estudar a relação existente entre diferentes cepas e
diferentes manifestações da doença em diversas áreas geográficas, ou em
diferentes pacientes numa mesma área.
33
2- OBJETIVOS
2.1- Objetivo Geral:
Caracterizar quatro cepas de Trypanosoma cruzi isoladas de pacientes
humanos, sob os aspectos biológico e molecular.
2.2- Objetivos Específicos
:
2.2.1- Caracterização biológica
:
A caracterização biológica avaliará os seguintes parâmetros: evolução do
parasita, período pré-patente, curvas de parasitemia, morfologia do parasita no
sangue periférico, tropismo tissular, lesões histopatológicas e taxa de mortalidade,
com o intuito de classificar as quatro cepas nos biodemas I, II ou III.
2.2.2 – Caracterização molecular:
A caracterização molecular visará a detecção de seqüências gênicas do
espaçador não transcrito do gene de mini-exon de Trypanosoma cruzi, que permite a
classificação das cepas em três grupos: T.cruzi I (TC I), T.cruzi II (TC II) e T.cruzi Z3
(TC Z3).
34
3- MATERIAL E MÉTODOS
Foram caracterizadas dentro de parâmetros biológicos e moleculares quatro
cepas de Trypanosoma cruzi, designadas AMJM, BFS, NBR e NCS, que foram
isoladas em 1986 de pacientes adultos originários de vários estados brasileiros,
residentes na região de Araraquara – SP, portadores de cardiopatia chagásica
crônica, comprovada clínica e sorológicamente (BUAINAIN et al., 1987). Essas
cepas foram isoladas por xenodiagnóstico no Laboratório de Parasitologia da
UNESP – Araraquara, e estão sendo mantidas em laboratório por meio de
passagens sucessivas em camundongos.
3.1- Caracterização Biológica
:
Formas tripomastigotas sangüíneas das cepas em estudo foram obtidas de
camundongos previamente infectados. Esses camundongos foram anestesiados
com 50 mg/kg de Thionembutal
(ABBOTT) e o sangue foi coletado por punção
cardíaca.
Para esse estudo foram utilizados camundongos Swiss não isogênicos,
machos, pesando 10 a 12 g. Para o estudo do comportamento da infecção foram
destinados lotes com 7 camundongos para cada cepa e para o estudo
histopatológico foram utilizados lotes com 21 camundongos para cada cepa
estudada. Os camundongos foram inoculados intraperitonealmente com sangue
citratado. O inóculo foi de aproximadamente 5 x 10
3
formas tripomastigotas
sangüíneas para as cepas AMJM, BFS e NCS e 2 x 10
3
formas parasitárias para a
cepa NBR. Os camundongos foram fornecidos pelo Biotério Central da Universidade
do Oeste Paulista – UNOESTE, Presidente Prudente – SP.
Para caracterização das cepas de Trypanosoma cruzi em estudo foram
analisados os seguintes parâmetros: período pré-patente, curvas parasitêmicas, taxa
35
de mortalidade, morfologia dos parasitas no sangue periférico e estudo
histopatológico.
Grupos de 10 camundongos de mesmo peso e idade, não infectados,
mantidos nas mesmas condições dos grupos em estudo, foram utilizados como
controle.
A caracterização biológica foi realizada nos laboratórios de Parasitologia
Clínica e Imunologia Básica da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE,
Presidente Prudente – SP.
3.1.1- Período pré-patente e curvas parasitêmicas
:
O período pré-patente e as curvas parasitêmicas foram determinados pela
pesquisa de formas tripomastigotas na corrente sangüínea de sete camundongos
infectados. A pesquisa foi feita diariamente a partir do 2º dia de infecção até a
observação ao microscópio dos parasitas e, em seguida, a intervalos de 2 dias, com
término da observação no 60º dia.
A contagem dos tripomastigotas sangüíneos foi feita como descrito por Brener
(1962). Para isso, coloca-se 5 µL de sangue colhido da cauda de cada camundongo
entre lâmina e lamínula de 22x22 mm. Faz-se então a contagem do número de
formas tripomastigotas em 100 campos microscópicos com aumento de 400 vezes.
O número obtido é então multiplicado por uma constante que depende do
microscópio, da ocular e da objetiva utilizados. Para obtenção da constante referida
utilizou-se o método descrito por Martins (1999).
Neste estudo foi utilizado microscópio NIKON YS2-T, com objetiva de 40
vezes e ocular de 10 vezes. Nesse referido aumento, a lamínula de 22x22 mm
possui 47 campos microscópicos em cada lado, perfazendo um total de 2209
campos em sua área, não considerando os intercampos. Para se chegar ao valor da
área dos intercampos, foi calculada a área dos campos contidos (2209) e subtraído
da área total da lamínula (484 mm
2
).
A área dos 2209 campos foi calculada dividindo-se 22 mm por 47, chegando-
se ao diâmetro (0,468 mm) e, consequentemente ao raio que cada campo ocupa na
lamínula (R= 0,234 mm) e, assim à área de cada campo (A= 0,172 mm
2
). Ao
36
nº de tripomastigotas em 100 campos x 2814N =
100
multiplicar-se a área de cada campo por 2209, obtém-se a área total dos campos
(379,95 mm
2
), que subtraindo-se da área total da lamínula, fornece o valor dos
intercampos (104,05 mm
2
), que representou 27,38% da área dos campos. A partir
desses cálculos conclui-se que na lamínula de 22x22 mm temos um total de 2814
campos.
Assim para obter o número de formas tripomastigotas em 5 µL de sangue,
utilizou-se a seguinte fórmula:
Onde N = número de formas tripomastigotas em 5 µL de sangue.
Assim, a constante para o microscópio utilizado, com objetiva de 40 vezes e
ocular de 10 vezes é = 28,14.
Foi estabelecida uma média aritmética do número das formas sangüíneas
observadas nos sete camundongos em cada dia de contagem e traçada uma curva
parasitêmica.
Esta metodologia foi repetida, para cada cepa em estudo, em três grupos de
sete camundongos.
No presente estudo, a caracterização do grau de parasitemia foi feita de
acordo com Devera et al., (2002). Assim, cepa de elevada parasitemia é aquela que
apresenta picos médios maiores que 1500 parasitas por 5 µL de sangue;
parasitemia média quando são observados picos entre 500 e 1499 tripomastigotas
por 5 µL de sangue e baixa parasitemia quando os picos são inferiores a 500 formas
sangüíneas por 5 µL de sangue.
37
3.1.2 – Taxa de mortalidade:
Foi feita diariamente a observação do número de animais que morriam
durante o curso da infecção, fazendo-se a porcentagem em relação ao número total
de infectados, após exclusão dos mortos para o estudo histopatológico.
3.1.3 – Morfologia dos parasitas no sangue periférico
:
A morfologia das formas parasitárias sangüíneas foi estabelecida em
esfregaços realizados em intervalos de quatro dias durante a fase aguda da
infecção. Para cada dia, dois ou três animais infectados foram selecionados ao
acaso. Com sangue coletado da cauda do animal foram confeccionados esfregaços
que, após secagem e fixação pelo metanol foram corados por Giemsa (De CARLI,
2001) e observados ao microscópio com aumento de 1000 vezes. Foram procurados
50 parasitas por lâmina ou lido todo o esfregaço nos casos de parasitemia baixa.
As formas tripomastigotas foram capturadas e mensuradas. A análise
morfométrica foi realizada por um sistema computadorizado que utiliza o software
IMAGELAB 2000. Os seguintes parâmetros foram analisados: comprimento do
flagelo, comprimento do corpo, comprimento total e largura do corpo.
Os critérios descritos por Brener e Chiari (1963), foram usados para se
caracterizar as formas delgadas, largas e muito largas do parasita.
3.1.4 – Estudo histopatológico:
Para o estudo histopatológico foram mortos, para cada cepa em estudo, 21
animais infectados, sendo 3 em cada um dos seguintes dias de infecção: 7º, 10º,
14º, 20º e 30º dias para o estudo da fase aguda e 150º e 180º dias para o estudo da
fase crônica. Dos animais mortos foram retirados fragmentos dos seguintes órgãos:
coração, músculos esqueléticos (músculos abdominais), intestino grosso, fígado e
baço. Esses fragmentos foram mantidos em formol a 10% por dez dias. Após
lavagem das peças por 12 horas em água corrente, elas foram submetidas aos
38
processos de desidratação e diafanização para inclusão em parafina. Secções de 5
µm de cada peça foram cortadas em micrótomo, estendidas em lâmina e coradas
por hematoxilina-eosina, segundo a técnica de Ramos modificada por Nai et al.
(2004).
Os cortes foram examinados ao microscópio em toda a sua extensão,
determinando-se a presença do parasita (parasitismo tecidual) e de reações
inflamatórias.
3.1.5- Classificação das cepas
:
Com base nos dados obtidos as cepas foram classificadas segundo Andrade
(1974, 1985) em três tipos biológicos ou biodemas: I,II ou III.
Tipo I – cepas com multiplicação rápida, com picos parasitêmicos muito
elevados, máximo de parasitemia e mortalidade ocorrendo do 7º ao 12º dias de
infecção, predomínio de formas delgadas na fase inicial da infecção e
macrofagotropismo; predomínio de formas largas e miotropismo na infecção
avançada.
Tipo II – cepas com multiplicação relativamente lenta, com picos
parasitêmicos irregulares entre o 12º e 20º dias de infecção, virulência muito variável
com mortalidade média entre 20 e 25 dias, predomínio de formas largas, com uma
baixa porcentagem de formas delgadas na fase inicial da infecção, miotropismo com
envolvimento predominante do miocárdio.
Tipo III – cepas com baixa multiplicação, a parasitemia evolui lentamente,
atingindo níveis elevados entre 20 e 30 dias de infecção, baixo grau de mortalidade,
predomínio de formas largas durante todo o curso da infecção e miotropismo com
envolvimento predominante de músculos esqueléticos.
39
3.1.6- Análise estatística dos dados:
Os valores médios obtidos para cada dia de observação da parasitemia, nos
sete camundongos infectados de cada grupo, os valores observados no pico da
parasitemia para as três cepas estudadas e os valores observados na análise
micrométrica para os quatro parâmetros analisados foram submetidos à análise de
variância, com auxílio do software GraphPad Prism, versão 3.02, para verificação da
existência de diferenças significativas entre os mesmos, a um nível de significância
de 5%.
3.2- Caracterização Molecular:
Foi utilizada a técnica do “PCR multiplex” descrita por Fernandes et al. (2001).
Parte do espaçador não transcrito do gene de mini-exon foi utilizado como alvo. O
espaçador não transcrito desse gene é composto de 500 pb, dos quais somente 30
pb são necessários para promover atividade. Assim, os outros 470 pb não têm
função definida e, enquanto conservam o mesmo tamanho entre muitos isolados,
têm acumulado múltiplas trocas de bases. A hipervariabilidade do espaçador não
transcrito do gene de mini-exon tem sido um excelente marcador molecular para
definir diferentes espécies de protozoários pertencentes à Ordem Kinetoplastida
(FERNANDES et al., 1999).
Cepas que geram produtos com 200 pb são caracterizadas como
pertencentes ao grupo I; cepas que geram produtos com 250 pb são caracterizadas
como pertencentes ao grupo II e cepas que geram produtos com 150 pb são aquelas
classificadas no zimodema 3 de Miles et al. (1980).
A caracterização molecular foi realizada no Laboratório de Doenças
Parasitárias do Departamento de Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz,
Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro – RJ.
40
3.2.1- Extração do DNA:
Formas epimastigotas foram obtidas pelo crescimento do parasita em meio
LIT (liver infusion tryptose) a 28º C por 3 semanas. Aproximadamente 5 mL da
cultura foi centrifugada a 3000 rpm por 20 minutos a 4º C. O sedimento obtido foi
ressuspenso em PBS (Na
2
HPO
4
10 mM, NaH
2
PO
4
10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) e
centrifugado a 3000 rpm por 10 minutos a 4º C. Esse procedimento foi repetido por
três vezes (ACOSTA et al., 2001).
A lise dos parasitas foi realizada pela adição de 1 mL de uma solução de TE
(10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA) e incubação a 56º C por 2 horas com 100
µg/mL de proteinase K e dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,5% de concentração
final.
A amostra foi separada em 2 tubos Eppendorf
®
sendo adicionado a cada tubo
igual volume de fenol estabilizado. Após centrifugação a 14000 rpm por 3 minutos a
fase aquosa (superior) foi transferida para um novo tubo Eppendorf
®
e foram
realizadas 3 extrações com igual volume de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico
(25:24:1) e 3 extrações com igual volume de clorofórmio. Com uma nova
centrifugação a 14000 rpm por 3 minutos recuperou-se a fase aquosa e, nesta
adicionou-se 2 vezes o volume de etanol absoluto e 10% do volume de acetato de
sódio 3M pH 5,2. A solução foi deixada à temperatura ambiente por 15 minutos e
após nova centrifugação a 14000 rpm por 20 minutos, o sobrenadante foi descartado
e o DNA foi lavado pela adição de 500 µL de álcool etílico a 70%. Após nova
centrifugação a 14000 rpm por 5 minutos o sobrenadante foi desprezado e o DNA foi
ressuspenso em 50 µL de TE.
3.2.2 – Reação em cadeia da polimerase (PCR
):
Para obter a amplificação de parte do espaçador não transcrito do gene de
mini-exon foram utilizados como primers um pool de 5 oligonucleotídeos: 5’-
ACACTTTCTGTGGCGCTGATCG-3’ (TC1 - específico para o grupo I); 5’-
TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT–3’ (TC2 - específico para o grupo II); 5’-
CCGCGWACAACCCCTMATAAAAATG–3’ (TC3 - específico para Z3); 5’-
41
CCTATTGTGATCCCCATCTTCG –3’ (TR - específico para Trypanosoma rangeli) e
5’- TACCAATATAGTACAGAAACTG – 3’ (ME - comum a todos os grupos) (Figura
1).
A reação continha 100 pmol de cada primer, 100 µM de cada
deoxinucleotídeo na seguinte solução: Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM MgCl
2
, 25 mM KCl,
0,1 mg/mL de soroalbumina bovina e 2,5 Unidades de Amplitaq Gold
TM
DNA
Polimerase (Celtes, Perkin Elmer). Aproximadamente 10 ng de DNA genômico foram
adicionados a essa mistura que foi levada a um volume final de 50 µL com água Milli
Q.
O processo de amplificação foi realizado em termociclador GeneAmp PCR
System 9600, Perkin Elmer
®
. O perfil térmico consistiu de 95ºC por 1 minuto para
ativação da enzima e 35 ciclos, incluindo denaturação a 94ºC (30 segundos),
anelamento a 55ºC (30 segundos) e extensão a 72ºC (30 segundos), com uma
extensão final durante 10 minutos a 72ºC.
Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose
a 2,5% em TBE 1X (0,09 M Tris-Borato, pH 8,0 e 0,002 M EDTA pH 8,0), corados
T.cruzi II – 250 pb
T.cruzi I – 200 pb
T.cruzi Z3 – 150 pb
T.ran
g
eli – 100
p
b
FIGURA 1- Esquema de amplificação mostrando os sítios de anelamento dos
primers (setas) e o tamanho dos produtos de amplificação dos genes de mini-
exon de T.cruzi I, T.cruzi II, T.cruzi Z3 e T.rangeli. (Figura adaptada de
Fernandes et al., 2001).
42
com brometo de etídio (0,5 µg/mL), visualizados sob luz ultravioleta e fotografados
com câmara Polaroid
®
Os dados obtidos foram analisados e as amostras foram caracterizadas nos
grupos I, II ou Z 3.
43
4- RESULTADOS
4.1- Caracterização Biológica:
4.1.1- Período pré-patente e curvas parasitêmicas
:
Foram analisados os dados obtidos com três grupos de sete camundongos
infectados com as cepas em estudo: AMJM, BFS, NBR e NCS.
A parasitemia da cepa NBR foi sub-patente durante todo o curso da infecção,
impossibilitando a determinação do período pré-patente e a elaboração da curva
parasitêmica.
Considerando-se individualmente a parasitemia em camundongos de um
mesmo grupo, observa-se uma grande variabilidade no número de formas
parasitárias sangüíneas desses animais, nas três cepas estudadas (Figuras 2, 3 e
4). Essa mesma variabilidade pode ser observada quando se comparam as
parasitemias médias em diferentes grupos. O comportamento de cada cepa nos
diferentes grupos de camundongos manteve-se relativamente constante,
observando-se uma ascensão lenta e regular da parasitemia até atingir um pico e
depois queda também regular até desaparecimento dos parasitas do sangue
periférico (Figura 5).
Quando comparamos as médias obtidas nos diferentes dias de observação
da parasitemia, nos sete camundongos inoculados, nos três grupos estudados,
observamos que, para um nível de significância de 5% não foram observadas
diferenças estatisticamente significativas.
A figura 6 mostra a evolução da parasitemia nos três grupos de camundongos
infectados, para as três cepas de Trypanosoma cruzi estudadas: AMJM, BFS e NCS.
Quando os valores observados no pico da parasitemia foram comparados, observou-
44
se diferenças estatísticamente significativas a um nível de significância de 5%, entre
as cepas AMJM e NCS e entre as cepas BFS e NCS. Para esse nível de
significância não foram observadas diferenças entre as cepas AMJM e BFS.
O período pré-patente variou de 5 a 9 dias para a cepa AMJM, 7 a 9 dias para
a cepa BFS e de 5 a 8 dias para a cepa NCS. Os níveis parasitêmicos foram baixos
com picos médios variando de 237 a 330 formas tripomastigotas/5 µL de sangue
para a cepa AMJM, 265 a 281 formas tripomastigotas/5 µL de sangue para a cepa
BFS e 406 a 523 formas tripomastigotas/5 µL de sangue para a cepa NCS. Esses
picos ocorreram entre os dias 18 e 21 para a cepa AMJM, 19 e 22 para a cepa BFS
e 18 e 23 para a cepa NCS ( Tabela 1).
A duração da fase aguda da infecção variou de 38 a 43 dias para a cepa
AMJM, 39 a 43 dias para a cepa BFS e 37 a 43 dias para a cepa NCS (Tabela 1).
Todos os camundongos infectados com as quatro cepas em estudo
sobreviveram e evoluíram para a fase crônica.
45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
13579111315171921232527293133353739414345
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
13579111315171921232527293133353739414345
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
50
100
150
200
250
300
350
400
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
(
A
)
(B)
(C)
FIGURA 2- Variabilidade individual de parasitemia em três grupos de camundongos
Swiss infectados com a cepa AMJM de Trypanosoma cruzi. (A) = grupo 1; (B) = grupo 2;
(C) = grupo 3; C 1-7 = camundongos 1-7.
46
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS / 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
1 3 5 7 9 111315171921232527293133353739414345
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
13579111315171921232527293133353739414345
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
FIGURA 3- Variabilidade individual de parasitemia em três grupos de camundongos Swiss
infectados com a cepa BFS de Trypanosoma cruzi. (A) = grupo 1; (B) = grupo 2; (C) =
grupo 3; C 1-7 = camundongos 1-7.
(
A
)
(B)
(C)
47
0
100
200
300
400
500
600
700
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
100
200
300
400
500
600
700
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
DIAS DE INFECÇÃO
FROMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
0
100
200
300
400
500
600
1 3 5 7 9 111315171921232527293133353739414345
DIAS DE INFECÇÃO
FORMAS TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
C 1
C 2
C 3
C 4
C 5
C 6
C 7
(A)
(B)
(C)
FIGURA 4- Variabilidade individual de parasitemia em três grupos de
camundongos Swiss infectados com a cepa NCS de Trypanosoma cruzi. (A) =
grupo 1; (B) = grupo 2; (C) = grupo 3; C 1-7 = camundongos 1-7.
48
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS / 5 uL SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
(A)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
50
100
150
200
250
300
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS / 5uL DE SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
(B)
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
100
200
300
400
500
600
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS/ 5 uL DE SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
GRUPO 1
GRUPO 2
GRUPO 3
(C)
FIGURA 5- Variabilidade da parasitemia média em três diferentes grupos de camundongos
Swiss infectados com três cepas de Trypanosoma cruzi. (A) = cepa AMJM; (B) = cepa BFS;
(C) = cepa NCS.
(A)
(B)
(C)
49
FIGURA 6- Parasitemia média em camundongos Swiss infectados com três
diferentes cepas de Trypanosoma cruzi, isoladas em Araraquara – SP de
pacientes chagásicos crônicos. (A) = Grupo 1; (B) = Grupo 2; (C) = Grupo 3.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS/5uL DE SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
AMJM
BFS
NCS
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS/5uL DE SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
AMJM
BFS
NCS
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
MÉDIA DE TRIPOMASTIGOTAS/5 uL DE SANGUE
DIAS DE INFECÇÃO
AMJM
BFS
NCS
(A)
(B)
(C)
50
TABELA 1- Características biológicas de quatro cepas de Trypanosoma cruzi
isoladas em Araraquara - SP de pacientes chagásicos crônicos.
Pico de parasitemia
Cepa Grupo de
camundongo
PPP
(dias)
nº/100 campos
(1)
nº/5 µL
(2)
dias
Duração
da fase
aguda
(dias)
AMJM 1º 5 8 237 21 39
2º 9 12 330 21 43
3º 6 10 285 18 38
BFS 1º 8 10 281 22 42
2º 7 9 265 21 39
3º 9 10 281 19 43
NCS 1º 5 14 406 19 37
2º 8 19 523 18 40
3º 7 16 438 23 43
NBR 1º ND SP SP ND ND
2º ND SP SP ND ND
3º ND SP SP ND ND
(1) média do número de formas tripomastigotas/100 campos microscópicos com
aumento de 400x; (2) média do número de formas tripomastigotas/5µL de sangue de
sete camundongos infectados; PPP = período pré-patente; ND = não determinado;
SP = sub-patente.
51
4.1.2- Taxa de mortalidade:
Nenhuma cepa foi capaz de produzir mortalidade nos camundongos
infectados até o 180º após a infecção.
4.1.3- Morfologia dos tripomastigotas sangüíneos
:
Foram analisadas apenas as cepas AMJM, BFS e NCS uma vez que a cepa
NBR apresentou parasitemia sub-patente, impossibilitando a análise morfológica das
formas sangüíneas.
Em todas as cepas estudadas foram observadas apenas formas sangüíneas
largas durante todo o curso da infecção. Essas formas apresentam cinetoplasto
terminal, núcleo arredondado e central ( Figura 7).
Os valores médios da micrometria realizada em trinta formas tripomastigotas
sangüíneas, para as cepas que apresentaram parasitemia patente, podem ser
observados na Tabela 2.
Quando os valores observados na análise micrométrica foram comparados,
observou-se que, para um nível de significância de 5%, foram observadas diferenças
estatísticamente significativas para comprimento do flagelo, comprimento do corpo e
comprimento total entre as cepas AMJM e BFS e entre as cepas AMJM e NCS.
Para esses parâmetros não foram observadas diferenças entre as cepas BFS e
NCS. Para os valores de largura do corpo não foram observadas diferenças
estatísticamente significativas entre as três cepas estudadas.
A caracterização das formas observadas como largas foi feita por meio da
observação visual e comparação com desenhos efetuados por Brener e Chiari
(1963), já que na literatura consultada não há uma definição de valores médios de
comprimento e largura das formas tripomastigotas sangüíneas, que poderiam servir
como base para classificação das diferentes formas em delgadas, largas ou muito
largas (DIAS e FREITAS FILHO, 1943; BRENER e CHIARI, 1963; BRENER, 1969;
BELDA NETO, 1973; SCHLEMPER Jr et al., 1986; De SOUSA, 1999).
52
FIGURA 7- Formas tripomastigotas sangüíneas largas de Trypanosoma cruzi
observadas no sangue periférico de camundongos Swiss infectados. (A) = cepa
AMJM; (B) = cepa BFS; (C) = cepa NCS.
(A)
(A) (A)
(B) (B) (B)
(C) (C) (C)
53
TABELA 2 – Valores médios da micrometria efetuada com 30 formas tripomastigotas
obtidas do sangue periférico de camundongos Swiss infectados com três cepas de
Trypanosoma cruzi isoladas em Araraquara – SP de pacientes chagásicos crônicos.
CEPAParâmetros morfométricos
(*)
AMJM BFS NCS
comprimento do flagelo 7,24 4,48 4,46
comprimento do corpo 12,88 11,15 11,44
comprimento total 20,12 15,63 15,90
largura do corpo 2,14 2,11 2,04
(*) valores em µm
54
4.1.4- Estudo histopatológico:
Parasitismo tecidual foi observado apenas em camundongos infectados pela
cepa NBR na fase crônica e pela cepa AMJM na fase aguda da infecção. As formas
amastigotas foram observadas no músculo cardíaco para as duas cepas citadas.
Observou-se reação inflamatória, variando de discreta a moderada, no músculo
cardíaco para todas as cepas estudadas. Reação inflamatória nos músculos da
parede intestinal foi observada somente nos camundongos infectados com a cepa
BFS. Observou-se reação inflamatória nos músculos esqueléticos dos camundongos
infectados com as cepas AMJM, BFS e NCS. Reação inflamatória no fígado foi
observada para as cepas AMJM e NBR. Não foram observadas reação inflamatória
ou presença de parasitas no baço dos animais infectados ( Tabela 3).
¾ Cepa AMJM – Durante a fase aguda foram observados parasitas e reação
inflamatória moderada no músculo cardíaco e reação inflamatória discreta
nos músculos esqueléticos. Na fase crônica observou-se reação
inflamatória discreta no músculo cardíaco e nos músculos esqueléticos e
moderada no fígado ( Figura 8 ).
¾ Cepa BFS – Foi observada reação inflamatória discreta no músculo
cardíaco e moderada nos músculos da parede intestinal, nos plexos
mioentéricos e nos músculos esqueléticos durante a fase aguda da
infecção e na fase crônica foi observada reação inflamatória discreta no
músculo cardíaco e moderada nas células ganglionares cardíacas. Não
foram observadas formas amastigotas nos tecidos analisados ( Figura 9 ).
¾ Cepa NBR - Observou-se reação inflamatória discreta no músculo
cardíaco e nas células ganglionares cardíacas durante a fase aguda e na
fase crônica foram observados parasitas no músculo cardíaco e reação
inflamatória moderada no fígado (Figura 10).
¾ Cepa NCS – Durante a fase aguda foi observada discreta reação
inflamatória no músculo cardíaco, nas células ganglionares cardíacas e
nos músculos esqueléticos. Na fase crônica foi observada discreta reação
55
inflamatória no músculo cardíaco. Não foi observado parasitismo tecidual
na fase aguda nem na fase crônica da infecção ( Figura 11 ).
56
TABELA 3- Achados histopatológicos em coração, músculos esqueléticos, fígado,
baço e intestino de camundongos infectados com quatro cepas de Trypanosoma
cruzi isoladas em Araraquara – SP de pacientes chagásicos crônicos.
Órgão
coração intestino músculo
esquelético
fígado baço
Cepa Achado histológico
f.a. f.c. f.a. f.c. f.a. f.c. f.a. f.c. f.a. f.c.
Parasitas + - - - - - - - - -AMJM
Inflamação + + - - + + - + - -
Parasitas - - - - - - - - - -BFS
Inflamação + + + - + - - - - -
Parasitas - + - - - - - - - -NBR
Inflamação + - - - - - - + - -
Parasitas - - - - - - - - - -NCS
Inflamação + + - - + - - - - -
f.a. = fase aguda; f.c. = fase crônica; (+) = presença de parasitas ou de inflamação;
(-) = ausência de parasitas ou de inflamação.
57
(A) (B)
(C)
FIGURA 8 – Aspectos histológicos de órgãos de camundongos Swiss infectados com a
cepa AMJM de Trypanosoma cruzi. (A) ninhos de formas amastigota ( ) no músculo
cardíaco, (1000 x), fase aguda; (B) inflamação no músculo esquelético ( ) (100 x),
fase aguda; (C) inflamação no músculo cardíaco ( ) (100 x), fase crônica; (D)
inflamação no fígado ( ) (100 x) fase crônica. Coloração de hematoxilina-eosina.
(C)
a
(D)
(C)
a
(C)
58
(A) (B)
FIGURA 9 – Aspectos histológicos de órgãos de camundongos Swiss infectados com a
cepa BFS de Trypanosoma cruzi. (A) inflamação no músculo cardíaco ( ) (100 x), fase
aguda; (B) inflamação nos músculos da parede intestinal ( ) e nos plexos mioentéricos
( ) (100 x), fase aguda; (C) inflamação nos músculos esqueléticos ( )(100 x), fase
aguda; (D) inflamação no músculo cardíaco ( ) e nas células ganglionares cardíacas
( ) (100 x) fase crônica. Coloração de hematoxilina-eosina.
(C) (D)
59
(B)
FIGURA 10 – Aspectos histológicos de órgãos de camundongos Swiss infectados com a
cepa NBR do Trypanosoma cruzi. (A) inflamação no músculo ( ) e nas células
ganglionares ( ) cardíacas (100 x), fase aguda; (B) inflamação no fígado ( ) (400 x) ,
fase crônica; (C) e (D) ninhos de formas amastigotas ( ) no músculo cardíaco (400 x e
1000 x ). Coloração de hematoxilina-eosina.
(A)
(C) (D)
60
(A)
(B)
(C) (D)
FIGURA 11 – Aspectos histológicos de órgãos de camundongos Swiss infectados com a
cepa NCS do Trypanosoma cruzi. (A) inflamação no músculo ( ) e células ganglionares
( ) cardíacas, fase aguda; (B) inflamação nas células musculares esqueléticas ( ),
fase aguda; (C) inflamação nas células musculares cardíacas ( ), fase crônica; (D)
células musculares cardíacas normais – controle. Coloração de hematoxilina-eosina.
A
umento de 100 x.
61
4.1.5- Classificação das cepas
:
Com base nos dados obtidos:
- baixa parasitemia com picos parasitêmicos médios ocorrendo entre o 18º e
23º dias de infecção
- ausência de mortalidade dos animais infectados
- predomínio de formas tripomastigotas largas durante todo o curso da
infecção
- envolvimento predominante do miocárdio
As cepas AMJM, BFS e NCS podem ser caracterizadas no Tipo ou Biodema
II.
A cepa NBR apresentou parasitemia sub-patente e, segundo De Sousa
(1999), cepas que não apresentam parasitemia patente não podem ser classificadas
de acordo com os critérios de Andrade (1974). Mas, apesar disso, classificamos
essa cepa no Tipo II baseados principalmente no miocardiotropismo, baixa
parasitemia (sub-patente) e ausência de mortalidade dos animais infectados.
62
4.2- Caracterização Molecular
:
As quatro cepas foram caracterizadas por meio da amplificação, pela
metodologia de “PCR multiplex”, de um segmento do espaçador não-transcrito do
gene de mini-exon, sendo que para todas as cepas estudadas foi amplificado um
fragmento com 250 pb, correspondente a T.cruzi II (Figura 11).
FIGURA 12 – Produto da amplificação do gene mini-exon. 1- marcador de peso
molecular ladder 100 DNA
®
; 2- cepa AMJM; 3- cepa NBR; 4- cepa NCS; 5- cepa
BFS; 6- cepa padrão T.cruzi II; 7- cepa padrão T.cruzi I; 8- cepa padrão T.cruzi Z3;
9- T. rangeli; 10- controle negativo.
1
2 3 4 5 6 7
8
9 10
pb
250 pb →
200 pb →
150 pb →
100 pb →
63
4.3- Denominação das Cepas:
De acordo com recomendações do Satellite Meeting (1999), as cepas devem
ser designadas por um código de quatro elementos, que são:
1- a classe do hospedeiro ou vetor do qual a cepa foi isolada, composta de quatro
letras, a primeira identificando a classe à qual o hospedeiro pertence, seguida por
três letras indicando o nome do gênero do hospedeiro
2- o país no qual foi feito o isolamento da cepa, composto por duas letras
3- o ano de isolamento indicado por quatro dígitos
4- a designação atribuída à cepa pelo laboratório onde ela foi isolada, seguida pelo
grupo a que pertence a cepa.
Baseado nessas recomendações, as quatro cepas estudadas seriam assim
designadas:
- MHOM/BR/1986/AMJM (T.cruzi II)
- MHOM/BR/1986/BFS (T.cruzi II)
- MHOM/BR/1986/NBR (T.cruzi II)
- MHOM/BR/1986/NCS (T.cruzi II)
64
5- DISCUSSÃO
Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado muito heterogêneo e sua
população é caracterizada por uma morfologia diversa, um comportamento biológico
heterogêneo, uma alta variabilidade genética e um curso clínico distintamente
diferente (DOST et al., 2002).
Variações intra-específicas nas diferentes cepas de Trypanosoma cruzi
estudadas têm sido demonstradas em nível morfo-biológico, bioquímico e genético
(ANDRADE, 1974; ANDRADE, 1985; MILES et al., 1977; MOREL et al., 1980;
STEINDEL et al., 1993).
Essa heterogeneidade pode ser uma das razões que explique a variabilidade
nas manifestações clínicas da doença de Chagas e as diferenças regionais de sua
morbidade (DEVERA et al., 2002).
Em uma determinada área geográfica, pode estar circulando um ou vários
padrões de cepas ou biodemas de Trypanosoma cruzi, porém, geralmente com
predomínio de um deles (OLIVEIRA et al., 1993).
A presença de um mesmo padrão de cepa de Trypanosoma cruzi em uma
mesma área endêmica pode ser de importância na explicação da ocorrência de
determinados quadros clínico-patológicos da doença de Chagas, peculiares a uma
determinada área geográfica (ANDRADE, 1974).
5.1- Caracterização Biológica
:
O comportamento biológico em animais de laboratório, é um dos parâmetros
usados para caracterização de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi.
Embora a infecção experimental em animais não reproduza fielmente a
infecção humana, o camundongo tem sido amplamente usado para estudar vários
aspectos da infecção. O uso comum desse animal é justificado devido a seu
65
pequeno tamanho, grande disponibilidade, fácil manutenção e simplicidade de
manipulação (ANDRADE, 2000; ARAÚJO-JORGE, 2000).
A grande maioria das caracterizações biológicas de cepas de Trypanosoma
cruzi têm sido conduzidas em camundongos suíços não isogênicos, já que esse
animal pertence a um grupo heterogêneo e, portanto, é considerado o melhor
representante das características da população humana de áreas endêmicas
(DEVERA et al., 2003).
O comportamento biológico de cepas de Trypanosoma cruzi está baseado na
sua virulência e patogenicidade.
Segundo Andrade (1974), o conceito de virulência está ligado à maior ou
menor capacidade de multiplicação do parasita, que é própria para uma determinada
cepa mas que pode variar dentro de certos limites, de acordo com inúmeras
variáveis, podendo assim ser atenuada ou exaltada. A patogenicidade representaria
a capacidade de determinar lesões tissulares que podem levar os animais à morte
em diversas fases da infecção dependendo dos setores atingidos. Nesse conceito, a
patogenicidade seria uma capacidade constante, enquanto a virulência, embora
peculiar a cada cepa, seria flutuante. Essas duas condições em conjunto, seriam os
fatores ligados ao parasita que determinariam o curso da infecção no animal
experimental.
Muitos estudos de caracterização biológica demonstram que cepas de
Trypanosoma cruzi originadas de humanos, reservatórios e vetores de distintas
áreas geográficas mostram diferentes comportamentos no animal experimental
(BADINEZ 1945; DEANE et al., 1963; ANDRADE e MAGALHÃES, 1997).
Esse fenômeno é influenciado por fatores ambientais e imunológicos,
virulência, patogenicidade e possíveis seleção de cepas e clones depois da
interação com vetores e hospedeiros vertebrados. A combinação de vários desses
fatores pode explicar a variabilidade do comportamento biológico do parasita (BICE
e ZELEDÓN, 1970; MAGALHÃES et al., 1996).
66
5.1.1- Evolução da parasitemia:
A primeira referência de que amostras de Trypanosoma cruzi de diferentes
procedências, poderiam se comportar de maneira diversa, foi feita por Brumpt em
1913, quando estudando uma amostra isolada por Chagas e outra procedente da
Bahia, verificou que a primeira apresentava uma virulência exaltada enquanto a
segunda tinha baixa virulência, determinando infecção não letal em cobaias
(ANDRADE, 1974).
Zuccarini em 1930, verificou uma diminuição da virulência das amostras
estudadas, com as passagens em animal, encurtamento do período pré-patente com
as passagens em série, observando que os animais recém nascidos morriam
precocemente em relação aos adultos, e mostrando parasitismo miocárdico com as
diversas amostras (ANDRADE, 1974).
Nesse estudo, as cepas AMJM, BFS e NCS apresentaram parasitemia
patente, enquanto a cepa NBR apresentou parasitemia sub-patente.
O períodos pré-patentes observados para as cepas em estudo que
apresentaram parasitemia patente foram variáveis, oscilando de 5 a 9 dias para a
cepa AMJM, 7 a 9 dias para a cepa BFS e 5 a 8 dias para a cepa NCS (Tabela 1).
Devera et al. (2002) observaram períodos pré-patentes mais curtos para
cepas de elevada parasitemia e maiores para cepas de baixa parasitemia.
Entretanto, Martins et al. (2003) observaram período pré-patente de quatro dias para
a cepa FAMEMA, que apresenta baixa parasitemia.
A relação entre duração do período pré-patente e os níveis de parasitemia
não pôde ser observada em um estudo realizado por Belda Neto em 1973. Ele
observou duas cepas que, apesar de apresentarem períodos pré-patentes idênticos,
apresentaram graus de parasitemia distintos.
Nas três cepas que apresentaram parasitemia patente, a multiplicação foi
relativamente lenta com baixa parasitemia (Figuras 2, 3 e 4). A cepa AMJM
apresentou picos parasitêmicos médios variando de 237 a 330 formas parasitárias/5
µL de sangue; a cepa BFS apresentou picos parasitêmicos médios oscilando entre
265 e 281 formas tripomastigotas/5 µL de sangue e para a cepa NCS os picos
parasitêmicos médios variaram de 406 a 523 formas sangüíneas/5 µL de sangue.
Esses picos parasitêmicos ocorreram entre o 18º e 21º dias após a infecção para a
67
cepa AMJM, 19º e 22º dias de infecção para a cepa BFS e 18º e 23º dias de
infecção para a cepa NCS (Tabela 1).
Cepas de Trypanosoma cruzi de alta, média e baixa virulências, bem como
cepas que não apresentam parasitemia patente em camundongos tem sido isoladas
por vários pesquisadores de pacientes chagásicos crônicos, de reservatórios
silvestres e de vetores (SCHLEMPER Jr et al.,1983; CARNEIRO et al., 1991;
STEINDEL et al., 1993). Em pacientes chagásicos crônicos há uma predominância
de cepas de Trypanosoma cruzi de baixa virulência para camundongos
(FERNANDES et al., 1997)
Em um estudo prévio realizado por Rosa et al. (1987), foi determinada a curva
parasitêmica dessas cepas: a cepa AMJM apresentou pico da parasitemia no 17º dia
de infecção com média de 10 formas tripomastigotas/100 campos; a cepa BFS
apresentou pico da parasitemia no 10º dia de infecção com média de 5 formas
parasitárias/100 campos; o pico da parasitemia para a cepa NBR ocorreu no 18º dia
de infecção com média de 6 formas parasitárias/100 campos e para a cepa NCS o
pico da parasitemia ocorreu no 17º dia de infecção com média de 35 parasitas/100
campos.
Quando comparamos os dados referentes ao número de parasitas por 100
campos microscópicos observados em nosso estudo, 8 a 12 formas parasitárias
para a cepa AMJM, 9 a 10 formas tripomastigotas para a cepa BFS, 14 a 19 formas
parasitárias para a cepa NCS e ausência de parasitemia patente para a cepa NBR
(Tabela 1), observamos que houve diminuição da parasitemia para as cepas NCS e
NBR, aumento da parasitemia para a cepa BFS e manutenção dos níveis
parasitêmicos para a cepa AMJM.
Transformações no comportamento biológico das cepas de Trypanosoma
cruzi podem ocorrer durante a realização de repiques sucessivos em camundongos,
onde as condições de manutenção do laboratório agiriam como meio selecionador
(CARNEIRO et al., 1991). Essas mudanças foram descritas por vários autores e o
aspecto mais freqüentemente observado foi o aumento da virulência (BRENER e
CHIARI, 1963; BRENER et al., 1974: CAMANDAROBA et al, 2001).
A cepa Y, no início de seu isolamento apresentava baixa virulência para
camundongos e, após dois anos de repiques sucessivos para manutenção teve sua
virulência acentuada (SILVA e NUSSENZWEIG, 1953).
68
Pinto et al. (1999) observaram que após quarenta anos de passagens por
camundongos, a cepa Y apresentou uma alteração no seu comportamento com
desaparecimento precoce dos parasitas da circulação e ausência de ninhos de
amastigotas nos tecidos. Os autores questionam se estaria havendo uma perda de
virulência ou uma mutação da cepa Y. Essa cepa, isolada em 1950, apresentava um
ciclo de vida constante e estável e produzia resultados hematológicos e
histopatológicos padronizados, tornando-se ideal para estudos experimentais.
Atenuação da virulência foi observado por Andrade (1974) estudando
dezesseis amostras isoladas de uma mesma área endêmica. Observou ainda que,
em uma mesma passagem, animais que receberam inóculos idênticos também
apresentaram variabilidade da parasitemia.
Martins et al. (2003) observaram diminuição da parasitemia da cepa
FAMEMA, isolada na região de Marília – SP, após três anos de repiques sucessivos
em camundongos.
Preservação da parasitemia foi observado por Campos e Andrade (1996) em
clones e subclones da cepa 21SF após manutenção em laboratório por quinze anos.
Phillips (1960) estudando as cepas WBH e Y observou que, após passagens
sucessivas do parasita com inóculos cada vez menos ricos, havia uma deterioração
da virulência. Por isso, estudamos o comportamento das cepas em três grupos de
camundongos utilizando um inóculo padronizado, já que essas cepas vinham sendo
mantidas há mais de dezesseis anos por repiques não padronizados em
camundongos.
Em nosso estudo, o comportamento das três cepas que apresentaram
parasitemia patente, AMJM, BFS e NCS, permaneceu aproximadamente constante
nos três grupos de camundongos infectados (Figura 5), sugerindo que pode ter
havido uma seleção das formas melhor adaptadas ao hospedeiro vertebrado. Esse
mesmo comportamento foi observado por Carneiro et al. (1991) ao estudar treze
cepas de Trypanosoma cruzi após dezoito meses de manutenção em camundongos.
A importância das condições de manutenção em laboratório como um fator de
seleção de cepas de Trypanosoma cruzi em camundongos submetidos a dupla
infecção foi demonstrada por Deane et al. (1984).
Estudos em populações clonadas demonstraram que cepas de Trypanosoma
cruzi consistem de distintas sub-populações as quais são ou não expressas
69
dependendo das condições de manutenção (MOREL et al., 1980; ARAÚJO e
CHIARI, 1988; DVORAK et al., 1989).
Brener et al. (1974) inocularam três diferentes cepas de Trypanosoma cruzi
em camundongos das linhagens DBA/2 e C57BL/6 que são mais resistentes à
infecção e observaram que, apesar do menor número de parasitas observados
nesses animais, o padrão da infecção foi similar ao observado em camundongos
albinos suscetíveis. Isso sugere que, embora possa ser influenciada pela espécie de
hospedeiro, a parasitemia é marcadamente dependente de peculiaridades da cepa
do parasita.
A cepa NBR apresentou parasitemia sub-patente nas três passagens por
camundongos. No estudo prévio, essa cepa apresentava parasitemia baixa, mas
patente. A diminuição da parasitemia pode estar relacionada com o pequeno
inóculo, já que Andrade (1974) observou que a virulência tinha uma correlação direta
com a idade dos animais infectados e com o número de parasitas inoculados. A
autora observou que os níveis parasitêmicos foram mais elevados e com picos mais
precoces quando os inóculos eram muito elevados. Já Brener e Chiari (1963) não
observaram relação entre o número de tripomastigotas metacíclicos inoculados e os
níveis iniciais de parasitemia. Em algumas ocasiões, após a inoculação de um
grande número de formas infectantes o exame do sangue a fresco foi repetidamente
negativo.
Parasitemia sub-patente foi observada por Lima et al. (1999) em todos os
camundongos infectados pela cepa G-327 e cinco clones derivados da mesma cepa.
Carneiro et al. (1991), estudando treze cepas isoladas de pacientes
chagásicos crônicos, utilizando um inóculo padronizado, verificaram que quatro
cepas apresentavam parasitemia sub-patente, sendo que após oito passagens por
camundongos uma tornou-se patente e três continuaram sub-patente mesmo após
serem inoculadas em camundongos irradiados com radiação gama.
Phillips (1960) procurou correlacionar quantitativamente o inóculo com a
patogenicidade. Verificou que em duas cepas, WBH e Y o curso da infecção e da
mortalidade dependeram diretamente do aumento do número de parasitas no
sangue circulante. Estudando, entretanto a cepa Sonya verificou que a
patogenicidade não dependia diretamente do inóculo, sendo a infecção sempre de
curso prolongado e sempre fatal. Concluiu que devem existir pelo menos duas
formas de infecção por Trypanosoma cruzi a serem consideradas: em uma a
70
intensidade da infecção está positivamente correlacionada com o número de
parasitas inoculados, enquanto que a outra depende da multiplicação e das lesões
tissulares que determinam, independentemente do inóculo.
Hauschka (1949) estudou a estabilidade de comportamento das cepas Brasil
e WBH para o animal experimental em um período de dois anos de observação.
Para esse estudo procurou eliminar ao máximo as variáveis que poderiam influenciar
o comportamento das cepas, utilizando animais geneticamente homogêneos, do
mesmo sexo, com dieta padronizada, infectados em intervalos regulares com
inóculos uniformes e concluiu que as diferenças de virulência observadas entre os
dois grupos foram estáveis e atribuíveis a um padrão fisiológico específico a cada
cepa do parasita. Cada uma manteve o seu próprio máximo de virulência quando
mantida em condições ótimas, em passagens sucessivas.
5.1.2- Morfologia das formas sangüíneas:
A variabilidade morfológica das formas sangüíneas de Trypanosoma cruzi foi
observada por Carlos Chagas em 1909 quando ele, ao descrever a doença,
observou formas delgadas e largas do parasita. Além dessas, outros tipos, como
pequenas, muito largas ou intermediárias podem também ser observadas (De
SOUSA, 1999).
Carlos Chagas considerou o dimorfismo das formas sangüíneas observado
por ele, como sendo a expressão de uma diferenciação sexual. Esse ponto de vista
não é aceito pela maioria dos autores (BRENER e CHIARI, 1963).
Diferentes cepas de Trypanosoma cruzi mostram em camundongos
experimentalmente inoculados, uma predominância relativa de diferentes formas
tripomastigotas sangüíneas: delgadas, largas ou muito largas (BRENER E CHIARI,
1963; BRENER et al., 1974; ANDRADE, 1974).
De acordo com Brener (1969), formas delgadas aparecem na fase inicial da
infecção enquanto formas largas e muito largas aumentam gradualmente durante o
curso da infecção.
Em nosso estudo, nas cepas que apresentaram parasitemia patente foram
observadas apenas formas largas durante todo o curso da infecção (Figura 7). Essas
71
formas apresentaram valores médios de 20,12 µm de comprimento e 2,13 µm de
largura para a cepa AMJM, 15,63 µm de comprimento e 2,11µm de largura para a
cepa BFS e 15,90 µm de comprimento e 2,04 µm de largura para a cepa NCS
(Tabela 2).
Esses resultados estão de acordo com os dados obtidos por Andrade (1974)
que observou que formas delgadas predominam em cepas altamente virulentas e
macrofagotrópicas, enquanto formas largas predominam em cepas menos virulentas
e miotrópicas.
Tripomastigotas sangüíneos dos tipos intermediários e largos tem
predominado na maioria das cepas isoladas de humanos, triatomíneos e mamíferos
silvestres (BRENER E CHIARI, 1963; ANDRADE, 1974).
Para Meyer e Oliveira (1948) o rompimento precoce das células parasitadas
libertaria formas delgadas, ao passo que o prolongamento da permanência dos
parasitas nas células daria origem a formas largas.
De acordo com Andrade (1974), uma multiplicação rápida e precoce sempre
coincide com a presença de formas delgadas e isto corresponde a um parasitismo
das células do sistema mononuclear fagocitário. Provocando-se uma maior
multiplicação parasitária em cepas como a Colombiana, que apresenta
predominância de formas largas durante todo o curso da infecção, pelo uso de
corticóide ou pela reativação por passagens em camundongos recém-nascidos,
observam-se picos precoces de parasitemia que coincidem com o aparecimento de
formas delgadas e de discreto reticulotropismo.
Segundo Brener (1969), quando amostras de sangue com formas largas e
delgadas de Trypanosoma cruzi são inoculadas intravenosamente em
camundongos, as formas delgadas desaparecem rapidamente da circulação,
provavelmente devido ao desenvolvimento intracelular, enquanto que as formas
largas permanecem na circulação por alguns dias. Formas delgadas são
aparentemente melhor equipadas para penetrar em células. Formas largas são
aparentemente mais resistentes aos mecanismos imunológicos do hospedeiro.
Quando injetadas intravenosamente em camundongos na fase crônica, formas
largas persistem na circulação por muitos dias, enquanto formas delgadas
desaparecem dentro de uma a duas horas.
72
As formas largas são também melhor adaptadas para desenvolvimento em
triatomíneos ou em culturas axênicas (De SOUSA, 1999).
Vários autores observaram predomínio de formas delgadas nas cepas que
apresentavam alta ou média virulências e predomínio de formas largas nas cepas de
baixa virulência (ANDRADE, 1974; DEVERA et al., 2002; MARTINS et al, 2003).
Entretanto, Belda Neto (1973) não observou correlação entre a predominância de
uma determinada forma morfológica e a agressividade das amostras estudadas por
ele. Amostras que apresentavam predominância de formas delgadas mostraram-se
tão patogênicas para camundongos quanto uma amostra que exibiu grande
quantidade de formas mais largas.
Carneiro et al. (1991) observaram um predomínio de formas largas durante a
infecção com cepas de média virulência. Cepas de alta virulência apresentaram
inicialmente formas delgadas e depois formas muito largas. Todas as formas
apresentaram tropismo preferencial para músculos cardíacos e esqueléticos.
5.1.3- Taxa de mortalidade:
Neste estudo, nenhuma cepa foi capaz de causar a morte em nenhum
camundongo infectado durante o período de estudo.
Essa observação está de acordo com Andrade (1974) que relatou que a
mortalidade nos diversos grupos estudados por ela variou paralelamente com os
índices parasitêmicos, sendo muito elevadas nas amostras com altas parasitemias e
nula nas amostras que cursaram com parasitemias muito baixas.
Carneiro et al. (1991) observaram mortalidade apenas em animais infectados
com cepas de alta parasitemia.
Camandaroba et al. (2001) observaram alta mortalidade em animais
infectados com cepas de alta parasitemia e baixa mortalidade em animais infectados
com cepas de média parasitemia.
Martins et al. (2003) estudando uma cepa de baixa virulência não observaram
morte dos camundongos.
73
5.1.4. Lesões histopatológicas:
Foram examinados cortes de tecidos de vários animais infectados e
sacrificados nas fases aguda e crônica da infecção.
Formas parasitárias foram observadas no músculo cardíaco de animais
infectados com as cepas AMJM na fase aguda e NBR na fase crônica da infecção.
Reação inflamatória foi observada no músculo cardíaco de animais infectados com
todas as cepas estudadas, nos músculos da parede intestinal para a cepa BFS, nos
músculos esqueléticos para as cepas AMJM, BFS e NCS e no fígado para as cepas
AMJM e NBR (Tabela 3 e Figuras 8, 9, 10 e 11).
Em camundongos infectados com a cepa NBR, apesar do pequeno inóculo e
de não apresentar parasitemia patente nos três grupos estudados, foram
observados parasitas no músculo cardíaco. Essa observação está de acordo com
Andrade (1974 e 1985), que relata que a patogenicidade é uma característica
constante e independe do inóculo.
Petana e Coura (1974) observaram que camundongos infectados com um
pequeno número de parasitas e outros infectados com um inóculo dez vezes maior
apresentaram lesões semelhantes no coração e no intestino.
Schlemper Jr et al. (1983) observaram que a presença de parasitismo tecidual
na fase crônica estava diretamente relacionada com a virulência exibida pela cepa
na fase aguda da infecção, exceto para uma cepa que, apesar da baixa virulência,
induziu parasitismo tecidual em 46% dos animais infectados.
Devera et al. (2002), estudando 14 cepas isoladas de humanos observaram
parasitismo tecidual em todos os camundongos infectados com cepas de alta e
média parasitemia, enquanto apenas uma cepa de baixa parasitemia induziu o
aparecimento de parasitas em vários órgãos.
Martins et al. (2003), estudando uma cepa de baixa parasitemia, observaram
ninhos de amastigotas e inflamação, principalmente no coração dos camundongos
infectados.
Andrade (1990), estudando 201 camundongos infectados com cepas dos três
biodemas, observou que há uma clara influência do tipo biológico da cepa nas
lesões histopatológicas detectadas. Cepas do Tipo III são mais patogênicas,
determinando lesões intensas em músculos cardíacos e esqueléticos, com
74
parasitemia patente nos tecidos mesmo em uma fase tardia da infecção. Lesões
cardíacas na fase crônica foram observadas também em camundongos infectados
com cepas Tipo I e Tipo II, assim como um envolvimento significativo de células
neuronais do plexo mioentérico.
5.1.5- Classificação das cepas:
A classificação das cepas é feita segundo os critérios estabelecidos por
Andrade (1974), tendo como parâmetros os índices de parasitemia, morfologia das
formas tripomastigotas sangüíneas, taxa de mortalidade dos animais infectados,
tropismo tissular. Analisando esses parâmetros, todas as quatro cepas estudadas
puderam ser classificadas no Tipo II.
Esses dados estão de acordo com Andrade e Magalhães (1997), que
observaram um predomínio de cepas do Tipo II no Brasil. Essas cepas estão
associadas com o ciclo doméstico do parasita. Cepas do Tipo I são raramente
observadas no Brasil, sendo representadas pela cepa Y e pela cepa SC-44, isolada
de um gambá em Santa Catarina. Cepas do Tipo I foram isoladas nos Estados de
São Paulo, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Cepas do Tipo III estão associadas
com o ciclo silvestre do parasita, tendo sido também observadas em pacientes
humanos das regiões norte e nordeste do Brasil.
Sabendo-se que o número de formas tripomastigotas inoculadas no animal
experimental pode interferir com os níveis de parasitemia (ANDRADE, 1974), é
necessário que se estabeleçam inóculos padrões para determinação dos níveis de
parasitemia.
Na literatura consultada, os diversos parâmetros biológicos de diferentes
cepas de Trypanosoma cruzi foram determinados utilizando-se de inóculos que
variaram de 50 a 150.000 formas parasitárias (BRENER et al., 1974; SCHLEMPER
Jr et al., 1983; CARNEIRO et al., 1991; CAMPOS E ANDRADE, 1996; FERNANDES
et al., 1997; PINTO et al., 1999; CAMANDAROBA et al., 2001; DEVERA et al., 2002;
GOMES et al., 2003; MARTINS et al., 2003).
75
É necessário também uniformizar os critérios de virulência e patogenicidade.
Diferentes autores utilizam índices de parasitemia médios bastante variáveis para
classificação dos níveis baixo, médio e altos de virulência.
Assim, Andrade (1974) classifica as diferentes cepas em níveis parasitêmicos
baixos, médios e elevados, sem contudo definir um valor médio de parasitemia para
cada um desses níveis.
Schlemper Jr et al. (1983) classificaram cepas de baixa virulência as que
apresentaram picos parasitêmicos de 10
5
parasitas/ mL, cepas de virulência média
quando os níveis médios de parasitemia foram de 6x10
5
parasitas/ mL, cepas de alta
virulência quando apresentaram picos parasitêmicos médios de 2 a 3x10
6
parasitas/
mL.
Carneiro et al. (1991), classificam as diferentes cepas estudadas, de acordo
com a virulência em três grupos: a) cepas com alta virulência são aquelas que
causam 100% de mortalidade nos animais infectados e predomínio de formas muito
largas na fase final da infecção; b) cepas com média virulência são as que não
causaram mortalidade nos animais infectados e predomínio de formas largas na fase
final da infecção e c) cepas com baixa virulência foram as que não causaram
mortalidade e as formas sangüíneas não foram determinadas devido à parasitemia
sub-patente.
Para Fernandes et al. (1997), cepas de alta virulência alcançaram picos
parasitêmicos de 13,1x10
3
parasitas/5 µL de sangue e cepas de baixa virulência
apresentaram picos parasitêmicos de 900 parasitas/5 µL de sangue.
Camandaroba et al. (2001) consideram cepas com alta parasitemia quando o
pico parasitêmico é maior do que 500 formas tripomastigotas/50 campos
microscópicos com aumento de 400 vezes e cepas com parasitemia média quando
os picos estão entre 100 e 500 formas parasitárias/50 campos microscópicos.
Devera et al. (2002) classificam cepas de elevada parasitemia aquelas que
apresentam picos médios maiores de 1500 parasitas/ 5µL de sangue; média
parasitemia quando os picos estão entre 500 e 1499 parasitas/ 5µL de sangue e
baixa parasitemia quando os picos são inferiores a 500 formas parasitárias/ 5µL de
sangue.
Gomes et al. (2003) classificam cepas de baixa parasitemia aquelas que
apresentam parasitemia sub-patente ou patente até 10
3
parasitas/mL de sangue,
76
média parasitemia quando os picos parasitêmicos variam de 10
4
a 10
5
parasitas/mL
de sangue e alta parasitemia quando os picos são maiores de 10
6
parasitas/mL de
sangue.
Pelo exposto observa-se a necessidade de se estabelecer valores médios de
parasitemia nos picos parasitêmicos, que sirvam como base para classificação das
diferentes cepas de acordo com o grau de virulência.
A demonstração de que uma alta porcentagem de cepas de Trypanosoma
cruzi isoladas de pacientes humanos são de baixa virulência em condições
experimentais, indicam que deveria ser dado maior atenção a essas populações, as
quais são freqüentemente negligenciadas devido à dificuldade de adaptação ao
modelo animal. Há outras evidências de que essas cepas são mais representativas
do pool de populações de Trypanosoma cruzi que circulam na natureza
(SCHLEMPER Jr et al., 1983). O uso de cepas de alta virulência pode ter distorcido
conceitos da doença de Chagas experimental (CARNEIRO et. al., 1991).
5.2- Caracterização Molecular:
A transmissão vetorial de Trypanosoma cruzi para humanos tem sido
atribuída, tradicionalmente, a dois ciclos conectados que são bem definidos: os
ciclos silvestre e doméstico. A infecção humana através do ciclo doméstico é o
resultado da domiciliação de vetores que trazem o parasita do ambiente silvestre
para as habitações humanas. A presença ocasional de mamíferos e triatomíneos
silvestres nas habitações humanas também representa uma fonte de transmissão do
parasita. Além disso, a infecção humana pode ser adquirida via ciclo silvestre
quando o homem invade esse ambiente (FERNANDES et al., 1999).
Miles et al. (1977, 1978, 1980) descreveram três distintos zimodemas de
Trypanosoma cruzi, os quais estão correlacionados com os ciclos de transmissão:
zimodemas 1 e 3 relacionados com o ciclo silvestre e zimodema 2 relacionado com o
ciclo doméstico.
Em contraste à grande variabilidade fenotípica, marcadores genéticos tem
revelado duas principais linhagens de Trypanosoma cruzi. Amplificação por PCR de
uma seqüência do domínio divergente D7 do gene que codifica a 24Sα rRNA indica
77
dimorfismo entre isolados de Trypanosoma cruzi (SOUTO e ZINGALES, 1993).
Essas observações foram confirmadas por ribotipagem (CLARK e PUNG, 1994).
Subseqüentemente, estudos envolvendo análise do RAPD e amplificação por PCR
do gene de mini-exon corroboraram a existência de duas linhagens, designadas
linhagens 1 e 2 (SOUTO et al., 1996). Tem sido notada uma associação preferencial
da linhagem 1 com o ciclo doméstico e da linhagem 2 com o ciclo silvestre do
parasita. As linhagens parecem estar correlacionadas com os zimodemas 2 e 1
respectivamente.
A posição do zimodema 3 foi investigada baseado na análise de seqüências
do gene de mini-exon e concluiu-se que constitui uma discreta sub-linhagem dentro
da linhagem 2 (FERNANDES et al., 1998).
As cepas caracterizadas na linhagem 1 foram denominadas T.cruzi II e as
cepas caracterizadas na linhagem 2 foram denominadas T.cruzi I. (SATELLITE
MEETING, 1999).
Isolados da região Amazônica que não puderam ser classificados dentro das
linhagens 1 ou 2, tiveram o gene de mini-exon clonado e seqüenciado. Todos os
clones tinham uma inserção similar no espaçador não transcrito desse gene. Dois
isolados que tinham sido previamente caracterizados fenotipicamente no zimodema
3 por análise de isoenzimas, também mostraram a mesma inserção no gene de mini-
exon (FERNANDES et al., 2001).
A existência de uma terceira linhagem foi recentemente proposta por Robello
et al. (2000), analisando seqüências de DNA de diferentes isolados de Trypanosoma
cruzi. Esses dados foram corroborados por Machado e Ayala (2001) e Augusto-Pinto
et al. (2003).
Neste estudo, utilizando "PCR multiplex", para todas as amostras foi
amplificado um fragmento de 250 pb (Figura 12) sendo então as mesmas
classificadas como T.cruzi II, que corresponde à linhagem 1 e está relacionada ao
ciclo doméstico do parasita. Isso já era esperado uma vez que essas amostras foram
isoladas de pacientes humanos e, sabe-se que, embora T.cruzi I e T.cruzi II possam
causar doença em humanos (BRISSE et al., 1998), T.cruzi II é altamente prevalente
em infecções humanas no Brasil (ZINGALES et al., 1998). A maioria das cepas
isoladas de pacientes humanos tem sido classificadas nesse grupo (SOUTO et al.,
1996; ZINGALES et al., 1998; FERNANDES et al., 1999 a).
78
Em países como México e Colômbia, onde a doença de Chagas é endêmica,
tem se observado o predomínio de T.cruzi I.
Bosseno et al. (2000) caracterizaram quatorze cepas isoladas de pacientes
humanos do México e observaram que todas as amostras pertenciam a T.cruzi I.
Cuervo et al. (2002) estudaram quatorze amostras Colombianas, isoladas de
diversos hospedeiros e de diversas áreas geográficas e caracterizaram dez
amostras como T.cruzi I e concluíram que essa pode ser a razão para o alto grau de
pacientes com doença de Chagas assintomática, já que T.cruzi I está associado com
baixa morbidade no Brasil.
Marin (2003) estudando vinte e nove isolados de pacientes chagásicos
Colombianos, observou que 86,2% das cepas foram classificadas como T.cruzi I.
Zingales et al. (1998) observaram que cepas da linhagem 1 circulam
preferencialmente no ciclo doméstico, enquanto que no ciclo silvestre cepas de
ambas as linhagens circulam igualmente. Em algumas áreas endêmicas do Brasil
existe uma ligação entre os dois ciclos mediada por cepas da linhagem 1. Em
regiões como Minas Gerais, Paraíba e Piauí, humanos são infectados por cepas da
linhagem 1 por meio de triatomíneos domiciliados e este é um fator predisponente
para o aparecimento da doença de Chagas. Na região Amazônica, humanos
interagem com o parasita que está circulando em um ciclo silvestre homogêneo
entre triatomíneos silvestres. Nessa região, onde quase todos os parasitas isolados
de triatomíneos e de humanos foram tipados como pertencentes à linhagem 2, as
manifestações clínicas da doença de Chagas raramente ocorrem.
De acordo com Zingales et al. (1998), uma hipótese que explicaria que
características de cepas da linhagem 1 permitiria que fosse feita a ligação entre os
ciclos domésticos e silvestres é que existe uma associação preferencial desta
linhagem a espécies de triatomíneos adaptadas aos ambientes domésticos e peri-
domésticos. Uma outra possibilidade é que cepas da linhagem 1 tenham
propriedades que favoreçam a infecção humana. Existem evidências que cepas
desse grupo apresentam uma parasitemia mais alta em humanos.
Também tem sido relatado que cepas da linhagem 1 são mais infectivas para
células HeLa do que cepas da linhagem 2. Esses resultados foram correlacionados
com a expressão da glicoproteína gp90, que inibe a mobilização do cálcio requerida
para a invasão celular e está presente em cepas da linhagem 2, mas não em cepas
da linhagem 1 (RUIZ et al., 1998).
79
Briones et al. (1999) sugerem que as duas linhagens de Trypanosoma cruzi
são, provavelmente, duas espécies diferentes que evoluíram independentemente
por um longo período de tempo e tem atributos epidemiológicos e ecológicos
distintos. Os ciclos silvestres e humanos da tripanossomíase americana poderiam
ser conseqüência da diversidade genética do parasita, assim como de adaptações
genéticas e imunológicas do hospedeiro.
Assim, a divisão de Trypanosoma cruzi em dois grupos principais é evidente
não somente genotípicamente mas, também, fisiológicamente. Para Zingales et al.
(1999) já é tempo para uma reavaliação do taxon Trypanosoma cruzi e para
estabelecer uma nomenclatura comum para essas linhagens que serviriam não
somente para taxonomistas, mas também para a comunidade de pesquisadores que
trabalham com o protozoário. Caracterizações genéticas adicionais dos sub-grupos
dentro dessas linhagens representam um passo fundamental para o conhecimento
das complexas manifestações clínicas e epidemiológicas da doença de Chagas.
80
6- CONCLUSÕES
- Três cepas, AMJM, BFS e NCS apresentaram parasitemia patente, enquanto
uma cepa, NBR apresentou parasitemia sub-patente nos três grupos de
camundongos estudados.
- Observou-se grande variabilidade individual na parasitemia nos sete
camundongos de cada grupo, para todas as cepas que apresentaram
parasitemia patente.
- Os períodos pré-patentes, picos médios de parasitemia e duração da fase aguda
foram variáveis para todas as cepas estudadas. Todas as cepas apresentaram
baixa parasitemia. As diferenças observados no pico da parasitemia foram
estatísticamente significativas entre as cepas AMJM e NCS e entre as cepas BFS
e NCS.
- Foram observadas apenas formas tripomastigotas largas durante todo o curso da
infecção, para as três cepas com parasitemia patente. Foram observadas
diferenças estatísticamente significativas para os valores de comprimento do
flagelo, comprimento do corpo e comprimento total entre as cepas AMJM e BFS
e entre as cepas AMJM e NCS. Não foram observadas diferenças
estatísticamente significativas para largura do corpo entre as três cepas
estudadas.
- O comportamento de cada cepa, nos três grupos de camundongos analisados foi
semelhante. As diferenças observadas na média do número de formas
tripomastigotas sangüíneas, nos sete camundongos de cada grupo, nos dias
avaliados não foram estatisticamente significativas.
- A taxa de mortalidade foi nula para todas as cepas estudadas.
- O estudo histopatológico mostrou presença de formas amastigotas no músculo
cardíaco para as cepas AMJM e NBR. Reação inflamatória foi observada no
músculo cardíaco para todas as cepas, nos músculos da parede intestinal para a
cepa BFS, nos músculos esqueléticos para as cepas AMJM, BFS e NCS e no
fígado para as cepas AMJM e NBR.
81
- Na caracterização molecular, a amplificação por PCR de parte do espaçador não
transcrito do gene de mini-exon gerou um fragmento de 250 pb para as quatro
cepas estudadas.
- Baseado no comportamento no animal experimental as quatro cepas foram
classificadas no Biodema II.
- A análise molecular permitiu classificar as quatro cepas no grupo II
- Com os dados obtidos as quatro cepas foram classificadas como T.cruzi II.
82
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