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UNIVERSIDADEESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITAFILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ANÁLISE DA MUTAGENICIDADE URINÁRIA E
SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NO MONITORAMENTO
DE INDIVÍDUOS EXPOSTOS A SOLVENTES ORGÂNICOS
SORAYA DUARTE VARELLA
ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda
ARARAQUARA - SP
2005
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UNIVERSIDADEESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITAFILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
ANÁLISE DA MUTAGENICIDADE URINÁRIA E
SUSCEPTIBILIDADE GENÉTICA NO MONITORAMENTO
DE INDIVÍDUOS EXPOSTOS ASOLVENTES ORGÂNICOS
SORAYA DUARTE VARELLA
TESE PARA OBTENÇÃO DOTÍTULO DE DOUTOR EM ANÁLISES CLÍNICAS,
ÁREA DE ANÁLISES CLÍNICAS.
ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda
ARARAQUARA - SP
2005
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Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Varella, Soraya Duarte
V293a Análise da mutagenicidade urinária e susceptibilidade genética no
monitoramento de indivíduos expostos a solventes orgânicos. / Soraya Duarte
Varella . – Araraquara, 2005.
98 f.
Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio
de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de
Pós Graduação em Análises Clínicas
Orientador: Eliana Aparecida Varanda
. 1.Mutagenicidade urinária. 2.Polimorfismo enzimático. 3.Exposição
ocupacional. 4.Teste de Arnês. I.Varanda, Eliana Aparecida, orient. II.
Título.
CDD: 616.-07566
CAPES:40300005
TERMO DE APROVAÇÃO
AUTOR: Soraya Duarte Varella
TÍTULO DO TRABALHO: Análise da mutagenicidade urinária e susceptibilidade genética no
monitoramento de indivíduos expostos a solventes orgânicos.
TESE PARA A OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR
PRESIDENTE E ORIENTADORA: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -UNESP
PRIMEIRO EXAMINADOR: Profa. Dra. Denise Crispin Tavares
INSTITUIÇÃO: Universidade de Franca
SEGUNDO EXAMINADOR: Profa. Dra. Lusânia Maria Greggi Antunes
INSTITUIÇÃO: Universidade de Medicinado Triângulo Mineiro
TERCEIRO EXAMINADOR: Profa. Dra. Ilce Mara de Syllos Cólus
INSTITUIÇÃO: Universidade Estadual de Londrina
QUARTO EXAMINADOR: Profa. Dra. Christiane Pienna Soares
INSTITUIÇÃO: Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara -UNESP
ARARAQUARA, 04 de outubro de 2005.
AGRADECIMENTOS
“O que somos e o que criamos é o resultado da interação entre nossos genes e o
meio ambiente. Nesse sentido, gostaria de expressar minha gratidão àqueles que passaram seus
genes”, Carlos e Marilda e ao meu avô Euclydes. Agradeço também aos meus irmãos Alexandre,
Luciano, Daniel e Neto, que colaboraram, criando um ambiente favorável para a realização desse
trabalho.
Gostaria também de registrar aqui meus agradecimentos especiais para:
Dra. Clarice Queico Fujimura, Ana Carolina Malaspina e Karina Andrade Prince
pela disponibilidade, paciência e ensinamentos.
Dra. Ilce Mara Syllos Cólus e Dra. Regislaine Burim, pela prestatividade.
Dr. Wagner Vilegas, Roberta Coelho, Marcelo Telascrea e Marcelo Silva, pelo
apoio na fase inicial desse trabalho.
Dra. Raquel Moreira, Dra. Tais Bauab, Dr. Sandro Valentin, pelos equipamentos
e Luis Eduardo dos Santos, pelo valioso auxílio.
Valéria Aparecida de Araújo Mallavolta , Walclécio Lira e Cássia Regina
Cardoso pela ajuda fundamental na coleta de sangue.
Dra. Mara Pinto e aos alunos da 73° Turma de Farmácia e Bioquímica Noturno,
pelo carinho e atenção.
César Terçariol pela colaboração na avaliação dos resultados (análises
estatísticas).
Toda equipe do laboratório de mutagênese: Ana Paula de Oliveira, Cássia
Regina Cardoso, Fabiana I. Biso, Fábio Vieira dos Santos, Flávio Romanini Tubaldini, Maira
Eiko. I. Nogueira, Mariana H. Passoni, Walclécio Lira. Especialmente a Raquel Aparecida
Rampazo, que dividiu essa pesquisa comigo.
Ednéia Fátima Corrêa, Marisa Fernades e Silvia Helena de Oliveira David, pelo
respaldo técnico, e pela amizade.
Ivone Shisuko Anno e Mirna Fernanda de Oliveira, amigas para todas as horas.
Claúdia Lúcia Molina, Laura Rosim e Sônia Ornellas Silva, funcionárias do
setor de pós-graduação
Aparecida Bernadete Rocateli Jesus e a todos os outros funcionários e
professores da FCFAR que colaboraram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho.
Todos os voluntários que participaram dessa pesquisa.
Centro Universitário Barão de Mauá, especialmente a Dra. Joyce Gabrielli, Dra.
Tokico Murakawa Moryia e Maria Zuanon.
CAPES pelo apoio financeiro.
RESUMO
A exposição ocupacional a solventes orgânicos é um sério problema para
milhares de trabalhadores. A literatura demonstra a ocorrência de um elevado risco de danos no
material genético desses indivíduos, no entanto, os efeitos da mistura dos solventes orgânicos não
são bem conhecidos. As diferenças genéticas (polimorfismos enzimáticos) também têm um
importante papel na capacidade de ativação e de detoxificação de xenobióticos, incluindo os
solventes orgânicos. As mutações causadas por agentes ambientais associadas aos diferentes
genótipos, são fatores relacionados ao desenvolvimento de neoplasias e outras doenças
degenerativas. O ensaio de mutagenicidade urinária indica a ocorrência de possíveis lesões pré-
clínicas enquanto que a determinação dos polimorfismos enzimáticos mostra um perfil genético
de risco. Assim, os profissionais da saúde envolvidos com a qualidade de vida do trabalhador,
podem ter subsídios para o controle da exposição ocupacional e conseqüentemente evitar o
aparecimento de doença (lesão clínica), principalmente o câncer. O trabalho diário num
laboratório de pesquisa onde são utilizados vários tipos de solventes é igualmente preocupante.
Diante disso, este estudo teve os seguintes objetivos: caracterizar a atividade mutagênica na urina
de 30 indivíduos ocupacionalmente expostos a solventes orgânicos e indivíduos sem essa
exposição (controles); identificar o polimorfismo constitucional desses indivíduos para os genes
GSTM1, GSTT1 e CYP2E1 ; e tentar correlacionar a influência desses genótipos com a atividade
mutagênica urinária. A coleta da urina foi realizada em frascos de polietileno durante o dia de
trabalho, até a obtenção de aproximadamente 1000mL. Para a concentração e extração dos
compostos presentes na urina foi usada a resina XAD-2 e o solvente acetona. Diferentes
concentrações (1,5; 3,0; 6,0 e 12,0 mL equivalente de urina/placa) de cada amostra foram
avaliadas através do teste de Ames, com e sem ativação metabólica, usando as linhagens TA100 e
YG1024. A partir do sangue total coletado de cada indivíduo, foi extraído o DNA e foi utilizada a
técnica de PCR para a amplificação dos polimorfismos dos genes GSTM1, GSTT1 e CYP2E1-
PstI. Os resultados da avaliação da atividade mutagênica das amostras de urina do grupo exposto
apresentaram aumento estatisticamente significativo (p < 0,05) na linhagem YG1024, com
metabolização quando comparado com os resultados encontrados no grupo controle.Observou-se
a influência (sem significância estatística) do genótipo GSTM1/GSTT1 nulo na resposta
mutagênica do grupo exposto. Das 7 amostras de urina com mutagenicidade positiva, 6 eram de
indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo e, apenas 1 amostra era de um indivíduo com
GSTM1 presente. Com isso, fica clara a relevância dos estudos que avaliam o risco de exposição
ocupacional a solventes orgânicos, através do uso de biomarcadores biológicos e perfis genéticos
e, assim promover medidas que resguardem a saúde desses trabalhadores.
Palavras-chave: mutagenicidade urinária; polimorfismo enzimático; exposição ocupacional; teste
de Ames.
ABSTRACT
The occupational exposure to organic solvents is a serious problem to millions of
workers. The reports shows a high risk of genetic damage on these workers. However, the effects of
mixtures of solvents are not well known. The genetic differences (enzimatic polymorphisms) are
very important for the capacity of activating and detoxifying carcinogens, such as organic solvents.
Mutations caused by environmental agents associated with the different genotypes are related to
cancer development and other degenerative diseases. The urinary mutagenicity assay shows pre-
clinical damages while the enzimatic polymorphisms show a genetic risk profile. In this way, the
health professionals can have subsity to occupational exposure control in order to avoid disease
development (clinical damage), cancer especially. The work in a research laboratory that uses
several types of solvents is equaly preocupating. In this way, in this study the genotyping approach
was used to study the influence of the metabolic polymorphisms CYP2E1, GSTM1 and GSTT1 on
urinary mutagenicity, detected with Salmonella/microsome assay, in 30 subjects exposed to
solvents, and 30 subjects without occupational exposure (controls). Urine samples were collected in
polyethylene containers at the end of the work shift. For the concentration and extraction of urine
samples was used the XAD-2 resin and acetone as eluting agent. Different doses of extract (1.5; 3.0;
6.0 and 12.0 mL equivalents per plate) were tested on Salmonella typhimurium strains TA100 and
YG1024, with and without metabolic activation. Genomic DNA was extracted from blood and the
GSTM1, GSTT1 and CYP2E1-PstI genotypes were deternined using a PCR method. The mutagenic
activity of urine samples from exposed workers shows a significant difference (p≤ 0.05) when
compared to those in the control group in the Salmonella typhimurium YG1024 with S9 mix. The
genotype GSTM1/GSTT1 null influenced (not statistical significance) in mutagenic activity from
exposed group. Among the 7 urine samples with positive mutagenicity, 6 were from volunteers with
GSTM1/GSTT1 null genotype and just 1 was from volunteers with GSTM1 present genotype. These
studies show the relevance of assessing the risk of occupational exposure to organic solvents, with
the use of biological biomarkers and genetic profiles and to promote ways for protecting the health
of the workers.
Keywords: urinary mutagenicy; enzimatic polymorphism; occupational exposure; Ames test
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 1
1.1- Exposição ocupacional, mutagenicidade urinária e efeitos adversos à saúde........ 2
1.2- Importância dos polimorfismos genéticos (GSTM1, GSTT1 e CYP2E1) nos
efeitos adversos à saúde, advindos da exposição a xenobióticos.................................. 6
2. OBJETIVOS............................................................................................................ 12
3. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 13
3.1- Amostras de urina................................................................................................... 13
3.2- Avaliação da mutagenicidade urinária................................................................... 15
3.2.1- Ensaio de mutação gênica reversa....................................................................... 15
3.2.2- Linhagens de Salmonella typhimurium............................................................... 15
3.2.3- Meios de cultura.................................................................................................. 16
3.2.4- Manutenção e estoque das culturas..................................................................... 17
3.2.5- Confirmação dos genótipos das linhagens de Salmonella typhimurium............. 17
3.2.6- Sistema de ativação metabólica........................................................................... 19
3.2.7- Procedimento do ensaio de acordo com Maron e Ames (1983)......................... 19
3.2.8- Controles............................................................................................................. 20
3.3- Estudo dos polimorfismos enzimáticos.................................................................. 21
3.3.1- Extração e quantificação do DNA genômico...................................................... 21
3.3.2- Amplificação das seqüências de DNA e detecção dos genótipos....................... 21
3.3.3- Detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 por PCR- multiplex.......................... 22
3.3.4- Detecção do genótipo CYP2E1 – PstI................................................................. 23
4. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS............................. 24
5. RESULTADOS........................................................................................................ 26
5.1- Caracterização das amostras estudadas.................................................................. 26
5.2- Atividade mutagênica dos extratos orgânicos de urina.......................................... 29
5.3- Distribuição das freqüências dos diferentes polimorfismos estudados.................. 48
5.4- Caracterização dos indivíduos analisados em relação a diferentes parâmetros..... 49
6. DISCUSSÃO............................................................................................................ 55
6.1- Análise da mutagenicidade urinária...................................................................... 55
6.2- Análise dos polimorfismos das enzimas de metabolização de xenobióticos e,
sua influência nos danos ao material genético............................................................... 59
7. CONCLUSÕES........................................................................................................ 67
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 69
ANEXOS
Questionário................................................................................................................... 88
Termo de Consentimento .............................................................................................. 96
Parecer do Comitê de Ética........................................................................................... 98
Lista de tabelas
Tabela 1: Descrição comparativa das linhagens bacterianas......................................... 16
Tabela 2: Caracterização dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação
ao sexo, grupo étnico e idade ......................................................................................... 26
Tabela 3: Caracterização dos indivíduos, através da freqüência, segundo o consumo
de vegetais, consumo de bebidas alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de
exposição a solventes orgânicos..................................................................................... 28
Tabela 4: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do
número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos
de urina do grupo controle (C), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens
TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação
metabólica...................................................................................................................... 33
Tabela 5: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do
número de revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos
de urina do grupo exposto (E), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens
TA100 e YG1024 tanto na presença (+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação
metabólica...................................................................................................................... 37
Tabela 6: Atividade mutagênica expressa em potência (número de revertentes
his+/mLequivalente urina), das amostras do grupo controle e exposto, com resposta
mutagênica positiva em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com (+S9)
ou sem (-S9) ativação metabólica).................................................................................. 41
Tabela 7: Atividade mutagênica expressa pelo maior valor da razão de
mutagenicidade (RM) nas amostras do grupo controle e exposto, nas linhagens
TA100 eYG1024, com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica..................................... 42
Tabela 8: Atividade mutagênica expressa pelo índice de aumento relativo no número
de revertentes his+, das amostras do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100
eYG1024, com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica................................................. 43
Tabela 9: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e
exposto, em relação à idade, sexo, grupo étnico, atividade mutagênica da urina e
polimorfismos dos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1.................................................... 51
Tabela 10: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e
exposto, em relação à idade, sexo e atividade mutagênica (diferentes parâmetros de
avaliação) daurina e polimorfismos dos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1................... 53
Lista de figuras
Figura 1: Fases da intoxicação...................................................................................... 3
Figura 2: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e
exposto (B), na linhagem de S. typhimurium TA100 sem ativação
metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 44
Figura 3: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e
exposto (B), na linhagem de S. typhimurium TA100 com ativação
metabólica..................................................................................................... 45
Figura 4: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e
exposto (B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 sem ativação
metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 46
Figura 5: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do controle (A) e
exposto (B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 com ativação
metabólica.* amostras com atividade mutagênica positiva.......................... 47
Figura 6: PCR multiplex para a detecção de alelos homozigotos nulos das glutationa
S-transferases M1 (GSTM1) e T1 (GSTT1).................................................. 48
Figura 7: PCR - RFLP para detecção do polimorfismo CYP2E1 –PstI........................ 49
Figura 8: Média e desvio padrão dos índices de aumento relativo no número de
revertentes his+, das amostras de urina dos indivíduos com genótipo
GSTM1/GSTT1 nulo, no grupo controle (A) e no exposto
(B)................................................................................................................. 54
1
PDF
1. Introdução
A exposição ocupacional diária a uma grande variedade de compostos químicos
em baixas concentrações, tem levado a efeitos crônicos na saúde do trabalhador, com sérias
conseqüências toxicológicas, sendo a causa de inúmeras doenças, inclusive o câncer.
A maioria das pessoas tem sido expostas a algum tipo de solvente no seu
trabalho. Embora, na última década, os níveis de exposição tenham diminuído muito em países
industrializados, o número de trabalhadores expostos a solventes ainda é grande (FECHNER et
al., 2001; JOO et al., 2004; HEUSER et al., 2005).
Diferenças individuais quanto ao risco de desenvolver câncer são provenientes,
entre outros fatores, da capacidade geneticamente determinada do organismo em ativar ou
detoxificar os carcinógenos. Assim sendo, a associação entre alelos específicos de genes
responsáveis pela metabolização de compostos químicos e o risco aumentado ao
desenvolvimento de tumores, se deve à existência de múltiplos passos enzimáticos no
metabolismo, que podem resultar na ativação ou detoxificação de xenobióticos. A ativação de
pró-carcinógenos é um evento fundamental para que os compostos ambientais possam interagir
com o DNA. De um modo geral, mas não absoluto, a formação de agentes eletrofílicos a partir de
2
carcinógenos ambientais são catalisadas pelas enzimas do citocromo P450 (CYPs) e neutralizadas
pelas glutationa S-transferases (GSTs), (RIBEIRO et al., 2003).
Os fatores genéticos e ambientais são importantes determinantes, além de
responsáveis pelas significativas variações individuais no desenvolvimento de doenças. A
combinação do conhecimento acerca dos fatores externos relacionados ao hábito de vida e
ambiente, acrescidos do minucioso entendimento de como diferenças genéticas podem causar
variações nas respostas do homem aos poluentes ambientais, possibilita o esclarecimento dos
mecanismos de desenvolvimento do câncer.
1.1. Exposição ocupacional, mutagenicidade urinária e efeitos adversos à saúde
A má qualidade do ar do ambiente de trabalho é um fator importante para o
desencadeamento do câncer ocupacional. Durante pelo menos oito horas por dia os trabalhadores
estão expostos ao ar poluído, colocando seriamente em risco sua saúde. Algumas substâncias
como asbestos, encontrados em materiais como fibras de amianto ou cimento, as aminas
aromáticas, usadas na produção de tintas e os agrotóxicos agem preferencialmente sobre a bexiga,
enquanto os hidrocarbonetos aromáticos, encontrados na fuligem, parecem agir sobre as células
da pele, sobre as vias respiratórias e pulmões (KLAASSEN, 2001).
Uma série de processos complexos que envolvem o agente químico e o
organismo resultam na manifestação do efeito tóxico. O entendimento dos mecanismos
responsáveis por essas manifestações só é possível através da compreensão dos processos
bioquímicos. Portanto, é fundamental o conhecimento das fases que antecedem o aparecimento
dos efeitos tóxicos, que são, a fase de exposição, a fase de toxicocinética e a fase de
toxicodinâmica (Figura 1).
3
Agente Químico
Fase de - ar Monitoramento
Exposição - água Ambiental
- alimentos
Vias de introdução
Absorção
Fase de
Toxicocinética Distribuição
Monitoramento
Eliminação Biológico
Biotransformação
Fase de união a união a
Toxicodinâmica moléculas moléculas
críticas não críticas
efeitos sem efeitos
adversos adversos
Fase lesões pré-clínicas Monitoramento
Clínica Clínico
lesões clínicas
Figura 1: Fases da intoxicação (KLAASSEN, 2001, modificado).
A fase de exposição corresponde à presença dessas substâncias químicas no
ambiente de trabalho, que podem introduzir-se principalmente pela via respiratória. A fase de
toxicocinética corresponde à absorção, distribuição, biotransformação, acúmulo e eliminação do
agente químico. A substância química, uma vez absorvida pelo organismo, interage com
moléculas específicas provocando desde desequilíbrios leves até morte, caracterizando assim a
4
fase de toxicodinâmica. A fase clínica corresponde ao aparecimento de sinais e sintomas que
caracterizam os efeitos tóxicos e evidenciam a presença do fenômeno de intoxicação.
Ocorrendo a exposição, o agente químico poderá introduzir-se no organismo
através de uma ou mais vias, como a respiratória, cutânea ou digestiva. A via respiratória é a
principal via de introdução dos agentes químicos no organismo humano, pois os estados físicos
dos agentes químicos mais comumente encontrados no ambiente de trabalho são gases, vapores e
partículas. O contato constante do sistema respiratório, que é permeável e ricamente
vascularizado com o ambiente externo, permite geralmente uma absorção rápida e eficiente,
fazendo com que o agente químico muitas vezes alcance outros centros vitais, como Sistema
Nervoso Central e outros órgãos, sem passar pelo sistema hepático (KLAASSEN, 2001).
O câncer provocado por exposições ocupacionais geralmente atinge regiões do
corpo que estão em contato direto com as substâncias carcinogênicas, seja durante a fase de
absorção (pele e aparelho respiratório) ou de excreção (aparelho urinário), o que explica a maior
freqüência de câncer de pulmão (LEE et al.,2003), de pele (FATIMA et al., 2000) e de bexiga
(PESCH et al., 2000) nesse tipo de exposição.
É bem documentado que mutações gênicas atuam em etapas do processo de
carcinogênese e, que ensaios que detectam componentes genotóxicos permitem identificar
substâncias com risco potencial à saúde humana. O teste de mutagenicidade com Salmonella
typhimurium, também conhecido como Salmonella/microssomo, ou Teste de Ames, é a
metodologia de triagem mais utilizada atualmente para detectar substâncias genotóxicas, sendo
validado em larga escala por diversos laboratórios (MORTELMANS & ZEIGER, 2000;
RIBEIRO et al., 2003; VARELLA et al., 2004a). O teste de mutação gênica reversa em
Salmonella typhimurium (teste de Ames) é um ensaio utilizado por mais de 20 anos para avaliar,
5
através da urina, tanto o estilo de vida como a exposição ocupacional a mutagênicos e/ou
carcinogênicos potenciais (PAVANELLO et al., 2002a ; MOHAMADI et al., 2003).
A análise da mutagenicidade urinária, avaliada através do teste de Ames, é bem
aceita por ser um método adequado para a demonstração da exposição ocupacional a compostos
químicos mutagênicos que são excretados na urina de forma inalterada, ou como conjugados, ou
ainda na forma de metabólitos mutagênicos (CERNÁ et al., 1997; BOSSO, 2000; HEUSER et
al., 2005). A atividade mutagênica na urina já foi demonstrada em indivíduos fumantes
(MOHAMADI et al., 2003); ou naqueles que estão em tratamento medicamentoso (GABBANI et
al., 1999; JUNEJA et al., 2002). Esse parâmetro também foi usado como biomarcador de
exposição ocupacional em vários ambientes de trabalho (BOSSO, 2000; VERMEULEN et al.,
2003; HANSEN et al., 2004).
O estudo de Yin et al. (1998) demonstrou a mutagenicidade urinária em
indivíduos expostos a produtos da combustão de gás liquefeito de petróleo. Trabalhadores de
forno de carvão de coque também apresentaram atividade mutagênica urinária mais elevada
quando comparada ao grupo controle (MIELZIYNSKA et al., 1997). Choi et al. (1995), em um
estudo caso-controle, avaliaram a mutagenicidade urinária de 37 pacientes (19 com câncer de
bexiga e 18 controles) através do teste de Ames, com a finalidade de detectar exposição
ocupacional a diferentes químicos e/ou casos de cânceres de bexiga, e verificaram
mutagenicidade urinária positiva em 52% dos indivíduos expostos contra 22% dos indivíduos não
expostos. Bosso (2000), estudando a exposição ocupacional em cortadores de cana da região de
Araraquara-SP, demonstrou indícios de mutagenicidade urinária nesses indivíduos.
É importante reconhecer o surgimento de compostos genotóxicos no ambiente
de trabalho e existe a necessidade de identificar as fontes de contaminação, de modo a apontar
esforços para minimizar e controlar essa situação (HOUK, 1992).
6
1.2. A importância dos polimorfismos genéticos (GSTM1, GSTT1 e CYP2E1) nos efeitos
adversos à saúde, advindos da exposição a xenobióticos.
Vários fatores, tais como, idade, hábito tabagista, afetam os resultados da
atividade mutagênica encontrada nas populações expostas. Entretanto, é evidente que o risco
genético não está apenas baseado no potencial genotóxico de agentes ambientais, mas também,
nas diferenças na susceptibilidade genética a esses efeitos adversos. Dessa maneira, os genótipos
são responsáveis pelas diferenças interindividuais na habilidade para ativar ou detoxificar
substâncias genotóxicas, sendo reconhecidos como biomarcadores da susceptibilidade para a
mutação, câncer e outras doenças (RIBEIRO et al., 2003).
Devido ao fato de que praticamente todos os organismos vivos estão
continuamente expostos a compostos químicos, vários mecanismos de proteção foram
desenvolvidos durante o processo evolutivo, sendo a metabolização a mais versátil dessas formas
de proteção. Assim, os animais mais evoluídos como o homem, desenvolveram no fígado um
mecanismo enzimático que intercepta os xenobióticos como, por exemplo à nicotina,
transformando-os em substâncias mais hidrossolúveis, facilmente excretadas do organismo
(KLAASSEN, 2001), impedindo seu acúmulo e, conseqüentemente, o surgimento de danos no
material genético.
A biotransformação das drogas, em especial as que se processam no fígado, são
comumente agrupadas em duas fases: I e II. Na fase I, geralmente realizada pelas enzimas da
super-família do citocromo P-450 (CYP), que inclui as reações de oxidação, de redução ou de
hidrólise, as drogas podem ser ativadas, inativadas ou terem inalteradas suas atividades.
Na fase II, que é geralmente realizada pelas enzimas da família das glutationa S-
transferases (GSTs) e N-acetiltransferases (NATs) e envolve reações de conjugação, ocorre a
inativação total do xenobiótico, caso este ainda não tenha sido inativado na fase I. No entanto,
7
quando os produtos formados na fase I não sofrem inativação ou são ativados a substâncias mais
reativas pelas enzimas da fase II, estes intermediários reativos podem se ligar covalentemente ao
DNA e causar diversas formas de dano ao organismo, pois agirão como agentes mutagênicos e/ou
carcinogênicos (LANG & PELKONEN, 1999; HANSEN et al., 2004; SEPEHR et al., 2004).
Os genes que codificam as enzimas de fase I e II vêm sendo clonados e
identificados em seres humanos e muitos deles mostram-se polimórficos dentro da população,
parecendo contribuir para a susceptibilidade individual ao desenvolvimento de tumores (AKTAS
et al., 2001; YOKOYAMA et al., 2002). A associação entre polimorfismos nas enzimas CYPs,
GSTs e NATs com o aumento de risco cânceres de pulmão e bexiga, têm sido demonstrada em
diversos estudos (BARTSCH et al., 2000; YOKOYAMA et al., 2002).
Assim, entre os mecanismos envolvidos no processo de carcinogênese, podemos
destacar as alterações em genes responsáveis pela metabolização de xenobióticos, de maneira que
distúrbios no balanço entre ativação e detoxificação podem ser uma possível explicação as
variações individuais na resposta à exposição a carcinógenos (AUTRUP, 2000; LOKTIONOV,
2004).
O CYP compreende uma superfamília de hemoproteínas localizadas na
membrana do retículo endoplasmático que, embora presente em todos os tecidos, são expressas
em grandes quantidades pelas células hepáticas (AUTRUP, 2000).
Muitas drogas eletrofílicas, assim como xenobióticos, são eliminadas por
oxidação no fígado. As hemoproteínas da superfamília CYP, responsáveis por essa oxidação, são
conhecidas por catalisar a ativação metabólica de muitos compostos químicos para metabólitos
mais reativos, que se ligam às macromoléculas celulares (TANAKA et al., 2000; VALOTI et al.,
2000; ALEYNIK & LIEBER, 2001).
8
O genoma humano possui mais de 50 genes diferentes para o CYP, subdivididos
em 10 famílias, nomeadas com números arábicos (CYP1 – CYP10). Essas famílias são
subdividas em subfamílias, indicadas por uma letra e suas izoenzimas nomeadas por um número
arábico. As CYP1, CYP2 e CYP3 estão intimamente envolvidas no metabolismo de drogas
(AUTRUP, 2000).
Os polimorfismos nos genes CYP influenciam a capacidade dos indivíduos de
converter diferentes compostos pró-carcinogênicos em carcinogênicos e assim, são os principais
fatores para a susceptibilidade do indivíduo para o desenvolvimento de câncer induzido
quimicamente (INGELMAN-SUNDBERG, 2001). Essa variabilidade na atividade enzimática
pode influenciar nos efeitos tóxicos, incluindo a carcinogênese induzida por compostos químicos
endógenos (AUTRUP, 2000).
O CYP2E1 tem sido extensivamente estudado por estar envolvido no
metabolismo do etanol (BURIM et al., 2004) e de outros xenobióticos com baixo peso molecular,
incluindo as n-nitrosaminas (TANAKA et al., 2000; VALOTI et al., 2000; ALEYNIK &
LIEBER, 2001). Muitos substratos da CYP2E1 são também agentes indutores, incluindo a
acetona e o etanol, e a indução dos metabólitos da CYP2E1 pelo etanol é uma possível explicação
para o aumento da incidência de muitos cânceres em alcoolistas (RONIS et al., 1996; MURRAY,
2002). Dentre os substratos para a CYP2E1, encontram-se vários solventes: benzeno
(JUNXIANG et al., 2002), acetona (FREEMAN et al., 1992), diclorometano (LEHNEBACH et
al.,1995), hexano (ALI & TARDIF, 1999), etc.
O polimorfismo da CYP2E1 tem importante papel na carcinogênese pulmonar
em indivíduos com hábitos tabagistas (BARTSCH et al., 2000). O gene CYP2E1 também está
envolvido na interação hepatotóxica em trabalhadores expostos ao clorofórmio e ao
tetraclorocarbono (KATSU et al., 1998).
9
Wan et al. (2002), observaram que trabalhadores com genótipo CYP2E1 c.-1293
C/C and c.-1293 G/C são mais susceptíveis a ação tóxica do benzeno. O Instituto Nacional de
Câncer (Universidade do Colorado) e investigadores chineses determinaram o fator de risco para
doenças hematológicas em indivíduos expostos ao benzeno e puderam observar que elevada
concentração da enzima CYP2E1 tem papel fundamental nessas doenças. O gene CYP2E1 faz a
conversão do benzeno em óxido de benzeno, que espontaneamente originará o fenol; este sofrerá
nova metabolização da CYP2E1, formando hidroquinonas, que darão origem as
benzohidroquinonas, que são conhecidas pelo seu potencial hematotóxico e genotóxico
(ROTHMAN et al., 1997).
Além da ativação dos procarcinógenos, a CYP2E1 é responsável pela produção
de radicais livres que causam injúria tecidual, e são formados tanto na presença como na ausência
dos substratos (MURRAY, 2002). Muitos desses radicais, formados pelas reações de fase I, são
detoxificados por vários complexos enzimáticos, destacando-se as glutationa-S-transferases.
Dentre os sistemas de detoxificação já descritos, as GSTs possuem importante
papel, fornecendo proteção contra compostos eletrofílicos e produtos do estresse oxidativo, pois
vem sendo sugerido que estas enzimas fazem parte de um mecanismo de resposta adaptativa aos
danos causados por compostos químicos (BROCKSTEDT et al., 2002; SCHNEIDER et al.,
2004). As GSTs estão amplamente distribuídas na natureza, encontradas desde as bactérias até o
homem, e são expressas em tecidos de mamíferos (HAYES & PULFORD, 1995).
Indivíduos com genótipo nulo para GSTM1, ocupacionalmente expostos ao
estireno, apresentaram um aumento na troca entre cromátides irmãs, além de terem um aumento
significativo na concentração de metabólitos urinários, quando comparados com indivíduos com
GSTM1 presente (TEIXEIRA et al., 2004).
10
Pitarque et al. (2002), monitorando trabalhadores expostos a solventes
orgânicos, observaram que os indivíduos com hábitos tabagistas com genótipo nulo para o
GSTM1 apresentaram um aumento significativo na frequência de micronúcleos.
Danos cromossômicos e concentrações elevadas de aductos de DNA foram
detectados nos linfócitos de fumantes e de motoristas de ônibus com genótipos GSTM1 e GSTT1
nulos (NORPPA, 2001). Outros estudos também encontraram aumento significativo nos aductos
de DNA de indivíduos com genótipo GSTM1 nulo ocupacionalmente expostos a hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos - HPAs (BUTKIEWICZ et al., 2000; ROJAS et al., 2000; PAVANELLO
et al., 2004).
Estudos recentes demonstram que os genótipos nulos de GSTM1 e GSTT1,
separadamente ou combinados, são fatores genéticos de alto risco para o desenvolvimento de
tumores. O genótipo GSTM1 nulo já foi associado ao desenvolvimento de diversos tipos de
cânceres, como o de pulmão (GASPAR et al., 2004); bexiga (JOHNS & HOULSTON, 2000);
mama (MITRUNEN et al., 2001) e de cabeça e pescoço (BUSCH et al., 2002; MATTHIAS et
al., 2002; AU et al., 2003). Por outro lado, Roddi et al. (2004), demonstraram aumento
estatisticamente significativo no risco de câncer de mama de indivíduos com genótipo GSTM1
+/+, comparado com o genótipo GSTM1 -/-. Gudmundsdottir et al. (2001) não encontrou
aumento no risco de câncer de mama associado a nenhuma combinação dos polimorfismos
GSTM1, GSTT1 e GSTP1.
Dentre os tumores mais freqüentemente associados à ausência do gene GSTM1,
destaca-se o câncer de pulmão, pelo fato de GSTM1a e a GSTM1b serem ativos na detoxificação
de certos epóxidos dos HPAs encontrados na fumaça do cigarro e em outros produtos de
combustão (HAYES & PULFORD, 1995). Assim sendo, HPAs presentes no cigarro, incluindo o
carcinógeno benzo(a)pireno, requerem primeiramente ativação metabólica pelas enzimas da fase
11
I (citocromo P450 e suas formas ativadas) que produzem um intermediário que se constitui no
substrato de detoxificação para as enzimas GSTM1 da fase II.
A freqüência do gene GSTM1 nulo em pacientes chineses com adenocarcinoma
de pulmão, segundo Gao & Zhang (1999), foi de 76,9% contra 49,2% em indivíduos saudáveis.
Aktas et al. (2001) estudaram a relação entre o genótipo GSTM1 nulo e o câncer
superficial e invasivo de bexiga. A deleção do gene GSTM1 foi encontrada em 54,3% de todos os
pacientes com câncer e em 64,3% dos pacientes que apresentam a forma invasiva do câncer de
bexiga.
Rossi et al. (1999), avaliaram a excreção de ácido fenilmercaptúrico e t,t-MA
(metabólito do benzeno) em motoristas de ônibus municipais, correlacionando com o
polimorfismo genético das enzimas de fase I e II, demonstrando altos níveis de excreção urinária
do t,t –MA em indivíduos com o genótipo GSTM1 nulo. Resultados semelhantes foram
mostrados por Bergamaschi et al. (1999) analisando a urina de ciclistas, e também demonstraram
que altos níveis de tolueno e benzeno foram encontrados nos ciclistas com deleção do gene
GSTM1.
Os diferentes estudos desenvolvidos em vários países, com genes responsáveis
pela metabolização de xenobióticos, são de grande importância para a determinação da
susceptibilidade genética e poderão futuramente ser utilizados como biomarcadores no auxílio à
prevenção e tratamento de várias doenças.
12
2. Objetivos
1- Caracterizar a atividade mutagênica dos compostos eliminados na urina de
indivíduos expostos ocupacionalmente a solventes orgânicos, em laboratórios de pesquisa do
Instituto de Química – UNESP- Araraquara e seus respectivos controles.
2- Identificar o polimorfismo constitucional desses indivíduos para dois genes
da super família glutationa-S-transferase (GSTM1 e GSTT1) e da família citocromo- P450
(CYP2E1).
3- Associar, sempre que possível, a influência desses genótipos (GSTM1, GSTT1
e CYP2E1) com a atividade mutagênica urinária dos grupos expostos e controles.
4- Fornecer um melhor entendimento sobre os riscos à saúde decorrentes da
exposição aos compostos em questão.
13
3. Material e métodos
A coleta e avaliação da mutagenicidade das amostras de urina foi realizada em
colaboração com o Departamento de Química Orgânica do Instituto de Química, UNESP -
Campus de Araraquara.
3.1. Amostras de urina
A avaliação da mutagenicidade urinária foi realizada em 30 indivíduos
saudáveis e não fumantes, sendo funcionários, alunos e professores com atividade diária nos
diversos laboratórios do Instituto de Química – UNESP - Araraquara (grupo exposto – E) e 30
indivíduos controles, não fumantes (grupo controle – C), pareados por sexo e idade. Dentre os
diversos solventes que estes indivíduos são expostos estão: acetato de etila, acetonitrila, metanol,
acetona, etanol, hexano, benzeno, etc. Todos os indivíduos responderam a um questionário
detalhado incluindo informações sobre a história pessoal e ocupacional e saúde em geral (Anexo
1), além de assinarem um termo de consentimento para participação neste estudo (Anexo 2). Esse
trabalho foi realizado após a aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara, UNESP (Anexo 3).
14
A coleta da urina foi realizada em frascos de polietileno durante o dia de
trabalho, até a obtenção de aproximadamente 1000mL. Entre as coletas a urina foi mantida sob
refrigeração. A concentração e extração dos compostos presentes na urina seguiu a metodologia
descrita por Yamasaki e Ames (1977), utilizando a resina XAD-2, com algumas modificações. A
resina foi previamente lavada por agitação e decantação várias vezes com água MilliQ, seguida
de metanol. Depois de lavada, a resina passou por soxhlet com metanol em ebulição por 16
horas, e foi armazenada no mesmo solvente a temperatura ambiente até seu uso.
As colunas de vidro com 0,7cm de diâmetro x 10cm foram previamente lavadas
com água destilada e na seqüência adicionou-se 0,7g de resina. Para ambientar a resina, foi
percolada água milliQ, em seguida a amostra de urina (previamente filtrada e com pH corrigido
para 7,0 com NaOH 0,5M) foi percolada com fluxo de 2-3mL de urina/minuto. Os compostos
adsorvidos pela resina foram eluídos em 10 mL de acetona. Usou-se o rotaevaporador (45°C) e
Concentrator 5301 (Eppendorf
®
), para evaporar todo o solvente.
O extrato seco foi dissolvido na proporção de 0,4mL de DMSO para cada
100mL equivalente urina, e armazenado a -20°C até o uso. Foram avaliadas 4 concentrações de
cada amostra de urina, a saber: 1,5; 3,0; 6,0 e 12,0mL equivalente urina/placa (EINISTÖ, et al.
1990).
Anteriormente, aos ensaios de mutagenicidade com as amostras de urina, a
resina XAD-2 foi testada. Adotou-se o mesmo procedimento para a adsorção, eluição e
concentração das amostras de urina, no entanto, a urina foi substituída por água milliQ. Em
seguida, esse extrato (branco da resina XAD-2) foi também avaliado nos ensaios com
Salmonella/microssomo.
15
3.2. Avaliação da mutagenicidade
3.2.1. Ensaio de mutação gênica reversa
O ensaio de mutação gênica reversa utilizado nesse trabalho foi o Teste de Ames
que baseia-se na utilização de linhagens de Salmonella typhimurium auxotróficas para o
aminoácido histidina, as quais revertem à prototrofia pelo tratamento com agentes mutagênicos
(MARON & AMES,1983).
3.2.2. Linhagens de Salmonella typhimurium
Foram utilizadas linhagens de Salmonella typhimurium TA100, gentilmente
fornecida pelo Prof. Dr. Bruce Ames da Universidade de Berkeley, California, EUA e a cepa
YG1024 gentilmente cedida pelos Drs. Takehito Nohmi e Watanabe Masahiko do Instituto
Nacional de Ciências Higiênicas, Tókio, Japão. Essas linhagens (Tabela 1) são auxotróficas em
relação à histidina, que detectam preferencialmente mutágenos que causam deslocamento do
quadro de leitura ou substituição de pares de bases do DNA. Essas cepas possuem várias
mutações no operon da histidina que são os alvos para mutação reversa, bem como mutações do
tipo rfa que causam perda parcial da barreira lipopolissacarídica da parede bacteriana, facilitando
a difusão de moléculas grandes para o interior da célula, a deleção do gene uvrB que causa
deficiência do sistema de reparo por excisão e fator R plasmidial (plasmídio pKM101) que
confere resistência à ampicilina e contém os genes muc AB, cuja expressão causa estímulo no
sistema de reparo suscetível ao erro (error prone). Essas mutações lhes conferem maior
sensibilidade na detecção de diversos mutágenos.
A linhagem YG1024 apresenta mutação no gene hisD (his D3052) que codifica
para histidinol desidrogenase, apresentando como ponto preferencial para reversão oito resíduos
16
repetitivos de GC e detecta compostos mutagênicos que causam deslocamento do quadro de
leitura do DNA, além de superproduzir O-acetiltransferases. É uma linhagem mais sensível na
detecção de compostos hidroxilaminos, nitro aromáticos e aminas aromáticas (WATANABE et
al., 1990).
A TA100 detecta mutágenos que causam substituição de pares de bases no
DNA. Contém uma mutação no gene hisG (hisG46) que codifica para a primeira enzima da
biossíntese da histidina, tendo o par GC como ponto preferencial para a reversão (MARON &
AMES, 1983).
Tabela 1: Descrição comparativa das linhagens bacterianas
Linhagem bacteriana Descrição
TA100 – rfa, ∆ uvrB, hisG46, bio
−
,
PKM101
Linhagem que tem o par GC como ponto
preferencial para a reversão
YG1024 –TA98 com pYG219 Linhagem derivada da TA98 com plasmídio que
aumenta a atividade da O-acetiltransferase.
3.2.3. Meios de cultura
Os meios de cultura foram preparados de acordo com as especificações de
Maron & Ames (1983).
O crescimento das linhagens de S. typhimurium foi realizado em caldo nutriente
Oxoid n.2 e o ágar nutriente foi elaborado a partir do caldo nutriente, com ou sem ampicilina,
dependendo do ensaio, solidificado com 1,5% de ágar (Difco).
17
Nos ensaios de mutagenicidade foi usado ágar mínimo glicosado com traços de
histidina/biotina, constituído de ágar glicose (20g de glicose, 15g de ágar e 930 mL de àgua
destilada) e meio Vogel Bonner E 50x concentrado (10g de sulfato de magnésio heptahidratado,
100g de ácido cítrico, 175g de fosfato de sódio de amônio, 500g de fosfato de potássio dibásico e
670 mL de água respectivamente, acrescido de 10 mL de uma solução de L-histidina 0,096
mg/mL (Sigma) e D-biotina 0,123 mg/mL (Sigma). O ágar de superfície (top agar) foi composto
de 0,5% de cloreto de sódio e 0,6% de ágar.
Os meios de cultura foram preparados e esterilizados em autoclave a 121º C por
15 minutos quando não especificados.
3.2.4. Manutenção e estoque das culturas
As cepas de S. typhimurium foram armazenadas em freezer -80º C, em frascos
para congelamento com 0,9 mL de cultura e 0,1 mL de DMSO como agente crioprotetor.
3.2.5. Confirmação dos genótipos das linhagens de S. typhimurium
a) Auxotrofia para histidina
As culturas bacterianas foram estriadas com alça de platina em placas controle
de ágar mínimo acrescidas de histidina e biotina e em placas testes contendo apenas biotina. A
biotina é requerida, uma vez que a deleção do gene uvrB se estende até o gene responsável por
sua síntese. Após incubação por 24h a 37ºC, as placas testes contendo apenas biotina não devem
apresentar crescimento, enquanto as placas suplementadas com histidina e biotina apresentam
crescimento.
b) Mutação rfa
18
A mutação no gene rfa confere sensibilidade ao cristal violeta. As culturas de S.
typhimurium foram inoculadas em placas de ágar nutriente utilizando-se de cotonetes estéreis de
forma a se obter um crescimento homogêneo. A seguir, foi colocado no centro da placa, um disco
de papel de filtro de 5mm de diâmetro embebido com 10 µL de uma solução de cristal violeta a
1%. As cepas devem apresentar um halo de inibição de, no mínimo 14 mm de diâmetro após
incubação a 37º C por 24h.
c) Plasmídeo pKM101
A presença do plasmídeo pKM101 foi confirmada através da resistência ao
antibiótico ampicilina. As culturas bacterianas foram semeadas perpendicularmente a uma estria
de solução de ampicilina 8mg/mL em placas de ágar nutriente. Após incubação a 37ºC por 24h,
as cepas portadoras do plasmídeo pKM101 apresentam crescimento contínuo através das estrias
da solução de ampicilina.
d) Deleção uvrB
A mutação uvrB confere sensibilidade à radiação ultravioleta, devido à
deficiência no mecanismo de reparo por excisão. As culturas de Salmonella foram semeadas em
placas de ágar nutriente utilizando-se cotonetes estéreis. A seguir, metade da placa foi coberta
com papel alumínio e irradiada com lâmpada germicida (ultravioleta) de 15watts a uma distância
de 33cm por 8 segundos. Após incubação a 37ºC por 24h, as cepas portadoras dessa deleção
crescem apenas na metade da placa não irradiada (coberta).
e) Taxa de reversão espontânea
A taxa de reversão espontânea foi determinada inoculando-se 100µL de cada
cultura (10
9
bactérias) em 2 mL de ágar de superfície estabilizado a 45ºC e vertendo-se essa
mistura, após homogeneização, sobre uma placa de ágar mínimo. O ensaio foi realizado em
19
triplicata e o número de colônias revertentes espontâneas obtidas após 48h de incubação a 37º C
deve estar dentro da faixa esperada para cada cepa, a saber :
TA100: 75 - 225 revertentes/ placa
YG1024 : 20 - 75 revertentes /placa.
3.2.6. Sistema de ativação metabólica
Os testes de mutagenicidade foram realizados em presença e ausência de
ativação metabólica. O sistema utilizado foi a fração microssomal S9 (S9 mix ) preparada a partir
de homogeneizados de fígado de ratos Sprague Dawley, previamentes tratados com Arocloror
1254, adquiridos sob a forma liofolizada da Moltox Molecular Toxicology Inc., Annapolis, USA.
Volumes adequados da mistura de ativação S9 foram preparados no momento do
ensaio e mantidos em gelo durante sua execução. Após o ensaio, a mistura não utilizada foi
descartada. Foi utilizada a mistura padrão recomendada por Maron & Ames (1983), constituída
de 4% de fração S9; 1% de cloreto de magnésio 0,4M; 1% de cloreto de potássio 1,65M; 0,5% de
D-glicose-6-fosfato 1 M; 4% de B- nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato 0,1 M; 50 % de
tampão fosfato de sódio 0,2 M pH 7,4 (81% de fosfato de sódio dibásico 0,2 M e 19 % de fosfato
de sódio monobásico 0,2 M) e 39,5% de água destilada estéril. Todos os reagentes, quando não
especificados foram procedentes da Sigma e Merck.
3.2.7. Procedimento do ensaio de acordo com Maron e Ames (1983)
Para a realização experimental do teste de mutagenicidade foi utilizado o
método de pré-incubação, empregando as linhagens TA100 e YG1024. O método de pré-
incubação é uma modificação do ensaio padrão de incorporação em placa, primeiramente
introduzido por Yahagi et al. (1975) a fim de detectar a atividade mutagênica de tinturas
20
carcinogênicas. Nessa técnica, a bactéria, a substância teste e a mistura S9, quando usada, são
incubadas antes de serem transferidas para a placa com ágar. Para o início dos ensaios as
bactérias foram inoculadas com a alça de platina em 30mL de caldo nutriente e mantidas a 37ºC,
sob agitação constante (160rpm) durante 14 h, de modo a se obter uma densidade de 1 a 2x 10
9
bactérias/mL. Em tubos de ensaio foram colocados 0,1mL da cultura (pernoite) de bactérias, a
concentração adequada do extrato seco dissolvido em DMSO e 0,5mL de tampão fosfato pH 7,4
nos ensaios sem metabolização. Nos ensaios com ativação metabólica foi adicionado 0,5mL da
mistura S9 (fração pós-mitocondrial, suplementada com cofatores e preparada a partir de fígado
de ratos tratados com agentes indutores de enzimas Arocloror 1254). A mistura S9 revela se a
substância ou amostra é mutagênica em sua forma original ou se necessita ser metabolizada ou
ativada para ser mutagênica. Os tubos assim compostos foram incubados a 37º C durante 20
minutos. Após esse tempo, foram adicionados 2mL de ágar superfície acrescido de uma solução
de histidina/biotina 0,05mM na proporção de 10/100 mL. Em seguida, os tubos foram agitados e
vertidos em placas de Petri que já continham o meio mínimo glicosado. Estas placas foram
incubadas por 48 horas a 37º C. Transcorrido o tempo necessário, foi efetuada a contagem das
colônias revertentes. Todas as concentrações testadas (que foram em número de 4), controles
positivos e negativos foram realizados em triplicata.
3.2.8. Controles
Paralelamente a cada ensaio, foram realizados controles positivo e negativo.
Como controle negativo foi usado o DMSO, o solvente do extrato. O volume de DMSO usado foi
de 50µL. Os controles positivos são compostos mutagênicos específicos para cada cepa e
condição do ensaio, sendo: 4-nitro-fenilenediamina para cepa YG1024 e azida sódica para
21
TA100, em ensaios sem fração S9; 2-antramina para TA100 e YG1024 em ensaios com ativação
metabólica.
3.3. Estudo dos polimorfismos enzimáticos
3.3.1. Extração e quantificação do DNA genômico
A extração do DNA foi feita de sangue total (EDTA) fresco, utilizando o Kit
WIZARD
(Genomic DNA Purification Kit) da Promega, de acordo com o protocolo fornecido
pelo fabricante. A quantificação do DNA foi feita por absorbância UV, de modo a ser estocado
em alíquotas de 25 µl, à concentração de 50 ng/µl, e mantido à -4°C até o uso.
3.3.2. Amplificação das seqüências de DNA e detecção dos genótipos
Para todos os polimorfismos estudados, os fragmentos foram amplificados no
termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc) e submetidos à eletroforese (95V) em cuba contendo
tampão TBE 0,5X (LGG Biotecnologia), para a detecção dos genótipos GSTM1, GSTT1 e
CYP2E1.
As reações foram visualizadas em gel de agarose (Labtrade) 2,0% feito também
com tampão TBE 0,5X e corado com 2 µl de brometo de etídio (na concentração de 10 mg/ml), e
4 µl de tampão de amostra (0,25% de azul de bromofenol, 15% de Ficoll em água) para a
visualização da corrida. Na eletroforese para a detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 usou-se
95V, assim como na primeira eletroforese para o genótipo CYP2E1. Após a digestão dos
produtos da PCR para o CYP2E1 a eletroforese foi feita em 60V.
22
Para comparar o peso das bandas foi usado marcador de peso molecular de 100
pares de base (pb) diluído. Em todos os casos, foi usado também um branco (todos os reagentes
exceto o DNA), com o intuito de assegurar que não houve contaminação das amostras. Os géis
foram observados e fotografados com filme polaróide em transiluminador de luz ultravioleta.
3.3.3. Detecção dos genótipos GSTM1 e GSTT1 por PCR- multiplex
A reação de co-amplificação em cadeia foi realizada baseada no protocolo para
PCR Multiplex de Abdel-Rahman et al. (1996) modificado, onde foram utilizados: 21,5µl de
PCR mix (Invitrogen); 1,0 µl (100ng/µl) de cada primer (Invitrogen): GSTM1 (5’-
GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC e 5’-GTTGGGCTCAAATATACGGTGG), GSTT1: (5’-
TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC e 5’-TCACCGGATCATGGCCAGCA) e CYP1A1(5’-
GAACTGCCACTTCAGCTGTCT e 5’-CAGCTGCATTTGGAAGTGCTC) e 2,0 µl (100 ng) de
DNA genômico. Os ciclos de co-amplificação foram de: 95°C por 5 minutos, 30 ciclos de 94°C
por 2 min., 59°C por 1 min. e 72°C por 1 min., seguidos de uma extensão final (4 min. a 72°C).
Os primers para CYP1A1 amplificam um fragmento constante de 312 pb, o qual
foi usado como controle interno da reação, excluindo a possibilidade de uma falsa interpretação
dos resultados devido à ausência da reação de amplificação. O fragmento de 215 pb pode ser
visto somente nos casos de indivíduos que possuem o gene GSTM1. O fragmento de 480 pb pode
ser visto somente nos casos de indivíduos que possuem o gene GSTT1. A ausência de
amplificação GSTM1 (215 pb) ou GSTT1 (480 pb), na presença de controle interno, indica os
respectivos genótipos nulos para cada gene.
23
3.3.4. Detecção do genótipo CYP2E1-PstI
A reação de amplificação em cadeia por PCR e o polimorfismo RFLP
(polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição) PstI do gene CYP2E1, foi realizada de
acordo com Anwar et al. (1996) modificado, onde foram utilizados: 21,5µl de PCR mix
(Invitrogen); 1,0 µl (100ng/µl) de cada primer (Invitrogen): CYP2E1
1
(5’ CCA GTC GAG TCT
ACA TTG TCA 3’) e CYP2E1
2
(5’ TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG 3’) e 2,0 µl (100 ng) de
DNA genômico. Os ciclos de amplificação foram de: 95°C por 1 minuto, 26 ciclos de 95°C por 1
min., 55°C por 1 min. e 72°C por 1 min., seguidos de uma extensão final (4 min. a 72°C).
Após a reação de amplificação, 20µl do produto de PCR foram digeridos com
6U (0,3µl) da enzima PstI (Gibco - BRL), 2,2µl de H
2
O e 2,5µl de tampão React 2, a 37
o
C por 1
hora, e então analisado em gel de agarose (Gibco-BRL) 2,0% submetido a eletroforese a 60V.
O par de primers CYP2E1
1
e CYP2E1
2
gera um produto de amplificação
constante de 410pb, referente ao genótipo homozigoto normal (c1/c1), o qual não sofre ação da
enzima PstI, originando uma banda não clivada. O genótipo homozigoto mutante (c2/c2) possui
um sítio para a enzima de restrição PstI, que cliva o produto da amplificação, gerando uma banda
de 290 e outra de 120pb, e o genótipo heterozigoto (c1/c2) apresenta as três bandas: 410, 290 e
120pb.
24
4. Avaliação e interpretação dos resultados
Os dados da mutagenicidade urinária foram analisados utilizando o programa
estatístico Salanal elaborado e gentilmente cedido pelo Dr. L. Myers do Research Triangle
Institute, RTP, Carolina do Norte, USA. Esse programa permite avaliar o efeito dose-resposta
através do cálculo da análise de variância (ANOVA – teste F) entre as médias do número de
revertentes nas diferentes doses testadas e o controle negativo, seguido de uma regressão linear.
A inclinação da reta da parte linear da curva dose-resposta é também fornecida por esse programa
e por extrapolação fornece a potência mutagênica de cada amostra, que corresponde ao número
de revertentes induzidos por mL equivalente de urina.
A partir dos resultados obtidos, foi calculado o razão de mutagenicidade (RM)
para cada dose analisada, que é a média do número de revertentes na placa teste (espontâneos
mais induzidos) dividida pela média do número de revertentes por placa do controle negativo
(espontâneos). A amostra foi considerada positiva quando a razão de mutagenicidade (RM) foi
maior ou igual a 2 em pelo menos uma das doses testadas e quando houve uma relação dose
resposta entre as concentrações testadas e o número de revertentes induzidos (VALENT et al.,
1993; VARGAS et al., 1993; VARELLA et al., 2004b). Por sua vez, a amostra foi considerada
25
negativa para o teste de Ames, quando a mesma não induziu aumento significativo no número de
revertentes e seus RM foram todos menores que 2.
Os dados da mutagenicidade urinária dos grupos controle e exposto, foram
comparados utilizando o programa estatístico BioEstat 2.0, através do teste de Mann-Whitney
(significância a 5%). O mesmo teste estatístico, foi utilizado para determinar a dependência entre
mutagenicidade urinária e os polimorfismos genéticos dos genes GSTM1,GSTT1 e CYP2E1, de
todos os indivíduos amostrados.
A dependência entre as variáveis, sexo, idade e etnia, e o genótipo foram
avaliadas usando o teste do χ
2
(qui-quadrado).
26
5. Resultados
5.1. Caracterização das amostras estudadas
Foram avaliados 60 indivíduos, divididos em dois grupos, controle (C) e exposto
(E). Na Tabela 2 onde indivíduos estão pareados segundo o sexo e a idade (± 7anos), observa-se
que a maioria é do sexo feminino (20 em cada grupo) , pertencente ao grupo étnico caucasiano
(19 e 18, grupo controle e exposto, respectivamente) e com faixa etária entre 19 e 54 anos (28 ±9
e 29,3 ± 7,7; grupo controle e exposto, respectivamente). No restante das tabelas, os indivíduos
não estão pareados segundo o sexo e a idade.
Tabela 2: Caracterização dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação ao sexo,
grupo étnico e idade.
Código Sexo F/M Etnia Idade
(anos)
Código Sexo F/M Etnia Idade
(anos)
07C M C 42 36E M C 35
11C M C 39 30E M C 33
36C M C 33 45E M C 33
18C M C 27 50E M C 32
27
22C M C 26 10E M C 32
Continuação
Código Sexo F/M Etnia Idade
(anos)
Código Sexo F/M Etnia Idade
(anos)
33C M C 25 07E M C 27
23C M C 25 38E M N 27
35C M C 23 47E M C 22
21C M C 22 44E M C 20
19C M C 20 16E M O 20
02C F C 49 31E F C 54
32C F C 48 06E F C 49
04C F C 43 23E F C 38
27C F C 42 02E F C 35
13C F C 34 18E F C 33
09C F C 30 40E F C 32
08C F C 29 17E F C 31
16C F C 29 09E F C 30
24C F C 28 39E F C 30
34C F C 25 19E F C 29
39C F C 23 27E F C 28
14C F C 22 48E F N 27
29C F C 21 29E F C 26
20C F C 20 26E F C 23
25C F C 20 35E F C 23
26C F C 20 46E F C 23
17C F C 19 28E F C 23
37C F C 19 33E F C 22
30C F N 19 54E F C 22
38C F C 19 43E F O 21
C: grupo controle; E: grupo exposto, M:sexo masculino; F: sexo feminino; C: caucasianos; N: negros e O: orientais.
28
Tabela 3: Caracterização dos indivíduos, através da freqüência, segundo os hábitos alimentares,
consumo de bebidas alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de exposição.
Consumo de
vegetais
Consumo de
bebidas alcoólicas
Uso de
medicamentos
Tempo de exposição
GRUPO
CONTROLE
2 (6,7%) não comem 7 (23,3%) não bebem 1 (3,3%) ansiolíticos
28 (93,3%) comem 14 (46,7%) bebem
eventualmente
2 (6,7%) analgésicos
9 (30%) 1-4
copos/semana
3 (10%) outros
24 (80%) nenhuma
medicação
GRUPO
EXPOSTO
2 (6,7%) não comem 9 (30%) não bebem 1 (3,3%) ansiolíticos
17 (56,6%) 1-5anos
28 (93,3%) comem 13 (43,3%) bebem
eventualmente
3 (10%)
antiinflamatórios
7 ( 23,3%) 6-10 anos
8 (26,7%) 1-4
copos/semana
7 (23,4%)
analgésicos
6 (20%) mais de 10
anos
3 (10%) outros
16 (53,3%) nenhuma
medicação
F: sexo feminino; M: sexo masculino; (freqüência/30 indivíduos).
A Tabela 3 apresenta, a caracterização dos indivíduos que participaram desse estudo,
através da distribuição da freqüência, segundo o consumo de vegetais, consumo de bebidas
alcoólicas, uso de medicamentos e tempo de exposição aos soleventes orgânicos. Dos indivíduos
de cada grupo, 6,7% não comem vegetais, 3,3% usam ansiolíticos e 10% outros tipos de
medicamentos. Entre os voluntários desse estudo, grupo controle e exposto, respectivamente,
80% e 53,4% não tomam nenhum tipo de bebida alcoólica, 46,7% e 43,3% eventualmente tomam
bebidas com teor alcoólico, 30% e 26,7% apresentam um consumo de bebida alcoólica entre 1 a
4 copos por semana., 6,7% e 23,4% fazem uso de analgésicos, 80% e 53,3% não tomam nenhuma
medicação. Apenas os voluntários (10%) do grupo exposto tomam antiinflamatórios. Todos os
voluntários foram orientados para fazer a coleta de urina quando não tivessem usando
29
medicamentos. O tempo de exposição a solventes orgânicos variou de 1 a 21anos. Dentre os
voluntários, o tempo de exposição variou entre 1 e 5 anos em 56,7% , 6 e 10 anos em 23,3% e,
mais que 10 anos em 20% dos indivíduos avaliados.
5.2. Atividade mutagênica dos extratos orgânicos de urina
A atividade mutagênica dos extratos orgânicos da urina do grupo controle (C) e
do grupo exposto (E) a solventes orgânicos, adsorvidos pela resina XAD-2, foi avaliada através
de ensaios com mutação gênica reversa em Salmonella typhimurium usando-se as linhagens
TA100 e YG1024, tanto na presença quanto na ausência de metabolização. Anteriormente aos
ensaios de mutagenicidade com as amostras de urina, foi feito um branco para a resina XAD-2,
realizando-se o mesmo procedimento de adsorção, eluição e concentração adotados para a
obtenção dos extratos orgânicos de urina, porém, a urina foi substituída por água milliQ. Em
seguida, esse extrato (branco) foi avaliado no teste de Ames, onde não apresentou atividade
mutagênica.
Nas tabelas de 4 e 5 estão os resultados obtidos nos ensaios das amostras de
urina dos grupos controle e exposto, respectivamente, com análise estatística descritiva indicando
média (M), desvio padrão (SD) do número de revertentes his+/placa e razão de mutagenicidade
(RM) nas diferentes doses testadas, com as linhagens TA100 e YG1024, tanto em presença (+S9)
como ausência (-S9) de metabolização.
Do total de amostras avaliadas, 10 apresentaram resultados significativos para
RM e efeito dose-resposta, sendo, 3 amostras pertencentes ao grupo controle (04C, 17C e 36C) e
o restante ao grupo exposto (02E, 09E, 39E, 40E , 44E, 45E e 54E).
As amostras 04C e 17C (Tabela 4) foram mutagênicas na linhagem TA100 (-
S9) com RM entre 1,3 e 2,5, e número de colônias his+ revertentes entre 141 e 390. Foi
30
observada atividade mutagêncica positiva da amostra 36C (Tabela 4) apenas na linhagem
YG1024 (-S9), os valores de RM variaram de 1,6 a 2,0, com valores de 43 a 55 no número de
colônias his+ revertentes.
Foi observada atividade mutagênica das amostras 02E, 09E, 39E, 40E, 44E e
45E (Tabela 5) na linhagem YG1024, com metabolização. O valor de RM variou de 1,3 a 3,3 e o
número de colônias his+ revertentes variou de 29 a 88. A amostra 54E (Tabela 5) foi mutagênica
para a linhagem YG1024, apenas na ausência de metabolização, com RM entre 1,9 e 2,2 e
número de colônias his+ revertentes entre 48 e 60.
A Tabela 6, mostra as potências mutagênicas (número de revertentes his+/mL
equivalente urina) das amostras do grupo controle e exposto, que apresentaram resposta
mutagênica positiva, em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com metabolização ou
sem metabolização).
Em ensaios com a linhagem TA100, em ausência de metabolização, duas
amostras do grupo controle apresentaram potências de 2,3 e 19,2 revertentes/mL equivalente de
urina. Para a linhagem YG1024 (-S9), apenas uma amostra do grupo controle (13,8
revertentes/mL equivalente de urina) e uma do grupo exposto (2,6 revertentes/mL equivalente de
urina) apresentaram atividade mutagênica. Porém, em presença de S9, seis amostras de urina do
grupo exposto foram positivas, com potências que variaram de 1,8 a 25,1 revertentes/mL
equivalente de urina.
A Tabela 7, mostra os maiores valores de RM obtidos para o grupo exposto e
controle e, as Figuras 2 a 5 ilustram esses resultados. Verificou-se que os valores do RM das
amostras de urina em ensaios com a linhagem YG1024 em presença do sistema de ativação
metabólica (Figura 5), demonstram um número maior de amostras com RM 2,0 no grupo
exposto, quando comparado ao número de amostras com a mesma característica no grupo
31
controle. Em ausência de S9 (Figura 4), observa-se um perfil semelhante, em ambos os grupos
(exposto e controle); destacando-se duas amostras do grupo controle (36C e 38C). Por outro
lado, na Figura 2, observa-se que para a linhagem TA100 (-S9), o grupo controle apresentou um
número maior de extratos urinários com RM 2,0; comparado ao grupo exposto aos solventes.
Em presença de metabolização (Figura 3), observa-se um perfil semelhante, em ambos os grupos
(exposto e controle). Analisando estatisticamente (Tabela 7), esses dados mostram um aumento
significativo (p = 0,008) nos valores de RM das amostras de urina do grupo exposto, comparado
ao grupo controle, apenas para a linhagem YG1024 (+S9).
A Tabela 8, mostra o índice de aumento relativo (maior número de revertentes
his+ obtido de cada amostra de urina, menos o número de revertentes his+ espontâneas; dividido
pelo número de revertentes his+ espontâneas), para cada amostra de urina do grupo controle e
exposto em todos os ensaios de mutagenicidade. Esses resultados demonstram um aumento
significativo (p = 0,002) na média dos índices de aumento relativo das amostra de urina do grupo
exposto, comparado ao grupo controle, apenas para a linhagem YG1024 (+S9).
Não apresentaram nenhuma atividade mutagênica as amostras, 07C,14C e 19C
(Tabela 4), 06E, 18E e 50E (Tabela 5).
Em 24 amostras do grupo controle e em 20 amostras do grupo exposto,
observou-se apenas resultados significativos em um dos parâmetros avaliados (o efeito dose-
resposta). A linhagem YG1024 (+S9) foi a que detectou mais amostras, com efeito dose resposta
significativo, sendo 17 no grupo controle e 16 no grupo exposto.
Apresentaram indícios de citotoxicidade, avaliada pela diminuição dos
revertentes e pela análise do background law, normalmente para as maiores concentrações
testadas, as amostras: 8C, 9C, 32C (Tabela 4), 09E, 33E e 36E (Tabela 5) para a linhagem
TA100(-S9); 13C, 16C, 33C (Tabela 4), 6E, 9E, 18E, 19E, 29E e 38E (Tabela 5) para linhagem
32
TA100(+S9); 20C (Tabela 4), 6E e 48E (Tabela 5) para a linhagem YG1024 (-S9); 18E (Tabela
5) para a linhagem YG1024 (+S9).
Os resultados obtidos demonstram que apenas para a linhagem YG1024 na
presença de ativação metabólica houve aumento significativo nos valores de RM (p = 0.008) e no
índice de aumento relativo (p = 0,002), encontrados no grupo exposto em relação ao grupo
controle, sugerindo a presença de maior quantidade de mutágenos indiretos na urina dos
indivíduos expostos ocupacionalmente aos solventes.
33
Tabela 4: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de
revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo
controle (C), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença
(+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica.
Código da
amostra
mL equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ±SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
02C 0
125 ±12 116 ±5 20 ±1 22 ±1
1,5
124 ±2 (1,0) 124 ±2 (1,0) 21 ±1 (1,1) 22 ±1 (1,0)
3,0
126 ±1 (1,0) 126 ±4 (1,1) 23 ±1 (1,2) 24 ±2 (1,1)
6,0
124 ±2 (1,0) 131 ±2 (1,1)* 25 ±2 (1,3)* 27 ±1 (1,2)*
12,0
128 ±7 (1,0) 128 ±2 (1,1)* 25 ±1 (1,3)* 26 ±1 (1,2)*
04C 0
108 ±4 103 ±6 19 ±1 21 ±4
1,5
141 ±11 (1,3)* 116 ±15 (1,1) 20 ±5 (1,1) 23 ±1 (1,1)
3,0
142 ±6 (1,3) ** 111 ±9 (1,1) 24 ±6 (1,3) 25 ±2 (1,2)
6,0
158 ±4 (1,5)** 136 ±6 (1,3)** 28 ±4 (1,5)* 25 ±4 (1,2)
12,0
240 ±78 (2,2)** 155 ±8 (1,5)** 28 ±2 (1,5)** 29 ±1 (1,4)
07C 0
125 ±12 128 ±7 21 ± 3 18 ±3
1,5
145 ±16 (1,2) 151 ±33 (1,2) 20 ±1 (1,0) 16 ±3 (0,9)
3,0
140 ±3 (1,1) 132 ±9 (1,0) 24 ±2 (1,2) 22 ±2 (1,2)
6,0
136 ±25 (1,1) 135 ±2 (1,1) 21 ±2 (1,1) 18 ±1 (1,0)
12,0
125 ±32 (1,0) 140 ±2 (1,1) 26 ±2 (1,3) 20 ±3 (1,1)
08C 0
144 ±18 151 ±16 29 ±9 25 ±2
1,5
151 ±19 (1,0) 148 ±8 (1,0) 33 ±3 (1,1) 28 ±1 (1,1)
3,0
141 ±4 (1,0) 177 ±20 (1,2) 36 ± 3 (1,2) 33 ±1 (1,3)**
6,0
150 ±9 (1,0) 145 ±26 (1,0) 33 ± 2 (1,1) 26 ±1 (1,0)
12,0
123 ±6 (0,9) 138 ±40 (0,9) 33 ± 1 (1,1) 36 ±1 (1,4)**
09C 0
177 ±5 139 ±5 29 ±9 21 ±3
1,5
100 ±6 (0,6) 145 ±8 (1,0) 31 ±4 (1,1) 29 ±3 (1,4)
3,0
125 ±10 (0,7) 157 ±13 (1,1) 29 ±5 (1,0) 29 ±1 (1,4)*
6,0
120 ±6 (0,7) 149 ±3 (1,2) 27 ±4 (0,9) 32 ±3 (1,5)*
12,0
137 ±7 (0,8) 150 ±5 (1,2) 30 ±6 (1,0) 38 ±6 (1,8)*
11C 0
144 ±18 139 ±5 29 ± 9 21 ±3
1,5
157 ±26 (1,1) 154 ±2 (1,1)* 27 ± 3 (0,9) 29 ±1 (1,4)*
3,0
141 ±13 (1,0) 160 ±7 (1,2)* 26 ± 3 (0,9) 28 ±4 (1,3)
6,0
130 ±7 (0,9) 174 ±24 (1,3) 27 ± 1 (0,9) 32 ±3 (1,5)*
12,0
146 ±14 (1,0) 149 ±14 (1,1) 30 ±2 (1,0) 28 ±3 (1,3)
13C 0
168 ±4 138 ±12 29 ±9 21 ±3
1,5
178 ±19 (1,1) 166 ±25 (1,2) 23 ±4 (0,8) 28 ±3 (1,3)
3,0
185 ±4 (1,1) 162 ±21 (1,2) 27 ± 1 (0,9) 25 ±3 (1,2)
6,0
186 ±16 (1,1) 146 ±16 (1,1) 26 ±6 (0,9) 34 ±5 (1,6)*
12,0
174 ±6 (1,0) 30 ±6 (0,2) 30 ±1 (1,0) 18 ±5 (0,9)
Controle +
1271 ±44 1472 ±58 1822 ±50 1021±36
34
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
14C 0
159 ±17 136 ±7 25 ±2 38 ±6
1,5
175 ±10 (1,1) 137 ±7 (1,0) 23 ±1 (0,9) 38 ±8 (1,0)
3,0
131 ±5 (0,8) 110 ±14 (0,8) 21 ±6 (0,8) 42 ±4 (1,1)
6,0
180 ±4 (1,1) 126 ±4 (0,9) 25 ±3 (1,0) 45 ±4 (1,2)
12,0
151 ±14 (0,9) 118 ±2 (0,9) 23 ±3 (0,9) 44 ±5 (1,2)
16C 0
170 ±9 138 ±12 22 ±1 32 ±1
1,5
175 ±1 (1,0) 158 ±4 (1,1) 15 ±3 (0,7) 27 ±1 (0,8)
3,0
191 ±11 (1,1) 117 ±12 (0,8) 22 ±5 (1,0) 44 ±2 (1,4)*
6,0
177 ±5 (1,0) 111 ±2 (0,8) 22 ±3 (1,0) 38 ±0 (1,2)
12,0
194 ±1 (1,1) 103 ±7 (0,7) 23 ±3 (1,0) 34 ±1 (1,1)
17C 0
159 ±17 136 ±7 25 ±2 38 ±6
1,5
246 ±14 (1,5)** 156 ±6 (1,1) 17 ±2 (0,7) 43 ±13 (1,1)
3,0
236 ±5 (1,5)* 153 ±20 (1,1) 25 ±2 (0,9) 37 ±5 (1,0)
6,0
340 ±15 (2,1)** 195 ±7 (1,4)** 27 ±7 (1,1) 44 ±6 (1,2)
12,0
390 ±6 (2,5)** 262 ±4 (1,9)** 39 ± 8 (1,6)* 41 ±2 (1,1)
18C 0
159 ±17 136 ±7 25 ±2 38 ±6
1,5
145 ±18 (0,9) 141 ±19 (1,0) 26 ±4 (1,0) 42 ±2 (1,1)
3,0
165 ±12 (1,0) 124 ±10 (0,9) 30 ±2 (1,2) 49 ±10 (1,3)
6,0
169 ±5 (1,1) 135 ±6 (1,0) 34, ±4 (1,4) 53 ±9 (1,4)
12,0
172 ±27 (1,1) 115 ±22 (0,8) 38 ±1 (1,5)** 53 ±4 (1,4)
19C 0
129 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
123 ±6 (1,0) 162 ±12 (1,0) 26 ±4 (1,0) 20 ±2 (0,8)
3,0
130 ±3 (1,0) 166 ±4 (1,0) 24 ±4 (0,9) 21 ±6 (0,8)
6,0
128 ±4 (1,0) 159 ±6 (1,0) 25 ±2 (0,9) 22 ±5 (0,8)
12,0
128 ±1 (1,0) 166 ±2 (1,0) 30 ±1 (1,1) 25 ±4 (1,0)
20C 0
129 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
116 ±5 (0,9) 183 ±11 (1,1) 24 ±3 (0,9) 26 ±5 (1,0)
3,0
132 ±4 (1,0) 178 ±15 (1,1) 24 ±2 (0,9) 24 ±2 (0,9)
6,0
150 ±9 (1,2) 175 ±3 (1,1) 22 ±1 (0,8) 37 ±6 (1,4)
12,0
123 ±6 (1,0) 185 ±3 (1,1)* 24 ±3 (0,9) 33 ±1 (1,3)**
21C 0
129 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
191 ±12 (1,5)** 179 ±7 (1,1) 26 ±2 (1,0) 23 ±1 (0,9)
3,0
188 ±2 (1,5)** 186 ±10 (1,1) 33 ±2 (1,2) 28 ±2 (1,1)
6,0
174 ±7 (1,3)** 193 ±2 (1,2)** 29 ±2 (1,1) 30 ±1 (1,2)*
12,0
180 ±8 (1,4)** 189 ±7 (1,2)* 28 ±3 (1,0) 29 ±3 (1,1)
22C 0
128 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
135 ±6 (1,1) 189 ±6 (1,2)* 21 ±1 (0,8) 25 ±2 (1,0)
3,0
184 ±10 (1,4)** 177 ±16 (1,1) 26 ±2 (1,0) 19 ±1 (0,7)
6,0
188 ±6 (1,5)** 173 ±7 (1,1) 24 ±4 (0,9) 25 ±2 (1,0)
12,0
183 ±4 (1,4)** 195 ±3 (1,2)** 36 ±5 (1,3) 24 ±1 (1,0)
Controle +
1184 ±111 1920 ±68 1608 ±99 1720 ±244
35
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
23C 0
129 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
191 ±2 (1,5)** 181 ±10 (1,1) 24 ±2 (0,9) 29 ±2 (1,1)
3,0
180 ±13 (1,4)* 158 ±7 (1,0) 22 ±3 (0,8) 25 ±4 (1,0)
6,0
165 ±6 (1,3)* 168 ±5 (1,0) 25 ±3 (0,9) 25 ±2 (1,0)
12,0
177 ±2 (1,4)** 170 ±2 (1,0) 24 ±3 (0,9) 31 ±2 (1,2)
24C 0
128 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
169 ±16 (1,3)* 178 ±14 (1,1) 25 ±3 (0,9) 25 ±2 (1,0)
3,0
167 ±14 (1,3) * 174 ±12 (1,1) 26 ±2 (1,0) 22 ±2 (0,8)
6,0
160 ±11 (1,3)* 196 ±5 (1,2)** 24 ±4 (0,9) 26 ±4 (1,0)
12,0
144 ±23 (1,1) 196 ±5 (1,2)** 36 ±5 (1,3) 25 ±2 (1,0)
25C 0
170 ±9 162 ±6 27 ±2 26 ±1
1,5
157 ±1 (0,9) 171 ±16 (1,1) 26 ±5 (1,0) 24 ±4 (0,9)
3,0
163 ±12 (1,0) 174 ±12 (1,1) 28 ±2 (1,0) 25 ±2 (1,0)
6,0
173 ±9 (1,0) 193 ±5 (1,2)** 20 ±2 (0,7) 31 ±3(1,2)
12,0
180 ±1 (1,1) 196 ±6 (1,2)** 25 ±3 (0,9) 28 ±6 (1,1)
26C 0
145 ±14 144 ±11 22 ±4 22 ±3
1,5
157 ±11 (1,1) 141 ±21 (1,0) 27 ±3 (1,2) 27 ±2 (1,2)
3,0
142 ±11 (1,0) 207 ±22 (1,4)* 23 ±3 (1,0) 28 ±4 (1,3)
6,0
129 ±2 (0,9) 199 ±17 (1,4)* 22 ±2 (1,0) 35 ±2 (1,6)**
12,0
146 ±6 (1,0) 252 ±12 (1,8)** 30 ±1 (1,4) 37 ±2 (1,7)**
27C 0
170 ±9 144 ±11 22 ±4 22 ±3
1,5
177 ±1 (1,0) 185 ±7 (1,3)* 23 ±1 (1,0) 28 ±5 (1,3)
3,0
182 ±6 (1,1) 168 ±5 (1,2) 31 ±3 (1,4) 29 ±2 (1,3)
6,0
162 ±4 (1,0) 200 ±27 (1,4) 29 ±1 (1,3) 35 ±0 (1,6)**
12,0
174 ±4 (1,0) 200 ±3 (1,4)** 27 ± 1 (1,2) 35 ±2 (1,6)**
29C 0
136 ±4 144 ±11 23 ±5 21 ±1
1,5
132 ±3 (1,0) 142 ±12 (1,0) 25 ±1 (1,1) 20 ±1 (1,0)
3,0
133 ±12 (1,0) 143 ±7 (1,0) 27 ±3 (1,2) 24 ±2 (1,1)
6,0
134 ±15 (1,0) 146 ±18 (1,0) 30 ±2 (1,3) 27 ±2 (1,3)*
12,0
133 ±9 (1,0) 154 ±17 (1,1) 32 ±2 (1,4) 29 ±3 (1,4)*
30C 0
125 ±2 116 ±5 28 ±3 21 ±1
1,5
147 ±10 (1,2)* 115 ±2 (1,0) 25 ±2 (0,9) 26 ±4 (1,2)
3,0
155 ±8 (1,2)* 120 ±14 (1,0) 29 ±1 (1,0) 31 ±3 (1,5)**
6,0
168 ±8 (1,3)** 120 ±18 (1,0) 34 ±3 (1,2) 38 ±3 (1,8)**
12,0
175 ±5 (1,4)** 128 ±5 (1,1) 37 ±2 (1,3)* 33 ±3 (1,6)*
32C 0
125 ±2 116 ±5 28 ±3 21 ±1
1,5
112 ±17 (0,9) 112 ±3 (1,0) 24 ±2 (0,9) 24 ±3 (1,1)
3,0
99 ±5 (0,8) 137 ±10 (1,2) 32 ±4 (1,1) 25 ±2 (1,2)
6,0
117 ±22 (0,9) 115 ±6 (1,0) 26 ±3 (0,9) 27 ±1 (1,3)**
12,0
73 ±55 (0,6) 118 ±7 (1,0) 31 ±2 (1,1) 29 ±2 (1,4)**
Controle +
1184 ±111 1920 ±68 1608 ±99 1720 ±244
36
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
33C 0
125 ±2 116 ±5 28 ±3 21 ±1
1,5
142 ±6 (1,1)* 112 ±13 (1,0) 30 ±3 (1,1) 30 ±2 (1,4)**
3,0
142 ±13 (1,1) 120 ±11 (1,0) 34 ±2 (1,2) 32 ±4 (1,5)*
6,0
150 ±7 (1,2)* 126 ±17 (1,1) 34 ±2 (1,2) 34 ±5 (1,6)*
12,0
136 ±1 (1,1) 80 ±18 (0,7) 31 ±2 (1,1) 35 ±2 (1,7)**
34C 0
125 ±2 116 ±6 28 ±3 21 ±1
1,5
106 ±4 (0,8) 118 ±8 (1,0) 28 ±2 (1,0) 27 ±4 (1,3)
3,0
94 ±8 (0,8) 121 ±11 (1,0) 34 ±4 (1,2) 27 ±1 (1,3)*
6,0
140 ±8 (1,1) 115 ±7 (1,0) 38 ±4 (1,4)* 30 ±2 (1,4)**
12,0
144 ±13 (1,2) 118 ±12 (1,0) 38 ±2 (1,4)* 30 ±1 (1,4)**
35C 0
125 ±12 128 ±7 21 ±3 31 ±4
1,5
143 ±10 (1,1) 211 ±76 (1,6) 25 ±6 (1,2) 32 ±4 (1,0)
3,0
126 ±9 (1,0) 149 ±8 (1,2) 19 ±2 (0,9) 31 ±3 (1,0)
6,0
158 ±6 (1,3)* 189 ±17 (1,5)* 21 ±2 (1,0) 33 ±3 (1,1)
12,0
150 ±13 (1,2) 160 ±19 (1,3) 21 ±1 (1,0) 38 ±9 (1,2)
36C 0
125 ±12 128 ±7 27 ±2 31 ±4
1,5
121 ±8 (1,0) 131 ±3 (1,0) 48 ± 7 (1,8)* 27 ±1 (0,9)
3,0
129 ±5 (1,0) 145 ±20 (1,1) 52 ±7 (1,9)* 35 ±9 (1,1)
6,0
115 ±16 (0,9) 148 ±19 (1,2) 55 ±7 (2,0)** 39 ±1 (1,3)
12,0
114 ±13 (0,9) 138 ±2 (1,1) 43 ±5 (1,6)* 43 ±7 (1,4)
37C 0
144 ±11 136 ±4 19 ±1 21 ±2
1,5
155 ±20 (1,1) 122 ±14 (0,9) 21 ±1 (1,1) 23 ±1 (1,1)
3,0
151 ±22 (1,0) 142 ±6 (1,0) 21 ±1 (1,1) 24 ±2 (1,1)
6,0
177 ±23 (1,2) 146 ±14 (1,1) 22 ±1 (1,2) 28 ±1 (1,3)*
12,0
137 ±14 (1,0) 136 ±42 (1,0) 22 ±2 (1,2) 21 ±1 (1,0)
38C 0
125 ±12 136 ± 4 27 ±2 31 ±4
1,5
116 ±7 (0,9) 132 ±4 (1,0) 52 ± 6 (1,9)* 29 ±4 (0,9)
3,0
115 ±4 (0,9) 133 ±8 (1,0) 46 ± 5 (1,7)* 29 ±4 (0,9)
6,0
128 ±3 (1,0) 146 ±17 (1,1) 42 ±8 (1,6) 32 ±2 (1,0)
12,0
133 ±10 (1,1) 130 ±9 (1,0) 42 ±12 (1,6) 27 ±3 (0,9)
39C 0
144 ±11 136 ±4 19 ±1 21 ±2
1,5
146 ±4 (1,0) 136 ±4 (1,0) 22 ±1 (1,2) 25 ±3 (1,2)
3,0
149 ±4 (1,0) 135 ±2 (1,0) 23 ±3 (1,2) 25 ±4 (1,2)
6,0
151 ±2 (1,0) 141 ±13 (1,0) 21 ±2 (1,1) 29 ±1 (1,4)*
12,0
155 ±4 (1,1) 133 ±12 (1,0) 21 ±1 (1,1) 27 ±2 (1,3)
Controle +
1010 ±12 2033 ±81 1240 ±107 1034 ±60
0 : controle negativo = 50µL DMSO
Controle positivo : –S9 → 10,0 µg/placa de 4-nitro-o-fenilenediamina para a YG1024 e 1,25µg/placa de azida sódica
para a TA100 ; +S9 → 0,63µg/placa de 2-antramina
* significância a 5%; ** significância a 1% (ANOVA).
37
Tabela 5: Atividade mutagênica expressa pela média (M) e desvio padrão (SD) do número de
revertentes/placa e razão de mutagenicidade (RM) dos extratos orgânicos de urina do grupo
exposto (E), nas diferentes doses, utilizando-se as linhagens TA100 e YG1024 tanto na presença
(+S9) quanto na ausência (-S9) de ativação metabólica.
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
02E 0
170 ±9 138 ±12 29 ±9 23 ±2
1,5
168 ±4 (1,0) 138 ±25 (1,0) 24 ±1 (0,8) 35 ±5 (1,5)*
3,0
186±4 (1,1) 158 ±8 (1,1) 23 ±1 (0,8) 52 ±4 (2,3) **
6,0
182 ±5 (1,1) 130 ±5 (0,9) 25 ±4 (0,9) 48 ±3 (2,1)**
12,0
185 ±24 (1,1) 163 ±20 (1,2) 29 ±1 (1,0) 33 ±1 (1,4)**
06E 0
125 ±12 128 ±7 21 ±3 18 ±3
1,5
143 ±8 (1,1) 144 ±16 (1,1) 23 ±3 (1,1) 17 ±2 (0,9)
3,0
117 ±6 (0,9) 149 ±24 (1,2) 24 ±1 (1,1) 21 ±6 (1,2)
6,0
133 ±13 (1,1) 181 ±23 (1,4) 25 ±1 (1,2) 25 ±6 (1,4)
12,0
129 ±5 (1,0) 79 ±9 (0,6) 17 ±2 (0,8) 17 ±1 (0,9)
07E 0
168 ±4 138 ±12 29 ±9 23 ±2
1,5
173 ±9 (1,0) 135 ±13 (1,0) 29 ±4 (1,0) 28 ±3 (1,2)
3,0
194 ±7 (1,2)* 138 ±17 (1,0) 26±5 (0,9) 36 ±3 (1,6)**
6,0
190 ±8 (1,1)* 151 ±5 (1,1) 26 ±4 (0,9) 32 ±4 (1,4)*
12,0
191 ±20 (1,1) 137 ±8 (1,0) 31 ±4 (1,1) 33 ±6 (1,4)
09E 0
177 ±5 138 ±12 29 ±9 23 ±2
1,5
135 ±13 (0,8) 144 ±10 (1,0) 26 ±2 (0,9) 46 ±5 (2,0)**
3,0
124 ±10 (0,7) 117 ±18 (0,8) 28 ±5 (1,0) 38 ±4 (1,7)**
6,0
120 ±13 (0,7) 147 ±16 (1,1) 29 ±4 (1,0) 51 ±4 (2,2)**
12,0
130 ±8 (0,7) 100 ±9 (0,7) 31 ±5 (1,1) 39 ±3 (1,7)**
10E 0
168 ±4 138 ±12 29 ±9 23 ±2
1,5
134 ±13 (0,8) 133 ±17 (1,0) 26 ±2 (0,9) 37 ±4 (1,6)**
3,0
171 ±33 (1,0) 149 ±16 (1,1) 25±3 (0,9) 40 ±5 (1,7)**
6,0
142 ±23 (0,8) 145 ±11 (1,1) 28 ±3 (1,0) 31 ±1 (1,3)**
12,0
166 ±12 (1,0) 141 ±10 (1,0) 27 ±4 (0,9) 43 ±3 (1,9)**
16E 0
144 ±18 139 ±5 21 ±4 23 ±2
1,5
173 ±7 (1,2) 154 ±17 (1,1) 21 ±1 (1,0) 39 ±4 (1,7)**
3,0
150 ±10 (1,0) 133 ±16 (1,0) 24 ±4 (1,1) 38 ±6 (1,7)*
6,0
148 ±6 (1,0) 139 ±7 (1,0) 23 ±2 (1,1) 37 ±4 (1,6)*
12,0
165 ±9 (1,1) 155 ±6 (1,1) 26 ±3 (1,2) 35 ±4 (1,5)*
17E 0
129 ±8 162 ±6 27 ±2 26 ±2
1,5
150 ±43 (1,2) 157 ±45 (1,0) 25 ±4 (0,9) 27 ±2 (1,0)
3,0
185 ±10 (1,4)** 192 ±11 (1,2)* 25 ±5 (0,9) 30 ±2 (1,2)
6,0
191 ±7 (1,5)** 176 ±10 (1,1) 20 ±2 (0,7) 28 ±3 (1,1)
12,0
194 ±3 (1,5)** 210 ±10 (1,3)** 25 ±3 (0,9) 29 ±1 (1,1)
Controle +
1944 ±43 1950 ±64 1521 ±106 1911 ±62
38
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
18E 0
159 ±17 136 ±7 25 ±2 38 ±6
1,5
158 ±20 (1,0) 139 ±12 (1,0) 20 ±1 (0,8) 39 ±3 (1,0)
3,0
154 ±7 (1,0) 126 ±5 (0,9) 21 ±3 (0,8) 34 ±10 (0,9)
6,0
203 ±12 (1,3) 106 ±18 (0,8) 27 ±2 (1,1) 30 ±6 (0,8)
12,0
187 ±2 (1,2) 115 ±8 (0,8) 30 ±5 (1,2) 17 ±5 (0,4)
19E 0
168 ±4 138 ±11 29 ±9 23 ±2
1,5
181 ±24 (1,1) 155 ±8 (1,1) 29 ±6 (1,0) 28 ±7 (1,2)
3,0
173 ±19 (1,0) 132 ±16 (1,0) 31 ±5 (1,1) 31 ±6 (1,3)
6,0
156 ±17 (0,9) 121 ±10 (0,9) 30 ±5 (1,0) 37 ±3 (1,6)**
12,0
177 ±6 (1,1) 95 ±16 (0,7) 31 ±2 (1,1) 34 ±2 (1,5)**
23E 0
145 ±14 146 ±11 22 ±4 22 ±3
1,5
216 ±30 (1,5)* 137 ±15 (0,9) 22 ±2 (1,0) 25 ±3 (1,1)
3,0
264 ±13 (1,8)** 153 ±22 (1,0) 23 ±1 (1,0) 29 ±1 (1,3)*
6,0
260 ±25 (1,8)** 179 ±23 (1,2) 27 ±2 (1,2) 31 ±2 (1,4)*
12,0
185 ±27 (1,3) 137 ±12 (0,9) 35 ±4 (1,6)* 24 ±3 (1,1)
26E 0
144 ±18 139 ±5 21 ±4 23 ±2
1,5
134 ±8 (0,9) 149 ±3 (1,1) 22 ±3 (1,0) 37 ±4 (1,6)**
3,0
130 ±8 (0,9) 146 ±31 (1,1) 22 ±2 (1,0) 35 ±4 (1,5)*
6,0
143 ±21 (1,0) 134 ±23 (1,0) 23 ±2 (1,1) 41 ±8 (1,8)*
12,0
150 ±5 (1,0) 149 ±19 (1,1) 29 ±1 (1,4) 37 ±5 (1,6)**
27E 0
168 ±4 144 ±11 19 ±3 22 ±1
1,5
171 ±137 (1,0) 155 ±9 (1,1) 25 ±5 (1,3) 32 ±2 (1,5)*
3,0
174 ±11 (1,0) 169 ±22 (1,2) 26 ±8 (1,4) 36 ±5 (1,6)
6,0
172 ±15 (1,0) 228 ±17 (1,6)** 28 ±4 (1,5) 34 ±6 (1,5)
12,0
184 ±9 (1,1) 151 ±20 (1,0) 19 ±2 (1,0) 37 ±1 (1,7)**
28E 0
144 ±18 139 ±5 25 ±4 21 ±3
1,5
142 ±5 (1,0) 151 ±5 (1,1) 30 ±5 (1,2) 32 ±4 (1,5)*
3,0
152 ±1 (1,1) 142 ±5 (1,0) 28 ±6 (1,1) 30 ±3 (1,4)*
6,0
153 ±26 (1,1) 150 ±11 (1,1) 18 ±3 (0,7) 31 ±4 (1,5)*
12,0
149 ±7 (1,0) 157 ±9 (1,1) 25 ±2 (1,0) 32 ±3 (1,5)*
29E 0
159 ±17 136 ±7 25 ±2 38 ±6
1,5
159 ±15 (1,0) 140 ±7 (1,0) 29 ±4 (1,2) 40 ±4 (1,1)
3,0
154 ±27 (1,0) 172 ±12 (1,3)* 30 ±8 (1,2) 45 ±9 (1,2)
6,0
155 ±7 (1,0) 80 ±17 (0,6) 29 ±5 (1,2) 49 ±11 (1,3)
12,0
178 ±7 (1,1) 99 ±6 (0,7) 27 ±3 (1,1) 33 ±9 (0,9)
30E 0
144 ±11 136 ±4 19 ±1 21 ±2
1,5
146 ±9 (1,0) 141 ±9 (1,0) 24 ± 1 (1,3)* 29 ±2 (1,4)*
3,0
146 ±3 (1,0) 150 ±17 (1,1) 24 ± 2 (1,3)* 32 ±2 (1,5)**
6,0
150 ±2 (1,0) 146 ±9 (1,1) 25 ±5 (1,3) 29 ±2 (1,4)*
12,0
132 ±17 (0,9) 141 ±28 (1,0) 29 ±1 (1,5)** 30 ±4 (1,4)
Controle +
1944 ±43 1950 ±64 1521 ±106 1911 ±62
39
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
31E 0
134 ±17 110 ±8 21 ±3 18 ±3
1,5
131 ±1 (1,0) 154 ±12 (1,4)* 18 ±2 (0,9) 26 ±4 (1,4)
3,0
136 ±4 (1,0) 129 ±4 (1,2) 22 ±3 (1,0) 25 ±2 (1,4)*
6,0
139 ±1 (1,0) 159 ±2 (1,4)** 28 ±1 (1,3)* 25 ±4 (1,4)
12,0
131 ±3 (1,0) 171 ±5 (1,6)** 29 ±1 (1,4)* 26 ±3 (1,4)*
33E 0
144 ±18 139 ±5 21 ±4 21 ±3
1,5
147 ±9 (1,0) 125 ±21 (0,9) 24 ±2 (1,1) 30 ±3 (1,4)
3,0
153 ±17 (1,1) 142 ±17 (1,0) 26 ±1 (1,2) 25 ±3 (1,2)
6,0
134 ±9 (0,9) 150 ±10 (1,1) 26 ±6 (1,2) 22 ±3 (1,0)
12,0
103 ±12 (0,7) 129 ±2 (0,9) 29 ±8 (1,4) 32 ±2 (1,5)*
35E 0
125 ±20 107 ±2 25 ±4 21 ±3
1,5
150 ±6 (1,2) 115 ±6 (1,1) 20 ±5 (0,8) 25 ±4 (1,2)
3,0
135 ±21 (1,1) 121 ±4 (1,1) 27 ±5 (1,1) 24 ±3 (1,1)
6,0
142 ±9 (1,1) 131 ±2 (1,2)** 29 ±4 (1,2) 30 ±1 (1,4)*
12,0
142 ±5 (1,1) 139 ±1 (1,3)** 32 ±3 (1,3) 30 ±4 (1,4)
36E 0
170 ±9 145 ±14 22 ±4 22 ±3
1,5
183 ±5 (1,1) 207 ±8 (1,4)** 25 ±3 (1,1) 27 ±3 (1,2)
3,0
192 ±3 (1,1) 211 ±17 (1,5)* 26 ±2 (1,2) 25 ±1 (1,1)
6,0
181 ±2 (1,1) 272 ±26 (1,9)** 23 ±3 (1,0) 35 ±2 (1,6)**
12,0
156 ±2 (0,9) 255 ±26 (1,8)** 24 ±3 (1,1) 38 ±2 (1,7)**
38E 0
125 ±20 107 ±2 25 ±4 22 ±1
1,5
127 ±20 (1,0) 97 ± 3 (0,9) 25 ±5 (1,0) 29 ±1 (1,3)*
3,0
126 ±4 (1,0) 116 ±3 (1,1)* 32 ±1 (1,3) 25 ±4 (1,1)*
6,0
146 ±5 (1,2) 69 ±3 (0,6) 29 ±3 (1,2) 30 ±1 (1,4)
12,0
191 ±8 (1,5)* 66 ± 3 (0,6) 41 ±4 (1,6)* 29 ±1 (1,3)
39E 0
117 ±1 151 ±16 32 ±1 27 ±1
1,5
97 ±7 (0,8) 159 ±18 (1,1) 26 ±1 (0,8) 55 ±2 (2,0)**
3,0
117 ±11 (1,0) 135 ±8 (0,9) 32 ±2 (1,0) 70 ±2 (2,6)**
6,0
176 ±1 (1,5)** 160 ±27 (1,1) 45 ± 1 (1,4)** 88 ±3 (3,3)**
12,0
175 ±8 (1,5)* 154 ± 16 (1,0) 37 ±2 (1,2) 73 ±3 (2,7)**
40E 0
170 ±9 103 ±6 19 ±2 27 ±1
1,5
193 ±3 (1,1) 126 ±4 (1,2)* 22 ±2 (1,2) 49 ±2 (1,8)**
3,0
198 ±6 (1,2) 132 ±4 (1,3)** 26 ±3 (1,4)* 57 ±2 (2,1)**
6,0
204 ±16 (1,2) 143 ±21 (1,4) 25 ±3 (1,3) 55 ±4 (2,0)**
12,0
193 ±14 (1,1) 120 ±9 (1,2) 34 ±4 (1,8)** 71 ±3 (2,6)**
43E 0
134 ±17 110 ±8 21 ±3 18 ±3
1,5
158 ±4 (1,2) 132 ±2 (1,2)* 19 ±2 (0,9) 20 ±6 (1,1)
3,0
131 ±7 (1,0) 133 ±3 (1,2)* 19 ±2 (0,9) 21 ±4 (1,2)
6,0
135 ±19 (1,0) 127 ±2 (1,2) 18 ±1 (0,9) 23 ±3 (1,3)
12,0
146 ±12 (1,1) 148 ±15 (1,3)* 21 ±2 (1,0) 21 ±2 (1,2)
Controle +
1767 ±106 1918 ±51 1917 ±16 1720 ±299
40
continuação
Código da
amostra
mL
equivalente
de urina/placa
N° de colônias revertentes his+/placa, M ± SD (RM)
TA100 YG1024
-S9 +S9 -S9 +S9
44E 0
145 ±14 144 ±11 26 ±4 22 ±3
1,5
140 ±18 (1,0) 233 ±14 (1,6)** 26 ±2 (1,0) 24 ±2 (1,1)
3,0
137 ±13 (0,9) 198 ±11 (1,4)* 23 ±2 (0,9) 29 ±1 (1,3)*
6,0
166 ±11 (1,1) 190 ±8 (1,3)* 21 ±2 (0,8) 36 ±1 (1,6)**
12,0
184 ±7 (1,3) 207 ±13 (1,4)* 26 ±3 (1,0) 43 ±1 (2,0)**
45E 0
145 ±14 144 ±11 22 ±4 22 ±3
1,5
167 ±25 (1,2) 183 ±32 (1,3) 23 ±1 (1,0) 29 ±2 (1,3)*
3,0
147 ±6 (1,0) 135 ±30 (0,9) 23 ±2 (1,0) 34 ±3 (1,5)*
6,0
183 ±16 (1,3) 184 ±10 (1,3)* 25 ±3 (1,1) 33 ±2 (1,5)*
12,0
180 ±14 (1,2)* 158 ±21 (1,1) 34 ±2 (1,5)* 46 ±6 (2,1)*
46E 0
125 ±12 128 ±7 21 ±3 18 ±3
1,5
136 ±15 (1,1) 125 ±4 (1,0) 21 ±2 (1,0) 24 ±1 (1,3)*
3,0
162 ±17 (1,3) 154 ±12 (1,2) 21 ±3 (1,0) 29 ±1 (1,6)**
6,0
211 ±25 (1,7)* 155 ±12 (1,2) 20 ±1 (1,0) 28 ±4 (1,6)*
12,0
234 ±15 (1,9)** 173 ±5 (1,4)** 18 ±2 (0,9) 28 ±4 (1,6)*
47E 0
134 ±17 110 ±8 21 ±3 18 ± 3
1,5
154 ±5 (1,1) 144 ±4 (1,3)** 21 ±3 (1,0) 24 ±3 (1,3)
3,0
161 ±10 (1,2) 128 ±3 (1,2) 23 ±3 (1,1) 26 ±3 (1,4)*
6,0
188 ±11 (1,4)* 136 ±8 (1,2)* 25 ±4 (1,2) 21 ±5 (1,2)
12,0
177 ±4 (1,3)* 151 ±2 (1,4)** 18 ±3 (0,9) 26 ±4 (1,4)
48E 0
125 ±12 128 ±7 21 ±3 18 ±3
1,5
135 ±18 (1,1) 137 ±17 (1,1) 24 ±1 (1,1) 26 ±3 (1,4)*
3,0
137 ±3 (1,1) 135 ±9 (1,1) 24 ±3 (1,1) 23 ±3 (1,3)
6,0
124 ±3 (1,0) 134 ±4 (1,0) 22 ±1 (1,0) 24 ±4 (1,3)
12,0
124 ±10 (1,0) 113 ±10 (0,9) 17 ±2 (0,8) 28 ±3 (1,6)*
50E 0
134 ±17 165 ±10 21 ±3 18 ±3
1,5
156 ±6 (1,2) 160 ±3 (1,0) 24 ±2 (1,1) 23 ±2 (1,3)
3,0
138 ±14 (1,0) 163 ±3 (1,0) 23 ±3 (1,1) 19 ±3 (1,1)
6,0
148 ±4 (1,1) 177 ±5 (1,1) 26 ±3 (1,2) 26 ±5 (1,4)
12,0
135 ±10 (1,0) 162 ±11 (1,0) 27 ±1 (1,3) 24 ±3 (1,3)
54E 0
134 ±17 110 ±8 27 ±2 31 ±4
1,5
144 ±10 (1,1) 117 ±9 (1,1) 50 ±8 (1,9)* 38 ±5 (1,2)
3,0
122 ±18 (0,9) 119 ±9 (1,1) 48 ±4 (1,8)** 34 ±5 (1,1)
6,0
143 ±18 (1,1) 142 ±2 (1,3)** 51 ± 4 (1,9)** 38 ±6 (1,2)
12,0
142 ±9 (1,1) 123 ±8 (1,1) 60 ±6 (2,2)** 33 ± 3 (1,1)
Controle +
1767 ±106 1918 ±51 1917 ±16 1720 ±299
0 : controle negativo = 50µL DMSO
Controle positivo : –S9 → 10,0 µg/placa de 4-nitro-o-fenilenediamina para a YG1024 e 1,25µg/placa de azida sódica
para a TA100 ; +S9 → 0,63µg/placa de 2-antramina
* significância a 5%; ** significância a 1% (ANOVA).
41
Tabela 6 : Atividade mutagênica expressa em potência (número de colônias revertentes his+/ mL
equivalente urina), das amostras do grupo controle e exposto, com resposta mutagênica positiva
em pelo menos um dos ensaios (TA100 ou YG1024, com (+S9) ou sem (-S9) ativação
metabólica).
Grupo controle Grupo exposto
TA100 YG1024 TA100 YG1024
Cód. -S9 +S9 -S9 +S9 Cód. –S9 +S9 -S9 +S9
04C 2,3 0 0 0 02E 0 0 0 9,2
17C 19,2 0 0 0 09E 0 0 0 12,9
36C 0 0 13,8 0 39E 0 0 0 25,1
40E 0 0 0 10,4
44E 0 0 0 1,8
45E 0 0 0 4,2
54E 0 0 2,6 0
Cód.:código da amostra.
42
Tabela 7: Atividade mutagência expressa pelo maior valor da razão de mutagenicidade (RM),
nas amostras de urina do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 e YG1024 com (+S9) e
sem (-S9) ativação metabólica.
Grupo controle
TA100 YG1024
Cód. -S9 +S9 -S9 +S9
Grupo exposto
TA100 YG1024
Cód. -S9 +S9 -S9 +S9
02C 1,0 1,1 1,3 1,2 02E 1,1 1,2 1,0 2,3
04C
2,2
1,5 1,5 1,4 06E 1,1 1,4 1,2 1,4
07C 1,2 1,2 1,2 1,1 07E 1,2 1,1 1,1 1,6
08C 1,0 1,2 1,2 1,4 09E 0,8 1,1 1,1
2,2
09C 0,8 1,2 1,1 1,8 10E 1,0 1,1 1,0 1,9
11C 1,1 1,3 1,0 1,5 16E 1,2 1,1 1,2 1,7
13C 1,1 1,2 1,0 1,6 17E 1,5 1,3 0,9 1,2
14C 1,1 1,0 1,0 1,2 18E 1,3 1,0 1,2 1,0
16C 1,1 1,1 1,0 1,4 19E 1,1 1,1 1,1 1,6
17C
2,5
1,9 1,6 1,2 23E 1,8 1,2 1,6 1,4
18C 1,1 1,0 1,5 1,4 26E 1,0 1,1 1,4 1,8
19C 1,0 1,0 1,1 1,0 27E 1,1 1,6 1,5 1,7
20C 1,2 1,1 0,9 1,4 28E 1,1 1,1 1,2 1,5
21C 1,5 1,2 1,2 1,2 29E 1,1 1,3 1,2 1,3
22C 1,5 1,2 1,3 1,0 30E 1,0 1,1 1,5 1,5
23C 1,5 1,1 0,9 1,2 31E 1,0 1,6 1,4 1,4
24C 1,3 1,2 1,3 1,0 33E 1,1 1,1 1,4 1,5
25C 1,1 1,2 1,0 1,2 35E 1,2 1,3 1,3 1,4
26C 1,1 1,8 1,4 1,7 36E 1,1 1,9 1,2 1,7
27C 1,1 1,4 1,4 1,6 38E 1,5 1,1 1,6 1,4
29C 1,0 1,1 1,4 1,4 39E 1,5 1,1 1,4
3,3
30C 1,4 1,1 1,3 1,8 40E 1,2 1,4 1,8
2,6
32C 0,9 1,2 1,1 1,4 43E 1,2 1,3 1,0 1,3
33C 1,2 1,1 1,2 1,7 44E 1,3 1,6 1,0
2,0
34C 1,2 1,0 1,4 1,4 45E 1,3 1,3 1,5
2,1
35C 1,3 1,6 1,2 1,2 46E 1,9 1,4 1,0 1,6
36C 1,0 1,2
2,0
1,4 47E 1,4 1,4 1,2 1,4
37C 1,2 1,1 1,2 1,3 48E 1,1 1,1 1,1 1,6
38C 1,1 1,1 1,9 1,0 50E 1,2 1,1 1,3 1,4
39C 1,1 1,0 1,2 1,4 54E 1,1 1,3
2,2
1,2
M 1,2 1,2 1,3 1,4 M 1,2 1,3 1,3 1,7*
Cód.:código da amostra; M: média de RM; valores em negrito representam RM 2,0.
* p < 0,05 – Teste de Mann Whitney.
43
Tabela 8: Atividade mutagência expressa pelo índice de aumento relativo no número de
revertentes his+, das amostras de urina do grupo controle e exposto, nas linhagens TA100 e
YG1024 com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica.
Grupo controle
TA100 YG1024
Cód. -S9 +S9 -S9 +S9
Grupo exposto
TA100 YG1024
Cód. -S9 +S9 -S9 +S9
02C 0,02 0,13 0,25 0,22 02E 0,09 0,18 0 1,3
04C 1,2 0,5 0,47 0,38 06E 0,14 0,41 0,19 1,22
07C 0,16 0,18 0,24 0,22 07E 0,15 0,09 0,07 0,57
08C 0,05 0,17 0,24 0,44 09E 0 0,07 0,07 1,22
09C 0 0,08 0,07 0,81 10E 0,02 0,08 0 0,87
11C 0,09 0,25 0,03 0,52 16E 0,2 0,12 0,24 0,7
13C 0,11 0,2 0,03 0,62 17E 0,5 0,3 0 0,15
14C 0,13 0,07 0 0,18 18E 0,28 0,02 0,2 0,03
16C 0,14 0,14 0,05 0,38 19E 0,14 0,12 0,07 0,61
17C 1,5 0,92 0,56 0,16 23E 0,45 0,23 0,59 0,41
18C 0,08 0,04 0,52 0,39 26E 0,04 0,07 0,38 0,78
19C 0,01 0,02 0,11 0 27E 0,1 0,58 0,47 0,68
20C 0,16 0,14 0 0,42 28E 0,06 0,13 0,2 0,52
21C 0,48 0,19 0,22 0,15 29E 0,12 0,26 0,2 0,29
22C 0,47 0,2 0,33 0 30E 0,04 0,1 0,53 0,52
23C 0,48 0,12 0 0,19 31E 0,04 0,55 0,38 0,44
24C 0,32 0,21 0,33 0 33E 0,06 0,08 0,38 0,52
25C 0,06 0,21 0,04 0,19 35E 0,2 0,3 0,28 0,43
26C 0,08 0,75 0,36 0,68 36E 0,13 0,88 0,18 0,73
27C 0,07 0,39 0,4 0,59 38E 0,17 0,08 0,64 0,36
29C 0 0,07 0,39 0,59 39E 0,34 0,07 0,41 2,26
30C 0,4 0,22 0,32 0,26 40E 0,2 0,39 0,8 1,63
32C 0 0,018 0,14 0,38 43E 0,18 0,35 0 0,28
33C 0,2 0,09 0,21 0,67 44E 0,27 0,62 0 0,95
34C 0,15 0,04 0,36 0,43 45E 0,26 0,28 0,55 1,09
35C 0,26 0,65 0,19 0,23 46E 0,87 0,35 0 0,61
36C 0,04 0,16 1,03 0,39 47E 0,4 0,24 0,19 0,31
37C 0,23 0,07 0,16 0,33 48E 0,1 0,07 0,14 0,56
38C 0,06 0,07 0,93 0,03 50E 0,16 0,07 0,29 0,31
39C 0,08 0,04 0,21 0,38 54E 0,07 0,29 1,02 0,23
M 0,2 0,2 0,3 0,4 M 0,2 0,2 0,3 0,7*
Cód.:código da amostra; M: média do índice de aumento relativo.
* p < 0,05 – Teste de Mann Whitney.
44
Figura 2: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do grupo controle (A) e exposto
(B), na linhagem de S. typhimurium TA100 sem ativação metabólica. * amostras com atividade
mutagênica positiva.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02C
04C
07C
08C
09C
11C
13C
14C
16C
17C
18C
19C
20C
21C
22C
23C
24C
25C
26C
27C
29C
30C
32C
33C
34C
35C
36C
37C
38C
39C
amostras de urina
RM
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02E
06E
07E
09E
10E
16E
17E
18E
19E
23E
26E
27E
28E
29E
30E
31E
33E
35E
36E
38E
39E
40E
43E
44E
45E
46E
47E
48E
50E
54E
amostras de urina
RM
A
B
*
*
45
Figura 3: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do grupo controle (A) e exposto
(B), na linhagem de S. typhimurium TA100 com ativação metabólica.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02C
04C
07C
08C
09C
11C
13C
14C
16C
17C
18C
19C
20C
21C
22C
23C
24C
25C
26C
27C
29C
30C
32C
33C
34C
35C
36C
37C
38C
39C
amostras de urina
RM
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02E
06E
07E
09E
10E
16E
17E
18E
19E
23E
26E
27E
28E
29E
30E
31E
33E
35E
36E
38E
39E
40E
43E
44E
45E
46E
47E
48E
50E
54E
amostras de urina
RM
A
B
46
Figura 4: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do grupo controle (A) e exposto
(B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 sem ativação metabólica. * amostras com atividade
mutagênica positiva.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02E
06E
07E
09E
10E
16E
17E
18E
19E
23E
26E
27E
28E
29E
30E
31E
33E
35E
36E
38E
39E
40E
43E
44E
45E
46E
47E
48E
50E
54E
amostras de urina
RM
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02C
04C
07C
08C
09C
11C
13C
14C
16C
17C
18C
19C
20C
21C
22C
23C
24C
25C
26C
27C
29C
30C
32C
33C
34C
35C
36C
37C
38C
39C
amostras de urina
RM
A
B
*
47
Figura 5: Razão de mutagenicidade (RM) das amostras de urina do grupo controle (A) e exposto
(B), na linhagem de S. typhimurium YG1024 com ativação metabólica. * amostras com atividade
mutagênica positiva.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02C
04C
07C
08C
09C
11C
13C
14C
16C
17C
18C
19C
20C
21C
22C
23C
24C
25C
26C
27C
29C
30C
32C
33C
34C
35C
36C
37C
38C
39C
amostras de urina
RM
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
02E
06E
07E
09E
10E
16E
17E
18E
19E
23E
26E
27E
28E
29E
30E
31E
33E
35E
36E
38E
39E
40E
43E
44E
45E
46E
47E
48E
50E
54E
amostras de urina
RM
*
*
*
*
* *
48
5.3. Distribuição das freqüências dos diferentes polimorfismos estudados
A amplificação por PCR do DNA para os genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1 foi
realizada em amostras de sangue total dos indivíduos expostos a solventes orgânicos e seus
respectivos controles.
O polimorfismo dos genes GSTM1 e GSTT1 é caracterizado pela deleção do
gene. A Figura 6 mostra o polimorfismo das glutationa-S-transferase mu e teta, onde podem ser
detectados os alelos homozigotos nulos para os genes GSTM1 e GSTT1 por meio da técnica de
PCR multiplex.
FIGURA 6: PCR multiplex para a detecção de alelos homozigotos nulos das glutationa S-transferases M1 (GSTM1)
e T1 (GSTT1), onde M = marcador de peso molecular (100 pb) e B = branco (todos os reagentes exceto o DNA). Os
produtos de PCR de 215 e 480 pb correspondem à presença dos genes GSTM1 e GSTT1, respectivamente. O
fragmento 312 pb corresponde ao gene constante CYP1A1, o qual foi usado como controle interno da reação.
Amostras 09E e 18E gene GSTTM1 presente; amostras 31E e 09C gene GSTT1 presente; amostras 02E, 27E e 39C
genes GSTM1 e GSTT1 ausentes.
A Figura 7 apresenta um perfil de PCR para o polimorfismo CYP2E1 –PstI. O
polimorfismo é caracterizado pela presença ou ausência do sítio para a enzima de restrição PstI.
B 09E 18E 31E M 02E 27E 09C 39C
__ 480 pb
__ 312 pb
__ 215 pb
49
FIGURA 7: PCR - RFLP para detecção do polimorfismo CYP2E1 –PstI, onde M = marcador de peso molécula (100
pb) e B = branco (todos os reagentes exceto o DNA). Amostras 08C, 09C, 17C, 20C e 15C são homozigotos
selvagens (c1/c1); amostras 18E e 43E são heterozigotos.
Com exceção de um indivíduo (23E), que por motivo de saúde, foi impossível
coletar sua amostra de sangue, dos 59 indivíduos analisados, apenas 2 (18E e 43E) apresentaram
genótipo heterozigoto para o CYP2E1-PstI . O genótipo mais freqüente foi o nulo para os genes
da glutationa S-transferase, aparecendo em 79,6% dos indivíduos analisados. A presença do gene
GSTM1 foi demonstrada apenas em 8,5% dos indivíduos (09E, 18E, 35E, 47E e 48E) todos
pertencentes ao grupo exposto. O gene GSTT1 foi observado em 11,9% dos voluntários (09C,
11C e 35C, 07E, 28E, 31E e 33E) (Tabela 9).
5.4. Caracterização dos indivíduos analisados em relação a diferentes parâmetros
A Tabela 9 apresenta, as características das amostras avaliadas em relação à
idade, sexo, grupo étnico, atividade mutagênica na urina e os polimorfismos dos genes CYP2E1,
GSTM1 e GSTT1. De um modo geral, pode-se dizer que as amostras foram compostas em sua
maioria, por indivíduos do sexo feminino, pertencente ao grupo étnico caucasiano e com faixa
410 pb
290 pb
120 pb
08C 09C 17C 20C M 18E 43E 15C B
50
etária entre 19 e 54 anos. Dentre os 59 participantes desse estudo, observou-se a seguinte
distribuição dos genótipos: 90% e 69% dos indivíduos do grupo controle e exposto
(respectivamente) apresentaram genótipo GSTM1/GSTT1 nulo; o genótipo GSTM1 presente foi
encontrado apenas no grupo exposto (17%); e o genótipo GSTT1 presente foi encontrado em 10%
e 14% dos indivíduos do grupo controle e exposto, respectivamente (Tabela 10).
Através do teste do χ
2
(qui-quadrado) não foi encontrada nenhuma dependência
entre as variáveis, sexo, idade e etnia e a atividade mutagênica positiva. O teste de Mann-
Whitney também não demonstrou nenhuma dependência entre o genótipo e atividade mutagênica
positiva. No entanto, observou-se que das 10 amostras de urina com resposta mutagênica
positiva, 9 amostras eram de indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo e, apenas 1 amostra
de urina de um indivíduo com o gene GSTM1 presente.
Nesse estudo, foram observadas diferenças entre o grupo controle e exposto,
porém sem significância estatística, na média dos índices de aumento relativo no número de
revertentes his+, em indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo. As amostras de urina dos
indivíduos do grupo controle com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo apresentaram média dos índices
de aumento relativo de 0,22; 0,18; 0,31 e 0,33; no grupo exposto esses valores foram de 0,21;
0,28; 0,30 e 0,78; em ensaios com as linhagens TA100 (-S9), TA100 (+S9), YG1024 (-S9) e
YG1024 (+S9), respectivamente (Figura 8).
51
Tabela 9: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em relação
à idade, sexo, grupo étnico, atividade mutagênica da urina e polimorfismos dos genes CYP2E1,
GSTT1 e GSTM1.
Código Sexo
M/F
Etnia Idade
(anos)
Atividade
Mutagênica
TA100 YG1024
CYP2E1 GSTM1 GSTT1
02C F B 49 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
04C F B 43 +/- -/- c1/c1 ausente ausente
07C M B 42 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
08C F B 29 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
09C F B 30 -/- -/- c1/c1 ausente presente
11C M B 39 -/- -/- c1/c1 ausente presente
13C F B 34 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
14C F B 22 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
16C F B 29 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
17C F B 19 +/- -/- c1/c1 ausente ausente
18C M B 27 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
19C M B 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
20C F B 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
21C M B 22 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
22C M B 26 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
23C M B 25 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
24C F B 28 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
25C F B 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
26C F B 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
27C F B 42 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
29C F B 21 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
30C F P 19 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
32C F B 48 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
33C M B 25 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
34C F B 25 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
35C M B 23 -/- -/- c1/c1 ausente presente
36C M P 33 -/- +/- c1/c1 ausente ausente
37C F B 19 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
38C F B 19 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
39C F B 23 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
02E F B 35 -/- -/+ c1/c1 ausente ausente
06E F B 49 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
07E M B 27 -/- -/- c1/c1 ausente presente
09E F B 30 -/- -/+ c1/c1 presente ausente
10E M B 32 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
16E M O 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
17E F B 31 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
18E F B 33 -/- -/- c1/c2 presente ausente
19E F B 29 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
23E F B 38 -/- -/- ND ND ND
26E F B 23 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
27E F B 28 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
28E F B 23 -/- -/- c1/c1 ausente presente
29E F B 26 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
30E M B 33 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
31E F B 54 -/- -/- c1/c1 ausente presente
33E F B 22 -/- -/- c1/c1 ausente presente
52
continuação
Código Sexo
M/F
Etnia Idade
(anos)
Atividade
Mutagênica
TA100 YG1024
CYP2E1 GSTM1 GSTT1
35E F B 23 -/- -/- c1/c1 presente ausente
36E M B 35 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
38E M N 27 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
39E F B 30 -/- -/+ c1/c1 ausente ausente
40E F B 32 -/- -/+ c1/c1 ausente ausente
43E F O 21 -/- -/- c1/c2 ausente ausente
44E M B 20 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
45E M B 33 -/- -/+ c1/c1 ausente ausente
46E F B 23 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
47E M B 22 -/- -/- c1/c1 presente ausente
48E F N 27 -/- -/- c1/c1 presente ausente
50E M B 32 -/- -/- c1/c1 ausente ausente
54E F B 22 -/- +/- c1/c1 ausente ausente
C: amostra do grupo controle; E: amostra do grupo exposto; M: masculino; F: feminino; B: branco; N: negro; O:
oriental; ND: não determinado; -/-: não apresentou atividade mutagênica com e sem ativação metabólica; +/-:
atividade mutagênica apenas sem ativação metabólica; -/+: atividade mutagênica apenas com ativação metabólica.
53
Tabela 10: Caracterização das amostras dos indivíduos dos grupos, controle e exposto, em
relação à idade, sexo, e atividade mutagênica (diferentes parâmetros de avaliação) da urina e
polimorfismos dos genes CYP2E1, GSTT1 e GSTM1.
GRUPO CONTROLE GRUPO EXPOSTO
Número de indivíduos
Idade (média ± SD)
Variação
30
28 ±9
19 - 49
30
29,3 ±7,7
19 - 54
Sexo
Feminino
Masculino
20
10
20
10
GSTM1 e GSTT1 ausentes 27 (90%) 20 (69%)
GSTM1 presente 0 5 (17%)
GSTT1 presente 3 (10%) 4 (14%)
CYP2E1 selvagem 30 (100%) 27 (93,1%)
CYP2E1 heterozigoto 0 2 (6,9%)
Índice de aumento relativo (média
a
)
TA100 (-S9)
TA100 (+S9)
YG1024 (-S9)
YG1024 (+S9)
0,2
0,2
0,3
0,4
0,2
0,2
0,3
0,7*
Maior valor de RM (média
b
)
TA100 (-S9)
TA100 (+S9)
YG1024 (-S9)
YG1024 (+S9)
1,2
1,2
1,3
1,4
1,2
1,3
1,3
1,7*
a
O índice de aumento relativo no número de revertentes his+ foi calculado, subtraindo o maior n° revertentes his+
encontrado para cada amostra de urina, do n° revertentes his+ espontâneas, o valor obtido foi dividido pelo n°
revertentes his+ espontâneas. A partir do índice de aumento relativo de cada amostra de urina, foi calculada a média
para cada grupo (controle e exposto)
b
A partir do valor de RM obtido para cada amostra de urina, foi calculada a média para cada grupo (controle e
exposto).
-S9: sem metabolização; +S9: com metabolização; RM: razão de mutagenicidade.
* p < 0,05 – Teste de Mann Whitney.
54
Figura 8: Média e desvio padrão dos índices de aumento relativo no número de revertentes his+,
das amostras de urina dos indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo, no grupo controle (A) e
no exposto (B).
TA100 (-S9) TA100 (+S9) YG1024 (-S9) YG1024 (+S9)
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Índice de aumento relativo
(média/desvio padrão)
Genótipo GSTM1/GSTT1 nulo (grupo controle)
TA100 (-S9) TA100 (+S9) YG1024 (-S9) YG1024 (+S9)
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Índice de aumento relativo
(média/desvio padrão)
Genótipo GSTM1/GSTT1 nulo (grupo exposto)
A
B
55
6. Discussão
6.1. Análise da mutagenicidade urinária
A mutagenicidade urinária tem sido muito usada como marcador de exposição
ocupacional e ambiental a diferentes genotoxinas. Um aumento da mutagenicidade urinária foi
demonstrado em fumantes (PAVANELLO & CONFLERO, 2000), após a ingestão de frituras
(PAVANELLO et al., 2002a), em pacientes sob tratamento medicamentoso (GABBANI et al.,
1999), e em exposição ocupacional a aminas aromáticas, HPA, solventes, etc. (VERMEULEN et
al., 2003; HANSEN et al., 2004; SIMIOLI et al., 2004).
A resina de troca não-iônica, Amberlit - A2 (XAD-2), tem sido
extensivamente usada nesses estudos de biomonitoramento de populações, para a concentração
dos mutágenos presentes na urina avaliados em ensaios com Samonella/microssomo
(YAMASAKI & AMES, 1977; GABBANI et al., 1999; SMITH et al., 2000, PAVANELLO et
al., 2002b; MOHAMADI et al., 2003; VERMEULEN et al., 2003). Por outro lado, André et al.
(2002), compararam a eficiência da resina XAD-2 com a Bakerbond -spe-SDB1, na
concentração de amostras de urina utilizadas no teste de Ames, e observaram maior atividade
mutagênica nos extratos concentrados pela Bakerbond. Apesar disso, no presente trabalho, foi
56
usada a resina XAD-2, por ser a mais amplamente utilizada, sendo possível observar a sua
eficiência, através da atividade mutagênica detectada em várias amostras.
O teste de mutação gênica reversa em Salmonella (teste de Ames), detecta
vários tipos de mutação de ponto, que envolve poucos pares de bases, em um genoma bacteriano
simples (RIBEIRO et al., 2003). A associação de várias linhagens, com sensibilidade específica a
determinadas classes de substâncias e protocolos com metabolização, demonstram as classes
químicas presentes na amostra, além de classificá-las em mutágenos diretos ou indiretos.
Geralmente em estudos de triagem, são usadas as linhagens TA100 (detecta
mutágenos que causam substituição de pares de bases) e a TA98 (detecta mutágenos que causam
mudança na matriz de leitura – frameshift), pela eficiência na detecção de grande número de
agentes mutagênicos. A substituição da linhagem de S. typhimurium TA98 pela YG1024, neste
estudo, baseou-se em dados da literatura que demonstraram a sensibilidade na detecção de
atividade mutagênica na urina em vários trabalhos (GABBANI et al., 1999; SMITH et al., 2000;
VERMEULEN et al., 2003). Devido ao fato da N-hidroxiarilamina ser uma enzima envolvida na
ativação metabólica de aminas aromáticas e nitroarenos mutagênicos, o gene da O-
acetiltransferase (OAT) da Salmonella typhimurium TA1538 foi clonado no plasmídeo pBR322 e
introduzido na TA98, resultando numa nova linhagem, a YG1024, que abriga múltiplas cópias do
plasmídeo pYG219 e apresenta cerca de cem vezes mais atividade da OAT do que a linhagem
controle, mostrando-se extremamente sensível em detectar a atividade mutagênica das
arilhidroxilaminas, nitroarenos e aminas aromáticas (WATANABE et al.,1990).
Bosso (2000), avaliando a atividade mutagênica da urina de cortadores de cana,
observou diferença estatisticamente significante (p≤ 0,05) na atividade mutagênica das amostras
57
de urina dos trabalhadores expostos quando comparada ao grupo controle na linhagem YG1024,
apenas na presença de metabolização.
Em um estudo realizado com trabalhadores expostos a HPAs, Simioli et al.
(2004), demonstram atividade mutagênica urinária na linhagem YG1024 (+S9), duas vezes maior
no grupo exposto em relação a atividade mutagênica das urinas do grupo controle.
Pavanello et al. (2002a), avaliaram a atividade mutagênica na urina após o
consumo de hamburger e, observaram que todas as amostras avaliadas foram mutagênicas na
linhagem YG1024 com ativação metabólica. Na urina de pacientes em tratamento dermatológico
com pomada a base de alcatrão, Gabbani et al. (1999) obtiveram atividade mutagênica em 93%
das amostras avaliadas com a linhagem YG1024 com metabolização. As linhagens TA98 e
YG1024 na presença de metabolização, foram utilizadas por Bowman et al. (2002), em um
estudo que demonstrou a correlação da concentração da nicotina e do carvão com a
mutagenicidade urinária de fumantes. Na análise da atividade mutagênica em indivíduos não
fumantes expostos a fumaça de cigarro, a linhagem YG1024 foi mais eficiente que a TA98
(SMITH et al., 2000).
Nossos resultados estão condizentes com os dados da literatura, pois, foi
observado aumento estatisticamente significativo (p ≤ 0,05) avaliando diversos parâmetros
(Tabela 10), na atividade mutagênica das amostras de urina coletadas de indivíduos expostos aos
solventes orgânicos, apenas na linhagem YG1024 (+S9).
A resposta da linhagem YG1024 (+S9) às amostras do grupo exposto,
demonstram a presença de mutágenos indiretos, pertencentes aos grupos dos HPAs, nitroarenos e
aminas aromáticas. Essas classes de compostos são conhecidas por sua atividade mutagênica e
/ou carcinogênica em mamíferos, pois as lesões resultantes das ligações desses compostos com o
58
DNA quando não reparadas poderão iniciar um processo neoplásico. Por isso, é muito comum o
aparecimento de câncer de pulmão, do trato urinário e de pele em trabalhadores de coque e em
limpadores de chaminé (LEE et al., 2002; TEIXEIRA et al., 2002).
As propriedades físico-químicas dos solventes, podem resultar em distúrbios nas
estruturas celulares, tais como o DNA (PHILIPS & JENKINSON, 2001). O benzeno é um
hidrocarboneto aromático, entre seus metabólitos, estão o fenol, a hidroquinona e a
benzoquinona, que podem se ligar covalentemente ao DNA, sendo considerado mutagênico e
carcinogênico (JOO et al., 2004; NAKAYAMA et al., 2004). O ácido hipúrico e o ácido metil-
hipúrico são metabólitos urinários do tolueno e do xileno, respectivamente, usados como
biomarcadores de exposição a esses solventes em estudos de monitoramento de indivíduos
ocupacionalmente expostos (MANINI et al., 2004). A exposição crônica ao n-hexano, um
hidrocarboneto alifático, causa neuropatias, e sua neurotoxicidade é devida ao metabólito 2,5-
hexanodione, que é usado como biomarcador urinário (HEUSER et al., 2005).
Existem muitas evidências que as condições de cozimento dos alimentos e os
hábitos alimentares influenciam na atividade mutagênica (MALAVEILLE et al., 2004). Para um
melhor entendimento dos resultados, foi aplicado um questionário que avaliou o estilo de vida,
uso de medicamentos, hábitos alimentares, etc. (Tabela 3). No entanto, não foi observada
nenhuma diferença que justificasse a atividade mutagênica detectada pela linhagem TA100, das 2
amostras de urina do grupo controle. Quando foram comparadas as média dos maiores valores de
RM obtidos nos grupos, exposto e controle, verificou-se que, para a TA100 tais valores ficaram
em torno de 1,2. Por outro lado, para a YG1024 (+S9) foi observado um aumento significativo (p
= 0,008) na média dos valores de RM no grupo exposto, comparados ao grupo controle (Tabela
7). Além disso, quando foram comparados os índices de aumento relativo (Tabela 8), observou-se
59
aumento significativo (p = 0,002) no grupo exposto em relação ao grupo controle, apenas na
linhagem YG1024 com metabolização.
Não apresentaram nenhuma atividade mutagênica (sem efeito dose-resposta e
RM < 2,0), 6 amostras de urina, sendo 3 amostras de cada grupo. Isso corresponde a 10% do total
de amostras analisadas, evidenciando a influência de outros fatores ambientais, que não
ocupacionais, na atividade mutagênica urinária.
De acordo com esses resultados, verificou-se que a linhagem YG1024 (+S9),
parece ter sido a linhagem responsável pela detecção da mutagenicidade devida a exposição
ocupacional, enquanto que, nas demais situações a atividade mutagênica pode estar relacionada a
outros fatores ambientais.
6.2. Análise dos polimorfismos das enzimas de metabolização de xenobióticos e, sua
influência nos danos ao material genético.
A susceptibilidade à ação de compostos químicos pode derivar de características
genéticas ou adquiridas do indivíduo, e pode estar associada com diferenças no metabolismo. A
maioria dos carcinógenos genotóxicos que comprovadamente causam tumores é considerada pré-
carcinógeno, ou seja, são compostos estáveis no pH fisiológico e, portanto, incapazes de reagir
com o DNA. No entanto, os xenobióticos são biotransformados no organismo, podendo gerar
produtos extremamente eletrofílicos que irão reagir com os centros nucleofílicos das células,
dentre eles, regiões do DNA, levando a formação de aductos, mutações e, subsenqüentemente o
risco do desenvolvimento de câncer. As diferenças na susceptibilidade aos efeitos dos
carcinógenos ambientais podem surgir como resultante do polimorfismo de enzimas CYP e GSTs.
De um modo geral, mas não absoluto, a formação de agentes eletrofílicos a partir de carcinógenos
ambientais é catalisada pelas enzimas CYP e neutralizada pelas GSTs. (RIBEIRO et al., 2003)
60
A biotransformação de xenobióticos envolve várias enzimas com especificidade
de reação, sendo agrupadas em enzimas de fase I e II.
Dentre as enzimas de fase I, destacam-se as pertencentes à família CYP, que
catalizam a inserção de um átomo de oxigênio ao substrato. A reação de oxidação pode resultar
na ativação do composto, convertendo carcinógenos indiretos em eletrófilos ativos capazes de
interagir com o DNA, RNA e proteínas. (PAVANELO & CONFLERO, 2000). Os polimorfismos
genéticos para o gene CYP2E1, têm sido usados como marcadores genéticos de risco de câncer
(KATO et al., 1992; BOUCHARDY et al., 2000).
As reações da fase II, catalizadas pelas GSTs, envolvem a conjugação com os
grupos eletrofílicos de uma grande variedade de substratos endógenos e exógenos, promovendo a
detoxificação e, tornando-os hidrossolúveis, sendo facilmente excretados (HAYES &
PULFORD, 1995). Os genes GSTM1 e GSTT1 são polimórficos, podendo ter uma deficência na
atividade enzimática causada por uma deleção em homozigose do gene (ANWAR et al., 1996;
ABDEL-RAHMAN et al., 1996).
Os solventes representam um importante grupo de poluentes em diferentes
ambientes ocupacionais, destacando-se a indústria de borracha, de tintas, de plásticos e em
laboratórios, é freqüente o uso de vários solventes.
A enzima CYP2E1 catalisa a bioativação de diferentes procarcinógenos e
protoxinas (anilina, cloretos alogenados e benzeno), dentre os vários substratos, estão, os
solventes orgânicos etanol, acetona e o benzeno (KERREMANS, 1996).
A biotransformação do etanol pela CYP2E1 produz acetaldeído e radicais livres
(TERELIUS et al., 1978). A exposição das células do fígado a esses metabólitos compromete a
função celular, causando doenças como a cirrose hepática (LINDROS, 1995). As GSTs catalizam
61
a conjugação do acetaldeído e dos radicais livres, protegendo as células hepáticas dos metabólitos
do etanol (FERNADEZ-CHECA et al., 1993).
O benzeno é metabolizado em fenol, pelas células hepáticas, subseqüentemente
em hidroquinona na medula óssea e, convertido não-enzimaticamente em p-benzoquinona. Esses
metabólitos são considerados tóxicos e geram espécies reativas de oxigênio, tais como O
2
-
e H
2
O
2
(NAKAYAMA et al., 2004). A hidroquinona induz a formação de micronúcleos, aumento na
troca entre cromátides irmãs e aberrações cromossômicas (SILVA et al., 2004).
Entre os hidrocarbonetos halogenados, encontra-se o diclorometano (DCM),
solvente orgânico muito utilizado pelas indústrias e, a exposição crônica deste substrato para a
CYP2E1, causa danos cerebrais e hepáticos (FECHNER et al., 2001).
Com base nesses dados, decidiu-se avaliar os polimorfismo dos genes CYP2E1,
GSTT1 e GSTM1 em indivíduos ocupacionalmente expostos a solventes orgânicos. O
desequilíbrio entre os sistemas enzimáticos, ativadores e os detoxificadores, pode levar ao
acúmulo de substâncias genotóxicas no organismo, causando efeitos adversos à saúde.
A partir do sangue coletado de cada indivíduo analisado, foi utilizada a técnica
de PCR para a amplificação dos genes CYP2E1, GSTM1 e GSTT1.
No presente estudo, 100% dos indivíduos do grupo controle apresentaram
genótipo homozigoto selvagem (c1/c1) para o gene CYP2E1 -PstI, no grupo exposto observou-se
uma freqüência de 96,6% e 3,4% do genótipo homozigoto selvagem (c1/c1) e do genótipo
heterozigoto (c1/c2), respectivamente. Esse tipo de polimorfismo do CYP2E1 –PstI, é comum em
Orientais, raro em caucasianos e vários outros grupos étnicos (LUCAS et al., 2001). As
freqüências dos polimorfismos do gene CYP2E1 –PstI demonstradas nesta pesquisa, estão de
acordo com outros estudos (GATTAS & SOARES-VIEIRA, 2000; CANALLE et al., 2004).
62
Devido à baixa freqüência do alelo c2 na população estuda, assim como é baixa
sua freqüência na população caucasiana em geral (KIM & NOVAK, 1990), o estabelecimento de
uma associação estatística entre o polimorfismo CYP2E1-PstI e atividade mutagênica urinária
não foi possível nesse estudo e, requer um número muito maior de voluntários. Qu et al. (2005),
chegaram a essa mesma conclusão, avaliando exposição ocupacional ao benzeno, através da
dosagem de metabólitos urinários e o polimorfismo do gene CYP2E1.
Nossos resultados demonstram uma freqüência de 91,5% de ausência apenas do
gene GSTM1, 81,1% de ausência apenas do gene GSTT1 e 74,6% de ausência de ambos os genes
(GSTM1 e GSTT1). D´Arce e Cólus (2000) e Losi-Guembarovski (2002), estudando indivíduos
brasileiros saudáveis de diferentes origens étnicas, provenientes do Paraná encontraram,
respectivamente, as freqüências de 33% e 48,86% de ausência do gene GSTM1. Arruda et al.
(1999) contram uma frequência de 36,9% de GSTM1 nulo em indivíduos das regiões norte,
nordeste e sudeste do Brasil. Em caucasianos da região sudeste do Brasil, Gattás e Soares-Vieira
(2000), obeservaram uma frequência de 60,2% do genótipo GSTM1 nulo. Um estudo feito com
uma população da Turquia, a freqüência do genótipo GSTM1 nulo foi de 51,9%, do GSTT1 nulo
foi de 17,3% e de ambos os genes 9% (ADA et al., 2004). Zhang et al. (2004) encontraram uma
freqüência de 38% e 53% dos genótipos nulos, GSTT1 e GSTM1, respectivamente, em
trabalhadores chineses.
Não existem razões óbvias para explicar a discrepância entre os resultados
obtidos em diferentes estudos. Um problema potencial quando se avalia as freqüências dos
polimorfismos genéticos é a grande mistura de etnias existentes no Brasil. A origem étnica da
população brasileira é composta de imigrantes europeus, africanos, asiáticos e índios; além disso,
são poucos os estudos envolvendo os polimorfismos e sua distribuição entre as etnias.
63
Nesse estudo, foram observadas diferenças entre o grupo controle e exposto,
porém sem significância estatística, na média dos índices de aumento relativo no número de
revertentes his+, em indivíduos com o genótipo GSTM1/GSTT1 nulo. A Figura 8, demonstra um
aumento desse valor nas amostras de urina de indivíduos com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo do
grupo exposto, comparado com o grupo controle, para a linhagem YG1024 (+S9). Apesar dessa
diferença não ter significância estatística, provavelmente devida a variações interindividuais na
resposta mutagênica, observou-se que para o grupo exposto a média dos índices de aumento
relativo no número de revertentes his+ (0,78) foi bem maior que a encontrada no grupo controle
(0,33). Esses resultados estão de acordo com os dados de literatura, que mostram a relação dos
genótipos GSTM1 e GSTT1 nulos, com os danos no material genético (PAVENELLO et al.,
2002b; LEE et al., 2003; TUIMALA et al., 2004).
Resultados semelhantes foram encontrados por Pavanello et al. (2002b), nas
amostras de urina de fumantes, onde indivíduos com genótipo GSTM1 nulo apresentaram um
discreto aumento, sem diferença estatisticamente significativa, na mutagenicidade urinária
(YG1024 com ativação metabólica), comparado com indivíduos com GSTM1 presente. A
concentração de 1-hidroxipireno na urina de indivíduos expostos ocupacionalmente a HPAs,
demonstrada por Lee et al. (2003), foi um pouco maior, porém não significativa, em
trabalhadores com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo, do que a encontrada em trabalhadores com os
respectivos genótipo positivos.
Tuimala et al. (2004), também demonstraram um discreto aumento, sem
significância estatística, na freqüência de troca entre cromátides irmãs em indivíduos com
genótipo GSTT1 nulo em relação aos indivíduos com genótipo GSTT1 presente (8,64 versus
7,93).
64
Teixeira et al. (2004) demonstraram que as deleções dos genes GSTT1 e GSTM1
e os polimorfismos do gene CYP2E1 aumentaram as trocas entre cromátides irmãs em
trabalhadores expostos a baixas concentrações de estireno.
Um estudo feito com trabalhadores de minas de carvão demonstrou uma
diferença estatisticamente maior nos aductos de DNA nos indivíduos com genótipo GSTM1 nulo
(PAVANELLO et al., 2004).
Leopardi et al. (2003), observaram uma freqüência de micronúcleo menor em
policiais de trânsito com o genótipo GSTM1 nulo.
Existem muitas divergências entre os estudos que correlacionam os
polimorfismos enzimáticos e os danos ao material genético. Pitarque et al. (2002) não
encontraram nenhum efeito do polimorfismo do gene GSTM1 e as trocas entre cromátides irmãs
em trabalhadores expostos a solventes. Os polimorfismos dos genes GSTT1 e GSTM1
encontrados em trabalhadores coreanos expostos a HPAs, não apresentaram nenhum efeito na
formação de aductos de DNA e na concentração de 1-hidroxipireno urinário (LEE et al., 2003).
Silva et al. (2004) também não demonstraram o efeito significativo do genótipo
GSTT1 nulo nas freqüências de micronúcleos e trocas entre cromátides irmãs em linfócitos
humanos tratados com hidroquinona (um metabólito do benzeno). Por outro lado, no mesmo
trabalho, observou-se que os indivíduos com genótipo GSTM1 nulo apresentaram um aumento
significativo (p< 0,013) na freqüência da troca entre cromátides irmãs, comparados aos
indivíduos com genótipo selvagem.
Qu et al. (2005) não demonstraram diferença estatisticamente significativa nas
concentrações de metabólitos urinários de benzeno entre indivíduos com genótipo GSTT1
presente e nulo, expostos ocupacionalmente ao benzeno.
65
Os hábitos alimentares, medicamentos e tabagismo têm grande influência na
atividade mutagênica urinária. Peters et al. (2004) observaram atividade mutagênica significativa
na urina de indivíduos após consumo de carne vermelha frita, no entanto, a mutagenicidade
urinária não foi influenciada pelos genótipos GSTM1, NAT1 e NAT2. Pavanello et al. (2002a),
demonstraram que a atividade do CYP1A2 aumenta as concentrações de mutágenos na urina,
especialmente em acetiladores lentos de NAT2, quando comparados aos acetiladores rápidos.
Altas concentrações de mutágenos urinários foram observadas em pacientes após tratamento
dermatológico com uma pomada a base de alcatrão. Os valores da mutagenicidade urinária dos
indivíduos com genótipo GSTM1 nulo foram maiores dos que os observados nos indivíduos com
genótipo selvagem (GABBANI et al., 1999).
Deleções dos genes GSTT1 e GSTM1 são comuns na maioria da população. O
aumento do risco de câncer associado a ausência dos genes GSTT1 e GSTM1 não é claro. Aktas
et al. (2001), encontraram uma freqüência de 64,5% do genótipo GSTM1 nulo em pacientes com
câncer de bexiga invasivo, tais resultados foram estatisticamente significativos quando
comparado ao grupo controle, demonstrando que o polimorfismo do gene GSTM1 pode ser um
importante fator de risco para o câncer de bexiga. Elevado risco de câncer de bexiga foi associado
a ausências dos genes GSTT1 e GSTM1 em fumantes num estudo de caso-controle realizado na
Argentina. Outro dado interessante revelado nesse estudo foi que o cigarro teve mais influência
do que o genótipo (MOORE et al., 2004). Outros estudos epidemiológicos demonstraram um
aumento discreto no risco de câncer de bexiga e pulmão em indivíduos com GSTM1 nulo
(McWILLIAMS et al., 1995; D´ERRICO et al., 1996).
Hirnoven et al. (1996) não observaram a influência do genótipo nulo para os
genes GSTT1 e GSTM1 no risco de doenças pulmonares em trabalhadores expostos a asbestos.
66
Resultados semelhantes foram demonstrados por Yang et al. (2004) em um estudo avaliando
chinesas com câncer de pulmão.
A maioria dos estudos envolvendo esses genes, utiliza protocolos que não
detectam genótipos heterozigotos. No entanto, no estudo de caso-controle com câncer de mama,
Parl (2004) empregou uma técnica capaz de detectar o genótipo heterozigoto. Seus resultados
demonstram um aumento significantemente maior de risco de câncer de mama para o genótipo
+/+ do que para o -/- do gene GSTM1.
Nossos resultados não permitiram uma associação significativa entre o genótipo
e a mutagenicidade urinária, porém, observou-se um predomínio de respostas mutagênicas
positivas das amostras de urina do grupo exposto com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo. Das 7
amostras de urina que foram positivas no teste de Ames, 6 eram de indivíduos com genótipo
GSTM1/GSTT1 nulo para a linhagem YG1024 (+S9). Com isso, fica clara a relevância dos
estudos que avaliam o risco da exposição ocupacional a solventes orgânicos, através do uso de
biomarcadores biológicos e dos perfis genéticos e, assim, promover medidas que resguardem a
saúde desses trabalhadores.
67
7. Conclusões
No presente trabalho foi proposto avaliar a atividade mutagênica de indivíduos
expostos ocupacionalmente a solventes orgânicos e seus respectivos controles (indivíduos sem a
exposição); determinar os polimorfismos dos genes GSTM1, GSTT1 e CYP2E1 nesses
indivíduos; e averiguar a existência ou não da associação dos genótipos e atividade mutagênica
nas amostras de urina. Os resultados apresentados permitem as seguintes conclusões:
1. A linhagem YG1024, é um indicador adequado para ensaios de
mutagenicidade urinária em indivíduos expostos ocupacionalmente a solventes orgânicos. E,
apenas para a linhagem YG1024 na presença de ativação metabólica houve diferença
significativa (p < 0,05) entre os grupos.
2. Dentre os participantes desse estudo, observou-se a seguinte distribuição dos
genótipos: 90% e 69% dos indivíduos do grupo controle e exposto (respectivamente)
apresentaram genótipo GSTM1/GSTT1 nulo; o genótipo GSTM1 presente foi encontrado apenas
no grupo exposto (17%); e o genótipo GSTT1 presente foi encontrado em 10% e 14% dos
indivíduos do grupo controle e exposto, respectivamente.
68
3. Observou-se um predomínio de respostas mutagênicas positivas das amostras
de urina do grupo exposto com genótipo GSTM1/GSTT1 nulo. A baixa freqüência do alelo c2
(CYP2E1-PstI), a inexistência da combinação dos genótipos GSTM1 e GSTT1 selvagens,
acrescido ao tamanho da população estudada, são fatores que podem ter impedido a
demonstração da associação entre os outros genótipos e a atividade mutagênica urinária.
4. A atividade mutagênica teve um aumento estatisticamente significativo no
grupo exposto, assim sendo, a exposição a solventes orgânicos pode ser considerado um fator de
risco para a saúde de tais indivíduos. No entanto, são necessários mais estudos para tentar
elucidar os mecanismos genéticos (biotransformação de xenobióticos) para a criação de medidas
preventivas primárias.
69
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ABNT/2002
88
ANEXO 1
Para Uso do Pesquisador
Número Código................................................................ Data........./......../.......
QUESTIONÁRIO DE SAÚDE PESSOAL
Por favor, leia as seguintes questões cuidadosamente e responda-as o mais completo e
corretamente possível. A informação dada não será associada com seu nome em nenhum
documento público e será revelada somente ao investigador responsável por este estudo. As
respostas que você fornecer podem ter um papel direto na interpretação de nossos resultados.
HISTÓRIA PESSOAL
1.Nome:
...................................................................................................................................................
2.Idade:
.............................................
3.Data de nascimento:
............/............./..................
dia mês ano
4.Sexo: ( ) masculino ( )feminino
5. Grupo étnico:
a) cor da pele: ..............................................................
b) descendência: ..........................................................
6.Estado Civil: ( ) Casado(a) ( ) Solteiro(a) ( ) Divorciado(a)
7. Quantos filhos naturais? (não incluir adotados ou enteados e considerar as crianças que moram
separadamente)
.....................................................................................
HISTÓRIA PROFISSIONAL ATUAL E PASSADA
8.Trabalha atualmente? ( ) SIM ( ) Não
9. A quanto tempo você trabalha nessa companhia? .............................................................
10. Se menos do que 10 anos, qual companhia trabalhou previamente e por quanto tempo?
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
11.Que tipo de trabalho você fez ou faz?..................................................................................
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
HISTÓRICO DE EXPOSIÇÃO
89
12. Você tem sido exposto, em seu emprego, a algum dos seguintes compostos químicos?
12.a. Quando você foi exposto pela primeira vez? (meses ou anos)
12.b. Quando você foi exposto pela última vez? (meses ou anos)
12.c. Quanto tempo em termos de dias, meses ou anos, no total, você foi exposto?
Asbestos ( ) sim 1......................................................................
(amianto) ( ) não 2......................................................................
3......................................................................
Radiação ( ) sim 1......................................................................
( ) não 2......................................................................
3......................................................................
Produtos de Carvão ( ) sim 1.....................................................................
( ) não 2.....................................................................
3.....................................................................
Cinzas (de madeira, ( ) sim 1.....................................................................
couro ou partículas ( ) não 2.....................................................................
finas de metal) 3.....................................................................
Pesticidas/herbicidas ( ) sim 1.....................................................................
( ) não 2....................................................................
3.....................................................................
Produtos de petróleo ( ) sim 1.....................................................................
( ) não 2.....................................................................
3.....................................................................
Tintura ( ) sim 1.....................................................................
( ) não 2.....................................................................
3.....................................................................
Solventes ( ) sim 1....................................................................
( ) não 2....................................................................
3....................................................................
Outros químicos ( ) sim 1....................................................................
(especificar no item 15) ( ) não 2....................................................................
3...................................................................
13.Listar os nomes de algumas substâncias específicas às quais você sabe ter sido exposto por
aspiração ou contato direto com a pele no trabalho ou no último ano ou dentro dos últimos dez
anos.
13.a. Nos últimos 12 meses?
90
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
13.b. Qual freqüência mensal de exposição?
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................13.c.
Dentro dos últimos 10 anos?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
......................................................................................................13.d. Com que freqüência mensal
nesses últimos 10 anos?
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
14. Listar alguma exposição a agentes químicos ou físicos que você se submeteu nos últimos 10
anos enquanto praticava um passatempo ou qualquer outra atividade em casa ou em outro
ambiente não profissional. Consulte na lista da questão de número 13, mas não limite sua
resposta somente aquelas substâncias.
14.a. Nos últimos 12 meses?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
14.b. Qual freqüência mensal de exposição?
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................14.c.
Dentro dos últimos 10 anos?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
......................................................................................................14.d. Com que freqüência mensal
nesses últimos 10 anos?
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................
HISTÓRIA DE CIGARRO
15.Você fuma constantemente? ( ) sim ( ) não
Se NÃO vá para a questão 17.
Se SIM:
a) Há quanto tempo você fuma?...................................................................................
b) Você fuma atualmente? ( ) sim ( ) não
91
Se NÃO, quando parou de fumar? ...............................................................................
Há quanto tempo parou de fumar? ...............................................................................
Proceda para a questão 16
Você fuma cigarro com filtro? ( ) sim ( ) não
Qual sua marca usual? ............................................................................................
c) Você usualmente fuma cigarros? ( ) sim ( ) não
Se sim, quantos maços por dia? ( ) menos que meio
( ) meio a 1 maço
( )mais que 1: quantos maços/dia? .........
d) Você fuma freqüentemente charutos? ( ) sim ( ) não
Se sim quantos charutos por dia? ( ) 1 charuto
( ) 2-3 charutos
( ) 4 ou mais charutos
e) Você fuma freqüentemente cachimbo? ( ) sim ( ) não
Se sim, quantos ao dia? ( ) 1
( ) 2 a 3
( ) 4 ou mais
f) O que fumou no passado?
( ) cigarro
( ) charuto
( ) cachimbo
g) Você mastiga fumo freqüentemente? ( ) sim ( ) não
16. Você tem usado algum medicamente prescrito por um médico nos últimos 12 meses ( por
exemplo: comprimidos para pressão sanguínea, antibióticos, antiinflamatórios, antidepressivos,
insulina, tranqüilizantes, relaxantes musculares e etc.)?
( ) sim ( ) não
Se sim, qual o tipo de medicação, a dose, a quantidade/ dia e o período de tempo (mês de
início e de término)?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
...................................................................................
17. Você usou alguma medicação não prescrita nos últimos 12 meses ( por exemplo: aspirina,
antiácidos, antihistamínicos, sedativos, ou outras drogas)?
( ) sim ( ) não
Se sim, qual o tipo de medicação, a dose, a quantidade/ dia e o período de tempo (mês de
início e de término)?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
92
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
...................................................................................
18. Você toma alguma vitamina freqüentemente ou tomou nos últimos 6 meses?
( ) sim ( ) não
Se sim, qual o tipo de vitamina, qual a dose e a quantidade por semana?
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................
19.a. Você já teve ou tem alguma das seguintes enfermidades?
( ) câncer
( ) hepatite
( ) mononucleose
( ) herpes
( ) aids
( ) meningite
( ) infecção bacteriana ou viral
( ) doença cardiovascular
( ) diabetes
( ) outras enfermidades
b. Se teve outras enfermidades, por favor, especifique qual, quando adoeceu e qual o
tratamento indicado.
Doenças:
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
Período de enfermo:
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................Tratamento
:
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................
c. Listar algumas outras doenças e os tratamentos que você se submeteu dentro dos últimos 12
meses (estes devem incluir gripes, resfriados, etc.)
Doenças:
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
.................................................................................................................................
...................................................................................................................................................
Período de enfermo:
............................................................................................................................................................
..........................................................................................................................................Tratamento
:
93
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................
d. Listar algumas vacinações que você recebeu nos últimos 12 meses.
Tipo de vacina .....................................................................................................................
Data administrada................................................................................................................
e. Listar qualquer raio X diagnóstico ou terapêutico que você recebeu nos últimos 10 anos.
Reação ao raio X Ano recebido
............................................................................ ........................
............................................................................ ........................
............................................................................ ........................
f. Você já fez algum raio X dentário? ( ) sim ( ) não
Se sim, ( ) no último mês
( ) nos últimos 6 meses
( ) nos últimos 6 – 12 meses
( ) mais de um ano atrás
g. Você fez alguma cirurgia no ano passado? ( ) sim ( ) não
Se sim, relacione o motivo e a data
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................
h. Você teve alguma febre alta durante o ano passado? ( ) sim ( ) não
Data Doença associada Medicação utilizada
................ ......................................... .............................................................
................ ......................................... .............................................................
................ ......................................... .............................................................
................ ......................................... .............................................................
................ ......................................... .............................................................
HISTÓRIA DA DIETA
(deve refletir somente hábitos freqüentes)
20. Você come vegetais? ( ) sim ( ) não
21. Você come carne? ( ) sim ( ) não
21.a. Se sim, como você come freqüentemente os seguintes alimentos?
Dias/ semana
Nunca 1-2 3-4 5-6 todo dia
Bife........................................................................................................................
Peixe......................................................................................................................
Frango...................................................................................................................
Porco.....................................................................................................................
Outros....................................................................................................................
................................................................................................................................
94
21.b. Você prefere o bife?
( ) mau passado ( ) no ponto ( ) bem passado
22. Você usa adoçante? ( ) sim ( ) não
Se sim, quanto por dia? ....................................................................
23. Você toma bebida dietética? ( ) sim ( ) não
Se sim, quanto por dia? ....................................................................
24. Comente a respeito de uma dieta específica não citada nas questões acima, por exemplo, dieta
especial tal como, altas doses de proteína, baixos níveis de carboidratos, etc.
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
........................................................................................................................
25. a. Você toma café? ( ) sim ( ) não
b. Se sim, quantos por dia? ..............................................................................................
c. Descafeinado? ( ) sim ( ) não
d. Se sim, quantos por dia? ..............................................................................................
26.a. Você toma chá? ( ) sim ( ) não
b. Se sim, quantos por dia? ..............................................................................................
27.a. Você toma cerveja? ( ) sim ( ) não
b. Se sim, por favor, indique sua média de consumo semanal:
( ) 1-6 garrafas ou canecas por semana
( ) 7-12 garrafas por semana
( ) 13-24 garrafas por semana
( ) mais que 24 garrafas por semana, se esta categoria for escolhida, qual a sua média de
consumo de cerveja por semana?........................ garrafas/ canecas por semana
28. Você bebe vinho? ( ) sim ( ) não
Se sim, por favor indicar a média de vinho consumido semanalmente:
( ) 1-4 copos por semana
( ) 5-8 copos por semana
( ) 9-16 copos por semana
( ) mais do que 16 copos por semana, se esta categoria foi escolhida, qual a média de consumo
de vinho semanal? ...................................copos por semana.
29. Você bebe outra bebida alcoólica? ( excluindo cerveja e vinho) ( ) sim ( ) não
Se sim, por favor, indicar a média consumida semanalmente:
( ) 1-4 copos por semana
( ) 5-8 copos por semana
( ) 9-16 copos por semana
( ) mais do que 16 copos por semana, se esta categoria foi escolhida, qual a média de consumo
semanal? ...................................copos por semana.
HISTÓRIA GENÉTICA
95
30. Você tem conhecimento de algum defeito de nascimento ou outra doença genética ou doença
herdada que afeta seus pais, irmão, irmãs ou seus filhos?
( ) sim ( ) não
Se sim, por favor, especificar
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
................................................................................................................................
31.a. Você ou sua esposa já tiveram dificuldade em engravidar (por um período de pelo menos
12 meses) ou já foram diagnosticados como inférteis?
( ) sim ( ) não
Se sim, por favor, especificar ( indicar quando ocorreu a dificuldade ou quando recebeu o
diagnóstico)
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
................................................................................................................................
31.b. Você já fez uma análise de sêmen? ( ) sim ( ) não
32. Você ou sua esposa já tiveram crianças com defeitos de nascimento ou outras doenças
genéticas ou herdadas? ( ) sim ( ) não
Se sim, por favor, especificar (indicar quando a criança nasceu e a natureza da doença)
............................................................................................................................................................
............................................................................................................................................................
................................................................................................................................
33. Você e sua esposa podem relatar a ocorrência de algum tipo de aborto?
( ) sim ( ) não
34. Você tem um casal de gêmeos vivos?
( ) sim ( ) não
35. Sua esposa ou mãe do seu filho apresentou parto tranqüilo?
( ) sim ( ) não
96
ANEXO 2
Termo de consentimento livre e esclarecido:
Eu ____________________________________________ ,RG ___________, Estado
Civil __________, Idade ________ anos, Residente na
____________________________________________,nº_____________________,
Complemento _____ Bairro ___________________, Cidade _________________,
Telefone _____________________,
Declaro ter sido esclarecido sobre os seguintes pontos:
1. O trabalho tem por finalidade avaliar na urina a presença de compostos químicos que causam
mutação, provenientes da exposição a solventes orgânicos para avaliar a sensibilidade
individual a esses compostos químicos.
2. Ao participar desse trabalho estarei contribuindo para uma melhor compreensão dos
mecanismos envolvidos na metabolização dos solventes orgânicos.
3. Terei que doar para a realização dessa pesquisa, o(s) seguinte(s) material (ais) biológico (s)
1L de urina e 20 mL de sangue.
4. A minha participação como voluntário deverá ter a duração de um dia (coleta única).
5. Que não corro nenhum risco ao participar dessa pesquisa e que a coleta de material terá um
desconforto mínimo.
6. Os materiais empregados na coleta serão descartáveis;
7. Deverei voltar ao laboratório todas as vezes em que houver solicitação dos pesquisadores
desse projeto;
8. Não terei nenhuma despesa ao participar desse estudo;
9. Os procedimentos aos quais serei submetido não provocarão danos físicos ou financeiros e
por isso não haverá a necessidade de ser indenizado por parte da equipe responsável por esse
trabalho ou da Instituição (FCF/UNESP);
10. Meu nome será mantido em sigilo, assegurando assim a minha privacidade e se desejar,
deverei ser informado sobre os resultados dessa pesquisa;
97
11. Deverei responder o Questionário de Saúde Pessoal fornecidos pelos pesquisadores.
12. Qualquer dúvida ou solicitação de esclarecimentos, poderei entrar em contato com a equipe
científica pelo telefone 016- 3301-69-51, ou com a pesquisadora Soraya Duarte Varella pelo
telefone 016-9761-02-07.
13. Para notificação de qualquer situação de anormalidade que não puder ser resolvida pelos
pesquisadores deverei entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas do Câmpus de Araraquara da UNESP, pelo telefone (0XX16) 3301-
6897.
Diante dos esclarecimento prestados, concordo em participar do estudo “Análise da
mutagenicidade urinária e susceptibilidade genética no monitoramento de indivíduos expostos
a solventes orgânicos” , na qualidade de voluntário.
Araraquara, __________________ 2003.
Assinatura do Voluntário
98
ANEXO 3
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
CAMPUS DE ARARAQUARA
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
Seção Técnica Acadêmica
Protocolo n° 18/2002 –CEP
Interessado: SORAYA DUARTE VARELLA
Orientador: Profa. Dra. ELIANA APARECIDA VARANDA
Projeto: MONITORAMENTO DE INDIVÍDUOS EXPOSTOS A SOLVENTES ORGÂNICOS
PARA ANÁLISE DA INSTABILIDADE GENÉTICA E MUTAGENICIDADE URINÁRIA.
Parecer n° 04/2003 – Comitê de Ética em Pesquisa
O projeto “Monitoramento de indivíduos expostos a solventes orgânicos para
análise da instabilidade genética e mutagenicidade urinária”, encontra-se adequado em
conformidade com as orientações constantes da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de
Saúde/MS.
Por essa razão, o Comitê de Ética em Pesquisa desta faculdade considera o
referido projeto estruturado dentro dos padrões éticos e é de PARECER FAVORÁVEL à sua
execução.
Lembramos Vossa Senhoria da necessidade de entrega do relatório parcial em
fevereiro de 2004 e do relatório final em agosto de 2005. No relatório final deverá constar o
Termo de Consentimento Livre Esclarecido dos sujeitos da pesquisa.
Araraquara, 18 de fevereiro de 2003.
Profa. Dra. REGINA MARIA BARRETO CICARELLI
Coordenadora do CEP
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