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MARIANA FERREIRA LEITE
ESTUDO TEMPORAL DO EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE
TUNGSTATO DE SÓDIO SOBRE ALGUNS PARÂMETROS DE
GLÂNDULAS SALIVARES E SALIVA DE RATAS DIABÉTICAS
São Paulo
2006
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Mariana Ferreira Leite
Estudo temporal do efeito da administração de tungstato de sódio
sobre alguns parâmetros de glândulas salivares e saliva de ratas
diabéticas
Tese apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade de São Paulo
para obter o título do Doutor pelo Programa de
Pós-Graduação em Odontologia
Área de Concentração: Materiais Dentários
Orientador: Prof. Dr. José Nicolau
São Paulo
2006
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Catalogação-na-Publicação
Serviço de Documentação Odontológica
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
Leite, Mariana Ferreira
Estudo temporal do efeito da administração de tungstato de sódio sobre alguns
parâmetros de glândulas salivares e saliva de ratas diabéticas/ Mariana Ferreira
Leite; orientador José Nicolau. -- São Paulo, 2006.
109p. : fig., graf.; 30 cm.
Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Área de
Concentração: Materiais Dentários) -- Faculdade de Odontologia da Universidade
de São Paulo.
1. Glândulas salivares – Tungstato de Sódio – Efeitos 2. Saliva - Tungstato de
Sódio – Efeitos 3. Diabetes Mellitus 4. Matérias dentários
CDD 617.63
BLACK D15
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,
POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE E COMUNICADO AO AUTOR A
REFERÊNCIA DA CITAÇÃO.
São Paulo, ____/____/____
Assinatura:
E-mail:
FOLHA DE APROVAÇÃO
Leite MF. Estudo temporal do efeito da administração de tungstato de sódio sobre
alguns parâmetros de glândulas salivares e saliva de ratas diabéticas
[Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP, 2006.
São Paulo, 22 de maio de 2006.
Banca Examinadora
1) Prof (a). Dr (a)._____________________________________________________
Titulação:____________________________________________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________
2) Prof (a). Dr (a)._____________________________________________________
Titulação:____________________________________________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________
3) Prof (a). Dr (a)._____________________________________________________
Titulação:____________________________________________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________
4) Prof (a). Dr (a)._____________________________________________________
Titulação:____________________________________________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________
5) Prof (a). Dr (a)._____________________________________________________
Titulação:____________________________________________________________
Julgamento:________________________ Assinatura:________________________
Mar Português
Ó mar salgado, quanto do teu sal
São lágrimas de Portugal!
Por te cruzarmos, quantas mães choraram,
Quantos filhos em vão rezaram!
Quantas noivas ficaram por casar
Para que fosses nosso, ó mar!
Valeu a pena? Tudo vale a pena
Se a alma nao é pequena.
Quem quer passar além do Bojador
Tem que passar além da dor.
Deus ao mar o perigo e o abismo deu,
Mas nele é que espelhou o céu.
Fernando Pessoa
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha filha Marina menina, meu orgulho, minha inspiração e
motivação para todos os meus esforços. Desculpa-me pela ausência em
determinado momento de nossas vidas, saiba que todo meu sacrifício é para que
você tenha o mundo a seus pés. Te amo minha filha.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu querido orientador Professor José Nicolau
O grande mestre é aquela pessoa que identifica talentos ocultos e os canalizam para
o rumo correto. O senhor foi a pessoa que descobriu minha vocação, despertou meu
interesse pela investigação e me motivou pela decisão de trilhar esse caminho. O
senhor foi um grande exemplo que influenciou minha escolha. Esse exemplo a que
me refiro não pode ser contabilizado em nenhuma base de dados como Medline ou
coisas do gênero. Infelizmente, não há Currículo Lattes que possa registrar o
exemplo de seriedade, honestidade e sinceridade que o senhor nos ensinou, além
do exemplo de dedicação à pesquisa, à Universidade de São Paulo, à FAPESP.
Agradeço pelos nossos seminários, pelas críticas que me ensinaram a me expressar
e sobretudo a ter a sofisticação de saber ouvir. Agradeço pela compreensão e
carinho paternal que recebi nos momentos que precisei. Saiba que sou sua discípula
e sua fiel seguidora.
AGRADECIMENTOS
Á minha super mãe pelo apoio INCONDICIONAL em todos os momentos de minha
vida e de minha formação, obrigada pelo exemplo de mulher batalhadora e
perseverante.
A toda minha família, meus irmãos, meus avós, tios e primos que sempre torceram
pelo meu sucesso, obrigada pelo carinho.
Ao Alexandre, meu companheiro durante todo o período de realização desse
trabalho, obrigada pela compreensão e apoio nas minhas decisões, pela amizade,
amor e carinho. Fico muito feliz pelo fruto da relação que construímos, colhemos
hoje muita admiração e amizade um pelo outro, além de uma filha linda, inteligente e
amada.
Ao Genésio e Heliana, grandes amigos que guardo no coração. Tenho muita
admiração pela trajetória de vida desse casal que me ensinou que a vida é bela. A
serenidade e otimismo que admiro em vocês me ajudaram em muitos momentos da
minha tese. Também agradeço a minha segunda mãe, Leila Gomes dos Santos.
Aos meus queridos amigos do laboratório Douglas, Fernando, Emily, Walter, Fausto,
Monique, Jonas, Paulinha, Helena, Alyne, Ana Paula. Obrigada pela paciência de
agüentar minhas reclamações e divagações e desculpa-me por falar além da conta
em certos momentos. A presença de vocês tornou a realização desse trabalho um
prazer. O clima de alegria e amizade do laboratório vai fazer muita falta na próxima
etapa da minha vida, acho que não sei viver sem vocês.
A minha amiga-irmã Emily por toda tua amizade, pelas sessões de terapia coletiva,
pelos conselhos racionais, pela companhia em muitos momentos da minha vida.
Obrigada minha irmãzinha.
Aos animais que tiveram suas vidas sacrificadas em nome da ciência.
Aos professores do Departamento de Materiais Dentários, especialmente a Rosa
Helena Miranda Grande, Leonardo Eloy Rodrigues Filho e Carlos Eduardo Francci,
pela confiança em meu trabalho e pelas oportunidades concedidas.
Aos funcionários do Departamento de Materiais Dentários, pela colaboração em
todos os momentos que precisei. Obrigada Rosinha por me acudir nos apuros
passados, sempre com muito carinho.
Aos amigos do Parc Cientific de Barcelona pela amizade com que me receberam, Dr
Joan Guinovart, Jorge, Mar, Delia, Laura, Suzana, Anna, Daniel, Carles, David,
Oscar, Emma, Jordi, Helena. Encantada por conocerlos, muchisimas gracias por
todo el cariño y amistad.
AGRADECIMENTOS
Á FAPESP pelo apoio financeiro. Pela concessão da bolsa de estudo de doutorado e
pelo uso da reserva técnica para a realização do estágio sanduíche no exterior.
Ao Parc Cientific de Barcelona – Universidade de Barcelona, Laboratório de
Enginyeria Metabòlica i Teràpia de la Diabetis pelo espaço concedido para a
realização de parte deste trabalho de tese.
Leite MF. Estudo temporal do efeito da administração de tungstato de sódio sobre
alguns parâmetros de glândulas salivares e saliva de ratas diabéticas
[Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP, 2006.
RESUMO
O presente estudo teve por objetivo avaliar a influência da administração do tungstato
de sódio (2 mg/ml) num período de 6 semanas sobre alguns parâmetros de parótida,
submandibular e saliva de ratas diabéticas induzidas por estreptozotocina. Os grupos
estudados foram divididos em controle (C), controle tratado com tungstato de sódio
(CT), diabético (D) e diabético tratado (DT). Os parâmetros estudados foram o
metabolismo energético, a composição protéica das glândulas e de saliva total
estimulada por pilocarpina e isoproterenol, bem como a via de secreção de proteínas.
No metabolismo energético foi determinada a concentração de glicogênio e a atividade
enzimática da hexoquinase, fosfofrutoquinase-1, piruvato quinase, glicose-6-fosfato
desidrogenase, lactato desidrogenase. Foram determinadas a concentração de
proteína total, a atividade enzimática da amilase e peroxidase e o teor de ácido siálico
em glândulas salivares e saliva. A via de secreção de proteínas foi estudada pela
avaliação da expressão de proteína quinase C por western blot. Os resultados obtidos
confirmam o potencial hipoglicemiante do tungstato de sódio, bem como sua ação no
controle da polifagia, da polidipsia e do peso corporal e glandular. A concentração de
glicogênio sofreu um incremento nos grupos diabéticos e o tratamento com tungstato
de sódio potencializou esse aumento nas glândulas salivares. A glândula parótida
sofreu um aumento de alguns parâmetros da via glicolítica e de sua composição
protéica nas semanas iniciais do estudo, com normalização nas semanas finais. O
tungstato se mostrou efetivo no controle da atividade de peroxidase em glândulas
salivares, com efeitos pouco significativos sobre os demais parâmetros estudados. Os
animais diabéticos apresentaram um aumento da proteína total em saliva, porém
nenhuma diferença foi observada na atividade da amilase e peroxidase. O tungstato de
sódio potencializou o aumento da concentração de proteínas causado pelo diabete
além de reduzir a atividade da amilase na saliva dos animais controle e diabético
tratados. A glândula submandibular de ratos diabéticos sofreu uma estimulação na
expressão de PKC ativa e inativa após uma semana experimental, além de uma
alteração do perfil das isoformas da enzima, o tungstato de sódio potencializou esse
aumento. Conclusão: O papel do tungstato de sódio no restabelecimento do
metabolismo energético não foi observado em parótida e submandibular, mostrando
que esse composto não modifica o metabolismo de tecidos periféricos como as
glândulas salivares. A ação do tungstato de sódio sobre a atividade da peroxidase em
glândulas salivares indica que esse composto pode atuar como auxiliar no sistema
antioxidante no organismo. O tungstato de sódio potencializa uma das vias de
secreção de saliva pelo estímulo da PKC.
Palavras-Chave: Glândulas salivares, saliva, diabetes, tungstato de sódio
Leite MF. Time course study of sodium tungstate administration on some parameters
of salivary gland and saliva of diabetic rats
[Tese de Doutorado]. São Paulo: Faculdade de Odontologia da USP, 2006.
ABSTRACT
The aim of study was evaluate the effect of sodium tungstate administration (2mg/ml)
on some parameters of parotid, submandibular and pilocarpine/isoproterenol
stimulated saliva of streptozotocin induced-diabetes, during six weeks. The groups
were divided in untreated control (C), treated control (CT), untreated diabetic (D) and
treated diabetic (DT). The parameters studied were energetic metabolism, proteic
composition of glands and saliva, besides the protein secretion pathway. In the
energetic metabolism were determinated hexokinase, phosphofructokinase-1,
pyruvate kinase, glycose-6-phosphate dehydrogenase and lactate dehydrogenase
activities. Were evaluated the total protein concentration, amylase and peroxidase
activities and free and total sialic acid content on saliva and salivary glands. The
protein secretion pathway was studied by evaluation of expression of protein kinase
C by western blot. The results obtained confirm the tungstate potential as
hypoglycemic, as well as its action in the polifagia, polidipsia and body and glandular
weight control. The glycogen concentration suffered an increment in the diabetic
group and the tungstate treatment potentialized the increase in the salivary glands.
Parotid glands suffered an increased in some parameters of glycolitic pathway and its
protein composition in the initial weeks of study, with normalization in the end of
experiment. The tungstate was effective in the control of peroxidase activity in
salivary glands, but few effects on the other parameters. Diabetic animals presented
an increased of total protein concentration in saliva, but no difference was observed
in the amylase and peroxidase activities. Sodium tungstate caused an increased in
the total protein concentration and a reduction on amylase activity of saliva in the CT
and DT groups. Submandibular gland of diabetic rats suffered stimulation in the
active and inactive PKC expression after one week and alteration in the isoforms
profile of enzyme. Sodium tungstate potencialized this increased. Conclusion: In this
study, was not observed effect of sodium tungstate on energetic metabolism of
parotid and submandibular, showing that this compound does not alter the
metabolism in the peripheral tissue as salivary glands. The tungstate acts on
peroxidase activity, this show the possible action of this compound in the antioxidant
system. Sodium tungstate stimulates the protein secretion pathway in the salivary
glands.
Keywords: Salivary glands, saliva, diabetes and sodium tungstate
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................16
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................19
2.1 Diabete Melito.....................................................................................................19
2.2 Diabete Melito e glândulas salivares................................................................24
2.3 Diabete Melito e tungstato de sódio.................................................................32
3 PROPOSIÇÃO........................................................................................................36
4 MATERIAL E MÉTODO..........................................................................................37
4.1 Animais e indução do diabete...........................................................................37
4.2 Tratamento com tungstato de sódio................................................................37
4.3 Obtenção das amostras.....................................................................................38
4.3.1Coleta da saliva..................................................................................................38
4.3.2Obtenção das glândulas parótida e submandibular...........................................39
4.4 Análises...............................................................................................................39
4.4.1 Determinação da glicemia.................................................................................39
4.4.2 Determinação de Proteína.................................................................................40
4.4.3 Determinação da atividade enzimática da amilase...........................................40
4.4.4 Determinação da atividade enzimática da peroxidase......................................41
4.4.5 Determinação de ácido siálico...........................................................................41
4.4.6 Determinação da concentração de glicogênio..................................................42
4.4.7 Determinação das enzimas hexoquinase (HK), fosfrutoquinase 1 (PFK-1),
piruvato quinase (PK), e glicose-6-desidrogenase (G6PD), lactato desidrogenase
(LDH)..........................................................................................................................43
4.4.8 Western Blot da proteína quinase C (PKC).......................................................44
4.5 Análise estatística..............................................................................................45
5 RESULTADOS........................................................................................................46
6 DISCUSSÃO...........................................................................................................82
7 CONCLUSÕES.......................................................................................................96
REFERÊNCIAS…..................................................................................................….99
ANEXO.....................................................................................................................108
16
1 INTRODUÇÃO
O diabete melito é uma enfermidade metabólica que desequilibra o sistema
anabólico do organismo, com comprometimento do metabolismo de carboidrato,
lipídeos e proteínas. A hiperglicemia causada pelo diabete causa complicações
tardias degenerativas como cardiopatias, arteriosclerose, micro e macroangiopatias,
neuropatias, nefropatias, retinopatias. Além dessas implicações gerais, algumas
patologias orais são manifestadas em decorrência do diabete, entre elas xerostomia,
gengivite, periodontite abscessos dentais e freqüentemente lesões na mucosa e
língua.
A xerostomia é um dos principais sintomas manifestados por pacientes
diabéticos. Assim, a saliva e as glândulas salivares de indivíduos e animais
diabéticos têm sido foco de investigação. As glândulas salivares apresentam uma
série de alterações na sua composição histológica, com acúmulo de tecido adiposo.
Há mudanças na sensibilidade de receptores do sistema nervoso autônomo, com
comprometimento da resposta adrenérgica e colinérgica. Além disso, já foram
observadas em glândulas salivares possíveis microangiopatias manifestadas pela
alteração em sua vasodilatação, um desequilíbrio do sistema antioxidante e
alteração no metabolismo de glicose e glicogênio.
O tungstato de sódio é um composto que tem sido investigado como
alternativa no tratamento do diabete. Este composto possui ação insulinomimética
em ratos diabéticos e tem se mostrado como um potente agente hipoglicemiante
capaz de controlar o peso corporal, a polifagia e polidipsia em diferentes modelos
animais de diabetes tipo 1 (ratos STZ) e de tipo 2 (ratos nSTZ e ZDF). O mecanismo
17
de ação do tungstato ainda não está bem definido, porém há muitos relatos que
apontam que sua administração restabelece o metabolismo de glicogênio hepático
através da estimulação da glicogênio sintase e diminui a gliconeogênese pela
inibição da glicose-6-fosfatase. O tungstato de sódio aumenta o influxo glicolítico
pela estimulação da atividade de algumas enzimas chaves da glicólise em fígado e
hepatócitos isolados, portanto esse composto estimula a obtenção de energia pela
estimulação da via glicolítica. Além disso, há indícios de que o tungstato de sódio
estimula a síntese de insulina e a regeneração de células β no pâncreas.
Há relatos que mostram o efeito do tungstato em outros tecidos que não estão
envolvidos diretamente com o controle da homeostase, manutenção da glicemia e
do metabolismo anabólico. A administração de tungstato de sódio causa uma
normalização da hiperglicemia e hiperlipidemia diminuindo os riscos de cardiopatias,
além de melhorar o desempenho da musculatura cardíaca. Outro estudo mostrou
que o tungstato de sódio recupera a capacidade reprodutiva através da proliferação
de células de Leydig em testículos de ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina. Não há relatos do efeito do tungstato de sódio sobre as glândulas
salivares.
Assim, o propósito do nosso estudo foi investigar a ação do tungstato de
sódio em alguns parâmetros de glândulas salivares de ratas diabéticas induzidas
pela injeção intraperitoneal de estreptozotocina. Estudamos o metabolismo
energético, através da determinação da concentração de glicogênio, da atividade de
alguns parâmetros da via glicolítica, da via das pentoses e do metabolismo
anaeróbico. Outro foco do estudo foi a determinação da composição protéica de
parótida, submandibular e saliva total estimulada por pilocarpina e isoproterenol nos
grupo experimentais estabelecidos. Os parâmetros estudados foram a concentração
18
de proteína total, a atividade enzimática da peroxidase e amilase e o teor de ácido
siálico livre e total. Além do metabolismo energético e da composição protéica de
glândulas salivares e saliva, também avaliamos a expressão de proteína quinase C
(PKC) como um possível indicativo da via de sinalização da síntese de proteínas em
glândulas salivares.
19
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Diabete Melito
O número de indivíduos diagnosticados com diabetes tem aumentado
dramaticamente em todo o mundo devido ao crescimento populacional, aumento da
expectativa de vida, da incidência de obesidade, diminuição de práticas de
atividades físicas, entre outras. As projeções para a prevalência de diabetes para o
ano 2030 apontam aproximadamente 366 milhões de indivíduos em todo mundo e
11.3 milhões no Brasil (WILD et al., 2004).
O diabete melito é uma desordem metabólica caracterizada pela hiperglicemia
e por manifestações tardias degenerativas. Essa enfermidade metabólica é
classificada como tipo 1, por ocorrer uma deficiência na produção de insulina pelas
células β das ilhotas de Langerhans do pâncreas e como tipo 2 , um quadro
associado à resistência à insulina com diminuição da sensibilidade de receptores
celulares e outros agravantes. Há outros tipos diabéticos, porém numa menor
incidência.
As principais manifestações clínicas do aumento da glicemia são polifagia,
poliúria, polidipsia, hálito cetônico, que ocorre pela presença de corpos cetônicos. O
aumento de corpos cetônicos no sangue causa um quadro de acidose, podendo
levar o indivíduo ao coma, especialmente no diabete tipo 1. O aumento da pressão
osmótica no líquido extracelular, causada pelo excesso de glicose, dificulta a
circulação periférica. Alguns tecidos, como o cérebro, retina e epitélio germinativo
das gônadas, não necessitam de receptores de insulina para o uso de glicose.
20
Assim, no cérebro o aumento da glicemia causa choque hipovolêmico, irritabilidade
nervosa progressiva, desmaio e convulsão (GUYTON; HALL, 1997).
De modo geral, as formas de diabete tipo 1 e tipo 2 são caracterizadas por
hiperglicemia crônica relacionada ao aparecimento de complicações tardias
degenerativas. Alterações macrovasculares estão freqüentemente associadas ao
diabete e afetam artérias que suprem o coração, cérebro e extremidade corporal. As
micro e macroangiopatias diabéticas estão correlacionadas à hiperglicemia e são
responsáveis por impotência sexual, arteriosclerose, retinopatias, neuropatia e
nefropatia (BROWNLEE; CERAMI, 1981).
A insulina é um hormônio sintetizado pelas células β das ilhotas de
Langerhans do pâncreas, que ao se ligar aos receptores existentes na membrana
plasmática das células alvo desencadeia uma complexa cascata de fosforilações
responsáveis pela ação final da insulina no metabolismo anabólico. A presença de
receptores de insulina em glândula submandibular foi demonstrada com a utilização
de insulina marcada com
125
iodo (SCACCHI; TURYN; DELLACHA, 1988).
A insulina é um hormônio anabolizante que atua no armazenamento de
substâncias energéticas e possui papel importante no metabolismo de carboidratos,
proteína e lipídios. Ela aumenta a permeabilidade celular através da estimulação da
síntese de transportadores de glicose (GLUTs) e sua translocação para a membrana
plasmática. Além disso, a insulina estimula a via glicolítica e a síntese de glicogênio
hepático e muscular pela ativação da glicogênio sintase e inibição da glicogênio
fosforilase. A insulina também promove o armazenamento de ácidos graxos e
glicerol no tecido adiposo na forma de triacilglicerol e impede a degradação de
gorduras pela inibição da lipase sensível a hormônios. No metabolismo de proteínas,
21
a insulina estimula a tradução no RNA-mensageiro, inibe a degradação de proteínas
e deprime a taxa de gliconeogênese (GUYTON; HALL, 1997).
A falta de insulina proporciona a ativação da glicogênio fosforilase e da lipase
sensível á hormônios, causa a depleção protéica e o aumento de aminoácidos
plasmáticos, inibe o crescimento, estimula a conversão dos excessos de ácidos
graxos em fosfolipídios e colesterol e a oxidação deles em corpos cetônicos como a
acetona, o ácido acetoacético e o ácido β-hidroxibutirato, entre outras. Assim, além
de hiperglicemia, o indivíduo diabético freqüentemente apresenta um aumento de
ácidos graxos livres na corrente sanguínea e lipogênese ectópica, gerando um
quadro de glicotoxicidade e lipotoxicidade (GUYTON; HALL, 1997).
Muitos relatos presentes na literatura esclarecem como o diabete afeta o
metabolismo de carboidratos. Ao ser encaminhada através da membrana plasmática
pela ação do GLUT, a glicose sofre uma fosforilação pela atividade da hexoquinase,
um mecanismo para sua manutenção no meio intracelular. A atividade da
hexoquinase é determinante não apenas para a síntese de energia pelo
desencadeamento da via glicolítica, como também para a síntese de glicogênio
hepático e muscular. Alguns autores (FRANK; FROMM, 1986) mostraram uma
diminuição da atividade dessa enzima e de sua síntese em musculatura esquelética
de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina. A fosfofrutoquinase (PFK) é uma
importante enzima reguladora da via glicolítica que catalisa a formação de frutose-
1,6-bisfosfato a partir da frutose-6-fosfato. Ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina apresentaram uma redução da atividade máxima da PFK-1 e da
concentração de seu produto de reação em musculatura esquelética comparado
com animais controle (CHEN-ZION; LIVNAT; BEITNER, 1994). Há relatos da
correlação entre o diabete tipo 2 e a deficiência da atividade da fosfofrutoquinase
22
(PFK) e da piruvato quinase (BOUCHÉ et al., 2004). A lactato desidrogenase é uma
enzima que direciona o piruvato, produto da via glicolítica, para uma via anaeróbica,
com a formação de lactato. A hiperlactactemia pode levar a uma resistência à
insulina por aumentar a gliconeogênese no fígado e diminuir a captação de glicose
na musculatura esquelética. Porém, esses resultados foram demonstrados em
animais e não em humanos (BOUCHÉ et al., 2004).
Além de comprometimento da via glicolítica pela inibição da síntese ou da
atividade de suas enzimas, o diabete desencadeia uma série de alterações
mitocondriais, afetando também a síntese de ATP e a formação de agentes
redutores antioxidantes, o que aumenta a susceptibilidade celular a estress
oxidativo. Em condições normais, a cadeia respiratória mitocondrial gera um
gradiente de prótons, cuja energia é utilizada para síntese de ATP. Quando há uma
alta estimulação desse processo, por exemplo através de uma hiperglicemia, ocorre
um desequilíbrio nesse gradiente de prótons transmembrânico e uma alteração do
potencial de membrana mitocondrial, estimulando a geração de superóxidos.
Há quatro principais hipóteses de como a hiperglicemia pode acarretar as
micro e macroangiopatias diabéticas. Aumento do fluxo da via de formação de poliol,
aumento da produção de produtos finais de glicosilação avançada (advanced
glycation ends products – AGE), ativação de isoformas de proteína quinase C e
aumento do fluxo da via de hexosaminas são os quatro mecanismos moleculares
relacionados com o aparecimento de patologias diabéticas e que são
desencadeados pela produção intracelular de superóxidos (BROWNLEE, 2001;
ROLO; PALMEIRA, 2006). A figura 2.1 mostra a correlação desses 4 fatores. A
hiperglicemia estimula a conversão de glicose em sorbitol e frutose com consumo de
NADPH e glutationa. A diminuição de redutores antioxidantes causa uma maior
23
susceptibilidade a estress oxidativo associado ao aumento de espécies reativas de
oxigênio (ROS) intracelular. A hiperglicemia aumenta a demanda pela via glicolítica.
A produção de superóxidos inibe a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, gerando
um aumento na taxa NADH/NAD
+
e um contra-fluxo da via glicolítica, com o
direcionamento para a síntese de novo de diacilglicerol (DAG). O aumento na
formação de diacilglicerol estimula diferentes isoformas de PKC. A ativação de
isoformas de PKC tem inúmeras conseqüências patológicas, afetando a expressão
de óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), endotelina-1, fator de crescimento
endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento transformador (TGF-β), inibidor do
ativador de plasminogênio-1 (PAI-1) e pela ativação de NF-
K
B e NAD(P)H oxidase. A
alteração desses fatores está relacionada à anormalidade no fluxo sanguíneo,
permeabilidade e capilaridade vascular, bem como à produção de mediadores pró-
inflamatórios. A hiperglicemia pode ocasionar a glicosilação de proteínas,
aumentando a produção intracelular de AGE, o que compromete a integridade
celular pela modificação da função protéica ou pela produção intracelular de ROS. A
hiperglicemia e a produção de superóxidos também estimulam a via de hexosamina
com a produção final de UDP-N-acetilglicosamina, um importante substrato para
glicosilação intracelular. A glicosilação de fatores de transcrição comprometeria a
expressão de muitos genes como o de PAI-1 (BROWNLEE, 2001).
24
Figura 2.1 – Mecanismos moleculares que relacionam a hiperglicemia com o aumento da via de
formação de poliol, da via das hexosaminas, formação de AGE e estimulação de PKC.
(
ROLO; PALMEIRA, 2006)
2.2 Diabete Melito e glândulas salivares
As glândulas salivares maiores (parótida, submandibular e sublingual) são
responsáveis por aproximadamente 95% da secreção salivar. Sua disposição básica
se compõe por unidades secretoras e um sistema de ductos, sustentados por um
tecido conjuntivo. As unidades secretoras, também chamadas de ácinos, são
compostas por células mucosas, serosas e mioepiteliais, que variam no tamanho,
25
forma e número. As células serosas são especializadas na síntese, armazenamento
e secreção de proteínas, enquanto que a secreção das células mucosas possui um
conteúdo menos enzimático e com maior teor de glicoproteínas. As glândulas
salivares menores, com ductos curtos, formam uma pequena massa glandular
distribuída por quase toda extensão da cavidade bucal, abaixo da membrana
mucosa. Embora produzam apenas aproximadamente 5% da saliva, elas secretam
mucoproteínas importantes na formação de película adquirida (TENCATE, 1988).
O fluido proveniente das unidades secretoras das glândulas salivares maiores
chama-se secreção primária, ou seja, um meio isotônico composto por água, íons,
proteínas, alto teor de sódio e baixo teor de potássio. Ao passar pelo sistema de
ductos, o fluido fica hipotônico, com baixo teor de sódio e cloretos, ocorrendo
também um transporte ativo de bicarbonato e potássio. A saliva presente na
cavidade oral, denominada saliva total, apresenta uma composição distinta daquela
sintetizada pelas glândulas salivares e possui microorganismos, células
descamadas, restos alimentares, leucócitos e outros componentes que infiltram
através da junção dentogengival (TENCATE, 1988).
As glândulas salivares recebem um suprimento nervoso autônomo simpático
e parassimpático. A estimulação β-adrenégica é responsável pela secreção protéica
de natureza mais viscosa, enquanto que a α-adrenérgica e colinérgica é responsável
pela secreção de água e eletrólitos, com menor concentração de substâncias
orgânicas. O processo celular de secreção é denominado de exocitose e ocorre
através da estimulação de receptores β-adrenégico (predominantes na parótida e
submandibular) que leva a geração de AMPc, este ao se ligar à proteína quinase A
no meio intracelular causa a separação da parte ativa desta enzima, fosforilando
proteínas alvo que atuam no processo de exocitose protéica. Outra forma de
26
estimulação do processo de exocitose é através da estimulação de receptores
colinérgicos muscarínicos, que estimula a hidrólise do fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato
(PIP
2
), gerando inositol trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG). O IP
3
estimula a
mobilização de cálcio intracelular no retículo endoplasmático e a formação do
complexo cálcio calmodulina, importante no processo de exocitose. O DAG estimula
fosforilação da proteína quinase C (PKC). A PKC fosforilada associada à alta
concentração de cálcio intracelular promove a exocitose de grânulos de secreção
(BAUM, 1993).
As principais funções da saliva presente na cavidade oral são: digestão, pela
presença de amilase e lipase; proteção da mucosa bucal através do potencial
lubrificante, ocasionado por seu conteúdo glicoproteico; ação mecânica de limpeza e
remoção de agregados bacterianos adsorvidos nas proteínas salivares; gustação,
não só dissolve e conduz substâncias a serem saboreadas até os botões gustativos,
como também participa do processo de desenvolvimento e maturação deles, pela
ação da gustina; capacidade tampão, que pode agir de dois modos, primeiro
desequilibrando o pH necessário para o crescimento máximo de bactérias, segundo
promovendo o tamponamento dos ácidos produzidos pela placa bacteriana, através
de bicarbonato e fosfato; exerce influência ecológica pelo seu amplo espectro de
proteínas antibacterianas, tais como lisozima, lactoferrina, peroxidase,
imunoglobulinas (IgA), proteínas ricas em prolinas e outras; possui um conteúdo
iônico e protéico, que contribui para o processo de remineralização e impede a
precipitação precoce de cálcio e fosfato, respectivamente (TENCATE, 1988).
Alguns parâmetros salivares têm sido estudados como indicativo de atividade
glandular, como por exemplo, amilase em parótida e a peroxidase em
27
submandibular. Discutiremos a seguir alguns aspectos de determinados
componentes salivares avaliados neste estudo.
A amilase é a enzima mais abundante na saliva e secretada principalmente pelas
glândulas parótidas. Ela está envolvida com três funções distintas, dá início ao
processo de digestão de carboidratos pela hidrólise do amido, possui afinidade por
hidroxiapatita, o que lhe confere participação na formação da película adquirida do
esmalte e na colonização bacteriana (VACCA SMITH; BOWEN, 2000), além de
possuir sítios específicos de ligação com bactérias, por exemplo streptococcus
viridans (KANDRA et al., 2005).
A peroxidase é uma enzima presente na saliva, secretada principalmente pela
glândula submandibular e distribuída por todo o organismo. Está envolvida em
diversas funções biológicas, variando de acordo com o seu tipo e localidade. Na
presença de H
2
O
2
, proveniente do metabolismo bacteriano ou de células como
leucócitos, a peroxidase salivar catalisa a transformação de tiocianato, derivado da
dieta e do tabaco, em hipotiocianato, que por sua vez inibe o crescimento
bacteriano. O espectro antimicrobiano do sistema peroxidase abrange gram positivo
e negativo, bactéria de origem não oral, potencial antiviral e antifúngico (IHALIN;
LOIMARANTA; TENOVUO, 2005). Além disso, a peroxidase catalisa a degradação
do peróxido de hidrogênio, diminuindo a toxicidade celular. Outros tipos, como a
mieloperoxidase, podem estar presentes em processos inflamatórios e na placa
bacteriana (TENOVUO; PRUITT, 1984).
A mucina presente na saliva atua como lubrificante da mucosa oral, o que
representa uma barreira protetora contra atritos, desidratação e danos ambientais na
cavidade oral. Esta proteína controla a permeabilidade e a penetração de agentes
irritantes e toxinas na mucosa, protegendo-a contra a ação de proteases gerada por
28
microorganismos, além de outras propriedades como afinidade por bactérias,
formando grumos facilmente eliminados pela deglutição. A mucina é uma
glicoproteína rica em resíduos de serina e treonina. Entre 40 e 80% da massa da
mucina pode ser composta por oligossacarídeos glicosilados em serina e treonina
(ZALEWSKA et al., 2000). Um dos principais oligossacarídeos glicosilados nas
cadeias protéicas de mucina é o ácido siálico, um derivado do ácido N-
acetilneuramínico que ocupa a porção terminal desta cadeia e proporciona
viscosidade por suas cargas elétricas negativas (HERP; WU; MOSCHERA, 1979). O
ácido siálico possui receptores para Streptococcus sanguis e oralis (THYLSTRUP,
1994).
Alguns autores estudaram a relação do diabete com as alterações no equilíbrio
bucal e suas manifestações patológicas. Além das implicações gerais, também
ocorrem manifestações bucais associadas a diabetes como xerostomia, perda de
dentes, gengivite, periodontite, abscessos dentais e freqüentemente lesões na
mucosa e língua (DARNELL; SAUNDERS, 1990).
A xerostomia é um dos principais sintomas relatados por pacientes diabéticos. A
xerostomia é um parâmetro subjetivo relatado pelo indivíduo, diagnosticado através
de queixas de boca seca, dificuldade de falar, mastigar, deglutir, etc. A
hipossalivação é uma medida objetiva que corresponde com a diminuição absoluta
do fluxo salivar (DAWES, 2004). Em trabalho realizado no Centro de Pesquisa em
Biologia Oral (dados submetidos à publicação), indivíduos diabéticos do tipo 2
descompensados apresentaram xerostomia, causada por uma redução absoluta do
fluxo salivar. A cintigrafia é uma técnica que avalia a função glandular através da
injeção intravenosa de contrastes, indivíduos diabéticos tipo 2 foram submetidos a
29
esse teste e os resultados mostraram uma anormalidade na produção de saliva e na
sua taxa de secreção (LIN et al., 2002)
Considerando que as funções de síntese e secreção de saliva nas glândulas
salivares são mediadas pela estimulação do sistema nervoso autônomo, alguns
estudos avaliaram a influência do diabete na produção de neurotransmissores, bem
como na sensibilidade dos receptores simpático e parassimpático. Um modelo de
rato diabético do tipo 2 apresentou uma diminuição na síntese e secreção de
noradrenalina em parótida e submandibular, além disso, o fluxo salivar em resposta
a estimulação de receptores adrenérgicos também sofreu uma redução comparada
com o controle, o que sugere um comprometimento da transmissão simpática em
glândulas salivares (VATTA et al., 2002). Há outros relatos que mostram que a
redução do fluxo salivar pode estar associada a uma diminuição da sensibilidade de
receptores muscarínicos em decorrência do diabete (WATANABE; YAMAGISHI-
WANG; KAWAGUCHI, 2001). Além de alteração em receptores do sistema nervoso
autônomo, o diabete afeta a via de sinalização desencadeada pela estimulação
desses receptores. Há relatos do aumento na expressão de PKC em glândulas
salivares de camundongo diabéticos não obesos (NOD Mouse) num curto período
de tempo (TENSING et al., 2005). Num longo prazo, o estímulo da expressão de
PKC poderia levar a um feed-back negativo, com comprometimento da síntese
protéica em glândulas salivares. Um estudo da vascularização em glândula
submandibular de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina mostrou uma
diminuição da vasodilatação e nenhuma alteração da vasoconstrição estimulada por
impulsos simpáticos (ANDERSON; GARRETT, 2004). Esses resultados acima
relatados apontam uma possível neuropatia e microangiopatia manifestada em
decorrência do diabete.
30
Aspectos estruturais da regulação hormonal das glândulas salivares foram
abordados (GARRET; EKSTRÖM; ANDERSON, 1998; HIGH; SUTTON; HOPPER,
1985; REUTERVING et al., 1987) com particular enfoque no diabete experimental.
As principais alterações histológicas apresentadas pelas glândulas salivares de
diabéticos são diminuição no número de grânulos de secreção salivar, acúmulo de
gotículas de gordura nas células acinares de parótida e submandibular e uma
alteração na proporção celular. O acúmulo de gordura nas glândulas salivares tem
sido suportado por três conjecturas: Primeira, um aumento de lipídeos como fonte
alternativa de obtenção de energia; segunda, uma endocitose não específica
decorrente da elevação da concentração de ácidos graxos livres circulante; terceira,
uma redução na formação dos grânulos de secreção salivar e da utilização de
gorduras que participam da composição de suas membranas contribuiriam para o
aumento de gordura intracelular. Além disso, há uma alteração na proporção de
ácidos graxos nas glândulas salivares de ratos diabéticos induzidos por
estreptozotocina. O diabete tipo 1 acarreta perda de peso corpóreo, porém seu
efeito sobre o peso glandular é contraditório. Há uma hipótese da insuficiência
insulínica exercer efeitos diretos e indiretos sobre a perda de peso das glândulas
salivares, ou seja, pelo comprometimento do metabolismo energético glandular ou
pela diminuição dos níveis de hormônio de crescimento, respectivamente (GARRET;
EKSTRÖM; ANDERSON, 1998).
Como citado anteriormente, as complicações tardias degenerativas apresentadas
por indivíduos diabéticos podem ser desencadeadas pelo desequilíbrio entre o
sistema antioxidante e a produção de radicais livre, como superóxidos e peróxidos.
De acordo com alguns autores (NOGUEIRA et al., 2005), a glândula submandibular
de ratos diabéticos apresenta um aumento da concentração de glutationa reduzida e
31
oxidada e uma redução na atividade da glutationa peroxidase, enquanto que a
parótida apresenta um aumento da catalase. Além disso, há uma correlação positiva
entre a concentração de malonaldeído na submandibular e a glicemia, um indicativo
de peroxidação lipídica de glândulas salivares de ratos diabéticos.
O diabete causa uma alteração no metabolismo de carboidratos no fígado e
musculatura esquelética (FRANK; FROMM 1986; LIBAL-WEKSLER et al., 2001)
com reflexos também em tecidos periféricos como as glândulas salivares. Após 30
dias da indução do diabete se observa uma diminuição da atividade da hexoquinase
na porção solúvel e ligada à mitocôndria de submandibular, enquanto que a glândula
parótida apresentou resultados inversos (NOGUEIRA; SANTOS; NICOLAU, 2005).
Embora o diabete comprometa o armazenamento de glicogênio hepático e muscular,
em glândulas salivares esse resultado foi contrário, com aumento da concentração
de glicogênio e da atividade da glicogênio sintase, bem como uma redução da
glicogênio fosforilase (NICOLAU et al., 2005).
Há muitos estudos que mostram alterações em glândulas salivares de
animais ou humanos diabéticos, como por exemplo pela avaliação do fluxo salivar,
análise estrutural, sensibilidade de receptores adrenérgicos ou colinérgicos, a
resposta à estimulação autonômica, metabolismo energético. Esses resultados são
indicativos que levam a pensar que essa enfermidade poderia acarretar uma
alteração da composição protéica tanto de glândulas salivares quanto no seu
produto de secreção. Porém, os relatos presentes na literatura não apontam um
consenso e sim resultados conflitantes que variam de acordo com o parâmetro
estudado ou a metodologia empregada.
Há uma série de estudos sobre a atividade da amilase, da peroxidase e da
quantidade de proteínas na saliva e nas glândulas de ratos diabéticos. Estas
32
proteínas têm sido estudadas como marcadores protéicos de atividade glandular. Os
trabalhos apresentados na literatura mostram resultados controversos, com
diminuição, aumento ou nenhuma diferença na atividade da amilase e peroxidase e
concentração de proteína total em glândulas salivares e saliva de animais e
indivíduos diabéticos (ANDERSON, 1983; ANDERSON; SHAPIRO, 1979;
ANDERSON; SHAPIRO, 1980; ANDERSON et al., 1989; DODDS; DODDS, 1997;
DODDS; YEH; JOHNSON, 2000; LIN et al., 2002).
Quanto à concentração de ácido siálico em submandibular de diabéticos, os
resultados também são conflitantes. Existem relatos que mostram aumento
(NICOLAU; ROSA; FAVA-DE-MORAES, 1969) diminuição (MICKELBOROUGH,
1967) ou nenhuma diferença significante na quantidade de ácido siálico
(ZEBROWSKI; BRIMMER, 1978) na glândula submandibular.
2.3 Diabetes e tungstato de sódio
A investigação de compostos com atividade antidiabética tem sido intensa
durante estes últimos anos. Entre estes compostos tem sido descrito um conjunto de
oxiânions derivados do vanádio, selênio, molibdênio e tungstênio que têm efeitos
sobre o metabolismo energético e apresentam a vantagem de serem administrados
via oral (BECKER et al., 1996; BERG et al., 1995; LI et al., 1995; MCNEILL;
DELGATTY; BATTELL, 1991).
33
As ações antidiabéticas do tungstato tem sido amplamente descritas na literatura
em diferentes modelos animais de diabetes tipo 1 (ratos STZ) e de tipo 2 (ratos
nSTZ e ZDF).
O modelo de diabetes tipo 1 utilizado, ratos STZ, se obtém mediante a injeção de
estreptozotocina em ratos Wistar adultos. Os tratamentos com tungstato de sódio
tem sido realizados entre 15 dias e 8 meses com resultados como a normalização
da glicemia e a restauração do metabolismo hepático da glicose mediante o
aumento na fosforilação da glicose e de enzimas chaves e metabólitos da via
glicolítica, assim como o restabelecimento do metabolismo do glicogênio hepático
(BARBERA; RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et al., 2001).
Recentemente foi demonstrado que num modelo de diabetes, ratos nSTZ, o
tratamento com tungstato estimula a regeneração de células beta do pâncreas, o
que resulta num aumento na insulinemia. Este resultado é de um grande potencial já
que abre a possibilidade de uma terapia que permita a cura desta doença
(FERNANDEZ-ALVAREZ et al., 2004).
O diabete está freqüentemente associado à maioria dos casos com obesidade.
Os estudos dos efeitos do tratamento com tungstato de sódio em animais com
diabetes tipo 2 associado à obesidade, ratos ZDF (Zucker Diabetic Fatty Rat),
mostram uma importante redução na glicemia, que parece estar relacionada por um
lado com o aumento no fluxo glicolítico, devido ao aumento na atividade da
glicoquinase e da piruvato quinase, e por outro lado com o aumento do conteúdo de
glicogênio hepático (MUNOZ et al., 2001). No metabolismo de lipídeos, o tratamento
induz o aumento da atividade da ácido graxo sintase e uma redução nos níveis de
triglicérides circulantes, o qual sugere que o tratamento com tungstato de sódio
poderia reduzir a lipotoxicidade. Por outro lado, neste modelo experimental o
34
tungstato de sódio não produziu um aumento na estimulação da secreção de
insulina, mas um aumento na captação e fosforilação de glicose (MUNOZ et al.,
2001). Num modelo de obesidade utilizando animais que se alimentaram com dieta
de cafeteria, a administração crônica de tungstato de sódio causou uma diminuição
do peso corporal através do aumento da termogênese e oxidação lipídica, sem
alterar a ingestão líquida e calórica, além disso, reduziu a adiposidade, melhorou a
sensibilidade à insulina e controlou a hiperinsulinemia (CLARET et al., 2005).O
tungstato também estimula o transporte intracelular de glicose nos adipócitos
isolados, que é potencializado na presença de H
2
O
2
(GOTO et al., 1992)
.
O mecanismo de ação do tungstato de sódio não está completamente
esclarecido, mas é sabido que além de atuar no metabolismo de lipídeos, glicose e
glicogênio, sua administração aumenta a massa de células beta no pâncreas e a
concentração de Glut-4 em diafragma de ratos induzidos por estreptozotocina
(GIRON et al., 2003). Além disso, seu potencial hipoglicemiante pode estar
relacionado com a inibição da glicose-6-fosfatase, uma importante enzima que atua
na homeostase da glicose (FOSTER et al., 1998). Finalmente, há uma série de
dados que implicam às proteínas quinases ERK1/2 no metabolismo estimulatório da
deposição de glicogênio induzida por tungstato (FOSTER et al., 1998).
Muitos trabalhos apontam o tungstato como uma alternativa de contorno dos
inconvenientes causados pelo diabete, por exemplo pelo restabelecimento do
metabolismo de carboidratos e lipídeos, da síntese de insulina, do número de células
pancreáticas e outras. Porém, há algumas desvantagens que devem ser
ponderadas. A administração de tungstato de sódio potencializa a perda de peso
corpóreo causada pelo diabete, o que pode ser um grande problema para o diabete
tipo 1 e uma alternativa de controle da obesidade relacionada com o tipo 2. Poucos
35
estudos foram desenvolvidos sobre a toxicidade do tungstato de sódio e não há um
modelo biológico de sua distribuição e retenção no corpo humano. Os modelos
animais de estudo apontam um acúmulo de tungstato nos rins, fígado e grande parte
nos ossos, substituindo os íons fosfato (LEGGETT, 1997). A dose de tungstato de
sódio administrada nos trabalhos presente na literatura (2mg/ml) não causou efeitos
hepatotóxicos e nefrotóxicos nos animais, sendo utilizadas as concentrações de
alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST) como referências no
fígado e a concentração de creatinina e uréia nos rins (BARBERA; RODRIGUEZ-
GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et al., 1997). Porém, a administração de
tungstato causou uma pequena diminuição na longevidade de ratos, além de efeitos
embriológicos e aumento da reabsorção de fetos em ratas prenhas (DOMINGO,
2002). Os sinais clínicos apresentados por animais submetidos ao tratamento com
tungstato de sódio são diminuição da atividade motora e tônus muscular, anorexia,
prostração, dispnéia, fadiga, caquexia, entre outros (DOMINGO, 2002).
36
3 PROPOSIÇÃO
Não há relatos da influência do tungstato de sódio em glândulas salivares de
animais diabéticos. Assim, abordamos diferentes aspectos das glândulas salivares
de ratas diabéticas induzidas por estreptozotocina e submetidas ao tratamento com
tungstato de sódio, administrado na água de consumo numa dose de 2 mg/ml, por
um período de 6 semanas. Os aspectos abordados foram o metabolismo de
carboidratos, parâmetros da via de secreção de proteínas e a composição protéica
de glândulas e saliva.
No metabolismo de carboidratos de parótida e submandibular estudamos a
concentração de glicogênio e alguns parâmetros da via glicolítica através da
determinação da atividade da hexoquinase, fosfofrutoquinase-1 e piruvato quinase.
Estudamos também a atividade enzimática da lactato desidrogenase e glicose-6-
fosfato desidrogenase, um indicativo do metabolismo anaeróbico e da via das
pentoses, respectivamente.
A concentração de proteína total e de ácido siálico livre e total e a atividade da
amilase e peroxidase foram determinadas no estudo da composição protéica de
parótida, submandibular e saliva de ratas diabéticas tratadas com tungstato de
sódio. Além disso, estudamos a expressão de PKC por western blot, como um
parâmetro da via de secreção de proteínas desencadeadas pela estimulação de
receptores muscarínicos colinérgicos.
37
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 Animais e indução do diabete
No presente estudo foram utilizadas ratas da raça Wistar, pesando
aproximadamente 180-200g, distribuídas em gaiolas individuais, com livre acesso à
água e alimento ao longo de todo período experimental. Os animais foram divididos
em 4 grupos: controle (C), controle tratado (CT), diabético (D) e diabético tratado
(DT).
A indução de diabete foi realizada pela injeção intraperitoneal de estreptozotocina
(60mg/kg peso corporal) dissolvida em tampão citrato 0,1M pH 4,5, em ratas
mantidas em jejum por aproximadamente 15 horas. Os animais controles receberam
uma dose, correspondente à dos experimentais, de citrato de sódio 0,1M pH 4,5.
Foram considerados como diabéticos os animais que apresentaram a glicemia
superior a 300 mg de glicose/ dL de sangue. Este estudo teve a aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa da FOUSP (Anexo A).
4.2 Tratamento com tungstato de sódio
O tungstato de sódio foi dissolvido em água destilada numa concentração de
2mg/ml, com livre acesso pelos animais. O tratamento consistiu na administração
38
aos animais do grupo controle (CT) e diabético (DT) tratados e foi iniciado no
momento da determinação da glicemia inicial. Os quatro grupos estudados foram
submetidos a diferentes tempos de tratamento com tungstato de sódio e sacrificados
por traumatismo craniano no final de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 semanas de administração.
Durante o período experimental, os consumos de água e alimento foram
monitorados.
4.3 Obtenção das amostras
4.3.1 Coleta da saliva
Para a realização da coleta de saliva total, com horário padronizado no
período da manhã, para minimizar os efeitos do ritmo circadiano, os animais foram
anestesiados com hidrato de cloral 165 mg/Kg de peso e barbital sódico 16,4 mg/Kg
de peso. A saliva foi coletada num bequer mergulhado em gelo picado. A salivação
foi estimulada através da aplicação intraperitoneal de nitrato de pilocarpina (7,5
mg/Kg de peso), um agonista não seletivo de receptores muscarínicos, e pela
aplicação de isoproterenol HCL, um agonista de receptores β-adrenérgico (5,0
mg/Kg de peso). A saliva foi centrifugada a 27000g por 15 minutos e o sobrenadante
foi utilizado para a determinação das atividades da amilase e da peroxidase, o
conteúdo de ácido siálico livre e total e a concentração de proteína total.
39
4.3.2 Obtenção das glândulas parótida e submandibular
Após o sacrifício, as glândulas salivares foram imediatamente removidas,
limpas de tecido aderente, prensadas e congeladas entre placa de alumínio
previamente mantida em gelo seco e permaneceram no freezer –80°C. No momento
do uso, as glândulas ainda congeladas foram pesadas, homogeneizadas no mesmo
tampão utilizado em cada experimento e centrifugadas a 15000g por 15 minutos.
Com o sobrenadante das amostras das glândulas salivares foram analisados os
mesmos parâmetros da saliva, bem como o conteúdo de glicogênio e a atividade
enzimática das enzimas da via glicolítica.
4.4 Análises
4.4.1 Determinação da glicemia
A glicemia em jejum foi determinada da amostras de sangue obtidas da cauda
por glicosímetro Accu-Chek Advantage da Roche ®, 72 horas da injeção de
estreptozotocina para confirmar o diagnóstico de diabete e no momento do sacrifício.
40
4.4.2 Determinação de Proteína
A concentração de proteína total foi determinada pelo método de Lowry
(LOWRY et al., 1951). Neste método, as proteínas presentes nas amostras de saliva
ou nas glândulas salivares reagem com o cobre em meio alcalino formando um
complexo. Os aminoácidos fenólicos presentes neste complexo apresentam pouca
variação em sua estrutura primária e são reduzidos pelo reativo de folin-ciocalteu,
resultando uma coloração azulada. A intensidade de coloração foi determinada por
espectrofotômetro a um comprimento de onda de 660 nm. Foi usado como padrão
uma curva de referência com uma solução de albumina 0,5 mg/L
4.4.3 Determinação da atividade enzimática da amilase
A atividade enzimática da amilase foi determinada pelo método descrito por
(FISHER; STEIN, 1961). Uma mistura de amido solúvel 1%, de tampão fosfato de
sódio 20 mM (pH 7,0) e de saliva ou do homogenado das glândulas foi incubada a
37°C por 5 minutos para que a amilase presente nas amostras promova a hidrólise
do polissacarídeo. Depois da incubação, foi acrescentada a esta mescla uma
alíquota da solução alcalina de ácido dinitrosalicílico (DNS) e fervida a 100ºC por 5
minutos para paralisar a reação. A coloração causada pelo DNS foi medida por
41
espectrofotometria 530 nm. Foi usado como padrão uma curva de referência com
uma solução de maltose 1 mg/mL.
4.4.4 Determinação da atividade enzimática da peroxidase
A atividade enzimática da peroxidase foi determinada pelo método de
(ANDERSON, 1986) e (CHANDRA; DAS; DATTA, 1977). Este método consiste na
medida da variação da absorbância 460nm, pelo espectofotômetro, de uma mistura
de amostras de saliva ou do homogenado das glândulas, de tampão fosfato 10mM,
o-dionisidina 10 mM e H
2
O
2
2,1 mM. Foi usado como padrão uma curva de
referência com uma solução de lactoperoxidase 1mg/mL com diluição 1:25.
4.4.5 Determinação de ácido siálico
A concentração do ácido siálico foi determinada pela combinação de métodos
de (AMINOFF, 1961; SKOZA; MOHOS, 1976), usando uma solução de ácido N-
acetil-neuramínico como curva padrão. Para a determinação do ácido siálico total, as
amostras de saliva ou do sobrenadante de glândulas foram pré-tratadas através da
hidrólise da amostra pela incubação em 0,1N H
2
SO
4
a 80°C por uma hora, para
ocorrer a separação dos derivados do ácido neuramínico presentes nas cadeias
proteicas das glicoproteínas
.
O conteúdo de ácido siálico foi determinado pela leitura
42
espectofotométrica a 549 nm de alíquotas resultante da mistura de ácido periódico
25 nm, arsenito de sódio 2%, ácido tiobarbitúrico 0,1M pH 9,0, dimetil sulfoxido e
amostras de saliva ou do homogenado das glândulas.
4.4.6 Determinação da concentração de glicogênio
A determinação do glicogênio das glândulas salivares foi realizada pelo
método proposto por (SINGH; SINGH; VENKITASUBRAMANIAN, 1976). As
glândulas salivares foram pesadas e digeridas em KOH 30% a 100ºC por 30
minutos. As amostras foram tratadas com solução saturada de Na
2
SO
4
e metanol a
95% para proporcionar a precipitação do glicogênio e posteriormente centrifugadas a
3020g por 20 minutos. O precipitado foi tratado com ácido tricloroacético 5%,
responsável pela separação da fração proteica das amostras. As amostras foram
lavadas com metanol contendo 0,1 % de Cloreto de Lítio, metanol absoluto, metanol-
éter etílico (3:1), etér etílico. Após a digestão do tecido, precipitação e lavagem do
glicogênio, foi acrescentada às amostras uma solução de antrona 0,2% dissolvida
em ácido sulfúrico. O reagente de antrona é um composto usado para em
determinações colorimétricas de polissacarídeos em fluidos corpóreos. Foi utilizado
como padrão uma curva com solução de glicose.
43
4.4.7 Determinação das enzimas hexoquinase (HK), fosfrutoquinase 1 (PFK-1),
piruvato quinase (PK), e glicose-6-desidrogenase (G6PD), lactato desidrogenase
(LDH)
As glândulas salivares foram homogeneizadas a 10% em meio contendo
tampão 50mM imidazol pH7.0, 2mM EDTA e 1mM mercaptoetanol. O homogenado
foi centrifugado a 12100g por 20 minutos e utilizamos o sobrenadante para as
determinações. A atividade das enzimas da via glicolítica acima citada são
determinadas de acordo com o método descrito por (FERREIRA; NICOLAU, 1987).
As análises enzimáticas foram determinadas pela leitura por espectrofotômetro
Beckman DU68 da variação da absorbância a 340nm por um paríodo de 5 minutos,
causada pela redução de NADP ou oxidação do NADH, utilizando cubeta de quartzo
com 1cm de comprimento de passagem de luz. Para a atividade enzimática da HK
foi acrescentada numa cubeta uma alíquota do meio de reação (Imidazol 0.1M,
MgCl2 0.2M, ATP 0.1M, NADP, G-6DP e água destilada), do homogenado das
glândulas salivares e do iniciador da reação (solução de glicose 0,1M). A atividade
enzimática da PFK-1 foi determinada pela mistura na cubeta de uma alíquota da
amostra e do meio de reação contendo tampão Hepes 100 mM pH8.0, KCl 2mM,
MgCl
2
325 mM, NH
4
Cl 50 mM, KH
2
PO
4
50 mM, NADH 6mM, AMP 2 mM, aldolase,
G-D-H, Tim, PGI, F6P, G6P, ATP 30mM. A análise enzimática da PK foi determinada
a partir de uma mistura do meio de reação (Imidazol 0,1M, MgCl
2
,2M, KCl 1,0M,
ADP 0,1M, NADH, PEP), de uma alíquota da amostra e de lactato desidrogenase,
iniciador da reação. A atividade enzimática da G6PD foi determinada a partir de uma
mistura do meio de reação (tampão Tris-HCl 0.1M, MgCL
2
e NADP), de uma
44
alíquota da amostra e de glicose-6-fosfato, iniciador da reação. A atividade
enzimática da LDH foi determinada a partir de uma mistura do meio de reação
(K
2
HPO
4
50mM, KH
2
PO
4
0,63mM, Piruvato de Na, pH 7.5), de uma alíquota da
amostra e de NADH, iniciador da reação.
4.4.8 Western Blot da proteína quinase C (PKC)
O estudo da PKC foi realizado no Laboratório de Engenharia Metabólica e
Terapia do Diabetes do Parc Cientific de Barcelona da Universidade de Barcelona
Espanha durante o período estágio sanduíche no exterior. Para o estudo da PKC em
glândulas salivares, foram utilizados os quatros grupos após um curto período de
tratamento (1 semana). As amostras foram pesadas e homogeneizadas ainda
congeladas em tampão contendo Tris 1M pH7.4, NaCL 5M, ortovanadato 0.2M, NaF
1M, PPi 100mM, triton 20%, SDS 10% e EGTA 0,2%, 2.5µl de ácido okadaico
100µM, 10 µL de aprotinina, 10 µL de leupeptina, 10µL aprotinina, 10µL de
pepstatina. As amostras foram centrifugadas a 4ºC a 13000g por 15 minutos e o
sobrenadante foi dissolvido em tampão de ruptura (0.5M Tris-HCl, SDS 10%, glicerol
20%, mercaptoetanol 2%, ditiotreitol (DTT) 0.2mM, azul de bromofenol, 0.03mM) e
fervido por 5 minutos para a denaturação das proteínas. Foi realizada uma
eletroforese num gel de poliacrilamida a 8% com as amostras dos 4 grupos
estudados (30 µg da amostra), usando como controle positivo células de ovários de
Hamisters que expressam receptores de insulina (CHOIR). O gel foi transferido para
membrana de nitrocelulose a 100V por 40 minutos. A membrana foi bloqueada
45
através da incubação por 30 minutos em solução de albumina 3% dissolvida em
tampão fosfato de sódio 1% e Tween20 0.1%. Após o bloqueio, a membrana foi
incubada com o anticorpo primário (anti-rabbit) dissolvido na mesma solução de
bloqueio. Foram utilizados 2 tipos de anticorpos primários, um que reconhece
isoformas desfosforiladas de PKC, denominado PKC-total (referência 9371 da Cell
Signaling) e outro que reconhece as isoformas ativas fosforiladas de PKC,
denominada PKC-clássica (referência 9371 da Cell Signaling). Foi utilizado o kit
ECL Plus Western Blotting Detection Reagents, composto por antígeno conjugado
com horseradish peroxidase, uma solução que reage com o anticorpo secundário
formando uma luminescência capaz de sensibilizar um filme fotográfico.
4.5 Análise estatística
A análise estatística entre os grupos estudados foi realizada pela análise de
variância e como teste de contraste foi utilizado o teste de Tukey, com nível de
significância de 5%. A média e o desvio padrão das amostras estão representadas
nas figuras sob a forma de pontos e barras, respectivamente. As diferenças
estatisticamente significantes estão representadas por letras diferentes entre os
grupos estudados na mesma semana.
46
5 RESULTADOS
A figura 5.1 representa a média dos valores da glicemia final (mg/dL) de ratas
controle e diabéticas, tratadas ou não com tungstato de sódio, num período de 6
semanas. Os animais diabéticos incluídos nos grupos estudados apresentaram uma
glicemia inicial superior a 300 mg/dl de sangue. Em nossas condições
experimentais, os animais diabéticos induzidos por estreptozotocina apresentaram
uma glicemia superior aos animais do grupo controle, com um aumento que variou
de 430 a 650%. Com exceção da primeira e terceira semana, foi observado que o
tungstato de sódio causou uma redução da glicose sanguínea dos animais
diabéticos tratados (DT) quando comparados com o grupo diabético sem o
tratamento (D) em todos os tempos experimentais, com uma variação de 44 a 57% e
alcançando níveis próximos do controle, como na quinta semana. Embora o
tungstato tenha apresentado um efeito hipoglicemiante, a glicemia do grupo
diabético submetido ao tratamento apresentou uma variação ao longo das semanas
estudadas. O tratamento com tungstato de sódio não alterou a glicemia dos animais
do grupo controle.
A figura 5.2 representa a média dos valores do peso corporal final em gramas
avaliados no momento do sacrifício, após decorrer 6 semanas. Os animais
diabéticos apresentaram redução da massa corporal em todos os tempos
experimentais, chegando a uma perda de aproximadamente 30% do peso corporal.
O tratamento com tungstato de sódio potencializou o efeito causado pela injeção de
estreptozotocina em todos os tempos experimentais, exceto na terceira semana,
com valores que alcançaram cerca de 55% de perda comparado com o grupo
47
controle. O grupo controle tratado não sofreu qualquer alteração no peso corporal
após a administração de tungstato de sódio.
As figuras 5.3 e 5.4 representam a média dos valores de peso da glândula
parótida e submandibular, respectivamente. O peso glandular foi expresso em peso
absoluto (mg) e relativo de parótida e submandibular. O peso relativo glandular
(PGR) foi determinado de usando a seguinte fórmula: PGR = (Peso glândula (g) x
Peso corporal (g) ) x 100.
A glândula parótida sofreu uma perda de peso absoluto na terceira e quarta
semana, mas de um modo geral, as diferenças no peso absoluto de parótida foram
pouco significativas entre os grupos estudados, resultados mostrados na figura 5.3.
O peso relativo de parótida foi maior no grupo diabético na maioria dos tempos
experimentais, esse aumento foi causado por uma diminuição do peso corporal. O
tratamento com tungstato de sódio causou efeitos não significativos no peso
absoluto e relativo de parótida, exceto na quarta semana. Os resultados de peso
absoluto e relativo de submandibular foram bem distintos dos da glândula parótida
(figura 5.4). A glândula submandibular de ratos diabéticos sofreu uma redução de
peso absoluto a partir da segunda semana experimental, com uma variação de 20 a
30% comparada com o grupo controle. O tratamento com tungstato de sódio
potencializou a perda de peso absoluto de submandibular, com uma variação ente
40 e 50% comparada como grupo controle. O efeito do tungstato de sódio no grupo
controle tratado foi pouco significativo. Não houve diferenças significativas no peso
relativo de glândula submandibular.
A figura 5.5 representa a média dos valores da ingestão alimentar e líquida
dos grupos estudados. Os animais diabéticos apresentaram maior consumo de
ração (polifagia) e maior consumo de água (polidipsia), confirmadas pelo aumento
48
no consumo de água e comida em todos os tempos experimentais estudados. O
tratamento com tungstato de sódio causou uma redução na ingestão líquida nos
animais diabéticos, que se manteve estável ao longo das semanas estudadas. A
ingestão alimentar dos animais diabéticos tratados apresentou uma redução gradual
no decorrer das semanas, alcançando níveis próximos do grupo controle. Não houve
efeitos significativos do tungstato de sódio sob a ingestão líquida e alimentar no
grupo controle tratado.
A figura 5.6 representa a variação da concentração de glicogênio de glândula
parótida e submandibular, ao longo de 6 semanas. As glândulas parótida e
submandibular dos animais diabéticos sofreram um aumento na concentração de
glicogênio nas semanas iniciais do experimento, enquanto que nas semanas finais
não houve diferenças significativas comparadas com o grupo controle. Na glândula
submandibular dos animais diabéticos também houve um acúmulo de glicogênio,
representado por uma concentração maior que a do grupo controle por um período
experimental mais longo comparado com a glândula parótida. Embora a figura
mostre uma tendência do tungstato de potencializar o armazenamento de glicogênio
em parótida de diabéticos tratados, esses resultados não foram estatisticamente
significantes devido ao grande desvio padrão. Além disso, esse efeito não se
reproduziu em submandibular. Não houve diferenças entre os grupos controle e
controle tratado na concentração de glicogênio de parótida e submandibular.
As figuras 5.7 e 5.8 representam os valores da atividade enzimática da
hexoquinase expressos em unidade por miligrama de proteína (U/mg prot) e unidade
por glândula (U/glândula) de parótida e submandibular, respectivamente, durante o
período experiementado. A atividade da hexoquinase de parótida apresentou uma
variação ao longo da semana em todos os grupos estudados em U/mg prot e nos
49
grupos diabéticos e diabéticos tratados em U/glândula. A glândula parótida dos
animais diabéticos apresentaram um aumento da atividade de hexoquinase em
algumas semanas, especialmente nas semanas iniciais quando expressa em
U/glândula. O tratamento com tungstato de sódio não produziu efeitos significantes
na HK de parótida nos grupos controle e diabéticos tratados em ambas as unidades
apresentadas. As variações apresentadas pela glândula submandibular se deram
nas semanas iniciais do experimento, especialmente na unidade U/mg prot. O grupo
diabético apresentou uma diferença estatisticamente significante comparado com o
grupo controle apenas na terceira semana e o tungstato de sódio apresentou um
efeito estimulante da HK de submandibular apenas na primeira semana em U/mg
prot.
As figuras 5.9 e 5.10 representam os valores da atividade enzimática da
fosfofrutoquinase-1 (PFK-1) expressos em unidade por miligrama de proteína (U/mg
prot) e unidade por glândula (U/glândula) de parótida e submandibular,
respectivamente. A glândula parótida dos animais diabéticos e diabéticos tratados
apresentaram um aumento da atividade de PFK-1 no início do experimento com pico
na terceira e quarta semana, respectivamente (U/mg prot). Não houve diferença na
atividade da PFK-1 entre os grupos diabéticos e diabéticos tratados, exceto na
última semana devido a um aumento da atividade da enzima no grupo diabético em
ambas as unidades apresentadas. A atividade da PFK-1 da glândula submandibular
não sofreu grandes variações entre os grupos estudados, com exceção da segunda
semana na unidade U/glândula.
As figuras 5.11 e 5.12 representam os valores da atividade enzimática da
piruvato quinase (PK) expressos em unidade por miligrama de proteína (U/mg prot)
e unidade por glândula (U/glândula) de parótida e submandibular, respectivamente.
50
A glândula parótida apresentou diferenças entre os grupos estudados apenas na
primeira e na quinta semana nas unidades U/mg prot e U/glândula, respectivamente.
O grupo diabético apresentou uma redução da atividade da enzima, potencializada
pelo tratamento com tungstato de sódio. A glândula submandibular do grupo
diabético apresentou uma redução na atividade da enzima na segunda semana
comparada com o grupo controle (U/mg prot). Porém, na quarta e quinta semana
esse evento foi contrário devido a uma redução no grupo controle. As diferenças
apresentadas na unidade U/glândula foram conseqüências da variação da atividade
da enzima na submandibular dos grupos controle e controle tratado.
As figuras 5.13 e 5.14 representam os valores da atividade enzimática da
glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD) expressos em unidade por miligrama de
proteína (U/mg prot) e unidade por glândula (U/glândula) de parótida e
submandibular, respectivamente. Os resultados mostram aumento na atividade
específica dessa enzima na glândula parótida dos animais diabéticos na segunda,
terceira e quarta semana após a injeção de STZ. Os dados para a atividade
específica dos animais tratados com tungstato de sódio apresentaram efeito
estimulante da enzima apenas na segunda semana experimental. A glândula
submandibular apresentou diferença entre os grupos estudados apenas na segunda
semana experimental em ambas unidades apresentadas, com uma estimulação da
atividade da enzima no grupo diabético tratado.
As figuras 5.15 e 5.16 representam os valores da atividade enzimática da
lactato desidrogenase (LDH) expressos em unidade por miligrama de proteína (U/mg
prot) e unidade por glândula (U/glândula) de parótida e submandibular,
respectivamente. A glândula parótida do grupo diabético apresentou uma atividade
enzimática reduzida na primeira semana do estudo (U/mg prot e U/glândula). Porém,
51
no decorrer do tempo ocorreu uma estimulação com pico de atividade na terceira
semana (apenas em U/mg prot), assim, as diferenças com o grupo controle
ocorreram apenas na primeira e segunda semana. De modo geral, os resultados do
grupo diabético tratado acompanharam os do grupo diabético. Os resultados da
atividade enzimática da G6PD de submandibular foram semelhantes aos de parótida
na primeira semana do estudo em ambas as unidades. Entretanto, o grupo diabético
tratado apresentou uma estimulação na terceira semana na unidade U/glândula.
A figura 5.17 representa os valores da concentração de proteína (mg
proteína/mg tecido) das glândulas parótida e submandibular dos grupos estudados.
A glândula parótida dos animais diabéticos apresentou uma redução na
concentração de proteínas na segunda semana estudada, enquanto que a diferença
na submandibular foi um aumento na quinta semana. O tratamento com tungstato de
sódio aumentou a concentração de proteínas na primeira e terceira semana de
parótida e na primeira de submandibular de animais diabéticos tratados. O tungstato
de sódio causou um aumento na concentração de proteínas no grupo controle na
glândula parótida (terceira semana) e na submandibular (segunda e quinta semana).
A figura 5.18 representa os valores da atividade enzimática da amilase (U/mg
prot) das glândulas parótidas e submandibular. Nossos resultados mostraram que a
parótida possui uma atividade da amilase muito maior que a da submandibular, o
que era esperado de acordo com a literatura. A glândula parótida do grupo diabético
apresentou um aumento da atividade da enzima nas semanas iniciais do tratamento,
sendo normalizada no final de experimento. O tungstato de sódio potencializou o
acúmulo de proteína no grupo diabético tratado na segunda semana experimental. A
glândula submandibular não apresentou diferenças na concentração de proteínas
52
entre os grupos controle e diabéticos. Além disso, todos os grupos estudados
sofreram variação da atividade da amilase ao longo das semanas.
A figura 5.19 representa os valores da atividade enzimática de peroxidase das
glândulas parótida e submandibular. Assim como aconteceu com a atividade da
amilase, a glândula parótida sofreu um aumento da peroxidase no grupo diabético
em algumas semanas das semanas estudadas, com um pico de atividade na
segunda semana. Em relação à glândula submandibular, nas semanas que
ocorreram diferenças estatisticamente significantes a tendência foi um aumento da
atividade no grupo diabético, com exceção da terceira semana devido um aumento
excessivo da atividade no grupo controle. O tungstato de sódio manteve a atividade
da peroxidase num nível próximo do grupo controle na maioria das semanas
estudadas, tanto de parótida quanto de submandibular.
As figuras 5.20 e 5.21 representam os valores da concentração de ácido
siálico de parótida e submandibular, respectivamente. Os valores apresentados em
cada figura representam a média da concentração de ácido siálico livre e total em µg
Nana/ mg proteína. A concentração de ácido siálico total de parótida do grupo
diabético apresentou um aumento nas semanas iniciais estudadas, com um pico na
segunda semana e queda nas semanas finais do experimento. Este evento também
passou com outros parâmetros estudados de parótida de ratos diabéticos, por
exemplo, com a atividade da amilase e peroxidase. Apesar desse aumento, as
diferenças com o grupo controle se deram apenas na segunda semana e na sexta,
devido à variação no grupo controle. Assim como aconteceu com a concentração de
ácido siálico total de parótida, o ácido siálico livre do grupo diabético também sofreu
um pico nas semanas iniciais dessa glândula. A glândula submandibular não
apresentou diferenças na concentração de ácido siálico total e livre comparando
53
grupo controle e diabético, com exceção da sexta semana por uma variação no
grupo controle. O tratamento com tungstato de sódio não apresentou grandes efeitos
sobre a concentração de ácido siálico total e livre de parótida e submandibular, com
apenas algumas diferenças. Na terceira semana em glândula parótida, o grupo
diabético tratado apresentou uma redução na concentração de ácido siálico total
comparado com o grupo diabético, enquanto que o grupo controle tratado
apresentou uma redução na concentração de ácido siálico livre comparado com o
grupo controle.
De modo geral, as modificações dos parâmetros salivares estudados em
parótida e submandibular apareceram nas semanas iniciais do experimento, com
uma tendência à normalização no final de 6 semanas. Assim, estudamos a
concentração de proteína total e a atividade enzimática da amilase e peroxidase em
saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenol dos grupos estudados no período
em que ocorreram as principais alterações nas glândulas salivares, ou seja, num
período de até quatro semanas experimentais. Nossos resultados em glândulas
salivares foram contrários dos que se passaram em saliva.
A figura 5.22 representa os valores da concentração de proteína total (mg/ml)
da saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenol nos quatro grupos estudados.
Em glândula parótida e submandibular foram observadas uma redução ou nenhuma
diferença estatisticamente significante na concentração de proteína total do grupo
diabético nas semanas iniciais do experimento, respectivamente. Porém, em saliva
os valores são bem diferentes, com um aumento da concentração de proteínas no
grupo diabético comparado com o grupo controle. O tratamento com tungstato de
sódio potencializou o aumento da concentração de proteína total em saliva dos
grupos controle e diabético tratados em algumas semanas estudadas.
54
As figuras 5.23 e 5.24 representam os valores da atividade enzimática da
amilase (U/mg prot) e peroxidase (µg/mg prot) da saliva estimulada por pilocarpina e
isoproterenol nos quatro grupos estudados. Os resultados mostraram que não houve
diferenças significantes entre os grupos controle e diabético, porém o tratamento
com tungstato de sódio causou uma redução na atividade da amilase do grupo
controle e diabético submetidos ao tratamento, em todas as semanas estudadas. A
atividade da peroxidase do grupo diabético apresentou uma redução na primeira
semana quando comparada ao controle, porém nenhuma diferença foi encontrada
no decorrer do experimento. Não houve efeitos significativos do tungstato de sódio
sob a atividade de peroxidase nos grupos tratados, com exceção do grupo diabético
na segunda semana, que apresentou uma redução de sua atividade.
As figuras 5.25 e 5.26 representam os resultados do estudo da proteína
quinase C (PKC) em glândula submandibular e parótida, respectivamente, após uma
semana de tratamento com tungstato de sódio. As imagens representam os quatro
grupos estudados comparados com um controle positivo de células de CHOIR,
sendo usados anticorpos que reconhecem as isoformas clássicas fosforiladas e
portanto ativas da enzima, bem como anticorpos contra PKC total, que reconhecem
isoformas não fosforiladas e portanto não ativas da enzima. Cada banda
apresentada no resultado de western representa um animal diferente. A glândula
submandibular do grupo diabético apresentou um aumento na expressão de PKC
clássica, bem como também ocorreu o aparecimento de diferentes isoformas
fosforiladas da enzima, especialmente o tipo alfa, esse subtipo foi bem marcado no
padrão positivo de CHOIR. Alguns animais do grupo diabético apresentaram uma
estimulação da expressão de PKC total, porém esse efeito não foi reproduzido em
todos os animais. Além disso, o tungstato de sódio potencializou a expressão de
55
PKC clássica e total em submandibular do grupo diabético tratado. A glândula
parótida não apresentou qualquer diferença entre os grupos estudados tanto no
estudo da PKC clássica quanto na PKC total.
Glicemia
0
100
200
300
400
500
600
700
800
123456
Semanas
mg/dl
C
CT
D
DT
Figura 5.1- Média da glicemia (mg/dl) dos grupos estudados controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por
i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e
barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<15). As diferenças estatisticamente significantes são
representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
cc
c
c
a
a
ccc
aa
bb
b
b
bb
b
bb
a
b
a
a
a
56
Peso corporal
0
50
100
150
200
250
300
123456
Semanas
Gramas
C
CT
D
DT
Figura 5.2 – Média do peso corporal (gramas) dos grupos estudados controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético
induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6
semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente
significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
a
a
a
b
b
b
cc
cc
cc
a
b
c
d
a
b
cc
aa
bb
57
Figura 5.3 – Média do peso absoluto (mg) e relativo (g/g peso corporal.100) de parótida dos grupos estudados controle (C), controle tratado com
tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato de sódio
(DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<12). As
diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
Peso absoluto da parótida
0
50
100
150
200
250
300
123456
Semanas
miligramas
C
CT
D
DT
Peso relativo da parótida
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
123456
Semanas
g/g peso corporal.100
C
CT
D
DT
aa
ab
b
bbb
a aa
bb
a
b
ab
c
aa
bb
a
a
ab
b
a
a
b
c
a
b
cc
58
Figura 5.4 – Média do peso absoluto (mg) e relativo (g/g peso corporal.100) de submandibular dos grupos estudados controle (C), controle tratado
com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato de
sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<12). As
diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
Peso relativo da submandibular
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
123456
Semanas
g/ gpeso corporal.100
C
CT
D
DT
Peso absoluto da submandibular
0
50
100
150
200
123456
Semanas
miligramas
CH
CT
DH
DT
a
a
b
c
c
a
b
d
b
a
c c
c
b
b
a
a
a
b
bb
bb
aa
59
Figura 5.5 – Média da ingestão alimentar e líquida (g.dia
-1
.g peso corporal
-1
e ml.dia
-1
.g peso corporal
-1
, respectivamente) dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ
tratado com tungstato de sódio (DT), por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Ingestão alimentar
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
123456
Semana
g/dia.g peso corporal
C
CT
D
DT
Ingestão de líquidos
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
123456
Semana
ml/dia.g peso corporal
C
CT
D
DT
c
b
a
a
b
cc
bbb
a
b
b
bbb
a
a
a
cc
a
a
a
a
a a
b
b
b
b
b b
cc cc cc cc cc cc
bb
60
Figura 5.6 – Média da concentração de glicogênio (µn/mg tec) de parótida e submandibular dos grupos estudados controle (C), controle tratado
com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato de
sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<12). As
diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
Glicogênio submandibular
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
123456
Sem anas
ug/mg tecido
C
CT
D
DT
Glicogênio parótida
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
123456
Semanas
ug/mg tec
C
CT
D
DT
aa
bb
aa
b
c
aaa
b b
aaa
aa
bb
bb
aa aaa
b
a
ab
b
61
Figura 5.7 – Média da atividade enzimática de hexoquinase (U/mg prot e U/glândula) de parótida dos grupos estudados controle (C), controle
tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com tungstato
de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente (8<n<10). As
diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
Hexoquinase parótida - U/mg prot
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
123456
Sem anas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Hexoquinase parótida - U/glândula
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
123456
Sem anas
U/gland
C
CT
D
DT
aa
bb
aaa
b
aa
bb
aa
bb
aaa
b
62
Figura 5.8 – Média da atividade enzimática de hexoquinase (U/mg prot e U/glândula) de submandibular dos grupos estudados controle (C),
controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com
tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente
(8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma
semana (p≤0.05)
Hexoquinase de submandibular - U/mg prot
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Hexoquinase de submandibular - U/glândula
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
123456
Sem anas
U/ gland
C
CT
D
DT
a
bbb
aaa
b
aa
bb
bb
a
c
aa
bb
63
Figura 5.9 – Média da atividade enzimática de fosfofrutoquinase-1 (PFK-1) (U/mg prot e U/glândula) de parótida dos grupos estudados controle
(C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente
(8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma
semana (p≤0.05)
Fosfofrutoquinase-1 de parótida - U/mg prot
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Fosfofrutoquinase-1 de parótida - U/glândula
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
123456
Semanas
U/gland
C
CT
D
DT
a
bbb
a
a
bb
bbb
a
a
bbb
a
bbb
bbb
a
64
Figura 5.10 – Média da atividade enzimática de fosfofrutoquinase-1 (PFK-1) (U/mg prot e U/glândula) de submandibular dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Fosfofrutoquinase-1 de submandibular - U/mg prot
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Fosfofrutoquinase-1 de submandibular - U/glândula
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
123456
Semanas
U/glândula
C
CT
D
DT
aaa
b
65
Figura 5.11 – Média da atividade enzimática de piruvato quinase (PK) (U/mg prot e U/glândula) de parótida dos grupos estudados controle (C),
controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com
tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente
(8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma
semana (p≤0.05)
Piruvato quinase de parótida - U/mg prot
0
0,5
1
1,5
2
2,5
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Piruvato quinase de parótida - U/glândula
0
0,5
1
1,5
2
123456
Semanas
U/glândula
C
CT
D
DT
a
ab
b
c
aa
ab
b
66
Figura 5.12 – Média da atividade enzimática de piruvato quinase (PK) (U/mg prot e U/glândula) de submandibular dos grupos estudados controle
(C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Piruvato quinase submandibular - U/mg prot
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Piruvato quinase submandibular - U/glândula
0
0,5
1
1,5
2
123456
Semanas
U/glândula
C
CT
D
DT
a
a
a
b
aaa
b
aaa
aaa
b
b b
aaa
a
bb
c
aa
bb
67
Figura 5.13 – Média da atividade enzimática de glicose-6-fosfato desidrogenase (U/mg prot e U/glândula) de parótida dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Glicose-6-fosfato desidrogenase parótida - U/mg prot
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
123456
Sem anas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Glicose-6-fosfato desidrogenase parótida - U/glândula
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
123456
Semanas
U/ gland
C
CT
D
DT
a
a
bb bbb
a
68
Figura 5.14 – Média da atividade enzimática de glicose-6-fosfato desidrogenase (U/mg prot e U/glândula) de submandibular dos grupos
estudados controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por
i.p. de STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio
padrão, respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes,
comparando grupos na mesma semana (p≤0.05)
Glicose-6-fosfato desidrogenase submandibular - U/mg prot
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
123456
Sem anas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Glicose-6-fosfato desidrogenase submandibular - U/glândula
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
123456
Semanas
U/ gland
C
CT
D
DT
a
b
b
c
bb
a
c
69
Figura 5.15 – Média da atividade enzimática de lactato desidrogenase (LDH) (U/mg prot e U/glândula) de parótida dos grupos estudados controle
(C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Lactato desidrogenase de parótida - U/mg prot
0
1
2
3
4
5
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Lactato desidrogenase de parótida - U/glândula
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
123456
Semanas
U/ gland
C
CT
D
DT
aa
aa
bb
bb bb
ab
a
aa
bb
70
Figura 5.16 – Média da atividade enzimática de lactato desidrogenase (LDH) (U/mg prot e U/glândula) de submandibular dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<10). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
Lactato desidrogenase de submandibular - U/mg prot
0
1
2
3
4
5
6
123456
Sem anas
U/mp prot
C
CT
D
DT
Lactato desidrogenase de submandibular - U/glândula
0
1
2
3
4
5
6
123456
Sem anas
U/ gland
C
CT
D
DT
aa
bb
bb
aa
a
bbb
71
Figura 5.17 – Média da concentração de proteína total (mg prot/ mg tecido) de glândula parótida e submandibular dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando
grupos na mesma semana (p≤0.05)
Proteína total de parótida
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
123456
Semanas
mgprot/mg tecido
C
CT
D
DT
Proteína total de submandibular
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
123456
Semanas
mg prot/mg tecido
C
CT
D
DT
a
a
a
a
b
a
a
b
b b
ab
a
a
b
a
a
b
a
ac
c
b
b
a
a
72
Figura 5.18 – Média da atividade enzimática da amilase (U/mg prot) de glândula parótida e submandibular dos grupos estudados controle (C),
controle tratados com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando
grupos na mesma semana (p≤0.05)
Atividade de amilase de parótida
0
10
20
30
40
50
60
70
80
123456
Semanas
U/mgprot
C
CT
D
DT
Atividade de amilase de submandibular
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
123456
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
bb
a
b
c
a
a
a
a
ab
b
c
aaa
b
aa
ab
b
aa
bb
aa
ab
b
b
ab
a
b
ab
a
73
Figura 5.19 – Média da atividade enzimática da peroxidase (µg/mg prot) de glândula parótida e submandibular dos grupos estudados controle
(C), controle tratados com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ
tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando
grupos na mesma semana (p≤0.05)
Atividade de peroxidase de parótida
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
123456
Semanas
microg/mg prot
C
CT
D
DT
Atividade de peroxidase de submandibular
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
123456
Semanas
microg/mg prot
C
CT
D
DT
a
ab
ab
b
b
b
a
a
a
a
bb
b
aaa
a
a
b
b
a
b
b
b
a
b
b
b
b
b
ab
b
74
Figura 5.20 – Média da concentração de ácido siálico total e livre (µnNana/mg prot) de parótida dos grupos estudados controle (C), controle
tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado com
tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão, respectivamente
(8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos na mesma
semana (p≤0.05)
Ácido siálico livre de parótida
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
1
234 5 6
Semanas
C
CT
D
DT
Ácido siálico total de parótida
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
123456
Semanas
microg/ mg prot
C
CT
D
DT
a
a
ab
b
a
a
b
b
b
bc
c
a a
a
b
b
b
bc
ac
a
a
a
b
b
b
ab
ab
ab
a
a
b
a
a
ab
ab
b
75
Figura 5.21 – Média da concentração de ácido siálico total e livre (µnNana/mg prot) de submandibular dos grupos estudados controle (C),
controle tratados com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 6 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando
grupos na mesma semana (p≤0.05)
Ácido siálico livre de submandibular
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
123456
Semanas
microg/ mg prot
C
CT
D
DT
Ácido siálico total de submandibular
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
123456
Semanas
microg/mg prot
C
CT
D
DT
a
a
a
b
bb
aa
aa
b
c
b
aaa
aa
bb
76
Proteína Total em Saliva
0
5
10
15
20
25
30
35
1234
Semanas
mg/ml
C
CT
D
DT
Figura 5.22 – Média da concentração de proteína total (mg/ml) de saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenal dos grupos estudados controle
(C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de STZ tratado
com tungstato de sódio (DT) por um período de 4 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<34). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
a
b
c
a
bb
b
c
a
a
bb
a
ab
b
b
77
Amilase salivar
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
1234
Semanas
U/mg prot
C
CT
D
DT
Figura 5.23 – Média da atividade enzimática da amilase (U/mgprot) de saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenal dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 4 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
bb
b
b
aa
a
a
aa
bb bb
aa
78
Atividade de peroxidase salivar
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1234
Semanas
u/mg prot
C
CT
D
DT
Figura 5.24 – Média da atividade enzimática da peroxidase (µg/mgprot) de saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenal dos grupos estudados
controle (C), controle tratado com tungstato de sódio (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p. de
STZ tratado com tungstato de sódio (DT) por um período de 4 semanas. Pontos e barras representam a média e desvio padrão,
respectivamente (8<n<12). As diferenças estatisticamente significantes são representadas por letras diferentes, comparando grupos
na mesma semana (p≤0.05)
a
ab
b
aaa
b
79
Figura 5.25 - Expressão qualitativa da proteína quinase C (PKC) clássica (isoformas fosforiladas) e total (isoformas desfosforiladas) da glândula
submandibular dos grupos estudados controle (C), controle tratado (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido
por i.p. de STZ tratado com tungstato de sódio (DT), tendo como padrão positivo células CHOIR. Cada banda representa um animal
diferente
PKC Clássica
PKC Total
C
CT D DT
CHOIR
C
CT D DT
CHOIR
C
C
CT
CT
D
D
DT
DT
CHOIR
CHOIR
80
Figura 5.26 - Expressão qualitativa da proteína quinase C (PKC) clássica (isoformas fosforiladas) e total (isoformas desfosforiladas) da glândula
parótida dos grupos estudados controle (C), controle tratado (CT), diabético induzido por i.p. de STZ (D) e diabético induzido por i.p.
de STZ tratado com tungstato de sódio (DT), tendo como padrão positivo células CHOIR. Cada banda representa um animal
diferente
PKC Clássica
PKC Total
CHOIR
CHOIR
CHOIR
CHOIR
C
C
C
C
CT
CT
CT
CT
D
D
D
D DT
DT
DT
DT
81
82
6 DISCUSSÃO
O diabete é uma doença crônica, cuja prevalência vem aumentando nos últimos
anos. Estudos apontam um crescimento próximo de 100% no número de indivíduos
com a doença em todo o mundo até o ano de 2030 (WILD et al., 2004). Muitos estudos
têm sido desenvolvidos com o intuito de apresentar alternativas de tratamento
profilático e terapêutico do diabete, que incluem reeducação alimentar, atividades
físicas e até mesmo um tratamento ortomolecular da doença através do equilíbrio
nutricional, metabólico e enzimático com a administração de micronutrientes como
aminoácidos, sais minerais, coenzimas, entre outros (MATSUMOTO, 1994).
Os compostos formados por tungstênio tem sido foco de investigação como uma
alternativa de tratamento do diabete por possuírem ação insulinomimética e serem
administrado por via oral. O cátion W
6+
não tem sido encontrado na forma isolada, mas
sempre ligado a uma estrutura farmaceuticamente aceitável. Esta estrutura pode ser
formada por compostos inorgânicos como peróxidos, óxidos ou hidróxidos, e por
compostos orgânicos como álcool, tiol, ácido carboxílico, entre outros. Porém, a forma
mais comum encontrada do anion tungstato é ligada a um cátion, por exemplo sódio,
potássio, magnésio e cálcio. O tungstato de sódio dihidratado (Na
2
WO
4
.2H
2
O) é um sal
branco e inodoro, com textura fina e cristalina que se dissolve facilmente em água. A
dose diária indicada de tungstato de sódio estaria entre 0.5 e 50 mg/Kg de peso
corporal (GOMIS DE BÁRBARA et al., 2003).
A ação do tungstato de sódio como hipoglicemiante tem sido comprovada em
muitos estudos, sendo administrado via oral dissolvido em água destilada numa
83
concentração de 2 mg/ml e disponibilizado aos animais com livre acesso (BARBERA;
RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et al., 1997; BARBERA et al., 2001;
FERNANDEZ-ALVAREZ et al., 2004; GIRON et al., 2003; MUNOZ et al., 2001). Esses
estudos mostraram que o tungstato de sódio estabilizou a glicemia na maioria dos
estudos realizados, a concentração da glicose sanguínea nem sempre alcançou níveis
iguais aos dos animais saudáveis. Os valores de glicemia apresentados no nosso
estudo foram determinados de amostras obtidas no momento do sacrifício do animal.
Os animais diabéticos apresentaram valores de glicemia muito elevados comparados
aos do controle e os animais diabéticos submetidos ao tratamento com tungstato de
sódio apresentaram uma redução da glicemia. Na quinta semana experimental a
glicemia do grupo diabético tratado não apresentou diferenças com o grupo controle.
Nossos resultados estão de acordo com os trabalhos presentes na literatura e
confirmaram o efeito do tungstato como redutor da glicemia na maioria dos tempos
estudados.
O diabete melito tipo 2 está freqüentemente associado a sobrepeso e obesidade,
enquanto que o tipo 1 o indivíduo pode apresentar perda de peso corporal em
decorrência do comprometimento de seu metabolismo anabólico, causado pela falta de
insulina. Nosso estudo confirmou a perda de peso no modelo experimental de diabetes
tipo 1, representado por ratas diabéticos induzidas por estreptozotocina, esse evento foi
reproduzido em todas as semanas estudadas. Embora o tungstato de sódio não tenha
exercido qualquer efeito sobre o peso corporal dos animais do grupo controle, no grupo
diabético tratado este sal potencializou a perda de peso causada pela injeção de
estreptozotocina, confirmando dados relatados na literatura (BARBERA; RODRIGUEZ-
GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et al., 1997; BARBERA et al., 2001; GIRON et al.
84
2003). A perda de peso corporal ocasionada pela administração do tungstato de sódio
pode ter sido ocasionada pela diminuição na ingestão alimentar discutida adiante, mas
também há outros fatores relevantes. O tungstato de sódio promove o aumento da
termogênese e oxidação de lipídeos em tecido adiposo de rato wistar obeso (CLARET
et al., 2005). A perda de peso corporal causada pela administração de tungstato de
sódio poderia representar um efeito colateral inconveniente ao ser indicado para
indivíduos diabéticos do tipo 1, porém seria uma boa alternativa para indivíduos
diabéticos do tipo 2 associado à obesidade. Um estudo focalizou o mecanismo
molecular pelo qual o tungstato de sódio exerceu controle de massa e melhoria da
sensibilidade à insulina em tecido adiposo branco de ratos wistar alimentados com dieta
de cafeteria. Esse estudo sugeriu que o tungstato de sódio além de atuar sobre
enzimas do metabolismo lipídico, também participa da modulação de proteínas
envolvidas na diferenciação de adipócitos, na formação de gotas de lipídeos
intracelular, bem como age sobre proteínas estruturais do citoesqueleto do tecido
adiposo (BARCELO-BATLLORI et al., 2005).
A indução do diabete pela estreptozotocina afeta o ganho de peso corporal e
potencializa a perda e esse efeito pode ser observado também em tecidos periféricos
como as glândulas salivares. Há alguns estudos na literatura que mostraram a perda
de peso absoluto da glândula parótida em diferentes períodos experimentais, por
exemplo três dias até seis meses após a indução do diabete (ANDERSON, 1983;
ANDERSON et al., 1989; ANDERSON et al., 1993; MAHAY et al., 2004). Em nosso
estudo, avaliamos o peso absoluto das glândulas salivares bem como o peso relativo,
uma relação com o peso corporal. Nossos resultados estão de acordo com os dados
apresentados na literatura, apenas em relação ao peso glandular da submandibular de
85
ratas diabéticas, que experimentou uma redução absoluta a partir da segunda semana
do estudo. A glândula parótida dos animais diabéticos apresentou uma redução do
peso apenas na quarta semana experimental, na quinta semana ocorreu uma diferença
com o grupo controle devido a um aumento do peso da glândula no grupo diabético. O
efeito do tungstato de sódio potencializou a perda de peso de glândula submandibular.
De modo geral, podemos dizer que as diferenças apresentadas no peso relativo
de glândula parótida foram ocasionadas por uma redução do peso corporal e não por
alterações de peso absoluto da glândula. A submandibular não apresentou diferenças
no peso relativo entre os grupos estudados, mostrando que essa glândula acompanha
as alterações corpóreas.
O aumento da glicemia provoca um desequilíbrio osmótico, causando um quadro
de desidratação intra e extracelular, manifestado clinicamente por poliúria, poligafagia e
polidipsia (MANFREDI et al., 2004). Enquanto polidsia é um sinal clássico causado pelo
efeito do diabete (MAGHNIE, 2003; MAGHNIE et al., 2000), há relatos que mostram
efeitos variados sobre a ingestão alimentar. Embora a polifagia tenha sido relatada
(BARBERA; RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et al., 2001; GIRON et
al., 2003), alguns autores não observaram diferenças entre animais saudáveis e
diabéticos (ANDERSON, 1983; BARBERA et al., 1997). Nossos resultados mostraram
que as ratas diabéticas apresentaram tanto polidipsia quanto polifagia. O tratamento
com tungstato de sódio exerceu efeito redutor no consumo de líquidos em todas as
semanas estudadas e de alimentos a partir da segunda semana, concordando com os
dados presentes na literatura (BARBERA; RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994;
BARBERA et al., 1997; BARBERA et al., 2001; GIRON et al., 2003). Não houve
qualquer efeito do tungstato de sódio na ingestão líquida e alimentar no grupo controle
86
tratado. Além de apresentar um efeito hipoglicemiante e controlador de peso corporal, o
tungstato de sódio também possui capacidade de modulador do apetite e da ingestão
alimentar. Essas características apontam esse composto como uma alternativa para o
tratamento de obesidade ou do diabete tipo 2 associado a sobrepeso. GOMIS DE
BÁRBARA et al. (2003) patentearam o uso de compostos de tungstato como
coadjuvante no tratamento de humanos obesos não diabéticos, como terapia anoréxica.
O armazenamento de glicogênio é uma resposta fisiológica ao aumento da
concentração de glicose sanguínea que ocorre após as refeições. A glicogênio sintase
é uma enzima chave nesse processo pois catalisa a adição de resíduos de glicose a
porção terminal não reduzida de uma cadeia de glicogênio inicial, usando como
substrato UDP-glicose (FERRER et al., 2003). Embora alguns autores não tenham
encontrado diferenças na concentração da proteína glicogênio sintase em hepatócitos
isolados de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina (LIBAL-WEKSLER et al.,
2001), nessa mesma célula de ratos diabéticos Zucker foi observada uma redução da
atividade da enzima, com conseqüente diminuição da concentração de glicogênio
(SEOANE et al., 1999). Há relatos do aumento da concentração de glicogênio em
parótida e submandibular de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina, com
aumento da atividade da glicogênio sintase e diminuição da glicogênio fosforilase
(NICOLAU et al., 2005). Em nossas condições experimentais, os animais diabéticos
também apresentaram uma tendência de acúmulo de glicogênio nas glândulas
salivares nas semanas inicias do experimento, tanto em parótida quanto em
submandibular.
O tungstato de sódio tem se mostrado como agente ativo no restabelecimento do
metabolismo de glicogênio em alguns modelos animais e em diferentes tempos de
87
administração. Em fígados de ratos diabéticos induzidos por estreptozotocina com dois
dias de idade e sacrificados após 2 semanas, os resultados obtidos mostraram
aumento do glicogênio quando comparado ao controle, contudo não foi observado
qualquer efeito do tungstato no armazenamento desse polissacarídeo e na atividade da
glicogênio sintase (BARBERA et al., 1997). O modelo diabético Zucker não apresentou
diferenças na concentração de glicogênio de fígado, comparando grupo experimental e
controle, entretanto a administração de tungstato de sódio causou um incremento de
glicogênio neste tecido (MUNOZ et al., 2001). O diabete, induzido pela injeção de
estreptozotocina em ratos adultos, causou uma redução do glicogênio hepático com
restabelecimento de seu metabolismo após 2 semanas e 8 meses de administração de
tungstato de sódio (BARBERA; RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994; BARBERA et
al., 2001). Em nossos resultados o efeito do tungstato de sódio como potente
estimulador da síntese de glicogênio foi observado apenas na glândula parótida. Não
houve qualquer efeito do tungstato de sódio na concentração de glicogênio no grupo
controle tratado.
A glicólise é a via central do catabolismo da glicose de forma quase universal,
não apenas em animais e vegetais como também na maioria dos microorganismos. A
seqüência de reações da glicólise difere de uma espécie para outra apenas na forma
em que sua velocidade é regulada e no destino metabólico do piruvato formado.
Algumas enzimas presentes na via glicolítica desempenham papel chave na sua
regulação bem como na sua velocidade catalítica, por exemplo, a hexoquinase (HK),
fosfofrutoquinase-1 (PFK-1) e piruvato quinase (PK).
Alguns estudos mostram que determinadas alterações metabólicas podem
influenciar a atividade de enzimas da via glicolítica de glândulas salivares. Por exemplo,
88
o excesso de vitamina A diminui a atividade de PFK-1 em glândula submandibular e de
PK em parótida e submandibular (SIQUARA-DA-ROCHA et al., 1978). O estado de
jejum além de causar redução glicêmica ainda diminuiu a atividade de PFK-1 e PK em
submandibular de ratos wistar em diferentes tempos de privação alimentar (LEAL;
PEDROSO; NICOLAU, 1979). A hexoquinase de parótida e submandibular também se
mostrou suscetível a alteração metabólica causada pelo diabete induzido por
estreptozotocina. Após 30 dias da indução da doença, a submandibular apresentou
uma redução de sua atividade na porção solúvel e ligada ao citoesqueleto, enquanto
que na parótida o efeito foi contrário (NOGUEIRA; SANTOS; NICOLAU, 2005). O
diabete provoca a redução na síntese e na atividade enzimática da hexoquinase em
musculatura esquelética de ratos (FRANK; FROMM, 1986). Há alguns estudos que
relacionam a deficiência do subtipo muscular de PFK-1 com resistência à insulina,
deficiência na sua secreção, bem como a instalação precoce do diabete do tipo 2 em
humanos (RISTOW et al., 1997; RISTOW et al., 1999a, 1999b).
Os relatos presentes na literatura mostram que o tungstato de sódio melhora o
fluxo glicolítico em diferentes tecidos por exemplo fígado, rins, pâncreas e hepatócitos
isolados. Ele estimula a atividade das enzimas da glicólise e aumenta a formação de
metabólitos produzidos por essa via, que possuem ação alostérica sob suas enzimas
catalíticas (BARBERA; RODRIGUEZ-GIL; GUINOVART, 1994; KIERSZTAN et al.,
2004). Além disso, seu efeito se estende para outras vias metabólicas, por exemplo
pela inibição da gliconeogênese através do controle da glicose-6-fosfatase (FOSTER et
al., 1998).
Nas condições experimentais de nosso estudo a glândula parótida de animais
diabéticos apresentou um aumento da atividade enzimática da HK (U/glândula) e da
89
PFK-1 (U/mg prot) nas semanas iniciais do tratamento, as diferenças apresentadas na
atividade da PK não foram muito significativas. Além disso, nossos resultados
mostraram que o tungstato de sódio exerceu efeito estimulante da via glicolítica de
modo significativo apenas na atividade da PFK-1 de parótida em algumas semanas
estudadas. A glândula submandibular apresentou uma estimulação da atividade da HK
(U/mg prot) nas semanas iniciais do estudo, mas apenas na terceira semana
experimental houve diferença estatisticamente significante com o grupo controle. Não
houve diferenças significantes na atividade de PFK-1 de submandibular entre os grupos
estudados no decorrer das semanas estudadas. As diferenças apresentadas na
atividade enzimática de PK de submandibular entre grupo controle e experimental
foram variáveis ao longo de 6 semanas. Essas diferenças podem ser atribuídas à
alterações no grupo controle e não necessariamente ao efeito do diabete sobre a
glândula salivar. O tungstato de sódio não exerceu efeito estimulante da via glicolítica
de submandibular, exceto na atividade da HK (U/mg prot) na primeira semana do
estudo.
Além da via glicolítica, estudamos outros parâmetros representativos de
diferentes vias metabólicas, por exemplo, a atividade da glicose-6-fosfato
desidrogenase (G6PD) e da lactato desidrogenase (LDH), indicativos de atividade da
via das pentoses e do metabolismo anaeróbico, respectivamente. A G6PD é uma
enzima que catalisa a via de transformação da glicose-6-fosfato em ribose-5-fosfato e
NADPH. A ribose-5-fosfato é utilizada como substrato para síntese de ácidos nucléicos,
enquanto que o NADPH é um potente agente redutor com papel essencial na síntese
de ácidos graxos, além disso, atua como antioxidante no controle de superóxidos. Em
condições anaeróbicas, o NADH gerado pela glicólise não pode ser reoxidado pelo O
2
e
90
sim pelo piruvato, com a formação de lactato. A redução do piruvato é catalisada pela
LDH.
Alguns estudos apontam à hiperglicemia como uma causa dos desequilíbrios
antioxidantes no organismo de ratos diabéticos (BROWNLEE, 2001; ROLO;
PALMEIRA, 2006). Há relatos que mostram nenhuma correlação entre a formação de
NADPH pela atividade da enzima G6PD e o diabete em fígado de ratos induzidos pela
injeção de estreptozotocina (ULUSU et al., 2005) e outros que apontam um aumento da
atividade da enzima em cérebro de ratos diabéticos (ULUSU et al., 2003). A LDH é uma
enzima que pode ser relacionada com dano celular, porém em animais diabéticos
submetidos a um processo de reparação tecidual foi mostrado uma redução da
atividade da LDH e um aumento da G6PD (GUPTA; RAGHUBIR, 2005). Não há relatos
do efeito do tratamento com tungstato de sódio sobre a atividade enzimática da G6PD e
da LDH em tecidos de ratos diabéticos. Nossos estudos mostraram uma estimulação da
G6PD de parótida de animais diabéticos nas semanas iniciais do tratamento (U/mg prot)
e nenhuma diferença na glândula submandibular. Na segunda semana do estudo, o
tungstato de sódio causou um aumento da atividade da enzima em parótida (U/mg prot
e U/glândula) e em submandibular (U/mg prot) de ratos diabéticos tratados. Nossos
resultados mostraram uma redução da atividade da LDH em animais diabéticos na
primeira semana do estudo em parótida e submandibular (U/mg prot e U/glândula). Não
houve diferenças significativas do tungstato de sódio sob a atividade da LDH nas
glândulas salivares de animais diabéticos tratados nas semanas estudadas.
Além do estudo do efeito do tungstato de sódio sobre a glicemia, peso corporal e
glandular, ingestão líquida e alimentar e metabolismo energético de glândulas salivares,
também avaliamos sua influência na composição orgânica de parótida, submandibular e
91
saliva total estimulada com pilocarpina e isoproterenol. Os parâmetros avaliados nos
quatro grupos estudados foram a concentração de proteína total, atividade enzimática
de amilase e peroxidase e teor de ácido siálico livre e total. De modo geral, podemos
observar que a glândula parótida foi mais susceptível ao efeito do diabete, com uma
estimulação dos parâmetros estudados nas semanas iniciais e uma tendência de
regularização no final dos experimentos. O tungstato de sódio não apresentou um efeito
marcante e característico sobre os parâmetros estudados, com exceção de um controle
da atividade da peroxidase.
Em nossas condições experimentais, as diferenças na concentração de proteína
total entre controle e diabéticos foram restritas a uma diminuição de parótida na
segunda semana, enquanto que a glândula submandibular apresentou um aumento na
quinta semana no grupo diabético. O tungstato de sódio não exerceu efeitos
significativos sobre a concentração de proteínas de glândulas salivares.
A atividade enzimática de amilase a peroxidase tem sido foco de investigação
como indicativo de função de glândula parótida e submandibular. Um estudo (Anderson,
1983) avaliou a atividade dessas enzimas em parótida de animais diabéticos induzidos
por estreptozotocina ao longo de 30 dias e o resultado foi uma redução brusca da
atividade da amilase nos primeiros dias de experimento, com uma estabilização no
período restante. A peroxidase de parótida de animais diabéticos sofreu um aumento
lento e gradual em sua atividade ao longo de todo experimento (ANDERSON, 1983).
Outro estudo mostrou uma redução da amilase de células isoladas de parótida de ratos
diabéticos após a estimulação com noradrenalina, porém não houve diferenças na
atividade basal da enzima (MAHAY et al., 2004). Embora alguns estudos observaram
uma redução da atividade da amilase, há relatos que mostraram que não há diferenças
92
na síntese da proteína, mas sim na sua atividade catalítica (ANDERSON; BEVAN,
1992).
Embora esses estudos tenham apontado uma redução da atividade da amilase
em glândulas salivares de ratos diabéticos, nossos resultados efeitos variáveis da
amilase ao longo das semanas estudadas. A glândula parótida do grupo diabético
apresentou uma estimulação da enzima na segunda semana do estudo, uma redução
na quinta, alcançando níveis próximos do controle nas semanas restantes. Não foram
observados efeitos significativos do tungstato de sódio sobre a atividade da amilase de
parótida, com exceção de uma redução na primeira e terceira semana do estudo nos
grupos controle e diabético tratado. A glândula submandibular não apresentou
diferenças entre os grupo controle e diabéticos. O efeito do tungstato de sódio nessa
glândula foi variável, com uma inibição da atividade da enzima do grupo controle e
diabético tratado na primeira semana e uma estimulação do grupo diabético tratado nas
últimas semanas estudadas. Nossos resultados apontam uma tendência de aumento da
atividade da peroxidase em parótida e submandibular no grupo diabético e o tratamento
com tungstato de sódio tende a manter a atividade dessa enzima num nível próximo do
controle, sugerindo que este sal poderia exercer efeito sob o sistema antioxidante de
glândulas salivares.
Os resultados da concentração de ácido siálico em glândulas salivares de ratos
diabéticos são contraditórios. Existem relatos que mostram aumento (NICOLAU; ROSA;
FAVA-DE-MORAES, 1969), diminuição (MICKELBOROUGH, 1967) ou nenhuma
diferença significante na concentração de ácido siálico (ZEBROWSKI; BRIMMER, 1978)
na glândula submandibular. Nossos resultados mostraram um aumento na
concentração de ácido siálico livre e total em glândula parótida de ratos diabéticos no
93
início do estudo e nenhuma diferença na glândula submandibular. Não foram
observados efeitos significativos do tungstato de sódio sobre a concentração de ácido
siálico livre e total nas glândulas estudadas.
Os resultados do nosso estudo mostraram um aumento na concentração de
proteína total em saliva estimulada por pilocarpina e isoproterenol de ratos diabéticos.
Nossos resultados estão de acordo com alguns estudos em saliva de pacientes
diabéticos tipo 1 e tipo 2 (DODDS; YEH; JOHNSON, 2000; LOPEZ et al., 2003; MATA
et al., 2004), embora há relatos que apontem nenhuma diferença significante
(MEURMAN et al., 1998). Foi observado que o tungstato promove o aumento de
proteínas em saliva de ratos controle e diabético tratados.
Embora o estado diabético tenha causado um aumento na concentração de
proteínas em saliva, essa diferença não foi observada na atividade da amilase e
peroxidase, com exceção na primeira semana do estudo da enzima antioxidante.
Alguns estudos mostram um aumento na atividade da amilase de pacientes diabéticos
do tipo 1 e tipo 2 (DODDS; DODDS, 1997; LOPEZ et al., 2003), enquanto outros
mostram nenhuma diferença significante (MEURMAN et al., 1998). Outro estudo com
hamsters diabéticos mostrou uma redução da atividade da peroxidase na saliva desses
animais comparada com o grupo controle (MURATSU; MORIOKA, 1985). Apesar de
não serem observadas diferenças na atividade da amilase e peroxidase entre animais
controle e diabéticos, o tratamento com tungstato de sódio causou uma redução
significativa na atividade das enzimas nos grupos tratados em todas as semanas
estudadas para a amilase e na segunda semana para a peroxidase. Assim, nossos
resultados mostraram que o tungstato de sódio potencializa o aumento quantitativo de
94
proteínas na saliva, porém não há aumento qualitativo, representado pela diminuição da
atividade das enzimas estudadas.
A proteína quinase C (PKC) é uma enzima presente na via de secreção de saliva
e esta envolvida com a síntese de proteínas e eletrólitos em glândulas salivares após
uma estimulação parassimpática. Um estudo em linhas de células estabelecidas de
glândula submandibular mostrou que o uso de inibidores específicos de PKC diminuiu a
síntese de amilase, sugerindo o envolvimento dessa quinase na produção da enzima
(JUNG et al., 2000). Há relatos do aumento na expressão de PKC em glândulas
salivares de camundongo diabéticos não obesos (NOD Mouse) num curto período de
tempo (TENSING et al., 2005). Em nosso estudo, sacrificamos os quatro grupos
experimentais após uma semana do início do tratamento e avaliamos por western blot a
expressão de isoformas de PKC clássica (ativa – isoformas desfosforiladas) e total
(inativa – isoformas fosforiladas) nas glândulas parótida e submandibular. Nossos
resultados confirmam os estudos presentes na literatura, pelo aumento na expressão
de isoformas clássica e total PKC em submandibular de ratos diabéticos. Os ratos
diabéticos não apenas apresentaram uma maior expressão de PKC, como também
acorreu uma diferença qualitativa no padrão de isoformas de PKC nesses animais. Não
houve diferenças significantes em parótida dos grupos estudados. Embora não tenha
sido determinada a atividade de PKC, esse aumento na expressão da enzima poderia
significar uma estimulação dessa via de síntese se proteínas. Esse poderia ser um
argumento para justificar o aumento na concentração de proteínas encontrado em
saliva de ratos diabéticos. Há relatos que mostraram que a ativação de PKC em células
acinares de glândulas salivares promoveu uma indução do processo apoptótico com
aumento da fragmentação de DNA (REYLAND et al., 2000). Assim, podemos sugerir
95
que a indução da expressão de PKC em glândulas salivares de ratos diabéticos poderia
causar uma degradação de glândulas salivares. O estudo da PKC mostra que há uma
alteração na via de sinalização parassimpática de glândula parótida, indicando uma
possível neuropatia em glândulas salivares. Além disso, foi observado que o tungstato
de sódio potencializa a indução de PKC em submandibular do grupo diabético tratado,
o que poderia contribuir para acelerar este processo degenerativo.
96
7 CONCLUSÕES
• O presente estudo confirma o potencial do tungstato como agente
hipoglicemiante, regulador da polidipsia, modulador do apetite, bem como seu
efeito sobre o controle o ganho de peso corporal. Essas características desse
composto poderia ser convenientes para o tratamento do diabete do tipo 2
associado à obesidade, porém poderia apresentar efeitos colaterais inadequados
ao tratamento do diabete do tipo 1.
• O diabete apresentou efeito distinto no peso absoluto de glândulas salivares. A
submandibular sofreu uma perda absoluta de seu peso e o tratamento com
tungstato de sódio potencializou essa perda.
• Em nossas condições experimentais, o metabolismo energético da glândula
parótida apresentou uma maior susceptibilidade ao diabete. De modo geral, os
parâmetros metabólicos que se apresentaram alterados sofreram uma
estimulação nas semanas inicias do tratamento, porém com uma normalização
nas semanas finais do estudo. Esse fato poderia sugerir que as glândulas
salivares possuem algum mecanismo de defesa compensatório contra a injeção
intraperitoneal de estreptozotocina.
97
• Os efeitos do tungstato de sódio sobre o metabolismo energético de glândulas
salivares foram pouco significativos. Esses resultados nos levam a fazer duas
inferências relacionadas com o tungstato de sódio: primeira – nossos resultados
não confirmam o potencial desse composto como restabelecedor do
metabolismo energético; segunda - o tungstato de sódio tem ação anabólica
estimulante em fígado e musculatura esquelética, porém não há alterações em
tecidos periféricos como as glândulas salivares, o que seria um bom indicativo de
baixa toxicidade desse sal.
• Não apenas os parâmetros do metabolismo energético sofreram estimulação nas
semanas iniciais com normalização nas semanas finais do experimento.
Podemos observar que a composição bioquímica das glândulas salivares
também sofre o mesmo efeito, especialmente a parótida.
• Em relação ao efeito do tratamento do tungstato sobre a composição protéica de
glândulas salivares, podemos dizer que o principal parâmetro influenciado pela
sua administração foi a atividade da peroxidase. Esse resultado sugere que
mais estudos devem ser realizados correlacionando o tungstato de sódio com o
sistema antioxidante em diferentes tecidos, especialmente glândulas salivares de
animais diabéticos.
• Os animais diabéticos induzidos por estreptozotocina apresentam um aumento
na concentração de proteína em saliva total estimulada por pilocarpina e
98
isoproterenol. Não houve diferenças significativas na atividade da amilase e
peroxidase comparando saliva de ratos controle e diabéticos nas semanas
estudadas.
• O estudo da expressão de PKC em glândulas salivares mostrou uma
estimulação dessa enzima causada pelo estado diabético em glândula
submandibular. Esse resultado mostra que em apenas uma semana após a
indução do diabete se encontram alterações em parâmetros da via de
sinalização protéica de glândulas salivares. O aumento da expressão de PKC
sugere uma possível neuropatia em submandibular de ratos diabéticos.
• A administração de tungstato de sódio potencializa a expressão de isoformas
ativas e inativas de PCK em glândula submandibular.
99
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ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
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