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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOECOLOGIA AQUÁTICA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE FLORAÇÕES NATURAIS E DE CULTURA DE
CIANOBACTÉRIAS: EFEITOS SOBRE
Ceriodaphnia silvestrii (CRUSTACEA, CLADOCERA)
JUSKA MILENA DOS SANTOS MENDONÇA
ORIENTAÇÃO: Profa. Dra. IVANEIDE ALVES SOARES DA COSTA
NATAL/RN
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOECOLOGIA AQUÁTICA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE FLORAÇÕES NATURAIS E DE CULTURA DE
CIANOBACTÉRIAS: EFEITOS SOBRE
Ceriodaphnia silvestrii (CRUSTACEA, CLADOCERA)
JUSKA MILENA DOS SANTOS MENDONÇA
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação do Departamento
de Oceanografia e Limnologia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Bioecologia Aquática.
NATAL/RN
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE OCEANOGRAFIA E LIMNOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOECOLOGIA AQUÁTICA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE FLORAÇÕES NATURAIS E DE CULTURA DE
CIANOBACTÉRIAS: EFEITOS SOBRE
Ceriodaphnia silvestrii (CRUSTACEA, CLADOCERA)
JUSKA MILENA DOS SANTOS MENDONÇA
Esta dissertação, apresenta pela aluna Juska Milena dos Santos Mendonça ao
Programa de Pós-graduação em Bioecologia Aquática do Departamento de
Oceanografia e Limnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foi
julgada adequada e aprovada pelos Membros da Banca Examinadora, na sua
redação final, para a conclusão do Curso e à obtenção do título de Mestre.
___________________________________________________
Profa. Dra. Ivaneide Alves Soares da Costa (Orientadora)
___________________________________________________
Profa. Dra. Sandra Maria Feliciano de Oliveira Azevedo (UFRJ)
___________________________________________________
Profa. Dra. Eneida Eskinazi Sant’ana (DOL/UFRN)
Natal, 30 de julho de 2006.
IV
Ao meu filho, Itzzac Guilherme, a mais
perfeita realização da minha vida.
V
AGRADECIMENTOS
Á todos aqueles que me ajudaram a crescer...
À Profa. Dra. Ivaneide Alves Soares Costa pela orientação e paciência;
Aos Professores da Banca da Qualificação, Prof. Dr. Guilherme Fulgêncio e
Profa. Dra. Renata Panosso, pelas valiosas sugestões;
Aos Professores da Banca de Defesa, Profa. Dra. Sandra Maria F. O. Azevedo e Profa. Dra.
Eneida Eskinazi Sant’anna;
À Profa. Dra. Magnólia Fernandes Florência Araújo do LETMA pelo apoio;
Ao Pessoal do Curso de Pós-Graduação em Bioecologia Aquática do Departamento de
Oceanografia e Limnologia da UFRN;
A Profa. Sandra Amaral e ao Biólogo Tacíscio Bruno Sampaio, do Biotério da Universidade
Potiguar – UNP;
A Profa. Dra. Silvia do Departamento de Genética e Biologia Celular, e ao Prof. Dr. Luiz Dias
do Departamento de Bioquímica pelo uso dos laboratórios;
Aos colegas do LETMA, Amanda, Sheila, Layse, Marquele, Cirleide, Elinez, Wanessa,
Cristina, Janderson, Gustavo, Fabrício;
Aos meus pais, Jairo e Francisca, alicerces da minha vida;
Jaisa, Tia Leila, Flavinha, Ia e a todo restante da família, muito obrigada mesmo;
E especialmente ao meu marido Jean Túlio e meu filhote Itzzac Guilherme, juntos são a
maior alegria de minha vida.
A FAPERN e CNPq pela concessão dos recursos financeiros.
OBRIGADA!!!
VI
SUMÁRIO
RESUMO ...............................................................................................................IX
ABSTRACT............................................................................................................X
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................1
1.1 Cianobactérias e Cianotoxinas....................................................................1
1.2 Impacto de florações de cianobactérias nos ecossistemas
aquáticos...........................................................................................................4
1.3 Testes ecotoxicológicos como Instrumento de Avaliação de
Cianotoxinas......................................................................................................7
2. OBJETIVOS......................................................................................................9
3. ÁREA DE ESTUDO.........................................................................................10
4. MATERIAIS E MÉTODOS .............................................................................13
4.1 Procedimento de amostragens..................................................................13
4.2 Identificação e quantificação de cianobactérias....................................... 14
4.3 Isolamento e cultivo de cianobactérias..................................................... 14
4.4 Preparação do extrato cru de cianobactérias ...........................................16
4.5 Bioensaios com camundongos..................................................................16
4.6 Organismo – teste.....................................................................................16
4.7 Cultivo dos Cladóceros............................................................................. 17
4.8 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii ..................................................18
4.9 Análise Estatística ....................................................................................20
5. RESULTADOS ...............................................................................................21
ARTIGO 1: Efeito de florações naturais hepatotóxicas e de culturas
neurotóxicas de cianobactérias sobre Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea,
Cladocera).......................................................................................................22
Resumo...........................................................................................................23
Introdução........................................................................................................24
Materiais e Métodos .......................................................................................26
Resultados.......................................................................................................30
Discussão........................................................................................................37
Conclusão........................................................................................................43
Referências......................................................................................................44
ARTIGO 2: Identificação e Toxicidade de Cepas de Cianobactérias Isoladas
de Ambientes Aquáticos do Rio Grande do Norte...........................................51
Resumo...........................................................................................................52
Introdução........................................................................................................53
Materiais e Métodos........................................................................................54
Resultados e Discussão..................................................................................56
Referências.....................................................................................................59
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................. 61
7. ANEXOS..........................................................................................................74
LISTAGEM DE FIGURAS VII
FIGURA 01 – Localização geográfica do Reservatório Armando Ribeiro
Gonçalves e Gargalheiras no Rio Grande do Norte.............................................11
FIGURA 02 – Imagem fotográfica do Reservatório Armando Ribeiro
Gonçalves/RN.......................................................................................................12
.
FIGURA 03 - Imagem fotográfica do Reservatório Gargalheiras/RN...................12
FIGURA 04 - Desenho esquemático das técnicas de isolamento de
cianobactérias. .....................................................................................................15
FIGURA 05 - Aspecto do cladócero Ceriodaphnia silvestrii ................................17
FIGURA 06 – Desenho esquemático para obtenção dos C. silvestrii
neonatos...............................................................................................................18
FIGURA 07 – Desenho experimental com C. silvestrii.........................................19
ARTIGO 1
FIGURA 1 – Controle da sensibilidade de C. silvestrii para a substância de
referência NaCl.....................................................................................................32
FIGURA 2 - Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de
cianobactérias do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves em julho de
2004..................................................................................................................... 35
FIGURA 3 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de
cianobactérias do Reservatório Gargalheiras em março de 2005....................... 35
FIGURA 4 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato cru de florações hepatotóxicas de
cianobactérias da Reservatório Gargalheiras em outubro de 2005..................... 36
FIGURA 5 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com cultura monoespecífica neurotóxica de C. raciborskii
(ITEP 018) produtora de saxitoxina..................................................................... 36
ARTIGO 2
PRANCHA 1 – Cepas de Cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN.
Anabaenopsis sp, Planktothrix agardhii, Cylindrospermopsis raciborskii
Geitlerinema unigranulatum .................................................................................64
PRANCHA 2 - Cepas de Cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Microcystis
panniformis e Chroococcus sp. ...............................................65
VIII
LISTAGEM DE TABELAS
ARTIGO 1
TABELA 1 – Parâmetros de qualidade da água monitorados durante as coletas
nos Reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras
(GARG)...................................................................................30
TABELA 2 – Densidade de cianobactérias e espécies dominantes nas amostras
dos reservatórios .........................................................................31
TABELA 3 - Estimativa da CL
50
-24h e CL
50
-48h (intervalo de confiança 95%) de
C. silvestrii expostos ao extrato cru de florações e culturas de cianobactérias
.............................................................................................34
TABELA 4 - Resultados comparativos entre bioensaios com camundongos,
quantificação MC-LR μmol/g, e as respectivas LC
50
-24h e LC
50
-48h (µg.L
-1
), para
as amostras de florações naturais e cepas cultivadas.........................41
ARTIGO 2
TABELA 1 – Caracterização das cepas de cianobactérias mantidas no Banco de
Cultura no LETMA/UFRN.............................................................59
IX
RESUMO
Incidência de florações tóxicas de cianobactérias é uma das conseqüências da
eutrofização nos ecossistemas aquáticos, sendo comum a sua ocorrência em reservatórios
e viveiros de cultivo de camarão no Estado Rio Grande do Norte. Cianobactérias podem
produzir toxinas que podem afetar organismos aquáticos e o homem através da cadeia
alimentar. Visando contribuir com o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos de
cianobactérias no RN, nos propomos avaliar a toxicidade de cianobactérias isoladas de
ambientes de águas doces e verificar o efeito de cultura e florações naturais ocorridas em
reservatórios para abastecimento humano, no crustáceo cladócero Ceriodaphnia silvestrii. O
estudo foi conduzido com amostras de florações naturais ocorridas em março e outubro de
2004 na Barragem Gargalheiras (08º L e 39º W), em julho de 2004 na Barragem Armando
Ribeiro Gonçalves (06
o
S e 37
o
W) e em fazendas comerciais de cultivo de camarão
(Litopenaeus vannamei), localizadas em ambientes de água doce do RN (6
o
58
’
S e 38
o
36
’
W). As amostras de florações foram coletadas com rede de plâncton (20µm) para
identificação, isolamento e obtenção de biomassa fitoplanctônica para liofilização e posterior
determinação da toxicidade por bioensaios. A toxicidade das amostras de culturas e
florações naturais foi investigada através de bioensaios em camundongos Swiss. A
quantificação das cianobactérias foi realizada pelo método de Ütermol, utlizando-se
amostras (300mL) fixadas com lugol. O teste de toxicidade com Ceriodaphnia silvestrii
seguiu as recomendações da ABNT (2001) e foram realizadas com amostras de florações
naturais hepatotóxicas e culturas de C. raciborskii neurotóxica e não tóxica. No teste, cinco
neonatos com idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes concentrações (0 a 800
mg.L
-1
) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48 horas. Três replicatas por
tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH, a temperatura e o oxigênio dissolvido no
início, com 24 e com 48 horas do teste. Através do método Trimmed Spearman-Karber foi
estimado a CL
50
. As florações eram mistas e compostas por Microcystis panniformis, M.
aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii,
produtoras de microcistina- LR, confirmada através de análise por HPLC. Amostras de
florações hepatotóxicas registraram potencial toxinogênico para o C. silvestrii, com valores
de CL
50
-24h de 47.48 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 38.15 mg.L
-1
para a amostra de GARG mar/05;
CL
50
-24h de 113,13 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 88,24 mg.L
-1
para ARG jul/04; CL
50
-24h de
300.39 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 149.89 mg.L
-1
para GARG 10/05. Para as amostras de cultura
valores de CL
50
-24h e CL
50
-48h para a cepa tóxica de C. raciborskii foram de 228.05 e
120.28 mg.L
-1
, respectivamente. Não houve mortalidade dos C. silvestrii nos testes com a
cepa de C. raciborskii não-tóxica. O teste de toxicidade com C. silvestrii apresentou um bom
grau de sensibilidade às cianotoxinas. A toxicidade das amostras de florações naturais
hepatotóxicas (microcistinas) e culturas neurotóxicas produtoras de saxitoxinas verificadas
neste estudo fornece forte indicativos da influência dessas toxinas sobre a estrutura da
comunidade zooplanctônica em ambientes aquáticos tropicais. Foram isoladas 11 cepas de
cianobactérias de reservatórios e viveiros do Estado, representadas por 6 espécies:
Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis
panniformis, Geitlerinema unigranulatum e Planktothrix agardhii. Nenhuma cepa apresentou
toxicidade em camundongos Swiss. As cepas foram catalogadas e depositadas no
Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos (LETMA) da UFRN e serão
utilizadas em estudos ecotoxicológicos e ecofisiológicos visando esclarecer as causas e
controle de florações de cianobactérias nos ambientes aquáticos do Estado. Os
reservatórios do Rio Grande do Norte devem merecer maior atenção perante os órgãos
responsáveis, tendo em vista os constantes florescimentos tóxicos de cianobactérias em
águas utilizadas para consumo humano.
X
ABSTRACT
The incidence of toxic cyanobacterial blooms is one of the important consequences of
eutrophication in aquatic ecosystems. It is a very common phenomenon in reservoirs and
shrimp ponds in the State of Rio Grande do Norte (RN), Brazil. Cyanobacterias produce
toxins which can affect aquatic organisms and men trough the food chain. Aiming to
contribute to the studies of cyanobacterias in RN, we propose: a) to evaluate the toxicity of
isolated cyanobacterias in important fresh-water environments; and b) to verify the effects of
both natural and cultured blooms occurred in reservoirs for human supply and in the
cladoceran Ceriodaphnia silvestrii. This study was carried out using samples of natural
blooms occurred between March and October of 2004 in Gargalheiras Dam (08º L e 39º W),
in July of 2004 in Armando Ribeiro Gonçalves Dam (06
o
S e 37
o
W) and in commercial
shrimp ponds (Litopenaeus vannamei) located in fresh-water environments. The samples
were collected with plankton net (20µm.) for identification, isolation and obtaining of
phytoplanktonic biomass for liophilization and later toxicity bioassays. The toxicity of cultured
samples and natural blooms was investigated through bioassays in Swiss mice.
Quantification of cyanobacteria in samples was conducted following the Ütermol method,
with 300mL samples fixed with lugol. The toxicity test with Ceriodaphnia silvestrii followed
ABNT, 2001 recommendations, and were accomplished with natural hepatotoxic bloom’s
samples and cultured samples of both non-toxic and neurotoxic C. raciborskii. In this test,
five newborns, aged between 6 and 24 hours, were exposed to different concentrations (0 a
800 mg.L
-1
) of crude cyanobacterial extracts during 24 and 48 hours. Three replicates were
used per treatment. The pH, temperature and dissolved oxygen – at the beginning and after
24 and 48hours from the test – were measured. We estimated the CL
50
through the Trimmed
Spearman-Karber method. The blooms were constituted by Microcystis panniformis, M.
aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii and Planktothrix agardhii,
producers of mycrocistin-LR confirmed with HPLC analysis. Samples of hepatotoxic blooms
registered toxinogenic potential for C. silvestrii, with CL
50
-24h value of 47.48 mg.L
-1
and CL
50
-
48h of 38.15 mg.L
-1
for GARG samples in march/2005; CL
50
-24h of 113,13 mg.L
-1
and CL
50
-
48h of 88,24 mg.L
-1
for ARG July/2004; CL
50
-24h of 300.39 mg.L
-1
and CL
50
-48h of 149.89
mg.L
-1
for GARG October/2005. For cultured samples, values of CL
50
-24h and CL
50
-48h for
C. raciborskii toxic strains were 228.05 and 120.28 mg.L
-1
, respectively. There was no
mortality of C. silvestrii during the tests with non-toxic C. raciborskii strain. The toxicity test
with C. silvestrii presented good sensitivity degree to cyanotoxins. The toxicity of natural
hepatotoxic blooms samples (microcystins) and cultured neurotoxic saxitoxins producer
samples analyzed in this study give us strong indications of that toxin’s influence on the
zooplanktonic community structure in tropical aquatic environments. Eleven cyanobacteria
strains were isolated, representing 6 species: Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis
raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis panniformis, Geitlerinema unigranulatum e
Planktothrix agardhii. None presented toxicity in Swiss mice. The strains were catalogued
and deposited in the Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos
(LETMA), in UFRN, and will be utilized in ecotoxicológical and ecophysiological studies,
aiming to clarify the causes and control of cyanobacterial blooms in aquatic environments in
RN. This state’s reservoirs must receive broader attention from the authorities, considering
the constant blooms occurring in waters used for human consumption.
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
1. INTRODUÇÃO
1.1 Cianobactérias e Cianotoxinas
As Cianobactérias são microrganismos procarióticos popularmente
conhecidos como algas azuis, devido a sua capacidade de produção de um
pigmento acessório, a ficocianina. Também possuem a clorofila-a, um pigmento
fotossintético existente nas algas e vegetais. Recentes estudos comparativos da
constituição genética das cianobactérias mostram significantes contribuições
para a revisão de sua taxonomia (MUR et al., 1999).
Estes microrganismos fotossintéticos são pioneiros da vida na Terra.
Fósseis do que certamente são hoje as cianobactérias foram encontrados em
rochas sedimentares da Austrália, datados de cerca de 3,5 bilhões de anos.
Foram provavelmente os primeiros seres a realizarem produção da matéria
orgânica e liberar oxigênio elementar na atmosfera primitiva (SCHOPF, 1996).
A morfologia das cianobactérias é bastante variada, podendo ser
encontrada como forma unicelular, colonial e filamentos. Suas células
apresentam-se esféricas, cúbicas, ovóides, cilíndricas, sem forma definida,
formando filamentos simples ou com ramificações e colônias com diferentes
arranjos. Podem apresentar células vegetativas diferenciadas, como os
heterócitos (com função de fixação do nitrogênio) e os acinetos (funcionam como
esporos de resistência e estoca substância de reserva).
As cianobactérias são organismos cosmopolitas amplamente adaptados
e muito tolerantes a ambientes extremos (BROCK, 1972). Muitas espécies são
capazes de sobreviver em solos ou outros habitats terrestres, interagindo nos
processos funcionais do ecossistema e no ciclo de nutrientes (WHITTON, 1992).
No entanto, as cianobactérias habitam vastamente os ecossistemas aquáticos,
principalmente os ambientes de água doce, que propiciam condições ideais para
o seu desenvolvimento como águas neutro-alcalinas (pH 6-9), temperaturas entre
15 a 30°C e altas concentrações de nutrientes, principalmente de fósforo e
nitrogênio (AZEVEDO, 1998).
Sendo componente natural do fitoplâncton, estes organismos têm
importância na produção primária e fixação de nitrogênio para todo elo da cadeia
1
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
alimentar aquática e terrestre (RAI, 1990). Algumas cianobactérias possuem
altos níveis protéicos, vitaminas e outros nutrientes ideais na formulação de
rações para animais domésticos e de engorda (BOROWITZKA & BOROWITZKA,
1988) e são também de interesse farmacêutico por suas propriedades
antibióticas, antitumorais, antivirais e antifúngicas (FALCH et al., 1995).
Todavia, algumas espécies de cianobactérias são conhecidas por
produzirem diferentes metabólitos secundários, incluindo substâncias tóxicas
conhecidas como cianotoxinas. De acordo com o mecanismo de ação quando em
contato com mamíferos, as cianotoxinas podem ser classificadas como
hepatotoxinas, neurotoxinas e dermatoxinas (CODD et al., 1999; SILVONEN &
JONES, 1999).
As principais hepatotoxinas são peptídeos cíclicos da família das
nodularinas e das microcistinas, e também alcalóides hepatotóxicos da família
das cilindrospermopsinas. A microcistina-LR é uma das variantes mais estudadas
de microcistinas. São amplamente distribuídas e produzidas por espécies de
Microcystis spp, Anabaena, Oscillatoria (Planktothrix), Nostoc, e Anabaenopsis
(DAWSON, 1998).
Uma toxina com ação e estrutura similar às microcistinas é característica
da espécie Nodularia spumigena, assim chamada de nodularina. Essas
hepatotoxinas agem desorganizando a arquitetura citoesquelética dos
hepatócitos de mamíferos, ocasionando danos no fígado e extravasamento do
sangue, levando à morte em horas ou em poucos dias (CARMICHAEL, 1994). Os
principais sintomas observados em mamíferos contaminados com esses tipos de
toxinas são contrações abdominais, hemorragia hepática, diarréia e palidez nas
extremidades corpóreas (KUIPER-GOODMAN et al., 1999). A hepatotoxina
cilindrospermopsina, produzida principalmente por Cylindrospermopsis
raciborskii, Aphanizomenon ovasliporum e Umezakia natans pode induzir danos
no fígado dos mamíferos, mas também nos rins, baço, timo e coração
(SILVONEN & JONES, 1999).
As neurotoxinas são toxinas alcalóides, pertencentes a três famílias: as
anatoxinas-a, anatoxinas-a(S) e saxitoxinas. Esses tipos de cianotoxinas são
2
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
potentes bloqueadores de transmissão neuromuscular pós-sináptico de
receptores nicotínicos e colinérgicos, ou inibidor da condução nervosa por
bloqueamento dos canais de sódio nos mamíferos (CHORUS & BARTRAN,
1999). Sua ação é mais rápida que as hepatotoxinas, podendo ocorrer morte de
poucos minutos a poucas horas, com sintomas de desequilíbrio, fasciculação
muscular, respiração ofegante, convulsões, taquicardia e intensa salivação. As
neurotoxinas são produzidas principalmente pelos gêneros de cianobactéria
Anabaena, Oscillatoria, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis (SILVONEN &
JONES, 1999). Saxitoxinas têm sido detectadas em Cylindrospermopsis
raciborskii nas águas do Brasil e suas concentrações comparáveis às
encontradas em Anabaena circinalis (LAGOS et al., 1998).
As dermatoxinas são produzidas por cianobactérias do gênero Lyngbya,
Oscillatoria e Schizothrix, capazes de causar dermatite aguda com inflamação
cutânea, bolhas, descamações e também inflamações gastrointestinais
(SILVONEN & JONES, 1999).
Ainda não há claras evidências das causas da produção dessas toxinas
pelas cianobactérias, mas é senso que tais compostos estejam relacionados com
a defesa natural contra a predação pelo zooplâncton, fato igualmente verificado
por plantas terrestres contra a predação de insetos (KIRK & GILBERT, 1992). A
produção e a regulação de cianotoxinas por espécies individuais de
cianobactérias podem ser afetadas por fatores ambientais tais como temperatura,
luminosidade, quantidade de nutrientes e pH, e, apesar de serem ainda pouco
entendidos, fatores genéticos também são atribuídos (SILVONEN & JONES,
1999).
3
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
1.2 Impactos de florações de cianobactérias nos ecossistemas aquáticos
O crescimento populacional e da produção agrícola e industrial, traz
conseqüências negativas para os corpos hídricos, que têm se tornado cada vez
mais eutrofizados devido, principalmente, aos lançamentos de esgotos
domésticos in natura, efluentes líquidos industriais ricos em nutrientes,
carreamento de fertilizantes utilizados na lavoura e dejetos oriundos da criação
de animais domésticos nas proximidades dos cursos hídricos (BELL & CODD,
1994).
Em resposta ao processo de eutrofização, a comunidade fitoplanctônica
apresenta redução na diversidade de espécies e um aumento considerável da
biomassa de espécies dominantes e, conseqüente desenvolvimento de florações
de cianobactérias. Estes organismos exercem efeitos variados sobre o
zooplâncton que podem ser de natureza inibitória ou toxicológica. Modificações
na estrutura e abundância do fitoplâncton reflete conseqüentes mudanças na
comunidade zooplanctônica (ROLLAND et al., 2005).
Está bem documentado na literatura que as novas condições
estabelecidas na água pela eutrofização, como elevadas turbidez e temperaturas
e baixa luminosidade, até mais do que pelas altas concentrações de nutrientes,
favorecem a dominância de cianobactérias em ambientes limnéticos (SCHEFFER
et al., 1997). Tais condições proporcionam vantagens competitivas para as
cianobactérias, favorecendo a dominância por espécies que formam grandes
colônias e filamentos, como é o caso de muitos reservatórios do Rio Grande do
Norte (COSTA et al., 2006a). A resposta do zooplâncton à presença de
cianobactérias varia com o tamanho do herbívoro, capacidade de ingerir
filamentos e colônias, grau de inibição alimentar (EPP, 1996, HIETALA et al,
1996). O zooplâncton tropical é formado predominantemente de espécies com
pequena escala (microcrustáceos e rotíferos), que exercem maior força de
predação sobre fitoplâncton de pequeno tamanho, favorecendo ainda mais a
dominância de cianobactérias filamentosas e coloniais. Pequenos cladóceros,
rotíferos e copépodos são menos afetados pelas cianobactérias do que
cladóceros de grande porte (SMITH & GILBERT, 1995). De fato, ESKINAZI-
4
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
SANT’ANA et al. (2005) observaram que em reservatórios eutrofizados no Rio
Grande do Norte com freqüentes florações mistas de cianobactérias compostas
por grandes colônias e filamentos, a comunidade zooplanctônica é bem
representada por cladóceros e rotíferos. Em eventos de floração, ocorre aumento
considerável na abundância de rotíferos coloniais (>90%). Agregados de colônias
e filamentos de cianobactérias são ainda impalatáveis para a maioria dos
herbívoros planctônicos (GLIWICZ, 1980), o que favorece a redução ou
eliminação de outros grupos do fitoplâncton mais vulneráveis à pressão de
herbivoria (SOMMER et al., 1986). É comum encontrar em corpos d’água
eutrofizados, principalmente próximos aos centros urbanos, dominância de
espécies de cianobactérias em florações com diferenças sazonais e espaciais de
toxicidade, provavelmente decorrentes de mudanças na proporção de cepas
tóxicas e não tóxicas na população (AZEVEDO et al., 1994).
As cianotoxinas também exercem influências negativas nos organismos
aquáticos, seja através da redução ou eliminação de espécies ou pela
bioacumulação de toxinas (ENGSTRÖM-ÖST et al., 2002; FERRÃO-FILHO et al.,
2000 e 2003). Florações de cianobactérias produtoras de toxinas têm causado
intoxicação e morte de organismos aquáticos e outros animais que utilizam a
água como fonte de alimentação. (CARMICHAEL, 1992; MAIN et al., 1977;
VASCONCELOS et al., 2001). Vários autores mostram que cianobactérias
tóxicas tem efeitos adversos nas comunidades zooplanctônica e nos demais
níveis tróficos, devido à letalidade e/ou diminuição da sua taxa de crescimento e
de reprodução. (LAMPERT, 1982; VASCONCELOS, 1991; 1993; 1999;
CHRISTOFFERSEN, 1996; TRABEAU et al., 2004). Efeitos de extratos de
cianobactérias em camundongos, embriões e ovos de peixes e anfíbios,
invertebrados, microalgas, macrófitas e plantas superiores têm também sido
investigados (FASTNER et al., 1995; OBEREMM et al., 1999; PIETSCH et al.,
2001; MARSÁLEK & BLÁHA, 2004; SAVENAS et al., 2006).
É uma preocupação marcante a possibilidade de bioacumulação e
transferências de cianotoxinas através da ingestão de animais, como peixes e
moluscos, que se alimentaram continuamente de cianobactérias acumulando as
toxinas em seus tecidos, oferecendo sérios riscos à saúde humana.
5
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
(FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994; MAGALHÃES et al., 2001). A
bioacumulação de cianotoxinas nos tecidos e órgãos de animais aquáticos,
principalmente em peixes, moluscos e zooplâncton, tem sido estudada por
Tencala et al. (1994), Amorim & Vasconcelos (1999), Magalhães et al. (2003). No
Brasil, a bioacumilação de microcistinas já foi evidenciada no zooplâncton
(FERRÃO et al., 2000) e em peixes e crustáceos (MAGALHÃES et al., 2001 e
2003).
Intoxicação de populações humanas pelo consumo de água contaminada
por cianotoxinas já foi descrita em muitos países como Austrália, China, África do
Sul e Inglaterra (FALCONER et al., 1994). O primeiro caso confirmado de mortes
humanas causadas por uma toxina produzida por cianobactérias foi em
Caruaru/Pernambuco/Brasil (JOCHIMSEN et al., 1998; CHAMICHAEL et al.,
2001; AZEVEDO et al., 2002) onde 116 (89%) de 131 pacientes que se
submeteram a um tratamento rotineiro de diálise renal, apresentaram distúrbios
visuais, náuseas, vômitos e fraqueza muscular, sintomas chamados de
“Síndrome de Caruaru”, e destes, 52 vieram à óbito por causa confirmada de
cianotoxinas existentes na água usada no tratamento. Além disso, há evidências
que populações abastecidas por reservatórios que apresentam extensas
florações podem estar expostas a baixos níveis de toxinas por longo período
(CARMICHAEL, 1994), levando a uma maior incidência de câncer hepático
nessa população (YU, 1995; FLEMING et al., 2002).
A presença de cianotoxinas em águas para consumo humano implica em
sérios riscos à saúde pública e por isso é importante o monitoramento ambiental
da densidade de cianobactérias e dos níveis de cianotoxinas nas águas. A
Portaria nº 518/2004, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2005), estabelece como
padrões para potabilidade de água, 1 µg/L para microcistinas, recomendando os
valores de 3 µg/L para saxitoxinas (STX), e 15 µg/L para cilindrospermopsina.
Diversos relatos de florações tóxicas de cianobactérias são registrados
nos diferentes continentes. No Brasil, já foram descritos eventos de florações
tóxicas de cianobactérias em corpos d’água dos Estados de São Paulo, Rio de
Janeiro, Minas Gerais, Pará, Paraná, Bahia, Pernambuco e do Distrito Federal
(AZEVEDO, 1998). No entanto, é sensato se conhecer que essa informação não
6
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
reflete a ocorrência de cepas tóxicas de cianobactérias apenas nesses Estados,
mas sim uma maior representação de estudos sobre esse tema concentrados na
região centro-sul do Brasil.
A Região Nordeste do Brasil é caracterizado por intensos períodos de
seca e, por isso, é comum a construção de barragens ou “açudes”, como são
popularmente conhecidas, para estocar a água nesses períodos, a qual é
utilizada para fins de consumo humano, irrigação, aqüicultura e pecuária.
Incidências de florações tóxicas de cianobactérias nestes ambientes têm sido
relatadas por Porfirio et al. (1999), Lazzaro et al. (2003), Bouvy et al. (2000) e
Costa et al. (2006). Em reservatórios do Rio Grande do Norte, há registros
freqüentes de florações de cianobactérias tóxicas (COSTA, 2003; COSTA et al.,
2003a, 2003b; COSTA et al., 2006), representando riscos potenciais à população
norte-riograndense.
1.3 Testes Ecotoxicológicos como Instrumento de Avaliação de
Cianotoxinas
Testes toxicológicos são considerados uma das metodologias mais
apropriadas para se estimar os efeitos tóxicos de contaminantes sobre os
organismos aquáticos. Nos estudos de avaliação, controle e monitoramento da
qualidade de ambientes aquáticos são, em geral, aplicados juntamente com
análises físico-químicas da água e levantamentos de espécie bioindicadoras da
qualidade da água.
A metodologia utilizada na ecotoxicologia avalia as concentrações de
substâncias tóxicas e o período de exposição necessário para produzir um efeito
deletério, a nível agudo ou crônico, em organismos sensíveis a esses agentes,
revelando o risco potencial resultante da descarga de efluentes domésticos e
industriais, e também o efeito de derrames acidentais de produtos tóxicos no
ambiente aquático (RAND & PETROCELLI, 1985). O uso dos testes
ecotoxicológicos para avaliar o efeito de florações tóxicas em organismos
aquáticos também vem sendo empregado nos últimos anos (SOTERO-SANTOS
et al., 2005; MONTAGNOLLI et al., 2004; PÉREZ-LINARES et al., 2002).
7
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
A estimativa dos impactos causados por agentes tóxicos sobre a
comunidade biológica exige o uso de testes seguros e sensíveis, que utilizem
espécies nativas ecologicamente importantes para as áreas impactadas. Como
existe uma variação na tolerância das espécies e na resposta mais sensível, para
poder se avaliar corretamente a toxicidade, são necessários testes que utilizem
espécies pertencentes a grupos filogeneticamente diferentes (ANDERSON et al.,
1988).
O efeito das cianotoxinas tem sido avaliado em diversos organismos-
alvos, tais como insetos, copépodos, tanaidáceos, artêmias, lagostins, peixes e
camarão (SMITH, 1996; BEST et al., 2000; METCALF et al., 2002;
MONTAGNOLLI et al., 2004; CHEN & XIE, 2005; PÉREZ-LINARES et al., 2002).
Espécies zooplanctônicas, especialmente os cladóceros também têm sido
largamente estudados para avaliar a toxicidade de cianobactérias (SOTERO-
SANTOS et al., 2005; FERRÃO-FILHO et al., 2000, FERRÃO-FILHO&
AZEVEDO, 2003; ROHRLACK, et al., 2001; NOGUEIRA et al., 2004; GUO & XIE,
2005). Impactos negativos em cladóceros podem indicar efeitos adversos em
outros elos da cadeia trófica, assim como demonstrar o poder tóxico das
florações de cianobactérias.
Espécies zooplanctônicas são consideradas de extrema importância
dentro da comunidade aquática, por representar um elo de passagem de fluxo de
matéria e energia dos produtores primários aos consumidores do topo da cadeia
alimentar (ABRANTES & GONÇALVES, 2003). Cladóceros (Crustácea) são
constituintes comuns da comunidade zooplanctônica de ambientes de água
doce, logo, é de grande interesse o estudo do comportamento dos cladóceros na
presença de cianotoxinas. Algumas espécies de cladóceras, mais
especificamente o Ceriodaphnia silvestrii, são normatizadas por entidades
ambientais brasileiras para testes ecotoxicológicos (CETESB, 1991; ABNT,
2003), por se apresentarem como organismos sensíveis a substâncias tóxicas.
8
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
2. OBJETIVOS
Visando contribuir com o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos de
cianobactérias no RN, nos propomos avaliar a toxicidade de cianobactérias isoladas
de importantes ambientes de águas doces e verificar o efeito de células em
condições de cultivo moespecífico e florações naturais ocorridas em reservatórios
para abastecimento humano, no crustáceo cladócero Ceriodaphnia silvestrii, através
dos seguintes objetivos específicos:
• Identificar e quantificar cianobactérias em florações ocorridas em
reservatórios e viveiros do Rio Grande do Norte;
• Isolar, identificar e cultivar cepas de cianobactérias;
• Testar a toxicidade de florações e das cepas isoladas, através de
bioensaios em camundongos;
• Avaliar o efeito de microcistinas de florações naturais e de saxitoxinas
produzidas por cultura de Cylindrospermopsis raciborskii (cepa ITEP 018)
sobre o microcrustáceo C. silvestrii;
• Avaliar o efeito de culturas de C. raciborskii não produtora de cianotoxinas
sobre o microcrustáceo C. silvestrii.
9
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
3. ÁREA DE ESTUDO
O estudo foi conduzido em importantes reservatórios e fazendas comerciais
de cultivo de camarão (Litopenaeus vannamei), localizados em ambientes de água
doce do Estado do Rio Grande do Norte (6
o
58
’
S e 38
o
36
’
W). Os viveiros de
camarão investigados neste estudo captam e despejam a água de cultivo em dois
rios do estado - o rio Ceára-Mirim e o rio Piranhas-Assu, os quais exercem influência
nos estuários do Potengi (Natal/RN) e Cavalos (Pendênicas/RN). Apesar de sua
grande relevância ecológica e sócio-econômica, os ecossistemas aquáticos do
Estado encontram-se ameaçados por atividades da agroindústria e pela aqüicultura,
as quais têm grande importância econômica na região.
O Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves (06
o
S e 37
o
W) e o
Reservatório Marechal Dutral (08º L e 39º W), mais conhecido como Gargalheiras,
localizam-se na bacia hidrográfica Piranhas-Assu, inserida na meso-região Centro-
oeste do Estado do Rio Grande do Norte/Brasil (figura 01). Esta bacia é localizada
no semi-árido potiguar e têm grande importância econômica para o estado do Rio
Grande do Norte. Totaliza 17.498,50 km² de superfície entre os estados do Rio
Grande do Norte e da Paraíba. No Estado do Rio Grande do Norte, a bacia do Rio
Piranhas-Assu corresponde a cerca de 30% do território estadual, abrangendo 33
municípios e uma população de aproximadamente 415.000 habitantes (SERHID/RN,
2000). A região é caracterizada por apresentar irregularidade e escassez de chuvas,
alcançando precipitações pouco superiores a 100 mm durante os meses de janeiro a
abril. Esta região também é caracterizada por elevadas taxas de evaporação e
evapotranspiração decorrentes dos elevados coeficientes térmicos locais.
10
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Lagoa Do Piató
Macau
R
i
o
P
i
r
a
n
h
a
s
-
A
s
s
u
Gargalheiras
Passagem das
Traíras
Sabugi
A
rmando Ribeiro
Gonçalves
Boqueirão de
Parelhas
Itans
Figura 01 – Localização geográfica do Reservatório Armando Ribeiro
Gonçalves e Gargalheiras no Rio Grande do Norte. Fonte: LEGEA/UFRN.
Representando o maior e mais importante reservatório do Estado, o
Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves (figura 02) possui
profundidade máxima de 40m e uma capacidade volumétrica de 2,4 x 10
9
m
3
, o que
corresponde à cerca de 50% de toda a água acumulada nas bacias do Estado.
Abastece uma população de 400 mil habitantes distribuídos em 20 municípios e
mais de 90 comunidades rurais (IDEMA, 2004). As águas deste reservatório
destinam-se ao abastecimento humano e ao sustento de importantes atividades
econômicas da região, como a irrigação de fruticulturas, pesca e aqüicultura, além
de ser uma área recreativa para a população local.
11
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
A Barragem Marechal Dutra, mais conhecida como Gargalheiras (figura 03),
possui uma capacidade volumétrica máxima de 4,0 x 10
7
m
3
(IDEMA, 2004). O
reservatório é utilizado para abastecimento público de dois importantes municípios
da região do Seridó (Currais Novos e Acari), além de ser destinado a cultura de
vazantes, irrigação, atividades pesqueiras e também área recreativa para a
população.
Figura 02 – Imagem fotográfica do Reservatório Armando Ribeiro
Gonçalves/RN.
Figura 03 – Imagem fotográfica do Reservatório Gargalheiras/RN.
12
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Embora não haja registros sobre as fontes pontuais de poluição da bacia
hidrográfica desses reservatórios, suspeita-se de diversas fontes difusas de
contaminação. São típicos os atos de lançamento ao rio Piranhas-Assu de despejos
orgânicos domésticos, industriais e esgotos em geral. A maioria das cidades que
circunvizinham a bacia do rio Piranhas-Assu, se caracteriza por possuir saneamento
básico insatisfatório, atributo comum em cidades pouco desenvolvidas, o que
contribui para a poluição ao transportarem diretamente para a água, o componente
fecal e urinário e os resíduos de detergentes sintéticos. As águas que retornam dos
sistemas de irrigação ou que escoam superficialmente dos solos agricultados da
região, são ricas em poluentes como pesticidas (principalmente o DDT), herbicidas,
fertilizantes (especialmente nitrogênio e fósforo), produtos químicos complexos e
substâncias tóxicas.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Procedimento de amostragens
Amostras de florações de cianobactérias foram coletadas com rede de
plâncton (20µm) no Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves/RN
(ARG) no mês de julho de 2004, e na Barragem de Gargalheiras (GARG), nos
meses de março e outubro de 2005. As amostras dos viveiros foram coletadas
em abril, julho e agosto de 2005. O material fitoplanctônico concentrado em rede
foi liofilizado e congelado a - 20
O
C.
Nas amostragens de florações, também foram medidos in situ a temperatura,
oxigênio dissolvido, pH e condutividade, através uma sonda multiparâmetros
HORIBA (US-22). A transparência da água foi medida através do disco de
Secchi. Análise de fósforo total foi realizada de acordo com a metodologia de
Valderrama (1995) e a clorofila-a foi extraída com etanol e determinada por
fluorimetria, de acordo com Marker (1980) e Jespersen & Christoffersen (1988).
13
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
4.2 Identificação e quantificação de cianobactérias
As espécies de cianobactérias foram identificadas utilizando o sistema de
Komárek & Anagnostidis (1998) para o gênero Chroococcales, Komárek &
Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek & Anagnostidis (1989)
para as Nostocales.
Para a quantificação, amostras (300ml) foram fixadas com lugol acético e
quantificadas pelo método de Ütermol (1958) em microscópia invertida. As
amostras eram contadas após, no mínimo 3 horas de sedimentação, para cada
centímetro de altura da câmara (MARGALEF, 1983). Os indivíduos (células,
colônias e filamentos) foram enumerados em campos aleatórios como proposto
por Uhelinger (1964), sendo o erro menor que 20%, a um coeficiente de
confiança de 95% (LUND et al., 1958). Espécies componentes de outros grupos
do fitoplâncton foram contabilizadas a fim de se estabelecer proporções de
dominância entre cianobactérias e demais populações fitoplanctônicas.
4.3 Isolamento e cultivo de cianobactérias
Para obtenção das culturas monoespecíficas de cianobactérias foi usada a
técnica de isolamento com o uso de pipetas de ponta capilar, do tipo Pasteur,
para separação de uma única célula ou colônia, observando-se através de um
microscópio óptico 400X (ROSOWSKI, 1973). Em complementação foram
também usadas as técnicas de semeadura em meio sólido e em meio líquido
(PRINGSHEIM, 1951; GUILARD, 1995).
14
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Figura 04 – Desenho esquemático das técnicas de isolamento de
cianobactérias. Amostra ambiental (A); plaqueamento em meio sólido
(B); diluição em meio líquido (C); isolamento com micropipetas de
Pateur (D).
Após identificadas, as cepas isoladas foram catalogadas pelas iniciais
maiúsculas da sigla do Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos
Aquáticos (LETMA), seguidas por um número de acordo com a ordem de
isolamento. Também foram feitas fichas individuais indicando o local de coleta,
nome do responsável pelo isolamento e as características morfológicas e
toxicológicas das cepas.
As cepas de cianobactérias isoladas foram cultivadas em meio ASM-1
(GORHAM et al., 1964), sob condições de temperatura média de 25°C,
ilumnidadas com 2 lâmpadas fluorescentes, fotoperíodo de 12h e mantidas no
Banco de Cultivo do Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos
Aquáticos (LETMA) da UFRN, para obtenção de biomassa.
As cepas tóxicas e não tóxicas de Cylindrospermopsis raciborskii utilizadas no
experimento com C. silvestrii (item 4.8) foram gentilmente cedidas pelo Prf. Dr.
Renato Molica da Universidade Federal Rural de Pernambuco, e também
cultivadas em meio ASM-1.
Todo o material utilizado foi esterilizado em autoclave para se evitar a
contaminação por bactérias e outros microrganismos. As culturas eram repicadas
a cada 20 dias aproximadamente. Todos os repiques e retiradas de amostras das
culturas eram realizados em capela de fluxo laminar estéril.
15
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
4.4 Preparação do extrato bruto de cianobactérias
O material liofilizado foi dissolvido em água destilada e agitado por 01 hora
em um agitador magnético. Em seguida, foi congelado e descongelado
repetidamente por 03 ciclos e sonicado. Finalmente, o sobrenadante foi retirado,
após centrifugação a 4.500 rpm por 20 minutos.
4.5 Bioensaios com camundongos
Foram realizados bioensaios em camundongos Swiss (machos e com peso
corpóreo variando de 15 a 20 gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1
mL do extrato bruto de cianobactérias. A inoculação do material foi feito em 3
animais. Os conseqüentes sintomas e o tempo de morte foram anotados e o
peso do fígado de cada animal foi verificado logo após a morte (FALCONER
1993). A classificação da toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).
4.6 Organismo – teste
Para o teste de toxicidade utilizamos o microcrustáceo zooplanctônico
tropical, Ceriodaphinia silvestrii, Daday, 1902 pertencente à família Daphniidae
(figura 05). Esta espécie mede de 0.8mm a 0.9mm de comprimento. As principais
características que definem essa espécie são carapaça arredondada, cabeça
anteriormente arredondada, olhos grandes preenchendo quase toda parte
anterior da cabeça, antênula muito curta e inchada medianamente (EL MOOR-
LOUREIRO, 1997). Habitam águas limnéticas e os fortes movimentos produzidos
pelas antenas, causam movimentos de saltos, que constituem o principal meio de
locomoção. Grande parte da população desses cladóceros é constituída apenas
por fêmeas partenogênica, porém, modificações ambientais desfavoráveis
induzem a produção de alguns ovos partenogênicos que originam machos e
fêmeas sexuais. Alimentam-se por filtração do fitoplâncton, bactérias e detritos
orgânicos, podendo ser esta, uma importante via de entrada de toxinas no
organismo.
16
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
A escolha dessa espécie como organismo-teste para o presente trabalho, foi
devido ao fácil cultivo em laboratório, possuir curto ciclo de vida com rápida
reprodução e ser normatizado pela Associação de Normas Técnicas Brasileiras,
ABNT. Além disso, o gênero Ceriodaphnia está representado nas águas do Rio
Grande do Norte, relacionando-se com as cianobactérias encontradas nos
reservatórios em estudo (ESKINAZI-SANT’ANA, 2005).
Figura 05 - Aspecto do cladócero Ceriodaphnia silvestrii (Fonte:
SANTOS, 2004).
4.7 Cultivo dos Cladóceros
Uma cultura da espécie tropical Ceriodaphnia silvestrii foi gentilmente cedida
pela Profa. Dra. Odete Rocha da Universidade Federal de São Carlos/SP e
mantida no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos
(LETMA) da UFRN. A espécie foi cultivada em Beckers de vidro sob condições
de temperatura média de 25ºC, fotoperíodo de 12h, com água filtrada em filtro de
0,45µm e autoclavada à 1atm por 20 min, oriunda de uma lagoa natural que
estava apresentando na ocasião das coletas, grau de dureza média de 24 mg.L
-1
CaCO
3
(CAERN, 2006). Para cada lote de água usado no cultivo, foi feito teste
de viabilidade colocando-se 10 organismos neonatos na nova água, observando-
17
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
se a sua sobrevivência. A água do cultivo foi renovada uma vez por semana,
sendo os organismos transferidos com pipeta de Pasteur de ponta arredondada.
Os cladóceros foram alimentados diariamente com suspensão da alga
Selenastrum capricornatum, as quais foram cultivadas em meio ASM-1.
4.8 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii
Para avaliar a sensibilidade do lote dos organismos usados para o teste
definitivo, foram feitos séries de 15 testes com a substância tóxica de referência
Cloreto de Sódio (NaCl) nas concentrações 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 e 2.2 g.mL
-1
. Os
procedimentos são idênticos aos descritos no experimento definitivo. Os lotes
dos organismos-testes só foram validados quando os resultados das CE
50
-24h
dos testes de referência permaneceram numa faixa ideal de sensibilidade (0,70 e
1,09 g.mL
-1
).
Os testes foram realizados com neonatos de C. silvestrii com idade de no
mínimo 6h e no máximo 24h, conforme Norma da ABNT (2003).
Um dia antes do início de cada teste, um lote de fêmeas ovígeras de C.
silvestrii, era separado das culturas utilizando-se pipeta com bordas
arredondadas, colocadas em um recipiente de vidro limpo com água de cultivo e
alimentados com Selenastrum capricornatum. Após 18h, os neonatos eram
separados das fêmeas e aguardava-se mais 6h para serem usados nos testes,
garantindo com esse procedimento o uso de filhotes com idade de no mínimo 6h
e no máximo 24h (figura 06).
Figura 06 – Desenho esquemático para obtenção dos C. silvestrii neonatos
18
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Os testes foram realizados em tubos de ensaios de 10mL (figura 07),
utilizando tréplicas por tratamento. Os organismos não eram alimentados nem foi
fornecido suplemento alimentar durante os experimentos. As concentrações do
extrato de cianobactérias utilizadas nos testes foram definidas através de testes
preliminares. Para as amostras dos reservatórios Barragem Engenheiro Armando
Ribeiro Gonçalves de julho de 2004 e Barragem de Gargalheiras de outubro de
2005, e para as culturas de C. raciborskii tóxica (ITEP 018) e não tóxica, os
testes definitivos foram realizados em concentrações de 0 (Grupo-Controle), 25
(A), 50 (B), 100 (C), 200 (D), 300 (E), 400 (F), 600 (G) e 800 (H) mg.L
-1
. Apenas
para a amostra de Gargalheiras de março de 2005, foi necessário diminuir as
concentrações do extrato bruto utilizado nos testes preliminares, devido a sua
alta toxicidade. Sendo assim, para os testes definitivos, as concentrações
estabelecidas foram 0 (Grupo-Controle), 8 (A), 16,5 (B), 25 (C), 33,5 (D), 41,5 (E)
e 50 (F) mg.L
-1
. Após 24 e 48h, foi contada a taxa de sobrevivência para cada
tréplica. Aqueles organismos que não eram capazes de realizar nenhum
movimento natatório dentro de um intervalo de 15 segundos, após agitação
suave do tubo, eram considerados imóveis.
No grupo controle o pH, temperatura e o oxigênio dissolvido foram medidos
no início, com 24h e com 48h de experimento e o desvio padrão foi calculado.
Nos grupos testes (A a H), as medidas foram tomadas no início, com 24h para as
concentrações com 100% de mortalidade, e com 48h de experimento para todos
os grupos.
Figura 07 – Desenho experimental com C. silvestrii
19
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
4.9 Análise Estatística
Os dados dos testes de toxicidade com C. silvestrii foram analisados para se
estimar a concentração letal que causa letalidade (imobilidade) a 50% dos
organismos (CL
50
) em 24h e 48h e seu intervalo de confiança, através do método
estatístico Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON et al, 1977). Os testes foram
considerados válidos quando a mortalidade dos organismos no controle não
excedeu 10%.
20
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
5. RESULTADOS
Artigo 1 - EFEITO DE FLORAÇÕES NATURAIS HEPATOTÓXICAS E DE
CEPAS NEUROTÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii SOBRE
Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea, Cladocera) – Página 22.
Artigo 2 - IDENTIFICAÇÃO E TOXICIDADE DE CEPAS DE
CIANOBACTÉRIAS ISOLADAS DE AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO
GRANDE DO NORTE – Página 49.
21
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
EFEITO DE FLORAÇÕES NATURAIS HEPATOTÓXICAS E
DE CEPAS NEUROTÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii SOBRE
Ceriodaphnia silvestrii (Crustacea, Cladocera)
Juska Milena dos Santos Mendonça¹, Ivaneide Alves Soares da Costa², Amanda
Palhares dos Santos², Layse Aranha Marinho², Marquele Cardoso Martins².
(ARTIGO A SER SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO)
______________________________
¹Departamento de Oceanografia e Limnologia, Centro de Biociências, Universidade
Federal dos Rio Grande do Norte. Via Costeira, s/n – Mãe Luíza, CEP – Natal/RN.
²Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências,
Universidade Federal dos Rio Grande do Norte. BR -Lagoa Nova, CEP – Natal/RN.
22
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
RESUMO
Incidências de florações tóxicas de cianobactérias vêm sendo observadas em
reservatórios de água para abastecimento humano no Estado do Rio Grande do
Norte, Brasil. Amostras de florações naturais hepatotóxicas ocorridas em março e
outubro de 2004 na Barragem Gargalheiras (08º L e 39º W), e em julho de 2004 na
Barragem Armando Ribeiro Gonçalves (06
o
S e 37
o
W), juntamente com amostras de
cepas de Cylindrospermopsis raciborski neurotóxica produtora de saxitoxinas e não
tóxica foram testadas em Ceriodaphnia silvestrii, de acordo com norma da ABNT
(2001). Cinco neonatos com idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes
concentrações (0-800 mg.L
-1
) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48
horas. Três replicatas por tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH,
temperatura e oxigênio dissolvido no início, com 24 e 48 horas do teste. Através do
método Trimmed Spearman-Karber foi estimado a CL
50
. As florações eram mistas e
compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis,
Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii, registrando potencial
toxigênico para o C. silvestrii, com valores de CL
50
-24h de 47.48 mg.L
-1
e CL
50
-48h
de 38.15 mg.L
-1
para a amostra de GARG mar/05; CL
50
-24h de 113,13 mg.L
-1
e
CL
50
-48h de 88,24 mg.L
-1
para ARG jul/04; CL
50
-24h de 300.39 mg.L
-1
e CL
50
-48h
de 149.89 mg.L
-1
para GARG 10/05. Valores de CL
50
-24h e CL
50
-48h para a cepa
tóxica de C. raciborskii foram de 228.05 e 120.28 mg.L
-1
, respectivamente. A
toxicidade das amostras também foi confirmada por análise de HPLC. Não houve
letalidade dos C. silvestrii nos testes com a cepa de C. raciborskii não-tóxica. Ficou
demonstrado que a espécie C. silvestrii apresenta alto grau de sensibilidade às
cianotoxinas.
23
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
1. INTRODUÇÃO
Florações de cianobactérias freqüentemente observadas em ambientes
estuarinos e lacrustes têm sido registradas em várias partes do mundo (SCOTT,
1991; VASCONCELOS, 1994; VASCONCELOS, 1999; FLEMING et al., 2002). As
causas das florações de cianobactérias são motivos de estudos, onde muitos
casos relatados denunciam a adição de nutrientes pelas atividades humanas,
tornando as águas propícias a tais florações (CARMICHAEL, 2001).
No Brasil, tem sido comum a ocorrência de florações de cianobactérias em
reservatórios próximos aos centros urbanos, devido ao rápido processo de
urbanização e ao crescimento da agroindústria (AZEVEDO et al., 1994; AZEVEDO,
1998), onde os gêneros mais comuns de cianobactérias encontrados em águas
doce eutrofizadas são Microcystis, Anabaena, Anabaenopsis, e
Cylindrospermopsis (DOMINGOS et al., 1999; SANT’ANNA et al., 2004).
A Região Nordeste do Brasil é caracterizada por intensos períodos de
seca e por isso é comum a construção de barragens para estocar a água, a qual é
utilizada para fins de consumo humano, irrigação, aqüicultura e pecuária.
Incidências de florações tóxicas de cianobactérias são comuns nestes ambientes e
também têm sido freqüentemente relatadas (BOUVY et al., 2004; COSTA et al.,
2006; PORFIRIO et al., 1999; LAZZARO et al., 2003).
No Rio Grande do Norte, florações de cianobactérias tóxicas já foram
observadas em importantes reservatórios como as Barragens Engenheiro
Armando Ribeiro Gonçalves, Gargalheiras, Passagem das Traíras, Itãns, Poço
Branco e Trairí (COSTA, 1999; COSTA et al., 2003; COSTA et al., 2006;
MORALES, 2003).
Florações de cianobactérias produtoras de cianotoxinas, em particular,
hepatoxinas e neurotoxinas, têm causado intoxicação e morte de organismos
aquáticos e outros animais que utilizam a água como fonte de alimentação
(VASCONCELOS et al., 2001; CARMICHAEL, 1992). O tipo mais frequente de
intoxicação é ocasionado por hepatotoxinas, principalmente microcistina, que é
amplamente distribuída e produzida principalmente pela Microcystis aeruginosa, e
também por outras espécies de Microcystis e outros gêneros como Anabaena,
24
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Oscillatoria e Nostoc (DAWSON, 1998). Outro tipo de cianotoxina freqüentemente
produzida em florações é a saxitoxina neurotóxica, que dentre as várias espécies
produtoras, tem sido detectada em Cylindrospermopsis raciborskii em ambientes
aquáticos brasileiros (LAGOS et al., 1998; MOLICA et al., 2002).
Vários autores mostram que cianobactérias tóxicas têm efeitos adversos
nas comunidades zooplanctônica, acarretando a morte e/ou diminuição da taxa de
crescimento e de reprodução (VASCONCELOS, 1991; VASCONCELOS, 1999;
PORTER e McDOUGH, 1998; CHRISTOFFERSEN, 1996), e nos demais elos da
cadeia trófica, devido à possibilidade de bioacumulação e transferências das
cianotoxinas através da cadeia alimentar, podendo chegar ao homem, oferecendo
sérios riscos à saúde da população (FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994).
Os efeitos tóxicos de florações de cianobactérias sobre organismos
aquáticos têm sido estudados por vários autores em diversas partes do mundo
(FALCONER, 2001; HAWKINS et al., 1997; VASCONCELOS, 1999). Muitos
organismos têm sido usados como organismos-testes para avaliar o efeito das
cianotoxinas, tais como insetos, camarões, copépodos, tanaidáceos, artêmias,
lagostins, peixes e outros (DeMOTT et al., 1991; MONTAGNOLLI et al., 2004;
METCALF et al., 2002; PÉREZ-LINARES et al., 2002; BEST et al., 2000; CHEN &
XIE, 2005).
Testes de ecotoxicidade podem ser eficientes instrumentos de avaliação
da qualidade de água e/ou sedimento. Algumas espécies de Cladocera
(Crustacea) são normatizadas por instituições oficiais (CETESB, 1991; ABNT,
2003) para testes ecotoxicológicos. Ceriodaphinia silvestrii, Daday, 1902
(Cladocera, Crustacea), é um microcrustáceo zooplanctônico tropical, com
ocorrência nas águas de lagos e de reservatórios brasileiros (FONSECA, 1998). O
gênero Ceriodaphnia é de ocorrência comum nos reservatórios do Rio Grande do
Norte (ESKINAZI-SANT’ANNA et al., 2005). Impactos nesses cladóceros podem
indicar efeitos adversos em todos os outros elos da cadeia trófica.
Em vista da importância de conhecer os impactos que as cianotoxinas
causam nos organismos aquáticos, o presente trabalho tem como propósito avaliar
a sensibilidade de Ceriodaphnia silvestrii a florações hepatotóxicas de
25
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
cianobactérias, ocorridas em reservatórios de água do Estado do Rio Grande do
Norte e de cepas neurotóxicas e não tóxicas de Cilyndrospermopsis raciborskii.
2.0 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Área de estudo e procedimentos amostrais
As coletas foram realizadas em dois importantes reservatórios utilizados para
abastecimento público, nos quais desenvolvem freqüentes florações tóxicas de
cinobactérias, situados no estado do Rio Grande do Norte, região tropical semi-
árida do Brasil. São os reservatórios denominados Barragem Engenheiro
Armando Ribeiro Gonçalves (06
o
S e 37
o
W) com capacidade total de
armazenamento de 2.400.000.000 m
3
de água, e o Barragem Marechal Dutra
(08º L e 39º W), também chamado Gargalheiras, com capacidade para
armazenar 40.000.000 m
3
de água.
Amostras de florações de cianobactérias foram coletadas com rede de
plâncton (20μm) em julho de 2004 e em março e outubro de 2005. O material
fitoplanctônico concentrado foi liofilizado e congelado a -20
O
C.
Também foram medidos parâmetros de qualidade da água “in situ” tais como
temperatura, oxigênio dissolvido, pH e condutividade utilizando-se uma sonda
multiparâmetros HORIBA (U-22). A transparência da água foi medida através do
disco de Secchi. Análise de fósforo total foi realizada de acordo com a
metodologia de Valderrama (1995) e a clorofila-a foi extraída com etanol e
determinada por fluorimetria, de acordo com Marker (1980) e Jespersen &
Christoffersen (1998).
26
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
2.2 Identificação e quantificação de cianobactérias
As espécies de cianobactérias foram identificadas utilizando o sistema de
Komárek & Anagnostidis (1998) para o gênero Chroococcales, Komárek &
Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek & Anagnostidis (1989)
para as Nostocales. Para a quantificação, amostras (300ml) foram fixadas com
lugol acético e quantificadas pelo método de Ütermol (1958) em microscópia
invertida.
2.3 Cultivo de cepas isoladas
Uma cultura monoespecífica de Cylindrospermopsis raciborskii neurotóxica
produtora de saxitoxina (ITEP 018) e outra não tóxica, foram gentilmente cedidas
pelo Prf. Dr. Renato Molica da Universidade Federal Rural de Pernambuco. As
culturas foram cultivadas em meio ASM-1 (GORHAM et al., 1964) e mantidas sob
condições de temperatura média de 25°C, iluminadas com 2 lâmpadas
fluorescentes, fotoperíodo de 12h, no Banco de Cultivo do Laboratório de
Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA) da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
2.4 Preparação do extrato bruto de cianobactérias
A biomassa fitoplanctônica foi liofilizada, dissolvida em água destilada e
agitada por 01 hora em um agitador magnético. Em seguida, foi congelada e
descongelada repetidamente por 03 ciclos e sonicada. Finalmente, o
sobrenadante foi retirado, após centrifugação a 4.500 rpm por 20 minutos.
2.5 Bioensaios com camundongos
Foram realizados bioensaios em camundongos Swiss (machos e com peso
corpóreo variando de 15 a 20 gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1
mL do extrato bruto de cianobactérias. A inoculação do material foi feito em 3
27
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
animais. Os conseqüentes sintomas e o tempo de morte foram anotados e o
peso do fígado de cada animal foi verificado logo após a morte (FALCONER
1993). A classificação da toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).
2.6 Cultivo dos Cladóceros
Uma cultura da espécie tropical Ceriodaphnia silvestrii foi gentilmente cedida
pela Profa. Dra. Odete Rocha da Universidade Federal de São Carlos/SP e
mantida no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos
(LETMA) da UFRN. As espécies foram cultivadas em Beckers de vidro sob
condições de temperatura média de 25ºC, fotoperíodo de 12h com água filtrada
em filtro de fibra de vidro de 0,45µm e autoclavada à 1atm por 20min, oriunda de
uma lagoa natural que estava apresentando na ocasião dos testes, grau de
dureza média de 24 mg/L CaCO
3
(CAERN, 2006). Para cada lote de água usado
no cultivo, teste de viabilidade foi feito, colocando-se 10 organismos neonatos na
nova água, observando-se a sua sobrevivência. A água do cultivo foi renovada
uma vez por semana, sendo os organismos transferidos com pipeta de Pasteur
de ponta arredondada. Os cladóceros foram alimentados diariamente com
suspensão da alga Selenastrum capricornatum, que foram cultivadas em meio
ASM-1.
2.7 Experimento com Ceriodaphnia silvestrii
Os testes foram realizados com neonatos de C. silvestrii com idade de no
mínimo 6h e no máximo 24h, conforme Norma da ABNT (2003). Tréplicas de
tubos de ensaios de 10 mL contendo 5 neonatos cada, foram utilizados por
tratamento. Os organismos foram expostos sem alimentos ou suplemento
alimentar.
Para avaliar a sensibilidade do lote dos organismos usados para o teste
definitivo, foram feitos séries de 15 testes com a substância tóxica de referência
Cloreto de Sódio (NaCl) nas concentrações 0.6, 1.0, 1.3, 1.6 e 2.2 g.mL
-1
. Os
28
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
lotes dos organismos-testes só foram validados quando os testes de referência
permaneceram na faixa ideal de sensibilidade.
As concentrações do extrato bruto de cianobactérias utilizadas nos testes
foram definidas previamente através de testes preliminares. Para as amostras do
ambiente Barragem Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves de julho de 2004 e
Barragem de Gargalheiras de outubro de 2005, e para as culturas neurotóxica
(ITEP 018) e não tóxica de Cylindrospermopsis raciborskii, os testes foram
realizados em concentrações de 0 (Grupo-Controle), 25 (A), 50 (B), 100 (C), 200
(D), 300 (E), 400 (F), 600 (G) e 800 (H) mg.L
-1
. Para a amostra de Gargalheiras
de março de 2005, as concentrações estabelecidas foram 0 (Grupo-Controle), 8
(A), 16,5 (B), 25 (C), 33,5 (D), 41,5 (E) e 50 (F) mg.L
-1
.
Após 24 e 48h, foi contada a taxa de imobilidade para cada tréplica. Aqueles
organismos que não eram capazes de realizar nenhum movimento natatório
dentro de um intervalo de 15 segundos após agitação suave do tubo, eram
considerados imóveis.
No grupo controle, o pH, temperatura e o oxigênio dissolvido foram medidos
no início, com 24h e com 48h de experimento e o desvio padrão foi calculado.
Nos grupos testes (A a H), as medidas foram tomadas no início e no final do
experimento.
2.8 Análise Estatística
Os dados foram analisados para se estimar a concentração letal que causa
letalidade a 50% dos organismos (CL
50
) em 24h e 48h e seu intervalo de
confiança, através do método estatístico Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON
et al., 1977). Os testes foram considerados válidos quando a imobilidade dos
organismos no controle não excedeu 10%.
29
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
3. RESULTADOS
3.1 Qualidade da água dos Reservatórios
Os reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras (GARG)
apresentaram alto grau de eutrofização de acordo com as concentrações de
clorofila-a (38,2 a 321,0 μ.L
-1
), fósforo total (69,9 a 133,0 μ.L
-1
) e da transparência
da água (0,45 a 0,50 m), conforme tabela 01.
Tabela 1 – Parâmetros de qualidade da água monitorados durante as coletas
nos reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) e Gargalheiras (GARG).
Local Data
Clorofila-a
(μ.L
-1
)
Fósforo
Total
(μ.L
-1
)
Secchi
(m)
pH
Condutividade
elétrica
(μS.cm
-1
)
OD
(mg.L
-1
)
Temperatura
(°C)
ARG jul/04 321,0 133,0 0,50 9,4 277,0 14,0 32,0
GARG mar/05 44,7 69,9 0,47 8,8 819,6 7,3 29,8
GARG out/05 38,2 103,9 0,45 8,4 897,2 8,4 27,0
(OD= oxigênio dissolvido)
3.2 Identificação e quantificação das cianobactérias
As florações de cianobactérias eram mistas e compostas pelas espécies
Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis
raciborskii e Planktothrix agardhii em elevadas densidades, variando de 10
6
a 10
9
cel.mL
-1
(Tabela 2). As cianobactérias representaram mais de 90% da
comunidade fitoplanctônica.
30
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Tabela 2 – Densidade de cianobactérias e espécies dominantes nas amostras
dos reservatórios.
Local Data Cianobactérias
(Cel. mL
-1
)
Espécies dominantes
ARG jul/04 10
9
1
a
- Microcystis panniformis
2ª- Microcystis aeruginosa
3ª- Anabaena circinalis
GARG mar/05
10
7
1ª- Cylindrospermopsis raciborskii
2ª- Microcystis panniformis
3ª- Microcystis aeruginosa
4ª- Planktothrix agardhii
GARG out/05
10
6
1ª- Cylindrospermopsins raciborskii
2ª- Microcystis aeruginosa
3ª- Microcystis panniformis
4ª- Planktothrix agardhii
(ARG= Reservatório Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves, GARG= Reservatório Gargalheiras)
3.3 Bioensaios com camundongos em amostras de florações
Os camundongos testados nos bioensaios com as amostras dos
reservatórios ARG jul/04 2004 e GARG de mar/05, apresentaram sintomas
típicos de hepatotoxicidade, como contração abdominal frotes dificultando a
locomoção e palidez nas extremidades (orelhas, patas, olhos e fucinho). O peso
do fígado dos camundongos após os bioensaios variou entre 7 à 10% do peso
corpóreo. A dose letal testada no bioensaio para a floração da Armando Ribeiro
Gonçalves de julho de 2004 foi de 1000 mg.kg
-1
de peso corpóreo com morte em
1 hora e de 600 mg.kg
-1
de peso corpóreo com morte em 3 horas. Na amostra
de floração de Gargalheiras de março de 2005 foi de 1000 mg.kg
-1
de peso
corpóreo com morte em 2 horas. Na floração de Gargalheiras de outubro de
2005, não houve morte dos camundongos quando injetado uma dose de 1111
mg.kg
-1
de peso corpóreo, embora os animais tenham apresentado leves sinais
de hepatotoxicidade na primeira hora do teste, recuperando-se em seguida.
31
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
3.4 – Teste de Referência
Os resultados dos testes de referências oscilaram dentro de um faixa de
CL
50
-24h entre 1,09 e 0,70 g.L
-1
com média de 0,93 g.L
-1
a um intervalo de
confiança de 95% (Figura 1).
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Série dos Testes de Referência
CL
50
-24h (g.L
-1
)
Figura 1 – Controle da sensibilidade de C. silvestrii para a substância de
referência NaCl.
3.5 Toxicidade aguda do extrato bruto de florações mistas hepatotóxicas
e de cepas neurotóxicas e não tóxicas de Cylindrospermopsis
raciborskii sobre Ceriodaphnia silvestrii
Tanto as amostras de florações naturais, quanto a cultura neurotóxica
monoespecífica de Cylindrospermopsis raciborskii produtora de saxitoxinas (ITEP
018) apresentaram toxicidade para indivíduos de C. silvestrii. A cepa não tóxica
de C. raciborskii não apresentou nenhuma letalidade nas diferentes
concentrações testadas, tanto com 24h, quanto para 48h. Os valores da CL
50
-
48h para todas as amostras que se apresentaram tóxicas para os cladóceros
foram maiores do que as CL
50
-24h. A amostra de Gargalheiras (GARG) de março
de 2005 foi sete vezes mais tóxica do que a amostra de outubro de 2005 e três
32
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
vezes mais para a amostra de Armando Ribeiro Gonçalves (ARG) de julho de
2004. Os valores de CL
50
-24h e CL
50
-48h e seus respectivos intervalos de
confiança de cada teste são mostrados na tabela 3.
A taxa média de mortalidade (%) da C. silvestrii aumentou gradativamente
com as variações crescentes das concentrações do extrato bruto de florações
naturais e de culturas cianobactérias após a exposição de 24 e 48 horas. Os
valores de mortalidade para os grupos controles nos experimentos foram abaixo
de 10%, validando todos os testes, conforme norma da ABNT.
A concentração letal para 50% dos cladóceros da amostra de floração
natural ARG de jul/04 foi 113,13 mg.L
-1
para 24 horas e de 88,24 mg.L
-1
para 48
horas. Com 24 e 48 horas, nenhuma mortalidade foi visualizada até a
concentração 50 mg.L
-1
e a mortalidade de 100% dos organismos ocorreu a partir
de 300 mg.L
-1
(figura 2).
Já para a amostra de floração natural ocorrida em Gargalheiras mar/05 a
CL
50
-24h foi 47,48 mg.L
-1
e CL
50
-48h 38,15 mg.L
-1
, significativamente menor do
que as outras amostras analisadas. A mortalidade dos organismos ocorreu a
partir de concentrações acima de 33,5 mg.L
-1
e 100% de mortalidade foi
observada com 48 horas na concentração de 50 mg.L
-1
. Nesta concentração foi
observada 70% de mortalidade dos organismos com 24 horas (figura 3).
Na outra amostra de floração natural ocorrida em Gargalheiras out/05 a
CL
50
-24h foi 300,39 mg.L
-1
e para CL
50
-48h foi 149,89 mg.L
-1
. A concentração
letal para 100% dos organismos foi de 800 mg.L
-1
(Figura 4).
No teste de toxicidade com amostras de culturas neurotóxicas produtoras
de saxitoxina (Cylindrospermopsis raciborskii - ITEP 018) a taxa (%) de
mortalidade do C. silvestrii também aumentou gradativamente com as variações
crescentes das concentrações do extrato após a exposição de 24 e 48 horas,
exceto para a concentração de 300 mg.L
-1
. A CL
50
24 e 48h foi 228,05 mg.L
-1
e
120,28 mg.L
-1
respectivamente, sendo 600 mg.L
-1
a concentração letal para
100% dos cladóceros. (figura 5). O teste realizado com a cultura não tóxica de
Cylindrospermopsis raciborskii não apresentou nenhuma sensibilidade nem
mortalidade quando submetidas às mesmas concentrações do extrato bruto da
cultura tóxica. Diferentemente dos testes com amostra ambientais, os testes com
33
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
cepas tóxicas e não tóxicas de C. raciborskii não apresentaram diminuição de
oxigênio dissolvido com aumento das concentrações, permanecendo bastante
satisfatório até o final do experimento (60% a 90% de saturação).
Os parâmetros ambientais da água de cultivo apresentaram valores
compatíveis para a sobrevivência dos organismos. A água de diluição utilizada
nos testes apresentou grau de dureza média de 24 mg/L CaCO
3
. Durante os
experimentos, os grupos controles apresentaram pH médio de 7,4 (± 0,5). O pH
foi mais baixo (5,7- 6,5) nas últimas concentrações do teste realizado com a
amostra de GARG 03/05. No entanto, esses mesmos valores de pH foram
evidenciados nos testes feitos com a amostra não tóxica de C.raciborskii
(ITEP18), no qual não apresentou mortalidade dos organismos mesmo nesta
faixa de pH, mostrando que tais valores não interferiram na sobrevivência dos
organismos. A temperatura média foi de 23°C (± 0,4) durante os experimentos.
O oxigênio dissolvido medido no início do experimento, apresentou variação de
65 a 96% de saturação, mantendo estas condições nas concentrações mais
baixas do extrato até o final do experimento (48 horas). Porém, observou-se
diminuição na concentração de oxigênio com o aumento das concentrações do
extrato tóxico das amostras de florações, apresentando de 29 a 35% de
saturação nas duas mais altas concentrações ao final do teste. Na amostra
Gargalheiras de out/2005, os tratamentos com maiores concentrações do extrato
tóxico apresentaram de 20 a 25% no final do experimento.
Tabela 3 – Estimativa da CL
50
-24h e CL
50
-48h (intervalo de confiança 95%)
de C. silvestrii expostos ao extrato bruto de florações e culturas de
cianobactérias
Amostra
Tipo
CL
50
-24h (mg.L
-1
)
CL
50
-48h (mg.L
-1
)
ARG 07/04 Floração 113,13 (88,32 – 144,91) 88,24 (69,44 – 112,13)
GARG 03/05 Floração 47,48 (44,9 – 50,20) 38,15 (36,55 – 39,83)
GARG 10/05 Floração 300,39 (258,39 – 349,21) 149,89 (92,70 – 242,36)
C. raciborskii
neurotóxica
Cultura 228,05 (175,65 – 296,07) 120,28 (85,09 – 170,02)
C. raciborskii
não-tóxica
Cultura NM NM
(NM= nenhuma mortalidade)
34
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 100 200 300 400 600 800
Concentração (mg.L
-1
)
Mortalidade (%)
24h
48h
CL
50
-48h = 88,24 mg.L
-1
CL
50
-24h = 113,13 mg.L
-1
Figura 02 – Taxa média de mortalidade (%) de C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de
cianobactérias do Reservatório Armando Ribeiro Gonçalves em julho de 2004.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 8 16,5 25 33,5 41,5 50
Concentração (mg.L
-1
)
Mortalidade (%)
24h
48h
CL
50
-48h = 38,15 mg.L
-1
CL
50
-24h = 47,48 mg.L
-1
Figura 03 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de
cianobactérias do Reservatório de Gargalheiras em março de 2005.
35
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 100 200 300 400 600 800
Concentração (mg.L
-1
)
Mortalidade (%)
24h
48h
CL
50
-48h = 149,89 mg.L
-1
Figura 04 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de florações hepatotóxicas de
cianobactérias do Reservatório de Gargalheiras em outubro de 2005.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 25 50 100 200 300 400 600 800
Concentração (mg.L
-1
)
Mortalidade (%)
24h
48h
CL
50
-24h = 300,39 mg.L
-1
CL
50
-24h = 228,05 mg.L
-1
CL
50
-48h = 120,28 mg.L
-1
Figura 05 – Taxa média de mortalidade (%) do C. silvestrii nos testes de
toxicidade de 24 e 48h com o extrato bruto de cultura monoespecífica
neurotóxica de C. raciborskii (ITEP 018), produtora de saxitoxina.
36
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
4. DISCUSSÃO
Cianobactérias são bastante representativas no fitoplâncton de águas doces
do Brasil. Matsumura-Tundisi & Tundisi (2005) descreveram uma dominância de
cianobactérias de ordem de 99,4% do total do fitoplâncton no Estado de São Paulo
na década de 80. Em diversos reservatórios do semi-árido potiguar, as
cianobactérias vêm representando mais de 90% da população do fitoplâncton e vêm
desenvolvendo florações mistas tóxicas periodicamente, compostas por espécies de
Microcystis panniformis, Microcystis aeruginosa, Anabaena circinalis, C. raciborskii,
Aphanizomenon sp. e Planktothrix agardhii (COSTA et al., 2003a e 2003b).
Os reservatórios estudados nesse trabalho apresentaram também alto grau
de eutrofização e ocorrência de floração mista hepatotóxica composta por
Cylindrospermopsis raciborskii, Planktothrix agardhii, Microcystis panniformis e M.
aeruginosa. Sotero-Santos (2005) também encontrou florações de M. aeruginosa em
um reservatório eutrofizado no Estado de São Paulo.
A presença de microcistina e saxitoxina já foi confirmada em florações nos
Reservatórios Armando Ribeiro (COSTA, et al 2006a) e Gargalheiras (COSTA et al.,
2006b). Outros reservatórios do semi-árido brasileiro também têm mostrado
freqüentes florações de cianobactéria (BOUVY et al., 1999; BOUVY et al., 2000;
HUSZAR et al., 2000). Segundo Bouvy (1999) e Tucci & Sant’anna (2003), diversos
fatores, tais como, alta temperatura, altos valores de pH, baixos valores de O
2
,
ausência de predadores eficientes e, principalmente, altos níveis de nutrientes,
promovem intenso crescimento de cianobactérias. Boon et al. (1994) acrescentam
que as cianobactérias não são palatáveis para muitos organismos zooplanctônicos
por causa do tamanho de sua colônia ou filamento, seus efeitos tóxicos e baixos
valores nutricionais, contribuindo para o fenômeno das florações.
Por serem comumente encontrados e por fazerem parte da comunidade
natural de água doce, os cladóceros têm sido estudados para avaliar a toxicidade de
cianobactérias (SOTERO-SANTOS et al., 2005; FERRÃO-FILHO et al., 2000;
FERRÃO-FILHO& AZEVEDO, 2002; ROHRLACK et al., 2001; LAWTON et al., 1994;
NOGUEIRA et al., 2004; GUO & XIE, 2005). Ferrão-Filho et al. (2000, 2002) e
Rohrlack et al. (2001) avaliaram o efeito tóxico em cladóceros alimentados com
37
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
células intactas de Microyistis aeruginosa e constataram diferentes respostas entre
espécies de cladóceros, tipos de cepas de Microcystis e tamanho das células
oferecidas. Guo & Xie (2005) mostram ainda que há influencia negativa na
sobrevivência, crescimento e reprodução de três espécies de cladóceros filtradores
de Microcystis produtoras de microcistina-LR, mas que eles podem desenvolver
tolerância quando expostos previamente a Microcystis aeruginosa.
Esses estudos, no entanto, são realizados com células tóxicas intactas ou
toxinas purificas, e seus efeitos podem ser menores quando comparados aos efeitos
observados em estudos utilizando-se extrato bruto de cianobactéria (OBEREMM et
al., 1999; TÖRÖKNE et al., 2000 PIETSCH et al., 2001; WIEGAND et al., 2002). Isso
porque na fase de senescência das cianobactérias, a lise da parede celular libera os
agentes tóxicos que permanecem dissolvidos na água, expondo a comunidade
trófica aquática através da exposição aguda ou a longo prazo.
No presente estudo, Ceriodaphnia silvestrii mostrou sensibilidade tanto para
microcistina de florações naturais quanto para saxitoxina de cepas cultivadas de C.
raciborskii na qual foram expostas. A toxicidade destas amostras também foi testada
por análise em HPLC, e seus valores juntamente com as comparações com os
bioensaios com camundongos e os testes de toxicidade realizados neste trabalho
são ilustradas na tabela 5.
Embora a amostra da floração de GARG out/2005 não tenha sido tóxica para
camundongos, foi letal nas dosagens de 300,39 mg.L
-1
em 24 horas, e 149,89 mg.L
-1
em 48 horas para C. silvestrii. Apesar do bioensaio com camundongos ter sido
negativo, foi observado leves sintomas de hepatoxicidade nas primeiras horas,
desaparecendo após 24 horas, mesmo tendo sido utilizada a dose máxima conforme
recomendado por Lawton et al. (1994). Os leves sintomas apresentados pelos
camundongos podem ter ocorrido possivelmente pela metabolização das
cianotoxinas nos camundongos, pela presença de outros componentes bioativos na
amostra, como bactérias e lipopolisacarídeos, ou ainda, devido à baixa concentração
de toxinas na amostra. Por outro lado, a análise por HPLC também não detectou a
presença de Microcistina-LR nesta mesma amostra, isso pode indicar baixos níveis
da toxina, ou, ainda, quantidade de biomassa liofilizada insuficiente para atingir o
limite de detecção do método. Em seus estudos, Gilbert (1990) não observou
38
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
sintomas tóxicos nos camundongos quando 500 mg.kg
-1
de extrato liofilizado da
cepa de Anabaena affinis foi injetado intraperitonealmente, porém esse material se
mostrou tóxico para comunidades de cladóceros. Segundo ele, os resultados obtidos
com bioensaios com camundongos não devem ser extrapolados para comunidades
zooplanctônicas.
Já a amostra da floração ocorrida em GARG mar/05 apresentou o maior grau
de toxicidade para os C. silvestrii – 47,48 mg.L
-1
para 24 horas e 38,15 mg.L
-1
para
48 horas, cerca de sete vezes maior do que a de GARG out/05 e três vezes maior
do que ARG jul/04. A alta toxicidade dessa amostra também foi comprovada por
HPLC, tendo sido detectada 519,20 μmol/g de microcistina-LR, valor três vezes
maior do que a amostra de ARG jul/04, que foi de 171,8 μmol/g, e, os bioensaios
com camundongos foram positivos para estas amostras (tabela 5).
O C. silvestrii testado nessa dissertação, também demonstrou sensibilidade
para a cultura de C. raciborskii (ITEP 018). Essa cepa foi estudada por Molica et al.
(2002), que confirmaram a presença de sintomas característicos da “Toxina
Paralisante de Molusco” (Paralytic Shellfish Poisons - PSP) em cobaias inoculadas,
e, através de análise de HPLC, verificaram a produção de 3,3 mol% do conteúdo de
saxitoxina total (tabela 5). A primeira evidência de produção de saxitoxina por C.
raciborskii no Brasil foi descrita por Lagos et al. (1998). Acumulação de PSP’s em
tecido de Daphnia magna foi relatado por Nogueira et al. (2004) ao serem mantidas
em meio contendo células vivas e células liofilizadas da cianobactéria
Aphanizomenon issatschenkoi.
Em recentes estudos, Ferrão-Filho et al. (2006) submeteram os cladóceros
Daphnia pulex e Moina micrura a doses agudas de saxitoxinas produzidas por
Cylindrospermopsis raciborskii isoladas de um Reservatório do Rio de Janeiro,
Brasil, e os resultados evidenciaram que não ocorria mortalidade dos cladóceros,
mas apenas uma paralisia nos movimentos natatórios seguida de recuperação da
natação ao serem transferidos para água não contaminada (efeito reversível),
indicando a compatibilidade do mescanismo de ação dessas saxitoxinas. Apesar
dessa recente constatação, a denominação “mortalidade” dos cladóceros após 24 e
48h adotado nesta pesquisa, foi considerada pela falta de capacidade natatória dos
organismos após agitação suave do tubo-teste por 15 segundos, conforme
39
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
instruções das normas técnicas da CETESB (1991) e ABNT (2003). No entanto,
estes resultados apontam a necessidade de realização de bioensaios para testar
sensibilidades (comportamento e/ou mortalidade) entre diferentes espécies de
zooplâncton em relação às cepas de cianobactérias e às suas toxinas.
Os resultados dos testes realizados com amostras ambientais hepatotóxicas e
culturas neurotóxicas de C. raciborskii (ITEP 018), nas mesmas concentrações,
evidenciaram o efeito danoso de microcistinas e saxitoxinas na sobrevivência dos
cladóceros. Como o teste realizado com a cultura não tóxica de C. raciborskii não
apresentou nenhuma mortalidade para os cladóceros, demonstra tanto a toxicidade
de saxitoxina produzida pela (ITEP 018) quanto uma boa sensibilidade do teste de
C. silvestrii sobre esta toxina.
O potencial toxigênico tanto das amostras de florações ocorridas em ARG
jul/04, quanto em GARG mar/05 foi comprovado por análise através de HPLC e
bioensaios com camundongos, e, embora estas análises não tenham comprovado a
toxicidade da amostra de GARG out/05, conforme já discutido nesse trabalho, ela
mostrou-se tóxica quando testada com C. silvestrii. Isso indica que o teste com C.
silvestrii poderia ser mais sensível e melhor aplicado para amostras com baixo
potencial toxigênico, embora seja necessário realizar mais experimentos com
amostras tóxicas e não tóxicas para validar esta afirmação.
Em todos os testes com amostras de florações naturais, exceto para as
amostras de cultura, o oxigênio dissolvido decresceu com o tempo e aumento das
concentrações do extratro bruto de cianobactérias. É possível que microcistinas, ou
outros compostos bioativos, produzidos por estas florações, tenha promovido
interferências e efeitos sinergéticos levando a redução de oxigênio dissolvido, já que
não ocorreu o mesmo nos testes realizados com culturas monoespecíficas tóxicas
(saxitoxinas) e não tóxicas. As amostras de culturas apresentaram elevados níveis
de saturação de oxigênio dissolvido (74 – 96%) durante todo o experimento. Apesar
da diminuição das concentrações de oxigênio nas maiores concentração do extrato
bruto de florações hepatotóxicas foi descartada a possibilidade de um falso positivo,
causado pelo efeito indireto de oxigênio, uma vez que suas concentrações, mesmo
em niveis mínimos, foram suficientes para a sobrevivência dos cladóceros (ABNT,
2003; CETESB, 1991; KNIE & LOPES 2004).
40
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Tabela 4 – Resultados comparativos entre bioensaios com camundongos,
quantificação de cianotoxinas, e as respectivas LC
50
-24h e LC
50
-48h (mg.L
-1
),
para as amostras de florações naturais e cepas cultivadas.
Amostra
Bioensaio
Camundongos
Swiss
Cianotoxinas
LC
50
-24h
C.
silvestrii
(mg.L
-1
)
LC
50
-48h
C. silvestrii
(mg.L
-1
)
ARG 07/04 Pos
171,8
♦
(Mc-LR μmol.g
-1
)
113,13 88,24
GARG 03/05 Pos
519,2
♦
(Mc-LR μmol.g
-1
)
47,48 38,15
GARG 10/05 Neg* ND
♦
300,39 149,89
ITEP 018 Pos
♦♦
3,3
♦♦
(Saxitoxina mol%)
228,05 120,28
(* Apresentou leves sintomas de hepatoxicidade, mas nenhuma morte; ND = não
detectado;
♦
COSTA et al., 2006c;
♦♦
MOLICA et al., 2002)
Apesar da complexidade e inconsistência entre os dados sobre efeitos de
cianotoxinas em microcrustáceos devido a diferenças na instrumentação e
metodologia usada por cada autor, fica evidenciado que as cianobactérias podem
causar efeitos deletérios na comunidade zooplanctônica. Isso também foi
demonstrado por Marsáled & Bláha (2004) que encontraram valores de CL
50
-48h
variando de 6000 a 99000 µg.mL
-1
para Daphnia magna e CL
50
-24h de 1100 a
12300 e de 6600 a 8900 µg.mL
-1
para Daphnia pulex e Ceriodaphnia dúbia,
respectivamente. Para Artemia salina, os autores encontraram o valor de CL
50
-24h
variando de 6800 a 7100 µg.mL
-1
e CL
50
-48h de 3500 a 31900 µg.mL
-1
. Com valores
semelhantes para A. salina, Sabour et al. (2002) encontraram CL
50
-24h numa faixa
de 6000 a 40600 µg.mL
-1
e CL
50
-48h de 2800 a 18200 µg.mL
-1
. Para Daphnia similis,
Sotero-Santos et al. (2005) avaliou a CL
50
-24h numa faixa de 186,61 a 229,84 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 162,45 a 194,75 mg.L
-1
. O resultado encontrado por Montagnolli et al.
(2003) da CL
50
-96h para o microcrustáceo Kalliapseudes schubartii teve média de
1,44 mg.ml
-1
. A sensibilidade varia entre os diferentes grupos estudados. Valores
semelhantes aos obtidos nesse estudo para ambientes situados no nordeste
brasileiro (Barragem Armando Ribeiro Gonçalves e Gargalheiras/RN), utilizando
41
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
extrato bruto de cianobactérias, foram encontrados por Sotero-Santos et al. (2005)
no Reservatório de Barra Bonita, localizado na região sudeste do Brasil, com CL
50
-
24h e CL
50
-48h para os C. silvestrii na faixa de 155,11 a 160,62 mg.L
-1
e 107,17 a
100,39 mg.L
-1
, respectivamente.
Os resultados aqui obtidos sumarizam apenas uma situação de análise de
laboratório, tendo em vista de que florações naturais de cianobactérias expõem por
mais tempo os organismos aquáticos às toxinas ou a outros componentes bioativos
produzidos pelas cianobactérias, os quais poderiam influenciar a toxicidade destes
organismos promovendo também efeitos nas comunidades aquáticas. Já é bem
documentado que cianobactérias também produzem, além de toxinas, diversas
substâncias danosas aos organismos, tais como metabólicos secundários e
lipopolissacarídeos-LPS (CARMICHAEL, 1997; BEST et al., 2000). Oberemm et al.
(1999) mostraram que extrato bruto de cepa de Mycrocystis aeruginosa contendo
baixa concentração de microcistina não causou sozinho efeitos nos organismos
testados. Ao contrário, nossas amostras de florações naturais evidenciaram
elevadas concentrações de microcistinas, e as amostras de culturas, uma
quantidade considerável de saxitoxinas, sugerindo ter exercido forte influência nos
organismos testados. Por outro lado, a não sensibilidade de C. silvestrii confirmada
no teste realizado com cultura de C. raciborskii não produtora de saxitoxina, poderia
indicar uma insignificante influência de outros compostos bioativos sobre C. silvestrii,
sugerindo importante influência de cianotoxinas sobre estes organismos mesmo
tendo havido participação de outros metabóltios secundários naturais.
Ensaios ecotoxicológicos advertem para a contaminação dos ambientes
aquáticos por agentes tóxicos naturais e antropogênicos, com o comprometimento
da manutenção da vida aquática. O uso do C. silvestrii como organismo-teste mostra
ter potencial efetividade, por se apresentar sob forma metodológica simples, rápida,
com pouco custo financeiro, e principalmente pela alta sensibilidade apresentada por
esses organismos, mostrando resultados precisos. No Brasil, esses cladóceros
também vêm sendo utilizados para avaliar efeitos tóxicos de efluentes industriais e
domésticos (COSTA & ESPÍNDOLA, 2002) e também da qualidade da água de
estações de tratamento (TAKENAKA et al., 2005). A realização desses tipos de
42
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
testes com organismos nativos é mais criteriosa para a preservação das
comunidades aquáticas.
5. CONCLUSÃO
A toxicidade das amostras de florações naturais hepatotóxicas (microcistinas) e
culturas neurotóxicas produtoras de saxitoxinas verificadas neste estudo fornece
forte indicativos da influência dessas toxinas sobre a estrutura da comunidade
zooplanctônica em ambientes aquáticos tropicais. Os cladóceros são importantes
organismos da cadeia trófica de ecossistemas de água doce tropicais, e se essa e
outras espécies similares são comprometidas por cianotoxinas, outros organismos
como peixes de importância econômica para o local, também podem ser afetados.
Nossos resultados demonstraram que C. silvestrii apresentou um bom grau de
sensibilidade podendo ser considerado um método promissor e eficaz para detecção
de toxicidade da água com florações de cianobactérias. Portanto, a utilização desse
organismo indica uma ferramenta potencial em programas de biomonitoramento na
gestão de recursos hídricos, por requerer pouco investimento com tempo de
resposta rápido e fornecer uma informação real dos efeitos das cianotoxinas sobre
os organismos aquáticos.
Os reservatórios do Rio Grande do Norte devem merecer maior atenção perante
os órgãos responsáveis, tendo em vista os constantes florescimentos tóxicos de
cianobactérias em águas utilizadas para consumo humano.
43
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
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50
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
IDENTIFICAÇÃO E TOXICIDADE DE CEPAS DE CIANOBACTÉRIAS ISOLADAS DE
AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO GRANDE DO NORTE.
Juska Milena dos Santos Mendonça¹, Ivaneide Alves Soares da Costa², Amanda dos
Santos Palhares², Layse Aranha Marinho²,
Marquele Cardoso Martins².
(ARTIGO A SER SUBMETRIDO PARA PUBLICAÇÃO)
______________________________
¹Departamento de Oceanografia e Limnologia, Centro de Biociências, Universidade
Federal dos Rio Grande do Norte. Via Costeira, s/n – Mãe Luíza, CEP – Natal/RN.
²Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte. BR -Lagoa Nova, CEP – Natal/RN
51
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
RESUMO
Incidências de florações tóxicas de cianobactérias são muito comuns em
reservatórios do nordeste do Brasil. Cianobactérias são organismos produtores
naturais de cianotoxinas, que frequentemente dominam corpos aquáticos
eutrofizados. A produção dessas toxinas tem importantes conseqüências para a
qualidade da água e freqüentemente causa alta mortalidade entre organismos
aquáticos, podendo atingir a população público. Neste trabalho, objetivamos
isolar, cultivar, identificar e avaliar a toxicidade de cianobactérias presentes em
reservatórios de abastecimento humano e viveiros de camarão (Litopenaeus
vannamei) localizados em ambientes de água doce do Estado do Rio Grande do
Norte (6
o
58
’
S e 38
o
36
’
W). As amostras foram coletadas com rede de plâncton
(20µm) e a toxicidade foi testada através de bioensaios com camundongos
Swiss. Para obtenção das culturas específicas foram usadas técnicas de
semeadura em meio sólido e líquido, isolamento com micropipetas e diluições
sucessivas. A identificação das espécies foi realizada com o auxílio de um
microscópio óptico (400X) utilizando o novo sistema de Komárek & Anagnostidis.
As cepas isoladas foram cultivadas em meio de cultura ASM-1, sob condições de
temperatura média de 25°C, intensidade luminosa de 1.000 Lux, fotoperíodo de
12h. Foram isoladas 11 cepas de cianobactérias representadas por 6 espécies:
Anabaenopsis sp., Cylindrospermopsis raciborskii, Chroococcus sp., Microcystis
panniformis, Geitlerinema unigranulatum e Planktothrix agardhii. Nenhuma cepa
apresentou toxicidade em camundongos Swiss. As cepas foram catalogadas e
depositadas no Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Organismos Aquáticos
(LETMA) da UFRN e serão utilizadas em estudos ecotoxicológicos e
ecofisiológicos visando esclarecer as causas e controle de florações de
cianobactérias nos ambientes aquáticos do Estado.
52
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
1. INTRODUÇÃO
Cianobactérias são importantes organismos autotróficos fotossintetizantes,
amplamente adaptados e muito tolerantes a ambientes extremos (BROCK, 1972).
Elas são produtoras naturais de toxinas (cianotoxinas), tendo efeito inibidor a
predador, algas competidoras e macrófitas, mas podem também afetar outros
organismos aquáticos e terrestres, bem como o homem (DUY et al., 2000).
Ambientes de água doce com águas neutro alcalinas (pH 6-9), temperatura entre
15 a 30°C e altas concentrações de nutrientes, principalmente de fósforo e
nitrogênio, propiciam condições ideais para o desenvolvimento das cianobactérias
(AZEVEDO, 1998). No entanto, a descarga excessiva de efluentes antropogênicos,
principalmente em reservatórios próximos aos centros urbanos (BELL & CODD,
1994) promove a formação de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas
nessas águas (PEARL & TUCKER, 1995). Essas florações têm importantes
conseqüências para a qualidade da água e o seu colapso freqüentemente causa alta
mortandade entre populações de animais aquáticos (VASCONCELOS et al., 2001).
É uma preocupação marcante a possibilidade da bioacumulação e transferências de
cianotoxinas através da cadeia alimentar para o homem, oferecendo sérios riscos à
saúde humana (FALCONER, 1991; FALCONER et al., 1994).
No Brasil, os gêneros mais comuns de cianobactérias encontradas em águas
doce eutrofizadas são Microcystis, Anabaena e Cylindrospermopsis (TUNDISI &
MATSUMURA-TUNDISI, 1992; DOMINGOS et al., 1999). Incidências de florações
tóxicas de cianobactérias são também muito comuns em ecossistemas aquáticos
nordestinos, principalmente nos reservatórios d’água construídos artificialmente para
usos múltiplos, principalmente para sobrevivência humana aos intensos períodos de
seca (BOUVY et al., 2004; COSTA et al., 2006a e 2006b; PORFIRIO et al., 1999;
LAZZARO et al., 2003).
No Rio Grande do Norte, as florações de cianobactérias tóxicas têm sido
observadas na Barragem Armando Ribeiro Gonçalves, nos reservatórios Passagem
das Traíras, Itãns, Poço Branco e Trairí (COSTA, 2003; COSTA et al., 2003a e
2003b; MORALES, 2003). Também têm sido encontradas quantidades consideradas
53
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
de cianobactérias tóxicas em viveiros de cultivo de camarão no Estado (COSTA, et
al. 2005), atividade aqüícola de grande importância econômica no RN.
Atualmente o controle de cianobactérias e de suas toxinas em água de
abastecimento e em cultivos de pescado para alimentação humana é um dos
grandes problemas no monitoramento de qualidade de água. Por isso a implantação
de um banco de culturas de cianobactérias no Departamento de Microbiologia e
Parasitologia da UFRN foi a primeira iniciativa tomada para desenvolver estudos
sobre esses organismos e contribuir para a resolução de problemas. Este trabalho
tem como objetivo isolar, cultivar, identificar e avaliar a toxicidade de cianobactérias
presentes em reservatórios de abastecimento humano e viveiros de camarão do
Estado do Rio Grande do Norte, visando subsidiar estudos ecotoxicológicos e
ecofisiológicos que possam elucidar fatores controladores de florações de
cianobactérias e responder questões ligadas à presença potencial de toxinas e seus
efeitos nas comunidades aquáticas e no homem.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Procedimento de amostragens
Foram realizadas coletas de fitoplâncton em importantes reservatórios para
abastecimento humano e fazendas comerciais de cultivo de camarão (Litopenaeus
vannamei ) localizados em ambientes de água doce do Estado do Rio Grande do
Norte (6
o
58
’
S e 38
o
36
’
W). Os viveiros de camarão investigados neste estudo
captam e despejam a água de cultivo em dois importantes rios do estado - o rio
Ceára-Mirim e o rio Piranhas-Assu, os quais exercem influência nos estuários do
Potengi (Natal/RN) e Cavalos (Pendênicas/RN). Apesar de sua grande diversidade,
os ecossistemas aquáticos do Estado encontram-se ameaçados por atividades da
agroindústria e pela aqüicultura, as quais têm grande importância econômica na
região.
Amostras foram obtidas através de arrastos verticais e horizontais utilizando-se
uma rede de plâncton (20µm) na coluna d’água. Amostras vivas e fixadas com
54
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
formol a 4% foram utilizadas para identificação das espécies. O material vivo foi
conservado em meio ASM-1 para posterior isolamento.
2.2 Isolamento e cultivo de cianobactérias
Para obtenção das culturas específicas foram usadas técnicas de semeadura
em meio sólido, em meio líquido e a técnica de isolamento com micropipetas do
tipo Pasteur e também através de diluições sucessivas (PRINGSHEIM, 1951;
GUILARD, 1995), com o auxílio de um microscópio óptico (400X).
As cepas isoladas eram cultivadas em meio de cultura ASM-1 (GORHAM
et al., 1964), sob condições de temperatura média de 25°C, iluminadas com 2
lâmpadas fluorescentes, fotoperíodo de 12h e mantidas no Banco de Cultivo do
Laboratório de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA) da
Universidade Federal do Rio grande do Norte.
2.3 Identificação das espécies de cianobactérias
Para o estudo taxonômico foi utilizado microscópio óptico, ocular de medição
e fotografias, técnicas de microscopia para identificação das espécies naturais e
isoladas. Foram calculadas médias de 30 medidas de cada característica
métrica de interesse taxonômico. A identificação das espécies foi feita seguindo-
se o sistema de Komárek & Anagnostidis (1998) para a Chroococcales,
Komárek & Anagnostidis (2005) para as Oscillatoriales e Komárek &
Anagnostidis (1989) para as Nostocales.
As cepas foram catalogadas pelas iniciais maiúsculas da sigla do Laboratório
de Ecologia e Toxicologia de Microrganismos Aquáticos (LETMA), seguidas por
um número de acordo com a ordem de isolamento. Também foram feitas fichas
individuais indicando o local de coleta, nome do responsável pelo isolamento e
as características morfológicas e toxicológicas das cepas.
55
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
2.4 Bioensaios com camundongos
Para verificar a toxicidade das cepas isoladas, foram realizados bioensaios
em camundongos Swiss (machos e com peso corpóreo variando de 15 a 20
gramas) através de injeção intraperitonial (i.p) de 1 mL do extrato bruto de
cianobactérias, ressuspenso em água ultra-purificada. Foram feitas inoculações
do material em 3 animais e os sintomas foram observados. A classificação da
toxicidade seguiu os critérios de Lawton et al. (1994).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Cultivo e Identificação das Cepas Isoladas
Foram isoladas 11 cepas de cianobactérias representadas por 6 espécies.
(tabela 1). As descrições das espécies identificadas e cultivadas são descritas a
seguir:
Ordem Nostocales
Anabaenopsis sp.
Tricomas moderadamente curtos e espiralados, 16 µm de comprimento,
células retângulo-arredondadas, 8,6 µm de comprimento, 5,5 µm de largura;
heterocitos esféricos-arredondados localizados em cada extremidade, 5,8 µm de
diâmetro; acinetos grandes, 11 µm de comprimento, 6 µm de largura, localizados na
extremidade apical ou distando 2-3 células dela. A cultura apresenta característica
verde-azulada com intensa sedimentação dos filamentos. (Prancha 1: figs. 1-2)
56
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Cylindrospermopsis raciborskii
Tricomas retos ligeiramente curvados, solitários, cilíndricos e estreitos,145 µm
de comprimento, 2,1 µm de largura; células cerca de 2 vezes mais longas que
largas, 4,5 µm de comprimento; heterocito terminal solitário, 7-9 µm de comprimento;
células apicais cônico-arredondados, conteúdo celular verde azulado, numerosos
aerotópos. A cultura apresenta crescimento lento e grandes filamentos
heterocitados. (Prancha 1: fig. 5)
Ordem Oscillatoriales
Planktothrix agardhii
Tricomas retos, estreitos, não constritos e solitários; 315.46 µm de
comprimento, 3,1 µm de diâmetro; células mais curtas do que largas, 4,8 µm de
comprimento, com célula apical capitada ou não; conteúdo celular verde-azulada
com inúmeros aerótipos; motilidade presente. O cultivo apresenta rápido
crescimento com aglomerados de tricomas em suspensão. (Prancha 1: fig. 3-4)
Geitlerinema unigranulatum
Filamentos retos, não constrictus, solitários ou formando feixes; 80,4 µm de
comprimeento, 2 µm de largura; células retangulares, 5,46 µm de comprimento;
conteúdo celular verde-azulado, septos indistintos, granuloso (1 grânulo), células
apicais cilindro-arredondadas; motilidade presente. A cultura apresenta um aspecto
característico de filamentos emaranhados que se agregam firmemente à superfície
da parede do recipiente. (Prancha 1: fig. 6-7)
57
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Ordem Croocrocalles
Microcystis panniformis
Colônias sub-esféricas quando jovens e irregulares quando adultas;
mucilagem estreita, difluente e inconspícua; células densamente dispostas em toda
mucilagem, 3,5 µm de diâmetro; conteúdo celular verde-amarronzado e com
aerótipos. Em culturas, assim como no ambiente natural, as colônias formam
densos agregados verdes em suspensão e sedimentados. (Prancha 2: fig. 8-11)
Chroococcus sp.
Células grandes ovaladas, arredondadas, envoltos por uma fina camada de
mucilagem, 11 µm de diâmetro, 17 de comprimento; conteúdo celular verde-azulada,
sem grânulos ou aerótipos. A cultura se apresenta na forma de partículas verdes-
azuladas que se sedimentam no fundo do recipiente. (Prancha 2: fig. 12-13)
3.2 Toxicidade das cepas
Os bioensaios realizados com as cepas isoladas de cianobactérias não
mostraram toxicidade quando testadas em doses 1000 mg.kg
-1
de peso corpóreo.
58
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
Tabela 1 – Caracterização das cepas de cianobactérias mantidas no banco de cultura
LETMA\UFRN
CEPA ESPÉCIE
LOCAL DA
COLETA
DATA DA
COLETA
BIOENSAIO
LETMA 001
Planktothrix agardhii
ARG 30/10/2004 Negativo
LETMA 002 Anabaenopsis sp VIVEIRO 09/07/2005 Negativo
LETMA 004
Geitlerinema unigranulatum
VIVEIRO 08/08/2005 Negativo
LETMA 005
Geitlerinema unigranulatum
VIVEIRO 26/07/2005 Negativo
LETMA 006
Planktothrix agardhii
ARG 30/05/2005 Negativo
LETMA 007
Geitlerinema unigranulatum
GARG 26/01/2005 Negativo
LETMA 008
Geitlerinema unigranulatum
GARG 22/03/2005 Negativo
LETMA 009
Cylindrospermopsis raciborskii
VIVEIRO 27/04/2005 Negativo
LETMA 010
Planktothrix agardhii
GARG 22/03/2005 Negativo
LETMA 011 Chroococcus sp. VIVEIRO 21/07/2005 Negativo
LETMA 013
Microcystis panniformis
GARG 18/10/2005 Negativo
(ARG = Barragem Engenheiro Armando Ribeiro Gonçalves; GARG = Gargalheiras;
VIVEIRO= viveiro destinado à criação de camarão aclimatado).
Neste trabalho, a técnica de isolamento por pipetagem foi mais eficiente para
o isolamento, tanto das espécies filamentosas quanto coloniais. Para espécies
coloniais, como Microcystis spp, o sucesso do isolamento só foi obtido realizando-se
uma pré-lavagem sucessiva gota a gota, em média 10 vezes, das células ou
colônias isoladas por pipetagem. As culturas monoespecíficas foram obtidas através
do plaqueamento em meio sólido ASM-1. Tal procedimento torna-se necessário
principalmente para evitar contaminação das culturas por espécies de Geitlerinema
spp, que ficam geralmente aderidas a mucilagem das colônias. Todas as culturas
apresentaram bom crescimento em meio ASM-1.
A técnica de isolamento e manutenção de cianobactérias potencialmente
tóxicas em laboratórios permite que estudos contínuos acerca de muitas espécies
desses procariotos possam ser explorados em várias linhas de pesquisa (ficologia,
fisiologia e toxicologia), por comunidades científicas do mundo todo.
Com o intuito de solucionar problemas causados pelos efeitos deletérios de
florações de cianobactérias em várias partes do mundo, estudos vêm sendo
realizados com espécies isoladas de cianobactérias, como por exemplo, Hawkins, et
al. (1997), que avaliaram o efeito tóxico de Cylindrospermopsis raciborskii isolado de
59
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
um pequeno lago da Austrália. No Brasil, Bittencourt-Oliveira et al. (2004) isolaram
Microcystis panniformis de um reservatório eutrofizado do Estado de São Paulo e
verificaram o ritmo circadiano na biosíntese de microcistina. Molica et al. (2002)
avaliaram a toxicidade de Cylindrospermopsis raciborskii isolados de águas de
Caruaru/PE.
No presente trabalho, as cepas isoladas de reservatórios do semi-árido
potiguar e viveiros de camarão do Estado não foram tóxicas quando testadas em
camundongos. No entando, Costa & Azevedo (1994) relatam que cerca de 75% das
espécies isoladas no Brasil, apresentam toxicidade. Além disso, COSTA et al.
(2003a e 2003b) observaram que cianobactérias representam mais de 90% da
população do fitoplâncton em reservatórios do Rio Grande do Norte, e desenvolvem
freqüentes florações mistas tóxicas, compostas por Microcystis panniformis, M.
aeruginosa, Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Plankitothrix
agardhii. Assim, faz-se necessária a realização de análises químicas mais sensíveis,
como por exemplo, o método “HPLC” para confirmar a toxicidade das cepas. Por
outro lado, não devemos desconsiderar a possibilidade de ter sido isolado apenas
espécies não tóxicas, uma vez que florações de cianobactérias apresentam-se
compostas por uma mistura de espécies produtoras e não produtoras de toxinas
(SIVONEN & JONES, 1999).
A presença de cianobactérias tóxicas em reservatórios de abastecimento
públicode e viveiros de cultivo e camarão representa um problema tanto econômico,
devido às mortalidades de camarões pelas cianotoxinas (SMITH, 1996), e também
de saúde pública pela probabilidade de ocorrer bioacumulação de toxinas nos
músculos e vísceras do pescado (peixe e camarão) e transferência até o homem
(FALCONER et al., 1994). É essencial, portanto, a continuidade deste trabalho, na
tentativa de isolar cepas tóxicas, bem como investigar fatores que estimulam a
produção de toxinas por cianobactérias nestes ambientes. As espécies isoladas
neste trabalho serão utilizadas em experimentos científicos na tentativa de
esclarecer as causas e conseqüências das florações de cianobactérias nos
ambientes aquáticos do Estado, contribuindo com o desenvolvimento científico do
Rio Grande do Norte.
60
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
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63
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
2
1
(20X)
(100X)
(40X)
(100X)
(20X)
(40X)
(100X)
4
7 6
5
3
Prancha 1. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Anabaenopis sp.
(1-2) Planktothrix agardhii (3-4); Cylindrospermopsis raciborskii (5); Geitlerinema
unigranulatum (6-7).
Prancha 1. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Anabaenopis sp.
(1-2) Planktothrix agardhii (3-4); Cylindrospermopsis raciborskii (5); Geitlerinema
unigranulatum (6-7).
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MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
9
8
(100X) (40X)
10
11
(100X) (40X)
12
13
(40X) (40X)
Prancha 2. Cepas de cianobactérias isoladas no LETMA/UFRN. Microcystis
panniformis (8-11): 8 e 9 = colônias jovens com e sem nanquim respectivamente, 10
e 11 = colônias senescentes; Chroococcus sp (12-13).
65
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
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MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
– ANEXOS –
74
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
01 - Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da
UFRN, Natal/2005.
ISOLAMENTO E CULTIVO DE CIANOBACTÉRIAS POTENCIALMENTE
TÓXICAS DE AMBIENTES AQUÁTICOS DO RIO GRANDE DO NORTE
Amanda Palhares dos Santos, Juska Milena dos Santos Mendonça, Sheylla Weil Ramos
Marques, Sheila Gomes de Melo e Ivaneide Alves Soares da Costa
Universidade federal do Rio grande do Norte
Departamento de microbiologia e Parasitologia
Laboratório de Ecologia e toxicologia de micrganismos aquáticas
No Rio Grande do Norte, florações de cianobactérias potencialmente
produtoras de toxinas são decorrentes do processo de eutrofização em
ecossistemas de água doce e estuarina. Isto constitui um problema ambiental e
de saúde pública, visto que as cianotoxinas podem contaminar o homem
através da ingestão de água, peixe e camarão contendo a toxina. O isolamento
e cultivo desses organismos são de extrema importância para o
desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos e fisiológicos os quais servirão
para apontar possíveis soluções para esse problema. Este trabalho tem como
objetivo o isolamento e cultivo das cianobactérias de ambientes aquáticos do
Rio Grande do Norte. Amostras de água foram coletadas com rede de plâncton
(20µ) no Açude Gargalheiras, Barragem Armando Ribeiro Gonçalves e em
viveiros de camarão de água doce. As espécies foram isoladas e cultivadas em
meio ASM-1 líquido e mantidas sob fotoperíodo de 12:12 horas para o ciclo
claro: escuro, temperatura de 24
o
C a 27
o
C e intensidade luminosa de 80 – 1700
LUX. Foram isoladas quatro cepas potencialmente tóxicas: Geitlerinema
amphibium, Plankthotrix agardhii, Cylindrospermopis raciborskii e Anabaena
circinalis. Alíquotas dessas culturas foram liofilizadas e serão utilizadas para
testar a toxicidade das cepas através de bioensaios com camundongos.
75
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
02 - Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da
UFRN, Natal/2005
OCORRÊNCIA DE FLORAÇÃO TÓXICA DE CIANOBACTÉRIA (Microcystis
aeruginosa) NO RESERVATÓRIO ARMANDO RIBEIRO GONÇALVES,
ASSU/RN
Sheila Gomes de Melo, Ivaneide Alves Soares da Costa, Amanda Palhares dos Santos,
Juska Milena dos Santos Mendonça, Sheylla Weil Ramos Marques
Universidade federal do Rio grande do Norte
Departamento de microbiologia e Parasitologia
Laboratório de Ecologia e toxicologia de micrganismos aquáticas
Florações de cianobactérias são caracterizadas pelo crescimento exagerado
desses microrganismos e são geralmente decorrentes do processo de
eutrofização dos ambientes aquáticos. Isto representa um grave problema de
saúde pública, principalmente em reservatórios de abastecimento doméstico,
pelo fato de várias espécies serem capazes de produzir e liberar cianotoxinas
na água, as quais também podem se acumular na cadeia trófica. As pessoas
são contaminadas bebendo a água, comendo peixes ou camarão contendo a
toxina ou através de atividades de recreação. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a toxicidade de uma floração de cianobactéria ocorrida em julho de 2004
no reservatório Armando Ribeiro Gonçalves, no município de Assu/RN. O teste
de toxicidade foi realizado com camundongos “Swiss”. A quantificação das
espécies foi feita pelo método de Utermöhl. A floração foi composta unicamente
pela espécie Microcystis aeruginosa e apresentou densidade 2 x10
8
cél.mL
-1
.
Esses valores estão acima do limite permitido para o consumo humano
segundo a Portaria 518 de março de 2004 do Ministério da Saúde. Os
camundongos testados no bioensaio apresentaram sintomas de hepatoxicidade
e morte após 1h e 30 com uma dose de 1052mg.kg de peso corpóreo. A
concentração de clorofila-a foi 449μg.L
-1
e do fósforo total 21 μg.L
-1
. Os
resultados evidenciam a necessidade urgente da implantação de um programa
de monitoramento de cianobactérias nos reservatórios de abastecimento
público do RN.
76
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
03- Resumo publicado no XVI Congresso de Iniciação Científica da
UFRN, Natal/2005
CARACTERIZAÇÃO E VARIAÇÃO SAZONAL DO FITOPLÂNCTON, COM
ÊNFASE EM CIANOBACTÉRIAS, EM VIVEIROS DE CARCINICULTURA NO
ESTUÁRIO DO RIO CAVALOS/MACAU/RN.
Sheylla Weil Ramos Marques, Amanda Palhares dos Santos, Sheila Gomes de Melo,
Juska Milena dos Santos Mendonça e Ivaneide Alves Soares da Costa
Universidade federal do Rio grande do Norte
Departamento de microbiologia e Parasitologia
Laboratório de Ecologia e toxicologia de microrganismos aquáticas
A ocorrência de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas em
viveiros de camarão no Rio Grande do Norte tem se tornado um tema de
crescente interesse, não só para pesquisadores, mas, também para a
população, isso porque as toxinas produzidas por algumas espécies podem
provocar redução na produtividade e mortalidade dos camarões e até atingir a
saúde humana pela bioacumulação. O objetivo deste trabalho é identificar e
quantificar as espécies de fitoplâncton, em viveiros de camarão (Litopenaeus
vannamei) de uma fazenda localizada no estuário do Rio Cavalos, Macau/RN.
Foram realizadas duas coletas uma no período de estiagem (28/10/2004) e
outra no período chuvoso (05/04/2005). Amostras de água integrada foram
coletadas nos pontos de captação e viveiros, fixadas com lugol acético e os
organismos quantificados pelo método de Utermöhl. Variáveis ambientais
também foram analisadas com a finalidade de avaliar as condições tróficas do
ambiente. No ponto de captação a densidade do fitoplâncton variou de 47000 a
64500 ind.mL
-1
e nos viveiros de 36271 ind.mL
-1
a 347375 ind.mL
-1
.
Cianobactérias representaram >80% da população do fitoplâncton, com
dominância das espécies Pseudoanabaena sp, Aphanocapsa sp e
Cylindrospermopsis raciborskii. A clorofila-a variou de 23-193 μg. L
-1
, o pH de
8,5-9,0, o oxigênio dissolvido de 5,0-17 mg.L
-1
, a transparência da água de 0,2-
0,4m, as concentrações de fósforo total de 117-628 μg.L
-1
e de amônia 10,44 -
303 μg.L
-1
.
77
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
04 – Resumo publicado no XI Congresso Brasileiro de Ficologia,
Itajaí/SC,
MONITORAMENTO DE FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS NO AÇUDE
GARGALHEIRAS, ACARI/RN.
Amanda Palhares dos Santos, Adriano Augusto da Silva, Sheila Gomes de Melo, Elinez da
Silva Rocha, Wanessa Sousa, Juska Milena dos Santos Mendonça e
Ivaneide Alves Soares da Costa
Universidade federal do Rio grande do Norte
Departamento de microbiologia e Parasitologia
Laboratório de Ecologia e toxicologia de microrganismos aquáticas
O açude Gargalheiras, localizado no semi-árido potiguar, é utilizado para
fins de abastecimento humano, aqüicultura e lazer, mas apresenta contínuas
florações de cianobactérias. Com a finalidade de investigar a periodicidade,
intensidade e toxicidade das florações, amostras mensais foram analisadas
entre janeiro e dezembro de 2005. Para identificação das espécies, amostras
foram coletadas com rede de plâncton (20µm) e preservadas com formol a 4%.
As espécies foram quantificadas de acordo com Ütermol e fixadas com lugol-
acético. Parâmetros ambientais (oxigênio dissolvido, temperatura, pH,
condutividade, transparência, fósforo total e clorofila) foram medidos. Elevados
níveis de fósforo total (M=84 µg.L
-1
; DP= 17), clorofila-a (M=43,6 µg.L
-1
; DP=
18,1) e baixa transparência (M=0,8 m; DP= 0,9) confirmaram o estado de
eutrofização do reservatório. Florações mistas de cianobactérias (Microcystis
aeruginosa, M. protocystis, M. panniformis, Planktothrix agardhi e
Cylindrospermopsis raciborskii) ocorreram durante todo o ano, atingindo
densidades máximas entre 10
4
e 10
5
céls./mL. A população de
Cylindrospermopsis raciborskii apresentou tricomas retos, espiralados e
encurvados. Foi comprovada hepatoxicidade, através de bioensaios em
camundongos, nas florações ocorridas em janeiro e março de 2005.
78
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
05 - Artigo Científico Publicado na Revista FAPERN, v. 1, n. 03 de
abr/mai de 2006.
79
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
80
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
06 – Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de
Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.
INCIDÊNCIA DE HEPATOTOXINAS EM RESERVATÓRIOS
ABASTECIMENTO HUMANO NO SEMI-ÁRIDO POTIGUAR (RN,BRASIL)
Costa, I. A. S.¹, Santos, A. P
1
., Mendonça, J. M. S.¹, Kujbida, P., Anjos, F.M. &
Pinto, E.
1
Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil
2
Departamento Anal. Clin. Tox.,FCFUSP, São Paulo /SP, Brasil
(
iasoares@cb.ufrn.br)
Importantes reservatórios do semi-árido potiguar que são destinados ao
abastecimento humano, frequentemente apresentam florações de
cianobactérias, denunciando o elevado grau de eutrofização destes ambientes.
Cianobactérias podem produzir hepatotoxinas, tais como microcistinas, que
contaminam a água e o pescado comprometendo sua qualidade e oferecendo
riscos à saúde humana. Avaliamos a toxidade de 7 florações ocorridas em 4
reservatórios no Estado do Rio Grande do Norte entre julho de 2004 e abril de
2005 através de bioensaios com camundongos e análise por HPLC. Amostras
de florações foram coletadas com rede de plâncton (20µm) e liofilizadas para
os testes de toxicidade e uma alíquota foi preservada com formol a 4 % para
identificação das espécies. A quantificação seguiu o método de Ütermol sendo
as amostras fixadas com lugol-acético. As florações eram compostas por
Microcystis panniformis, M. aeruginosa, Anabaena circinalis,
Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii, com densidades entre
10
5
a
10
9
células/mL. Os camundongos testados apresentaram sinais de
hepatoxicidade e morte entre 1 e 3 horas. A análise de HPLC constatou a
presença de microcistina-LR nas 7 amostras testadas: Reservatório Armando
Ribeiro Gonçalves jul/2004 (34,21 µg.g
-1
) e out/2004 (172,60 µg.g
-1
);
Gargalheiras, jan/2005 (123,31 µg.g
-1
),mar/2005 (101,58 µg.g
-1
),abr/2005
(30,64 µg.g
-1
); Itans, abr/2005 (149,74 µg.g
-1
) e Passagem das Traíras (86,08
µg.g
-1
). A quantidade de células e microcistina-LR encontrada na água dos
reservatórios estão acima do limite máximo aceitável para consumo humano
segundo a OMS e a Portaria 518 de março/2004 do Ministério da Saúde do
Brasil. Microcistina-LR é potente produtora de tumores no fígado e sua
presença na água coloca em risco à saúde da população. É necessário e
emergencial o monitoramento e o tratamento de cianotoxinas nos mananciais
de abastecimento de água no estado do Rio Grande do Norte.
APOIO: FAPERN/CNPq
81
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
07- Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de
Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.
EFEITO DE CULTURAS TÓXICAS DE Cylindrospermopsis raciborskii E
Anabaena spiroides SOBRE Litopenaeus vannamei (Crustacea,
Decapoda)
Mendonça, J. M. S.¹, Costa, I. A. S.², Santos, A.P.
3
; Marinho, L. A.
3
& Martins, M. C.
3
¹ PPG em Bioecologia Aquática (DOL/UFRN), Natal/RN, Brasil
² DMP/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil
3
Graduação em Ciências Biológicas (UFRN), Natal/RN, Brasil
O camarão cultivado Litopenaeus vannamei representa o principal produto de
exportação do Rio Grande do Norte. No entanto, esta atividade tem contribuído
com a eutrofização de rios e reservatórios do estado, favorecendo o aumento
na incidência de florações tóxicas de cianobactérias nestes ambientes e,
consequentemente, nos viveiros de produção do camarão. Cianotoxinas
compromete a qualidade da água e afeta a biota aquática. Também podem ser
bioacumuladas na cadeia trófica e atingir a saúde humana através da ingestão
do camarão. Nesse estudo, foram realizados testes de toxicidade com cepas
tóxicas de Cylindrospermopsis raciborskii (ITEP 028) e Anabaena spiroides
(ITEP 026), espécies formadoras de florações em viveiros de água doce do
estado, em pós-larvas de camarão marinho aclimatado Litopenaeus vannamei
(Pl
15
). As cepas foram cultivadas em meio ASM-1 e o teste foi realizado
utilizando extrato bruto centrifugado, obtido a partir das culturas liofiliozadas.
As cepas tóxicas C. raciborskii e A. spiroides causaram efeito letal com 100%
de morte das pós-larvas do camarão em 36 horas, com a concentração de 0,5
mg.mL
-1
de extrato bruto das culturas tóxicas. Estes resultados evidenciam que
cianotoxinas são letais para as pós-larvas do camarão L. vannamei. Portanto, a
liberação de cianotoxinas das células de cianobactérias durante a senescência
natural das florações no viveiro pode diminuir drasticamente a produção de
camarão acarretando grandes prejuízos financeiros.
APOIO: FAPERN/CNPq
82
MENDONÇA, J.M.S. Avaliação da toxicidade de cianobactérias: efeito sobre Ceriodaphnia silvestrii
83
08 - Resumo aceito para publicação no IX Congresso de Brasileiro de
Ecotoxicologia, à ser realizado em São Pedro/SP, julho de 2006.
EFEITO DE MICROCISTINAS DE FLORAÇÕES NATURAIS E SAXITOXINAS
DE CULTURAS DE CIANOBACTÉRIAS, SOBRE Ceriodaphnia silvestrii
(Crustácea, Cladocera)
Mendonça, J. M. S.¹, Santos, A. P. ², Marinho, L. A. ²
&
Martins, M. C. ²
& Costa, I. A. S.
3
¹ PPG em Bioecologia Aquática (DOL/UFRN), Natal/RN, Brasil
² Ciências Biológicas (UFRN), Natal/RN, Brasil
3
Departamento de Microbiologia e Parasitologia/CB/UFRN, Natal/RN, Brasil
No Rio Grande do Norte, é comum a ocorrência de florações tóxicas de
cianobactérias em reservatórios de abastecimento humano. Foram investigados
os efeitos ecotoxicológicos de florações naturais de cianobactérias ocorridas em
reservatórios de água para abastecimento humano do RN e de cepas tóxicas e
não tóxicas de Cylindrospermopsis raciborski sobre Ceriodaphnia silvestrii.
Amostras de florações naturais foram coletadas com rede de plâncton (20μm) nos
reservatórios Armando Ribeiro Gonçalves (06
o
S e 37
o
W) em julho de 2004 e
Gargalheiras (08º L e 39º W) em março e outubro de 2005. Cepas C. raciborskii
não tóxicas e produtoras de saxitoxinas foram gentilmente cedidas pelo Dr.
Renato Molica da UFRPE. A toxicidade das florações foi confirmada por
bioensaios com camundongos e análise em HPLC. Os testes de toxicidade com
Ceriodaphnia silvestrii seguiram a norma da ABNT, 2001. Cinco neonatos com
idade entre 6 e 24 horas foram expostos a diferentes concentrações (0-800 mg.L
-
1
) de extrato bruto de cianobactérias durante 24 e 48 horas. Três replicatas por
tratamentos foram usadas. Foram medidos o pH, temperatura e oxigênio
dissolvido no início, com 24 e 48 horas. Os dados dos testes foram sumarizados e
analisados usando o método Trimmed Spearman-Karber para estimação da CL
50
.
As florações eram compostas por Microcystis panniformis, M. aeruginosa,
Anabaena circinalis, Cylindrospermopsis raciborskii e Planktothrix agardhii. Todas
as amostras de floração investigadas registraram toxicidade para C. silvestrii, com
valores de CL
50
-24h de 47.48 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 38.15 mg.L
-1
para GARG
mar/05; CL
50
-24h de 127.71 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 105.79 mg.L
-1
para ARG jul/04;
CL
50
-24h de 300.39 mg.L
-1
e CL
50
-48h de 149.89 mg.L
-1
para GARG 10/05.
Valores de CL
50
-24h e CL
50
-48h para ITEP018 foram de 228.05 e 120.28 mg.L
-1
,
respectivamente. Não houve mortalidade dos C. silvestrii nos testes com a cepa
de C. raciborskii não-tóxica. O teste de toxicidade com C. silvestrii se mostrou
eficiente para detecção de microcistinas e saxitoxinas dissolvidas na água.
APOIO: FAPERN/CNPq
84
09 – Artigo Científico Submetido a Revista FAPERN, v.1, n.04, jul/ago,
2006.
FLORAÇÕES DE ALGAS NOCIVAS: AMEAÇA ÀS ÁGUAS POTIGUARES
Ivaneide Alves Soares da Costa, Amanda Palhares dos Santos, Adriano Augusto Silva,
Sheila Gomes de Melo, Juska Milena dos Santos Mendonça, Renata de Fátima Panosso e
Magnólia Fernandes Florêncio Araújo
Universidade Federal do Rio Grande do Norte, [email protected]n.br
RESUMO
Estudos realizados em diferentes e importantes ambientes aquáticos do Estado do Rio Grande do Norte
(reservatórios, rios, lagoa costeira, estuários e viveiros de camarão), no período de 2003 a 2005, diagnosticaram
intenso processo de eutrofização artificial. Como conseqüência, reservatórios do semi-árido vêm desenvolvendo
freqüentes florações de cianobactérias tóxicas, o que compromete sua utilização para o abastecimento humano.
Os resultados aqui apresentados mostram a presença excessiva de cianobactérias nos reservatórios, o que
representa uma ameaça constante. Por isso, o monitoramento desses organismos deve ser permanente, visando à
proteção da saúde humana e dos recursos hídricos.
Palavras-chave (Key words): eutrofização, cianobactérias, cianotoxinas.
INTRODUÇÃO
No Rio Grande do Norte, apesar da
grande diversidade, os ecossistemas
aquáticos encontram-se ameaçados por
atividades da agroindústria pela
aqüicultura, as quais são de grande
importância econômica na região. A perda
da qualidade da água prejudica o seu uso
para diversos fins, dentre eles o
doméstico, irrigação, lazer, aquicultura e
outros, promovendo graves conseqüências
para biota aquática e à saúde pública.
Neste panorama, investigações voltadas à
qualidade da água são de importância vital
para o desenvolvimento sócio-econômico
do Estado.
Importantes reservatórios do semi-
árido potiguar, denominados
regionalmente como açudes ou barragens,
apresentam frequentemente uma cor verde,
parecida com uma “sopa de ervilha”, na
superfície da água. A cor verde é típica de
Florações de Cianobactérias, formadas
pela proliferação exagerada desses
microrganismos (Figuras 1 e 2). Esse fato
denuncia o alto nível de Eutrofização
Artificial, que é um tipo de poluição das
águas causada pelo excesso de nutrientes,
principalmente nitrogênio e fósforo. Esses
nutrientes estão contidos na matéria
orgânica lançada por despejos de esgotos
domésticos e industriais e são acumulados
nos corpos d’água. Agro-fertilizantes
oriundos da fruticultura e o excesso de
nutrientes provenientes das rações
utilizadas nas atividades de piscicultura e
carcinicultura parecem contribuir
significativamente para a eutrofização
desses ambientes (COSTA et al., 2005 a e
b, 2006). A oferta de nutrientes, associada
à maior intensidade de luz e calor, águas
alcalinas e elevado tempo de residência da
água, como é o caso das águas do semi-
árido potiguar, favorecem a dominância de
cianobactérias nesses ambientes,
As Florações de cianobactérias
figuram como uma das sérias
conseqüências da eutrofização, por
causarem grande impacto ambiental, social
e econômico. Também comprometem a
qualidade da água e do pescado, afetando o
equilíbrio dos corpos d`água, a
sobrevivência dos animais aquáticos e a
saúde humana, além de aumentar o custo
de tratamento da água. Os principais
efeitos observados na água são alterações
na cor, sabor e odor, tornando-a imprópria
para o consumo humano. A decomposição
85
das florações de cianobactérias leva à
desoxigenação da água promovendo a
morte de organismos aquáticos.
Entretanto, o efeito mais grave é o
fato de várias espécies serem capazes de
produzir e liberar toxinas (cianotoxinas)
na água, as quais podem se acumular na
musculatura de peixes ou camarões e
produzir diferentes sintomas de
intoxicação (hepatotóxicos e
neurotóxicos). As pessoas podem se
intoxicar bebendo a água, comendo peixes
ou camarão contendo a toxina ou através
de atividades de recreação. O tipo mais
comum de intoxicação é causado por
hepatoxinas (microcistinas) cujos sintomas
são os mesmos de uma gastroenterite, tais
como vômitos, dor abdominal e diarréia. A
microcistina é potencial produtora de
tumores no fígado, quando ocorre ingestão
de água contendo a toxina, mesmo em
baixas concentrações, por longos períodos
(ver quadro 1).
Os ambientes que apresentam
florações tóxicas devem ser monitorados e
interditados para o banho, pesca e
abastecimento doméstico, caso excedam os
limites máximos permitidos pela legislação
que regulamenta os padrões de
potabilidade da água (Portaria n
o
518/março/2004 do Ministério da Saúde e
da resolução n
o
357/2005 o CONAMA).
O máximo tolerável para banho e para
consumo humano, por exemplo, é a
presença de cem e vinte mil células de
cianobactérias em cada mililitro d’água,
respectivamente. Quando a água atinge a
cor verde, encontramos pelo menos um
milhão de células de cianobactérias por
mililitro de água.
A presente pesquisa tem como
objetivo diagnosticar e avaliar as condições
ecotoxicológicas, com base na incidência
de cianobactérias e cianotoxinas, de
importantes ambientes aquáticos
(reservatórios artificiais, rios, lagoas
costeiras e viveiros de camarão) do Estado
do Rio grande do Norte.
SÍNTESE DOS RESULTADOS
A maioria dos ambientes
investigados (70%) foram classificados
como eutróficos, de acordo com os níveis
de nutrientes (fósforo total), clorofila-a,
turbidez da água e incidência de
cianobactérias e cianotoxinas. Foram
investigados 19 reservatórios, 11 fazendas
de cultivo de camarão Litopenaeus
vannamei de água doce e salgada, 4 rios e
a lagoa costeira de Guaraíra.
Freqüentes e duradouras florações
tóxicas de cianobactérias ocorreram
principalmente em reservatórios do semi-
árido, os quais são utilizados
principalmente para abastecimento
humano. Eles estão localizados nas bacias
Apodi-Mossoró (Lucrécia, Pau dos Ferros,
Tenente Ananias e Pilões),
Piranhas-Assu
(Armando Ribeiro, Gargalheiras e
Passagem das Traíras) e Trairi (Açude
Traíri).
Em diversos ambientes foram
encontradas elevadas concentrações de
clorofila-a e fósforo total, respectivamente,
≤ 800μg/L e ≤ 350 µg/L. A dominância de
cianobactérias na maioria dos ambientes
foi superior a 90% da biomassa total do
fitoplâncton.
Florações hepatotóxicas foram
observadas em 60% dos reservatórios.
Elevados níveis de microcistinas (≤ 30
≥172 µg/L) foram encontrados nos
reservatórios Itans, Passagem das Trairas,
Sabugi, Pilões, Lucrécia, Tenente Ananias,
Pau dos Ferros, Gargalheiras, Armando
Ribeiro e no rio Assu. Esses valores estão
muito acima do limite máximo permitido
para consumo humano, que é de 1µg/L.
Apesar da ocorrência de florações em
viveiros de camarão de água doce e
estuarina, a toxicidade foi comprovada
apenas em um cultivo que capta água do
rio Assu. A densidade de cianobactérias é
extremamente alta nos pontos de captação
dos cultivos (rios, estuários e lagoas) em
alguns períodos, evidenciando o efeito
poluente das descargas dos viveiros nesses
ambientes.
CARMICHAEL, W. W. Health effects of toxin-
producing cyanobacteria: The CyanoHABs.
Human and Ecological Risk Assessment: 75
1393-1407pp., 2001.
b
a
COSTA, I. A. S.; Azevedo, S. M.O. ;
CHELLAPPA, N. T. ; Senna, P.A.C. ; Bernardo, R.
R. ; Costa, S. M. The occurence of toxic-producing
cyanobacterial blooms in a semi-arid reservoir in
the northeast Brazil. Brazilian Journal of Biology,
São Paulo, 66(1b):29-41, 2006 (in press).
Figura 1. Aspecto de uma floração hepatotóxica
(microcistina) na Barragem Armando Ribeiro
Gonçalves em julho/2004 (a); Visualização
microscópica das espécies potencialmente tóxicas
contidas na amostra, Microcystis aeruginosa e
Microcystis panniformis (b).
COSTA,I.A.S.; SILVA, P.F.; SANTOS,A,P.;
SILVA,R.S.; MELO,S.M.; SAMPAIO, T.B.M.
Ocorrência de florações tóxicas de cianobactérias
em reservatórios de abastecimento humano no
Estado Do Rio Grande Do Norte. In: X Congresso
Brasileiro de Limnologia, 2005, Ilhéus/BA.
Resumos do X Congresso Brasileiro de
Limnologia, 2005.
c a b
Figura 2. Cianobactérias em viveiros de camarão de
água doce: (a) Anabaena circinalis; (b)
Cylindrospermopsis raciborskii; (c) Anabaenopsis
sp.
COSTA,I.A.S.; SILVA, P.F.; SANTOS,A,P.;
SILVA,R.S.; MELO,S.M.; SAMPAIO, T.B.M..
AVALIAÇÃO DO FITOPLÂNCTON COM
ÊNFASE EM CIANOBACTÉRIAS EM
VIVEIROS DE CAMARÃO NO RIO GRANDE
DO NORTE. In: X Congresso Brasileiro de
Limnologia, 2005, Ilhéus. Resumos do X
Congresso Brasileiro de Limnologia, 2005.
CONCLUSÕES
Os índices de cianobactérias e
cianotoxinas diagnosticados neste estudo
são preocupantes e, por isso, autoridades e
população devem ser alertadas sobre o
problema. A implementação de uma
proposta de manejo que tenha como
objetivo a minimização dos efeitos da
poluição e a concepção de mecanismos de
gestão mais eficientes, voltados à
conservação de mananciais do Rio Grande
do Norte, além de emergenciais, devem ser
seriamente considerados no planejamento
ambiental e sócio-econômico do estado.
ABSTRACT
Recent studies in different and important reservoirs
in aquatic environments of Rio Grande do Norte
(reservoirs, lakes, estuaries and shrimps farms)
have diagnosed an intense process of artificial
eutrophication. In consequence, some reservoirs in
the semi-arid region have developed frequent
blooms of toxic cyanobacteria. The results
presented here shows a permanent risk of
cyanotoxins in supply waters, and need for
monitoring.
REFERÊNCIAS
AZEVEDO, S.M.F.O. Toxinas de cianobactérias:
Causas e conseqüências para a saúde pública.
Medicina on line, 1 (3): 1-22, 1998.
86
QUADRO 1: O QUE SÃO CIANOBACTÉRIAS E CIANOTOXINAS?
Cianotoxinas são toxinas produzidas pelas Cianobactérias. Estes microrganismos também são
denominados de algas azuis ou cianofíceas pelo fato de possuírem um pigmento verde-azulado, a
ficocianina, além da clorofila-a e carotenos. São procariontes como as bactérias (não possuem material
nuclear envolvido por membranas) e fotossintetizantes aeróbicos como vegetais e algas (modo de
produzir energia utilizando a luz solar, liberando oxigênio). Surgiram no planeta há 3,5 bilhões de anos,
sendo, portanto foram os primeiros organismos a produzirem oxigênio na atmosfera. Podem ocorrer em
ambientes marinhos e estuarinos, mas predominam em água doce. Nestes ambientes, apresentam ampla
diversidade de formas devido às suas adaptações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas adquiridas
durante a sua história evolutiva. As cianotoxinas são produtos naturais tóxicos produzidos por esses
microrganismos, cujas causas ainda não foram devidamente esclarecidas, sendo sua síntese geneticamente
determinada. Os principais mecanismos de toxicidade das cianotoxinas são: neurotóxicos (produzem
danos ao sistema nervoso), hepatotóxicos (danos ao fígado, aparecimento de tumores) e dermatotóxicos
(irritantes ao contato com a pele). As cianotoxinas de maior ocorrência no semi-árido potiguar são
microcistinas, seguidas de saxitoxinas. As microcistinas responsáveis por intoxicações agudas ou
crônicas, podendo causar hepatotoxidade (diarréia, cólicas e hemorragia no fígado) e câncer hepático. As
saxitoxinas são um grupo de neurotoxinas cujos sintomas de intoxicação humana incluem tontura,
adormecimento da boca e extremidades, fraqueza muscular, náusea, vômito e taquicardia. Cianotoxinas
não são inativadas pela fervura e quando suas células são quebradas por ação de algicidas e/ou cloro
(substâncias químicas que matam algas), liberam a toxina na água. Por este motivo, a legislação
brasileira proíbe o uso de algicidas em águas de abastecimento humano com florações. (VEJA MAIS
EM: CARMICHAEL 2001 e AZEVEDO 1998).
Agradecimentos: FAPERN/CNPq pela bolsa de pesquisa. A UFRN pelo apoio concedido. A UNP pela realização dos bioensaios
em camundongos. A Dra. Sandra Azevedo/UFRJ e ao Dr. Ernani Pinto/ USP pelo apoio e realização das análises de cianotoxinas e a
CAERN pelo apoio em algumas coletas.
87
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