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Universidade de São Paulo
FFCLRP - Departamento de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada
A invasão da água doce pelos crustáceos: o papel dos processos
osmorregulatórios
Alessandra Silva Augusto
Orientador: Prof. Dr. John Campbell McNamara
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para a obtenção do
título de Doutora em Ciências, Área: Biologi
a
Comparada
RIBEIRÃO PRETO - SP
2005
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“A compreensão do funcionamento dos
organismos vivos é ajudada enormemente
pelo uso de uma abordagem comparativa.
Comparando-se diferentes animais e
examinando-se a solução encontrada para
o problema da sobrevivência, dentro das
restrições impostas pelo ambiente,
penetra-se em princípios gerais que, de
outra forma, permaneceriam obscuros.
Assim, uma abordagem comparativa e
ambiental permite uma compreensão mais
profunda da fisiologia”
Knut Schmidt-Nielsen
Aos meus pais, Imaculada e José Augusto
Ao meu irmão, Guto
Ao André
Ao Prof. John
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Agradecimentos
Ao meu orientador Prof. Dr. John Campbell McNamara por me oferecer toda a
formação necessária para que eu me tornasse uma bacharel, uma mestre e, agora, uma
doutora.
Ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto-USP na pessoa de seu chefe Prof. Dr. Evandro Camilo.
Ao programa de pós-graduação em Ciências, área Biologia Comparada, na pessoa
de seu coordenador Prof. Dr. John Campbell McNamara.
A Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão
de uma bolsa de doutorado e reserva técnica (processo 01/00576-2) na pessoa de seu diretor
científico Prof. Dr. José Fernando Perez.
Ao Centro de Biologia Marinha (CEBIMar) da USP na pessoa de sua diretora Profa.
Dra. Eleonora Trajano pelo alojamento e acondicionamento dos camarões Palaemon
northropi em São Sebastião, litoral norte do Estado de São Paulo.
Ao Prof. Dr. Lewis Joel Greene por ceder o Centro de Química de Proteínas da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP para as análises de aminoácidos livres por
aparelho de HPLC. Também, a Dra. Helen Julie Laure pela amizade e auxílio na operação
deste aparelho.
Ás colegas do Centro de Química de Proteínas: Vanessa, Solange, Regina, Maria
Helena e Alana pela companhia durante as medições dos aminoácidos livres.
Á Profa. Dra. Rosa Furriel pela assessoria dos meus relatórios científicos da Capes
e pelas valiosas sugestões que aperfeiçoaram meu trabalho e minha formação.
À minha grande amiga e técnica do Laboratório de Fisiologia de Crustáceos, Susie
Keico, pelo apoio incondicional em todos os momentos.
À Profa. Dra. Márcia Salomão Melis pela acolhida em seu laboratório: mais uma
grande amiga.
Ao Sr. Lippe, motorista da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto-USP, por nos
conduzir durante as coletas de crustáceos, sua paciência e disponibilidade tornaram mais
amenas as cansativas coletas de campo.
Aos amigos da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP:
Nina, Fernanda Bell, Elaine Ribeiro, Álvaro, Renata Tardivo, Idalina, Renata Andrade e
Miriam pelas agradáveis conversas durante esses anos de pesquisa.
À Profa. Dra. Marisa Barbieri pela orientação extra-oficial sobre a importância da
Educação na carreira científica.
Aos inseparáveis amigos: Lys, Dani Marconato, Estevão, Regiane, Fernanda
Barbosa, Ricardo Marques, Thiago.
À minha avó Ló, por ser a primeira pessoa a acreditar em mim.
À minha mãe Imaculada, meu pai José Augusto e meu irmão Guto: Minha Eterna
Família.
Ao André Perticarrari: meu Amigo e meu Amor, por toda a vida...
À Deus: que além da formação científica me permitiu ao longo destes anos ganhar
tantos Amigos Verdadadeiros. Obrigada.
SUMÁRIO
1. Resumo, 1
2. Abstract, 5
3. Introdução, 7
3.1 Os mecanismos de osmorregulação em crustáceos, 8
3.2 Os mecanismos de osmorregulação durante a ontogênese de crustáceos, 12
3.3 Adaptações relacionadas à invasão da água doce, 14
3.4 Apresentação do presente trabalho, 17
3.5 O camarão de poças de maré Palaemon northropi, 18
3.6 Macrobrachium amazonicum: um camarão neotropical de águas interiores e
estuarinas, 19
3.7 O caranguejo Dilocarcinus pagei: um antigo invasor da água doce, 20
3.8 Objetivos e contribuição do presente trabalho para a compreensão da invasão da
água doce pelos crustáceos, 21
4. Materiais & Métodos, 23
4.1 Coleta dos animais, 23
4.2 Obtenção dos Estágios Ontogenéticos de Macrobrachium amazonicum e
Dilocarcinus pagei, 24
4.3 Exposição de espécimes adultos de Palaemon northropi, M. amazonicum e D. pagei
a diferentes salinidades, 26
4.4 Obtenção da hemolinfa e dissecção dos tecidos de P. northropi, M. amazonicum e
D. pagei, 29
4.5 Medida do grau de hidratação de estágios ontogenéticos selecionados dos camarões
P. northropi e M. amazonicum e do caranguejo D. pagei, 30
4.6 Preparação dos homogeneizados para análise dos aminoácidos livres, 30
4.7 Análise qualitativa e quantitativa dos aminoácidos livres por HPLC, 31
4.8 Medida da osmolalidade e concentrações de Na
+
e Cl
-
da hemolinfa ou urina, 32
4.9 Análises Estatísticas, 32
5. Resultados
5.1 Palaemon northropi, 34
5.1.1 Mortalidade de adultos após exposição a diferentes salinidades, 34
5.1.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória, 34
5.1.3 Grau de hidratação, 37
5.1.4 Concentração de aminoácidos livres nos tecidos e hemolinfa de adultos, 38
5.2 Macrobrachium amazonicum, 48
5.2.1 Mortalidade de estágios ontogenéticos selecionados após exposição a diferentes
salinidades, 48
5.2.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória, 48
5.2.3 Grau de hidratação em embriões, zoeas I, zoeas II e tecidos de adultos, 52
5.2.4 Concentração de aminoáciods livres em embriões, zoeas I, zoeas II e tecidos e
hemolinfa de adultos, 55
5.3 Dilocarcinus pagei, 71
5.3.1 Mortalidade de estágios ontogenéticos selecionados, 71
5.3.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória, 71
5.3.3 Avaliação da osmolalidade e dos íons sódio e cloreto na urina, 75
5.3.4 Grau de hidratação em embriões, juvenis e tecidos e hemolinfa, 77
5.3.5 Concentração de aminoácidos livres em embriões, juvenis e tecidos e hemolinfa
de adultos, 80
6. Discussão
6.1 Processos osmorregulatórios em uma espécie basal: o camarão entre-marés
Palaemon northropi, 93
6.2 Processos osmorregulatórios em um decápodo recente invasor da água doce: o
camarão Macrobrachium amazonicum, 101
6.3 Processos osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei: um antigo invasor
da água doce, 111
7. Discussão Integrada, 123
8. Referências Bibliográficas, 130
1. RESUMO
Os crustáceos decápodos são animais essencialmente marinhos e poucos estão
completamente adaptados à água doce, embora os lagostins da superfamília Astacoidea e
Parastacoidea, os caranguejos Potamoidea e Trychodactylidae e alguns camarões Caridea
tornaram-se completamente independentes da água salobra.
Os crustáceos que invadem meios diluídos se confrontam com vários problemas,
sendo que o principal deles é a tendência ao influxo de água por osmose e o efluxo de sal
por difusão através das superfícies corpóreas, comprometendo a estabilidade do volume e
composição dos fluidos corporais. As adaptações fisiológicas que permitiram a conquista
da água doce pelos diferentes grupos de crustáceos incluem a) redução da permeabilidade;
b) eficientes mecanismos de absorção de sal pelo epitélio branquial compensando a perda
difusiva para o meio externo; c) produção de urina hiposmótica ou isosmótica com
reduzido fluxo pelas glândulas antenais; e e) regulação do volume intracelular através de
efetores osmóticos orgânicos pelas espécies recentes invasoras que migram para a água
salobra para completar seu ciclo de vida. Embora a capacidade de hiperosmorregular a
osmolalidade da hemolinfa seja fator primordial para a invasão da água doce, a completa
independência da água salobra é conquistada por aquelas espécies em que todos os seus
estágios de desenvolvimento são capazes de sobreviver e se desenvolver no biótopo
dulcícola.
Neste trabalho objetivou-se avaliar os processos fisiológicos de osmorregulação em
três espécies de decápodos com diferentes graus de dependência da água salobra e
relacioná-los quanto às características osmorregulatórias que permitiram a invasão da água
doce pelos crustáceos. Assim, foram investigadas as seguintes espécies: a) o palaemonídeo
Palaemon northropi, um camarão encontrado no infralitoral marinho e em poças de maré
que enfrenta diariamente em seu habitat amplas variações de salinidade, sendo descrito
como um forte osmorregulador nessas condições; b) o camarão Macrobrachium
amazonicum, um palaemonideo com vasta distribuição neotropical, ocupando desde águas
interiores distantes do mar até estuarinas; e c) o caranguejo braquiuro Dilocarcinus pagei,
uma espécie hololimnética que completa todo seu ciclo de vida na água doce com marcante
desenvolvimento abreviado.
Assim, avaliou-se a taxa de mortalidade, capacidade osmo- e ionorregulatória da
hemolinfa, grau de hidratação dos tecidos e o papel dos aminoácidos livres como efetores
osmóticos orgânicos do processo de regulação do volume celular em P. northopi, M.
amazonicum e D. pagei adultos expostos a meios de diferentes salinidades. No camarão M.
amazonicum e no caranguejo D. pagei também avaliou-se o grau de hidratação e a
concentração de aminoácidos livres em selecionados estágios embrionários e pós-
embrionários. A osmolalidade e a concentração de sal na urina de D. pagei também foi
avaliada após exposição à água salobra de 25‰.
O camarão P. northropi mostrou-se o mais eficiente osmo- e ionorregulador dentre
as espécies estudadas, regulando sua hemolinfa em salinidades que variam de 5 a 45‰,
condizentemente com o ambiente de estirâncio que habita. No entanto, não possui
mecanismos de absorção de sal eficientes para permitir sua sobrevivência em água doce,
morrendo após duas horas nessa salinidade. A eficiente capacidade osmorregulatória de P.
northropi se reflete na redução do papel dos aminoácidos livres na regulação do volume
celular nesta espécie, visto que somente o tecido muscular apresentou alteração na
concentração desses osmólitos após exposição a meio hiposmótico de 5‰.
O camarão M. amazonicum parece estar em pleno processo de invasão da água
doce. Embora os espécimes adultos tenham demonstrado boa adpatação à água doce e forte
capacidade osmo- e ionorregulatória da hemolinfa, as zoeas I e II da população aqui
estudada não sobrevivem mais que duas horas nessa salinidade. Adicionalmente, os
embriões, zoeas e tecidos do camarão adulto possuem uma elevada concentração de
aminoácidos livres em relação a vários crustáceos dulcícolas, típica de espécies diádromas
como o camarão M. olfersii (Augusto, 2000). Os achados aqui sobre M. amazonicum são
consistentes, visto que características de crustáceos marinhos/estuarinos podem ser
esperadas nesta espécie que ainda possui populações de água salobra ou dependentes desta
para completar seu ciclo de vida. A exposição de M. amazonicum à água salobra de 25‰
causou um aumento na concentração dos aminoácidos livres nos tecidos muscular e
branquial. Os embriões e zoeas II não tiveram sua concentraçãpo de aminoácidos livres
alteradas após exposição à água salobra, sugerindo que os embriões possam ser
osmoticamente bem protegidos pelas membranas embrionárias e que as zoeas II podem ter
desenvolvido estruturas osmorregulatórias responsáveis pela eficiente regulação da
osmolalidade da hemolinfa. As zoeas I apresentaram um aumento de 42% na concentração
total de aminoácidos livres, sugerindo que nesta fase, ao contrário das zoeas II, as estruturas
relacionadas a osmorregulação como brânquias ou branquiostegitos podem ainda não estar
completamente formadas.
O caranguejo dulcícola D. pagei mostrou-se um eficiente osmo- e ionorregulador da
osmolalidade da hemolinfa e capaz de se adaptar a salinidades mais elevadas, visto que,
embora apresente mortalidade a partir de 25‰, sobreviveu por até dois dias em água do
mar (35‰). Semelhantemente a maioria dos caranguejos dulcícolas, D. pagei excreta urina
isosmótica à hemolinfa. Adicionalmente, parece utilizar tanto os mecanismos de regulação
da osmolidade da hemolinfa, quanto os mecanismos de regulação do volume celuar, visto o
aumento apresentado na concentração de aminoácidos livres nos tecidos muscular e
nervoso, além da hemolinfa. Os aminoácidos livres também constituem importantes
osmólitos da regulação do volume celular nos embriões de D. pagei, visto seu aumento de
quase 100% após exposição à água salobra. Esse aumento sugere que as membranas
embrionárias de D. pagei ofereçam proteção osmótica parcial aos embriões e que estes
ainda não possuam eficientes mecanismos de regulação do seu fluido extracelular.
Dilocarcinus pagei pode ser vista como uma espécie verdadeiramente dulcícola, visto a
independência da água salobra para completar seu ciclo de vida e a reduzida osmolalidade
da hemolinfa e concentração de aminoácidos livres intracelulares em relação a vários outros
crustáceos de água doce.
Os aminoácidos livres osmoticamente importantes foram os mesmos em embriões,
zoeas, juvenis e adultos das espécies estudadas, semelhantemente aos demais crustáceos
citados na literatura. Os aminoácidos glicina, prolina, alanina e arginina são os principais
efetores osmóticos de P. northropi, M. amazonicum e D. pagei e constituem cerca de 40 a
60% da concentração total, indicando que o predomínio destes aminoácidos livres seja um
padrão em crustáceos, independentemente do estágio ontogenético ou habitat ocupado.
Finalmente, a concentração de aminoácidos livres no tecido muscular mostrou-se
como um bom parâmetro para se medir o grau de invasão das espécies na água doce, visto
que sua concentração foi maior na espécie marinha/entre-marés P. northropi, intermediária
na espécie diádroma M. amazonicum e, reduzida, no caranguejo antigo invasor da água
doce D. pagei.
Os resultados aqui apresentados contribuem para a compreensão da invasão da água
doce pelos crustáceos, fornecendo dados a respeito das adaptações fisiológicos relacionadas
à conquista deste biótopo. Adicionalmente, sugere que futuros estudos comparativos que
investiguem os diferentes mecanismos fisiológicos, acrescido de avaliações moleculares e
filogenéticas, poderão trazer resultados ainda mais conclusivos sobre a curiosa e recente
conquista da água doce pelos crustáceos.
2. Abstract
Decapods crustaceans are essentially marine animals and very few among them,
mainly crayfish (superfamilies Astacoidea and Parastacoidea) along with Potamoidea and
Trichodactylidae crabs and few Caridea shrimps are fully adapted to freshwater where they
spend their entire life cycle.
All crustaceans which live in dilute media are confronted with an essential problem:
the passive influx of water and efflux of salt across permeable body surfaces, leading to an
increase in the volume of their body fluid and a decrease in its osmotic concentration.
These problems have been solved through four main adaptive physiological mechanisms,
including 1) salt reabsorption mechanisms, 2) hiposmotic urine or low rate of isosmotic
urine production, 3) reduction of surface permeability, and 4) control of the intracellular
concentration of osmotic effectors, mainly free amino acids.
The osmoregulatory processes have been extensively studied in adult crustaceans at
the extracellular (Towle, 1981; Onken et al., 1995; McNamara & Lima, 1997) and
intracellular levels (Tan & Choong, 1981; Gilles & Péqueux, 1983; Wilder et al., 2001;
McNamara et al., 2004).
The present study evaluates osmotic; sodium, chloride regulatory patterns, tissues
hydration, and free amino acids (FAA) pools in various tissues and hemolymph of the
selected ontogenetics stages in three crustaceans species: a) Palaemon northropi, that
inhabits rocky tide pools, and are frequently confronted by reduced and elevated salinities;
b) Macrobrachium amazonicum, that depends on brackish water to complete larval
development; and c) the hololimnetic crab Dilocarcinus pagei.
The intertidal shrimp, P. northropi, exhibits well-developed hyper/hypo-osmotic,
sodium and chloride regulatory capabilities in saline medium (5, 20 or 45‰) by 5 days.
During acclimation to 5‰, total FAA in the muscle decrease by 63%. In gill and nervous
tissues, there were no changes in FAA titers, attesting to the predominant role played by the
mechanisms of anisosmotic extracellular regulation that maintain hemolymph osmolality,
buffering cells against volume changes, leading to a decrease dependency on FAA as the
primary effectors of cell volume regulation.
While cinnamon shrimps appear to be well adapted to the freshwater biotope, the
larval phases (zoeae I and II) do not survive in freshwater and are still largely dependent on
brackish water. The increase in FAA concentrations in the muscle, gill and zoeae I in dilute
seawater (25‰) suggests that FAA are involved in the regulation of the cell volume. The
increase in these organic solutes may be related to an increase in intracellular synthesis or
an influx of these osmotic effectors from the hemolymph.
The freshwater crab D. pagei is hyperosmotic regulators in freshwater and low
salinities (5-24‰) while at high salinities (25-35‰) it is hypoconformers. Like the
freshwater Macrura, D. pagei does not have the ability to produce dilute urine. The increase
in FAA concentrations in the muscle, nervous and embryos in dilute seawater (25‰)
suggests that FAA are involved in the regulation of the cell volume.
In this study, the decrease in total FAA concentration in M. amazonicum and D.
pagei, was in agreement with the general observations made in crustaceans that have
invaded freshwater. This study suggests differential degrees of adaptation to a dilute
seawater existence among the species examined, confirming the hypothesis that M.
amazonicum and P. northropi are still in the process of invading the dilute environment.
3. INTRODUÇÃO
De forma simplificada, os seres vivos podem ser descritos como uma solução
aquosa envolta por uma membrana, a superfície do corpo. O volume do organismo e a
concentraçao dos solutos são usualmente mantidos dentro de limites bastantes estreitos,
visto que o funcionamento ótimo de um animal requer uma composição relativamente
constante e bem definida de seus fluidos corporais, e desvios substanciais são geralmente
incompatíveis com a vida (Schmidt-Nielsen, 1996).
Os crustáceos são artrópodos essencialmente marinhos, uma vez que a grande
maioria das espécies conhecidas vive no mar. Eles são dominantes no plâncton marinho,
assim como no plâncton dulcícola, e estão entre os três ou quatro grupos mais importantes
do bentos, tanto em relação às espécies macroscópicas quanto às intersticiais; além disso,
muitas espécies são parasitas (Barnes et al., 1995). Já foram descritas cerca de 52.000
espécies de crustáceos (Martin & Davis, 2001).
Entre os aproximadamente trinta filos animais, todos originários no mar, dezesseis
invadiram a água doce, enquanto somente sete invadiram o ambiente terrestre (Lee & Bell,
1999). Os crustáceos ancestrais surgiram no mar a aproximadamente 600 milhões de anos
(Barnes, 1990), sendo que a invasão na água doce pelos decápodos iniciou-se há cerca de
3,4 milhões de anos, no Terciário (Schubart et al., 1998). Na verdade, entre o meio
dulcícola e o marinho existe uma barreira osmótica e iônica que poucas espécies são
capazes de enfretar. Durante a evolução, vários grupos de crustáceos enfrentaram o desafio
de invadir ambientes com salinidades menores que a da água do mar, desde o estuário até a
água doce.
A transição do ambiente marinho para o dulcícola pelos diferentes grupos de
crustáceos constitui um grande desafio osmótico e iônico visto que na água doce, um meio
hiposmótico em relação aos fluidos corporais dos animais, os gastos energéticos com a
osmorregulação são geralmente maiores que no mar ou estuário onde os gradientes são
menores. A capacidade dos crustáceos tornarem-se totalmente independentes da água
salobra deve-se essencialmente a dois tipos de adaptações: a) eficientes mecanismos de
hiperosmorregulação e b) independência dos seus estágios ontogenéticos da água salobra
(Schubart & Diesel, 1998).
A invasão na água doce pelos crustáceos tem envolvido a seleção de um conjunto de
adaptações fisiológicas, morfológicas, bioquímicas, comportamentais e ecológicas que têm
atuado em conjunto assegurando a ocupação e a exploração da água doce por esse grupo de
artrópodos.
3.1 Os mecanismos de osmorregulação em crustáceos
Os crustáceos apresentam inúmeros padrões de regulação osmótica (Prosser, 1973).
Em relação à capacidade de sobreviver em diferentes salinidades, os crustáceos podem ser
classificados desde estenoalinos, tolerando apenas pequena variação na salinidade do meio
externo, até eurialinos, capazes de tolerar amplas alterações. Os limites de distribuição das
espécies nos diferentes ambientes são parcialmente determinados pela sua capacidade de
tolerar alterações na salinidade do meio externo. Assim, quanto mais eurialina for uma
espécie, maior a sua propensão evolutiva de ter membros que tenham ocupado e invadido
uma variedade de habitats (Lee & Bell, 1999).
A relação entre a osmolalidade da hemolinfa e a do meio externo após exposição a
uma determinada salinidade é frequentemente expressa em termos de osmoconformidade e
de osmorregulação. Nos crustáceos osmoconformadores, a concentração osmótica da
hemolinfa segue aquela do meio externo, enquanto nos osmorreguladores a concentração
osmótica da hemolinfa é mantida entre certos limites de forma espécie-específicas. Por
exemplo, uma espécie pode ser capaz de regular a osmolaliade da sua hemolinfa até uma
determinada salinidade, mas tornar-se osmoconformadora após expor-se a salinidades
muito diferentes daquela do seu ambiente natural.
A regulação osmótica e iônica nos crustáceos é constituída por dois processos
distintos: a Regulação Anisosmótica Extracelular (RAE), responsável pela manutenção da
osmolalidade e composição da hemolinfa, e a Regulação Isosmótica Intracelular (RII),
responsável pelo manutenção do volume e composição do meio intracelular. Na verdade,
quanto mais eficiente a RAE, menor a varição da osmolalidade da hemolinfa e,
consequentemente, maior a proteção das células e tecidos à variações no volume, reduzindo
o papel dos mecanismos de RII.
A RAE é efetuada através de alterações na permeabilidade das superfícies do corpo
à íons e água, e por mecanismos ativos de absorção (em meio hiposmótico) ou secreção de
sal (em meio hiperosmótico) localizados nos epitélios de interface entre o organismo e o
meio externo, como nas brânquias e glândulas antenais (Mantel & Farmer, 1983).
Os tecidos epiteliais são altamente especializados com polarização anatômica e
funcional, sendo que a superfície apical faceia o meio externo, enquanto a superfície basal
faceia o meio interno contendo o fluido extracelular. As células especializadas no transporte
iônico ativo são caracterizadas principalmente por microvilos apicais e invaginações basais
associadas a numerosas mitocôndrias, as quais estão relacionadas ao fornecimento de ATP
para o funcionamento enzimático (Mantel & Farmer, 1983; Péqueux, 1995). Os
mecanismos de RAE são intermediados por várias enzimas como a Na
+
/K
+
-ATP-ase, V-
ATPase e anidrase carbônica (Péqueux et al., 1988; Shetlar & Towle, 1989; Péqueux, 1995;
Onken & Putzenlechner, 1996; McNamara & Torres, 1999; Weihrauch et al., 2004).
As brânquias são constituídas por uma camada simples de células epiteliais, cuja
superfície basal é banhada por uma lacuna de hemolinfa. Esta camada epitelial pode ser
fina (células de 1 a 2 µm) ou espessa (células de 10 a 20 µm); o epitélio fino está
relacionado à função respiratória e o epitélio espesso ao transporte de íons e água. Outros
tipos de células, incluindo células pilares, nefrócitos e axônios também podem estar
presentes. A estrutura básica das brânquias inclui células que são separadas da hemolinfa
por uma membrana no lado basal e coberta por uma cutícula no lado apical. A superfície
baso-lateral possui invaginações associadas a numerosas mitocôndrias, enquanto a
superfície apical é normalmente composta por canais e microvilos (Mantel & Farmer,
1983).
Embora as brânquias sejam consideradas o principal órgão responsável pelo
controle da osmolalidade da hemolinfa em crustáceos aquáticos, a glândula antenal, órgão
renal dos crustáceos, também exerce importante papel na manutenção do volume e
composição de solutos. As glândulas antenais pareadas estão localizadas adjacentes às
antenas, cada uma consistindo de um saco terminal, labirinto, canal nefridial e bexiga
(Barnes, 1990). Os poros excretores abrem-se na superfície inferior das bases das segundas
antenas. O filtrado inicial que entra na glândula antenal é isosmótico à hemolinfa e
modificações por processos de reabsorção e secreção tubular ocorrem através da passagem
deste filtrado pela glândula antenal (Mantel & Farmer, 1983).
A maioria dos crustáceos, inclusive as espécies dulcícolas e terrestres, prduzem
urina isomótica à hemolinfa, embora a glândula antenal dos lagostins seja capaz de produzir
urina hiposmótica (Lockwood, 1977; Mantel & Farmer, 1983; Sarver et al., 1994). Esta
habilidade tem sido relacionada à presença de um alongado segmento tubular que pode ser
diferenciado em regiões proximal e distal (Mantel & Farmer, 1983).
A hemolinfa funciona como um tampão contra alterações no volume intracelular.
Quando os mecanismo de regulação da osmolalidade da hemolinfa são eficazes o suficiente
para mantê-la dentro de variações estreitas, as células e tecidos ficam protegidos contra
alterações na sua composição e volume. No entanto, quando estes mecanismos de regulação
não são tão eficientes, o meio intracelular fica sujeito a variações, sendo requisitados os
mecanismos de RII. Na verdade, os mecanismos de controle do volume celular são mais
efetivos nos animais osmoconformadores por estarem suscetíveis a maiores variações na
osmolalidade da hemolinfa e, portanto, a variações na composição e volume celular. Esse
pode ser o caso de crustáceos que estão sujeitos a variações ambientais de salinidade, como
os habitantes de estuários, ou aqueles que apresentam comportamento migratório entre a
água doce e a salobra como parte do seu ciclo de vida.
A RII é constituída pelo ajuste do nível intracelular de efetores osmóticos como
peptídeos, aminoácidos livres, K
+
e Ca
2+
. Embora as alterações do volume celular resultem
principalmente do movimento rápido de íons inorgânicos e água, a limitação e a
recuperação do volume intracelular se baseam principalmente em moléculas orgânicas.
Acontece que a concentração de cátions como o Na
+
e o K
+
têm um efeito perturbador sobre
a ação de enzimas metabólicas, e alterações substanciais nas suas concentrações podem
levar a desarranjos no metabolismo celular (Schmidt-Nielsen, 1996). Entretanto, a atividade
enzimática não é afetada por alterações na concentração de determinados aminoácidos livres
como a glicina, a prolina e a alanina, embora a lisina e a arginina tenham ação perturbadora
sobre certas reações enzimáticas.
O processo de regulação do volume intracelular possui duas fases: uma de limitação,
e outra de reajuste do volume. O processo de limitação do volume ocorre a curto prazo
sendo realizado frequentemente por efetores osmóticos inorgânicos, principalmente o K
+
.
Alterações na atividade intracelular do K
+
têm sido observadas durante exposição a meios
hipo- ou hiperosmótico em células de vários vertebrados e invertebrados (Rorive & Gilles,
1979; Trischitta et al., 2005). É sugerido que estas variações possam estar envolvidas na
limitação do volume da célula, visto que ocorre somente durante a fase de inchamento ou
murchamento, e não durante a fase de reajuste do volume celular. Em contraste, o processo
de recuperação do volume é realizado principalmente por efetores osmóticos orgânicos,
frequentemente os aminoácidos livres. Diante de alterações da salinidade do meio externo
do organismo, a variação na concentração desses efetores intracelulares mantém o meio
intracelular isosmótico com o meio extracelular circundante (Kévers et al., 1979a, b; Gilles,
1974, 1975, 1979).
São três os possíveis mecanismos de controle da concentração de aminoácidos livres
intracelulares (Figura 1):
1) alteração na taxa de síntese e oxidação destes compostos (Gilles, 77; Bishop &
Burton, 1993);
2) deslocamento do equilíbrio entre o influxo e o efluxo de aminoácidos que
atravessam a membrana plasmática (Fugelli, 1980; Tan & Choong, 1981);
3) alteração do equilíbrio entre a síntese e o catabolismo de proteínas (Boone &
Schoffeniels, 1979).
Figura 1. Mecanismos de alteração na concentração de aminoácidos livres intracelulares
(AAL) em meios hipo- e hiperosmótico. A: Mecanismo de redução do volume celular
através da diminuição da concentração dos aminoácidos livres intracelulares: 1) redução na
1) síntese AAL
2) AAL Proteínas
3)
Célula
Hemolinfa
AAL
1) síntese AAL
2) Proteínas AAL
3)
Célula
Hemolinfa
Proteínas AAL
A) Regulação Isosmótica Intracelular em meio hiposmótico B) Regulação Isosmótica Intracelular em meio hiperosmótico
taxa de síntese; 2) aumento da síntese de proteínas intracelulares; 3) efluxo para a
hemolina. B: Mecanismo de aumento do volume celular através do aumento na
concentração de aminoácidos livres intracelulares: 1) aumento na taxa de síntese 2)
aumento do catabolismo de proteínas intracelulares; 3) influxo a partir da hemolinfa Fonte:
Gilles & Péqueux, 1981.
Um fênomeno de ocorrência geral entre crustáceos aclimatados é a participação dos
aminoácidos livres não-essenciais no controle do volume celular. Os aminoácidos valina,
isoleucina, leucina, lisina, histidina, fenilalanina, treonina, arginina, metionina e triptofano
são considerados aminoácidos essenciais e estão presentes em baixas concentrações nos
crustáceos (Prosser, 1973). Os demais funcionam como osmólitos orgânicos do processo de
regulação do volume celular em diferentes tecidos e estágios ontogenéticos de crustáceos
decápodos (Claybrook, 1983; Charmantier; 1998, Augusto, 2000; McNamara et al., 2004).
3.2 Os mecanismos de osmorregulação durante a ontogênese de crustáceos
Embora a capacidade de hiperregular a osmolalidade da hemolinfa seja fator
primordial para a invasão da água doce, a completa independência da água salobra só é
realmente conquistada pelas espécies capazes de completar todo o seu ciclo de vida neste
biótopo.
Embora os crustáceos decápodos sejam na sua maioria animais marinhos, alguns
camarões carídeos, as lagostas da superfamília Astacoidea e Parastacoidea, e os
caranguejos da infra-ordem Potamoidea e da família Trichodactylidae (Magalhães, 1991)
tornaram-se totalmente independentes da água salobra e possuem um ciclo de vida que se
desenvolve completamente na água doce. No entanto, ainda há muitas espécies que estão
em pleno processo de invasão do ambiente limnético e isto pode ser verificado pela
dependência da água salobra por alguns dos seus estágios ontogenéticos. Dentre os
crustáceos são observadas tanto espécies adultas que migram para se reproduzir em águas
mais concentradas [M. rosenbergii (Tan & Choong, 1981), M. acanthurus (Choudhury,
1970) e E. sinensis (Péqueux, 1995)], quanto espécies que se reproduzem na água doce,
embora seus estágios larvais migrem para a água salobra até se desenvolverem
completamente [M. olfersii (Dugger & Dobkin, 1975) e M. petersii (Read, 1982)].
Durante a ontogênese dos crustáceos parece haver três padrões básicos de
osmorregulação (revisão, Charmantier, 1998):
1) nenhuma alteração na capacidade osmorregulatória acompanha a metamorfose, e
a osmorregulação varia pouco com o desenvolvimento [caranguejos marinhos Libinia
emarginata (Kalber, 1970) e Chionoecetes opilio (Charmantier & Charmantier-Daures,
1991)];
2) o tipo de osmorregulação é estabelecido no primeiro estágio pós-embrionário
[Artemia salina e várias espécies de Cladocera (Conte et al., 1972; Conte, 1984),
Macrobrachium petersi (Read, 1984), Palaemonetes argentinus (Charmantier & Anger,
1999) e Astacus leptodactylus (Susanto & Charmantier, 2001)];
3) a metamorfose marca o surgimento do tipo de osmorregulação do adulto
[Penaeus japonicus (Charmantier et al., 1988), Homarus americanus, H. gammarus (Thuet
et al., 1988), Sesarma curacaoense (Anger & Charmantier, 2000) e Carcinus maenas
(Cieluch et al., 2004)].
Durante o desenvolvimento, os embriões dos crustáceos são envolvidos pelo cório
(composto por uma membrana externa e outra interna), pela membrana vitelínica e pela
membrana embrionária (Stromberg, 1972). Estes embriões podem ser submetidos a
variações de salinidade do meio circundante, sem que isto necessariamente prejudique seu
desenvolvimento (revisão, Charmantier, 1998). Nas espécies em que o ovo fertilizado fica
exposto ao meio externo, o embrião pode ser osmoticamente protegido pelas membranas do
ovo (H. americanus, Cancer irroratus) ou adquirir capacidade osmorregulatória (A. salina).
Quando os embriões são incubados internamente, são osmoticamente protegidos, mas
podem tornar-se capazes de osmorregular (Cladocera) (Charmantier, 1998; Susanto &
Charmantier, 2001).
No entanto, embora as membranas embrionárias ofereçam proteção osmótica aos
embriões, a osmolalidade do fluido extracelular destes pode sofrer variações diante de
flutuações da salinidade do meio externo, sendo requisitado um mecanismo de regulação de
volume das células embrionárias, uma área quase desconhecida na literatura sobre a
ontogênese da osmorregulação em crustáceos (Charmantier, 1998, Augusto, 2000).
3.3 Adaptações relacionadas à invasão da água doce
A invasão da água doce pelos crustáceos ocorre em função da seleção de um
conjunto de adaptações fisiológicas (alteração da permeabiliadade corporal, absorção de sal
pelas brânquias, reabsorção de sal e excreção de água pela glândula antenal, alteração da
concentração de efeteres osmóticos intracelulares), morfológicas (estrutura branquial),
bioquímicas (aumento ou redução da atividade de enzimas ionotransportadoras),
reprodutivas (desenvolvimento larval abreviado) e comportamentais (migração entre a água
doce e salobra). Embora a invasão da água doce esteja associada a mecanismos com
consideráveis gastos energéticos, estes gastos são compensados pela capacidade de
exploração de um novo ambiente.
A hiperregulação da osmolalidade da hemolinfa constitui o mais importante
mecanismo que permitiu a invasão da água doce, pois compensa a constante perda passiva
de íons e o ganho osmótico de água, mantendo a osmolalidade da hemolinfa maior que a do
meio externo. A hiperosmorregulação se dá por mecanismos de RAE, principalmente
através da absorção de sal por epitélios especializados branquiais, o qual é intermediado
pela ação de enzimas ionotransportadoras como a Na
+
/K
+
-ATPase, V-ATPase e anidrase
carbônica.
As células branquiais de crustáceos que vivem em meios diluídos apresentam
numerosas invaginações da membrana plasmática na sua região basal que aumentam a
superfície de contato com a hemolinfa. Nestas invaginações estão localizadas enzimas
transportadoras de íons. Em crustáceos mantidos em meios hiposmóticos a Na
+
/K
+
-ATPase
promove o transporte do Na
+
intracelular para a hemolinfa, gerando um gradiente para sua
entrada apical através de canais e trocadores específicos (Greger & Kunzelmann, 1990;
Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998; Weihrauch et al., 2004). Uma importante parte
do influxo de Na
+
ainda é acoplada ao efluxo de NH
4
por um antiporter Na
+
/NH
4.
A enzima
citosólica anidrase carbônica cataliza a formação de íons H
+
e HCO
3
-
a partir da hidratação
do CO
2
metabólico, ocasionando uma intensa troca apical de Na
+
por H
+
e de Cl
-
por HCO
3
-
(Henry, 1988) (Figura 2). O influxo de Cl
-
também pode ocorrer de forma passiva junto
com Na
+
(Mantel & Farmer, 1983).
Figura 2: Mecanismo de absorção de sal pelas brânquias em meio hiposmótico. Entrada
baso-lateral de NH
3
e sua reação com um próton formando NH
4
+
,
o qual é trocado por Na
+
.
A anidrase carbônica cataliza a hidratação do CO
2
e a formação de HCO
3
-
e H
+
,
os quais são
trocados apicalmente por Cl
-
e Na
+
, respectivamente. A enzima Na
+
/K
+
-ATPase troca três
íons Na
+
intracelulares por dois íons K
+
extracelulares, gerando um gradiente eletroquímico
para o transporte ativo de Na
+
do meio externo para a hemolinfa. Fonte: Randall et al.,
1997.
Um maior grau de adaptação à água doce é encontrado em crustáceos com reduzida
osmolalidade da hemolinfa, o que diminui o gradiente entre este fluido do animal e o meio
externo e, consequentemente, a perda difusiva de sal e o influxo osmótico de água. O ponto
de equilíbrio entre a osmolalidade do meio externo e da hemolinfa é conhecido como ponto
isosmótico e também reflete o grau de adaptação osmótica à água doce visto que as
espécies mais limnéticas se equilibram com o meio externo em salinidades mais baixas.
A redução da permeabilidade da superfície corpórea à água e íons é um importante
mecanismo de adaptação em crustáceos dulcícolas pois permite a redução do fluxo passivo,
reduzindo consequentemente os gastos energéticos necessários à compensação de sal
(Shaw, 1959; Greenaway, 1980; Morris & Aardt, 1998). Os crustáceos de água doce e
salobra possuem uma reduzida permeabiliadade corporal, enquanto os marinhos são mais
permeáveis à água (Potts & Parry, 1964; Prosser, 1973).
NH
3
NH
3
+
H
+
NH
4
+
Na
+
CO
2
CO
2
+
H
2
O
H
+
+
HCO
3
-
Na
+
Cl
-
K
+
Na
+
Meio Hiposmótico: Absorção de Sal
meio externo
células de interface
hemolinfa
O papel da glândula antenal em produzir urina hipo- ou isosmótica é considerado
por vários autores como uma vantagem adaptativa à invasão dos crustáceos na água doce.
Embora a maioria dos crustáceos produza urina isosmótica à hemolinfa, é frequentemente
sugerido que a capacidade de produzir urina diluída em maior volume constitua uma
vantagem para a conquista de meios diluídos, visto o maior volume de água excretada
(Lockwood, 1977; Wheatly & Gannon, 1995; Susanto & Charmantier, 2001). O aumento
da taxa de fluxo urinário após exposição a um meio diluído pode ser produzido pela
redução da osmolalidade da hemolinfa ou por alterações no volume interno ou pressão.
Experimentos com o caranguejo marinho Cancer magister mostram que o sinal para o
aumento da produção urinária é o aumento do volume da hemolinfa, uma vez que o fluxo
urinário aumenta quando uma solução isosmótica de sal é injetada na hemolinfa, mas não
quando a osmolalidade da hemolinfa é reduzida por remoção da hemolinfa e substituição
pelo mesmo volume de água destilada (Holliday, 1978).
A produção de urina hiposmótica à hemolinfa é observada principalmente em
lagostins, os mais bem sucedidos decápodos dulcícolas com mais de 500 espécies
habitando riachos, lagoas, lagos e cavernas (Peterson & Loizzi, 1974; Loockwood, 1977;
Riegel, 1977; Sarver et al., 1994). Em contraste, a maioria dos caranguejos dulcícolas
produz reduzido fluxo de urina isosmótica evitando, dessa forma, a perda de sal e reduzindo
a dependência de mecanismos ativos de absorção para contrabalancear a perda difusiva
[Holthuisana transversa (Greenaway, 1981); Potamon potamios (Warburg & Goldenberg,
1984); Potamonautes warreni (Morris & Aardt, 1998)].
Finalmente, a conquista da água doce pelos crustáceos costuma também ser
acompanhada por alterações das características reprodutivas, sendo que o desenvolvimento
larval abreviado é o mais marcante entre os Malacostraca, Branchiura e, ocasionalmente,
entre Copepoda e Cirripedia (Anderson, 1973).
O desenvolvimento larval abreviado é caracterizado pela produção de ovos maiores,
ricos em vitelo, permitindo o quase, ou completo desenvolvimento larval dentro do ovo,
eclodindo-se uma larva em estágio avançado ou um juvenil [M. iheringi (Bueno, 1980), M.
jelskii (Gamba, 1984), D. pagei (Hirose, 2000)]. Pace et al., (1976) descreveram que nos
caranguejos do gênero Potamon, os naúplios, metanaúplios, protozoeas e megalopa podem
ocorrer dentro do ovo. No entanto, o gasto energético para produção destes ovos é maior,
sendo produzido um número bastante reduzido destes.
O valor adaptativo do desenvolvimento larval abreviado, com redução ou
eliminação das larvas aquáticas de vida livre, tem sido atribuído à vários fatores como a
limitada disponibilidade de alimento na água doce, à proteção osmótica oferecida pelas
membranas embrionárias, à menor probabilidade de predação dos ovos que das larvas, e
pela redução da dispersão do habitat parental (Rabalais & Gore, 1985; Hoegh-Guldberg &
Pearse, 1995; Strathmann & Strathmann, 1995).
Tipicamente, crustáceos marinhos, estuarinos ou no processo de invasão da água
doce como M. amazonicum (Gamba, 1984) e M. olfersii (Dugger & Bobkin, 1975)
produzem um grande número de ovos pequenos, sendo que as larvas passam por vários
estágios antes de sofrerem a metamorfose. O desenvolvimento larval abreviado pode ser
visto como uma resposta à pressão seletiva da recente irradiação adaptativa no ambiente
dulcícola (Sollaude, 1923; Rabalais & Gore, 1985), sendo especulado que o
desenvolvimento direto em caranguejos da família Potamonidae tenha sido uma pré-
adaptação à invasão da água doce (Pace et al., 1976).
3.4 Apresentação do Presente Trabalho
Neste trabalho avaliou-se os processos fisiológicos de osmorregulação em três
espécies de crustáceos pertencentes a ordem Decapoda que possuem distintas
características durante seu ciclo de vida estreitamente relacionadas à sua capacidade
osmorregulatória. O camarão Palaemon northropi é um palemonídeo encontrado em poças
de maré e que enfrenta diariamente em seu habitat amplas varições de salinidade, sendo
descrito como um forte osmorregulador nessas condições. Macrobrachium amazonicum é
um camarão palaemonideo com vasta distribuição neotropical, ocupando desde águas
interiores distantes do mar até estuarinas. Finalmente, o caranguejo braquiuro Dilocarcinus
pagei é uma espécie considerada antiga invasora da água doce, que completa seu ciclo de
vida neste biótopo com desenvolvimento larval abreviado (Hirose et al., 2000). Assim,
segue-se a caracterização destes três diferentes decápodos da fauna brasileira que foram
aqui investigados e relacionados quanto ao seu grau de invasão em meios diluídos com base
nos parâmetros fisiológicos de osmorregulação em estágos ontogenéticos selecionados.
3.5 O camarão de poças de maré Palaemon northropi
O camarão P. northropi distribui-se desde o o arquipélago das Bermudas, na
América Central, até o Uruguai, na América do Sul, (Holthuis, 1952). No litoral norte do
Estado de São Paulo pode ser encontrado no infralitoral e nas poças litorâneas formadas
durante a maré baixa.
Pinheiro & McNamara (2002) avaliaram a capacidade osmorregulatória desta
espécie após exposição a salinidades entre 5 e 50‰ por até 12 horas, e o descreveram como
um forte hipo- e hiperregulador, que mantém as concentrações dos principais osmólitos da
hemolinfa entre limites pouco variáveis nessas condições de exposição aguda. Este padrão
osmorregulatório observado em P. northropi é de certo modo característico, visto que parte
do seu habitat natural, as poças entre-marés, está sujeito a amplas variações de salinidade
devido à evaporações, ciclos de maré, diluições por água da chuva e deságue de rios e
riachos locais.
Embora os mecanismos de regulação osmótica e iônica da hemolinfa estejam bem
estudados nos camarões do gênero Palaemon [Palaemon macrodactylus (Born, 1968), P.
affinis (Kirkpatrick & Jones, 1985), P. elegans (Taylor & Spicer, 1987), P. longirostris
(Campbell & Jones, 1989), P. northropi (Pinheiro & McNamara, 2002; Freire et al., 2003]
há somente um estudo sobre os mecanismos de Regulação Isosmótica Intracelular nos
camarões deste gênero (Dalla Via, 1989). A falta de estudos sobre estes mecanismos,
acrescido das características osmorregulatórias de P. northropi, um habitante de meios de
salinidades flutuantes, fazem desta, uma interessante espécie para se estudar os mecanismos
de invasão em meios mais diluídos que a água do mar, desde a água salobra até a água
doce.
3.6 Macrobrachium amazonicum: um camarão neotropical de águas interiores e
estuarinas
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) é um camarão da família Palaemonidae
conhecido popularmente como camarão canela e endêmico das bacias fluviais da América
do Sul, como as do Rio Amazonas, São Francisco e Paraguai (Gomes Corrêa, 1977).
Apresenta grande importância ecológica e econômica para a pesca e aquicultura em função
da sua fácil manutenção, reprodução em cativeiro e rápido crescimento, sendo pescado em
grande escala no Rio Tocantins-PA (Coelho, 1963).
O camarão M. amazonicum ocupa diversos biótopos neotropicais, desde regiões
estuarinas nos Estados do Pará e Amazonas, até rios e lagos nos Estados de São Paulo e
Mato Grosso do Sul (Gomes Corrêa, 1977). No entanto, embora este camarão ocupe esta
diversidade de salinidades, e as várias populações apresentem diferentes características
biológicas em relação à fecundidade, proporção macho/fêmea, época reprodutiva e
maturação gonadal, ainda não existem estudos genéticos que estabeleçam os limites
taxonômicos desta espécie e a taxonomia clássica sugere que as diferentes populações
sejam constituídas por uma única espécie. Bastos et al., (2002) caracterizaram
geneticamente diferentes populações continentais e costeira de camarões do gênero
Macrobrachium através do gene mitocondrial 12S, mas este mostrou-se muito conservado
para discriminar populações de uma mesma espécie, inclusive as de M. amazonicum.
Muitos estudos sobre M. amazonicum tratam essencialmente de métodos de cultivo
em cativeiro como alimentação e temperaturas adequadas para o desenvolvimento larval e
pós-larval (Cavalcante, 1977; Freitas et al., 1978; Coelho et al., 1982; Barreto & Soares,
1982; Esteves, 1982), embora alguns aspectos da sua ecologia também tenham sido
avaliados (McNamara et al., 1983; Vega Perez, 1984; Collart & Rabelo, 1996).
Embora haja poucos estudos sobre o ciclo de vida de M. amazonicum, Vega Perez
(1984) caracterizou morfologicamente os estágios ontogenéticos desta espécie, descrevendo
que o período de incubação dos ovos varia de 14 a 19 dias a 23
o
C e que o desenvolvimento
larval apresenta 9 estágios de zoeas planctônicas. Collart & Rabelo (1996) avaliaram
diferentes populações de M. amazonicum no Estado do Amazonas em relação ao tamanho
dos ovos e observaram que o tamanho destes aumenta à medida que as populações se
distanciam do estuário do Rio Amazonas. Os autores observaram que os menores ovos
(0,20 mm
3
) pertencem a uma população de M. amazonicum localizada no Rio Tocantins
distante 120 km do estuário, enquanto os maiores ovos (0,27 mm
3
) pertencem a uma
população do Rio Guaporé, localizada a 3410 km do estuário.
Provérbio et al., (1990) e Zanders et al., (1992) avaliaram algumas características
osmorregulatórias de uma população dulcícola da Venezuela, como atividade Na
+
/K
+
-
ATPase e capacidade osmorregulatória após exposição a diferentes salinidades. Ainda,
McNamara et al., (1983) avaliaram o efeito de diferentes salinidades na sobrevivência e
muda da zoeas I de M. amazonicum.
A diversidade de salinidades em que as várias populações de M. amazonicum são
encontradas e sua abundância no território brasileiro torna oportuno o estudo dos
mecanismos de regulação osmótica e iônica nos estágios ontogenéticos desta espécie
exposta a diferentes salinidades.
3.7 O caranguejo Dilocarcinus pagei: um antigo invasor da água doce
A família Trichodactylidae é exclusivamente dulcícola e distribui-se na América do
Sul e Central desde o sul do México até a Argentina, com a maioria das espécies ocorrendo
no Brasil (Magalhães, 1991). Dilocarcinus pagei é um caranguejo hololimnético desta
família encontrado nas bacias continentais da América do Sul e planícies costeiras das
Guianas e do Brasil.
Dilocarcinus pagei foi descrito pela primeira vez por Stimpson (1861). Na Represa
Municipal de São José do Rio Preto a espécie foi registrada por Taddei (1999) e por Suzuki
et al., (2000), sendo que Onken & McNamara (2002) iniciaram o estudo dos mecanismos
osmorregulatórios desta espécie através de análises estruturais e funcionais das brânquias
posteirores e transporte iônico. Weihrauch et al., (2004) ainda avaliaram a microanatomia e
a expressão do RNA mensageiro nas brânquias anteriores e posteriores de D. pagei.
O ciclo de vida do caranguejo D. pagei é caracterizado por um desenvolvimento
larval abreviado, eclodindo-se juvenis muito parecidos com os adultos. Hirose et al., (2000)
caracterizaram o tipo de desenvolvimento e o tamanho do primeiro juvenil de D. pagei de
uma população da Represa Municipal de São José do Rio Preto-SP, e verificaram que o
tamanho dos juvenis no abdome das fêmeas varia de 1,7 a 2,4 mm. Estes dados sugerem
que 1,7 mm possa ser o tamanho do primeiro estágio juvenil de D. pagei, devendo ocorrer
mudas dentro da bolsa incubadora da fêmea.
Assim, com base somente na sua embriologia, D. pagei pode ser classificado como
um antigo invasor da água doce, visto seu desenvolvimento larval abreviado e
independência da água salobra para completar seu ciclo de vida.
Quanto à osmorregulação, pouco se sabe sobre seus mecanismos em caranguejos
dulcícolas [Potamon niloticus (Shaw, 1959), Potamon fluviatilis (Harris & Micallef, 1971),
Eriocheir sinensis (Onken & Putzenlechner, 1996) e Armases robertii (Schubart & Diesel,
1998)], tornando-se oportuno o estudo dos braquiuros da fauna brasileira.
Visto a existência de marcantes características em D. pagei como antigo invasor da
água doce e a escassez de informações sobre os procesos osmorregulatórios em caranguejos
Trichodactylidae (Onken & McNamara, 2002; Weihrauch et al., 2004) iniciou-se aqui um
estudo sobre os processos intra- e extracelulares da regulação osmótica em D. pagei,
tentando-se estabelecer uma relação entre estes mecanismos e a invasão dos crustáceos na
água doce de forma comparativa com os demais decápodos estudados.
3.8 Objetivos e Contribuição do Presente Trabalho para a Compreensão da Invasão
da Água Doce pelos Crustáceos
Visto que o principal desafio à invasão da água doce pelos crustáceos é a
capacidade de hiperregular a osmolalidade da hemolinfa diante de uma tendência a perda
de sal por difusão e ganho de água por osmose, os processos fisiológicos de regulação
osmótica e iônica constituem um dos principais mecanismos fisiológicos que permitiram a
complexa invasão deste biótopo.
Assim, uma análise comparativa dos processos relacionados à manutenção da
osmolalidade da hemolinfa e do volume intracelular de crustáceos considerados antigos ou
recentes invasores da água doce como D. pagei e M. amazonicum, bem como de uma
espécie que enfrenta salinidades extremamente variáveis em seu habitat como o camarão P.
northropi, pode contribuir para o conhecimento sobre os mecanismos de adaptação
fisiológica relacionados à invasão da água doce.
Assim, avaliou-se a taxa de mortalidade, capacidade osmo- e ionorregulatória da
hemolinfa, grau de hidratação dos tecidos, e o papel dos aminoácidos livres como efetores
osmóticos orgânicos do processo de regulação do volume celular em P. northropi, M.
amazonicum e D. pagei adultos expostos a meios de diferentes salinidades. No camarão M.
amazonicum e no caranguejo D. pagei, ainda foi avaliado o grau de hidratação e a
concentração de aminoácidos livres em selecionados estágios embrionários e pós-
embrionários.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Coleta dos animais
4.1.1 Coleta do camarão Palaemon northropi
O camarão Palaemon northropi foi coletado durante a maré baixa em poças de maré
(≈7‰) na praia de Barequeçaba, em São Sebastião, litoral norte do Estado de São Paulo.
Os camarões foram transportados para a Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto em galões contendo 50 l de água do mar aerada por bombas de
oxigenação. Foram acondicionados no laboratório em tanques de plástico contendo água do
mar aerada da praia de Barequeçaba (31‰). Os camarões foram alimentados em dias
alternados com músculo de peixe.
4.1.2 Coleta do camarão Macrobrachium amazonicum
Os espécimes de Macrobrachium amazonicum foram coletados em uma represa da
Usina São Geraldo localizada em Sertãozinho, Nordeste do Estado de São Paulo, com o
auxílio de peneiras de malha de aço junto à vegetação marginal constituída principalmente
por gramíneas. As coletas foram realizadas mensalmente nos anos de 2002 a 2003. Os
camarões foram transportados para a Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto em galões contendo 50 l de água aerada por bombas de oxigenação. Foram
acondicionados no laboratório em tanques de plástico contendo água doce (<0,5‰)
durante 3 dias antes de se iniciar os experimentos. Os camarões foram alimentados em dias
alternados com cenoura ou fígado bovino.
4.1.3 Coleta do caranguejo Dilocarcinus pagei
Espécimes de Dilocarcinus pagei utiliazados para a avaliação da capacidade osmo-
e ionorregulatória, mortalidade e Regulação Isosmótica Intracelular em adultos foram
coletados na Represa Municipal de São José do Rio Preto (SP) (20º48'36''S, 49º22'59''W),
com o auxílio de peneiras de malha de aço junto às raízes da vegetação marginal,
constituída principalmente por aguapés (Eichhornia sp). As coletas foram realizadas
mensalmente nos meses de abril à agosto de 2001. Os caranguejos foram transportados para
a Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto em caixas de isopor contendo
água do local da coleta em quantidade suficiente para molhá-los, sem cobrí-los totalmente.
Foram acondicionados no laboratório em tanques de amianto contendo água doce
(<0,5‰) durante 3 dias antes de se iniciar os experimentos. Os caranguejos foram
alimentados em dias alternados com alface, laranja, banana, maçã, pêssego e carne bovina.
As fêmeas ovígeras de D. pagei e os animais utilizados para a avaliação da
osmolalidade e dos íons sódio e cloreto da hemolinfa e urina foram coletados no rio Mogi,
região de Barrinha-SP, nos meses de setembro a novembro de 2004 e 2005, período no qual
são encontradas fêmeas com ovos nesta região. Foram coletados, transportados para o
laboratório, acondicionados e alimentados semelhantemente aos espécimes coletados em
São José do Rio Preto.
4.2 Obtenção dos estágios ontogenéticos de Macrobrachium amazonicum e
Dilocarcinus pagei
4.2.1 Obtenção dos embriões do camarão M. amazonicum
As fêmeas ovígeras de Macrobrachium amazonicum foram mantidas em tanques
contendo água doce até os embriões apresentarem os pigmentos dos olhos, o que ocorreu
por volta do 10
o
dia do período embrionário nos camarões mantidos a uma temperatura de
aproximadamente 23
o
C. As fêmeas foram então transferidas para garrafas plásticas aeradas
contendo 2 l de água doce ou salobra (6 ou 25‰) e após 2 dias os embriões foram retirados
dos pleópodos das fêmeas com pinça de dissecção. Durante esta fase as fêmeas foram
alimentadas em dias alternados com carne ou cenoura.
4.2.2 Obtenção das zoeas I do camarão M. amazonicum
As fêmeas ovígeras de M. amazonicum foram mantidas em tanques contendo água
doce (<0,5‰) até os embriões apresentarem os pigmentos dos olhos. As fêmeas foram,
então, transferidas para garrafas plásticas aeradas contendo 2 l de água salobra (14‰). A
eclosão das zoeas I ocorreu por volta do 20
o
dia do desenvolvimento embrionário,
iniciando-se ao entardecer e terminando ao amanhecer, sendo que em algumas fêmeas a
eclosão das zoeas I durou até 48 horas, interrompendo-se durante o dia.
As zoeas I foram divididas em grupos de aproximadamente 20 larvas e transferidas
para recipientes tampados contendo 300 ml de água salobra de 6 ou 25‰. Foram mantidas
em estufa incubadora a 23
o
C por 2 dias.
As fêmeas ovígeras foram mantidas em água salobra de 14‰ até a eclosão das
zoeas I devido a alta mortalidade destas larvas em salinidades reduzidas, chegando a 100%
de mortalidade em água doce após 2 horas da eclosão, inclusive quando mantidas em água
doce do local de coleta.
4.2.3 Obtenção das zoeas II do camarão M. amazonicum
Após a eclosão das zoeas I em água salobra de 14‰, estas foram divididas em
grupos de aproximadamente 20 larvas e transferidas para recipientes tampados contendo
300 ml de água salobra (14‰). Foram mantidas em estufa incubadora a 23
o
C até a ecdise
para zoea II, o que ocorreu aproximadamente 3 dias após a eclosão das zoeas I.
As zoeas II foram divididas em grupos de aproximadamente 20 larvas e transferidas
para recipientes tampados contendo 300 ml de água contendo as salinidades experimentais
de 6 ou 25‰. Foram mantidas em estufa incubadora a 23
o
C por 2 dias.
4.2.4 Obtenção dos embriões do caranguejo Dilocarcinus pagei
As fêmeas ovígeras do caranguejo D. pagei foram mantidas em tanques de plástico
contendo água doce até o aparecimento dos olhos dos embriões, observados a olho nú.
As fêmeas foram, então, transferidas para aquários individuais contendo 6 l de água
doce (<0,5‰) ou salobra (25‰). As fêmeas foram mantidas submersas nessas salinidades
durante 2 dias. Após esse período de exposição foram dissecados em torno de 6 ovos,
retirados do pleópodo das fêmeas com o auxílio de uma pinça fina de dissecção. A presença
de embriões vivos no abdome das fêmeas mantidas em água doce ou salobra foi detectada
pela cor alaranjada brilhante dos ovos ou pelo batimento cardíaco dos embriões verificado
por microscópio óptico.
4.2.5 Obtenção dos juvenis do caranguejo Dilocarcinus pagei
As fêmeas ovígeras de D. pagei foram mantidas em tanques de plástico contendo
água doce até a eclosão dos juvenis. Em D. pagei, os juvenis ficam aderidos ao pleópodo
das fêmeas até alcançarem cerca de aproximadamente 2,5 mm de comprimento (Hirose et
al., 2000).
Logo após a eclosão, as fêmeas foram transferidas para aquários individuais aerados
contendo 6 l de água doce (<0,5‰) ou salobra (25‰). As fêmeas foram mantidas nestas
salinidades durante 2 dias. Após esse período de exposição foram retirados em torno de 6
juvenis do pleópodo das fêmeas com o auxílio de uma pinça fina de dissecção.
4.3 Exposição de espécimes adultos de Palaemon northropi, M. amazonicum e D. pagei
a diferentes salinidades
4.3.1 Exposição de P. northropi a diferentes salinidades para avaliação preliminar do limite
letal de salinidade
Grupos de 30 camarões divididos em três cristalizadores cada foram mantidos em 2
l de água doce (<0,5‰) ou salobra de 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 20 ou 45‰ para se avaliar o limite
letal de salinidade desta espécie em laboratório.
As águas salobras de 0,5, 1, 1,5 e 2‰ utilizadas nos experimentos foram obtidas
misturando-se água doce mineral com sal marinho, ambos pesados em balança devido a
dificuldade de se medir estas salinidades reduzidas em refratômetro óptico. As águas
salobras de 5 e 20‰ foram obtidas misturando-se água mineral com água da praia de
Barequeçaba. A salinidade de 45‰ foi obtida congelando-se água do mar da praia de
Barequeçaba (31‰) em um freezer e recolhendo-se as primeiras porções desta durante o
descongelamento. As salinidades foram verificadas com um refratômetro de mão
(American Optical, Modelo 10419). A temperatura da água neste período foi de
aproximadamente 23
o
C.
Os camarões foram alimentados diariamente com músculo de peixe.
4.3.2 Exposição de P. northropi a diferentes salinidades para avaliação da capacidade
osmo- e ionorregulatória e do processo de Regulação Isosmótica Intracelular
Três grupos de aproximadamente 30 animais cada foram expostos às salinidades de
5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os camarões foram colocados em caixas de plástico tampadas
contendo 60 l de água aerada para evitar a evaporação.
A água salobra utilizada nos experimentos foi obtida misturando-se água mineral
com água da praia de Barequeçaba, litoral Norte do Estado de São Paulo. As salinidades
foram verificadas com um refratômetro de mão (AO, Modelo 10419). A temperatura
ambiental foi de aproximadamente 23
o
C.
Durante o período experimental os animais foram alimentados diariamente com
músculo de peixe.
4.3.3 Exposição do camarão M. amazonicum a diferentes salinidades para avaliação
preliminar do limite letal de salinidade e da capacidade osmo- e ionorregulatória
Grupos de 15 animais medindo aproximadamente 6,0 cm de comprimento da
extremidade do rostro à extremidade do telso foram mantidos submersos nas salinidades de
10, 20, 25, 30 e 35‰ durante 10 dias, exceto os animais em 35‰ que morreram antes deste
período. Os camarões foram colocados em tanques de plástico tampados contendo 6 l de
água aerada por animal. Os animais controles permaneceram em água doce (<0,5‰).
A água salobra utilizada nos experimentos foi obtida misturando-se água de uma
mina da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP, com água da
praia de Guaecá, litoral Norte do Estado de São Paulo. As salinidades foram verificadas
com um refratômetro de mão (AO, Modelo 10419). A temperatura da água neste período
foi de aproximadamente 23
o
C.
Os camarões foram alimentados em dias alternados com cenoura ou fígado bovino.
4.3.4 Exposição do camarão M. amazonicum a diferentes salinidades para avaliação do
decurso temporal do processo de Regulação Isosmótica Intracelular
Após o estudo da capacidade osmorregulatória de M. amazonicum, escolheu-se a
salinidade de 25‰ para se avaliar os mecanismos de Regulação Isosmótica Intracelular,
visto que esta salinidade representa um desafio osmótico com reduzida mortalidade para
esta espécie.
Assim, foram expostos grupos de 12 animais à água salobra de 25‰ durante 1, 2, 5
ou 10 dias. Os camarões controles permaneceram em água doce (≤0,5‰). Os animais
foram expostos em tanques de plástico tampado contendo 6 l de água aerada por animal e
mantidos a temperatura ambiente de aproximadamente 23
o
C.
Foram alimentados em dias alternados com cenoura ou fígado bovino.
4.3.5 Exposiçao do caranguejo Dilocarcinus pagei a diferentes salinidades para avaliação
preliminar do limite letal de salinidade e da capacidade osmo- e ionorregulatória
Grupos de 6 animais foram mantidos submersos nas salinidades de 5, 10, 15, 20, 25,
30 e 35‰ durante 10 dias, exceto os animais expostos a 35‰ que morreram antes de 2
dias. Os caranguejos foram colocados em tanques de fibrocimento tampados contendo 6 l
de água aerada por animal. Os animais controles permaneceram em água doce.
A água salobra utilizada nos experimentos foi obtida misturando-se água de uma
mina da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP, com água da
praia de Guaecá, litoral Norte do Estado de São Paulo. As salinidades foram verificadas
com um refratômetro de mão (AO, Modelo 10419). A temperatura ambiental foi de
aproximadamente 23
o
C.
4.3.6 Exposiçao do caranguejo Dilocarcinus pagei a diferentes salinidades para avaliação
do decurso temporal do processo de Regulação Isosmótica Intracelular
Foram expostos 25 animais à água salobra de 25‰. Grupos de 5 animais foram
retirados após 1, 2, 5 e 10 dias. Os caranguejos controles permaneceram em água doce
(≤0,5‰). A exposição foi feita em tanque de fibrocimento contendo aproximadamente 6 l
de água aerada por animal, fechado com plástico para evitar a evaporação.
Os caranguejos foram alimentados em dias alternados com alface, banana,
laranja, maçã, pêssego ou carne bovina.
4.3.7 Exposiçao do caranguejo Dilocarcinus pagei à água salobra para avaliação da
osmolalidade e dos íons sódio e cloreto da hemolinfa e urina
Grupos de 6 animais foram mantidos submersos em água doce (grupo controle) ou
salobra de 25‰ durante 5 dias. Os caranguejos foram colocados em tanques de
fibrocimento tampados contendo 6 l de água aerada por animal e alimentados em dias
alternados com alface, banana, laranja, maçã, pêssego ou carne bovina.
Após o período de exposição foram retiradas amostras de urina e hemolinfa de
todos os animais.
4.4 Obtenção da hemolinfa e dissecção dos tecidos de P. northropi, M. amazonicum e
D. pagei
4.4.1 Obtenção da hemolinfa e dissecção dos tecidos de P. northropi e M. amazonicum
As amostras de hemolinfa dos camarões P. northropi e M. amazonicum (≈60 µl
cada) foram retiradas com uma seringa de insulina e agulha #25-8 inserida na região
cardíaca dos camarões, e guardadas em um freezer para posterior análise. Os camarões
foram, então, mortos por resfriamento e colocados em uma placa de cera sobre gelo. Pelo
fato dos camarões da espécie P. northropi serem muito pequenos, cada amostra de
hemolinfa (≈60 µl) foi constituída por um pool de 4 a 8 camarões (≈8-10 µl cada).
As amostras de tecido muscular foram compostas por partes do último segmento
abdominal (≈2,0 g). Para a obtenção do tecido nervoso (≈1,0 g) foram dissecados o cordão
nervoso ventral e os gânglios torácico, supraesofágico e óptico. Foi feito um corte
longitudinal em cada lado do cordão nervoso ventral e um transversal ao nível do telson;
dessa forma o cordão nervoso pôde ser retirado intacto. Após a retirada da carapaça,
estômago, esôfago, coração, gônadas e hepatopâncreas foram rebatidos e cortados com uma
tesoura de ponta fina. O animal foi lavado com salina para a retirada dos fragmentos de
tecido e os gânglios torácico e supraesofágico dissecados com uma microtesoura de ponta
fina. Os gânglios ópticos foram separados dos cartuchos ópticos por leve pressionamento
após a secção dos pedúnculos ópticos.
As amostras de tecido branquial (≈1,0 grama) foram constituídas pelas 6
o
e 7
o
brânquias de cada lado do animal, sendo dissecadas com uma microtesoura de ponta fina
após a retirada dos branquiostegitos.
4.4.2 Obtenção da hemolinfa, urina e dissecção dos tecidos de D. pagei
As amostras de urina de D. pagei foram retiradas com uma cânula acoplada a uma
seringa inserida no nefróporo da glândula antenal. As amostras de hemolinfa foram
retiradas com uma agulha #25-8 e seringa de insulina inserida na articulação entre o
coxopodito do último pereiópodo e o segundo segmento abdominal. Os caranguejos foram,
então, mortos por resfriamento e colocados em uma placa de cera sobre gelo.
As amostras de tecido muscular foram compostas pelo músculo do primeiro
pereiópodo, o quelípede. Para a obtenção do tecido nervoso foi dissecado o gânglio
torácico. Após a retirada da carapaça, órgãos como o estômago, esôfago, coração e gônadas
foram rebatidos e cortados com uma tesoura de ponta fina. O hepatopâncreas, orgão
amarelo e volumoso, que preenche a maior parte da cavidade abdominal, foi dissecado
cuidadosamente. O animal foi lavado com salina para a retirada dos fragmentos de tecido e
o gânglio foi encontrado sobre a musculatura torácica. Este tecido possui um aspecto
esbranquiçado e formato estrelado, e pôde ser dissecado com uma microtesoura de ponta
fina.
As amostras de tecido branquial anterior e posterior foram constituídas,
respectivamente, pela 3
o
e 8
o
brânquias, as quais foram dissecadas com uma microtesoura
de ponta fina após a retirada dos branquiostegitos.
4.5 Medida do grau de hidratação de estágios ontogenéticos selecionados dos camarões P.
northropi e M. amazonicum e do caranguejo D. pagei
As amostras de embriões, zoeas e juvenis inteiros ou tecidos muscular, branquial e
nervoso dos adultos das três espécies mantidas em diferentes salinidades experimentais
foram secos cuidadosamente em papel absorvente e pesados em balança de precisão Ohaus
(± 10 µg) sobre placas de alumínio previamente pesadas. Foram secos em estufa a 60
o
C por
24 h e pesados novamente em suas respectivas placas de alumínio. Obtidos os pesos antes
(peso úmido) e depois da secagem (peso seco), foi calculada a porcentagem de água em
cada amostra:
%água = (PU-PS) X 100
PU
onde PU = peso úmido, PS = peso seco
4.6 Preparação dos homogeneizados para análise dos aminoácidos livres
Amostras secas de embriões, zoeas ou juvenis inteiros ou tecidos muscular,
branquial e nervoso dos adultos expostos à diferentes salinidades foram colocadas em tubos
Eppendorf e homogeneizadas com pó de vidro e 100 µl de água destilada por
aproximadamente 5 min. Os homogeneizados foram centrifugados a 4000 rpm (Fanem
Excelsa Baby II, Modelo 206R) por 30 min, sedimentando os restos celulares e o pó de
vidro.
O sobrenadante foi rapidamente retirado com pipeta automática, evitando a possível
evaporação, transferido para um outro tubo Eppendorf, e seu volume completado com água
destilada para 100 µl ou 200 µl no caso de tecido muscular de adultos.
Os homogeneizados foram guardados em um freezer a –25
o
C para posterior análise.
4.7 Análise qualitativa e quantitativa dos aminoácidos livres por HPLC
Os aminoácidos livres das amostras homogeneizadas de embriões, zoeas, juvenis ou
tecidos e hemolinfa de animais adultos expostos a diferentes salinidades foram derivados
com fenilisotiocianato (PITC) (Bidlingmeyer et al., 1987) e separados em aparelho de
cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Nesse sistema, os aminoácidos reagem
com o fenilisotiocianato (PITC) na presença de uma base orgânica (trietilamina, TEA)
produzindo aminoácidos feniltiocarbamila-derivados no seu grupo amino. Estes são
separados pela HPLC operada em fase-reversa, e detectados e quantificados pela sua
absorbância a 254 nm (Freire et al., 1995).
Inicialmente, 50 µl de cada amostra homogeneizada foram colocados em tubos de
vidro pirolizados, e secos a vácuo por 30 min. Foram adicionados 150 µl de etanol 80%
contendo 6,24 nmoles de ácido α-aminobutírico e imediatamente agitados e centrifugados
por 5 min a 1200 rpm. 100 µl do sobrenadante de cada amostra foram então retirados e
transferidos para novos tubos pirolizados e novamente secos a vácuo por 20 min. Seguiu-se
à derivatização onde, após acrescentar 20 µl de metanol/água/TEA (2:2:1) a cada amostra,
estas foram secas e em seguida adicionados 20 µl de uma solução contendo
metanol/água/TEA/PITC (7:1:1:0,5). Após reagir por 20 min, as amostras derivadas foram
secas a vácuo por aproximadamente 2 horas.
Para a leitura pelo o aparelho de HPLC acrescentou-se 200 µl de tampão acetato de
sódio pH 7,5 a cada amostra em duplicata, sendo esta agitada e transferida para um tubo de
aspiração automática devidamente lacrado. A leitura foi feita usando uma coluna Picotag
C18 (150 x 3,9 mm) eluída com um gradiente de tampão acetato de sódio 0,14 M com TEA
0,05 M, a pH 5,9 como solução A, e acetonitrila/água (3:2) como solução B.
O HPLC (Milton Roy) é um sistema LDC MP3000, operado a uma taxa de eluição
de 1,0 ml/min a 38
o
C, com detecção a 254 nm. A injeção da amostra e a integração dos
picos correspondentes às concentrações de aminoácidos livres foram feitas
automaticamente.
Esse sistema permite a identificação e quantificação de todos os aminoácidos
comuns com exceção da asparagina que elui próxima à serina, sendo quantificada como tal;
glutamina que se comporta como glicina; e triptofano que não pode ser quantificado pois
coelui com produtos de degradação.
Os dados são expressos como nanomoles de aminoácido por miligrama de peso seco
para os tecidos ou µmoles por litro para a hemolinfa.
4.8 Medida da osmolalidade e concentrações dos íons sódio e cloreto na hemolinfa ou
urina
A osmolalidade da hemolinfa e urina de D. pagei e da hemolinfa de P. northropi e
M. amazonicum foi medida em amostras de 10 µl em um micro-osmômetro de pressão a
vapor (Wescor, Modelo 5500). A concentração de sódio foi medida por emissão
espectrofotométrica (GBC, modelo 932AA) em 10 µl de hemolinfa diluída em água
destilada 15000 vezes para os animais mantidos em água doce ou expostos a 5, 10 e 15‰;
25000 vezes para os animais expostos a 20 ou 30‰, e 50.000 vezes para aqueles expostos a
35‰.
A concentração de cloreto foi medida em 10 µl de hemolinfa usando-se um
microtitulador (Metron Herisou, modelo E 485), empregando nitrato de mercúrio como o
titulante, e S-difenilcarbazona como o indicador (Schales & Schales, 1941).
4.9 Análises Estatísticas
Para avaliar o efeito da exposição a diferentes salinidades ou tempo de exposição
sobre a osmolalidade e concentrações dos íons sódio e cloreto da hemolinfa, bem como ao
grau de hidratação e concentração de aminoácidos livres foram feitas análises de variância
(ANOVA) de 1 fator seguido pelo teste de médias múltiplas de Student-Newman-Keuls
(SNK) para localizar as médias estatisticamente diferentes.
O efeito da exposição ao meio salino durante os vários intervalos temporais sobre o
grau de hidratação e a concentração dos aminoácidos livres nos diferentes tecidos
(muscular, branquial e nervoso) ou estágios ontogenéticos foi avaliado através de análises
de variância de 2 fatores (ANOVA), onde os fatores principais foram o tempo de exposição
e o tecido/estágio ontogenético. Ao constatar um efeito de um dos fatores, o teste SNK foi
usado para localizar as médias estatisticamente diferentes entre os tecidos ou estágios para
cada período.
O test-t Student foi realizado para se avaliar o efeito da exposição à água salobra de
25‰ durante 5 dias sobre a osmolalidade e concentração dos íons sódio e cloreto da urina
de D. pagei.
As análises foram feitas após averiguar as condições de normalidade de distribuição
e igualdade de variância usando os programas Statgraphics 6.0 Plus e Sigma Stat 1.0,
empregando um nível mínimo de significância de P = 0,05. Os dados são expressos como
Média ± Erro Padrão da Média.
Os gráficos foram feitos usando o programa SlideWrite Plus 4.0 para Windows. Os
pontos isosmótico, e isoiônico para sódio e cloreto, foram calculados produzindo uma
equação quadrática a partir da equação das respectivas retas (y = a + bx) e das polinomiais
de segundo grau (y = a + bx + cx
2
) obtidos após o ajuste aos dados em função da
salinidade. Os pontos isosmótico e isoiônico correspondem aos interceptos das curvas e
retas para cada parâmetro (osmolalidade, sódio e cloreto). A ajustagem das polinomiais aos
dados é representada por R
2
.
A capacidade osmorregulatória das três espécies estudadas é expressa como
alteração da osmolalidade da hemolinfa em função da osmolalidade do meio (∆
osmolalidade da hemolinfa/∆ osmolalidade do meio). A capacidade ionorregulatória para
os íons sódio e cloreto é expressa como a alteração da concentração do respectivo íon na
hemolinfa em função da concentração deste íon no meio (∆ concentração do íon na
hemolinfa/∆ concentração do íon no meio) (Freire et al., 2003).
5. RESULTADOS
5.1 Palaemon northropi
5.1.1 Mortalidade de adultos após exposição a diferentes salinidades
O camarão entre-marés P. northropi sobreviveu apenas 2 horas quando mantido em
água doce (<0,5‰) ou salobra de 0,5 e 1‰. No entanto, apresentaram 100% de
sobrevivência em salinidades a partir de 1,5‰ por até 10 dias, exceto os animais expostos a
45‰ que apresentaram 30% de mortalidade nos primeiros 3 dias de exposição (Figura 3).
Dos resultados obtidos com as referidas salinidades pode-se concluir que na salinidade de
aproximadamente 1,2‰ ocorre 50% de mortalidade.
0 0,5 1 1,5 2 5 20 45
Salinidade, ‰
0
20
40
60
80
100
Mortalidade, %
Figura 3. Mortalidade de adultos de Palaemon northropi após exposição a diferentes
salinidades. Nas salinidades em que não houve mortalidade o tempo de exposição dos
animais foi de 10 dias.
5.1.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória
A osmolalidade e as concentrações dos íons sódio e cloreto estão mostradas nas
Figuras 4, 5 e 6.
Nos animais controles mantidos em 20‰ durante 5 dias a osmolalidade da
hemolinfa foi de 599 ± 12 mOsm/kg de água, valor que se manteve estatisticamente
inalterado após exposição à água salobra de 5‰ (548 ± 12 mOsm/kg de água). A
osmolalidade da hemolinfa aumentou após exposição a 45‰ por 5 dias (948 ± 31 mOsm/kg
de água). A curva ajustada mostra que a hemolinfa foi hiperregulada até o ponto isosmótico
de 569 mOsm/kg água (19‰), sendo hiporregulada nas salinidades maiores (Figura 4). A
capacidade osmorregulatória de P. northropi foi de 0,32.
0 1020304050
Salinidade,
0
/
00
0
200
400
600
800
1000
Osmolalidade, mOsm/kg água
a
Linha Isosmótica
Figura 4. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 5 dias sobre a osmolalidade
(Média ± EPM, N=6) da hemolinfa de Palaemon northropi. Cada amostra de hemolinfa foi
constituída por um pool de 4 a 8 animais.
a
significativamente diferente dos animais em
20‰ (controles). P≤0,05. R
2
= 0,98.
A concentração de sódio nos animais controles mantidos em 20‰ foi de 249,3 ± 32
mM, não havendo alterações estatisticamente significantes após exposição às salinidades de
5 ou 45‰ durante 5 dias. Os animais hiperregularam a concentração de sódio até o ponto
isoiônico de 238 mM (17‰), hiporregulando a partir desta salinidade (Figura 5). A
capacidade regulatória do sódio em P. northropi foi de 0,12.
0 1020304050
Salinidade,
‰
0
100
200
300
Concentra
ção
de
Na
+
, mM
Linha Isoiônica
Figura 5. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 5 dias sobre a concentração
de sódio (Média ± EPM, N=6) da hemolinfa de Palaemon northropi. Cada amostra de
hemolinfa foi constituída por um pool de 4 a 8 animais.
a
significativamente diferente dos
animais em 20‰ (controles). P≤0,05. R
2
= 0,97
A concentração do cloreto na hemolinfa dos animais controles mantidos em 20‰
foi de 240,0 ± 15,3 mM. Nos animais mantidos em 5‰ houve uma redução na
concentração de cloreto (209,0 ± 1,0 mM), e aumento nos animais mantidos em 45‰
(366,7 ± 8,8 mM) em relação aos animais controles. Os animais hiperregularam a
concentração do cloreto até o ponto isoiônico de 168 mM (14‰), hiporregulando nas
salinidades mais elevadas (Figura 6). A capacidade regulatória do cloreto em P. northropi
foi de 0,25.
0 1020304050
Salinidade,
‰
0
100
200
300
400
Concentra
çã
o
de Cl
-
, mM
a
a
Linha Isoiônica
Figura 6. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 5 dias sobre a concentração
de cloreto (Média ± EPM, N=6) da hemolinfa de Palaemon northropi. Cada amostra de
hemolinfa foi constituída por um pool de 4 a 8 animais.
a
significativamente diferente dos
animais em 20‰ (controles). P≤0,05. R
2
= 0,97.
5.1.3 Grau de hidratação
A exposição do camarão entre-marés P. northropi às salinidades de 5, 20 ou 45‰
não provocou alterações significativas no grau de hidratação dos tecidos muscular,
branquial e nervoso (Figura 7).
Musculo Branquia Nervoso
Tecido
0
20
40
60
80
100
Grau de Hidratação, %
5 ‰ 20 ‰ 45 ‰
Figura 7. Grau de hidratação (Média ± EPM, N=6) dos tecidos muscular, branquial e
nervoso de Palaemon northropi após exposição às salinidades de 5, 20 ou 45‰ por 5 dias.
5.1.4 Concentração de aminoácidos livres nos tecidos e hemolinfa de adultos
No tecido muscular do camarão P. northropi exposto a 5‰ houve uma redução de
63% na concentração total dos aminoácidos livres (261 ± 31 nmol/mg de peso seco) em
relação aos animais controles mantidos em 20‰ (715 ± 59 nmol/mg de peso seco). Em
contraste, no músculo dos animais expostos a 45‰ (651 ± 37 nmol/mg de peso seco) a
concentração total de aminoácidos livres manteve-se semelhante a dos animais controles
(Figura 8).
52045
Salinidade, ‰
0
200
400
600
800
Concentração, nmol/mg peso seco
a
Figura 8. Concentração total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
muscular de P. northropi mantido em 5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média
± erro padrão da média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰ (grupo
controle). P≤0,05.
Os aminoácidos livres predominantes no tecido muscular de P. northropi mantido
nas três salinidades avaliadas foram os não- essenciais glicina, taurina, alanina e prolina
(Tabela 1). Os aminoácidos glicina, arginina e prolina reduziram após exposição à água
salobra de 5‰ (Figura 9).
52045
Salinidade,
‰
0
100
200
300
400
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
a
a
a
Figura 9. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
muscular de Palaemon northropi após exposição à água salobra de 5, 20 ou 45‰ por 5
dias.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰ (grupo controle). P≤0,05.
Tabela 1. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
muscular de P. northropi mantido em 5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média
± erro padrão da média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰ (grupo
controle). P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão
indicados em negrito.
Aminoácido
livre
5‰ 20‰ 45‰
Asp
1,3 ± 0,2 0,4 ± 0,1 1,4 ± 0,3
Glu
2,8 ± 0,3 5,3 ± 2,1 7,8 ± 1,7
Ser
11,4 ± 3,2 20,8 ± 10,8 5,7 ± 0,9
Gli
a
97,3 ±
±±
± 6,1 340,1 ±
±±
± 84,1 326,4 ±
±±
± 20,7
His
3,3 ± 0,1 4,9 ± 1,5 4,6 ± 1,0
Tau
38,9 ±
±±
± 2,7 92,2 ±
±±
± 25,9 73,5 ±
±±
± 4,2
Arg
a
2,8 ± 1,3
62,4 ±
±±
± 6,6 68,0 ±
±±
± 1,4
Tre
6,5 ± 1,2 6,6 ± 4,4 5,0 ± 1,7
Ala
17,3 ±
±±
± 2,3 34,4 ±
±±
± 10,6 55,9 ±
±±
± 8,7
Pro
a
25,2 ±
±±
± 3,5 72,8 ±
±±
± 40,3 48,4 ±
±±
± 29,7
Tir
1,9 ± 0,2 2,6 ± 0 ,1 1,9 ± 0,2
Val
7,1 ± 1,2 10,5 ± 5,8 7,7 ± 1,4
Met
4,6 ± 0,9 3,9 ± 2,0 2,9 ± 0,8
Cis
0,9 ± 0,1 2,1 ± 0,7 1,0 ± 0,1
Ile
5,5 ± 0,8
nd nd
Leu
10,8 ±
±±
± 2,2 36,0 ±
±±
± 16,2 28,2 ±
±±
± 3,9
Fen
0,9 ± 0,2 2,2 ± 0,7 1,8 ± 0,5
Lis
4,9 ± 0,9 14,1 ± 3,8 10,9 ± 0,9
Total
a
266,1 ± 30,0 715,0 ± 59,0 651,3 ± 37,6
Tecido Branquial
No tecido branquial de P. northropi a concentração total de aminoácidos livres foi
estatisticamente semelhante nas três salinidades avaliadas (Figura 10).
Os aminoácidos livres mais concentrados no tecido branquial de P. northropi foram
glicina, arginina, alanina, prolina e lisina (Tabela 2). Assim como na concentração total, os
aminoácidos livres individuais do tecido branquial não apresentaram alterações
significantes nas suas concentrações após exposição às salinidades de 5 ou 45‰ em relação
aos animais controles mantidos em 20‰ (273 ± 52,5 nmol/mg de peso seco) (Figura 11).
52045
Salinidade, ‰
0
100
200
300
400
Concentração, nmol/mg peso seco
Figura 10. Concentração total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
branquial de P. northropi mantido em 5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média
± erro padrão da média, N=6.
52045
Salinidade,
‰
0
50
100
150
200
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Figura 11. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
branquial de Palaemon northropi após exposição à água salobra de 5, 20 (controle) ou
45‰ por 5 dias.
Tabela 2. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
branquial de P. northropi mantido em 5, 20 (controle) ou 45‰ durante 5 dias. Os dados
são a média ± erro padrão da média, N=6. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais
concentrados estão indicados em negrito.
Aminoácido livre 5‰ 20‰ 45‰
Asp
3,0 ± 0.4 2,0 ± 0.5 1,9 ± 0,7
Glu
15,6 ± 3,5 13,1 ± 3,2 21,7 ± 4,8
Ser
5,1 ± 0,9 9,8 ± 2,2 7,6 ± 0,43
Gli
23,7 ±
±±
± 5,8 81,9 ±
±±
± 8,2 129,2 ±
±±
± 8,6
His
5,5 ± 0,9 3,6 ± 0,9 5,6 ± 1,3
Tau
nd nd nd
Arg
67,7 ±
±±
± 13,4 89,3 ±
±±
± 21,6 61,5 ±
±±
± 8,6
Tre
8,1 ± 1,7 2,2 ± 0,3 10,8 ± 6,3
Ala
44,8 ±
±±
± 9,0 31,9 ±
±±
± 7,7 41,1 ±
±±
± 3,9
Pro
42,0 ±
±±
± 7,5 25,1 ±
±±
± 4,7 36,3 ±
±±
± 6,4
Tir
2,5 ± 0,3 2,6 ± 1,2 2,3 ± 1,1
Val
7,3 ± 1,8 4,7 ± 1,1 5,5 ± 0,9
Met
2,2 ± 0,5 2,0 ± 1,4 1,3 ± 0,9
Cis
1,0 ± 0,3 2,5 ± 00,3
nd
Ile
4,2 ± 1,2 4,4 ± 0,7 4,2 ± 0,3
Leu
7,8 ± 1,7 5,0 ± 1,0 8,8 ± 1,2
Fen
3,0 ± 0,8 2,3 ± 0,3 2,3 ± 0,3
Lis
29,7 ±
±±
± 7,6 55,6 ±
±±
± 10,7 30,6 ±
±±
± 4,9
Total
273,7 ± 52,5 338,2 ± 82,0 370,0 ± 36,6
Tecido Nervoso
Semelhantemente ao tecido branquial, a concentração total de aminoácidos livres no
tecido nervoso dos animais expostos a 5 ou 45‰ permaneceu smelhante ao dos animais
controles mantidos em 20‰ (265,6 ± 29,0 nmol/mg de peso seco) (Figura 12). Os
aminoácidos livres mais concentrados no tecido nervoso de P. northropi foram glicina,
taurina, alanina e prolina (Tabela 3). A maioria dos aminoácidos livres permaneceu com
suas concentrações inalteradas quando os animais foram expostos a 5 ou 45‰ em relação
aos animais controles mantidos em 20‰. A treonina (+289%), a isoleucina (108%) e a
leucina (174%) aumentaram nos animais expostos a 5‰, enquanto a alanina e a prolina
aumentaram 68 e 113%, respectivamente, nos animais expostos a 45‰ (Figura 13 e Tabela
3).
52045
Salinidade, ‰
0
100
200
300
Concentração, nmol/mg peso seco
Figura 12. Concentração total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
nervoso de P. northropi mantido em 5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média ±
erro padrão da média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰ (grupo
controle). P≤0,05.
02045
Salinidade,
‰
0
20
40
60
80
Concentra
ção, nmol/mg peso seco
Figura 13. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) no tecido
nervoso de Palaemon northropi após exposição à água salobra de 5, 20 (controle) ou 45‰
por 5 dias.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰. P≤0,05.
Tabela 3. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
nervoso de P. northropi mantido em 5, 20 (controle) ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são
a média ± erro padrão da média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰.
P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em
negrito.
Aminoácido livre
5‰ 20‰ 45‰
Asp
16,5 ± 1,7 20,1 ± 2,7 14,3 ± 3,2
Glu
14,1 ± 0,8 15,5 ± 1,6 11,8 ± 4,3
Ser
5,4 ± 0,5 5,8 ± 0,1 5,1 ± 0,8
Gli
20,3 ±
±±
± 1,4 24,5 ±
±±
± 3,1 35,0 ±
±±
± 6,0
His
3,7 ± 0,7 3,3 ± 0,7 3,8 ± 0,9
Tau
83,0 ±
±±
± 0,2 63,8 ±
±±
± 7,6 57,7 ±
±±
± 9,8
Arg
0,3 ± 0,2 1,8 ± 0,6 0,4 ± 0,1
Tre
a
7,4 ± 0,3 1,9 ± 0,4 2,3 ± 0,4
Ala
26,5 ±
±±
± 1,7 29,2 ±
±±
± 2,9
a
49,3 ±
±±
± 8,5
Pro
29,3 ±
±±
± 3,8 25,9 ±
±±
± 2,7
a
55,3 ±
±±
± 9,6
Tir
3,6 ± 0,4 2,9 ± 0,4 2,1 ± 0,3
Val
4,2 ± 0,4 3,5 ± 0,9 2,7 ± 0,5
Met
4,2 ± 0,4 3,5 ± 0,9 2,7 ± 0,5
Cis
nd nd nd
Ile
a
2,5 ± 0,3 1,2 ± 0,3 1,4 ± 0,2
Leu
a
5,2 ± 0,6 1,9 ± 0,2 2,5 ± 0,3
Fen
2,1 ± 0,2 1,9 ± 0,2 1,9 ± 0,3
Lis
9,8 ± 1,5 25,5 ± 7,4 13,7 ± 2,5
Total
237,0 ± 14,1 265,6 ± 29,0 265,6 ± 44,0
Hemolinfa
Na hemolinfa dos camarões expostos a 20‰ a concentração total de aminoácidos
livres foi de 4607 ± 1169 µmol/l. Após exposição a 5‰ houve um aumento de 149%
(11473 ± 1971 µmol/l) em relação aos animais controles mantidos em 20‰, enquanto nos
animais expostos a 45‰ a concentração total de aminoácidos livres permaneceu
semelhante a dos animais controles (Figura 14).
Os aminoácidos livres predominantes na hemolinfa de P. northropi nas três
salinidades avaliadas foram glicina, taurina, alanina, prolina e leucina (Tabela 4). No
entanto, embora vários aminoácidos livres apresentasssem uma tendência a um aumento em
5‰, somente os aminoácidos prolina e metionina tiveram suas concentrações
significativamente aumentadas. Os aminoácidos livres predominantes na hemolinfa, com
exceção da prolina, permaneceram com suas concentrações inalteradas nos animais
expostos a 5‰ em relação aos animais controles mantidos em 20‰ (Figura 15).
52045
Salinidade, ‰
0
5
10
15
Concentração, mmol/l
Figura 14. Concentração total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) na hemolinfa de
P. northropi mantido em 5, 20 ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média ± erro padrão
da média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰ (grupo controle). P≤5.
52045
Salinidade,
‰
0
500
1000
1500
2000
2500
Concentração, µmol/L
a
Figura 15. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) na
hemolinfa de Palaemon northropi após exposição à água salobra de 5, 20 (controle) ou
45‰ por 5 dias.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰. P≤0,05.
Tabela 4. Concentração dos aminoácidos livres (µmol/l) na hemolinfa de P. northropi
mantido em 5, 20 (controle) ou 45‰ durante 5 dias. Os dados são a média ± erro padrão da
média, N=6.
a
significativamente diferente dos animais em 20‰. P≤0,05. nd: não detectado.
Os aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Aminoácido
livre
5‰ 20‰ 45‰
Asp
35,9 ± 5,8 22,6 ± 5,7 21,4 ± 5,1
Glu
441,6 ± 142,9 95,8 ± 14,6 115,5 ± 13,2
Ser
487,7 ± 130,4 161,1 ± 65,5 189,9 ± 64,9
Gli
2045,1 ±
±±
± 243,8 1435,5 ±
±±
± 54,5 1879,2 ±
±±
± 373,1
His
205,0 ± 56,8 39,4 ± 12,3 69,0 ± 14,3
Tau
1225,0 ± 202,0 838,5 ± 11,7 664,8 ± 99,4
Arg
a
1,6 ± 1,1 48,5 ± 48,5
a
242,1 ± 50,5
Tre
367,9 ± 100,6 43,2 ± 32,5 124,1 ± 9,6
Ala
1333,7 ±
±±
± 330,8 347,1 ±
±±
± 120,2 956,1 ±
±±
± 203,9
Pro
a
1616,8 ±
±±
± 237,5 510,7 ±
±±
± 191,3 890,3 ±
±±
± 163,6
Tir
2,4 ± 0,8 9,2 ± 2,3 25,6 ± 14,4
Val
719,5 ± 228,9 111,7 ± 45,6 238,1 ± 81,2
Met
a
448,9 ± 89,2 46,8 ± 12,5 97,4 ± 36,9
Cis
nd nd nd
Ile
584,0 ± 159,2 93,3 ± 0,7 168,3 ± 57,6
Leu
910,7 ± 209,4 208,8 ± 86,9 308,1 ± 101,1
Fen
517,1 ± 116,8 134,2 ± 78,7 174,1 ± 54,9
Lis
361,5 ± 20,1 420,5 ± 39,2 425,6 ± 16,5
Total
11473,0 ± 1169,0 4607,0 ± 536,0 6597,0 ± 1321,0
5.2 Macrobrachium amazonicum
5.2.1 Mortalidade de estágios ontogenéticos selecionados após exposição a diferentes
salinidades
O camarão de água doce M. amazonicum não apresentou mortalidade nas
salinidades abaixo de 25‰. Em 25‰, houve um total de 12% de mortalidade após 2 e 10
dias de exposição, sendo que todos os camarões que morreram estavam na muda. Em 30‰,
a mortalidade iniciou-se após 24 horas, e 90% dos camarões morreram antes de 7 dias de
exposição. Todos os animais expostos a 35‰ morreram antes de 24 horas. Em relação aos
estágios ontogenéticos iniciais, embora os embriões sobrevivam em água doce, as zoeas I e
II não sobreviveram mais que 2 horas nesta salinidade. No entanto, a taxa de sobrevivência
foi de quase 100% nos experimentos em que as zoeas I e II foram mantidas em 6 ou 25‰.
5.2.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória
A osmolalidade e as concentrações dos íons sódio e cloreto da hemolinfa de M.
amazonicum estão mostradas nas Figuras 16 a 21.
Em água doce (animais controles) a osmolalidade da hemolinfa dos camarões foi de
403,0 ± 34,0 mOsm/kg de água. Após exposição por 10 dias à água salobra de 10, 20, 25 e
30‰, a osmolalidade da hemolinfa aumentou e tornou-se estatisticamente maior que nos
animais mantidos em água doce (Figura 16). A curva de ajuste mostra que a hemolinfa foi
hiperregulada até 20‰, sendo o ponto isosmótico da hemolinfa 685 mOsm/kg água (22‰).
A capacidade osmorregulatória de M. amazonicum foi de 0,43.
0102030
Salinidade,
‰
0
200
400
600
800
1000
Osmolalidade, mOsm/kg água
Linha Isosmótica
Figura 16. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
osmolalidade (Média ± EPM, N=8) da hemolinfa de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente
diferente dos animais expostos a 10‰.
c
significativamente diferente dos animais expostos a
20‰.
d
significativamente diferente dos animais expostos a 25‰ (P≤0,05). Curva ajustada
como polinomial de segundo grau. R
2
=0,97.
Durante exposição à água salobra de 25‰ a osmolalidade da hemolinfa aumentou a
partir de 24 horas, mantendo-se estatisticamente maior que nos animais controles por todo o
decurso temporal da exposição (Figura 17).
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
800
Osmolalidade, mOsm/kg
á
gua
Figura 17. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por 10 dias sobre a osmolalidade
(Média ± EPM, N=8) da hemolinfa de Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce. P≤0,05. A linha pontilhada horizontal indica a
osmolalidade correspondente à salinidade de 25‰.
As concentrações dos íons sódio e cloreto na hemolinfa dos animais mantidos em
água doce foram, respectivamente, 119,5 ± 16,0 mM e 149,0 ± 14 mM. Semelhantemente
ao aumento na osmolalidade da hemolinfa após exposição à água salobra, as concentrações
de sódio e cloreto também aumentaram significativamente após exposição à água salobra
de 10, 20, 25 e 30‰ em relação aos animais mantidos em água doce (Figuras 18 e 19). Os
animais hiperregularam a concentração do sódio até 10‰, sendo 13‰ (299 mM) o ponto
isoiônico. O cloreto foi hiperregulado até o ponto isoiônico de 17‰ (277 mM),
hipoconformando-se em salinidades superiores. Em M. amazonicum, a capacidade
regulatória de sódio foi 1,3 e de cloreto 0,5.
0 102030
Salinidade,
‰
0
200
400
600
800
Concentra
ção de Na
+
, mM
Linha Isoiônica
Figura 18. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
concentração de sódio (Média ± EPM, N=8) da hemolinfa de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente
diferente dos animais expostos a 10‰.
c
significativamente diferente dos animais expostos a
20‰.
d
significativamente diferente dos animais expostos a 25‰. P≤0,05. R
2
=0,96
0102030
Salinidade,
‰
0
100
200
300
400
500
Concentra
ção de Cl
-
, mM
a
b
a
bc
a
bcd
Linha Isoiônica
Figura 19. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
concentração de cloreto (Média ± EPM, N=8) na hemolinfa de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente
diferente dos animais expostos a 10‰.
c
significativamente diferente dos animais expostos a
20‰.
d
significativamente diferente dos animais expostos a 25‰. P≤0,05. R
2
=0,96.
Após exposição à água salobra de 25‰ por até 10 dias, as concentrações de sódio e
cloreto na hemolinfa apresentaram aumento a partir de 24 h, permanecendo maior que nos
animais controles por todo o período da exposição. O íon sódio aumentou progressivamente
durante o decurso temporal da exposição à água salobra (Figuras 20 e 21).
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
C
oncentração de Na
+
, mM
a
ab
abc
abcd
Figura 20. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
de sódio (Média ± EPM, N=8) da hemolinfa de Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos
animais em após 1 dia de exposição.
c
significativamente diferente dos animais em após 2
dias de exposição.
d
significativamente diferente dos animais após 5 dias de exposição.
P≤0,05. A linha pontilhada horizontal indica a concentração de sódio correspondente à
salinidade de 25‰.
012510
Tempo, dias
0
100
200
300
400
Concentra
ção de Cl
-
,
mM
Figura 21. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
de cloreto (Média ± EPM, N=8) na hemolinfa de Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,05. A linha pontilhada
horizontal indica a concentração de cloreto correspondente à salinidade de 25‰.
5.2.3 Grau de hidratação em embriões, zoeas I, zoeas II e tecidos de adultos
O grau de hidratação dos estágios ontogenéticos selecionados de M. amazonicum
está mostrado nas Figuras de 22 a 24.
Os embriões de M. amazonicum mantidos em água doce (66,0 ± 2,0%) ou salobra
de 6 (72,0 ± 0,5%) ou 25‰ (65,8 ± 0,9%) são menos hidratados que as zoeas I e II
mantidas em 6 (79,0 ± 2,0% e 83,0 ± 1,0%, respectivamente) ou 25‰ (77,0 ± 3,0% e 80,0
± 1,0%, respectivamente) (Figura 22).
Após exposição à água salobra de 25‰, embriões, zoeas I e zoeas II não
apresentaram alterações no teor de água.
embrião zoea I zoea II
Estágio Ontogenético
0
20
40
60
80
Grau de Hidratação, %
<0,5 ‰ 6 ‰ 25 ‰
b
Figura 22. Grau de hidratação (Média ± EPM, N=5) de embriões, zoeas I e zoeas II de
Macrobrachium amazonicum após exposição à água doce (<0,5‰) ou salobra (6 ou 25‰)
durante 2 dias.
a
significativamente diferente do embrião em água doce;
b
significativamente
diferente dos embriões em 25‰. P≤0,05.
Nos animais adultos mantidos em água doce (controles) o grau de hidratação dos
tecidos muscular, branquial e nervoso foi estatisticamente semelhante: 80,0 ± 0,2; 81,0 ±
0,5 e 81,0 ± 0,6%, respectivamente. Após exposição à água salobra de 10, 20, 25 ou 30‰
durante 10 dias, o teor de água dos tecidos não se alterou (Figura 23).
Musculo Branquia Nervoso
Tecido
20
40
60
80
Grau de Hidratação, %
0 10 20 25 30
‰
Figura 23. Efeito da exposição à diferentes salinidades durante 10 dias sobre o grau de
hidratação (Média ± EPM, N=7) dos tecidos muscular, branquial e nervoso de
Macrobrachium amazonicum adulto.
Durante a manutenção dos animais em 25‰ por até 10 dias somente o tecido
muscular apresentou redução no grau de hidratação após 24 h de exposição à água salobra,
recuperando-o após 2 dias. Os tecidos branquial e nervoso não apresentaram alteração no
grau de hidratação (Figura 24).
Musculo Branquia Nervoso
Tecido
20
40
60
80
Grau de Hidratação, %
0 1 2 5 10 dias
Figura 24. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre o grau de
hidratação (Média ± EPM, N=7) dos tecidos muscular, branquial e nervoso de
Macrobrachium amazonicum adulto.
a
significativamente diferente dos animais em água
doce. P≤0,05.
5.2.4 Concentração de aminoácidos livres em embriões, zoeas I, zoeas II e tecidos e
hemolinfa de adultos
A concentração de aminoácidos livres nos embriões, zoeas I, zoeas II e tecidos de
M. amazonicum adulto está mostrada nas Figuras 25 a 36.
Nos embriões de M. amazonicum mantidos em água doce a concentração total de
aminoácidos livres foi de 131,0 ± 16,9 nmol/mg de peso seco, sendo que após exposição à
água salobra de 6 ou 25‰ esta concentração permaneceu estatisticamente inalterada (114,6
± 17,1 e 96,5 ± 16,8 nmol/mg de peso seco, respectivamente) (Figura 25). Os aminoácidos
livres mais concentrados nos embriões em ambas as salinidades foram ácido glutâmico,
glicina, alanina e prolina (Tabela 5). No entanto, nenhum aminoácido livre individual teve
sua concentração alterada nos embriões após exposição à água salobra de 25‰ (Figura 26).
embrião zoea I zoea II
Estágio Ontogenético
0
200
400
600
Concentração, nmol/mg peso seco
<0,5 ‰ 6 ‰ 25 ‰
Figura 25. Concentração total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) em embriões,
zoeas I e zoeas II de Macrobrachium amazonicum após exposição à água doce (<0,5‰) ou
salobra (6 ou 25‰).
a
significativamente diferentes das zoeas I em 6‰. P≤0,05.
Tabela 5. Concentração dos aminoácidos livres individuais (nmoles/mg de peso seco) em
embriões, zoeas I e zoeas II de M. amazonicum em função da salinidade do meio. Os
dados são a média ± erro padrão da média, N=6.
a
significativamente diferente dos
respectivos estágios ontogenéticos em 6‰. P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos
livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Amin
oácid
o
livre
Embriões
< 0,5 ‰
Embriões
6 ‰
Embriões
25 ‰
Zoeas I
6 ‰
Zoeas I
25 ‰
Zoeas II
6 ‰
Zoeas II
25 ‰
Asp
3,3 ± 0,5 5,5 ± 0,6 1,7 ± 0,5 8,1 ± 0,8 7,0 ± 0,7 4,8 ± 1,3 5,3 ± 1,1
Glu
13,2 ±
±±
± 0,9 13,9 ±
±±
± 1,2 8,5 ±
±±
± 1,9
18,6 ± 0,8 20,6 ± 2,9
13,5 ±
±±
±
1,6
16,6 ±
±±
± 2,2
Ser
4,7 ± 0,6 4,5 ± 0,4 3,4 ± 0,6 8,5 ± 1,3 10,8 ± 0,9 4,7 ± 0,8 3,96 ± 0,4
Gli
17,6 ±
±±
± 4,4 17,2 ±
±±
± 3,5 14,3 ±
±±
± 3,1
100,5 ±
±±
±
14,6
122,4 ±
±±
±
13,4
66,0 ±
±±
±
12,0
84,6 ±
±±
±
13,6
His
6,7 ± 0,9 8,6 ± 0,6 4,8 ± 1,0 22,4 ± 4,2 23,0 ± 1,9 6,2 ± 0,6 10,6 ± 3,9
Tau
9,4 ±1,3 9,0 ± 0,7 5,9 ± 1,0 17,6 ± 1,8 17,5 ± 1,7
11,7 ±
±±
± 2,2 13,4 ±
±±
± 2,8
Arg
7,5 ± 0,8 8,6 ± 0,8 5,1 ± 0,9 22,1 ± 2,7 22,6 ± 1,9
10,9 ±
±±
± 2,1 12,6 ±
±±
± 3,0
Tre
3,0 ± 0,5 2,9 ± 0,5 2,2 ± 0,4 4,9 ± 1,1 6,1 ± 0,3 2,9 ± 0,2 6,9 ± 4,2
Ala
19,4 ±
±±
± 4,7 9,3 ±
±±
± 2,0 17,0 ±
±±
± 2,9 48,4 ±
±±
± 7,6 65,8 ±
±±
± 4,9 21,4 ±
±±
± 6,5 25,1 ±
±±
± 8,0
Pro
21,2 ±
±±
± 5,4 11,1 ±
±±
± 1,2 15,6 ±
±±
± 2,2 39,6 ±
±±
± 5,3
a
97,2 ±
±±
±
12,3
10,4 ±
±±
± 6,4
a
33,1 ±
±±
± 5,8
Tir
3,9 ± 0,4 5,5 ± 0,4 3,0 ± 0,5 5,8 ± 1,1 5,9 ± 0,6
2,2 ± 0,3 2,9 ± 0,4
Val
4,3 ± 0,7 3,5 ± 0,5 3,3 ± 0,5 10,5 ± 2,0 11,6 ± 0,8 3,4 ± 0,3 4,7 ± 0,7
Met
1,7 ± 0,2 1,1 ± 0,1 1,6 ± 0,2 4,8 ± 1,7 3,9 ± 0,4 1,8 ± 0,2 1,5 ± 0,3
Cis
nd Nd nd
1,1 ± 0,4 0,8 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,3 ± 0,1
Ile
3,5 ± 0,6 3,1 ± 0,5 2,6 ± 0,4 6,5 ± 1,2 6,9 ± 0,4 0,5 ± 0,2 3,0 ± 0,5
Leu
4,7 ± 0,9 3,9 ± 1,1 3,6 ± 0,5 10,5 ± 0,9 11,8 ± 0,7 1,8 ± 0,2 5,4 ± 0,7
Fen
1,0 ± 0,3 2,7 ± 0,4 0,4 ± 0,1 5,5 ± 0,9 6,3 ± 0,4 1,7 ± 0,2
a
2,6 ± 0,3
Lis
5,5 ± 1,2 4,2 ± 1,1 3,0 ± 0,4 12,4 ± 2,5 17,5 ± 3,4 5,1 ± 1,2 6,2 ± 0,7
Total
131,0 ±
16,9
114,6 ±
17,1
96,5 ±
16,8
347,7 ±
45,8
a
496,0 ±
26,2
179,4 ±
22,0
239,0 ±
37,3
<0,5 6 25
Salinidade,
‰
0
10
20
30
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Figura 26. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=6) em
embriões de Macrobrachium amazonicum após exposição à água doce (<0,5‰) ou salobra
(6 e 25‰) por 2 dias.
Nas zoeas I de M. amazonicum mantidas em 6‰ a concentração total de
aminoácidos livres foi de 347,7 ± 45,8 nmol/mg de peso seco. Após exposição à água
salobra de 25‰ por 2 dias houve um aumento de 43% na concentração total de
aminoácidos livres, indo para 496,0 ± 26,2 nmol/mg de peso seco (Figura 25). Os
aminoácidos livres mais concentrados nas zoeas I foram glicina, alanina, taurina e prolina
em ambas as salinidades (Tabela 5).
Embora a concentração total de aminoácidos livres tenha aumentado nas zoeas I
após exposição a 25‰, somente a prolina apresentou aumento significante (indo de 39 ± 5
para 97 ± 12 nmol/mg de peso seco) (Figura 27). Vários aminoácidos livres individuais
apresentaram tendências a um aumento, embora não consideradados estatisticamente
significantes (Tabela 5).
625
Salinidade,
‰
0
50
100
150
Concentra
ção, nmol/mg peso seco
a
Figura 27. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM) nas zoeas I de
Macrobrachium amazonicum após exposição à água salobra de 6 ou 25‰ por 2 dias.
a
significativamente diferente das zoeas I em 6‰. P≤0,05.
Nas zoeas II de M. amazonicum mantidas em 6‰ a concentração total de
aminoácidos livres foi de 179,4 ± 22,0 nmol/mg de peso seco, mantendo-se inalterada após
exposição à 25‰ (239,0 ± 37,3 nmol/mg de peso seco (Figura 25).
Os aminoácidos livres mais concentrados nas zoeas II em ambas as salinidades
foram ácido glutâmico, glicina, taurina, alanina e prolina. Após exposição à água salobra de
25‰ somente a prolina (de 10,0 ± 6,0 para 33,0 ± 6,0 nmol/mg de peso seco) (Figura 28)e
a fenilalanina (de 2,0 ± 0,2 para 3 ± 0,3 nmol/mg de peso seco) tiveram suas concentrações
alteradas (Tabela 5).
625
Salinidade,
‰
0
20
40
60
80
100
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
a
Figura 28. Concentração dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM) nas zoeas II de
Macrobrachium amazonicum após exposição à água salobra de 6 ou 25‰ por 2 dias.
a
significativamente diferente das zoeas II em 6 ‰. P≤0,05.
Tecido Muscular
A concentração total dos aminoácidos livres no tecido muscular apresentou aumento
(+72%) no 5
o
dia de exposição à água salobra de 25‰ (Figura 29), embora as
concentrações de alguns aminoácidos livres individuais já aumentassem após 24 horas
(Tabela 6). Os principais aminoácidos livres que contribuiram para o aumento da
concentração total após 5 dias foram serina (+232%), arginina (+75%), alanina (+400%),
prolina(+270%) e leucina (+72%) (Figura 30 e Tabela 6). Embora a glicina seja um dos
principais aminoácidos livres, sua concentração permaneceu inalterada após exposição à
água salobra de 25‰.
012510
Tempo
,
dias
50
100
150
200
250
300
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
abcd
Figura 29. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) no tecido muscular de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente
diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra;
c
significativamente diferente
dos expostos durante 2 dias à água salobra;
d
significativamente diferente dos animais
expostos durante 5 dias à água salobra. P≤0,05.
Tabela 6. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
muscular de M. amazonicum mantido em água doce (0 dia) ou durante exposição à água
salobra (25‰). Os dados são a média ± erro padrão da média, N=7.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos animais expostos
durante 1 dia à água salobra.
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2
dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos animais expostos durante 5 dias à
água salobra P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão
indicados em negrito.
Tempo, dias
Amin
oácid
o livre
0 1 2 5 10
Asp
0,13 ± 0,03 1,0 ± 0,2 0,7 ± 0,1 1,1 ± 0,2 0, ± 0,2
Glu
3,0 ± 1,6 4,2 ± 1,6 2,4 ± 0,4 2,4 ± 0,3 2,5 ± 0,5
Ser
2,5 ± 0,5
a
5,7 ± 0,8
a
6,3 ± 1,3
a
8,3 ± 0,9
a
7,4 ± 0,9
Gli
95,2 ±
±±
± 18,8 71,2 ±
±±
± 8,8
a
54,6 ±
±±
± 4,9
c
92,4, ±
±±
± 6,4
ad
55,9 ±
±±
± 5,2
His
1,9 ± 0,6 3,1 ± 0,5 3,7 ± 0,3
abce
6,0 ± 0,8 2,9 ± 0,4
Tau
nd nd nd nd nd
Arg
29,0 ±
±±
± 8,8 28,1 ±
±±
± 2,3 19,0 ±
±±
± 1,2
abce
50,8 ±
±±
± 3,3 32,0 ±
±±
± 3,2
Tre
0,4 ± 0,2 2,8 ± 0,7
ae
5,3 ± 1,0
a
4,1 ± 1,0 1,7 ± 0,5
Ala
12,5 ±
±±
± 1,8 16,3 ±
±±
± 1,6 19,2 ±
±±
± 1,1
abce
62,8 ±
±±
± 6,3
abc
50,2 ±
±±
± 0,3
Pro
9,6 ±
±±
± 4,0 14,6 ±
±±
± 2,1 12,9 ±
±±
± 0,8
abc
35,6 ±
±±
± 4,1
abc
37,1 ±
±±
± 3,6
Tir
0,2 ± 0,05
a
1,7 ± 0,3
ae
2,4 ± 0,2
a
2,3 ± 0,4
acd
1,2 ± 0,1
Val
1,3 ± 0,2
a
4,17 ± 0,5
a
7,9 ± 0,5
a
6,6 ± 0,8
a
3,3 ± 0,3
Met
1,1 ± 0,3
abe
1,5 ± 0,2 3,2 ± 0,3
abe
2,5 ± 0,4 1,0 ± 0,2
Cis
nd nd nd nd nd
Ile
0,8 ± 0,47
a
2,4 ± 0,3
a
4,5 ± 0,2
a
2,0 ± 0,3
a
1,0 ± 0,08
Leu
2,5 ± 0,5
a
4,5 ± 0,5
a
8,4 ± 0,3
a
4,3 ± 0,4
a
2,5 ± 0,3
Fen
0,2 ± 0,06
ae
0,5 ± 0,08 0,8 ± 0,05
ae
0,7 ± 0,1 0,3 ± 0,04
Lis
2,6 ± 0,9 3,2 ± 0,4 3,6 ± 0,3
ab
1,6 ± 0,08
ab
1,7 ± 0,2
Total
164,0 ± 25,0 164,7 ± 14,1 154,3 ± 5,4
abc
283,0 ± 22,0
d
201,9 ± 18,0
012510
Tempo, dias
0
20
40
60
80
100
120
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Gli
A
rg
A
la
P
ro
Figura 30. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) no tecido muscular de
Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra;
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à água salobra. P≤0,05.
Tecido Branquial
A concentração total dos aminoácidos livres no tecido branquial do camarão M.
amazonicum aumentou em dois períodos distintos em relação aos animais mantidos em
água doce: após 24 horas (+62%) e após 5 dias (+43%) (Figura 31). Os principais
aminoácidos livres responsáveis pelo aumento em 24 horas foram: ácidos aspartico e
glutâmico (+180% e 132%, respectivamente), glicina (+185%), alanina (+36%), prolina
(+214%), tirosina (+106%) e valina (+75%). Os aminoácidos relacionados ao aumento na
concentração total após 5 dias foram: arginina (+103%), alanina (+35%) e prolina (+494%)
(Figura 32 e Tabela 7).
012510
Tempo, dias
0
50
100
150
200
250
Concentra
çã
o, nmol/mg peso seco
Figura 31.
Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) no tecido branquial de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,5.
Tabela 7. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
branquial de M. amazonicum mantido em água doce (0 dia) ou durante exposição à água
salobra (25‰). Os dados são a média ± erro padrão da média, N=7.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos animais expostos
durante 1 dia à água salobra.
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2
dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos animais expostos durante 5 dias à
água salobra. P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão
indicados em negrito.
Tempo, dias
Amin
oácid
o livre
0 1 2 5 10
Asp
2,0 ± 0,2
a
5,6 ± 1,2
b
3,5 ± 4,0
b
2,1 ± 0,1
b
1,7 ± 0,4
Glu
4,9 ± 0,7
a
11,4 ± 2,1 6,4 ± 1,6 8,0 ± 1,6 6,5 ± 0,6
Ser
5,5 ± 0,7 6,4 ± 0,6 4,4 ± 0,6 3,8 ± 0,4 4,2 ± 0,8
Gli
12,8 ±
±±
± 1,5
a
36,5 ±
±±
± 2,0
b
15,5 ±
±±
± 3,3
b
17,7 ±
±±
± 2,1
b
8,1 ±
±±
± 0,8
His
3,1 ± 0,4 4,8 ± 0,7 3,3 ± 0,4 4,8 ± 0,8
d
2,3 ± 0,5
Tau
0,7 ± 0,07 0,9 ± 0,4 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,09 0,4 ± 0,09
Arg
19,1 ±
±±
± 1,9 28,0 ±
±±
± 4,9 18,80 ±
±±
± 3,9
abc
38,8 ±
±±
± 3,5
d
23,4 ±
±±
± 3,2
Tre
3,9 ± 0,4 5,4 ± 0,7 4,5 ± 0,5 3,7 ± 0,3
b
2,4± 0,8
Ala
37,1 ±
±±
± 3,2
a
50,6 ±
±±
± 4,2
b
33,2 ±
±±
± 4,0
ac
50,0 ±
±±
± 5,2
bd
34,9 ±
±±
± 1,8
Pro
5,7 ± 1,2
a
17,9 ± 2,2
a
18,3 ± 3,1
abc
33,9 ± 3,7
ad
20,0 ± 1,6
Tir
1,6 ± 0,3
a
3,3 ± 0,3 2,7 ± 0,3 2,6 ± 0,2 2,2 ± 0,5
Val
4,3 ± 0,4
a
7,5 ± 0,8 6,6 ± 0,4 6,1 ± 0,4
b
4,6 ± 0,9
Met
2,8 ± 0,6 2,9 ± 1,3 1,8 ± 0,2 2,4 ± 0,2 1,7 ± 0,3
Cis
nd nd nd nd Nd
Ile
2,5 ± 0,2 3,5 ± 0,4 3,0 ± 0,2 2,7 ± 0,2 2,2 ± 0,5
Leu
4,9 ± 0,4 6,7 ± 0,7 5,5 ± 0,4 4,8 ± 0,4 3,8 ± 1,1
Fen
2,1 ± 0,2 2,1 ± 0,3 2,0 ± 0,3 1,5 ± 0,3 1,3 ± 0,5
Lis
17,8 ±
±±
± 2,0 21,0 ±
±±
± 34 14,0 ±
±±
± 2,4
abc
5,2 ±
±±
± 0,4
abc
3,9 ±
±±
± 0,7
Total
133,1 ± 11,3
a
215,6 ± 20,0 142,8 ± 17,0
a
190,5 ± 11,0 124,8 ± 10,8
012510
Tempo, dias
0
10
20
30
40
50
60
Concentra
ção, nmol/mg peso seco
Gli
A
rg
A
la
P
ro
Figura 32. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) do tecido branquial posterior de
Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra;
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos animais expostos durante 5 dias à água salobra.
*significativamente diferente dos animais no período imediatamente anterior. P≤0,5.
Tecido Nervoso
A concentração total dos aminoácidos livres no tecido nervoso de M. amazonicum
não apresentou alteração após exposição à água salobra de 25‰ por até 10 dias (Figura 33).
No entanto, a concentração de alguns aminoácidos livres individuais aumentou em alguns
períodos do decurso temporal da exposição, por exemplo: ácidos aspártico e glutâmico
(+45% e 63%, respectivamente), glicina (+43%), alanina (até +49%) e prolina (até +80%)
(Figura 34 e Tabela 8).
012510
Tempo, dias
0
50
100
150
200
250
Concentra
çã
o, nmol/mg peso seco
Figura 33. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) no tecido nervoso de Macrobrachium
amazonicum.
012510
Tempo, dias
0
10
20
30
40
50
60
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Gli Arg Ala Pro
Figura 34. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) do tecido nervoso de
Macrobrachium amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra;
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à água salobra. P≤0,05.
Tabela 8. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
nervoso de M. amazonicum mantido em água doce (0 dia) ou durante exposição à água
salobra (25‰). Os dados são a média ± erro padrão da média, N=7.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos animais expostos
durante 1 dia à água salobra.
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2
dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à
água salobra. P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão
indicados em negrito.
Tempo, dias
Amin
oácid
o livre
0 1 2 5 10
Asp
8,5 ± 1,7 9,5 ± 0,6 8,8 ± 0,3 12,6 ± 0,9
abc
15,6 ± 3,0
Glu
5,8 ± 1,2 9,5 ± 1,0 8,5 ± 0,5 11,3 ± 1,0
abcd
15,6 ± 1,5
Ser
5,0 ± 0,9 3,7 ± 0,3 3,2 ± 0,3 2,7 ± 0,5 3,1 ± 0,4
Gli
19,9 ±
±±
± 1,2
a
34,9 ±
±±
± 3,1 20,0 ±
±±
± 3,2
b
13,9 ±
±±
± 2,1
b
12,3 ±
±±
± 1,9
His
2,1 ± 0,4 3,0 ± 0,2 2,5 ± 0,4 3,5 ± 0,7 3,0 ± 0,3
Tau
nd nd nd nd nd
Arg
26,2 ±
±±
± 4,0 32,5 ±
±±
± 3,6 25,7 ±
±±
± 2,8 39,7 ±
±±
± 2,5 38,5 ±
±±
± 3,7
Tre
4,6 ± 1,1 5,0 ± 0,4 5,0 ± 0,4 4,8 ± 0,6 4,5 ± 0,3
Ala
27,4 ±
±±
± 4,1 47,7 ±
±±
± 3,5 35,2 ±
±±
± 5,7 38,0 ±
±±
± 3,2
abc
53,6 ±
±±
± 4,8
Pro
10,8 ± 2,0
a
35,0 ± 2,0
a
5,6 ± 1,3
abc
51,4 ± 5,8
abc
53,6 ± 3,7
Tir
2,7 ± 0,7 1,7 ± 0,20 3,1 ± 0,6 2,4 ± 0,4 1,9 ± 0,1
Val
3,0 ± 0,8
a
3,0 ± 0,3 4,3 ± 0,7 2,5 ± 0,4
a
2,7 ± 0,2
Met
2,4 ± 0,6 0,6 ± 0,2 2,0 ± 0,4 1,3 ± 0,3 0,5 ± 0,1
Cis
nd nd nd nd nd
Ile
2,5 ± 0,7 1,6 ± 0,2 3,1 ± 1,0 1,5 ± 0,2 1,4 ± 0,1
Leu
5,0 ± 1,3 2,8 ± 0,4 5,2 ± 2,0 2,4 ± 0,4 1,9 ± 0,1
Fen
2,5 ± 0,6
a
0,8 ± 0,7 1,5 ± 0,3
a
1,1 ± 0,4
a
0,7 ± 0,06
Lis
13,6 ± 3,3 3,8 ± 0,6 4,0 ± 0,4 2,9 ± 0,6 2,8 ± 0,7
Total
143,4 ± 23,1 196,8 ± 13,7 151,5 ± 12,8 192,2 ± 16,6 211,6 ± 13,5
Hemolinfa
A concentração total dos aminoácidos livres na hemolinfa dos camarões mantidos
em água doce foi de 2887,0 ± 440 µmol/L, sendo glicina, alanina, prolina, leucina e lisina
os mais concentrados (Tabela 9). A concentração total dos aminoácidos livres na hemolinfa
permaneceu inalterada após exposição à água salobra de 25‰ por até após 10 dias (P=0,17)
(Figura 35). No entanto, alguns aminoácidos livres apresentaram significante aumento ao
longo do decurso temporal da exposição à água salobra, principalmente alanina (+80%) e
prolina (+135%) (Figura 36 e Tabela 9).
012510
Tempo, dias
0
1000
2000
3000
4000
5000
Concentração, umol/l
Figura 35. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) na hemolinfa de Macrobrachium
amazonicum.
Tabela 9. Concentração dos aminoácidos livres (µmol/l) na hemolinfa de M. amazonicum
mantido em água doce (0 dia) ou durante exposição à água salobra (25‰). Os dados são a
média ± erro padrão da média, N=7.
a
significativamente diferente dos animais em água
doce.
b
significativamente diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra.
c
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos animais expostos durante 2 dias à água salobra. P≤0,05.
nd: não detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Tempo, dias
Amin
oácid
o livre
0 1 2 5 10
Asp
19,0 ± 4,0
a
4,0 ± 1,5
a
6,0 ± 1,0
a
5,0 ± 0,8
a
11,0 ± 3,0
Glu
36,0 ± 8,0 35,0 ± 8,0 41,0 ± 11,0 29,0 ± 4,0 67,0 ± 11,0
Ser
202,0 ± 96,0 86,0 ± 17,0 189,0 ± 14,0 37,0 ± 7,0 68,0 ± 12,0
Gli
350,0 ±
±±
± 94,0 534,0 ±
±±
± 58,0 399,0 ±
±±
± 47,0 363,0 ±
±±
± 36,0 619,0 ±
±±
± 113,0
His
45,0 ± 9,0 50,0 ± 3,0 66,0 ± 7,0
41,0 ± 7,0 56,0 ± 13,0
Tau
nd nd nd nd nd
Arg
202,0 ± 26,0 115,0 ± 22,0 218,0 ± 8,0 138,0 ± 17,0
abcd
340,0 ±
54,0
Tre
96,0 ± 17,0 51,0 ± 7,0 91,0 ± 12,0 61,0 ± 10,0 62,0 ± 7,0
Ala
395,0 ±
±±
± 95,0 297,0 ±
±±
± 64,0 294,0 ±
±±
± 16,0 454,0 ±
±±
± 43,0
abcd
713,0 ±
±±
±
105,0
Pro
304,0 ±
±±
± 71,0 307,0 ±
±±
± 27,0 403,0 ±
±±
± 41,0 444,0 ±
±±
± 48,0
abcd
716,0 ±
±±
±
181,0
Tir
72,0 ± 1,0 69,0 ± 17,0 96,0 ± 14,0 107,0 ± 28,0 195,0 ± 113,0
Val
150,0 ± 24,0 110,0 ± 10,0 171,0 ± 21,0 131,0 ± 20,0 171,0 ± 27,0
Met
92,0 ± 10,0 67,0 ± 12,0 109,0 ± 8,0 79,0 ± 14,0 213,0 ± 89,0
Cis
nd nd nd nd nd
Ile
214,0 ± 38,0 111,0 ± 14,0 202,0 ± 18,0 142,0 ± 24,0 158,0 ± 45,0
Leu
442,0 ±
±±
± 68,0
a
170,0 ±
±±
± 17,0 251,0 ±
±±
± 42,0 260,0 ±
±±
± 43,0 305,0 ±
±±
± 69,0
Fen
170,0 ± 17,0
a
85,0 ± 17,0 143,0 ± 19,0
a
84,0 ± 17,0 125,0 ± 22,0
Lis
5,5 ± 2,2 10,2 ± 1,9 6,6 ± 1,6 8,3 ± 1,9 9,0 ± 2,8
Total
2887,5 ± 439,9 2564,6 ± 246,4 2745,8 ± 256,0 2580,0 ± 263,2
4095,3 ±
1016,0
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
800
1000
Concentração, µmol/L
G
li
A
la
P
ro
L
eu
Figura 36. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=7) da hemolinfa de Macrobrachium
amazonicum.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente
diferente dos animais expostos durante 1 dia à água salobra;
c
significativamente diferente
dos animais expostos durante 2 dias à água salobra.
d
significativamente diferente dos
animais expostos durante 5 dias à água salobra P≤0,05.
5.3 Dilocarcinus pagei
5.3.1 Mortalidade dos estágios ontogenéticos selecionados
Nos experimentos realizados com o caranguejo de água doce D. pagei adulto não
houveram mortes em 5, 10, 15 ou 20‰. Em 25‰, a mortalidade iniciou-se após 24 horas
de exposição, sendo que 20% dos animais morreram antes de 8 dias. Em 30‰, a
mortalidade iniciou-se após 2 dias, sendo que 50% dos caranguejos morreram antes de 9
dias de exposição. Em 35‰ todos morreram no segundo dia. Não houve mortalidade de
embriões e juvenis de D. pagei mantidos em água doce (<0,5‰) ou expostos à água salobra
de 25‰.
5.3.2 Avaliação da capacidade osmo- e ionoregulatória
A osmolalidade e as concentrações dos íons sódio e cloreto da hemolinfa do
caranguejo D. pagei estão mostradas nas Figuras 37 a 42.
Em água doce (animais controles) a osmolalidade da hemolinfa foi de 420,0 ± 39,0
mOsm/kg de água, mantendo-se estatisticamente inalterada após exposição à água salobra
de 5, 10, 15 e 20‰ por 10 dias. A partir de 25‰ tornou-se maior que nos animais controles
(Figura 37). A curva mostra que a osmolalidade da hemolinfa foi hiperregulada até o ponto
isosmótico de 24‰ (744 mOsm/kg de água). A capacidade osmorregulatória de D. pagei
foi de 0,45.
0 5 10 15 20 25 30 35
Salinidade, ‰
0
200
400
600
800
1000
Osmolalidade, mOsm/Kg de
água
Linha Isosmótica
Figura 37. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
osmolalidade (Média ± EPM, N=5) da hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,05. R
2
= 0,98.
Durante exposição à água salobra de 25‰, a osmolalidade da hemolinfa aumentou a
partir de 24 horas, mantendo-se maior que nos animais controles por todo o decurso
temporal da exposição (Figura 38).
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
800
Osmolalidade, mOsm/kg !
água
Figura 38. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a osmolalidade
(Média ± EPM, N=5) da hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos
animais em água doce. P≤0,05. A linha pontilhada horizontal indica a osmolalidade
correspondente à salinidade de 25‰.
Osmolalidade, mOsm/kg água
Osmolalidade, mOsm/kg água
As concentrações dos íons sódio e cloreto da hemolinfa dos animais mantidos em
água doce foram, respectivamente, 214,0 ± 20,2 mM e 226,0 ± 13 mM, valores mantidos
inalterados até 20‰, quando as concentrações aumentaram em relação aos animais
controles (Figuras 39 e 40). Os animais regularam as concentrações de sódio e cloreto até
15‰ conformando-se em salinidades mais elevadas. O ponto isoiônico da concentração de
sódio foi 449 mM (22‰), e de cloreto 256 mM (16‰). A capacidade ionorregulatória de
D. pagei para sódio foi 1,06 e para cloreto 0,4.
0 5 10 15 20 25 30 35
Salinidade,
‰
0
200
400
600
800
Concentração de Na
+
, mM
Linha Isoiônica
ab
ab
ab
ab
Figura 39. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
concentração de sódio (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos
animais no período imediatamente anterior. P≤0,05. R
2
= 0,97
0 5 10 15 20 25 30 35
Salinidade,
‰
0
200
400
600
Concentra
ção de Cl
-
, mM
ab
a
a
ab
Linha Isoiônica
Figura 40. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre a
concentração de cloreto (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos
animais no período imediatamente anterior. P≤0,05. R
2
= 0,97.
Durante exposição dos animais à água salobra de 25‰ por até 10 dias, as
concentrações dos íons sódio e cloreto aumentaram a partir de 24 h, permanecendo maior
que nos animais controles por todo o período de exposição (Figuras 41 e 42).
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
Concentra
ção de Na
+
, mM
Figura 41. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
de sódio (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce. P≤0,05. A linha pontilhada horizontal indica a
concentração de sódio correspondente à salinidade de 25‰.
012510
Tempo, dias
0
100
200
300
400
Concentração de Cl
-
, mM
Figura 42. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
de cloreto (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente
diferente dos animais em água doce. P≤0,05. A linha pontilhada horizontal indica a
concentração de cloreto correspondente à salinidade de 25‰.
5.3.3 Avaliação da osmolalidade e dos íons sódio e cloreto na urina
A osmolalidade da urina dos animais mantidos em água doce foi de 383,8 ± 43,7
mOsm/kg de água, aumentado para 776,7 ± 43,0 mOs/kg de água nos animais expostos a
25‰ por 5 dias. O test-t mostrou que a osmolalidade da urina de D. pagei é isosmótica à
hemolinfa em água doce (367,0 ± 46,8 mOsm/kg de água) ou salobra de 25‰ (777,0 ± 11,0
mOsm/kg de água).
As concentrações dos íons sódio e cloreto na urina dos animais mantidos em água
doce foram, respectivamente, 101,6 ± 17,0 e 111,0 ± 5,1 mM. Nos animais expostos à água
salobra de 25‰ por 5 dias as concentrações do sódio e do cloreto apresentaram um
aumento significante de 86 e 180%, respectivamente, em relação aos animais controles.
Semelhantemente à osmolalidade, os íons sódio e cloreto na urina são isoiônicas à
hemolinfa nos animais mantidos em água doce ou expostos à água salobra (Figuras 43 e
44).
Figura 43. Osmolalidade e concentrações dos íons sódio e cloreto (Média ± EPM, N=6) na
hemolinfa e urina de D. pagei mantido em água doce durante 5 dias.
hemolinfa urina
<0,5‰
0
100
200
300
400
Osmolalidade, mOsm/kg de água
O
smolalidade
S
ódio
C
loreto
Concentração de Na
+
e Cl
-
, mM
400
300
200
100
0
Figura 44. Osmolalidade e concentrações dos íons sódio e cloreto (Média ± EPM, N=6) na
hemolinfa e urina de D. pagei mantido em água salobra de 25‰ durante 5 dias.
5.3.4 Grau de hidratação e Concentração de Aminoácidos Livres em embriões, juvenis
e tecidos de adultos
O grau de hidratação de embriões, juvenis e tecidos de adultos do caranguejo D.
pagei é mostrado nas Figuras de 45 a 47.
Os embriões de D. pagei apresentaram uma redução significativa de 11% no teor de
água após exposição a água salobra de 25‰, indo de 69,5 ± 0,7 para 61,5 ± 1,6%. Os
juvenis apresentaram o mesmo grau de hidratação quando mantidos em água doce (76,6 ±
6,6%) ou salobra de 25‰ (76,0 ± 1,8%)(Figura 45).
hemolinfa urina
25‰
0
200
400
600
800
Osmolalidade, mOsm/kg de água
Osmolalidade Sódio Cloreto
Concentração de Na
+
e Cl
-
, mM
800
600
400
200
0
embrião juvenil
Estágio Ontogenético
0
20
40
60
80
Grau de Hidratação, %
<0,5 ‰ 25 ‰
Figura 45. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 2 dias sobre o grau de
hidratação (Média ± EPM, N=5) de embriões e juvenis de D. pagei.
a
significativamente
diferente dos embriões em água doce.
P≤0,05.
Durante a manutenção dos caranguejos adultos em água doce (animais controles) o
tecido nervoso apresentou-se como o mais hidratado (85,4 ± 1,39%) (P=0,002) e os demais
tecidos tiveram o mesmo grau de hidratação, inclusive as brânquias anteriores e posteriores.
Após exposição à água salobra de 5, 10, 15, 20, 25 e 30‰ durante 10 dias, o teor de
água dos tecidos muscular e nervoso permaneceu semelhante ao dos animais mantidos em
água doce. Nos tecidos branquiais anterior e posterior ocorreu aumento a partir de 5‰,
permanecendo inalterado nos períodos subsequentes (Figura 46).
Musculo Branquia A. Branquia P. Nervoso
Tecido
0
20
40
60
80
100
Grau de Hidratação, %
<0,5 5 10 15
20 25 30
‰
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
a
*
Figura 46. Efeito da exposição a diferentes salinidades durante 10 dias sobre o grau de
hidratação (Média ± EPM, N=5) dos tecidos muscular, branquial anterior (A), branquial
posterior (P) e nervoso.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
*
significativamente diferente dos tecidos muscular e branquial. P≤0,05.
Após exposição dos animais à água salobra de 25‰ por até 10 dias os tecidos
muscular (P=0,22), branquial anterior (P=0,10), branquial posterior (P=0,11) e nervoso
(P=0,19) não apresentaram alteração no grau de hidratação (Figura 47).
Musculo Branquia A. Branquia P. Nervoso
Tecido
0
20
40
60
80
100
Grau de Hidratação
, %
0 1 2 5 10
dias
Figura 47. Efeito da exposição a salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre o grau de
hidratação (Média ± EPM, N=5) dos tecidos muscular, branquial anterior (A), branquial
posterior (P) e nervoso de Dilocarcinus pagei.
5.3.5. Concentração de aminoácidos livres em embriões, juvenis e tecidos e hemolinfa
de adultos
As concentrações totais e individuais dos aminoácidos livres em embriões, juvenis e
tecidos de adultos de D. pagei estão mostradas nas figuras de 48 a 58.
Nos embriões mantidos em água doce a concentração total de aminoácidos livres foi
de 42,6 ± 3,5 nmol/mg peso seco, havendo um aumento de 95% após exposição à água
salobra de 25‰ durante 2 dias (83,0 ± 8,7 nmol/mg peso seco) (Figura 48). Esse aumento
se deve principalmente aos aminoácidos arginina e prolina (Figura 49) e, embora a maioria
dos aminoácidos livres apresentassem uma tendência a aumentar a sua concentração após
exposição à água salobra, esse aumento não foi estatisticamente significante (Tabela 10).
embrião juvenil
Estágio Ontogenético
0
50
100
150
Concentração, nmol/mg peso seco
<0,5 ‰ 25 ‰
a
Figura 48. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por 2 dias sobre a concentração total
de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) em embriões e juvenis de D. pagei.
a
significativamente diferente dos embriões em água doce. P≤0,05.
Tabela 10: Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) em embriões e
juvenis de D. pagei mantidos em água doce (<0,5‰) ou expostos à água salobra (25‰).
Os dados são a média ± erro padrão da média, N=5.
a
significativamente diferente dos
respectivos estágios ontogenéticos em água doce. P≤0,05. nd: não detectado. Os
aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Aminoácid
o livre
Embriões
< 0,5 ‰
Embriões
25 ‰
Juvenis
< 0,5 ‰
Juvenis
25 ‰
Asp
1,1 ± 0,2 1,5 ± 0,2 2,4 ± 0,3
a
0,6 ± 0,2
Glu
1,7 ± 0,1 3,8 ± 0,7 4,7 ± 0,4
a
6,5 ± 0,3
Ser
2,4 ± 0,5 4,1 ± 0,9 7,0 ± 0,2
a
2,9 ± 0,3
Gli
5,1 ±
±±
± 0,4 5,3 ±
±±
± 0,5 11,4 ±
±±
± 0,5 9,8 ±
±±
± 1,6
His
1,3 ± 0,4 1,5 ± 0,3 4,8 ± 0,5 5,1 ± 0,8
Tau
1,6 ± 0,1 3,8 ± 0,5 4,4 ± 0,2 4,6 ± 0,4
Arg
2,0 ± 0,2
a
6,7 ±
±±
± 0,5 15,0 ±
±±
± 0,5 15,9 ±
±±
± 0,5
Tre
2,0 ± 0,3 4,3 ± 0,7 6,3 ± 0,2
a
4,0 ± 0,3
Ala
7,0 ±
±±
± 1,2 11,1 ±
±±
± 2,9 17,3 ±
±±
± 0,5 23,5 ±
±±
± 12,5
Pro
2,4 ± 0,3
a
9,1 ±
±±
± 1,4
3,4 ± 0,6
15,4 ±
±±
± 3,3
Tir
2,6 ± 0,4
a
4,9 ± 0,3 8,9 ± 1,0
a
5,8 ± 0,3
Val
2,9 ± 0,6 4,9 ± 0,8
10,0 ±
±±
± 0,3 7,2 ±
±±
± 0,8
Met
0,9 ± 0,1 2,1 ± 0,3 3,4 ± 0,2 2,1 ± 0,5
Cis
nd nd nd Nd
Ile
2,4 ± 0,1 3,3 ± 0,5 7,9 ± 0,5 5,2 ± 0,6
Leu
2,8 ± 0,2 4,3 ± 0,6 10,5 ± 2,5
a
6,9 ± 0,8
Fen
2,9 ± 0,6 3,1 ± 0,5 11,3 ± 2,5
a
3,8 ± 1,0
Lis
1,4 ± 0,1 4,3 ± 1,5 8,3 ± 0,3
a
6,9 ± 0,1
Total
42,6 ± 3,5
a
82,9 ± 8,7
136,7 ±
6,0
126,3 ±
11,9
<0,5 25
Salinidade,
‰
0
5
10
15
Concentrac
ção
, nmol/mg peso seco
a
a
Figura 49. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por 2 dias sobre a concentração dos
principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) de embriões de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos embriões em água doce. P≤0,05.
Assim como o grau de hidratação, a concentração total de aminoácidos livres nos
juvenis de D. pagei permaneceu inalterada após exposição à água salobra de 25‰ (Figura
48). Embora as concentrações de alguns aminoácidos livres como a alanina e a prolina
apresentassem uma tendência a aumentar, esta não foi estatisticamente significante (Figura
50). Alguns aminoácidos com reduzida contribuição como a treonina, tirosina e leucina
tiveram suas concentrações reduzidas após exposição à água salobra (Tabela 10).
<0,5 25
Salinidade, ‰
0
10
20
30
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Figura 50. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por 2 dias sobre a concentração dos
principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) em juvenis de Dilocarcinus pagei.
Tecido Muscular
A concentração total dos aminoácidos livres no tecido muscular do caranguejo D.
pagei apresentou uma tendência a aumentar a partir do 5
o
dia de exposição, embora
alcançasse valor significativamente maior que os animais controles apenas no 10
o
dia
(Figura 51).
012510
Tempo, dias
0
20
40
60
80
100
120
Concentra
çã
o, nmol/mg peso seco
a
bc
Figura 51. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido muscular de Dilocarcinus
pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente
diferente dos animais após 1 dia de exposição.
c
significativamente diferente dos animais
após 2 dias de exposição. P≤0,05.
Os aminoácidos livres mais concentrados no tecido muscular dos caranguejos
mantidos em água doce como a glicina, arginina, serina, ácido glutâmico (Tabela 11) não
apresentaram aumento após exposição à água salobra de 25‰, exceto a alanina e prolina
(Figura 52). Alguns aminoácidos aumentaram já em 5 dias de exposição, foram eles:
histidina, alanina, valina, metionina, e fenilalanina (Tabela 11). Após 10 dias, a histidina, a
valina e a fenilalanina voltaram às mesmas concentrações dos animais controles, embora o
ácido aspártico e a tirosina aumentassem neste período.
012510
Tempo, dias
0
10
20
30
40
50
Concentração, nmol/mg peso seco
G
li
A
rg
A
la
P
ro
Figura 52. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido muscular de
Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente diferente dos animais após 1 dia de exposição;
c
significativamente
diferente dos animais após 2 dias de exposição. P≤0,05.
Tabela 11. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
muscular de D. pagei mantido em água doce ou após exposição à água salobra (25‰). Os
dados são a média ± erro padrão da média, N=5.
a
significativamente diferente dos animais
em água doce.
b
significativamente diferente dos animais após 1 dia de exposição.
c
significativamente diferente dos animais após 2 dias de exposição. P≤0,05. nd: não
detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Tempo, dias
Aminoácidos
livres
0 1 2 5 10
Asp
0,1 ± 0,1 0,7 ± 0,5 0,6 ± 0,3 1,0 ± 0,7
a
2,1 ± 0,4
Glu
1,7 ± 1,4 1,4 ± 0,5 1,7 ± 0,7 1,7 ± 0,7 1,3 ± 0,3
Ser
2,8 ± 2,2 0,9 ± 0,2 0,7 ± 0,2 1,7 ± 0,3 1,9 ± 0,4
Gli
15,2 ±
±±
± 2,7 20,5 ±
±±
± 5,3 18,0 ±
±±
± 2,0 33,4 ±
±±
± 6,1 38,8 ±
±±
± 6,9
His
0,3 ± 0,1 1,2 ± 0,4 0,9 ± 0,2
a
2,8 ± 0,9
a
2,6 ± 0,5
Tau
0,1 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,6 ± 0,5 0,9 ± 0,4 0,9 ± 0,6
Arg
7,6 ±
±±
± 1,0 9,1 ±
±±
± 2,4 10,1 ±
±±
± 0,5 14,2 ±
±±
± 0,6 17,6 ±
±±
± 2,9
Tre
0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,3 0,1 ± 0,1 0,3 ± 0,2
nd
Ala
5,1 ±
±±
± 1,5 8,3 ±
±±
± 1,8 7,2 ±
±±
± 1,0
abc
16,3 ±
±±
± 2,5
abc
17,2 ±
±±
± 1,9
Pro
1,2 ± 0,3 3,9 ± 1,2 4,6 ± 2,1 9,0 ± 1,8
a
10,0 ± 1,5
Tri
0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,8 ± 0,2
a
1,1 ± 0,2
Val
0,2 ± 0,1 0,8 ± 0,4 0,6 ± 0,1
a
1,2 ± 0,3 0,7 ± 0,1
Met
0,6 ± 0,2 0,9 ± 0,4 0,9 ± 0,2
abc
2,9 ± 0,6 2,3 ± 0,4
Cis
nd nd nd
0,1 ± 0,1 0,2 ± 0,1
Ile
0,1 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,2 0,3 ± 0,1
Leu
0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,2 0,5 ± 0,1 1,0 ± 0,3 0,7 ± 0,1
Fen
0,1 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,6 ± 0,1
a
0,5 ± 0,1
Lis
0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,2
Total
46,1 ± 8,4 50,4 ± 12,7 47,7 ± 3,8 88,8 ± 13,6
abc
98,7 ± 12,0
Tecido Branquial
Não houve aumento nas concentrações total ou individual dos aminoácidos livres no
tecido branquial posterior dos caranguejos expostos a 25‰ por até 10 dias (Figuras 53 e
54). Os aminoácidos livres predominantes no tecido branquial posterior foram alanina,
glicina, ácido glutâmico, taurina, prolina e serina (Tabela 12 e Figura 54).
012510
Tempo, dias
0
20
40
60
Concentra
çã
o, nmol/mg peso seco
Figura 53.
Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido branquial posterior de
Dilocarcinus pagei.
012510
Tempo, dias
0
5
10
15
20
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
G
lu
G
li
T
au
A
la
P
ro
Figura 54. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido branquial posterior de
Dilocarcinus pagei.
Tabela 12. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
branquial posterior de D. pagei mantido em água doce ou após exposição à água salobra
(25‰). Os dados são a média ± erro padrão da média, N=5. nd: não detectado. Os
aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Tempo, dias
Aminoácidos
livres
0 1 2 5 10
Asp
1,5 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,9 ± 0,4 0,7 ± 0,1
Glu
4,1 ±
±±
± 0,6 4,7 ±
±±
± 1,3 3,9 ±
±±
± 1,1 4,2 ±
±±
± 1,0 5,4 ±
±±
± 0,9
Ser
1,6 ± 0,3 1,1 ± 0,2 0,8 ± 0,1 1,2 ± 0,4 0,9 ± 0,1
Gli
7,1 ±
±±
± 1,1 9,4 ±
±±
± 2,8 9,2 ±
±±
± 3,2 11,9 ±
±±
± 4,2 14,6 ±
±±
± 3,3
His
0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,2 0,8 ± 0,2 0,8 ± 0,3 0,7 ± 0,1
Tau
3,5 ± 0,9 3,3 ± 0,8 2,9 ± 1,0 4,3 ± 0,9 3,8 ± 0,5
Arg
2,6 ± 0,7 3,9 ± 1,2 4,2 ± 1,3 4,1 ± 0,8
5,8 ±
±±
± 0,4
Tre
0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,2 ± 0,1
nd
Ala
12,4 ±
±±
± 2,8 10,3 ±
±±
± 3,8 8,0 ±
±±
± 1,3 8,5 ±
±±
± 2,0 13,5 ±
±±
± 2,4
Pro
2,9 ± 0,9 3,9 ± 1,8 3,4 ± 1,1 5,8 ± 1,3
8,8 ±
±±
± 1,0
Tri
0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,05 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,1
Val
0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,2 0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,1 0,6 ± 0,1
Met
0,7 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,9 ± 0,3 1,2 ± 0,1
Cis
0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1
nd
0,1 ± 0,1
nd
Ile
0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,07 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1
Leu
0,6 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,4 ± 0,1
Fen
0,7 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,05 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,1
Lis
0,5 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,2 0,4 ± 0,1 1,1 ± 0,3
Total
41,2 ± 7,1 42,0 ± 10,1 37,5 ± 7,9 44,1 ± 11,3 58,5 ± 6,1
Tecido Nervoso
A concentração total dos aminoácidos livres no tecido nervoso de D. pagei
apresentou uma tendência a aumentar a partir de 24 h de exposição, embora as análises
estatísticas indiquem aumento somente no 5
o
dia (Figura 55).
012510
Tempo, dias
0
100
200
300
Concentra
çã
o, nmol/mg peso seco
a
Figura 55. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido nervoso de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,05.
Os aminoácidos livres mais concentrados no tecido nervoso foram arginina, prolina,
alanina, ácidos aspártico e glutâmico, e glicina (Tabela 13). Os aminoácidos livres alanina e
prolina aumentaram após 24 h de exposição à água salobra e mantiveram-se maiores que
nos animais controle por todo o período da exposição. Após 5 dias, os aminoácidos livres
arginina (Figura 56) e leucina (Tabela 13) também aumentaram, mas voltaram às mesmas
concentrações dos animais mantidos em água doce após 10 dias.
012510
Tempo, dias
0
20
40
60
80
100
120
Concentra
ção
, nmol/mg peso seco
Asp Glu Gli Arg Ala
Pro
Figura 56. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) no tecido nervoso de Dilocarcinus
pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,05.
Tabela 13. Concentração dos aminoácidos livres (nmoles/mg de peso seco) no tecido
nervoso de D. pagei mantido em água doce ou após exposição à água salobra (25‰). Os
dados são a média ± erro padrão da média, N=5.
a
significativamente diferente dos animais
em água doce.
b
significativamente diferente dos animais após 1 dia de exposição.
c
significativamente diferente dos animais após 2 dias de exposição. P≤0,05. nd: não
detectado. Os aminoácidos livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Tempo, dias
Aminoácidos
livres
0 1 2 5 10
Asp
12, ±
±±
± 1,9 18,4 ±
±±
± 0,5 21,2 ±
±±
± 3,5 25,1 ±
±±
± 2,57 21,4 ±
±±
± 5,7
Glu
11,8 ±
±±
± 1,7 17,6 ±
±±
± 1,6 19,1 ±
±±
± 2,0
a
22,9 ±
±±
± 2,0 19,1 ±
±±
± 4,2
Ser
3,8 ± 0,7 5,3 ± 1,8 3,6 ± 0,7 4,9 ± 0,9 3,3 ± 0,8
Gli
11,0 ±
±±
± 2,4 22,5 ±
±±
± 2,0
14,4 ± 3,0
25,4 ±
±±
± 5,4
11,0 ± 0,6
His
0,5 ± 0,3 2,1 ± 0,6 1,8 ± 0,4 2,2 ± 0,5 1,7 ± 0,5
Tau
5,4 ± 1,2 7,2 ± 0,4 7,1 ± 0,6 8,7 ± 1,2 9,3 ± 2,3
Arg
17,5 ±
±±
± 4,0 29,9 ±
±±
± 0,8 25,8 ±
±±
± 2,3
a
33,1 ±
±±
± 3,6 25,7 ±
±±
± 4,4
Tre
4,9 ± 4,9
nd
1,1 ± 0,2 0,3 ± 0,2
nd
Ala
1,2 ± 2,5
a
38,0 ±
±±
± 2,4
a
52,7 ±
±±
± 6,7
a
46,1 ±
±±
± 2,7
a
32,3 ± 6,1
Pro
14,0 ±
±±
± 4,5
a
61,5 ±
±±
± 8,0
a
63,0 ±
±±
±
9,50
a
94,7 ±
±±
± 9,6
a
94,9 ±
±±
±
23,1
Tri
0,9 ± 0,1 1,8 ± 0,0 1,0 ± 0,1 1,8 ± 0,3 1,2 ± 0,4
Val
1,3 ± 0,3 2,0 ± 0,6 1,2 ± 0,2 25,8 ± 0,5 1,6 ± 0,6
Met
2,7 ± 1,2 2,8 ± 0,9 0,6 ± 0,2 1,7 ± 0,4 1,4 ± 0,1
Cis
nd nd nd nd nd
Ile
0,7 ± 0,1 1,2 ± 0,3 0,5 ± 0,1 1,61 ± 0,46 0,8 ± 0,3
Leu
1,4 ± 0,3 2,8 ± 0,8 1,1 ± 0,2
c
4,1 ± 1,1 2,3 ± 0,9
Fen
3,4 ± 1,2 3,9 ± 0,7
ab
0,5 ± 0,07 1,9 ± 0,4 1,1 ± 0,5
Lis
1,1 ± 0,2 2,7 ± 1,0 0,5 ± 0,1 3,7 ± 2,0 3,7 ± 2,3
Total
128,0 ± 22,6 220,8 ± 16,9 215,4 ± 19,0
a
268,0 ± 37,0 230,0 ± 46,0
Hemolinfa
A concentração total dos aminoácidos livres na hemolinfa apresentou uma tendência
a aumentar após 5 dias de exposição à água salobra de 25‰, mas tornou-se significante
somente no 10
o
dia, indo de 480,6 ± 55,7 para 1056,9 ± 216,6 µmol/l (Figura 57). Esse
aumento se deve principalmente aos aminoácidos livres não-essenciais alanina (+238%) e
prolina (+234%) (Figura 58). Embora serina e glicina estejam entre os aminoácidos livres
mais concentrados nos animais mantidos em água doce, suas concentrações permaneceram
inalteradas após exposição à água salobra (Tabela 14).
012510
Tempo, dias
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Concentração, nmol/mg peso seco
Figura 57. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
total de aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce. P≤0,05.
012510
Tempo, dias
0
50
100
150
200
250
300
Concentração, µmol/L
S
er
G
li
A
la
P
ro
Figura 58. Efeito da exposição à salinidade de 25‰ por até 10 dias sobre a concentração
dos principais aminoácidos livres (Média ± EPM, N=5) na hemolinfa de Dilocarcinus
pagei.
a
significativamente diferente dos animais em água doce;
b
significativamente
diferente dos animais após 1 dia de exposição;
c
significativamente diferente dos animais
após 2 dias de exposição. P≤0,05.
Concentração,
µ
mol/l
Tabela 14. Concentração dos aminoácidos livres (µmol/l) na hemolinfa de D. pagei
mantido em água doce ou após exposição à água salobra (25‰). Os dados são a média ±
erro padrão da média, N=5.
a
significativamente diferente dos animais em água doce.
b
significativamente diferente dos animais após 1 dia de exposição.
c
significativamente
diferente dos animais após 2 dias de exposição. P≤0,05. nd: não detectado. Os aminoácidos
livres mais concentrados estão indicados em negrito.
Tempo, dias
Aminoácidos
livres
0 1 2 5 10
Asp
3,6 ± 0,8 1,4 ± 0,9
nd
1,8 ± 1,5 24,8 ± 15,6
Glu
14,4 ± 7,6 9,1 ± 1,5 7,8 ± 2,4 7,7 ± 1,1 8,2 ± 0,4
Ser
49,8 ± 8,6
a
21,5 ± 5,5
a
26,2 ± 3,8
a
27,6 ± 3,6
a
22,0 ± 3,9
Gli
122,8 ±
±±
± 46,7 88,7 ±
±±
± 10,5
131,0 ±
±±
±
27,4
217,2 ±
±±
±
43,3
173,4 ±
±±
± 28,8
His
10,8 ± 1,9 8,6 ± 1,1 9,6 ± 1,3
10,1 ± 1,1 12,7 ± 2,4
Tau
11,5 ± 1,5 13,4 ± 3,6 10,7 ± 3,0 14,7 ± 1,7 22,9 ± 6,9
Arg
20,1 ± 5,9 17,9 ± 6,2 17,8 ± 7,1 28,7 ± 6,0 38,2 ± 10,4
Tre
14,2 ± 3,2 10,2 ± 3,3 10,0 ± 2,8 10,0 ± 2,32 7,9 ± 2,8
Ala
67,9 ±
±±
± 12,6 93,5 ±
±±
± 19,3 117,7 ±
±±
± 23,3 154,4 ±
±±
± 36,4
a
230,0 ±
±±
± 61,8
Pro
88,4 ±
±±
± 17,5 95,5 ±
±±
± 25,9 117,0 ±
±±
± 32,4
abc
255,2 ±
±±
±
0,3
abc
295,0 ±
±±
±
6,0
Tri
1,1 ± 0,7
nd
1,2 ± 0,8 1,7 ± 0,4 2,4 ± 1,9
Val
14,2 ± 2,2 13,1 ± 2,5 11,0 ± 2,0 14,1 ± 2,4 16,3 ± 1,8
Met
22,0 ± 11,1 6,5 ± 0,9 7,8 ± 2,3 16,2 ± 3,1 20,4 ± 6,5
Cis
5,3 ± 1,9
nd
3,5 ± 2,4 12,2 ± 6,3 6,8 ± 1,7
Ile
8,3 ± 1,2 7,1 ± 1,3 8,1 ± 0,5 7,0 ± 0,8 7,9 ± 1,1
Leu
13,1 ± 2,4 11,6 ± 1,9 10,5 ± 1,8 10,9 ± 1,6 16,3 ± 3,1
Fen
6,7 ± 2,1 6,6 ± 1,4 7,8 ± 1,4 10,9 ± 1,6 11,7 ± 0,6
Lis
5,5 ± 2,2 10,2 ± 1,9 5,6 ± 1,6 8,3 ± 1,9 9,0 ± 2,8
Total
480,6 ± 55,7 425,2 ± 75,3 515,5 ± 58,7
768,0 ±
110,4
a
1056,9 ±
216,6
6. DISCUSSÃO
Este trabalho foi realizado com o intuito de se avaliar de forma comparada os
processos osmorregulatórios de decápodos de diferentes ambientes e relacioná-los quanto à
invasão de meios mais diluídos que a água do mar. Para isso, avaliou-se os processsos
osmoregulatórios em uma espécies basal, o camarão de poças de maré Palaemon northropi;
em uma espécie que está em pleno processo de invasão da água doce, o camarão
Macrobrachium amazonicum; e em uma espécie que possui características condizentes com
a de um antigo invasor da água doce, o caranguejo Dilocarcinus pagei.
A partir de análises da capacidade osmo- e ionorregulatória, sobrevivência, grau de
hidratação e concentração de aminoácidos livres de estágios ontogenéticos selecionados do
caranguejo D. pagei e dos camarões M. amazonicum e P. northropi pôde-se formular
hipóteses sobre o complexo fenômeno da invasão da água doce pelos crustáceos.
Segue-se a discussão dos processos osmorregulatórios de cada uma das espécies que
foi aqui avaliada em função do seu grau de invasão em meios diluídos. No final, é feita uma
discussão integrada objetivando-se relacinar os parâmetros osmorregulatórios das três
espécies e as adaptações relacionadas ao processo geral da invasão da água doce pelos
crustáceos.
6.1 Processos osmorregulatórios em uma espécie basal: o camarão entre-marés
Palaemon northropi
Palaemon northropi é um camarão de marinho com uma considerável capacidade
de adaptação a salinidades variáveis, visto que, embora apresente mortalidade em
salinidades inferiores a 1,5‰, sobrevive por até 10 dias em salinidades de até 45‰.
Partindo-se da presente investigação sobre osmolalidade, concentração dos íons sódio e
cloreto na hemolinfa, e concentração de aminoácidos livres em diferentes tecidos, pode-se
inferir que este camarão possua características condizentes com as de um habitante de
regiões de estirâncio, capaz de ocupar ambientes de água salobra de salinidades bastante
reduzidas. Assim, adiciona-se dados interessantes para a compreensão da penetração das
espécies em meios mais diluídos que a água do mar, local onde a vida iniciou-se e a partir
da qual conquistou a água salobra dos estuários e lagunas e a água doce dos rios, corrégos,
riachos, lagos e lagoas.
A) Mortalidade
Freire et. al., (2003) classificaram o camarão entre-marés Palaemon northropi como
uma espécie fortemente eurialina, característica típica de habitantes de poças de maré os
quais ficam diariamente expostos a variações de salinidade, sendo capaz de sobreviver às
salinidades entre 7 e 42‰. Aqui, verificou-se que P. northropi sobrevive em salinidades
acima de 1,5‰ e até a salinidade máxima testada de 45‰ por até 10 dias, semelhantemente
a outros camarões do gênero Palaemon como P. affinis (Kirkpatrick & Jones, 1985), P.
longirostris (Campbell & Jones, 1989), P. pandaliformis (Freire et al., 2003).
A forte eurialinidade destas espécies está estreitamente relacionada aos ambientes
de salinidades flutuantes que habitam, consistindo numa vantagem evolutiva em relação aos
decápodos marinhos restritos a meios de salinidades razoavelmente constantes.
B) Capacidade osmo- e ionorregulatória
Os camarões palaemonideos de água salobra e marinha apresentam capacidade
hiper- e hiporregulatória semelhantes, além de ponto isosmótico abaixo da osmolalidade da
água do mar (Parry, 1954; Denne, 1968; Spaargaren, 1972; Morris et al., 1988), sendo esta
uma característica comum às espécies que vivem em ambientes com flutuações extremas de
salinidade (Kirkpatrick & Jones, 1985).
Palaemon northropi tem sido classificado como um forte osmo- e ionorregulador
após exposição a salinidades entre 7 e 42‰ por até 10 dias (Freire et. al., 2003). Aqui,
verificou-se que após exposição por 5 dias, P. northropi apresenta uma forte capacidade
hiperosmorregulatória até o ponto isosmótico de 569 mOm/kg de água (19‰),
hiporregulando até a salinidade máxima avaliada de 45‰. Pinheiro & McNamara (2002)
verificaram que P. northropi ainda é capaz de hiporregular a osmolalidade da hemolinfa até
50‰ por 12 horas. A forte capacidade osmorregulatória de P. northropi em altas e baixas
salinidades é condizente com a vida no ambiente de estirâncio que habita, onde a salinidade
pode variar rapidamente de 3 a 33‰, em função da maré, embora haja um predomínio de
água em torno de 17‰ (Pinheiro & McNamara, 2002).
A Tabela 15 mostra a osmolalidade da hemolinfa de várias espécies de camarões da
família Palaemonidae. Entre os camarões do gênero Palaemon mantidos em água salobra, a
osmolalidade da hemolinfa pode variar de 450 mOsm/kg água em Palaemon pandaliformis
(Freire et al., 2003) até 750 mOsm/kg água em Palaemon affinis (Kirkpatrick & Jones,
1985). A osmolalidade da hemolinfa de P. northropi mantido em 20‰ (599 mOsm/kg
água) assemelha-se a de outros camarões da família Palaemonidae mantidos em água
salobra.
Tabela 15. Osmolalidade e ponto isosmótico (ambos em mOsm/kg de água) da hemolinfa
de vários camarões da família Palaemonidae em função da sua distribuição desde o
ambiente marinho até o dulcícola.
Espécie/Habitat Osmolalidade
Ponto
Isosmótico
Referência
Palaemon northropi, marinho/entre-
marés
599 (em 20‰) 569 Presente estudo
Palaemon northropi, marinho/entre-
marés
646 (em 20‰) 662 Pinheiro &
McNamara, 2002
Palaemon northropi, marinho/entre-
marés
630 (em 20‰) 547 Freire et al., 2003
Palaemon affinis, marinho/água salobra 750 (em 20‰) 629 KirkPatrick &
Jones, 1985
Palaemon macrodactylus/ água salobra 725 (em 23‰) 657 Born, 1968
Palaemon pandaliformis/ água salobra 450 (em 25‰) 328 Freire et al., 2003
Palaemonetes serratus, marinho/ água
salobra
770 (em 25‰) 685 Parry (1954)
Palaemonetes varians, marinho/água
salobra
620 (em 22‰) 602 Potts & Parry,
1964
Palaemonetes pugio/ água salobra 550 (em 17‰)
465 Roesijad et al.,
1976
Macrobrachium equidens, água salobra 555 (em 29 ‰) 492 Denne, 1968
Macrobrachium rosenbergii, água
doce/salobra
480 (em água
doce)
520 Sandifer et al.,
1975
Macrobrachium acanthurus, água
doce/salobra
440 (em água
doce)
640 Moreira et al.,
1983
Macrobrachium amazonicum, água
doce/salobra
403 (em água
doce)
602 Presente estudo
Macrobrachium olfersii, água doce 330 (em água
doce)
383 Freire et al., 2003
O ponto isosmótico têm sido frequentemente utilizado como parâmetro para se
estabelecer o grau de adaptação das espécies a meios de salinidades diluídas, sendo que
quanto menor o ponto isosmótico, mais bem adaptada seria a espécie a meios diluídos
(Mantel & Farmer, 1983). O ponto isosmótico da hemolinfa de P. northropi é 569
mOsm/kg de água (19‰), valor semelhante ao encontrado em outros camarões de água
salobra da família Palaemonidae, como P. pugio (Knowton & Kirby, 1984), P. varians
(Potts & Parry, 1964) e M. equidens (Denne, 1968).
As concentrações dos íons sódio e cloreto também foram hiper- e hiporreguladas em
P. northropi após exposição às salinidades de 5, 20 e 45‰ por 5 dias, confirmando o
padrão já estabelecido por Freire et al., (2003) e Pinheiro & McNamara (2002) no qual esta
espécie foi classificada como uma excelente hiper- e hipoionorreguladora até 40‰.
Semelhantemente aos achados de Pinheiro & McNamara (2002), foi verificado que
a concentração do íon cloreto em P. northropi apresenta uma tendência a aumentar após
exposição a altas salinidades. Estes autores verificaram um aumento na concentração de
cloreto após exposição dos animais à salinidade de 50‰ em relação aos animais mantidos
em 35‰. Aqui, verificou-se um aumento na concentração de cloreto nos animais expostos
a 45‰ em relação aos animais controles mantidos em 20‰, bem como uma redução nos
animais expostos a 5‰.
A concentração do sódio em P. northropi permaneceu inalterada após exposição às
salinidades de 5, 20 ou 45‰ por 5 dias. Pinheiro & McNamara (2002) verificaram que a
concentração do sódio tende a aumentar em P. northropi após exposição a 50‰ em relação
aos animais mantidos em 35‰. No entanto, com o intuito de averiguar as alterações
decorrentes do ciclo de maré, estes autores submeteram os animais às salinidades
experimentais por um período de apenas 12 horas, e este padrão pode se alterar por um
período de maior exposição como o avaliado aqui de 5 dias.
Os dados avaliados aqui sobre o camarão entre-marés P. northropi são consistentes
com os achados de outros autores que o descrevem como uma espécie eurialina fortemente
hipo- e hiperreguladora (Pinheiro & McNamara, 2002; Freire et al., 2003). Estas
características osmorregulatórias sugerem que P. northropi seja uma espécie bem adaptada
a ambientes de salinidades flutuantes, fornecendo subsídios para o conceito de que a
regulação hipo- e hiperosmótica é uma característica peculiar nos palemonídeos de água
salobra.
Embora não haja um grande número de espécies do gênero Palaemon que tenha
invadido a água doce, o estudo da capacidade osmorregulatória deste grupo adiciona dados
para a compreensão dos mecanismos pelos quais as espécies ancestrais marinhas invadiram
meios cada vez mais diluídos que a água do mar. A forte capacidade eurialina de P.
northropi, o qual pode sobreviver em salinidades que variam de 1,5 a 50‰, tem
indiscutível valor adaptativo na conquista de novos ambientes como, por exemplo, o
dulcícola, um ambiente que tem sido recentemente invadido por ancestrais palemonídeos
marinhos e estuarinos.
C) Grau de hidratação e Concentração de aminoácidos livres
A eficiente regulação do teor de água dos tecidos de P. northopi verificada aqui é
condizente com sua bem adaptada vida em ambiente de estirâncio, pois após exposição às
salinidades de 5 ou 45‰ o grau de hidratação dos tecidos muscular, branquial e nervoso
permaneceu semelhante ao dos animais mantidos em 20‰. Esta estabilidade pode também
estar relacionada ao fato dos animais terem sido aclimatados a esses meios durante 5 dias,
período no qual os tecidos já podem ter recuperado a hidratação inicial. Pinheiro &
McNamara (2002) avaliaram o grau de hidratação do tecido muscular do camarão P.
northropi após exposição às salinidades de 1, 5, 20, 35 e 50‰ por até 24 horas e
verificaram que o teor de água deste tecido permanece estável em 5 e 20‰, enquanto em
50‰ ocorre uma redução de 7% em relação aos animais mantidos em 20‰. No camarão
M. olfersii aclimatado à água salobra os tecidos muscular e nervoso perdem água após 24
horas, mas recuperam o grau de hidratação após 2 dias (McNamara et. al., 2004).
Muitos estudos têm identificado e quantificado os aminoácidos livres em tecidos de
animais intactos, tecidos isolados e células expostas à variações de salinidade. Os
resultados indicam que a regulação da concentração dos aminoácidos livres ocorre em
função das variações da osmolalidade do fluido extracelular. Adicionalmente, os
aminoácidos livres não-essencias são os principais efetores osmóticos responsáveis pela
regulação do volume celular. Este fenômeno tem sido demonstrado em todos os filos de
invertebrados (Gilles, 1975; Abe, 2002) e também em peixes (Buentello & Gatlin, 2002;
Frick & Wright, 2002), moluscos (Deaton, 2001), anfíbios (Baxter & Ortiz, 1966) e répteis
(Gilles & Baillien, 1973). Vários estudos propõem ainda que os aminoácidos livres também
podem participar da regulação do volume celular de bactérias (Measures, 1975) e de
algumas plantas e algas (Gilles, 1997). Estes resultados sugerem que a participação dos
aminoácidos livres na regulação isosmótica do fluido intracelular seja um fênomeno de
ocorrência geral nos seres vivos, podendo constituir-se num mecanismo básico e
plesiomórfico no qual a regulação do fluido extracelular foi adquirida durante a evolução.
Os crustáceos estuarinos são conhecidos pela sua boa capacidade de se aclimatar a
alterações ambientais como salinidade, temperatura e concentração de oxigênio dissolvido
(Mantel & Farmer, 1983). Nesse sentido, pode ser esperado que os mecanismos de
regulação do volume celular através de efetores osmóticos sejam relevantes em espécies
estuarinas visto a frequente exposição a variações de salinidade que estão sujeitas.
A maioria dos estudos sobre o papel de efetores osmóticos orgânicos na limitação e
controle do volume celular tratam de espécies marinhas expostas artificialmente a meios
diluídos [C. maenas (Kévers et al., 1979), Panulirus japonicus (Shinagawa et al., 1995) e
H. gammarus (Charmantier et al., 1988)] ou espécies que migram entre a água doce e
salobra como parte do seu ciclo de vida [E. japonicus (Abe et al., 1999), M. rosenbergii
(Wilder et al., 2001) e M. olfersii (McNamara et al., 2004)]. Nesse sentido, torna-se
oportuna a investigação feita aqui sobre o perfil dos aminoácidos livres em crustáceos
como o camarão P. northropi, uma espécie que há vários milhões de anos fica diariamente
exposta à variações de salinidade no seu habitat natural.
Os dados obtidos no presente estudo com o camarão P. northropi mostram que há
indícios de mecanismos de ajuste da concentração de aminoácidos livres somente no tecido
muscular (-63% nos animais expostos a 5‰), visto que os tecidos branquial e nervoso
permaneceram com a concentração destes efetores osmóticos inalterada após exposição às
salinidades de 5, 20 ou 45‰. Isso pode estar relacionado ao fato de P. northropi possuir
uma eficiente capacidade de regulação osmótica e iônica da hemolinfa (Pinheiro &
McNamara, 2002; Freire et al., 2003), o que pode amenizar as alterações do volume celular
e a importância de mecanismo de recuperação deste.
Assim, P. northropi pode ser visto como uma espécie predominantemente marinha
bem adaptada à água salobra que, possuindo eficientes mecanismos de absorção e secreção
de sal, evita alterações do volume e composição do meio intracelular, reduzindo os gastos
energéticos com a recuperação do volume dos tecidos nervoso e branquial.
A aparente ausência de alterações na concentração total dos aminoácidos livres do
tecido branquial de P. northropi, semelhantemente ao verificado aqui no caranguejo D.
pagei exposto à água salobra, pode estar relacionada ao fato do epitélio deste órgão ser o
principal local de reabsorção/secreção de sal, e a osmolalidade intracelular das células
epiteliais deste tecido pode estar sendo regulada mais rapidamente pelo transporte de íons
do que por alterações no nível de efetores osmóticos (Boone & Claybrook, 1977).
O aumento na concentração total de aminoácidos livres da hemolinfa de P.
northropi exposto a 5‰ em relação aos animais mantidos em 20‰ pode estar relacionada
ao efluxo destes efetores orgânicos a partir dos tecidos e/ou catabolismo das proteínas
extracelulares. Após exposição da lagosta marinha Panulirus japonicus à água salobra de
25‰, também ocorre aumento na concentração total dos aminoácidos livres da hemolinfa,
enquanto a concentração total de aminoácidos livres no músculo diminui cerca de 20%
(Shinagawa et al., 1995). Portanto, o aumento na concentração dos aminoácidos livres na
hemolinfa de P. northropi após exposição à salinidade de 5‰ pode ser uma resposta
comum a vários decápodos expostos a meio hiposmótico e, possivelmente, originário do
efluxo de aminoácidos livres a partir do tecido muscular que tem sua concentração reduzida
63% nos animais mantidos em água salobra de 5‰.
Os aminoácidos livres essenciais para crustáceos estão presentes em baixas
concentrações em P. northropi e aqueles considerados não-essenciais tiveram sua
concentração alterada após exposição a meio hiposmótico, confirmando o padrão
caracteristicamente observado em crustáceos.
Os aminoácidos livres não-sessenciais glicina e prolina, além do aminoácido livre
essencial arginina, constituem os principais efetores orgânicos de P. northropi. Na via
biossintética o glutamato é o precursor direto da prolina e o fornecedor do grupo amino dos
aminoácidos glicina, alanina e aspartato (Bishop & Burton, 1993). A hipótese mais aceita
sobre a regulação da concentração destes aminoácidos livres após exposição de crustáceos a
meios hipo- ou hiperosmótico sugere a ação direta dos íons inorgânicos sobre a ação da
enzima glutamato desidrogenase (GDH) que cataliza a aminação redutiva da α-
ketoglutarato para formar o glutamato. Assim, o aumento na salinidade do meio externo
resulta em um aumento da concentração dos íons sódio e cloreto na hemolinfa, os quais
estimulam diretamente a GDH, resultando na síntese do glutamato. O aumento da síntese
do glutamato pode também ser consequente da síntese de outros aminoácidos por ação em
massa. A atividade de outras enzimas envolvidas com a síntese de aminoácidos livres,
como as transaminases, não são afetadas pelo aumento da concentração iônica, enquanto a
enzima serina hidrolase, envolvida no catabolismo de aminoácidos livres, é inibida por altas
concentrações de sódio e cloreto. O efeito combinado de tais enzimas e o aumento na
concentração de sal é responsável pela alteração no equilíbrio de síntese e catabolismo dos
principais aminoácidos livres durante a regulação do volume celular (Bishop & Burton,
1993).
6.2 Processos osmorregulatórios em um decápodo recente invasor da água doce: o
camarão Macrobrachium amazonicum
Dos dados avaliados com embriões, zoeas I, zoeas II e diferentes tecidos de adultos
de M. amazonicum pode ser inferido que está espécie está em pleno processo de invasão da
água doce. Enquanto os espécimes adultos da população dulcícola aqui estudada
apresentam forte capacidade para hiperregular a hemolinfa em água doce ou baixas
salinidades, as zoeas I e II desta população não sobreviveram mais que 2 horas em água
doce. Adicionalmente, os embriões, zoeas e tecidos do camarão adulto possuem uma
elevada concentração de aminoácidos livres em relação a vários crustáceos dulcícolas,
embora menor que os marinhos e estuarinos. Esta não é uma característica surpreendente
nesta espécie, que ainda possui populações que habitam a água salobra ou são dependentes
desta para completar seu ciclo de vida (Gomes Corrêa, 1977; Guest, 1979; Esteves, 1982),
podendo apresentar diferentes padrões de osmorregulação e de reprodução dependendo do
habitat ocupado.
A) Mortalidade
Os espécimes do camarão M. amazonicum foram coletados em uma represa de água
doce na região de Ribeirão Preto-SP distante aproximadamente 400 km do mar. Embora
essa represa deságue no rio Mogi, ela é aparentemente intransponível ao retorno da fase
adulta após as larvas terem sido levadas pelo rio, o que descarta a possibilidade de uma
possível migração entre a água doce e salobra como parte do ciclo de vida desta espécie.
No entanto, embora as fêmeas ovígeras tenham sido coletadas nesta represa, sugerindo que
o acasalamento e o desenvolvimento embrionário ocorram na água doce, a zoea I morre em
condições laboratoriais se mantida durante duas horas em água doce mineral ou do local de
coleta. Curiosamente, todas as fêmeas ovígeras coletadas carregavam embriões no início do
desenvolvimento, desde recém fecundados até o estágio de gastrulação e, raramente, no
início da neurulação com olhos pouco visíveis. Este fato sugere que as fêmeas ovígeras
possam estar migrando para outros locais da represa quando os embriões encontram-se em
estágios mais avançados de desenvolvimento. No entanto, em quase todos os pontos de
coleta a salinidade da água foi <0,5‰, sendo que somente em um ponto a salinidade foi de
3‰. Deverão ser realizadas avaliações adicionais nas diversas profundidades a fim de se
avaliar as características fisíco-químicas da água e possíveis variações de salinidade.
A aparente dependência da água salobra pelas zoeas de M. amazonicum para
completar seu ciclo de vida é semelhante a outros camarões do gênero Macrobrachium
como M. olfersii, M. petersii e M. acanthurus. No entanto, as zoeas I e II do camarão M.
olfersii que habitam frequentemente rios próximos do mar, sobrevivem em água doce,
embora a zoea II não consiga sofrer a muda para zoea III (McNamara et al., 1986). Estes
resultados sugerem que tanto M. olfersii quanto M. amazonicum estão em pleno processo
de invasão da água doce, embora as populações de M. olfersii ocorram quase sempre
próximas do mar e M. amazonicum tanto próximas do mar, como por exemplo nos
estuários do Estado do Pará (Coelho, 1963; Holthuis, 1952), quanto em regiões distantes do
mar, como na região de Ribeirão Preto-SP ou no Estado do Mato Grosso (Collart & Rabelo,
1996). Infelizmente, não há trabalhos comparativos sobre o desenvolvimento embrionário e
mecanismos de osmorregulação destas diferentes populações de M. amazonicum, embora
Collart & Rabelo (1996) tenham descrito que o tamanho dos ovos das diferentes
populações de M. amazonicum no Estado do Amazonas aumentem à medida que estas se
distanciam do mar.
A mortalidade em adultos de M. amazonicum surgiu após exposição à salidade de
25‰, sendo que em 30‰, 90% dos animais morreram antes de 10 dias. Todos os animais
que morreram na água salobra de 25‰ se encontravam na muda. Os animais se retiravam
da carapaça que recobre o cefalotórax, mas morriam antes de se libertar do exoesqueleto
que recobre o abdome.
Variações na salinidade podem alterar a síntese e a secreção do novo exoesqueleto
ou ainda a secreção do fator inibidor da muda (Barnes, 1990). O orgão Y, tecido endócrino
secretor, produz o hormônio crustecdisona que age sobre as células hipodérmicas e o
hepatopâncreas para dar início à ecdise. Little (1969) demonstrou que esta estrutura
responsável em parte pela regulação hormonal do ciclo de muda dos palemonídeos torna-se
funcional após a metamorfose da larva, e que a salinidade pode exercer um papel
fundamental no ciclo de muda, agindo diretamente ao nível das células epidermais. Durante
a muda, os artrópodos apresentam uma elevação da hidratação que fornece a força
necessária para romper o exoesqueleto antigo e expandir o corpo (Cheng & Chang, 1991), o
que talvez não tenha sido fisiologicamente possível em M. amazonicum exposto à água
salobra.
Macrobrachium amazonicum é um dos representantes mais comuns entre as
espécies dulcícolas que habitam a região neotropical e por ocupar uma diversidade de
salinidades, os trabalhos sobre esta espécie originam-se de populaçãoes coletadas desde a
água doce (McNamara et al., 1983; Moreira & McNamara, 1986; Provérbio, 1990; Zanders
& Rodriguez, 1992; Valenti, 2004) até estuários (Coelho, 1963; Collart & Rabelo, 1996;
Bastos et al., 2002). É frequentemente observado que os espécimes de M. amazonicum
destas diferentes populações apresentam uma certa variação na capacidade de suportar
diferentes salinidades, não havendo um padrão fixo do grau de eurialinidade. Essa
plasticidade fisiológica pode estar relacionada ao fato das diferentes populações do
camarão M. amazonicum terem ocupado o biótopo dulcícola de forma independente durante
a evolução.
McNamara et al., (1983) observaram que 90% das zoeas I de uma população de M.
amazonicum estuarina, não passavam pela muda e morriam quando mantidas em 35‰,
embora não sofressem a muda para zoea II quando mantidas em água doce. Zanders &
Rodriguez (1992) descreveram que em uma população venezuelana dulcícola de M.
amazonicum distante 100 Km do mar, há 50% de mortalidade de adultos em 25‰ e que
85% das zoeas I morrem dentro de 24 horas quando expostas a esta salinidade. Guest &
Durocher (1979) obtiveram em laboratório o desenvolvimento larval completo de uma
população estuarina de M. amazonicum entre as salinidades de 1 e 15‰, mas não em água
doce. Gamba (1984) estudou o desenvolvimento embrionário e larval de M. amazonicum
em uma população dulcícola da Venezuela e concluiu que esta espécie está em pleno
processo de adaptação à água doce e que ainda possui características de espécies marinhas
como ovos pequenos (1 x 0,8 mm) e em grande número (208-1000).
Estes trabalhos mostram que as larvas e adultos destas diferentes populações
possuem certa variação na capacidade de sobreviver em salinidades variáveis, sendo que
alguns autores chegam a sugerir que seja possível a existência de raças fisiologicamente
distintas nesta espécie.
B) Capacidade Osmo- e Ionorregulatória
A capacidade de hiperosmorregular a hemolinfa foi um dos principais mecanismos
fisiológicos que permitiu a invasão da água doce pelos crustáceos decápodos, animais
tipicamente marinhos com poucas espécies completamente adaptados ao biótopo dulcícola
(Schubart & Diesel, 1998). A Tabela 16 mostra a osmolalidade da hemolinfa de vários
camarões do gênero Macrobrachium. O camarão M. amazonicum apresenta capacidade
hiperregulatória em água doce e em baixas salinidades, semelhantemente a outros camarões
do gênero Macrobrachium como M. olfersii (Lima et al., 1997), M. rosenbergii (Wilder et
al., 1998), M. tenellum (Aguilar et. al., 1998), M. petersii (Read, 1984), M. brasiliense
(Torres, 2000), M. potiuna, M. acanthurus, M. heterochirus (Moreira et. al., 1983) e M.
ohione (Castille & Lawrence, 1981).
Tabela 16. Osmolalidade da hemolinfa (mOsm/kg de água) de vários camarões dulcícolas
do gênero Macrobrachium. Os dados são expressos como Média ± Erro Padrão da Média
onde possível.
Espécie
Osmolalidade
Fonte
Macrobrachium amazonicum
403 ± 34
Presente estudo
Macrobrachium olfersii 340 Lima et al., 1997
Macrobrachium olfersii
381 ± 13
McNamara, 1987
Macrobrachium rosenbergii 435 Huong et al., 2000
Macrobrachium tenellum 531 Aguilar et. al., 1998
Macrobrachium petersii 475 Read, 1984
Macrobrachium brasiliense
412 ± 15
Freire et al., 2003
Macrobrachium potiuna 493 Moreira et. al., 1983
Macrobrachium acanthurus 440 Moreira et al., 1983
Macrobrachium heterochirus 425 Moreira et. al., 1983
Macrobrachium ohione 462 Castille & Lawrence, 1981
Macrobrachium australiense 520 Denne, 1968
Macrobrachium amazonicum torna-se hipoconformador a partir de 20‰, sendo
22‰ (685 mOsm/kg água) o ponto isosmótico da hemolinfa. As concentrações dos íons
sódio e cloreto foram hiperreguladas de forma distinta, com o sódio
conformando-se a
partir de 10‰ e o cloreto a partir de 17‰. Assim, esta espécie parece ter mecanismos
independentes que regulam a concentração dos íons sódio e cloreto na hemolinfa. Zanders
& Rodriguez (1992) avaliaram as características osmorregulatórias de uma população
dulcícola de M. amazonicum da Venezuela e verificaram que naquela população os animais
apresentavam forte capacidade de hiperregulação até 15‰, sendo 25‰ o ponto isosmótico.
Neste estudo os autores verificaram que as concentrações dos íons sódio e cloreto eram
hiperreguladas até 15‰, sendo que em 25‰ a concentração do cloreto era levemente
hipoiônica.
Do ponto de vista osmorregulatório, a população adulta de M. amazonicum aqui
estudada parece estar bem adaptada à água doce, visto sua eficiente capacidade de
hiperosmorregular a osmolalidade da hemolinfa em salinidades reduzidas, uma
característica vantajosa porque o reduzido gradiente entre a hemolinfa e o meio externo
diminui os gastos energéticos com os mecanismos osmorregulatórios. Por outro lado, M.
amazonicum ainda possui um alto ponto isosmótico (685 mOsm/kg de água) se comparado
a outras espécie dulcícolas do mesmo gênero como M. potiuna (562), M. brasiliense (521)
e M. olfersii (428) (Freire et al., 2003). Essa mistura de características são consistentes com
a posição evolutiva de um recente invasor que M. amazonicum ocupa entre as espécies que
habitam a água doce, e confirma a importância do estudo comparativo desta espécie para a
compreensão dos eventos evolutivos passados que permitiram a invasão e a conquista da
água doce pelos camarões palemonídeos.
C) Os Aminoácidos Livres e a Regulação Isosmótica Intracelular em M. amazonicum
A concentração de aminoácidos livres no camarão M. amazonicum foi menor que
nos crustáceos marinhos, mas superior a crustáceos dulcícolas que completam seu ciclo de
vida na água doce como D. pagei (presente estudo), A. leptodactylus (Van Marrewijk &
Ravenstein, 1974) e C. destructor (Dooley et al., 2002) (Tabela 17).
Tabela 17. Concentração de aminoácidos livres (AAL, nmol/mg peso seco) no tecido
muscular de crustáceos marinhos, estuarinos e dulcícolas. A concentração de aminoácidos
livres no tecido muscular tende a reduzir com a invasão da água doce pelas diferentes
espécies de decápodos.
Espécie Habitat AAL Fonte
Penaeus japonicus
Marinho 1945 Okuma & Abe, 1994
Panulirus japonicus
Marinho 1860 Okuma & Abe, 1994
Crangon crangon
Marinho 1650 Schoffeniels, 1970
Eriocheir sinensis Marinho/diádromo 1280 Vincent Marique &
Gilles, 1970
Uca pugilator Marinho/semi-terrestre 1165 Claybrook, 1983
Callinectes sapidus
Marinho/estuarino 1720 Wheatly, 1985
Penaeus aztecus Mar/estuarino 995 Fyhn, 1976
Homarus gammarus
Marinho 920 Claybrook, 1953
Palaemon northropi
Marinho/água salobra 715 Presente estudo
Eriocheir japonicus Água doce/diádromo 271 Abe et al., 1999
Macrobrachium rosenbergii Àgua doce/diádromo 490 Tan & Choong, 1981
Macrobrachium olfersii Àgua doce/diádromo 174 McNamara et al.,
2004
Macrobrachium amazonicum Água doce/diádromo 164 Presente estudo
Astacus fluviatilis
Água doce 940 Camien et al., 1951
Procambarus clarkii Água doce 575 Okuma & Abe, 1994
Astacus astacus Água doce 137 Dooley, 2000
Cherax destructor Água doce 79 Dooley et al., 2002
Astacus leptodactylus
Água doce 73 Van Marrewijk &
Ravenstein, 1974
Dilocarcinus pagei Água doce 46 Presente estudo
A Tabela 18 mostra de forma comparativa a concentração de aminoácidos livres em
diferentes estágios ontogenéticos da lagosta H. gammarus (Haond et al., 1999) e diferentes
decápodos dulcícolas. Em relação à concentração de aminoácidos livres, os estágios
ontogenéticos dos camarões M. amazonicum e M. olfersii ocupam uma posição
intermediária comparado à alta concentração da lagosta H. gammarus (Haond et al., 1999)
e à reduzida concentração do caranguejo D. pagei (presente estudo), apoiando a hipótese da
recente invasão ocupada pelos dois palemonídeos.
Tabela 18. Concentração total de aminoácidos livres (AAL, nmol/mg de peso seco) em
diferentes estágios ontogenéticos de crustáceos decápodos. Os dados são expressos como
Média ± Erro Padrão da Média, onde possível. Os valores para a fase adulta referem-se ao
tecido muscular.
Espécie
Habitat
AAL Fonte
Homarus
gammarus
Marinho embriões: -----
instar I: 502 ± 39
instar II: 622 ± 27
juvenis: 1112 ± 147
adultos: 920
Haond et al., 1999;
Claybrook, 1953
Macrobrachium
amazonicum
Água
doce/diádromo
embriões: 131 ± 17
zoeas I: 348 ± 46 (6 ‰)
zoeas II: 179 ± 22 (6 ‰)
adultos: 283 ± 22
Presente estudo
Macrobrachium
olfersii
Água
doce/diádromo
embriões: 51 ± 7
zoeas I: 144 ± 11
zoeas II: 106 ± 14 (14 ‰)
adultos: 188 ± 11
Augusto, 2000
Dilocarcinus
pagei
Água doce
embriões: 43 ± 3
juvenis: 137 ± 6
adultos: 46 ± 8
Presente estudo
As zoeas I de M. amazonicum possuem uma elevada concentração de aminoácidos
livres em relação aos embriões e zoeas II. Haond et al., (1999) também observaram
diferenças significativas na concentração destes efetores osmóticos entre os instares da
lagosta H. gammarus, sendo que nos instares II e juvenis a concentração de aminoácidos
livres foi significativamente maior que nos instares I, III e IV. Petersen & Anger (1997)
observaram que os embriões do caranguejo aranha Hyas araneus apresentam uma redução
na concentração de proteínas próximo à eclosão, e sugerem a hidrólise destas em
aminoácidos livres, os quais poderiam exercer importante função na eclosão. Assim, a
maior concentração de aminoácidos livres nas zoeas I de M. amazonicum, pode ser uma
característica comum durante o desenvolvimento de alguns crustáceos e talvez originária da
hidrólise proteíca durante a eclosão das zoeas.
A resposta à aclimatação à água salobra de 25‰ foi diferencial entre os estágio
ontogenéticos e tecidos analisados de M. amazonicum, no que se refere à alteração do grau
de hidratação e aumento na concentração de aminoácidos livres. Embora o teor de água dos
estágios ontogenéticos e tecidos de adultos tenha se mantido inalterado, exceto no músculo
em 24 horas, as zoeas I e tecidos muscular e branquial de adultos apresentaram aumento na
concentração de aminoácidos livres. Estes resultados sugerem a existência de mecanismos
responsáveis pelo aumento da concentração destes efetores osmóticos diante de alterações
na osmolalidade da hemolinfa de M. amazonicum.
As membranas embrionárias de M. amazonicum parecem ser relativamente
impermeáveis, oferecendo considerável proteção osmótica durante o desenvolvimento dos
embriões visto que a hidratação permaneceu inalterado durante exposição à água doce ou
salobra de 25‰. Adicionalmente, embora a concentração de aminoácidos livres tenha sido
bastante elevada nos embriões de M. amazonicum mantidos em água doce (131 nmol/mg de
peso seco), está não se alterou após exposição à água salobra de 25‰, o que pode ser
consequência da proteção osmótica oferecida pelas membranas embrionárias. Por outro
lado, é possível que nesta espécie a concentração de aminoácidos livres já seja bastante
elevada e constitua um fator limitante aos mecanismos de aumento após exposição à água
salobra. Adicionalmente, foi observado em laboratório, que após a eclosão as zoeas I
perdem a capacidade de sobreviver em água doce, o que pode estar associado à perda da
proteção osmótica oferecida pelas membranas embrionárias.
Embora sejam poucos os trabalhos que investigaram o papel dos aminoácidos livres
na regulação do volume celular em embriões de crustáceos, Augusto (2000) verificou que
nos embriões do camarão de água doce M. olfersii a concentração de aminoácidos livres
aumenta 94% (indo de 51 para 99 nmol/mg de peso seco) após exposição à água salobra de
21‰ sugerindo, diferentemente de M. amazonicum, o envolvimento destes efetores
osmóticos na regulação do volume celular em embriões desta espécie.
Somente as zoeas I de M. amazonicum apresentaram aumento na concentração total
de aminoácidos livres após exposiçao à água salobra de 25‰ (+43%), o que pode estar
associada ao desenvolvimento de estruturas responsáveis pela regulação do fluido
extracelular como branquiostegitos, pleuras e epipoditos nas zoeas II. Estas estruturas,
tornariam a regulação da osmolalidade da hemolinfa mais eficiente nas zoeas II, reduzindo
o papel dos mecanismos de Regulação Isosmótica Intracelular nesta e nas próximas fases
do desenvolvimento. No camarão diádromo M. olersii, a concemtração de aminoácidos
livres também não se altera nas zoeas II, embora as zoeas I apresentem um aumento de
24% após exposição à água salobra de 21‰ (Augusto, 2000).
Em A. salina, a atividade Na
+
/K
+
-ATPásica associada a mecanismos
osmorregulatórios é detectada ainda no estágio embrionário (Peterson et al., 1978) e está
relacionada em parte à existência de um orgão dorsal responsável pelo transporte iônico
ativo (Conte et al., 1972). No camarão P. japonicus, a atividade da Na
+
/K
+
-ATPase é nula
nos branquiostegitos, pleura e epipoditos dos embriões, aumentando nas zoeas (Bouaricha
et al., 1991). Em Callianassa jamaicense (Felder & Felder, 1986) a atividade Na
+
/K
+
-
ATPase aumenta progressivamente nos branquiostegitos e pleuras durante o
desenvolvimento embrionário e é máxima nas zoeas I.
Adicionalmente, visto que as zoeas I e II de M. amazonicum não sobrevivem em
água doce e ainda desconhece-se a verdadeira salinidade na qual a população aqui estudada
se desenvolva na natureza, pode-se inferir que as salinidades de 6 e 25‰ não constituam
um desafio osmótico significativo para o meio interno das zoeas II.
A concentração total de aminoácidos livres no tecido muscular aumentou 42% no 5
o
dia de exposição, devido pricipalmente aos aminoácidos arginina, alanina e prolina. O
aumento na concentração desses aminoácidos livres pode ser devido ao catabolismo de
proteínas intracelulares e/ou aumento da síntese destes efetores orgânicos, visto que, exceto
a arginina, tratam-se de aminoácidos considerados não-essenciais para crustáceos, e obtidos
somente através de vias metabólicas (Gilles & Péqueux, 1981; Tan & Choong, 1981). No
entanto, a concentração total de aminoácidos livres na hemolinfa permaneceu inalterada
durante o decurso da exposição à água salobra, sugerindo que este fluido talvez não esteja
fornecendo aminoácidos livres para os tecidos, como frequentemente sugerido.
Em crustáceos aclimatados a meio hiperosmótico constata-se tanto aumento quanto
redução na concentração total dos aminoácidos livres da hemolinfa. Em M. amazonicum a
hemolinfa não parece exercer papel repositório de aminoácidos livres para os tecidos, visto
a manutenção da concentração destes após exposição à água salobra de 25‰ por até 10
dias.
O tecido branquial apresentou um rápido aumento na concentração total dos
aminoácidos livres após exposição à água salobra, já em 24 horas, demonstrando um
fênomeno de regulação intracelular metabólico bastante rápido. Semelhantemente ao tecido
muscular, os aminoácidos livres envolvidos com este aumento são os não-essenciais
alanina, prolina e o não-essencial arginina.
A concentração dos aminoácidos livres no tecido nervoso de M. amazonicum
apresentou uma tendência a aumentar após 24 horas de exposição à água salobra, mas não
foi comprovada estatisticamente. Embora poucos estudos tenham avaliado a resposta do
tecido nervoso de crustáceos após aclimatação a diferentes salinidades, a maioria mostra
que este tecido apresenta um claro aumento na concentração dos aminoácidos livres [M.
olfersii (McNamara et al., 2004), D. pagei (Augusto et al., 2002). No entanto, é possível
que o tecido nervoso de M. amazonicum apresente outras barreiras contra alterações de
volume, visto que não apresentou alteração no grau de hidratação e concentração de
aminoácidos livres após exposição à água salobra de 25‰ por até 10 dias.
6.3 Processos Osmorregulatórios no caranguejo Dilocarcinus pagei: um antigo invasor
da água doce
Dilocarcinus pagei é um caranguejo dulcícola com uma considerável capacidade de
adaptação a salinidades elevadas, visto que, embora apresente mortalidade a partir de 25‰,
sobrevive por até dois dias em água do mar (35‰). Partindo-se das investigações do
presente trabalho sobre osmolalidade e as concentrações dos íons sódio e cloreto na
hemolinfa, teores de aminoácidos livres e grau de hidratação de embriões, juvenis e
diferentes tecidos de adultos, pode-se inferir que este caranguejo possui características
condizentes com um antigo habitante da água doce, e que os aminoácidos livres contribuam
com uma importante fração na regulação do volume celular em embriões e tecidos
muscular e nervoso de adultos diante de alterações na salinidade do meio externo.
A) Mortalidade
Os crustáceos dulcícolas apresentam diferentes graus de sobrevivência em
salinidades maiores que o seu meio natural. Enquanto o lagostin P. clarkii e o camarão
Palaemonetes paludosus apresentam uma taxa de mortalidade de 30% após exposição a
25‰, salinidade em que surgem os primeiros sinais de necrose na glândula antenal
(Shinagawa, 1995; Turner et al., 1975), o caranguejo africano Potamon fluviatilis sobrevive
até 24 dias em água do mar e o caranguejo jamaicano semi-terrestre Armase robertii não
apresenta mortalidade após exposição a 48‰ (Schubart & Diesel, 1998). Em D. pagei os
embriões e juvenis não apresentaram mortalidade após exposição à salinidade de 25‰,
ainda que nos adultos tenha ocorrido alguma mortalidade nesta salinidade.
Embora os crustáceos sejam diferenciados desde estenoalinos até eurialinos quanto
à capacidade de suportar alterações na salinidade do meio externo, está classificação é mais
apropriada para fins comparativos entre diferentes espécies. Assim, em relação a vários
crustáceos, D. pagei pode ser considerada uma espécie eurialina sob condições
laboratoriais, visto que embriões, juvenis e adultos sobreviveram em meios de salinidades
maiores que seu habitat natural, embora os caranguejos P. fluviatilis e A. robertii pareçam
ser ainda mais eurialinos que D. pagei.
B) Capacidade Osmo- e Ionorregulatória
Os crustáceos dulcícolas apresentam diferentes padrões de osmorregulação durante
a exposição a meios mais concentrados, frequentemente hiperosmorregulando em água
doce e em baixas salinidades (≈15‰), e osmoconformadando-se em salinidades superiores
próximas da letalidade (Schubart & Diesel, 1998). O caranguejo dulcícola E. sinensis, que
apresenta comportamento migratório para o mar durante o período reprodutivo
(Schoffeniels & Péqueux, 1979) e os lagostins P. clarkii (Sarver et al., 1994) e Cherax
destructor (Mills & Gedees, 1980) são eficientes hiperosmorreguladores, mas tornam-se
osmoconformadores em salinidades acima de 24‰ (750 mOsm/kg água).
Dilocarcinus pagei torna-se osmoconformador a partir de 25‰ (775 mOsm/kg
água), valor semelhante aos caranguejos estuarinos C. maenas (Theede, 1969) e Sesarma
catenata (Boltt & Heeg, 1975).O padrão osmorregulatório observado em D. pagei é
bastante semelhante ao descrito por Morris & Aardt (1998) para o caranguejo semi-terrestre
P. warreni. Em ambos, a osmolalidade da hemolinfa é hiperrregulada até 25‰,
diferentemente das concentrações dos íons sódio e cloreto, que são reguladas até 15‰.
Embora haja muitos estudos sobre os mecanismos branquiais de transporte dos íons
sódio e cloreto, estes ainda não estão totalmente esclarecidos. Morris & Aardt (1998)
sugerem que os caranguejos dulcícolas da família Potamonidae e Parathelphusoidae
possuem uma baixa permeabilidade ao sódio, o que permitiria um maior influxo difusional
de cloreto durante exposição a alta salinidade. Onken et al., (1995) propôs um modelo para
o transporte de cloreto nas brânquias do caranguejo E. sinensis independente do transporte
de sódio,
conduzido por uma V-ATPase apical junto a trocadores Cl/HCO
3
-
apicais e canais
de cloreto basais. Rathmayer & Siebers (2001) verificaram que nas brânquaias de E.
sinensis não ocorre transporte de sódio ou cloreto quando o transporte de um deles é
bloqueado por inibidor específico (ouabaina e acetazolamide, respectivamente), sugerindo
que o transporte dos dois íons seja acoplado nesta espécie.
Onken & McNamara (2002) demonstraram que as brânquias posteriores do
caranguejo D. pagei possuem uma especial particularidade em relação às características
estruturais e ionotransportadoras. Em contraste aos crustáceos marinhos e a outros
caranguejos de água doce como E. sinensis e P. niloticus nos quais o epitélio lamelar é
simetricamente espesso em ambas as superfícies lamelares (Taylor & Taylor, 1992), estes
autores verificaram uma marcada assimetria nas lamelas branquiais posteriores de D. pagei,
onde somente o epitélio lamelar proximal é espesso. Assim, as brânquias posteriores de D.
pagei absorvem ativamente Na
+
e Cl
-
da água doce através de lados opostos da lamela,
enquanto que no caranguejo E. sinensis está absorção ocorre em ambos os lados. Esta
característica única verificada nas brânquias de D. pagei pode, entretanto, ser um padrão
típico dos caranguejos trichodactylideos.
A hemolinfa de D. pagei tem baixa osmolalidade quando comparada a outros
caranguejos, apresentando valores semelhantes aos lagostins e camarões dulcícolas (Tabela
19). Esta reduzida osmolalidade apresentada por D. pagei pode ser considerada adaptativa
do ponto de vista fisiológico, pois diminuiria o gasto energético com os mecanismos de
hiperosmorregulação devido a redução do gradiente entre o corpo do animal e o meio
externo e, consequentemente a perda difusiva de sal e o influxo osmótico de água.
Visto que o grau de diluição da hemolinfa é um dos indicadores da adaptação das
espécies à água doce (Mantel & Farmer, 1983), pode-se inferir, com base neste parâmetro,
que D. pagei seja um antigo invasor do biótopo dulcícola, devido à reduzida osmolalidade
da sua hemolinfa em relação aos demais caranguejos. A antiga invasão na água doce pelos
caranguejos da família Trichodactylidae é corroborada ainda pela literatura filogenética.
Sternberg et al., (1999) verificaram que as diferentes famílias de caranguejos dulcícolas
originaram-se de grupos distintos de caranguejos ancestrais marinhos. Colosi (1921)
sugeriu que os caranguejos de água doce, exceto os Trichodactylidae, tiveram uma recente
derivação (pós-Cretáceo) de grupos de braquiuros marinhos. Em contraste, os
Trichodactylidae formariam um grupo antigo, descendente dos mesmos ancestrais dos
caranguejos marinhos da superfamília Portunoidae.
Tabela 19. Osmolalidade (mOsm/kg água) de vários crustáceos dulcícolas (Infraordem
Brachyura, Astacidea e Caridea). Os dados são expressos como Média ± Erro Padrão da
Média, onde possível.
Espécie Osmolalidade Fonte
Brachyura
Dilocarcinus pagei
420 ± 39
presente estudo
Dilocarcinus pagei
386 ± 18
Onken & McNamara, 2002
Potamon niloticus 500 Shaw, 1959
Potamon fluviatilis
538 ± 97
Harris & Micallef, 1971
Potamon edulis 540 Harris & Micallef, 1971
Eriocheir sinensis
532 ± 13
Schubart & Diesel, 1998
Paratelphusa hydrodomus 620 Ramamurthi, 1976
Armases robertii
678 ± 33
Schubart & Diesel, 1998
Astacidea
Procambarus clarkii
387 ± 8
Sarver et al., 1994
Astacus astacus
406 ± 7
Schubart & Diesel, 1998
Astacus leptodactilus 420 Bielawshi, 1964
Orconectes limosus
434 ± 26
Schubart & Diesel, 1998
Caridea
Macrobrachium amazonicum
403 ± 34
Presente estudo
Macrobrachium olfersii
336 ± 24
Freire et al., 2003
Macrobrachium brasiliense
412 ± 15
Freire et al., 2003
Macrobrachium potiuna
418 ± 14
Freire et al., 2003
Macrobrachium rosenbergii 435 Huong et al., 2000
Palaemonetes antennarius 400 Parry, 1965
Semelhantemente a maioria dos caranguejos de água doce (Mantel & Farmer,
1983), D. pagei não é capaz de produzir uma urina diluída quando mantido em água doce.
Os caranguejos dulcícolas frequentemente produzem um reduzido fluxo de urina isosmótica
devido a reabsorção deste fluido na glândula antenal, o que pode ser considerado vantajoso
por conservar sais, reduzindo a dependência de mecanismos ativos de absorção e
compensando a perda difusiva para o meio externo através da superfície do corpo.
Weihrauch et al., (2004) mediram a atividade das enzimas ionotransportadoras F-, V- e
Na
+
/K
+
-ATPase nas brânquias posteriores de D. pagei e verificaram uma reduzida atividade
em comparação ao caranguejo E. sinensis (Putzenlechner, 1995), refletindo uma menor
perda passiva de sal em D. pagei. Essa característica, típica de caranguejos hololimnéticos,
associada a um possível reduzido fluxo de urina isosmótica podem ser consideradas
eficientes estratégias à vida na água doce como forma de conservação de sal.
A produção de urina isosmótica à hemolinfa é muitas vezes considerada como uma
pré-adaptação à invasão do ambiente terrestre, visto que o reduzido fluxo urinário, típico de
caranguejos limnéticos, pode ser uma estratégia para solucionar o problema da conservação
de água (Greenaway, 1981; Wolcott, 1992; Morris & Aardt, 1998). Visto que os
caranguejos aquáticos excretam amônia como composto nitrogenado através do epitélio
branquial, as excursões terrestres são limitadas não somente pela respiração aérea ou
balanço de água, mas principalmente pela dificuldade da eliminação destes compostos
nitrogenados no ar. Durante as excursões terrestres os caranguejos sofrem alguma perda
evaporativa de água através das superfícies respiratórias e integumento, mas
frequentemente exibem relativa redução na permeabilidade à água no ar.
Foi observado durante coletas de campo, que D. pagei possui o hábito de sair da
água ao final da tarde, sendo capaz de sobreviver pelo menos seis horas fora da água,
andando a procura de alimento. Assim, ainda que este caranguejo não seja considerado uma
espécie semi-terrestre, é possível que ele utilize a estratégia de produzir reduzido fluxo de
urina isosmótica como forma de conservação de água, típico de caranguejos terrestres
durante suas saída do ambiente aquático.
C) Grau de hidratação
Poucos trabalhos na literatura indicam o grau de hidratação dos tecidos de
crustáceos dulcícolas, sendo que a maioria se refere ao tecido muscular de animais adultos
(Shaw, 1959; Shinagawa et al., 1995; McNamara et al., 2004).
Aqui, verificou-se que as membranas que envolvem a massa de células
embrionárias de D. pagei parecem oferecer proteção parcial contra a perda de água em
meios mais concentrados, visto a desidratação de 11% após exposição à água salobra de
25‰. Alguns estudos sobre osmorregulação têm demonstrado que diferentes grupos de
crustáceos podem apresentar certa variação na permeabilidade das membranas
embrionárias à água e íons. Enquanto os embriões da lagosta H. americanus são bastante
protegidos osmoticamente pelas membranas embrionárias, e tornam-se isosmóticos e
incapazes de osmorregular quando estas são retiradas (Charmantier & Aiken, 1987), nos
anfípodos Orchestia gammarellus e Marinogammarus marinir a membrana do ovo oferece
apenas proteção limitada ao embrião (Vlasblon & Bolier, 1971). Assim, embora os
embriões de D. pagei não apresentem mortalidade durante exposição à água salobra,
indicando uma certa proteção pelas membranas embrionários, está proteção parece ser
limitada quanto a perda de água.
Os juvenis e os tecidos muscular e nervoso de D. pagei adulto permaneceram com
seus graus de hidratação inalterados após exposição à água salobra. Esses resultados são
condizentes com o fato dos animais adultos osmorregularem a osmolalidade do fluido
extracelular até 25‰, o que reduz o gradiente para a perda de água a partir dos tecidos. No
entanto, após exposição à água salobra de 30‰ os animais adultos tornaram-se
osmoconformadores, embora o grau de hidratação dos tecidos muscular e nervoso
permanecesse inalterado. Esta resposta pode estar relacionada ao fato dos animais terem
sido expostos a 30‰ durante 10 dias, período em que os tecidos já podem ter recuperado a
hidratação perdida. No camarão de água doce M. olfersii aclimatado à água salobra os
tecidos muscular e nervoso perdem água após 24 horas, embora recuperem a hidratação
após 2 dias (McNamara et al., 2004).
O tecido branquial de D. pagei exposto à água salobra de 5 a 30‰ por 10 dias
permanece mais hidratado que nos carangejos controles mantidos em água doce (Figura
46). É possível que o gradiente osmótico entre a hemolinfa e o meio externo deste crustáceo
cause algum fluxo de água através do epitélio branquial, provocando um aumento da
hidratação restrita somente a este tecido de interface (McNamara et al., 2004).
D) O papel dos aminoácidos livres na Regulação Isosmótica Intracelular de D. pagei
Os aminoácidos livres e as substâncias ninhidrina positivas são importantes efetores
osmóticos de vários crustáceos e moluscos. Enquanto a contribuição dos íons inorgânicos
para a osmolalidade do fluido intracelular é razoavelmente constante em várias espécies, a
contribuição dos aminoácidos livres é extremamente variável entre espécies, e mesmo entre
tecidos da mesma espécie (Péqueux, 1995). No entanto, é estimado que os aminoácidos
livres contribuam com aproximadamente 50% da osmolalidade intracelular em espécies
como C. sapidus, E. sinensis, C. maenas e Mytilus edulis (Péqueux, 1995).
A avaliação da concentração total de aminoácidos livres no caranguejo de água doce
D. pagei corrobora a hipótese de que há uma tendência à redução na concentração destes
efetores orgânicos intracelulares à medida que os crustáceos invadem meios de salinidade
reduzida (Mantel & Farmer, 1983). A Tabela 17 (página 106) mostra a concentração total
de aminoácidos livres no tecido muscular de decápodos de diferentes ambientes, desde
marinhos até dulcícolas. Dilocarcinus pagei possui uma baixa concentração de
aminoácidos livres, semelhantemente ao caranguejo dulcícola/diádromo Eriocheir
japonicus (Abe et al., 1999) e aos lagostins A. leptodactylus (Van Marrewijk & Ravenstein,
1974) e Cherax destructor (Dooley et al., 2002). No entanto, embora os lagostins sejam
frequentemente considerados os mais bem sucedidos decápodos dulcícolas, a julgar pelo
número de aproximadamente 500 espécies, não parece haver um padrão quanto à
concentração de aminoácidos livres no tecido muscular deste grupo, havendo uma grande
variação entre P. clarkii (Okuma & Abe, 1994) e A. fluviatilis (Dooley, 2000) em relação a
A. leptodactylus (Van Marrewjk & Ravensteis, 1974), C. destructor (Dooley et al., 2002) e
A. astacus (Dooley, 2000).
No entanto, avaliando-se de forma geral a concentração de aminoácidos livres nos
diversos grupos de decápodos pode-se inferir que há uma tendência à redução na
concentração total de aminoácidos livres intracelulares, e que em relação a este parâmetro,
o caranguejo D. pagei mostra-se bem adaptado ao ambiente limnético.
A avaliação da concentração de aminoácidos livres em embriões e estágios larvais
de crustáceos é muito pouco estudada, sendo que a maioria dos trabalhos referem-se às pós-
larvas ou adultos (Tan & Choong, 1981; Okuma & Abe, 1994; Dooley, 2000; McNamara et
al., 2004).
A concentração de aminoácidos livres em embriões de crustáceos é relatada
somente por Augusto (2000) para o camarão diádromo M. olfersii. A concentração de
aminoácidos livres nos embriões de D. pagei mantidos em água doce (42 ± 8 nmol/mg de
peso seco) é semelhante ao tecido muscular de adultos (46 ± 8 nmol/mg de peso seco),
embora também semelhante aos embriões do camarão M. olfersii (51 nmol/mg de peso
seco). Como nos demais estágios ontogenéticos avaliados de D. pagei, e nos embriões de
M. olfersii, os aminoácidos livres individuais mais concentrados nos embriões de D. pagei
foram glicina e alanina.
Embora não haja estudos sobre a concentração de aminoácidos livres em juvenis de
crustáceos dulcícolas, o valor apresentado por esse estágio ontogenético de D. pagei (137 ±
6 nmol/mg de peso seco) é bastante inferior ao medido em juvenis de crustáceos marinhos
como o camarão P. japonicus (1120 nmol/mg de peso seco) (Dalla Via, 1986) e a lagosta
H. gammarus (1400 nmol/mg de peso seco) (Haond et al., 1999). O aminoácido livre
glicina é um dos predominantes nos juvenis de D. pagei, assim como nos juvenis de P.
japonicus (Dalla Via, 1986) e H. gammarus (Haond et al., 1999)
No tecido muscular de crustáceos a concentração total de aminoácidos livres varia
de 174 a 1832 nmoles/mg de peso seco (Claybrook, 1983), sendo as menores concentrações
encontradas em espécies dulcícolas como o camarão M. olfersii (McNamara et al., 2004) e
o lagostin A. leptodactylus (Van Marrewijk e Ravestein, 1974) e as maiores concentrações
em espécies eurialinas como o camarão marinho/estuarino Penaeus aztecus (Schoffeniels,
1970). O tecido muscular de D. pagei apresenta 46 nmol/mg peso seco, valor inferior ao
encontrado na maioria dos crustáceos. No entanto, os aminoácidos livres mais concentrados
no tecido muscular foram glicina, arginina e alanina, padrão verificado no músculo de
vários decápodos [Por exemplo, A. leptodactilus (Van Marrewijk & Ravestein, 1972), C.
sapidus (Gerad & Gilles, 1972), Panopeus herbstii (Boone & Claybrook, 1977), Uca
pugilator (Mantel & Farmer, 1983) e M. olfersii (Augusto, 2000)].
No tecido branquial de D. pagei a concentração de aminoácidos livres foi de 41 ± 7
nmol/mg peso seco. Há poucas informações referentes à concentração de aminoácidos
livres nesse tecido de outras espécies. No tecido branquial de M. olfersii a concentração
total dos aminoácidos livres é de 86 nmoles/mg de peso seco (McNamara et al., 2004), em
Panopeus herbstii 113 nmoles/mg de peso seco (Boone & Claybrook, 1977) e em P.
japonicus 536 nmoles/mg (Shinagawa et al., 1995). Os aminoácidos livres alanina e glicina
são predominantes no tecido branquial de todas as espécies avaliadas.
No tecido nervoso a concentração total de aminoácidos livres varia de 99
nmoles/mg de peso seco no camarão M. olfersii (McNamara et al., 2004) a 2260
nmoles/mg de peso seco no caranguejo Carcinus maenas (Evans, 1972). Dilocarcinus
pagei alcança 128 nmoles/mg peso seco, valor superior aos verificados nos tecidos
muscular e branquial desta espécie. Esses resultados são consistentes com dados da
literatura que demonstram que o tecido nervoso possui uma alta concentração de
aminoácidos livres (Mantel & Farmer, 1983). Os aminoácidos livres predominantes no
tecido nervoso de D. pagei (arginina, prolina, alanina, glicina e ácidos aspártico e
glutâmico) são também em H. vulgaris (Gilles & Schoffeniels, 1968), C. maenas (Evans,
1972) e E. sinensis (Gilles & Schoffeniels, 1960). A elevada concentração dos ácidos
aspártico e glutâmico no tecido nervoso de crustáceos talvez seja esperado devido ao papel
neurotransmissor desses aminoácidos na transmissão sináptica.
A concentração total de aminoácidos livres na hemolinfa varia de ≈650 µmoles/l em
Orconectes limosus (Speck et al., 1972) a ≈10000 µmoles/l no isopódo marinho
Sphaeroma serratum (Charmantier et al., 1976). A concentração de aminoácidos livres na
hemolinfa de D. pagei mantido em água doce é bastante reduzida (480 µmoles/l) em
relação a vários decápodos, embora os aminoácidos predominantes (glicina, alanina,
prolina e serina) sejam os mesmos de outros crustáceos como E. sinensis, Carcinus
maenas, Uca pugilator, A. leptodactilus (Mantel & Farmer, 1983).
Há indícios do envolvimento dos aminoácidos livres na Regulação Isosmótica
Intracelular em vários estágios ontogenéticos de camarões, lagostas e caranguejos onde
exercem um papel importante no processo global da regulação de volume [por exemplo, em
C. sapidus (Costlow & Sastry, 1966), Mennipe mercenaria (Tucker, 1978), H. gammarus
(Charmantier et al., 1999;), M. olfersii (Augusto, 2000), P. japonicus (Dalla Via, 1986) e P.
aztecus (Bishop e Burton, 1993; Okuma e Abe, 1994)].
O papel dos aminoácidos livres na regulação do volume celular em D. pagei foi
bastante semelhante entre embriões e tecidos de adultos. A desidratação dos embriões de D.
pagei expostos à água salobra (-11%) foi acompanhada por um aumento de 95% na
concentração total de aminoácidos livres, sugerindo o envolvimento destes efetores
osmóticos na regulação do volume celular nesta fase do desenvolvimento, semelhantemente
aos embriões do camarão M. olfersii (+94%) (Augusto, 2000). É possível que as
membranas embrionárias de D. pagei ofereçam proteção osmótica limitada aos embriões,
ou ainda, por D. pagei ser uma espécie antiga invasora da água doce, os embriões tenham
perdido a capacidade de osmorregular em meios mais concentrados, ficando sujeitos à
regulação do volume celular através de efetores osmóticos.
No tecido muscular, a concentração total dos aminoácidos livres apresentou um
aumento de 115% após 10 dias, devido principalmente aos aminoácidos alanina e prolina.
Paralelamente, o aumento na concentraçao total dos aminoácidos livres da hemolinfa neste
mesmo período também se deu pelo aumento dos aminoácidos alanina e prolina, sugerindo
um mecanismo extracelular de fornecimento de aminoácidos livres para os tecidos durante
exposição a salinidade elevada.
Em crustáceos aclimatados a meio hiperosmótico é verificado tanto aumento quanto
redução na concentração dos aminoácidos livres da hemolinfa. Essa diferença se deve ao
fato de que o acúmulo de aminoácidos livres nas células pode ser devido ao catabolismo de
proteínas da hemolinfa, o que causaria um aumento transitório destes no fluido extracelular,
ou simplesmente ao influxo de aminoácidos livres para os tecidos sem serem originários do
catabolismo de proteínas, o que levaria a uma redução destes efetores osmóticos na
hemolinfa (Augusto, 2000). Koenig (1981) observou que a síntese de aminoácidos livres a
partir de glicose [
14
C] no camarão Penaeus setiferus foi máxima durante as primeiras 24
horas de exposição a meio hiperosmótico, enquanto a liberação de aminoácidos a partir de
proteínas alcançou o nível máximo após dois dias de exposição, sugerindo que a síntese
destes efetores orgânicos seja mais importante na fase inicial de limitação do volume
celular, enquanto o reajuste do volume celular seja mais gradual e relacionado ao
catabolismo proteíco. Após exposição de M. rosenbergii à água salobra de 20‰, ocorre
aumento na concentração total dos aminoácidos livres da hemolinfa e redução na
concentração de proteínas (Huong, 2000), enquanto a concentração total de aminoácidos
livres no músculo aumenta cerca de 80% (Tan & Choong, 1981). Em E. sinensis, também
ocorre um aumento na concentração dos aminoácidos livres da hemolinfa após exposição a
um meio hiperosmótico (Gilles, 1977), enquanto em M. olfersii ocorre redução de 75% na
concentração dos aminoácidos livres da hemolinfa, sem alteração na concentração das
proteínas (McNamara et al., 2004). Portanto, o aumento na concentração total dos
aminoácidos livres no músculo e hemolinfa D. pagei após 10 dias de exposição parece ser
uma resposta comum a vários decápodos aclimatados a meio hiperosmótico e,
possivelmente, originário do catabolismo de proteínas da hemolinfa
No tecido branquial posterior de D. pagei a concentração de aminoácidos livres
permaneceu inalterada, embora tenha ocorrido aumento do grau de hidratação das
brânquias anteriores e posteriores após 24 horas de exposição. Após exposição do
caranguejo estuarino P. herbstii a meio hiposmótico durante 10 dias também não foram
verificadas alterações na concentração total dos aminoácidos livres nas brânquias, embora o
músculo e o hepatopâncreas apresentassem redução de 45% (Boone & Claybrook, 1977).
No entanto, na lagosta marinha P. japonicus ocorre um aumento de 37% na cocentração
total dos aminoácidos livres após exposição a 125% água do mar (Shinagawa et al., 1995).
Em M. olfersii, ocorre um aumento simultâneo na concentração total dos aminoácidos
livres e no grau de hidratação do tecido branquial após 24 horas de exposição à água
salobra. No entanto, os aminoácidos livres voltam a ter a mesma concentração dos animais
mantidos em água doce após 48 h e o grau de hidratação permanece maior que nos animais
controle, semelhantemente a D. pagei. Boone & Claybrook (1977) sugeriram que a
manutenção na concentração dos aminoácidos livres do tecido branquial após exposição a
meios hipo- ou hiperosmótico possa ser devido ao fato das brânquias serem o principal
local de regulação ativa de sal nos crustáceos, e a osmolalidade deste tecido possa talvez ser
alterada mais rapidamente pelo transporte de íons do que por alterações no nível dos
aminoácidos livres.
No tecido nervoso houve um aumento gradativo na concentração total dos
aminoácidos livres após 24 horas de exposição à água salobra, embora tenha se tornado
significativamente maior que nos animais controles apenas no 5
o
dia. É vantajoso que o
tecido nervoso tenha ultilizado os aminoácidos livres como efetores osmóticos, pois os
fenômenos físico-químicos que constituem a geração do potencial de ação não toleram
alterações osmóticas e iônicas em demasia. Flutuações na composição química dos fluidos
que envolvem o tecido nervoso poderiam produzir alterações na sinalização neural,
afetando as propriedades do sistema nervoso e, consequentemente, o organismo como um
todo (Prior e Pierce, 1981).
Nos juvenis expostos à água salobra de 25‰ não ocorreram alterações na
concentração total de aminoácidos livres. No entanto, é possível que a capacidade
osmorregulatória dos juvenis desta espécie seja bastante semelhante a dos adultos, como
observado em outros crustáceos como o caranguejo marinho Chionoecetes opilio
(Charmantier & Charmantier-Daures, 1994), o camarão P. japonicus (Charmantier et al.,
1988) e as lagostas H. americanus e H. gammarus (Thuet et al., 1988). O aumento na
concentração total de aminoácidos livres nos tecidos muscular e nervoso de adultos
ocorreu, respectivamente, somente após dez e quinze dias de exposição à água salobra, mas
os juvenis foram expostos à água salobra por apenas dois dias, período em que os
mecanismos responsáveis pelo aumento na concentração intracelular de aminoácidos livres
talvez ainda não estejam disponíveis nessa espécie.
De forma geral, os aminoácidos livres glicina, alanina, ácido glutâmico e taurina
funcionam como osmólitos orgânicos do processo regulação do volume celular em
diferentes crustáceos como P. japonicus (Dalla Via, 1986), M. rosenbergii (Tan e Choong,
1981), P. clarkii (Okuma e Abe, 1994) e M. olfersii (Augusto, 2000; McNamara et al.,
2004). Esse padrão se confirmou nos embriões e nos tecidos muscular e nervoso de D.
pagei, onde os principais aminoácidos livres que se alteraram foram os não-essenciais
alanina e prolina além do aminoácido livre essencial arginina nos embriões e tecido
nervoso.
Esses resultados sugerem o envolvimento dos aminoácidos livres na Regulação
Isosmótica Intracelular em D. pagei, pois os aumentos verificados nos embriões e tecidos
muscular e nervoso não são consequentes de alterações no grau de hidratação que se
mantém estável. Adicionalmente, os principais aminoácidos livres que têm sua
concentração aumentada após exposição à água salobra são aqueles considerados não-
essenciais.
7. DISCUSSÃO INTEGRADA
Em relação a capacidade osmo-e e ionorregulatória, as três espécies estudadas
mostraram-se eficientes reguladoras, embora com graus diferentes de invasão a meios
diluídos. As espécies dulcícolas D. pagei e M. amazonicum apresentaram capacidade
osmorregulatória até às salinidades de 25 e 20‰, respectivamente, osmoconformando-se
em salinidades superiores e próximas à letalidade. Assim, ainda que o caranguejo D. pagei
seja uma espécie considerada antiga invasora da água doce, possui considerável
flexibilidade na regulação da osmolalidade da sua hemolinfa, possuindo mecanismos osmo-
e ionorregulatórios que o permite resistir a salinidades muito maiores que seu meio natural.
O camarão M. amazonicum, por se tratar de uma espécie considerada recente invasora da
água doce, apresenta uma notável capacidade osmorregulatória quando exposta a diferentes
salinidades, típica dos palaemonideos que estão no processo de colonização deste biótopo.
Ambas as espécies possuem, ainda, uma reduzida osmolalidade da hemolinfa em água
doce, conferindo vantagem adaptativa devido ao reduzido gradiente mantido entre o meio
externo e interno e, consequentemente, o reduzido gasto energético com mecanismos
osmorregulatórios. A regulação da osmolalidade e da concentração de sais da hemolinfa
destes crustáceos reflete a eficaz maquinaria fisiológica, bioquímica e morfológica, que em
conjunto, asseguram a manutenção razoavelmente constante da composição do fluido
extracelular.
Embora o camarão entre-marés P. northopi não possua mecanismos de absorção de
sal suficientemente eficientes para permitir sua sobrevivência em água doce, mostrou-se o
mais eficiente regulador, osmorregulando sua hemolinfa em salinidades de 5 a 45‰. Esse
sistema osmorregulatório de P. northropi pode refletir o padrão osmorregulatório dos
ancestrais marinhos/estuarinos dos palaemonideos que foram capazes de ocupar a água
doce e, como M. amazonicum, perderam no ambiente limnético a capacidade de sobreviver
em água do mar.
Hipotetiza-se que a perda da capacidade osmorregulatória em águas mais
concentradas pelos crustáceos dulcícolas seja um indício de quão antiga seja sua invasão na
água doce (Mantel & Farmer, 1983). Essa hipótese apresenta algumas limitações do ponto
de vista morfológico, visto que a capacidade de osmorregular os fluidos corporais em meios
de salinidades variáveis está relacionada não somente à permeabilidade da cutícula ou aos
mecanismos de secreção/reabsorção de sais através de epitélios, mas também à relação
superfície/volume corporal das espécies invasoras.
Esta afirmação fica bastante evidente quando se compara mecanismos
osmorregulatórios de braquiuros e carideos. Em muitos grupos de crustáceos, a forma
alongada do corpo encurtou-se através do dobramento ventral do abdome por baixo da
parte anterior do corpo (Figura 59). Entretanto, as lagostas e os camarões ainda possuem
um grande abdome estendido. O corpo dos carídeos tende a ser cilíndrico e lateralmente
comprimido com um abdome bem desenvolvido, sendo que o exoesqueleto é, comumente,
fino e flexível. Em contraste, nos caranguejos o abdome está consideravelmente reduzido e
se encaixa debaixo do cefalotórax, o que pode ter ocasionado uma redução da sua área de
troca com o meio externo e, consequentemente, do influxo de água (Barnes, 1990;
Schimidt-Nielsen, 1996). Portanto, aqueles caranguejos que invadiram à água doce há
menos tempo que camarões podem possuir uma maior capacidade de sobreviver em
ambientes mais concentrados.
Assim, metodologias que avaliam a recência da invasão na água doce baseada na
capacidade das espécies osmorregularem em água salobra ou marinha, podem ser eficientes
no estudo comparativo entre decápodos da mesma infraordem, mas limitadas na
comparação entre crustáceos de infraordens diferentes como camarões e caranguejos.
Figura 59. Comparação do cefalotórax e abdome de um camarão, uma lagosta e um
caranguejo e a origem da forma reduzida do corpo, a qual pode ocasionar uma redução da
área de troca com o meio externo e, consequentemente, o influxo de água. Fonte: Barnes,
1990.
A avaliação preliminar sobre a capacidade das diferentes espécies aqui estudadas
sobreviverem em diferentes salinidades mostrou coerentemente que o camarão P. northropi
é a espécie mais eurialina, embora as espécies de água doce D. pagei e M. amazonicum
também suportem salinidades bem maiores que o seu meio natural.
A dependência da água salobra pelas zoeas do camarão M. amazonicum da
população aqui estudada, apoia a hipótese da recente invasão da água doce por esta espécie,
em constraste ao caranguejo D. pagei, que completa todo o seu ciclo de vida na água doce.
Assim, embora os espécimes adultos de M. amazonicum estejam bem adaptados à água
doce, sugere-se que as larvas ocupem biótopos diferentes com regimes específicos de
salinidade, semelhantemente a outros camarões do gênero Macrobrachium, como M.
olfersii e M. acanthurus.
A concentração de aminoácidos livres nos tecidos costuma ser usada na literatura
como parâmetro para se avaliar a recência da invasão na água doce, visto que os crustáceos
dulcícolas possuem menor concentração destas moléculas que os marinhos (Camien, 1951;
Mantel & Farmer, 1983). Potts & Parry (1964) sugeriram ainda que a recência da invasão
na água doce pode ser estimada de forma comparada pela similaridade da concentração de
aminoácidos livres nos tecidos das espécies invasoras.
A tendência à redução na concentração de aminoácidos livres intracelulares em
espécies dulcícolas também é observada em outros grupos de invertebrados. Enquanto nos
moluscos marinhos a concentração de aminoácidos livres é de aproximadamente 1000
nmol/mg de peso seco, no caracol pulmonado Helisoma duryi a concentração de
aminoácidos livres é 10 nmol/mg de peso seco (Matsushima et al., 1989) e no bivalve
Corbicula manilensis é 30 nmol/mg de peso seco (Gainey, 1978). Os moluscos de água
doce ainda possuem uma das mais baixas osmolalidade da hemolinfa, chegando a 50
mOsm/kg de água no bivalve Lampsilis teres (Jordan & Deaton, 1999). No entanto, os
moluscos são extremamente sensíveis a meios hiperosmóticos e normalmente não
sobrevivem em salinidades acima de 200 mOsm/kg de água (Jordan & Deaton, 1999).
Os resultados aqui apresentados sobre a concentração de aminoácidos livres em
decápodos com diferentes graus de invasão em salinidades reduzidas mostram que a
concentração destes efetores osmóticos orgânicos nos tecidos, principalmente no muscular,
constitui um bom parâmetro para se avaliar o grau de independência da água salobra pelas
espécies dulcícolas. A concentração de aminoácidos livres no tecido muscular apresentou
uma clara redução nas espécies dulcícolas, D. pagei (46 nmol/mg de peso seco) e M.
amzonicum (164 nmol/mg de peso seco), em relaçao à espécie entre-marés P. northropi
(715 nmol/mg de peso seco). Adicionalmente, a concentração destas moléculas foi ainda
menor no caranguejo D. pagei, uma espécie hololimnética considerada antiga invasora da
água doce que possui reduzida osmolalidade da hemolinfa e ciclo de vida completamente
desenvolvido neste biótopo.
A tendência à redução na concentração total de aminoácidos livres também foi
observada em embriões, zoeas e juvenis das espécies aqui estudadas. Assim, embora as
zoeas de M. amazonicum aparentemente não possuam mecanismos eficientes de regulação
dos seus fluidos corporais em água doce, possuem uma reduzida concentração de
aminoácidos livres, típica de espécies limnéticas. Esta característica sugere que a redução
na concentração de aminoácidos livres pode anteceder evolutivamente o desenvolvimento
de mecanismos osmorregulatórios que propiciem o desenvolvimento das larvas das
espécies invasoras na água doce.
Pode ser inferido com base nos achados do presente trabalho, acrescido de dados da
literatura (Tabela 17, página 106), que decápodos considerados recentes invasores da água
doce como M. amazonicum (presente estudo) e M. olfersii (McNamara et al., 2004)
possuem uma concentração intermediária de aminoácidos livres nos seus tecidos, menor
que as espécies marinhas, mas ainda maior que as espécies antigas invasoras que possuem
ciclo de vida independente da água salobra.
A invasão da água doce constitui um processo que denota considerável gasto
energético consequente dos mecanismos de absorção de sal pelas brânquias, produção de
urina hiposmótica em algumas espécies e síntese e transporte de efetores osmóticos
intracelulares em espécies diádromas. Ainda assim, a irradiação dos crustáceos na água
doce tem considerável valor, pois permitiu a invasão de um novo biótopo, longe de
predadores e competidores estuarinos e marinhos.
A importância osmótica dos aminoácidos livres na regulação do volume celular foi
demonstrada em todas as espécies aqui estudadas, embora ausente em algumas fases do
desenvolvimento ou em certos tecidos. Essa resposta espécie-específica e tecido-específico
pode estar relacionada a diferencial capacidade osmorregulatória dos embriões e/ou
proteção osmótica oferecida pelas membranas embrionárias; ao surgimento ontogenético de
estruturas capazes de regular a osmolalidade da hemolinfa das larvas e, finalmente, de quão
eficiente são estes mecanismos de regulação nos adultos.
Entre os tecidos dos animais adultos, o tecido muscular foi aquele que apresentou
maior capacidade de alterar a concentração de aminoácidos livres após exposição a meios
de salinidades variáveis. No entanto, o decurso temporal deste aumento foi diferencial entre
as espécies, com M. amazonicum e P. northropi tendo sua concentração alterada após 5
dias e D. pagei somente após 10 dias. O aumento da concentração de aminoácidos livres na
camarão diádromo M. amazonicum e no camarão entre-marés P. northropi pode refletir o
que realmente ocorre na natureza e constituir um mecanismo comum a estas espécies. Em
constraste, a resposta mais lenta de D. pagei é coerente com sua posição de antigo invasor
de águas continentais, onde não fica exposto a variações de salinidade no seu habitat
natural.
Os aminoácidos livres osmoticamente importantes são geralmente os mesmos em
embriões, larvas, juvenis e adultos das espécies estudadas, semelhantemente aos demais
crustáceos citadas na literatura. Os aminoácidos livres não-essenciais glicina, prolina,
alanina e o essencial, arginina, são os principais efetores osmóticos de D. pagei, M.
amazonicum e P. northopi e constituem cerca de 40 a 60% da concentração total, indicando
que o predomínio destes aminoácidos livres seja um padrão em crustáceos,
independentemente do estágio ontogenético ou habitat ocupado.
Finalmente, a comparação do tipo de desenvolvimento das duas espécies dulcícolas,
D. pagei e M. amazonicum, apoia a teoria de que a invasão da água doce é frequentemente
acompanhada pela abreviação do desenvolvimento larval e que as espécies recentes
invasoras podem não ter sido selecionadas quanto a esse tipo de desenvolvimento.
Enquanto em M. amazonicum eclodem-se numerosas zoeas I livre-natantes, incapazes de
sobreviver em água doce, em D. pagei eclodem-se poucos juvenis, capazes de sobreviver
desde a água doce até a água salobra de 25 ‰, semelhantemente aos adultos.
Esses achados estão de acordo com Bishop & Burton (1993) que sugeriram que no
decurso da invasão da água doce, os adultos primeiro teriam adquirido a capacidade de
osmorregular nesse novo biótopo e, posteriormente, teria surgido o desenvolvimento larval
abreviado. Charmantier (1988) corroborara esta hipótese através de um estudo da adaptação
à água doce de diferentes crustáceos, mostrando que as espécies adultas que habitam a água
salobra tornam-se fisiologicamente capazes de viver em água doce, mas que a reprodução,
com vários estágios larvais, ainda depende da água do mar ou salobra para o
desenvolvimento. Está situação ainda é observada em vários camarões do gênero
Macrobrachium como M. rosenbergii (Tan & Choong, 1981), M. acanthurus (Choudhury,
1970), M. olfersii (Dugger & Dobkin, 1975), M. petersii (Read, 1982) e no caranguejo E.
sinensis (Anger, 1991). Assim, em um segundo momento evolutivo, após a conquista
inicial da água doce pelos adultos, o desenvolvimento dentro do ovo teria-se alongado,
resultando na inclusão de estágios larvais dentro do ovo.
Em essência, fica claro que a invasão da água doce pelos diferentes grupos de
crustáceos que se originaram no mar e paulatinamente invadiram a água doce é um
processo complexo que envolve não somente adaptações fisiológicas, mas também
adaptações morfológicas, reprodutivas, ecológicas e comportamentais. Aqui, acrescentou-
se importantes informações fisiológicas sobre a invasão da água doce, pertinentes à
compresensão da invasão deste biótopo.
Estudos futuros da fisiologia osmorregulatória acrescida de estudos genéticos
comparativos entre as diferentes populações do camarão M. amazonicum, por exemplo,
poderão ajudar na compreensão da invasão da água doce por essa curiosa espécie que ocupa
biótopos de salinidades extremamente distintas. A avaliação da permeabilidade à água e
íons acrescida da taxa de produção urinária em espécies dulcícolas como o caranguejo D.
pagei também poderão auxiliar na elucidação dos mecanismos osmorregulatórios de
braquiuros.
Finalmente, visto que o continente americano abriga numerosas espécies dulcícolas,
inclusive espécies endêmicas com distribuições restritas, como os anomuros do gênero
Aegla, futuros estudos comparativos que investiguem os diferentes mecanismos
fisiológicos que permitiram a invasão da água doce, acrescido de avaliações moleculares e
filogenéticas, poderão trazer resultados ainda mais conclusivos sobre a curiosa e recente
conquista da água doce pelos crustáceos.
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