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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
KARLA CARVALHO MIRANDA
Identificação e suscetibilidade in vitro de espécies de Malassezia
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Maria do Rosário Rodrigues Silva
Dissertação de Mestrado
Goiânia – GO, 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
KARLA CARVALHO MIRANDA
Identificação e suscetibilidade in vitro de espécies de Malassezia
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Maria do Rosário Rodrigues Silva
Goiânia – GO, 2006
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AGRADECIMENTOS
A Deus por todas as bênçãos concedidas. Força, coragem, determinação, amor,
saúde, perseverança, vida...
A meus padrinhos Maria Abadia e Vanderico e primos Pierre, Leandro e Fernando,
que me acolheram e ensinaram que sempre somos capazes do que queremos se temos uns aos
outros.
A toda minha família, em especial minhas avós Geralda e Orísia, por compreender
os vários momentos de ausência e por todo apoio que sempre recebo, vocês são meu refúgio
e minha força!
A minha orientadora prof
a
Dr
a
Maria do Rosário Rodrigues Silva pelos
ensinamentos, dedicação, carinho, amizade, paciência, compreensão e oportunidades.
Exemplo de determinação, força e competência. Durante esses anos você me ensinou mais
que ciência. Aprendi que podemos ser grandes se tivermos persistência, dedicação e Fé.
Obrigada por acreditar e principalmente cuidar de mim todo esse tempo. Permaneça a
certeza de um imenso carinho e admiração pela pessoa que você é e que essa amizade dure
enquanto houver vida!
5
A prof
a
Orionalda de Fátima Lisboa pela lição de vida, força e fé dada a todos nós.
Por todos os momentos de alegria, carinho e dedicação. Você é iluminada por Deus!
A prof
a
Dr
a
Lúcia Kioko Hasimoto e Souza por toda atenção, cuidado, amizade e
conselhos e principalmente o carinho com que sempre me acolhe. Você influenciou grande
parte dessa minha estória. É muito bom poder contar com alguém como você em todos os
momentos. Obrigada por tudo, Dindinha!
A minha grande amiga Crystiane Rodrigues de Araujo. A qual não tenho palavras
para definir, a não ser como minha irmã de coração. Tenho certeza que nossa amizade vem
de algo além do que possamos compreender. Seu carinho, dedicação, conselhos e
companheirismo serão sempre insubstituíveis. Agradeço por tê-la comigo não só nesse, mas
em todos os momentos de minha vida, inclusive os que virão. Muito Obrigada minha
amiga!
A Hildene Menezes e Silva por cuidar de mim todo esse tempo. Pela alegria que
traz a nossas vidas com a perseverança e o imenso amor que guarda no coração.
A Flávia Ikeda e Araújo, dedicação, amizade, carinho, força, companheirismo sem
os quais eu não conseguiria vencer muitas batalhas.
A Wilson de Melo Cruvinel, carinho, confiança e principalmente pela amizade
incondicional. Obrigada por toda atenção que sempre dedica a mim.
A Péricles Lopes Dourado, amizade, carinho, atenção sem os quais não conseguiria
atravessar grandes obstáculos.
6
A Janine de Aquino Lemos pelo auxílio, amizade e carinho que me cercaram desde
a minha chegada ao Laboratório de Micologia, sentimentos que só se solidificaram com o
tempo, conte sempre comigo.
A Xisto Sena Passos pelo auxílio, companheirismo e principalmente amizade que se
firmou por todo esse tempo. Obrigada por tudo!
A Carolina Rodrigues Costa pelo companheirismo durante o mestrado, atenção,
carinho e amizade que se fortalece a cada dia.
A Ailton José Soares pelo auxílio técnico e atenção durante a realização desse
trabalho.
A Cícero Júnior e Maria do Socorro sempre prontos a nos ajudar.
Aos professores do curso de microbiologia por todo conhecimento, auxílio, atenção e
carinho que sempre me transmitiram.
Ao programa de pós-graduação em Medicina Tropical pela oportunidade de
desenvolver esse projeto.
A todos que direta ou indiretamente auxiliaram para a realização desse trabalho,
muito obrigada!
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Abstract
Yeasts of the genus Malassezia are part of the normal human skin flora,
responsible for several diseases including pityriasis versicolor. The difficulty in
culturing Malassezia species in vitro have delayed the known of the taxonomic
status of these yeasts. Nowadays morphological characteristics and physiological
features as utilization of different tween compounds as well as molecular biological
studies of Malassezia yeasts allowed their classification in 11 species: M. furfur, M.
sympodialis, M. slloffiae, M. obtusa, M. globosa, M. restricta, M. pachydermatis, M.
yamatoensis, M. nana, M. japonica and M. dermatis. Numerous susceptibility
testing methods for yeasts has been developed but is not applicable to Malassezia
spp due to their obligatory lipophilic nature. The alternative approach has been
assessed with broth microdilution methods using media as Leeming-Notman (LN)
and modified Dixon. In this work, we differentiated Malassezia species by
morphological and biochemical criteria and assessed the in vitro activity of
fluconazole, itraconazole, ketoconazole and voriconazole against Malassezia
species by broth microdilution method using the LN medium slightly modified. We
isolated 95 Malassezia strains that were identified as M. furfur (74), M. sympodialis
(11), M. obtusa (08) and M. globosa (02). The modified LN medium used for
susceptibility testing allowed good growth of Malassezia and the visual reading of
the minimal inhibitory concentration (MIC) was readly obtained after 7 days at the
incubation at 32ºC. In general, all the drugs had low MIC values for all Malassezia
species tested, except for one M. globosa strain that showed high MIC
s
values. For
the 95 strains, the MIC ranges were of <0,03 – 4 μg/ml to ketoconazole, <0,03 -
>16 μg/ml to voriconazole, of < 0,125 – >64μg/ml to fluconazole and < 0,03 – 16
μg/ml to itraconazole. In summary in our study we identified M. furfur as the most
prevalent species of pytiriasis versicolor lesions in our region and the good
reproductibility and visual readings obtained by using modified LN medium suggest
that this medium should be proposed for the antifungal testing of drugs against
Malassezia species.
8
Resumo
As leveduras do gênero Malassezia são constituintes da microbiota humana,
responsáveis por várias doenças incluindo pitiríase versicolor. A dificuldade de
cultivar as espécies de Malassezia in vitro tem adiado o conhecimento do status
taxonômico dessas leveduras. As características morfológicas e fisiológicas como
utilização de diferentes tweens bem como estudos de biologia molecular de
leveduras de Malassezia permitiram a sua classificação em 11 espécies: M. furfur,
M. sympodialis, M. slloffiae, M. obtusa, M. globosa, M. restricta, M. pachydermatis,
M. yamatoensis, M. nana, M. japonica and M. dermatis. Vários métodos de teste
de suscetibilidade para leveduras têm sido desenvolvidos, mas não são aplicáveis
para Malassezia spp devido à sua natureza lipofílica obrigatória. A alternativa mais
próxima tem sido avaliada com o método de microdiluição em caldo usando meios
como Leeming-Notman (LN) e Dixon modificado. Neste trabalho, diferenciamos
espécies de Malassezia por critérios bioquímicos e morfológicos e avaliamos a
atividade in vitro de fluconazol, itraconazol, cetoconazol e voriconazol contra
Malassezia spp pelo método de microdiluição em caldo usando o meio de LN
levemente modificado. Nós isolamos 95 cepas de Malassezia que foram
identificadas como M. furfur (74), M. sympodialis (11), M. obtusa (08) e M. globosa
(02). O meio de LN modificado usado para o teste de suscetibilidade permitiu um
bom crescimento de Malassezia e a leitura visual da concentração inibitória
mínima (CIM) foi prontamente obtida depois de 7 dias de incubação à 32ºC. Em
geral, todos antifúngicos tiveram baixos valores de CIM para todas espécies de
Malassezia testadas, exceto para um isolado de M. globosa que mostrou alto
valores de CIM
s
. Para as 95 cepas, as variações de CIM foram de <0,03-4 μg/ml
para cetoconazol, <0,03 ->16 μg/ml para voriconazol, de < 0,125 - >64μg/ml para
fluconazol e < 0,03 -16 μg/ml para itraconazol. Em resumo, em nosso estudo nós
identificamos M. furfur como a espécie mais prevalente em lesões de pitiríase
versicolor em nossa região e a boa reprodutibilidade e leitura visual obtidas
usando o meio de LN modificado sugere que esse meio deveria ser proposto para
os testes antifúngicos de medicamentos contra espécies de Malassezia.
9
Lista de Abreviaturas
ATCC - American Type Culture Collection
CFM – Concentração Fungicida Mínima
CIM – Concentração Inibitória Mínima
CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO – Dimethyl Sulfoxide
G+C – Guanina + Citosina
IGS – Inter Genic Spacer
ITS – Internal Transcribed Spacer
KOH – Hidróxido de Potássio
LSU – Large Subunit of the
r
RNA gene
MIC – Minimal Inhibitory Concentration
NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards
PCR – Polymerase Chain Reaction
PV – Pitiríase Versicolor
rDNA – Nuclear ribosomal DNA
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism
REA – Restriction Endonuclease Analysis
10
Índice
1. Introdução ........................................................................................................... 1
1.1 Generalidades ............................................................................................... 1
2. Pitiríase Versicolor .............................................................................................. 2
2.1 Clínica............................................................................................................ 2
2.2 Etiologia......................................................................................................... 3
2.3 Classificação taxonômica .............................................................................. 4
2.4 Condições Predisponentes............................................................................ 4
2.5 Epidemiologia ................................................................................................ 5
2.6 Diagnóstico .................................................................................................... 6
2.6.1 Diagnóstico Clínico.................................................................................. 6
2.6.2 Diagnóstico laboratorial........................................................................... 7
2.7 Identificação das espécies de Malassezia..................................................... 8
2.7.1 Métodos Fisiológicos............................................................................... 9
2.7.2 Métodos Ultraestruturais ....................................................................... 11
2.7.3 Métodos Moleculares ............................................................................ 11
2.8 Características morfofisiológicas das espécies de Malassezia.................... 12
2.8.1 Malassezia furfur................................................................................... 12
2.8.2 Malassezia pachydermatis.................................................................... 12
2.8.3 Malassezia sympodialis......................................................................... 13
2.8.4 Malassezia globosa............................................................................... 13
2.8.5 Malassezia obtusa................................................................................. 13
2.8.6 Malassezia restricta............................................................................... 14
2.8.7 Malassezia slooffiae.............................................................................. 14
2.8.8 Novas espécies propostas .................................................................... 14
2.9 Tratamento .................................................................................................. 15
2.10 Suscetibilidade in vitro para as espécies de Malassezia ........................... 18
3. Justificativa........................................................................................................ 20
4. Objetivos ........................................................................................................... 21
5. Referências Bibliográficas................................................................................. 22
11
6. ARTIGO 1: Identificação de espécies de Malassezia em pacientes com pitiríase
versicolor em Goiânia-GO, Brasil.......................................................................... 29
7. ARTIGO 2: In vitro susceptibility of itraconazole, voriconazole, ketoconazole and
fluconazole against the Malassezia species.......................................................... 38
8. Conclusões........................................................................................................ 51
9. Anexos .............................................................................................................. 52
1. Introdução
1.1 Generalidades
Os primeiros achados de leveduras do gênero Malassezia foram relatados
por Eichstedt em 1846, que descreveu o microrganismo obtido da pele de
pacientes com pitiríase versicolor. Em 1874, Malassez descreveu o encontro de
leveduras ovaladas no extrato córneo de pacientes com pitiríase versicolor, sendo
que estas leveduras estavam também associadas a outros problemas de pele. Em
1889, Baillon (Apud Marcon & Powell 1992) propôs o nome de Malassezia furfur
em reconhecimento ao trabalho de Malassez para descrever o agente etiológico
da infecção de natureza furfurácea da pele, observadas em pacientes com
pitiríase versicolor.
Essas leveduras fazem parte da microbiota da pele de humanos e de
outros animais homotérmicos, colonizando o hospedeiro já nas primeiras horas de
vida (Hernadez et al. 2003; Salah et al. 2005). Comumente, são encontradas em
indivíduos na puberdade e adultos jovens, devido à elevada atividade das
glândulas sebáceas nesta fase da vida (Ljubojevic et al. 2002), podendo produzir
infecções superficiais de pele além de pitiríase versicolor, como, dermatite
seborréica, foliculites e dermatite atópica (Sugita et al. 2004) e infecções
sistêmicas principalmente em recém nascidos, crianças e pacientes
imunocomprometidos que fazem uso de cateter intravascular (Fauchet at al.
2004). A forma clínica mais freqüentemente descrita é a pitiríase versicolor.
2
2. Pitiríase Versicolor
2.1 Clínica
Pitiríase versicolor é uma dermatomicose crônica, recorrente, usualmente
assintomática, produzindo lesões descamativas principalmente no pescoço, tórax,
membros superiores, costas, abdômen (figura 1), face e raramente em áreas
intertriginosas. As lesões podem ser únicas ou múltiplas que podem se tornar
confluentes, de coloração que varia de acordo com a pigmentação da pele normal
do paciente, com a exposição da lesão à luz solar e com a gravidade da doença
(Aljabre 2003; Aste and Pau 2004). Alguns autores supõem que as alterações de
pigmentação induzidas por espécies de Malassezia nas lesões de pitiríase
versicolor podem ocorrer devido à produção de ácidos dicarboxílicos, que podem
ter efeitos citotóxicos direto nos melanócitos. Estes ácidos atuam inibindo a
atividade da tirosinase, que está presente no interior dessas células, e é
responsável pela síntese de melanina (Marcon and Powell 1992; Romano et al.
2005).
Figura 1. Lesões hipercrômicas, descamativas localizadas no
abdômen,características de pitiríase versicolor.
3
2.2 Etiologia
Até 1995 eram conhecidas três espécies de Malassezia: M. furfur (Baillon
1889) (Apud Marcon & Powell 1992), M. pachydermatis (Dodge 1935) (Apud
Marcon & Powell 1992) e M. sympodialis (Simmons & Guého 1990). Em 1996,
Guého et al, descreveram quatro novas espécies, baseando-se em suas
características morfológicas, fisiológicas, ultraestruturais e moleculares: M.
globosa, M. obtusa, M. restricta e M. slooffiae. Dentre as características
morfológicas das células, utilizadas para a distinção entre as sete espécies foram
consideradas, a espessura, a presença de multicamada da parede celular e a
produção de blastoconídios pelo processo de brotamento monopolar ou simpodial.
Com relação aos testes fisiológicos foram avaliados, o crescimento em meio
contendo ácidos graxos, a capacidade de produção das enzimas catalase e
urease, além da sua capacidade de assimilar tweens (ésteres de
polioxietilenosorbitano) em diferentes concentrações. A utilização de testes de
assimilação de óleo de rícino (Cremophor El) e hidrólise de esculina são também
propostos para a distinção entre as espécies lipodependentes. M. furfur é capaz
de assimilar o Cremophor El e M. sympodialis, M. obtusa e algumas cepas de M.
pachydermatis são capazes de hidrolisar a esculina (Mayser et al. 1997). A
caracterização molecular para a definição das sete espécies de Malassezia foi
permitida através do sequenciamento da região LSU do rRNA (Guillot et al. 1995).
Novas técnicas moleculares como sequenciamento de rDNA, análises
filogenéticas, sequenciamento de nucleotídeos das regiões ITS, IGS
1
de vários
genes do rRNA permitiram a incorporação de quatro novas espécies a esse
4
gênero: M. dermatis, M. nana, M. japonica e M. yamatoensis (Sugita et al. 2002;
Sugita et al. 2003; Sugita et al. 2004; Hirai et al. 2004).
2.3 Classificação taxonômica
O gênero Malassezia agrupa leveduras mitospóricas e até o momento não
está estabelecida sua fase sexual. Devido às suas características ultraestruturais
essas leveduras podem ser classificadas como pertencentes ao subfilo
basidiomicota. As leveduras do gênero Malassezia possuem uma invaginação da
membrana plasmática, que interrompe transversalmente toda parede celular,
adquirindo disposição helicoidal. Essa característica justifica sua classificação no
subfilo basidiomicota (Guillot et al. 1995).
A reprodução assexuada ocorre através da formação de blastoconídios,
com processo típico de germinação enteroblástica monopolar. O broto formado se
separa da célula mãe através de um septo com posterior fissão. Essa separação
geralmente deixa uma cicatriz pronunciada na célula mãe que traz sucessivas
germinações e como conseqüência a formação de um colarete no local de onde
emergiram os brotos (Aheam and Simmons 1998).
2.4 Condições Predisponentes
Os fatores que levam ao desenvolvimento de pitiríase versicolor ainda não
estão completamente elucidados. É conhecido, entretanto, que o microrganismo
tem como habitat natural o organismo do hospedeiro, e o desenvolvimento da
5
lesão ocorre geralmente devido à transformação do fungo da fase saprofítica (em
forma de levedura) para a fase parasitária (forma filamentosa) (Gupta et al. 2002).
Condições endógenas relacionadas ao hospedeiro como predisposição
genética, hipersecreção sebácea, hiperidrose, imunossupressão adquirida ou
desordens endócrinas podem estar relacionados com o desenvolvimento de
pitiríase versicolor (Romano et al. 2005). Além disso, fatores ambientais como
climas quentes e úmidos são considerados características importantes para
desencadear o processo infeccioso (Midgley 2000; Hafez et al. 2003).
2.5 Epidemiologia
A prevalência de micoses superficiais pode ser alterada pela idade,
gênero e atividade social, sendo algumas vezes também afetada por fatores
geográficos e sócio-econômicos. As características expressas pelas micoses
superficiais podem ser variadas, havendo diferenças em localização e gravidade
das lesões em determinadas populações de diferentes regiões de um mesmo país
ou de países distintos (Çelik et al. 2003; Khatri 2004).
Pitiríase versicolor é a micose superficial mais comumente encontrada no
mundo, com elevada frequência em climas tropicais, subtropicais e úmidos. As
lesões, com predileção no tronco e membros superiores tem prevalência em
adultos jovens com poucos casos relatados em crianças e idosos, com maior
incidência no gênero feminino (Quintero and Perfetti 2004). A ocorrência de
grande número de casos na faixa etária de 15 a 30 anos, com predomínio na
puberdade, pode ser explicada pelos níveis crescentes dos hormônios sexuais e a
6
intensa produção das glândulas sebáceas nessa fase da vida (Ingordo et al. 2003;
Quintero et al. 2004; Tarazooie et al. 2004; Salah et al. 2005).
Nas Américas, Central e do Sul, o índice de pitiríase versicolor é
relativamente alto, quando comparado a outras doenças de pele. A prevalência de
pitiríase versicolor na Venezuela é de aproximadamente 15,5% (Quintero et al.
2004), enquanto na República Dominicana (Santo Domingo), esses índices se
mostraram ainda mais elevados, como demonstrado por Arenas et al. (2001) que
relataram pitiríase versicolor em cerca de 30
a 60% dos casos diagnosticados
como infecções fúngicas naquela região. Ambos países são de clima tropical, o
que colabora com a elevada presença dessas leveduras nessas regiões. Há uma
enorme carência de relatos da doença no Brasil.
2.6 Diagnóstico
2.6.1 Diagnóstico Clínico
O diagnóstico clínico de pitiríase versicolor se baseia no aspecto
característico das lesões, sendo positivos os sinais de Besnier (descamação da
pele ao passar a unha), e de Zileri (ampliação da lesão ao esticar a pele), e
apresentando ainda como característica uma fluorescência verde amarelada
quando a lesão é submetida à Lâmpada de Wood.
7
2.6.2 Diagnóstico laboratorial
2.6.2.1 Exame em vida parasitária
O exame micológico através de hidróxido de potássio (KOH) a 20% permite
a visualização de células arredondadas ou ovaladas, associadas ou não a hifas
grossas, septadas, curtas e tortuosas (figura 2a). Estas estruturas podem ainda
ser visualizadas com maior nitidez quando se usa a adição de tinta para caneta
tinteiro (tinta parker) ou azul de metileno ao KOH (figura 2b).
Figura 2. Características microscópicas de exame micológico direto de Pitiríase
Versicolor mostrando leveduras agrupadas associadas a hifas curtas e tortuosas
através da utilização de KOH a 20% (a) e KOH + tinta parker (b).
(Fonte: www.geocites.com/hongosgratis/fungi)
2.6.2.2 Cultivo
Em meios normalmente utilizados para o crescimento dos fungos, como o
ágar Sabouraud dextrose as espécies de Malassezia apresentam um
desenvolvimento reduzido ou são incapazes de crescer. As leveduras desse
gênero apresentam um caráter de lipodependência, (exceção de M.
pachydermatis) necessitando assim, de meios enriquecidos com ácidos graxos de
8
diferentes cadeias para seu desenvolvimento. Óleos naturais como oliva, cereal,
girassol e soja são ricos em ácidos graxos sendo, portanto utilizados para auxiliar
no crescimento de espécies de Malassezia (Marcon & Powell.1992). O meio de
ágar Dixon modificado, que possui em sua composição glicerol, ácido oléico,
tween 40, peptona, bile de boi e extrato de malte (Guillot et al. 1996) é largamente
utilizado para o cultivo das espécies de Malassezia. Neste meio as colônias de
Malassezia apresentam-se normalmente úmidas, cremosas, friáveis, de coloração
branca amarelada (figura 3). A temperatura ótima de crescimento para estas
leveduras oscila de 32 a 37ºC, sendo que algumas são capazes de resistir até
41ºC.
Figura 3. Colônias cremosas, úmidas e branco amareladas de
Malassezia spp em Ágar Dixon modificado a 32ºC.
2.7 Identificação das espécies de Malassezia
Há várias técnicas propostas para identificação das espécies, incluindo
métodos fisiológicos, ultraestruturais e moleculares.
9
2.7.1 Métodos Fisiológicos
Prova da Catalase
Todas as espécies de Malassezia com exceção de M. restricta, produzem
a catalase decompondo o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) com liberação de O
2
sob
a forma de gás.
Prova da Urease
As leveduras do gênero Malassezia são capazes de degradar a uréia
(CH
4
N
2
O) em 2 moléculas de amônia (NH
3
). Nesta prova há alteração do pH do
meio que passa de neutro a alcalino.
Hidrólise da esculina
Algumas espécies de Malassezia como M. sympodialis e M. obtusa são
capazes de hidrolisar a esculina, sendo um método usado para distinguir estas
espécies. Neste teste há a avaliação da atividade da β-glicosidase, revelada pelo
enegrecimento do meio, quando a esculina se reduz em esculetina e glicose.
Assimilação em tweens
A assimilação de diferentes tweens (Figura 4), como o tween 20 conhecido
como éster de ácido láurico (monolaurato de sorbitan polioxietilenado), tween 40
éster de ácido palmítico (monopalmitato de sorbitan polioxietilenado), tween 60
éster de ácido esteárico (monoesterato de sorbitan polioxietilenado) e tween 80
10
éster de ácido oléico (monooleato de sorbitan polioxietilenado), possibilitam a
distinção entre várias espécies de Malassezia (Guého et al., 1996).
Figura 4. Padrão de assimilação de tweens 20, 40, 60
e 80 apresentado por M. furfur.
Coloração de Gram
As características microscópicas expressas por M. globosa (redonda) e M.
obtusa (ovalada) podem ser visualizadas através da coloração de Gram. Estas
duas leveduras não são capazes de assimilar os diferentes tweens sendo esta
coloração de grande utilidade para distinção entre as duas espécies (Figura 5).
Figura 5. Característica micromorfológica à coloração de Gram. a- Células
ovaladas de M. obtusa. b- Células globosas de M. globosa. 400X
11
2.7.2 Métodos Ultraestruturais
Através das características morfológicas ultraestruturais, é possível
distinguir as sete espécies de Malassezia (M. furfur, M. pachydermatis, M.
slooffiae, M. sympodialis, M. globosa, M. obtusa e M. restricta). Cada espécie
exibe morfologia típica em microscopia eletrônica, sendo que todas as espécies
apresentam brotamentos unilaterais com cicatrizes proeminentes na célula mãe,
sendo que os brotos geralmente são formados em uma base estreita ou larga
desta célula (Guillot et al. 1995; Guého et al. 1996). As características
micromorfológicas de cada espécie são descritas no item 2.8, características
morfofisiológicas das espécies de Malassezia.
2.7.3 Métodos Moleculares
As análises morfológicas e bioquímicas descritas por Guého et al. 1996 não
permitem a identificação de todas as espécies de Malassezia (Makimura et al.
2000). Vários métodos moleculares como a reassociação dos valores de G+C,
comparação do rRNA, cariotipagem, reação de polimerase em cadeia (PCR) +
análise do polimorfismo dos fragmentos diferentes de DNA submetidos a enzimas
de restrição (RFLP), PCR+ análise de DNA com endonucleases de restrição
(REA), têm sido descritos para caracterização de todas as espécies conhecidas
desta levedura (Gupta et al. 2000 b; Guillot et al. 2000; Gaitanis et al. 2002; Gupta
et al. 2002; Mirhendi et al. 2005).
As técnicas descritas acima utilizam o microrganismo em cultura, exigindo,
portanto um período de tempo maior para seu procedimento. Mais recentemente
12
técnicas como o nested-PCR para a identificação da espécie têm sido utilizados à
partir de material clínico (Sugita et al. 2001; Gupta et al. 2004; Morishita et al.
2006).
As técnicas moleculares são consideradas de grande importância porque
são capazes de detectar a presença de duas leveduras em uma mesma lesão, e
ainda algumas vezes permitem a verificação de diferenças dentro da mesma
espécie (Gupta et al. 2000; Gupta et al. 2001).
2.8 Características morfofisiológicas das espécies de Malassezia
2.8.1 Malassezia furfur
Em meios contendo ácidos graxos, M. furfur mostra colônias de textura
cremosa, brilhantes ou foscas, lisas, friáveis, convexas de coloração branco-fosco.
Ao exame microscópico da cultura são visualizadas células de variados tamanhos
e formas: ovais (1,5-3 μm), cilíndricas (2,5-8 μm) e esféricas (2,5-5 μm) com
brotamento na base larga da célula sendo que ocasionalmente são observados
filamentos curtos e grossos. A principal característica para distinção das outras
espécies reside na sua capacidade de assimilação de tweens 20, 40, 60 e 80.
2.8.2 Malassezia pachydermatis
Levedura lipofílica, porém, não lipodependente, M. pachydermatis é capaz
de crescer em ágar Sabouraud sem a necessidade de adição de fonte de ácidos
graxos de cadeia longa, o que a diferencia das outras espécies. Apresenta
13
colônias foscas, de aspecto cremoso e textura macia ou friável. À microscopia
mostra células ovais pequenas medindo aproximadamente 2,5 x 5,0 μm,
apresentando-se com brotos de grande tamanho que surgem na base larga da
célula onde se observa a formação de um colarinho.
2.8.3 Malassezia sympodialis
As colônias de M. sympodialis são brilhantes, lisas, planas, com elevação
central e textura macia. À microscopia da cultura são observadas células ovais ou
globosas de 1,5-2,5 x 2,5-6,0 μm, apresentando brotamento simpodial que auxilia
na diferenciação de outras espécies de Malassezia. A assimilação de tween 40, 60
e 80, como única fonte de ácidos graxos e hidrólise da esculina são características
expressas por esta espécie.
2.8.4 Malassezia globosa
Essa espécie apresenta-se com colônias elevadas, pregueadas, rugosas,
ásperas e quebradiças. M. globosa não cresce ou cresce pouco à 37ºC. À
microscopia da colônia são observadas células esféricas de aproximadamente
2,5-8,0 μm, com brotamento na base estreita da célula esta morfologia
arredondada permite a sua distinção de M. obtusa. Pequenos filamentos próximos
ao local de formação do broto podem ser observados. Esta espécie não é capaz
de assimilar tweens.
2.8.5 Malassezia obtusa
Forma colônias planas e lisas de textura mucóide. Ao exame
microscópico da colônia evidenciam-se células cilíndricas, medindo
14
aproximadamente 2,0 μm x 6,0 μm, com brotamentos na base larga da célula mãe
e filamentos quando presentes podem ser formados sobre qualquer ponto da
superfície da célula. Assim como M. globosa não é capaz de assimilar tweens.
2.8.6 Malassezia restricta
M. restricta apresenta colônias levemente lisas ou rugosas de textura dura
ou quebradiça que se desenvolvem a temperatura de 32ºC, mas resiste a
temperatura de 39ºC. À microscopia da colônia observam-se células esféricas ou
ovais (2,0 μm x 4,0 μm), apresentando brotamentos na base estreita da célula. A
diferenciação com outras espécies se faz pela prova da catalase, sendo que M.
restricta é a única espécie incapaz da produção desta enzima.
2.8.7 Malassezia slooffiae
As colônias apresentam-se rugosas, geralmente com sulcos e textura
áspera. Na micromorfologia observam-se células curtas cilíndricas medindo
aproximadamente 2,0 μm x 4,0 μm, com brotamentos na base larga da célula-
mãe. O desenvolvimento em presença de tweens 20, 40 e 60 e a ausência de
crescimento em tween 80 servem para a caracterização desta espécie.
2.8.8 Novas espécies propostas
Espécies de Malassezia como M. dermatis, M. japonica, M. yamatoensis e
M. nana descritas por Sugita et al. 2002; Sugita et al. 2003; Sugita et al. 2004 e
15
Hirai et al. 2004 são passíveis de identificação somente através do uso de
técnicas moleculares.
Algumas características de morfologia macroscópicas e microscópicas com
algumas peculiaridades são descritas para estas espécies.
Malassezia dermatis forma colônias branca amareladas, semibrilhantes a
opacas e cremosas. À microscopia são observadas células esféricas, ovais ou
elipsóides (2-8 x 2-10 µm) e filamentos podem ser formados na área de origem
dos brotos. Malassezia japonica, apresenta colônias de coloração amarelo pálido,
semibrilhantes a opacas, rugosas e cremosas com margem definida e lobulada. À
análise micromorfológica da colônia se observam células esféricas, ovais ou
elipsóides medindo aproximadamente 5 x 7 µm. Malassezia nana apresenta
colônias creme a amareladas, brilhantes a opacas, lisas e convexas, de textura
macia e viscosa. Ao exame microscópico são observadas pequenas células
ovóides a globosas medindo aproximadamente 2 x 3 µm, com brotos monopolar
de base estreita. Malassezia yamatoensis produz colônias branco amareladas,
semibrilhantes, rugosas e algumas vezes pregueadas. A micromorfologia da
colônia revela células ovais a elipsóides 2-4,5 x 2-7,5 µm de tamanho, com brotos
que se formam de uma base estreita.
2.9 Tratamento
O tratamento de pitiríase versicolor pode ser realizado por quimioterápicos
específicos e não específicos. Entre os antifúngicos não específicos podem ser
utilizados, sulfeto de selênio a 2,5%, tiossulfato de sódio 25% + ácido salicílico a
1% e loções de propilenoglicol a 50% (Miranda et al. 2005). Estes medicamentos,
16
encontrados sob a forma de loções, cremes ou shampoo agem devido à sua ação
queratolítica, retirando células mortas. O forte odor deixado pelo medicamento na
pele do indivíduo representa uma dificuldade na aceitação deste tipo de terapia
(Gupta et al. 2002).
Antifúngicos específicos de uso tópico e oral incluem os derivados azólicos
(cetoconazol, clotrimazol, itraconazol, fluconazol, econazol), alilaminas
(terbinafina) e benzilaminas (butenafina) (Gupta et al. 2004).
Cetoconazol, itraconazol, fluconazol e voriconazol, são bastante efetivos na
terapia de pitiríase versicolor (Gupta et al. 2003 a) e atuam na inibição da síntese
de ergosterol, principal constituinte da membrana através da inibição do citrocomo
P-450 dependente da enzima lanosterol 14-α-demetilase, acarretando um
aumento da permeabilidade da membrana e inibição do crescimento celular
(Vanden Bosche 1997; Martens 2004).
O cetoconazol que foi o primeiro derivado azólico utilizado no tratamento de
pitiríase versicolor (Gupta et al. 2002), é bem absorvido por via oral, porém, tem
seu uso limitado devido a sua hepatotoxicidade (Sunenshine et al.1998). Terapia
de 4 semanas com dosagens diárias de 200mg é considerada eficaz (Gupta et al.
2002) .
O itraconazol é altamente lipofílico podendo se acumular nos tecidos
adiposos e pele (Kose et al. 2005), sendo melhor absorvido quando ingerido
durante as refeições. Reações adversas como: dor abdominal, náuseas, dispnéia
e cefaléia têm sido observadas durante a administração desse antifúngico (Carrilo-
Muñoz et al. 2001). O tratamento de pitiríase versicolor geralmente é realizado
com uma dosagem de 200 mg/dia por 7 dias (Thoma et al. 2005).
17
Estudos recentes têm sugerido o fluconazol como opção efetiva no
tratamento de pitiríase versicolor (Gupta et al. 2002). É considerado um
antifúngico de amplo espectro, apresentando-se com uma estrutura estável e
altamente solúvel em água. Por ser hidrofílico, sua concentração nos tecidos não
alcança níveis tão elevados como ocorre com o itraconazol, assim, o fluconazol
permanece no sangue (meio rico em água e pobre em lipídeos) por mais tempo.
Cefaléia, náusea, exantema e dor abdominal são alguns efeitos adversos que
esse antifúngico provoca (Martin 1999). Esse fármaco tem sido administrado em
dosagens de 50 mg/dia por 2 semanas, ou 200 mg em dose única, que pode ser
repetida depois de duas semanas para tratamento de pitiríase versicolor (Thoma
et al. 2005).
Um novo triazólico, voriconazol, que apresenta uma atividade antifúngica
para Candida spp, Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans e dermatófitos duas
vezes maior quando comparado aos triazólicos de referência (itraconazol e
fluconazol) (Maertens 2004; Donnelly and Pauw 2004), tem sido envolvido em
testes de suscetibilidade para leveduras do gênero Malassezia apresentando-se
com valores de concentração inibitória mínima muito baixos (Velegraki et al.
2004). Embora estes resultados mostrem atividade in vitro, pouco se conhece a
respeito de sua ação in vivo quando se refere ao tratamento de pitiríase versicolor.
Terbinafina, fármaco pertencente à classe das alilaminas é considerado um
fungicida que atua inibindo a enzima esqualeno epoxidase, e conseqüentemente
leva a uma diminuição na formação do ergosterol. A terbinafina é altamente
seletiva para a esqualeno epoxidase do fungo, provavelmente devido a diferenças
na seqüência de aminoácidos desta enzima comparada com a dos mamíferos.
18
Devido a sua natureza lipofílica possui boa absorção, penetrando nos tecidos
queratinizados (cabelo, pele e unhas) (Gupta et al. 2003 b). A administração por
via oral, deste medicamento mostra-se com pouca eficácia, no entanto por via
tópica tem mostrado bons resultados no tratamento de pitiríase versicolor. O
mecanismo de ação quando utilizada por via tópica, provavelmente ocorra devido
a sua ação direta no microrganismo presente na derme (Gupta et al. 2004).
Hidroclorato de butenafina, fármaco fungicida, apresenta mecanismo de
ação semelhante as alilaminas. Este antifúngico mostra atividade in vitro para
dermatófitos e leveduras dos gêneros Candida e Malassezia. Eficácia de
tratamento de pitiríase versicolor tem sido obtido com o uso tópico do creme a 1%
diariamente por 2 a 6 semanas (Gupta et al. 2000).
Devido às constantes recidivas presentes no tratamento de pitiríase
versicolor e alguns medicamentos apresentarem pouca eficácia, é muito
importante estabelecer a medicação adequada, o que poderia ser auxiliada pelos
testes de suscetibilidade in vitro para fungos.
2.10 Suscetibilidade in vitro para as espécies de
Malassezia
Os testes de suscetibilidade in vitro têm se tornado ferramentas
importantes para o controle terapêutico, sobretudo nas infecções causadas por
leveduras. Vários estudos multicêntricos foram realizados com o intuito de definir
as condições ideais de realização do ensaio, como preparo do inóculo,
composição e pH do meio, temperatura e tempo de incubação e determinação da
leitura do teste. O National Committee For Clinical Laboratory Standards (NCCLS),
atualmente com a denominação de Clinical and Laboratory Standards Institute
19
(CLSI), através do documento M27-A
2
, de 2002, padronizou a técnica de
microdiluição em caldo que se tornou adequada para avaliar a concentração
mínima do fármaco capaz de inibir o crescimento do fungo (CIM), ou ainda a
concentração fungicida mínima (CFM) que é a menor concentração capaz de
matar o fungo (NCCLS 2002). Esta técnica é útil para leveduras do gênero
Candida e Cryptococcus.
Para leveduras do gênero Malassezia, essa técnica, no entanto deve ser
modificada, principalmente quando se refere ao meio de cultura, já que estes
fungos necessitam de ácidos graxos para seu crescimento (Garau et al. 2003).
Desta forma, vários pesquisadores têm utilizado meios como Dixon e Lemming-
Notman, os quais possuem substâncias lipídicas necessárias ao crescimento
destes microrganismos (Velegraki et al. 2004), tentando assim conseguir
resultados com boa reprodutibilidade.
20
3. Justificativa
Pitiríase versicolor apresenta lesões localizadas em diferentes regiões do
corpo como pescoço, face e tronco que comprometem a imagem do indivíduo.
Este lado estético é grave, pois causa problemas psicológicos que atrapalham a
vida do paciente.
Esta micose é causada por diferentes espécies de Malassezia, que
indiscutivelmente são difíceis de serem identificadas, pois exigem técnicas não
habituais usadas no laboratório de micologia. As espécies agentes causadoras
desta micose são, portanto pouco conhecidas na maioria dos países, embora esta
doença ocorra com grande freqüência. Dados não relatados mostram uma
elevada freqüência de casos em nossa região. Determinar, portanto a etiologia da
doença contribuirá enormemente para o conhecimento de dados epidemiológicos
na região Centro-Oeste.
As lesões de pitiríase versicolor são difíceis de tratamento e altamente
recidivantes, embora haja vários medicamentos utilizados na sua terapia.
Portanto, o fámaco adequado poderia produzir melhores resultados. Os testes de
suscetibilidade in vitro contribuiriam provavelmente na obtenção deste fármaco.
Para determinação da concentração inibitória mínima de diferentes
fármacos para as espécies de Malassezia é utilizada a metodologia de
macrodiluição em caldo padronizada para leveduras dos gêneros Candida e
Cryptococcus com alterações principalmente com relação ao meio de cultura. O
meio de Leeming-Notman, Dixon modificado, apresentam perfis adequados para a
avaliação de suscetibilidade visto à sua riqueza em ácidos graxos permitindo um
bom crescimento de fungos do gênero Malassezia.
21
4. Objetivos
Devido ao pouco conhecimento da freqüência de pitiríase versicolor e de seus
agentes etiológicos no nosso meio, e ainda a dificuldade de padronização do meio
de cultura para os testes de suscetibilidade in vitro usado para leveduras do
gênero Malassezia, o nosso trabalho constou dos seguintes objetivos:
1- Verificar a freqüência de pitiríase versicolor em pacientes encaminhados ao
Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública-
UFG, em Goiânia - GO, durante o período de janeiro a dezembro de 2004.
2- Identificar as espécies de Malassezia sp. através de análises morfológicas
e fisiológicas.
3- Verificar a suscetibilidade in vitro das espécies de Malassezia frente aos
derivados azólicos: cetoconazol, fluconazol, itraconazol e voriconazol.
22
5. Referências Bibliográficas
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29
6. ARTIGO 1: Identificação de espécies de Malassezia em pacientes com
pitiríase versicolor em Goiânia-GO, Brasil.
Este artigo foi encaminhado a Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical na forma de “short communication”.
30
Identificação de espécies de Malassezia em pacientes com pitiríase
versicolor em Goiânia-GO, Brasil.
Identification of Malassezia species from patients with pityriasis versicolor in
Goiânia-GO, Brazil.
Karla Carvalho Miranda
1
, Crystiane Rodrigues de Araujo
1
, Ailton José Soares
1
, Janine de Aquino
Lemos
1
, Lúcia Kioko Hasimoto e Souza
1
, Maria do Rosário Rodrigues Silva
1
.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi verificar a freqüência de pitiríase versicolor e
identificação de leveduras do gênero Malassezia, de pacientes encaminhados ao
laboratório de Micologia da Universidade Federal de Goiás, de Goiânia. Foram
diagnosticados 95 casos de pitíriase versicolor e identificados 4 espécies de
Malassezia: M. furfur, M.sympodialis, M. globosa e M. obtusa.
Palavras – chave: Pitiríase versicolor. Malassezia spp. Testes fenotípicos de
identificação. Assimilação de tweens.
ABSTRACT
The objective of this work was to isolate and identify yeasts of the genus
Malassezia in patients in Laboratorio de Micologia da Universidade Federal de
Goiás,in Goiânia-GO. We diagnosed 95 cases of pityriasis versicolor that were
identified as M. furfur, M.sympodialis, M. globosa and M. obtusa.
1-Laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública -Universidade
Federal de Goiás.
Endereço para correspondência: Maria do Rosário Rodrigues Silva Rua 15 n° 108 Apt
o
700, Setor
Oeste, 74140-090, Goiânia-Go, Brasil. Telefone: (0xx62) 3209-6127. E-mail:
31
Key-words: Pityriasis versicolor. Malassezia spp. Growth in Dixon agar. Tests
phenotypics of identification. Tweens assimilation.
As leveduras do gênero Malassezia
podem produzir diferentes tipos de
infecções superficiais como pitiríase versicolor, dermatite seborreica, foliculites,
dermatite atópica e eventualmente lesões sistêmicas
5 7
8
. Trabalhos de diferentes
pesquisadores englobaram o gênero Malassezia em 11 espécies distintas: M.
globosa, M. obtusa, M. restricta, M.slooffiae, M. furfur, M. sympodialis,
(lipodependentes) e M. pachydermatis (não lipodependente) M. dermatis, M. nana,
M. japonica e M. yamatoensis
4 12
.
Neste trabalho nós identificamos as espécies de 95 isolados de leveduras
do gênero Malassezia obtidas de pacientes com pitiríase versicolor encaminhados
ao laboratório de Micologia do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da
UFG, durante o ano de 2004 usando diferentes técnicas fenotípicas.
As amostras de pele foram coletadas de 842 pacientes portadores de
infecções fúngicas superficiais encaminhados ao laboratório de Micologia durante
o ano de 2004 para caracterização e identificação de fungos do gênero
Malassezia. Estas leveduras foram previamente identificadas através de exame
direto usando KOH a 40% e cultivadas em meios de ágar Dixon modificado
ajustado em pH 6,0 e Ágar Sabouraud dextrose suplementado com cloranfenicol
(0.05%), incubadas à 32°C por até 15 dias. Amostras positivas ao exame direto,
mas que não cresceram em meio de cultura, foram recultivadas até a obtenção de
crescimento. A identificação dos isolados foi feita segundo Guého et al 1996
4
.
32
Ao exame direto, leveduras brotantes e hifas curtas e tortuosas
características de Malassezia sp foram visualizadas em 95 amostras. Pitiríase
versicolor foi observado com maior freqüência no sexo feminino (66,3%), sendo a
faixa etária mais afetada entre 11-30 anos (tabela 1).
Pela diferença de comportamento na assimilação dos tweens 20, 40, 60 e
80 e características morfológicas exibidas na coloração de Gram foi possível
identificar 74 isolados de M. furfur (77,8%), 11 de M. sympodialis (11,4%). 08
isolados de M. obtusa e 02 de M. globosa.
Lesões causadas por Malassezia foram encontradas predominantemente
no tronco e dorso, com uma porcentagem de 34,7% e 32,6% respectivamente. O
agente etiológico mais isolado nestes locais foi M. furfur sendo responsável por
50,5% (48/95) dos casos. A correlação entre etiologia de pitiríase versicolor e o
local da lesão encontra -se na tabela 2.
Dentre as infecções causadas por leveduras do gênero Malassezia
destaca-se a pitiríase versicolor que se mostra bastante comum em adolescentes
jovens, sendo considerada de distribuição mundial
6 13
A identificação de 95 casos
(11,3%) de pitiríase versicolor observada de um total de 842 amostras de lesões
superficiais, mostra que esta micose tem uma elevada freqüência no nosso meio.
Porcentagens semelhantes às encontradas em nosso trabalho foram verificadas
por Çelik et al em 2003
3
na Turquia e por Ogunbiyi et al
9
, na Nigéria.
Em nosso estudo foi verificado que pitiríase versicolor ocorreu com maior
freqüência em adultos jovens (11- 30 anos), do sexo feminino (66,3%) com
localização no tronco em 34,7%. A distribuição das espécies de Malassezia
obtidas de 62 pacientes analisados por Salah et al, 2005
10
, mostrou que 65% dos
33
pacientes com pitiríase versicolor pertenciam à faixa etária de 15-30 anos. Na
República Dominicana, Arenas et al, 2001
1
verificaram que de 100 pacientes
analisados, 61% estavam na faixa de 11 a 30 anos com um predomínio de
pacientes do sexo feminino (62%) e com lesões freqüentemente observadas no
tronco (70%). A maior colonização no tronco e dorso pode ser explicada pela
elevada densidade de glândulas sebáceas nesta área, o que preenche o
requerimento de ácidos graxos exigidos pelas leveduras lipofílicas como M.
furfur
10
.
Através da metodologia proposta por Guého et al em 1996
4
, nós
conseguimos identificar quatro espécies lipodependentes de Malassezia atuando
como agentes de pitiríase versicolor. M. furfur foi isolada em 77,8% dos casos de
pitiríase versicolor em nosso trabalho mostrando que esta espécie continua
predominante em nosso meio. Até a década de 1990 M. furfur era considerada o
principal agente de pitiríase versicolor
11
. Embora M. globosa seja o agente
etiológico mais comumente identificado nos últimos anos, nós identificamos esta
espécie em apenas dois casos. Malassezia sympodialis, espécie encontrada em
11,4% da nossa casuística, foi também identificada com relativa freqüência por
Aspiroz et al
2
, que observaram uma porcentagem de 40,5 % em 79 casos
estudados. Em conclusão, M. furfur foi o agente etiológico mais comumente
encontrado produzindo pitiríase versicolor, evidenciando a patogenicidade dessa
espécie. As lesões de tronco e dorso dos adultos jovens do sexo feminino
predominaram em nossa casuística. Assim, o estudo de pitiriase versicolor é de
grande importância para definição de aspectos epidemiológicos de uma
determinada região.
34
Referências Bibliográficas
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36
Tabela 1. Correlação de sexo e idade de 95 pacientes portadores de pitiríase
versicolor.
Sexo
Idade
Masculino Feminino Total
n % n % n %
0 – 10 - - 01 1,1 01 1,1
11 – 20 07 7,4 19 20 26 27,4
21 – 30 10 10,5 18 18,9 28 29,5
31 – 40 09 9,5 11 11,6 20 21
41 – 50 04 4,2 10 10,5 14 14,7
51 – 60 - - 04 4,2 04 4,2
> 60
02 2,1 - - 02 2,1
Total 32 33,7 63 66,3 95 100
37
Tabela 2. Correlação entre etiologia e local da lesão de 95 pacientes com pitiríase
versicolor
Espécies de Malassezia
Local da lesão
M. furfur
n (%)
M. sympodialis
n (%)
M. obtusa
n (%)
M. globosa
n (%)
Total
n (%)
Face 02 (2,0) 01 (1,0) 01 (1,0) - 04 (4,2)
Pescoço 07 (7,4) - - - 07 (7,4)
Braços 08 (8,4)
01 (1,0) 01 (1,0) - 10 (10,5)
Tronco 27 (28,4)
04 (4,2) 01(1,0) 01 (1,0) 33 (34,7)
Abdomen 05 (5,3)
01 (1,0) - - 06 (6,3)
Dorso 21 (22,1)
04 (4,2) 05 (5,3) 01 (1,0) 31 (32,6)
Coxas 04 (4,2)
- - - 04 (4,2)
Total 74 (77,8)
11 (11,4) 08 (8,3) 02 (2,0) 95
38
7. ARTIGO 2: In vitro susceptibility of itraconazole, voriconazole,
ketoconazole and fluconazole against the Malassezia species.
Este artigo foi encaminhado ao International Journal of Antimocrobial
Agents
39
In vitro susceptibility of itraconazole, voriconazole, ketoconazole and
fluconazole against the Malassezia species.
Karla Carvalho Miranda
a
, Crystiane Rodrigues de Araujo
a
, Carolina
Rodrigues Costa
a
, Xisto Sena Passos
a
, Orionalda de Fátima Lisboa
Fernandes
a
, Maria do Rosário Rodrigues Silva
a,*
a
Laboratório de Micologia da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brazil.
Abstract
In this paper, we identified 95 Malassezia isolates by morphological and
biochemical criteria and assessed the in vitro activity of fluconazole, itraconazole,
ketoconazole and voriconazole by broth microdilution method against Malassezia
species using the Leeming-Notman medium slightly modified. The isolates of
Malassezia were identified as M. furfur (74), M. sympodialis (11), M. obtusa (8) and
M. globosa (2). The modified Leeming-Notman medium used for susceptibility
testing allowed a good growth of Malassezia and the visual reading of the minimal
inhibitory concentration was readily obtained until day 5 of incubation at 32ºC.
Although high MIC values as 16 μg/ml to fluconazole had been observed in 9.5%
of Malassezia isolates, in general, these microorganisms were susceptible to all
drugs studied. Interestingly one M. globosa isolate showed high MIC values for
voriconazole, itraconazole and fluconazole. For the 95 strains, the MIC ranged of
<0,03 – 4 μg/ml to ketoconazole, <0,03 - >16 μg/ml to voriconazole, < 0,125 – >64
*Corrresponding author. Tel: +55-62-32096127; fax: +5562- 35211839.
E-mail address: [email protected]
40
μg/ml to fluconazole and < 0,03 – 16 μg/ml to itraconazole. In summary, the good
reproducibility and visual readings obtained by using modified Leemming-Notman
medium suggest that this medium should be proposed for the antifungal testing of
drugs against Malassezia species.
Keywords: Malassezia species; in vitro susceptibility; modified Leeming Notman
medium.
1. Introduction
Malassezia yeasts are members of the human skin flora in particular the
neck, the chest, the upper arms, the back, the abdomen and the face [1, 2]. These
yeasts may be etiological agents of skin disorders such as pityriasis versicolor and
less frequently of systemic infection [3-5].
The difficulty in culturing Malassezia species in vitro has delayed the known
of the taxonomic status of these yeasts. Nowadays, morphological characteristics
and physiological features, the use of different tween compounds as well as
molecular biological studies of Malassezia yeasts, allowed their classification in 11
species: M. furfur, M. sympodialis, M. slloffiae, M. obtusa, M. globosa, M. restricta,
M. pachydermatis, M. yamatoensis, M. nana, M. japonica and M. dermatis [6, 7].
The broth microdilution method developed by NCCLS/CLSI document
M27A2 is applicable for determination of the MIC against Candida spp and
Cryptococcus neoformans, but it is not applicable to yeasts of genus Malassezia
due to their obligatory lipophilic nature. The alternative approach has been
assessed with broth microdilution method using media as Leeming-Notman (LN)
41
and modified Dixon [8]. These media are turbid, then the visual and turbidimetric
results are difficult to interpret [9,10].
In this paper, we differentiated Malassezia species by morphological and
biochemical criteria and assessed the in vitro activity of fluconazole, itraconazole,
ketoconazole and voriconazole against Malassezia species using the Leeming-
Notman medium slightly modified.
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Malassezia identification
A total of 95 strains of Malassezia spp isolated from patients with pityriasis
versicolor were studied. The strains were maintained in modified Dixon’s agar
(3.6% malt extract agar, 0.6% peptone, 1.2% ox. bile, 1.0% tween 40, 0.2%
glycerol and 2.0% oleic acid) at 32°C.
The identification was performed according to Guillot et al., 1996 [11]
method. The yeasts were submitted to catalase test, growth in the presence of
tweens 20, 40, 60 and 80, microscopy study using the Gram stain to distinguish
between M. obtusa and M. globosa and esculin hydrolysis tests to confirm the
identification of M. sympodialis. Colonies of Malassezia were subcultured on
modified Dixon’s agar in order to obtain pure cultures before each testing.
2.2. In vitro susceptibility tests
Broth microdilution method was performed in accordance with guide lines in
NCCLS document M27-A
2
[12] using modified Leeming-Notman medium
42
containing 0.1% glucose, 0.1% peptone, 0.8% bile salts, 0.2% yeast extract, 0.1%
glycerol, 0.5% tween 60, 3% olive oil and containing 50µg/L of chloramphenicol.
The inoculum suspension was prepared by the spectrophotometric method
obtaining a final inoculum of (2.5 ± 1.0) x 10
3
cells ml
-1
. All inoculum´s suspensions
were vortexed for 20s to disperse Malassezia clumps.
The final concentrations of the antifungal agents were 0.125 – 64µg/ml for
fluconazole (Pfizer International, New York, USA) and 0.03 - 16µg/ml for
itraconazole, ketoconazole (Jansen Pharmaceuticals, Beerse, Belgium) and
voriconazole (Pfizer International, New York, USA).
Growth of each strain on various concentrations of all four drugs was
recorded every 24h for 7 days of incubation at 32
o
C. The cell growth was
compared with the growth in a drug free control. Minimal Inhibitory Concentration
(MIC) was defined as the lowest concentration of the agent that produced a 50%
growth in comparison with control. The data were reported as MIC ranges, MIC at
which 90% of the isolates were inhibited and mode (the most frequent MIC values).
Each isolate was tested twice on separate occasions. Agreement was evaluated by
MIC endpoints discrepancies of no more than two dilutions.
2.3. Quality control
One NCCLS quality control strain, Candida parapsilosis ATCC 22019 was
included on each day testing to check the accuracy of drug dilutions and
reproducibility of the results.
43
3. Results
According to morphological and biochemical characteristics, the 95 isolates
of Malassezia were identified as M. furfur (74), M. sympodialis (11), M. obtusa (8)
and M. globosa (2). The modified Leeming-Notman medium used for susceptibility
testing allowed good growth of Malassezia, starting from 72h post inoculation,
when the yeast colonies began to mature. MICs were apparent variations in
antifungal susceptibility among Malassezia species. For M. furfur and M.
sympodialis MIC values could be determined in three days, whereas for M. globosa
and M. obtusa MIC values could not be determined until day 5. Although high MIC
values as 16 μg/ml to fluconazole had been observed in 9.5% of Malassezia
isolates, in general, these microorganisms were susceptible to all drugs studied.
Interestingly one M. globosa isolate showed high MIC values for voriconazole,
itraconazole and fluconazole.
For the 95 strains, the MIC ranges were of <0.03 – 4 μg/ml to ketoconazole,
<0.03 - >16 μg/ml to voriconazole, of <0.125 – >64 μg/ml to fluconazole and <0.03
– 16 μg/ml to itraconazole. Overall, similar MIC values (difference no more than
two dilutions) were observed in each in vitro susceptibility testing performed on
separate occasions. The MIC ranges, MIC
90
and mode for M. furfur, M.
sympodialis, M. obtusa and M. globosa species are presented in table 1.
The MIC ranges for the reference strain, C. parapsilosis ATCC 22019 were
into the values standardized by the NCCLS document M27A2.
44
4. Discussion
In our study we identified M. furfur as the most prevalent species of PV
lesions. It is known that there is a variation of Malassezia species among the
geographical regions. M. globosa is predominant in two extremes of South Europe
[13], M. sympodialis is the most common species in Canada [14] while in Brazil, M.
furfur was found highly associated with skin macules [15].
Despite the fact that broth microdilution method recommended by NCCLS is
generally accepted as a standard protocol to determine yeast susceptibility, this
technique against Malassezia sp should be slightly adapted in relation to culture
medium due to lipophilic nature of this species. Then it was used the Lemming-
Notman medium, with some modifications. In this medium we added a large
quantity of olive oil and omitted of glycerol monostearate and cow’s milk. The MIC
values were determined in three days for M. furfur and M. sympodialis and 5 days
for M. globosa and M. obtusa. This incubation time was required to obtain a good
growth with these species. These modifications allowed a better visual reading of
MIC. In vitro susceptibility method in previous experiments performed in our
laboratory with Leeming-Notman medium without the modification established in
our work showed difficulty to interpret the MIC (data not shown). In this study on
the whole, the in vitro susceptibility data generated on each test performed in
separate runs for all species and drugs showed good reproducibility.
In our study, our MICs of ketoconazole for Malassezia species ranged from
<0.03 to 4 µg/ml, but 33.6% of the isolates showed MIC of <0.03 µg/ml. These data
are similar to those found by Gupta et al., 2000 [16] that reported MIC values of
45
<0.03 µg/ml for 95% of strains tested and Hammer et al., 2000 [17] that observed
ranges of 0.03 to 0.25 µg/ml for 54 isolates. All Malassezia strains with exception
of one M. globosa isolate had low MIC values to itraconazole. Previous studies
performed by Garau et al., 2003 [18] have showed MIC of itraconazole between
<0.03 and 0.06µg/ml. According to Strippoli et al., 1997 [19], ketoconazole and
itraconazole are the most active drugs against Malassezia furfur isolates. This
yeast was found in 77.8% of our isolates. Our MICs of voriconazole for Malassezia
spp were similar to or lower than those found for ketoconazole. Around 96.8% of
Malassezia isolates showed MICs ranging from <0.03 to 0.5 µg/ml for voriconazole
(for only one M. globosa isolate the MIC was >16 µg/ml). Garau et al., 2003 [18],
observed that the MIC of voriconazole for 70 Malassezia isolates ranged of <0.03
to 0.125 µg/ml.
Although fluconazole can be an effective treatment option for PV [20], in our
study fluconazole MIC were higher than those for the other azoles, and ranged
between <0.125 to >64 µg/ml. Around 9.5% of Malassezia isolates had MIC of 16
µg/ml for this drug. These results are similar to Velegraki et al., 2004 [8], that
verified high MICs of fluconazole for Malassezia isolates. Use of prophylactic
treatment due to frequent recurrence of pityriasis versicolor may cause high MICs
for fluconazole.
In summary, on the whole, the isolates tested were susceptible to all drugs,
except for 9.5% of Malassezia isolates that showed MIC values of 16 µg/ml for
fluconazole, and for one M. globosa isolate, which was the less susceptible
species for three drugs tested (itraconazole, voriconazole and fluconazole). It is
difficult to explain the M.globosa resistance, but it is known that this specie is
46
included in the less susceptible Malassezia species [21]. The good reproducibility
and visual readings obtained by using modified Leemming-Notman medium
suggest this medium as an alternative in antifungal testing of drugs against
Malassezia species.
Acknowledgements
Were are grateful to Pfizer Pharmaceutical Group for donating the voriconazole.
47
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50
Table 1. Antifungal susceptibility profile of 95 isolates from Malassezia species
Minimal Inhibitory Concentration (µg/ml)
Species Antifungal agents range MIC
90
Mode
Itraconazole < 0.03 - 0.25 0.25 < 0.03
Voriconazole < 0.03 – 0.5 0.5 0.125
Fluconazole < 0.125 - 16 8 1
Ketoconazole < 0.03 - 4 0.25 0.125
M. furfur
(n=74)
Itraconazole < 0.03 - 0.125 0.06 < 0.03
Voriconazole < 0.03 – 0.125 0.125 < 0.03
Fluconazole <0.125 – 16 8 < 0.125
Ketoconazole <0.03 – 0.25 0.125 < 0.03
M. sympodialis
(n=11)
Itraconazole <0.03 – 0.25 0.06 < 0.03
Voriconazole <0.03 - 1 1 < 0.03
Fluconazole <0.125 – 16 4 < 0.125
Ketoconazole <0.03 – 0.5 0.5 0.5
M. obtusa
(n=8)
Itraconazole <0.03 – 16 - -
Voriconazole <0.03 - >16 -
-
Fluconazole <0.125 - >64 -
-
M. globosa
(n=2)
Ketoconazole <0.03 -0.5 -
-
MIC
90
: minimum inhibitory concentration that inhibited 90% of the isolates
51
8. Conclusões
1. O percentual de 11,3% de casos de pitiríase versicolor, em relação a todas as
micoses superficiais observado durante o ano de 2004 na cidade de Goiânia
mostra que esta micose é muito freqüente no nosso meio.
2. Embora M. furfur tenha sido a espécie mais freqüentemente isolada, outras
espécies como M. sympodialis, M. obtusa e M. globosa também se
apresentaram como agentes de pitiríase versicolor, mostrando uma
diversidade de etiologia na região Centro-Oeste. M. globosa e M. sympodialis
tem sido comumente relatadas em outros países como Grécia e Espanha.
3. A maior freqüência de casos em adultos jovens (11-30 anos) do sexo feminino
com lesões predominantes na região do tronco, encontrado em nosso trabalho
corresponde ao verificado por numerosos pesquisadores em diferentes áreas
geográficas.
4. Embora, não se tenha estabelecido valores de concentração inibitória mínima
dos antifúngicos para as várias espécies de Malassezia, os baixos valores
encontrados permitem sugerir que as amostras destas leveduras foram
suscetíveis aos agentes antifúngicos estudados. Há poucos relatos de
resistência in vitro deste microrganismo.
5. A técnica de microdiluição em caldo padronizada pelo NCCLS com o uso do
meio de Leeming-Notman modificado em nosso trabalho permitiu uma melhor
interpretação da CIM. É conhecido que o meio de Leeming-Notman apresenta
certa turbidez que pode dificultar a leitura dos resultados.
52
9. Anexos
Termo De Consentimento Livre e Esclarecido
Você está sendo convidado (a) para participar, como voluntário, em uma pesquisa
intitulada
“Identificação e suscetibilidade in vitro das espécies de Malassezia obtidas de
pacientes com pitiríase versicolor”. Após ser esclarecido (a) sobre as informações a
seguir, no caso de aceitar fazer parte do estudo, assine ao final deste documento, que
está em duas vias. Uma delas é sua e a outra é do pesquisador responsável. Em caso de
recusa você não será penalizado (a) de forma alguma. Em caso de dúvida sobre a
pesquisa, você poderá entrar em contato com os pequisadores participantes.
Pesquisadores participantes:
Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva – Investigadora responsável
Fone: (0XX62) 3209-6127
Karla Carvalho Miranda - Biomédica/Pesquisadora
Fones: (0XX62) 3209-6127 / 3224-3758
OBJETIVO DO ESTUDO
Serão analisados os pacientes encaminhados ao serviço de diagnóstico do IPTSP:
laboratório Margarida Dobler Komma provenientes do serviço de ambulatório de
Dermatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás, com suspeita
de infecção fúngica superficial.
Provavelmente você já deve ter ouvido falar em pano branco. Esta mudança da cor
da pele ocorre devido a fungos que podem estar presentes na pele, causando a doença
chamada pitiríase versicolor (pano branco). O paciente ou o responsável pelo paciente
terá acesso aos exames laboratoriais que auxiliarão no diagnóstico e ao tratamento
médico.
Neste trabalho, após a devida identificação e caracterização do fungo, será
realizado um teste, no qual será verificada a sensibilidade do fungo isolado frente a quatro
medicamentos, cetoconazol, itraconazol, voriconazol e terbinafina.
53
CONDUÇÃO DO ESTUDO
O paciente será submetido inicialmente à colheita de escamas de pele, pelo
profissional responsável. O material coletado será levado para o Laboratório de Micologia
do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Publica da UFG, onde será submetido a exame
micológico.
Estes exames não serão pagos pelo paciente.
PARTICIPAÇÃO AUTORIZADA
Participar deste estudo será uma decisão autorizada pelo paciente ou pelo seu
responsável e este poderá se recusar a participar ou desistir deste estudo a qualquer
momento, sem explicar o por quê.
PACIENTES PARTICIPANTES DO ESTUDO
Neste estudo serão incluídos todos os pacientes (autorizados), que apresentarem
características de lesões de pele causadas por fungos, que forem encaminhados ao
laboratório Margarida Dobler Komma.
RISCOS
Não há riscos para o paciente. Não usaremos nenhum tipo de medicamento. Para
colheita do material, o paciente não será maltratado.
BENEFÍCIOS
Nosso estudo possivelmente contribuirá enormemente para uma terapia eficaz.
CONFIDENCIALIDADE
Se o responsável concordar com a participação do paciente, as informações clínicas
e laboratoriais relacionadas ao paciente serão confidencialmente mantidas em sigilo o
tempo todo, nem o nome ou mesmo iniciais irão constar em qualquer registro nesta
pesquisa. O Comitê de Ética poderá necessitar ter acesso aos seus registros médicos
para verificação dos formulários de estudo, no entanto, sua identidade será mantida em
sigilo absoluto.
Dra. Maria do Rosário Rodrigues Silva Karla Carvalho Miranda
54
CONSENTIMENTO DA PARTICIPAÇÃO DA PESSOA COMO SUJEITO DA PESQUISA
Eu, _____________________________________, RG ( ), CPF
(___________________/___),abaixo assinado, concordo em participar do estudo
“Identificação e suscetibilidade in vitro das espécies de Malassezia obtidas de pacientes
com pitiríase versicolor”. O trabalho coletará dados referentes ao sexo, idade e região do
corpo mais afetada por leveduras do gênero Malassezia além de verificar a
suscetibilidade in vitro frente ao cetoconazol, itraconazol, voriconazol e terbinafina.Foi me
garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem que isto leve a
qualquer penalidade ou interrupção do acompanhamento ao paciente / assistência /
tratamento.
Declaro ter entendido as explicações recebidas e concordo livremente em participar
do estudo, podendo desistir em qualquer momento.
Nome:____________________________________________________________
Data: _____________________________________________________________
_______________________________________________
Assinatura do paciente ou responsável
Declaro ter explicado em detalhes os procedimentos acima descritos no texto
“Informação ao paciente” e a este concedida à oportunidade de elaborar perguntas.
Karla Carvalho Miranda
(PESQUISADORA RESPONSÁVEL)
55
INSTRUCTIONS TO AUTHORS
Aim and editorial policy
Aim and editorial policy
The Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical publishes scientific
papers related to infectious and parasitic diseases, preventive medicine, public
health and related subjects.
The journal appears six times a year and accepts papers from Brazilian or foreign
workers which conform with these regulations and are approved by referees
selected by the Editors.
1. As weel as full papers the journal publishes short communications indicating
the results of therapeutics trials, preliminary studies, new techniques, case
reports, letters to the editor, historical events, bibliographic abstracts and
summaries of theses. Literature reviews and editorials will be published only
when requested by the Editorial Board.
2. The papers must be original and unedited, typed on A4 paper, in double
spacing with a margin of 3 cm on the left side of the page. Three copies must be
sent to the address given below, one of which must be the original.
Presentation of originals
3. The articles should be sent through diskettes together with three printed copies
of the reviewed version, once observed the following requirements:
a) compatible 3 1/2" or 5 1/4" MS-DOS diskettes can be used. Macintosh
diskettes in the format 3 1/2" will also be accepted. Eliminate from the diskettes
any file not related to the paper which is being sent, including previous versions,
back-ups and temporary files. The diskette label should contain: title of the article,
author's name, file name, text editor utilized, and the accessory files names (style,
sheets, graphics, tables, etc.);
b) the author is asked to send works compatible with the following text
processings: Word for Windows (6.0 or prior version), Word for Macintosh (6.0 or
prior version). Other formats can be accepted but under previously agreement.
Articles in ASCII (text only) format should never be sent;
Print ISSN 0037-8682
•
Presentation of originals•
56
c) when editing the text, the "enter" command may exclusively be used in the end
of the paragraphs. Do not add extra spaces of "tabs" to the text in order to get first
line backing nor title centralization in the page. Neither use additional
backspacers ("enters") to space the paragraphs. To obtain these results, just use
the paragraph format commands avaiable in all the above mentioned text editors;
d) tables can be included since they are set up in the text editor itself. Notes and
footnotes should preferably appear after the end of the article duely numbered
and referenced as well;
e) illustrations, tables and graphs produced in other programs and "imported" for
inclusion in the text should be sent in attached files, in easily compatibile
universal formats (TIFF, BMP, PICT, GIF, etc.). Avoid not-standardized formats
(EPS, WMF, etc.) and files that only can be opened by specific programs.
Anyway, always send a well printed copy of the graph, table or illustration for
reproduction if necessary.
4. Although Portuguese is the preferred language, papers in English and Spanish
are also accepted. Written in a clear precise manner, the text should be
sufficiently concise to normally not exceed twelve type-written pages for papers
and six for short communications.
5. The following sequence should be observed:
a) title of the paper (the original and translated one) and name of the authors in
small letters. In the bottom of the page, the title of the institution where the work
was done, affilliation of the authors, source of financial support (if any) and
complete address for correspondence, including telephone and fax numbers, and
e-mail;
b) abstract: 150 words long for articles and 50 for communications and case
reports. This should summarise the objective of the work presented, how it was
carried out, the results achieved and the conclusion reached. Abbreviations or
bibliographic citations should not be included. Cite four or five key-words for
indexing;
c) resumo: just after the summary in the language of the paper must be a faithful
translation of the abstract, followed by the key-words;
d) introduction: clearly and objectively the purpose of the research, with
information justifying the work, relating to previous paper in this field; reducing the
citations to a minimum;
e) material and methods: in a precise manner the techniques necessary to
understand and reproduce the works should be cited. Established methods
57
should be referenced;
f) results: always when necessary should be accompanied by tables, figures or
illustrations which present the data in such a clear manner so that only
commentary and not duplication is necessary in the text, which should
complement this data organization. When indicated, the data must be subjected
to statistical analysis. This section should be informative, and not an
interpretation;
g) discussion: the results are interpreted in the light of present understanding of
the problem with the necessary references. Caution should be exercised with
reference to hypotheses and speculations include only those that clarify the
thinking behind the line of discussion;
h) acknowledgements: limited to those considered essential;
i) references: typed in small letters, without full stop between the abbreviations,
in double spacing, numbered in alphabetical order using the last surname of the
author; all authors must be cited. When there is more than one citation from the
same author, a chronological order is followed. The citations, whose numbers
come above the corresponding word without neither comma nor parenthesis, in
the text must refer to the numeration in the reference list which has the following
style and punctuation:
Articles in periodicals (the titles of the periodicals must appear in full as below):
Coura JR, Conceição MJ. Estudo comparativo dos métodos de Lutz, Kato e
Simões Barbosa no diagnóstico da esquistossomose mansoni. Revista da
Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 8:153-158, 1974.
Books:
Chandra RK, Newberne PM. Nutrition, immunity and infection: mechanisms of
interactions. Plenum, New York, 1977.
Book chapters:
Fulton JD. Diagnosis of protozoal diseases. In: Gell PGH, Coombs RRA (ed)
Clinical aspects of immunology, 2nd edtition, Blackwell, Oxford, p.133-136, 1968.
Abstract from meeting:
Brener Z. Variações intra-específicas do Trypanosoma cruzi e patogenia da
doença de Chagas. In: Resumos do XIII Congresso da Sociedade Brasileira de
Medicina Tropical, Brasília p.371, 1977.
58
Theses:
Tavares W. Contaminação do solo do Estado do Rio de Janeiro pelo Clostridium
tetani. Contribuição ao conhecimento da distribuição natural do bacilo tetânico.
Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ,
1975.
Only published papers or papers in press can be cited in the reference list.
Unpublished data or personal communications should be mentioned in the text as
(AB Figueiredo: personal communication, 1980) or (CD Dinis, EF Oliveira:
unpublished data).
6. Tables: should be numbered in Arabic numerals with a short descriptive title.
Try to keep tables to a minimum, and remember that large tables are difficult to
understand. They must be typed on separate sheets, with no vertical lines, with
units referred to at the head of each column. Tables' data, including the title, must
be written in small letters, except the abbreviations.
7. Illustrations: should be of good quality and consecutively numbered in Arabic
numerals. Beside the photographies, graphics, pictures, etc. must be referred in
the text as Figures. Note on the reverse in pencil the number of the figure and the
name of the author and paper. The titles should be listed on a separate sheet
using the reference numbers. The minimum number of illustrations should be
submitted.
8. Ethics committee: research work on human beings must present the name of
the Ethics Committee that had approved it.
9. Authors agreement: a written statement of all authors giving permission for
publication of the paper is required.
Home
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© 2001 SBMT
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59
Official Journal of the International Society of Chemotherapy
Guide for Authors
The Journal now accepts online submissions only. Manuscripts can be submitted
at http://ees.elsevier.com/ijaa/
Articles must be written in English. It is essential to give a fax number and e-mail
address when submitting a manuscript. See Manuscripts.
Submission of an article implies that the work described has not been published
previously (except in the form of an abstract or as part of a published lecture or
academic thesis), that it is not under consideration for publication elsewhere, that
its publication is approved by all authors and tacitly or explicitly by the responsible
authorities where the work was carried out, and that, if accepted, it will not be
published elsewhere in the same form, in English or in any other language, without
the written consent of the Publisher.
Upon acceptance of an accepted article by the publisher, authors will be asked to
transfer copyright (for more information on copyright see http://authors.elsevier.com).
This transfer will ensure the widest possible dissemination of information. A letter
will be sent to the corresponding author confirming receipt of the manuscript. A
form facilitating transfer of copyright will be provided.
If excerpts from other copyrighted works are included, the author(s) must obtain
written permission from the copyright owners and credit the source(s) in the article.
Elsevier has preprinted forms for use by authors in these cases contact: ES Global
Rights Department, P.O. Box 800, Oxford, OX5 1DX, UK; phone: (+44) 1865
843830, fax: (+44) 1865 853333, e-mail:
Should authors be requested by the editor to revise the text, the revised version
should be submitted within three months. After this period, the article will be
regarded as a new submission.
Submission Checklist
Please ensure that the following are including in your submission:
" One author designated as corresponding author:
" Their E-mail address
" Full postal address
" Telephone and fax numbers
" Keywords
" All figure captions
60
" All tables (including title, description, footnotes)
" All necessary files have been uploaded as attachments to the e-mail
" Manuscript has been spell checked
" All text pages have been numbered
" References are in the correct format for this journal
" All references mentioned in the Reference list are cited in the text and vice versa
" Permission has been obtained for use of copyrighted material from other sources
(including the Web)
" Colour figures are clearly marked as being intended for colour reproduction or to
be reproduced in black-and-white
Manuscripts.
Please type all pages with double spacing and wide margins on one side of the
paper. Words to be printed in italics are to be underlined. Title page, abstract,
tables, legends to figures and reference list should each be provided on separate
pages of the manuscript.
Use a true type font such as Times New Roman or Arial. The text should be in
single-column format. Number the pages. Keep the layout of the text as simple as
possible. Most formatting codes will be removed and replaced on processing the
article. In particular, do not use the wordprocessor's options to justify text or to
hyphenate words. However, do use bold face, italics, subscripts, superscripts etc.
Do not embed 'graphically designed' equations or tables, but prepare these using
the wordprocessor's facility. When preparing tables, if you are using a table grid,
use only one grid for each individual table and not a grid for each row. Do not
prepare tables in Powerpoint. The electronic text should be prepared in a way very
similar to that of conventional manuscripts (see also the Author Gateway's
Quickguide: http://authors.elsevier.com). Do not import the figures into the text file
but, instead, indicate their approximate locations directly in the electronic text and
on the manuscript. See also the section on illustrations.
To avoid unnecessary errors you are strongly advised to use the spellchecker
function of your wordprocessor
The title page should include: the title, the name(s) and affiliation(s) of the
author(s), an address for correspondence, and telephone/ telefax numbers for
editorial queries. All articles should include an Abstract (a single paragraph) of no
more than 120 words and 3-6 key words for abstracting and indexing purposes.
Please do not split the article into separate files (title page as one file, text as
another, etc.). Ensure that the letter 'l' and digit '1' (also letter 'O' and digit '0') have
been used properly, and structure your article (tabs, indents, etc.) consistently.
Characters not available on your wordprocessor (Greek letters, mathematical
symbols, etc.) should not be left open but indicated by a unique code (e.g.,
gralpha, @, #, etc., for the Greek letter ). Such codes should be used consistently
throughout the entire text. Please make a list of such codes and provide a key. Do
not allow your wordprocessor to introduce word splits and do not use a 'justified'
61
layout. Please adhere strictly to the general instructions on style/arrangement and,
in particular, the reference style of the journal. It is very important that you save
your file in the wordprocessor format. If your wordprocessor features the option to
save files 'in flat ASCII', please do not use it.
Please write your text in good English (American or British usage is accepted, but
not a mixture of these). Italics are not to be used for expressions of Latin origin, for
example, in vivo, et al., per se. Use decimal points (not commas); use a space for
thousands (10 000 and above).
Provide the following data in your submission (in the order given). This is required
for all types of paper submitted.
Title. Concise and informative. Titles are often used in information-retrieval
systems. Avoid abbreviations and formulae where possible.
Author names and affiliations. Where the family name may be ambiguous (e.g., a
double name), please indicate this clearly. Present the authors' affiliation
addresses (where the actual work was done) below the names. Indicate all
affiliations with a lower-case superscript letter immediately after the author's name
and in front of the appropriate address. Provide the full postal address of each
affiliation, including the country name.
Corresponding author. Clearly indicate who is willing to handle correspondence at
all stages of refereeing and publication, also post-publication. Ensure that
telephone and fax numbers (with country and area code) are provided in
addition to the e-mail address and the complete postal address.
Present/permanent address. If an author has moved since the work described in
the article was done, or was visiting at the time, a 'Present address' (or 'Permanent
address') may be indicated as a footnote to that author's name. The address at
which the author actually did the work must be retained as the main, affiliation
address. Superscript Arabic numerals are used for such footnotes.
The following types of manuscripts are routinely accepted:
Original Articles The form of these articles is discussed fully below; an abstract is
required.
Letter Headings should not be used in a letter; no abstract or keywords are
required. The text should be no more than 800 words; there should be a maximum
of 7 references and one table or figure may be included.
Review An abstract and keywords are required. The text should be divided into
sections by suitable headings. Tables and figures may be used as appropriate for
the text.
Opinions, Commentaries etc. These take the same form as a review.
Short Communication These should be no more than 2,500 words, with up to 15
62
references and a maximum of 3 figures or tables.
Leaders These tend to be invited papers but unsolicited Leaders are welcome.
There are no abstract, keywords or section headings.
Abstract. A concise and factual abstract is required (maximum length 200 words).
The abstract should state briefly the purpose of the research, the principal results
and major conclusions. An abstract is often presented separately from the article,
so it must be able to stand alone. Do not cite references in the abstract. Non-
standard or uncommon abbreviations should be avoided in the abstract, but if
essential they must be defined at their first mention in the abstract itself.
Keywords. Immediately after the abstract, provide a maximum of 6 keywords,
using British spelling and avoiding general and plural terms and multiple concepts
(avoid, for example, 'and', 'of'). Be sparing with abbreviations: only abbreviations
firmly established in the field may be eligible. These keywords will be used for
indexing purposes.
Abbreviations. Define abbreviations that are not standard in this field at their first
occurrence in the article: in the abstract but also in the main text after it. Ensure
consistency of abbreviations throughout the article.
Subdivision of the article. Divide your article into clearly defined and numbered
sections. Subsections should be numbered 1.1 (then 1.1.1, 1.1.2, ?), 1.2, etc. (the
abstract is not included in section numbering). Use this numbering also for internal
cross-referencing: do not just refer to 'the text.' Any subsection may be given a
brief heading. Each heading should appear on its own separate line.
Introduction. State the objectives of the work and provide an adequate
background, avoiding a detailed literature survey or a summary of the results.
Experimental/Materials and methods. Provide sufficient detail to allow the work to
be reproduced. Methods already published should be indicated by a reference:
only relevant modifications should be described.
Include in figure legends and table texts technical details of methods used, while
describing the methods themselves in the main text.
Results/Discussion. This should explore the significance of the results of the work,
not repeat them. A combined Results and Discussion section is often appropriate
in a Short Communication but not in an Original Article. Avoid extensive citations
and discussion of published literature.
N.B. Acknowledgements. Collate acknowledgements in a separate section at the
end of the article and do not, therefore, include them on the title page, as a
footnote to the title or otherwise. In the acknowledgements any help in carrying out
the work should be recorded (eg provision of bacterial strains, permission to study
patients, general or specific technical help.) When the work included in a paper has
63
been supported by a grant from any source, this must be indicated. A connection
of any author with companies producing any substances or apparatus used in the
work should be declared. Authors will be asked to respond to a form e-mailed to
them when their paper is accepted.
Speed of publication Manuscripts are accepted subject to editorial review.
Editorial Review All manuscripts are subject to peer review. If changes are
requested,revisions received later than 3 months after this request will be treated
as new submissions.
Title page: should include authors' names, full addresses including email, and
address for correspondence. Authorship should be only by those workers who
have contributed materially to the paper and to the underlying work; others who
have assisted or collaborated in some way should be recognized at the end of the
paper, as should grant support, under the heading 'Acknowledgements'.
References should be numbered consecutively (with parentheses) as they appear
in the text. Type the reference list with double spacing on a separate sheet.
References should accord with the system used in Uniform requirements for
manuscripts submitted to biomedical journals (N Engl J Med 1991;324:424-428).
Examples:
1 Taylor DN, Sanchez JL, Candler W et al. Treatment of traveller's diarrhea:
ciprofloxacin plus loperamide compared with ciprofloxacin alone. Ann Intern Med
1991;114:731-734.
2 Mackowiak PA, ed. Fever. Basic Mechanisms and Management. New York:
Raven Press, 1991.
3 Rubin M, Pizzo PA, Monotherapy in neutropenic cancer patients. In: Peterson
PK, Verhoef J, eds. Antimicrobial Agents Annual 3. Amsterdam: Elsevier, 1988.
Please note that all authors should be listed when six or less; when seven of more,
list only first three and add 'et al.'. Do not include references to personal
communications, unpublished data or manuscripts either 'in preparation' or
'submitted for publication'. If essential, such material may be incorporated into the
appropriate place in the text. Recheck references in the text against reference list
after your manuscript has been revised.
Specific remarks
Mathematical formulae. Present simple formulae in the line of normal text where
possible. In principle, variables are to be presented in italics. Use the solidus (/)
instead of a horizontal line,
64
e.g., Xp/Ym rather than
Powers of e are often more conveniently denoted by exp.
Number consecutively any equations that have to be displayed separate from the
text (if referred to explicitly in the text).
Tables. Number tables consecutively in accordance with their appearance in the
text. Place footnotes to tables below the table body and indicate them with
superscript lowercase letters. Avoid vertical rules. Be sparing in the use of tables
and ensure that the data presented in tables do not duplicate results described
elsewhere in the article.
Nomenclature and units. Follow internationally accepted rules and conventions:
use the international system of units (SI). If other quantities are mentioned, give
their equivalent in SI.
DNA sequences and GenBank Accession numbers. Many Elsevier journals cite
'gene accession numbers' in their running text and footnotes. Gene accession
numbers refer to genes or DNA sequences about which further information can be
found in the databases at the National Center for Biotechnical Information (NCBI)
at the National Library of Medicine. Elsevier authors wishing to enable other
scientists to use the accession numbers cited in their papers via links to these
sources, should type this information in the following manner:
For each and every accession number cited in an article, authors should type the
accession number in bold, underlined text. Letters in the accession number
should always be capitalised. (See Example below). This combination of letters
and format will enable Elsevier's typesetters to recognise the relevant texts as
accession numbers and add the required link to GenBank's sequences.
Example: GenBank accession nos. AI631510 , AI631511 , AI632198 , and
BF223228 ), a B-cell tumour from a chronic lymphatic leukaemia (GenBank
accession no. BE675048 ), and a T-cell lymphoma (GenBank accession no.
AA361117 ).
Authors are encouraged to check accession numbers used very carefully. An erro
r
in a letter or number can result in a dead link. In the final version of the printed
article, the accession number text will not appear bold or underlined. In the final
version of the electronic copy, the accession number text will be linked to the
appropriate source in the NCBI databases enabling readers to go directly to that
source from the article.
Policy and Ethics.
The work described in your article must have been carried out in accordance with
The Code of Ethics of the World Medical Association (Declaration of Helsinki) for
experiments involving humans;
http://www.wma.net/e/policy/17-a_e.html or, if animal
experiments were used, EC Directive 86/609/EEC for animal experiments;
65
http://europa.eu.int/scadplus/leg/en/s23000.htm
Authors in Japan please note: If you would like information about how to have
the English of your paper checked, corrected and improved (before
submission),please contact our Tokyo office who will inform you of the services
provided by language correctors: Elsevier Japan, 9-15 Higashi-Azabu 1-chome,
Minato-ku, Tokyo, 106 Japan, Tokyo; Tel: +81-3-5561-5032; Fax: +81-3-5561-
5032.
Proofs will be sent to the authors to be carefully checked for printer's errors.
Changes or additions to the edited manuscript cannot be allowed at this stage.
Corrected proofs should be returned to the publisher by email within two days of
receipt.
Page charges. The Journal does not charge a submission fee.
Offprints. An electronic proof of the final article will be supplied to authors at the
time of publication. Authors will be given the option to purchase hard copy proofs
at a deeply discounted rate at this time.
Illustrations. Photographs should be presented as high quality jpg (jpeg) or tiff
files with high contrast. Magnification should be indicated by a line representing the
actual scale of reproduction (0.1 mm, 1mm or 10 mm); the use of magnification
factors is to be avoided where possible. Illustrations will not be redrawn by the
Publisher: line figures should be suitable for direct reproduction. They should be
prepared with black on white background, or be black-and-white images; they
should be completely and consistently lettered, the size of the lettering being
appropriate to that of the illustration, taking into account the necessary reduction in
size.
Illustrations should be designed to fit either a single column (84 mm wide) or the
full text width (175mm). However, if specifically requested by the author(s), plates
may be reproduced larger than the typeset area; all originals for these should have
the same proportions to achieve uniformity in their presentation. N.B. When plates
are required to fill the entire page, the originals should have the dimensions 215 x
285 mm and contain no essential information or labelling near the edges. Further
information about artwork can be found on the World Wide Web: access under
http://www.elsevier.com/locate/authorartwork
Colour figures will be included subject to the authors' agreement to defray the
cost.
Tables All tables must be cited in the text and have titles. Number them
consecutively with Arabic numerals. Table titles should be complete but brief.
Information other than that defining the data should be presented as footnotes.
Only horizontal rules should be included, and kept to a minimum.
66
All questions arising after acceptance of a manuscript by the editor, especially
those relating to proofs, publication and reprints should be directed to the
publishers, Elsevier Ireland Ltd., Elsevier House, Brookvale Plaza, East Park,
Shannon, Co. Clare, Ireland. Tel: +353 61 709600, Fax: +353 61 709100, E-mail:
[email protected]. In the USA and Canada: For further information, contact
Elsevier Inc., Attn: Journal Information Center, 360 Park Avenue South, New York,
NY 10010, USA. Tel: +1 212 6333750; Telefax: +1 212 6333990; Telex: 420-643
AEP Ui; E-mail: [email protected].revisions received later than 3 months after
this request will be treated as new submissions.
Authors in Japan please note: If you would like information about how to have
the English of your paper checked, corrected and improved (before
submission),please contact our Tokyo office who will inform you of the services
provided by language correctors: Elsevier Japan, 9-15 Higashi-Azabu 1-chome,
Minato-ku, Tokyo, 106 Japan, Tokyo; Tel: +81-3-5561-5032; Fax: +81-3-5561-
5032.
Proofs will be sent to the authors to be carefully checked for printer's
errors.Changes or additions to the edited manuscript cannot be allowed at this
stage. Corrected proofs should be returned to the publisher by email within two
days of receipt.
Page charges will not be made.
Twenty-five free reprints will be supplied. The publisher will send authors a form
enabling further reprints to be ordered at prices listed on the form.
Illustrations Photographs should be presented as high quality jpg (jpeg) or tiff files
with high contrast. Magnification should be indicated by a line representing the
actual scale of reproduction (0.1 mm, 1mm or 10 mm); the use of magnification
factors is to be avoided where possible. Illustrations will not be redrawn by the
Publisher: line figures should be suitable for direct reproduction. They should be
prepared with black on white background, or be black-and-white images; they
should be completely and consistently lettered, the size of the lettering being
appropriate to that of the illustration, taking into account the necessary reduction in
size.
Illustrations should be designed to fit either a single column (84 mm wide) or the
full text width (175mm). However, if specifically requested by the author(s), plates
may be reproduced larger than the typeset area; all originals for these should have
the same proportions to achieve uniformity in their presentation. N.B. When plates
are required to fill the entire page, the originals should have the dimensions 215 x
285 mm and contain no essential information or labelling near the edges. Further
information about artwork can be found on the World Wide Web: access under
http://www.elsevier.com/locate/authorartwork
Colour figures will be included subject to the authors' agreement to defray the
67
cost.
Tables All tables must be cited in the text and have titles. Number them
consecutively with Arabic numerals. Table titles should be complete but brief.
Information other than that defining the data should be presented as
footnotes.Only horizontal rules should be included, and kept to a minimum.
All questions arising after acceptance of a manuscript by the editor, especially
those relating to proofs, publication and reprints should be directed to the
publishers, Elsevier Ireland Ltd., Elsevier House, Brookvale Plaza, East Park,
Shannon, Co. Clare, Ireland. Tel: +353 61 709600, Fax: +353 61 709100, E-mail:
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NY 10010, USA. Tel: +1 212 6333750; Telefax: +1 212 6333990; Telex: 420-643
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