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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
VALDELÚCIA MARIA ALVES DE SOUZA GRINEVICIUS
AVALIAÇÃO DA REMEDIAÇÃO DE EFLUENTES DE UMA
INDÚSTRIA TÊXTIL UTILIZANDO BIOINDICADORES
E BIOMARCADORES
Florianópolis
2006
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VALDELÚCIA MARIA ALVES DE SOUZA GRINEVICIUS
AVALIAÇÃO DA REMEDIAÇÃO DE EFLUENTES DE UMA
INDÚSTRIA TÊXTIL UTILIZANDO BIOINDICADORES
E BIOMARCADORES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, da Universidade Federal de Santa Catarina,
como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em
Biotecnologia. Área de concentração: Ambiental.
Orientadores: Prof
a
. Dr
a
. Rozangela Curi Pedrosa
Prof. Dr. Valfredo Tadeu de Fávere
Florianópolis
2006
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Grinevicius, Valdelúcia Maria Alves de Souza
Avaliação da remediação de efluentes de uma indústria têxtil utilizando
bioindicadores e biomarcadores / Valdelúcia Maria Alves de Souza Grinevicius.
Florianópolis, 2006. 161 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Santa Catarina.
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia.
1.Efluente têxtil. 2. Remediação. 3. Quitosana. 4. Testes de toxicidade aguda.
5. Estresse oxidativo. 6. Biomarcadores.
iv
Dedico este trabalho a meu marido Sérgio e ao nosso filho Alexei, que nutrem minha
vida com verdadeiro amor, que me inspiram a manter a confiança e o entusiasmo, e
que me apoiaram nesta jornada de pesquisa.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Criador, por ter abençoado minha existência com inúmeras
oportunidades de aprender mais sobre os fenômenos que permitem a existência da
vida e, desta forma, compreender alguns dos mistérios que nos desafiam a entender
a mente divina.
Aos meus queridos pais Belmiro e Maria do Carmo e meus amados irmãos
Cleide e Roberto que me ensinaram a admirar a natureza e sempre demonstraram
como minhas vitórias dependem fundamentalmente da minha honestidade ao
enfrentar as dificuldades na vida.
A Prof
a.
Dr
a.
Rozangela Curi Pedrosa e ao Prof. Dr. Valfredo Tadeu de
Fávere pela orientação. O valor inestimável da atuação deles garantiu o sucesso
desta pesquisa.
Ao Prof. Dr. Danilo Wilhelm Filho do Centro de Ciências Biológicas,
Departamento de Ecologia e Zoologia da UFSC; ao Prof. Dr. Mauro C. M.
Laranjeiras do Centro de Ciências Físicas e Matemáticas da UFSC; ao Prof. Dr. Jacir
Dal Mazo do Centro de Ciências Agroambientais e de Alimentos da Universidade
UNOCHAPECÓ; e à Prof
a.
Dr
a.
Regina Vasconcellos Antônio do Centro de Ciências
Biológicas, Departamento de Bioquímica da UFSC por todas as sugestões,
contribuições e participação na banca examinadora.
A Prof
a.
Dr
a.
Margarida Matos de Mendonça por ter contribuído para o
desenvolvimento do projeto de pesquisa como minha tutora, sua presença marcante
e idéias estimulantes foram decisivas e conquistaram minha admiração e respeito!
Que privilégio conhecê-la!
Ao Prof. Dr. Carlos Henrique Lemos Soares e à amiga Prof
a.
Dr
a.
Ivana
Eunice Baptista pelo auxílio nos ensaios com Daphnia magna.
Ao Prof. Dr. Jörg Zaar, da Universidade Regional de Blumenau e da Umwelt,
pelo auxílio nos ensaios com Vibrio fischeri.
À Prof
a.
Dr
a.
Irene Yukiko Kimura do Departamento de Química da
Universidade Estadual de Maringá por ter gentilmente cedido as imagens de
microscopia eletrônica de varredura das microsferas de quitosana.
Às Prof
as.
Dr
as.
Cândida Leite Kassuya e Alessandra Pellizzaro Bento da
Universidade do Oeste Catarinense - UNOESC - Campus Videira, pela paciência,
conselhos, recomendações e principalmente pela clareza de idéias, valiosas
sugestões e companheirismo em nossas viagens.
Aos amigos do curso de mestrado em Biotecnologia, em especial para
Sabrina Moro Villela, Liz Camargo Ribas e Vitor Enumo de Souza por terem me
vi
honrado com suas sugestões de refinada inteligência, exemplos de honestidade,
dedicação ao trabalho e amizade genuína. Muito obrigada!
Aos amigos do Laboratório de Bioquímica Experimental, que contribuíram
inúmeras vezes para a execução e o sucesso desta pesquisa, principalmente pela
paciência, dedicação e companheirismo. Muito obrigada às alunas da iniciação
científica Karina Bettega e Mariane Magiavachi, os mestrandos Luis Paulo Wiese e
Maicon Kviecinsk, e aos doutorandos Eduardo Antonio Ferreira, Reginaldo
Geremias, Silvio Ávila e Tatiana Schoenfelder!
Aos mestres e amigos Karina Carbonari, Jean Benassi e Jussara de Mattos
Rebello, pela colaboração em diferentes etapas desta pesquisa e principalmente
pelo incentivo e exemplo de dedicação, fé e otimismo.
Aos amigos do Laboratório QUITEC Rogério Laus, Karen, Karina, Alexandre,
e Elder que colaboraram nesta pesquisa, com sugestões e principalmente na
realização das etapas de seleção da formulação de quitosana e nos ensaios
químicos.
Às amigas do Laboratório de Biologia Molecular e Bioquímica de
Microrganismos, principalmente às doutorandas Ana Kelly Pitlovanciv e Derce
Recouvreux pelo apoio e amizade.
Às minhas amigas Aline Previ, Caroline Rosa, Érika Celestino e Flávia
Fernandes de Oliveira por todo apoio logístico e principalmente pelo carinho e
amizade sincera.
À Prof
a.
Dr
a.
Célia Regina Monte Barardi pelo trabalho competente e
responsável que desempenhou na gestão anterior da coordenação deste programa,
principalmente pelo exemplo de atitude saudável, pelo apoio às questões discentes
e pelo trabalho incansável na pesquisa.
Aos Drs. Mário Steindel e Boris Ugarte Stambuk pela competência na
condução da coordenação do Programa de Mestrado e Doutorado em Biotecnologia
na atual gestão e às secretárias Joice Ferrari da Costa e Lígia Costa por toda a
gentileza, atenção e capricho com que trataram todos os alunos do programa.
À indústria têxtil que forneceu os efluentes, especialmente aos engenheiros
da gerência de produção e da operação da estação de tratamento de efluentes pelas
informações adicionais que foram prontamente oferecidas, quando solicitadas.
E finalmente a CAPES por ter financiado esta pesquisa.
vii
“Pois a terra estará repleta do conhecimento de D’us, como as águas cobrem o leito
dos mares. Todos que estão sedentos vão para as águas." (Yeshayáhu 11:9, 55:1)
viii
RESUMO
Este trabalho apresenta uma avaliação preliminar do potencial da quitosana,
na forma pulverizada (QTS3), como um agente remediador de efluente de indústria
têxtil. A capacidade de remediação de QTS3 foi avaliada comparativamente à físico-
química e biológica convencional (ETE), através de ensaios físico-químicos (redução
de cor, pH, condutividade, dureza e teor de metais) e bioensaios com organismos
bioindicadores (Artemia sp, Daphnia magna e Vibrio fischeri). Também foram
realizados testes de toxicidade subcrônica através da inibição de germinação de
sementes, do crescimento de plântulas e de inibição de raízes de bulbos de cebola
(Allium cepa). Além disto, foram verificados alguns biomarcadores de estresse
oxidativo (lipoperoxidação - TBARS, concentração de GSH, atividade da catalase) e
de genotoxicidade (fragmentação do DNA e teste de micronúcleos) em peixes
(Danio rerio). Os resultados obtidos demonstraram que a quitosana removeu
aproximadamente 80% dos corantes e reduziu significativamente a condutividade, a
dureza e a concentração dos íons de metais existentes no efluente não remediado
(EB). Porém, a remediação convencional causou um aumento na concentração de
alguns íons de metais. O efluente EB foi altamente tóxico para V. fischeri (FD=64),
porém os efluentes remediados (ETE e QTS3) não apresentaram toxicidade aguda
(FD=1). O efluente QTS3 não causou toxicidade aguda aos microcrustáceos
(Artemia sp e D. magna), enquanto o ETE causou toxicidade apenas à D. magna
(FD=4). Na verificação da toxicidade subcrônica através da inibição de germinação
de sementes e do crescimento de plântulas de A. cepa, não foram constatadas
diferenças significativas entre os efluentes. Foi observada uma inibição no
crescimento das raízes de bulbos expostos ao EB, porém esta foi maior no ETE e o
QTS3 causou menor inibição. A remediação com quitosana levou também a uma
redução de toxicidade verificada através dos biomarcadores de estresse oxidativo
em D. rerio que apresentou menores níveis de lipoperoxidação (TBARS=55,06 ±
11,42 nmol.g
-1
), enquanto os peixes expostos ao ETE apresentaram valores maiores
(78,60 ± 4,45 nmol.g
-1
). Igualmente, com relação à GSH, os animais expostos ao
QTS3 (8,34 ± 0,94 µmol.g
-1
) não apresentaram diferença significativa em relação ao
grupo controle (9,17 ± 0,30 µmol.g
-1
), enquanto os peixes expostos ao ETE (13,70 ±
1,46 µmol.g
-1
) apresentaram maiores níveis de GSH. Com relação à CAT,
novamente os peixes expostos ao QTS3 (118,30 ± 9,30 mmol.min
-1
.g
-1
) não
apresentaram diferença do grupo controle (103,65 ± 10,76 mmol.min
-1
.g
-1
), enquanto
os expostos ao EB (45,85 ± 1,90 mmol.min
-1
.g
-1
), apresentaram uma atividade
diminuída. O QTS3 levou a uma redução da genotoxicidade verificando-se menor
dano ao DNA (3,00 ± 0,70) e menor freqüência de micronúcleos (0,37 ± 0,12 ‰),
comparativamente aos peixes expostos ao efluente ETE, que apresentaram valores
maiores para ambos (8,25 ± 1,10 e 0,57 ± 0,08
‰, respectivamente). Estes
resultados permitem concluir que a quitosana pulverizada pode ser utilizada como
agente de remediação de efluentes têxteis com vantagens ambientais,
comparativamente à remediação efetuada pela empresa que utiliza coagulante
inorgânico tóxico. Além de que confirmaram a adequação dos bioindicadores e
biomarcadores empregados neste estudo no monitoramento da remediação de
efluentes industriais.
Palavras-chave: efluente têxtil, remediação, quitosana, testes de toxicidade aguda,
estresse oxidativo, biomarcadores.
ix
ABSTRACT
The present work consists in a preliminary evaluation of a pulverized
chitosan (QTS3) as a remediator agent against a textile effluent (EB). The QTS3
remediation capacity was compared to a conventional physic-chemical and biological
remediation (ETE), using physic-chemical assay (color reduction, pH, conductivity,
hardness, and metal content), assay of acute exposure with different bioindicators
(Vibrio fischeri, Artemia sp, Daphnia magna), subchronic exposure using Allium cepa,
and also biomarkers of oxidative stress and genotoxicity (DNA fragmentation and
micronuclei assay) using the fish Danio rerio as bioindicator. The results showed that
chitosan remediation was able to remove approximately 80% of dyes and also
significantly decreased the metal content present in the EB effluent, compared to an
increase in metal content found after conventional remediation. The non-remediate
effluent (EB) was highly toxic to V. fischeri (FD=64), whilst the ETE and QTS3
effluents did not cause acute toxicity using a dilution factor FD=1. Also, the QTS3
effluent did not cause acute toxicity to Artemia sp and D. magna, whilst the ETE
effluents cause to D. magna (FD=4). After subchronic exposure to A. cepa no
differences were observed either in the development seeds or seedlings. However,
inhibition of root growth was observed in the onion bulbs (A. cepa) after exposure to
non-remedied effluent (EB), being higher in relation to ETE compared to QTS3
effluent. Chitosan remediation decreased biomarkers of oxidative stress such as
lipoperoxidation (TBARS) (55.06 ± 11.42 nmol.g
-1
) and GSH contents (8.34 ± 0.94
µmol.g
-1
), whilst animals exposed to ETE effluent showed enhanced TBARS values
(78.60 ± 4.45 nmol.g
-1
), and also enhanced GSH contents (13.70 ± 1.46 µmol.g
-1
).
However, after QTS3 exposure no differences were found for GSH contents in
controls (9.17 ± 0.30 µmol.g
-1
). In QTS3 exposure no CAT activity induction was
observed (118.30 ± 9.30 mmol.min
-1
.g
-1
) compared to controls (103.65 ± 10.76
mmol.min
-1
.g
-1
), whilst after EB exposure CAT activity was decreased (102.70 ± 4.52
mmol.min
-1
.g
-1
). Accordingly, DNA fragmentation and micronuclei indices were higher
after exposure to ETE effluent (8.25 ± 1.10 and 0.57 ± 0.08
‰, respectively)
compared after chitosan remedied exposure (3.00 ± 0.70 and 0.37 ± 0.12 ‰,
respectively), and the controls (4.75 ± 1.50 and 0.37 ± 0.12
‰, respectively). The
results indicate that chitosan (QTS3) a useful tool for the remediation of effluents
from textile industry, which showed a better efficiency compared to the industrial
treatment that use toxic inorganic coagulants.
Keys words: textile effluent, remediation, chitosan, acute test toxicity, oxidative
stress, biomarkers.
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Erro!
Indicador não definido.
– Etapas do processamento de fibras de algodão em indústria têxtil....
Figura 2
16
– Representação das unidades que compõem as estruturas dos corantes
reativos. (a) grupo reativo triazina e (b) grupo reativo vinilsulfona ............................
Figura 3 17 – Principais métodos de tratamento de efluentes coloridos .......................
Figura 4 19 – Planta de tratamento de efluentes da empresa em estudo .....................
Figura 5
21
– Exemplo de estrutura química de azo corante, em destaque o grupo azo
(-N=N-) ......................................................................................................................
Figura 6
22
– Síntese de corantes azo e formação de aminas aromáticas após clivagem
redutiva química ou enzimática.................................................................................
Figura 7
23
– Exemplo da redução de um azo corante banido (ácido preto 077) em uma
amina carcinogênica (benzidina)...............................................................................
Figura 8
4
– Esquema com equações das reações de neutralização das EROs, nas
quais participam as enzimas SOD e CAT .................................................................
1
Figura 9 4 – Estrutura química dos biopolímeros quitina (a) e da quitosana (b) ......... 4
Figura 10
5
– Fotomicrografia obtida em microscópio eletrônico de varredura de
microsfera de quitosana. (a) morfologia da superfície externa da microesfera (50 X),
(b) detalhe da superfície (8000 X).............................................................................
3
Figura 11
......................................6
– Plântulas de Allium cepa com 12 dias, apresentando desenvolvimento
normal após cultivo em substrato contendo QTS3 a 100%.
9
Figura 12
.................................................................................................6
– Plântulas de A. cepa com 12 dias, apresentando desenvolvimento
anormal após cultivo em substrato contendo dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) em
caixa de germinação
9
Figura 13
7
– Áreas do cometa que foram mensuradas para determinar a classe do
cometa e para o cálculo do índice de dano...............................................................
8
Figura 14
80
– Fotomicrografia de eritrócitos de Danio rerio corados pelo método
Feulgen-Fast-Green ..................................................................................................
Figura 15
8
– Fotomicrografia obtida de partículas de quitosana pulverizada em
microscópio de varredura (ampliação 300 X)............................................................
4
Figura 16
8
– Fotomicrografia obtida de partículas de quitosana pulverizada, para
observação de sua morfologia superficial em microscópio eletrônico de varredura
(ampliação 600 X) .....................................................................................................
4
xi
Figura 17
9
– Índice de lipoperoxidação (TBARS, nmol.g
-1
) em homogenato de pool de
Danio rerio (n= 6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil
não remediado (EB20), a 20 % do efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20
% do efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 7 dias......
8
Figura 18
9
– Concentração de GSH (µmol.g
-1
) em homogenato de pool de Danio rerio
(n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não
remediado (EB20), a 20 % do efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 %
do efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 7 dias..........
9
Figura 19
100
– Atividade enzimática da catalase (CAT) (expressa em mmol de H
2
O
2
consumido min.
-1
g
-1
) em homogenato de pool de Danio rerio (n=6), expostos à água
de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado (EB20), a 20 % de
efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % de efluente remediado com
quitosana pulverizada (QTS320), durante 7 dias ....................................................
Figura 20
10
– Índice de dano ao DNA (teste do cometa) em homogenato de Danio
rerio (n= 6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não
remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 %
do efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias........
2
Figura 21
10
– Freqüência de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de
Danio rerio (n= 6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil
não remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20
% do efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias....
3
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Classificação dos corantes, principais características (estrutura química e
solubilidade de corantes), fibras nas quais são aplicados e exemplos de corantes em
uso.
...........................................................................................................................13
Tabela 2 – Relação de corantes que apresentam metais na estrutura molecular. ...26
Tabela 3 – Ensaios de sensibilidade de bactérias bioluminescentes (Vibrio fischeri)
expostas a Cr
(na forma de K Cr O ), Zn (na forma de ZnSO .7H O), e 3,5-
diclorofenol 6 mg.L
.
6+
2 2 7
2+
4 2
-1
.................................................................................................64
Tabela 4 – Resumo dos requisitos para o ensaio de toxicidade subcrônica com
sementes de Allium cepa ..........................................................................................67
Tabela 5 – Pontuação e exemplos de cada classe de cometa visualizada através de
coloração com nitrato de prata. Imagens de nucleóides presentes em homogenato
de Danio rerio (n= 6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente
têxtil não remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e
a 20 % do efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias.
..................................................................................................................................77
Tabela 6 – Imagens de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de Danio
rerio (n= 6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20% do efluente têxtil não
remediado (EB20), a 20% de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20% do
efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias.
..............81
Tabela 7 – Leitura de absorbâncias (a 517 nm) e porcentagem de remoção de cor,
referentes ao efluente têxtil não remediado (EB); remediado pela empresa (ETE);
remediado com microesferas de quitosana (QTS1), com quitosana solubilizada em
ácido acético (QTS2) e com quitosana pulverizada (QTS3).
....................................86
Tabela 8 – Leitura de absorbâncias (a 517 nm) e porcentagem de remoção de cor.
Resultados referentes ao efluente têxtil não remediado (EB) e remediado com
diferentes formulações de quitosana empregadas: QTS
A
(0,1 g); QTS
B
(0,2 g); QTS
C
(0,3 g); QTS
D
(0,4 g); QTS
E
(0,5 g) e QTS
F
(1,0 g). ..................................................86
Tabela 9
.....................................................................................................................8
– Valores de pH referentes ao efluente têxtil não remediado (EB);
remediado pela empresa (ETE); remediado com microesferas de quitosana (QTS1),
com quitosana solubilizada em ácido acético (QTS2) e com quitosana pulverizada
(QTS3).
7
Tabela 10
8
– Concentração de metais no efluente têxtil não remediado (EB),
remediado pela empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3) ...
8
Tabela 11
8
– Características físico-químicas (condutividade e dureza) do efluente
têxtil não remediado (EB), remediado pela empresa (ETE) e remediado com
quitosana pulverizada (QTS3)...................................................................................
9
xiii
Tabela 12
90
– Toxicidade aguda para bioindicadores (Artemia sp, n=10 e Daphnia
magna, n=10) utilizados na seleção da quitosana. Resultados referentes ao efluente
têxtil não remediado (EB); remediado pela empresa (ETE); remediado com
microesferas de quitosana (QTS1), quitosana solubilizada em ácido acético (QTS2)
e quitosana pulverizada (QTS3)................................................................................
Tabela 13 – Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri (n= 10
6
UFC), expostas
às diferentes diluições do efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela
empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3)
.............................91
Tabela 14 – Ensaio de toxicidade aguda com náuplios de Artemia sp (n=10),
expostos às diluições de efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela
empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3).............................
92
Tabela 15
9
– Ensaio de toxicidade aguda empregando juvenis de Daphnia magna
(n=10), expostos às diluições do efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela
empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3).............................
3
Tabela 16
9
– Ensaio de toxicidade subcrônica empregando sementes e plântulas de
Allium cepa (n=100), expostas ao efluente têxtil não remediado (EB), ao remediado
pela empresa (ETE) e ao remediado com quitosana pulverizada (QTS3) ................
5
Tabela 17
..................................................................................................................................9
– Inibição de crescimento de raízes de bulbos de Allium cepa (n=6),
expostos à água mineral (controle negativo), ao dicromato de potássio (1,75 mg/L)
(controle positivo), ao efluente têxtil não remediado (EB), ao remediado pela
empresa (ETE) e ao remediado com quitosana pulverizada (QTS3), durante 3 dias.
6
Tabela 18 – Ensaio de toxicidade aguda empregando Danio rerio (n=6), expostos à
água de torneira aerada (CN) e
às diluições de efluente têxtil não remediado (EB),
remediado pela empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3), por
48 h ...........................................................................................................................
97
Tabela 19 – Freqüência de classes de dano ao DNA (teste do cometa) em
homogenato de Danio rerio (n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 %
do efluente têxtil não remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela
empresa (ETE20) e a 20 % do efluente remediado com quitosana pulverizada
(QTS320), durante 2 dias........................................................................................
101
Tabela 20
................................................................................................................................113
– Concentração máxima de metais permitida para lançamentos em
corpos de água doce (Classes I, II e III) e para lançamento de efluentes industriais
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
BHT Hidroxitolueno butilado
CAT Catalase
CE
50
Concentração efetiva real da amostra que
causa efeito agudo a 50 % dos organismos no
tempo de exposição.
CEUA Comissão de Ética no Uso de Animais
DMSO Dimetilsulfóxido
DTNB 5,5’-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico
EB Efluente têxtil não remediado
EDTA Ácido etilenodiaminotetraacético
EROs Espécies reativas de oxigênio
ETE Efluente têxtil remediado através de
tratamento convencional em estação de
tratamento de efluentes
FATMA Fundação do Meio Ambiente de Santa
Catarina
FD Fator de diluição
GD
Grau médio de desacetilação (%
GD) da
quitosana
GSH Glutationa reduzida
GSSH Glutationa oxidada
GST Glutationa S-transferase
O
2
•-
Radical ânion superóxido
•
OH
Radical hidroxil
PBS
Solução salina tamponada com fosfato
QTS1 Efluente têxtil remediado com microesferas de
quitosana
QTS2 Efluente têxtil remediado com quitosana
solubilizada em ácido acético
QTS3 Efluente têxtil remediado com quitosana
pulverizada
TBA Ácido tiobarbitúrico
xv
TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA Ácido tricloroacético
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS .................................................................................................. v
RESUMO...................................................................................................................viii
ABSTRACT ................................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................x
LISTA DE TABELAS ................................................................................................. xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................... xiv
SUMÁRIO.................................................................................................................. xv
1 INTRODUÇÃO .........................................................................................................1
1.1 Indústria têxtil no cenário brasileiro e em Santa Catarina....................................1
1.2 Potencial poluidor/degradador gerado pela indústria têxtil e legislação associada
ao controle da poluição
..............................................................................................2
1.3 Etapas do processo produtivo têxtil e substâncias químicas utilizadas ...............5
1.3.1 Corantes .........................................................................................................9
1.4 Classificação de corantes..................................................................................11
1.4.1 Corantes reativos..........................................................................................14
1.5 Tratamento de efluentes de uma indústria têxtil ................................................16
1.6 Aspectos dos corantes relacionados à poluição................................................20
1.6.1 Toxicidade de corantes azo e antraquinona ...................................................22
1.7 Bioindicadores utilizados na avaliação de toxicidade de efluentes têxteis ........26
1.7.1 Vibrio fischeri..................................................................................................27
1.7.2 Artemia sp.....................................................................................................29
1.7.3 Daphnia magna.............................................................................................30
1.7.4 Danio rerio ....................................................................................................31
1.7.5 Allium cepa ...................................................................................................32
1.8 Biomarcadores no biomonitoramento................................................................33
1.8.1 Teste cometa ................................................................................................35
1.8.2 Teste de micronúcleos..................................................................................37
1.8.3 Lipoperoxidação de membranas celulares....................................................38
1.8.4 Defesas antioxidantes...................................................................................39
1.9 Novas alternativas de remoção de cor de corantes e de efluentes têxteis ........41
1.9.1 Uso de polieletrólitos em processos de adsorção.........................................43
1.9.1.1 Uso de quitosana em processos de adsorção..........................................43
2 OBJETIVOS ...........................................................................................................47
xvi
2.1 Objetivo Geral....................................................................................................47
2.2 Objetivos Específicos ........................................................................................47
3 METODOLOGIA.....................................................................................................48
3.1 Considerações Gerais .......................................................................................48
3.2. Materiais e Equipamentos ................................................................................48
3.2.1 Reagentes gerais..........................................................................................48
3.2.2 Equipamentos ...............................................................................................49
3.3 Coleta das amostras de efluentes .....................................................................50
3.4 Determinação do grau de desacetilação e morfologia da quitosana, preparação
das microesferas, solução de quitosana como agente de coagulação e de quitosana
pulverizada
..............................................................................................................51
3.4.1 Grau de desacetilação e morfologia .............................................................51
3.4.2 Preparação das microesferas de quitosana (QTS1) .....................................52
3.4.3 Preparação da solução de quitosana em ácido acético (QTS2) ...................53
3.4.4 Quitosana pulverizada (QTS3)......................................................................53
3.5 Remediação dos efluentes ................................................................................54
3.5.1 Etapa 1 – Seleção de formulação de quitosana para remediação de efluente
têxtil .......................................................................................................................54
3.5.1.1 Remediação com microsferas de quitosana (QTS1)................................54
3.5.1.2 Remediação do efluente por coagulação/floculação da quitosana (QTS2)
.............................................................................................................................55
3.5.1.3 Remediação do efluente por adsorção em quitosana pulverizada (QTS3)
.............................................................................................................................56
3.5.2 Análises físico-químicas dos efluentes não remediados e remediados ........57
3.5.2.1 Determinação do pH ................................................................................57
3.5.2.2 Determinação da concentração de metais ...............................................57
3.5.2.3 Determinação da condutividade ...............................................................58
3.5.2.4 Determinação da dureza ..........................................................................58
3.6 Avaliação da toxicidade aguda dos efluentes não remediados, e remediados
utilizando organismos bioindicadores
......................................................................59
3.6.1 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp ................................................59
3.6.2 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna........................................60
3.7 Remediação e biomonitoramento dos efluentes................................................61
3.7.1 Etapa 2 – Remediação e biomonitoramento do efluente têxtil com a
quitosana selecionada (QTS3)
...............................................................................62
3.7.1.1 Remediação com QTS3 ...........................................................................62
3.7.1.2 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade aguda
.............................................................................................................................62
3.7.1.2.1 Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri...................................62
3.7.1.2.2 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp.......................................64
3.7.1.2.3 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna...............................64
xvii
3.7.1.2.4 Ensaio de toxicidade aguda com Danio rerio, para determinação da
dose de não efeito
..............................................................................................65
3.7.1.3 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade
subcrônica
............................................................................................................66
3.7.1.3.1 Ensaio de toxicidade subcrônica com Allium cepa ..............................66
a) Teste de inibição de germinação de sementes de Allium cepa....................66
b) Ensaio de inibição do crescimento de plântulas de Allium cepa...................68
c) Ensaio de inibição do crescimento de raiz de Allium cepa ...........................69
3.7.1.3.2 Ensaios de toxicidade subcrônica com Danio rerio .............................70
a) Avaliação do dano às membranas celulares através da medida da
lipoperoxidação
.................................................................................................71
b) Glutationa reduzida (GSH) ...........................................................................73
c) Atividade da enzima catalase (CAT).............................................................73
3.7.1.4 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de genotoxicidade
com Danio rerio
....................................................................................................74
a) Avaliação do dano ao DNA (Teste cometa)..................................................75
b) Avaliação do dano secundário ao DNA (Teste de micronúcleos).................78
3.8 Análise estatística..............................................................................................82
4 RESULTADOS .......................................................................................................83
4.1 Caracterização da quitosana, das microesferas de quitosana e da quitosana
pulverizada
..............................................................................................................83
4.1.1 Caracterização da quitosana pela determinação do grau de desacetilação e
do diâmetro das microesferas
................................................................................83
4.2 Remediação dos efluentes ................................................................................85
4.2.1 Etapa 1 – Seleção de formulação de quitosana para remediação de efluente
têxtil
.......................................................................................................................85
4.2.1.1 Determinação da porcentagem de remoção de cor dos efluentes ...........85
4.2.2 Análises físico-químicas dos efluentes não remediados e remediados ........87
4.2.2.1 Verificação do pH .....................................................................................87
4.2.2.2 Análise de metais .....................................................................................87
4.2.2.3 Determinação da condutividade e dureza ................................................88
4.2.2.4 Avaliação da toxicidade aguda dos efluentes utilizando Artemia sp e
Daphnia magna
....................................................................................................89
4.2.3. Etapa 2 – Remediação e biomonitoramento do efluente têxtil com a
quitosana selecionada (QTS3)...............................................................................91
4.2.3.1 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade aguda91
4.2.3.1.1 Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri...................................91
4.2.3.1.2 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp.......................................92
4.2.3.1.3 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna...............................93
4.2.3.1.4 Ensaio de toxicidade subcrônica com Allium cepa ..............................94
xviii
a) Teste de inibição de germinação de sementes e de crescimento de plântulas
de Allium cepa
..................................................................................................94
b) Ensaio de inibição do crescimento de raiz de bulbos de Allium cepa...........95
4.2.3.1.5 Ensaio de toxicidade aguda com Danio rerio para determinação da
dose de não efeito
..............................................................................................96
4.2.3.1.6 Ensaios de toxicidade subcrônica com Danio rerio .............................97
a) Avaliação do dano às membranas celulares através da medida da
lipoperoxidação (TBARS)
.................................................................................97
b) Glutationa reduzida (GSH) ...........................................................................99
c) Atividade da enzima catalase (CAT)...........................................................100
4.2.3.1.7 Ensaios de genotoxicidade com Danio rerio......................................101
a) Avaliação do dano ao DNA (Teste cometa)................................................101
b) Avaliação do dano secundário ao DNA (Teste de micronúcleos)...............102
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................104
6 CONCLUSÕES ....................................................................................................140
7 PERSPECTIVAS..................................................................................................142
REFERÊNCIAS.......................................................................................................143
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Indústria têxtil no cenário brasileiro e em Santa Catarina
No Brasil, as indústrias têxteis concentram-se nas Regiões Sul e Sudeste,
nas quais os estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Rio Grande do
Sul e Santa Catarina se destacam (BRAILE; CAVALCANTI, 1993).
O segundo maior pólo têxtil em volume de produção do Brasil situa-se em
Santa Catarina e localiza-se em áreas urbanas de elevada densidade demográfica,
principalmente nos municípios de Blumenau e Brusque, onde se encontra a maior
produção têxtil do sul do Brasil. Tal concentração industrial levou a uma situação de
degradação ambiental da bacia hidrográfica do Rio Itajaí-Açu (SANTOS, 1996;
WOLFF, 1997).
As indústrias de fiação e tecelagem do vale do Itajaí são algumas das
maiores do setor na região sul, na qual representam 53,38 %, enquanto o litoral
norte representa 17,23 %, o sul do estado 8,78 %, Florianópolis 8,45 %, extremo
oeste 4,39 %, Lages 3,72 %, planalto norte 2,70 % e vale do Rio do Peixe 1,35 %.
As principais cidades onde se concentram as indústrias têxteis são Blumenau, com
15,54 % das fiações e tecelagens; Brusque com 14,53 % e Joinville com 10,81 %
(KNUT, 2001; SANTOS, 1996).
Citando dados do Instituto Brasileiro de Geografia e de Estatística (IBGE), o
Banco Regional de Desenvolvimento do Extremo Sul (BRDE) (2004, 2005) apontou
para Santa Catarina a variação de + 9,6 % (2004/2003) e + 9,1 % (2004/2005) na
2
produção industrial física para a indústria têxtil no primeiro semestre (meses de
janeiro a maio) de cada ano, comparativamente ao ano anterior. Esta instituição
aponta o desempenho do setor têxtil como um dos responsáveis pelo bom resultado
da indústria catarinense no primeiro semestre de 2005. Este crescimento é resultado
do alto nível de organização deste ramo empresarial, constatado pela Associação
Brasileira da Indústria Têxtil e de Confecção (ABIT), que representa a integração da
cadeia têxtil brasileira e é composta por inúmeros segmentos da indústria têxtil.
Estes abrangem desde o cultivo do algodão, matérias-primas sintéticas, fibras
têxteis, fiações, tecelagens, malharias, tinturarias e estamparias, até as confecções
(ABIT, 2004). No entanto, todos os níveis produtivos são potencialmente capazes de
gerar poluição (KNUT, 2001).
1.2 Potencial poluidor/degradador gerado pela indústria têxtil e legislação
associada ao controle da poluição
As indústrias têxteis de vestuário e de artefatos de tecidos são atividades
potencialmente poluidoras (emissão de gases e efluentes sólidos e líquidos) e/ou
utilizadoras de recursos ambientais (uso de água) em seu processo produtivo
segundo o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA, 2000). Também podem ser potencialmente contaminadoras do
solo e das águas subterrâneas (IBGE, 1999). Isto se deve ao fato de que os
efluentes das indústrias têxteis apresentam características físico-químicas próprias,
tratando-se de misturas complexas de corantes, surfactantes, detergentes,
3
oxidantes, sais, etc. Ao longo do tempo, estes despejos podem variar de acordo com
a utilização de novos reagentes, processos, maquinários e novas técnicas. Sua
quantidade depende da demanda de consumo que, por sua vez, é determinada pela
moda vigente em vestuário (BALAN, 1999, 2002; KIMURA, 2001; PEARCE; LLOYD;
GUTHRIE, 2003).
Em Santa Catarina, a Portaria Intersetorial n
o
01 de 1992 da Secretaria de
Estado da Tecnologia, Energia e Meio Ambiente e da Fundação do Meio Ambiente
(FATMA) aprovou a listagem das atividades consideradas potencialmente
causadoras de degradação ambiental. Esta Portaria definiu que as atividades de
fabricação de artefatos têxteis (estamparias e/ou tinturarias), apresentam um
potencial poluidor/degradador de nível médio para o ar, de nível alto para a água e
de nível médio para o solo (FATMA, 1992; KNUT, 2001). A Resolução n
o
237 de
1997 do Conselho Nacional de Meio Ambiente (CONAMA, 1997), que além de definir
as atividades potencialmente poluidoras e estabeleceu os critérios para o exercício
da competência do Licenciamento Ambiental Municipal. Para determinar os níveis de
potencial poluidor/degradador adotou-se uma avaliação geral englobando ar, água e
solo, e uma avaliação específica para cada compartimento. Nesta Resolução foram
apresentadas as atividades que são associadas às indústrias têxteis, de vestuário e
de artefatos têxteis e seu potencial poluidor:
a) Beneficiamento, fiação e tecelagem de fibras têxteis vegetais: potencial médio
para a avaliação geral, médio para os compartimentos ar e água, e pequeno
para o solo;
b) Beneficiamento, fiação e tecelagem de fibras têxteis artificiais e sintéticas:
potencial médio para a avaliação geral, médio para os compartimentos ar e
água, e pequeno para o solo;
4
c) Beneficiamento, fiação e tecelagem de materiais têxteis de origem animal:
potencial médio para a avaliação geral, médio para os compartimentos ar e
água, e pequeno para o solo;
d) Fabricação de artefatos têxteis, com estamparia e/ou tintura: potencial grande
na avaliação geral, médio para o ar, grande para a água, e médio para o solo;
e) Serviços industriais de lavação, tingimento, alvejamento, estamparia e/ou
amaciamento: potencial grande para a avaliação geral, médio para o ar, grande
para a água, e médio para o solo;
f) Confecções de roupas e artefatos de têxteis de cama, mesa, copa e banho,
com tingimento e/ou estamparia: potencial grande para a avaliação geral,
médio para o ar, grande para a água, e médio para o solo.
No entanto, para o efetivo controle da poluição não basta apenas o
licenciamento. Deve haver um monitoramento dos efluentes gerados ao longo do
processo industrial. Este importante aspecto está contemplado na Portaria n
o
17 de
2002 (FATMA, 2002), onde foi estabelecido que a toxicidade aguda do efluente deve
ser determinada em laboratório, mediante a condução de testes ecotoxicológicos
padronizados, utilizando microcrustáceos e bactérias bioluminescentes. Esta portaria
constituiu um avanço, já que em nível da federação, a obrigatoriedade dos ensaios
toxicológicos foi determinada apenas a partir de 2005.
Em nível federal, na Resolução n
o
237 de 1997 (CONAMA, 1997), ainda em
vigor, foi estabelecida a obrigatoriedade do licenciamento ambiental para as
atividades ou empreendimentos da indústria têxtil, de vestuário e artefatos de tecidos
representadas por empresas que atuam no beneficiamento de fibras têxteis vegetais,
de origem animal e sintéticas; na fabricação e acabamento de fios e tecidos; no
tingimento, estamparia e outros acabamentos em peças do vestuário, e em artigos
5
diversos de tecidos. Tais empresas foram consideradas como apresentando um grau
médio de degradação ambiental. Esta Portaria visou disciplinar a localização,
instalação, ampliação e operação de empreendimentos e atividades utilizadoras de
recursos ambientais consideradas efetiva ou potencialmente poluidoras ou daquelas
que, sob qualquer forma, possam causar degradação ambiental (CONAMA, 1997).
A Resolução CONAMA n
o
20 de 1986 (CONAMA, 1986) foi revogada e
atualmente está em vigor a Resolução CONAMA n
o
357 de 2005 que determina os
padrões e limites máximos para lançamentos de efluentes em corpos de água
receptores (CONAMA, 2005).
1.3 Etapas do processo produtivo têxtil e substâncias químicas utilizadas
Os processos na indústria têxtil abrangem desde a fiação até a tecelagem,
durante os quais são adicionados vários compostos químicos, entre eles os
detergentes e os corantes que são eliminados durante as etapas subsequentes.
Desta forma, as operações de limpeza, tingimento e acabamento na indústria têxtil
dão origem a uma grande quantidade de despejos. A recirculação destes despejos e
a recuperação de produtos químicos e subprodutos constituem os maiores desafios
enfrentados pela indústria têxtil com o fim de reduzir os custos com o tratamento dos
mesmos. Assim, seus efluentes incorporam substâncias provenientes de todas as
etapas úmidas, ou seja, que envolvem lavagem durante todo o beneficiamento de
fibras têxteis tais como: engomação, desengomação, alvejamento, mercerização,
tingimento, vaporização e acabamento. Dependendo do processo e da matéria-
6
prima utilizada, os efluentes líquidos gerados no processo têxtil irão variar em
quantidade e em sua composição. Por serem complexos e de elevada diversidade
química, o tratamento por métodos convencionais em estações de tratamento de
efluentes (ETE) apresenta diversos problemas, em especial o baixo nível de
eficiência quanto à remoção de cor e a elevada produção de lodo (BRAILE;
CAVALCANTI, 1993; KNUT, 2001; MELO FILHO, 1997).
Os fios em rolos ou bobinas passam por fervura em soluções de soda
cáustica ou detergente (cozimento) e, após a lavagem, ocorre o tingimento por
imersão dos fios em soluções contendo corantes, hidróxido de sódio e detergentes.
Os fios tingidos em bobinas seguem para a tecelagem e os tingidos em rolos
recebem um tratamento inicial com solução de goma de fécula de amido
(engomação), para aumentar a resistência dos fios durante a tecelagem. Em
seguida, os fios passam por um processo de desengomação utilizando glicose,
enzimas, detergentes alcalinos quentes, sabões e emolientes dissolvidos em água.
Durante o cozimento e a lavagem utiliza-se soda cáustica, detergentes e outros
auxiliares na remoção de impurezas como ceras naturais, gorduras, álcoois e
lubrificantes. Para o alvejamento do tecido utiliza-se principalmente hipoclorito de
sódio, clorito de sódio, peróxido de sódio, peróxido de hidrogênio e hidrossulfito de
sódio. A mercerização confere ao material têxtil celulósico maior resistência
mecânica à ruptura, além de brilho. Nesta etapa utiliza-se soda cáustica e o
acabamento é obtido através da aplicação de gomas e resinas em temperaturas
controladas, além de surfactantes, uréia, formol e emulsões polietilênicas. Estas
etapas podem ser observadas no fluxograma apresentado na figura 1 (BRAILE;
CAVALCANTI, 1993; DOS SANTOS, 2005; KIMURA, 2001).
7
Engomação
Desengomação
e lavagem
Matéria
Prima em
fardos
Tingimento
de fios
Fiação
Cozimento e
Lavagem
Tecelagem
Alvejamento
e
Lavagem
Mercerização
Secagem
Estamparia
Lavagem
Acabamento
Tinturaria
Tingimento
Lavagem
Acabamento
Figura 1 – Etapas do processamento de fibras de algodão em indústria têxtil (Modificado de
DOS SANTOS, 2005).
Na estamparia de tecidos de algodão, a pasta é o veículo de aplicação do
corante sobre o tecido. Esta pasta pode ser composta por uréia, espessante alginato
de sódio, fosfato dissódico (para corantes diretos), bicarbonato de sódio (para
corantes reativos) e sabões (SERVIÇO NACIONAL DE APRENDIZAGEM
8
INDUSTRIAL – SENAI; CENTRO DE TECNOLOGIA DA INDÚSTRIA QUÍMICA E
TÊXTIL – CETIQT; DEUTSCHE GESELLSCHAFT FÜR TECHNISCHE
ZUSAMMENARBEIT - GTZ, 1998).
No processo de branqueamento das fibras utiliza-se como oxidante o
hipoclorito de sódio e o cloreto de sódio. No entanto, na tinturaria os oxidantes
utilizados são o dicromato de potássio, o cloreto de ferro (III) e o nitrito de sódio
(PERUZZO, 2003).
Embora na literatura existam diferentes esquemas demonstrativos do
processamento de fibras de algodão, de uma maneira geral as etapas apresentadas
na figura 1 são as que ocorrem, com maior freqüência, nas indústrias têxteis e afins.
Portanto, entre os produtos químicos mais utilizados na indústria têxtil
destacam-se os ácidos (sulfúrico, clorídrico, fórmico, acético), bases (hidróxido de
sódio, hidróxido de potássio, amônia, carbonato de sódio), sais (silicato de sódio,
polifosfatos, fosfato de amônia, cloreto de amônia e cloreto de magnésio), oxidantes
(peróxido de hidrogênio), solventes orgânicos (tetracloroetileno, metanol, etanol),
ceras, parafinas, silicones (produtos de acabamento), espessantes (amido, éteres de
amido, gomas vegetais), tensoativos (sabões, detergentes, dispersantes)
(VANDEVIVERE; BIANCH; VERSTRAETE, 1998).
Porém, entre todas as substâncias químicas utilizadas no processo têxtil, os
corantes constituem uma questão delicada em função do seu potencial poluidor.
Fica claro o conflito existente entre as exigências dos órgãos ambientais
fiscalizadores e a demanda por consumo de produtos mais coloridos. Nesta
complicada equação devem ser inseridos elementos como as matérias-primas
9
necessárias à produção, tanto de corantes quanto de produtos têxteis, o controle da
qualidade dos efluentes líquidos lançados, a capacidade de autodepuração dos
corpos de água receptores e a resistência dos organismos que neles vivem. Este
conflito pode sofrer uma redução significativa quando são adotados procedimentos
para produção mais limpa na qual sejam empregadas substâncias que causem
mínimos impactos ambientais (BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001; CONAMA,
2005).
1.3.1 Corantes
Corantes são definidos como “substância, geralmente orgânica,
desenvolvida para ser absorvida ou adsorvida, ou reagir com, ou ainda ser
depositada em um substrato de forma a imprimir cor ao mesmo, com algum grau de
permanência” (SOCIETY OF DYERS AND COLOURISTS, 2005).
Corantes e pigmentos são colorantes que diferem entre si por sua
solubilidade. Os corantes que forem parcialmente ou completamente dissolvidos em
um líquido podem ser aplicados sobre diferentes substratos (materiais têxteis, papel,
cabelos, couro, entre outros). Já os pigmentos são praticamente insolúveis nos
meios nos quais eles são aplicados. Colorantes são caracterizados por sua
capacidade de absorver luz no espectro visível (400 a 700 nm), por esta razão
parecem coloridos (TROTMAN, 1984; ZOLLINGER, 1991).
10
Entre os fatores que determinam a seleção do corante a ser utilizado se
destacam a sua afinidade por uma fibra têxtil e o processo de tingimento (contínuo,
semicontínuo e por esgotamento), além das características técnicas desejadas para
o produto em termos de solidez como, por exemplo, à luz, à fricção e ao suor
(ABIQUIM, 2005).
Até a metade do século XIX todos os corantes orgânicos eram derivados de
partes de vegetais e de substâncias extraídas de animais. Embora a indústria de
corantes tenha se originado na Europa durante o século XVI, o primeiro corante
sintético foi descoberto em 1856 na Inglaterra (GUARATINI; ZANONI, 2000).
No Brasil, desde a época colonial, os corantes têm desempenhado um papel
especial. O nome que o país recebeu deriva de um corante que provém de uma
árvore conhecida como pau-brasil (Caesalpinia echinata), cuja cor vermelha é
atribuída a um composto conhecido como brazileína que, na realidade, é um produto
da oxidação da brazilina, presente no lenho da árvore. A fórmula dos corantes
brazilina e brazileína foi determinada por Liebermann e Burg em 1883 (ABIQUIM,
2005).
O Colour Index, catálogo da Society of Dyers and Colourists, registra que
atualmente mais de oito mil corantes sintéticos são empregados na indústria têxtil
(ZANONI; CARNEIRO, 2001).
A utilização de corantes no Brasil concentra-se principalmente nos corantes
reativos para fibras celulósicas que hoje respondem por 57 % do mercado, seguidos
pelos corantes dispersos com 35 % (ABIQUIM, 2005).
11
Souza e Peralta-Zamora (2005) atribuem aos azo corantes 60 % do mercado
consumidor brasileiro. Entre estes se destacam os corantes reativos com 57 % do
mercado consumidor e os corantes dispersos com 35 % (ABIQUIM, 2005).
1.4 Classificação de corantes
A norma técnica NBR 5766 de 1974 da Associação Brasileira de Normas
Técnicas (ABNT), estabelece a classificação de corantes orgânicos e sintéticos
comercializados no Brasil (ABNT, 1974).
Os corantes são classificados segundo o Colour Index (CI), conforme sua
classe química, e de acordo com o método de fixação à fibra têxtil. Com relação à
classe química dos corantes, estes são classificados de acordo com a estrutura
química do grupo cromóforo. Os grupos mais importantes são azos, antraquinona e
ftalocianina (HAO; KIM; CHANG, 2000; KUNZ et al., 2002).
Entre os vários grupos cromóforos utilizados na síntese de corantes, o grupo
mais representativo e que é mais amplamente empregado no tingimento de fibras
têxteis estão os azo corantes. Estes se caracterizam por apresentarem um ou mais
grupamentos -N=N- ligados a sistemas aromáticos. Estes são encontrados entre os
corantes básicos, ácidos, diretos, mordentes e reativos (KIMURA, 2001;
VANDEVIVERE; BIANCH; VERSTRAETE, 1998).
Em termos de utilização na indústria têxtil, adota-se a classificação de
acordo com a aplicação dos corantes ou o modo de fixação às fibras (GUARATINI;
12
ZANONI, 2000; KIMURA, 2001; TROTMAN, 1984): básicos, ácidos, diretos ou
substantivos, mordentes ou pré-metalizados, ao enxofre ou sulfurosos, azóicos, à
cuba, dispersos ou dispersivos, reativos e branqueadores.
Na tabela 1 são apresentadas outras características dos corantes como
estrutura química (azo, antraquinona, etc.). Como a estrutura química do corante
interfere no processo de tingimento e na afinidade dos corantes por determinadas
fibras têxteis, então o emprego de um tipo de corante é determinado por sua
estrutura que também pode causar toxicidade do corante ou de produtos
intermediários de sua degradação, bem como sua solubilidade a qual, por sua vez,
interfere diretamente no processo de tingimento e na qualidade do mesmo
(ASPLAND, 1992a, 1992b; BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001; GUARATINI;
ZANONI, 2000; KIMURA, 2001; TROTMAN, 1984; ZOLLINGER, 1991).
Na indústria têxtil em estudo no presente trabalho são utilizados
principalmente os corantes pertencentes ao grupo conhecido comercialmente como
remazol, que no Colour Index são denominados como corantes reativos
(BURKINSHAW; JARVIS, 1996).
13
Tabela 1 – Classificação dos corantes, principais características (estrutura química e
solubilidade de corantes), fibras nas quais são aplicados, e exemplos de corantes em uso
(ABIQUIM, 2005; ASPLAND, 1992a, 1992b; GIRARDI; VALLDEPERAS; LIZ, 1999;
GUARATINI; ZANONI, 2000; KIMURA, 2001; TROTMAN, 1984; ZOLLINGER, 1991).
Classes de
corantes
Estrutura
química
Solubilidade
Fibras
(*)
Exemplos
Básicos
Azo,
antraquinona,
triarilmetano,
triazina, acridina,
quinolina.
Hidrossolúveis. PROT
CI Básico
Violeta 2
Ácidos
Azo, azina,
antraquinona,
triarilmetano,
trimetil-metano,
xanteno,
nitro, nitroso,
quinolina,
ftalocianinas.
PROT
SINT
CI
Amarelo 1
Diretos ou
substantivos
Azo (diazo, triazo) Hidrossolúveis. CEL
CI Direto
Amarelo 2
Mordentes ou pré-
metalizados
Azo
CEL
PROT
SINT
CI Mordente
Laranja
Ao Enxofre ou
sulfurosos
Macromoléculas
com pontes de
polissulfetos
Compostos altamente
insolúveis em água,
hidrossolúveis em solução
de sulfito de sódio e
hidrossulfito de sódio e
após redução são
insolúveis no interior da
fibra onde interagem.
CEL
CI Enxofre
Laranja 1
Azóicos Azo
Componente naftol é
insolúvel em água, com a
adição de hidróxido de
sódio forma naftolato que
é um agente de
acoplamento
hidrossolúvel,
Componente base
insolúvel em água, com a
adição de nitrito de sódio
ou ácido clorídrico, forma
base diazotada ou sal de
diazônio (RN
2+
) que reage
com o agente de
acoplamento, já fixo à
fibra, e produz um corante
insolúvel em água.
CEL
PROT
SINT
Corante
Vermelho
obtido
através da
reação entre
metanitro-
ortotoluidina
e ácido beta-
hidroxi-
naftóico.
14
(continuação...)
À cuba
Antraquinona,
índigo
Insolúveis em água, com a
adição de hidróxido de
sódio e de hidrossulfito de
sódio convertem-se em
compostos leuco-solúveis,
que são absorvidos pelas
fibras onde sofrem
oxidação e formam um
pigmento colorido
insolúvel.
CEL
CI Cuba
Preto 1
Dispersos Azo
Não completamente
insolúveis em água.
SINT
CI Disperso
Laranja
Reativos
Azo,
mono e diazo,
(metalizado ou
não metalizado),
trifenodioxazina,
ftalocianina,
antraquinona.
Hidrossolúveis.
CEL
PROT
SINT
CI Reativo
preto 5
Branqueadores
Grupos
carboxílicos
azometinos
(-N=CH-), ou
etilênicos
(-CH=CH) aliados
a sistemas
benzênicos,
naftalênicos,
pirênicos e anéis
aromáticos.
CEL
Cumarina,
derivados
estilbênicos
obtidos da
condensação
de cloreto
cianúrico
com ácido
diamino-
estilbeno-
dissulfônico,
seguido de
condensação
sucessiva
com outras
aminas.
(*) Tipos de fibras onde os corantes podem ser aplicados: CEL = fibras celulósicas (algodão), PROT =
protéicas (lã, seda), SINT = fibras sintéticas (poliamidas sintéticas, poliéster, nylon, diacetato de
celulose, triacetado de celulose, acrílicas).
1.4.1 Corantes reativos
Os corantes reativos são compostos que contêm um ou mais grupos reativos
que formam ligações covalentes com um átomo de oxigênio, de nitrogênio ou de
enxofre de fibras celulósicas (grupo hidroxil), fibras protéicas (grupos amino, hidroxil
15
e mercaptano) e poliamidas (grupo amino). O primeiro corante comercial com dois
grupos reativos (vinilsulfona) foi o reativo preto 5, que é um azo corante
recomendado para fibras celulósicas e protéicas (lã). Com relação ao tipo estrutural,
existem dois grupos principais: o grupo com anel heterocíclico e o grupo com
vinilsulfona (ASPLAND, 1992a, 1992b; TROTMAN, 1984; ZOLLINGER, 1991).
A molécula de um corante reativo apresenta estruturalmente uma
combinação de grupos denominados como grupo cromóforo (C), grupo de
solubilização (S), grupo de ligação (L), grupo reativo (R) e grupo de saída (X),
conforme figura 2. Os grupos (L), (R) e (X) têm efeito nas propriedades físicas da
molécula como um todo, entre as quais a cor, massa molar, solubilidade e
capacidade de difusão para o interior da fibra, entre outros. Todos os grupos, com
exceção do (X), são solúveis em água. O grupo cromóforo (C) é a parte da molécula
que é colorida e pode ser azo (-N=N-). Cerca de 80 % de todos corantes reativos
apresentam este grupo cromogênico. Os demais podem ser do tipo trifenodioxazina,
ftalocianina ou antraquinona. Todos os corantes reativos apresentam em suas
moléculas, como grupo para solubilização em meio aquoso (S), o sulfonato de sódio
(-SO
3
Na). Faz parte também da molécula dos corantes reativos um grupo de ligação
(L) entre a parte reativa da molécula e a parte solúvel colorida que pode ser um
grupo imino (-NH-), ou amida (-NHCO-), ou sulfona (-SO
2
-), entre outros. Os
corantes reativos apresentam em sua molécula um característico grupo reativo (R),
que pode ser um anel heterocíclico ou um radical vinilsulfona (-SO
2
-CH=CH
2
), e um
grupo de saída (X), que podem ser íons (Cl
-
, F
-
, Br
-
) e CH
3
SO
2
(ASPLAND, 1992a,
1992b; ZOLLINGER, 1991).
16
Grupo Reativo (R)
Grupo de Ligação (L)
NH
N
N
N
NH
Cl
SO
3
Na
OH
SO
3
Na
NaSO
3
N=N
Grupo Cromóforo (C)
(S)
SO Na
3
Grupo Solubilizante (S)
Grupo de Saída (X)
(S)
(a)
(C)
(S) (R) (L)
NaO
3
SOCH
2
CH
2
O
2
S
N(CH
3
)
2
N N
O
CH
3
O
CH
3
(b)
Figura 2 – Representação das unidades que compõem as estruturas dos corantes reativos.
(a) grupo reativo triazina e (b) grupo reativo vinilsulfona (baseada em KIMURA, 2001).
1.5 Tratamento de efluentes de uma indústria têxtil
O tratamento de efluentes a serem lançados em corpos receptores visa à
adequação dos parâmetros aos limites estabelecidos por regulamentação específica,
e, desta forma, reduzir os efeitos prejudiciais sobre os organismos. O monitoramento
dos efluentes a serem lançados nos corpos receptores deve ser realizado de
maneira a serem respeitados os limites dos padrões para os efluentes a serem
lançados, impostos em legislação pertinente nas esferas federal, estadual e
municipal (CONAMA, 2005; FATMA, 2002).
17
A Resolução CONAMA n
o
357/05 define como formas de tratamento de
efluentes industriais o tratamento convencional e o avançado (CONAMA, 2005).
No tratamento convencional, a clarificação é realizada através dos
processos de coagulação e de floculação, seguidos de desinfecção e correção do
pH. Já para o tratamento avançado devem ser aplicadas técnicas de remoção e/ou
inativação de constituintes refratários aos processos convencionais de tratamento.
Estes constituintes podem conferir à água características como cor, sabor, odor e
atividade tóxica (CONAMA, 2005). Na figura 3 encontram-se as principais formas de
tratamento de efluentes coloridos realizadas na atualidade (KARAPINAR et al.,
2000).
OXIDAÇÃO:
BIOLÓGICA
+
+
QUÍMICA
COAGULAÇÃO
FLOCULAÇÃO
A
DSORÇÃO
FILTRAÇÃO MÉTODOS
ELETRO - QUÍMICOS
CARVÃO
ATIVADO
ZEÓLIT
A
BENTONIT
A
CINZAS DE
MADEIRA
CINZAS
DE CERÂMIC
A
BIOPOLÍMEROS
REMEDIAÇÃO REALIZADA NA
DA INDÚSTRIA EM ESTUDO
ESCÓRIAS
QUITOSAN
A
Figura 3 – Principais métodos de tratamento de efluentes coloridos (modificado de
KARAPINAR et al., 2000).
O processo de tratamento convencional de efluentes têxteis envolve
inúmeras etapas devido às características do processo produtivo. Os efluentes
18
podem sair dos processos em alta temperatura (entre 60 ºC e 90 ºC) ou em
temperatura ambiente. Os efluentes são captados e recebem uma injeção de gás
carbônico para a neutralização do pH. Em seguida, passam por dispositivos de
tratamento físico (grades, caixas de areia, peneiras estáticas) para a retirada de
sólidos em suspensão, fibras de algodão, restos de pastas, etc; depois seguem para
os tanques de neutralização e equalização. No tanque de neutralização é efetuada
nova medição do pH, pois as estações são projetadas para tratarem os efluentes
com pH variando entre 8 e 10. Após a equalização, os efluentes seguem para os
tanques de aeração onde permanecem de 24 a 36 h, e depois vão para o
decantador secundário. A aeração constitui importante passo no processo de
tratamento biológico propriamente dito, já que os aeradores irão fornecer oxigênio às
bactérias e demais organismos da microfauna, presentes no lodo ativado, que é
necessário à decomposição aeróbica da matéria orgânica. Esta matéria confere
turbidez ao efluente juntamente com outros materiais em suspensão. Nesta fase, os
nutrientes para os organismos são fornecidos pelo esgoto sanitário que é gerado na
empresa. Após a adição de um agente coagulante, ocorre floculação dos materiais
em suspensão, que se depositam no decantador levando à redução da turbidez bem
como à remoção da cor do efluente. Neste processo o efluente fica por
aproximadamente 12 h. No final, uma parte do lodo do decantador é concentrada em
um filtro-prensa e enviada para o aterro industrial, e outra parcela volta para os
tanques de aeração (recirculação) para realimentar as bactérias e a microfauna.
Estas etapas são apresentadas na figura 4 (BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001;
SANTOS, 1996; VAZOLLÉR, 1989).
19
Caixa de Areia
Caixa de Passagem
Tanque
de Equalização
Medidor de Vazão
Magnético MV
Aeração (3 células)
Decantador Secundário
Sulfato de Alumínio
Descolorante
A
densado
r
Prensa
Recipientes
Decantado
r
Terciário
MV
Polieletrólito
Peneira Estática
Gradeamento
Efluente Bruto
Recirculação
A
terro Industrial
Lodo
Escada de Aeração
Corpo Receptor
Figura 4 – Planta de tratamento de efluentes da empresa em estudo (fonte: gerência da
empresa fornecedora do efluente têxtil avaliado no presente trabalho).
O tratamento convencional envolve um processo de coagulação/floculação
no qual ocorre a agregação de colóides e partículas dissolvidas em flocos maiores,
que podem ser sedimentados por ação da gravidade, resultando na remoção dos
mesmos da fase líquida (KIMURA, 2001). Trata-se de um processo versátil e pode
ser utilizado sozinho ou combinado com o tratamento biológico, de forma a remover
sólidos em suspensão e matéria orgânica, assim como promover uma elevada
remoção da cor de efluentes de indústrias têxteis (TÜNAY, 1996; MERIÇ; SELÇUK;
20
BELGIORNO, 2005). No entanto, este processo apresenta como desvantagem o
grande volume de lodo gerado (KUNZ et al., 2002). Este lodo é rico em corantes,
além das demais substâncias utilizadas no processo têxtil. Portanto, torna-se um
problema, devendo ser descartado de maneira adequada para evitar contaminação
ambiental (BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001).
Os tratamentos descritos acima envolvem processos não destrutivos
fundamentados em coagulação, seguidos de separação por flotação ou
sedimentação e também processos destrutivos que ocorrem na etapa de tratamento
biológico (lodos ativados). Tais tratamentos, apesar da sua eficiência relativamente
elevada com aproximadamente 80 % de remoção da carga de corantes e de material
particulado, apresentam uma geração de lodo onde os corantes que foram
adsorvidos não podem ser reaproveitados (KUNZ et al., 2002).
1.6 Aspectos dos corantes relacionados à poluição
A poluição visual dos corpos de água por efluentes da indústria têxtil ou por
corantes presentes em esgotos domésticos não é um problema apenas estético, já
que pode afetar o processo de fotossíntese devido à ocorrência da diminuição da
transparência da água o que dificulta a entrada dos raios solares (KUNZ et al.,
2002).
Esta cor está associada à presença de determinadas estruturas na molécula
dos corantes. No caso de azo corantes, estes apresentam moléculas com duas
21
partes principais, uma é parte da molécula que se liga à fibra têxtil e a outra é o
grupo cromóforo, que pode apresentar um ou mais grupamentos -N=N- ligados a
sistemas aromáticos, apresentado na figura 5. O cromóforo corresponde à parte da
molécula orgânica capaz de absorver luz seletivamente e apresenta como principal
característica um sistema de dupla ligação conjugada (por exemplo, C=C, C=O,
N=N, etc), responsável pela absorção molecular. Quando estes cromóforos
estiverem ligados a alguns grupos saturados, verifica-se que ocorre alteração do
comprimento de onda além de alterações na intensidade de absorção. O conjunto
formado por cromóforo e grupos saturados é denominado como auxócromo, com
tendência a ser polar, o que aumenta a polaridade do corante e, conseqüentemente,
sua solubilidade em água (ZOLLINGER, 1991).
Os azo corantes são os corantes sintéticos mais liberados no meio ambiente
por indústrias têxteis, químicas e farmacêuticas (DOS SANTOS, 2005).
Figura 5 – Exemplo de estrutura química de azo corante, em destaque o grupo azo (-N=N-)
(Fonte: KUNZ et al., 2002).
A entrada de corantes no meio ambiente ocorre basicamente por quatro
vias, ou seja, através de emissões ou descargas de efluentes nos processamentos
rotineiros, do descarte de sobras e resíduos dos processos, de embalagens usadas
22
e de eliminação acidental (BALAN, 2002). Uma vez contaminando o meio, os
corantes que são xenobióticos, podem causar toxicidade aos organismos aquáticos
(KUMAR et al., 2006, DOS SANTOS et al., 2005).
1.6.1 Toxicidade de corantes azo e antraquinona
A toxicidade de produtos da degradação de corantes cuja estrutura química
é do tipo azo é atribuída à formação de aminas aromáticas durante a quebra do
corante por redução química ou enzimática (Figura 6). Em sua estrutura as aminas
aromáticas apresentam um ou mais anéis aromáticos com um ou mais radicais
amino, além de terem sido consideradas como sendo potencialmente carcinogênicas
e genotóxicas, causando toxicidade para a vida aquática e para humanos (OH et al.,
1997; PIELESZ et al., 2002; PINHEIRO; TOURAUD; THOMAS, 2004).
Ar – NH
2
Diazotização Ar - N
2
+
Cl
-
Acoplamento Ar - N=N- Ar’
Amina Aromática HCl, NaNO
2
Sal de diazônio Ar’ – H Azo Corante
Par da ligação
Clivagem Redutiva
Ar- N=N- Ar’ Clivagem do grupo azo Ar- NH
2
+ Ar’ – NH
2
Azo Corante Redução química ou enzimática Aminas Aromáticas
Figura 6 – Síntese de azo corantes e formação de aminas aromáticas após clivagem
redutiva química ou enzimática (modificado de OH et al., 1997).
23
Na figura 7 é apresentado um exemplo de amina aromática (benzidina)
derivada da degradação em condições anaerobióticas de um corante azo banido
pela Comissão Européia. Os azo corantes e seus derivados podem estar presentes
em brinquedos, roupas e até na água. Desta maneira, a via oral e a absorção
dérmica são as principais vias de exposição de humanos a azo corantes e seus
produtos de degradação (AHLSTRÖM; ESKILSSON; BJÖRKLUND, 2005). É
importante ressaltar que a benzidina foi considerada carcinogênica para humanos
em relatório da International Agency for Research on Cancer (IARC), assim como
alguns metais e outros compostos derivados de azo corantes (IARC, 1972, 1980,
1990; PINHEIRO; TOURAUD; THOMAS, 2004).
Redução química ou
enzimática do azo corante
benzidina
Figura 7 – Exemplo da redução de um azo corante banido (ácido preto 077) em uma amina
carcinogênica (benzidina) (modificado de AHLSTRÖM; ESKILSSON; BJÖRKLUND, 2005).
A concentração máxima permitida de benzidina para águas doces da classe
I é de 0,001 µg.L
-1
para rios cujas águas sejam captadas para consumo humano.
Para rios nos quais haja pesca ou cultivo de organismos para consumo é de 0,0002
24
µg.L
-1
. A classe I é constituída por rios cujas águas são destinadas ao
abastecimento público tratada apenas com desinfecção (CONAMA, 2005).
Bastian, Santos e Ferrari (2001) mencionam uma lista inclusa em um guia de
prevenção à poluição para as indústrias têxteis, onde são apresentados alguns dos
principais azo corantes que possuem a base benzidina, e também foram citados
vários corantes básicos, ácidos, diretos, mordentes, azóicos e dispersos. Tal lista
constitui motivo de preocupação, já que estes corantes ainda são utilizados nas
empresas, embora tenham sido banidos (BROWN; HAMBURGER, 1987; WEBER;
WOLFE, 1987; SPONZA; IŞIK, 2005). Isto é agravado ao considerar-se que, nos
efluentes gerados por estas empresas em condições de anaerobiose, formam-se as
aminas aromáticas carcinogênicas, as quais se acumulam por não sofrerem
degradação (BROWN; LABOUREUR, 1983; FIELD et al., 1995). Desta forma, o
acúmulo de benzidina nos sedimentos de locais onde se situam as plantas de
tratamento de efluentes torna tais sedimentos potencialmente contaminantes para os
ecossistemas aquáticos (SPONZA; IŞIK, 2005). Por outro lado, estudos indicam que
a maioria das aminas aromáticas é degradada em condições aeróbicas ou em
reatores combinados anaeróbicos/aeróbicos (IŞIK; SPONZA, 2003, 2004;
PINHEIRO; TOURAUD; THOMAS, 2004; SPONZA; IŞIK, 2005; SUPAKA et al.,
2004). O uso destes corantes que geram poluentes deve ser sujeito a regras, além
de haver um tratamento mais adequado dos efluentes gerados de maneira a
promover a detoxificação dos mesmos (SPONZA; IŞIK, 2005), principalmente
quando se tem em mente que em vários países justifica-se o uso dos mesmos, em
função dos baixos custos e eficiência no tingimento (SNYDERWINE et al., 2002).
25
Infelizmente, não apenas os azo corantes são motivos de preocupação, pois
em estudo recente no qual foram empregados corantes do tipo antraquinona,
verificou-se toxicidade no produto de sua degradação em condições anaeróbicas. O
tratamento consistiu na exposição do efluente têxtil e do corante em bioreatores
mantidos em condições anaerobióticas mesófilas (30
o
C) e termófilas (55
o
C). Houve
descoloração, tanto de efluente de indústria têxtil quanto de um corante do tipo
antraquinona denominado como reativo azul 19. Porém, esta descoloração foi total
apenas a 55
o
C. Nestas condições o corante apresentou toxicidade uma vez que
houve redução de 50 % na atividade dos microrganismos metanogênicos presentes
no lodo. No entanto, não foram afetados os microrganismos oxidantes de glicose
incluindo os acetogênicos e os fermentadores formadores de propionato, de butirato
e de butanol. Em ensaios complementares, empregando-se cepas previamente
expostas ao corante; verificou-se que mesmo após a remoção do corante do meio
manteve-se a inibição aos microrganismos indicando a irreversibilidade da toxicidade
causada pela exposição preliminar (DOS SANTOS, 2005; DOS SANTOS et al.,
2005).
A toxicidade dos corantes pode estar relacionada também a presença de
metais em sua estrutura química. Por esta razão, recomenda-se que estes sejam
evitados ou substituídos por corantes que não causem danos aos organismos
expostos. Na tabela 2 são apresentados alguns dos corantes ácidos, diretos e
reativos que possuem metais associados em sua estrutura química (BASTIAN;
SANTOS; FERRARI, 2001).
26
Tabela 2 – Relação de corantes que apresentam metais na estrutura molecular (BASTIAN;
SANTOS; FERRARI, 2001; ZOLLINGER, 1991).
Corante Metal
Azul Ingraim 5
Azul Vat (à cuba) 29
Cobalto
Azul Ingraim 14 Níquel
Azul Ácido 249; Azul Direto 86, 87 e 218;
Azul Ingraim 1, 13; Azul Reativo 7, 17
Azul Solvente 24, 25, 55;
Verde Ingraim 3
Vermelho direto 180
Cobre
1.7 Bioindicadores utilizados na avaliação de toxicidade de efluentes têxteis
A obrigatoriedade da realizacão de testes de toxicidade utilizando
organismos bioindicadores garante o fornecimento de informações imprescindíveis
sobre a qualidade do efluente a ser lançado no corpo receptor, cujas características
físico-químicas e biológicas devem ser respeitadas (CONAMA, 2005).
O monitoramento utilizando os bioindicadores, ou biomonitoramento,
possibilita avaliar a qualidade das águas superficiais que recebem efluentes
industriais. Com esta abordagem, busca-se oferecer mais informações sobre os
impactos ocasionados nos organismos pelas tecnologias de produção empregadas
e, desta forma, estimular a mudança de tecnologia para uma nova, na qual sejam
produzidos materiais não-poluentes. Neste contexto, a Biotecnologia Ambiental se
insere com vantagens, contribuindo para manter o ambiente limpo através da
remediação e do biomonitoramento de todos os tipos de efluentes industriais
(GAVRILESCU; CHISTI, 2005).
27
Além disto, a avaliação de efluentes através de análises químicas é
incompleta, uma vez que nada informam a respeito do efeito tóxico provocado por
substâncias presentes nos efluentes (SCHLENK, 1999). De fato, as análises
químicas devem ser complementadas com ensaios ecotoxicológicos para se
determinar a qualidade de efluentes a serem lançados em corpos de água de
superfície (CONAMA, 2005). Entre os organismos utilizados destacam-se Vibrio
fischeri, Daphnia magna, Danio rerio (KNIE; LOPES, 2004) e Allium cepa
(ARAMBASIC; BJELIC; SUBAKOV, 1995).
1.7.1 Vibrio fischeri
A bactéria bioluminescente Vibrio fischeri (Beijerinck, 1889) Lehmann &
Newmann, 1896 (Proteobacteria, Ordem Vibrionales, Família Vibrionaceae), é gram-
negativa. Este microrganismo heterotrófico apresenta distribuição mundial e pode
ser encontrado como simbionte em várias espécies de lulas e peixes, como
patógeno de invertebrados e como saprófito de vida livre, desenvolvendo-se sobre
matéria orgânica dissolvida ou particulada presente no mar (
WILLIAM MYRON
KECK
FOUNDATION, 2002). São anaeróbios facultativos que emitem luz em
condições ambientais favoráveis (KNIE; LOPES, 2004).
A variação de bioluminescência emitida por V. fischeri que são simbiontes de
lulas (Euprymna scolopes) foi descrita por Boettcher e Ruby (1990). Segundo estes
autores a emissão de luminescência ocorre devido à ação de um grupo de genes
denominado como lux operon, que tem sido utilizado em inúmeras aplicações
28
biotecnológicas associadas ao monitoramento, devido ao fato de que a produção de
luz pode ser controlada sob condições experimentais e ligada a uma condição
ambiental específica.
Os ensaios com bactérias bioluminescentes apresentam algumas
vantagens, já que podem ser realizados com pequeno volume de amostras de água
doce ou salina e são relativamente fáceis de executar. Além disso, a rapidez na
obtenção dos resultados, após 30 min de exposição, permite uma resposta rápida
em casos de acidentes ambientais. Como as bactérias podem ser mantidas
congeladas ou liofilizadas, isto reduz os custos (KNIE; LOPES, 2004).
Em estudos realizados por Ledakowicz, Solecka e Zylla (2001), verificou-se
a toxicidade de efluente têxtil contendo corante antraquinona, detergente aniônico e
amaciante, antes e após o efluente ser tratado através de processos avançados de
oxidação, utilizando como organismo bioindicador V. fischeri. Estas bactérias
também foram utilizadas para verificar a toxicidade aguda de efluentes de uma
indústria têxtil tratados e não tratados (BAPTISTA et al., 2002), e de chorume de
aterro sanitário (SILVA; DEZOTTI; SANT’ANNA JÚNIOR, 2004).
Anualmente, as empresas brasileiras potencialmente poluidoras, além de
efetuarem ensaios ecotoxicológicos agudos com bactérias bioluminescentes, devem
realizar ensaios agudos com Daphnia magna, utilizando os efluentes finais gerados
na estação de tratamento de efluentes que serão lançados no meio ambiente, de
maneira complementar as análises físico-químicas (CONAMA, 2005).
29
1.7.2 Artemia sp
Outro importante organismo bioindicador que tem sido alvo de estudos são os
microcrustáceos zooplanctônicos de ambientes de águas salgadas representados
por várias espécies pertencentes ao gênero Artemia Leach 1819 (Classe Crustacea,
Ordem Anostraca, Família Artemiidae). O nome específico Artemia salina Linnaeus
1758, já não é mais válido taxonômicamente devendo-se empregar somente Artemia
sp no caso de não identificação da espécie (SORGELOOS et al., 1986); embora A.
salina ainda seja empregado por alguns autores (EL-NAGGAR; EL-AASAR;
BARAKAT, 2004; SILVA; DEZOTTI; SANT’ANNA JÚNIOR, 2004).
Estes microcrustáceos são fontes significativas de alimento para
invertebrados aquáticos e para peixes, por isso são ambientalmente importantes
(SORGELOOS et al., 1986). O emprego destes organismos em bioensaios deve-se
ao fato dos mesmos apresentarem distribuição cosmopolita; possuirem cistos de
dormência e, principalmente, apresentarem fácil manutenção em laboratório
(BARAHONA; SÁNCHES-FORTÚN, 1999). Outra vantagem consiste no fato da
eclosão ocorrer com organismos apresentando idade similar, além de mínimas
variações nas condições fisiológicas e genéticas (PERSOONE et al., 1980).
O método baseia-se na verificação da imobilidade dos náuplios quando
expostos às soluções de diferentes compostos. Entre as vantagens do teste
destacam-se o baixo custo, a rapidez e a simplicidade (MEYER et al., 1982), assim
como a sensibilidade e possibilidade de realização de testes com muitas substâncias
e com individuos de diferentes idades ao mesmo tempo (BARAHONA; SÁNCHES-
FORTÚN, 1996; FORTÚN et al., 1997).
30
Por outro lado, para realizar estudos mais completos de toxicidade aguda de
efluentes, devem ser utilizados organismos de diferentes níveis tróficos,
principalmente peixes (BAPTISTA, 2001). Dentre estes, a espécie Danio rerio tem
sido muito utilizada por mostrar sensibilidade a diferentes contaminantes ambientais
(KNIE; LOPES, 2004).
1.7.3 Daphnia magna
Os microcrustáceos do plâncton de água doce Daphnia magna Straus, 1820
e Daphnia similis Straus, 1820 (Cladocera, Crustacea), vulgarmente conhecidos
como pulgas-d’água são recomendados para efetuarem a avaliação da toxicidade
aguda de amostras de efluentes líquidos, águas continentais superficiais ou
subterrâneas e substâncias químicas solúveis ou dispersas em água (ABNT, 2003).
O método consiste na exposição de indivíduos jovens (neonatos) de D.
magna por períodos de 24 a 48 h (teste agudo), a várias diluições de uma amostra.
Ao término do tempo, são verificados os seus efeitos sobre a capacidade natatória
(mobilidade) dos organismos (KNIE; LOPES, 2004).
O método apresenta algumas vantagens, entre as quais o fato dos
organismos apresentarem variabilidade genética mínima, o que assegura alguma
uniformidade de respostas dos ensaios. Seu manuseio é simples e a manutenção
em aquários sob condições controladas facilita a cultura no laboratório. A espécie é
sensível a uma ampla gama de compostos químicos nocivos além de se adaptar
31
bem a ensaios estáticos, semi-estáticos e de fluxo contínuo. Também é reconhecida
internacionalmente como organismo-teste há muito tempo. E finalmente, os ciclos de
vida e reprodutivo são suficientemente curtos, permitindo seu uso em testes crônicos
(ABNT, 2003; KNIE; LOPES, 2004).
Por intermédio de teste de toxicidade utilizando o organismo-teste D. magna,
verificou-se que um efluente têxtil sintético contendo azo corantes diretos apresentou
100 % de inibição sobre os microcrustáceos em todas as diluições testadas. A
toxicidade manteve-se mesmo após tratamento em reator anaeróbico. Porém, após
o tratamento aeróbico, a toxicidade foi reduzida. Este teste de toxicidade
demonstrou que a degradação anaeróbica de azo corantes gerou metabólitos
tóxicos para os microcrustáceos. Como a toxicidade foi eliminada após o tratamento
aeróbico, houve um indício de que os produtos que causaram toxicidade aos
microcrustáceos foram parcialmente degradados sob condições aeróbicas
(SPONZA; IŞIK, 2005).
1.7.4 Danio rerio
Uma espécie animal que é reconhecida internacionalmente como adequada
para testes ecotoxicológicos é um peixe tropical de água doce, originário da Ásia, o
Danio rerio Hamilton-Buchanan, 1822 (Pisces, Ordem Cypriniformes, Família
Cyprinidae), que é popularmente conhecida como zebrafish ou paulistinha (KNIE;
LOPES, 2004). Alguns autores referem-se a esta espécie com Brachidanio rerio,
32
porém, esta denominação hoje não é mais aceita (INTEGRATED TAXONOMIC
INFORMATION SYSTEM – ITIS, 2005).
Estes peixes são bentopelágicos onívoros e muito ativos, vivem em média
três anos e possuem um comprimento máximo de 5 cm (KNIE; LOPES, 2004). As
fêmeas são maiores do que os machos, a espécie pode ser encontrada em diversos
habitats, desde rios e riachos com águas calmas até águas paradas, como campos
de cultivo de arroz (FISH BASE, 2005).
D. rerio tem sido amplamente empregado em diversos países como
organismo bioindicador em função de estar comercialmente disponível; apresentar
cultivo e manutenção em laboratório relativamente simples; suportar grandes
variações de temperatura, de pH e dureza da água; além de demonstrar
sensibilidade satisfatória para um grande leque de substâncias químicas (KNIE;
LOPES, 2004).
1.7.5 Allium cepa
A espécie Allium cepa Lineu foi classificada anteriormente dentro da Família
Liliaceae (BRASIL, 1992) e atualmente está incluída na Família Alliaceae, dentro da
Ordem Liliales. Esta espécie tem sido utilizada em ensaios toxicológicos que
consistem em expôr a base de bulbos às substâncias poluentes ou aos efluentes
para se efetuar o monitoramento da toxicidade dos mesmos (CHANDRA et al., 2005;
FISKESJO, 1988, 1993).
33
O teste de elongamento de raízes é simples, rápido, de fácil execução e tem
sido aplicado no biomonitoramento da genotoxicidade causada por contaminantes
ambientais (GRANT, 1982; CHANDRA et al., 2005), assim como para a verificação
dos efeitos tóxicos causados pela exposição de meristemas das raízes dos bulbos
ao chorume de resíduos de curtumes (CHANDRA; GUPTA, 2002).
Por outro lado, através da exposição de sementes pode-se verificar a
fitotoxicidade de substâncias ou de efluentes. Este método consiste na exposição de
sementes, em substrato sólido umedecido com a substância que se deseja testar
para verificar a porcentagem de germinação, bem como o vigor no crescimento da
raiz das plântulas (TÍQUIA; TAM; HODGKISS, 1996). Trata-se de uma técnica
simples, rápida, segura e de fácil reprodução, além de permitir a avaliação de danos
causados por substâncias tóxicas (WANG; KETURY, 1990).
1.8 Biomarcadores no biomonitoramento
Além de testes de avaliação toxicológica aguda, obrigatórios pela legislação,
fazem-se necessários alguns outros ensaios biológicos que permitem uma avaliação
mais detalhada e específica da real contaminação ambiental e dos potenciais riscos
para a população de organismos expostos. O monitoramento biológico de exposição
permite que sejam estabelecidos limites ou níveis de ação, os quais devem ser
determinados com base nas relações de resposta entre a concentração/dose e os
efeitos observáveis nos ensaios. Dentro deste contexto os biomarcadores de
34
exposição e de efeito são ferramentas úteis no monitoramento ambiental (MUTTI,
1999).
Desta forma, o monitoramento biológico ou biomonitoramento envolve a
mensuração periódica de biomarcador de exposição. Este pode ser definido como
“uma substância exógena, seu metabólito ou o produto da interação entre um agente
xenobiótico e alguma molécula ou célula alvo, que pode ser medido em um
compartimento situado no organismo” (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1987).
Portanto, este tipo de biomonitoramento permite verificar após a exposição
às substâncias químicas o nível de absorção, de transformação em metabólitos
ativos e de acumulação em um órgão, tecido ou célula-alvo (MUTTI, 1999), ou seja,
os biomarcadores de exposição permitem uma estimativa da concentração interna
ou a biodisponibilidade de um xenobiótico particular ou do seu metabólito em um
organismo. São exemplos de biomarcadores de exposição: a indução do sistema
enzimático citocromo CYP450, determinada pela exposição aos hidrocarbonetos
aromáticos planares; os aumentos nos níveis de vitelogenina, resultantes da
estimulação por fitoestrógenos presentes em efluentes de indústrias de papel e
celulose; e a formação de aductos específicos de DNA, pela exposição aos
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) (SCHLENK, 1999).
Também devem ser estudados os biomarcadores de efeito, que foram
definidos como “uma substância fisiológica ou outra alteração dentro de um
organismo, que possa ser mensurável e que, dependendo de sua magnitude, possa
ser reconhecida como um risco real ou potencial de prejuízo à saúde ou de causar
doença” (NATIONAL RESEARCH COUNCIL, 1989; MUTTI, 1999). São
considerados biomarcadores de efeito a fragmentação do DNA; as aberrações
35
cromossômicas; a ocorrência de micronúcleos e a lipoperoxidação além de outros
índices de estresse oxidativo (ADAMS et al., 1989).
Espera-se que a verificação destes biomarcadores torne possível o
reconhecimento das modificações iniciais que precedem danos progressivos
estruturais ou funcionais ao nível molecular, celular e tecidual. Esta estratégia
baseia-se na identificação de eventos bioquímicos precoces e reversíveis, que sejam
sensíveis e também indicadores de exposição específicos (MUTTI, 1999;
SILBERGELD, 1993).
Como os biomarcadores podem detectar precocemente efeitos adversos de
agentes tóxicos e, principalmente, tendo em vista que muitos efeitos subletais
podem ocorrer sem necessariamente resultar na morte do organismo, tornou-se
relevante utilizar ensaios subletais (ALMEIDA et al., 2002).
Tal detecção precoce de efeitos adversos pode ser possível através da
realização de ensaios subletais nos quais podem ser verificados danos ao DNA
através do teste cometa (LEMOS et al., 2005).
1.8.1 Teste cometa
O teste cometa é um método confiável, relativamente barato e de fácil
execução (LEMOS et al., 2005). Pode ser efetuado utilizando-se diferentes tecidos,
porém, pela praticidade utilizam-se os eritrócitos (LEMOS et al., 2005; VAN DER
OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
36
O teste cometa permite também uma clara distinção entre a variabilidade
natural e aquela induzida pelo estresse causado pelo contaminante que apresentar
genotoxicidade (LEMOS et al., 2005). O dano genotóxico verificado em cada célula é
detectado através da extensão da migração de fragmentos de DNA submetidos a um
campo elétrico. Estes fragmentos são quebras simples ou duplas no DNA, causadas
pelas substâncias genotóxicas. Como apresentam tamanhos distintos, formam uma
imagem que lembra um cometa - daí a denominação do teste. O comprimento da
cauda reflete a extensão do dano causado ao núcleo da célula e pode ser
comparado com uma célula intacta (DEVENTER, 1996; GONTIJO; TICE, 2003).
Este é um método citogenético no qual também pode ser empregado o
corante nitrato de prata que permite uso de microscopia óptica convencional,
apresentando um nível de sensibilidade similar ao método empregando brometo de
etídeo. Este método requer o uso de microscopia de fluorescência, além de cuidados
muito maiores com a segurança química por tratar-se de substância genotóxica
(NADIN; VARGAS-ROIG; CIOCCA, 2001).
É importante observar que os resultados do teste cometa são concordantes
com aqueles obtidos em outros testes de genotoxicidade nos quais é possível
verificar a indução de dano ao DNA, como os testes de aberrações cromossômicas e
teste de micronúcleos (MONTEIH; VANSTONE, 1995; LEMOS et al., 2005).
Através do teste cometa pode-se efetuar a mensuração de quebras simples
ou duplas, assim como sítios álcali lábeis no DNA. Já o teste de micronúcleos
elucida danos citogenéticos ao detectar alterações secundárias no DNA, como as
deleções cromossômicas (DIEKMANN et al., 2004).
37
1.8.2 Teste de micronúcleos
Em peixes, dentre os biomarcadores de genotoxicidade, destaca-se o teste
de micronúcleos (VAN DER OOST; BEYER; VERMEULEN, 2003).
O teste de micronúcleos pode ser aplicado em qualquer população de
células que esteja em divisão celular. Este ensaio foi utilizado no monitoramento do
potencial genotóxico de diferentes substâncias e de misturas complexas, como
efluentes têxteis, tanto em laboratório quanto em campo (BUENO, 2000; ÇAVAS;
ERGENE-GÖZÜKARA, 2003, 2005; ODEIGAH; OSANYIPEJU, 1995).
Bueno (2000) efetuou um biomonitoramento in situ com peixes marinhos
(Geophagus brasiliensis) não tendo encontrado diferenças significativas nos animais
coletados em sítio referência e nos animais do local poluído utilizando como
biomarcador citogenético a presença de micronúcleos em células.
Knopper e colaboradores (2005) encontraram diferenças significativas entre
as freqüências de micronúcleos de peixes da espécie Microtus pennsylvanicus, que
foram coletados em sítio referência e em rios contaminados com pesticidas
organoclorados e metais como mercúrio, cádmio e chumbo.
Juntamente com a ocorrência de micronúcleos, a lipoperoxidação é
considerada como um exemplo de biomarcador de efeito (ADAMS et al., 1989).
38
1.8.3 Lipoperoxidação de membranas celulares
A lipoperoxidação é um processo induzido por espécies reativas de oxigênio
(EROs), que podem reagir com biomoléculas tais como proteínas, lipídios, ácidos
nucléicos e carboidratos (MEAGHER; FITZGERALD, 2000). Nas membranas
celulares, além das proteínas, existem fosfolipídios em abundância. Estes
compostos, principalmente os ácidos graxos poliinsaturados, são alvos endógenos
facilmente acessíveis ao ataque dos radicais livres formados no metabolismo celular.
Ao longo deste processo formam-se novos radicais livres e, conseqüentemente, a
lipoperoxidação pode levar à formação de radicais livres em cadeia (ZWART et al.,
1999).
Em função das conseqüências resultantes deste processo de ataque
oxidativo para o metabolismo celular e, principalmente pela precisão da resposta, a
lipoperoxidação foi considerada como um biomarcador adequado para determinar os
danos oxidativos às membranas (LIVINGSTONE, 2001). Benassi (2004) relacionou a
toxicidade de efluentes ricos em metais com a indução do estresse oxidativo em
tilápias (Oreochromis niloticus). Este, por sua vez, causou a lipoperoxidação das
membranas celulares que foi verificada através da determinação das espécies
reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS), e também levou às alterações dos níveis
das defesas enzimáticas e não enzimáticas.
39
1.8.4 Defesas antioxidantes
A toxicidade de poluentes pode ser determinada através da verificação de
alterações nas defesas antioxidantes. Estas representam um mecanismo de defesa
celular para combater a toxicidade das EROs (WILHELM FILHO, 1996).
A glutationa (GSH) é um importante antioxidante que neutraliza diretamente
os metabólitos reativos. Trata-se do principal tiol não protéico associado a uma
variedade de funções celulares, entre as quais a detoxificação através da
conjugação com intermediários eletrofílicos, principalmente via atividade da enzima
glutationa S-transferase (GST) na fase II da biotransformação (GALLAGHER; DI
GIULIO, 1992). Este tiol também apresenta a atividade “scavenger” de radicais
livres, é cofator de enzimas essenciais e atua na defesa contra moléculas oxidantes
e xenobióticos potencialmente perigosos (PEÑA et al., 2000).
O sistema de defesa antioxidante também conta com outras substâncias
exógenas tais como α-tocoferol (principal componente da vitamina E), β-caroteno,
ascorbato (vitamina C), além das endógenas como a glutationa (GSH) e o ácido
úrico (urato) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1998).
Entre os biomarcadores associados com as defesas antioxidantes
enzimáticas, merecem destaque as enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa
S-transferase (GST) e catalase (CAT), entre outras (PENG; JONES; WATSON,
2000).
A superóxido dismutase (SOD) é uma metaloenzima considerada uma das
mais importantes defesas antioxidantes na neutralização das EROs, pois são
40
responsáveis pela conversão do O
2
•-
em H
2
O
2
e O
2
(HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1998).
Outra importante enzima que apresenta atividade antioxidante é a catalase
(CAT) que está presente na maioria das células eucarióticas e procarióticas aeróbias
onde converte o peróxido de hidrogênio em água. Nos animais, embora esta enzima
esteja presente na maioria dos órgãos, está concentrada principalmente no fígado e
nos eritrócitos. Estruturalmente, a CAT é composta de quatro subunidades protéicas,
cada uma contendo um grupo heme [Fe (III) – protoporfirina] ligado ao sítio ativo.
Ligando-se a cada subunidade da enzima encontra-se uma molécula de NADPH.
Estas atuam na estabilidade da estrutura enzimática (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1998).
As participações das enzimas SOD e CAT são importantes na neutralização
das EROs, como parte da resposta de proteção contra o estresse oxidativo (DI
GIULIO et al., 1995). A ação das enzimas SOD e CAT pode ser observada nas
equações apresentadas na figura 8.
Os tecidos e órgãos podem apresentar diferentes níveis de defesa
antioxidativa (WILHELM FILHO; GIULIVI; BOVERIS, 1993). Estes níveis dependem
do organismo e das circunstâncias envolvidas como hábitos, idade, capacidade de
termorregulação, habitat, taxa metabólica e estado nutricional (WILHELM FILHO et
al., 2001).
41
2O
2
-
+ 2H
+
H
2
O
2
+ O
2
2H
2
O
2
2H
2
O + O
2
[
SOD
]
[
CAT
]
Figura 8 – Esquema com equações das reações de neutralização das EROs, nas quais
participam as enzimas SOD e CAT (Adaptada de DI GIULIO et al., 1995).
Vários trabalhos já publicados sobre o uso dos biomarcadores no
diagnóstico de agentes poluidores, bem como no acompanhamento dos processos
de remediação e tratamento de efluentes, revelaram que os mesmos são
ferramentas bastante úteis e sensíveis. Desta forma, a determinação dos níveis de
TBARS e GSH, do dano ao DNA pelo teste cometa e a verificação da indução de
enzimas citoprotetivas (SOD, CAT e GST), são fundamentais para a avaliação dos
riscos associados ao lançamento de substâncias ou de efluentes no ambiente
(ANGUIANO; MONTAGNA; PÉCHEN DE D’ANGELO, 2003; BENASSI, 2004; LIMA
et al., 2006; WILHELM FILHO et al., 2001).
1.9 Novas alternativas de remoção de cor de corantes e de efluentes têxteis
Entre as formas de remoção de cor atualmente em estudo destacam-se os
processos físicos, que se baseiam fundamentalmente na sorção (absorção e/ou
adsorção) dos corantes em materiais sorventes/adsorventes, sendo apontados como
alternativas no processo de descoloração de efluentes (SALEN, 1995; KIMURA,
2001).
42
A adsorção é um dos processos físicos de tratamento mais utilizado para a
remoção de cor dos efluentes e corantes têxteis. Entre os materiais empregados
como adsorventes, o carvão ativo é um dos mais utilizados. Na atualidade, vários
materiais adsorventes alternativos têm sido empregados com sucesso, como no
caso da bentonita, que promoveu a remoção de cor de corantes catiônicos (TAHIR;
RAUF, in press), ou na remoção de cor do corante verde malaquita, através de
resíduos do processamento de juta (BANERJEE; DASTIDAR, 2005).
Em geral, nas estações de tratamento de efluentes têxteis são empregados
sistemas físico-químicos de coagulação e precipitação, seguidos de tratamento
biológico através de sistemas de lodos ativados (KUNZ et al., 2002). Nestes
tratamentos são usados agentes coagulantes que, através de interações químicas e
físicas, proporcionam a remoção de moléculas e de materiais em suspensão fina na
água através da formação de partículas maiores (flocos) que precipitam, podendo
então ser removidas por sedimentação e/ou filtração (SPINELLI, 2001). Alguns
sistemas utilizam os coagulantes inorgânicos (sulfato de alumínio e cloreto férrico),
ou os coagulantes orgânicos não biodegradáveis como polieletrólitos sintéticos
(SANIN, 1997), ou ainda coagulantes orgânicos biodegradáveis como o polieletrólito
quitosana (QTS), no qual o fenômeno de sorção (adsorção ou absorção) é o
responsável pela remoção dos compostos presentes em efluentes têxteis (KIMURA,
2001).
43
1.9.1 Uso de polieletrólitos em processos de adsorção
O uso de polieletrólitos no tratamento físico-químico tradicional, juntamente
com o sulfato de alumínio e resina, tem como objetivo promover a adsorção das
partículas que conferem cor ao efluente pelo polieletrólito, formando flocos que, após
serem direcionados para o decantador físico-químico, constituem a massa sólida do
decantador. Esta é lançada em um tanque de mistura, com adição de cal para
posterior passagem pelo filtro prensa e, no final, o lodo úmido será descartado em
aterro industrial (BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001).
1.9.1.1 Uso de quitosana em processos de adsorção
Considerado como uma nova alternativa biotecnológica, o uso de quitosana
no tratamento de efluentes industriais contendo íons metálicos baseia-se na
capacidade do biopolímero formar complexos com os metais Cu (II), Cd (II), Ni (II),
Pb (II) e Zn (II) (MUZZARELLI; WECKX; FILIPPINI, 1989; FÁVERE, 1994; VARMA;
DESHPANDE; KENNEDY, 2004). Este biopolímero é capaz também de adsorver os
corantes, o que permite a remoção de cores de efluentes provenientes de diferentes
etapas do processo têxtil (KIMURA, 2001).
A quitosana pode ser obtida quimicamente através da desacetilação da
quitina (Figura 9) em solução aquosa alcalina. Este polímero é reconhecidamente
44
não tóxico, além de não apresentar odor, ser biocompatível com tecidos animais e
enzimaticamente biodegradável (ZONG et al., 2000).
(a)
...
HO
OH
O
O
OH
HO
O
O
...
HO
OH
O
O
NHCOCH
3
NHCOCH
3
NHCOCH
3
(b)
...
HO
OH
O
O
OH
HO
O
O
...
HO
OH
O
O
NHCOCH
3
NH
2
NH
2
Figura 9 – Estrutura química dos biopolímeros quitina (a) e da quitosana (b) na qual o grupo
amino (-NH
2
) está destacado (Fonte: KIMURA, 2001).
A quitosana apresenta maior capacidade de adsorção em comparação com
a quitina, seu precursor de origem natural. Isto decorre da presença na quitosana de
um grande percentual de grupos amino livres, expostos durante o processo de
desacetilação (ONSOYEN; SKAUGRUD, 1990). Este polímero é solúvel em ácidos
orgânicos, tais como ácido acético, ácido fórmico, ácido lático, entre outros. Porém,
é insolúvel em ácido sulfúrico (VARMA; DESHPANDE; KENNEDY, 2004).
O potencial de aplicações biotecnológicas da quitosana pode ser estimado
quando se considera a versatilidade físico-química desse polímero natural, isto se
deve ao fato deste material ser facilmente modificado fisicamente. Podem ser
obtidas inúmeras formulações com várias possibilidades de aplicações da quitina e
da quitosana. A partir de ambas é possível serem obtidos fibras, filmes, géis,
membranas, pó, nanopartículas, cápsulas, microcápsulas e microesferas para serem
45
aplicados nos mais diversos campos (KIMURA, 2001; KUMAR, 2000; RHAZI et al.,
2002; VALENTINI et al., 2000). Podem ser empregadas na remoção de metais de
efluentes (BODDU et al., 2003), bem como na adsorção de corantes aniônicos
(CHIOU; HO; LI, 2004), corantes catiônicos (CHAO et al., 2004) ou corantes têxteis
(KIMURA et al., 2001).
Embora diferentes formas para o tratamento e remediação de efluentes
têxteis tenham sido apresentadas e continuem sendo sugeridas como formas
alternativas ou combinadas para efetivamente remover compostos químicos, a
maioria dos químicos especializados nos processos têxteis, não têm efetuado
paralelamente um estudo da toxicidade dos corantes (BAE; FREEMAN, in press).
Este fato torna-se particularmente importante quando se tem em mente que a
exposição aguda ou crônica de organismos pode levar a efeitos letais e subletais
(LIMA et al., 2006).
Ressaltando neste trabalho o enfoque biotecnológico, o mesmo foi
desenvolvido de maneira integrativa, dentro da definição do termo biotecnologia,
onde está explícita a utilização de sistemas biológicos em processos técnicos ou
industriais que, por sua vez, implica na integração de diferentes áreas como a
bioquímica, a química e a biologia, de modo a desenvolver o potencial total de cada
sistema. Este trabalho aponta os benefícios do uso de biopolímeros, bioindicadores
e de biomarcadores como ferramentas biotecnológicas em processo de tratamento
de efluentes industriais.
Desta forma, o presente trabalho teve como proposta a avaliação do
potencial remediador do polímero biodegradável quitosana sobre o efluente de
indústria têxtil, através da realização de ensaios ecotoxicológicos com bioindicadores
46
aquáticos e de ensaios toxicológicos com vegetais para determinar os possíveis
efeitos deletérios associados aos efluentes.
Por outro lado, buscou-se também demonstrar as vantagens do uso de
biomarcadores enzimáticos, de estresse oxidativo e citogenéticos, como ferramentas
efetivas na avaliação da capacidade de remediação da quitosana sobre o efluente
têxtil, levando em consideração que os parâmetros físico-químicos não fornecem
informações suficientes para tal avaliação. Além disso, como complemento, propôs-
se a redução do número de etapas e de materiais no processo de tratamento do
efluente.
Portanto, esta pesquisa representa um estudo avaliativo (preliminar) da
eficácia na remediação de efluente proveniente da indústria têxtil utilizando alguns
bioindicadores e biomarcadores de efeito e exposição.
47
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
• Avaliar a capacidade de remediação de efluentes de uma indústria têxtil por
quitosana comparativamente àquela realizada através de processos
microbiológicos e físico-químicos convencionais, utilizando diferentes
bioindicadores e biomarcadores de exposição e efeito.
2.2 Objetivos Específicos
• Selecionar a melhor formulação para remediação de efluente têxtil com
quitosana.
• Efetuar, em caráter preliminar, uma avaliação físico-química dos efluentes
não remediados e remediados.
• Avaliar a toxicidade aguda dos efluentes não remediados e remediados,
utilizando os bioindicadores Vibrio fischeri, Artemia sp e Daphnia magna.
• Avaliar a toxicidade subcrônica dos efluentes não remediados e remediados,
utilizando sementes e bulbos de Allium cepa.
• Avaliar a toxicidade aguda e subcrônica de efluentes não remediados e
remediados, utilizando o peixe Danio rerio.
• Avaliar a toxicidade subcrônica de efluentes não remediados e remediados,
utilizando biomarcadores de estresse oxidativo em D. rerio.
• Avaliar a genotoxicidade de efluentes não remediados e remediados,
utilizando teste cometa e micronúcleos em D. rerio.
48
3 METODOLOGIA
3.1 Considerações Gerais
O presente trabalho foi realizado em duas etapas:
• Etapa 1: seleção da formulação da quitosana para a remediação de efluente
têxtil.
• Etapa 2: remediação do efluente têxtil com a quitosana selecionada, e
monitoramento da remediação.
3.2. Materiais e Equipamentos
3.2.1 Reagentes gerais
Os reagentes: hidroxitolueno butilado (BHT); 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
(CDNB), 5,5’-ditiobis-2-ácido nitrobenzóico (DTNB), glutationa reduzida (GSH),
glicina, ácido tiobarbitúrico (TBA), triton X-100 e tris[hidroximetil] aminometano
(TRIS), foram adquiridos junto à Sigma Chemical Co. (St. Louis, U.S.A.). O tampão
fosfato com soro bovino fetal (PBS livre de Ca
2+
e Mg
2+
), as agaroses de ponto de
fusão baixo (LMPA - “low melting point agarose”) e de ponto de fusão normal (NMPA
- “normal melting point agarose”), foram obtidos da Gibco BRL (New York, USA);
ácido tricloroacético (TCA), citrato de sódio tribásico, fosfato de potássio dibásico,
butanol, dicromato de potássio, peróxido de hidrogênio, ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA), fuccina e verde malaquita, foram obtidos junto à
49
Vetec (São Paulo, Brasil); fosfato de sódio monobásico e fosfato de sódio dissódico
junto à Merck (São Paulo, Brasil). Todos os demais reagentes utilizados nos ensaios
foram de grau analítico.
A quitosana pulverizada utilizada como agente remediador no presente
estudo foi obtida junto à Empresa Purifarma (São Paulo, Brasil).
3.2.2 Equipamentos
Os principais equipamentos utilizados na realização deste trabalho são
abaixo listados:
Agitador magnético (Velp Scientifica)
Bomba peristáltica (Ismatec)
Centrífuga (Eppendorf)
Centríguga (FANEM)
Condutivímetro (Mettler Toledo, MC 226)
Espectrofotômetro UV-Vis (TECHCOMP, modelo 8500 II)
Espectrômetro de absorção atômica (Analyst 100 Perkin Elmer) com forno de grafite
(HGA 800 Perkin Elmer)
Espectrômetro de absorção atômica (VARIAN Spectra - AA-50)
Fonte de eletroforese horizontal (Consort, E844, 400 V – 400 mA)
Homogenizador Potter-Elvehjem (Glas-Col, modelo GKH)
Incubadora com agitação termostatizada minishaker (Marconi, MA 832)
50
Luminômetro (LUMISTOX
®
, DR. LANGE)
Luxímetro digital (Lutron, LX- 101)
Máquina fotográfica digital (Sony, Cyber-Shot; 3,2 megapixels)
Microscópio de campo invertido (Leica)
Microscópio eletrônico de varredura (modelo Philips XL 30)
Microscópio estereoscópico binocular (PZO)
Microscópio óptico (Nikon)
Oxímetro digital (Schott, modelo Gerate GMBH)
PHmetro (Micronal)
Paquímetro (Zaas Precision)
Regulador de fotoperíodo (Kienzle)
Titulador automático (Schott Geräte, modelo T 80/20)
Vórtex (Marconi, modelo MA 162)
3.3 Coleta das amostras de efluentes
Para a realização dos ensaios do presente trabalho, foram coletadas
amostras de efluentes de uma indústria têxtil situada no município de Blumenau/SC,
onde são produzidos tecidos de algodão. Foi coletada uma única amostra de
efluente têxtil bruto, não remediado, na entrada (100 L) e outra amostra na saída
(100 L) da estação de tratamento de efluentes da indústria têxtil. As amostras do
efluente têxtil não remediado (EB) e do remediado na estação de tratamento de
efluentes da empresa (ETE) foram acondicionadas em frascos de polietileno, e
congeladas até a realização dos ensaios.
51
3.4 Determinação do grau de desacetilação e morfologia da quitosana,
preparação das microesferas, solução de quitosana como agente de
coagulação e de quitosana pulverizada
3.4.1 Grau de desacetilação e morfologia
O grau de desacetilação da quitosana (% GD) ou a porcentagem de grupos
amino foi determinado por titulação condutimétrica empregando o condutivímetro
digital e um titulador automático, conforme o método proposto por Raymond; Morin e
Marchessault (1993). Uma amostra de 200 mg de quitosana foi transferida para um
béquer de 600 mL, contendo 450 mL de solução de NaCl (1mmol.L
-1
) e 5,0 mL de
HCl (1,0 mol.L
-1
). Após a dissolução do polímero, a titulação foi conduzida com a
adição de 0,5 mL de NaOH (0,1 mol.L
-1
) a cada 20 segundos, sob atmosfera de
nitrogênio. Esta titulação foi repetida por mais duas vezes.
Esta determinação foi efetuada no Laboratório QUITECH (Grupo de
Pesquisa em Quitina e Quitosana e Aplicações Tecnológicas) do Departamento de
Química da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), coordenado pelos
professores Valfredo T. de Fávere e Mauro C. M. Laranjeira.
A morfologia da superfície externa das partículas de quitosana foi analisada
empregando microscópio eletrônico de varredura (MEV). Para tanto, as amostras de
quitosana foram colocadas em suportes (estabes) do MEV, recobertas com ouro; e
micrografadas (tensão de 15 kV, sem padrão), conforme Kimura et al. (1999). Este
52
procedimento foi realizado no Laboratório de Materiais (LABMAT) do Centro
Tecnológico da UFSC.
3.4.2 Preparação das microesferas de quitosana (QTS1)
As microesferas de quitosana foram obtidas pelo método de inversão de
fases (STOLBERG et al., 1999). Uma solução de quitosana a 3 % (m/v) foi
preparada dissolvendo-se 3 g de quitosana em 100 mL de ácido acético (CH
3
COOH)
a 5 % (m/v). A solução viscosa obtida foi gotejada, com auxílio de uma bomba
peristáltica acoplada, em um banho contendo solução de NaOH (2,0 mol.L
-1
). As
microesferas gelificadas foram lavadas com água destilada para eliminar o NaOH
residual, até meio neutro, e secas a 60ºC em estufa até peso constante.
A morfologia da microesfera foi analisada de acordo com Kimura (2001)
empregando um microscópio eletrônico de varredura do Laboratório de Materiais
(LABMAT), do Centro Tecnológico da UFSC. O diâmetro médio das microesferas foi
determinado a partir da fotomicrografia de vinte microesferas reticuladas com
glutaraldeído 2,5 % (m/v) e lavadas com água destilada e com acetona, para retirar o
excesso de material reticulante, através da medida dos diâmetros dos eixos vertical
e horizontal de cada partícula (Figura 10), esta determinação foi efetuada no
Laboratório QUITECH (Grupo de Pesquisa em Quitina e Quitosana e Aplicações
Tecnológicas), do Departamento de Química da UFSC.
As microesferas (QTS1) sem reticulação foram utilizadas no procedimento
de remediação do efluente têxtil em estudo.
53
(a) (b)
Figura 10 – Fotomicrografia obtida em microscópio eletrônico de varredura de microsfera de
quitosana. (a) morfologia da superfície externa da microesfera (50 X), (b) detalhe da
superfície (8000 X) (imagens gentilmente cedidas por Dr
a
. Irene Y. Kimura e Dr. Valfredo T.
de Fávere).
3.4.3 Preparação da solução de quitosana em ácido acético (QTS2)
A formulação de quitosana solubilizada em ácido acético (QTS2) foi
preparada utilizando um agitador magnético e um béquer, dentro do qual se
acrescentou 1 g de quitosana solubilizada em 100 mL de CH
3
COOH a 1 % (v/v), por
1 h. O pH da solução foi corrigido com solução de CaO a 1 % (m/v), até a
neutralidade. Esta formulação de quitosana foi utilizada como coagulante no
procedimento de remediação do efluente EB.
3.4.4 Quitosana pulverizada (QTS3)
54
A quitosana pulverizada foi utilizada sem modificações, sendo acrescentada
diretamente ao efluente bruto, segundo formulações apresentadas no item 3.5.1.3.
3.5 Remediação dos efluentes
3.5.1 Etapa 1 – Seleção de formulação de quitosana para remediação de
efluente têxtil
Para a seleção da melhor formulação de quitosana foram realizados ensaios
preliminares com QTS1, QTS2 e QTS3.
3.5.1.1 Remediação com microsferas de quitosana (QTS1)
A remediação do efluente EB foi realizada conforme metodologia proposta
por Kimura (2001), com modificações. Eluiu-se o efluente EB através de uma coluna
cromatográfica de vidro com altura de 11 cm, diâmetro de 1,2 cm e empacotada com
2,1 g de QTS1. Uma bomba peristáltica foi acoplada ao sistema e manteve-se
constante o fluxo do efluente que passava pela coluna (1,1 mL.min
-1
).
55
O pH do efluente remediado por QTS1 foi monitorado durante todo o
processo através de um eletrodo colocado logo após a saída do efluente pela
coluna.
A determinação da cor em solução no efluente EB e remediado foi realizada
através de leitura espectrofotométrica da amostra, sem correção do pH, tendo-se
obtido o valor de absorbância máxima em 517 nm. A porcentagem de remoção da
cor foi calculada a partir da equação (1):
Remoção da cor (%) = 100 –
Abs QTS1 X 100 (1)
Abs EB
3.5.1.2 Remediação do efluente por coagulação/floculação da quitosana (QTS2)
A remediação do efluente EB foi realizada conforme metodologia proposta
por Kimura (2001), com modificações. O efluente EB (50 mL) foi adicionado em um
erlenmeyer contendo 100 mL da solução de QTS2, preparada com solução de ácido
acético 1 % e 1 g de quitosana pulverizada, a correção do pH até a neutralidade foi
efetuada com óxido de cálcio a 1 % para a precipitação do polímero.
O conjunto foi mantido em rotação máxima por 10 min, à temperatura
ambiente (25
o
C). Desligou-se o agitador magnético e aguardou-se 30 min para
sedimentação, em seguida separou-se o sobrenadante por centrifugação (2000 g, 5
min).
56
A determinação da cor em solução no efluente EB e remediado com QTS2
foi realizada através de leitura espectrofotométrica da amostra em 517 nm. A
porcentagem de remoção da cor foi calculada a partir da equação (2):
Remoção da cor (%) = 100 –
Abs QTS2 X 100 (2)
Abs EB
3.5.1.3 Remediação do efluente por adsorção em quitosana pulverizada (QTS3)
Para a seleção da formulação de quitosana pulverizada foram realizados
ensaios em batelada, acrescentando-se 20 mL do efluente têxtil EB em
erlenmeyeres nos quais, em seguida, foram adicionadas diferentes massas de
quitosana pulverizada (0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 e 1,0 g) denominadas como QTS
A
até
QTS
F
. Os conjuntos foram mantidos em incubação sob agitação a 25
o
C e 200 rpm,
sem ajuste de pH, por 24 h. Alíquotas foram centrifugadas (4000 g, 15 min) e
efetuou-se a leitura da absorbância dos efluentes remediados obtidos em
espectrofotômetro a 517 nm.
Calculou-se a porcentagem de remoção da cor conforme equação (3):
Remoção da cor (%) = 100 – Abs QTS
A-G
X 100 (3)
Abs EB
Após a verificação da formulação de quitosana que apresentou maior
porcentagem de remoção de cor, com menor consumo de quitosana, esta foi
selecionada para a remediação do efluente EB e recebeu a denominação QTS3.
57
Para a remediação do EB, foram acrescentados 250 mL deste em
erlenmeyer, contendo 3,75 g de quitosana pulverizada, na mesma proporção
utilizada para obter QTS3. A remediação foi efetuada em batelada, o conjunto foi
mantido em incubação sob agitação a 25
o
C e 200 rpm, sem ajuste de pH, por 24 h.
Alíquotas foram centrifugadas (4000 g, 15 min) e efetuou-se a leitura da absorbância
dos efluentes remediados obtidos em espectrofotômetro a 517 nm.
3.5.2 Análises físico-químicas dos efluentes não remediados e remediados
3.5.2.1 Determinação do pH
O pH foi medido a partir de alíquotas retiradas dos efluentes EB, ETE,
QTS1, QTS2 e QTS3. Para a leitura, por potenciometria, foi utilizado um pHmetro,
previamente calibrado com soluções padrões de pH 4,0 e 7,0.
3.5.2.2 Determinação da concentração de metais
A concentração de metais presentes nos efluentes estudados foi
determinada por espectrometria de absorção atômica, de acordo com American
Public Health Association (APHA) (1998). Para os metais chumbo e cádmio as
determinações foram realizadas por meio de espectrômetro de absorção atômica,
58
acoplado com forno de grafite. Estes ensaios foram realizados na Central de
Análises do Departamento de Química, da UFSC.
3.5.2.3 Determinação da condutividade
Para determinação da condutividade, foram utilizados 50 mL de água de
torneira aerada, e dos efluentes EB, ETE e QTS3, em 100 % de concentração. As
amostras foram mantidas em incubação com agitação termostatizada até atingirem a
temperatura de 25
o
C e imediatamente em seguida foi medida a condutividade,
nesta mesma temperatura com um condutivímetro digital calibrado com solução
padrão de KCl (0,745 g.L
-1
) para condutância de 1,42 mS. cm
-1
a 25
o
C.
3.5.2.4 Determinação da dureza
Para determinação da dureza foi utilizado o método de titulometria. Foi
utilizado um volume de 20 mL de água de torneira aerada e dos efluentes EB, ETE,
e QTS3 em 100 e 20 % de concentração, para realizar titulação com EDTA (0,02 M)
até a mudança de cor de vermelho-vinho para azul, utilizando-se o indicador
eriocromo-T. Antes de gotejar o indicador, para impedir que este fosse bloqueado
pelas pequenas quantidades de ferro presentes na amostra, foram acrescentados 10
mL de tampão NH
4
Cl / NH
4
OH (pH 10), conforme Fritz e Schenk Jr. (1969).
59
Após a adição do tampão, agitou-se a solução, adicionou-se 1 mL de
solução Na
2
S e 4 gotas do indicador eriocromo-T. Agitou-se o conjunto que adquiriu
cor vinho, em seguida procedeu-se à titulação com EDTA até o ponto de viragem
para a cor azul, quando foi anotado o volume de EDTA consumido. Para o efluente
EB em função da cor que apresentou, foi necessário efetuar-se uma diluição de 10
mL deste em 90 mL de água destilada.
O cálculo da dureza em termos de CaCO
3
(mg.L
-1
) foi realizado aplicando-se
a equação (4):
D={[M
EDTA
(mmoles/mL) X mL
EDTA
X PM CaCO
3
(mg/mmoles)]mL
amostra
} X 1000 mL.L
-1
(4)
D = [(M
EDTA
X mL
EDTA
X 100,09) / 100 mL] X 1000
Onde D = dureza da água em mg de CaCO
3
. L
-1
3.6 Avaliação da toxicidade aguda dos efluentes não remediados, e
remediados utilizando organismos bioindicadores
3.6.1 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp
Os ensaios de toxicidade aguda estáticos foram realizados conforme método
de Meyer et al. (1982), com modificações efetuadas segundo Gomes (1986). Cistos
de Artemia sp foram incubados por 24 h em solução de sal marinho sintético (30 g.
L
-1
), com aeração e iluminação constantes (500 lux) em sala climatizada mantida a
25 ºC. Após a eclosão dos cistos, as larvas foram transferidas para placas de
60
poliestireno para cultura de células. Em cada poço da placa foi adicionado 2 mL de
amostra dos efluentes EB, ETE, QTS1, QTS2 e QTS3 em diferentes diluições (100,
75, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, e 1,5 %), em solução de sal marinho sintético (30 g.L
-1
).
O controle negativo com sal marinho sintético (30 g.L
-1
) e o positivo com
dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) foram conduzidos paralelamente. Após 24 h de
exposição, sem alimentação, a 25
o
C e no claro, foi efetuada a contagem do número
de larvas imóveis em microscópio de campo invertido e a CE
50
foi calculada pela
análise probito, através do método matemático Trimmed Spearman-Karber
(HAMILTON et al., 1977), aplicando o software da Burlington Research-Inc. Para
cada concentração testada foram realizadas 3 replicatas com 10 larvas em cada.
3.6.2 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna
Os ensaios de toxicidade aguda com Daphnia magna foram realizados de
acordo com a norma da ABNT NBR 12713 (ABNT, 2003). Antes da análise da
toxicidade dos efluentes, os microcrustáceos passaram por um teste de
sensibilidade usando K
2
Cr
2
O
7
(1,75 mg.L
-1
), que teve por objetivo avaliar a qualidade
do lote das matrizes, conforme verificado por Baptista (2001).
Os ensaios de toxicidade aguda estáticos foram realizados em béqueres de
25 mL, em duplicatas para cada concentração, além dos controles negativos com
água de diluição. Em cada béquer foram colocados 10 microcrustáceos jovens,
apresentando entre 6 e 24 h de vida. Os efluentes EB, ETE, QTS1, QTS2 e QTS3
61
foram avaliados em diferentes diluições (100, 50, 25, 12,5 e 6,25 %). Os ensaios
foram mantidos a uma temperatura de 20
± 2 ºC em sala climatizada, no escuro e
sem alimentação. Após 24 e 48 h de exposição, os organismos imóveis foram
contados e a CE
50
foi calculada pela análise de probito através do método
matemático Trimmed Spearman-Karber (HAMILTON et al., 1977), usando o software
da Burlington Research-Inc. Os resultados foram apresentados também em termos
de fator de diluição (FD).
Segundo disposto na Portaria n
o
17 de 2002, o fator de diluição (FD)
“representa a primeira de uma série de diluições de uma amostra na qual não mais
se observam efeitos tóxicos agudos aos organismos-teste” (FATMA, 2002).
Estes ensaios foram realizados no Laboratório de Biologia e Biotecnologia
de Fungos, do Departamento de Bioquímica da UFSC, coordenado pelo Prof. Dr.
Carlos Henrique Lemos Soares.
3.7 Remediação e biomonitoramento dos efluentes
Para a escolha da melhor formulação de quitosana para remediação do
efluente têxtil em estudo foram utilizados os seguintes critérios:
a) Capacidade de remoção de cor do efluente conforme metodologia
apresentada nos itens 3.5.1.1, 3.5.1.2 e 3.5.1.3.
62
b) Capacidade de redução da toxicidade para os organismos indicadores
Artemia sp e D. magna, conforme metodologia apresentada nos itens 3.6.1 e
3.6.2.
A formulação QTS3 apresentou melhores resultados frente aos critérios
acima adotados, tendo desta forma sido selecionada para a continuidade dos
ensaios.
3.7.1 Etapa 2 – Remediação e biomonitoramento do efluente têxtil com a
quitosana selecionada (QTS3)
3.7.1.1 Remediação com QTS3
A remediação do efluente têxtil foi realizada conforme descrito no item
3.5.1.3, utilizando-se 0,3 g de quitosana pulverizada para cada 20 mL de efluente.
3.7.1.2 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade aguda
3.7.1.2.1 Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri
Os ensaios de toxicidade aguda empregando Vibrio fischeri foram realizados
utilizando os efluentes EB, ETE e QTS3 segundo a norma técnica ISO 11348-1 da
63
International Organization for Standardization (ISO) (1998) e a norma DIN 38412-34
do Deutsches Institut für Normung (DIN) (1993), para determinar a inibição da
bioluminescência e cálculo da CE
50
.
As cepas das bactérias liofilizadas da espécie V. fischeri pertencentes ao
lote U-013 da coleção da empresa Umwelt, de Blumenau; foram inoculadas em
duplicatas (n=10
6
unidades formadoras de colônias - UFC) em tubos contendo
solução salina (NaCl 2 %), e mantidos a 15 ± 1
o
C no termobloco. Imediatamente,
efetuou-se a primeira leitura da luminosidade no luminômetro e, em seguida, foi
introduzido um volume do efluente testado, de maneira a serem obtidas as diferentes
diluições do mesmo. Foi efetuada uma segunda leitura após um período de 30 min
e, somente então, foi possível determinar a porcentagem de inibição da
bioluminescência e o cálculo da CE
50
através de software específico Dr. Lange
LUMISsoft 4.
Foram analisadas as diluições 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,78; 0,39; 0,19
% que foram obtidas a partir do efluente EB; as diluições 80; 50; 33,33; 25 % obtidas
a partir do efluente ETE; e as diluições 80; 50; 33,33; 25 % a partir de QTS3, em
duplicatas.
Foram conduzidos ensaios de controle de sensibilidade das bactérias
bioluminescentes (V. fischeri) com densidade final da cultura principal 800 UNT
(unidades nefelométricas de turbidez), de acordo com norma ISO 11348-3 (ISO,
1998). Para tanto as bactérias foram expostas a Cr
6+
(na forma de K
2
Cr
2
O
7
), a Zn
2+
(na forma de ZnSO
4
.7H
2
O); e a 3,5-diclorofenol 6 mg.L
-1
. As determinações foram
realizadas em duplicatas, com medição após 30 min de exposição. Os ensaios de
controle de sensibilidade das cepas forneceram os resultados apresentados na
64
tabela 3. E os resultados de inibição de luminescência obtidos estão de acordo com
os valores estabelecidos nas normas ISO 11348-3 (1998) e DIN 38412 (1993), o que
demonstrou a sensibilidade do lote. Estes ensaios foram realizados no Laboratório
da UMWELT Ltda Assessoria Ambiental, situado em Blumenau; coordenado pelo Dr.
Jörg Zaar, da Universidade Regional de Blumenau (FURB).
Tabela 3 – Ensaios de sensibilidade de bactérias bioluminescentes (Vibrio fischeri) expostas
a Cr
6+
(na forma de K
2
Cr
2
O
7
), Zn
2+
(na forma de ZnSO
4
.7H
2
O), e 3,5-diclorofenol 6 mg.L
-1
.
Determinações realizadas em duplicatas, com medição após 30 min de incubação,
densidade final da cultura principal 800 UNT (unidades nefelométricas de turbidez).
Parâmetros Sensibilidade (%)
Taxa de inibição
Cr
6+
(na forma de K
2
Cr
2
O
7
) 4 mg.L
-1
23,23
Taxa de inibição
Zn
2+
(na forma de ZnSO
4
.7H
2
O) 25 mg.L
-1
67,58
Taxa de inibição
3,5-diclorofenol 6 mg.L
-1
48,94
3.7.1.2.2 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp
Os ensaios com Artemia sp foram realizados conforme método apresentado
no item 3.6.1.
3.7.1.2.3 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna
Os ensaios com Daphnia magna foram realizados conforme método
apresentado no item 3.6.2.
65
3.7.1.2.4 Ensaio de toxicidade aguda com Danio rerio, para determinação da
dose de não efeito
A espécie de peixe selecionada para os estudos foi o paulistinha ou
zebrafish (Danio rerio), por tratar-se de organismo modelo utilizado em diferentes
ensaios toxicológicos, e por apresentar pequeno tamanho corpóreo, mesmo na fase
adulta. Foram utilizados apenas animais juvenis de ambos os sexos (peso de 0,22 ±
0,01 g e comprimento de 3,35 ± 0,05 cm). Os animais foram mantidos em aquários
de 40 L dispostos em bancadas durante 15 dias para aclimatação, em condições
controladas mantendo-se fotoperíodo de 16 h; com lâmpadas fluorescentes;
luminosidade de 172,00 ± 32,36 lux; temperatura ambiental de 25 ± 2°C;
temperatura da água dos aquários mantida em 21 ± 1°C; pH mantido em 7,0 ± 0,5;
condutividade 61,65 ± 2,31 µS.cm
-1
à 25
o
C; dureza de 120,00 ± 0,00 de CaCO
3
mg.L
-1
; com aeração constante; oxigênio dissolvido 6,3 ± 0,1 mg.L
-1
a 21 ± 1
o
C;
recebendo ração comercial em flocos diariamente (2 vezes ao dia) e náuplios de
Artemia sp (semanalmente).
Os animais foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos de
exposição e 6 animais foram transferidos para cada béquer de vidro de 600 mL. Os
grupos de animais foram submetidos a ensaios estáticos, nos quais foram expostos
a 200 mL dos efluentes EB, ETE e QTS3 nas diluições 100, 50, 30, 20, e 1 %,
durante 48 h, de acordo com norma da ABNT NBR 15088 (2004) e norma ISO 7346
(1996), com modificações. Como controle negativo utilizou-se apenas água de
torneira sem cloro e aerada.
66
A utilização dos peixes no presente trabalho foi aprovada pela Comissão de
Ética no Uso de Animais - CEUA da UFSC, sob número de cadastro 147/CEUA e
protocolo 23080.007332/2002-48.
3.7.1.3 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade
subcrônica
3.7.1.3.1 Ensaio de toxicidade subcrônica com Allium cepa
a) Teste de inibição de germinação de sementes de Allium cepa
Os ensaios foram conduzidos com sementes de Allium cepa conforme
método de “blotter” utilizado por Rodo (2002), obtidas de variedades comerciais
(sementes HORTEC, variedade Aurora), e mantidas armazenadas em geladeira, em
recipientes vedados.
Foi verificada a viabilidade das sementes através de um ensaio de
embebição, sugerido por Piana, Tillmann e Silva (1995). Para tanto, após a quebra
de dormência no refrigerador por 12 h, as sementes foram mantidas submersas em
água mineral autoclavada por um período de hidratação de 3 h (n=50, peso de 0,158
± 0,002 g). Após o período de embebição, as sementes foram transferidas para
caixas de germinação (plásticas e transparentes), que foram previamente
preparadas utilizando duas folhas de papel toalha dobradas ao meio e uma folha de
67
papel de filtro; as folhas foram esterilizadas em estufa de secagem e esterilização a
50
o
C, por dois dias. Nestas caixas, o papel de filtro foi umedecido com 25 mL de
água mineral autoclavada. As caixas contendo as sementes foram mantidas em sala
climatizada, nas condições apresentadas na tabela 4 e após 6 e 12 dias, efetuou-se
a contagem de sementes germinadas e no 12
o
dia efetuaram-se as medições das
plântulas; sendo as determinações realizadas em triplicatas.
Tabela 4 – Resumo dos requisitos para o ensaio de toxicidade subcrônica com sementes de
Allium cepa (RODO, 2002).
Requisitos Espécie Allium cepa
Tipo de ensaio Estático: 6 – 12 dias
Água de diluição Água mineral
Volume máximo da
solução-teste por gerbox
25 mL
Número mínimo de replicatas por
diluição
3
Temperatura 25 ± 2 °C
Fotoperíodo
Luminosidade
16 h de luz
435,6 ± 44,8 lux
As sementes (n=100) utilizadas nos ensaios de inibição subcrônica estáticos
atenderam aos requisitos estabelecidos segundo as regras para análise de
sementes, apresentadas segundo Brasil (1992). Realizou-se a quebra de dormência
mantendo as sementes no refrigerador por 12 h. Foram utilizadas apenas sementes
do mesmo lote, as quais foram subdivididas em sublotes (n=100; 0,327 ± 0,003 g),
de maneira a obter-se maior uniformidade.
Para a realização destes ensaios, conduzidos de acordo com Piana,
Tillmann e Silva (1995) e Rodo (2002), com modificações; foram observados os
requisitos apresentados na tabela 4. Foi preparado controle negativo contendo
somente água mineral autoclavada e controle positivo com dicromato de potássio
68
(1,75 mg.L
-1
). Nos ensaios de germinação das sementes empregaram-se soluções
testes diluídas em água mineral, contendo 100 % dos efluentes EB, ETE e QTS3.
Para cada diluição e controles foram montadas três replicatas, com n = 100. Após 6
e 12 dias registrou-se o número de sementes que não germinaram. As contagens e
a interpretação dos resultados foram realizadas segundo Brasil (1992).
b) Ensaio de inibição do crescimento de plântulas de Allium cepa
Para este ensaio subcrônico semiestático foram utilizadas apenas as
sementes de Allium cepa que germinaram no teste de inibição de germinação e de
crescimento de plântulas (Figura 11) anteriormente descrito. Foram verificadas
algumas das características que indicam anormalidades no desenvolvimento das
plântulas apenas no controle positivo realizado com dicromato de potássio (1,75
mg.L
-1
) (Figura 12), segundo critérios apresentados em Brasil (1992). Também foram
efetuadas medições do comprimento das plântulas com uma régua, após 12 dias,
registrou-se o comprimento de 40 plântulas. As contagens e a interpretação dos
resultados obtidos foram realizadas segundo Brasil (1992).
69
Figura 11 – Plântulas de Allium cepa com 12 dias, apresentando desenvolvimento normal
após cultivo em substrato contendo QTS3 a 100 %.
Figura 12 – Plântulas de A. cepa com 12 dias, apresentando desenvolvimento anormal após
cultivo em substrato contendo dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) em caixa de germinação.
c) Ensaio de inibição do crescimento de raiz de Allium cepa
O teste subcrônico semiestático para verificar a inibição do crescimento de
raiz de bulbos de Allium cepa foi conduzido de acordo com método de Arambasic,
70
Bjelic e Subakov (1995), com modificações. Anteriormente ao teste de toxicidade, os
bulbos de A. cepa foram selecionados através de um pré-teste, onde as raízes
velhas foram cuidadosamente removidas e a base dos bulbos foi inserida em tubos
do tipo falcon (50 mL) contendo água mineral. Após 3 dias de exposição à
temperatura de 25 ºC ± 2 ºC e na ausência de luz direta, o crescimento das raízes foi
observado. Apenas os bulbos que apresentaram o mesmo padrão de crescimento
durante os 3 dias foram selecionados para os testes usando os efluentes. As raízes
crescidas durante o pré-teste foram removidas e os bulbos foram reutilizados após
secagem por 5 dias, sob refrigeração.
Nos testes de inibição de crescimento das raízes, a base dos bulbos foi
colocada no interior de tubos do tipo falcon (50 mL) contendo os efluentes EB, ETE
e QTS3, sem diluição. Para cada efluente foram incubadas 6 cebolas durante 3 dias,
os ensaios foram realizados em triplicatas. O diâmetro dos bulbos e o comprimento
das maiores raízes foram medidos usando um paquímetro. Os ensaios foram
realizados em temperatura ambiente (25 ± 2 °C) em sala climatizada e no escuro,
utilizando como controle negativo bulbos expostos apenas em água mineral e como
controle positivo dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
).
3.7.1.3.2 Ensaios de toxicidade subcrônica com Danio rerio
A toxicidade subcrônica dos efluentes foi verificada em D. rerio onde foram
avaliados os biomarcadores de estresse. Para tanto, os animais foram divididos
aleatoriamente em diferentes grupos de exposição de 6 animais e posteriormente
71
transferidos para cada béquer de vidro de 600 mL, contendo 200 mL de efluente, de
acordo com da NBR 15088 (ABNT, 2004) e da norma ISO 7346 (ISO, 1996), com
modificações. O primeiro grupo foi exposto a 20 % do efluente EB, o segundo grupo
foi exposto a 20 % do efluente ETE, o terceiro grupo foi exposto a 20 % do efluente
QTS3 e o último grupo foi mantido apenas em água de torneira aerada sem cloro
(controle negativo), com renovação diária dos efluentes.
Todos os ensaios subcrônicos semiestáticos foram realizados em triplicatas,
nos quais os peixes foram mantidos em sala climatizada com fotoperíodo de 16 h,
com lâmpadas fluorescentes fornecendo uma luminosidade de 172,0 ± 32,4 lux; em
temperatura ambiente de 25 ± 2
o
C, e com temperatura da água nos béqueres de 21
± 1
o
C; em pH 7,0 e sem aeração mecânica.
Após o período de exposição de 7 dias, 6 animais de cada grupo de
tratamento foram anestesiados em gelo, pesados e medidos, sendo imediatamente
sacrificados através de transecção cefálica. Foi preparado um homogenato do pool
de 6 peixes para avaliação dos biomarcadores de estresse.
a) Avaliação do dano às membranas celulares através da medida da
lipoperoxidação
A avaliação da lipoperoxidação das membranas foi realizada em triplicatas,
pela detecção dos seus derivados lipoperóxidos, através de substâncias que reagem
como o ácido tiobarbitúrico (TBARS), conforme metodologia proposta por Ohkawa
72
(1979) e por Bird e Draper (1984) e modificada por Hermes-Lima, Willmore e Storey
(1995).
Após o sacrifício, os animais foram colocados imediatamente no gelo e uma
pequena porção de cada peixe foi separada. Em seguida as porções foram pesadas
em conjunto de maneira a totalizar 100 mg de tecido para a preparação dos
homogenatos, obtidos em ácido fosfórico a 1 % (1:5 p/v). A homogenização foi
realizada a 4 ºC, com cerca de 20 impactos em homogenizador Potter-Elvehjem.
Posteriormente, juntou-se 400 µL do homogenato para 400 µL da solução gelada de
ácido tiobarbitúrico (TBA) a 1 %; NaOH a 50 mM; hidroxitolueno butilado (BHT) a 0,1
mM e 200 µL de ácido fosfórico a 7 %. A seguir, cada amostra foi incubada a 100 ºC
por 15 min em banho-maria. As amostras e o branco foram levados então ao freezer
por 10 min e, foram acrescentados 1,5 mL de butanol em todos os tubos que foram
agitados vigorosamente em vórtex por 10 s e centrifugados (2000 g, 5 min).
Alíquotas do sobrenadante foram lidas, espectrofotometricamente a 532 e a 600 nm.
Para a leitura do branco substituiu-se a solução de TBA por HCl (3,0 mM).
Foi calculada a concentração de TBARS (nmol.g
-1
) utilizando-se o
coeficiente de extinção molar de 156 mM
-1
.cm
-1
segundo a equação (5):
[TBARS] =
Amostra (A
532
– A
600
) X 10
3
X (4X17) (5)
156
73
b) Glutationa reduzida (GSH)
Amostras do pool de 6 peixes inteiros, exceto da região cefálica que
removida após transsecção, foram precipitadas com ácido tricloroacético (TCA) 12 %
na diluição de 1:5 (p/v) e homogeneizadas com cerca de 20 impactos em um
homogeneizador Potter-Elvehjem. Imediatamente após centrifugação (5000 g, 5
min), foi realizada a determinação de GSH nos sobrenadantes obtidos. A
concentração de pequenos tióis foi avaliada segundo metodologia proposta por
Beutler, Duron e Kelly (1963), onde a adição de 0,2 mL de 5,5-ditiobis-2-2 ácido
nitrobenzóico (DTNB) (2,5 mM) nas cubetas contendo 1,9 mL de tampão fosfato de
potássio pH 8,0 e 0,1 mL do extrato ácido permitiu, após cerca de 2 min, a obtenção
máxima de formação do ânion tiolato (TNB) de cor amarela, mensurável em 412 nm.
As análises foram realizadas em duplicatas e os valores expressos em µmol.g
-1
.
Foi calculada a concentração da GSH (µmol.g
–1
) utilizando-se o coeficiente
de extinção molar do ânion tiolato de 14,1 M
-1
.cm
-1
, segundo a equação (6):
[GSH] =
Amostra
412
x 4 (6)
14,1
c) Atividade da enzima catalase (CAT)
Para análise da atividade desta enzima, quantificou-se a velocidade de
decomposição do peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
), em 240 nm, pela enzima presente
na amostra (AEBI, 1984). Para tanto, amostras de tecidos do pool de 6 peixes foram
74
preparadas na diluição 1:20 (p/v) com tampão Tris (20 mM, pH 7,4), 0,1 % Triton e
NaCl (150mM) e homogeneizadas com cerca de 20 impactos em homogeneizador
Potter-Elvehjem. Após centrifugação (5000 g, 5 min), transferiu-se para uma cubeta
de quartzo, 2 mL da solução de H
2
O
2
e 20 µl de amostra de sobrenadante do
homogenato. Após homogeneização, a velocidade de decomposição do H
2
O
2
foi
determinada, durante 60 segundos. A solução de peróxido de hidrogênio (10 mM),
em tampão fosfato de potássio (50 mM, pH 7,0) foi preparada e titulada no dia da
análise. Todas as amostras foram analisadas em duplicatas, sendo os valores
expressos em mmol de H
2
O
2
consumido min
-1
.g
-1
, usando coeficiente de extinção
molar de 40 M
-1
.cm
-1
.
Foi calculada a atividade da enzima CAT através da equação (7):
[CAT] = Amostra
240
(Abs
maior
– Abs
menor
) x 19 x 60 (7)
40
3.7.1.4 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de genotoxicidade
com Danio rerio
A genotoxicidade foi verificada através de biomarcadores citogenéticos
(RIBEIRO; SALVADORI; MARQUES, 2003). Este ensaio foi realizado segundo
norma da ABNT 15088 (2004) e da norma ISO 7346 (1996), com modificações. Os
animais, após a aclimatação, foram divididos aleatoriamente em diferentes grupos
de exposição. Em seguida, 6 animais foram transferidos para cada béquer de vidro
de 600 mL, contendo 200 mL de efluentes. O primeiro grupo foi exposto a 20 % do
efluente EB, o segundo grupo foi exposto a 20 % do efluente ETE, o terceiro grupo
75
foi exposto a 20 % do efluente QTS3 e o último grupo foi mantido apenas em água
de torneira aerada sem cloro (controle negativo). Os animais foram expostos aos
efluentes durante 2 dias, em ensaio agudo semi-estático.
a) Avaliação do dano ao DNA (Teste cometa)
A fragmentação do DNA foi avaliada através de eletroforese horizontal
utilizando o teste cometa (SINGH et al., 1988) e os procedimentos de fixação e
coração das amostras com nitrato de prata foram realizados segundo método
proposto por Nadin, Vargas-Roig e Ciocca (2001), com mínimas modificações.
Amostras de cada peixe foram cortadas em pequenos pedaços (100 mg) e,
em seguida, foi feito um homogenato individual em homogenizador de vidro, onde
foram acrescentados 95 µL de solução de extração de núcleo que continha 1 mL de
tampão fosfato pH 7,4; 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO); e 20 mM de EDTA. As
células isoladas do homogenato (10 µl) foram então embebidas em 120 µl de
agarose de baixo ponto de fusão (LMPA, 0,75 %), mantida a 37 °C. Esta mistura
(células/LPMA) foi adicionada a uma lâmina de microscópio pré-coberta com uma
camada de agarose de ponto de fusão normal (NMPA, 1 %). Então as lâminas foram
mergulhadas por 1 h em solução de lise gelada que continha 2,5 mM NaCl, 100 mM
EDTA, 1 % Triton X-100, 10 % DMSO, 1 % n-lauril sarcocinato e 10 mM Tris (pH 10).
Após este período as lâminas foram mantidas por 20 min em tampão alcalino gelado
(300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 13). As lâminas contendo o DNA liberado foram
submetidas a uma eletroforese horizontal por 15 min sob tensão elétrica de 25V e
76
uma corrente elétrica de 300 mA. Posteriormente, as lâminas foram neutralizadas
por 10 min em tampão Tris 0,4 M (pH 7,5) e, em seguida, foram expostas à solução
de parada (15 g de ácido tricloroacético, 5 g de sulfato de zinco, 5 mL de glicerol e
completou-se o volume com água destilada até 100 mL) por 5 min. As lâminas foram
transferidas para solução de fixação (15 g de TCA, 5 g de sulfato de zinco, 5 mL de
glicerol e completou-se o volume com água destilada até 100 mL), foram secas em
estufa por 1 h e depois foram coradas com nitrato de prata, segundo Nadin, Vargas-
Roig e Ciocca (2001), com mínimas modificações.
A solução corante foi preparada na seguinte seqüência: 34 mL de solução B
(nitrato de amônio a 0,2 % p/v, nitrato de prata a 0,2 % p/v, ácido tungstosilícico a
0,5 % p/v, formaldeído a 0,15 % e carbonato de sódio a 5 % p/v) e 66 mL de solução
A (carbonato de sódio a 5 % p/v). Misturou-se a solução A e B, e imediatamente as
lâminas foram mantidas em contato com esta solução corante por 15 min em um
banho-maria a 37
o
C, ao abrigo da luz. Em seguida, as lâminas foram submersas
individualmente na solução de parada (1 mL de ácido acético e completou-se o
volume com água destilada até 100 mL) por 5 min, foram lavadas com água
destilada e posteriormente foram secas ao ar.
Como controle interno da técnica, 100 µL de H
2
O
2
(100 µM) foram
misturados às amostras de homogenato dos animais do grupo controle e incubados
durante 15 min a 25 ºC. Para cada animal foram analisadas aleatoriamente imagens
de 100 núcleos (50 núcleos por lâmina, em duplicatas) e o tamanho dos cometas
(região do nucleóide + cauda) (Figura 13), foi classificado visualmente dentro de 5
classes de dano, variando de 0 (cometas sem dano) a 4 (cometas com dano
máximo), de acordo com metodologia proposta por Collins; Ai-Guo e Duthie (1995),
77
com modificações. A fim de expressar o dano visualizado nas lâminas em valores
numéricos, as lâminas foram fotografadas e as imagens obtidas foram tratadas com
aplicativo Microsoft Paint™, disponível no software Windows Milennium Edition,
2000. Para a determinação das classes foram utilizadas as imagens tratadas com o
aplicativo Microsoft Paint™, sendo que cada classe recebeu uma pontuação, de
acordo com as características próprias de cada classe de dano, conforme
demonstrado na tabela 5.
Tabela 5 – Pontuação e exemplos de cada classe de cometa visualizada através de
coloração com nitrato de prata. Imagens de nucleóides presentes em homogenato de Danio
rerio (n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não
remediado (EB20), 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20), e a 20 % do
efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias. Imagens obtidas
com câmera digital (aumento de 9,6 X) acoplada ao microscópio óptico (aumento de 1000 X)
e tratadas com aplicativo Microsoft Paint™. Determinações realizadas em duplicatas.
Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
Pontuação 0 1 2 3 4
Imagem
digital do
cometa
Tratamento
da
Imagem
Microsoft
Paint™
Para cada animal foi calculada uma pontuação de acordo com o número de
cometas visualizados em cada classe, segundo a equação (8):
Índice de dano ao DNA (ID) = [(№ de cometas classe 0 x 0) + (№ de cometas classe
1 x 1) + (№ de cometas classe 2 x 2) + (№ de cometas classe 3 x 3) + (№ de
cometas classe 4 x 4)] (8)
78
Conseqüentemente, obteve-se uma única pontuação para cada grupo
estudado. Então, o índice de dano de cada grupo podia variar de 0 (ausência de
dano) a 400 (presença de dano máximo). A visualização dos resultados foi realizada
em um microscópio óptico inicialmente em aumento 10 X, em casos de dúvida entre
as classes efetuou-se leitura da lâmina com objetiva de 1000 X para possibilitar a
comparação com as imagens digitais utilizadas como gabarito, conforme tabela 5.
Desta forma, a “cabeça” e a “cauda” dos cometas (Figura 13) foram mensuradas
visualmente com base em fotomicrografias obtidas com câmera digital acoplada ao
microscópio, utilizando objetiva com aumento de 1000 X e aumento de 9,6 X da
câmera.
1= tamanho da cabeça
2= comprimento do corpo
3=comprimento da cauda
4= comprimento da cauda sem o corpo
5= comprimento do cometa
Linha de
referência
Figura 13 – Áreas do cometa que foram mensuradas para determinar a classe do cometa e
para o cálculo do índice de dano (modificada de SINGH, 2005).
b) Avaliação do dano secundário ao DNA (Teste de micronúcleos)
O teste de micronúcleos é o ensaio in vivo mais amplamente empregado na
detecção de agentes clastogênicos que causam quebras em cromossomos, e de
79
agentes aneugênicos que induzem segregação cromossômica anormal
(MACGREGOR et al., 1987; HAYASHI et al., 1994). Os micronúcleos podem ser
visualizados próximos ao núcleo principal (HAYASHI et al., 1998).
Após o sacrifício de cada animal, removeu-se a cabeça expondo a região
cardíaca. Esta região foi pressionada contra uma lâmina de microscopia de modo a
obter um esfregaço. Foram preparadas 2 lâminas para cada animal. Após secar por
cerca de uma hora, os esfregaços foram fixados com metanol absoluto (99,5 %)
durante 5 min, e secos ao ar em temperatura ambiente segundo método proposto
por Hayashi, Sofuni e Ishidate Jr. (1983), com modificações.
Os esfregaços foram corados através do método Feuglen-Fast-Green. Para
a hidrólise ácida, as lâminas foram colocadas em cubas de vidro contendo HCl 1 M à
temperatura ambiente por 1 min. Em seguida, foram transferidas para cuba contendo
HCl 1 M previamente aquecido a 63
o
C e o conjunto foi mantido em banho-maria por
10 min. Em seguida, as lâminas foram retiradas da cuba e mantidas inclinadas por
15 min sobre papel. Ao término deste tempo, as lâminas foram transferidas para
uma cuba contendo HCl 1 M à temperatura ambiente, permanecendo por mais 5
min. Posteriormente, as lâminas foram lavadas com água destilada, em intervalos de
5 min, totalizando um tempo de 15 min.
As lâminas, após secarem em temperatura ambiente por 2 dias, foram
transferidas para cuba de vidro previamente coberta com papel alumínio e contendo
reativo de Schiff, suficiente para as cobrir. O conjunto foi mantido em câmara escura
à temperatura ambiente por 1 h. As lâminas foram lavadas com água destilada,
repetiu-se este procedimento três vezes, por um tempo de 5 min para cada lavagem.
Verificou-se então, ao microscópio, se a coloração dos núcleos estava adequada.
80
Para a coloração do citoplasma utilizou-se solução Fast Green a 0,5 %, onde
as lâminas foram mantidas por 7 segundos e, após ter-se escorrido o excesso de
corante, as mesmas foram mergulhadas individualmente por 3 vezes em etanol
absoluto durante 2 min cada. Posteriormente, as lâminas foram secas à temperatura
ambiente.
Para a determinação da freqüência de micronúcleos foram contadas 2.000
células por lâmina, os valores obtidos foram expressos em freqüência absoluta e
freqüência relativa em ‰
(DIEKMANN et al., 2004). Na figura 14 pode ser observada
uma célula contendo micronúcleos próximos ao núcleo principal.
Figura 14 – Fotomicrografia de eritrócitos de Danio rerio corados pelo método Feulgen-Fast-
Green, a seta indica célula com micronúcleos (câmera digital com aumento de 9,6 X
acoplada ao microscópio óptico com aumento de 1000 X).
A fim de expressar numericamente os micronúcleos visualizados nas
lâminas estas foram fotografadas com câmera digital (aumento de 9,6 X) acoplada
ao microscópio óptico (aumento de 1000 X) (Figura 14) e as imagens obtidas foram
tratadas com aplicativo Microsoft Paint™. Desta forma, foi possível confirmar a
ocorrência dos micronúcleos com as imagens tratadas com o aplicativo Microsoft
81
Paint™, conforme demonstrado na tabela 6. Este aplicativo permitiu visualizar com
maior nitidez os micronúcleos possibilitando o cálculo da freqüência relativa de
micronúcleos por grupo de exposição, conforme equação (9):
Frequência de micronúcleos =
№ de micronúcleos X 1000 (‰) (9)
4000
Tabela 6 – Imagens de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de Danio rerio (n=
6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado
(EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20), e a 20 % do efluente
remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias. Imagens obtidas com
câmera digital (aumento de 9,6 X) acoplada ao microscópio óptico (1000 X) e tratadas com
aplicativo Microsoft Paint™. Determinações realizadas em duplicatas.
Número de micronúcleos por célula
Amostras
Eritrócito sem
micronúcleos
Eritrócitos com 1
micronúcleo
Eritrócito com 4
micronúcleos
Imagem
digital das
células
Tratamento
da Imagem
com
Microsoft
Paint™
82
3.8 Análise estatística
As análises estatísticas dos dados obtidos foram realizadas através de
análise de variância (ANOVA), complementada pelo teste de Tukey-Kramer. Para tal
utilizou-se o software INSTAT (GraphPad, San Diego, CA, USA), admitindo níveis de
significância mínimos de p<0,05.
83
4 RESULTADOS
4.1 Caracterização da quitosana, das microesferas de quitosana e da quitosana
pulverizada
4.1.1 Caracterização da quitosana pela determinação do grau de desacetilação
e do diâmetro das microesferas
O grau médio de desacetilação (90 %
GD) da quitosana que representa a
porcentagem de grupos amino distribuídos na cadeia polimérica foi determinado por
titulação condutimétrica.
A quitosana pulverizada foi fotografada para se verificar suas características
superficiais na ausência de reticulação, conforme pode ser visto nas figuras 15 e 16.
Ampliações maiores não foram possíveis, pois a amostra de quitosana foi destruída
com a passagem dos feixes de elétrons do microscópio eletrônico de varredura
(MEV).
O diâmetro médio das microesferas foi de 1,03 ± 0,06 mm, determinado a
partir da micrografia de vinte microesferas. Considerando-se os detalhes da
superfície externa da microesfera de quitosana, foi observado que a mesma se
apresentou pouco porosa.
84
Figura 15 – Fotomicrografia obtida de partículas de quitosana pulverizada em microscópio
eletrônico de varredura (ampliação 300 X).
Figura 16 – Fotomicrografia obtida de partículas de quitosana pulverizada, para observação
de sua morfologia superficial em microscópio eletrônico de varredura (ampliação 600 X).
85
4.2 Remediação dos efluentes
4.2.1 Etapa 1 – Seleção de formulação de quitosana para remediação de
efluente têxtil
4.2.1.1 Determinação da porcentagem de remoção de cor dos efluentes
Na tabela 7 são apresentados os resultados referentes à porcentagem de
remoção de cor do efluente EB, ETE, QTS1, QTS2 e QTS3.
Com relação à remoção de cor, o tratamento convencional da indústria com
lodos ativados e uso de sulfato de alumínio, descolorante e polieletrólito, foi mais
eficaz (96,15 % de remoção de cor) que todos os tratamentos realizados com a
quitosana. Entretanto, é importante ressaltar que a QTS3 também causou
significativa remoção de cor do efluente (80,76 %).
Na tabela 8 são apresentados os valores de absorbância e porcentagem de
remoção de cor, obtidos a partir dos efluentes EB e QTS
A
até QTS
F
para a seleção
da melhor concentração da formulação a ser utilizada na remediação dos efluentes.
Foram testadas as formulações de quitosana de 0,1 a 1,0 g para a remediação de
um volume de 20 mL de efluente têxtil bruto.
A formulação QTS
C
(0,3 g) foi escolhida para realizar o tratamento dos
efluentes em função de tratar-se da dosagem mais baixa que apresentou diferença
significativa em relação ao efluente EB. Ela foi escolhida também por não ter
86
apresentado diferença estatística em relação ao ETE. A formulação QTS
C
foi então
denominada como QTS3.
Tabela 7 – Leitura de absorbâncias (a 517 nm) e porcentagem de remoção de cor,
referentes ao efluente têxtil não remediado (EB); remediado pela empresa (ETE); remediado
com microesferas de quitosana (QTS1), com quitosana solubilizada em ácido acético
(QTS2) e com quitosana pulverizada (QTS3). Todos os valores foram expressos como
média ± EPM. (***) diferença estatística significativa (p<0,001) em relação ao EB.
Determinações realizadas em triplicatas.
Amostras
Absorbância
(517 nm)
Remoção
de cor (%)
EB 0,524 ± 0,006 0
ETE 0,020 ± 0,001*** 96,15 ± 5,00***
QTS 1 0,130 ± 0,004*** 75,00 ± 3,10***
QTS 2 0,140 ± 0,004*** 73,10 ± 2,80***
QTS3 0,102 ± 0,001*** 80,76 ± 1,00***
Tabela 8 – Leitura de absorbâncias (a 517 nm) e porcentagem de remoção de cor.
Resultados referentes ao efluente têxtil não remediado (EB) e remediado com diferentes
formulações de quitosana empregadas: QTS
A
(0,1 g); QTS
B
(0,2 g); QTS
C
(0,3 g); QTS
D
(0,4
g); QTS
E
(0,5 g) e QTS
F
(1,0 g). Todos os valores foram expressos como média ± EPM. (***)
representa diferença estatística significativa (p<0,001) em relação ao EB. Determinações
realizadas em triplicatas.
Efluentes
Absorbância
(517 nm)
Remoção
de cor (%)
EB 0,524 ± 0,006 0
QTS
A
0,170 ± 0,018*** 67,30 ± 10,60***
QTS
B
0,134 ± 0,004*** 75,00 ± 3,00***
QTS
C
0,102 ± 0,001*** 80,76 ± 1,00***
QTS
D
0,135 ± 0,004*** 75,00 ± 3,07***
QTS
E
0,118 ± 0,004*** 76,92 ± 3,33***
QTS
F
0,139 ± 0,011*** 73,07 ± 7,85***
87
4.2.2 Análises físico-químicas dos efluentes não remediados e remediados
4.2.2.1 Verificação do pH
Na tabela 9 são apresentados os valores de pH obtidos nas análises
químicas realizadas com efluentes EB; ETE, QTS1, QTS2 e QTS3. Com relação ao
pH, pode-se observar que os tratamentos com QTS3 e ETE causaram ligeira
elevação do pH ao passo que QTS1 causou forte redução deste parâmetro.
Tabela 9 – Valores de pH referentes ao efluente têxtil não remediado (EB); remediado pela
empresa (ETE); remediado com microesferas de quitosana (QTS1), com quitosana
solubilizada em ácido acético (QTS2) e com quitosana pulverizada (QTS3). Determinações
realizadas em triplicatas.
Efluentes pH
EB 7,5 ± 0,3
ETE 7,6 ± 0,2
QTS1 3,5 ± 0,1
QTS2 7,0 ± 0,3
QTS3 7,7± 0,2
4.2.2.2 Análise de metais
Na tabela 10 são apresentados os resultados obtidos referentes às análises
químicas realizadas no efluente têxtil EB, ETE e no QTS3. Com relação à
concentração de metais, os dados obtidos demonstram que ambas as remediações
realizadas promoveram a remoção dos metais. Entretanto, QTS3 promoveu a
redução de todos os metais enquanto ETE houve o aumento na concentração de
88
alguns deles (Co, Mg, Pb, Rb e Th). Por motivo de ordem técnica, não foram
realizadas as análises de metais para os efluentes QTS1 e QTS2.
Tabela 10 – Concentração de metais no efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela
empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3). Determinações realizadas
em duplicatas.
Metal EB ETE QTS3
Concentração (X 10
-3
) ppm
Al 0,382 0,356 0,109
Cd 0,000 0,000 0,000
Co 0,227 0,229 0,072
Cr 0,039 0,036 0,013
Cu 0,000 0,000 0,000
Fe 0,837 0,628 0,033
Hg 0,000 0,000 0,000
Li 22,215 20,695 10,138
Mg 1364,000 2420,000 415,000
Mn 0,068 0,028 0,015
Mo 0,369 0,303 0,114
Pb 0,859 1,197 0,110
Rb 8,743 9,276 2,623
Th 2,160 3,410 0,103
Zn 0,000 0,000 0,000
4.2.2.3 Determinação da condutividade e dureza
Na tabela 11 são apresentados os resultados obtidos referentes às análises
químicas para determinação da condutividade e dureza de amostras de: água de
torneira aerada e sem cloro, e efluentes EB, ETE e QTS3.
Os resultados obtidos mostram que a remediação com QTS3 causou
redução na condutividade (2,1 vezes) e na dureza (4,6 vezes) comparativamente ao
89
efluente EB. Com relação ao controle negativo (água de torneira) o QTS3 não
apresentou diferença estatística significativa. Por motivo de ordem técnica não foram
realizadas as determinações de condutividade e de dureza para os efluentes QTS1
e QTS2.
É importante notar que o efluente QTS3 causou uma redução da
condutividade no efluente muito maior do que aquela observada no tratamento
convencional realizado pela empresa em estudo.
Tabela 11 – Características físico-químicas (condutividade e dureza) do efluente têxtil não
remediado (EB), remediado pela empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada
(QTS3). Todos os valores foram expressos como média ± EPM. (***) e (*) representam
diferenças estatísticas significativas em relação ao EB para p<0,001 e p<0,05;
respectivamente. Determinações realizadas em triplicatas.
Efluentes
Condutividade
µS.cm
-1
25
o
C
Dureza em
CaCO
3
mg.L
–1
Água de torneira 61,65 ± 2,31*** 120,00 ± 7,70***
EB 4693,00 ± 54,01 890,00 ± 44,00
ETE 4550,00 ± 54,00* 111,00 ± 22,00***
QTS3 2253,00 ± 3,33*** 196,00 ± 39,00***
4.2.2.4 Avaliação da toxicidade aguda dos efluentes utilizando Artemia sp e
Daphnia magna
Os resultados referentes aos testes de toxicidade aguda usando os
microcrustáceos Artemia sp expostos aos efluentes EB, ETE, QTS1, QTS2 e QTS3
são apresentados na tabela 12. Os dados obtidos mostraram que após 24 h de
remediação o efluente QTS2 apresentou maior toxicidade para os microcrustáceos
com concentração efetiva (CE
50
=15,05 %), superando inclusive o apresentado pelo
90
efluente EB (CE
50
=12,22 %), enquanto que o efluente QTS3 causou uma redução
total da toxicidade, impossibilitando estabelecer a CE
50
uma vez que em nenhuma
das concentrações da formulação QTS3 testadas ocorreu imobilidade dos animais.
Por outro lado, QTS1 e ETE também não apresentaram toxicidade.
Os resultados obtidos com D. magna também confirmam que novamente a
remediação com QTS3 diminuiu substancialmente a toxicidade do efluente, de tal
forma que impossibilitou estabelecer a CE
50
do mesmo, pois em nenhuma das
concentrações testadas ocorreu toxicidade. Diferentemente, o efluente ETE
apresentou toxicidade elevada com FD=4, assim como o valor apresentado pelo
efluente EB, que foi determinado como sendo FD=2. Curiosamente, em QTS1 e
QTS2 houve uma forte elevação da toxicidade do efluente (FD=8).
Tabela 12 – Toxicidade aguda para bioindicadores (Artemia sp, n=10 e Daphnia magna,
n=10) utilizados na seleção da quitosana. Resultados referentes ao efluente têxtil não
remediado (EB); remediado pela empresa (ETE); remediado com microesferas de quitosana
(QTS1), quitosana solubilizada em ácido acético (QTS2) e quitosana pulverizada (QTS3).
Determinações realizadas em triplicatas.
Efluentes Tratamento
Concentração
Efetiva (CE
50
)
(%)
Artemia sp
Fator de
Diluição
(FD)
Daphnia magna
EB Sem tratamento 12,22 2
ETE
Lodos Aeróbios
Sulfato de Alumínio +
Descolorante +
Polieletrólito
n.a.t. 4
QTS1 Microesferas n.a.t. 8
QTS2
QTS pulverizada
(Ácido Acético a 1 % +
Óxido de Cálcio a 1 %)
15,05 8
QTS3 QTS pulverizada n.a.t. 1
n.a.t. = não apresentou toxicidade
91
4.2.3. Etapa 2 – Remediação e biomonitoramento do efluente têxtil com a
quitosana selecionada (QTS3)
4.2.3.1 Biomonitoramento dos efluentes utilizando ensaios de toxicidade aguda
4.2.3.1.1 Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri
Na tabela 13 são apresentados os resultados referentes ao ensaio estático
de toxicidade aguda utilizando bactérias bioluminescentes (Vibrio fischeri) expostas
a diferentes diluições (50; 25; 12,5; 6,25; 3,1; 1,5; 0,7; 0,3; 0,1 %) dos efluentes EB,
ETE, e QTS3. Os resultados mostram que a remediação do efluente com QTS3
promoveu a redução da toxicidade (FD=1), enquanto que o EB apresentou FD=64,
causando elevada toxicidade às bactérias, que reagiram reduzindo a
bioluminescência. O ETE também causou redução na toxicidade (FD=1).
Tabela 13 – Ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri (n= 10
6
UFC), expostas às
diferentes diluições do efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela empresa (ETE) e
remediado com quitosana pulverizada (QTS3). Determinações realizadas em duplicatas.
Efluentes CE
50
(%) Fator de Diluição (FD)
Água de torneira aerada n.a. n.a.
EB 10,64 64
ETE n.a.t. 1
QTS3 n.a.t. 1
n.a. = não aplicável; n.a.t. = não apresentou toxicidade
92
4.2.3.1.2 Ensaio de toxicidade aguda com Artemia sp
Na tabela 14 são apresentados os resultados obtidos após a exposição de
náuplios de Artemia sp às diferentes diluições (100; 75; 50; 25; 12,5; 6,2; 3,1; 1,5 %)
de EB, ETE e QTS3. Os resultados mostram que a remediação com quitosana,
assim como a remediação efetuada pela empresa, reduziram totalmente a toxicidade
para os microcrustáceos, pois nenhum indivíduo imóvel foi encontrado em nenhuma
das diluições testadas, o que inviabilizou o cálculo da CE
50
.
Paralelamente, foram conduzidos ensaios com dicromato de potássio como
controle positivo na concentração 1,75 mg.L
-1
, sendo que após 24 h de exposição
todos os microcrustáceos morreram. Como controle negativo utilizou-se apenas
água de cultivo (sal marinho sintético a 30 g.L
-1
), na qual nenhum microcrustáceo
permaneceu imóvel durante a realização do experimento.
Tabela 14 – Ensaio de toxicidade aguda com náuplios de Artemia sp (n=10), expostos às
diluições de efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela empresa (ETE) e remediado
com quitosana pulverizada (QTS3). Determinações realizadas em triplicatas.
Efluentes CE
50
(%)
Água de torneira aerada n.a.
EB 12,22
ETE n.a.t.
QTS3 n.a.t.
n.a. = não aplicável; n.a.t.= não apresentou toxicidade
93
4.2.3.1.3 Ensaio de toxicidade aguda com Daphnia magna
Na tabela 15 são apresentados os resultados obtidos a partir da exposição
de formas juvenis de Daphnia magna às diferentes diluições de EB, ETE e QTS3. Os
resultados mostram mais uma vez que a remediação com quitosana eliminou
totalmente a toxicidade para os microcrustáceos, pois nenhum indivíduo imóvel foi
encontrado em nenhuma das diluições testadas, o que inviabilizou o cálculo da CE
50
.
Por outro lado, a remediação efetuada pela empresa (ETE) não foi capaz de
reduzir completamente a toxicidade do efluente para os microcrustáceos, pois a
concentração efetiva (CE
50
=49,80 %) manteve-se alta e muito próxima do valor que
foi determinado para o efluente EB (CE
50
=49,98 %).
Tabela 15 – Ensaio de toxicidade aguda empregando juvenis de Daphnia magna (n=10),
expostos às diluições do efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela empresa (ETE)
e remediado com quitosana pulverizada (QTS3). Determinações realizadas em triplicatas.
Efluentes CE
50
(%)
Fator de Diluição
(FD)
Água de torneira aerada n.a. n.a.
EB 49,98 2
ETE 49,80 4
QTS3 n.a.t. 1
n.a. = não aplicável; n.a.t. = não apresentou toxicidade
94
4.2.3.1.4 Ensaio de toxicidade subcrônica com Allium cepa
a) Teste de inibição de germinação de sementes e de crescimento de plântulas
de Allium cepa
Na tabela 16 são apresentados os resultados obtidos a partir da exposição
de sementes e de plântulas de Allium cepa à água mineral, ao EB, ETE e QTS3. Os
resultados mostram que a remediação com quitosana, assim como a remediação
efetuada pela empresa, causaram inibição da germinação de sementes similares
aos valores do controle negativo, não houvendo diferença estatística entre os
valores obtidos.
Paralelamente, foram conduzidos ensaios com dicromato de potássio (1,75
mg.L
-1
) como controle positivo. Esta concentração causou forte inibição na
germinação das sementes (76,00 ± 3,21 %) e no crescimento das plântulas (97,55 ±
5,00 %) e, em ambos os casos, houve diferença estatisticamente significativa entre
todos os efluentes e o controle positivo (p< 0,001).
Com relação à inibição do crescimento das plântulas, verificou-se que
ocorreram diferenças significativas entre os efluentes EB, ETE e QTS3 em relação
ao controle negativo (p<0,001). Por outro lado, os efluentes ETE e QTS3 não
apresentaram diferença significativa em relação ao EB.
95
Tabela 16 – Ensaio de toxicidade subcrônica empregando sementes e plântulas de Allium
cepa (n=100), expostas ao efluente têxtil não remediado (EB), ao remediado pela empresa
(ETE) e ao remediado com quitosana pulverizada (QTS3). Todos os valores foram
expressos como média ± EPM. (***) representa diferença estatística significativa em relação
ao efluente EB (p< 0,001). Determinações realizadas em triplicatas.
Efluentes
Inibição da germinação
de sementes (%)
Inibição do crescimento
de plântula (%)
Água Mineral 21,40 ± 2,96 0***
K
2
Cr
2
O
7
76,00 ± 3,21*** 97,55 ± 5,00***
EB 26,67 ± 6,22 16,26 ± 1,60
ETE 25,00 ± 1,52 16,75 ± 1,47
QTS3 26,00 ± 5,29 23,34 ± 1,60
b) Ensaio de inibição do crescimento de raiz de bulbos de Allium cepa
Na tabela 17 são apresentados os resultados obtidos a partir da exposição
da base dos bulbos à água mineral (controle negativo), ao efluente EB, ETE e QTS3.
Os resultados mostram que a remediação com quitosana reduziu consideravelmente
a toxicidade, o que determinou a menor taxa de inibição do crescimento de raiz (39,6
± 6,6 %), comparativamente aos demais efluentes. Por outro lado, o tratamento com
ETE causou forte inibição no crescimento da raíz sendo esta maior do que aquela
observada com EB.
Paralelamente, utilizou-se dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) como controle
positivo. Esta concentração causou forte inibição no crescimento das raízes (97,6 ±
33,3 %), apresentando diferença estatística em relação ao controle negativo
(p<0,01).
96
Tabela 17 – Inibição de crescimento de raízes de bulbos de Allium cepa (n=6), expostos à
água mineral (controle negativo), ao dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) (controle positivo),
ao efluente têxtil não remediado (EB), ao remediado pela empresa (ETE) e ao remediado
com quitosana pulverizada (QTS3), durante 3 dias. Todos os valores foram expressos como
média ± EPM. (***), (**) representam diferenças estatísticas significativas em relação ao
efluente EB para (p< 0,001) e (p<0,01), respectivamente. (
α
) representa diferença
estatisticamente significativa de QTS3 em relação ao ETE (p<0,05). Determinações
realizadas em triplicatas.
Efluentes
Crescimento da raiz
(cm)
Inibição de crescimento da raiz
(%)
Água mineral 2,50 ± 0,30** 0
K
2
Cr
2
O
7
0,06 ± 0,02*** 97,60 ± 33,30
EB 1,30± 0,15 48,00 ± 11,50
ETE 0,55 ± 0,14** 78,00 ± 25,50*
QTS3 1,51 ± 0,10 39,60 ± 6,60
4.2.3.1.5 Ensaio de toxicidade aguda com Danio rerio para determinação da
dose de não efeito
Os resultados obtidos demonstraram que a menor diluição onde não houve
nenhuma mortalidade de Danio rerio expostos aos diferentes efluentes foi 20 %
(Tabela 18), sendo esta diluição selecionada para os ensaios de toxicidade
subcrônica com D. rerio.
97
Tabela 18 – Ensaio de toxicidade aguda empregando Danio rerio (n=6), expostos à água de
torneira aerada (CN) e às diluições de efluente têxtil não remediado (EB), remediado pela
empresa (ETE) e remediado com quitosana pulverizada (QTS3), por 48 h. Determinações
realizadas em triplicatas.
Efluentes Porcentagem de mortalidade (%)
Água de torneira aerada 0
EB a 100 %
EB a 50 %
EB a 30 %
EB a 20 %
EB a 1 %
100
100
100
0
0
ETE a 100 %
ETE a 50 %
ETE a 30 %
ETE a 20 %
ETE a 1 %
0
0
0
0
0
QTS a 100 %
QTS a 50 %
QTS a 30 %
QTS a 20 %
QTS a 1 %
0
0
0
0
0
4.2.3.1.6 Ensaios de toxicidade subcrônica com Danio rerio
a) Avaliação do dano às membranas celulares através da medida da
lipoperoxidação (TBARS)
Na figura 17 são apresentados os resultados obtidos a partir da exposição
de Danio rerio, durante 7 dias, a 20 % dos efluentes EB, ETE e QTS3. Os peixes
expostos ao efluente QTS320 apresentaram os menores níveis de lipoperoxidação
(55,06 ± 11,42 nmol.g
-1
) comparativamente ao ETE20 (78,60 ± 4,45 nmol.g
-1
), sem
98
no entanto apresentar diferença significativa em relação aos animais do controle
negativo (CN) (52,72 ± 9,18 nmol.g
-1
).
Por outro lado, os peixes que foram expostos ao efluente EB20 (123,56 ±
10,72 nmol.g
-1
) apresentaram valores 2,3 vezes maiores do que os apresentados
pelos peixes mantidos em água de torneira aerada (CN), cerca de 1,6 vezes maiores
do que os apresentados pelos peixes mantidos em ETE20, e cerca de 2,2 vezes
maiores do que o QTS320.
Efluentes
T
B
A
R
S
(
n
m
o
l
.
g
-
1
)
CN EB20 ETE20 QTS3 20
0
50
100
150
**
*
**
Figura 17 – Índice de lipoperoxidação (TBARS, nmol.g
-1
) em homogenato de pool de Danio
rerio (n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não
remediado (EB20), a 20 % do efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % do
efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 7 dias. Todos os valores
foram expressos como média ± EPM. (**) e (*) representam diferenças estatísticas
significativas em relação ao EB20, para (p<0,01) e (p<0,05), respectivamente.
Determinações realizadas em triplicatas.
99
b) Glutationa reduzida (GSH)
A figura 18 apresenta os resultados obtidos com relação à concentração de
GSH de D. rerio expostos por 7 dias a 20 % dos efluentes EB, ETE e QTS3.
Os peixes expostos a QTS320 também apresentaram os menores níveis de
GSH (8,34 ± 0,94 µmol.g
-1
) comparativamente ao EB20 (31,43 ± 6,01 µmol.g
-1
) com
diferença significativa (p<0,001). Não houve diferença estatística de QTS320 em
relação ao controle negativo (CN) (9,17 ± 0,30 µmol.g
-1
).
Da mesma forma, os animais expostos ao efluente ETE20 (13,70 ± 1,46
µmol.g
-1
) apresentaram diferença estatística em relação aos animais expostos ao
efluente EB20 (p<0,001). Curiosamente houve um aumento de 3,4 vezes na
concentração da GSH nos animais expostos ao efluente EB20, em relação ao grupo
controle negativo (CN).
Efluentes
G
S
H
(
µ
m
o
l
.
g
-
1
)
CN EB20 ETE20 QTS3 20
0
10
20
30
40
***
***
***
Figura 18 – Concentração de GSH (µmol.g
-1
) em homogenato de pool de Danio rerio (n=6),
expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado (EB20), a
20 % do efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % do efluente remediado com
quitosana pulverizada (QTS320), durante 7 dias. Todos os valores foram expressos como
média ± EPM. (***) representa diferença estatística significativa (p<0,001), em relação ao
efluente EB20. Determinações realizadas em triplicatas.
100
c) Atividade da enzima catalase (CAT)
Na figura 19 constam os resultados obtidos com 7 dias de exposição, após
os quais a atividade manteve-se elevada em Danio rerio expostos tanto no efluente
QTS320 (118,30 ± 9,30 mmol.min
-1
.g
-1
) quanto no efluente ETE20 (102,70 ± 4,52
mmol.min
-1
.g
-1
). Ambos não apresentaram diferenças estatísticas significativas entre
si e em relação ao controle negativo (CN) (103,65 ± 10,76 mmol.min
-1
.g
-1
).
Nos animais expostos ao efluente EB20 (45,85 ± 1,90 mmol.min
-1
.g
-1
), houve
uma redução na atividade desta enzima. Pode-se verificar também que os animais
expostos aos efluentes QTS3 20 e ETE20 apresentaram diferenças estatisticamente
significativas em relação aos animais expostos ao efluente EB20 (p<0,001 e p<0,01;
respectivamente) sem, no entanto, apresentar diferença em relação ao grupo
controle (CN).
Efluentes
C
A
T
(
m
m
o
l
.
m
i
n
-
1
.
g
-
1
)
CN EB 20 ETE 20 QTS3 20
0
50
100
150
***
**
**
Figura 19 – Atividade enzimática da catalase (CAT) (expressa em mmol de H
2
O
2
consumido
min
-1
.g
-1
) em homogenato de pool de Danio rerio (n=6), expostos à água de torneira aerada
(CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela
empresa (ETE20) e a 20 % de efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320),
durante 7 dias. Todos os valores foram expressos como média ± EPM. (***) e (**)
representam diferenças estatísticas significativas (p<0,001) e (p<0,01), respectivamente, em
relação ao efluente EB20. Determinações realizadas em duplicatas.
101
4.2.3.1.7 Ensaios de genotoxicidade com Danio rerio
a) Avaliação do dano ao DNA (Teste cometa)
A tabela 19 apresenta a freqüência de distribuição de cometas em cada
classe por tipo de exposição realizada. Os resultados para os grupos expostos a 20
% do efluente QTS3 e o controle negativo mostraram uma predominância das
classes associadas a um dano menor (classes 0 e 1). Por outro lado, nos grupos
expostos a 20 % do efluente ETE houve um aumento nas freqüências das classes
de maior dano (classes 2, 3 e 4), em relação ao controle negativo (CN).
Tabela 19 – Freqüência de classes de dano ao DNA (teste cometa) em homogenato de
Danio rerio (n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não
remediado (EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % do
efluente remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias. Todos os valores
foram expressos como média ± EPM. Determinações realizadas em duplicatas.
Efluentes
(20 %)
Frequência das Classes de Dano (%)
Classe 0 Classe 1 Classe 2 Classe 3 Classe 4
Água torneira
Aerada (CN)
79,3 ± 14,2 17,0 ± 11,0 0,6 ± 1,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
EB20 12,5 ± 7,0 7,5 ± 10,5 23,7 ± 1,7 6,2 ± 5,2 0,0 ± 0,0
ETE20 35,6 ± 6,7 10,2 ± 5,7 3,4 ± 4,2 0,3 ± 0,8 0,6 ± 1,1
QTS320 40,0 ± 7,0 8,7 ± 4,5 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0
Os resultados referentes ao índice de dano ao DNA para o homogenato de
cada um dos seis peixes expostos em diferentes tratamentos, são apresentados na
figura 20. O índice de dano apresentado pelos peixes expostos ao efluente QTS320
(3,00 ± 0,70) apresentou diferença estatística em relação ao apresentado pelo
102
efluente EB20 (29,50 ± 0,50), para p<0,001. Também não diferiu estatisticamente
em relação ao grupo controle negativo (4,75 ± 1,50).
O efluente QTS320 representou apenas 10,16 % do índice de dano
verificado nos peixes expostos ao efluente EB20, enquanto o efluente remediado
pela empresa ETE20 (8,25 ± 1,10) representou 27,9 % comparativamente ao EB20,
conforme pode ser visualizado na figura 20.
Efluentes
Í
n
d
i
c
e
d
e
d
a
n
o
a
o
D
N
A
(
0
-
4
0
0
)
CN EB 20 ETE 20 QTS3 20
0
10
20
30
40
***
***
***
Figura 20 – Índice de dano ao DNA (teste cometa) em homogenato de Danio rerio (n=6),
expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado (EB20), a
20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % do efluente remediado com
quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias. Todos os valores foram expressos como
média ± EPM. (***) representa diferença estatística significativa em relação ao EB20
(p<0,001). Determinações realizadas em duplicatas.
b) Avaliação do dano secundário ao DNA (Teste de micronúcleos)
Os resultados referentes à freqüência de micronúcleos em eritrócitos de
peixes expostos aos diferentes tratamentos são apresentados na figura 21. Os
103
resultados obtidos com os ensaios no teste de micronúcleos confirmaram aqueles
que foram obtidos com a fragmentação do DNA no teste cometa. Os peixes
expostos ao efluente QTS320 durante 48 h, apresentaram menor freqüência de
micronúcleos (0,37 ± 0,12 ‰) estatisticamente significativa em relação ao EB20
(1,15 ± 0,16
‰), para p<0,01. Além de não terem diferido estatisticamente dos
animais do grupo controle negativo (CN) (0,37 ± 0,12 ‰), nem do ETE20 (0,57 ±
0,08 ‰). O efluente ETE20, por outro lado, também diferiu estatisticamente do
efluente EB20 (p<0,01).
Efluentes
F
r
e
q
ü
ê
n
c
i
a
d
e
M
i
c
r
o
n
ú
c
l
e
o
s
(
0
/
0
0
)
CN EB 20 ETE 20 QTS3 20
0.0
0.5
1.0
1.5
**
**
**
Figura 21 – Freqüência de micronúcleos em eritrócitos de sangue periférico de Danio rerio
(n=6), expostos à água de torneira aerada (CN), a 20 % do efluente têxtil não remediado
(EB20), a 20 % de efluente remediado pela empresa (ETE20) e a 20 % do efluente
remediado com quitosana pulverizada (QTS320), durante 2 dias. Todos os valores foram
expressos como média ± EPM. (**) representa diferença estatística significativa em relação
ao EB20 para (p<0,01). Determinações realizadas em duplicatas.
104
5 DISCUSSÃO
A quitosana pulverizada foi apontada por Kimura (2001) como sendo um
agente adsorvente adequado à remoção de cor de corantes e de efluentes têxteis.
Já Spinelli (2001) considerou este biopolímero como um coagulante adequado ao
tratamento de águas superficiais destinadas ao abastecimento público. Chen, Chen
e Wu (2003) também consideraram a quitosana como um floculante orgânico
adequado ao tratamento de água e efluentes. O trabalho realizado por estes
pesquisadores elucidou os mecanismos envolvidos na floculação com quitosana.
Estes autores verificaram que a massa molar de quitosana exerce um papel na
floculação maior do que o exercido pelo grau de desacetilação. Também foi
postulado que, em termos de microambiente estrutural, as ligações em ponte são
dominantes em relação à capacidade deste floculante em promover a neutralização
de cargas.
Por outro lado, a capacidade de atuar com agente floculante também varia
com o aumento do grau de desacetilação da quitosana. Quando ocorre um aumento
no número de grupos amino (-NH
2
) na cadeia do polímero ocorre um aumento da
massa molar da quitosana. A elevação da massa molar, por sua vez, determina uma
mudança na configuração da molécula de quitosana em solução, que pode adquirir a
forma estendida ou enovelada (CHEN; CHEN; WU, 2003).
Com relação à morfologia das partículas de quitosana pulverizada utilizada
na presente pesquisa verificou-se a predominância de flocos com certa uniformidade
em suas dimensões, apresentando uma superfície irregular com estrias e dobras
suaves que proporcionaram um aumento na área de contato entre a partícula e os
105
efluentes, favorecendo o processo de adsorção. Em estudos previamente realizados
no Laboratório QUITECH por Valentini et al. (2000) e por Kimura (2001), verificou-se
que a quitosana em pó, flocos e microsferas, utilizadas na presente pesquisa,
apresentaram pouca porosidade. É importante destacar que a porosidade é outro
fator que pode influenciar diretamente a velocidade de adsorção (KIMURA, 2001).
O uso do polieletrólito quisotana pulverizada como coagulante no processo
de tratamento de águas apresenta ainda a vantagem de ser atóxica (SPINELLI,
2001), enquanto o uso de sulfato de alumínio e outros compostos de alumínio como
coagulante inorgânico no tratamento de águas de rios ou lagos, pode determinar um
aumento significativo do conteúdo deste metal na água tratada e, desta forma,
representar riscos à saúde (KEITH et al., 1999).
No presente trabalho, na busca pela formulação de quitosana mais
adequada, foram realizadas três abordagens para a remediação do efluente têxtil.
Inicialmente, com microsferas de quitosana as quais, apesar de possibilitarem a
remoção de cor do efluente têxtil levaram a uma importante redução do pH (Tabela
9). Resultado semelhante foi obtido por Kimura et al. (2001), que verificaram uma
maior remoção da cor de efluentes têxteis em pH ácido, com microsferas de
quitosana.
Provavelmente devido à redução do pH, o efluente remediado com QTS1
demonstrou toxicidade frente aos organismos bioindicadores Artemia sp e Daphnia
magna e, por esta razão, foi descartado dos ensaios posteriores.
No caso da remediação com QTS2, onde foi utilizado o processo de
coagulação/floculação com quitosana, embora tenha havido uma importante
106
porcentagem de remoção de cor do efluente (Tabela 7) houve também elevada
toxicidade para os organismos bioindicadores (Tabela 12). É importante observar
que houve a necessidade de utilizar óxido de cálcio para correção do pH da solução
de quitosana, antes de efetuar a remediação do efluente. Considerando-se que o
óxido de cálcio causou toxicidade em ensaios preliminares realizados com Artemia
sp, provavelmente por esta razão o efluente QTS2 também causou importante
toxicidade para os microcrustáceos utilizados (Artemia sp e D. magna) nos testes
preliminares e, desta forma, foi excluído dos ensaios posteriores.
Já a quitosana pulverizada em suspensão aquosa (QTS3) apresentou
eficiência na remoção da cor (Tabelas 7 e 8) sem alterar o pH do efluente remediado
(Tabela 9). Da mesma forma, Kimura (2001) verificou que a adsorção de corantes
têxteis foi maior utilizando quitosana pulverizada comparativamente ao uso de
microsferas de quitosana na remoção da cor de corantes têxteis.
Com respeito à avaliação toxicológica de efluentes industriais, os parâmetros
físico-químicos avaliados na presente pesquisa, apresentados nas tabelas 9, 10 e
11; deve-se considerar principalmente o pH, a condutividade e dureza podem afetar
a toxicidade de substâncias, incluindo os metais (KNIE; LOPES, 2004).
Graff et al. (2003) demonstraram que os parâmetros condutividade e dureza
são fatores que afetam de maneira significativa a toxicidade da água dos rios. Na
atual pesquisa, a condutividade do efluente bruto (4,693 ± 0,054 mS.cm
-1
) foi a
maior, comparativamente aos demais efluentes estudados (Tabela 11). No entanto,
causou alguma surpresa, por ser maior do que algumas amostras de chorume de um
aterro sanitário municipal, estudadas por Sisinno et al. (2000). Estas apresentaram
107
valores entre 3,09 e 6,20 mS.cm
-1
e dureza de 60 a 95 mg.L
-1
de CaCO
3
, que
contribuíram para causar toxicidade elevada a Danio rerio após 48 h de exposição.
Apesar da remediação com quitosana (QTS3) ter reduzido sensivelmente a
dureza do efluente remediado, ele apresentou valor acima daqueles obtidos por
Sisinno et al. (2000) para chorume de aterro sanitário. Isto revelou outro aspecto
curioso dos efluentes têxteis: a dureza causada pela adição de sais durante o
processo têxtil. Entre estes sais encontram-se o fosfato dissódico e bicarbonato de
sódio (SENAI; CETIQT; GTZ, 1998); silicato de sódio, polifosfatos, fosfato de
amônia, cloreto de amônia e cloreto de magnésio (VANDEVIVERE; BIANCH;
VERSTRAETE, 1998); além de dicromato de potássio, cloreto de ferro (III) e nitrito
de sódio (PERUZZO, 2003) e também permanganato de potássio (ASCHNER;
LUKEY; TREMBLAY, in press).
A dureza total da água pode influenciar de maneira significativa, tanto o
comportamento como a sensibilidade das espécies–teste. Águas que apresentem
dureza baixa em combinação com valores de pH decrescentes (a partir pH 6,9),
aumentam a biodisponibilidade de metais (KNIE; LOPES, 2004).
Para os testes com peixes, Knie e Lopes (2004) recomendam que sejam
utilizadas apenas águas com dureza na faixa de 250 mg.L
-1
de CaCO
3
. Segundo
estes autores, a norma ISO 7346 (1996) determina que o cultivo desta espécie pode
ser realizado em águas com dureza de até 300 mg.L
-1
. Por outro lado, segundo a
norma 15088 da ABNT (2004) para Danio rerio, os valores de dureza para o cultivo
devem estar entre 10 e 60 mg.L
-1
de CaCO
3
e entre 40 e 48 mg.L
-1
de CaCO
3
para a
água de diluição. Na presente pesquisa optou-se por utilizar a água de torneira com
a dureza apresentada (120,15 ± 7,70 mg.L
-1
de CaCO
3
) (Tabela 11), tanto no cultivo
108
como na diluição das amostras utilizadas nos ensaios, em função de Knie e Lopes
(2004) terem chamado a atenção sobre o fato de que em Santa Catarina, muitas
águas apresentam dureza muito próxima ou acima de 100 mg.L
-1
de CaCO
3
. Além
disto, o cálcio é um elemento essencial para o desenvolvimento dos peixes. A
dureza da água utilizada apresentou valor bem menor do que os limites
estabelecidos para a potabilidade de águas (500 mg.L
-1
) (BRASIL; FUNASA, 2001).
No local de lançamento de efluentes pode haver um enriquecimento de
nutrientes, conforme foi demonstrado em um estudo, no qual carpas (Cyprinus
carpio) que foram expostas a efluentes contendo substâncias tóxicas, apresentaram
crescimento em comparação ao grupo controle. Este crescimento pode ser explicado
graças aos nutrientes contidos nos efluentes que causam um enriquecimento
orgânico e, conseqüentemente, um aumento nos níveis de nutrientes disponíveis no
local onde forem lançados (SMOLDERS; BERVOETS; BLUST, 2004).
No entanto, os efluentes podem causar toxicidade variável de acordo com o
tempo de exposição, pois as substâncias presentes nos efluentes podem ser
degradadas ou transformadas pelos organismos expostos (SISINNO et al., 2000).
Além disso, deve-se ter em conta que as misturas complexas de corantes e
dos produtos da degradação dos mesmos, presentes nos efluentes estudados na
atual pesquisa, podem causar toxicidade aos organismos (PINHEIRO; TOURAUD;
THOMAS, 2004).
A toxicidade observada na presente pesquisa poderia ser relacionada aos
parâmetros físico-químicos anteriormente discutidos e à presença de cor no efluente
têxtil não remediado que pode ser atribuída à presença de vários corantes utilizados
109
no processo de tingimento na indústria têxtil em estudo. Conforme ressaltado por Oh
et al. (1997), os corantes reativos e os demais corantes que apresentam grupo azo,
ao sofrerem clivagem redutiva química ou enzimática originam as aminas
aromáticas. Algumas destas foram consideradas como carcinogênicas (PINHEIRO;
TOURAUD; THOMAS, 2004).
Apesar de que na presente pesquisa não foram efetuadas análises para
verificação dos níveis de aminas aromáticas em nenhum dos efluentes estudados,
pode-se especular que parte da toxicidade, particularmente a genotoxicidade,
verificada nos efluentes poderia ser atribuída à presença destas aminas nos
efluentes não remediados (EB) e nos remediados (ETE e QTS3).
Para reduzir o conteúdo de corantes nos efluentes Bastian, Santos e Ferrari
(2001) recomendam o uso de corantes que apresentem maior capacidade de
retenção à fibra têxtil, evitando-se ou até mesmo reduzindo-se o uso de corantes
que apresentam baixa porcentagem de retenção à fibra têxtil. A porcentagem de
retenção do corante no banho determina o quanto será retido na fibra têxtil e,
conseqüentemente, o quanto será perdido no efluente que resulta do processo de
tingimento. Estes autores ressaltam ainda que devem ser substituídos ou evitados
os corantes que apresentarem toxicidade aos organismos aquáticos, como no caso
daqueles que apresentam metais ou enxofre em sua estrutura. E os autores
concluem que devido à presença destes corantes nos efluentes que chegam à
estação de tratamento, o teor de enxofre no efluente aumenta muito e, através da
redução dos sulfatos a sulfetos, forma-se gás sulfídrico, que é tóxico para os
organismos e corrosivo para as tubulações.
110
Como verificado em vários trabalhos, a quitosana apresenta a capacidade
de remover a cor de soluções aquosas devido aos grupos funcionais amino e hidroxil
que existem em sua molécula. Estes grupos conferem ao biopolímero e polieletrólito
quitosana elevada afinidade por muitas classes de corantes, incluindo os corantes
dispersos, diretos, reativos, aniônicos, à cuba e ao enxofre; no entanto, conferem a
este biopolímero baixa afinidade por corantes catiônicos (CHAO et al., 2004; CHIOU;
LI, 2002; WU; TSENG; JUANG, 2001). Uma vez que na presente pesquisa a
remoção de cor obtida através da remediação com quitosana não foi completa,
pode-se supor que isto se deu provavelmente em função da baixa afinidade que a
quitosana pode apresentar por corantes catiônicos, conforme ressaltado no trabalho
de Chao et al. (2004).
Na presente pesquisa a remediação com quitosana pulverizada (QTS3)
também mostrou maior efetividade na remoção dos metais (Al, Co, Cr, Fe, Li, Mg,
Mn, Mo, Pb, Rb e Th), comparativamente à remoção por processo microbiológico e
físico-químico efetuado pela empresa (ETE), conforme pode ser verificado na tabela
10.
Vários estudos apontaram a quitosana como bom agente quelante de metais
pesados como mercúrio, cromo, cobre e íons metálicos (EIDEN; JEWELL;
WIGHTMAN, 1980; JANSSON-CHARRIER et al., 1996; WU; TSENG; JUANG, 2001;
JUANG; SHAO, 2002).
Fávere et al. (2004) verificaram a remoção de ferro (III) utilizando
microsferas de quitosana na remediação de efluentes de mineração de carvão, ricos
em Fe, Mn e Al. Da mesma forma, Laus et al. (2006) também utilizando microsferas
de quitosana verificaram a remoção de ferro (III) e de manganês (II) de águas
111
contaminadas pela mineração de carvão. Já Valentini et al. (2000) verificaram a
adsorção de Cu(II) e Ni(II) por cápsulas de quitosana e polivinilálcool (PVA). Fávere
(1994) verificou a adsorção dos íons Cu(II), Cd(II), Ni(II), Pb(II) e Zn(II) pelo
biopolímero quitina, quitosana e pelas quitosanas modificadas.
Os níveis de metais encontrados em todos os efluentes estudados na
presente pesquisa (Al, Co, Cr, Fe, Li, Mg, Mn, Mo, Pb, Rb, Th) também foram
inferiores comparativamente aos determinados para outros efluentes têxteis
estudados por Baptista (2001), nos quais a autora verificou a presença de Al, Cu,
Pb, Zn e Cr.
As principais fontes industriais de cromo são as empresas que produzem
corantes, as tinturarias e as indústrias têxteis (IARC,1990), o que pode explicar a
presença de cromo na presente pesquisa. Similarmente, Baptista (2001) e Smith
(1990) encontraram este elemento em estudos realizados com diferentes efluentes
têxteis.
O chumbo encontrado na presente pesquisa pode originar-se dos compostos
de chumbo utilizados como pigmentos em tintas e corantes (ABADIN et al., 2005). A
exposição aos compostos de chumbo, por sua vez, pode aumentar o risco de câncer
devido ao acúmulo de Pb nos ossos ou no leite materno (ETTINGER et al., 2004).
Entre os efluentes têxteis estudados por Smith (1990), antes de receberem
qualquer forma de tratamento, foram verificadas as presenças dos metais Cd, Cu,
Hg e Zn. Porém, estes metais não foram detectados na presente pesquisa em todos
os efluentes estudados.
112
Na atual pesquisa, foram verificadas concentrações diferentes de metais
sendo em geral maiores no efluente EB, embora alguns metais tenham apresentado
elevação no efluente ETE e tenham sido sempre menores no efluente QTS3,
indicando que os processos de remediação tiveram eficácia diferenciada na remoção
de metais do efluente final.
Portanto, é importante ressaltar que do ponto de vista qualitativo, no efluente
QTS3 houve a diminuição de todos os metais enquanto no ETE houve o aumento de
alguns metais (Co, Mg, Pb, Rb e Th) (Tabela 10), provavelmente em função do
acréscimo de polieletrólito ou descolorante (resina) no decantador terciário (Figura
4).
Com relação aos metais Al, Co, Cr, Fe, Mg, Mn, Mo, Pb, Rb e Th, Smith (1990)
verificou valores muito maiores comparativamente aos encontrados para estes
metais na presente pesquisa. Embora este autor não tenha detectado lítio (Li) em
todas as amostras estudadas, este metal foi detectado na presente pesquisa nos
efluentes EB e ETE (Tabela 10) provavelmente devido ao fato deste elemento ser
utilizado como agente promotor de inibição da corrosão em sistemas de resfriamento
(CrLi
2
O
2
) ou como umectante em sistemas de ar condicionado (LiBr) (BIRCH, 1988;
LÉONARD; HANTSON; GERBER, 1995).
Na presente pesquisa, o lítio (Li) (Tabela 10) apresentou valores muito abaixo
do máximo permitido para o lançamento de efluentes, que é de 2,5 mg.L
-1
(CONAMA, 2005); embora haja certa controvérsia estudos apontam para possíveis
efeitos teratogênicos associados à exposição a compostos de lítio (LÉONARD;
HANTSON; GERBER, 1995).
113
Os efluentes em estudo são despejados após prévio tratamento na
microbacia do Rio Itajaí, cujas águas são captadas para abastecimento público.
Então este rio, dentro de sua microbacia, pode ser enquadrado ao longo de seu
percurso nas classes I, II e III da Resolução CONAMA (2005). Por esta razão,
efetuou-se a comparação entre os valores obtidos para a concentração de metais
nos efluentes e os valores máximos permitidos para lançamento no corpo receptor,
apresentados na tabela 20.
Tabela 20 – Concentração máxima de metais permitida para lançamentos em corpos de
água doce (Classes I, II e III) e para lançamento de efluentes industriais (CONAMA, 2005),
em ppm (µg. L
-1
).
Metais Padrões (valor máximo µg.L
-1
)
Águas doces
Classes I e II
Águas doces
Classe III
Lançamento de
Efluentes
Al 100,0 200,0 n.c.
Cd 1,0 10,0 200,0
Co 50,0 200,0 n.c.
Cr 50,0 50,0 500,0
Cu 9,0 13,0 1000,0
Fe 300,0 5000,0 15000,0
Hg 0,20 2,0 10,0
Li 2500,0 2500,0 2500,0
Mg n.c. n.c. n.c.
Mn 100,0 500,0 1000,0
Mo n.c. n.c. n.c.
Pb 10,0 33,0 500,0
Rb n.c. n.c. n.c.
Th n.c. n.c. n.c.
Zn 180,0 5000,0 5000,0
n.c. = nada consta
Apesar de que, nesta pesquisa, ser abordado apenas o monitoramento do
tratamento de efluentes industriais, deve-se ter em mente que, quando os efluentes
são lançados nos rios eles afetam a qualidade das águas dos mesmos. As águas
114
dos rios são utilizadas para abastecimento público, somente após tratamento
convencional ou avançado (CONAMA, 2005). Desta forma, a presença de
substâncias tóxicas na água bruta que é captada para tratamento deve ser também
monitorada.
Os metais Al, Co, Mg, Mo, Rb e Th não foram contemplados na Resolução
do CONAMA (2005), o que causa certa preocupação, uma vez que entre os efeitos
tóxicos associados aos metais podem estar envolvidos neurotoxicidade e a
hepatotoxicidade; além de ser obrigatório efetuar-se uma avaliacão da toxicidade
aguda para peixes de água doce (UNITED STATES ENVIRONMENTAL
PROTECTION AGENCY - USEPA, 1991).
Estudos indicam que o Al pode influenciar a homeostase do Fe, e também
pode contribuir para a toxicidade sobre células nervosas nas quais o dano tenha
sido induzido por radicais livres mediados pelo Fe (STOHS; BAGCHI, 1995); o Al
também foi associado à osteosporose e ao mal de Alzheimer (KISNIERIENË;
SAKALAUSKAS, 2005); o cobalto (Co) pode afetar a transmissão neuromuscular
(FAROON et al., 2004); os efeitos tóxicos do magnésio (Mg) são dose-dependentes
e ocorrem principalmente nos sistemas cardiovascular e nervoso (TOFIL; BENNER;
WINKLER, 2005); o tório (Th) pode acumular-se nos ossos segundo Agency for
Toxic Substances and Desease Registry (ATSDR) ligada ao Center of Desease
Control (CDC) norte americano (ATSDR, 1990); com relação ao rubídio (Rb) estudos
demonstraram que a exposição conjunta ao chumbo (Pb) levou ao aumento da
concentração do Rb sangüíneo (SINGH et al., 1994) e, a exposição tanto ao Rb
quanto ao Lítio causou lesões renais em roedores (BERTELLI et al., 1985).
115
Na presente pesquisa o magnésio foi o elemento que apresentou maiores
valores em todos os efluentes, embora tenha sido maior no efluente ETE. Isto
ocorreu provavelmente em função da adição de compostos que apresentam este
elemento durante o tratamento dos efluentes ou ainda devido à adição de sais de
magnésio durante o processo têxtil (VANDEVIVERE; BIANCH; VERSTRAETE,
1998), o que pode explicar sua presença no efluente EB.
Smith (1990) menciona que uma quantidade razoável de contaminação
presente nos efluentes têxteis pode originar-se do próprio substrato como no caso
das fibras celulósicas (algodão), pois estas apresentam altos níveis de vários
contaminantes metálicos provenientes de fungicidas. Este autor refere-se ao fato de
que os contaminantes, normalmente, se desprendem durante o processo de
beneficiamento das fibras.
A presença do Mn nos efluentes da indústria têxtil em estudo poderia ser
devida ao uso de fungicidas à base de manganês (Mn) no cultivo de algodão
(SMITH, 1990) ou ao uso de permanganato de potássio para remoção de odores
dos efluentes (ASCHNER; LUKEY; TREMBLAY, in press).
É importante lembrar ainda que a exposição contínua ao manganês pode
levar a alterações neurofuncionais e a uma condição neurológica crônica
denominada como manganismo (MERGLER, 1999).
A Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) através da Portaria n
o
1469 de
2000 determinou os padrões de potabilidade da água para consumo humano
(BRASIL; FUNASA, 2001). Nesta portaria foi apresentando o valor máximo permitido
para as substâncias inorgânicas com potencial tóxico que podem estar presentes na
água potável. Foram propostos os valores máximos permitidos para o alumínio (0,2
116
mg.L
-1
), o cádmio (0,005 mg.L
-1
), o cromo (0,05 mg.L
-1
), o cobre (2,0 mg.L
-1
), o ferro
(0,3 mg.L
-1
), o mercúrio (0,001 mg.L
-1
), o manganês (0,1 mg.L
-1
) e o chumbo (0,01
mg.L
-1
), entre outros.
No caso da presente pesquisa, diferentes efluentes contendo misturas
complexas de metais podem ocorrer variações, conforme ressaltado por Roney e
Colman (2004). Tais variações podem contribuir para os efeitos tóxicos sobre os
organismos expostos como é possível discernir ao serem observados os resultados
obtidos em várias pesquisas realizadas sobre a toxicidade de metais, principalmente
no caso do alumínio e seus compostos.
O alumínio é o primeiro metal e o terceiro elemento químico mais abundante
na crosta terrestre, depois do oxigênio e do silício. Trata-se de um elemento muito
reativo que nunca é encontrado como metal livre na natureza. Este elemento
combina-se com outros, formando compostos que podem ser encontrados na água
em sua forma iônica. Os compostos de alumínio apresentam muitas e importantes
aplicações, entre as quais se destaca o emprego em tratamento de água. A
concentração de alumínio em águas naturais, assim como na água potável, é baixa
(<0,1 ppm), exceto em águas muito ácidas nas quais o alumínio pode se dissolver.
Entretanto, o alumínio dissolvido na água causa toxicidade para organismos
aquáticos incluindo os peixes (KEITH et al., 1999). O valor máximo ou limite de
concentração permitido na água para consumo humano estabelecido para o Al na
água é de 0,2 mg.L
-1
(BRASIL; FUNASA, 2001).
Já na presente pesquisa, o nível maior de alumínio encontrado no efluente
proveniente do tratamento convencional (ETE), certamente deve-se à utilização de
sulfato de alumínio na empresa têxtil em estudo (Figura 4).
117
Por outro lado, a toxicidade do alumínio e a acumulação ao longo prazo tem
sido apontadas como uma das possíveis causas da osteoporose e do mal de
Alzheimer. Também no meio ambiente a liberação deste metal do solo pela chuva
ácida tem afetado seriamente as florestas e a vida aquática (KISNIERIENË;
SAKALAUSKAS, 2005).
Na presente pesquisa todos os efluentes estudados apresentaram níveis
muito baixos de metais, especialmente o efluente remediado com quitosana QTS3,
cujos valores foram os menores. Em todos os casos os valores estavam abaixo dos
máximos permitidos para lançamento de efluentes em corpo de água receptor,
segundo CONAMA (2005), o que pode ser constatado comparando-se as tabelas 10
e 20. No entanto, os efluentes tratados ainda podem causar toxicidade aos
organismos aquáticos (BAPTISTA et al., 2002).
Como a quitosana apresenta capacidade de remover cor e metais em
soluções aquosas, e com base nas características da quitosana pulverizada, pode-
se considerar que esta atende a alguns dos critérios utilizados em uma avaliação
preliminar que deve ser efetuada antes do uso de substâncias químicas, segundo
recomendado por Smith (1990). Este autor estabeleceu tais critérios de maneira a
promover uma redução no potencial poluidor de produtos a serem empregados em
indústrias têxteis.
Entre os critérios de Smith (1990) que podem ser aplicados à quitosana
pulverizada encontram-se o desempenho, a biodegradabilidade, a baixa toxicidade
e, conseqüentemente, menor risco para o operador do sistema de tratamento e para
o consumidor final da água tratada com este coagulante conforme demonstrado nos
trabalhos de Kimura (2001) e Spinelli (2001).
118
Outro aspecto que justificaria o uso de quitosana pode ser encontrado em
um estudo de Cheng et al. (2005). Estes autores verificaram a viabilidade econômica
do emprego de quitosana dissolvida em ácido acético (6 %) utilizada no tratamento
de efluentes. A quitosana empregada como coagulante foi mais efetiva em remover
partículas coloidais orgânicas em suspensão existentes em efluentes de cervejaria.
A remoção de 95 % de turbidez foi atingida com o uso de 120 mg de quitosana por
litro. Segundo estes autores, tal eficiência na remoção pode ser devida aos grupos
funcionais (cargas positivas na superfície da quitosana em pH baixo), ou ainda em
função do tamanho das partículas em suspensão, uma vez que colóides podem
ligar-se à superfície da quitosana. Por outro lado, os autores ressaltam que para
obter resultado semelhante com o coagulante sulfato de alumínio, foram necessários
350 mg. Cheng e colaboradores consideraram que levando em conta as relações de
custo e benefício, o emprego da quitosana revelou-se mais vantajoso no caso do
pré-tratamento de efluentes gerados em algumas das etapas da produção da
cervejaria, além de não ter sido necessário o ajuste do pH do efluente, o qual foi
mantido em 4,5. Após o tratamento do efluente os sólidos em suspensão adsorvidos
na quitosana formaram-se 15 g de resíduo seco por litro. Este resíduo, segundo os
autores, pode ser vendido para obtenção de ração animal e, desta forma,
compensar os gastos com a aquisição de quitosana. Para uma produção de 200
toneladas de efluentes/dia são necessários 24 kg de quitosana, e são produzidas 3
toneladas de resíduos secos.
Portanto, apesar da quitosana ser aproximadamente de 10 vezes mais cara
do que o sulfato de alumínio, seu uso torna-se economicamente viável quando os
resíduos gerados são empregados em outro processo produtivo (CHENG et al.,
2005).
119
Desta forma, a viabilidade da utilização da quitosana pode ser apoiada pelos
resultados de Cheng et al. (2005), como também pelos resultados obtidos na
presente pesquisa, na qual houve uma remoção de 80,76 ± 1,00 % da cor de
efluente têxtil utilizando 18,7 g de quitosana por litro (QTS3), sem a necessidade do
ajuste do pH, o que representa redução de custos.
Por outro lado, a quitosana é um biopolímero altamente biodegradável e
aumenta a degradabilidade de compostos que estejam ligados a ela (USTINOV et
al., 2004), o que constitui outra vantagem quando se considera que o lodo gerado na
remediação dos efluentes poderia ser descartado nos aterros sanitários com menor
risco ambiental. Isto seria possível tendo-se em vista que a disposição final em
aterros do lodo gerado através do tratamento de água com quitosana não representa
prejuízo ambiental, conforme ressaltado por Spinelli (2001).
Para avaliar os efeitos que misturas de corantes causam em organismos
aquáticos, devem ser empregados conjuntamente diferentes organismos-teste de
forma a obter-se um quadro mais completo dos efeitos que determinadas
substâncias, misturas complexas ou efluentes podem causar em diferentes níveis
tróficos conforme ressaltado por Baptista (2001).
A toxicidade de corantes foi determinada através da exposição de larvas de
Artemia salina, em diferentes intervalos de tempo (0, 6, 12 h) às diferentes
concentrações do corante cristal violeta diluído em água do mar. Na concentração
de 115 mg.L
-1
(24 h), o corante cristal violeta apresentou importante toxicidade para
A. salina (EL-NAGGAR; EL-AASAR; BARAKAT, 2004).
120
Similarmente, na presente pesquisa após a exposição dos náuplios de
Artemia sp estes apresentaram sensibilidade já nas primeiras 24 h de exposição ao
efluente não remediado (EB), porém os demais efluentes remediados (ETE e QTS3)
não causaram toxicidade a estes microcrustáceos, conforme pode ser verificado nas
tabelas 12 e 14. De forma similar, El-Naggar; El-Aasar e Barakat (2004) verificaram
que os produtos da degradação do corante cristal violeta por Pseudomonas
aeruginosa em bioreator aerado não foram tóxicos para A. salina.
Estudos com larvas de artêmias com 24, 48 e 72 h de vida demonstraram
que a sensibilidade aos produtos químicos difere com a idade; sendo que as larvas
com 72 h apresentam maior sensibilidade (BARAHONA; SÁNCHEZ-FORTÚN, 1996;
FORTÚN et al., 1997). Corroborando estes dados, Benassi (2004) verificou que
náuplios expostos por 48 h foram sensíveis a um efluente rico em metais.
Comparativamente, na presente pesquisa a maior toxicidade do efluente
têxtil não remediado (EB) levou à imobilidade já nas primeiras 24 h de exposição e,
no mesmo período, o efluente remediado com QTS3 não causou toxicidade para os
náuplios. Resultado semelhante foi observado em 48 h, indicando que este estágio
também não apresentou sensibilidade.
Embora o efluente não remediado (EB) tenha apresentado níveis baixos de
metais, pode-se supor que os náuplios de Artemia sp também foram sensíveis aos
mesmos.
Na presente pesquisa, os náuplios de Artemia sp expostos ao efluente não
remediado (EB) foram mais sensíveis já nas primeiras 24 horas de exposição,
comparativamente aos microcrustáceos de água doce (D. magna), expostos ao
121
mesmo efluente. No entanto, os náuplios de Artemia sp não foram sensíveis aos
efluentes ETE e QTS3, sendo que apenas os efluentes EB e ETE causaram
toxicidade aos juvenis de D. magna (Tabela 15).
Similarmente, Benassi (2004) também verificou que os náuplios de A. salina
mostraram-se um pouco mais sensíveis que as formas juvenis de D. magna, quando
expostos a efluentes de mineração de carvão ricos em metais. Por outro lado, Silva,
Dezotti e Sant’Anna Júnior (2004) também verificaram que indivíduos de A. salina
apresentaram menor sensibilidade, comparativamente aos juvenis de D. similis
expostos a chorume de aterro sanitário.
Em estudos de toxicidade aguda utilizando o organismo-teste D. similis,
realizados com dois esgotos distintos provenientes de uma planta de tratamento de
água que utiliza alumínio e de outra planta que utiliza cloreto férrico, foi observado
que estes não causaram toxicidade aguda aos microcrustáceos. O sulfato de
alumínio [Al
2
(SO
4
)
3
.18H
2
O] e cloreto férrico (FeCl
3
.6H
2
O) são substâncias químicas
utilizadas normalmente como coagulantes primários em estações de tratamento de
água, durante o processo de floculação/decantação. No entanto, após exposição
crônica (14 dias), verificou-se que ambos os esgotos causaram redução na taxa de
reprodução, enquanto o esgoto contendo cloreto férrico causou alguma mortalidade
(SOTERO-SANTOS; ROCHA; POVINELLI, 2005).
Na presente pesquisa, na exposição aguda de indivíduos jovens de D.
magna verificou-se que o efluente não remediado apresentou toxicidade com fator
de diluição FD=2, porém o efluente remediado ETE causou maior toxicidade aos
organismos expostos com FD=4, acima do determinado pela FATMA (2002). Por
outro lado, o efluente QTS3 não causou toxicidade aos organismos-teste, o que
122
indica que a remediação com quitosana foi mais eficaz na redução da toxicidade dos
efluentes têxteis.
Resultados similares foram obtidos por Baptista et al. (2002), que também
verificaram que o efluente têxtil não tratado causou toxicidade para D. magna (CE
50
=2,25 %), embora o efluente tratado em lagoas de estabilização não tenha sido
tóxico para estes organismos, ao contrário da presente pesquisa na qual o efluente
ETE foi mais tóxico para estes organismos. Portanto, os valores das concentrações
efetivas (CE
50
) apresentados por Baptista et al. (2002) para o efluente têxtil foram
muito menores do que os obtidos na presente pesquisa para o EB (CE
50
=49,98 %) e
para ETE (CE
50
=49,80 %). O que sugere que os efluentes têxteis EB e ETE em
estudo apresentaram menor toxicidade de uma maneira geral e comparativamente
aos estudados por Batista e colaboradores.
Isidori et al. (in press) verificaram a toxicidade de alguns surfactantes
utilizando D. magna e Ceriodaphnia dubia. Estes autores observaram que, tanto na
exposição aguda de D. magna (24 h) quanto na crônica de C. dubia (7 dias), houve
toxicidade para os microcrustáceos, porém recomendaram os testes crônicos por
serem mais significativos em termos de concentrações efetivas.
Comparando os resultados da presente pesquisa obtidos com D. magna
para os efluentes não remediados e remediados (Tabelas 12 e 15) aos resultados
obtidos por Isidori et al. (in press) para os surfactantes, estes últimos foram mais
tóxicos, com CE
50
bem menores (CE
50
=0,09 a 1,20 %).
Na presente pesquisa, a toxicidade dos efluentes não remediados (EB) e
remediados (ETE e QTS3) também foi avaliada através de um microrganismo teste
123
(Vibrio fischeri) (Tabela 14), que é um bioindicador bioluminescente com inúmeras
aplicações biotecnológicas (NUNES-HALLDORSON; DURAN, 2003).
As bactérias bioluminescentes (V. fischeri) emitem luz em condições
ambientais favoráveis, porém na presença de substâncias tóxicas a
bioluminescência é reduzida. A diminuição da intensidade de luz é proporcional à
toxicidade da amostra testada e está associada com a inibição de processos
metabólicos das bactérias (KNIE; LOPES, 2004).
Na presente pesquisa nenhum dos efluentes remediados (ETE e QTS3)
apresentou toxicidade (FD=1) para V. fischeri. No entanto, o efluente têxtil EB, como
esperado, causou forte inibição na bioluminescência das bactérias (FD=64), muito
acima do permitido (FD=2) para o lançamento de efluentes têxteis nos corpos de
água receptores, segundo determinado pela Portaria n
o
17 (FATMA, 2002). Da
mesma forma, Baptista et al. (2002) e Wang et al. (2002) verificaram resultados
similares aos da presente pesquisa relativamente ao efluente não tratado e a
corantes, respectivamente; que também foram tóxicos para as bactérias. Embora
Baptista et al. (2002) tenham apontado as V. fischeri como sendo mais sensíveis do
que os demais organismos empregados, isto não ocorreu no caso da presente
pesquisa, onde apesar destas bactérias não terem sido afetadas pelo ETE após
exposição aguda (30 min), este causou maior toxicidade em D. magna e em D. rerio.
Por outro lado, remediação com quitosana apresenta algumas vantagens
sobre a biorremediação utilizando fungos. Entre as quais, pode-se destacar o fato de
que a quitosana ter apresentado uma rápida atuação (24 h) com a remoção de 80,76
± 1,0 % da cor de um efluente têxtil complexo contendo uma mistura de vários
corantes e de outras substâncias, como no caso verificado na presente pesquisa
124
(Tabela 7) e por Kimura (2001). Balan e Monteiro (2001) conseguiram após 24 h,
que é o tempo de retenção normalmente empregado nas indústrias, obter a remoção
de 64 % da cor do corante com Phellinus gilvus, de 75 % com Pleurotus sajor-caju, e
de 70 % com Pycnoporus sanguineus.
Entre os aspectos que dificultam o emprego de fungos em sistema de
tratamento de efluentes têxteis destaca-se metabolismo destes organismos. Apesar
de serem capazes de removerem a cor por mineralização enzimática (ZHENG et al.,
1999); por biosorção (CONNEELY; SMYTH; MACMULLAN, 1999; ZHENG et al.,
1999); por biodegradação (CONNEELY; SMYTH; MACMULLAN, 1999); ou ainda por
promoverem esta remoção por um ou mais destes processos (COULIBALY;
GOURENE; AGATHOS, 2003). Sua capacidade de metabolizar substâncias
depende de suas condições fisiológicas, dos nutrientes disponíveis e do crescimento
de sua biomassa (CONNEELY; SMYTH; MACMULLAN, 1999). Desta forma, essa
capacidade pode ser atingida apenas após um determinado período de tempo de
crescimento, que pode levar até duas semanas (BALAN; MONTEIRO, 2001;
VILLELA et al., 2005). Por outro lado, quando se emprega a quitosana pulverizada
na remoção de cor não existem tais problemas, uma vez que se trata de um material
de ação imediata (KIMURA, 2001).
Buscando-se verificar a toxicidade de efluentes têxteis sobre vegetais na
presente pesquisa foram efetuados ensaios com sementes e bulbos de Allium cepa.
Nos ensaios com sementes, estas foram expostas aos efluentes têxteis não
remediados (EB) e remediados (ETE e QTS3), que também continham uma mistura
complexa de substâncias (corantes, metais, surfactantes, etc.). Embora não se
tenham realizado ensaios de bioacumulação com as sementes ou com as plântulas,
125
trabalhos anteriores demonstraram que as plantas expostas a ambientes
contaminados com metais sofrem estresse (PIP, 1993) e podem acumular em seus
tecidos alguns destes metais (NOGAWA et al., 1989).
Considerando os resultados da presente pesquisa, pode-se perceber que
houve uma resposta muito parecida entre o controle negativo e os efluentes
estudados (EB, ETE e QTS3), tanto em termos de inibição da germinação quanto na
inibição do crescimento das plântulas, conforme pode ser verificado na tabela 16.
Isto poderia ter acontecido devido ao curto período de exposição de apenas 12 dias,
além de que as sementes não foram pré-embebidas. Embora Gallego, Benavides e
Tomaro (1996) tenham verificado os efeitos morfológicos do estresse após 4 dias de
exposição, as mudas estavam em um estágio de desenvolvimento mais avançado,
ou seja, já contavam com 21 dias desde a germinação.
Na presente pesquisa, nos ensaios conduzidos com bulbos de Allium cepa,
verificou-se o alongamento das raízes expostas aos efluentes EB, ETE e QTS3. No
período de exposição (3 dias) não houve diferenças estatísticas entre os resultados
obtidos com relação ao EB. Porém, houve uma maior inibição do crescimento das
raízes dos bulbos expostos ao efluente ETE do que a verificada nos bulbos expostos
ao efluente QTS3 (Tabela 17). É importante observar que a concentração de
alumínio presente no efluente ETE foi aproximadamente três vezes maior do que a
de QTS3. Estes resultados sugerem que o ensaio de inibição de crescimento de
raízes de bulbos apresentou mais sensibilidade do que o ensaio conduzido com
sementes e plântulas de A. cepa. Da mesma forma, Zhang e Zhou (2005)
consideraram que o crescimento de raiz foi um indicador mais sensível do que a
germinação das sementes. Estes autores verificaram os efeitos tóxicos causados por
126
coagulantes a base de alumínio: o cloreto de alumínio (AlCl
3
) e o cloreto de
polialumínio (CPA), este último apresentou toxicidade para ambos vegetais em
condições neutras. Os autores observaram ainda que ambos coagulantes causaram
redução no crescimento de raízes de Brassica chinensis e Raphanus sativus. Em
condições neutras, R. sativus foi mais sensível aos efeitos tóxicos de AlCl
3
,
e B.
chinensis foi mais sensível a este coagulante em pH ácido.
O sinal mais importante da toxicidade do alumínio para as plantas é a
inibição do crescimento de raízes (VAN SCHÖLL et al., 2004). A toxicidade deste
metal pode ser associada à ação que seus íons exercem sobre a parede celular e
sobre a membrana plasmática das células em desenvolvimento na raiz (AHN et al.,
2002). Verificou-se que o Al
3+
induziu mudanças no potencial de membrana
plasmática de células de Nitellopsis obtusa, provavelmente por afetar a homeostase
de Ca
2+
(KISNIERIENË; SAKALAUSKAS, 2005).
Nos ensaios, tanto com sementes quanto com bulbos de Allium cepa, na
presente pesquisa utilizou-se como controle positivo o dicromato de potássio, em
função do mesmo ser utilizado na indústria têxtil como oxidante (PERUZZO, 2003).
O dicromato de potássio (1,75 mg.L
-1
) causou forte inibição na germinação das
sementes, no desenvolvimento das plântulas e no alongamento de raízes de bulbos,
o que sugere que o uso de dicromato de potássio mesmo em menores
concentrações na indústria têxtil poderia representar um risco para as plantas
aquáticas, e mesmo aquelas cultivadas com água retirada de rio que tenha recebido
efluentes contendo dicromato de potássio.
A presente pesquisa, nos peixes (D. rerio) expostos por 48 h em ensaio
agudo estático aos efluentes ETE e QTS, não houve morte em nenhuma das
127
concentrações testadas. No entanto, após 24 h de exposição ao efluente EB, houve
mortalidade total de peixes expostos a todas as concentrações superiores a 20 %, o
que indica a toxicidade do mesmo. Desta forma, os ensaios conduzidos para a
determinação das defesas antioxidantes e genotoxicidade dos efluentes foram
efetuados com a concentração de 20 %. A renovação diária dos efluentes foi
necessária para reduzir o acúmulo de substâncias geradas pelo metabolismo dos
animais, bem como para garantir certa uniformidade na composição das substâncias
presentes nos efluentes utilizados nos ensaios, já que estas substâncias podem ser
degradadas ou biotransformadas pelos organismos expostos (SISINNO et al., 2000).
As misturas das substâncias presentes em efluentes têxteis podem
determinar o aumento da toxicidade sobre os peixes, conforme verificado por Meinelt
et al. (2001). Estes autores constataram que o Ca
2+
influencia diretamente a
toxicidade induzida por corante na presença de substâncias húmicas. Já alguns dos
corantes utilizados na indústria têxtil apresentam metais em sua estrutura
(ZOLLINGER, 1991); os quais além de causarem poluição afetando o ambiente
podem se acumular nos tecidos dos peixes (DEMIRAK et al., in press).
Além disso, Smith (1990) verificou em efluentes têxteis que, além de
misturas de corantes, também foram detectadas misturas de compostos fenólicos
que apresentaram toxicidade para os organismos aquáticos.
Sob condições de estresse, os peixes podem reagir fugindo ou podem sofrer
um processo de adaptação através de enzimas de defesa. Em peixes, o tipo de
resposta quantitativa com relação às defesas antioxidantes aparentemente depende
do tempo de exposição e dos níveis de poluição. Esta resposta ocorre de acordo
128
com a capacidade funcional dos órgãos e tecidos envolvidos (WILHELM FILHO et
al., 2001).
Portanto, existe a resposta celular ao estresse (RCE) que constitui um
mecanismo universal representado por uma reação de defesa da célula aos danos
que forças do meio ambiente causaram em macromoléculas. No entanto, muitos
aspectos da RCE não são específicos ao tipo de agente estressor porque as células
monitoram o estresse com base nos danos causados nas macromoléculas sem
considerar o tipo de estressor que produziu o dano. Então, o estudo dos
mecanismos de adaptação ao estresse e aos ambientes extremos pode nos fornecer
a base para o monitoramento de mudanças que estejam ocorrendo no meio (KÜLTZ,
2005).
Como conseqüência direta da exposição de células a alguns tipos de
estresse, ocorrem eventos moleculares que resultam no aumento na geração de
EROs. Isto ocorre no caso de exposição a agentes estressores, como substâncias
químicas altamente reativas. Como a RCE envolve a avaliação e a neutralização do
dano induzido pelo estresse, nas células expostas ocorre um aumento temporário da
tolerância a tal dano e/ou pode haver uma remoção das células danificadas através
da morte celular programada (apoptose) (KÜLTZ, 2005).
Evidências indicam que os metais de transição atuam na deterioração
oxidativa de macromoléculas e a toxicidade associada aos mesmos pode ser em
parte causada pelo dano oxidativo causado nos tecidos (STOHS; BAGCHI, 1995).
Verificou-se que Fe, Cu, Cr, Cd, Hg, Ni e Pb causam depleção da glutationa e dos
grupos sulfidrila das proteínas que resultam na produção de EROs, como
129
conseqüência ocorre um aumento da lipoperoxidação e de dano ao DNA (STOHS;
BAGCHI, 1995).
Em estudos realizados com animais expostos a efluentes provenientes da
lixiviação de rejeitos de mineração de carvão, houve um aumento no nível de
lipoperoxidação e também de dano ao DNA durante as duas primeiras semanas de
exposição, além de uma elevação na expressão de enzimas de estresse oxidativo
(catalase e superóxido dismutase), indicando sua toxicidade (BENASSI, 2004).
Wilhelm Filho et al. (2001) também verificaram uma elevação significativa no
nível de TBARS de peixes coletados em sítio com contaminação antrópica, em
relação ao grupo controle coletado em sítio referência, sem contaminação.
Na presente pesquisa os peixes que foram expostos por 7 dias aos efluentes
ETE e EB apresentaram um significativo aumento na lipoperoxidação de membranas
(Figura 17). Curiosamente, os animais expostos ao ETE apresentaram um nível de
lipoperoxidação relativamente alto em comparção aos animais expostos ao efluente
EB, sugerindo uma maior toxicidade do efluente remediado da forma convencional.
Já os animais expostos ao efluente QTS3, apresentaram níveis de lipoperoxidação
similares ao grupo controle e menores que dos animais expostos ao efluente ETE, o
que sugere que no efluente QTS3 houve uma redução significativa de toxicidade
para os peixes. Teoricamente, esta menor lipoperoxidação poderia estar associada
tanto à redução da concentração de metais quanto de corantes e surfactantes.
Similarmente, Ribeiro et al. (2000) verificaram que o efluente têxtil tratado
causou uma elevação nos níveis de TBARS e na concentração de GSH de
130
Oreochromis niloticus já na primeira semana de tratamento, esta tendência manteve-
se até a 4
a
semana.
Na presente pesquisa os animais expostos aos efluentes ETE apresentaram
uma correlação inversa entre os níveis de GSH e de TBARS, fato que também foi
verificado em acarás (Geophagus brasiliensis) expostos a ambientes contaminados
(WILHELM FILHO et al., 1997).
A ação protetora da GSH previne os danos às membranas celulares e a
outras macromoléculas. Esta molécula hidrossolúvel, por ser ubíqua, pode ser
encontrada desde os microrganismos, plantas e animais. A GSH é encontrada
principalmente no citossol celular e em outras fases aquosas de sistemas vivos,
onde desempenha um papel fundamental na regulação do balanço redox. Portanto
,
pode ser usada como um indicador de estresse oxidativo no processo de
detoxificação de xenobióticos (KONISHI et al., 2005; JEFFERIES et al., 2003).
Em um estudo realizado com peixes onde em ambos os tratamentos, tanto a
curto quanto em longo prazo, houve uma redução dos níveis de GSH. Supôs-se que,
a maior parte dos xenobióticos de origem industrial poderia ter sido detoxificada
através da via da GST, capacitando os animais a sobreviverem após a exposição à
toxicidade aditiva e/ou sinergística da mistura de substâncias tóxicas
(CHATTERJEE; BHATTACARYA, 1984). Esta diminuição no conteúdo de GSH
poderia ser um indício de que, num estresse severo, haja depleção deste tiol devido
à perda do mecanismo de adaptação ou devido à oxidação interna da GSH sem
haver a reposição de sua forma reduzida (ZHANG et al., 2005).
131
Jifa et al. (2005) verificaram que o conteúdo de GSH de peixes (Lateolabrax
japonicus) apresentou um declínio significativo após 6 dias de exposição ao
surfactante dodecilbenzeno sulfonato de sódio (DBSS), em relação ao grupo
controle; após este período observou-se uma tendência ao aumento na GSH. O
tratamento com dodecil sulfato de sódio (DSS), por outro lado, levou a um aumento
mais rápido de GSH.
Na presente pesquisa, no final do curto período de exposição (7 dias), pode-
se constar um aumento significativo de GSH nos animais expostos ao efluente não
remediado (EB) em relação ao grupo controle, indicando tratar-se de um estado de
estresse oxidativo, conforme pode ser observado na figura 18, e confirmado pelos
dados obtidos através de TBARS (Figura 19). A elevação dos níveis de GSH poderia
ser causada por surfactantes (JIFA et al., 2005), por metais (LANGE; AUSSEIL;
SEGNER, 2000), ou por azo corantes que apresentam potencial genotóxico (TSUDA
et al., 2000) presentes nos efluentes têxteis. Já os animais expostos ao efluente
remediado (QTS3) não apresentaram diferença significativa em relação ao grupo
controle, indicando que no processo de remediação com quitosana, houve redução
de toxicidade devido à remoção dos vários agentes estressores presentes no
efluente.
Desta forma, os resultados confirmam que a GSH é freqüentemente a
primeira linha de defesa contra o estresse oxidativo (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
1998). Os níveis de GSH podem aumentar devido a um mecanismo de adaptação a
um estresse oxidativo e, por outro lado, em caso de estresse severo, pode haver
supressão dos níveis de GSH devido à perda do mecanismo de adaptação, além de
ocorrer predominantemente oxidação da GSH para sua forma oxidada com uma
132
menor capacidade de regeneração da mesma por processo de redução (ZHANG et
al., 2005).
A GSH também está associada com a regulação e possivelmente com a
detoxificação de metais. Os níveis de GSH variaram de acordo com cada tipo de
metal, após exposição subletal de trutas (Oncorhynchus mykiss) a cádmio e zinco e
a uma combinação de ambos por um período de 14 e 28 dias. Após 14 dias houve
um leve aumento na GSH em todos os tratamentos. Porém, após 28 dias, apenas os
animais expostos à combinação de Zn e Cd (10 µg Cd.L
-1
com 1000 µg Zn.L
-1
)
apresentaram significativa elevação no conteúdo de GSH em relação ao grupo
controle. Houve acumulação de Cd, embora não tenha ocorrido acumulação de Zn
nos tecidos (LANGE; AUSSEIL; SEGNER, 2000).
Paris-Palacios; Biagianti-Risbourg e Vernet (2000) também verificaram um
aumento nas defesas antioxidantes hepáticas, tanto no conteúdo de GSH quanto no
da CAT, em peixes (Danio rerio) expostos por 14 dias a concentrações subletais de
cobre na forma de CuSO
4
(40 e 140 µg Cu.L
-1
). Esta substância, que tem atividade
antifúngica, é freqüentemente utilizada no cultivo de algodão e, juntamente com o
cobre, derivado de corantes metálicos; podem ser encontrados em efluentes têxteis
(BASTIAN; SANTOS; FERRARI, 2001; ZOLLINGER, 1991).
Benassi (2004) também verificou um aumento da atividade da CAT em
peixes (Oreochromis niloticus) expostos aos efluentes provenientes de mineração de
carvão não remediados, em relação ao grupo controle. Este autor sugere que a
presença de compostos tóxicos no efluente de carvão não remediado provavelmente
favoreceu a formação de peróxido de hidrogênio, potencializando a produção do
radical hidroxil via reação de Haber-Weiss. Isto sugere que a elevação da atividade
133
da CAT também constitui um indício de uma forte geração de O
2
•-
(HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1998).
Resultados similares foram obtidos em estudo semi-estático conduzido em
laboratório com fêmeas de Danio rerio que foram expostas a concentrações sub-
letais de sulfato de cobre (Cu SO
4
) (40 ± 5 e 140 ± 30 µg Cu. L
-1
), durante 7 e 14
dias de exposição seguidos de 14 dias de recuperação, em água limpa, ao final dos
quais os animais foram sacrificados. Em todos os peixes observou-se um aumento
linear na atividade da CAT, proporcional ao aumento da concentração de cobre e ao
tempo de exposição (PARIS-PALACIOS; BIAGIANTI-RISBOURG; VERNET; 2000).
Este resultado era esperado, pois o cobre é conhecido como promotor de estresse
oxidativo (SEGNER; BRAUNBECK, 1998).
Hermes-Lima e Storey (1996) consideram que a elevação da atividade da
CAT representa um caráter adaptativo que está associado à prevenção do estresse
oxidativo.
Curiosamente, na presente pesquisa os peixes expostos ao efluente QTS3
apresentaram diferença significativa em relação aos expostos ao efluente EB, nos
quais aparentemente houve uma inibição da atividade desta enzima. A atividade da
CAT para os peixes expostos ao efluente QTS3 não diferiu significativamente do
grupo controle (Figura 19), indicando novamente que a remediação com quitosana
reduziu a toxicidade do efluente, por ter retirado do efluente os agentes estressores.
Similarmente ao resultado obtido na presente pesquisa com peixes expostos
ao efluente EB, em estudo efetuado por Bainy et al. (1996) houve uma inibição da
atividade da CAT em tilápias (Oreochromis niloticus) expostas a um local poluído.
134
Corroborando os resultados do presente trabalho, Ribeiro et al. (2000)
verificaram que o efluente têxtil tratado causou uma inibição da atividade da CAT de
Oreochromis niloticus na primeira semana de tratamento, no entanto, verificou-se em
seguida um aumento da atividade desta enzima que se manteve até o final (4
a
semana) do tratamento.
Por outro lado, Jifa et al. (2005) verificaram que os níveis de CAT de peixes
(Lateolabrax japonicus) foram mantidos significativamente altos em peixes expostos
a surfactante após 6 dias de exposição, no entanto verificaram um decréscimo da
enzima no tempo máximo de exposição (18 dias) mantendo-se acima dos níveis
apresentados pelo grupo controle, o que indicou a toxicidade do surfactante
dodecilbenzeno sulfonato de sódio, enquanto os animais expostos ao surfactante
dodecil sulfato de sódio não apresentaram diferença significativa em relação ao
grupo controle.
Hermes-Lima e Storey (1996) verificaram que a atividade da CAT na
musculatura branca esquelética aumentou em rã-leopardo (Rana pipiens), quando
foram expostas a anóxia; porém, sem haver variação nas demais enzimas. Segundo
estes autores, esta elevação da atividade da CAT na musculatura representa um
caráter adaptativo que está associado à prevenção da lipoperoxidação. Desta forma,
a determinação da atividade da CAT, do nível de GSH e de TBARS fornecem
informações que possibilitam avaliar o estado de estresse oxidativo em que os
organismos se encontravam após a exposição a agentes estressores.
Os testes citogenéticos são provavelmente a forma mais sensível e eficiente
de detecção dos efeitos de substâncias genotóxicas. Entre estes se destaca o teste
cometa, no qual podem ser utilizados quaisquer tipos celulares que apresentem
135
núcleo, além de requer mínima quantidade de células sendo análises realizadas em
nível de cada célula individualmente (SUMATHI et al., 2001).
O estresse oxidativo causado por EROs também representa uma fonte de
dano ao DNA, pois devido à alta reatividade do radical hidroxil, este pode atuar
sobre a molécula do DNA gerando diversos produtos, uma vez que este radical pode
atacar os açúcares e também as bases do DNA em diferentes posições, como por
exemplo, com uma 2’-desoxiguanosina nas posições 4, 5 ou 8 do anel purínico
(BREEN; MURPHY, 1995).
Na presente pesquisa, além dos ensaios bioquímicos para a avaliação do
estresse oxidativo foram realizados testes citogenéticos com D. rerio expostos aos
efluentes têxteis remediados e não remediados, que foram posteriormente avaliados
pelo teste cometa que confirmou os resultados de Lemos et al. (2005). Segundo
estes autores a detecção precoce de efeitos adversos, como por exemplo, a
ocorrência de dano ao DNA poderia ser possível através da realização de ensaios
subletais.
Os resultados da presente pesquisa indicam que o efluente têxtil EB foi
capaz de induzir maior dano ao DNA das células presentes no homogenato que
incluía os tecidos: muscular, sanguíneo, hepático e os tecidos associados ao trato
gastrointestinal. Por outro lado, nos peixes expostos ao efluente QTS3 houve uma
fragmentação do DNA similar à que ocorre naturalmente, pois não apresentaram
diferenças significativas em relação ao grupo controle. Portanto, a remediação com
quitosana foi eficiente na remoção de agentes clastogênicos que induziram dano ao
DNA em peixes expostos ao efluente EB, conforme pode ser verificado na figura 20.
Os nucleóides podem ser observados na tabela 5.
136
Similarmente Sumathi et al. (2001) consideraram que os efluentes têxteis
contém agente(s) capaz(es) de induzir dano ao DNA de células do fígado e em
eritrócitos de peixes. Estes autores verificaram a genotoxicidade de efluente têxtil
através do teste cometa utilizando hepatócitos e eritrócitos de carpas (Cyprinus
carpio) e verificaram que, em ambos os tipos celulares, o comprimento máximo da
cauda dos cometas foi obtido no terceiro dia de tratamento, havendo um gradual
decréscimo deste comprimento que continuou até o 28
o
dia de tratamento. Também
foi observada uma tendência de aumento das quebras no DNA de maneira
diretamente proporcional ao aumento das concentrações do efluente têxtil testado.
A utilização de homogenato de pool de D. rerio na presente pesquisa
forneceu resultados similares aos obtidos por Jarvis e Knowles (2003). Estes autores
utilizaram organismos inteiros (embriões de D. rerio) no teste cometa, os quais
podem fornecer melhores indicações de dano ao DNA do que se o ensaio fosse
conduzido com poucos tipos celulares selecionados. Estes autores argumentam
ainda que é mais provável que diferentes tipos celulares possam demonstrar mais
adequadamente os danos provocados pela exposição do organismo.
Entre os metais, o alumínio destaca-se pelo seu efeito lesivo ao DNA, pois
pode formar complexos com macromoléculas e evidências sugerem que o núcleo e
a cromatina são freqüentemente sítios de ligação deste elemento na célula
(CRAPPER-MCLACHLAN, 1986; KARLIK; EICHHORN; CRAPPER-MCLACHLAN,
1980). Parte do dano ao DNA verificado na presente pesquisa poderia ser atribuída
ao alumínio detectado nos efluentes em estudo, principalmente no efluente ETE, no
qual também foram encontradas as classes de maior dano ao DNA (Tabela 19).
137
Benassi (2004) também verificou a toxicidade de efluentes ricos em metais
que, mesmo em uma diluição de 10 %, levaram à indução de dano ao DNA de
peixes (Oreochromis niloticus) expostos aos mesmos.
Lemos et al. (2005) com o objetivo de validar o teste cometa como
biomarcador de potencial genotóxico de substâncias indutoras de fragmentação do
DNA, utilizaram tilápias (Tilapia rendalli) expostas a águas de lago contaminado com
efluentes industriais e com despejos domésticos. Os autores concluíram que, o teste
cometa realizado com sangue periférico desta espécie é um bom biomarcador, de
acordo com os critérios estabelecidos por van der Oost, Beyer e Vermeulen (2003).
No presente trabalho, além do dano ao DNA avaliado pelo teste cometa,
também foi avaliada a genotoxicidade medindo-se a frequência de micronúcleos,
que foi maior nos peixes expostos ao efluente EB, como esperado, em função do
potencial genotóxico associados aos metais (FAROON et al., 2004) e aos azo
corantes (TSUDA et al., 2000). Já a remediação com quitosana foi eficiente na
remoção da genotoxicidade do efluente QTS3, pois os animais expostos a este
efluente apresentaram níveis similares de freqüência de micronúcleos aos do grupo
controle, conforme pode ser observado na figura 21.
Similarmente, o potencial genotóxico de efluentes de uma indústria têxtil foi
demonstrado através do aumento da freqüência de micronúcleos em eritrócitos do
sangue periférico de Oreochromis niloticus expostos por 3, 6 e 9 dias às diferentes
concentrações de efluente têxtil (ÇAVAS; ERGENE-GÖZÜKARA, 2003).
Curiosamente, não foram encontradas diferenças significativas entre as
frequências de micronúcleos de peixes da espécie Microtus pennsylvanicus
138
coletados em sítio referência daqueles coletados em rios contaminados com
pesticidas organoclorados e metais, como mercúrio, cádmio e chumbo.
Aparentemente, os animais não acumularam danos ao DNA suficientes para resultar
na formação de micronúcleos em eritrócitos acima dos níveis basais. Desta forma,
embora tenham apresentado danos primários ao DNA verificados através do teste
cometa, não apresentaram danos aos cromossomos (KNOPPER et al., 2005).
Embora tenham encontrado danos significativos ao DNA de eritrócitos de
carpas (Cyprinus carpio) em apenas 3 dias de tratamento, Sumathi et al. (2001) não
verificaram diferenças significativas nas freqüências de micronúcleos entre os
animais expostos, quando comparadas ao controle negativo.
Segundo alguns autores, os metais, mesmo em baixas concentrações
podem atuar sinergisticamente ou aditivamente quando em conjunto, pois estes
atuam induzindo a genotoxicidade através de ligações com a estrutura de DNA e/ou
de proteínas e através da geração de EROs (CHANDRA et al., 2005).
Em resumo, com base nos resultados obtidos de remoção de cor do efluente
têxtil, no presente trabalho, verificou-se uma equivalência entre a remediação com
quitosana (QTS3) e a remediação por processos convencionais efetuados pela
empresa têxtil em estudo (ETE). Em ambas as remediações o pH manteve-se
próximo da neutralidade. Porém, a condutividade do efluente ETE foi o dobro da
apresentada pelo QTS3. No entanto, este efluente apresentou dureza um pouco
maior do que o ETE. Por outro lado, a remediação com quitosana foi mais eficiente
na remoção dos metais e, conseqüentemente, na redução da toxicidade. O efluente
QTS3 não causou toxicidade aguda às bactérias bioluminescentes (V. fischeri) e aos
microcrustáceos (Artemia sp e D. magna), enquanto o efluente ETE causou
139
toxicidade apenas à D. magna. O efluente QTS3 causou menor inibição de
crescimento de raiz de bulbos de cebola (A. cepa), ao passo que a exposição dos
bulbos ao efluente ETE causou forte inibição no crescimento das raízes, sendo esta
maior do que aquela observada com o EB. A remediação com quitosana levou
também a uma redução de toxicidade do efluente QTS3, verificada através dos
biomarcadores de estresse oxidativo nos peixes que apresentaram menores níveis
de lipoperoxidação determinada através de TBARS, enquanto os animais expostos
ao ETE apresentaram valores maiores. Igualmente com relação à GSH, os animais
expostos ao efluente remediado com QTS3 não apresentaram diferença significativa
em relação ao grupo controle, enquanto os peixes expostos ao ETE apresentaram
maiores níveis de GSH. Com relação à CAT, novamente os peixes expostos ao
QTS3 não apresentaram diferença quanto ao grupo controle, enquanto os expostos
ao ETE apresentaram comparativamente uma diminuição da atividade desta enzima.
Da mesma forma, a remediação com quitosana levou a uma redução da
genotoxicidade, verificando-se menor dano ao DNA e menor frequência de
micronúcleos, comparativamente aos peixes expostos ao efluente ETE, que
apresentaram valores maiores para ambos.
Na indústria têxtil em estudo, apesar do tratamento convencional apresentar
eficiência na descoloração do efluente, a toxicidade residual verificada no mesmo
sugere que devem ser empregados compostos para a descoloração que apresentam
toxicidade, que também poderia ser atribuída aos metais, corantes e surfactantes
presentes no efluente têxtil.
140
6 CONCLUSÕES
A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que:
• A remedição realizada com quitosana na forma pulverizada apresentou maior
eficácia na remoção de cor do efluente têxtil, quando comparada com as
formas de microesferas e solução de quitosana em ácido acético. Entretando, a
remoção de cor obtida através da remediação através de tratamento
microbiológico e fisico-químico convencional (96 %), foi mais efetiva do que
aquela obtida pela quitosana pulverizada (80 %).
• Na indústria têxtil em estudo, apesar do tratamento convencional apresentar
eficiência na descoloração do efluente, foi verificada uma toxicidade residual,
provavelmente devida às substâncias utilizadas na descoloração do efluente,
bem como aos metais, corantes e surfactantes presentes no efluente.
• A remediação com quitosana promoveu a diminuição de todos os metais
encontrados originalmente no efluente não remediado (EB), enquanto que na
remediação realizada pela empresa (ETE) houve aumento de alguns metais,
entre os quais o alumínio.
• O efluente remediado com quitosana na forma pulverizada (QTS3) e o efluente
ETE não apresentaram toxicidade aguda para bactérias e para
microcrustáceos (Artemia sp).
• A remediação com quitosana pulverizada apresentou menor toxicidade aguda
para D. magna quando comparada ao tratamento convencional (ETE).
• De maneira geral, os bioindicadores utilizados (Vibrio fischeri, Artemia sp, D.
magna e D. rerio) foram eficazes para caracterizar a toxicidade dos efluentes
avaliados antes e após a remediação.
141
• Relativamente ao bioindicador A. cepa, a inibição no desenvolvimento de
raízes de bulbos foi mais sensível, comparativamente à inibição da germinação
de sementes e do crescimento de plântulas.
• De maneira geral, os biomarcadores de estresse oxidativo e de defesas
antioxidantes utilizados (TBARS, GSH e CAT), também foram eficazes para
caracterizar a toxicidade dos efluentes avaliados.
• Os biomarcadores de genotoxicidade (teste cometa e de micronúcleos)
demonstraram, igualmente, que ambos são instrumentos eficientes para avaliar
a toxicidade dos efluentes remediados (ETE e QTS3) e não remediado (EB).
• O uso integrado de diferentes biomarcadores demonstrou resultados
convergentes, confirmando a adequação de sua utilização para o diagnóstico
da qualidade de ambientes aquáticos.
• Finalmente, diante de todos os aspectos avaliados, pode-se concluir que a
quitosana utilizada na forma pulverizada mostrou-se uma alternativa bastante
promissora e eficiente no processo de remediação de efluentes têxteis.
Portanto, a quitosana ao promover a remoção de cor, de metais e,
provavelmente, de outros xenobióticos presentes no efluente remediado,
determinou, conseqüentemente, a redução da toxicidade dos mesmos.
142
7 PERSPECTIVAS
• Aplicar o teste cometa e de micronúcleos em raízes de cebolas expostas aos
diferentes efluentes visando avaliar o dano ao DNA, uma vez que este
organismo mostrou-se sensível ao teste de toxicidade.
• Efetuar a avaliação da oxidação das proteínas nos peixes durante o estresse
oxidativo por meio da carbonilação de proteínas, uma vez que estas são
passíveis de sofrer oxidação, durante uma situação de estresse como a
verificada nos experimentos realizados.
• Efetuar exposição crônica (30, 60 ou 90 dias) dos peixes aos efluentes, através
de processo semi-estático com aeração, para verificar a ocorrência de perda do
processo adaptativo às injúrias causadas pelas substâncias tóxicas presentes
nos efluentes.
• Verificar nos efluentes a presença de compostos fenólicos e de outros que
apresentam toxicidade para organismos aquáticos.
• Efetuar a quantificação de aminas aromáticas nos efluentes.
• Realizar ensaios para avaliação das possibilidades de recuperação e
reutilização da quitosana, em termos de sua aplicação e viabilidade econômica.
• Avaliar a biodegradabilidade da quitosana complexada com os corantes.
143
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