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ADRIANA PITTELLA SUDRÉ
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE ANTÍGENOS DE
Strongyloides stercoralis
Niterói
2005
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ADRIANA PITTELLA SUDRÉ
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE ANTÍGENOS DE
Strongyloides stercoralis
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Patologia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre.
Á
rea de concentração: Patologia Clínica e
Análises Clínicas
Orientador: Profa. Dra. Heloisa Werneck de Macedo
Co-orientador: Prof. Dr. José Mauro Peralta
Niterói
2005
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ADRIANA PITTELLA SUDRÉ
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DE ANTÍGENOS DE
Strongyloides stercoralis
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Patologia da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre. Área de
concentração: Patologia Clínica e Análises
Clínicas
Aprovado em Dezembro de 2005
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Profª Dra. Regina Helena Saramago Peralta (examinador prévio)
Universidade Federal Fluminense
___________________________
Prof. Dr. Valmir Laurentino Silva
Universidade do Grande Rio
Fundação Oswaldo Cruz
____________________________
Prof. Dr. Arnaldo Maldonado Júnior
Fundação Oswaldo Cruz
Aos meus pais (Eliane e Raul), pelo
exemplo, amor e dedicação, que me
permitiram chegar até aqui.
A
os meus avós (Onofrette e José Maria)
que infelizmente partiram sem ver o
término desta obra.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais (Eliane e Raul) pelo apoio e conselhos durante mais esta jornada;
À minha família, em especial aos meus irmãos (Luciana e Gustavo) que mesmo
longe sempre torceram por mim;
Ao meu noivo Eduardo, pela amizade, amor e por sempre me fazer acreditar que
seria possível;
À Profª Drª Heloisa Werneck de Macedo pela confiança, paciência e orientação.
Obrigada por acreditar e confiar no potencial de uma “estranha que apareceu na sua
porta”;
Ao Prof Dr José Mauro Peralta pela orientação, confiança e por me receber tão bem
em seu laboratório;
À Profª Dra Regina Helena Saramago Peralta pelos ensinamentos e paciência;
Aos amigos do Laboratório de Sorologia da UFRJ: Margareth Gonçalves, Tiana
Gonçalves, Laura Oliveira, Helena Lúcia Santos, Adriana Neves, Diva Monteiro,
Jorge, Mauro Jorge Castro, e Giovani da Costa por me mostrarem que o
companherismo ajuda a superar as dificuldades;
Aos técnicos do Laboratório de Parasitologia do Hospital Universitário Antônio Pedro
pela ajuda na “corrida em busca de larvas” sem a qual nada disto seria possível;
Ao Prof. Fernando Sodré pelos ensinamentos e apoio;
Ao Carlos Ausberto pelo apoio técnico crucial para a realização deste trabalho;
À Magali Barreto por toda a “ajuda estatística” e por tornar a viagem à Sumidouro
inesquecível;
À Profª. Beatriz Brener, grande amiga, por todas as palavras de incentivo e por fazer
despertar em mim o amor pela parasitologia;
Aos amigos Rodrigo Alva e Tatiana Robaina pelo carinho, companherismo e pelas
sábias palavras nos tempos difíceis;
À todos os colegas do curso de Pós-graduação em Patologia pela amizade e apoio
durante esta jornada;
Aos professores, coordenadores e secretárias do Curso de Pós-graduação em
Patologia;
Aos pacientes, sempre solícitos, que tornaram este trabalho possível;
A todos que ajudaram, de alguma forma, mas não foram citados aqui por falha
minha.
“Na luta do homem contra os parasitos, o homem
ganha as batalhas e os parasitos vencem a
guerra, ocultos pelo descaso das autoridades e
camuflados na miséria, na ignorância e no
abatimento moral de um povo”.
Pedro Marcos Linard
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS..................................................................................................4
SUMÁRIO .........................................................ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES........................................................................................8
ÍNDICE DE TABELAS ..............................................................................................10
ABREVIATURAS......................................................................................................11
RESUMO...................................................................................................................12
ABSTRACT...............................................................................................................13
1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................14
2 REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................17
2.1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS .........................................................................17
2.2 CICLO EVOLUTIVO .......................................................................................18
2.3 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ..............................................24
2.4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA ESTRONGILOIDÍASE ........................27
3 OBJETIVOS...................................................................................................36
3.1 OBJETIVOS GERAIS .....................................................................................36
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................36
4 MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................38
4.1 AMOSTRAGEM..............................................................................................38
4.1.1 Amostras de Soro ...........................................................................................38
4.1.2 Amostras de Fezes.........................................................................................41
4.2 MÉTODOS COPROPARASITOLÓGICOS .....................................................43
4.3 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO ..............................................47
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO
DODECIL SULFATO DE SÓDIO (SDS-PAGE)
..............................................51
4.5 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO – TÉCNICA DE WESTERN-BLOT
(TEIXEIRA ET AL., 1994)
...............................................................................52
4.6 OXIDAÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS PELO METAPERIODATO DE
SÓDIO
............................................................................................................54
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................54
5 RESULTADOS...............................................................................................55
5.1 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES........................................................55
5.2 OBTENÇÃO DAS LARVAS ............................................................................57
5.3 PREPARAÇÃO DOS ANTÍGENOS ................................................................58
5.4 PADRONIZAÇÃO DO SDS-PAGE E WESTERN-BLOT.................................58
5.5 RESULTADOS DO WESTERN-BLOT NOS GRUPOS DE SOROS
ESTUDADOS
.................................................................................................62
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................77
7 CONCLUSÕES ..............................................................................................89
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................................90
9 ANEXOS.........................................................................................................98
9.1 ANEXO I .........................................................................................................99
9.2 ANEXO II ......................................................................................................100
9.3 ANEXO III .....................................................................................................101
9.4 ANEXO IV.....................................................................................................102
ÍNDICE DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Ciclo evolutivo do Strongyloides stercoralis (Adaptado de Ly et al.,
2003)
......................................................................................................20
Figura 2 - Técnica de Rugai et al. (1954)................................................................44
Figura 3 - A- Larva rabditóide de S. stercoralis (1- vestíbulo bucal curto; 2-
primórdio genital); B- Larva filarióide de S. stercoralis (3- cauda
truncada; 4- esôfago longo).
...................................................................44
Figura 4 - Técnica de Coprotest..............................................................................45
Figura 5 - Técnica de Hoffman et al (1934).............................................................46
Figura 6 - Técnica de Willis (1921)..........................................................................47
Figura 7 - Técnica de Harada & Mori (1955)...........................................................48
Figura 8 - Diagrama da preparação do antígeno somático (AgSS) ........................50
Figura 9 - Gráfico de freqüência dos parasitos encontrados pela técnica de
Coprotest na comunidade de Soledade, Sumidouro, RJ. Número
total de indivíduos positivos = 51.
...........................................................56
Figura 10 - Gráfico representativo da detecção de larvas de Stongyloides
stercoralis em relação ao número de amostras examinadas pela
técnica de Rugai et al. (1954) (Encanto, Sumidouro, RJ)
.......................57
Figura 11 - Gráfico de freqüência dos parasitos encontrados pela técnica de
Coprotest na comunidade do Encanto, Sumidouro, RJ. Número total
de indivíduos positivos = 51.
...................................................................57
Figura 12 - Gel à 10% de acrilamida contendo: A-Peso Molecular; B-AgSS; C-
precipitado da extração de antígenos.
....................................................60
Figura 13 - Corrida eletroforética do AgSS em gel à 12% de acrilamida (A) e
10% de acrilamida (B). Gel corado pela técnica de impregnação
pela prata.
...............................................................................................60
Figura 14 - Resultado do Western-blot realizado sem a utilização do
metaperiodato. Para a confecção da membrana foi utilizada uma
concentração de 74,8µg de antígeno num gel de 10% de
acrilamida.
..............................................................................................61
Figura 15 - Resultado do Western-blot dos mesmos soros da Fig.14, mas com
utilização do metaperiodato. Para a confecção da membrana foi
utilizada uma concentração de 80µg de antígeno num gel com 12%
de acrilamida.
.........................................................................................61
Figura 16 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
Strongyloides stercoralis (G1). CN = Controle Negativo.
........................63
Figura 17 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
Strongyloides stercoralis (G1). CN = Controle Negativo.
........................63
Figura 18 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos adultos negativos
no EPF (G2).
...........................................................................................65
Figura 19 - Ensaio de Western-blot com soros de cordão umbilical (G3). CP =
Controle Positivo.
....................................................................................65
Figura 20 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos negativos no EPF
mas provenientes de área com alta prevalência de estrongiloidíase
(G4). CP = Controle Positivo.
.................................................................67
Figura 21 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
outras helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle
Positivo.
..................................................................................................67
Figura 22 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
outras helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle
Positivo.
..................................................................................................68
Figura 23 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
outras helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle
Positivo.
..................................................................................................68
Figura 24 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos que já
apresentaram estrongiloidíase no passado (G6). CN = Controle
Negativo. CP = Controle Positivo.
...........................................................69
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
pacientes positivos para Strongyloides stercoralis (G1).
........................70
Tabela 2 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
indivíduos adultos negativos para qualquer parasitose (G2).
.................71
Tabela 3 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
cordão umbilical (G3).
.............................................................................71
Tabela 4 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
indivíduos negativos no EPF mas provenientes de áera de alta
prevalência de estrongiloidíase (G4).
.....................................................72
Tabela 5 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
indivíduos positivos para outras helmintíases (G5).
...............................73
Tabela 6 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
indivíduos positivos para outras helmintíases (G5).
...............................74
Tabela 7 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de
indivíduos que já apresentaram estrongiloidíase no passado (G6).
.......75
Tabela 8 - Resumo das freqüências das três principais bandas encontradas no
Western-blot.
..........................................................................................76
ABREVIATURAS
A. lumbricoides
AgSS
BCIP
BSA
CN
CP
E. vermicularis
ELISA
EPF
H. nana
HUAP
IgA
IgE
IgG
IgM
IMPPG
KDa
kHz
Log
10
M
mA
mg
mL
mm
mM
µg
µl
µm
NBT
PBS
PCR
PM
PMSF
rf
rpm
S. fuelleborni
S. mansoni
S. ratti
S. stercoralis
TBS-T
T. trichiura
Ascaris lumbricoides
Antígeno a partir do extrato bruto de larvas de S. stercoralis
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, 4-toluidina sal
Albumina de soro bovino
Controle Negativo
Controle Positivo
Enterobius vermicularis
Enzime-linked immunosorbent assay
Exame Parasitológico de Fezes
Hymenolepis nana
Hospital Universitário Antônio Pedro
Imunoglobulina A
Imunoglobulina E
Imunoglobulina G
Imunoglobulina M
Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes
kilodalton
kilohertz
Logaritmo na base 10
Molar
miliamper
miligrama
mililitro
milímetro
milimolar
micrograma
microlitro
micrômetro
Cloreto de azul tetrazolio
Tampão fosfato-salina
Reação em cadeia da polimerase – “Polimerase chain reaction”
Peso Molecular
Fenil-metil-sulfonil-fluoreto
Mobilidade relativa
Rotação por minuto
Strongyloides fuelleborni
Schistosoma mansoni
Strongyloides ratti
Strongyloides stercoralis
Tampão Tris HCl-NaCl acrescido de Tween 20
Trichuris trichiura
RESUMO
A estrongiloidíase é causada pelo nematóide intestinal Strongyloides
stercoralis, e apresenta prevalência de 3 a 13% no Brasil, ocorrendo de forma
assintomática na maior parte dos indivíduos infectados. Entretanto, é considerado de
grande importância por causar hiperinfecção e disseminação em pacientes
imunodeprimidos, principalmente sob o uso de corticóides. O diagnóstico definitivo
normalmente é feito medinte a detecção de larvas nas fezes; mas como a
quantidade de parasitos é baixa na maioria dos casos e a eliminação de larvas é
reduzida e irregular, esta se torna extremamente difícil. Sendo assim, o
desenvolvimento de testes sorológicos confiáveis para o diagnóstico da
estrongiloidíase parece ser uma alternativa necessária. Desta forma, objetivou-se
neste trabalho caracterizar imunologicamente epítopos de larvas de S. stercoralis
por meio da análise de sua reatividade frente a amostras de soro de indivíduos com
e sem a infecção pelo agente. A pesquisa de larvas de S. stercoralis foi realizada em
amostras de fezes com as técnicas de Rugai e Coprotest objetivando-se comparar a
sensibilidade das técnicas, selecionar indivíduos positivos e negativos para a
estrongiloidíase, e obter larvas filarióides para confecção de antígeno somático. Para
a caracterização imunológica por meio da técnica Western-blot, foram utilizados 101
soros, divididos em 6 grupos: (G1) pacientes somente positivos para S. stercoralis
no exame parasitológico de fezes (EPF) (N=23), (G2) adultos comprovadamente
negativos para qualquer parasitose pelo EPF (N=10), (G3) soros de cordão umbilical
(N=10), (G4) pacientes negativos para qualquer parasitose pelo EPF provenientes
de área com alta prevalência de estrongiloidíase (N=10), (G5) indivíduos portadores
de outras helmintíases (N= 44), e (G6) indivíduos tratados para estrongiloidíase
(N=4). A prevalência da estrongiloidíase foi mais elevada na comunidade do Encanto
(6,4%) do que na de Soledade (3,36%). Além disso, foi observada uma considerável
flutuação na eliminação de larvas por estes pacientes. Nos grupos de soro testados,
foram encontrados perfis variados de reatividade, com o reconhecimento de
proteínas com massas moleculares que variavam de 6 e 129kDa. No G1, uma banda
proteica de aproximadamente 26kDa apresentou uma alta freqüência de reatividade
(18/23). Esta mesma banda também foi encontrada em um soro do grupo 3, 6 soros
do grupo 5 [Ancilostomídeos (2/10), Ascaris lumbricoides (3/10) e Taenia sp. (2/10)]
e um soro do grupo 6. Duas outras bandas reativas, uma de aproximadamente
33kDa e um duplex de aproximadamente 21kDa, também apresentaram freqüências
elevadas de respectivamente 17/23 e 9/23. Porém estas duas bandas também foram
encontradas em todos os outros grupos estudados. Desta forma, podemos sugerir
que a banda de 26KDa possa ser uma ferramenta importante no desenvolvimento
de técnica diagnóstica para a estrongiloidíase.
Palavras-chave: Strongyloides stercoralis, Caracterização imunológica, Western-
blot.
ABSTRACT
The strongyloidiasis is caused by the intestinal nematode Strongyloides
stercoralis, being prevalent in 3-13% infected patients in Brazil, and it typically occurs
in the asymptomatic form. However, this nematode is considered of great importance
for developing hyperinfection and dissemination in immunosupressed patients
especially under corticoid therapy. The definitive diagnosis is normally done by
detection of larvae on fecal samples; however, as the parasite load is often low in
most cases and the larvae shedding is reduced and irregular, the diagnosis becomes
extremely difficult. Thus, developing reliable serological methods for the diagnosis of
strongyloidiasis becomes imperative. The objective of this study was to
immunologically characterize epitopes of S. stercoralis larvae by analysis of its
reactivity to serum samples of individuals with and without the disease. The search
for S. stercoralis larvae on fecal samples by using the Rugai and Coprotest
techniques was done with two objectives: to compare the sensibility of the two
techniques, define the individuals positive and negative for strongyloidiasis, and to
obtain filarioid larvae for the making of somatic antigen. The Western-blot technique
was applied for the immunologic characterization of 101 serum samples that were
divided into 6 groups: (G1) patients only positive for S. stercoralis by fecal exam,
(G2) adults negative for any parasites by fecal exam (N=10), (G3) serum from
umbilical cord (N=10), (G4) patients negative for any parasites by fecal exam from an
area with high prevalence of strongyloidiasis (N=10), (G5) individuals with other
helminth infection (N= 44), and (G6) individuals treated for strongyloidiasis (N=4).
The results showed that strongyloidiasis was more prevalent in the Encanto
community (6,4%) when compared to the Soledade community (2,7%). Additionally,
a considerable fluctuation of larvae shedding was observed in these patients. In all
the studied serum groups different reactivity profiles were observed, and the
recognition of proteins with molecular mass varied from 6 to 129kDa. A protein band
of approximately 26kDa presented a high frequency of reactivity (18/23) on the G1.
The same band was also found in one serum from G3, 6 serum samples from G5
[hookworms (2/10), Ascaris lumbricoides (3/10) and Taenia sp. (2/10)] and one
serum sample from G6. Two other reactive bands, one of approximately 33kDa and a
duplet of approximately 21kDa, also have high frequency, 17/23 and 9/23,
respectively. However, these two bands were also observed in all the other studied
serum groups. Thus, we can suggest that the 26kDa band could be an important tool
for the development of a diagnostic technique for strongyloidiasis.
Key words: Strongyloides stercoralis, immunological characterization, Western-blot.
1 INTRODUÇÃO
As infecções parasitárias têm grande importância na avaliação da saúde
pública em países em desenvolvimento. No Brasil, várias doenças causadas por
parasitos ainda possuem alta prevalência. Entretanto, como em um mesmo país
podemos encontrar áreas altamente desenvolvidas contrastando com áreas
bastante pobres, a prevalência e o espectro parasitário variam muito. Pode-se dizer
que esta variação se deve a diversos fatores observados nas diferentes áreas,
como: sócio-econômicos, educacionais, condições sanitárias e ambientais
(Kobayashi et al., 1995; Coura, 2005).
Entre as doenças principais destaca-se a estrongiloidíase, que possui
prevalência variável no país (3 a 82%) (Gonçalves et al.; 1990; Kobayashi et al.1995;
Kobayashi et al.,1996; Machado & Costa-Cruz, 1998; Santos,2000; Pavelecini et al.,
2004). Segundo Camillo-Coura et al (2005), as questões sobre o panorama atual
das infecções por S. stercoralis no mundo, inclusive no Brasil, carecem de
respostas, porque não se dá a mesma relevância aos inquéritos de prevalência.
15
O nematóide intestinal causador da estrongiloidíase, Strongyloides
stercoralis, possui um duplo ciclo evolutivo e realiza a infecção do hospedeiro
através da penetração no tegumento. Normalmente a infecção decorre de forma
assintomática na maior parte dos indivíduos. Entretanto, este parasito é considerado
de grande importância por causar hiperinfecção e disseminação em pacientes
imunodeprimidos, principalmente sob o uso de corticóides (Santos, 2000).
Segundo Stephenson et al. (2000), o S. stercoralis é o quarto nematóide
intestinal mais importante, perdendo apenas para Ascaris lumbricoides, Trichuris
trichiura e Ancilostomídeos. Entretanto, a estrongiloidíase ainda é relativamente
negligenciada em estudos de campo e programas de controle se comparado a estes
outros nematóides intestinais. Já Cimerman & Cimerman (19999) colocam o
Strongyloides como sendo o quinto nematóide em importância, devido a maiores
prevalências também do Enterobius vermicularis.
O diagnóstico definitivo normalmente é feito mediante detecção de larvas
nas fezes. Várias são as técnicas descritas para o diagnóstico coproparasitológico
da estrongiloidíase, sendo que as mais comuns são: exame direto com uso de
solução salina e lugol, métodos de concentração de larvas como o Baermann-
Moraes (1948) e o Rugai (1954), métodos de concentração por sedimentação,
cultura em placa de ágar (Arakaki et al., 1988) e em papel de filtro (Harada-Mori,
1955) (Siddiqui & Berk, 2001).
Devido a quantidade de parasitos ser baixa, na maioria dos casos, e pela
baixa e irregular eliminação de larvas, o diagnóstico da estrongiloidíase, por exames
parasitológicos, se torna extremamente difícil (Liu & Weller, 1993). Sendo assim, o
16
desenvolvimento de técnicas diagnósticas mais sensíveis e específicas se torna
necessário.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
A estrongiloidíase é causada por duas espécies de nematóides intestinais
pertencentes ao gênero Strongyloides, que são geo-helmintos da família
Rhabdiasiea (Railliet 1915). Entretanto, a espécie S. stercoralis (Bavay, 1876)é
considerada a de maior importância clínica para o homem, por ser a mais comum e
de distribuição mundial, com mais de 600 milhões de pessoas infectadas no mundo
(Chan et al., 1994). A outra espécie, Strongyloides fuelleborni, é encontrada
esporadicamente na África e Nova Guiné (Liu & Weller, 1993; Siddiqui & Berk,
2001).
Segundo Siddiqui & Berk (2001) o S. stercoralis foi primeiramente
reportado em 1876, nas fezes de soldados franceses trabalhando no Vietnã que
apresentavam severa diarréia, e esta doença foi conhecida durante anos como
18
diarréia da Cochinchina. A elucidação de seu ciclo evolutivo completo ocorreu
apenas 50 anos após a descoberta do parasito.
Entre as doenças parasitárias com maior prevalência no Brasil, vários
autores apontam a estrongiloidíase como sendo uma das principais, com prevalência
variando de 3 a 82% (Gonçalves et al.; 1990; Kobayashi et al.1995; Kobayashi et
al.,1996; Machado & Costa-Cruz, 1998; Santos,2000, Pavelecini et al., 2004). De
acordo com esses autores, as regiões que apresentaram maiores prevalências
foram as de menor desenvolvimento, onde fatores como a falta de saneamento
básico e de educação, associados a uma dieta nutricional pobre, contribuiram
bastante para essa elevada prevalência.
A prevalência da infecção humana por S. stercoralis no Estado do Rio de
Janeiro se encontra entre 3 e 6,5% (Moura et al., 1989; Santos, 2000). Entretanto,
Nucci e colaboradores (1995) encontraram 21% de prevalência entre pacientes com
algum tipo de doença maligna hematológica.
O S. stercoralis é considerado por Liu e Weller (1993) como sendo um
parasito endêmico em grande parte das regiões tropicais e subtropicais,
particularmente no sudeste asiático, América do Sul, e África sub-saariana.
2.2 CICLO EVOLUTIVO
O Strongyloides tem a peculiaridade de ser o único nematóide parasito do
homem capaz de realizar um duplo ciclo evolutivo (Fig. 1). Somente as fêmeas são
19
parasitas, sendo partenogenéticas, e produzindo larvas que no meio externo dão
machos e fêmeas de vida livre (Rey, 2001).
Pouco se sabe sobre os mecanismos que levam à produção de machos e
a evolução dos helmintos no meio externo, mas acredita-se depender de um certo
número de fatores agindo sobre as fêmeas partenogenéticas, entre os quais se
incluem a idade dos parasitos, a duração da infecção, a carga parasitária e a
resposta imune do hospedeiro (Rey, 2001) além de características genéticas do
próprio parasito (Massey Jr. et al., 2001).
Devido ao ciclo complexo, em que se alternam gerações de vida livre e de
vida parasitária, a morfologia das fases evolutivas adultas não é a mesma em uma e
outra situação (Rey, 2001; Ly et al., 2003).
Os parasitos de vida livre são encontrados no solo ou no esterco, onde se
alimentam de bactérias e de matéria orgânica, realizando a cópula e ovopostura
pelas fêmeas. Destes ovos eclodem larvas que têm o esôfago do tipo rabditóide, isto
é, com a metade anterior cilíndrica, um pseudobulbo, no meio, seguido de uma
porção estreita e de um bulbo posterior, terminal (Genta, 1992; Rey, 2001).
20
Figura 1 - Ciclo evolutivo do Strongyloides stercoralis (Adaptado de Ly et al., 2003)
21
Por razões ainda desconhecidas, algumas larvas rabditóides de primeiro
estádio (quer produzidas por fêmeas de vida livre, quer por fêmeas parasitas), em
lugar de produzirem outras de segundo estádio, passam a evoluir para um tipo
diferente, denominado larva filarióide (apresentam um esôfago muito longo e
cilíndrico, atingindo quase o meio do corpo, e sem uma dilatação bulbar); sendo esta
muito ativa e podendo permanecer por muitos dias no solo, mas só completam sua
evolução se encontrarem um hospedeiro adequado e nele penetrarem (Cimerman &
Cimerman, 1999).
Depois de atravessarem o tegumento, elas alcançam a circulação e
realizam um ciclo pulmonar, ou seja, passam primeiro pela aurícula e ventrículo
direitos do coração, depois pelas artérias pulmonares e rede capilar dos pulmões.
Perfurando a parede dos capilares, chegam aos alvéolos e bronquíolos, onde os
movimentos do epitélio ciliado promovem seu transporte passivo, junto com as
secreções brônquicas, até a traquéia e a laringe, para serem deglutidas em seguida.
Durante essa migração, completa-se a evolução larvária e, ao chegarem à cavidade
intestinal, as formas adultas estão formadas (Carvalho Filho, 1978).
No intestino encontram-se apenas fêmeas partenogenéticas habitando a
mucosa intestinal, particularmente do duodeno e jejuno. Elas, aí, tem características
morfológicas e biológicas diferentes das fêmeas de vida livre. A existência de
machos parasitos não foi confirmada para nenhuma espécie de Strongyloides
(Genta, 1992; Neves, 2000).
As fêmeas partenogenéticas no intestino perfuram o epitélio e alojam-se
na espessura da mucosa, onde se movem, se alimentam e fazem suas desovas.
22
Destes ovos, já embrionados, saem imediatamente larvas rabditóides que, na luz do
intestino, misturam-se com o bolo alimentar e são expulsas com as fezes do
paciente (Genta, 1992; Rey, 2001).
Três a quatro semanas depois da penetração das formas infectantes pela
pele, o hospedeiro começa a eliminar larvas em suas dejeções (Carvalho Filho,
1978).
Devido às peculiaridades já descritas, Rey (2001) classifica o ciclo de vida
do S. stercoralis de duas formas: ciclo direto, onde não há intercalação de uma fase
com formas adultas de vida livre e parasitária entre um hospedeiro e outro; e ciclo
indireto, no qual se alternam fases de vida livre e parasitária.
É importante ressaltar que somente as larvas do tipo filarióide são
infectantes para o homem ou para os animais suscetíveis, pois estas contam com
mecanismos para invasão dos tecidos cutâneos e estão adaptadas para a vida
parasitária.
Várias são as vias de penetração conhecidas para este parasito, sendo
que a mais habitual é a cutânea, onde a infecção ocorre na maioria das vezes pelos
pés (Costa-Cruz et al., 1998).
Segundo Rey (2001), na estrongiloidíase pode ainda ocorrer a auto-
infecção, sendo esta externa (decorrente da transformação de larvas rabditóides em
filarióides infectantes na região anal e perianal contaminada com fezes, havendo
penetração das larvas pela mucosa retal, com invasão da rede venosa e ciclo
23
pulmonar) ou interna (quando as condições locais do intestino propiciam a evolução
do parasito na luz do intestino delgado e grosso, com invasão direta da mucosa por
larvas que não saíram para o meio exterior).
Entretanto, Genta (1992) acredita que a autoinfecção ocorre normalmente
no intestino do hospedeiro, com pequenas quantidades de larvas rabditóides
sofrendo muda para a forma filarióide, sendo assim responsáveis pela manutenção
da infecção, mesmo em indivíduos que já não residem em áreas endêmicas.
Um outro problema ressaltado por diversos autores (Genta, 1992; Kothary
et al., 1999; Rey, 2001) diz respeito a falta de regulação desta autoinfecção,
surgindo assim uma hiperinfecção com disseminação do parasito para diversos
órgãos.
De acordo com proposições feitas por Genta (1992), os corticóides podem
ser responsáveis por esta falta de regulação, pois os metabólitos produzidos pela
metabolização dos corticóides no organismo, são muito semelhantes a ecdisona,
que é a substância que regula a ecdise (muda) na maioria dos helmintos. Sendo
assim, um aumento de substâncias semelhantes a ecdisona, podem competir com
sítios de ligação desta na superfície do parasito e levar a um aumento da quantidade
de mudas do mesmo.
24
2.3 PATOGENIA E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A maior parte dos indivíduos com estrongiloidíase, a possui de forma
assintomática ou apresentam manifestações clínicas brandas, não patognomônicas
(Rossi et al., 1993; Grove, 1996). A patologia e a sintomatologia da estrongiloidíase
não estão somente relacionadas à carga parasitária, mas também a fatores como a
diminuição da resistência orgânica e estado de nutrição do paciente, podendo
evoluir com largo espectro de manifestações clínicas, desde formas assintomáticas
ou oligossintomáticas em indivíduos com baixa carga parasitária, até formas graves
e fatais em pacientes imunossuprimidos ou em uso de corticóides (Santos, 2000).
A infecção crônica por S. stercoralis, quando apresenta sintomas, estes
podem ser cutâneos, gastrointestinais ou pulmonares (Liu & Weller, 1993). O
envolvimento cutâneo se caracteriza por edema local, congestão, pápulas
hemorrágicas e prurido intenso (Upadhyay et al., 2001; Safdar et al., 2004). Além
disso, pode ser observada a síndrome da larva currens, que corresponde a uma
erupção cutânea serpiginosa, causada pela migração da larva filarióide pela pele
(Smith et al., 1976; Mahmoud, 1996). Segundo Liu e Weller (1993), em muitos
casos, as larvas podem invadir a pele da região perianal, sendo extremamente
móveis, o que as difere das larvas de Ancilostomídeos, causadores de larva migrans
cutânea (LMC), já que estas possuem uma migração mais lenta nos tecidos. Os
sintomas gastrointestinais incluem diarréia, desconforto abdominal, náuseas, e
anorexia (Liu & Weller, 1993; Kim et al, 2003; Safdar et al, 2004); além de
constipação, desidratação, astenia, irritabilidade, emagrecimento, inapetência,
epigastralgia, plenitude gástrica e pirose (Porto et al., 2002; Werneck-Silva et al.,
2001). Já na estrongiloidíase pulmonar, os principais sintomas são tosse e falta de
25
ar, (Liu & Weller, 1993; Mahmoud, 1996; Upadhyay et al., 2001; De la Rosa et al.,
2002; Safdar et al., 2004) podendo ainda haver febre e expectoração mucopurulenta
ou sanguinolenta (Woodring et al., 1994; Upadhyay et al., 2001).
A estrongiloidíase raramente pode causar cólica intestinal e
sangramentos, com granulomas de mucosa semelhantes aos de doença inflamatória
intestinal; nestes casos, um diagnóstico errado pode levar a um tratamento deletério
com agentes imunossupressores (Liu & Weller,1993). Entretanto, Nucci et al. (1995)
reportaram que pacientes com estrongiloidíase apresentaram freqüentemente febre
e eosinofilia, que poderiam ser indicativos desta infecção. No entanto, ocorre uma
demora na elevação da contagem de eosinófilos na síndrome de hiperinfecção em
imunossuprimidos (Potter et al., 2003).
A apendicite causada por S. stercoralis é uma condição rara, tendo sido
descrita por Felekouras et al. (2002).
Em pacientes imunossuprimidos, a doença pode tomar proporções ainda
maiores, culminando com uma hiperinfecção e disseminação do parasito por todo o
organismo do paciente (Conway et al.,1995; Grove,1996). Nestes casos, ocorre uma
exuberância de sintomas gastrointestinais (Mahmoud, 1996), como completo
rompimento dos padrões normais da mucosa, ulcerações, e íleo paralítico (Siddiqui
& Berk, 2001). Além disso, este quadro é caracterizado pela presença de larvas
rabditóides e/ou de parasitos adultos em outros tecidos (Santos, 2000).
Quando há disseminação, pode ainda ocorrer envolvimento pulmonar,
com formação de edema bilateral e infecções bacterianas e fúngicas, devido a um
26
vazamento da microbiota intestinal através de perfurações da mucosa intestinal
pelos parasitos. Pode ocorrer septicemia, pneumonia e meningite. As infecções
secundárias bacterianas são freqüentemente as causas imediatas de morte em
pacientes com síndrome de hiperinfecção (Genta, 1992; Liu & Weller, 1993;
Mahmoud, 1996; Kothary et al., 1999).
Segundo Hira et al. (2004), a falta de consciência sobre as potenciais
manifestações fatais da estrongiloidíase em imunocomprometidos tem claramente
resultado em atrasos no manejo apropriado desta doença.
Sendo assim, pessoas com imunidade celular alterada, principalmente os
indivíduos que estejam recebendo corticosteróides por longos períodos, que
apresentem linfoma, leucemia, doenças linfoproliferativas, doenças auto-imunes,
AIDS ou transplantados, infecção pelo HTLV-1, além de viajantes que estiveram em
áreas endêmicas, alcoólatras, prisioneiros e outros indivíduos pertencentes a
instituições, podem ser considerados em um grande grupo de risco, onde os
cuidados com o diagnóstico e tratamento de uma infecção por S. stercoralis devem
ser redobrados (Nucci et al., 1995; Graeff-Teixeira et al., 1997; Fontanet, 2000;
Oliveira et al., 2002; Porto et al., 2002; Huaman et al., 2003; Potter et al., 2003).
Entretanto, devido às peculiaridades de seu ciclo biológico, o parasitismo
por S. stercoralis é um dos mais difíceis de ser diagnosticado.
27
2.4 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA ESTRONGILOIDÍASE
Exame Parasitológico de Fezes:
O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase normalmente é feito mediante
a detecção de larvas nas fezes. Entretanto, como a quantidade de parasitos é baixa
na maioria dos casos e a eliminação de larvas é pequena e irregular, o diagnóstico
desta enfermidade por exames parasitológicos se torna extremamente difícil (Liu &
Weller, 1993).
Nenhum teste é considerado 100% sensível para o diagnóstico. Uma
única amostra de fezes examinada para procura de larvas irá apenas detectar cerca
de 30% das infecções que não apresentam complicações. A sensibilidade do
diagnóstico aumenta cerca de 50% com o uso de três amostras fecais, podendo
chegar perto de 100% com o uso de sete amostras (Nielsen & Mojon, 1987). Como o
exame de múltiplas amostras de fezes é bastante inconveniente para o paciente e
consome muito tempo, a maioria dos médicos relutam em utilizá-lo (Hira et al.,
2004).
Devido ao fato dos parasitos adultos habitarem o interior do tecido
intestinal e não o lúmen, estes não são detectáveis nas fezes, apenas em biópsias
ou ocasionalmente em aspirados duodenais. Assim como os parasitos adultos, as
larvas filarióides são raramente vistas nas fezes, com exceção dos casos de
hiperinfecção e de constipação intestinal. Algumas larvas rabditoides podem se
transformar espontaneamente em larvas filarioides, em amostras fecais não fixadas
e conservadas à temperatura ambiente por algumas horas.
28
Várias são as técnicas descritas para o diagnóstico da estrongiloidíase
por exame de amostras de fezes, sendo que as mais comuns são: exame direto com
uso de solução salina e lugol, métodos de concentração de larvas como o Baermann
modificado por Moraes (Moraes, 1948) e suas variações, métodos de concentração
por sedimentação, cultura em placa de ágar (Arakaki et al., 1988), e método de
Harada-Mori (Harada & Mori, 1955).
Segundo Siddiqui e Berk (2001), a técnica de concentração por uso de
fomalina-acetato de etila aumenta o rendimento, mas as larvas mortas são mais
difíceis de serem diferenciadas.
Estudo feito por Sato et al. (1995), comparou quatro diferentes métodos
para exame de amostras fecais (exame direto, fomalina-acetato de etila, Harada-
Mori, e cultura em placa de ágar), encontrando sensibilidade mais alta no método de
cultura em placa de ágar. O mesmo foi observado por Kobayashi et al. (1996), que
mostraram que cerca de 60% dos casos não teriam sido diagnosticados caso
fossem utilizados apenas os métodos de Harada-Mori e de concentração fecal.
Jongwutiwes et al. (1999) também comprovaram a eficácia da cultura em placa de
ágar quando comparada ao exame direto, sedimentação com formalina-éter e
método do papel de filtro aplicada à rotina laboratorial, encontrando resultados
bastante satisfatórios.
Em 1991, Willcox e Coura mostraram que a técnica de Hoffman et al
(1934) foi capaz de detectar 30,9% de casos enquanto que a técnica de Baermann-
Moraes (adaptada) detectou 31,5% de casos de estrongiloidíase. Eles concluíram
29
que é necessário o uso das duas técnicas combinadas para obter maior
sensibilidade do exame parasitológico de fezes.
Um estudo de custo-benefício das técnicas de Baermann modificada,
exame direto, e cultura em placa de ágar foi realizado por Kaminsky (1993). Neste
estudo, observou-se que o método de Baermann modificado era 3,6 vezes mais
eficiente do que o exame direto. A cultura, em placa de agar, aumentou a eficiência
do método de Baermann modificado em 0,8 vezes. Se somente o custo dos
materiais for avaliado, o exame direto é considerado o mais barato, tendo o
Baermann modificado um custo quatro vezes maior e o método de cultura em placa
de ágar um custo 15 vezes maior. Isto se deve ao fato desta última técnica
necessitar de equipamentos de laboratório mais caros e de pessoas bastante
treinadas para sua realização. Além disso, o autor considera que o Baermann
modificado possui a rapidez como vantagem (2 horas), contrastando com a cultura
em placa de ágar que precisa de 24 horas para se obter o resultado.
Intapan et al. (2005) compararam as técnicas de cultura em placa de ágar
e concentração em solução de formalina-acetato de etila para o diagnóstico da
estrongiloidíase. Estes autores encontraram uma maior sensibilidade da cultura em
placa de ágar, havendo um desempenho semelhante entre as duas técnicas
somente em indivíduos com elevada eliminação de larvas nas fezes.
30
Pesquisa de larvas em fluidos corpóreos:
Diversos relatos da presença de larvas rabditóides ou filarióides de S.
stercoralis já foram feitos em broncoscopias (Upadhyay et al., 2001); lavados
broncoalveolares (Ly et al., 2003 e Mayayo et al., 2005); escarro (Kim et al., 2005) e
fluido cerebroespinhal (Kothary et al., 1999) principalmente em indivíduos sob
corticoterapia.
Entretanto, Lai et al. (2002) relataram um caso de efusão pericárdica
induzida por S. stercoralis em paciente imunocompetente, havendo presença de
larva filarióide no líquido retirado por pericardiocentese.
Alterações Hematológicas :
A eosinofilia sangüínea é, às vezes, a única pista da presença da
infecção, mas esta é moderada e não específica (Liu & Weller, 1993). Segundo
Román-Sanchez et al. (2003), a presença de eosinofilia teve uma sensibilidade de
93,5% e especificidade de 93,1% como fator sugestivo da estrongiloidíase.
Diagnóstico Sorológico:
De acordo com Rossi et al. (1993), o desenvolvimento de testes
sorológicos confiáveis para o diagnóstico da estrongiloidíase pode ter grande
utilidade em situações epidemiológicas e clínicas.
As técnicas sorológicas, principalmente as imunoenzimáticas, podem ser
uma boa alternativa para o diagnóstico da estrongiloidíase. Normalmente, as
preparações antigênicas de S. stercoralis, resultantes de extração de antígenos
31
solúveis totais em solução salina, têm sido utilizadas nas técnicas sorológicas
padronizadas. Entretanto, estas preparações não possuem adequada
especificidade, pois representam o extrato bruto do parasita, com antígenos comuns
a outros parasitos. Além disso, uma das principais limitações encontradas no
desenvolvimento de testes sorológicos mais sensíveis e específicos, é a dificuldade
em se obter quantidades suficientes de antígenos que permitam seu posterior
fracionamento e análise (Rossi et al., 1993; Siddiqui e Berk, 2001).
O Ensaio Imunoenzimático (Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)
é considerado por Liu e Weller (1993) como sendo superior aos outros testes
sorológicos em termos de praticidade, segurança e disponibilidade de reagentes.
Além disso, a sensibilidade do teste varia em torno de 85% a 95% e a especificidade
pode chegar a 90%, sendo superior a maioria dos outros testes sorológicos (Rossi et
al., 1993; Liu e Weller, 1993; Uparanukraw et al., 1999; Schaffel et al., 2001). Este
teste detecta a presença de anticorpos das classes de imunoglobulinas G (IgG), A
(IgA), M (IgM) e E (IgE) específico para o parasito, mas não confere um valor
quantitativo da carga parasitária. Também segundo Liu e Weller (1993), o teste
ELISA, pincipalmente para anticorpos IgG, nem sempre pode distinguir entre
infecções recentes e antigas.
Devido ao fato de o método ELISA poder apresentar resultados falsos-
positivos devido a reação cruzada com outros nematóides, Conway et al. (1993a)
constataram que ao se realizar uma pré-absorção do soro estudado com extratos de
nematóides, havia um aumento da especificidade da detecção de IgG anti-S.
stercoralis no método ELISA indireto.
32
Outro método de diagnóstico que pode ser utilizado é o teste de
aglutinação em partículas de gelatina. Entretanto, este teste mostrou uma proporção
relativamente maior de falso-positivos ao ser comparado com o teste ELISA (Sato et
al., 1991).
Sato et al. (1995a) consideram que em inquéritos epidemiológicos de
massa, onde um grande número de indivíduos será examinado, um teste sorológico
deve ser aplicado previamente ao exame das fezes. Estes autores acreditam que o
teste ELISA é conveniente para tal, pois pode testar um grande número de soros
simultaneamente em relativamente poucas horas. Uma vez detectados os indivíduos
positivos, estes devem ser então avaliados parasitologicamente para se constatar a
presença de larvas nas fezes.
Segundo Costa-Cruz et al. (1997), a reação de imunofluorescência
indireta utilizando larvas de S. stercoralis ou Strongyloides ratti como antígenos (em
cortes feitos com criostato), pode ser utilizada como subsídio para o diagnóstico da
estrongiloidíase devido a sua acuracidade. No ano seguinte, Costa-Cruz et al. (1998)
mostraram que amostras sangüíneas colhidas em papel de filtro e avaliadas pela
imunofluorescência indireta, com a finalidade de realizar um inquérito
soroepidemiológico da estrongiloidíase, é um procedimento recomendado, pelo seu
baixo custo, facilidade de armazenamento e transporte, além de fornecer dados
confiáveis.
Os testes sorológicos são úteis também para avaliar a eficácia de um
tratamento, pois o S. stercoralis freqüentemente persiste, apesar do tratamento com
33
anti-helmínticos e também porque é difícil a avaliação de um tratamento de sucesso
por meio de exame de amostras fecais (Sato et al., 1995a).
Estudos feitos por Lindo et al. (1996) mostraram que existe um pequeno,
mas consistente declínio na resposta de IgG ao S. stercoralis após tratamento de
sucesso e que os indivíduos permanecem soropositivos por um período longo de
tempo (pelo menos 18 meses em alguns casos).
Muitos pesquisadores (Sato et al., 1995a; Costa-Cruz et al., 1997; Costa-
Cruz et al., 2003; Silva et al., 2003; Machado et al., 2003; Rodrigues et al., 2004)
vem procurando utilizar antígenos heterólogos, ou seja, provenientes de larvas de
outras espécies de Strongyloides, principalmente S. ratti e S. venezuelensis, pois
são de fácil obtenção e constituem uma fonte segura de antígenos, não havendo
risco para seus manipuladores. Entretanto, apesar dos grandes avanços, ainda é
necessária uma melhor comparação entre os componentes anitgênicos
imunodominantes destas duas espécies de Strongyloides com o S. stercoralis (Silva
et al., 2003).
Recentemente, a análise por Western-blot tem sido aplicada no
imunodiagnóstico da estrongiloidíase, demonstrando maior especificidade que o
ELISA. Uparanukraw et al. (1999) por meio de análise pelo Western-blot,
constataram que apenas as amostras dos pacientes (n=55) infectados por S.
stercoralis reagiram com diversas proteínas da larva filarióide (L3). As proteínas
mais importantes reconhecidas pelos anticorpos tinham pesos moleculares de 28,
31, 41 e 205 kDa. Outros autores (Sato et al., 1990; Conway et al., 1993b; Conway
et al., 1994; Atkins et al., 1999) também realizaram experimentos semelhantes
34
buscando proteínas que fossem reconhecidas pelos anticorpos de pacientes com
estrongiloidíase, com os resultados variando em torno das mesmas proteínas
encontradas por Uparanukraw et al. (1999).
Atualmente, vem-se procurando outras formas mais reprodutíveis de
diagnóstico, que não necessitem da utilização de larvas para preparação de
antígenos. A caracterização de antígenos recombinantes expressos, de forma
induzida, em outros microorganismos, pode ser uma fonte antigênica importante no
imunodiagnóstico. Entretanto, a utilização destes antígenos como componentes de
“kits” diagnósticos ainda não está disponível devido a dificuldades nos parâmetros
sorológicos de especificidadee sensibilidade, e operacionais destinados a produção
em larga escala (Ravi et al., 2002).
A produção de anticorpos policlonais e monoclonais contra diferentes
proteínas de larvas do S. stercoralis também pode ser utilizada no diagnóstico para
detecção de antígenos em amostras de fezes (coproantígeno) (Taweethavonsawat
et al., 2002). Entretanto, estas técnicas ainda estão pouco descritas na literatura
para o diagnóstico da estrongiloidíase.
Diagnóstico Molecular
Diversos trabalhos estão sendo realizados para se determinar seqüências
de genes desse parasito, inclusive com o objetivo de que possam vir a ser utilizadas
no diagnóstico clínico, por meio de variantes de métodos da reação em cadeia da
polimerase (PCR) (Putland et al., 1993; Moore et al., 1996; Dorris & Blaxter, 2000;
Massey Jr. et al., 2001, Gallego et al., 2005).
35
No entanto, não se conhece ainda nenhuma técnica que seja considerada
a ideal para o diagnóstico laboratorial da estrongiliodíase.
Diante destes fatos, nos pareceu importante avaliar se epítopos de S.
stercoralis podem ser utilizados no imunodiagnóstico da estrongiloidíase e permitir o
conhecimento de seqüências protéicas que possibilitem a proução de proteínas
recombinantes.
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Caracterizar imunologicamente epítopos de larvas de S. stercoralis
mediantes análise de sua reatividade frente a amostras de soro de indivíduos com e
sem a infecção.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter larvas de S. stercoralis para confecção de antígeno somático de
amostras fecais de pacientes positivos para estrongiloidíase.
Pesquisar larvas de S. stercoralis em amostras de fezes de uma
população utilizando os métodos de Rugai e Coprotest.
37
Padronizar a técnica Western-blot para verificar a frequência de
reatividade de epítopos de larvas de S. stercoralis em uma coleção de
amostras estudadas.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Universitário Antônio Pedro em dezoito de agosto de 2004 (CMM/HUAP 137/04)
(ANEXO I).
4.1 AMOSTRAGEM
4.1.1 AMOSTRAS DE SORO
Para a caracterização imunológica de antígenos de larvas de S.
stercoralis, foram utilizadas amostras de soro provenientes dos seguintes locais:
comunidades de Soledade e Encanto, Sumidouro, RJ; Hospital Universitário Antônio
Pedro (HUAP), Niterói, RJ; e Laboratório de Sorologia do Instituto de Microbiologia
Professor Paulo de Góes (IMPPG), UFRJ, RJ. Estas amostras foram divididas nos
seguintes grupos:
39
GRUPO 1 (G1)
Formado por 23 amostras de soros de pacientes comprovadamente
positivos apenas para S. stercoralis pelo Exame Parasitológico de Fezes (EPF).
Estas amostras foram provenientes dos seguintes locais: comunidades de Soledade
e Encanto, Sumidouro, RJ; HUAP; e soroteca do Laboratório de Sorologia do
IMPPG,UFRJ.
A coleta das amostras sangüíneas das comunidades de Soledade e
Encanto foi feita em colaboração com o Laboratório de Avaliação e Promoção da
Saúde Ambiental (LAPSA) do Departamento de Biologia do Instituto Oswaldo Cruz,
Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, como parte de um projeto de controle de
verminoses coordenado por esta instituição. Este projeto foi aprovado pelo Comitê
de Ética em Pesquisa/CEP/FIOCRUZ sob o número 182/02 (ANEXO II).
Os pacientes atendidos no HUAP que apresentaram amostras fecais
positivas para larvas de S. stercoralis no EPF foram convidados a doar uma amostra
de sangue para este estudo. Para isto, cada paciente assinou um termo de
consentimento antes da coleta de sangue (ANEXO III).
Todas as amostras de sangue foram coletadas por punção venosa em
tubos para coleta sem anticoagulante (Vacutainer-Becton Dickinson, Ind. Cirúrgicas
Ltda., Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil), para obtenção de soros, que foram
congelados a -20°C até o momento da execução da técnica Western-blot.
40
GRUPO 2 (G2)
Formado por 10 amostras de soro de adultos comprovadamente
negativos para qualquer parasitose pelo EPF.
Estes lndivíduos, que concordaram em participar do projeto através da
assinatura de um termo de consentimento (Anexo IV), foram selecionados a partir do
EPF de três amostras de fezes frescas coletadas em dias alternados.
A coleta da amostra de sangue foi feita por punção venosa utilizando-se
seringa descartável de 5mL (BD Plastik, Becton-Dickinson Indústrias Cirúrgicas
Ltda., Curitiba, Paraná, Brasil) e agulha descartável 21G 30X8 (Injex Indústrias
Cirúrgicas Ltda, Ourinhos, São Paulo, Brasil).
GRUPO 3 (G3)
Formado por 10 amostras de soro de cordão umbilical gentilmente
cedidos pela Maternidade Escola da UFRJ.
GRUPO 4 (G4)
Formado por 10 amostras de soro de indivíduos de área endêmica para a
estrongiloidíase com EPF negativo, provenientes da soroteca do Laboratório de
Sorologia do IMPPG, UFRJ.
GRUPO 5 (G5)
Formado por 44 amostras de soro de indivíduos portadores de outras
helmintíases: Ascaris lumbricoides (10), Ancilostomideos (10), Hymenolepis nana
41
(3), Taenia sp (10), Schistosoma mansoni (5), Enterobius vermicularis (3), Trichuris
trichiura (3); provenientes da soroteca do Laboratório de Sorologia, IMPPG, UFRJ.
GRUPO 6 (G6)
Formado por 4 amostras de soro de indivíduos tratados para
estrongiloidíase, provenientes do HUAP.
4.1.2 AMOSTRAS DE FEZES
A pesquisa de larvas de S. stercoralis em amostras de fezes foi realizada
com três objetivos diferentes: comparar a sensibilidade das técnicas de Rugai e
Coprotest, selecionar indivíduos positivos e negativos para estrongiloidíase, e obter
larvas filarióides para confecção de antígeno somático. Também foi feita avaliação
das amostras de fezes de indivíduos adultos para fins de formação de um grupo
negativo para qualquer parasitose pelo EPF.
Na comunidade de Soledade, 112 moradores de ambos os sexos e com
idades variando entre 1 e 75 anos, concordaram em participar da pesquisa
fornecendo amostras de fezes. Este número corresponde a quase todos os
residentes desta comunidade. De um mesmo indivíduo, foram coletados dois tipos
de amostras fecais:
a) fezes frescas - armazenadas em potes específicos para a coleta, sem a
presença de conservantes químicos, e sendo mantidas em recipientes
isotérmicos até a realização da técnica de Rugai pelo Laboratório de
42
Parasitologia do HUAP. O tempo decorrido entre a coleta e a realização
da técnica foi de no máximo 24 horas.
b) fezes fixadas em formol 10% - colocadas em recipientes plásticos
padronizados contendo em seu interior formol 10%. Esta amostra foi
processada pelo método de Coprotest realizado no Laboratório de
Parasitologia do HUAP.
Na comunidade do Encanto, 140 moradores (aproximadamente todos os
moradores da comunidade) de ambos os sexos e com idades variando entre 2 e 80
anos, forneceram até três amostras de fezes coletadas em dias diferentes que foram
divididas em duas partes, uma das quais processada por meio da técnica de Rugai
et al (1954) no mesmo dia da coleta; e a outra parte processada pela técnica de
Kato-Katz (1972) pelo laboratório da Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz), RJ. Dentre
estes moradores, 128 também receberam um frasco para coleta de fezes contendo
formol a 10% para realização da técnica de Coprotest pelo Laboratório de
Parasitologia do HUAP.
Todos os indivíduos destas duas comunidades que eliminavam nas fezes
ovos de helmintos ou cistos de protozoários foram tratados de acordo com
orientação médica.
No Laboratório de Parasitologia do HUAP e no Laboratório Migueloti
Viana foram obtidas amostras fecais de pacientes positivos para larvas de S.
stercoralis durante as análises de rotina. Estas amostras foram utilizadas para
obtenção das larvas filarióides pelo método de cultura. O número de amostras fecais
utilizadas foi determinado de acordo com a disponibilidade de larvas em cada
43
amostra, totalizando no final em torno de 70 mil larvas. Um termo de consentimento
autorizando a utilização do material fecal nesta pesquisa foi assinado por cada
indivíduo (ANEXO III).
Os indivíduos adultos que concordaram em participar deste estudo ao
assinarem o termo de consentimento (ANEXO IV), tiveram três amostras de fezes
frescas, de dias alternados, examinadas pelas técnicas de Rugai et al. (1954),
Hoffman et al. (1934), e Willis (1921), que fazem parte da rotina diagnóstica do
Laboratório de Parasitologia do HUAP.
4.2 MÉTODOS COPROPARASITOLÓGICOS
Método de Rugai et al. (1954)
Foi realizado colocando-se as amostras fecais no centro de uma gaze
previamente dobrada quatro vezes, unindo-se as pontas em diagonal e fixando-se o
conjunto na borda de cálices de sedimentação com o auxílio de prendedores de
papel. A seguir, foi colocada água à temperatura de 42 a 44ºC pelas paredes do
cálice, de forma que as fezes ficassem parcialmente submersas (Fig. 2). Devido ao
termohidrotropismo das larvas, estas tendem a migrar da amostra fecal para a água
aquecida, sedimentando no fundo do cálice. Após o repouso de 1 hora, o líquido do
fundo do cálice foi retirado com auxílio de pipeta pasteur e examinado ao
microscópio óptico para pesquisa de larvas vivas do parasito.
44
FEZES
ÁGUA
42/44
o
Figura 2 - Técnica de Rugai et al. (1954)
Quando foram encontradas larvas, uma gota de lugol foi colocada para
promover a morte destas, tornando mais fácil a localização das estruturas
características dessa fase evolutiva do parasito (larva rabditóide com primórdio
genital bem visível e vestíbulo bucal curto; larva filarióide com terminação da cauda
truncada e esôfago até quase a metade do corpo. (Fig. 3)
A
B
2
1
3
4
Figura 3 - A- Larva rabditóide de S. stercoralis (1- vestíbulo bucal curto; 2-primórdio
genital); B- Larva filarióide de S. stercoralis (3- cauda truncada; 4- esôfago longo).
Método de Sedimentação por Centrifugação (Coprotest)
Foi feito segundo as especificações do fabricante (NL - Comércio Exterior
LTDA, São Paulo, SP.) (Fig. 4). Brevemente, o frasco padronizado contendo formol a
45
10% e amostra fecal em seu interior foi agitado para promover homogenização do
conteúdo. A cápsula de vedação na parte superior do frasco foi então removida e o
conteúdo do frasco (7mL) colocado em tubos de centrífuga. Foram acrescentados
3mL de acetato de etila e uma gota de detergente, sendo os tubos fechados e
agitados vigorosamente por 30 segundos. O material foi centrifugado a 1500 rpm por
2 minutos. O sobrenadante foi então descartado e o sedimento preservado, sendo
este pipetado para uma lâmina de vidro e examinado ao microscópio.
Figura 4 - Técnica de Coprotest
Método de Hoffman et al. (1934)
Primeiramente homogenizamos a amostra fecal com água destilada até
que forme uma solução. Em seguida foi realizada a filtração desta em gaze dobrada
4 vezes sobre tamiz, passando-a para um cálice de fundo cônico para
46
sedimentação, e completando o volume do cálice com água destilada (Fig. 5).
Depois de aguardar cerca de 2 horas, o sedimento foi coletado com pipeta Pasteur e
colocado entre lâmina e lamínula. Foi feita a observação da lâmina ao microscópio
procurando-se estruturas parasitárias. A observação foi realizada em microscópio
óptico com aumento de 100x e 400x.
Figura 5 - Técnica de Hoffman et al (1934)
Método de Willis (1921)
Este método baseia-se na flutuação em solução saturada de cloreto de
sódio (densidade 1.200) de estruturas parasitárias de baixa densidade.
Primeiramente, foi realizada a homogeneização da amostra com solução
saturada de cloreto de sódio. Em seguida, foi feita a filtração da solução em gaze
dobrada 4 vezes sobre tamiz, e passagem desta para um tubo de ensaio até formar
um menisco positivo. Colocou-se então uma lamínula sobre a solução e aguardou-se
47
15 minutos para que as estruturas pudessem flutuar e aderir à lamínula. Depois foi
então retirada a lamínula, desvirando-a rapidamente, e colocando-a sobre uma
lâmina para posterior exame ao microscópio óptico com aumento de 100x e 400x.
(Fig. 6)
Figura 6 - Técnica de Willis (1921)
4.3 MÉTODO DE PREPARAÇÃO DO ANTÍGENO
Obtenção das larvas
Amostras fecais de pessoas infectadas com S. stercoralis, recebidas
durante as análises de rotina dos laboratórios citados acima, foram submetidas à
cultura em papel de filtro inclinado, seguindo o método de Harada & Mori (1955) com
ligeiras modificações. Nesta cultura, espalhamos uma porção da amostra fecal em
papel de filtro de 20X200mm dobrado para formar uma espécie de calha, e
colocamos o papel em tubo de ensaio de 20X200mm contendo 7mL de água
aquecida à 40-45°C, de um modo que as fezes não toquem na água (Fig. 7). O tubo
48
foi então fechado com um chumaço de algodão hidrófobo e deixado em repouso no
interior de um recipiente isotérmico. Após 3 a 5 dias, as larvas filarióides que
migraram para a água no interior do tubo, foram identificadas por meio de um
microscópio invertido. O tubo foi então aberto e o papel de filtro desprezado,
fazendo-se também a homogenização do líquido.
Figura 7 - Técnica de Harada & Mori (1955)
Outra forma de recuperação das larvas filarióides utilizada neste estudo,
consistiu em deixar a amostra fecal à temperatura ambiente por 24 a 48 horas, em
potes de plástico sem conservante e após este período, foi realizada a técnica de
Rugai para coleta das larvas filarióides da amostra fecal.
Independente da forma de recuperação das larvas utilizadas, foram
coletados 20 µL do líquido contendo as larvas e colocados em uma lâmina,
acrescentando-se uma gota de lugol. Após ser colocada a lamínula, foi feita a
contagem do número de larvas presentes em toda a extensão da lamínula, para
estimar o número de larvas por cada 1mL de líquido. Em seguida, o material foi
49
centrifugado (1500 rpm por 2 minutos) e o sobrenadante retirado com uma pipeta,
até restar em torno de 1mL de líquido. Foram feitas cinco lavagens em tampão
fosfato-salina (PBS) pH 7,2 (Na
2
HPO
4
0,0075M; NaH
2
PO
4
0,0025M; NaCl 0,15M)
ressuspendendo-se em 0,25% de hipoclorito de sódio por 30 minutos, seguido por
novo procedimento de cinco lavagens em PBS. O material foi então transferido para
um frasco de vidro devidamente identificado, e congelado a -20°C.
Preparação dos antígenos
Após o descongelamento do concentrado de larvas, foi feita a extração
dos antígenos somáticos através da técnica descrita por Conway et al. (1994)
ligeiramente modificada. O concentrado de larvas foi colocado em um
homogeinizador (homogeneizador do tipo Potter da PYREX Laboratory Glasware,
Corning, USA), em banho de gelo, utilizando-se 10 mL de tampão PBS. O extrato
obtido foi submetido à tratamento por ultra-som (High Intensity Ultrasonic
Processor), 20 khz, 1mA, por três períodos de 60 segundos, em banho de gelo. Ao
homogenado foram acrescentados os inibidores de proteases: EDTA 5M, fenil-metil-
sulfonil-fluoreto (PMSF, Sigma) e Iodoacetamida (Sigma), na concentração final de
0,25 mM e deixado durante à noite a 4°C. Depois, foi então centrifugado a 10.000 x
g por 30 min a 4°C. O precipitado foi ressuspendido em 2mL de PBS e adicionados
os mesmos inibidores de proteases, sendo congelado a -20°C para ser analisado
posteriormente. O fluido sobrenadante foi coletado e colocado para dialisar contra
açúcar em saco de diálise de limite de retenção de 2kDa (AMICON) a 4°C para
concentração da solução. Após a diálise, o conteúdo líquido contendo o concentrado
de proteínas de larvas foi então denominado de AgSS e distribuído em alíquotas de
1mL armazenadas à -20°C até o uso (Fig. 8). A concentração de proteínas foi
50
determinada empregando reagente comercial “BCA Protein assay reagent” (Pierce,
Rockford, Illinois, USA), seguindo as recomendações do fabricante. A curva padrão
foi estabelecida, em cada ensaio, utilizando como proteína padrão uma solução de
albumina de soro bovino na concentração de 1mg/mL (BSA, Sigma Chem. Co,
USA).
Coleta do sobrenadante
Larvas filarióides
Inibidores de protease
+
Homo
g
eneização a 4ºC
g
elo
Tratamento por ultra-som
Repouso durante a noite (4ºC)
Centrifugação
Coleta do precipitado
Inibidores de protease
+
Ressuspendido em 2mL
de PBS
Congelamento
Diálise
AgSS (Congelado)
Figura 8 - Diagrama da preparação do antígeno somático (AgSS)
51
4.4 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA CONTENDO
DODECIL SULFATO DE SÓDIO (SDS-PAGE)
O SDS-PAGE foi feito segundo o método descrito por Laemmli (1970)
com ligeiras modificações. As proteínas do AgSS foram submetidas a eletroforese
utilizando géis de separação contendo 8, 10 e 12% de acrilamida para padronização,
e a corrida feita em um sistema vertical (Mini Protean II Dual Slab cell. Bio Rad). O
AgSS foi inicialmente dissociado por aquecimento a 100°C em tampão Tris-HCl
contendo dodecil sulfato de sódio a 10% e 2-mercaptoetanol a 10% (Tampão de
Amostra) por 5 minutos. As concentrações de 50, 74 e 80µg de antígeno foram
utilizadas para a padronização. Foram empregados marcadores de peso molecular
na faixa de 200 a 10 kDa (BenchMark Prestained Protein Ladder – GibcoBRL, USA).
Para a corrida eletroforética foi aplicada corrente de 10mA e 150 volts no gel de
empilhamento e 20mA e 200 volts no gel de separação.
Os géis para análise do perfil protéico foram corados pelo azul de
Coomassie (Coomassie Blue R-250, Sigma – 12% da solução do corante a 1%
diluído em água deionizada, 50% de álcool metílico, 10% de ácido acético e água
deionizada para completar o volume) ou pela prata (Ansorge, 1985). Os géis
utilizados para análise antigênica foram eletrotransferidos para membrana de
nitrocelulose (0,2µm) por 1 hora a 400 mA (Sistema Bio-Rad) em tampão tris-glicina
contendo metanol a 20% (Tris 0,025M; glicina 0,192M; metanol 20% v/v) conforme
técnica descrita por Teixeira et al. 1994, sendo armazenadas secas à temperatura
ambiente entre folha de papel de filtro, até serem usadas na reação
imunoenzimática.
52
4.5 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO – TÉCNICA DE WESTERN-BLOT
(TEIXEIRA et al., 1994)
A membrana de nitrocelulose contendo o AgSS foi cortada em tiras de
aproximadamente 3mm, colocadas em placas compartimentadas (Mini-incubation
Trays, Bio-Rad) e lavadas duas vezes, de cinco minutos cada, em água destilada.
No ensaio, as tiras foram incubadas com tampão Tris HCl 0,02M NaCl 0,5M pH 7,5
– 0,3% de Tween 20 (TBS-T) contendo 5% de leite desnatado (solução
bloqueadora), por 30 minutos sob agitação, à temperatura ambiente, para bloqueio
da membrana. Em seguida, foram lavadas 3 vezes com TBS-T por 5 minutos cada.
Estas tiras de nitrocelulose foram incubadas com as amostras de soro humano
(diluição de 1:100) por 60 minutos, sob agitação, à temperatura ambiente. Repetiu-
se as 3 lavagens de 5 minutos com TBS-T. Foi então adicionado o conjugado (IgG
de cabra anti-IgG humana ligada à fosfatase alcalina, Sigma) por 60 minutos, sob
agitação, à temperatura ambiente. O conjugado foi testado nas diluições de 1:3000 e
1:5000 para padronização. Foram feitas, então, 3 lavagens com TBS-T e uma com
água deionizada de 5 minutos cada. A reação foi revelada imergindo-se as tiras na
solução reveladora NBT(cloreto de azul tetrazolio) - BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil-
fosfato,4-toluidina sal) dissolvido em tampão substrato Tris-HCl/MgCl
2
pH 9,5 (Tris
0,1M , MgCl
2
0,005M) por 10 a 20 minutos para o aparecimento das bandas. As tiras
foram então lavadas em água deionizada para interromper a reação, e deixadas
secar à temperatura ambiente.
53
Todas as proteínas do AgSS reconhecidas pelas amostras de soro
testadas foram consideradas. O valor aproximado das bandas protéicas
reconhecidas foi determinado seguindo as seguintes etapas:
a) estimar o tamanho do gel de separação do SDS-PAGE, tomando-se por
base a distância total percorrida pelo padrão comercial de peso molecular
no gel;
b) medir a distância percorrida por cada banda reativa tomando-se como
ponto de partida o início do gel de separação até a posição da banda;
c) calcular a mobilidade relativa (Rf) para cada banda do padrão comercial
de peso molecular e para cada banda reativa no Western-blot-IgG
(Distância percorrida ⁄ tamanho do gel);
d) calcular o logarítmo na base 10 (Log
10
) para cada banda do padrão
comercial de peso molecular;
e) montar um gráfico com os valores logarítmos dispostos no eixo da
abscissa e os Rfs referentes ao padrão comercial de peso molecular
dispostos no eixo da ordenada. Lançar no mesmo gráfico os Rfs de cada
banda reativa no Western-blot-IgG;
f) A partir do valor traçado no gráfico para cada uma das bandas peptídicas
reconhecidas pelo soro do paciente, calcular o anti-logarítimo, que
resultará no peso molecular aproximado.
54
4.6 OXIDAÇÃO DE GLICOPROTEÍNAS PELO METAPERIODATO DE
SÓDIO
Esta técnica foi realizada como descrito por Pizzini et al. (1999) com a
finalidade de melhorar a visualização das bandas reativas no Western-blot. Tiras de
membranas de nitrocelulose contendo o AgSS foram preparadas conforme descrito
no item 5.4. Antes da etapa de bloqueio da técnica de Western-blot, estas tiras foram
incubadas com metaperiodato de sódio 100mM em tampão acetato (ácido acético
0,2M; acetato de sódio 0,2M; e água deionizada) por 20 minutos, sob agitação, no
escuro. Após este tempo, as tiras foram então lavadas uma vez com água
deionizada por cinco minutos e quatro vezes com TBS-T por cinco minutos cada,
passando então para a etapa de bloqueio da técnica de Western-blot. O tratamento
com metaperiodato foi realizado após a corrida eletroforética para evitar problemas
associados à mudanças na mobilidade resultantes da deglicosilação.
4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise dos resultados do Western-blot foram feitas utilizando-se o teste
de Fisher para amostras independentes. Este teste foi utilizado para comparar os
resultados obtidos nos soros do G1 com o dos soros dos outros grupos.
Para a elaboração do teste e também da tabela de frequência foi usado o
programa EPIINFO (1997). O nível de significância aceito para todas as análises foi
p<0,05.
5 RESULTADOS
5.1 EXAME PARASITOLÓGICO DE FEZES
Dentre as 112 amostras de fezes, coletadas na comunidade de Soledade,
analisadas pelo Laboratório de Parasitologia do HUAP – UFF por meio do Coprotest,
51 amostras foram positivas para algum tipo de parasitose intestinal (45,5%) e 61
amostras foram negativas (54,5%). Os parasitos encontrados são mostrados na
Figura 9. Quando analisamos as mesmas amostras pela técnica de Rugai et al.
(1954), obtivemos 109 amostras negativas para larvas de helmintos e 3 amostras
positivas para larvas de S. stercoralis (2,7%).
Já na comunidade do Encanto, dos 140 moradores que concordaram em
participar fornecendo amostras de fezes, apenas 47 (33,6%) contribuíram com três
ou mais amostras, havendo a maior parte dos indivíduos contribuindo com apenas
duas amostras (57-40,7%). O resultado da análise destas amostras pela técnica de
Rugai et al. (1954) evidenciou a presença de 9 indivíduos positivos para larvas de S.
56
stercoralis (6,4%). Entretanto, é importante observar que nem sempre esta detecção
de larvas ocorreu em todas as amostras analisadas de um mesmo indivíduo positivo,
como mostra a Figura 10.
Dentre os 128 moradores da comunidade do Encanto que receberam o
frasco contendo formol a 10% para realização da técnica de Coprotest, somente 111
realizaram a coleta da amostra fecal corretamente. O resultado da análise destas
amostras pode ser visto na Figura 11.
É importante ressaltar que, na comunidade do Encanto, dos 9 indivíduos
positivos para larvas de S. stercoralis pela técnica de Rugai et al. (1954), 8 também
tiveram suas amostras fecais examinadas pela técnica de Coprotest. Entretanto,
somente um morador teve amostras fecais positivas em ambas as técnicas.
Frequência
2%
6%
11%
18%
11%
6%
38%
5%
3%
Ancilostomídeos
Strongyloides stercoralis
Schistosoma mansoni
Entamoeba coli
Entamoeba histolytica / dispar
Endolimax nana
Iodamoeba butschlii
Blastocystis hominis
Giardia lamblia
Figura 9 - Gráfico de freqüência dos parasitos encontrados pela técnica de Coprotest
na comunidade de Soledade, Sumidouro, RJ. Número total de indivíduos positivos =
51.
57
1
2
3
123456789
Amostras
negativos
positivos
não realizados
1
2
3
Figura 10 - Gráfico representativo da detecção de larvas de Stongyloides
stercoralis em cada uma das três amostras examinadas pela técnica de Rugai et al.
(1954) para cada um dos 9 pacientes positivos (Encanto, Sumidouro, RJ)
Frequência
5%
4%
1%
3%
9%
16%
29%
4%
22%
7%
Ascaris lumbricoides
Ancilostomídeos
Strongyloides stercoralis
Schistosoma mansoni
Entamoeba coli
Entamoeba histolytica/dispar
Endolimax nana
Iodamoeba butschlii
Blastocystis hominis
Giardia lamblia
Figura 11 - Gráfico de freqüência dos parasitos encontrados pela técnica de
Coprotest na comunidade do Encanto, Sumidouro, RJ. Número total de indivíduos
positivos = 51.
5.2 OBTENÇÃO DAS LARVAS
A utilização da técnica de cultura de fezes em papel de filtro (Harada &
Mori, 1955) para a obtenção das larvas de S. stercoralis, não se mostrou satisfatória,
58
visto que muitas vezes não se conseguia recuperar larvas filarióides de amostras
fecais conhecidamente positivas, pois estas não migravam para a água no fundo do
tubo de ensaio.
Já a utilização de uma outra forma de recuperação das larvas, deixando a
amostra fecal conhecidamente positiva em repouso à temperatura ambiente e depois
realizando a técnica de Rugai et al. (1954), foi bastante satisfatória possibilitando a
recuperação de um total de aproximadamente 70 mil larvas filarióides que foram
congeladas para serem utilizadas neste estudo.
5.3 PREPARAÇÃO DOS ANTÍGENOS
Para um primeiro teste de extração dos antígenos somáticos, foi utilizado
um total de aproximadamente 17 mil larvas, que gerou ao final do processo uma
solução de antígeno bruto (1,5mL) de concentração protéica 0,748mg/mL.
Já em uma segunda extração de antígenos somáticos, foi utilizado um
total de aproximadamente 50 mil larvas, gerando ao final do processo uma solução
de antígeno bruto (10mL) de concentração protéica 0,1mg/mL .
5.4 PADRONIZAÇÃO DO SDS-PAGE E WESTERN-BLOT
A corrida eletroforética do AgSS e do precipitado da extração de
antígenos evidenciou a presença de proteínas de diversos pesos moleculares no
AgSS e pouca quantidade protéica no precipitado (Fig. 12).
59
Os testes de padronização revelaram que a separação de proteínas
apresentou melhor resolução no gel à 12% de acrilamida (Fig. 13).
A antigenicidade dos extratos de S. stercoralis foi estudada através da
técnica de Western-blot. As condições ideais para o ensaio de Western-blot foram:
utilização do antígeno na concentração de 80µg e a diluição do conjugado de
1:3000. O emprego do extrato bruto demonstrou um perfil complexo com
reatividades mesmo em amostras de indivíduos sem a infecção pelo parasito. A fim
de melhorar essa especificidade, optamos em tratar os extratos antigênicos com
metaperiodato 100mM, que nos permite diminuir reatividades com grupos de
carboidratos, que geralmente são responsáveias por reações não específicas. O
tratamento dos antígenos não somente melhorou a visualização das bandas, como
também diminuiu as reações inespecíficas quando comparadas com ensaios
semelhantes sem a utilização do metaperiodato (Figs.14 e 15).
60
A
B
C
Figura 12 - Gel à 10% de acrilamida contendo: A- Padrão de Peso Molecular; B-
AgSS; C-precipitado da extração de antígenos.
AB
Figura 13 - Corrida eletroforética do AgSS em gel à 12% de acrilamida (A) e 10%
de acrilamida (B). Gel corado pela técnica de impregnação pela prata.
61
Figura 14 - Resultado do Western-blot realizado sem a utilização do
metaperiodato. Para a confecção da membrana foi utilizada uma concentração de
74,8µg de antígeno num gel de 10% de acrilamida. (fitas 1 a 5 indivíduos positivos
para S. stercoralis pelo EPF, e fitas de 6 a 10 indivíduos negativos para S. stercoralis
pelo EPF)
Figura 15 - Resultado do Western-blot dos mesmos soros da Fig.14, com utilização
do metaperiodato. Para a confecção da membrana foi utilizada uma concentração de
80µg de antígeno num gel com 12% de acrilamida. (fitas 1 a 5 indivíduos positivos
para S. stercoralis pelo EPF, e fitas de 6 a 10 indivíduos negativos para S. stercoralis
pelo EPF)
62
5.5 RESULTADOS DO WESTERN-BLOT NOS GRUPOS DE SOROS
ESTUDADOS
Em todos os grupos de soros testados, foram encontrados perfis variados
de reatividade, com o reconhecimento de proteínas com massas moleculares que
variavam de 6 a 129kDa (Tabelas 1,2,3,4,5,6 e 7).
No grupo dos pacientes positivos para S. stercoralis no EPF (G1), uma
banda protéica de aproximadamente 26kDa apresentou uma alta freqüência de
reatividade (18/23) (Figs. 16 e 17 e Tabela 8). Esta mesma banda também foi
encontrada de forma esporádica nos grupos 3, 5 e 6 (Figs. 19, 21 e 24 e Tabela 8).
Quando analisamos a freqüência de aparecimento desta banda em relação aos
grupos de soros com o auxílio do teste de Fischer para amostras independentes (α =
0,05), percebemos que a banda de 26kDa apareceu significativamente mais no G1
do que em G2 (p< 0.0000324), G3 (p<0.0004218), G4 (p<0.0000324), G5 (S.
mansoni) (p<0.0025641), G5 (Trichuris trichiura) (p<0.0215385), G5 (Enterobius
vermicularis) (p<0.0215385), G5 (Taenia sp.) (p<0.0027994), G5 (H. nana)
(p<0.0215385), G5 (Ascaris lumbricoides) (p<0.0125538), e G5 (Ancilostomídeo)
(p<0.0004218). Entretanto, no grupo de pessoas que já tiveram estrongiloidíase no
passado, não houve diferença estatística em relação à banda de 26kDa quando
comparado ao grupo 1 (p<0.0646154).
63
26kDa
Figura 16 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para Strongyloides
stercoralis (G1). CN = Controle Negativo.
26kDa
Figura 17 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para
Strongyloides stercoralis (G1). CN = Controle Negativo.
64
Duas outras bandas reativas, uma de aproximadamente 33kDa e um
duplex de aproximadamente 21kDa, também apresentaram freqüências elevadas de
respectivamente 17/23 e 9/23. Porém estas duas bandas também foram
encontradas em todos os outros grupos estudados (Tabelas 2,3,4,5,6,7 e 8). Desta
forma, quando comparamos a frequência de aparecimento destas duas bandas em
relação aos grupos de soros estudados, não encontramos diferença significativa em
nenhum grupo ao nível de 5% de significância.
No grupo de indivíduos adultos negativos no EPF (G2), todos (10)
apresentaram a banda de aproximadamente 33kDa. O duplex de 21kDa foi
encontrado em 6 dos 10 soros. A banda de 26kDa não foi encontrada em nenhum
soro deste grupo (Tabela 2 e Fig. 18).
No grupo de soros de cordão umbilical (G3) apenas um soro (1/10)
apresentou reatividade para a banda de aproximadamente 26kDa. Três soros (3/10)
não apresentaram nenhuma reatividade no Western-blot. Com relação às bandas de
aproximadamente 33 e 21kDa, suas prevalências foram de 6/10 e 4/10
respectivamente (Fig. 19 e Tabela 3).
65
Figura 18 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos adultos negativos no
EPF (G2).
26kDa
Figura 19 - Ensaio de Western-blot com soros de cordão umbilical (G3). CP =
Controle Positivo.
66
O grupo de soros de indivíduos negativos no EPF mas de área de
elevada prevalência para estrongiloidíase (G4) teve resultados semelhantes aos dos
grupos 2 e 3, tendo como prevalência das bandas reativas de aproximadamente 33
e 21kDa os valores de 7/10 e 4/10 respectivamente. Três soros (3/10) não
apresentaram nenhuma reatividades no Western-blot. Nenhum soro apresentou
reatividade à banda de 26kDa (Fig. 20 e Tabela 4).
No grupo de soros de indivíduos com outras parasitoses (G5), houve
grande variação no padrão de reatividade de acordo com o tipo de parasitose
estudada, como podemos ver nas Tabelas 5 e 6 e Figuras 21, 22 e 23. É importante
ressaltar que houve presença da banda de 26kDa em soros positivos para
Ancilostomídeos (1/10), A. lumbricoides (3/10) e Taenia sp. (2/10). Além disso, a
prevalência da banda de 33kDa foi bastante alta neste grupo, sendo esta de 5/5 nos
soros positivos para S. mansoni, 3/3 em T. trichiura, 9/10 nos soros positivos para A.
lumbricoides e Ancilostomídeos, 2/3 nos soros positivos para E. vermicularis e H.
nana, e 6/10 nos soros positivos para Taenia sp. Já o duplex de 21kDa apresentou
uma prevalência consideravelmente menor, sendo esta de 2/3 nos soros positivos
para E. vermicularis e H. nana, 1/3 nos soros positivos para T. trichiura, 3/10 nos
soros positivos para A. lumbricoides, 1/5 nos soros positivos para S. mansoni, 2/10
nos soros positivos para Ancilostomídeos, e 1/10 nos soros positivos para Taenia sp.
Já no grupo de soros de indivíduos que já apresentaram estrongiloidíase
(G6), obtivemos padrões de reatividade bastante distintos (Tabela 7 e Fig. 24), que
coincidiram com o tempo decorrido após a apresentação da doença. Somente um
soro (1/4) apresentou reatividade à banda de 26kDa.
67
Entretanto, a banda de 21kDa foi encontrada em 2/4 indivíduos, enquanto
que a banda de 33kDa foi encontrada em 3/4 indivíduos.
Figura 20 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos negativos no EPF mas
provenientes de área com alta prevalência de estrongiloidíase (G4). CP = Controle
Positivo.
26kDa
A
scaris lumbricoides
E
. vermicularis
Figura 21 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para outras
helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle Positivo.
68
A
scaris lumbricoides
Figura 22 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para outras
helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle Positivo.
Figura 23 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos positivos para outras
helmintíases (G5). CN = Controle Negativo. CP = Controle Positivo.
69
26kDa
Figura 24 - Ensaio de Western-blot com soros de indivíduos que já apresentaram
estrongiloidíase no passado (G6). CN = Controle Negativo. CP = Controle Positivo.
70
Tabela 1 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de pacientes positivos para Strongyloides stercoralis (G1).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1
X X X X X
X
2
X X X X X
3
X X X X X
4
X X X X X
5
X X X X X X X X X X X
6
X X X X X X X
7
X X
8
X
9
X X X X X X
10
X X X
G1 11
X X X
X
X
12
X X X
13
X
X
X
X
X
14
X
15
X
X
XX
X
X
16
X X X X X X
17
X
X
18
X X X X X X X X
19
X X X
X
X
X
X
20
X X X X X X X X X
21
X
X X
X
X
X
X
22
X
23
X X X X X X
71
Tabela 2 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de indivíduos adultos negativos para qualquer parasitose (G2).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1
X X X
2
X
X
X
X
X
X
3
X X X
4
X X X
X
X
X
G2 5
X X X X X X
6
X
X
X
X
7
X X X
8
X X X X X
X X
X
X
X
X
X
9
X X X X X X
10
X X X X X X X X X
Tabela 3 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de cordão umbilical (G3).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1
2
3
4
X X
X X
X
X X
X
G3 5
X X X X X X X X
6
X X X X
X
X
X
X
7
X
8
X X X
X
X X
9
X X X X X X X X
10
X X X X X X
72
Tabela 4 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de indivíduos negativos no EPF mas provenientes de áera de alta
prevalência de estrongiloidíase (G4).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1
2
X X
3
X X X X
4
X X X X X X
G4 5
X X X X
6
7
8
X X
9
X X X X
10
X X X X X
73
Tabela 5 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de indivíduos positivos para outras helmintíases (G5).
Legenda: S = S. mansoni; Tt = Trichuris trichiura; H = H. nana; Al = Ascaris lumbricoides
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1 - S
X X X X
2 - S
X X X X
3 - S
X X X X
4 - S
X X X X
5 - S
X X X X
1 – Tt
X X X X X X
2 – Tt
X X
3 – Tt
X X X X
4 - H
X X X X X X
5 - H
X X X X X X X X X X
G5
6 - H
X X X
1 - Al
X X X
2 - Al
X X X X
3 - Al
X X
4 - Al
X X
5 - Al
X X X X X X X X
6 - Al
X X X X X
7 - Al
X X
8 - Al
X X X
9 - Al
X X X X X
10 -Al
X X X
74
Tabela 6 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de indivíduos positivos para outras helmintíases (G5).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1 - A
X X X X
2 - A
X X
3 - A
X X X X
4 - A
X X
5 - A
X
6 - A
X X X
7 - A
X X X X
8 - A
X X X X X
9 - A
X
G5
10 - A
X X
1 - T
X X
2 - T
3 - T
X X
4 - T
X X X
5 - T
X X
6 - T
X X
7 - T
X X X
8 - T
X X
9 - T
X X
10 - T
X X
1 - E
X X X X X
2 - E
X X
3 - E
X X
Legenda: A = Ancilostomídeo; T = Taenia sp; E = Enterobius vermicularis
75
Tabela 7 - Freqüência das bandas reativas no Western-blot dos soros de indivíduos que já apresentaram estrongiloidíase no passado
(G6).
Peso molecular aproximado das bandas reativas no Western Blot (kDa)
Grupo Soro
6-7 8 9 10-11 12-14 20 21 25 26 27 29-31 33 35 37 39 40 41-44 46 47 50 53 54 55 56 57 59 60 62 63 66 68 69 71 74 76 79 85 87 95 98 107 110 112 129
1
X X X X X X X
G6 2
X X X X
3
X X X X X X X X X
4
X X X X X X
76
Tabela 8 - Resumo das freqüências das três principais bandas encontradas no
Western-blot.
2/4 (50%) 3/4 (75%) 1/4 (25%) G6 (N=4)
12/44 (27%) 36/44 (82%)
Ancilostomídeos (1/10) A.
lumbricoides (3/10) Taenia
sp. (2/10)
G5 (N=44)
4/10 (40%) 7/10 (70%) 0 G4 (N=10)
4/10 (40% 6/10 (60%) 1/10 (10%) G3 (N=10)
6/10 (60%) 10/10 (100%) 0 G2 (N=10)
9/23 (39,1%) 17/23 (73,9%) 18/23 (78,3%) G1 (N=23)
Duplex de 21kDaBanda de 33kDaBanda de 26kDa Grupos
6 DISCUSSÃO
O diagnóstico definitivo da estrongiloidíase ainda possui como padrão a
detecção de larvas nas fezes. Muitas são as técnicas empregadas, que diferem em
sensibilidade e custo (Willcox & Coura, 1991; Kaminsky, 1993; Siddiqui & Berk,
2001; Hernandez-Chavarría & Avendaño, 2001; Blatt & Cantos, 2003), entretanto as
mais utilizadas são as que se baseiam no termohidrotropismo das larvas (Rugai et
al., 1954 e Moraes, 1948) e na cultura em placa de ágar (Arakaki et al., 1988). No
entanto, existe grande dificuldade em se diagnosticar todos os indivíduos positivos,
pois a eliminação de larvas muitas vezes é inconstante e em baixa quantidade (Goka
et al., 1990; Dreyer et al., 1996; Toma et al., 2000).
Em nosso estudo, na comunidade de Soledade, obtivemos 3 (2,7%)
indivíduos positivos para S. stercoralis pela técnica de Rugai. Entretanto, ao
analisarmos estas mesmas amostras pela técnica de Coprotest, somente foram
positivas duas amostras. A baixa prevalência da estrongiloidíase nesta área pode
ser explicada pelo fato das amostras de fezes não terem sido processadas no
78
mesmo dia da coleta, tendo sido mantidas em refrigeração até o processamento, o
que poderia ter levado a morte de algumas larvas, inviabilizando sua detecção pela
técnica de Rugai. Além disso, a análise de somente uma amostra de cada indívíduo
é considerada pouco sensível, sendo necessárias 3 amostras de fezes para
diagnosticar 50% de indivíduos positivos, e 7 amostras de fezes para diagnosticar
perto de 100% de positivos (Nielsen & Mojon, 1987).
Já na comunidade do Encanto, a frequência da estrongiloidíase pela
técnica de Rugai foi bem mais elevada (6,4%). Um estudo realizado por Kobayashi
et al. (1995) em 222 moradores de cinco fazendas de Holambra, São Paulo,
encontrou 10,4% de indivíduos positivos para S. stercoralis por meio das técnicas de
concentração por formol-éter, Harada-Mori e cultura em placa de ágar. Este mesmo
autor e colaboradores (1996) encontraram valores semelhantes de positividade
(11,3%) em 422 habitantes das cidades de Maceió e Holambra com a técnica de
cultura em placa de ágar. Machado e Costa-Cruz (1998) estudaram amostras fecais
de 300 crianças em creches de Uberlândia pelas técnicas de Baermann-Moraes e
Lutz, encontrando 13% de positividade para S. stercoralis. Desta forma, os dados
encontrados por nós corroboram com os descritos por estes pesquisadores.
Entretanto, um estudo realizado por Nucci et al. (1995) em 343 indivíduos portadores
de doenças malignas atendidos no Hospital Universitário da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, encontrou 21% de positividade para S. stercoralis, o que diferiu
grandemente da taxa global de positividade (4,2%) de todos os exames de fezes
realizados no hospital na mesma época e também dos resultados obtidos em nosso
estudo. Isto pode estar relacionado à presença de infecções inaparentes em
indivíduos imunocompetentes, que não são diagnosticadas pelo EPF.
79
Um dos fatores que podem ter contribuído para um aumento da taxa de
positividade na comunidade do Encanto em relação à comunidade de Soledade foi a
de realização da técnica de Rugai no mesmo dia da coleta da amostra. Além disso,
foram analisadas pelo menos 2 amostras de cada indivíduo, aumentando assim a
sensibilidade do teste.
A utilização da técnica de Coprotest na comunidade do Encanto também
se mostrou pouco sensível para a pesquisa de S. stercoralis, pois dos 9 indivíduos
positivos pela técnica de Rugai, 8 foram analisados também pelo Coprotest e
somente um foi positivo em ambas as técnicas. Blatt & Cantos (2003) também
constataram uma menor sensibilidade da técnica de formalina-acetato de etila
quando comparada com a técnica de Baermann para o diagnóstico da
estrongiloidíase. Além disso, Siddiqui & Berk (2001) chamam a atenção para o fato
de que na técnica de formalina-acetato de etila as larvas mortas tornam-se muito
mais difíceis de serem identificadas.
Um outro ponto interessante foi a flutuação da freqüência de eliminação
das larvas de S. stercoralis nas fezes dos indivíduos infectados, que corrobora com
dados descritos por outros autores (Nucci et al., 1995; Dreyer et al., 1996, Machado
& Costa-Cruz, 1998; Toma et al., 2000). Desta forma, fica bastante clara a
necessidade de se analisar diversas amostras fecais de um mesmo indivíduo para
evitar os resultados falso-negativos. Neste estudo, acreditamos que se
continuássemos analisando as amostras fecais desta comunidade, talvez fossemos
encontrar mais indivíduos positivos que não foram detectados nestes testes iniciais.
80
Os resultados aqui relatados comprovam a dificuldade em se diagnosticar
todos os indivíduos positivos para S. stercoralis pelo EPF, sugerindo assim que
novas formas de diagnóstico sejam implementadas. Muitos autores vem
pesquisando novos métodos de diagnóstico por técnicas sorológicas (Neva et al.,
1981; Gam et al., 1987; Sato et al., 1990; Mangali et al., 1991; Sato et al., 1991;
Conway et al., 1993a e b; Rossi et al., 1993; Lindo et al., 1994; Costa-Cruz et al.,
1998). Entretanto, a grande dificuldade se encontra na obtenção de larvas
suficientes para posterior purificação e utilização como antígenos (Rossi et al.,
1993).
Em nosso estudo, foram obtidas em torno de 70 mil larvas filarióides de S.
stercoralis mediante dois tipos de cultura fecal. Primeiramente utilizamos a técnica
descrita por Harada & Mori (1955) mas constatamos uma baixa obtenção de larvas
filarióides de amostras conhecidamente positivas. Este dado também foi relatado por
Kobayashi et al., 1995; Kobayashi et al., 1996; Blatt & Cantos, 2003.
Na tentativa de melhorar esta recuperação das larvas, passamos a
manter a amostra fecal no próprio frasco de coleta sem conservante durante 24 a 48
horas (tempo observado para que as larvas rabditóides realizem muda para o
estádio de filarióide). Após este tempo, foi feita a recuperação da larva com a técnica
de Rugai. Esta modificação simples melhorou muito a quantidade de larvas obtidas.
Uma técnica semelhante a esta, utilizando carvão ativado misturado à amostra fecal
foi utilizada por Rossi et al. (1993) apresentando-se também satisfatória.
Em um primeiro teste de extração antigênica das larvas, obtivemos um
rendimento bastante satisfatório (15 mil larvas originando 1,5mL com concentração
81
protéica de 0,748mg/mL), sendo suficiente para a realização de toda a padronização
e testes de Western-blot. Já Conway et al. (1993b) conseguiram obter cerca de 1mg
de proteína total utilizando aproximadamente 100 mil larvas. Machado et al. (2003)
utilizaram 100 mil larvas de Strongyloides venezuelensis para confecção de antígeno
heterólogo para teste imunológico da estrongiloidíase, obtendo uma concentração
protéica de 0,240mg/mL.
Uma segunda extração dos antígenos foi realizada com as larvas
restantes, onde obtivemos um rendimento muito inferior (50 mil larvas originando
10mL com concentração protéica de 0,1mg/mL). Acreditamos que esta perda possa
ser devido à utilização de hipoclorito de sódio durante o processo de obtenção das
larvas, gerando destruição e decomposição das mesmas.
Apesar das dificuldades encontradas para obtenção e purificação de
antígenos, muitos autores vêm tentando caracterizar imunologicamente os antígenos
de S. stercoralis visando a confecção de testes imunológicos que possam sanar a
deficiência do EPF. Dentre estes, a técnica de Western-blot vem sendo muito
utilizada (Conway et al., 1993b; Sato et al., 1990; Lindo et al., 1994; Conway et al.,
1994). Um estudo realizado por Genta et al. (1986) mostrou que são produzidos
anticorpos IgG específicos para este parasita e que estes podem ser úteis para o
diagnóstico da estrongiloidíase. Já Genta e Weil (1982) evidenciaram baixos níveis
de anticorpos IgG direcionados contra a superfície das larvas rabditóides em
pacientes com altos níveis de IgG contra antígenos de superfície de larvas
filarióides; sugerindo a possibilidade das larvas adquirirem novos antígenos durante
a muda de rabditóide para filarióide. Desta forma, decidimos utilizar a técnica
82
Western-blot para pesquisa de anticorpos IgG visando a caracterização imunológica
de larvas filarióides de S. stercoralis.
Segundo Alarcón de Noya et al. (2000), o tratamento com metaperiodato
de sódio oxida os grupos hidroxila dos açúcares em aldeídos em pH ácido. Durante
os testes de padronização da técnica Western-blot, constatamos que a utilização do
metaperiodato de sódio melhorou a visualização das bandas reativas como também
reduziu as reações inespecíficas. Estes dados corroboram com os descritos por
Pizzini et al. (1999) para o diagnóstico de Histoplasmose aguda. Alarcón de Noya et
al. (2000) encontraram redução na reatividade cruzada no imunodiagnóstico do
Schistosoma mansoni quando foi utilizado antígeno solúvel de ovo.
Mangali et al. (1991) estudaram duas preparações antigênicas de S.
stercoralis (extrato bruto e forma parcialmente purificada) em um ELISA e
verificaram que houve maior reatividade na fração purificada do que no extrato bruto.
Isto se deve ao fato de que o extrato bruto provavelmente contém uma grande
proporção de carboidratos não antigênicos ou pouco antigênicos que podem
interferir nas reações antígeno-anticorpo. Desta forma, acreditamos que a utilização
do metaperiodato de sódio contribui para a eliminação destas substâncias pouco
antigênicas favorecendo as reações de ligação entre antígeno-anticorpo.
A utilização do Western-blot no teste dos 6 grupos de soros utilizados
neste estudo revelou uma grande variedade de reatividade, sugerindo que diversas
moléculas sejam responsáveis pela imunogenicidade deste parasito. Brindley et al.
(1988) estudaram antígenos de superfície e de excreção/secreção de larvas
filarióides de S. stercoralis e constataram que estes compõem um amplo e
83
heterogêneo grupo de moléculas, das quais muitas são imunogênicas em indivíduos
infectados e algumas são alergênicas em humanos e primatas.
Esta variabilidade na reatividade do Western blot também foi encontrada
por Genta et al. (1987) onde 19 bandas distintas foram reconhecidas pela IgG.
Dentre os soros de indivíduos positivos para S. stercoralis no EPF,
encontramos alta reatividade (18/23) para a banda protéica de aproximadamente
26kDa. Sato et al. (1990) em estudo semelhante, encontraram grande variabilidade
na reatividade dos soros ao extrato de larvas, entretanto, as bandas reativas mais
freqüentes foram as de 97, 66, 41 e 26kDa. Já Conway et al. (1993b e 1994) e Lindo
et al. (1994) encontraram padrões de reatividade semelhantes, tendo as proteínas
de peso molecular 41, 31 e 28kDa como as mais freqüentes. Siddiqui et al. (1997)
encontraram um padrão de reatividade mais freqüente nas bandas de 96, 86, 41, e
32kDa. Acreditamos que esta diferença nos resultados obtidos se deva ao fato de
que nenhum destes autores utlizou metaperiodato no protocolo de reação do
Western-blot, o que poderia ter modificado o perfil de reatividade do teste. Além
disso, diferenças metodológicas nas técnicas utilizadas e diferenças no tipo de
antígeno utilizado também podem ter influenciado nos resultados.
Silva et al. (2003) utilizaram antígeno heterólogo (Strongyloides ratti) para
o diagnóstico imunológico de pacientes portadores de estrongiloidíase com a técnica
Western-blot. Neste estudo, os autores encontraram uma banda reativa de 28-35kDa
com uma elevada frequência.
84
Dos cinco soros que não apresentaram reatividade com a banda de
26kDa, dois eram de indivíduos com estrongiloidiase disseminada. Um destes
indivíduos era HIV positivo e o outro estava sendo internado devido a
estrongiloidíase pela segunda vez em menos de um ano. Infelizmente não foi
possível obter dados médicos dos outros 3 soros não reativos.
Muito se tem discutido sobre a influência da co-infecção pelo vírus HIV no
agravamento da infecção pelo S. stercoralis. Blatt & Cantos (2003) estudaram
amostras fecais de indivíduos positivos (211) e negativos (213) para HIV por meio
das técnicas de cultura em placa de ágar, Lutz, formalina-acetato de etila, Baermann
e Harada-Mori. Estes autores encontraram uma maior susceptibilidade à infecção
por S stercoralis em pacientes HIV positivos comparados com os HIV negativos.
Entretanto, Viney et al. (2004) ao estudar o status imune de 35 indivíduos HIV
positivos com o desenvolvimento da infecção por S. stercoralis, verificaram que em
indivíduos com a função imune preservada, o desenvolvimento direto do parasita é
relativamente mais comum, enquanto que em indivíduos com uma baixa função
imune o desenvolvimento indireto é relativamente mais freqüente. Desta forma, os
autores acreditam que a infecção pelo HIV não é responsável pela disseminação da
estrongiloidíase. Sendo assim, não podemos afirmar que haja alguma relação entre
a co-infecção pelo HIV e a estrongiloidíase disseminada no paciente pertencente ao
nosso estudo, mas acreditamos que novos estudos devam ser realizados neste
campo para elucidar tais questões.
Sato et al. (1990) também encontraram redução da reação de soros de
pacientes com estrongiloidíase disseminada aos antígenos de S. stercoralis no
Western-blot. Da mesma forma, Carvalho et al. (1983) reportou níveis de IgG
85
significativamente menores em pacientes com estrongiloidíase severa do que em
pacientes assintomáticos. Estes achados sugerem que possa haver uma redução da
resposta imunológica em indivíduos com estrongiloidíase disseminada, dificultando
assim o diagnóstico sorológico nestes indivíduos.
Recentemente vem sendo descrita associação entre a infecção pelo vírus
HTLV-1 e o agravamento da estrongiloidíase (Gotuzzo et al., 1999; Isotalo et al.,
2000; Adedayo et al., 2001; Porto et al., 2001; Huaman et al., 2003). Acredita-se que
a resposta imunológica à infecção por helmintos seja do tipo Th2, enquanto que a
infecção pelo HTLV-1 é do tipo Th1. Como as células Th1 e Th2 secretam citocinas
com funções antagônicas, quando existe co-infecção de HTLV-1 e S. stercoralis,
ocorre uma modulação da resposta imune, normalmente prevalecendo a resposta
Th1 e favorecendo a disseminação do parasita (Porto et al., 2002). Além disso,
acredita-se que a associação entre estas duas infecções seja uma grande causa de
falha terapêutica no tratamento da estrongiloidíase (Gotuzzo et al., 1999; Porto et al.,
2002; Satoh et al., 2002). Desta forma, no caso do paciente com estrongiloidíase
disseminada recorrente reportado em nosso estudo, uma explicação para este fato
seria uma possível co-infecção com HTLV-1. Entretanto, não foi possível a
realização da pesquisa desta infecção no paciente.
A reatividade à banda de 26kDa também foi encontrada em um dos soros
de cordão umbilical (grupo 3). Isto pode ser explicado pela passagem de anticorpos
maternos para o feto. Infelizmente não foi possível obter dados referentes a uma
possível infecção da gestante por S. stercoralis.
86
No grupo de soros de indivíduos com outras parasitoses (G5), foi
constatada reatividade para a banda de 26kDa em dois soros de indivíduos positivos
para Taenia sp, três positivos para A. lumbricoides e um para Ancilostomideos. Muito
se tem discutido a respeito da reatividade cruzada nos testes sorológicos para a
estrongiloidíase, principalmente nos ensaios ELISA. Sithithaworn et al. (2003)
encontraram reação cruzada nos ensaios ELISA com Onchocerca viverrini e
Ancilostomídeos; entretanto, nenhuma reatividade cruzada foi encontrada com
Taenia sp, Angiostrongylus e Giardia intestinalis. Já Neva et al. (1981) e Conway et
al. (1993a), constataram um alta taxa de reação cruzada em indivíduos portadores
de filaríase, principalmente oncocercose.
Estudos visando uma redução desta reação cruzada já estão sendo
amplamente realizados, e acredita-se que a utilização de uma etapa de pré-
absorção dos soros a serem testados com extratos de certos nematóides aumenta a
especificidade da detecção de IgG anti-S. stercoralis no ELISA (Conway et al.,
1993a; Lindo et al., 1994).
Por outro lado, Nucci et al. (1995), ao estudarem a resposta sorológica de
pacientes com doenças hematológicas malignas e estrongiloidíase encontraram
diversos fatores de risco, sendo que um deles foi a co-infecção com A. lumbricoides.
Estes mesmos autores sugeriram que amostras fecais positivas para A. lumbricoides
devem ser exaustivamente pesquisadas para a presença de larvas de Strongyloides.
Da mesma forma, Mangali et al. (1991) ao testarem o soro de treze indivíduos
positivos para T. trichiura e A. lumbricoides, encontraram três soros positivos para S.
stercoralis no ELISA. Estes autores também consideraram a possibilidade destes
87
pacientes apresentarem uma forma leve de infecção pelo S. stercoralis, onde não foi
possível a detecção de larvas nas fezes.
Desta forma, acreditamos que os indivíduos positivos para outras
parasitoses que apresentaram reatividade para a banda de 26kDa em nosso estudo,
não representariam um resultado falso-positivo e sim indivíduos que possuíam um
quadro de co-infecção. Neste caso, um quadro de infecção leve, com pequena
eliminação de larvas, se torna extremamente difícil de ser diagnosticado,
principalmente porque foi realizado apenas o exame de uma única amostra fecal de
cada indivíduo.
Outras duas bandas, uma de 33 e um duplex de 21kDa apresentaram alta
frequência no grupo de indivíduos positivos para S. stercoralis (G1). Entretanto,
estas bandas foram freqüentes nos outros grupos estudados incluindo o controle
negativo. Notamos que ao avaliarmos a concomitância das duas bandas, esta foi
significativamente maior no G1, o que poderia significar mais um padrão diagnóstico
para a estrongiloidíase.
Em dois estudos realizados por Conway et al. (1993b e 1994) foi
encontrada reatividade com uma banda protéica de 31kDa nos soros de pacientes
positivos para S. stercoralis. Já Siddiqui et al. (1997) em estudo semelhante,
encontraram reatividade a uma banda proteica de 32kDa. Genta et al. (1986)
encontraram reatividade às bandas de 21,9, 31,2 e 33,7kDa em soros de indivíduos
positivos para S. stercoralis. Acreditamos que estas sejam equivalentes às bandas
de 21 e 33kDa descritas por nós.
88
No grupo de soros de indivíduos que já haviam apresentado
estrongiloidiase, o perfil de reatividade variou de acordo com o tempo de
apresentação da doença. Desta forma, o indivíduo com um ano decorrido da
infecção e tratamento apresentou reatividade às bandas de 21, 33 e 26kDa. No
indivíduo com cerca de dois anos decorridos após a infecção, houve reatividade
para as bandas de 33 e 21kDa. Já no indivíduo com mais de 5 anos decorridos após
a infecção, houve reatividade somente para a banda de 33kDa. Nenhuma
reatividade às bandas de 26, 21 e 33kDa foi encontrada no soro do indivíduo que
contraiu e tratou a enfermidade a cerca de 30 anos. Isto corrobora com os dados
descritos por Lindo et al. (1996) onde os anticorpos IgG tendem a declinar
lentamente após o tratamento, podendo permanecer durante um período de até 18
meses. Entretanto, não podemos descartar a possibilidade de uma manutenção do
ciclo do parasito através de reinfecções, que mantém a taxa parasitária baixa mas
constate, o que continua estimulando o sistema imunológico e na maioria das vezes
não é detectado pelo EPF. Desta forma, mais estudos nesta área precisam ser
desenvolvidos para elucidar tais questões.
Acreditamos que estas três bandas reativas observadas em nosso estudo
sejam importantes para o diagnóstico da estrongiloidíase, principalmente a banda de
26kDa, devido à sua alta freqüência em indivíduos positivos. Entretanto, mais
estudos precisam ser realizados nesta área visando um aperfeiçoamento das
técnicas de diagnóstico imunológico mediante a confecção de anticorpos
monoclonais e antigenos recombinantes, possibilitando um diagnóstico mais
específico desta enfermidade.
7 CONCLUSÕES
Os resultados deste trabalho nos permitem concluir que:
A técnica de Rugai se mostrou mais sensível para o diagnóstico da
estrongiloidíase quando comparada com a técnica do Coprotest na
população estudada
A utilização do metaperiodato de sódio na técnica do Western blot
melhorou a visualização das bandas reativas e reduziu algumas reações
inespecíficas
A banda de 26kDa apresentou uma substancial frequëncia de reatividade
entre os indivíduos positivos para S. stercoralis, podendo ser utilizada no
diagnóstico presuntivo da estrongiloidíase mediante técnicas mais simples
como o ELISA ou o dot-blot.
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9 ANEXOS
99
9.1 ANEXO I
100
9.2 ANEXO II
101
9.3 ANEXO III
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Doador
Nome do doador:
Idade: anos R.G. R.G.-HUAP:
Responsável legal (se for o caso):
Título do projeto: Caracterização Imunológica de anticorpos de larvas do
Strongyloides stercoralis.
Responsável pelo projeto: Heloísa Werneck de Macedo CRF 2775 – RJ.
Departamento de Patologia da Universidade federal Fluminense – UFF.
Laboratório de Parasitologia
Eu, _______________________________________, abaixo assinado, concordo em
participar da pesquisa conduzida pelo Laboratório de Parasitologia do Hospital
Universitário Antônio Pedro, para avaliar a presença de parasitoses intestinais, em
especial a estrongiloidíase, em meu organismo, através dos exames em amostras
de fezes e sangue.
Eu estou consciente que as parasitoses intestinais são prejudiciais a minha
saúde e estarei colaborando para a melhoria dos métodos de diagnóstico da
estrongiloidíase.
Para isso, autorizo a coleta de fezes em duas amostras e amostra de sangue
e estou ciente de que isso pode me causar certo desconforto.
Após obter as informações eu, voluntariamente concordo em participar deste
projeto, ciente de que poderei retirar minha autorização a qualquer momento, sem
prejuízo algum para minha relação com HUAP-UFF.
Sei que será mantido caráter confidencial dos meus dados pessoais e, se os
resultados dos testes gerarem, além do estabelecimento da técnica, informações
valiosas para todos que atuem com estas metodologias, serão apresentados em
congressos e publicações especializadas.
Niterói, de de .
_________________________________ _________________________
Assinatura do ( ) doador ou ( ) responsável
Assinatura do profissional ou aluno que obteve o consentimento e inscrição
_____________________________ _____________________________
Assinatura da testemunha Assinatura da testemunha
Casos especiais de consentimento:
1. Paciente menor de 16 anos; deverá ser dado por um dos pais ou, na ausência destes, pelos
parentes mais próximo ou responsável.
2. Paciente maior que 16 anos e menor de 21 anos; com assist6encia de um dos pais ou
responsável.
3. Paciente e/ou responsável analfabeto; o presente documento deverá ser lida para o paciente e/ou
seu responsável ma presença de duas testemunhas que firmarão também o documento.
4. Paciente deficiente mental, incapaz de manifestação de sua vontade: suprimento necessário da
manifestação de vontade por seu representante legal.
102
9.4 ANEXO IV
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Doador
Nome do doador:
Idade: anos R.G. R.G.-HUAP:
Responsável legal (se for o caso):
Título do projeto: Caracterização Imunológica de antigenos de larvas de
Strongyloides stercoralis.
Responsável pelo projeto: Heloísa Werneck de Macedo CRF 2775 – RJ.
Departamento de Patologia da Universidade federal Fluminense – UFF.
Laboratório de Parasitologia
Eu, _______________________________________, abaixo assinado, concordo em
participar da pesquisa conduzida pelo Laboratório de Parasitologia do Hospital
Universitário Antônio Pedro, para avaliar a presença de parasitoses intestinais, em
especial a estrongiloidíase, em meu organismo, através dos exames em amostras
de fezes e sangue.
Eu estou consciente que as parasitoses intestinais são prejudiciais a minha
saúde e estarei colaborando para a melhoria dos métodos de diagnóstico da
estrongiloidíase.
Para isso, autorizo a coleta de fezes em três amostras e amostra de sangue e
estou ciente de que isso pode me causar certo desconforto.
Após obter as informações eu, voluntariamente concordo em participar deste
projeto, ciente de que poderei retirar minha autorização a qualquer momento, sem
prejuízo algum para minha relação com HUAP-UFF.
Sei que será mantido caráter confidencial dos meus dados pessoais e, se os
resultados dos testes gerarem, além do estabelecimento da técnica, informações
valiosas para todos que atuem com estas metodologias, serão apresentados em
congressos e publicações especializadas.
Niterói, de de .
_________________________________ _________________________
Assinatura do( ) doador ou ( ) responsável
Assinatura do profissional ou aluno que obteve o consentimento e inscrição
_____________________________ _____________________________
Assinatura da testemunha Assinatura da testemunha
Casos especiais de consentimento:
5. Paciente menor de 16 anos; deverá ser dado por um dos pais ou, na ausência destes, pelos
parentes mais próximo ou responsável.
6. Paciente maior que 16 anos e menor de 21 anos; com assist6encia de um dos pais ou
responsável.
7. Paciente e/ou responsável analfabeto; o presente documento deverá ser lida para o paciente e/ou seu
responsável ma presença de duas testemunhas que firmarão também o documento.
8. Paciente deficiente mental, incapaz de manifestação de sua vontade: suprimento necessário da
manifestação de vontade por seu representante legal.
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