ads:
JOSÉ EDUARDO DE SÁ PEDROSO
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DO ÁCIDO
HIALURÔNICO NAS PREGAS VOCAIS DE
RATAS, DURANTE O CICLO ESTRAL E O
CICLO GRAVÍDICO-PUERPERAL
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo-Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências.
São Paulo
2006
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
JOSÉ EDUARDO DE SÁ PEDROSO
ANÁLISE DA CONCENTRAÇÃO DO ÁCIDO
HIALURÔNICO NAS PREGAS VOCAIS DE
RATAS, DURANTE O CICLO ESTRAL E O
CICLO GRAVÍDICO-PUERPERAL
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo-Escola Paulista de Medicina,
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências pelo programa de Pós-Graduação
em Otorrinolaringologia e Cirurgia de
Cabeça e Pescoço.
Orientador: Prof. Dr. Osíris Camponês do
Brasil.
Co-orientador: Prof. Dr. Manuel de Jesus
Simões.
São Paulo
2006
ads:
Pedroso, José Eduardo de Sá .
Análise da concentração do ácido hialurônico nas pregas vocais de
ratas durante, o ciclo estral e gravídico-puerperal/ José Eduardo de Sá
Pedroso- São Paulo, 2006
xii, 58 f.
Tese (doutorado)- Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista
de Medicina. Programa de Pós-graduação em Otorrinolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço.
Título em inglês: Analysis of hyaluronic acid concentration in rat vocal
folds during estral and gravidic puerperal cycles.
1. Cordas vocais 2. Laringe 3. Ácido hialurônico 4. Hormônios
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINAESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS
PROGRAMA DE PÓSPROGRAMA DE PÓS
PROGRAMA DE PÓS-
--
-GRADUAÇÃO OTORRINOLARINGOLOGIA
GRADUAÇÃO OTORRINOLARINGOLOGIA GRADUAÇÃO OTORRINOLARINGOLOGIA
GRADUAÇÃO OTORRINOLARINGOLOGIA
E CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO
E CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO E CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO
E CIRURGIA DE CABEÇA E PESCOÇO
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS
COORDENADOR DO CURSO DE PÓSCOORDENADOR DO CURSO DE PÓS
COORDENADOR DO CURSO DE PÓS-
--
-G
GG
GRADUAÇÃO
RADUAÇÃORADUAÇÃO
RADUAÇÃO
Prof. Dr. PAULO AUGUSTO DE LIMA PONTES
iv
DEDICATÓRIA
DEDICATÓRIADEDICATÓRIA
DEDICATÓRIA
À Andrea grande amor da minha vida, companheira
compreensiva e paciente.
Ao Renato luz da minha vida, que me ajudou a
compreender e dar valor ao que realmente importa.
Aos meus pais pelo exemplo, confiança, e sobretudo
pelo amor que me dedicaram.
Aos meus irmãos, que não são poucos, pela solidariedade
e muita torcida.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. OSÍRIS CAMPONÊS DO BRASIL Professor Orientador do Departamento
de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da UNIFESP – EPM,
exemplo de pessoa e profissional ético e moral, pela sua amizade, e muita paciência e
bom humor.
Ao Dr. MANUEL DE JESUS SIMÕES Professor Livre Docente da Disciplina de
Histologia da UNIFESP - EPM pela constante orientação nas descrições das lâminas
no Laboratório de Histologia.
Ao Dr. PAULO AUGUSTO DE LIMA PONTES Professor Titular do Departamento
de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço da UNIFESP – EPM, pela
idéia do trabalho e seu exemplo de incansável capacidade profissional.
Ao Dr. MOACYR DOMINGOS NOVELLI, por proporcionar acesso ao Laboratório
de Informática Ligado a Odontologia para mensurações eletrônicas das lâminas,por
meio do programa Imagelab 2000.
À Dra. HELENA B. NADER Professora Titular do Departamento de Biologia
molecular da UNIFESP-EPM, por me receber e permitir a utilização do laboratório
da Biologia Molecular.
Ao Dr. JOÃO ROBERTO M. MARTINS pelas orientações no Laboratório de
Biologia Molecular.
Aos colegas Dr. LUCIANO RODRIGUES NEVES e Dra. PAULA LORENZON,
pela ajuda nos acessos à USP, e nas correções nas idéias.
Ao Dr. ANTONIO PONTES pela impressionante facilidade no manuseio do
computador, durante o dimensionamento e a preparação das imagens.
vi
A ELSA YOKO KABAYASHI e ALINE MENDES pela ajuda no Laboratório da
Biologia Molecular, auxiliando-me na bancada e no aprendizado de uma área nova
para mim.
A Dra. GUI MI CO Diretora do Centro de Desenvolvimento de Modelos
Experimentais para Medicina e Biologia – CEDEME, por permitir a utilização dos
animais e do biotério, bem como pela ajuda na determinação das ratas a serem
utilizadas na pesquisa.
Às Sras. MARIA JOSÉ e ADALVA secretárias, da Pós-Graduação, pela paciência
ao esclarecer sobre o preechimento dos formulários, bem como pelos avisos das
minhas obrigações.
A Profa. MAIZA COSTA NEIVA, pela correção dos erros de português.
Ao biólogo PAULO CELSO FRANCO, pela preparação das lâminas e pelos
cuidados nas técnicas de histologia.
Ao técnico EMANUEL PEREIRA CABRAL pelo tratamento dos animais e pela
ajuda no manuseio dos mesmos.
vii
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS.................................................................viii
LISTA DE TABELAS..................................................................ix
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................x
RESUMO......................................................................................xi
1. INTRODUÇÃO..........................................................................1
2. OBJETIVO...............................................................................11
3. REVISÃO DE LITERATURA................................................13
4. MÉTODO.................................................................................17
5. RESULTADOS........................................................................31
5. DISCUSSÃO............................................................................38
6. CONCLUSÕES........................................................................44
7. REFERÊNCIAS.......................................................................46
8. ANEXOS..................................................................................51
9. ABSTRACT.............................................................................56
10. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA........................................58
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Unidade dissacarídica básica dos glicosaminoglicanos....................................8
Figura 2. Ácido Hialurônico: Estrutura molecular...........................................................8
Figura 3. Contenção da rata............................................................................................19
Figura 4. Realização do esfregaço
..................................................................................................
19
Figura 5. Esfregaço das fases do ciclo estral: A-estro; B-diestro; C-metaestro;
D- proestro. Células (setas) c-celula cornificada; e-celula epitelial; l-leucócito............20
Figura 6. Incisão cérvico torácica...................................................................................22
Figura 7. Dissecção da traquéia......................................................................................22
Figura 8. Detalhe da laringe da rata...............................................................................
.
23
Figura 9. Detalhe da incisão posterior na laringe...........................................................24
Figura 10. Incisão para a ressecção da prega vocal. A seta mostra a cartilagem
aritenóidea.......................................................................................................................24
Figura 11. Esquema do preparo da amostra para estudo bioquímico.............................27
Figura 12. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico do ácido hialurônico..27
Figura 13. Tela de trabalho do software Imagelab 2000................................................29
Figura 14. Corte da prega vocal de rata corada com HE no puerpério. Onde E é o
epitélio, LP-lâmina própria e M- músculo.......................................................................35
Figura 15. Corte da prega vocal da fase proestro do ciclo estral corada com azul de
alcian. E-epitélio, C-cartilagem, LP-lâmina própria e M- músculo................................36
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Dados sobre a amostra no ciclo estral: peso, quantidade do ácido hialurônico
e concentração do àcido hialurônico. Subgrupos: E-estro, D-diestro, M-metaestro, P-
proestro............................................................................................................................32
Tabela 2. Dados sobre a amostra no ciclo gravídico-puerperal: peso, quantidade do
ácido hialurônico e concentração do acido hialurônico. Subgrupos: 7°- sétimo dia, 14°
décimo quarto dia, 21- vigésimo primeiro dia, P- décimo quarto dia de puerpério........33
Tabela 3. Comparativo entre subgrupos no grupo estral, segundo a medida AH µ/g
tecido seco.......................................................................................................................34
Tabela 4. Comparativo entre subgrupos no grupo Gravídico-puerperal no 7°, 14°, 21° e
14° dia de puerpério (P) segundo a medida AH µ/g tecido seco.....................................34
Tabela 5. Comparativo total entre subgrupos no grupo Estral (E, D, M e P) e subgrupos
no grupo Prenhez (7, 14, 21 e P) segundo a medida AH µ/g tecido seco........................35
Tabela 6. Os resultados apresentados pela análise quantitativa das concentrações de
GAGs, no corte com coloração azul de alcian, e corte tratado com hialuronidase
específica para o AH........................................................................................................37
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AH Ácido hialurônico
BSA Albumina Sérica Bovina
DAB Diaminobenzidina
GAG(s) .Glicosaminoglicano(s)
HE Hematoxilina-Eosina
LP Lâmina Própria
PBS Solução salina tamponada com fosfato/
Phosphate buffered saline
PV Prega vocal
PPVV Pregas vocais
xi
RESUMO
Os hormônios exercem importante influência sobre a laringe. Variações da voz são
comuns na prática clinica, e podem refletir alterações nas pregas vocais ao nível
macroscópico e ultraestrutural. A prega vocal contém, entre outras substâncias, o ácido
hialurônico, sendo este responsável, em grande parte, pelas suas propriedades
viscoelásticas. A concentração do ácido hialurônico nos tecidos pode variar com a ação
dos hormônios. OBJETIVO: O objetivo deste trabalho é analisar comparativamente a
concentração do ácido hialurônico nas pregas vocais de ratas durante o ciclo estral e
ciclo gravídico-puerperal. MÉTODO: Foram utilizadas 40 ratas adultas, divididas em
dois grupos, ciclo estral e gravídico-puerperal. No primeiro grupo utilizamos 20 ratas
para determinação da concentração do ácido hialurônico no ciclo estral; no segundo
grupo, também de 20 animais, foi realizado o mesmo experimento no ciclo gravídico-
puerperal. Os dois grupos foram divididos em subgrupos de acordo com a fase do ciclo
em que se encontravam, e com o tempo de prenhez do animal. Nos subgrupos de cinco
animais, quatro foram utilizados para o estudo da concentração do AH e um para os
procedimentos histológicos. O método utilizado foi desenvolvido no Departamento de
Biologia Molecular da Universidade de São Paulo-Escola Paulista de Medicina e trata-
se de um método fluorimétrico para a determinação do AH em fluidos biológicos,
utilizando sondas de ligação do AH. Os cortes histológicos foram submetidos à
coloração de Hematoxilina–Eosina, e azul de alcian com e sem tratamento com
hialuronidase. RESULTADOS: No grupo do ciclo estral não se observou variação da
concentração do ácido hialurônico. No grupo do ciclo gravídico-puerperal houve
aumento da concentração do ácido hialurônico no subgrupo do puerpério. Na
comparação entre os dois grupos do ciclo estral e gravídico-puerperal não houve
xii
diferença. Quando comparamos todos os subgrupos há diferença no grupo do puerpério.
CONCLUSÕES: Comparando-se todos os subgrupos do ciclo estral e ciclo gravídico-
puerperal, só no puerpério houve aumento da concentração do ácido hialurônico.
1
1. INTRODUÇÃO
2
Os hormônios exercem importante influência sobre a laringe. A voz
humana é sensível às variações hormonais e sua alteração pode constituir o primeiro
sintoma de diversas doenças hormonais.
As modificações laríngeas não se limitam apenas aos períodos da
puberdade, andropausa e menopausa elas ocorrem durante toda a vida do indivíduo. Os
mais óbvios e profundos efeitos hormonais são fisiológicos
e ocorrem na época da
puberdade, quando alterações nas dimensões laríngeas provocam abaixamento do tom
da voz masculina em aproximadamente uma oitava e feminina em algumas notas ( De
Biase & Silva, 2000). As mudanças vocais na mulher, associadas aos hormônios
sexuais, são muito comuns na prática clínica e têm sido investigadas em alguns
períodos, como: pré-menstrual, gravidez, e menopausa.
Segundo Greene & Dalton (1953), no período pré-menstrual, quando os
níveis de estrógeno e progesterona estão mais baixos, ocorre um leve espessamento das
pregas vocais (PPVV). Os autores relatam que algumas cantoras de ópera evitam
obrigações com o canto, alguns dias antes e após a menstruação.
O impacto hormonal se dá não somente sobre o trato genital, mas
também sobre as mucosas, os músculos, os tecidos ósseos, a laringe e o córtex cerebral
(Abitbol et al, 1999). Este autor, em estudo com 97 mulheres, profissionais da voz,
apresentando disfonia pré-menstrual, referiu-se à ação da progesterona e do estrogênio
sobre os músculos e a mucosa do complexo vocal e seus efeitos vascular, secretor,
energético, bem como sobre a hidratação. Segundo o autor, um terço das mulheres sofre
com a síndrome pré-menstrual, caracterizada por fadiga vocal, diminuição de alcance
vocal, com perda de tons agudos, aspereza e perda da expressão vocal, além de edema e
congestão das pregas vocais.
3
A atividade da progesterona e do estrógeno no período pré-menstrual
causa vasodilatação, aumentando o volume de sangue e resultando em edema da prega
vocal (PV) ( Sataloff et al, 1997). Este autor menciona que, embora médicos estejam
mais impressionados com as mudanças da voz no período pré-menstrual do que com
aquelas ocorridas no meio do ciclo, essas alterações podem ser mais pronunciadas no
período da ovulação.
Figueiredo et al (2004) concluíram, durante a avaliação perceptivo-
auditiva nos períodos menstrual e de ovulação, que a maioria dos parâmetros utilizados
para detectar modificação na voz mostrou alterações significativas. As mulheres,
entretanto, não apresentaram conscientização sobre a mudança de suas vozes,
confirmando as conclusões do trabalho de Vasconcelos et al (2001).
Semple & McComb (2000), estudando macacos da região de Gibraltar,
observaram que, através de pequenas alterações na voz das fêmeas, os machos
conseguiam distinguir o status reprodutivo das mesmas. Collins & Missing (2003)
observaram que os homens se sentem atraídos não só pelo aspecto visual das mulheres,
como também pela sua voz, de acordo com as fases do ciclo menstrual.
Como já mencionado, os hormônios atuam de maneira mais acentuada
dependendo do período do ciclo hormonal em que a mulher se encontra. A gravidez é
também uma fase em que observamos muitas mudanças anatômicas e clínicas.
A laringopatia gravídica é uma condição comum, sendo causada por
alterações fisiológicas, anatômicas e psicológicas, conseqüentes às alterações
endócrinas. São semelhantes às alterações pré-menstruais. A elevação dos níveis de
progesterona circulante aumenta a fragilidade vascular, levando à hemorragia
submucosa e predispondo à retenção hídrica. A disfunção vocal é caracterizada pela
diminuição da eficiência vocal, perda das notas altas e fadiga vocal com leve disfonia.
4
Newmam et al (2000) encontraram receptores para estrógeno,
progesterona e andrógeno, no epitélio, citoplasma e núcleo de células de PPVV
humanas, assim como nos fibroblastos da lâmina própria. A quantidade destes
receptores varia de acordo com o sexo e a idade. Altman et al (2003) encontraram
receptores para hormônio tireoidiano em PPVV humanas.
As variações que observamos nas pregas vocais macroscopicamente
devido a estes hormônios refletem alterações que acontecem ao nível microscópico e
ultraestrutural. Com o desenvolvimento de métodos mais sensíveis, podemos detectar e
analisar as substâncias que participam deste fenômeno.
Alguns autores têm estudado a quantificação destas substâncias nas PPVV
humanas. Pawlak et al (1996) estudaram os glicosaminoglicanos (GAGs) e os
proteoglicanos, na lâmina própria das pregas vocais de 14 cadáveres. Foi detectado o
ácido hialurônico (AH) no citoplasma de células presentes na lâmina própria, que na
imunohistoquímica mostraram ter características de fibroblastos. Hammond et al (1997)
avaliaram 18 PPVV humanas normais, sendo dez homens e oito mulheres, com idades
entre 20 e 60 anos. Foram realizados dois cortes histológicos. Um deles foi tratado com
hialuronidase testicular, e o outro não. Com a análise computadorizada das imagens foi
possível observar que as PPVV dos homens têm maior quantidade absoluta de AH na
lâmina própria, podendo haver variações individuais que fogem a esta regra. Este fato
explicaria, segundo os autores, por que as mulheres têm maior propensão a ter nódulo
vocal, pois com uma quantidade menor de AH não teriam tanta proteção aos traumas
quanto os homens. Butler et al (2001) desenvolveram um estudo avaliando a
distribuição do AH ao longo de toda a espessura da lâmina própria e verificando
variações quanto ao sexo e idade. Os resultados obtidos representam a proporção
relativa do AH em quatro regiões diferentes da lâmina própria. Observaram que
5
mulheres apresentam relativamente menos AH na camada mais superficial da LP, mas
possuem mais AH nas camadas mais profundas, com grande variação entre indivíduos
nos resultados. Não houve diferenças estatisticamente significantes de acordo com os
grupos etários. Lebl (2004) estudou 32 PPVV humanas obtidas de necropsias de 16
cadáveres, sendo oito homens e oito mulheres sem lesão laríngea, com idade variando
entre 38 e 68 anos. As PPVV foram decorticadas e divididas em regiões anterior, média
e posterior da borda livre (denominada região superior) e regiões anterior, média e
posterior da face subglótica (denominada região inferior). O método utilizado para a
determinação do AH em fluidos biológicos foi desenvolvido pela Universidade Federal
de São Paulo - Escola Paulista de Medicina. Concluiu-se que homens e mulheres
diferem, em todas as regiões, quanto à concentração média de AH. As mulheres
apresentam média maior que os homens em todas as regiões e a concentração total é o
dobro da dos homens.
A vibração das pregas vocais depende, entre outras coisas, do tamanho e
da composição da lâmina própria (LM). Entre as substâncias que compõem a matriz
extracelular (MEC) desta região, estão os GAGs e proteínas fibrosas (Hirano, 1981).
Pequenas alterações quantitativas nas macromoléculas que formam a MEC são capazes
de determinar impactos negativos acentuados nas propriedades biomecânicas das PPVV
. O AH é um GAG e um dos principais componentes da LP. Sua influência nas
propriedades biomecânicas das PPVV foi demonstrada por Gray et al (1999) e Chan et
al (2001).
Foram realizados diversos trabalhos onde foi estudada a cicatrização das
PPVV em modelo animal, após dano causado artificialmente. Entre substâncias
analisadas, a que despertou maior interesse foi o AH, pois ficou patente sua importância
na cicatrização das PPVV (Thibeault et al, 2002; Rousseau et al, 2003; Rousseau et al,
6
2004; Thibeault et al, 2004). Seguindo a mesma linha de raciocínio, alguns autores
estudaram a possibilidade de se fazer a correção da insuficiência glótica e de cicatrizes
das PPVV utilizando o AH, em modelo animal e em humanos (Hallen et al 1998; Chan
et al 1999; Hertergard et al, 2002; Hertergard et al, 2003; Perazzo, 2005).
Tateya et al (2005) afirmaram em seu experimento, utilizando como
modelo animal o rato, que sua LP é mais parecida com a do homem, sendo este animal
mais indicado para se fazer estudos das PPVV.
O ácido hialurônico (AH) foi citado pela primeira vez na literatura
médica por Meyer & Palmer em 1934. Eles isolaram um polissacarídeo ácido com alto
peso molecular do humor vítreo de boi, que não era sulfatado. Propuseram que seu
nome fosse acido hialurônico, de “hialóide” (vítreo), mais ácido urônico. O AH é um
GAG.
Os GAGs são açúcares de cadeias longas, não ramificadas e compostas
de unidades dissacarídicas repetitivas (Figura-1). Tais compostos ocorrem em todas as
espécies de animais que possuem organização tecidual, desde esponjas até mamíferos
(Lindholm, 1997). Com exceção do queratan sulfato, as unidades dissacarídicas dos
GAGs são formadas por um monossacarídeo aminado (N-acetilglicosamina ou N-
acetilgalactosamina) que, na maioria das vezes, é sulfatado por um ácido urônico
(glicurônico e idurônico). A presença de grupamentos carboxílicos no resíduo do ácido
urônico e de uma variável quantidade de grupos sulfato por dissacarídeo faz com que os
GAGs apresentem uma alta quantidade de cargas negativas.
O ácido hialurônico (AH) apresenta três características fundamentais que
os distinguem dos demais GAGs: ele não se associa covalentemente a uma proteína
central, não é sulfatado e sua síntese ocorre por um complexo que se localiza na
membrana plasmática.
7
A unidade dissacarídica repetitiva do AH é um ácido glicurônico e uma
N-acetilglicosamina (figura-2). A cadeia do AH é flexível e extremamente longa,
chegando a 3000 unidades dissacarídicas. A presença de grupos carboxila, associadas à
extensão e flexibilidade das cadeias, fazem com que o AH forme soluções
extremamente viscosas, fundamentais à estruturação de alguns tecidos, como o humor
vítreo e o cordão umbilical, e fundamentais na migração celular, como ocorre durante o
desenvolvimento e cicatrização. O AH auxilia também muitas funções celulares, como
o controle da morfogênese e diferenciação, locomoção celular, reparo tecidual e
resposta inflamatória. Tem sido atribuído ao AH papel no processo mitótico e no
crescimento de tumores.
A síntese do AH ocorre primariamente nos fibroblastos e é realizada pela
enzima hialuron sintetaze, localizada na parede interna da membrana da célula, sendo
esta enzima também responsável pelo seu transporte para fora desta. Existem três tipos
de enzimas para a síntese: “hyaluron syntetase 1” (HAS-1), “hyaluron syntetase 2”
(HAS-2) e a “hyaluron syntetase 3” (HAS-3) . Cada uma realiza a síntese de cadeias
com pesos moleculares diferentes.
Os principais receptores do AH na superfície da célula são o “Cluster of
differentation-44” (CD44) e o “Receptor for Hyaluronan-Mediated Motility”
(RHAMM), e ambos participam da regulação dos fatores de crescimento celular. A alta
concentração de AH e altos níveis de CD44 têm sido encontrados com uma grande
relação com a gênese de tumores, levando o CD44 a ser considerado marcador tumoral
para tumores urológicos e de mama, principalmente ( Lida e Bourguignom, 1997).
8
Figura 11-Unidade dissacarídica básica dos glicosaminoglicanos.
Figura 12. Ácido Hialurônico: Estrutura molecular
Segundo Santos & Ferrazoli (2005) os períodos reprodutivos podem ser
classificados como ciclos estrais contínuos ou estacionais. O ciclo estral é o período
decorrente entre sucessivas fases de receptividade sexual, geralmente chamada de cio ou
9
estro. Os ciclos podem ser monoestrais (uma vez por ano) ou poliestrais (duas ou mais
vezes por ano). A duração dos ciclos estrais contínuos é específica da espécie: na rata,
por exemplo, é de quatro a cinco dias; na cobaia e na ovelha, é de 16 dias no máximo; e
na vaca e na porca, é de no máximo 21 dias. A ovulação se deve ao bloqueio de
estímulos atuantes sobre o hipotálamo, gerando liberação de FRH e LRH, que produzem
secreção de gonadotrofinas hipofisárias. Embora mais difícil de ser explicada, a
atividade sexual rítmica espontânea da fêmea foi cuidadosamente estudada na rata.
O ciclo estral pode ser dividido em duas fases gerais: 1) fase folicular,
correspondente ao período de crescimento e maturação dos folículos, caracterizada por
secreção estrogênica gradualmente acelerada e alteração da mucosa uterina e vaginal; 2)
fase lútea, iniciada pela ovulação do folículo e sua subseqüente transformação em corpo
amarelo.
A duração da fase lútea depende do corpo amarelo se tornar funcional ou
não, no primeiro caso secretando progesterona, com seu conseqüente efeito sobre a
mucosa uterina
vaginal. As fases da função ovariana foram divididas em estágios, que
são correlacionados com a citologia da vagina. Na rata, o esfregaço da parede vaginal
revela um padrão mutável de células e muco. No começo do estro, o esfregaço é
composto quase exclusivamente de células epiteliais cornificadas. No fim do estro,
aparece muito muco enquanto que as células cornificadas ainda são bastante visíveis.
Doze horas mais tarde, no metaestro, o esfregaço apresenta células cornificadas, muitos
leucócitos e quase nenhum muco. Na rata, o ciclo se sucede rapidamente: os corpos
amarelos não são secretores e o metaestro é curto, a não ser que se instale um processo
de gravidez ou pseudogravidez. Em animais cujos corpos amarelos são secretores, o
metaestro é prolongado. O diestro é associado a um esfregaço vaginal que contém quase
apenas leucócitos e ocasionalmente células ovais com grandes núcleos, células epiteliais
10
nucleadas. Um dia depois, o esfregaço se caracteriza por células epiteliais nucleadas
apenas - o animal está então no proestro. Diestro, proestro e estro ocorrem na fase
folicular da função ovariana, enquanto que o metaestro ocorre na fase lútea. O
conhecimento da relação entre a citologia vaginal e a função ovariana propiciou a
fisiologistas e bioquímicos um poderoso instrumento experimental.
Em primatas, o ciclo reprodutivo é o ciclo menstrual, que vai do primeiro
dia de sangramento até a véspera do início do próximo período de sangramento. Em
macacas Rhesus e mulheres, a duração dos ciclos apresenta cerca de 28 dias. A
ovulação é espontânea, ocorrendo por volta da metade do ciclo (entre o 11º e o 14º dia).
Os primatas são sexualmente receptivos ao longo de todo o ciclo; portanto, não
apresentam o estágio de estro durante o ciclo menstrual. O ciclo menstrual pode ser
também dividido em fase folicular e lútea. Durante a fase folicular, o endométrio
uterino torna-se mais espesso. Na fase lútea, caracteristicamente, as artérias em espiral
se apresentam mais tortuosas, e as glândulas do endométrio exibem maior atividade
secretora. A menstruação ocorre quando o corpo amarelo cessa a secreção de
progesterona. O sangramento das artérias espirais e a queda do endométrio persistem
durante três a cinco dias, seguindo-se novo crescimento do endométrio.
Os diversos estudos clínicos demonstram que, de alguma maneira, os
hormônios provocam alterações nas pregas vocais, as quais acabam repercutindo na
voz, provavelmente alterando as substâncias que as compõem. Foi demonstrado que o
ácido hialurônico é um dos principais componentes das PPVV. Será que a concentração
do mesmo não pode variar nos tecidos de acordo com estímulos hormonais?
11
2. OBJETIVO
12
O objetivo deste trabalho é analisar comparativamente a concentração
do ácido hialurônico nas pregas vocais de ratas, durante o ciclo estral e o ciclo
gravídico-puerperal.
13
3. REVISÃO DE LITERATURA
14
Likar & Likar (1964) realizaram estudo determinando a localização e
quantificação dos mucopolissacarídeos ácidos nas células da mama e parede uterina de
bovinos, de acordo com as fases do ciclo estral (estro, diestro, metaestro, proestro). O
estudo histoquímico para a localização de mucopolissacarídeos ácidos revelou uma série
de variações de coloração, de acordo com a fase do ciclo e da camada da parede uterina
estudada. Foi descoberta uma correlação entre quantidade de mucopolissacarídeos
ácidos e a fração de AH. Descobriu-se, também, que as células da mama e a quantidade
de hialuronato variavam em quantidade, de acordo com a fase do ciclo. O AH que
estava alto durante o estro, diminuía no diestro até o metaestro e, a seguir, tornava a
aumentar. O autor ainda faz uma discussão sobre os diversos métodos para a
determinação dos mucopolissacarídeos ácidos.
Kofoed et al (1972) afirmaram que o estrógeno e a progesterona induzem
a mudanças no conteúdo dos GAGs nos órgãos dos animais. Em seu estudo eles
isolaram e caracterizaram os GAGS em útero e glândula salivar de ratas. Os animais
foram divididos em quatro grupos: animais castrados, não castrados, castrados com uma
dose de benzoato de estradiol (1µg) e, finalmente, castrados com uma dose maior
(10µg) de benzoato de estradiol. A concentração de ácido urônico aumentava com a
castração e diminuía com a injeção de benzoato de estradiol, mas a quantidade total do
AH no útero dos animais castrados era menor que nos animais que recebiam o
estrógeno. Não houve mudança da concentração do ácido urônico nas glândulas
salivares.
Cabrol et al (1985) estudaram a distribuição dos GAGs no colo, no istmo
e no corpo do útero de mulheres grávidas e não grávidas. Os GAGs foram medidos no
cérvice uterino de mulheres grávidas (n=9) e não grávidas (n=14), no istmo de grávidas
(n=8) e não grávidas (n=6), e no corpo uterino de grávidas (n=12) e não grávidas (n=5).
15
Referiram a presença do AH e dermatam sulfato em todas as regiões estudadas, sendo
maior a concentração ao final da gestação.
Pontes et al (1989), realizaram estudo histológico e histoquímico da
mucosa nasal de 16 ratas no ciclo estral e 24 ratas no ciclo gravídico-puerperal. No ciclo
estral, os animais foram divididos em quatro grupos iguais, de acordo com a fase do
ciclo - estro, diestro, metaestro e proestro. No grupo da gravidez, os animais foram
sacrificados no 7°, 14° e 21° dia, sendo cada grupo com quatro animais. No grupo do
puerpério, os animais foram sacrificados no 7°, 14° e 21° dia, tendo cada grupo quatro
animais. O estudo histológico foi realizado com a coloração do Hematoxilina-Eosina e
com azul de alcian, com e sem a hialuronidase testicular, e com outras colorações.
Concluiu-se que a mucosa nasal sofre modificações importantes no ciclo estral, na
prenhez e no puerpério. No ciclo estral foi encontrada, no cório de toda a mucosa nasal,
uma mucopolissacáride ácida não sulfatada, provavelmente representada pelo ácido
hialurônico, que não varia durante o ciclo estral, mas que desaparece ou diminui durante
a prenhez, reaparecendo no puerpério.
Rajabi et al (1992) estudaram a concentração do AH no soro de fêmeas
de porcas da Guinea, sendo 13 prenhas, cinco não prenhas e quatro após a gestação.
Como método, realizou um ensaio radiométrico, onde utilizou uma proteína ligada ao
AH e marcada com iodo-125. Concluiu que a concentração do AH aumentava
progressivamente até o parto e, dois dias após, voltava aos níveis anteriores a ele.
Laurent et al (1995) estudaram o AH em diversos tecidos do aparelho
urogenital de ratos. Utilizaram seis animais, sendo dois machos e quatro fêmeas, duas
das quais prenhas. Foi realizado estudo semiquantitativo com imunohistoquímica e
ensaio radiométrico para ácido hialurônico. Observou-se que o AH se acumula
predominantemente no tecido conectivo ao redor da fibra do músculo liso, na região
16
subepitelial da lâmina própria, e tecido conectivo perineural e perivascular. Nas fêmeas
foi encontrada maior quantidade na vagina e na bexiga, sendo que o órgão que
apresentou maior volume de AH foi a vagina das prenhas.
Kobayashi et al (1999) estudaram a quantidade de AH em 388 amostras
de soro sanguíneo de mulheres, sendo 250 durante a gravidez, com idades variando de
20 a 37 anos, e 70 que não estavam grávidas, com idade entre 25 e 41 anos. Nenhuma
paciente fez uso de medicação durante a gravidez. Foram divididas em seis grupos: o
primeiro grupo foi o das 70 mulheres que não estavam grávidas o segundo grupo era
composto de 47 mulheres que colheram soro entre a 5
a
e a 14
a
semana de gravidez; no
terceiro grupo havia 46 mulheres entre a 1
e a 26
a
semana; no quarto grupo, estavam
58 mulheres entre a 27
a
e a 37
a
semana de gravidez; no quinto grupo encontravam-se
99 mulheres entre a 38
a
e a 40
a
semana, sem estar em trabalho de parto; e, finalmente,
o sexto grupo foi de 68 mulheres já em trabalho de parto, entre a 38
a
e a 40
a
semana.
Observou-se que a concentração do AH aumenta progressivamente no soro durante a
gravidez e, de maneira mais intensa, ao seu termo.
Cubas (2001) analisou dos GAGs no colo uterino de ratas no ciclo estral.
Foram utilizadas 40 ratas e divididas em grupos de acordo com a fase do ciclo estral em
que se encontravam. Os animais foram sacrificados, tendo sido retirados os colos
uterinos para estudo morfológico, histoquímico e imunohistoquímico. O autor detectou
relação entre o perfil dos GAGs, o pico de proliferação celular e a variação hormonal
que ocorre durante o ciclo estral. Não houve variação significativa da concentração do
AH durante o citado ciclo.
17
4. MÉTODO
18
Depois de realizado o projeto da tese, este foi enviado para o comitê de
ética, que aprovou o trabalho sob o número 1234/05.
Foram utilizadas 40 ratas (sp-wistar) adultas, com cerca de 250 gramas.
Os animais ficaram confinados em gaiolas plásticas com grade de metal e mantidos com
alimentação e água ad libitum, com temperatura e luminosidade do ambiente
controladas. Estes animais ficaram alojados no Centro de Desenvolvimento de Modelos
Experimentais para Medicina e Biologia – CEDEME, da Universidade Federal de São
Paulo - Escola Paulista de Medicina.
No primeiro grupo, utilizamos 20 ratas para determinação da
concentração do AH no ciclo estral. Estas ratas foram submetidas a exame
colpocitólogico para determinação da fase do ciclo em que se encontravam. O animal
era contido por um técnico de laboratório, introduzindo-se na vagina uma haste com
algodão embebido em solução fisiológica 0,9% (figura-3). A seguir, era feito um
esfregaço em uma lâmina (figura-4), a qual era analisada imediatamente “a fresco”, no
microscópio óptico com aumento de 40 vezes. As fases do ciclo estral foram
determinadas de acordo com a quantificação das células: epiteliais, cornificadas e
leucócitos no exame colpocitológico (Quadro 1). Quando havia dúvidas quanto a
classificação da fase do ciclo estral o animal não era incluído no subgrupo
. Os animais foram divididos em quatro subgrupos -: P-proestro, M-Metaestro, E-Estro
e D-diestro - e imediatamente sacrificados. Em cada subgrupo havia cinco animais.
19
Figura 13. Contenção da rata para a colpocitologia.
Figura 14- Realização do esfregaço
.
20
Quadro 1. Quadro de classificação do ciclo estral, segundo esfregaço vaginal (Short
& Woodnott-1969)
FASES SECREÇÃO VAGINAL
Célula
Epitelial
Célula
Epitelial
Cornificada
Leucócito Muco
I. Pró-estro
+++
+
+/-
_
II. Estro
( inicial)
_
+++
_ _
III.Estro
(tardio)
+/-
+++
+/-
_
IV.
Metaestro
+
++
++
_
V. Diestro
+
_
+++
Pouco,elásti
co
= nenhum; +/- ocasional; + = pouco; ++ = moderado; +++ = muito
Figura 15 - Esfregaço das fases do ciclo estral: A-estro; B-diestro; C- proestro;
D- metaestro. Células (setas) c- célula cornificada; lc-leucócito; e-célula epitelial.
21
No segundo grupo, também de 20 animais, foi realizado o mesmo
experimento no ciclo gravídico-puerperal. Os animais foram divididos em subgrupos de
cinco animais e sacrificados no 7°, 14° e 21° dia de prenhez e no 14° dia de puerpério.
Os animais foram acasalados à noite e, na manhã seguinte foi realizados o diagnóstico
de prenhez, com o encontro de espermatozóides na vagina das ratas (Hamilton & Wolfe,
1938), e quando foram sacrificadas foi realizado a laparotomia para a verificação da
presença de fetos no útero .
Aos animais foram atribuídas letras seguidas de números em algarismos
romanos, de acordo com os subgrupos em que se encontravam.
Em todos os subgrupos de cinco animais, quatro deles foram utilizados
para o estudo da concentração do AH e um foi usado para os procedimentos
histológicos. Como as PPVV eram pequenas tivemos que utilizar as duas para os
procedimentos bioquímicos.
Quadro 2. Divisão numérica dos grupos de animais e subgrupos, e sua utilização.
GRUPOS Subgrupos
N° de animais
para a
bioquímica do
AH.
N° de animais
para os
procedimentos
histológicos
total
ESTRO.
4 1
5
DIESTRO
4 1
5
METAESTRO
4 1
5
CICLO
ESTRAL
PROESTRO
4 1
5
7° DIA DE
PRENHEZ
4 1
5
14° DIA DE
PRENHEZ
4 1
5
21° DIA DE
PRENHEZ
4 1
5
CICLO
GRAVÍDICO-
PERPERAL
14° DIA DE
PUERPÉRIO
4 1
5
total 32 8 40
22
Os animais foram sacrificados usando cloridrato de tiazina (rompun®) e
ketamina, com injeção intraperitoneal, em dose letal.
Após o sacrifício dos animais foi realizada a retirada de suas pregas vocais, com
microscópio cirúrgico (DF Vasconcelos) na sala de dissecção da disciplina de
Otorrinolaringologia. Os aumentos utilizados no microscópio dependiam da fase da
dissecção. O animal foi colocado em decúbito dorsal, e não foi necessário tricotomia. A
incisão foi realizada com bisturi lâmina 15 no plano sagital mediano, na altura do osso
hióide até o inicio da região abdominal (figura-6). Após, foi dissecada a musculatura
pré-tiróidea, individualizada a traquéia e separada do esôfago (Figura-7). Em seguida
dissecamos a região da cartilagem tireóidea. Retiramos a peça, com limite inferior na
altura do segundo ou terceiro anel traqueal e superior na altura do osso hióideo. A
seguir, a peça foi “limpa” de modo que só ficamos com a laringe (figura-8), a qual foi
colocada na posição anatômica e feita incisão mediana posterior em toda a superfície.
Ficamos então com duas hemilaringes (figura-9). Localizamos as pregas vocais e
realizamos incisão superior e inferior na PV (Figura-10), com bisturi delicado, para
fazer a retirada das PPVV, com o cuidado de não incluirmos as cartilagens aritenóideas
nesta peça (figura-10).
.
Figura 16. Incisão cérvico-torácica
23
Figura 17. Dissecção da traquéia
Figura 18. Detalhe da laringe da rata
.
24
Figura 19. Detalhe da incisão posterior na laringe
Figura 20. Incisão para a ressecção da prega vocal. A seta
mostra a cartilagem aritenóidea.
25
Preparo da amostra para estudo bioquímico.
As pregas vocais de cada animal foram trituradas e colocadas em
acetona, para remoção dos resíduos lipídicos. A acetona foi evaporada após período de
1 hora em estufa a 50° C e foi obtido o "pó cetônico", que foi pesado. Ao pó cetônico
foi adicionado maxatase (protease alcalina; Biocon do Brasil Industrial Ltda –RJ,
Brasil) na dosagem de 4 mg/ml em tampão Tris-HCL 0,05M em pH-8,0, acrescido de
NaCl 1 M (100 µl de enzima para cada 100 mg de pó seco). A mistura foi incubada a
60° C por 24 horas e, após este período, a maxatase foi inativada por aquecimento a
100° C, durante 20 minutos. Após resfriamento, as amostras foram centrifugadas e o
AH foi dosado no sobrenadante.
Figura 11. Esquema do preparo da amostra para estudo bioquímico
Análise da concentração do ácido hialurônico
O método utilizado foi desenvolvido no Departamento de Biologia
Molecular da Universidade de São Paulo - Escola Paulista de Medicina (figura-11) e
PREGAS VOCAIS TRITURADAS
+
ACETONA
Pó cetônico
Estufa 50° C - 1h
Solução com
maxatase
MAXATASE 60° C
24 hs
ÀCIDO HIALURÔNICO
DOSADO NO
SOBRENADANTE
100° C 20 min
CENTRIFUGADA
26
trata-se de um método fluorimétrico para a determinação do AH em fluidos biológicos,
utilizando “sondas” de ligação do AH. A sonda é isolada de cartilagem nasal bovina e é
constituída da região globular do agregam (um proteoglicano formado por um esqueleto
protéico ao qual se ligam cadeias de queratam sulfato e condroitim sulfato) e da proteína
de ligação do AH. A sonda é usada tanto imobilizada em placas de ELISA, à
semelhança de um anticorpo de captura, como sonda biotinilada, funcionando nesse
último caso como anticorpo secundário marcado.
Determinação da concentração do AH por método fluorométrico.
À placa de ELISA com sonda adsorvida foram adicionados 100 µl/poço
de soluções de AH padrão em várias concentrações (0 a 500 µg/l), diluídas no tampão
de ensaio Tris-HCL 0,05 M, pH 7,75 e BSA 1% (albumina bovina sérica), além das
soluções das amostras obtidas dos tecidos diluídas no mesmo tampão de ensaio (1:100),
em triplicatas. Foi realizada a incubação a 4° C por 12 horas, sendo a placa então lavada
com tampão de lavagem (Tris-HCL 0,05 M , Ph 7,75) por três vezes. Em seguida foram
adicionadas 100 µl da sonda (1mg/ml) 1:10000 em tampão de ensaio. A placa foi
agitada por 2 horas e em seguida lavada nove vezes com tampão de lavagem. Após esta
operação, foram adicionados à placa 100 µl/poço de estreptavidina marcada com
európio diluído 1:10000 em tampão de ensaio. A estreptavidina tem afinidade pela
biotina conjugada à sonda. A placa foi agitada por meia hora e a seguir lavou-se com
tampão de lavagem nove vezes. Por fim, com o objetivo de soltar o európio ligado à
estreptavadina, adicionou-se uma solução de “enhancement”, 280µl/poço, agitou-se
cinco minutos e o európio livre na placa foi lido em um fluorímetro. O resultado foi
obtido em ng/ml.
27
Proteína de ligação do
ácido hialurônico
Àcido hialurônico
Biotina conjugada com
a proteína de ligação
Európio ligado a
estreptavidina
Európio livre
Figura 12. Representação esquemática do ensaio fluorimétrico do AH. Placas de
ELISA foram revestidas com a proteína de ligação do AH (PLAH) e sucessivamente
incubadas com amostras desconhecidas, PLAH conjugada com biotina e estreptavidina
marcada com európio. Após a liberação do európio com solução “enhancement” a
fluorescência final é medida em um fluorímetro (Martins, 2002).
Preparo do material para cortes histológicos
No preparo do material para os procedimentos histológicos, a laringe foi
mergulhada em uma solução de formaldeído 10% para a fixação. Após 24 horas, as
28
peças foram desidratadas em concentrações crescentes de álcool etílico, diafanizadas
pelo xilol e impregnadas em parafina líquida.
Os cortes na laringe foram coronais, tendo sido feitos três cortes de 4 µm
seqüenciais na região membranácea média. . Foram distribuídos em lâminas, colocados
em estufa a 60° C, por 45 minutos, e depois mantidos em estufa regulada à temperatura
de 37° C, por 24 horas, para secagem.
A desparafinação dos cortes foi feita mediante três incubações sucessivas
com xilol, por 10 minutos cada. Posteriormente, os cortes foram hidratados com dois
banhos de 10 minutos em etanol absoluto e um banho de 10 minutos em etanol 70%.
Em seguida, as lâminas foram mergulhadas em água destilada por 10 minutos.
Um corte foi submetido à coloração de hematoxilina-eosina (HE), outro à
coloração com azul de alcian e o terceiro corte submetido a tratamento com
hialuronidase de Streptomyces hyalurolyticus (Sigma Cheminal Co. –St Louis,
MO,USA), sendo posteriormente também corado pela técnica do azul de alcian.
Para o tratamento com a hialuronidase, a lâmina foi lavada com PBS
duas vezes, por cinco minutos, depois com acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 (tampão da
enzima hialuronidase) duas vezes, por cinco minutos. Incubamos com hialuronidase 500
unidades/ml em acetato de sódio 0,1 M pH 5,0 ON. Lavamos com PBS duas vezes
durante cinco minutos e, finalmente, coramos com a técnica do azul de alcian pH 2,5.
Determinação do AH por titulação eletrônica
O processo de Titulação eletrônica foi realizado no Laboratório de
Informática Dedicado a Odontologia (LIDO) do Departamento de Estomatologia da
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo (FO-USP).
29
As lâminas com cortes corados com azul de alcian tiveram as imagens
digitalizadas por câmera digital (Sony Hyper HAD SSC-DC14), acoplada a microscópio
óptico (Laboval 4, Carl Zeiss), utilizando-se aumento de 40 vezes. Para titulação
eletrônica da PV foram incluídos no campo o epitélio, lâmina própria e o músculo das
pregas vocais. Foram coletadas as informações de um campo por lâmina e enviadas ao
computador, via placa de vídeo (VID Cap), onde foram analisadas pelo software
Imagelab 2000® (desenvolvido no LIDO). (Novelli et al, 1997)
O Software Imagelab 2000® (versão atualizada do programa DIRACOM
3) permite, por processo de decomposição da cada “pixel” nas cores elementares RGB
(R= vermelho; G= verde; B= azul), identificar estruturas a partir de um espectro de cor
selecionado, escolhido dentre 126 tons para cada uma das cores elementares. Após a
definição do espectro de cores, que seleciona somente as estruturas de coloração azul
(positividade para glicosaminoglicanos), o programa apresenta os valores da
concentração (em porcentagem) da cor selecionada em relação ao campo total (fig-12).
Figura 13. Tela de trabalho software Imagelab 2000.
30
Estatística
Os resultados dos subgrupos foram submetidos ao teste de análise de
variância (ANOVA). O teste de ANOVA é indicado quando se quer comparar três ou
mais grupos de informações com nível de mensuração numérica. As amostras são
independentes e/ou pareadas e deseja-se saber se em médias os grupos são diferentes.
Pode-se testar mais de um efeito com um único modelo.
31
5. RESULTADOS
32
Concentração do Ácido Hialurônico
Os valores das dosagens das concentrações do AH, obtidos por meio do
método fluorimétrico, pertencentes aos vários subgrupos estão expressos na tabela 1 e
na tabela 2.
TABELA 1. Dados sobre a amostra no ciclo estral: peso, quantidade e concentração do
ácido hialurônico. Subgrupos: E-estro, D-diestro, M-metaestro, P-proestro.
Subgrupos
peso
(g)
AH (ng)
na
amostra
AH
µg/g tec
E-I
E-II
0,0114
0,0124
971,152
1015,980
85,2
81,9
E-III 0,0122
1657,432
135,9
E-IV 0,0118
940,968
79,7
95,7 média
23,3 DP
D-I 0,0123
1176,448
95,6
D-II 0,0136
1622,096
119,3
DIII 0,0136
1319,360
97,0
DIV 0,0127
1138,928
89,7
100,4 média
11,2 DP
M-I 0,0118
915,068
77,5
M-II 0,0125
851,284
68,1
M-III 0,0126
1094,464
86,9
M-IV 0,0122
1329,916
109,0
85,4 média
15,2 DP
P-I 0,0124
1644,272
132,6
P-II 0,0131
1515,276
115,7
P-III 0,0129
1217,804
94,4
P-IV 0,0138
1359,708
98,5
110,3 média
15,1 DP
33
TABELA 2. Dados sobre a amostra no ciclo gravídico-puerperal: peso, quantidade e
concentração do ácido hialurônico. Subgrupos: 7° - sétimo dia, 14° - décimo quarto dia,
21 - vigésimo primeiro dia, P- décimo quarto dia de puerpério.
AH
(ng/mL)
AH
Sub
Grupos
peso
(g)
Na
amostra
µg/g tec
7-I 0,0125
1181,236
94,5
7-II 0,0133
949,284
71,4
7-III 0,0134
955,304
71,3
7-IV 0,0136
1397,704
102,8
85,0 média
14,0 DP
14-I 0,0124
1571,612
126,7
14-II 0,0126
956,732
75,9
14-III 0,0127
1209,824
95,3
14-IV 0,0123
490,532
39,9
84,5 média
31,5 DP
21-I 0,0115
759,78
66,1
21-II 0,0124
953,484
76,9
21-III 0,0129
1138,088
88,2
21-IV 0,0121
917,028
75,8
76,7 média
7,9 DP
P-1 0,0040
1036,992
259,2
P-2 0,0038
1022,508
269,1
P-3 0,0052
783,132
150,6
P-4 0,0046
1479,612
321,7
250,1 média
62,2 DP
34
TABELA 3. Comparativo entre subgrupos no grupo estral, segundo a medida AH µ/g
tecido seco.
ESTRO DIESTRO METAESTRO PROESTRO
Média 95,68 100,40 85,38 110,30
Desvio-padrão 26,88 12,97 17,52 17,49
N 4 4 4 4
ANOVA (p) = 0,372 Não significante. Não houve diferença entre os subgrupos quanto à
medida avaliada.
TABELA 4. Comparativo entre subgrupos no grupo gravídico-puerperal no 7°, 14°, 21°
e 14° dia de puerpério (P), segundo a medida AH µ/g tecido seco.
7º DIA 14° DIA 21° DIA P
Média 84,98 84,45 76,74 250,15*
Desvio-padrão 16,12 36,35 9,07 71,80
N 4 4 4 4
ANOVA (p) < 0,001 *Significante. Por comparações múltiplas,temos que o grupo P
teve respostas maiores que os demais grupos.
35
TABELA 5. Comparativo total entre subgrupos no grupo estral (E, D, M e P) e
subgrupos no grupo prenhez (7, 14, 21 e P), segundo a medida AH µ/g tecido seco.
ESTRAL PRENHEZ
E D M P 7 14 21 P
Média 95,68
100,40
85,38
110,30
84,98
84,45
76,74
250,1*
Desvio-padrão 26,88
12,97
17,52
17,49
16,12
36,35
9,07
71,80
N 4 4 4 4
4 4 4 4
ANOVA (p) < 0,001 * Significante. Por comparações múltiplas temos que o grupo
prenhez P teve respostas maiores que os demais grupos.
Resultado da histologia
Figura 14. Corte da prega vocal de rata corada com HE no puerpério, onde E é o
epitélio, LP-lâmina própria e M-músculo.
36
No corte das pregas vocais de ratas coradas com HE, observamos na
borda livre a presença de epitélio pavimentoso estratificado não queratinizado,
constituído por cerca de três ou quatro camadas. A LP abaixo do epitélio apresenta em
algumas regiões duas camadas e, em outras, chega a três camadas. Logo abaixo
podemos observar o músculo tireoaritenóideo
Figura 15. Corte da prega vocal da fase puerpério corada com azul de alcian.
E-epitélio, C-cartilagem aritenóide, LP-lâmina própria e M-músculo.
Nos cortes da prega vocal de ratas coradas com azul de alcian, podemos
observar uma coloração azul mais intensa no epitélio, lâmina própria, glândulas e
principalmente na cartilagem, indicando a presença de GAGs nestas estruturas.
37
Tabela 6. Os resultados apresentados pela análise quantitativa das concentrações de
GAGs, no corte com coloração azul de alcian e corte tratado com hialuronidase
específica para o AH.
Cortes histológicos
Azul de
alcian
em %
Azul de alcian
com
hialuronidase
em %
DIFERENÇA
CICLO
ESTRAL
ESTRO
DIESTRO
METAESTRO
PROESTRO
15,6
20,9
21,0
19,8
9,2
16,7
18,0
18,9
6,4
4,2
3,0
0,9
7° DIA 13,1 12,2 0,9
14° DIA 19,2 11,7 7,5
21° DIA 18,9 9,2 9,7
CICLO
GRAVÍDICO
PUERPERAL
14° PUER. 16,5 11,5 5,0
38
5. DISCUSSÃO
39
Há uma grande dificuldade em se pesquisar, dos pontos de vista
histológico e bioquímico, a PV de cadáveres femininos em relação à fase hormonal,
uma vez que geralmente em seus prontuários não constam dados do ciclo menstrual e
medicações usadas.
Coelhos e cães já foram utilizados em experimentos com PPVV
(Rousseau et al, 2003; Rousseau et al, 2004), mas, segundo Tateya et al (2005), o rato é
um modelo melhor, pois a LP das suas PPVV tem características semelhantes às
humanas: pode ser dividida em camadas, sendo que a profunda contém mais fibras
colágenas que a superficial. Além disso, no rato, dispomos de extensa informação
genética e, como ele tem um ciclo de vida curto, possibilita que diversos ciclos sejam
investigados. Devido ao seu tamanho e fertilidade, é um modelo economicamente mais
viável. A porção cartilagíinea da laringe é cerca de cinco vezes maior no rato que no
humano, fato que pode ser apontado como uma desvantagem neste modelo.
Quando determinamos o intervalo de tempo para o sacrifício dos animais
no ciclo gravídico-puerperal, escolhemos a cada sete dias, pois, como a gestação da rata
dura cerca de 21 dias, estamos dividindo este período em três fases iguais. Escolhemos
o 14° dia de puerpério para o sacrifício, uma vez que é neste dia que começaria o
desmame, e a rata voltaria a ter os mesmos estímulos que no ciclo estral.
Nos cortes histológicos realizados com a coloração de HE, foi observado
que a estrutura das PPVV de ratos é semelhante à dos humanos: com epitélio
pavimentoso estratificado não queratinizado com algumas camadas (3 ou 4), a LP com 2
camadas e, mais profundamente, o músculo, os vasos e os nervos. Foi encontrada
cartilagem aritenóide em quase toda a extensão da PV, o que confirma os achados de
Tateya et al (2005).
40
Tivemos muita dificuldade na utilização do software Imagelab 2000, para
estabelecer um espectro de cores em que a medida fosse realizada, porque as variações
de cores eram todas em azul. O tamanho do campo também foi fator limitante, pois a LP
da rata é muito pequena. Assim, ficava difícil ocupar um campo inteiro para as medidas,
mesmo nos maiores aumentos, e a cartilagem não podia fazer parte dessas medidas.
Quando realizamos a quantificação do AH através do programa Imagelab 2000,
esperávamos confirmar os achados do método fluorimétrico, observando um aumento
ou diminuição da coloração, mas, devido às dificuldades já mencionadas, os resultados
não puderam ser comparados.
Os métodos utilizados para a pesquisa do AH em outros trabalhos são
indiretos, como demonstram Pontes et al (1989), Hammond et al (1997) e Butler et al
(2003), nos quais são utilizados reagentes para os GAGs e proteínas, sendo que, depois,
é usada hialuronidase testicular, para se diferenciar onde havia presença do AH por
comparação ou subtração. Ocorre que esta hialuronidase não é especifica para o AH,
podendo degradar também o condroitin sulfato. Portanto, nesses trabalhos, pode-se estar
incluindo outras substâncias além do AH.
O método empregado para a detecção da concentração do ácido
hialurônico foi desenvolvido na Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de
Medicina, no Departamento de Biologia Molecular, e é um dos mais sensíveis descritos
na Literatura. É utilizada uma hialuronidase específica para o AH e, no método
fluorimétrico, é usada uma proteína de ligação ao AH, isolada de cartilagem bovina que
reconhece especificamente o AH.
Likar & Likar (1964), em seu estudo em células de mama e parede uterina
de bovinos, encontrou um aumento dos mucopolissacarídeos e, junto com estes, a fração
de hialuronato, de acordo com a fase do ciclo estral. Durante a fase chamada de
41
folicular (diestro, proestro e estro), houve aumento do estrógeno e aumento gradativo da
quantidade de hialuronato, que após a ovulação (fase lútea) volta a diminuir. Pontes et al
(1989) e Cubas (2001) realizaram trabalhos nos quais eram feitas as quantificações do
AH na mucosa nasal e colo uterino de ratas, respectivamente, sendo que ambos
observaram não haver variação da quantidade de AH nestes tecidos durante o ciclo
estral. Na pesquisa de Likar & Likar (1964), o modelo animal era diferente e a técnica
para a quantificação do AH também. Provavelmente estes fatores culminaram com
resultados divergentes em relação aos nossos.
Em nosso trabalho não observamos variação significativa da
concentração do AH nas pregas vocais de ratas durante o ciclo estral. Este resultado
confirma os achados de Pontes et al (1989) e Cubas (2001) que, em suas pesquisas,
utilizaram o mesmo modelo animal, mas em tecidos diferentes, a técnica por nós
utilizada para a determinação do AH foi a mesma do segundo autor.
Kofoed et al (1972) demonstraram que a variação do conteúdo do AH no
útero de ratas sofre a influência dos hormônios. O estrógeno faria diminuir a
concentração do AH, portanto, era de se esperar que a concentração do mesmo variasse
durante o ciclo estral, uma vez que o estrógeno tem seu pico durante a fase folicular e
torna a diminuir logo após a ovulação. Acontece, entretanto, que o autor não realizou
seu experimento com a variação fisiológica dos hormônios, tendo castrado e
administrado doses diferentes de benzoato de estradiol, e, talvez por esta razão, tenha
encontrado uma variação mais evidente nos seus resultados.
Pontes et al (1989) observaram na sua amostra a existência de um
mucopolissacarídeo ácido não sulfatado, possivelmente o AH, que diminuía com a
evolução da gravidez. Nos trabalhos de Cabrol et al (1985) e Laurent et al (1995), os
tecidos estudados, provenientes de órgãos urogenitais de animais no período
42
gestacional, são alvos mais sensíveis à ação dos hormônios, pois com a evolução da
gestação temos uma diminuição do estrógeno e, como demonstrou Kofoed et al (1972),
isto causaria o aumento da quantidade de AH. Rajabi et al (1992) e Kobayashi et al
(1999) estudaram o AH no soro de porcas da Guinea e em mulheres, respectivamente,
encontrando um aumento do AH com a evolução da prenhez. É provável que isto ocorra
por aumento na mobilização do AH nos tecidos.
Na nossa amostra não notamos variação na concentração de AH durante
a prenhez. Era de se esperar que houvesse, pois Newman et al (2000) demonstraram que
a PV apresenta receptores para os hormônios gonadotróficos. Para explicar estes dados,
podemos supor que os hormônios teriam uma ação diferente nos tecidos de órgãos
urogenitais, que participam de maneira mais ativa do processo gestacional, aumentando
a concentração do AH e mobilizando o AH através do sangue, enquanto nos outros
tecidos sua ação seria menos evidente.
Pontes et al (1989) observaram que no puerpério o mucopolissacarídeo
ácido não sulfatado reaparecia. Em nosso trabalho, encontramos um aumento
significativo da concentração do AH neste período. Era de se esperar que, após o parto,
com a volta dos hormônios aos níveis normais, o AH também voltasse a níveis
observados anteriormente. Segundo Rajabi (1992), os níveis do AH no soro de porcas
da Guinea voltam ao normal dois dias após o parto. Verificamos que mesmo
comparando com o período do ciclo estral, isto é, fora da gestação, a concentração do
AH estava significativamente aumentada no puerpério, o que nos leva a crer que,
provavelmente com a amamentação, outras substâncias passam a agir e podem causar
mudanças na dinâmica do AH.
Talvez nossa amostra fosse pequena e, para podermos detectar
variações mais substanciais, tivéssemos que usar uma amostra maior. Por outro lado, no
43
nosso experimento, o método realizado é um dos mais sensíveis para a análise da
concentração do AH.
Nosso estudo demonstrou que a concentração do AH pode variar nas
pregas vocais e que, provavelmente, este fenômeno sofre a ação de muitos fatores. A
importância desta substância na função fonatória nos inspira a aprofundar as pesquisas
nesta área, para uma possível correlação clínica no futuro.
44
CONCLUSÕES
45
Da análise da concentração de ácido hialurônico nas pregas vocais de
ratas no ciclo estral e gravídico-puerperal, podemos concluir que:
1. Não há variação da concentração do ácido hialurônico durante ciclo estral.
2. No puerpério há um aumento da concentração do ácido hialurônico
3. Comparando-se todos os subgrupos do ciclo estral e ciclo gravídico-puerperal,
só no puerpério há aumento da concentração do ácido hialurônico.
46
7. REFERÊNCIAS
47
Abitbol J, Abitbol P, Abitbol B. Sex hormones and Female voice. J Voice 1999;13(3):
424-46.
Altman KW, Haines III GK, Vacalanka SK, Keni SP, Koop PA, Radosevich JA.
Identification of Thyroid Hormone Receptors in the Human Larynx. Laryngoscope
2003;113(11):1931-4.
Butler JE, Hammond TH, Gray SD. Gender-related differences of hyaluronic acid
distribution in the humam vocal fold. Laryngoscope 2001;111(5):907-11
De Biase N, Silva MC . Estudo da frequência fundamental da voz em mulheres jovens
com síndrome pré-menstrual. Dist. Com. 2000;11(2):301-11.
Cabrol D, Dallot E, Cedard L, Sureau C. Pregnancy-related changes in the distribution
of glycosaminoglycans in the cervix and corpus of the human uterus. Europ J Obstet
Gynec reprod Biol 1985;20:289-95.
Chan RW, Titze RI. Hyaluronic Acid (With Fibronectin) As a Biopimplant for the
Vocal Fold Mucosa. Laryngoscope 1999;109(8):1142-9.
Chan RW, Gray SD, Titze RI. The Importance of hyaluronic acid in vocal fold
biomechanics. Otol Laringol Head Neck Surg 2001;124(6):607-14.
Collins S A, Missing C . Vocal and Visual attractiveness are related in women. Anim
Behav 2003;65:997-1004
Cubas JMC. Análise histomorfológica e caracterização dos glicosaminoglicanos no colo
uterino de ratas durante o ciclo estral. [Tese] São Paulo:Universidade Federal de São
Paulo; 2002.
Figueiredo LC, Gonçalves MIR, Pontes A, Pontes P. Estudo do comportamento vocal
no ciclo menstrual: avaliação perceptivo-auditiva, acústica e auto-perceptiva. Rev Bras
Otol 2004 ;70(3):331-9.
Gray SD, Titze IR, ChaR, Hammond TH. Vocal Fold Proteoglycans And Their
Influence on Biomechanics. Laryngoscope 1999;109(6):845-54.
Grene RJ, Dalton K .The Premenstrual Syndrome. Brit Med J 1953;1: 4118-25.
Hallén L, Dahqvist A, Laurent C. Dextranomeres in Hyaluronan (DiHA): A promising
Substance in Treating Vocal Cord Insufficiency 1998;108(3):393-7.
Hamilton JB, Wolf JM. The effect of male hormone substances upon birth and prenatal
development in the rat. Anat Rec1938;70:433-39.
Hammond TH, Zhou R, Hammond EH, Pawlak A, Gray SD.The intermediate layer: a
morphologic Study of the elastin and hyaluronic acid constituents of normal human
vocal fold. J Voice 1997;11(1):59-66.
48
Hertergård S, Hallén L, Laurent C, Lindström E, Olafsson K, Dahlqvist A. Cross-
Linked Hyaluron Used as Augmentation Substance for treatment of Glottal Insfficience:
Safety Aspects and Vocal fold Function. Laryngoscope 2002;112(12):2211-9.
Hertergård S, Dahlqvist A, Laurent C, Borzacchiello A, Ambrosio L. Viscoelastic
properties of rabbit vocal folds after augmentation. Otolaryngol Head Neck Surg
2003;128(3):401-6.
Hirano M Structure of the vocal fold in normal and disease states- anatomical and
physical studies.In: Ludlow CL, Hard MO, eds. Proceedings of the conference on the
assessment of vocal pathology. Rockville, MD: American Speech Language-Hearing
Association; 1981. p.11-30.
Kobayashi H, Sun GW, Tanaka Y, Kondo T, Terao T. Serum hyaluronic acid levels
during pregnancy and labor. Obstet Gynecol 1999;93(4):480-4.
Kofoed A J, Houssay AB, Tocci AA, Curbelo HM. Efects of oestrogens upon
glycosaminoglicans in the uterus of rats.Acta Endocr 1972;69:87-94.
Laurent C, Hellström , Engström-Laurent A, Wells AF, Bergh A. Localization and
quantity of hialuronan in urogenital organs of male and female rats. Cell Tissue Res
1995:279:241-48.
Lebl MDA. Estudo da concentração e disposição do ácido hialurônico em pregas vocais
humanas. Tese de mestrado- Unifesp-EPM 2004:38 pgs.
Lida N, Bourguignon LYW. Coexpression Variant (v10/ex14) and CD in Human
Mammary Epithelial Cells Promotes Tumorogenesis. J Cell Physio 1997;171:152-60.
Likar IN, Likar JL. Acid mucopolyssacarides and mast cells in the bovine uterus at
different stages of the sexual cycle.Acta Endocr 1964;46:493-506.
Lindholm P, Vilkman E, Skoski TR, Luukkonen ES, Kauppila S. The Effect os
postmenopausal HRT on measured voice values and vocal symptoms Mat J Clim &
Postm 1997;28:47-53.
Martins JRM. O papel do glicosaminoglicanos na definição da atividade inflamatória da
oftalmopatia de Graves. [Tese]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo;2002.
Meyer K, Palmer JW. The Polysaccharide of Vitreous Humor. J Biol Chem 1934;
107:629-34.
Newman RS, Butler J, Hammond EH, Gray S . Preliminary Report on Hormone
Recptors in Human Vocal Fold. J Voice 2000;14(1):72-81.
Novelli MD, Barreto E, Matos D, Saad SS, Borra RC. Aplicação do processamento de
imagens para computador na quantificação das variáveis histopatológicas na reparação
tecidual de anastomose coloclica em cães. Rev Ass Méd Bra-s 1997;43:277-82
49
Pawlak AS, Hammond TH, Hammond E, Gray SD. Immunocytochemical study of
proteogycans in vocal folds. Ann Otol Rhinol Laryngol 1996;105:6-11.
Perazzo PSL. Estudo do comportamento histológico da prega vocal do coelho após a
injeção do Ácido Hialurônico.[Tese] São Paulo: Faculdade de Ciências Médicas da
Santa Casa de São Paulo; 2005.
Pontes PAL, Simões MJ, Merzel J . Histoquimic detection of glicoproteins and
glycosaminoglycans on respiratory mucose of albine mouses duringestral cicle and
pregnant. Rev Bras Biol 1989; 49:1125-9
Rajabi RM, Quillen EW, Nuwayhid BS, Brandt R, Poole AR. Circulating hyaluronic
acid in nonpregnant, pregnant, and postpartum guinea pigs: Elevated levels observed at
parturition. Am J Obst Gynecol 1992;166:242-6.
Rousseau B, Hirano S, Scheidt TD, Welham NV,Thibeault S, Chan RW, Bless DM.
Charaterization of Vocal Fold Scarring in a Canine Model. Laryngoscope
2003;113(4):620-7.
Rousseau B, Hirano S, Chan RW, Welham NV,Thibeault S, Ford CN, Bless DM.
Charaterization of Chronic Vocal Fold Scarring in a Rabbit Model. J Voice
2004;18(1):116-24.
Santos AV, Ferrazzoli MO. Ciclo estral nos animais. Portal veterinário: Artigos
científicos. 2001[consultado em 2005]: 6 pgs. Disponível em: http//
www.redevet.com.br/artigos/estral1.htm .
Short DJ, Woodnott DP. The IAT Manual of Laboratory Animal Pratice and
Thecniques In: Mamaliam Reproduction. Rowlands W. CR Austin pgs 340-49
Satalof RT, Emerich KA, Hoover CA. Endocrine dysfunction In: Satalof RT 1997.
Professional voice : the science and art of clinical care 2 ed San Diego, Singular
Publishing Group 291-7.
Semple S, McComb K. Perception of female reproductive state from vocal cues in
mammal species. Proc R Soc Lond Biol Sci 2000;267:707-12.
Tateya T, Sohn JH, Tateya I, Bless DM. Histologic Characterization of Rat Fold
Scarring. Ann Otol Rhinol Laryngol 2005;114:183-92.
Thibeault S, Gray SD, Bless DM, Chan RW, Ford CN. Histologic and Rheologic
Characterization of Vocal Fold Scarring. J Voice 2002;16(1):96-104.
Thibeault S, Rousseau B, Welham NV, Hirano S, Bless DM. Hyaluronan Levels in
Acute Vocal Scar. Laryngoscope 2004;114(5):760-4.
Vasconcelos AM, Silva MAA, Ferreira LP, Silva FLC. Percepções vocais relacionadas
às alterações vocais nas mulheres. Dist Com. 2001;12(2):195-222
50
8. ANEXOS
51
Anexo 1. Dados sobre a amostra no ciclo estral: quantidade do ácido hialurônico diluído
1:100, volume da solução e concentração do ácido hialurônico na solução.
Sub
grupos
Diluído 1:100
AH ng/mL)
vol. Ress (µL)
AH (ng/mL)
na solução
E-1
E-II
34,684
36,285
280
280
3468,4
3628,5
E-III 59,194 280 5919,4
E-IV 33,606 280 3360,6
D-I 42,016 280 4201,6
D-II 57,932 280 5793,2
DIII 47,12 280 4712
DIV 40,676 280 4067,6
M-I 32,681 280 3268,1
M-II 30,403 280 3040,3
M-III 39,088 280 3908,8
M-IV 47,497 280 4749,7
P-I 58,724 280 5872,4
P-II 54,117 280 5411,7
P-III 43,493 280 4349,3
P-IV 48,561 280 4856,1
52
Anexo 2. Dados sobre a amostra no ciclo gravídico-puerperal: quantidade do ácido
hialurônico diluído 1:100, volume da solução e concentração do ácido hialurônico na
solução.
Diluído 1:100
AH (ng/mL)
Sub
Grupos
AH ng/mL)
vol. Res (µL)
na solução
7-I 42,187 280 4218,7
7-II 33,903 280 3390,3
7-III 34,118 280 3411,8
7-IV 49,918 280 4991,8
14-I 56,129 280 5612,9
14-II 34,169 280 3416,9
14-III 43,208 280 4320,8
14-IV 17,519 280 1751,9
21-I 27,135 280 2713,5
21-II 34,053 280 3405,3
21-III 40,646 280 4064,6
21-IV 32,751 280 3275,1
P-1 86,416 120 8641,6
P-2 85,209 120 8520,9
P-3 65,261 120 6526,1
P-4 123,301 120 12330,1
53
Anexo 3. Gráfico comparativo entre subgrupos no grupo estral, segundo a
medida AH µ/g tecido seco.
0
20
40
60
80
100
120
140
E
D
M
P
AH
µ/g
tec
Intervalo de confiança para a média: média ± 1,96 * desvio-padrão / √ (n-1)
Anexo 4. Gráfico comparativo entre subgrupos no grupo ciclo gravídico-
puerperal, 7°, 14°, 21° e 14° dia de puerpério (P), segundo a medida AH µ/g
tecido seco.
0
50
100
150
200
250
300
350
7
14
21
P
A
H
µ/
g
Intervalo de confiança para a média: média ± 1,96 * desvio-padrão / √ (n-1)
54
Anexo 5. Gráfico comparativo total entre subgrupos no grupo estral (E, D, M e P) e
subgrupos no grupo prenhez (7, 14, 21 e P), segundo a medida AH µ/g tecido seco.
0
50
100
150
200
250
300
350
E
D
M
P
7
14
21
P
Estral
Prenhez
z
A
H
µ/
g
Intervalo de confiança para a média: média ± 1,96 * desvio-padrão /
√
(n-1).
55
9. ABSTRACT
56
Hormones play an important role in the larynx. Voice variations are common in the
clinical practice and may reflect alterations in the vocal folds at the macroscopic and
ultrastructural levels. The vocal fold is composed of a number of substances that
provideits viscoelastic properties nestly the hialuronic acid. The concentration of
hyaluronic acid in the tissues may vary according to hormone action.
OBJECTIVE
:
the objective of this study is to analyze the concentration of hyaluronic acid in the vocal
folds during estral and gravidic-puerperal cycles.
METHOD
: 40 adult female rats were
divided into two groups: Group I- 20 adult female rats were to determine concentration
of hyaluronic acid during the estral cycle, and group II , 20 animals were submitted to
the same procedure but during the gravidic-puerperal cycle. The two groups were
divided into sub-groups according to the rats phase of the cycle and according to
gestacional phase. In the sub-groups of five animals, four were used to analyze the HA
concentration and one was used for histological procedures. The method used was
developed in the Department of Molecular Biology of the Federal University of São
Paulo University –
Escola Paulista de Medicina.
It is a fluorometric method that
determines HA in biologic fluids, using a probe to bind HA. Histological sections were
submitted to alcian blue/ hematoxylin-eosin staining method with and without
hyaluronidase treatment.
RESULTS
: Variation in the concentration of hyaluronic acid
was not observed during the estral cycle. In the gravidic puerperal cycle group, an
increase in the hyaluronic acid concentration was observed only in the puerperal
subgroup. No difference could be observed in the comparison between the two groups
of estral and gravidic-puerperal cycles,
CONCLUSIONS
: When comparing all
subgroups of the estral and gravidic-puerperal cycles, an increase in the hyaluronic acid
concentration could be seen only in the puerperal phase.
57
10. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
58
Collins Prático. Dicionário Inglês-Português. 2
a
edição. São Paulo: Harper Collins;
1985. Editora Siciliano; p. 367.
Ganança MM, Pontes PAL. METODOLOGIA CIENTÍFICA: normatização para
redação de teses. São Paulo: UNIFESP-EPM, Programa de pós-graduação em
Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço; 2005. 44f.
Novo Dicionário Aurélio da Língua Portuguesa, 2
a
edição. Rio de Janeiro: Aurélio
Buarque de Holanda Ferreira; 1986. Editora Nova Fronteira; p.1838.
Marwel DL, Satake E, Research and Statistical Methods in Communication Disorders.
Baltimore US: Willians & Wilkins; 1997.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
