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MAUREN ISFER ANGHEBEM OLIVEIRA
ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS XbaI E EcoRI
DO GENE DA APOLIPOPROTEÍNA B COM A
DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA
E DIABETES MELLITUS TIPO 2
CURITIBA
2005
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MAUREN ISFER ANGHEBEM OLIVEIRA
ASSOCIAÇÃO DOS POLIMORFISMOS XbaI E EcoRI DO GENE
DA APOLIPOPROTEÍNA B COM A DOENÇA ARTERIAL
CORONARIANA E DIABETES MELLITUS TIPO 2
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas, Curso de Pós-
Graduação em Ciências Farmacêuticas, Setor
de Ciências da Saúde, Universidade Federal
do Paraná.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Marileia Scartezini.
Co-orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi
de Souza.
CURITIBA
2005
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iii
A você MARINA, minha filha linda,
que tem sido o impulso principal
de muitas das minhas realizações.
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, que tudo concede àqueles que seguem Seu maior desejo
e ensinamento: AMAR aquilo que se faz, principalmente a vida.
,
Agradeço à minha família e amigos, pelo apoio, estímulo e
compreensão nas muitas horas de ausência.
Agradeço aos meus orientadores, pelo “mostrar o caminho”.
Agradecimentos especiais à Prof.ª Dr.ª Marileia Scartezini, pela orientação, por ter
viabilizado este trabalho, pela dedicação, e, principalmente, pelo vínculo de amizade
formado durante estes dois anos.
Ao Prof. Geraldo Picheth, pelo incentivo em iniciar este mestrado. Agradeço por seu
apoio e competência, e aproveito para externar minha admiração.
Ao Prof. Dr. Emanuel Maltempi de Souza, pela prontidão e conselhos na co-orientação
deste trabalho.
À Prof.ª Dr.ª Eleidi Chautard Freire Maia e ao Prof. Dr. Ricardo Lehtonen Rodrigues
de Souza, do Departamento de Genética da UFPR, pela colaboração com as análises
estatísticas.
À Caroline Luise Prochaska, pelo companheirismo, dedicação, e, principalmente, pela
amizade. Aos demais colegas do mestrado, por todo o apoio.
Agradeço à minha querida amiga, Dr.ª Elsie Helena Martins Capp, pela amizade, apoio
e carinho. E pelas conversas divertidas que aliviaram momentos de cansaço.
v
Ao meu chefe, Ten. Cel. Braga, pelo apoio e amizade, e pelas dispensas do trabalho
concedidas para a realização deste mestrado.
Ao meu colega e amigo, Célio Luiz Banaszeski, pelo suporte, incentivo e
colaboração durante toda nossa convivência profissional.
Aos demais colegas e amigos do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital
da Polícia Militar do Paraná, pelo apoio.
À uma pessoa muito especial, Alessandro José Polli Oliveira, com quem dividi
minha vida, conquistas e derrotas. Agradeço pelo amor incondicional, pela
compreensão e apoio.
À minha avó, Nilse Sbaraini, por ter dedicado sua vida e seu amor na minha
formação pessoal e profissional.
À minha mãe, que, com dedicação e amor, ensinou suas filhas a lutar pelos seus
objetivos, mas sempre apoiando-se nos alicerces do bom caráter.
Aos meus pais, irmãos, tios e primos, que me ajudaram, apoiaram e sempre
estiveram presentes em todas as conquistas da minha vida.
A todos aqueles que contribuíram para a realização deste trabalho.
vi
“Cada um que passa em nossa vida, passa
sozinho, pois cada pessoa é única, e
nenhuma substitui a outra.
Cada um que passa em nossa vida passa
sozinho, mas não vai só, nem nos deixa
sós: leva um pouco de nós mesmos, deixa
um pouco de si mesmo.
Há os que levam muito, mas não há os que
não levam nada; há os que deixam muito,
mas não há os que não deixam nada.
Esta é a maior responsabilidade da nossa
vida e a prova evidente de que duas
pessoas não se encontram ao acaso”.
Antonie Saint Exupéry
vii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... x
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... xii
RESUMO ......................................................................................................................... xiii
ABSTRACT ..................................................................................................................... xiv
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 1
2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 2
2.1 OBJETIVO PRINCIPAL ............................................................................................ 2
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..................................................................................... 2
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................... 3
3.1 APOLIPOPROTEÍNA B E SUAS VARIAÇÕES GENÉTICAS ............................... 3
3.1.1 Polimorfismo XbaI do gene da apolipoproteína B ................................................... 5
3.1.2 Polimorfismo EcoRI do gene da apolipoproteína B ................................................. 8
3.2 DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA E DIABETES MELLITUS ..................... 10
4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 14
4.1 VARIÁVEIS ESTUDADAS ....................................................................................... 15
4.1.1 Variáveis Antropométricas ....................................................................................... 15
4.1.2 Parâmetros Bioquímicos ........................................................................................... 15
4.2 REAGENTES .............................................................................................................. 16
4.3 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA ......................................................... 16
4.4 AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DOS EXONS 26 E 29 DO GENE DA
APO B PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)..........................
18
viii
4.5 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO
XbaI DO EXON 26 DO GENE DA APO B HUMANA ...........................................
20
4.6 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO
EcoRI DO EXON 29 DO GENE DA APO B HUMANA..........................................
21
4.7 IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA RESTRIÇÃO COM XbaI E EcoRI .. 21
4.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .....................................................................................
23
5 RESULTADOS ............................................................................................................. 24
5.1 DADOS ANTROPOMÉTRICOS E BIOQUÍMICOS ................................................ 25
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE DA APO B ....................................... 27
5.3 ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE HAPLÓTIPOS E GENÓTIPOS DO GENE
DA APO B E DAC NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DM2 .............................
34
6 DISCUSSÃO .................................................................................................................
37
6.1 VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS ........................................ 37
6.2 VARIABILIDADE GENÉTICA ................................................................................. 40
7 CONCLUSÕES ............................................................................................................ 46
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 47
ANEXOS
.......................................................................................................................... 56
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
apo B
apolipoproteína B
AV
Amplitude de Variação
DAC
Doença Arterial Coronariana
DAC +
Presença de Doença Arterial Coronariana comprovada por coronarioangiografia
DAC –
Ausência de Doença Arterial Coronariana comprovada por coronarioangiografia
DM
Diabetes mellitus
DM2 –
Ausência de Diabetes Mellitus tipo 2
DM2 +
Presença de Diabetes Mellitus tipo 2
DP
Desvio Padrão
EDTA
Ácido Etilenodiaminotetracético
GL
Grau de Liberdade
HbA
1C
Hemoglobina Glicada A
1C
HDL-C
HDL-Colesterol
IMC
Índice de Massa Corporal
LDL
Lipoproteína LDL
LDL-C
LDL-Colesterol
M
Média
PCR
Reação em cadeia da polimerase
RFLP
Polimorfismo de Comprimento de Fragmentos de Restrição; Restriction Fragment
Length Polymorphism
SNP
Polimorfismo de Nucleotídeo Único; Single Nucleotide Polymorphism
TBE
Tampão Tris-Borato-EDTA
x
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
FREQUÊNCIAS (%) DOS ALELOS X+ E X− DO POLIMORFISMO
XbaI DO GENE DA APO B, EM CAUCASIANOS, ORIENTAIS E
AFRICANOS, NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DAC .........................
7
TABELA 2
FREQUÊNCIAS (%) DOS ALELOS E+ E E− DO POLIMORFISMO
EcoRI DO GENE DA APO B, EM CAUCASIANOS, ORIENTAIS E
AFRICANOS, NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DAC .........................
9
TABELA 3 CLASSIFICAÇÃO DOS GRUPOS ...............................................................
15
TABELA 4 MARCADORES BIOQUÍMICOS .................................................................
16
TABELA 5 CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DOS EXONS
26 E 29 DO GENE DA APO B HUMANA....................................................
19
TABELA 6 PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS
FRAGMENTOS DOS EXONS 26 E 29 DO GENE DA APO B HUMANA
20
TABELA 7 CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO
EXON 26 DO GENE DA APO B COM A ENZIMA XbaI ..........................
20
TABELA 8 CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO
EXON 29 DO GENE DA APO B COM A ENZIMA EcoRI .......................
21
TABELA 9 DISTRIBUIÇÃO DE FREQUÊNCIAS POR SEXO E FATORES DE
RISCO PARA DAC NOS GRUPOS ESTUDADOS......................................
24
TABELA 10 VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS DOS GRUPOS:
DM2−DAC−, DM2−DAC+ E DM2+DAC+, COM MÉDIA (M) ± DESVIO
PADRÃO (DP) E AMPLITUDE DE VARIAÇÃO (AV) DAS
VARIÁVEIS ANALISADAS ........................................................................
26
TABELA 11 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS POLIMORFISMOS
XbaI E EcoRI DO GENE DA APO B NOS GRUPOS DM2−DAC−(N=70),
DM2−DAC+(N=70) E DM2+DAC+(N=70) E NA AMOSTRA (N=210) ....
32
TABELA 12 FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS POLIMORFISMOS
XbaI E EcoRI DO GENE DA APO B NOS GRUPOS DAC− (N=70) E
DAC+ (N=140) ...............................................................................................
33
TABELA 13 DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIA (%) DOS GENÓTIPOS DO GENE
DA APO B (XbaI/EcoRI) NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=70),
DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+ (N=70).................................................
34
xi
TABELA 14 FREQÜÊNCIAS ABSOLUTAS E RELATIVAS DOS DIFERENTES
HAPLÓTIPOS DO GENE DA APO B (XbaI/EcoRI) NOS GRUPOS
DM2−DAC− (N=70), DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+ (N=70).............
35
TABELA 15 DISTRIBUIÇÃO DAS FREQÜENCIAS (%) DOS GENÓTIPOS
X−X−/E+E+ E DEMAIS GENÓTIPOS XbaI/EcoRI DO GENE DA APO B
NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=70), DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+
(N=70)..............................................................................................................
36
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Representação da apolipoproteína B-100 na lipoproteína de densidade
baixa .................................................................................................................
3
Figura 2
Representação esquemática do mapa do gene da apo B .............................
4
Figura 3
Processo de extração do DNA de sangue total .............................................
17
Figura 4 Representação esquemática do fragmento do exon 26 amplificado e
localização do polimorfismo XbaI do gene da apo B humana ....................
22
Figura 5 Representação esquemática do fragmento do exon 29 amplificado e
localização do polimorfismo EcoRI do gene da apo B humana ................
22
Figura 6
Distribuição de freqüência de idade ..............................................................
25
Figura 7 Perfil eletroforético da PCR para amplificação do polimorfismo XbaI do
exon 26 do gene da apo B ...............................................................................
28
Figura 8 Perfil eletroforético da PCR para amplificação do polimorfismo EcoRI
do exon 29 do gene da apo B ..........................................................................
29
Figura 9 Perfil eletroforético típico da PCR-RFLP do polimorfismo XbaI do exon
26 do gene da apo B ........................................................................................
30
Figura 10 Perfil eletroforético típico da PCR-RFLP do polimorfismo EcoRI do
exon 29 do gene da apo B ...............................................................................
31
xiii
RESUMO
A apolipoproteína B (apo B) é a única proteína da lipoproteína de baixa densidade
(LDL) e está envolvida no transporte e metabolismo do colesterol. Polimorfismos de
único nucleotídeo (SNPs) do gene da apo B humana têm sido associados ao risco para
a Doença Arterial Coronariana (DAC). Uma amostra de 210 indivíduos submetidos à
cineangiocoronariografia, foi classificada em 3 grupos iguais (N=70) caracterizados
como DM2−DAC− (grupo controle), DM2−DAC+ (presença de DAC e ausência de
Diabetes mellitus tipo 2) e DM2+DAC+ (presença de DAC e Diabetes mellitus tipo 2).
A DAC foi definida como a presença de estenose maior que 50% em qualquer artéria
coronária, e o diagnóstico do DM2 foi estabelecido pelos critérios da Associação
Americana de Diabetes. A proporção homens/mulheres nos grupos foi: 33/37
(DM2−DAC−), 52/18 (DM2−DAC+) e 43/27 (DM2+DAC+). A idade média foi de 62
± 10 anos nos três grupos. Foram analisadas as variáveis idade, sexo, tabagismo,
pressão arterial sistólica e diastólica, índice de massa corporal, presença de hipertensão
e história familiar para DAC, bem como as concentrações séricas do perfil lipídico
(colesterol total, HDL-C, LDL-C e triglicérides), apolipoproteína A1 e B, glicemia e
hemoglobina glicada. O grupo DM2+DAC+ apresentou concentrações séricas de
triglicérides com médias superiores às do grupo controle (P<0,001), e concentrações
séricas de HDL-C com médias inferiores às do grupo controle (P=0,001). Os
polimorfismos XbaI (exon 26) e EcoRI (exon 29) do gene da apo B foram
caracterizados por PCR-RFLP, sendo os fragmentos de DNA, após a restrição,
identificados por eletroforese em agarose e corados com brometo de etídeo. As
freqüências genotípicas encontradas para o polimorfismo XbaI foram 0,171, 0,458 e
0,371 para o grupo DM2−DAC−; 0,214, 0,479 e 0,307 para o grupo DM2−DAC+; e
0,171, 0,386 e 0,443 para o grupo DM2+DAC+, respectivamente, para os genótipos
X+X+, X+X− e X−X−. As freqüências genotípicas encontradas para o polimorfismo
EcoRI foram 0,728, 0,229 e 0,043 para o grupo DM2−DAC−; 0,657, 0,314 e 0,029
para o grupo DM2−DAC+; e 0,700, 0,257 e 0,043 para o grupo DM2+DAC+,
respectivamente, para os genótipos E+E+, E+E− e E−E−. Não houve diferença
significativa entre as freqüências alélicas dos polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da
apo B (P=0,8331 e P=0,5828, respectivamente; Teste Exato de Fisher bidirecional)
quando comparados os 3 grupos em estudo; nem entre as freqüências genotípicas
(P=0,9439 e P=0,6701, respectivamente; Teste Exato de Fisher bidirecional). A
freqüência do genótipo X−X−/E+E+ do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B
comparada à dos demais genótipos, mostrou diferença significativa (χ
2
(1)
=6,43;
P=0,0112) entre os grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+, sendo mais freqüente neste
último, validando o uso deste genótipo como marcador adicional de risco em estudos
populacionais, para a DAC na presença de DM2.
Palavras-chave: Doença Arterial Coronariana, DAC, Diabetes mellitus tipo 2, apolipoproteína
B, apo B, apo B-100, polimorfismo de único nucleotídeo, SNP, Polimorfismo
de Comprimento de Fragmento de Restrição, RFLP, XbaI, EcoRI.
xiv
ABSTRACT
Apolipoprotein B (apo B) is the only protein of the low density lipoprotein (LDL) and
it is involved with the transportation and metabolism of the cholesterol. Single
nucleotide polymorphisms (SNPs) of the human apo B gene have been associated to
risk of Coronary Artery Disease (CAD). 210 individuals submitted to
cinecoronarography exam were divided in three groups (N=70) characterized as
DM2−CAD− group (control group), DM2−CAD+ group (individuals with CAD and
without type 2 Diabetes mellitus) and DM2+CAD+ group (individuals with CAD and
type 2 Diabetes mellitus). CAD was defined as the presence of stenosis higher than
50% in any coronary artery, and the diagnostic of type 2 Diabetes mellitus (DM2) was
established by the American Diabetes Association criteria. The ratio men/women in
the groups were 33/37 (DM2−CAD−), 52/18 (DM2−CAD+) and 43/27
(DM2+CAD+). The median age was 62 ± 10 years for the three groups. The variables
analyzed were age, sex, tobacco, systolic and diastolic arterial pressure, body mass
index, hypertension, and family history for CAD. The plasmatic concentrations of the
lipid profile (total cholesterol, HDL-C, LDL-C and triglycerides), apolipoprotein A1
and B, glycemia and glycated hemoglobin were also analyzed. The DM2+CAD+
group showed higher averages of plasmatic concentrations of and triglycerides
(P<0.001) and lower averages of plasmatic concentrations HDL-C (P=0.001) when
compared with control group. The XbaI (exon 26) and EcoRI (exon 29)
polymorphisms of the apo B gene were characterized by PCR-RFLP, and the DNA
fragments were identified by electrophoresis in agarose and stained by ethidium
bromide after the enzyme restriction. The genotypic frequencies found for the XbaI
polymorphism were 0.171, 0.458 and 0.371 for the DM2−CAD− group; 0.214, 0.479
and 0.307 for the DM2−CAD+ group; and 0.171, 0.386 and 0.443 for the
DM2+CAD+ group, respectively for the X+X+, X+X− and X−X− genotypes. The
genotypic frequencies found for the EcoRI polymorphism were 0.728, 0.229 and 0.043
for the DM2−CAD− group; 0.657, 0.314 and 0.029 for the DM2−CAD+ group; and
0.700, 0.257 and 0.043 for the DM2+CAD+ group, respectively for the E+E+, E+E−
and E−E−. There was no significant difference between the allelic frequencies of the
XbaI and EcoRI polymorphisms of the apo B gene when the 3 groups were compared
(P=0,8331 e P=0,5828, respectively, two-tailed Fischer's Exact Test); and neither
difference between the genotypic frequencies (P=0,9439 e P=0,6701, respectively,
two-tailed Fischer's Exact Test). The frequency of the X−X−/E+E+ genotype of the
XbaI/EcoRI polymorphism of the apo B gene when compared to the other genotypes,
showed significant difference (χ
2
(1)
= 6.43; P=0.0112) between the DM2−CAD+ and
DM2+CAD+ groups (more often in the DM2+CAD+ group) validating the use of this
genotype as an additional marker of risk for CAD with the presence of DM2 in
populational studies.
Key-words: Coronary Artery Disease, CAD, Type 2 Diabetes mellitus, apolipoprotein B, apo
B, apo B-100, Single Nucleotide Polymorphism, SNP, Restriction Fragment
Length Polymorphism, RFLP, XbaI, EcoRI.
1 INTRODUÇÃO
Variações no gene da apolipoproteína B (apo B) têm sido associadas com a Doença
Arterial Coronariana (DAC). A aterosclerose, processo básico da DAC, consiste no
espessamento e endurecimento de artérias de médio e grande calibre pela formação da
placa aterosclerótica. Manifestações agudas são geralmente causadas por
desestabilização da placa aterosclerótica com redução significativa e abrupta da luz do
vaso em razão da formação local de trombo, podendo levar à oclusão parcial (angina)
ou total (infarto agudo do miocárdio).
As lipoproteínas plasmáticas estão relacionadas com o processo aterosclerótico. A
apo B é uma glicoproteína anfipática que desempenha um papel central no
metabolismo lipoprotéico humano, em particular no transporte de colesterol no sangue.
Concentrações plasmáticas aumentadas de apo B constituem um importante fator de
risco para o desenvolvimento de aterosclerose e doenças coronarianas (TAHRI-
DAIZADEH et al., 2004). Variações no gene da apo B vem sendo estudadas na
tentativa de associar esses polimorfismos com a etiologia da DAC ou suas
complicações (DELGHANDI et al., 1999; WHITFIELD et al., 2004).
A capacidade de diagnosticar e prevenir prematuramente a DAC continua limitada,
apesar dos avanços científicos. O histórico familiar ainda é uma ferramenta adequada e
eficaz de triagem para identificar pacientes com predisposição genética. O risco para
desenvolvimento de DAC pode ser indicado pela variabilidade do DNA nos genes
candidatos, cujos produtos encontram-se envolvidos com o metabolismo lipídico,
estrutura e função das apolipoproteínas, aterogênese e trombogênese (LUSIS, 1986;
CHAER et al., 2004). O estudo da associação entre doenças e variações polimórficas
de genes é empregado para demonstrar o papel de fatores genéticos na etiologia de
doenças multifatoriais.
O Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) está associado como um fator de alto risco
para a DAC. O fato de que muitos indivíduos com DAC possuem DM2, torna
importante a identificação de genes independentes que conferem susceptibilidade para
DAC nesses pacientes.
2
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO PRINCIPAL
Verificar a associação dos polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da
apolipoproteína B com a DAC e DM2, em uma população brasileira.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Associar as variáveis antropométricas e bioquímicas, em indivíduos com
DAC na presença ou ausência de DM2, comparando com um grupo controle.
Determinar as freqüências alélicas, haplotípicas e genotípicas dos
polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apolipoproteína B, correlacionando-
as com a DAC, na presença ou ausência de DM2.
Determinar as freqüências do genótipo X−X−/E+E+ do polimorfismo
XbaI/EcoRI do gene da apolipoproteína B, e compará-lo com os demais
genótipos XbaI/EcoRI, nos grupos estudados.
Verificar a possível associação entre o genótipo X−X−/E+E+ do
polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B e a DAC, na presença ou
ausência de DM2.
3
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 APOLIPOPROTEÍNA B E SUAS VARIAÇÕES GENÉTICAS
A apolipoproteína B é uma glicoproteína constituída por 4536 aminoácidos,
com peso molecular de aproximadamente 540 kDa. A apo B pode ser encontrada em
duas formas: apo B-48 e apo B-100. A apo B-100 é a único constituinte protéico da
lipoproteína de baixa densidade, a LDL. A natureza anfipática da apo B faz com que
as regiões hidrofóbicas estejam imersas no núcleo da LDL e, as hidrofílicas, expostas
na superfície da molécula (SEGREST et al., 2001). Esta apolipoproteína possui cinco
domínios estruturais, sendo o quarto domínio (aminoácidos 3070-4100) o responsável
pela interação da apo B com os receptores da LDL (BROWN e GOLDSTEIN, 1979) e
pela manutenção da integridade desta partícula (YANG et al., 1986). Estes processos
modulam a remoção de LDL do plasma e regulam a biossíntese do colesterol. A apo
B-100 está ilustrada na Figura 1.
FONTE: Adaptado de SEGREST et al., 2001.
Figura 1 – Representação da apolipoproteína B-100 na lipoproteína de densidade baixa.
4
O gene da apo B se localiza no braço curto do cromossomo 2 (2p24) e contém
29 exons e 28 introns. A clonagem e o sequenciamento do gene da apo B ( KNOTT et
al., 1986) tornou possível o estudo de suas variações no DNA humano.
A apo B-48 é codificada pelo mesmo gene que codifica a apo B-100, resultado
de um mecanismo de edição do RNA mensageiro. Ocorre a troca da base nucleotídica
citosina pela uracila, modificando o códon CAA, que codifica o aminoácido glutamina
(posição 2153), para um códon de terminação UAA (CHEN et al., 1987).
Várias mutações polimórficas no gene da apo B já foram estudadas. Dentre os
sítios polimórficos já descritos, destacam-se XbaI (exon 26), EcoRI (exon 29), Ins/Del
(exon 1 – peptídeo sinalizador), MspI (exon 26) e região hipervariável na extremidade
3’ (VNTR). A Figura 2 representa o mapa do gene da apo B, ressaltando os sítios
polimórficos relacionados às enzimas XbaI e EcoRI.
FONTE: Adaptado de CHIODINI et al., 2003.
Figura 2 - Representação esquemática do mapa do gene da apo B.
Os 29 exons do
gene da apo B estão representados pelas barras verdes sobre a linha superior. No exon 26 está
localizado o polimorfismo XbaI, e a troca da citosina pela timina não altera o aminoácido
codificado (treonina). No exon 29 está localizado o polimorfismo EcoRI, e a substituição da
guanina pela adenina resulta na troca do ácido glutâmico pela lisina.
5
3.1.1 Polimorfismo XbaI do gene da apolipoproteína B
O polimorfismo XbaI do gene da apo B refere-se a uma troca de um nucleotídeo
no exon 26, a qual resulta em uma mutação silenciosa, que não afeta a seqüência de
aminoácidos da apo B. Ocorre a troca de um nucleotídeo citosina por uma timina na
terceira posição do códon 2488 (ACC→ACT), que codifica para o mesmo aminoácido
treonina. A presença de timina resulta em um sítio de restrição para a enzima XbaI,
originando o alelo X+, e sua ausência, o alelo X−. Essa variação determina três
genótipos X+X+, X+X− e X−X−. O fragmento de 710 pares de bases (pb), gerado pelo
método mais amplamente utilizado, que amplifica parte do exon 26, contendo o sítio
de mutação, é clivado pela enzima XbaI durante a restrição enzimática em dois
fragmentos de 433 e 277 pb no alelo X+, e não é clivado no alelo X− (RENGES et al.,
1992).
A Tabela 1 resume as freqüências dos alelos X+ e X− determinadas em vários
estudos, com caucasianos, orientais e africanos.
Vários pesquisadores investigaram associações entre as variações XbaI do gene
da apo B e a DAC, encontrando resultados discordantes. BOHN e BERG (1994)
mostraram que de 12 estudos com polimorfismo do gene da apo B, 5 deles mostraram
associação estatisticamente significativa entre o alelo X− e/ou o genótipo X−X− com
DAC, quando o grupo DAC+ foi comparado com o respectivo controle.
Na população italiana estudada por BARONI et al. (2003), o polimorfismo
XbaI do gene da apo B foi independentemente associado com DAC. O alelo X+ foi
associado com altas concentrações de Colesterol total, LDL-C, Apo B e Triglicérides,
e o genótipo X+X+ foi relacionado com o aumento do risco para infarto do miocárdio.
Dois estudos de meta-análises sobre polimorfismos do gene da apo B e DAC
ressaltaram as divergências entre os diversos trabalhos existentes (CHIODINI et al.,
2003; BOEKHOLDT et al., 2003).
CHIODINI et al. (2003) verificaram aumento no risco para DAC em
homozigotos X− apenas quando todos os estudos foram analisados em conjunto.
BOEKHOLDT et al. (2003) concluíram que o genótipo X+X+ estava correlacionado
6
com concentrações médias de LDL-C e Apo B aumentadas, mas não com aumento de
risco para DAC.
Ao comparar brasileiros hipercolesterolêmicos com indivíduos
normocolesterolêmicos, CAVALLI et al. (2000) não encontraram diferenças
significativas nas freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo XbaI do gene da
apo B. SALAZAR et al. (2000) encontraram maior freqüência do genótipo X−X− em
mulheres com DAC quando comparadas com mulheres sem DAC. Os dados de
MACHADO et al. (2001) não mostraram diferença significativa nas freqüências
alélicas e genotípicas do polimorfismo XbaI de caucasianos brasileiros com problemas
cardiovasculares, quando comparados com controles normais. SCARTEZINI et al.
(2003) também não verificaram diferenças significativas entre as freqüências alélicas e
genotípicas do polimorfismo XbaI do gene da apo B ao estudarem brasileiros com e
sem DAC.
DUNNING et al. (1993) reportaram que a determinação de haplótipos no gene
da apo B com múltiplos marcadores possivelmente ajudaria a definir mais
especificamente os genótipos associados com DAC.
O sítio de ligação da apo B com o receptor da lipoproteína LDL localiza-se
entre os resíduos de aminoácido 3147 e 3381 (KNOTT et al., 1986; YANG et al.,
1986). Nesta região gênica estão os sítios polimórficos para as enzimas XbaI e EcoRI.
MYANT et al. (1989) sugeriram associação entre DAC e esses marcadores tomados
em conjunto em algumas populações, refletindo o desequilíbrio de ligação entre esses
sítios e uma mutação na seqüência de reconhecimento do receptor, que afetaria o
metabolismo da lipoproteína LDL.
SCARTEZINI et al. (2003) consideraram o genótipo X−X−/E+E+ como
marcador genético de DAC independente de fatores de risco como o Sexo, Idade,
Tabagismo, Hipertensão, Colesterol total e Triglicérides. Concluíram que este
genótipo pode estar em desequilíbrio de ligação com uma variação desconhecida no
gene da apo B ou em outro gene relacionado à DAC.
7
TABELA 1 – FREQÜÊNCIAS DOS ALELOS X+ E X− DO POLIMORFISMO XbaI DO
GENE DA APO B, EM CAUCASIANOS, ORIENTAIS E AFRICANOS, NA
PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DAC
Grupo étnico (País) Apo B XbaI
CAUCASIANOS X +
X −
Grupo
Referência
Brasil 0,386 0,614 DAC +
0,462 0,538
DAC −
SCARTEZINI et al., 2003.
Brasil 0,470 0,530 DAC +
0,380 0,620
DAC −
MACHADO et al., 2001.
Brasil 0,340 0,660 DAC +
0,610 0,390
DAC −
SALAZAR et al., 2000.
Brasil 0,414 0,586 DAC +
0,382 0,618
DAC −
DE PÁDUA MANSUR et al., 2000.
Estados Unidos 0,500 0,500 DAC +
0,529 0,471
DAC −
GENEST et al., 1990.
Europa 0,465 0,535 DAC +
0,454 0,546
DAC −
TURNER et al., 1995.
Finlândia 0,387 0,613 DAC +
0,457 0,543
DAC −
NIEMINEN et al., 1992.
França 0,431 0,569 DAC +
0,470 0,530
DAC −
RÉGIS-BAILLY et al., 1996.
Inglaterra 0,460 0,540 DAC +
0,530 0,470
DAC −
MYANT et al., 1989.
Itália 0,311 0,689 DAC +
0,403 0,597
DAC −
CORBO et al., 1997.
ORIENTAIS
China 0,088 0,912 DAC +
0,025 0,975
DAC −
YE et al., 1995.
China 0,010 0,990 DAC +
0,010 0,990
DAC −
PAN et al., 1995
China 0,076 0,924 DAC +
0,091 0,909
DAC −
SAHA et al., 1992
Coréia 0,060 0,940 DAC +
0,050 0,950
DAC −
HONG et al., 2001.
Índia 0,285 0,715 DAC +
0,225 0,775
DAC −
PURI et al., 2003.
Índia 0,200 0,800 DAC +
(descendentes) 0,290 0,710
DAC −
RENGES et al., 1991.
Japão 0,020 0,980 DAC +
0,040 0,960
DAC −
ABURATANI et al., 1988.
AFRICANOS
Senegal 0,210 0,790
DAC −
CHAUFFERT et al., 1997.
Etiópia 0,268 0,732
DAC −
CORBO et al., 1999.
Benin 0,133 0,867
DAC −
CORBO et al., 1999.
8
3.1.2 Polimorfismo EcoRI do gene da apolipoproteína B
O polimorfismo EcoRI do gene da apo B refere-se a uma troca da base guanina
por adenina (GAA→AAA) no exon 29 (PRIESTLEY et al., 1985), resultando na troca
do ácido glutâmico pela lisina. A presença do sítio de clivagem para a EcoRI do
polimorfismo revela o alelo E+. Quando ocorre a mutação, a enzima EcoRI perde o
sítio de restrição, originando o alelo E−. Essa variação determina três genótipos:
E+E+, E+E− e E−E−. O fragmento de 480 pares de bases (pb), obtido da amplificação
parcial do exon 29, é clivado durante a restrição enzimática em dois fragmentos, de
253 e 227 pb no alelo E+, e não é clivado no alelo E−.
A Tabela 2 resume as freqüências dos alelos E+ e E− determinadas em vários
estudos, com caucasianos, orientais e africanos.
HUMPHRIES (1988) relata que o significado funcional do polimorfismo EcoRI
ainda é desconhecido. A alta freqüência do alelo E− em pacientes com DAC,
observando alguns estudos, sugere que a mudança de aminoácido possa alterar o
metabolismo de lipoproteínas que contêm apo B, ou resultar em uma apo B mais
aterogênica. Alternativamente, é possível que essa variação esteja em desequilíbrio de
ligação com outra mutação dentro do gene da apo B ou em genes vizinhos (MYANT
et al, 1989; DELGHANDI et al., 1999).
STEPANOV et al. (1998) verificaram que indivíduos portadores do alelo raro
E− tiveram concentrações de triglicérides superiores às dos homozigotos para E+
(P<0,05). Já DELGHANDI et al. (1999) não observaram nenhuma associação
significativa entre os alelos e genótipos detectados com EcoRI e as concentrações de
lípides e risco para aterosclerose.
MISRA et al. (2001) estudaram a população asiática do norte da Índia e não
encontraram diferença significativa nas freqüências alélicas e genotípicas do
polimorfismo EcoRI entre os grupos hiperlipêmicos e normolipêmicos.
Os resultados de estudos brasileiros associando o polimorfismo EcoRI do gene
da apo B com fenótipos clínicos foram relatados por FORTI et al. (2003). SALAZAR
e colaboradores (2000) não observaram diferenças significativas entre mulheres com e
9
sem DAC em relação à freqüência dos genótipos para o polimorfismo EcoRI.
Resultados semelhantes foram obtidos por BYDLOWSKI et al. (1996) e DE PÁDUA
MANSUR et al. (2000).
O estudo realizado por SAKUMA et al. (2004) relata que o polimorfismo
EcoRI do gene da apo B está associado com variações no LDL-Colesterol (LDL-C)
em Afro-brasileiros.
TABELA 2 – FREQÜÊNCIAS DOS ALELOS E+ E E− DO POLIMORFISMO EcoRI DO
GENE DA APO B, EM CAUCASIANOS, ORIENTAIS E AFRICANOS, NA
PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DAC
Grupo étnico (País)
Apo B EcoRI
CAUCASIANOS E +
E −
Grupo Referência
Brasil 0,793 0,207 DAC +
0,782 0,218
DAC −
SCARTEZINI et al., 2003.
Brasil 0,806 0,194 DAC +
0,850 0,150
DAC −
MACHADO et al., 2001.
Brasil 0,700 0,300 DAC +
0,750 0,250
DAC −
SALAZAR et al., 2000.
Estados Unidos 0,730 0,270 DAC +
0,793 0,207
DAC −
GENEST et al., 1990.
Inglaterra 0,790 0,210 DAC +
0,850 0,150
DAC −
MYANT et al., 1989.
Itália 0,745 0,255 DAC +
0,778 0,222
DAC −
CORBO et al., 1997.
ORIENTAIS
China 0,890 0,110 DAC +
0,960 0,040
DAC −
YE et al., 1995.
China 0,960 0,040 DAC +
0,950 0,050
DAC −
PAN et al., 1995.
China 0,917 0,083 DAC +
0,929 0,071
DAC −
SAHA et al., 1992.
Coréia 0,950 0,050 DAC +
0,980 0,020
DAC −
HONG et al., 2001.
Índia 0,950 0,050 DAC +
0,820 0,180
DAC −
PURI et al., 2003.
Índia 0,890 0,110 DAC +
(descendentes) 0,890 0,110
DAC −
RENGES et al., 1991.
AFRICANOS
Senegal 0,890 0,110
DAC −
CHAUFFERT et al., 1997.
Etiópia 0,958 0,042
DAC −
CORBO et al., 1999.
Benin 0,818 0,182
DAC −
CORBO et al., 1999.
10
3.2 DOENÇA ARTERIAL CORONARIANA E DIABETES MELLITUS
As doenças cardiovasculares são a primeira causa de morte por doença no
Brasil (Ministério da Saúde – Brasil, 2005) e em vários países do mundo (WHO –
Organização Mundial da Saúde, 2004), e são determinadas por fatores tanto
ambientais quanto genéticos (BERNARD et al, 2004), e respondem pela principal
causa de morbidade e mortalidade em indivíduos com DM2 (TEMELKOVA-
KURKTSCHIEV e HANEFELD, 2004).
Dentre as doenças cardiovasculares, a DAC, representada pelo infarto agudo do
miocárdio (IAM) e angina, destaca-se como a maior causadora da incapacidade e
morte no nosso meio. É uma doença da idade adulta, de etiologia multifatorial,
resultante de uma interação complexa de múltiplos fatores, genéticos e ambientais
(VOGEL e MOTULSKY, 1997).
A ocorrência de DAC varia amplamente no mundo e, geralmente, a maior
freqüência é encontrada em países ocidentais ou com estilo de vida ocidental. Estudos
epidemiológicos prospectivos têm demonstrado que a incidência de DAC em
indivíduos com Diabetes mellitus (DM) é cerca de duas a três vezes maior do que a
observada na população em geral (ROSEGREN et al., 1989; STAMLER et al., 1993).
A prevalência de DM entre portadores de DAC aumentou significantemente nos
últimos 10 anos (TAKAISHI et al., 2004). A ocorrência de eventos coronarianos em
pacientes com DM e sem história de doença isquêmica do coração é tão grande quanto
em indivíduos sem DM e com histórico de eventos coronarianos. O aumento do risco
de eventos cardiovasculares em indivíduos com DM2 pode ser relacionado, ao menos
em parte, com anormalidades no metabolismo de lípides e lipoproteínas (BERNARD
et al., 2004).
A aterosclerose coronariana resulta de respostas inflamatórias e
fibroproliferativas exacerbadas a vários tipos de injúria ao endotélio e músculo liso da
artéria, respostas nas quais participam um grande número de fatores de crescimento,
citocinas e moléculas vasoreguladoras (SHIMOKATA et al., 2004). Pacientes com
11
DM tem risco aumentado de desenvolver complicações específicas, dentre elas, a
aterosclerose (American Diabetes Association, 2005), base fisiológica da DAC.
O DM é uma síndrome de etiologia múltipla decorrente da falta de insulina e/ou
da incapacidade da insulina de exercer adequadamente seus efeitos. É caracterizada
por hiperglicemia crônica com distúrbios do metabolismo dos carboidratos, lípides e
proteínas (American Diabetes Association, 2005).
O DM2 está presente em mais de 90% dos indivíduos com DM e anteriormente
era descrito como diabetes não-insulino dependente ou diabetes da maturidade. A
maioria dos pacientes com este tipo de diabetes apresenta obesidade, a qual é
relacionada à resistência à insulina. O risco de desenvolver DM2 aumenta com a
idade, obesidade e falta de atividade física. O DM2 está associado com predisposição
genética complexa (American Diabetes Association, 2005). A susceptibilidade para
DAC em indivíduos com DM não pode ser inteiramente explicada por fatores de risco
convencionais; existem fatores genéticos influenciando no desenvolvimento de
complicações vasculares nestes indivíduos (LEVY, 2003).
O DM2 tem alta prevalência na população brasileira (7,6%, entre 30 e 50 anos)
e é um importante fator de risco independente de DAC (Ministério da Saúde, 2005).
Na mulher, é um fator de risco mais expressivo do que no homem, elevando a
mortalidade por DAC em 3 a 7 vezes. No indivíduo com DM, é particularmente
importante o controle associado dos outros fatores de risco – como sedentarismo,
obesidade, tabagismo; para diminuição mais eficaz do risco de DAC (III Diretrizes
Brasileiras em Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose, 2001).
O indivíduo portador de DM2 apresenta em geral um conjunto de
anormalidades lipídicas caracterizado por concentrações aumentadas de Triglicérides,
redução do HDL-Colesterol (HDL-C) e alteração de LDL-C (KRAUSS, 2004). Este
indivíduo deve receber tratamento com critérios de prevenção secundária,
recomendado pelas III Diretrizes Brasileiras em Dislipidemias e Diretriz de Prevenção
da Aterosclerose (2001), o qual é mais rígido em relação ao perfil lipídico,
especialmente em relação ao LDL-C. Isso reflete a importância dos lípides no processo
da aterosclerose e associação com a DAC.
12
Evidências de estudos epidemiológicos, correlações clínicas, hiperlipidemias
familiares, indicam que os lípides desempenham um papel importante na patogênese
da aterosclerose, conseqüentemente da DAC (SANKARANARAYANAN et al., 1999;
WHITFIELD et al., 2004).
As dislipidemias apresentam uma função importante no desenvolvimento e
progressão da aterosclerose, base fisiológica da DAC, incluindo infarto agudo do
miocárdio. Os lípides plasmáticos e as concentrações de lipoproteínas mostram um
padrão de hereditariedade, e mais da metade dos pacientes com DAC prematura
apresentam uma alteração genética nas lipoproteínas. Conseqüentemente, os genes
envolvidos no metabolismo lipídico, como os que codificam as principais
apolipoproteínas, são genes candidatos para DAC (CHIODINI et al., 2003). Portanto,
o desenvolvimento da DAC pode ser indicado pela variabilidade do DNA nos genes
candidatos, cujos produtos encontram-se envolvidos com o metabolismo lipídico,
estrutura e função das apolipoproteínas, aterogênese e trombogênese.
Concentrações plasmáticas elevadas de LDL-C são associados com um
aumento no risco de DAC (CASTELLI et al., 1986). A aterogenicidade da partícula de
LDL, principalmente a LDL pequena e densa vem sendo reconhecida (BOSSE et al.,
2004; CARMENA et al., 2004). Todavia, como a quantidade de colesterol na partícula
de LDL pode variar substancialmente, a concentração de LDL-C não é
necessariamente igual ao número de partículas de LDL (SNIDERMAN e
ROSENBLOOM, 2005). Embora o LDL-C seja o principal alvo terapêutico no
tratamento das dislipidemias, sua concentração não reflete o número total de partículas
aterogênicas, que incluem também lipoproteínas de intensidade intermediária (IDL) e
muito baixa (VLDL). As concentrações de LDL-C podem, inclusive, subestimar o
risco para DAC em indivíduos com síndrome metabólica (CARR e BRUNZELL,
2004). A apolipoproteína B é única proteína componente da lipoproteína LDL e suas
concentrações plasmáticas são também associadas com doença cardiovascular. As
evidências indicam as concentrações plasmáticas de apo B como um indicador de risco
de eventos cardiovasculares melhor que as concentrações de LDL-C, por estimar de
13
maneira mais precisa o número total das partículas aterogênicas, inclusive a LDL
pequena e densa (SNIDERMAN et al., 2003; WÄGNER et al., 2003).
Altas concentrações de apolipoproteína B têm sido relacionadas com a
ocorrência precoce de DAC, a presença de eventos recorrentes e com processos
trombóticos (IZAR et al., 2003). WÄGNER et al. (2003) sugerem que a apo B pode
identificar fenótipos dislipêmicos de alto risco em pacientes com DM2
normotrigliceridêmicos.
A apo B serve como ligante para o receptor da LDL mediando a remoção
plasmática da LDL. Mutações não polimórficas no gene da apo B podem causar
Hipercolesterolemia Familiar, caracterizada por aumento das concentrações
plasmáticas de LDL-C com deposição de colesterol nos tecidos e aterosclerose
prematura (SOUTAR et al., 2003; BENN et al., 2005). Estas variantes genéticas raras
não podem explicar toda a variabilidade da apo B na população em geral. Como
conseqüência, estudos encontraram uma grande variedade de polimorfismos no gene
da apo apresentando resultados inconsistentes, talvez devido à falta de análises
estatísticas adequadas, linhas de seleção e diversidade populacional (IOANNIDIS et
al., 2001; WHITFIELD et al., 2004).
A predição de fatores de risco cardiovascular deve ser aprimorada pela
combinação de fatores convencionais e outros marcadores de risco, como os
polimorfismos genéticos, mesmo porque ainda não está bem claro se fatores genéticos
e ambientais influenciando patologias como a DAC são interações sinérgicas ou
simplesmente efeitos aditivos aos fatores de risco tradicionais (BERNARD et al.,
2004; AUSTIN et al., 2004).
14
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Amostras de sangue de 210 indivíduos submetidos à angiocoronariografia,
classificados nos grupos descritos abaixo, foram utilizadas para a realização desta
pesquisa. A seleção dos indivíduos e coleta de sangue foi realizada no serviço de
hemodinâmica do Hospital Cardiológico Costantini, uma instituição particular. O
Projeto de Pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres
Humanos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (Protocolo
CEP/HC 663.082/2003-05). Para todos pacientes a coleta de sangue foi realizada
aproveitando o mesmo vaso utilizado para a angiocoronariografia, no início do
procedimento, sendo coletados 5 mL de sangue total em tubos Vacutainer (BD)
contendo EDTAK
3
para as extrações de DNA e, 10 mL em tubos Vacutainer com gel
separador, para as análises bioquímicas.
Foram considerados indivíduos com DAC (DAC+) aqueles que apresentaram
uma redução do diâmetro luminal coronariano maior ou igual a 50% em pelo menos
uma artéria coronária, determinado por angiocoronariografia. Pacientes com estenose
menor que 50% em todas as artérias coronárias ou que não apresentaram estenose
foram considerados não portadores de DAC (DAC−). Estes critérios foram baseados
nas Diretrizes de Doença Coronariana Crônica Angina Estável.
Foram considerados indivíduos com Diabetes Mellitus tipo 2 (DM2+) aqueles
com história clínica da doença obtida dos prontuários, valores de glicemia em jejum
maiores do que 126 mg/dL ou glicose 2h após sobrecarga de 75g de glicose maiores
do que 200 mg/dL, conforme classificação da Associação Americana de Diabetes
(American Diabetes Association, 2005).
Foram excluídos do estudo indivíduos com patologias não relacionadas ao DM
ou à DAC, como hepatopatias, valvulopatias e doença pulmonar. A freqüência de
terapia antihipertensiva e antilipemiante foi de 55,7% e 49,5%, respectivamente, entre
os indivíduos participantes deste estudo.
A amostra foi divida em três grupos de acordo com a presença ou não de DM2 e
de DAC. A Tabela 3 sumariza a classificação dos grupos estudados.
15
TABELA 3 – CLASSIFICAÇÃO DOS GRUPOS
Grupos Número de Indivíduos Características
DM2−DAC−
70 (37 mulheres, 33 homens)
Sem Diabetes mellitus tipo 2 e sem
Doença Arterial Coronariana
DM2−DAC+
70 (18 mulheres, 52 homens)
Sem Diabetes mellitus tipo 2 e com
Doença Arterial Coronariana
DM2+DAC+
70 (27 mulheres, 43 homens)
Com Diabetes mellitus tipo 2 e com
Doença Arterial Coronariana
4.1 VARIÁVEIS ESTUDADAS
4.1.1 Variáveis Antropométricas
As variáveis antropométricas dos pacientes foram obtidas de acordo com Ficha
de Coleta de Dados padronizada, cujo modelo encontra-se no Anexo I. As Tabelas 9 e
10 mostram os dados sobre Sexo, Índice de Massa Corporal (IMC), Pressão Arterial
Sistólica e Pressão Arterial Diastólica. As medidas de peso e altura foram realizadas
em balança antropométrica (Filizola, capacidade para 150 kg e sensibilidade para
100g). O IMC foi calculado através do Índice de Quetelet, dividindo o peso (em
quilogramas) pela altura (em metro) elevada ao quadrado. A verificação da pressão
arterial foi realizada conforme preconizado pelas IV Diretrizes Brasileiras de
Hipertensão, através de método indireto (técnica auscultatória), com
esfigmomanômetro aneróide (Tykos) e estetoscópio (Littmann), validados e calibrados
pelos fabricantes.
4.1.2 Parâmetros Bioquímicos
Os parâmetros bioquímicos foram quantificados no soro, obtido por coleta a
vácuo em tubo de 10 mL com gel separador (Vacutainer, BD), e os princípios
metodológicos e reagentes empregados estão sumarizados na Tabela 4. Os ensaios,
calibração e controle de qualidade interno e externo foram realizados conforme
16
protocolos fornecidos pelo fabricante do reagente. Todas as análises foram realizadas
no Laboratório de Análises Clínicas Frishmann Aisengart de Curitiba.
TABELA 4 – MARCADORES BIOQUÍMICOS
DOSAGEM METODOLOGIA AUTOMAÇÃO / MARCA
Apolipoproteína AI
Imunoturbidimétrico Hitachi 912 / Roche
Apolipoproteína B
Imunoturbidimétrico Hitachi 912 / Roche
Colesterol total
Enzimático, colorimétrico Vitros 750 / Johnson & Johnson
Glicose
Enzimática, glicose oxidase Vitros 750 / Johnson & Johnson
HDL-Colesterol
Homogêneo, enzimático Hitachi 912 / Roche
Hemoglobina glicada
HPLC com troca iônica Variant / Bio Rad
LDL-Colesterol
Homogêneo, enzimático Hitachi 912 / Roche
Triglicérides
Enzimático, colorimétrico Vitros 750 / Johnson & Johnson
Os valores de referência para os parâmetros bioquímicos encontram-se no Anexo IV.
4.2 REAGENTES
A enzima Taq DNA polimerase foi adquirida da MGM Assessoria Biológica S.A.
do Brasil, bem como o tampão da Taq DNA polimerase e solução de cloreto de
magnésio 50 mM. Os desoxinucleotídeos trifosfatos (dNTP) foram adquiridos da
Amersham Biosciences. Marcadores de massa molecular de 100 pares de base (100
bp) e 123 pares de base (123 bp) foram adquiridos da Amersham Biosciences e Gibco,
respectivamente. Os oligonucleotídeos iniciadores foram sintetizados pela Invitrogen.
A agarose foi adquirida da Invitrogen. A água reagente tipo 1, apresentando
condutividade de 18,2 MΏ-cm, foi obtida em sistema Milli-Q (Millipore) e esterilizada
por autoclavação. Os demais reagentes utilizados foram provenientes de diversas
fontes, e todos eram reagentes de grau analítico.
4.3 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DO DNA
O DNA genômico foi purificado do sangue total pelo procedimento descrito por
LAHIRI e NURNBERGER (1991), mas adaptado para tubos do tipo Eppendorf de 1,5
mL. A Figura 3 mostra um esquema das etapas de extração do DNA.
17
Figura 3 – Processo de extração do DNA de sangue total.
Sinteticamente, o sangue total (1 mL) foi hemolisado com auxílio do detergente
Nonidet P-40 (Sigma) em tampão fosfato. As proteínas foram precipitadas em meio
contendo alta concentração de cloreto de sódio (concentração final de 3 mol/L) e na
presença de 10% de SDS (dodecil sulfato de sódio). O DNA presente no sobrenadante
foi, então, precipitado em 2 volumes de etanol absoluto e as impurezas removidas com
duas lavagens com etanol a 70%. O DNA seco a temperatura ambiente foi solubilizado
em água tipo MilliQ estéril numa concentração aproximada de 100 ng/µL e as
amostras mantidas em freezer a -20ºC. O tempo aproximado para extração do DNA foi
de 60 minutos.
A quantificação do DNA foi realizada por espectrofotometria em 260 nm e a
pureza pela relação da Absorbância 260nm/ Absorbância 280nm (A
260/280
). O
procedimento possibilitou a obtenção de amostras com DNA nas concentrações de 50
a 500 ng/µL e relação A
260/280
entre 1,5 e 1,9 (SAMBROOK et al., 1989).
18
4.4 AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DOS EXONS 26 E 29 DO GENE DA
APO B PELA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)
Fragmentos de DNA correspondentes às regiões do gene da apo B foram
amplificados através da PCR. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados na reação de
PCR foram aqueles descritos por RENGES et al. (1992) e suas seqüências são as
seguintes:
- Exon 26 do gene da apo B (polimorfismo XbaI):
X 1: F-5’-GGAGACTATTCAGAAGCTAA-3’;
X 2: R-5’-GAAGAGCCTGAAGACTGACT-3’.
- Exon 29 do gene da apo B (polimorfismo EcoRI):
E 3: F-5’-CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG 3’
E 4: R-5’-CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC 3’.
Os oligonucleotídeos iniciadores foram dissolvidos em água tipo MilliQ estéril
na concentração de 100 pmol/µL, e as soluções mantidas em freezer a -20ºC. Como
solução de uso, uma mistura dos oligonucleotídeos iniciadores 5’ e 3’ foi preparada a
partir da solução estoque, de forma a produzir uma solução contendo 10 pmol/µL de
cada iniciador.
As PCRs foram realizadas em termociclador Mastercycler Gradient
(Eppendorf). As condições da reação de PCR para amplificação dos fragmentos dos
exons 26 e 29 do gene apo B, foram, respectivamente, as mesmas (com exceção dos
oligonucleotídeos iniciadores) e estão descritas nas Tabelas 5 e 6.
A quantidade e qualidade do produto de PCR obtido foram determinadas
através da eletroforese horizontal em gel de agarose a 1,5%, a 60 Volts e 30
miliAmperes durante 1 hora (cuba Horizon 58, Life Technologies) em tampão TBE
1X (Tris-hidroximetilaminometano 89 mmol/L; ácido bórico 89 mmol/L e EDTA 1
mmol/L, pH 8,2).
19
O DNA foi corado com solução de brometo de etídeo 0,5 µg/mL e visualizado
em transiluminador sob luz ultravioleta (302 nm). As imagens foram obtidas com
câmera CCD (sistema Biochemi, UVP).
Inicialmente o procedimento de PCR-RFLP foi realizado como descrito por
RENGES et al. (1992). O tempo da reação de PCR deste ensaio supera às 4 horas, o
que foi considerado excessivamente longo e motivou estabelecer novas condições de
reação com tempo reduzido. O ensaio foi então otimizado (Tabelas 5 e 6) com redução
de 50% do tempo, e permitiu obter produtos de PCR com boa quantidade e ausência de
bandas inespecíficas (Figuras 7 e 8).
As reações de PCR-RFLP com as enzimas XbaI e EcoRI foram otimizadas nas
condições descritas nas Tabelas 7 e 8. Os perfis eletroforéticos dos fragmentos de
restrição (Figuras 9 e 10) permitiram a caracterização dos genótipos em estudo sem
resultados conflitantes.
TABELA 5 – CONDIÇÕES DE AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DOS EXONS 26
E 29 DO GENE DA APO B HUMANA.
REAGENTES e DNA
CONCENTRAÇÃO
FINAL
VOLUME
DNA molde
~ 10 ng/µL 1,0 µL
Tampão Taq (10X)
1 X
1,0 µL
MgCl
2
(50 mM)
1,5 mmol/L
0,3 µL
dNTP (5 mM)
0,2 mmol/L
0,4 µL
Oligonucleotídeos Iniciadores
(10 pmol/µL, cada)
20 pmol (cada)
[2µmol/L, cada]
2,0 µL
Taq DNA Polimerase (5 U/µL)
0,2 U/µL 0,4 µL
Água Reagente tipo 1 estéril
-----
4,9 µL
Volume Final
10 µL
Tampão Taq 10X concentrado: 200 mM Tris-HCl (pH 8,4); 500 mM KCl
20
TABELA 6 – PROGRAMA UTILIZADO PARA AMPLIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS
DOS EXONS 26 E 29 DO GENE DA APO B HUMANA.
Nº CICLOS ETAPAS
TEMPERATURA
(ºC)
TEMPO
1X Desnaturação
94 5 minutos
34 X
Desnaturação
Anelamento
Extensão
94
58
72
1 minuto
1 minuto
1 minuto
1 X Extensão Final
72 10 minutos
4.5 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO
XbaI DO EXON 26 DO GENE DA APO B HUMANA.
Para determinação do polimorfismo XbaI do exon 26, o produto de
amplificação deste exon foi submetido à digestão pela a enzima XbaI (Amersham
Biosciences), conforme descrito na Tabela 7.
TABELA 7 – CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO EXON
26 DO GENE DA APO B COM A ENZIMA XbaI
REAGENTES Reação Concentração final
Enzima XbaI (12 U/µL)
0,6 µL 0,36 U/µL
Albumina Bovina 0,1%
2,0 µL
0,01 %
Tampão M (10X)
2,0 µL
1 X
Produto de PCR do exon 26
5,0 µL 5 a 10 ng/µL
Água Reagente tipo 1 estéril
10,4 µL
---
Volume Final
20 µL
----
Homogeneizar e deixar em Banho-Maria a 37º C por 4 horas
Tampão M 10X concentrado: 100 mM Tris-HCl (pH 7,5); 500 mM NaCl, 10mM DDT, 100mM MgCl
2
21
4.6 REAÇÃO DE RESTRIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DO POLIMORFISMO
EcoRI DO EXON 29 DO GENE DA APO B HUMANA.
Para determinação do polimorfismo EcoRI do exon 29 do gene apo B, o
produto de amplificação deste exon foi submetido à digestão pela a enzima EcoRI
(Amersham Biosciences), conforme descrito na Tabela 8.
TABELA 8 – CONDIÇÕES DA REAÇÃO DE RESTRIÇÃO DO FRAGMENTO DO EXON
29 DO GENE DA APO B COM A ENZIMA EcoRI
REAGENTES Reação Concentração final
Enzima EcoRI (15 U/µL)
0,6 µL 0,45 U/µL
Tampão H (10X)
2,0 µL
1 X
Produto de PCR do exon 29
5,0 µL 5 – 10ng/µL
Água Reagente tipo 1 estéril
12,4 µL
---
Volume Final
20 µL
---
Homogeneizar e deixar em Banho-Maria a 37º C por 4 horas
Tampão H 10X concentrado: 500 mM Tris-HCl (pH 7,5); 1000 mM NaCl, 10mM DDT, 100mM MgCl
2
4.7 IDENTIFICAÇÃO DOS FRAGMENTOS DA RESTRIÇÃO COM XbaI E EcoRI
Ao produto de restrição (10 µL) foram adicionados 3 µl de solução de glicerol
30% contendo os corantes azul de bromofenol (0,05%) e xileno cianol (0,05%). A
mistura foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1,5% como descrito no item
3.4.1. A eletroforese foi interrompida quando o corante azul de bromofenol atingia
aproximadamente 2/3 do gel. Os fragmentos de DNA foram corados com brometo de
etídeo 0,5 µg/mL e visualizados em transiluminador UV (302 nm). Os
eletroforetogramas foram registrados com o sistema de captação de imagens digitais
(câmera CCD) Biochemi (UVP).
Os pontos de corte das enzimas XbaI e EcoRI nos exons 26 e 29, os possíveis
genótipos, bem como os tamanhos dos fragmentos produzidos estão mostrados nas
Figuras 4 e 5 .
22
Figura 4 – Representação esquemática do fragmento do exon 26 amplificado e
localização do polimorfismo XbaI do gene da apo B humana.
Figura 5 – Representação esquemática do fragmento do exon 29 amplificado e
localização do polimorfismo EcoRI do gene da apo B humana.
FONTE: Figuras adaptadas de : http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/Exclusivo/Inserir/Anexos
/LinkAnexos/dislipidemias%202005.pdf - Acesso em: 18 nov 2005.
Genótipo X-X-
’ ’
Exon 26
Exon 25 Exon 27
5
3
PCR
Restrição Enzimática XbaI
Fragmento
amplificado
710 bp
’
’
5
3
’ ...T C T A G A... 3
...A G A T C T... 5
710 bp
710 bp
433 bp
277 bp
433 bp
277 bp
Genótipo X-X+
Genótipo X+X+
Genótipo E-E-
’
Exon 26
’
Exon 29
Exon 285
3
PCR
Restrição Enzimática EcoRI
Fragmento
amplificado
480 bp
’
’
5
3
’ ...G A A T T C... 3
...C T T A A G... 5
480 bp
480 bp
253 bp
227 bp
253 bp
227 bp
Genótipo E-E+
Genótipo E+E+
23
4.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Statistica para
Windows versão 5.0.
As concentrações médias dos marcadores bioquímicos foram comparadas entre
os diferentes grupos utilizando-se o teste da análise da variância (ANOVA) ou teste
“t” para amostras não pareadas. As freqüências alélicas foram obtidas pela contagem
dos genes.
O teste de Chi-quadrado (χ
2
) foi utilizado para analisar as variáveis categóricas.
O grau de liberdade considerado no teste de Chi-quadrado está indicado como índice
anexo ao símbolo da estatística, sendo que, χ
2
(1)
, caracteriza um teste de Chi-quadrado
com 1 grau de liberdade. Neste caso, as tabelas de contingência foram analisadas
utilizando o programa estatístico RxC (MILLER, 2005). Para a análise de variáveis
que não apresentaram distribuição normal, utilizou-se da transformação logarítmica ou
do teste U de Mann-Whitney (não-paramétrico), a fim de normalizá-las.
O Teste Exato de Fisher (bidirecional) foi utilizado para comparar as
freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos DM2−DAC−, DM2−DAC+ e
DM2+DAC+. E as freqüências haplotípicas foram obtidas empregando-se o método da
verossimilhança máxima, programa ARLEQUIN – versão 3 (EXCOFFIER e
SCHNEIDER, 2005).
Valores de P<0,05 foram considerados como estatisticamente significativos.
24
5 RESULTADOS
A amostra estudada foi composta por 210 indivíduos; sendo 196 euro-
brasileiros (93,3%), 10 afro-brasileiros (4,8%) e 4 orientais (1,9%). As distribuições
dos indivíduos por sexo e fatores de risco para DAC estão descritas na Tabela 9.
TABELA 9 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQUÊNCIAS POR SEXO E FATORES DE RISCO
PARA DAC NOS GRUPOS ESTUDADOS
SEXO FATORES DE RISCO PARA DAC
Tabagismo
Hipertensão
Arterial
Histórico Familiar
de DAC Masculino Feminino
Sim Não Sim Não Sim Não
GRUPOS
N % N % N % N % N % N % N % N %
DM2−DAC−
(N=70)
33 47,1 37 52,9
27
38,6
43
61,4
28
40,0
42
60,0
29
41,4
41
58,6
DM2−DAC+
(N=70)
52 74,3 18 25,7
42
60,0
28
40,0
28
40,0
42
60,0
32
45,7
38
54,3
DM2+DAC+
(N=70)
43 61,4 27 38,6
39
55,7
31
44,3
37
52,9
33
47,1
34
48,6
36
51,4
* P
0,0416 0,0291
0,2405 0,7126
N = número de indivíduos
* Teste do Chi-quadrado, χ²
(1)
Os grupos diferiram significativamente na distribuição entre homens e mulheres
(P=0,0416), e quanto ao uso de tabaco (P=0,0291), sendo que os grupos DAC+
apresentaram maior freqüência do sexo masculino e de tabagistas. A presença de
hipertensão arterial e o histórico familiar de DAC não foram diferentes entre os 3
grupos estudados .
Os indivíduos estudados apresentaram idade variando entre 36 e 83 anos. A
distribuição das freqüências de idade nos 3 grupos estudados está representada na
Figura 6. A idade média do grupo DM2−DAC− (59 ± 10 anos) foi menor e
estatisticamente diferente da média dos grupos DM2−DAC+ (63 ± 11 anos, P=0,048) e
DM2+DAC+ (65 ± 9 anos, P=0,002). Não houve diferença estatisticamente
significativa quando comparadas às médias de idade dos grupos DM2−DAC+ e
DM2+DAC+.
25
Figura 6 – Distribuição de freqüência de idade
5.1 DADOS ANTROPOMÉTRICOS E BIOQUÍMICOS
A Média (M) ± Desvio Padrão (DP), a Amplitude de Variação (AV) e valores
de P dos dados antropométricos e bioquímicos dos 3 grupos estudados estão mostrados
na Tabela 10.
As médias das medidas das pressões arteriais sistólica e diastólica não
apresentaram diferenças estatisticamente significativas entre os três grupos, assim
como as concentrações médias das variáveis Colesterol Total, LDL-Colesterol,
Apolipoproteína A e Apolipoproteína B.
Os dados apresentados na Tabela 10 mostram que houve diferença significativa
(P<0,05) quando comparadas às médias das variáveis Índice de Massa Corporal,
Glicose, Hemoglobina Glicada, HDL-Colesterol e Triglicérides entre os grupos DM2−
DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
36-40
41-45
46-50
51-55
56-60
61-65
66-70
71-75
76-80
81-83
IDADE (ANOS)
FREQUÊNCIA (%)
DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+
26
TABELA 10 – VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS DOS GRUPOS: DM2−DAC−, DM2−DAC+ E DM2+DAC+,
COM MÉDIA (M) ± DESVIO PADRÃO (DP) E AMPLITUDE DE VARIAÇÃO (AV) DAS VARIÁVEIS
ANALISADAS.
Grupo DM2−DAC− (N=70) Grupo DM2−DAC+ (N=70)
Grupo DM2+DAC+ (N=70)
Variáveis
M ± DP AV M ± DP AV
P
*
M ± DP AV
P
**
P
***
IMC (kg/m
2
) 23,9 ± 3,2 16,5 – 33,8 26,2 ± 3,7 17,9 – 41,8
0,002
27,9 ± 4,7 20,1 – 45,8
<0,001 0,022
Pressão arterial sistólica (mmHg) 141,3 ± 21,4 95 – 220 146,0 ± 19,6 110 – 200
0,370
146,2 ± 21,4 100 – 200
0,351 0,999
Pressão arterial diastólica (mmHg) 80,1 ± 9,2 60 – 100 78,3 ± 9,5 53 – 100
0,447
79,9 ± 8,3 59 - 100
0,987 0,538
Hemoglobina glicada (mg/dL) 5,3 ± 0,7 2,6 – 6,4 5,5 ± 0,5 3,0 – 6,5
0,462
7,6 ± 1,6 5,1 – 12,4
<0,001 <0,001
Glicose (mg/dL) 90,5 ± 11,3 71 – 116 93,9 ± 12,5 54 – 123
0,868
157,3 ± 66,4 80 – 340
<0,001 <0,001
Colesterol Total (mg/dL) 175,5 ± 34,8 114 – 290 167,7 ± 39,3 74 – 295
0,446
171,6 ± 39,4 94 – 303
0,815 0,818
HDL-Colesterol (mg/dL) 47,1 ± 12,1 24 – 78 42,9 ± 11,1 24 – 69
0,162
39,8 ± 8,9 21 – 66
0,001 0,215
LDL-Colesterol (mg/dL) 118,9 ± 28,9 52 – 192 108,5 ± 36,2 29 – 257
0,121
112,6 ± 27,6 46 – 174
0,463 0,714
Triglicérides 107,7 ± 58,6 31 – 418 136,7 ± 75,8 54 – 571
0,081
166,0 ± 100,2 57 – 588
<0,001 0,076
Apolipoproteína A (mg/dL) 120,2 ± 25,7 74 – 178 114,5 ± 25,2 58 – 184
0,369
113,3 ± 24,0 61 – 175
0,233 0,956
Apolipoproteína B (mg/dL) 88,7 ± 23,2 40 – 163 89,5 ± 27,8 19 – 184
0,978
93,2 ± 24,2 45 - 149
0,542 0,667
N= número de indivíduos
P
*
= diferença estatística entre Grupo DM2−DAC− e Grupo DM2−DAC+
P
**
= diferença estatística entre Grupo DM2−DAC− e Grupo DM2 +DAC+
P
***
= diferença estatística entre Grupo DM2−DAC+ e Grupo DM2 +DAC+
27
O Índice de Massa Corporal (IMC) foi significativamente diferente entre todos
os grupos. O grupo DM2+DAC+ apresentou média e amplitude de variação maiores
que os outros dois grupos para o IMC.
As concentrações médias de glicose dos indivíduos do grupo DM2+DAC+
foram maiores e diferentes das concentrações médias dos grupos DM2−DAC− e
DM2−DAC+, sendo que estes não mostraram diferenças entre si. Esses dados refletem
a classificação da amostra, onde os grupos DM2−DAC− e DM2−DAC+ são
compostos por indivíduos sem DM2, e o grupo DM2+DAC+ por pacientes com DM2,
onde a hiperglicemia é esperada.
As concentrações de Hemoglobina Glicada (HbA
1C
) apresentaram médias
superiores e estatisticamente diferentes somente quando comparado o grupo
DM2+DAC+ com os demais grupos sem DM2.
Houve diferença significativa entre os valores médios das concentrações séricas
de HDL-C encontrados para o grupo DM2−DAC− e o grupo DM2+DAC+. O grupo
DM2+DAC+ apresentou médias inferiores às do grupo controle (P=0,001).
As concentrações de Triglicérides no grupo DM2−DAC− foram, em média,
menores e significativamente diferentes daquelas encontradas no grupo DM2+DAC+
(P<0,001). Os valores de Triglicérides, por não apresentarem distribuição normal,
foram normalizados através de transformação logarítmica antes de proceder à análise
estatística, porém os resultados não foram diferentes.
5.2 ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE DA APO B
As Figuras 7 a 10 mostram resultados típicos para os produtos de PCR e para os
perfis de restrições estudados.
28
Figura 7 – Perfil eletroforético da PCR para amplificação do
polimorfismo XbaI do exon 26 do gene da apo B.
Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE 1X (60V,
30mA). Os produtos de PCR (2µL) foram corados com
brometo de etídeo 0,5µg/mL e visualizados em
transiluminador UV (302 nm). As imagens foram
registradas com câmera digital CCD Biochemi (UVP).
A linha 1 mostra o marcador de massa molecular (123 pb -
Gibco); as linhas 2 a 4 mostram produto de PCR da
amplificação parcial do exon 26 do gene da apo B
(polimorfismo XbaI). A linha 5 mostra o controle da
reação (sem DNA). O tamanho esperado para o produto
de PCR está identificado à direita do gel.
12345
123 bp
246 bp
369 bp
492 bp
615 bp
738 bp
710 bp
12345
123 bp123 bp
246 bp246 bp
369 bp369 bp
492 bp492 bp
615 bp615 bp
738 bp738 bp
710 bp710 bp
29
Figura 8 – Perfil eletroforético da PCR para amplificação do
polimorfismo EcoRI do exon 29 do gene da apo B.
Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE 1X
(60V, 30mA). Os produtos de PCR (2µL) foram
corados com brometo de etídeo 0,5µg/mL e
visualizados em transiluminador UV (302 nm). As
imagens foram registradas com câmera digital CCD
Biochemi (UVP).
A linha 1 mostra o marcador de massa molecular (100
pb – Amersham Biosciences); as linhas 2 a 4 mostram
produto de PCR da amplificação parcial do exon 29 do
gene da apo B (polimorfismo EcoRI). A linha 5 mostra
o controle da reação (sem DNA). O tamanho esperado
para o produto de PCR está identificado à direita do gel.
100 bp
200 bp
300 bp
400 bp
500 bp
600 bp
480 bp
12 3 45
100 bp100 bp
200 bp200 bp
300 bp300 bp
400 bp400 bp
500 bp500 bp
600 bp600 bp
480 bp480 bp
12 3 45
30
Figura 9 – Perfil eletroforético típico da PCR-RFLP do
polimorfismo XbaI do exon 26 do gene da apo B.
Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE 1X (40V,
20mA). Os fragmentos de DNA (10 µL) do polimorfismo
XbaI do exon 26 do gene da apo B foram corados com
brometo de etídeo 0,5µg/mL e visualizados em
transiluminador UV (302 nm). As imagens foram
registradas com câmera digital CCD Biochemi (UVP).
A linha 1 mostra o produto de PCR sem corte. A linha 2
mostra o marcador de massa molecular (123 pb – Gibco);
as linhas 3 a 5 mostram o perfil de restrição típico para os
genótipos X+X+, X+X− e X−X−, respectivamente. Os
tamanhos esperados para os fragmentos de restrição e para
o produto de PCR sem corte estão identificados à direita
do gel.
1
23 45
123 bp
246 bp
369 bp
492 bp
615 bp
738 bp
277 bp
433 bp
710 bp
1
23 45
123 bp123 bp
246 bp246 bp
369 bp369 bp
492 bp492 bp
615 bp615 bp
738 bp738 bp
277 bp
277 bp
433 bp433 bp
710 bp710 bp
31
Figura 10 – Perfil eletroforético típico da PCR-RFLP do
polimorfismo EcoRI do exon 29 do gene da apo
B. Eletroforese em agarose 1,5%, em tampão TBE
1X (40V, 20mA). Os fragmentos de DNA (10 µL)
do polimorfismo EcoRI do exon 29 do gene da apo
B foram corados com brometo de etídeo 0,5µg/mL
e visualizados em transiluminador UV (302 nm).
As imagens foram registradas com câmera digital
CCD Biochemi (UVP).A linha 1 mostra o produto
de PCR sem corte. A linha 2 mostra o marcador de
massa molecular (123 pb – Gibco); as linhas 3 a 5
mostram o perfil de restrição típico para os
genótipos E−E−, E+E− e E+E+, respectivamente.
Os tamanhos esperados para os fragmentos de
restrição e para o produto de PCR sem corte estão
identificados à direita do gel.
123 bp
246 bp
369 bp
492 bp
615 bp
1
2345
227 bp
253 bp
480 bp
123 bp123 bp
246 bp246 bp
369 bp369 bp
492 bp492 bp
615 bp615 bp
1
2345
227 bp227 bp
253 bp253 bp
480 bp480 bp
32
A variabilidade do gene da apo B XbaI e EcoRI, das 210 amostras estudadas,
está apresentada nas Tabelas 11 a 14, as quais mostram as freqüências dos genótipos e
dos alelos, nos grupos DM2−DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+.
TABELA 11 - FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS POLIMORFISMOS
XbaI E EcoRI DO GENE DA APO B NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=70),
DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+ (N=70) E NA AMOSTRA TOTAL.
Genótipos Alelos H-W
Apo B Grupos X+X+ (N)
X+X− (N) X−X− (N)
* P
X+ (N)
X− (N)
* P
χ
2
(1)
; P
DM2−DAC−
0,171 (12) 0,458 (32) 0,371 (26) 0,400 (56) 0,600 (84)
χ
2
=0,158; P=0,31
DM2−DAC+
0,214 (15) 0,479 (34) 0,307 (21) 0,457 (64) 0,543 (76)
χ
2
=0,030; P=0,13
DM2+DAC+
0,171 (12) 0,386 (27) 0,443 (31)
P= 0,51
0,364 (51) 0,636 (89)
P=0,28
χ
2
=0,196; P=0,34
XbaI
exon
26
Todos
0,186 (39) 0,443 (93) 0,371 (78) --- 0,407 0,593 ---- ----
Apo B Grupos E+E+ (N)
E+E− (N) E−E− (N)
** P
E+
E−
* P
χ
2
(1)
; P
DM2−DAC−
0,728 (51) 0,229 (16) 0,043 (3) 0,843 (118) 0,157
(22)
χ
2
=1,316; P=0,75
DM2−DAC+
0,657 (46) 0,314 (22) 0,029 (2) P= 0,63 0,814 (114) 0,186 (26)
χ
2
=0,107; P=0,26
DM2+DAC+
0,700 (49) 0,257 (18) 0,043 (3) P= 0,87 0,829 (116) 0,171 (24)
P=0,83
χ
2
=0,629; P=0,57
EcoRI
exon
29
Todos
0,695
(146)
0,267 (56) 0,038 (8) ---- 0,829 0,171 ---- ----
N = número de indivíduos
H-W: Equilíbrio de Hardy-Weinberg
* Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ
2
); Grau de Liberdade (GL) = 2
** Valor de probabilidade “P” para o Teste Exato de Fisher bidirecional, comparação com DM2−
DAC−; Grau de Liberdade (GL) = 1. O teste foi realizado comparando as freqüências E+E+
contra E+E− somado ao E−E−.
Não houve diferença estatisticamente significativa nas freqüências alélicas para
os polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apo B entre os 3 grupos estudados
(P=0,2858 e P=0,8364, respectivamente). Também não houve diferença
estatisticamente significativa nas freqüências genotípicas para os polimorfismos XbaI
e EcoRI do gene da apo B entre os 3 grupos estudados (P=0,5079 e P=0,8339,
respectivamente), conforme mostrado na Tabela 11.
33
As distribuições das freqüências observadas desses genótipos nos grupos
DM2−DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+ não mostraram diferenças estatisticamente
significativas quando comparadas com aquelas esperadas pela Lei de Hardy-Weinberg,
o que sugere que a distribuição genotípica em todos os grupos está de acordo com o
equilíbrio de Hardy-Weinberg (P>0,05).
As freqüências genotípicas e alélicas não foram significativamente diferentes
entre os grupos estudados.
Para comparar os dados deste trabalho com outros estudos, os grupos DM2−
DAC+ e DM2+DAC+ foram reunidos formando um grupo designado DAC+. Os
dados estão mostrados na Tabela 12. Analisadas as freqüências genotípicas e alélicas
destes polimorfismos entre os grupos DAC− e DAC+, não houve diferença
estatisticamente significativa entre eles.
TABELA 12 – FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DOS POLIMORFISMOS
XbaI E EcoRI DO GENE DA APO B NOS GRUPOS DAC− (N=70) E
DAC+ (N=140)
Genótipos Alelos
Apo B Grupos X+X+ (N)
X+X− (N) X−X− (N)
*P X+
X−
DAC−
0,171 (12) 0,458 (32) 0,371 (26)
0,400 0,600
DAC+
0,193 (27) 0,432 (61) 0,375 (52)
P =
0,9161
0,411 0,589
XbaI
exon 26
χ
2
(2)
= 0,11; P =0,9439
χ
2
(1)
= 0,04; P =0,8331
Apo B Grupos E+E+ (N)
E+E− (N) E−E− (N)
* P E+
E−
DAC−
0,728 (51) 0,229 (16) 0,043 (3)
0,843 0,157
DAC+
0,679 (95) 0,285 (40) 0,036 (5)
P =
0,6806
0,822 0,178
EcoRI
exon 29
χ
2
(2)
= 0,80; P =0,6701
χ
2
(1)
= 0,30; P =0,5828
N = número de indivíduos
* Valor de probabilidade “P” para o Teste Exato de Fisher (bidirecional), comparação com DM2−
DAC−; Grau de Liberdade (GL) = 1
34
5.3 ANÁLISE DE ASSOCIAÇÃO ENTRE HAPLÓTIPOS E GENÓTIPOS DO
GENE DA APO B E DAC NA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE DM2
As freqüências dos genótipos do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B
encontradas nos grupos DM2−DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+ estão apresentadas
na Tabela 13.
TABELA 13 – DISTRIBUIÇÃO DE FREQÜÊNCIA (%) DOS GENÓTIPOS XbaI/EcoRI
DO GENE DA APO B NOS GRUPOS DM2−DAC− (N=70), DM2−DAC+
(N=70) E DM2+DAC+ (N=70).
GENÓTIPOS
DM2−DAC−
N=70
DM2−DAC+
N=70
DM2+DAC+
N=70
XbaI EcoRI N % N % N %
X+X+ E+E+
11 15,71 14 20,00 11 15,71
X+X+
E+E−
1 1,43 1 1,43 1 1,43
X+X+
E−E−
0 - 0 - 0 -
X+X−
E+E+
26 37,14 24 34,29 18 25,71
X+X− E+E−
6 8,57 10 14,29 9 12,86
X+X− E−E−
0 - 0 - 0 -
X−X−
E+E+
14 20,00 8 11,43 20 28,57
X−X− E+E−
9 12,86 11 15,74 8 11,43
X−X− E−E−
3 4,29 2 2,85 3 4,29
N = número de indivíduos
Teste do Chi-quadrado (χ
2
(12)
=9,45; P= 0,6641).
Comparando todas as classes genotípicas observadas na Tabela 13, pelo Teste
do Chi-quadrado, não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os 3
grupos estudados (χ
2
(12)
= 9,45 ; P=0,6641).
As freqüências haplotípicas do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B,
mostradas na Tabela 14, foram obtidas com base nos genótipos apresentados na Tabela
13.
35
TABELA 14 – FREQÜÊNCIAS ABSOLUTAS E RELATIVAS DOS DIFERENTES
HAPLÓTIPOS DO GENE DA APO B (XbaI/EcoRI) NOS GRUPOS
DM2−DAC− (N=70), DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+ (N=70).
DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+
DM2-DAC-
x
DM2-DAC+
DM2-DAC-
x
DM2+DAC+
DM2-DAC+
x
DM2+DAC+
Apo B
XbaI/EcoRI
N % N % N %
χ
2
(1)
P*
χ
2
(1)
P*
χ
2
(1)
P*
X+E+
55 39,3 63 45 49 35 0,94 0,3329 0,55 0,4580 2,92 0,0877
X+E-
1 0,7 1 0,7 2 1,4 0,00 1,0000 0,00 1,0000 0,34 0,5616
X-E+
63 45 51 36,4 67 47,9 2,13 0,1444 0,23 0,6317
3,75 0,0528
X-E-
21 15 25 17,9 22 15,7 0,66 0,4159 0,11 0,7378 0,23 0,6314
Total (N) 140 100 140 100 140 100
χ
2
(2)
=1,47; P**= 0,4772
N = número de haplótipos
* Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ
2
); grupos dois a dois; Grau de
Liberdade (GL) = 1
** Valor de probabilidade “P” para o do Chi-quadrado (χ
2
); entre os 3 grupos; Grau de Liberdade
(GL) = 2
Comparando as freqüências dos haplótipos do polimorfismo XbaI/EcoRI do
gene da apo B, pelo Teste do Chi-quadrado, não houve diferença estatisticamente
significativa entre os 3 grupos estudados (χ
2
(2)
= 1,47; P=0,4772).
Ao analisar os grupos DM2−DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+, dois a dois,
pelo Teste do Qui-quadrado (χ
2
), as freqüências dos haplótipos do gene da apo B
também não foram estatisticamente diferentes. No entanto, o haplótipo X−E+
apresentou diferença próxima da significância (χ
2
(1)
= 3,75; P= 0,0528) entre os grupos
DM2−DAC+ e o DM2+DAC+. A partir deste dado, investigou-se a freqüência do
genótipo X−X−/E+E+ e demais genótipos XbaI/EcoRI entre os grupos em estudo, uma
vez que o genótipo X−X−/E+E+ foi anteriormente considerado como marcador
genético para DAC (SCARTEZINI et al., 2003).
36
TABELA 15 – DISTRIBUIÇÃO DAS FREQÜÊNCIAS (%) DOS GENÓTIPOS X−X−
/E+E+ E DEMAIS GENÓTIPOS XbaI/EcoRI DO GENE DA APO B NOS
GRUPOS DM2−DAC− (N=70), DM2−DAC+ (N=70) E DM2+DAC+
(N=70).
DM2-DAC- DM2-DAC+ DM2+DAC+
DM2-DAC-
x
DM2-DAC+
DM2-DAC-
x
DM2+DAC+
DM2-DAC+
x
DM2+DAC+
Apo B
XbaI/EcoRI
N % N % N %
χ
2
P*
χ
2
P*
χ
2
P*
X−X−/E+E+
14 20 8 11,43 20 28,57
Demais
Genótipos
56 80 62 88,57 50 71,43
1,94 0,1635 1,40 0,2370
6,43 0,0112
TOTAL
70 100 70 100 70 100
χ
2
= 6,29;
P** = 0,0430
N = número de indivíduos.
* Valor de probabilidade “P” para o Teste do Chi-quadrado (χ
2
); grupos dois a dois; Grau de Liberdade (GL) = 1
** Valor de probabilidade “P” para o do Chi-quadrado (χ
2
); entre os 3 grupos; Grau de Liberdade (GL) = 2
Comparando as freqüências do genótipo X−X−/E+E+ com os demais genótipos
XbaI/EcoRI do gene da apo B, nos 3 grupos estudados, pelo Teste do Chi-quadrado, a
distribuição genotípica foi estatisticamente significativa (χ
2
(2)
= 6,29; P=0,0430). E
analisando os grupos estudados, dois a dois, pelo Teste do Chi-quadrado (χ
2
), a
distribuição do genótipo X−X−/E+E+, comparado com os demais genótipos
XbaI/EcoRI do gene da apo B, mostrou-se estatisticamente diferente entre os grupos
DM2−DAC+ e o DM2+DAC+ (χ
2
(1)
= 6,43; P = 0,0112), conforme Tabela 15.
37
6 DISCUSSÃO
As alterações na seqüência do DNA contribuem para variações fenotípicas,
influenciando características individuais antropométricas, risco de doenças e resposta
ao ambiente.
Os polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) são variações no genoma que
surgem a partir de mutações de ponto. Análises do sequenciamento do genoma
humano estimam em 1,42 milhões a presença de SNPs, na proporção de cerca de um
SNP para cada 1,9 kilobases (The International SNP Map Working Group, 2001).
A procura de genes relacionados à susceptibilidade para a doença
cardiovascular e o DM2, tem sido objeto de intensa pesquisa, face ao grande impacto
destas patologias nas sociedades modernas (FRANCKE et al., 2001).
As diferentes características relacionadas à etnia, associadas intrinsecamente
aos estudos de polimorfismos, aumentam a relevância da pesquisa da variabilidade na
miscigenada população brasileira, na busca de associações ou identificação de
particularidades na comparação com outros estudos populacionais.
Como elemento essencial ao complexo mecanismo de transporte e metabolismo
do Colesterol sérico, a apo B, tem sido alvo de intensa pesquisa com ênfase na
identificação de patologias de origem genética ou na busca de marcadores de risco
associados à DAC.
Neste estudo, os polimorfismos de único nucleotídeo no gene da apoB,
detectados com as enzimas de restrição XbaI e EcoRI, são pesquisados em uma
população caracterizada quanto à presença de DAC por angiocoronariografia e
separada em grupos quanto à presença ou não de DM2.
6.1 VARIÁVEIS ANTROPOMÉTRICAS E BIOQUÍMICAS
As características sócio-econômicas dos indivíduos estudados (N=210), como a
disponibilidade de planos de saúde permitindo acesso ao serviço privado de
hemodinâmica, e as características da colonização da região geográfica em que foi
38
realizado o estudo – região Sul do país, podem responder pela predominância de euro-
brasileiros na amostra (93,3%).
Entre os fatores de risco para Doença Arterial Coronariana analisados (Tabela
9), as freqüências de hipertensão arterial (P=0,2405) e história familiar para DAC
(P=0,7126) não diferiram entre os grupos estudados. Este achado reflete as
características dos pacientes que são submetidos ao processo invasivo de
cineangiocoronariografia, e nossos dados não diferem do esperado (III Diretrizes
Brasileiras em Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose, 2001).
A presença de tabagismo foi significativamente menor (P=0,0291) no grupo
controle DM2−DAC− em relação aos demais grupos. A maior prevalência desse fator
de risco modificável em grupos onde a DAC está presente pode sugerir o
envolvimento desse elemento na gênese da alteração vascular. A associação entre o
tabagismo e DAC está bem estabelecida e demonstrada em inúmeros trabalhos
(BAKHRU e ERLINGER, 2005; SHARMA et al., 2005). Face à elevada freqüência de
tabagistas com DAC e, associando às condições sócio-culturais muito favoráveis da
população estudada, é possível sugerir que as campanhas anti-tabaco não estão
atingindo com eficácia este público alvo.
A freqüência significativa de homens com DAC em relação às mulheres era
esperada e reflete a já descrita prevalência desta patologia no sexo masculino (III
Diretrizes Brasileiras em Dislipidemias e Diretriz de Prevenção da Aterosclerose,
2001; RABELO et al., 2003a).
A comparação das médias da variável Idade mostra que o grupo controle
DM2−DAC− é formado por indivíduos com 4 e 6 anos a menos que aqueles dos
grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+, respectivamente.
Os valores médios de Índice de Massa Corporal (IMC, Tabela 10) foram
significativamente maiores (P=0,002) quando os grupos com DAC foram comparados
ao controle (Média: 26,2 e 27,9 versus 23,9 kg/m
2
). Medidas de IMC ≥ 25 kg/m
2
são
correlacionados ao aumento de risco para DAC (FRUCHART et al., 2004). As médias
para IMC > 25 kg/m
2
observadas para os grupos com DAC+ neste estudo, estão em
39
concordância com os trabalhos que relacionam o sobrepeso e a obesidade com as
doenças cardiovasculares (HAWKINS, 2004).
Os valores médios das pressões arteriais sistólica e diastólica não foram
diferentes entre todos os grupos em estudo. O uso agressivo da terapia antihipertensiva
é característica comum dos pacientes que freqüentam os serviços de cardiologia, e
poderia explicar este achado. Mesmo assim, os valores médios superiores a 141 mmHg
observados para a pressão sistólica em todos os grupos estão acima dos valores
preconizados como normais (<130 mmHg) pelas IV Diretrizes Brasileiras de
Hipertensão Arterial.
As concentrações de glicemia em jejum e hemoglobina glicada foram
significativamente diferentes (P<0,001) entre o grupo DM2+DAC+ com relação aos
demais.
A hemoglobina glicada A
1C
é um marcador do controle glicêmico nas 6
semanas anteriores à sua dosagem, permitindo monitorar a adesão do paciente ao
tratamento. As concentrações médias de HbA
1C
foram superiores no grupo
DM2+DAC+ e sugerem um controle inadequado para glicemia (American College of
Endocrinology, 2002; SACKS et al., 2002). Concentrações elevadas da glicose
plasmática, mantidos por longos períodos são responsáveis pelo aumento na glicação
de proteínas resultando em incremento dos eventos coronarianos e trombóticos
(COOPER, 2004).
Entre os componentes do perfil lipídico, Colesterol total, LDL-C, HDL-C e
Triglicérides, apenas os dois últimos apresentaram concentrações séricas
significativamente diferentes (P<0,001) entre o grupo controle e o grupo DM2+DAC+.
As concentrações médias elevadas de Triglicérides de 166 mg/dL (desejável <150
mg/dL) observadas no grupo com DM2 são esperados, uma vez que as alterações
metabólicas associadas à esta patologia favorecem a hipertrigliceridemia. Da mesma
forma, a observada redução nas concentrações médias de HDL-C de 39,8 mg/dL
(desejável > 45 mg/dL) no grupo DM2+ pode ser um reflexo das concentrações
elevadas de Triglicérides que estão associados à redução do HDL-C decorrente da
40
redução do catabolismo das lipoproteínas ricas em Triglicérides, já associadas ao DM2
(RABELO et al., 2003).
As concentrações séricas das apolipoproteínas AI e B não foram diferentes
entre os grupos em estudo.
Concentrações elevadas de Colesterol total, LDL-C e Apolipoproteína B estão
associados à DAC (HOMMA, 2004; TAKAISHI et al., 2004). Os valores médios
observados em todos os grupos estão próximos aos valores de referência para estes
analitos. O uso de medicamentos hipolipemiantes, amplamente utilizados na
cardiologia clínica, e, conseqüentemente, nos pacientes em estudo, pode justificar os
valores para o perfil lipídico próximos aos valores desejáveis.
6.2 VARIABILIDADE GENÉTICA
As freqüências genotípicas para os polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apo
B não foram diferentes entre os grupos em estudo (Tabela 11). Em todos os grupos as
distribuições genotípicas foram similares (P>0,05) àquelas esperadas pelo equilíbrio de
Hardy-Weinberg.
É pertinente ressaltar que a presença do DM2 nos grupos com DAC não causou
diferenças significativas nas freqüências alélicas ou genotípicas dos polimorfismos
XbaI e EcoRI. Este achado é relevante, uma vez que o desenho experimental de vários
estudos similares a este publicados com dados da população brasileira não discrimina
os indivíduos com DM2. Este é o primeiro estudo que associa os polimorfismos XbaI e
EcoRI do gene da apo B com o DAC na presença ou ausência de DM2, em uma
população brasileira.
Para efeitos de comparação com outros dados obtidos da literatura os grupos
DM2−DAC+ e DM2+DAC+ foram unidos em um grupo designado DAC+ (Tabela
12), representando o desenho experimental comumente utilizado em vários estudos.
As freqüências dos alelos dos polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apo B,
em indivíduos com e sem DAC, diferem em populações caucasianas e orientais
(MYANT et al., 1989; RENGES et al., 1991; RENGES et al., 1992). A comparação
41
entre as freqüências alélicas, dos polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apo B deste
estudo com as freqüências de coreanos, obtidas por HONG et al. (2001), mostrou
diferença significativa tanto para o grupo DAC+ (XbaI : χ
2
(1)
= 142,67; P<0,0001 e
EcoRI : χ
2
(1)
= 8,30; P<0,0001), como para o grupo DAC− (XbaI : χ
2
(1)
= 112,07;
P<0,0001 e EcoRI : χ
2
(1)
= 22,51; P<0,0001). Diferenças significativas também foram
verificadas ao comparar as freqüências alélicas XbaI e EcoRI dos grupos DAC+ em
indianos obtidas por PURI et al. (2003) com as deste trabalho (XbaI : χ
2
(1)
= 5,36;
P=0,0206 e EcoRI : χ
2
(1)
= 9,84; P=0,0017). Entre os grupos DAC−, as freqüências dos
alelos X+ e X− encontradas por esses dois grupos de pesquisadores apresentaram
diferença (χ
2
(1)
= 8,62; P=0,0033); e as freqüências dos alelos E+ e E− não mostraram
diferença significativa (EcoRI : χ
2
(1)
= 0,22; P=0,6395).
Em relação aos alelos do polimorfismo XbaI (Tabela 1), a freqüência do alelo
comum X− em caucasianos varia de 0,390 a 0,62 na ausência de DAC, e, de 0,50 a
0,69, em indivíduos com DAC. As freqüências do alelo X− obtidas neste trabalho
(DAC− = 0,60; DAC+ = 0,59) estão dentro desta faixa de variação.
As freqüências dos alelos X+ e X− dos grupos DAC+, não foram
significativamente diferentes (χ
2
(1)
= 0,39; P=0,5331) daquelas encontradas por
SCARTEZINI et al. (2003) para euro-brasileiros; assim como as freqüências dos
alelos X+ e X− dos grupos DAC− também não apresentaram diferenças significativas
(χ
2
(1)
= 1,14; P=0,2860).
Comparando as freqüências alélicas de X+ e X− do grupo DAC+ encontradas
neste estudo, com os dados de MACHADO et al. (2001), não houve diferença
significativa (χ
2
(1)
= 1,31; P=0,2531). O mesmo aconteceu quando as freqüências
encontradas nos controles (N=67) foram comparadas com aquelas do grupo controle
deste trabalho (χ
2
(1)
= 0,14; P=0,7055).
Ao comparar nossos dados com os dados encontrados por SALAZAR et al.
(2000) para o polimorfismo XbaI, os grupos com DAC não mostraram diferenças
significativas (χ
2
(1)
= 1,55; P=0,2138). No entanto, os grupos DAC− (controle), foram
diferentes estatisticamente (χ
2
(1)
= 14,56; P=0,0001). Esta diferença pode estar
42
relacionada ao fato de que a amostra de SALAZAR et al. (2000) ser composta apenas
por mulheres hospitalizadas.
As freqüências dos alelos X+ e X− obtidas por CAVALLI et al. (2000), quando
comparadas àquelas encontradas neste estudo, não mostraram diferenças significativas
entre o grupo com hipercolesterolemia e o grupo DAC+ (χ
2
(1)
= 0,38; P=0,5385), e nem
entre o grupo de normocolesterolêmicos e o grupo DAC− (χ
2
(1)
= 0,01; P=0,9263).
A freqüência alélica do polimorfismo XbaI do gene da apo B dos grupos
controle deste estudo e aquela descrita por CHIODINI et al. (2003) foi diferente (χ
2
(1)
=
37,25, P<0,0001).
Comparando as freqüências dos alelos X+ e X− do grupo DAC− deste estudo,
com as do grupo DAC− descritas por BOEKHOLDT et al. (2003), foram observadas
diferenças significativas (χ
2
(1)
= 4,84; P=0,0278). Esses pesquisadores associaram o
alelo raro X+ com aumento nas concentrações de LDL-Colesterol e Apolipoproteína
B, mas também com uma redução no risco para desenvolvimento de doenças
isquêmicas do coração. Sugeririam, então, que alterações no gene da apo B possam
modificar as propriedades aterogênicas da LDL sem influenciar os fatores de risco
adicionais, ou seja, mudanças estruturais da apo B causariam hipercolesterolemia e
uma LDL modificada, menos aterogênica. TAHRI-DAIZADEH et al. (2004) sugerem
que o polimorfismo XbaI do gene da apo B não tenha efeito isolado, mas, pelo fato de
promover uma mutação silenciosa, pode estar em forte desequilíbrio de ligação com
algum variante biologicamente funcional.
Em relação aos alelos do polimorfismo EcoRI, a literatura mostra que a
freqüência do alelo raro E− em caucasianos varia de 0,15 a 0,25 em controles, e, de
0,19 a 0,30, em indivíduos com DAC (Tabela 2). As freqüências do alelo E− obtidas
neste trabalho (DAC− = 0,16; DAC+ = 0,19) estão dentro desta faixa de variação.
As freqüências dos alelos E+ e E− dos grupos DAC+ deste estudo (Tabela 12),
foram similares (χ
2
(1)
= 0,66; P=0,4174) daquelas encontradas por SCARTEZINI et al.
(2003), assim como as freqüências dos grupos DAC− (χ
2
(1)
= 1, 78; P=0,1824).
43
Comparando as freqüências alélicas de E+ e E− do grupo DAC+, com os dados
de MACHADO et al. (2001), não foi encontrada diferença significativa (χ
2
(1)
= 0,14;
P=0,7039). O mesmo aconteceu quando as freqüências encontradas em seus controles
foram comparadas com aquelas encontradas no grupo controle deste trabalho (χ
2
(1)
=
0,03; P=0,8562). Quando nossos dados foram comparados com os dados obtidos por
SALAZAR et al. (2000), foram observadas diferenças tanto em relação aos grupos
DAC− (χ
2
(1)
= 9,18; P=0,0024), como em relação aos grupos DAC+ (χ
2
(1)
= 6,54;
P=0,0106). Esta diferença pode estar relacionada ao fato de que a amostra de
SALAZAR et al. (2000) ser composta apenas por mulheres hospitalizadas.
Comparando o grupo DAC− deste estudo com o grupo DAC− descrito por
BOEKHOLDT et al. (2003) em sua metanálise com caucasianos, não foi encontrada
diferença significativa (χ
2
(1)
= 1,42; P=0,2333) em relação às freqüências dos alelos E+
e E−. O mesmo ocorreu ao se comparar o grupo DAC− descrito por CHIODINI et al.
(2003) em sua metanálise com caucasianos, com o grupo DAC− deste estudo (χ
2
(1)
=
0,04; P=0,8514).
A Tabela 13 foi elaborada para observar a distribuição de freqüência dos
genótipos XbaI/EcoRI do gene da apo B. A análise dos dados permitiu o estudo de
haplótipos com o programa ARLEQUIN.
A freqüência do haplótipo X−E+ em indivíduos caucasianos na ausência de
DAC varia de 0,34 a 0,47 (MONSALVE et al., 1988; HANSEN et al., 1993;
BENEDICTIS et al., 1997). A freqüência encontrada neste estudo, para o grupo
controle, está dentro destes limites (DAC− = 0,45).
As freqüências dos haplótipos XbaI/EcoRI (Tabela 14) obtidas no presente
estudo não apresentaram diferença significativa entre os grupos DAC+ e DAC−
(P=0,4820). Deve-se ressaltar que o haplótipo X−E+ mostrou diferença entre os
grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+ próxima da significância (χ
2
(1)
= 3,75; P=0,0528).
A freqüência do haplótipo X−E+ do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo
B encontrada por SCARTEZINI et al. (2003) não difere da freqüência encontrada
neste estudo (χ
2
(1)
= 0,01; P=0,9096).
44
A comparação entre o genótipo X−X−/E+E+ (Tabela 15), com os demais
genótipos XbaI/EcoRI do gene da apo B apresentou diferença significativa entre os
grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+ (χ
2
(1)
= 6,43; P= 0,0112).
SCARTEZINI et al. (2003) encontraram diferenças significativas (χ
2
(1)
= 6,27;
P=0,012) entre as freqüências do genótipo X−X−/E+E+ e os demais genótipos
XbaI/EcoRI do gene da apo B para os grupos DAC+ e DAC−. Com base neste achado,
estes pesquisadores sugerem o uso do genótipo X−X−/E+E+ do polimorfismo
XbaI/EcoRI gene da apo B como possível marcador de risco para DAC.
A presença ou ausência de DM2 na amostra de SCARTEZINI et al. (2003) não
foi critério para a classificação dos seus grupos. Os grupos DAC+ e DAC−
caracterizados por estes autores continham pacientes com DM2 na proporção de 16% e
8%, respectivamente.
Comparando a freqüência do genótipo X−X−/E+E+ do presente estudo com
aquela descrita por SCARTEZINI et al. (2003), não foi verificada diferença
significativa (χ
2
(1)
= 1,55; P=0,2130).
Nossos dados sugerem que a presença do Diabetes mellitus tipo 2 associado à
Doença Arterial Coronariana pode ser o determinante responsável pela diferença
significativa na freqüência genotípica entre os grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+. O
DM2 e a DAC são condições associadas à herança multifatorial, onde a combinação de
um ou múltiplos genes e o meio ambiente contribuem para o desenvolvimento de uma
patologia. Nestes casos, o risco de desenvolver a patologia pode depender do sexo, da
etnia, do histórico familiar, número de parentes afetados e grau de parentesco
(McCARTHY, 2004; NORDLIE et al., 2005; AGARWAL e MOORCHUNG, 2005).
Portanto, a presença do DM2 pode ser um fator diferencial na caracterização
genotípica dos polimorfismos estudados neste trabalho.
Futuros estudos que permitam diferenciar características peculiares nos
indivíduos com DM2 podem ressaltar a associação entre a variabilidade do gene da
apo B e a Doença Arterial Coronariana.
45
Em síntese, os dados obtidos das freqüências genotípicas dos polimorfismos
XbaI e EcoRI do gene da apo B não foram diferentes entre os grupos DM2−DAC+
(controle), DM2−DAC+ e DM2+DAC+; e a freqüência do genótipo X−X−/E+E+ foi
diferente entre os grupos DM2+DAC+ e DM2−DAC+, permitindo sugerir que este
genótipo pode ser utilizado como marcador adicional de risco em estudos
populacionais.
46
7 CONCLUSÕES
Verificou-se maior prevalência do sexo masculino e de Tabagismo, assim como
média superior das variáveis Idade e IMC, nos grupos de indivíduos com DAC
(DM2−DAC+ e DM2+DAC+).
O grupo DM2+DAC+ apresentou concentrações séricas de triglicérides com
médias superiores às do grupo controle (P<0,001), e concentrações séricas de
HDL-C com médias inferiores às do grupo controle (P=0,001).
Não houve diferença significativa (P>0,05) entre as freqüências alélicas e
genotípicas dos polimorfismos XbaI e EcoRI do gene da apo B quando
comparados os 3 grupos em estudo (DM2−DAC−, DM2−DAC+ e DM2+DAC+).
O genótipo X−X−/E+E+ do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B
comparado aos demais genótipos, mostrou diferença significativa (χ
2
(1)
=6,43;
P=0,0112) entre os grupos DM2−DAC+ e DM2+DAC+.
O genótipo X−X−/E+E+ do polimorfismo XbaI/EcoRI do gene da apo B pode ser
utilizado como marcador adicional de risco para DAC em indivíduos portadores
de Diabetes mellitus tipo 2.
47
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55
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56
ANEXOS
ANEXO I – FICHA DE COLETA DE DADOS DO PACIENTE
Caracterização do Paciente Nº registro
interno
Data
Nome:
____/___/__
_
Dados clínicos
N Dados Observações
1 Sexo ( 1 ) = Masculino ( 2 ) = Feminino
2 Idade [ ] anos
3 Peso [ ] kg
4 Altura [ ] cm
5 IMC Não preencher
6 Pressão Arterial (PA) [________/_______] mmHg
7 Tabagismo ( 1 ) = Nunca fumou
( 2 ) = Ex-fumante
( 3 ) = Fumante
8
Diabetes mellitus
( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não
Tipo do diabetes: ( 1 ) = Tipo 1; ( 2 ) = Tipo 2;
( 3 ) = outro
Tempo do diagnóstico do Diabetes mellitus: [ ] anos
09 História familiar de
Doença Arterial
Coronária (DAC)
Pelo menos um parente de primeiro grau foi diagnosticado
com DAC até os 55 anos (homens) ou até 65 anos (mulheres)
( 1 )= Sim; ( 2 ) = Não
10 História clínica
Insuficiência Renal: ( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não
Tempo da doença: [ ] anos
Infarto: ( 1 ) = Sim ( 2 ) = Não
Tempo de ocorrência do evento: [ ]/(meses) ou (anos)
Anotar outros dados relevantes:
11 Medicamentos: Hipoglicemiantes: ( 1 ) = Sim; ( 2 ) = Não
Quais:
b) Hipolipemiantes: ( 1 ) = Sim; ( 2 ) = Não
Quais:
c) Anti-hipertensivos: (1) = Sim; (2) = Não
Quais:
Outros:
12 Dados do cateterismo Não é necessário preencher
57
ANEXO II – SEQUÊNCIA DE BASES DO DNA DO EXON 26 DO GENE DA
APO B
GenBank Nº AH003569 [Human apolipoprotein B-100 (apoB) gene]
Exon 26: nucleotídeos 3412 – 10983
O início e o final do exon estão identificados em letra azul e setas em negro. A
seqüência amplificada (710 bp) em destaque e marcada em negrito. O sítio de
anelamento dos iniciadores está marcado em vermelho. O sítio de restrição da enzima
XbaI está identificado com (↓) e o nucleotídeo mutado entre parênteses.
3361 tctggaaatg tactgcttaa tttaaccaat gtcttttcat ttttatgtta ggatctggag
3421 aaacaacata tgaccacaag aatacgttca cactatcatg tgatgggtct ctacgccaca
3481 aatttctaga ttcgaatatc aaattcagtc atgtagaaaa acttggaaac aacccagtct
3541 caaaaggttt actaatattc gatgcatcta gttcctgggg accacagatg tctgcttcag
3601 ttcatttgga ctccaaaaag aaacagcatt tgtttgtcaa agaagtcaag attgatgggc
3661 agttcagagt ctcttcgttc tatgctaaag gcacatatgg cctgtcttgt cagagggatc
3721 ctaacactgg ccggctcaat ggagagtcca acctgaggtt taactcctcc tacctccaag
3781 gcaccaacca gataacagga agatatgaag atggaaccct ctccctcacc tccacctctg
3841 atctgcaaag tggcatcatt aaaaatactg cttccctaaa gtatgagaac tacgagctga
3901 ctttaaaatc tgacaccaat gggaagtata agaactttgc cacttctaac aagatggata
3961 tgaccttctc taagcaaaat gcactgctgc gttctgaata tcaggctgat tacgagtcat
4021 tgaggttctt cagcctgctt tctggatcac taaattccca tggtcttgag ttaaatgctg
4081 acatcttagg cactgacaaa attaatagtg gtgctcacaa ggcgacacta aggattggcc
4141 aagatggaat atctaccagt gcaacgacca acttgaagtg tagtctcctg gtgctggaga
4201 atgagctgaa tgcagagctt ggcctctctg gggcatctat gaaattaaca acaaatggcc
4261 gcttcaggga acacaatgca aaattcagtc tggatgggaa agccgccctc acagagctat
4321 cactgggaag tgcttatcag gccatgattc tgggtgtcga cagcaaaaac attttcaact
4381 tcaaggtcag tcaagaagga cttaagctct caaatgacat gatgggctca tatgctgaaa
4441 tgaaatttga ccacacaaac agtctgaaca ttgcaggctt atcactggac ttctcttcaa
4501 aacttgacaa catttacagc tctgacaagt tttataagca aactgttaat ttacagctac
4561 agccctattc tctggtaact actttaaaca gtgacctgaa atacaatgct ctggatctca
4621 ccaacaatgg gaaactacgg ctagaacccc tgaagctgca tgtggctggt aacctaaaag
4681 gagcctacca aaataatgaa ataaaacaca tctatgccat ctcttctgct gccttatcag
4741 caagctataa agcagacact gttgctaagg ttcagggtgt ggagtttagc catcggctca
4801 acacagacat cgctgggctg gcttcagcca ttgacatgag cacaaactat aattcagact
4861 cactgcattt cagcaatgtc ttccgttctg taatggcccc gtttaccatg accatcgatg
4921 cacatacaaa tggcaatggg aaactcgctc tctggggaga acatactggg cagctgtata
4981 gcaaattcct gttgaaagca gaacctctgg catttacttt ctctcatgat tacaaaggct
5041 ccacaagtca tcatctcgtg tctaggaaaa gcatcagtgc agctcttgaa cacaaagtca
5101 gtgccctgct tactccagct gagcagacag gcacctggaa actcaagacc caatttaaca
5161 acaatgaata cagccaggac ttggatgctt acaacactaa agataaaatt ggcgtggagc
5221 ttactggacg aactctggct gacctaactc tactagactc cccaattaaa gtgccacttt
5281 tactcagtga gcccatcaat atcattgatg ctttagagat gagagatgcc gttgagaagc
5341 cccaagaatt tacaattgtt gcttttgtaa agtatgataa aaaccaagat gttcactcca
5401 ttaacctccc attttttgag accttgcaag aatattttga gaggaatcga caaaccatta
5461 tagttgtact ggaaaacgta cagagaaacc tgaagcacat caatattgat caatttgtaa
5521 gaaaatacag agcagccctg ggaaaactcc cacagcaagc taatgattat ctgaattcat
5581 tcaattggga gagacaagtt tcacatgcca aggagaaact gactgctctc acaaaaaagt
5641 atagaattac agaaaatgat atacaaattg cattagatga tgccaaaatc aactttaatg
5701 aaaaactatc tcaactgcag acatatatga tacaatttga tcagtatatt aaagatagtt
5761 atgatttaca tgatttgaaa atagctattg ctaatattat tgatgaaatc attgaaaaat
5821 taaaaagtct tgatgagcac tatcatatcc gtgtaaattt agtaaaaaca atccatgatc
5881 tacatttgtt tattgaaaat attgatttta acaaaagtgg aagtagtact gcatcctgga
5941 ttcaaaatgt ggatactaag taccaaatca gaatccagat acaagaaaaa ctgcagcagc
6001 ttaagagaca catacagaat atagacatcc agcacctagc tggaaagtta aaacaacaca
6061 ttgaggctat tgatgttaga gtgcttttag atcaattggg aactacaatt tcatttgaaa
6121 gaataaatga cgttcttgag catgtcaaac actttgttat aaatcttatt ggggattttg
6181 aagtagctga gaaaatcaat gccttcagag ccaaagtcca tgagttaatc gagaggtatg
6241 aagtagacca acaaatccag gttttaatgg ataaattagt agagttggcc caccaataca
58
6301 agttgaa[gga gactattcag aagctaagca atgtcctaca acaagttaag ataaaagatt
6361 actttgagaa attggttgga tttattgatg atgctgtcaa gaagcttaat gaattatctt
6421 ttaaaacatt cattgaagat gttaacaaat tccttgacat gttgataaag aaattaaagt
6481 catttgatta ccaccagttt gtagatgaaa ccaatgacaa aatccgtgag gtgactcaga
6541 gactcaatgg tgaaattcag gctctggaac taccacaaaa agctgaagca ttaaaactgt
6601 ttttagagga aaccaaggcc acagttgcag tgtatctgga aagcctacag gacaccaaaa
6661 taaccttaat catcaattgg ttacaggagg ctttaagttc agcatctttg gctcacatga
6721 aggccaaatt ccgagagacc(t)↓ctaga
agata cacgagaccg aatgtatcaa atggacattc
6781 agcaggaact tcaacgatac ctgtctctgg taggccaggt ttatagcaca cttgtcacct
6841 acatttctga ttggtggact cttgctgcta agaaccttac tgactttgca gagcaatatt
6901 ctatccaaga ttgggctaaa cgtatgaaag cattggtaga gcaagggttc actgttcctg
6961 aaatcaagac catccttggg accatgcctg cctttgaagt cagtcttcag gctcttc
]aga
7021 aagctacctt ccagacacct gattttatag tccccctaac agatttgagg attccatcag
7081 ttcagataaa cttcaaagac ttaaaaaata taaaaatccc atccaggttt tccacaccag
7141 aatttaccat ccttaacacc ttccacattc cttcctttac aattgacttt gtagaaatga
7201 aagtaaagat catcagaacc attgaccaga tgctgaacag tgagctgcag tggcccgttc
7261 cagatatata tctcagggat ctgaaggtgg aggacattcc tctagcgaga atcaccctgc
7321 cagacttccg tttaccagaa atcgcaattc cagaattcat aatcccaact ctcaacctta
7381 atgattttca agttcctgac cttcacatac cagaattcca gcttccccac atctcacaca
7441 caattgaagt acctactttt ggcaagctat acagtattct gaaaatccaa tctcctcttt
7501 tcacattaga tgcaaatgct gacataggga atggaaccac ctcagcaaac gaagcaggta
7561 tcgcagcttc catcactgcc aaaggagagt ccaaattaga agttctcaat tttgattttc
7621 aagcaaatgc acaactctca aaccctaaga ttaatccgct ggctctgaag gagtcagtga
7681 agttctccag caagtacctg agaacggagc atgggagtga aatgctgttt tttggaaatg
7741 ctattgaggg aaaatcaaac acagtggcaa gtttacacac agaaaaaaat acactggagc
7801 ttagtaatgg agtgattgtc aagataaaca atcagcttac cctggatagc aacactaaat
7861 acttccacaa attgaacatc cccaaactgg acttctctag tcaggctgac ctgcgcaacg
7921 agatcaagac actgttgaaa gctggccaca tagcatggac ttcttctgga aaagggtcat
7981 ggaaatgggc ctgccccaga ttctcagatg agggaacaca tgaatcacaa attagtttca
8041 ccatagaagg acccctcact tcctttggac tgtccaataa gatcaatagc aaacacctaa
8101 gagtaaacca aaacttggtt tatgaatctg gctccctcaa cttttctaaa cttgaaattc
8161 aatcacaagt cgattcccag catgtgggcc acagtgttct aactgctaaa ggcatggcac
8221 tgtttggaga agggaaggca gagtttactg ggaggcatga tgctcattta aatggaaagg
8281 ttattggaac tttgaaaaat tctcttttct tttcagccca gccatttgag atcacggcat
8341 ccacaaacaa tgaagggaat ttgaaagttc gttttccatt aaggttaaca gggaagatag
8401 acttcctgaa taactatgca ctgtttctga gtcccagtgc ccagcaagca agttggcaag
8461 taagtgctag gttcaatcag tataagtaca accaaaattt ctctgctgga aacaacgaga
8521 acattatgga ggcccatgta ggaataaatg gagaagcaaa tctggatttc ttaaacattc
8581 ctttaacaat tcctgaaatg cgtctacctt acacaataat cacaactcct ccactgaaag
8641 atttctctct atgggaaaaa acaggcttga aggaattctt gaaaacgaca aagcaatcat
8701 ttgatttaag tgtaaaagct cagtataaga aaaacaaaca caggcattcc atcacaaatc
8761 ctttggctgt gctttgtgag tttatcagtc agagcatcaa atcctttgac aggcattttg
8821 aaaaaaacag aaacaatgca ttagattttg tcaccaaatc ctataatgaa acaaaaatta
8881 agtttgataa gtacaaagct gaaaaatctc acgacgagct ccccaggacc tttcaaattc
8941 ctggatacac tgttccagtt gtcaatgttg aagtgtctcc attcaccata gagatgtcgg
9001 cattcggcta tgtgttccca aaagcagtca gcatgcctag tttctccatc ctaggttctg
9061 acgtccgtgt gccttcatac acattaatcc tgccatcatt agagctgcca gtccttcatg
9121 tccctagaaa tctcaagctt tctcttccag atttcaagga attgtgtacc ataagccata
9181 tttttattcc tgccatgggc aatattacct atgatttctc ctttaaatca agtgtcatca
9241 cactgaatac caatgctgaa ctttttaacc agtcagatat tgttgctcat ctcctttctt
9301 catcttcatc tgtcattgat gcactgcagt acaaattaga gggcaccaca agattgacaa
9361 gaaaaagggg attgaagtta gccacagctc tgtctctgag caacaaattt gtggagggta
9421 gtcataacag tactgtgagc ttaaccacga aaaatatgga agtgtcagtg gcaacaacca
9481 caaaagccca aattccaatt ttgagaatga atttcaagca agaacttaat ggaaatacca
9541 agtcaaaacc tactgtctct tcctccatgg aatttaagta tgatttcaat tcttcaatgc
9601 tgtactctac cgctaaagga gcagttgacc acaagcttag cttggaaagc ctcacctctt
9661 acttttccat tgagtcatct accaaaggag atgtcaaggg ttcggttctt tctcgggaat
9721 attcaggaac tattgctagt gaggccaaca cttacttgaa ttccaagagc acacggtctt
9781 cagtgaagct gcagggcact tccaaaattg atgatatctg gaaccttgaa gtaaaagaaa
9841 attttgctgg agaagccaca ctccaacgca tatattccct ctgggagcac agtacgaaaa
9901 accacttaca gctagagggc ctctttttca ccaacggaga
acatacaagc aaagccaccc
9961 tggaactctc tccatggcaa atgtcagctc ttgttcaggt ccatgcaagt cagcccagtt
10021 ccttccatga tttccctgac cttggccagg aagtggccct gaatgctaac actaagaacc
10081 agaagatcag atggaaaaat gaagtccgga ttcattctgg gtctttccag agccaggtcg
59
10141 agctttccaa tgaccaagaa aaggcacacc ttgacattgc aggatcctta gaaggacacc
10201 taaggttcct caaaaatatc atcctaccag tctatgacaa gagcttatgg gatttcctaa
10261 agctggatgt aaccaccagc attggtagga gacagcatct tcgtgtttca actgcctttg
10321 tgtacaccaa aaaccccaat ggctattcat tctccatccc tgtaaaagtt ttggctgata
10381 aattcattat tcctgggctg aaactaaatg atctaaattc agttcttgtc atgcctacgt
10441 tccatgtccc atttacagat cttcaggttc catcgtgcaa acttgacttc agagaaatac
10501 aaatctataa gaagctgaga acttcatcat ttgccctcaa cctaccaaca ctccccgagg
10561 taaaattccc tgaagttgat gtgttaacaa aatattctca accagaagac tccttgattc
10621 ccttttttga gataaccgtg cctgaatctc agttaactgt gtcccagttc acgcttccaa
10681 aaagtgtttc agatggcatt gctgctttgg atctaaatgc agtagccaac aagatcgcag
10741 actttgagtt gcccaccatc atcgtgcctg agcagaccat tgagattccc tccattaagt
10801 tctctgtacc tgctggaatt gtcattcctt cctttcaagc actgactgca cgctttgagg
10861 tagactctcc cgtgtataat gccacttgga gtgccagttt gaaaaacaaa gcagattatg
10921 ttgaaacagt cctggattcc acatgcagct caaccgtaca gttcctagaa tatgaactaa
10981 atggtaagaa atatcctgcc tcctctccta gatactgtat attttcaatg agagttatga
60
ANEXO III – SEQUÊNCIA DE BASES DO DNA DO EXON 29 DO GENE DA
APO B
GenBank Nº AH003569 [Human apolipoprotein B-100 (apoB) gene]
Exon 29: nucleotídeos 12730 – 14334
O início e o final do exon estão identificados em letra azul e setas em negro. A
seqüência amplificada (480 bp) em destaque e marcada em negrito. O sítio de
anelamento dos iniciadores está marcado em vermelho. O sítio de restrição da enzima
EcoRI está identificado com (↓) e o nucleotídeo mutado entre parênteses.
12721 tctgtttagt cctctccaga taaaaaactc accatattca aaactgagtt gagggtccgg
12781 gaatctgatg aggaaactca gatcaaagtt aattgggaag aagaggcagc ttctggcttg
12841 ctaacctctc tgaaagacaa cgtgcccaag gccacagggg tcctttatga ttatgtcaac
12901 aagtaccact gggaacacac agggctcacc [ctgagagaag tgtcttcaaa g
ctgagaaga
12961 aatctgcaga acaatgctga gtgggtttat caaggggcca ttaggcaaat tgatgatatc
13021 gacgtgaggt tccagaaagc agccagtggc accactggga cctaccaaga gtggaaggac
13081 aaggcccaga atctgtacca ggaactgttg actcaggaag gccaagccag tttccaggga
13141 ctcaaggata acgtgtttga tggcttggta cgagttactc aag(a)↓aattcca tatgaaagtc
13201 aagcatctga ttgactcact cattgatttt ctgaacttcc ccagattcca gtttccgggg
13261 aaacctggga tatacactag ggaggaactt tgcactatgt tcataaggga ggtagggacg
13321 gtactgtccc aggtatattc gaaagtccat aatggttcag aaatactgtt ttcctatttc
13381 caagacctag tgattacact tcctttcgag]
ttaaggaaac ataaactaat agatgtaatc
13441 tcgatgtata gggaactgtt gaaagattta tcaaaagaag cccaagaggt atttaaagcc
13501 attcagtctc tcaagaccac agaggtgcta cgtaatcttc aggacctttt acaattcatt
13561 ttccaactaa tagaagataa cattaaacag ctgaaagaga tgaaatttac ttatcttatt
13621 aattatatcc aagatgagat caacacaatc ttcaatgatt atatcccata tgtttttaaa
13681 ttgttgaaag aaaacctatg ccttaatctt cataagttca atgaatttat tcaaaacgag
13741 cttcaggaag cttctcaaga gttacagcag atccatcaat acattatggc ccttcgtgaa
13801 gaatattttg atccaagtat agttggctgg acagtgaaat attatgaact tgaagaaaag
13861 atagtcagtc tgatcaagaa cctgttagtt gctcttaagg acttccattc tgaatatatt
13921 gtcagtgcct ctaactttac ttcccaactc tcaagtcaag ttgagcaatt tctgcacaga
13981 aatattcagg aatatcttag catccttacc gatccagatg gaaaagggaa agagaagatt
14041 gcagagcttt ctgccactgc tcaggaaata attaaaagcc aggccattgc gacgaagaaa
14101 ataatttctg attaccacca gcagtttaga tataaactgc aagatttttc agaccaactc
14161 tctgattact atgaaaaatt tattgctgaa tccaaaagat tgattgacct gtccattcaa
14221 aactaccaca catttctgat atacatcacg gagttactga aaaagctgca atcaaccaca
14281 gtcatgaacc cctacatgaa gcttgctcca ggagaactta ctatcatcct ctaatttttt
14341 aaaagaaatc ttcatttatt cttcttttcc aattgaactt tcacatagca cagaaaaaat
61
ANEXO IV – VALORES DE REFERÊNCIA PARA ANÁLISES
LABORATORIAIS
ANALITOS MNEMÔNICO
VALORES DE
REFERÊNCIA
REFERÊNCIAS
Hemoglobina
Glicada A
1C
(%)
HbA
1C
4,5 – 6,5%
Bio Rad – Variant (HPLC)
Glicose (mg/dL)
GLU 60 - 99 American Diabetes Association, 2005.
Colesterol total
(mg/dL)
COL Desejável < 200
Limítrofe 200 - 239
Elevado > 240
HDL-colesterol
(mg/dL)
HDL-c > 40
>45 (diabéticos)
> 60 (desejável)
LDL-colesterol
(mg/dL)
LDL-C < 100 Ótimo
100 – 129 Desejável
130 – 159 Limítrofe
160 – 189 Alto
≥ 190 Muito alto
Triglicérides
(mg/dL)
TG < 150 Ótimo
150 – 200 Limítrofe
200 – 499 Alto
≥ 500 Muito alto
III Diretrizes Brasileiras em
Dislipidemias, 2001.
Apolipoproteína
AI (mg/dL)
apoAI ♂ 104 - 202
♀ 108 - 225
Apolipoproteína
B (mg/dL)
apoB ♂ 66 – 133
♀ 60 - 117
Roche Diagnostics – Hitachi 912
O princípio do ensaio de hemoglobina glicada A
1c
(Variant – Bio Rad) pode ser acessado em: www.bio-rad.com/
Os princípios dos ensaios em química seca – glicose, colesterol total e triglicérides (Vitros 750 -
Johnson&Johnson) podem ser acessados em: www.orthoclinical.com/Docs/USSearchPage.aspx?Language=ALL
Os princípios dos ensaios de HDL-colesterol e LDL-colesterol e das apolipoproteínas AI e B (Hitachi 912 -
Roche Diagnostics) podem ser acessados em: www.roche-diagnostics.com/
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