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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA VEGETAL
TALÍA DA COSTA
CRESCIMENTO IN VITRO, ACLIMATIZAÇÃO E
CONTEÚDO DE DIOSGENINA DE DIFERENTES
SOMACLONES DE Dioscorea composita HEMSL.
(DIOSCOREACEAE)
FLORIANÓPOLIS, SC
2006
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ii
TALÍA DA COSTA
CRESCIMENTO IN VITRO, ACLIMATIZAÇÃO E
CONTEÚDO DE DIOSGENINA DE DIFERENTES
SOMACLONES DE Dioscorea composita HEMSL.
(DIOSCOREACEAE)
Orientadora: Dra. Ana Maria Viana
Co-orientador: Dr. Edison Paulo Chu
FLORIANÓPOLIS, SC
2006
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Vegetal da
Universidade Federal de Santa Catarina,
como parte dos requisitos para a obtenção
do título de Mestre em Biologia Vegetal.
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iii
Costa, Talía da
Crescimento in vitro, aclimatização e conteúdo de diosgenina de diferentes somaclones de
Dioscorea composita Hemsl. (Dioscoreaceae). / Florianópolis, 2006.
f. 150; grafs, tabs, il.
Orientadora: Dra. Ana Maria Viana
Co-orientador: Dr. Edison Paulo Chu
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas.
Bibliografia: f. 150.
1. Dioscorea composita; 2. Cultura in vitro; 3. Microtubérculos; 4. Crescimento; 5. Diosgenina; 6.
Carboidratos.
iv
TALÍA DA COSTA
CRESCIMENTO IN VITRO, ACLIMATIZAÇÃO E CONTEÚDO DE DIOSGENINA
DE DIFERENTES SOMACLONES DE Dioscorea composita HEMSL.
(DIOSCOREACEAE)
______________________________ _______________________________
Prof. Dra. Ana Maria Viana Prof. Dr. Edison Paulo Chu
Orientadora/ CCB–UFSC Co-orientador/ Instituto de Botânica, SP
________________________________ __________________________________
Prof. Dra. Vetúria Lopes de Oliveira Prof. Dr. Gilmar Roberto Zaffari
Avaliadora/ CCB–UFSC Avaliador/ CTTMAR–UNIVALI/ EPAGRI
______________________________
Prof. Dr. Ênio Pedrotti
Suplente/ CCA-UFSC
FLORIANÓPOLIS, SC
2006
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Biologia Vegetal da
Universidade Federal de Santa Catarina
como parte dos requisitos para a obtenção
do título de Mestre em Biologia Vegetal.
v
Ao meu pai Liba e
minha mãe Zequinha
por serem minhas fontes
inspiradoras e por todo o amor,
Dedico.
vi
De coração agradeço
A Deus, por tudo o que é de mais sagrado;
Aos meus pais, Libório da Costa e Maria José Vieira da Costa pela oportunidade do
estudo, por acreditarem sempre em mim apoiando-me em todas as minhas decisões, por
superarmos juntos a distância física desses dois anos, pela amizade e por todo o amor
oferecido, base de nossa relação;
À família “da Costa Saraiva”: minha irmã Taísa pela energia contagiante que ela
irradia, por todas as nossas conversas e também por me hospedar tantas vezes lá em São
Paulo. Meu cunhado Fernando por tantas idas e vindas ao Instituto de Botânica em São Paulo
conseguindo fazer do trânsito algo irrelevante diante de tanta conversa boa e a minha sobrinha
Maria Paula (2 aninhos!) pelos seus sorridentes pedidos irrecusáveis (“Quer jogar bola Tati?
Quer, né?”) que me fizeram ver o mundo maravilhoso que tinha lá fora;
A toda a minha família que me apoiou nesta nova etapa de minha vida e que soube
reclamar com carinho a minha ausência, especialmente à tia Nida pelas palavras amigas,
principalmente nesta fase de finalização da dissertação e à tia Lila pelos domingos de oração;
Às amizades que fiz durante esses dois anos de mestrado, as quais me proporcionaram
crescimento profissional e pessoal diante dessa diversificação de regionalidades, em especial
à Deisy Regina Tres por compartilhar momentos maravilhosos, mostrando-me sempre o lado
positivo de tudo o que acontece, por virar madrugada estudando comigo e por ficar analisando
experimento noite adentro e também em alguns sábados de sol, e a Daniela Viviani pelas
longas conversas no laboratório, pelo sorriso constante e pelo auxílio (tabelas, contagens,
saquinhos... ufa!) fundamental, tornando divertido nossos dias de trabalho;
À profª Dra. Ana Maria Viana pelo aceite da orientação;
vii
Ao profº Dr. Edison Paulo Chu pela co-orientação, pela disponibilização de recursos
para o desenvolvimento de parte da dissertação, além do incentivo pessoal presente nas
mensagens trocadas por e-mail;
À profª Dra. Áurea Maria Randi por todas as nossas conversas;
À profª Dra. Marisa Santos e à amiga Tagiane Arioli pelo auxílio e disponibilização de
material para a realização das análises anatômicas;
À profª Dra. Vetúria Lopes de Oliveira por ceder tão gentilmente a casa de vegetação,
possibilitando dar continuidade aos experimentos;
Aos funcionários e aos amigos do Instituto de Botânica do Estado de São Paulo, Seção
de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, que colaboraram em parte das atividades laboratoriais,
em especial aos amigos do “alojas BBB” que fizeram do meu dia-a-dia, no alojamento, algo
extremamente especial;
À Vera Lucia de Mello Araújo Zapelini, secretária do curso de Pós-graduação em
Biologia Vegetal, pela disposição em prestar todo e qualquer tipo de serviço com a graça de
sempre e
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado.
viii
“Coragem e Fé Representam Metade do
Caminho da Vitória.
Determinação, Esforço e Perseverança
Completam o Resto do Caminho”
Masaharu Taniguchi
ix
CRESCIMENTO IN VITRO, ACLIMATIZAÇÃO E CONTEÚDO DE DIOSGENINA DE
DIFERENTES SOMACLONES DE Dioscorea composita HEMSL. (DIOSCOREACEAE)
RESUMO
As populações naturais de Dioscorea composita Hemsl. estão se tornando raras, devido ao
extrativismo predatório ocasionado pela importância da diosgenina como precursor de
compostos esteroidais. Plantas de cinco somaclones (S1, S2, S3, S4, S5), regeneradas a partir
de um calo, produzido pela cultura de embrião zigótico, foram analisadas quanto ao
crescimento in vitro e conteúdo de carboidratos e de diosgenina em diferentes condições de
cultivo e após a aclimatização. Ramos foram formados em todos os somaclones na primeira
semana de cultivo, na ausência de reguladores de crescimento. A rizogênese iniciou-se a partir
da segunda semana e aumentou até a última semana de cultivo. O somaclone S4 apresentou a
maior percentagem de formação de ramos e de raízes e o S2 a menor. Provavelmente como
conseqüência, as plantas deste somaclone apresentaram a menor percentagem de
sobrevivência durante a aclimatização. Visando avaliar o efeito dos reguladores de
crescimento sobre o crescimento dos somaclones, 5 µM de auxinas (ANA e AIB), citocininas
(BAP e 2iP) e giberelina (GA
3
) foram adicionados ao meio de cultura. As citocininas e GA
3
inibiram o crescimento da parte aérea de alguns somaclones. Todos os reguladores de
crescimento foram eficientes em promover o crescimento dos microtubérculos, mas o
somaclone S2 apresentou o maior incremento na presença de auxinas e citocininas. Na
presença de GA
3
, o mesmo resultado foi observado para S5. O ANA aumentou o sistema
radicular nos somaclones. Diferentes concentrações de GA
3
não induziram diferenças nas
massas secas dos microtubérculos, mas reduziram a percentagem de formação de
microtubérculos pequenos e aumentaram as percentagens de microtubérculos maiores que
201mg. Para obter maior proporção de microtubérculos com massa seca superior a 201 mg o
tempo de permanência das plantas, em meio de cultura contendo GA
3
, foi de 15 e 30 dias para
o somaclone S1 e 15 dias para o S4. Para o melhor crescimento da parte aérea, esses tempos
foram de 30 e 45 dias para S1, não influenciando o S4. A combinação do GA
3
com diferentes
concentrações de ANA aumentou a senescência dos somaclones, especialmente na presença
de 5 µM, não aumentou a massa seca dos microtubérculos, mas aumentou a proporção de
microtubérculos com massa seca maior. A presença de 2,73 mM e 4,10 mM de glutamina e 5
µM de GA
3
não promoveu o aumento da massa seca da parte aérea ou dos microtubérculos,
contudo aumentou a proporção de microtubérculos com massas secas superiores a 100 mg.
Em todos os somaclones diosgenina e colesterol estiveram presentes. O conteúdo de
diosgenina dos tubérculos das plantas aclimatizadas foi maior no somaclone S3, que
apresentou também maior conteúdo de carboidratos. Para as plantas cultivadas in vitro, o
conteúdo de diosgenina foi maior nos microtubérculos das plantas cultivadas com GA
3
e na
parte aérea das plantas cultivadas com ANA. Entretanto, o maior conteúdo de carboidratos foi
observado na presença de auxinas.
Palavras-chave: Dioscorea composita, cultura in vitro, microtubérculos, crescimento,
diosgenina, carboidratos.
x
IN VITRO GROWTH, ACCLIMATIZATION AND DIOSGENIN CONTENT OF
DIFFERENT SOMACLONES OF Dioscorea composita HEMSL. (DIOSCOREACEAE)
ABSTRACT
Natural populations of Dioscorea composita Hemsl. are becoming rare due to the predatory
exploration caused by the importance of the diosgenin as precursor of steroidal compounds.
Plants of five somaclones (S1, S2, S3, S4, S5), regenerated from one callus, produced by
zygotic embryo culture were analyzed concerning their in vitro growth, carbohydrate and
diosgenin content under different culture conditions and after acclimatization. Shoots were
formed in all somaclones in the first week of culture in the absence of growth regulators.
Rhizogenesis started in the second week and increased until the last week of culture.
Somaclone S4 showed the highest percentage of shoots and roots and S2 the smallest.
Probably as a consequence the plants of somaclone S2 showed the smallest survival
percentage during acclimatization. Aiming to assess the effect of growth regulators on growth
of the somaclones 5 µM auxins (NAA and IBA), cytokinins (BAP and 2iP) and gibberellin
(GA
3
) were added to the culture medium. Cytokinins and GA
3
inhibited the growth of the
aerial parts of some somaclones. All growth regulators were efficient to promote the
microtuber growth but somaclone S2 showed the largest increment in the presence of auxins
and cytokinins. In the presence of GA
3
, the same result was observed for S5. NAA increased
the root system of the somaclones. Different concentration of GA
3
did not induce differences
in the microtuber dry masses, but was necessary to reduce the percentage of formation of
smaller microtubers and increased the percentage of microtubers larger than 201 mg. To
obtain the higher proportion of microtubers with dry mass superior than 201 mg the time of
permanence of plants in the culture medium with GA
3
was of 15 and 30 days for somaclone
S1 and 15 days for S4. For the best growth of the aerial part, those times were of 30 and 45
days for S1, not influencing the S4. The combination of GA
3
with different concentration of
NAA increased the somaclones senescence, especially in the presence of 5 µM, did not
increase the microtubers dry mass, but increased the proportion of microtubers with the
largest dry mass. The presence 2.73 mM and 4.10 mM of glutamine and 5 µM of GA
3
did not
promote neither the aerial dry mass or the microtuber dry mass, however increased the
proportion of microtubers dry masses higher than 100 mg. In all somaclones diosgenin and
cholesterol were present. The content of diosgenin in tubers of acclimatized plants was higher
in the somaclone S3 which also had the higher carbohydrate content. For the in vitro grown
plants the diosgenin content was higher in the microtuber of plants cultured with GA
3
and in
the aerial part of plants cultured with NAA. However, the higher carbohydrate content was
observed in the presence of auxins.
Keywords: Dioscorea composita, in vitro culture, microtuber, growth, diosgenin,
carbohydrate.
xi
SUMARIO
RESUMO ..................................................................................................................................ix
ABSTRACT ...............................................................................................................................x
INTRODUÇÃO..........................................................................................................................1
OBJETIVOS...............................................................................................................................2
OBJETIVO GERAL:..................................................................................................................2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ....................................................................................................3
1. CAPÍTULO 1 .........................................................................................................................4
1.1. REVISÃO DE LITERATURA ...........................................................................................4
1.1.1 Características da Família Dioscoreaceae......................................................................4
1.1.2. Importância medicinal e atividades biológicas do gênero Dioscorea...........................6
1.1.3. Importância da aplicação de técnicas de culturas de células, tecidos e órgãos na
multiplicação in vitro ..............................................................................................................9
1.1.4. Importância da aplicação de técnicas de culturas de células, tecidos e órgãos na
produção de diosgenina.........................................................................................................12
1.1.5. Importância da indução de microtubérculos do gênero Dioscorea em sistemas de
cultura in vitro.......................................................................................................................16
2. CAPÍTULO 2 .......................................................................................................................19
MORFOGÊNESE, CRESCIMENTO IN VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE SOMACLONES
DE D. composita NA AUSÊNCIA DE REGULADORES DE CRESCIMENTO ..................19
2.1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................19
2.2. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................20
2.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes somaclones de
D. composita .........................................................................................................................20
2.2.2. Crescimento in vitro dos diferentes somaclones.........................................................21
2.2.3. Aclimatização de plantas dos diferentes somaclones..................................................22
2.2.3.1. Aclimatização de plantas em bandejas plásticas em câmara de crescimento.......22
2.2.3.2. Aclimatização de plantas em copos plásticos em câmara de crescimento............23
2.2.3.3. Aclimatização em vasos de 2,5 L em casa de vegetação......................................23
2.2.4. Determinação da massa seca das plantas ....................................................................24
2.2.5. Determinação da densidade estomática e das dimensões das células-guarda e dos
poros estomáticos dos somaclones S2 e S4...........................................................................
24
2.2.6. Análise estatística........................................................................................................25
2.3. RESULTADOS .................................................................................................................26
2.3.1. Morfogênese in vitro de segmentos nodais caulinares de diferentes somaclones ......26
2.3.2. Aclimatização de plantas dos diferentes somaclones..................................................30
2.3.2.1. Análise da sobrevivência das plantas em câmara de crescimento ........................30
2.3.2.2. Análise da sobrevivência e do crescimento das plantas após a transferência para a
casa de vegetação...............................................................................................................32
2.3.3. Determinação da densidade estomática, das dimensões das células-guarda e dos poros
estomáticos dos somaclones S2 e S4 ....................................................................................34
2.4. DISCUSSÃO.....................................................................................................................34
2.5. CONCLUSÕES.................................................................................................................42
3.
CAPÍTULO 3 .......................................................................................................................44
MORFOGÊNESE E CRESCIMENTO IN VITRO DE SOMACLONES DE D. composita NA
PRESENÇA DE DIFERENTES REGULADORES DE CRESCIMENTO. ...........................44
xii
3.1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................44
3.2. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................45
3.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes somaclones de
D. composita .........................................................................................................................45
3.2.2. Efeito de diferentes reguladores de crescimento sobre a morfogênese e o crescimento
in vitro...................................................................................................................................46
3.2.3. Determinação da massa seca das plantas ....................................................................47
3.2.4. Análise estatística........................................................................................................48
3.3. RESULTADOS .................................................................................................................48
3.3.1. Efeito dos reguladores de crescimento sobre a morfogênese das plantas dos diferentes
somaclones ............................................................................................................................48
3.3.2. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento dos microtubérculos .....50
3.3.3. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento dos bulbilhos aéreos.....59
3.3.4. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento da parte aérea e do
sistema radicular das plantas.................................................................................................
60
3.4. DISCUSSÃO.....................................................................................................................68
3.5. CONCLUSÕES.................................................................................................................73
4. CAPÍTULO 4 .......................................................................................................................75
EFEITO DO ÁCIDO GIBERÉLICO, ÁCIDO NAFTALENOACÉTICO E GLUTAMINA
SOBRE A MORFOGÊNESE E CRESCIMENTO IN VITRO DE SOMACLONES DE D.
composita Hemsl. .....................................................................................................................75
4.1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................75
4.2. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................................76
4.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes somaclones de
D. composita .........................................................................................................................77
4.2.2. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a morfogênese e o
crescimento in vitro...............................................................................................................77
4.2.3. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a morfogênese e o crescimento in vitro......................................................78
4.2.4. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético sobre a morfogênese e o crescimento in vitro...........................................
78
4.2.5. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de glutamina
sobre a morfogênese e o crescimento in vitro.......................................................................
79
4.2.6. Determinação da massa seca das plantas ....................................................................80
4.2.7. Análise estatística........................................................................................................80
4.3. RESULTADOS .................................................................................................................80
4.3.1. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a morfogênese e o
crescimento in vitro...............................................................................................................
81
4.3.1.1. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a morfogênese das
plantas ................................................................................................................................81
4.3.1.2. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre o crescimento dos
microtubérculos..................................................................................................................82
4.3.1.3. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre o crescimento da
parte aérea e do sistema radicular das plantas ...................................................................86
4.3.2. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a morfogênese e o crescimento in vitro......................................................90
4.3.2. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a morfogênese e o crescimento in vitro......................................................
91
4.3.2.1. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a morfogênese das plantas.......................................................................91
xiii
4.3.2.2. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a o crescimento dos microtubérculos ......................................................92
4.3.2.3. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das plantas.............97
4.3.3. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético sobre a morfogênese e o crescimento in vitro...........................................99
4.3.3.1. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético sobre a morfogênese das plantas............................................................99
4.3.3.2. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético sobre o crescimento dos microtubérculos............................................101
4.3.3.3. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de ácido
naftaleno acético sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das plantas104
4.3.4. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de glutamina
sobre a morfogênese das plantas e o crescimento in vitro..................................................107
4.3.4.1. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
glutamina sobre a morfogênese das plantas e o crescimento dos microtubérculos.........
107
4.3.4.2. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
glutamina sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das plantas...........110
4.4. DISCUSSÃO...................................................................................................................111
4.5. CONCLUSÕES...............................................................................................................117
5. CAPÍTULO 5 .....................................................................................................................119
ANÁLISE BIOQUÍMICA E QUANTIFICAÇÃO DE DIOSGENINA DOS SOMACLONES
DE D. composita ....................................................................................................................119
5.1. INTRODUÇÃO...............................................................................................................119
5.2. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................121
5.2.1. Condições de cultivo.................................................................................................121
5.2.2. Análise bioquímica de carboidratos solúveis e amido ..............................................122
5.2.3. Quantificação de diosgenina .....................................................................................123
5.3. RESULTADOS ...............................................................................................................124
5.3.1. Análises bioquímicas de carboidratos solúveis e amido...........................................124
5.3.2. Quantificação de diosgenina .....................................................................................125
5.4. DISCUSSÃO...................................................................................................................129
5.5. CONCLUSÕES...............................................................................................................136
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................138
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................................140
1
INTRODUÇÃO
O gênero Dioscorea é considerado de grande importância econômica por apresentar
muitas espécies potenciais produtoras de compostos esteroidais de interesse na medicina
popular e pelas indústrias farmacêuticas, podendo ser utilizados como antiinflamatórios,
agentes anticancerígenos, no tratamento de desordens por deficiência hormonal, na forma de
contraceptivos orais e anabolizantes. Diosgenina, sapogenina esteroidal utilizada como
precursora de esteróides farmacologicamente ativos, tais como hormônios esteroidais e
corticosteróides, é o principal composto encontrado em tubérculos de Dioscorea composita.
D. composita, espécie nativa do México, teve sua exploração acentuada na década de
80 e, como conseqüência, as populações naturais da espécie foram reduzidas. Por isso, o
emprego da técnica de cultura de células, tecidos e órgãos vegetais agrega valores a esta
cultura, contribui para a adoção de novas abordagens para viabilizar a produção consistente de
plantas e de metabólitos secundários, pois as culturas comerciais tornaram-se inviáveis devido
ao longo período necessário para a exploração comercial.
Os estudos sobre o cultivo in vitro de plantas, a partir de segmentos nodais,
possibilitam a otimização dos sistemas para a obtenção, programada ou planejada, de um
grande número de mudas, isentas de patógenos, em um curto período de tempo e em espaço
físico reduzido. O uso da cultura de tecidos para produção de metabólitos secundários é
bastante difundido entre várias espécies de importância medicinal. A importância da
diosgenina tem estimulado vários estudos do desenvolvimento de técnicas rápidas de detecção
e identificação em micro escala, tal como a cromatografia em camada delgada e estudos sobre
o potencial de produção de sapogeninas esteroidais por sistemas de cultura de células de
várias espécies de Dioscorea, em especial D. composita e D. floribunda, mas são raras as
2
informações sobre o potencial de produção destes compostos através da cultura de órgãos, tais
como os microtubérculos.
Em plantas de D. composita, cultivadas em condições naturais, os tubérculos são os
órgãos em que são acumuladas as maiores quantidades de diosgenina e, portanto, a otimização
de sistemas de produção de microtubérculos in vitro seria uma abordagem muito útil para a
avaliar o potencial de produção de sapogeninas, já que estariam facilitadas as possibilidades
de manipulação dos sistemas de cultura. Por outro lado, os microtubérculos também poderiam
ser utilizados para a propagação vegetativa e armazenamento de germoplasma.
Neste contexto foi conduzido o presente trabalho que consta de cinco capítulos, que
abordam a importância do gênero Dioscorea e da espécie D. composita e estudos que
permitem avaliar o potencial da utilização de abordagens biotecnológicas para a produção de
plantas e de diosgenina.
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL:
Avaliar o crescimento em diferentes condições de cultura in vitro, a aclimatização e os
níveis de diosgenina, açúcares solúveis totais e amido dos tubérculos, microtubérculos e parte
aérea das plantas dos diferentes somaclones de Dioscorea composita Hemsl.
3
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Avaliar a capacidade de morfogênese, crescimento in vitro e de aclimatização dos
somaclones produzidos in vitro, na ausência de reguladores de crescimento e determinar a
densidade estomática e as dimensões dos estômatos dos somaclones S2 e S4.
2. Avaliar os efeitos de auxinas, citocininas e giberelinas, utilizadas isoladamente,
sobre o crescimento in vitro das plantas dos diferentes somaclones.
3. Avaliar os efeitos de ácido giberélico, ácido naftalenoacético e glutamina sobre o
crescimento in vitro das plantas dos diferentes somaclones.
4. Avaliar os efeitos do ácido giberélico, ácido naftalenoacético e ácido indolbutírico
sobre a produção de diosgenina, açúcares solúveis totais e amido de plantas produzidas in
vitro não aclimatizadas, do somaclone S5.
5. Determinar os níveis de diosgenina, açúcares solúveis totais e amido de tubérculos e
parte aérea das plantas de diferentes somaclones produzidas in vitro, na ausência de
reguladores de crescimento, e aclimatizadas.
4
CAPÍTULO 1
1.1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1.1 Características da Família Dioscoreaceae
A família Dioscoreaceae (R.Br.) Lindley é uma das 17 famílias incluídas na ordem
Liliiflorae, compreendendo 11 gêneros (Joly, 1998) e cerca de 900 espécies distribuídas pelas
regiões tropicais, subtropicais e temperadas do mundo, com exceção da Antártica. Entretanto,
somente algumas ocorrem nas partes quentes das zonas temperadas (Pedralli, 2004).
São monocotiledôneas, perenes, possuindo caules delgados a robustos, formando
muitas vezes um emaranhado sobre outras plantas, ocorrendo também espécies eretas e
herbáceas (Pedralli, 2002b). Estes caules apresentam ramificações podendo atingir vários
metros, alguns com espinhos peciolares ou bulbilhos nas axilas das folhas (Barroso et al.,
1974).
As folhas apresentam grande variação morfológica (Pedralli, 2002b), sendo
geralmente alternas, opostas ou espiraladas, lobadas ou não, pecioladas em forma de coração
ou seta (Joly, 1998). A inflorescência desenvolve-se na axila das folhas superiores, em geral
como panícula ou espiga (Joly, 1998). As flores são actinomorfas, trímeras, pequenas,
geralmente unissexuais e algumas com odor. As flores masculinas possuem odor adocicado e
grão de pólen viscoso fortemente aderido à antera; as femininas são maiores, com ovário
5
ínfero, tricarpelar, trilocular, em geral com muitos óvulos e alguns nectários septais
(Weberling & Schwantes, 1986; Dahlgren & Clifford, 1982; Joly, 1998; Pedralli, 2002b).
Os frutos são do tipo cápsulas trialadas, bagas ou drupas (Pedralli, 2002b). As
sementes podem ser aladas, ou não (Joly, 1998), reticuladas ou lisas, com tamanhos variados
(Pedralli, 2002b), possuindo embrião pequeno bem diferenciado e cotilédone lateral imerso no
endosperma, o qual contém lipídeos e aleurona (Pedralli, 2004).
Os órgãos de reserva são classificados como tubérculos e algumas espécies de
Dioscorea apresentam a notável peculiaridade de gerar pesados tubérculos aéreos nas axilas
foliares (Rizzini & Mors, 1995), denominados bulbilhos aéreos, acumulando água e nutrientes
após a floração (Dahlgren & Clifford, 1982).
O gênero Dioscorea possui o maior número de representantes da família
Dioscoreaceae, principalmente nos trópicos americanos (Joly, 1998). Estima-se que ocorram
no Brasil entre 150 e 200 espécies de Dioscorea, único gênero da família presente em todas as
regiões do país, desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul (Pedralli, 2002a e 2004). Os
principais Estados produtores encontram-se na região Nordeste, onde são cultivados mais de
90% da produção brasileira, predominando o cultivo de espécies comestíveis. Espécies com
finalidade farmacológica são cultivadas nas regiões Sul, Centro Sul, Sudeste, Oeste e Norte
(Moura, 1995 apud Coelho, 2002).
Os tubérculos do gênero Dioscorea possuem um elevado potencial econômico (Rizzini
& Mors, 1995), com cerca de 25 espécies utilizadas na alimentação humana. Estes tubérculos
apresentam vitaminas do complexo B, contendo ainda vitamina A e C (ácido ascórbico),
elevados teores de potássio, sódio, magnésio, fósforo, cálcio, ferro, cobre e zinco (Cazé Filho,
2002). São ricos em amido (Pedralli, 2004; Ammirato, 1984) sendo apreciados pela farinha
(Rizzini & Mors, 1995). Contêm, aproximadamente, 8 a 10 mg de ácido ascórbico, em cada
6
100 g de tubérculo, e foram utilizados na prevenção do escorbuto por marinheiros em viagens
através dos oceanos, o que facilitou a sua ampla distribuição pelos trópicos (Ammirato, 1984).
Dioscorea composita Hemsl., conhecida também como barbasco ou inhame mexicano,
é uma planta trepadeira, nativa do México, que possui tubérculos grandes, chegando a pesar
50 kg. Apresenta folhas alternas, pecioladas e coriáceas, com largura entre 7 e 20 cm. É uma
espécie dióica, com flores verdes e floração no período de junho a outubro (CONABIO -
www.conabio.gob.mx). Apresenta ampla distribuição geográfica, podendo ser encontrada
desde o nível do mar, formando vegetação secundária, até em florestas com altitude de 1500
metros (CONABIO - www.conabio.gob.mx).
1.1.2. Importância medicinal e atividades biológicas do gênero Dioscorea
D. composita foi a primeira espécie selvagem encontrada no México a ser explorada
industrialmente, a partir de 1940, juntamente com D. floribunda (Viana, 1985; Oashi, 1999).
Esta exploração pode ser explicada pelo fato de essas espécies possuírem diosgenina (Chu &
Figueiredo-Ribeiro, 1991), metabólito secundário da classe das sapogeninas de maior
importância econômica, devido ao fato de sua fórmula (C
27
H
42
O
3
) ser muito semelhante à
fórmula do progesterona natural (C
21
H
30
O
2
) (Oashi, 1999). Esta última autora afirma que a
procura por fontes alternativas de matéria-prima para a síntese de hormônios esteroidais
(andrógenos, estrógenos e progesteronas) e corticosteróides, os quais podem ser utilizados
como antiinflamatórios, agentes anticancerígenos, no tratamento de desordens por deficiência
hormonal, na forma de contraceptivos orais e anabolizantes, resultou no fim da década de 40,
na utilização de sapogeninas esteroidais vegetais em substituição às substâncias de origem
animal, tais como o colesterol e os ácidos biliares. Sendo assim, a extração de diosgenina,
7
realizada a partir das espécies de Dioscorea, fez com que muitas dessas espécies se tornassem
raras, dificultando e tornando caro para as indústrias utilizar fontes selvagens ainda não
exploradas. Desta forma, as sapogeninas esteroidais adquiriram grande importância
econômica, como precursores de esteróides farmacologicamente ativos, incluindo os
anticoncepcionais de via oral, os corticosteróides e os hormônios sexuais (Brenac & Sauvaire,
1996; Oashi, 1999).
Entretanto, o intenso extrativismo na década de 80, não tendo sido acompanhado da
otimização dos métodos de cultivo agronômico das espécies, e a coleta indiscriminada de
plantas silvestres, provocaram a escassez dessa matéria prima, Assim, as populações naturais
de Dioscorea, produtoras de diosgenina, foram reduzidas em seu habitat natural (Viana, 1985;
Rizzini & Mors, 1995; Oashi, 1999). O potencial comercial da diosgenina, cujo preço está em
torno de 674 dólares o quilograma, pode ser uma das razões do extrativismo predatório
(Scragg, 1994).
De acordo com Viana (1985), o cultivo, em larga escala, das espécies de Dioscorea
utilizadas para a produção de sapogeninas, não foi bem sucedido, pois a necessidade de
tutoramento das plantas e a produção de tubérculos de grande tamanho encareciam o plantio e
a coleta.
Devido às dificuldades geradas pela restrição da matéria-prima obtida a partir de
tubérculos de Dioscorea, os laboratórios iniciaram a utilização e a produção de parte dos
hormônios a partir da hecogenina, presente no suco do sisal. Outras fontes também utilizadas
são o estigmasterol e o sitosterol, obtidos dos resíduos da purificação do óleo de soja, tendo a
vantagem de serem mais abundantes (Rizzini & Mors, 1995).
Utilizados principalmente por atletas fisiculturistas, os produtos anabolizantes também
são provenientes de sapogenina esteroidal. Estes hormônios esteroidais contêm alguns
miligramas de sapogeninas, tais como o estigmasterol e o sitosterol, além de muitos
8
possuírem extrato de raízes de Dioscorea, especialmente D. composita, em sua formulação. A
indústria voltada para a produção desses anabolizantes varia seus preços no mercado de
acordo com a quantidade de sapogeninas em cada formulação, tendo lucros de dezenas a
centenas de reais (SUPLEMENTOS ON LINE - www.suplementoonline.com.br).
Outras propriedades em estudo envolvem a atividade antimutagênica (Miyzawa et al.,
1996); a atividade antifúngica e moluscicida (Yamamoto et al., 1996); o combate à diabete
através da utilização da Dioscorea japonica (Verspohl, 2002); a atividade antioxidante de D.
batatas, sendo importante no tratamento de processos degenerativos ou patológicos, tais como
o envelhecimento, doenças coronárias e o mal de Alzheimer (Hou et al., 2002). Além disso,
D. villosa L. é espécie utilizada nos tratamentos de dores do parto, cólicas, irritações
gastrointestinais, náusea e vômito matutino, asma, soluço e reumatismo (Edwards et al.,
2002).
As plantas do gênero Dioscorea também são amplamente utilizadas no tratamento de
diversos tipos de câncer. D. collettii var. hypoglauca é uma espécie utilizada, por vários
séculos, como remédio na China, pois possui em seu rizoma 14 tipos de saponinas esteroidais
(Hu et al., 1997), sendo utilizada no tratamento de diversos tipos de câncer, tais como câncer
cervical, tumor renal e da bexiga (Hu & Yao, 2002). Além disso, esta espécie apresenta
citotoxicidade contra leucemia aguda humana, quando testada em linhagens de células in
vitro, além de mostrar atividade citotóxica também contra câncer de colo, devido à presença
de protodioscina, uma saponina furostanol purificada do rizoma desta variedade (Hu & Yao,
2002). D. birmanica Prain & Burkill e D. membranacea Pieere ex. Prain & Burkill,
tradicionalmente utilizadas como plantas medicinais para o tratamento de câncer na Tailândia,
também mostraram atividade citotóxica efetiva quando testadas in vitro, em linhagens de
células de carcinoma do pulmão, adenocarcinoma do cólon e adenocarcinoma de mama
(Itharat et al., 2004).
9
Algumas espécies de Dioscorea, consideradas tóxicas, são utilizadas pelos indígenas
Xavantes, Borore, Pacaas, Novos, Surui, Cinta Larga e Kajara, das regiões Centro-Oeste e
Norte do Brasil, em suas flechas na pesca e na caça (Pedralli, 2002b).
Muitas atividades biológicas relatadas para o gênero Dioscorea favoreceram o
extrativismo dessas espécies e reforçam a necessidade de estudos de conservação e produção
dos metabólitos secundários de interesse farmacológico. Porém, o manejo inadequado da
cultura de Dioscorea, a utilização de tubérculos de tamanhos heterogêneos, a contaminação
por microorganismos, a qualidade agronômica inferior, o elevado custo dos tubérculos para
iniciar o plantio e a indisponibilidade de material vegetal, são algumas das limitações
impostas à produtividade de várias espécies de Dioscorea (Cazé Filho, 2002). Por isso, o
emprego de técnicas de cultura de células, tecidos e órgãos agrega valores a esta cultura, por
contribuir para a adoção de novas abordagens, as quais viabilizam a produção de plantas, de
metabólitos secundários e conservação de germoplasma de várias espécies de Dioscorea.
1.1.3. Importância da aplicação de técnicas de culturas de células, tecidos e
órgãos na multiplicação in vitro
Estudos sobre cultura de tecidos vegetais têm auxiliado no melhor entendimento da
fisiologia do crescimento de regiões isoladas da planta, sem a interferência dos efeitos das
demais partes do vegetal, eliminando-se, também, a influência do meio ambiente. A grande
capacidade de regeneração dos tecidos vegetais cultivados in vitro se deve,
fundamentalmente, à totipotencialidade das células vegetais (Kerbauy, 1999), que permite
manifestar, em momentos diferentes e sob estímulos apropriados, a potencialidade de iniciar
um novo indivíduo multicelular.
10
A multiplicação in vitro apresenta várias vantagens sobre os métodos convencionais
de propagação, pois permite a obtenção de um grande número de mudas em um curto período
de tempo e em espaço físico reduzido (Lauzer et al., 1992; Torres et al., 1998), além de
possibilitar a produção de plantas isentas de patógenos. As técnicas de cultura de tecidos
vegetais e a produção de microtubérculos in vitro, também são alternativas interessantes, em
relação aos métodos convencionais, adotadas para diferentes espécies de Dioscorea, uma vez
que ajudam a resolver três importantes problemas: a propagação vegetativa, a produção de
diosgenina e de outras sapogeninas e a conservação de germoplasma (Furmanowa &
Guzewska, 1989; Jean & Cappadocia, 1991).
A partir da década de 70, as técnicas de cultura de tecidos vegetais ganharam grande
impulso, em âmbito comercial, logo após a primeira aplicação realizada por Morel, em 1960,
de multiplicação de orquídeas mediante cultura de ápices caulinares. No ano de 1974,
Murashige apresentou o conceito de estágios de desenvolvimento no processo de propagação
in vitro. Esses estágios permitem alterações, conforme as peculiaridades de cada espécie,
sendo eles: seleção e desinfestação dos explantes (estágio I); multiplicação dos explantes
(estágio II) e aclimatização (estágio III) (Grattapaglia & Machado, 1998).
A multiplicação dos explantes pode ser feita através de cultivo de gemas axilares
(segmento nodais), organogênese direta ou indireta e via embriogênese somática. A cultura de
partes aéreas, tal como o cultivo in vitro de segmentos nodais, é uma das técnicas utilizadas
na cultura de tecidos vegetais, que envolve o isolamento de órgãos meristemáticos pré-
formados e a estimulação de seu crescimento. As plantas regeneradas através desta técnica
apresentam uma fidelidade genética muito alta. Além disso, os segmentos nodais, que contém
gemas axilares, apresentam determinação para o crescimento vegetativo, desenvolvendo-se
naturalmente quando supridas suas necessidades nutricionais (Grattapaglia & Machado,
1998).
11
A fase de aclimatização pode ser considerada a mais delicada do processo de
micropropagação. A baixa luminosidade e a elevada umidade relativa encontrada nas
condições in vitro, associadas à conseqüente redução da taxa de transpiração, faz da
transferência de plantas produzidas in vitro para um novo ambiente, um estágio crítico. Por
isso, a aclimatização, definida por Costa (1998) como processo realizado artificialmente, onde
ocorre a adaptação climática da planta, quando transferida para um novo ambiente, representa
uma fase muito sensível da micropropagação. Esta fase representa um estresse para a planta,
devido às mudanças pertinentes às condições ambientais, quando da transferência das plantas
da situação in vitro para a situação in vivo (Read & Fellman, 1985; Azcón-Aguilar et al.,
1997).
Quando in vitro, as plantas nos estágios de diferenciação, multiplicação e
enraizamento, apresentam comportamento heterotrófico, visto que possuem a sua disposição
alta concentração de nutrientes, devido ao aporte artificial do meio de cultura, significante
quantidade de açúcar utilizada como fonte de carbono, baixa intensidade luminosa, alta
umidade relativa do ar e trocas gasosas limitadas (Costa, 1998; Estrada-Luna et al., 2001).
Quando transferidas para condições in vivo, há necessidade de iniciar a absorção de sais e os
processos fisiológicos necessários para seu desenvolvimento e sobrevivência, dando início ao
comportamento autotrófico da planta (Yano-Melo et al., 1999), ocorrendo, então, um grande
gasto de energia. Por isso, a qualidade das plantas regeneradas in vitro, no momento de sua
transferência para a aclimatização, é um dos fatores fundamentais para o sucesso desta etapa
da micropropagação (Van Huylenbroeck & Debergh, 2000), onde as características
fisiológicas, bem como as anatômicas, desempenham um importante papel neste contexto.
Outros pontos considerados críticos para o desenvolvimento vegetal durante a fase de
aclimatização devem ser controlados, tais como a transferência gradual das plantas para uma
intensidade de luz maior do que a requerida na condição in vitro, evitando, assim, a destruição
12
das moléculas de clorofila e, conseqüentemente, a clorose. Além disso, a manutenção de alta
umidade relativa do ar, favorecendo o estabelecimento das plantas sob as condições de
aclimatização, tende a diminuir o estresse causado pelo possível déficit hídrico (Costa, 1998).
Entretanto, mudanças fisiológicas e genéticas podem se manifestar em plantas
produzidas através da cultura de calos ou da cultura de tecidos vegetais (Bouman & De Klerk,
2001), ocorrendo assim a variação somaclonal, termo definido por Larkin & Scowcroft (1981)
como mudanças genéticas ocasionadas pelas condições da cultura in vitro. Esta variação pode
ser genética ou epigenética, ambas contribuindo para variações fenotípicas e genotípicas
observadas nas plantas (Jain, 2001).
Apesar da ampla utilização e da importância dada à cultura de tecidos para muitas
espécies vegetais, há uma carência de informações detalhadas sobre os processos de
regeneração de Dioscorea (Twyford & Mantell, 1996). Viana & Mantell (1989) relataram a
indução de calos a partir da cultura de embriões zigóticos em meio de cultura MS (Murashige
& Skoog, 1962) suplementado com 18 μM de 2,4-D e a regeneração de plantas a partir de
calos em meio de cultura contendo 0,1μM de zeatina e 3,3 mM de glutamina. Porém, pouco
se sabe sobre o comportamento e o potencial de crescimento in vitro de somaclones de
Dioscorea composita Hemsl. regenerados a partir de calos, sendo importante a avaliação
desse crescimento através da capacidade de morfogênese e multiplicação.
1.1.4. Importância da aplicação de técnicas de culturas de células, tecidos e
órgãos na produção de diosgenina
A cultura de tecidos vegetais pode ser uma ferramenta para a produção de metabólitos
secundários, tais como a diosgenina em plantas de Dioscorea composita. A cultura de
13
suspensões celulares é considerada o sistema mais adequado para viabilizar a produção, em
larga escala, de metabólitos secundários de interesse (Stafford, 1991). Porém, de acordo com
este autor, culturas diferenciadas, como cultura de ramos, de raízes e de embriões somáticos,
têm sido desenvolvidas para diferentes espécies, podendo resultar em maior produção, em
termos de percentagem da matéria seca. Charlwood et al. (1990), explicam que o menor
acúmulo de metabólitos secundários por culturas de calos e suspensões celulares, quando
comparado com cultura de órgãos vegetais, pode ser resultante da falta de expressão de genes
que controlam os passos essenciais das vias biossintéticas do metabolismo secundário nas
células não especializadas dos calos. É possível, também, que a ausência, dentro da célula, de
compartimentos para o armazenamento dos metabólitos secundários ou, ainda, a ausência de
mecanismos de transporte para a remoção dos produtos finais tóxicos, propiciem o menor
acúmulo de metabólitos secundários. Outro aspecto da produção de metabólitos secundários
por suspensões celulares, que muitas vezes torna o processo inviável, por gerar altos custos, é
a necessidade de se utilizar dois diferentes meios de cultura, em alguns casos: o primeiro para
o crescimento e estabilização das células e o segundo para a indução da produção do
metabólito (Phillipson, 1990).
Stafford (1991), relata casos em que suspensões de células produziram os metabólitos
secundários de interesse, em quantidade maior do que as encontradas nas próprias plantas.
Para D. deltoidea, a produção de diosgenina, via suspensões celulares, atingiu o valor de 2%
da massa seca, semelhante ao produzido pelas plantas. Entretanto, Datta & Datta (1984),
quantificando o teor de diosgenina em culturas de calos de D. composita, obtiveram variação
de 0,89% de diosgenina, em termos da massa seca, em calos com 30 dias de cultivo, a 1,61%,
em calos com 90 dias de cultivo. Esses valores foram inferiores aos teores de diosgenina
produzidos pelos tubérculos das plantas cultivadas em condições naturais, que apresentaram
3,6% de diosgenina em relação à massa seca.
14
De acordo com Heble & Staba (1980), a síntese de diosgenina em sistemas que
envolvem culturas de tecidos é dependente do desenvolvimento morfogenético e está
relacionada aos diferentes níveis da citocinina benzilaminopurina (BAP) no meio de cultura.
Estes autores observaram baixo teor de diosgenina em plantas de D. composita com poucas
folhas e caules alongados, que cresciam em meios contendo 0,1 mg.L
-1
de BAP, e alto nível
de diosgenina, em plantas que apresentavam muitas folhas e múltiplas gemas meristemáticas,
como no meio contendo 0,5 mg.L
-1
de BAP. O acúmulo de diosgenina em plantas de D.
composita ocorre nos tubérculos, e o nível de BAP pode afetar significativamente a
morfogênese de D. composita e os processos envolvidos na biossíntese da diosgenina.
A produção do metabólito secundário em plantas do gênero Dioscorea pode ser
aperfeiçoada pela manipulação dos constituintes do meio de cultura, tais como as fontes de
carbono e de nitrogênio (Tal et al., 1982). Tais autores verificaram, ainda, que as condições
para o máximo crescimento celular nem sempre são as condições necessárias para a máxima
produção de diosgenina, não havendo relação direta entre o crescimento celular e a produção
do metabólito secundário.
A produção de diosgenina também foi estudada em D. floribunda por Aminuddin &
Chowdhury (1983), que utilizaram calos derivados da cultura do meristema apical e de
tecidos dos tubérculos. Esses autores observaram que as células provenientes da cultura de
tecidos dos tubérculos apresentaram maior conteúdo de diosgenina (1,10% em relação à
massa seca, na oitava semana de cultura) quando comparados com o conteúdo apresentado
pelas células oriundas da cultura do meristema apical (0,194% da massa seca, na oitava
semana de cultura).
O entendimento da seqüência da biossíntese de diosgenina e o tempo de aparecimento
deste metabólito são importantes para a otimização de sua quantificação e extração. Tal et al.
(1984), pesquisaram inibidores metabólicos para melhor compreender a seqüência da
15
biossíntese de diosgenina em suspensões celulares de D. deltoidea. De acordo com esses
autores, alguns desses inibidores metabólicos interferiram na formação de metabólitos
derivados do ácido mevalônico. Esta interferência na via do ácido mevalônico pode
influenciar na produção de diosgenina, pois apesar de a síntese de diosgenina em cultura de
células vegetais ter sido relatada a partir do metabolismo do colesterol, Sttaford & Warren
(1991), afirmam que a síntese de diosgenina resulta, também, da via do ácido mevalônico.
Drapeau et al. (1986) otimizaram os métodos para extração de diosgenina produzida
por cultura de células de D. deltoidea utilizando o método de hidrólise com ácido sulfúrico e
isopropanol e não o método tradicional com ácido clorídrico. Eles demonstraram que a
diosgenina pode ser obtida diretamente durante a fase de crescimento das células e não apenas
quando as culturas entram na fase estacionária, como propõem Tal et al. (1984), ao indicarem
que o acúmulo dos metabólitos intermediários da biossíntese de diosgenina ocorre nas fases
iniciais do crescimento e que os mesmos são transformados em diosgenina pelas células
quando as culturas entram na fase estacionária.
Como espécies produtoras de diosgenina têm a produção deste metabólito iniciada nas
folhas para, posteriormente, ser acumulado nos tubérculos, estudos relacionados à indução e
ao desenvolvimento dos tubérculos e dos microtubérculos na cultura de tecidos vegetais são
imprescindíveis. A indução e o desenvolvimento de tubérculos são fenômenos complexos e
influenciados por variáveis como nutrição, ambiente, genética, área foliar e substâncias
reguladoras de crescimento (Arteca, 1996). De acordo com este autor, uma série de eventos
ocorre durante a indução e o crescimento do tubérculo. Após o início das divisões celulares, o
primeiro sinal bioquímico da tuberização é a deposição de amido. Alguns autores consideram
que a formação de tubérculos ocorre como resultado de um decréscimo no fotoperíodo, o que
restringe a utilização de carboidratos para o alongamento do caule ou para o desenvolvimento
de flores e frutos (Chu, 1998).
16
1.1.5. Importância da indução de microtubérculos do gênero Dioscorea em
sistemas de cultura in vitro
A indução de microtubérculos in vitro foi observada em algumas espécies de
Dioscorea. Os microtubérculos são considerados propágulos que facilitam o armazenamento,
o intercâmbio de germoplasma e a transferência das plantas micropropagadas para o campo
(Ammirato, 1984). Mantell & Hugo (1989), relatam que alguns componentes do meio de
cultura são fundamentais para o processo de tuberização in vitro de certas espécies de
Dioscorea, tais como a concentração de sacarose, reguladores de crescimento, especialmente
citocininas, auxinas e ácido abscísico, e a manutenção das culturas sob fotoperíodo de dias
curtos.
A sacarose é uma das principais formas em que o carbono é translocado e,
conseqüentemente, o principal substrato para o metabolismo vegetal (Farrar et al., 2000).
Kouassi et al. (1990) demonstraram, através da cromatografia, que D-frutose, D-glucose e
maltose estavam presentes nos tubérculos de D. esculenta. Porém, a sacarose encontrava-se
em maior quantidade, perfazendo 2% a 8% da massa seca, podendo, ainda, este conteúdo ser
aumentado durante período de estocagem dos tubérculos. Em D. alata o aumento dos
açúcares chegou a 30%, em D. rotundata a 31,5% e em D. esculenta a 72,5%.
Geralmente, baixos níveis de carboidratos potencializam o incremento da expressão
gênica da fotossíntese, da mobilização de reservas e dos processos de translocação, enquanto
que o excesso favorece os processos de armazenamento (Chu, 1998). O conteúdo elevado de
sacarose induz mudanças na expressão dos genes que desencadeiam a síntese de sacarose
sintetase e da sacarose invertase (Farrar et al., 2000), chegando a alterar o programa de
desenvolvimento da planta (Chu, 1998). A quantidade ótima de sacarose para a indução e
17
desenvolvimento de microtubérculos, depende da espécie em questão, do meio de cultura e
dos reguladores de crescimento (Lauzer et al., 1992).
O balanço hormonal também está relacionado com a indução da tuberização e o
desenvolvimento dos tubérculos. Há muitos estudos sobre o efeito das giberelinas exógenas e
endógenas na tuberização, e em ambos os casos, as giberelinas têm efeito inibitório na
promoção da tuberização. Níveis endógenos de citocininas promovem a tuberização, e o
fornecimento exógeno das mesmas também tem mostrado efeito indutor, sendo esta resposta
promovida pela interação entre auxinas e citocininas (Arteca, 1996). O ácido jasmônico e seu
metil éster estão relacionados com o processo de tuberização, sendo importantes na formação
de microtubérculos em plantas de D. alata, D. rotundata e D. cayenensis cultivadas in vitro,
mas apenas quando foram utilizadas baixas concentrações de sais em combinação com
fotoperíodo de dias curtos (Jasik & Mantell, 2000). John et al. (1993) observaram que o ácido
abscísico (ABA) e o ácido naftalenoacético (ANA) estimularam o crescimento de
microtubérculos induzidos em plantas micropropagadas de D. alata, enquanto que as
citocininas inibiram o crescimento dos mesmos.
Estudos preliminares conduzidos por Alizadeh et al. (1998), sobre a indução de
microtubérculos em plantas micropropagadas de D. composita, indicaram que o ANA, o ácido
indolacético (AIA), o ácido indolbutírico (AIB), o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), a 2-
isopenteniladenina (2iP), a adeninahemisulfato e o ABA, quando utilizados isoladamente,
induziram a formação de microtubérculos em 70-100% das plantas, enquanto que as taxas de
indução obtidas para a benziladenina e cinetina foram menores que 66%. Entretanto, apenas
nos meios de cultura contendo ANA, AIA, AIB e 2,4-D foram produzidos microtubérculos
com maiores massas frescas, superiores a 240 mg por microtubérculo. Estes autores também
relatam que concentrações de sacarose acima de 8% promoveram aumento significativo da
massa fresca dos microtubérculos, 700-800 mg por microtubérculo, após 8 meses de cultura e
18
que, na presença de cinetina, as formulações salinas dos meios Murashige e Skoog, Anderson
Rhododendron e B5 promoveram a indução de microtubérculos, mas apenas nos dois
primeiros meios os pesos de matéria fresca dos mesmos foram superiores a 100 mg por
microtubérculo.
A ausência de dados na literatura sobre o crescimento, desenvolvimento e processos
de tuberização de diferentes somaclones de Dioscorea composita Hemsl., produzidos in vitro,
a partir da regeneração de um único calo, bem como a ausência de estudos sobre a
composição bioquímica dos microtubérculos produzidos in vitro, especialmente quanto ao
potencial dos mesmos para a produção de diosgenina estimulou a realização do presente
trabalho no Laboratório de Fisiologia Vegetal, Departamento de Botânica, na Universidade
Federal de Santa Catarina em parceria com a Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas do
Instituto de Botânica do Estado de São Paulo.
19
CAPÍTULO 2
MORFOGÊNESE, CRESCIMENTO IN VITRO E ACLIMATIZAÇÃO DE
SOMACLONES DE D. composita NA AUSÊNCIA DE REGULADORES DE
CRESCIMENTO
2.1. INTRODUÇÃO
Um sistema de regeneração de plantas de D. composita a partir de calos, originados
através da cultura de embriões zigóticos, foi descrito por Viana & Mantell (1989). Porém, não
foram conduzidos experimentos posteriores para avaliar o potencial de micropropagação e
aclimatização destas plantas.
De um modo geral há uma carência de informações detalhadas sobre os processos de
regeneração de plantas do gênero Dioscorea a partir de calos, especialmente sobre as espécies
de importância medicinal (Twyford & Mantell, 1996). Tais estudos são importantes, pois
permitem otimizar métodos para a produção in vitro de plantas em larga escala. A otimização
de protocolos de micropropagação requer, para muitas espécies, a utilização de reguladores de
crescimento na fase de multiplicação de ramos, a partir de segmentos caulinares contendo as
gemas axilares ou apicais, e de enraizamento dos mesmos (Grattapaglia & Machado, 1998).
Contudo, a utilização de reguladores de crescimento em sistemas de cultura in vitro,
principalmente quando o objetivo é a manutenção da fidelidade genética das plantas
20
micropropagadas, deve ser monitorada cuidadosamente, uma vez que estes podem contribuir
para a indução de variabilidade genética (Jain, 2001). Um outro aspecto importante refere-se à
otimização de protocolos de aclimatização, que podem requerer procedimentos sofisticados
para amenizar o estresse gerado durante a adaptação das plantas micropropagadas às
condições ex vitro (Van Huylenbroeck & Debergh, 2000).
Os objetivos deste estudo foram avaliar o crescimento in vitro e a capacidade de
aclimatização das plantas dos diferentes somaclones de D. composita, micropropagadas na
ausência de reguladores de crescimento.
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes
somaclones de D. composita
A partir da regeneração de um único calo produzido a partir da cultura de embrião
zigótico, segundo a metodologia descrita por Viana & Mantell (1989) originaram-se sete
plantas de Dioscorea composita, permanecendo viáveis apenas cinco, denominadas
somaclones S1, S2, S3, S4, e S5. Essas plantas foram isoladas do calo e multiplicadas, em
períodos de 60 dias, através da cultura de segmentos nodais caulinares contendo gema axilar
foliar (Figura 1A) em meio de cultura MS (Sigma, Co.) (Murashige & Skoog, 1962),
suplementado com sacarose 2% (p/v) e Phytagel
®
(Sigma, Co.) a 0,2% (p/v). O pH do meio
de cultura foi ajustado para 5,8 com NaOH 1 M ou HCl 1 N, antes da autoclavagem, sendo
21
distribuídos 8 mL de meio em cada tubo de ensaio (25 x 150 mm), fechados com tampas de
polipropileno, autoclavados durante 18 minutos a 1,1 Kgf.cm
-2
, em temperatura de 121ºC.
Após a inoculação, cada tubo foi fechado com um filme de polipropileno (72 mm x 72 mm)
preso com elástico de borracha e com uma tira de filme de PVC.
As culturas dos diferentes somaclones foram mantidas em sala de crescimento com
temperatura controlada (25ºC ± 2ºC), sob fotoperíodo de 16 horas, mantido por lâmpadas
fluorescentes Phillips TDL, com fluxo de fótons de 22,3 µmol.m
-2
.s
-1
e umidade relativa de
70%. Estas condições de cultura foram utilizadas em todos os experimentos descritos a seguir,
exceto quando outras condições foram requeridas. Estas plantas (Figura 1B) forneceram os
segmentos nodais caulinares contendo gema axilar foliar para a montagem de todos os
experimentos subseqüentes.
2.2.2. Crescimento in vitro dos diferentes somaclones
Segmentos nodais caulinares contendo gema axilar foliar, de aproximadamente 0,5 cm
de comprimento, foram removidos de plantas de 60 dias de idade dos diferentes somaclones,
cultivadas nas condições descritas no item 2.2.1 e inoculados em número de dois por tubo de
Figura 1. Segmentos nodais caulinares de
D
ioscorea
composita (A) e plantas com 60 dias de idade (B),
produzidas em meio Murashige & Skoog
suplementado com sacarose 2% e phytagel 0,2% a
partir da morfogênese dos segmentos nodais caulinares
(barra= 1cm).
A B
22
ensaio contendo o meio de cultura MS suplementado com 2% de sacarose e 0,2% de Phytagel.
A avaliação dos diferentes somaclones foi realizada semanalmente, quanto à percentagem de
formação de ramos e de raízes, e após 56 dias, quanto ao número de nós e de folhas
produzidas por planta. No primeiro caso foram utilizadas três repetições de 10 tubos de
ensaio, para cada somaclone, contendo cada tubo 3 explantes. No segundo, foram utilizadas
30 repetições por somaclone.
2.2.3. Aclimatização de plantas dos diferentes somaclones
2.2.3.1. Aclimatização de plantas em bandejas plásticas em câmara de
crescimento
Plantas de 60 dias de idade dos somaclones S1, S2, S3 e S4, produzidas de acordo com
a metodologia descrita no item 2.2.1., foram transferidas para bandejas plásticas (24 cm x 17
cm x 10 cm) (Figura 2A) contendo substrato composto de areia e terra na proporção de 1:1.
As bandejas foram mantidas fechadas durante 30 dias, em sala de crescimento, nas condições
descritas no item 2.2.1. Foram utilizadas duas repetições de 10 plantas cada, para cada
somaclone. Após 30 dias, as plantas sobreviventes de cada somaclone, foram transferidas para
areia e terra na proporção de 1:1, por volume, em copos plásticos de 300 mL. Essas plantas
foram mantidas dentro de bandejas plásticas fechadas de 28 L (Figura 2B), nas mesmas
condições de crescimento, durante 60 dias. A abertura das tampas das bandejas foi realizada
gradualmente durante a aclimatização, até a exposição completa das plantas. Semanalmente,
avaliou-se a percentagem de sobrevivência dos somaclones ao longo do experimento.
23
2.2.3.2. Aclimatização de plantas em copos plásticos em câmara de crescimento
Plantas de 60 dias de idade dos somaclones S1, S2, S3 e S4, produzidas de acordo com
a metodologia descrita no item 2.2.1., foram transferidas para substrato composto de areia e
terra, na proporção de 1:1, em copos plásticos de 300 mL. Essas plantas foram colocadas
dentro de bandejas plásticas fechadas de 28 L. As bandejas foram mantidas durante 60 dias,
em sala de crescimento, nas condições descritas no item 2.2.1. As tampas foram removidas
gradualmente, até a completa exposição das plantas ao ambiente. A percentagem de
sobrevivência das plantas foi avaliada semanalmente, durante 60 dias. Foram utilizadas 3
repetições de no mínimo 10 plantas por somaclone.
2.2.3.3. Aclimatização em vasos de 2,5 L em casa de vegetação
Após permanecerem 120 dias nas condições descritas no item 2.2.3.2., as plantas
sobreviventes dos somaclones S1, S2, S3 e S4 foram transferidas para vasos de 2,5 L,
contendo substrato composto de areia e terra, na proporção de 1:1. Permaneceram em
Figura 2. Plantas de Dioscorea composita com 30 dias de idade,
aclimatizadas em bandejas plásticas de 24 cm x 17 cm x 10 cm (A) e
transferidas para copos plásticos nas bandejas de 28 L (B).
A
B
24
ambiente sombreado por 4 semanas e, em seguida, foram transferidas para casa de vegetação,
com temperatura variando entre 35ºC para a mínima e 38ºC para a máxima. As plantas foram
cobertas com sombrite reduzindo a intensidade luminosa em 50%
por 4 meses, sendo regadas,
com água potável, uma vez por semana. Após o período em casa de vegetação, o crescimento
das plantas foi avaliado através da determinação das massas frescas e secas da parte aérea e
dos tubérculos. A partir desses dados foram calculados os teores de água dos tubérculos,
assim como os valores da razão massa seca/massa fresca da parte aérea e dos tubérculos e da
razão massa seca do tubérculo/massa seca da parte aérea. A percentagem de sobrevivência
também observada. Foram utilizadas no mínimo 5 repetições de cada somaclone.
2.2.4. Determinação da massa seca das plantas
Após a determinação da massa fresca, a parte aérea e os tubérculos das plantas foram
colocados em embalagens de papel e mantidos em estufa por pelo menos 48 horas a 85ºC. O
teor de água dos tubérculos foi expresso em percentagem da massa fresca e determinado
através da seguinte fórmula:
Teor de água (% da massa fresca) = (massa fresca – massa seca)/massa fresca*100.
2.2.5. Determinação da densidade estomática e das dimensões das células-guarda
e dos poros estomáticos dos somaclones S2 e S4
Folhas frescas, totalmente expandidas, de plantas dos somaclones S2 e S4, cultivados
em meio básico MS, durante 150 dias, foram utilizadas para determinar a densidade
25
estomática bem como as dimensões das células-guarda e dos poros estomáticos. Todas as
observações foram realizadas em microscópio óptico, marca Zeiss-Jena, modelo Loboval 4,
com magnitude de 400 x, no laboratório de Anatomia Vegetal da UFSC. Réplicas da
superfície abaxial de zonas costais da região mediana das folhas foram retiradas, com auxílio
de esmalte incolor, e montadas entre lâmina e lamínula. Para contagem do número de
estômatos por área, em 32 repetições para cada somaclone, foram projetadas imagens sobre
área delimitada conhecida, com auxílio de câmara clara acoplada ao microscópio óptico. A
densidade estomática é apresentada em número de estômatos.mm
-2
.
A determinação das dimensões das células-guarda e dos poros estomáticos foi feita
utilizando imagens projetadas em papel com auxílio de câmara clara acoplada ao microscópio
óptico, onde o comprimento (eixo longitudinal entre os dois pólos da célula) e a largura (eixo
transversal mediano da célula) foram determinados e aferidos com escala micrometrada. Para
cada somaclone foram utilizadas 40 repetições.
2.2.6. Análise estatística
Os experimentos foram montados seguindo-se o delineamento estatístico
completamente casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância simples
(ANOVA) e a comparação das médias foi realizada pelo teste de Tukey, ao nível de
significância de 5% (p ≤ 0,05) (Gomez & Gomez, 1984). Os dados em percentagem foram
transformados em arco seno da raiz quadrada antes de serem submetidos à ANOVA.
Os dados dos experimentos sobre a avaliação da densidade estomática e dimensões das
células-guarda e dos poros estomáticos foram submetidos ao teste
t, ao nível de significância
de 5% (p ≤ 0,05). Foi determinado o número mínimo amostral pela equação n=(t
2
.s
2
).d
–2
, onde
26
“t” é dado pela tabela de Student (considerando n-1, para significância de 0,05), “s” é o desvio
padrão e “d” é igual a E/100*média, onde E=10 para 10% de probabilidade, valor considerado
satisfatório (Sokal & Rohlf, 1969).
2.3. RESULTADOS
2.3.1. Morfogênese in vitro de segmentos nodais caulinares de diferentes
somaclones
As percentagens de segmentos nodais caulinares dos diferentes somaclones, que
formaram ramos ao longo dos 56 dias de cultivo são mostradas na Figura 3. Observa-se que,
para todos os somaclones, a brotação de ramos, a partir da gema axilar pré-existente no
explante, foi detectada antes do sétimo dia de avaliação do experimento. A percentagem
inferior de formação de ramos foi observada para o somaclone S2 já por volta de quatorze
dias do início do experimento. A partir do 28º dia de cultivo as diferenças entre os somaclones
mantiveram-se constantes, apresentando o somaclone S4 a maior percentagem neste período
(94,6 ± 5,8%), contrastando com o somaclone S2, cuja percentagem de formação de ramos foi
a mais baixa (63,4 ± 8,7%).
27
Quando se compara, para cada somaclone, a percentagem de segmentos nodais
caulinares que formaram ramos após 28 e 56 dias de cultivo, verifica-se que não foram
detectadas diferenças entre os diferentes períodos de cultivo (Figura 4).
0
20
40
60
80
100
S1 S2 S3 S4 S5
Somaclones
Formação de ramos (%)
28 dias 56 dias
Figura 4: Formação de ramos dos diferentes somaclones de Dioscorea composita aos 28 e 56 dias de
cultivo em meio básico Murashige & Skoog, na ausência de reguladores de crescimento.
a a
a
a
a a
a a
a a
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28 35 42 49 56
Tempo (dias)
Formação de ramos (%)
S1 S2 S3 S4 S5
Figura 3. Formação de ramos em segmentos nodais caulinares de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, em meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com 2% de sacarose, na ausência de
reguladores de crescimento.
b
a
a
ab
b
c
c
28
A análise de crescimento das plantas dos diferentes somaclones cultivadas durante 56
dias em meio de cultura básico MS, indica diferenças entre os somaclones, em relação ao
número de nós e à percentagem final de culturas que produziram ramos e raízes. Apenas para
a variável do número de folhas não foram detectadas diferenças entre os somaclones (Tabela
1). A formação de ramos observada, após 56 dias do início do experimento indicou que houve
grande variação entre as percentagens de brotação, tendo o somaclone S4 maior valor
(95,98%). O somaclone que apresentou a menor porcentagem de brotação das gemas axilares
foi o S2 (66,67%), os somaclones S1 e S3, foram semelhantes.
Tabela 1. Morfogênese e crescimento in vitro de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita em meio de cultura Murashige & Skoog, após 56 dias de cultura. Universidade Federal de
Santa Catarina, 2006.
Somaclones
Formação de ramos
(%)
a
Formação de raízes
(%)
a
Número de
nós.planta
-1a
Número de
folhas.planta
-1a
S1 90,43 ± 3,7 b 88,61 ± 6,0 ab 4,73 ± 1,8 ab 7,27 ± 2,6 a
S2 66,67 ± 11,7 d 45,28 ± 15,0 c 4,00 ± 2,4 ab 5,80 ± 2,6 a
S3 88,10 ± 4,1 b 81,30 ± 6,4 abc 2,93 ± 1,2 b 7,40 ± 4,9 a
S4 95,98 ± 3,7 a 90,46 ± 5,7 a 3,93 ± 1,8 ab 5,40 ± 1,8 a
S5 83,47 ± 2,3 c 78,24 ± 0,8 bc 5,80 ± 1,9 a 6,00 ± 2,0 a
a
Médias ± desvio padrão de trinta repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0,05).
As raízes já foram detectadas nos explantes a partir de quatorze dias do início do
experimento (Figura 5). Contudo, para todos os somaclones observou-se que a percentagem
de enraizamento não estabilizou por volta de 28º dia de cultivo, continuando a aumentar até o
56º dia de cultivo. Após 56 dias do início do experimento, a menor percentagem de
enraizamento dos explantes foi observada para o somaclone S2 (45,28%), sendo, entretanto,
semelhante aos somaclones S3 (81,30%) e S5 (78,24%). O somaclone S5 foi o que apresentou
maior número de nós por planta (5,8) para cada planta, mas este valor não diferiu dos obtidos
para os somaclones S1, S2 e S4. O somaclone S3 apresentou o menor número de nós por
29
planta (2,93). Com relação ao número de folhas verifica-se, entretanto, que os somaclones não
diferiram entre si, apresentado de 5,4 a 7,27 folhas por planta.
Na Figura 6 são apresentadas plantas completas, produzidas a partir da morfogênese
ocorrida nos segmentos nodais caulinares dos somaclones S2 e S4 em meio de cultura
desprovido de reguladores de crescimento.
Figura 6: Plantas enraizadas dos
somaclones S4 (A) e S2 (B) de
Dioscorea composita produzidas in
vitro, a partir da cultura de segmentos
nodais caulinares contendo gema axilar
foliar, em meio Murashige & Skoog
suplementado com 2% de sacarose,
após 56 dias.(barra= 1cm)
A B
Figura 5. Formação de raízes em segmentos nodais caulinares de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, ao longo de 56 dias de cultivo em meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com
2% de sacarose.
0
20
40
60
80
100
0 7 14 21 28 35 42 49 56
Tempo (dias)
Enraizamento (%
)
S1 S2 S3 S4 S5
a
a
ab
c
a
ab
b
30
2.3.2. Aclimatização de plantas dos diferentes somaclones
2.3.2.1. Análise da sobrevivência das plantas em câmara de crescimento
Os resultados da percentagem de sobrevivência das plantas dos somaclones S1, S2, S3
e S4, aclimatizadas em embalagens plásticas de 24 cm x 17 cm x 10 cm e depois transferidas
para copos plásticos e mantidas em bandejas plásticas de 28 L, estão ilustrados na Figura 7A.
Esses resultados indicam que após 8 semanas do início do experimento, a percentagem final
de sobrevivência foi de 82,2%, 77,8%, 74,6% e 28,5%, respectivamente para os somaclones
S1, S3, S4 e S2. A percentagem de sobrevivência do somaclone S2 foi significativamente
inferior à dos demais somaclones, não havendo diferença entre os somaclones S1, S3 e S4.
A percentagem de sobrevivência das plantas dos diferentes somaclones, quando a
aclimatização foi realizada diretamente em copos plásticos e a manutenção dos mesmos foi
feita em bandejas plásticas de 28 L, é apresentada na Figura 7B. Observa-se que, após 8
semanas, as percentagens finais de sobrevivência foram de 80,6%, 61,1%, 66,7%, 76,7%,
respectivamente para os somaclones S1, S2, S3 e S4. Não houve diferença entre a
percentagem de sobrevivência dos somaclones.
31
Diferenças no crescimento dos somaclones também puderam ser observadas,
especialmente quando esses foram transferidos da sala de crescimento, onde permaneceram
em condições controladas durante os 56 dias de aclimatização, para a sala com temperatura
ambiente. O somaclone S2 apresentou, visualmente, menor crescimento e desenvolvimento
durante as 4 semanas em que as plantas permaneceram neste novo ambiente, demonstrando
pouco ou nenhum surgimento de perfilhos (Figura 8), além de ter apresentado, desde o cultivo
in vitro, folhas de coloração verde clara, diferindo da cor verde escura apresentada pelas
folhas dos demais somaclones.
0
20
40
60
80
100
0 102030405060
Tempo (dias)
Sobrevivência (%)
0
20
40
60
80
100
0 102030405060
Tempo (dias)
Sobrevivência (%
)
S1 S2 S3 S4
Figura 7: Sobrevivência dos diferentes somaclones de Dioscorea composita, após aclimatização
em bandejas plásticas de 24 cm x 17 cm x 10 cm (A) e diretamente em copos plásticos mantidos
em bande
j
as de 28 L
(
B
)
.
A
B
a
a
b
32
2.3.2.2. Análise da sobrevivência e do crescimento das plantas após a
transferência para a casa de vegetação
Na Tabela 2 é mostrada a percentagem de sobrevivência das plantas dos diferentes
somaclones, após a transferência para a casa de vegetação, onde permaneceram por quatro
meses. Observa-se que a percentagem de sobrevivência varia entre os somaclones, sendo o
menor valor verificado para o somaclone S2. Os demais somaclones apresentaram alta
percentagem de sobrevivência (acima de 88%), com maiores valores para os somaclones S1 e
S4.
Tabela 2. Crescimento de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea composita micropropagadas
e mantidas por quatro meses em casa de vegetação. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones Sobrevivência (%) MFA (g)
a
MSA (g)
a
MSA/MFA
a
MST (g)
a
MST/MSA
a
S1 100 15,56 a 3,97 a 0,26 a 2,86 a 0,69 b
S2 75 2,80 b 0,63 b 0,23 a 0,86 b 1,29 a
S3 88,24 6,09 b 1,55 b 0,26 a 0,56 b 0,46 c
S4 95,83 12,51 a 3,97 a 0,27 a 2,80 a 0,85 ab
a
Médias de seis repetições (somaclone S2) e de pelo menos quinze repetições para os demais somaclones,
seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de
Tukey (p ≤ 0,05). MFA= massa fresca da parte aérea; MSA= massa seca da parte aérea; MST= massa seca do
tubérculo.
A
A
S1 S2 S3 S4
S1 S2 S3 S4
Figura 8: Aspecto geral dos somaclones de Dioscorea composita com 90 dias (A) e 130 dias (B) de
idade.
A B
33
Verifica-se, também, pela Tabela 2, que o menor crescimento ocorreu nas plantas do
somaclone S2. Esse somaclone apresentou os menores valores de massas fresca e seca da
parte aérea (2,80 g e 0,66 g, respectivamente). Entretanto, estes valores não diferiram dos
observados para o somaclone S3, da mesma maneira que os valores de massa seca dos
tubérculos, que, novamente foram os menores. Para todas estas variáveis, os maiores valores
foram os encontrados para os somaclones S1 e S4. Os somaclones não diferiram com relação
aos valores de razão entre massa seca e massa fresca da parte aérea, contudo o somaclone S2
foi o que apresentou a maior razão entre as massas secas do tubérculo e da parte aérea, sendo
o valor (1,29) semelhante ao obtido para o somaclone S4 (0,85).
O somaclone S4 foi o que apresentou os maiores valores de massa fresca e seca dos
tubérculos (7,1 g e 2,69 g, respectivamente) e o menor teor de água (62,8%), sendo os
mesmos similares aos obtidos para o somaclone S1 (Tabela 3). Os menores valores de massa
fresca e seca dos tubérculos foram observados para o somaclone S3 (1,59 g e 0,49 g,
respectivamente), assim como o maior teor de água. Tais valores foram semelhantes aos do
somaclone S2.
Tabela 3. Crescimento de tubérculos de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea composita
micropropagadas e mantidas por quatro meses em casa de vegetação. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones MFT (g)
a
MST (g)
a
MST/MFT
a
Teor de água (%)
a
S1 5,35 ab 1,95 ab 0,36 ab 64,14 bc
S2 2,65 bc 0,86 bc 0,32 bc 68,15 ab
S3 1,59 c 0,49 c 0,31 c 68,99 a
S4 7,10 a 2,69 a 0,37 a 62,80 c
a
Médias de cinco repetições (somaclone S2) e de pelo menos dezessete repetições, para os demais somaclones,
seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de
Tukey (p ≤ 0,05). MFT= massa fresca do tubérculo; MST= massa seca do tubérculo.
34
2.3.3. Determinação da densidade estomática, das dimensões das células-guarda e
dos poros estomáticos dos somaclones S2 e S4
O número médio de estômatos.mm
-2
foi maior para o somaclone S4 (283,33 ± 86,5
estômatos.mm
-2
) do que para o somaclone S2 (215,28 ± 61,9). Porém, em termos do
comprimento e largura das células-guarda, os valores observados para o somaclone S2 foram
superiores (Tabela 4). Entretanto, não foram observadas diferenças entre os somaclones para
as dimensões do poro estomático.
Tabela 4. Densidade estomática e dimensões das células-guarda e do poro estomático de folhas dos
somaclones S2 e S4 de Dioscorea composita cultivados em meio de cultura Murashige & Skoog
suplementado com 2% de sacarose, por dois meses. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
Variáveis
S2
S4
Densidade estomática (n
o
de estômatos.mm
-2
)
a
215,28 ± 61,9 b 283,33 ± 86,5 a
Comprimento da célula-guarda (µm)
a
26,63 ± 3,2 a 24,23 ± 3 b
Largura da célula-guarda (µm)
a
7,26 ± 1,7 a 5,81 ± 1,2 b
Comprimento do poro estomático (µm)
a
15,55 ± 3,5 a 15,38 ± 2,5 a
Largura do poro estomático (µm)
a
9,16 ± 1,9 a 8,35 ± 2 a
a
Médias ± desvio padrão de 32 repetições para densidade estomática e de 40 repetições para dimensões das
células-guarda e dos poros estomáticos, seguidas pelas mesmas letras na mesma linha, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste t de Student (p ≤ 0,05).
2.4. DISCUSSÃO
O estudo sobre o crescimento dos diferentes somaclones de
D. composita mostrou
grande variação na percentagem de brotação e de enraizamento. Em
D. zingiberensis, Chen et
35
al. (2003), obtiveram 74,1% de brotação dos segmentos nodais em meio MS sem adição de
reguladores de crescimento, após 20 dias de cultivo. No mesmo trabalho, a maior
percentagem de brotação observada foi em meio de cultura MS, suplementado com 4,4 µM de
BAP e 1,1 µM de ANA, resultando em 88,9% de segmentos nodais com ramos
desenvolvidos. Esses resultados refletem a variação nas respostas para uma mesma variável e
as diferentes necessidades fisiológicas dentro do gênero
Dioscorea. Pode-se inferir que os
diferentes somaclones de
D. composita, ao contrário de D. zingiberensis, possuem
concentração endógena de hormônios suficiente para desencadear elevadas percentagens de
brotação e de desenvolvimento das gemas axilares, o que parece não ocorrer com
D.
zingiberensis, cuja necessidade de reguladores de crescimento exógenos, para a formação de
ramos, foi registrada nos resultados obtidos por Chen
et al. (2003). O mesmo raciocínio pode
ser aplicado para explicar a diferença na capacidade de enraizamento dos somaclones de
D.
composita. O fato de a rizogênese ocorrer em altas percentagens e na ausência de reguladores
de crescimento, para a maioria dos somaclones estudados, representa uma diminuição dos
custos de produção em escala comercial. Normalmente, meios de cultura específicos para
induzir o enraizamento devem ser desenvolvidos, para a maioria das espécies, o que torna o
processo da micropropagação mais trabalhoso e caro.
O número de nós produzidos por planta, em particular, é uma importante variável de
crescimento, pois em cada nó há gemas axilares, que podem se desenvolver, quando
inoculadas em meio de cultura e originar novas plantas. Esta variável pode, portanto, ser
utilizada para estimar as taxas de multiplicação dos somaclones, indicando o potencial de
propagação vegetativa dos mesmos para uma possível produção de plantas em escala
comercial, para o cultivo e produção da diosgenina. A propagação através da cultura de
segmentos de caule, como os segmentos nodais, é um dos métodos mais favoráveis para
melhor preservação e multiplicação de genótipos superiores de plantas, uma vez que
36
normalmente a habilidade de regeneração não é perdida com o tempo, pois as gemas axilares
ou apicais estão pré-formadas. Somados a isto, os segmentos de caule são fáceis de manter em
condições de luz e sem a adição de reguladores de crescimento (Malmberg
et al., 1985) ou,
ainda, podem ser conservados por determinados períodos de tempo encapsuladas em alginato
de sódio, como demonstrado para
Malus pumila (Sicurari et al., 2001) e espécies florestais
como
Cedrela fissilis (Nunes et al., 2002).
Lauzer
et al. (1992), quando estudaram a propagação in vitro de duas espécies do
gênero
Dioscorea, obtiveram de 2 a 3 nós para cada ramo de D. abyssinica e de 12 a 14 nós
para cada ramo de
D. mangenotiana, após 45 dias de cultivo, em meio de cultura MS
suplementado com ANA (0,5 µM), BAP (4,4 ou 8,9 µM, dependendo da espécie) e sacarose
3%. Borges
et al. (2004), pesquisando a regeneração e multiplicação in vitro de D. alata,
obtiveram, após 60 dias de cultivo, média de 3 nós por planta em meio D-571 (De la Cruz
et
al., 1992), suplementado com manitol em diferentes concentrações (1,5; 3,5 e 5,5%), BAP 0,1
e 1 mg.L
-1
, na presença e ausência de carvão ativado. No presente trabalho, é importante
salientar que o número máximo de nós variando de 3,9 a 5,8 nós por planta, dependendo do
somaclone, foi conseguido na ausência de reguladores de crescimento, o que é um fato
positivo, pois as culturas não são expostas a reguladores de crescimento, que podem induzir
possíveis variações genéticas nas plantas.
O cultivo
in vitro de D. composita foi estudado por Alizadeh et al. (1998), sob
diferentes concentrações de sacarose e reguladores de crescimento. O efeito da sacarose no
número de nós por planta foi maior quando a concentração utilizada no meio de cultura foi de
8 e 10% e com a adição de 2,5 µM de cinetina, quando os autores obtiveram as médias de 17
e 16 nós por planta, respectivamente, após 8 meses de cultura. Quando se utilizou sacarose a
2%, o número de nós foi reduzido, sendo de apenas 8 nós por planta. Entretanto, este número
ainda é superior ao obtido no presente trabalho, sugerindo que a presença da cinetina, no meio
37
de cultura utilizado por esses autores, tenha sido responsável pelas diferenças. Os resultados
obtidos no presente trabalho mostram os diferentes padrões de crescimento das espécies do
gênero
Dioscorea, resultado da grande dispersão de ocorrência deste gênero, sendo
encontrado em quase todos os continentes. Também pode resultar das exigências específicas
em seu ciclo de vida, até mesmo dentro da própria espécie, evidenciando a necessidade,
muitas vezes, de reguladores de crescimento para uma maior obtenção de nós por planta.
O número de folhas produzidas por planta foi uma variável também analisada por
Alizadeh
et al. (1998) em plantas de D. composita, sendo observada uma média de 9 folhas
por planta cultivada em meio MS com sacarose 2%. Chu & Figueiredo-Ribeiro (2002)
também utilizaram esta variável em seus estudos com plantas de
D. bulbifera, D. delicata e D.
olfersiana, sob a influência de diferentes fotoperíodos. Para o fotoperíodo de 12 horas, que os
autores denominaram neutro,
D. bulbifera, D. delicata e D. olfersiana apresentaram média de
3,0; 3,2 e 3,3 folhas por planta, respectivamente. Este resultado é inferior ao encontrado para
os diferentes somaclones de
D. composita neste trabalho, sendo importante ressaltar que,
neste caso, as plantas foram produzidas sob fotoperíodo de 16 horas. No contexto do presente
trabalho, a avaliação do número de folhas é uma variável importante, pois nas folhas de várias
espécies de
Dioscorea, a hidrólise da sacarose é acompanhada pelo aumento na quantidade de
frutose e glucose (Kouassi
et al., 1990), o que acarreta a síntese de diosgenina. De acordo
com Sttaford & Warren (1991), a síntese de diosgenina resulta da via do ácido mevalônico, a
qual está ligada à via glicolítica. Além disso, as espécies de
Dioscorea produtoras de
diosgenina têm, provavelmente, esta produção iniciada nas folhas e somente após, este
metabólito secundário ser translocado e armazenado nos tubérculos. O fato de não terem sido
detectadas diferenças entre o número de folhas produzidas pelas plantas dos diferentes
somaclones de
D. composita é de fundamental importância, pois todos os somaclones não
38
parecem apresentar limitações provocadas pelo menor desenvolvimento da parte aérea da
planta.
As raízes são importantes para a realização de atividades essenciais do metabolismo
vegetal, uma vez que a ramificação intensa dos sistemas radiculares gera uma formidável
superfície de contato com o solo, a qual é multiplicada pela formação dos pêlos absorventes.
Esta superfície de contato com o solo, adquirida pela quantidade suficiente de raízes, é
importante para os sistemas de micropropagação, especialmente na fase de aclimatização,
quando as plantas produzidas
in vitro começam a absorver, de maneira mais ativa, os
nutrientes do solo, os quais se encontram em menor disponibilidade que no meio de cultura. O
fato de o somaclone S2 apresentar a menor percentagem de enraizamento
in vitro pode sugerir
implicações na capacidade de aclimatização deste, além de diminuir a eficiência da produção
em larga escala e indicar a necessidade do direcionamento de esforços para o
desenvolvimento de protocolos mais eficientes de enraizamento para este somaclone. Fato
interessante foi observado ao analisar-se a percentagem de enraizamento das plantas dos
diferentes somaclones, ao longo dos 56 dias de cultivo
in vitro, pois os resultados indicam a
necessidade de se manterem as culturas
in vitro por um tempo mais prolongado para que a
percentagem máxima de enraizamento seja alcançada e para que a fase posterior de
aclimatização, em que a emissão de raízes é de suma importância para a sobrevivência da
planta, não seja afetada.
As diferenças apresentadas na morfogênese e no crescimento
in vitro das plantas dos
diferentes somaclones de
D. composita, iniciadas a partir da cultura de segmentos nodais
caulinares, são evidentes. Essas diferenças indicam que a falta de uniformidade nas respostas
dos somaclones pode ter base na variação somaclonal. De acordo com Jain (2001), a variação
somaclonal pode ser causada por inúmeros fatores, dentre eles a cultura de calos por vários
ciclos e a regeneração de um grande número de plantas cultivadas por longo período. A cada
39
subcultura, as células devem se reprogramar e se reestruturar e esses eventos podem gerar
variação somaclonal nas plantas produzidas novamente (Jain, 2000). Estes fatores podem
explicar as diferenças observadas nas plantas dos diferentes somaclones de
D. composita, que
foram obtidas a partir da regeneração de calos, produzidos na presença de 2,4-D. A indução e
a exploração da variação somaclonal em sistemas de regeneração de plantas a partir de calos,
contudo, é uma forma interessante de gerar e ampliar a variabilidade genética, o que pode
significar o desenvolvimento de plantas com maior capacidade de tuberização e produção de
diosgenina.
As diferenças encontradas entre os somaclones, em termos da sobrevivência durante a
aclimatização podem, também, ser conseqüência de variação somaclonal. As condições
fisiológicas e anatômicas das plantas obtidas por cultura de tecidos
in vitro também são
importantes para o estabelecimento e sobrevivência destas quando transferidas das condições
in vitro para as condições in vivo. O desenvolvimento do sistema radicular exerce papel
fundamental no sucesso da aclimatização. O menor desenvolvimento do somaclone S2 pode
estar relacionado com o pouco desenvolvimento de seu sistema radicular. Kadlecek
et al.
(2001), propõem possíveis danos ao sistema radicular, causados durante o processo de
transferência das plantas para a situação
in vivo. Estes danos ocasionariam dificuldade na
absorção de água e de nutrientes do solo e, como conseqüência, dificuldade na aclimatização.
As plantas dos diferentes somaclones apresentaram alta percentagem de sobrevivência
quando transferidas para casa de vegetação, última etapa da fase de aclimatização. Este
resultado mostra a capacidade de adaptação das plantas a um novo ambiente, e a importância
do processo de aclimatização em bandejas plásticas, uma vez que as plantas foram,
gradualmente, se ajustando às novas condições de luminosidade, temperatura e umidade
relativa que encontraram na casa de vegetação. A menor massa fresca e seca da parte aérea
das plantas do somaclone S2 pode ser conseqüência da pouca ou nenhuma formação de
40
perfilhos observada para este somaclone. O mesmo resultado, para estas duas variáveis, foi
observado nas plantas do somaclone S3, entretanto, este somaclone apresentou, visualmente,
desenvolvimento normal dos perfilhos.
Os resultados sobre os menores valores de massa fresca e seca dos tubérculos das
plantas dos somaclones S2 e S3, em relação às do somaclone S4, sugerem que sejam devidos
a dois fatos: menor massa fresca e seca da parte aérea ou ao maior teor de água encontrado
nos tubérculos. Além disso, é possível que, nas plantas dos somaclones S2 e S3, os compostos
sintetizados nas partes aéreas estariam sendo utilizados antes de serem armazenados nos
órgão subterrâneos, acarretando a diminuição das massas frescas e secas dos tubérculos.
O estresse causado pelo déficit hídrico, durante o processo de aclimatização, está
diretamente relacionado com a baixa percentagem de sobrevivência de muitas espécies,
quando transferidas para casa de vegetação. Diferenças na anatomia foliar de cada somaclone
podem estar relacionadas com a perda de água e com as diferentes respostas dos somaclones à
aclimatização. A perda de água pelas folhas pode se dar através dos estômatos ou pela
cutícula. A cutícula, membrana composta por uma cutina matriz, juntamente com ceras
internas e superficiais, protege os tecidos das plantas, limitando a perda de água por
transpiração. Folhas de plantas cultivadas
in vitro possuem uma camada mínima ou
inexistente de cera protetora (Tombolato & Costa, 1998). Essa carência de ceras em plantas
cultivadas
in vitro permite uma perda de água excessiva, resultando na dessecação, que pode
levar a danos e diminuir a taxa de sobrevivência das plantas (Sutter, 1985). Isto ocorre devido
à exposição das plantas às alterações bruscas nas condições ambientais, pois são
características da cultura
in vitro, a baixa intensidade luminosa e a alta umidade relativa do ar.
Nas condições
in vitro, os estômatos apresentam-se pouco funcionais, ocasionando
dificuldade no controle da abertura e fechamento destes, quando transferidos para condições
in vivo. Esta hipótese estimulou a realização do experimento para a determinação da
41
densidade estomática e das dimensões das células-guarda e dos poros estomáticos dos
somaclones S2 e S4, que apresentaram diferenças entre a percentagem de sobrevivência. Os
resultados indicaram haver variação somaclonal entre as plantas desses dois somaclones,
sugerindo que a característica de maior densidade estomática de S4 associada às
características das dimensões das células-guarda, pode ter resultado em maior eficiência
fisiológica. Assim, este pode ter sido um dos fatores responsáveis pela melhor aclimatização
do somaclone S4.
Os resultados obtidos no presente trabalho estão de acordo com aqueles obtidos em
estudos conduzidos com outras espécies, os quais mostram que há uma relação inversa entre o
tamanho do estômato e a densidade estomática (Muchow & Sinclair, 1989; Romero-Aranda
et
al., 1994). Conforme Larcher (2000), a diminuição da transpiração é influenciada, também,
pela distância entre os estômatos. A maior proximidade dos estômatos faz com que ocorram
arcos de transpiração, ou seja, a formação de um microclima ocasionado pela maior umidade
próxima aos estômatos. O mesmo autor conclui, ainda, que a diferença entre a densidade
estomática e as dimensões das células-guarda pode ser conseqüência das adaptações das
plantas às condições locais nas quais se encontram. Essas características variam de espécie
para espécie, podendo ocorrer diferenças mesmo entre os indivíduos de uma mesma espécie.
A densidade estomática também depende das divisões e diferenciações celulares, podendo os
diversos ciclos da cultura de tecidos
in vitro terem influenciado na morfogênese destes
somaclones. Possíveis variações genéticas podem ser a causa da diferença nos tamanhos das
células-guarda dos somaclones de
D. composita. Masterson (1994), em seus estudos com
plantas fossilizadas, mostra que a poliploidia, definida como um aumento no número de
cromossomos (Torres
et al., 2000), aumenta o tamanho celular. Este evento genético poderia
estar sendo verificado nas plantas do somaclone S2. As diferenças encontradas no
42
comprimento e na largura das células-guarda dos dois somaclones não influenciaram as
dimensões do poro estomático.
A diferença visual na coloração das folhas do somaclone S2, quando comparado com
os demais somaclones, pode ser explicada pela possível carência de pigmentos fotossintéticos.
Geralmente plantas cultivadas sob baixa intensidade luminosa, tais como o que ocorre sob
condições
in vitro, tendem a priorizar a síntese de clorofila de forma a propiciar maior
absorção de luz (Taiz & Zeiger, 2004). Porém, com a variação somaclonal observada neste
trabalho é possível inferir que a rota de biossíntese da clorofila para o somaclone S2 possa ter
sofrido alguma alteração que não permitiu que as células deste somaclone pudessem
completar a síntese das clorofilas. Além disso, a presença de transposons, série de elementos
genéticos que podem ocasionalmente ser transportada de uma posição para outra no mesmo
cromossomo ou em cromossomos diferentes, ou serem também inseridos em regiões
específicas de expressão de pigmentos, podem fazer com que esta inserção interfira com a
função de um gene codificador para o pigmento clorofila (Marcotrigiano, 1997) acarretando,
assim, numa deficiência do somaclone S2 para a captação de luz e realização da fotossíntese,
contribuindo para a baixa percentagem de sobrevivência observada.
2.5. CONCLUSÕES
1. Os segmentos de caule contendo a gema axilar dos diferentes somaclones
apresentam diferenças quanto à capacidade de morfogênese (formação de novos ramos e
enraizamento)
in vitro.
43
2. As plantas micropropagadas dos diferentes somaclones apresentam padrões
diferentes de crescimento, quando cultivadas em meio de cultura e quando aclimatizadas em
casa de vegetação.
3. A aclimatização em bandejas plásticas (24 cm x 17 cm x 10 cm) proporciona
diferenças na percentagem de sobrevivência dos diferentes somaclones, o que não é
observado durante a aclimatização em copos plásticos mantidos em bandejas de 28 L. Pela
praticidade e eficiência recomenda-se a aclimatização nesta última condição.
4. As diferenças nas variáveis anatômicas (densidade estomática e dimensões das
células guarda dos estômatos) indicam ser a causa da baixa percentagem de sobrevivência e
do crescimento do somaclone S2 em relação aos demais.
5. Plantas completas dos diferentes somaclones são produzidas
in vitro em meio de
cultura desprovido de reguladores de crescimento e aclimatizadas com sucesso.
44
CAPÍTULO 3
MORFOGÊNESE E CRESCIMENTO IN VITRO DE SOMACLONES DE D. composita
NA PRESENÇA DE DIFERENTES REGULADORES DE CRESCIMENTO.
3.1. INTRODUÇÃO
A morfogênese e o crescimento
in vitro são extremamente influenciados pela
disponibilidade de nutrientes no meio de cultura. Além disso, a composição do meio de
cultura, englobando os nutrientes e os reguladores de crescimento (tipo e concentração), entre
outros fatores, influenciam os processos de crescimento e desenvolvimento das plantas
cultivadas
in vitro. Por isso, a composição química adequada de um meio de cultura é um
aspecto bastante importante na cultura de tecidos vegetais, pelo fato de influenciar
diretamente no processo de morfogênese e crescimento.
Neste contexto, o uso de reguladores de crescimento e de fontes nitrogenadas no meio
de cultura é, muitas vezes, responsável pelo desenvolvimento da parte aérea e radicular, bem
como dos microtubérculos de plantas de
Dioscorea.
Os reguladores de crescimento agem como moléculas sinalizadoras responsáveis por
vários efeitos no desenvolvimento do vegetal (Taiz & Zeiger, 2004), sendo definidos como
compostos que, em baixas concentrações, regulam os processos fisiológicos das plantas,
principalmente o crescimento e o desenvolvimento. São necessários para o crescimento e
45
desenvolvimento de tecidos caulinares isolados, que ao contrário das raízes, desenvolvem-se
pouco em meio nutritivo sob ausência de reguladores de crescimento (Taiz & Zeiger, 2004).
Estes mesmos autores sugerem que haja uma relação entre a parte aérea e a radicular,
podendo alguns fatores derivados das raízes regularem o crescimento da parte aérea.
O desenvolvimento vegetal pode ser regulado pelas diferentes classes de reguladores
de crescimento. No presente capítulo, estudou-se apenas a influência de três classes de
reguladores de crescimento: as auxinas, as citocininas e as giberelinas. As auxinas e as
citocininas, ao contrário dos demais hormônios vegetais e agentes de sinalização, são
necessárias para a sobrevivência do vegetal, não sendo encontrado ainda nenhum mutante
com deficiência em auxina e citocinina, sugerindo que esta deficiência seja letal (Taiz &
Zeiger, 2004). As giberelinas estão envolvidas em muitos processos fisiológicos vegetais,
especialmente na divisão e alongamento celular (Arteca, 1996).
Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do ácido giberélico, auxinas
(ANA, AIB) e citocininas (BAP e 2iP) sobre a morfogênese e o crescimento
in vitro de
plantas dos diferentes somaclones de
D. composita.
3.2. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes
somaclones de D. composita
46
Foram utilizadas plantas de Dioscorea composita Hemsl regeneradas de um único calo
produzido a partir da cultura de embrião zigótico, segundo a metodologia descrita por Viana
& Mantell (1989). Estas plantas, denominadas somaclones S1, S2, S3, S4, S5, foram isoladas
do calo e multiplicadas, durante 60 dias, através da cultura de segmentos nodais caulinares
contendo gema axilar foliar em meio de cultura MS (Sigma, Co.) (Murashige & Skoog,
1962), suplementado com sacarose 2% (p/v) e Phytagel
®
(Sigma, Co.) a 0,2% (p/v). O pH do
meio de cultura foi ajustado para 5,8 com NaOH 1 M ou HCl 1 N, antes da autoclavagem,
sendo distribuídos 8 mL de meio em cada tubo de ensaio (25 mm x 150 mm), fechados com
tampas de polipropileno, autoclavados durante 18 minutos a 1,1 Kgf.cm
-2
, em temperatura de
121ºC. Após a inoculação, cada tubo foi fechado com um filme de polipropileno (72 mm x 72
mm), preso com elástico de borracha e com uma tira de filme de PVC.
As culturas dos diferentes somaclones foram mantidas em sala de crescimento com
temperatura controlada (25ºC ± 2ºC), sob fotoperíodo de 16 horas fornecido por lâmpadas
fluorescentes Phillips TDL, com fluxo de fótons de 22,3 µmol.m
-2
.s
-1
e umidade relativa de
70%. Estas condições de cultura foram utilizadas em todos os experimentos descritos a seguir,
exceto quando outras condições foram requeridas.
3.2.2. Efeito de diferentes reguladores de crescimento sobre a morfogênese e o
crescimento in vitro
Foram utilizadas plantas inteiras dos diferentes somaclones com idades entre 77 e 90
dias, cultivadas nas condições descritas no item 3.2.1. As plantas foram inoculadas em 10 mL
de meio de cultura MS, em tubos de ensaio (25 mm x 150 mm), suplementado com 8% de
sacarose e 0,2% de Phytagel e com 5 µM dos seguintes reguladores de crescimento, utilizados
47
isoladamente: ácido naftalenoacético (ANA), ácido indolbutírico (AIB), 6-benzilaminopurina
(BAP), 6- γ- γ-(dimetilamina) purina (2iP) e ácido giberélico (GA
3
). O meio de cultura
testemunha não continha reguladores de crescimento.
Após 4 meses, as culturas foram avaliadas quanto à percentagem de formação de
ramos, de raízes, de microtubérculos, de bulbilhos aéreos. O crescimento das culturas foi
avaliado pela determinação da massa seca da parte aérea, das raízes e dos microtubérculos,
número de nós, de gemas e de folhas. A partir desses dados foi calculado o teor de água dos
microtubérculos, assim como a razão massa seca/massa fresca da parte aérea, dos
microtubérculos e a razão massa seca do tubérculo/massa seca da parte aérea. Foram
utilizadas 12 repetições de cada somaclone para cada regulador de crescimento.
3.2.3. Determinação da massa seca das plantas
Após a determinação da massa fresca, as partes aéreas, os microtubérculos e as raízes
das plantas produzidas em cada tratamento foram colocadas em embalagens de papel e
mantidas em estufa por pelo menos 48 horas a 85ºC. O teor de água dos microtubérculos foi
expresso em percentagem da massa fresca e determinado através da seguinte fórmula:
Teor de água (% da massa fresca) = (massa fresca – massa seca)/massa fresca*100.
Esta metodologia foi utilizada em todos os experimentos descritos a seguir, exceto
quando outras condições foram requeridas.
48
3.2.4. Análise estatística
Os experimentos obedeceram a um delineamento estatístico completamente
casualizado. Os dados foram submetidos à análise de variância simples (ANOVA) e a
comparação das médias foi feita pelo teste de Tukey, ao nível de significância de 5% (p ≤
0,05) (Gomez & Gomez, 1984). Quando necessário, alguns dados foram submetidos ao teste
t, ao nível de significância de 5% (p ≤ 0,05) (Sokal & Rohlf, 1969).
3.3. RESULTADOS
3.3.1. Efeito dos reguladores de crescimento sobre a morfogênese das plantas dos
diferentes somaclones
Plantas dos diferentes somaclones apresentaram quatro diferentes respostas de
morfogênese: formação de ramos, formação de raízes, tuberização e/ou formação de bulbilhos
aéreos, em função do tratamento (Tabela 1). A percentagem de senescência das plantas foi
maior para o somaclone S2, em todos os tratamentos. No tratamento com o AIB, este valor
alcançou 66,7%. Além disso, todas as plantas desse somaclone, que sobreviveram, formaram
ramos, raízes e microtubérculos. Da mesma forma, em todos os demais somaclones, em todos
os tratamentos, a percentagem de explantes que formaram ramos e raízes foi de 100%. Não
foi observada senescência para o somaclone S3. Para o somaclone S1, a percentagem máxima
de senescência observada foi de 8,3% para o GA
3
e 2iP, enquanto que para o somaclones S4 e
49
S5, os valores observados foram respectivamente de 8,3%, para o AIB e 16,7%, para a
testemunha.
Tabela 1. Morfogênese das plantas de diferentes somaclones de Dioscorea composita cultivadas por
12 semanas em meio de cultura Murashige & Skoog suplementado com 8% de sacarose, na ausência
ou na presença de 5µM de diferentes reguladores de crescimento. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones Reguladores de
crescimento
Ramos
(%)
Raízes
(%)
Tuberização
(%)
Bulbilhos
Aéreos (%)
Senescência
(%)
GA3 100 100 100 8,3 8,3
ANA 100 100 100 8,3 0
AIB 100 100 100 16,7 0
BAP 100 100 83,3 0 0
2iP 100 100 100 0 8,3
S1
Testemunha 100 100 100 0 0
GA3 100 100 100 25 0
ANA 100 100 100 8,3 25
AIB 100 100 100 8,3 66,7
BAP 100 100 100 0 8,3
2iP 100 100 100 0 16,7
S2
Testemunha 100 100 100 16,7 16,7
GA3 100 100 100 8,3 0
ANA 100 100 92 0 0
AIB 100 100 100 0 0
BAP 100 100 50 0 0
2iP 100 100 100 0 0
S3
Testemunha 100 100 100 0 0
GA3 100 100 100 8,3 0
ANA 100 100 100 8,3 0
AIB 100 100 100 0 8,3
BAP 100 100 83,3 0 0
2iP 100 100 100 0 0
S4
Testemunha 100 100 100 8,3 0
GA3 100 100 100 41,7 0
ANA 100 100 100 0 0
AIB 100 100 100 16,6 0
BAP 100 100 66,7 0 0
2iP 100 100 100 0 0
S5
Testemunha 100 100 100 8,3 16,7
Com relação à indução de microtubérculos, ainda na Tabela 1, observa-se que, para os
somaclones S1, S4 e S5, houve redução na percentagem de culturas que formaram
microtubérculos, apenas nos tratamentos com BAP. Em todos os demais tratamentos,
incluindo a testemunha, 100% das plantas inoculadas sofreram indução. Verifica-se que o
50
BAP promoveu a menor percentagem de indução de microtubérculos nas plantas dos
diferentes somaclones, inclusive quando comparado com os meios de cultura sem reguladores
de crescimento. Entretanto, para o somaclone S2, o BAP foi eficiente, e todas as plantas deste
somaclone, em meio de cultura contendo BAP induziram microtubérculos. Para o somaclone
S3, este regulador de crescimento teve eficiência bastante reduzida na indução de
microtubérculos e apenas 50% das plantas produziram microtubérculos. Já para o somaclone
S2, verificou-se que em todos os tratamentos houve 100% de indução e que, para o somaclone
S3, a percentagem de indução com ANA também foi reduzida para 92%.
A formação de bulbilhos aéreos ocorreu em todos os somaclones no tratamento com
GA
3
, sendo a maior percentagem observada para o somaclone S5 (41,7%). O ANA induziu a
formação de bulbilhos aéreos apenas nos somaclones S1, S2 e S4, enquanto que na presença
de AIB, apenas os somaclones S1, S2 e S5 responderam. Já na ausência de reguladores de
crescimento, apenas os somaclones S2, S4 e S5 apresentaram bulbilhos aéreos. O BAP e o 2iP
não induziram a formação de bulbilhos aéreos em qualquer dos somaclones, estimulando até
certa inibição, uma vez que na ausência de reguladores de crescimento, os somaclones S2, S4
e S5 formaram bulbilhos aéreos.
3.3.2. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento dos
microtubérculos
Para cada somaclone o crescimento dos microtubérculos foi diferente dependendo do
regulador de crescimento utilizado (Tabela 2). Todos os reguladores de crescimento foram
eficientes em promover o crescimento dos microtubérculos, quando comparados com as
testemunhas.
51
Tabela 2. Efeito de reguladores de crescimento sobre o crescimento e teor de água de microtubérculos
de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de
plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na
ausência ou presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Reguladores de
crescimento
Somaclones MST (mg)
a
MST/MFT
a
MST/MSA
a
Teor de água (% MFT)
a
GA
3
161,2 a 0,26 ab 2,01 a 73,1 de
ANA 166,2 a 0,16 e 1,11 b 83,7 a
AIB 145,6 ab 0,22 cd 1,04 b 78,05 bc
BAP 66,4 c 0,19 de 0,66 b 80,6 ab
2iP 117,7 abc 0,30 a 1,12 b 69,7 e
Testemunha
S1
79,7 bc 0,24 bc 0,60 b 75,3 cd
GA
3
101,8 c 0,25 a 1,35 c 74,8 c
ANA 262,2 a 0,15 c 3,76 abc 84,8 a
AIB 199,7 ab 0,17 bc 4,25 abc 82,23 ab
BAP 197,6 ab 0,15 c 4,50 ab 84,66 a
2iP 185,3 ab 0,22 ab 5,64 a 77,58 bc
Testemunha
S2
140,1 bc 0,24 a 1,54 bc 76,1 c
GA
3
48,7 b 0,24 a 0,6 bc 76,1 c
ANA 123,3 a 0,2 bc 1,47 a 79,5 ab
AIB 99,3 a 0,22 ab 0,93 abc 77,9 bc
BAP 17,7 b 0,18 c 0,23 c 81,7 a
2iP 101,4 a 0,22 ab 1,22 ab 77,7 bc
Testemunha
S3
58,2 b 0,23 ab 0,62 bc 76,5 bc
GA
3
122,8 ab 0,26 a 1,79 a 73,3 b
ANA 150,2 a 0,18 b 1,12 ab 81,64 a
AIB 152,1 a 0,23 ab 1,13 ab 77,07 ab
BAP 65,4 b 0,20 b
0,91 b 79,8 a
2iP 120,7 ab 0,27 a 1,09 ab 72,5 b
Testemunha
S4
80,9 b 0,26 a 0,58 b 73,5 b
GA
3
163,6 a 0,27 a 2,53 a 72,7 c
ANA 128,8 ab 0,22 bc 1,11 b 77,9 ab
AIB 95,9 b 0,25 ab 0,64 b 74,7 bc
BAP 63,4 b 0,18 c 0,73 b 81,8 a
2iP 114,8 ab 0,24 ab 2,05 a 75,2 bc
Testemunha
S5
67,4 b 0,27 ab 0,49 b 72,9 bc
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MST= massa seca do microtubérculo;
MFT= massa fresca do microtubérculo; MSA= massa seca da parte aérea.
Para o somaclone S1, GA
3
e ANA promoveram a maior massa seca quando
comparados com o BAP e a testemunha. Porém, a razão entre a massa seca e a massa fresca
dos microtubérculos foi bastante inferior à testemunha quando o somaclone S1 foi inoculado
em meio contendo ANA. Como conseqüência, o maior teor de água (83,7%) foi encontrado
nos microtubérculos deste somaclone em presença de ANA. O contrário ocorreu quando o
52
somaclone S1 foi inoculado em meio de cultura contendo 2iP, que originou a maior razão
entre a massa seca e a massa fresca dos microtubérculos (0,30) e apresentou o menor teor de
água (69,7%), sendo inferior, inclusive, em relação à testemunha. Apenas o GA
3
promoveu o
maior valor de razão entre a massa seca do microtubérculo e massa seca da parte aérea (2,01)
quando comparado a todos os demais tratamentos.
Para o somaclone S2, a maior massa seca dos microtubérculos foi observada na
presença de ANA (262,2 mg), mas este resultado diferiu apenas dos obtidos com o GA
3
e a
testemunha. Na presença do GA
3
e na testemunha, o somaclone S2 apresentou os maiores
valores de razão entre as massas seca e fresca dos microtubérculos e estes valores diferiram
dos obtidos com ANA, AIB e BAP. Os reguladores que estimularam o aumento da massa seca
dos microtubérculos foram os mesmos que promoveram os maiores valores de razão entre as
massas secas do microtubérculo e da parte aérea, com destaque para o 2iP, cuja razão foi de
5,64. O GA
3
, por outro lado, foi o regulador de crescimento com o qual foi observada a menor
razão. O teor de água encontrado nos microtubérculos do somaclone S2 foi maior para os
reguladores que induziram a menor razão entre a massa seca e a massa fresca dos
microtubérculos, ou seja, ANA e BAP. Os valores obtidos para estes tratamentos diferiram
apenas do GA
3
, 2iP e da testemunha.
Os reguladores de crescimento ANA, AIB e 2iP promoveram o crescimento em massa
seca dos microtubérculos do somaclone S3, em relação aos demais tratamentos. A presença de
BAP no meio de cultura tornou a razão entre a massa seca e a massa fresca dos
microtubérculos inferior à testemunha e aos demais reguladores de crescimento, com exceção
do ANA. Em meio contendo ANA, o somaclone S3 apresentou o maior valor da razão entre
as massas secas do microtubérculo e da parte aérea (1,47), sendo que este valor diferiu do
GA
3
, BAP e testemunha. Os maiores teores de água foram verificados nos microtubérculos
53
formados na presença de BAP (81,7%) e ANA (79,5%) e os menores teores nos demais
tratamentos.
Para o somaclone S4, o AIB e o ANA produziram os maiores valores de massa seca
dos microtubérculos (152,1 e 150,2 mg, respectivamente), quando comparados com o BAP
(65,4 mg) e com a testemunha (80,9 mg). Este somaclone apresentou os valores de razão entre
as massas secas e frescas dos microtubérculos inferiores ao controle quando inoculado em
meio contendo ANA (0,18) e BAP (0,20) e, conseqüentemente, os maiores teores de água
quando na presença destes mesmos reguladores de crescimento. Os menores valores de razão
entre as massas secas do microtubérculo e da parte aérea foram observados na presença de
BAP (0,91) e na testemunha (0,58), mas estes valores diferiram apenas do obtido com o GA
3
.
O somaclone S5 apresentou maior massa seca dos microtubérculos na presença de
GA
3
no meio de cultura (163,6 mg). Entretanto, este valor não diferiu dos obtidos com ANA e
2iP. A razão entre as massas seca e fresca dos microtubérculos foi menor em meio de cultura
com BAP (0,18) do que nos tratamentos com GA
3
, AIB, 2iP e a testemunha. Não foram
observadas diferenças entre os valores da razão das massas secas dos microtubérculos e das
partes aéreas obtidos com as auxinas e a testemunha. Apenas com o GA
3
e 2iP foram obtidos
valores maiores. O teor de água presente nos microtubérculos do somaclone S5 foi maior na
presença de BAP (81,8%), mas não diferiu do obtido na presença de ANA.
As plantas responderam de maneira variada ao estímulo de um mesmo regulador de
crescimento ou à ausência dos mesmos (Tabela 3).
54
Tabela 3. Influência dos somaclones sobre o crescimento e teor de água de microtubérculos de
diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de
plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na
ausência ou presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones
Reguladores de
crescimento
MST (mg)
a
MS/MF
a
MST/MSA
a
Teor de água (% MF)
a
S1 161,2 a 0,26 ab 2,01 ab 73,1 ab
S2 101,8 ab 0,25 ab 1,35 bc 74,8 ab
S3 48,7 b 0,24 b 0,63 c 76,1 a
S4 122,8 a 0,26 ab 1,79 ab 73,3 ab
S5
GA
3
163,6 a 0,27 a 2,53 a 72,7 b
S1 166,3 b 0,16 bc 1,1 b 83,7 ab
S2 262,2 a 0,15 c 3,8 a 84,8 a
S3 123,4 b 0,21 ab 1,5 b 79,5 bc
S4 150,2 b 0,18 abc 1,1 b 81,6 abc
S5
ANA
128,8 b 0,22 a 1,1 b 77,9 c
S1 145,6 ab 0,22 ab 1,04 b 78,05 ab
S2 199,7 a 0,17 b 4,25 a 82,2 a
S3 99,3 b 0,22 ab 0,93 b 77,9 ab
S4 152,1 ab 0,23 ab 1,13 b 77,1 ab
S5
AIB
95,9 b 0,25 a 0,64 b 74,7 b
S1 66,4 b 0,19 a 0,66 b 80,6 a
S2 197,6 a 0,15 a 4,50 a 84,7 a
S3 17,7 b 0,18 a 0,23 b 81,7 a
S4 65,4 b 0,20 a
0,91 b 79,8 a
S5
BAP
63,4 b 0,18 a 0,73 b 81,8 a
S1 117,7 ab 0,30 a 1,12 b 69,7 c
S2 185,3 a 0,22 c 5,64 a 77,6 a
S3 101,4 b 0,22 c 1,22 b 77,7 a
S4 120,7 ab 0,27 ab 1,09 b 72,5 bc
S5
2iP
114,8 b 0,24 bc 2,05 b 75,2 ab
S1 79,7 b 0,24 a 0,6 b 75,3 a
S2 140,1 a 0,24 a 1,54 a 76,1 a
S3 58,2 b 0,23 a 0,62 b 76,5 a
S4 80,9 b 0,26 a 0,58 b 73,5 a
S5
Testemunha
67,4 b 0,27 a 0,49 b 72,9 a
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MF= massa fresca; MST= massa seca dos
microtubérculos; MSA= massa seca da parte aérea.
Na ausência de reguladores de crescimento ou na presença do BAP, o somaclone S2
apresentou os maiores valores de massa seca dos microtubérculos e de razão entre a massa
seca do microtubérculo e da parte aérea. Em termos de razão massa seca/massa fresca do
microtubérculo e de teor de água, também não foram observadas diferenças entre os
somaclones para ambos os tratamentos. O 2iP também promoveu o maior crescimento em
55
massa seca dos microtubérculos do somaclone S2 (185,3 mg) em relação a S3 e S5. O mesmo
resultado foi observado para a razão entre massa seca do microtubérculo e massa seca da parte
aérea, mas neste caso o valor foi superior a todos os demais somaclones. Contudo, o maior
valor da razão entre as massas seca e fresca do microtubérculo (0,3) e o menor teor de água
foram obtidos para o somaclone S1, sendo diferentes dos somaclones S2, S3 e S5.
Quando os explantes dos diferentes somaclones foram cultivados em meio de cultura
com GA
3,
o somaclone S3 produziu microtubérculos com a menor massa seca, diferindo dos
valores obtidos para S1, S4 e S5. A maior razão entre as massas seca e fresca do
microtubérculo (0,27) e o menor teor de água (72,7%) foram observados para o somaclone
S5, diferindo, porém, apenas do S3. Já a maior razão entre a massa seca do tubérculo e da
parte aérea foi observada para o somaclone S5 (2,52), diferindo dos somaclones S2 e S3.
Na presença de ANA, o somaclone S2 apresentou a maior média de massa seca do
microtubérculo dentre todos os somaclones. Entretanto, a maior razão entre a massa seca e
fresca dos microtubérculos foi obtida para o somaclone S5 (0,22) diferindo apenas dos
obtidos em S1 e S2. Em termos da razão entre as massas secas do microtubérculo e da parte
aérea, verifica-se que o somaclone S2 foi superior aos demais. Da mesma forma, este
somaclone apresentou maior teor de água (81,6%) do que os somaclones S3 e S5.
O AIB promoveu o maior incremento em massa seca dos microtubérculos (199,7mg).
A maior razão entre massa seca do microtubérculo e da parte aérea foi observada para o
somaclone S2 (4,25). O valor de massa seca diferiu dos obtidos em S3 e S5 e o valor da razão
diferiu de todos os demais tratamentos. Em termos da razão entre a massa seca do
microtubérculo e da parte aérea, observa-se que o somaclone S5 foi superior em relação ao
S2, apresentando também o menor teor de água.
56
Na Tabela 4 são apresentadas as freqüências das classes de massa seca dos
microtubérculos produzidos pelos diferentes somaclones na presença ou ausência de
reguladores de crescimento.
Tabela 4. Distribuição por classes de freqüência (%) de massa seca de microtubérculos e número total
de microtubérculos formados por tratamento (entre parênteses) dos diferentes somaclones de
Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de plantas em meio de cultura
Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na ausência ou presença de 5
μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
a
Reguladores de
crescimento
Classes de
MST (mg)
S1 S2 S3 S4 S5
≤ 100 18
(11) 50 (12) 100 (12) 25 (12) 33 (12)
101-150 27 33 0 50 8
151-200 27 17 0 17 17
201-300 27 0 0 8 42
GA
3
> 300 0 0 0 0 0
≤ 100 8 (12) 0 (9) 36 (11) 17 (12) 8 (12)
101-150 17 0 36 25 75
151-200 50 11 18 50 17
201-300 25 78 0 8 0
ANA
> 300 0 11 0 0 0
≤ 100 25 (12) 0 42 (12) 8 (12) 58 (12)
101-150 33 0 58 67 33
151-200 8 50 (4) 0 0 8
201-300 33 50 0 8 0
AIB
> 300 0 0 0 0 0
≤ 100 80 (10) 9 (11) 100 (6) 80 (10) 75 (8)
101-150 10 18 0 10 25
151-200 10 18 0 10 0
201-300 0 55 0 0 0
BAP
> 300 0 0 0 0 0
≤ 100 36 (11) 10 (10) 50 (12) 42 (12) 36 (11)
101-150 36 20 33 33 45
151-200 27 30 8 17 18
201-300 0 30 8 8 0
2iP
> 300 0 10 0 0 0
≤ 100 58 (12) 17 (12) 100 (12) 75 (12) 50 (12)
101-150 44 42 0 25 25
151-200 0 8 0 0 0
201-300 0 17 0 0 0
Testemunha
> 300 0 0 0 0 0
a
Valores de proporções calculadas com base no número total de microtubérculos formados de, pelo menos, seis
repetições. MST= massa seca dos microtubérculos.
Verifica-se que, na ausência de reguladores de crescimento, em todos os somaclones,
exceto o S2, a totalidade dos microtubérculos formados apresentaram no máximo 150 mg de
57
massa seca. Neste tratamento o somaclone S2 foi o único que formou 30% dos
microtubérculos com maior massa seca, entre 151 mg e 300 mg. Entretanto, na presença de
GA
3,
os somaclones S1, S4 e S5 apresentaram 54%, 25% e 59% dos microtubérculos nesta
classe de massa seca, respectivamente. Contudo, no somaclone S2 83% dos microtubérculos
tiveram massa seca menor que 150 mg e apenas 17% deles alcançaram no máximo massa seca
entre 151 mg e 200 mg. Todos os microtubérculos formados pelo somaclone S3, na presença
de GA
3
, apresentaram massa seca menor que 100 mg.
Na presença de ANA os somaclones S1, S2 e S4 apresentaram, respectivamente, 75%,
100% e 58% dos microtubérculos com massa seca entre 151 e 300 mg, sendo que o S2 não
formou microtubérculos menores que 151 mg e 11% deles tinham massa seca superior a 300
mg. Por outro lado, os somaclones S3 e S5 não formaram microtubérculos com massa seca
superior a 200 mg. Com o AIB 100% dos microtubérculos do somaclone S3, 75% do S4 e
91% do S5 foram menores que 150 mg, enquanto que 41% dos microtubérculos do S1 e 100%
do S2 tiveram massa seca entre 151 e 200 mg, apesar da baixa percentagem de sobrevivência
das culturas do S2.
Na presença de BAP, de 75% a 100% dos microtubérculos dos somaclones S1, S3, S4
e S5 apresentaram massa seca menor que 100 mg e apenas o S2 apresentou 73% dos
microtubérculos com massa seca entre 151 mg e 300 mg. A totalidade dos microtubérculos do
somaclone S1 foi menor que 100 mg e não foram formados microtubérculos maiores que 201
mg nos somaclones S1, S3, S4 e S5. Quando o 2iP foi utilizado observa-se, novamente, que
apenas o somaclone S2 apresentou 70% dos microtubérculos maiores que 151 mg, onde 40%
destes pesaram mais que 201 mg. Os somaclones S1, S3, S4 e S5 apresentaram de 72% a 81%
dos microtubérculos menores que 150 mg na presença de 2iP. Apenas uma baixa proporção
deles, entre 8% e 27%, tiveram massa seca entre 151 mg e 200 mg e somente em S3 e S4 8%
dos microtubérculos foram superiores a 200 mg.
58
Na Tabela 5 estão representados os resultados de três experimentos independentes,
conduzidos para os somaclones S1 e S4, que confirmam os resultados obtidos no experimento
anterior, para os tratamentos com ausência ou presença de GA
3
na concentração de 5 μM.
Observa-se que, na ausência de reguladores de crescimento, tanto o somaclone S1 quanto o
S4, em todos os experimentos conduzidos, apresentaram microtubérculos cuja totalidade não
ultrapassou 200 mg de massa seca. Por outro lado, nos experimentos com GA
3
, o somaclone
S1 apresentou de 21% a 49% de microtubérculos com massa seca superior a 151 mg, com
pelo menos 25% destes pesando entre 201 mg e 300 mg. Em todos os experimentos
conduzidos para o somaclone S4, 66% dos microtubérculos ultrapassaram 151 mg, e, de 33%
a 50% destes pesaram entre 201 mg e 300 mg.
Tabela 5. Distribuição por classes de freqüência (%) de massa seca de microtubérculos e número total
de microtubérculos formados por tratamento (entre parênteses) pelos somaclones S1 e S4 de
Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de plantas em meio de cultura
Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na ausência ou presença de 5
μM de GA
3
. Dados de três experimentos independentes. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006
Experimentos
a
Tratamentos Somaclones Classes de
MST (mg)
1 2 3 Média
S1 ≤ 100 42 (12) 42 (12) 58 (12) 33
101-150 0 8 42 17
151-200 58 50 0 36
201-300 0 0 0 0
> 300 0 0 0 0
S4 ≤ 100 0 33 (12) 75 (12) 36
101-150 33 (12) 8 25 22
151-200 50 58 0 36
201-300 0 0 0 0
Testemunha
> 300 0 0 0 0
S1 ≤ 100 16 (12) 16 (12) 25 (12) 19
101-150 33 25 25 28
151-200 8 16 8 11
201-300 33 25 33 30
> 300 8 16 0 8
S4 ≤ 100 16 (12) 16 (12) 16 (12) 16
101-150 16 16 16 16
151-200 33 16 33 27
201-300 33 50 33 39
GA
3
> 300 0 0 0 0
a
Valores de proporções calculadas com base no número total de doze microtubérculos formados. MST= massa
seca dos microtubérculos.
59
3.3.3. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento dos bulbilhos
aéreos
Na presença de GA
3
, o somaclone S5 apresentou a maior média de massa seca dos
bulbilhos aéreos (25 mg), seguido pelos somaclones S4 (20 mg), S1 (16 mg), S2 (3 mg) e S3
(1 mg), Na ausência de reguladores de crescimento, os somaclones S2, S4 e S5 formaram
bulbilhos aéreos com massas secas médias de 3 mg, 6 mg e 1 mg, respectivamente. Quando
na presença de AIB, o somaclone S1 apresentou bulbilhos aéreos com massa seca de 32 mg e
o S2 de 13 mg. Dos demais somaclones, apenas o S5 formou bulbilhos com massa seca de 6
mg. Em meio de cultura contendo ANA, as médias de massa seca dos bulbilhos aéreos foram
2 mg para o somaclone S1, 4 mg para o S2 e 12 mg para o S4 (Figura 1).
Figura 1. Bulbilhos aéreos (setas) dos diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos em
meio de cultura Murashige & Skoog semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose e com 5µM de
GA
3
(A), ANA (B) e AIB (C). (barra= 1cm)
A
S1 S2 S4 S5
B
S1 S2 S4
C
S1 S2 S5
60
3.3.4. Efeito dos reguladores de crescimento sobre o crescimento da parte aérea e
do sistema radicular das plantas
Os resultados sobre o crescimento em massa seca da parte aérea e das raízes das
plantas dos diferentes somaclones, quando cultivadas na presença ou na ausência de
reguladores de crescimento, são mostrados na Tabela 6. Quando se considera a massa seca da
parte aérea das plantas observa-se que o GA
3
inibiu o crescimento em relação a testemunha
para os somaclones S1, S4 e S5, não tendo efeito sobre o crescimento da parte aérea dos
somaclones S2 e S3. Outros reguladores de crescimento que inibiram o incremento em massa
seca da parte aérea foram o BAP, para os somaclones S2, S4 e S5 e o 2iP, para os somaclones
S2 e S5. Em termos da razão entre a massa seca e a massa fresca da parte aérea verifica-se
que os maiores valores, em relação à testemunha, foram observados na presença de GA
3
,
apenas no caso dos somaclones S1 e S3. O ANA promoveu o maior incremento em massa
seca do sistema radicular, em relação à testemunha, em todos os somaclones e no caso dos
somaclones S2 e S3, foi tão eficiente quanto ao AIB.
61
Tabela 6. Efeito de reguladores de crescimento sobre o crescimento em massa seca da parte aérea e do
sistema radicular de plantas dos diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12
semanas, a partir do cultivo de plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose, na ausência ou presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou
2iP. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Reguladores de crescimento Somaclones MSA (mg)
a
MSA/MFA
a
MSR (mg)
a
GA
3
82,4 d 0,19 a 26,4 d
ANA 155,9 a 0,15 b 176,3 a
AIB 144,2 ab 0,15 b 107,5 b
BAP 94,2 cd 0,14 b 35,7 d
2iP 107,8 bcd 0,15 b 73,1 c
Testemunha
S1
132,1 abc 0,16 b 31,2 d
GA
3
80,8 ab 0,16 a 13,2 c
ANA 76,8 abc 0,13 ab 48,8 a
AIB 54,0 abc 0,13 ab 38 ab
BAP 49,1 bc 0,10 b 16,4 cd
2iP 44,8 c 0,15 a 22,0 bcd
Testemunha
S2
98,9 a 0,14 ab 27,6 bc
GA
3
81,7 bc 0,24 a 14,4 d
ANA 105,8 ab 0,15 cd 100,4 a
AIB 120,4 a 0,15 cd 84,4 ab
BAP 68,8 c 0,13 d 9,0 d
2iP 81,2 bc 0,17 bc 65,9 b
Testemunha
S3
105 abc 0,19 b 35,0 c
GA
3
74,4 b 0,18 a 20,8 c
ANA 147,1 a 0,18 a 160,1 a
AIB 155,2 a 0,15 ab 75,7 b
BAP 74,0 b 0,12 b 29,2 c
2iP 117,7 a 0,14 b 84,7 b
Testemunha
S4
136,2 a 0,16 ab 30,1 c
GA
3
64,5 b 0,17 a 22,9 c
ANA 128,7 a 0,13 bc 126,7 a
AIB 159,1 a 0,15 ab 62,1 b
BAP 77,8 b 0,12 c 16,7 c
2iP 62,8 b 0,17 a 32,4 c
Testemunha
S5
125,6 a 0,15 ab 42,8 bc
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MFA= massa fresca da parte aérea; MSA=
massa seca da parte aérea; MSR= massa seca das raízes.
Os resultados da Tabela 7 indicam que, para os somaclones S1, S2 e S5, o BAP inibiu
a formação de ramos em relação à testemunha. Outros reguladores de crescimento que
tiveram ação inibitória semelhante foram o 2iP, para os somaclones S2 e S5, o AIB, para o
somaclone S2 e o GA
3
, para os somaclones S4 e S5. No caso do somaclone S3 o GA
3
e o
ANA promoveram a formação de ramos. Quanto ao crescimento do maior ramo verificou-se
que, para os somaclones S1 e S4, nenhum regulador de crescimento apresentou efeito em
62
relação à testemunha, enquanto que para o S2 o 2iP teve efeito inibitório. Para o somaclone
S3 o BAP promoveu o crescimento do ramo, enquanto que para o somaclone S5 o ANA e o
AIB apresentaram esse efeito promotor. Entretanto, quando se analisou o número de nós
formados por planta observou-se que os tratamentos que causaram inibição em relação à
testemunha foram o GA
3
e o BAP para o somaclone S1, o 2iP para o somaclone S2, o GA
3,
para o somaclone S4 e todos os tratamentos, com exceção do AIB, para o somaclone S5. Em
termos do número total de gemas produzidas por planta verificou-se que os reguladores de
crescimento que inibiram a formação de gemas, em relação à testemunha, foram o BAP e o
2iP para os somaclones S2 e S5, o GA
3
para os somaclones S1, S4 e S5, e o AIB para S1 e S5.
No caso do somaclone S3, nenhum regulador de crescimento teve efeito sobre número de
gemas em relação à testemunha, mas o 2iP e o GA
3
provocaram inibição em relação aos
demais reguladores.
63
Tabela 7. Efeito de reguladores de crescimento sobre o crescimento da parte aérea de plantas dos
diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de
plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na
ausência ou presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Reguladores
de crescimento
Somaclones
Nº de
ramos.planta
-1a
Comprimento do
maior ramo (cm)
a
Nº de
nós.planta
-1a
Nº de
gemas.planta
-1a
GA
3
3,2 ab 2,1 a 8,4 b 14,7 c
ANA 3,7 a 3,7 a 13,1 ab 25,2 ab
AIB 3,6 a 3,3 a 11,3 ab 18 bc
BAP 1,9 b 2,0 a 8,3 b 13,0 c
2Ip 3,1ab 2,5 a 9,4 ab 21,1 abc
Testemunha
S1
3,7 a 3,0 a 13,7 a 28,2 a
GA
3
3,6 ab 1,3 a 16,5 ab 31,8 ab
ANA 4,1 ab 0,8 abc 17,5 ab 34,1 ab
AIB 2,5 b 0,9 abc 11,2 abc 21,0 abc
BAP 2,3 b 0,7 bc 10,4 bc 16,3 bc
2iP 1,9 b 0,4 c 5,0 c 8,3 c
Testemunha
S2
5,3 a 1,2 ab 23,1 a 47,4 a
GA
3
2,4 ab 0,4 abc 5,6 c 12,0 bc
ANA 3,0 a 0,6 ab 12,0 ab 26,3 a
AIB 2,2 abc 0,6 abc 13,7 a 24,0 a
BAP 1,8 bc 0,8 a 14,3 a 23,4 ab
2iP 1,4 c 0,2 c 6,2 bc 11,7 c
Testemunha
S3
1,3 c 0,3 bc 8,6 abc 18,7 abc
GA
3
2,2 b 1,7 b 6,7 b 13,0 c
ANA 3,2 ab 3,7 a 11,2 ab 20,2 abc
AIB 4,0 ab 3,6 a 14,5 a 24,9 ab
BAP 2,3 ab 2,0 ab 10,8 ab 15,5 bc
2iP 3,0 ab 3,4 a 12,4 a 21,9 abc
Testemunha
S4
4,6 a 3,1 ab 14,6 a 28,2 a
GA
3
1,7 b 1,6 b 7,0 bc 12,9 bc
ANA 3,2 a 4,6 a 9,8 bc 17,0 bc
AIB 3,2 a 5,0 a 11,3 ab 18,6 b
BAP 1,6 b 1,9 b 8,3 bc 12,0 bc
2iP 1,8 b 1,0 b 5,6 c 10,2 c
Testemunha
S5
3,3 a 2,4 b 15,0 a 30,3 a
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05).
Os resultados apresentados na Tabela 8 indicam que, quando se compara, para cada
regulador de crescimento testado as respostas de crescimento em massa seca da parte aérea,
observa-se que tanto na presença como na ausência de reguladores de crescimento não houve
diferença entre os somaclones. Contudo, na presença de ANA o incremento em massa seca foi
inibido para os somaclones S2 e S3 e o AIB apenas inibiu o crescimento do somaclone S2. Na
presença de BAP apenas os somaclones S1 e S2 diferiram em termos de massa seca, com
64
menor valor para o S2. O 2iP apenas promoveu o aumento em massa seca dos somaclones S1
e S4. Em termos dos valores de razão entre massa seca e massa fresca verifica-se que com o
GA
3
apenas o somaclone S3 apresentou maior acúmulo de massa seca por unidade de massa
fresca, em relação aos demais. O ANA promoveu o aumento da razão entre a massa seca e
massa fresca apenas para o somaclone S4, enquanto que as respostas dos somaclones não
diferiram na presença de AIB. O BAP diminuiu o valor da razão do somaclone S2 em relação
aos somaclones S1 e S3 e o 2iP inibiu o acúmulo de massa seca por unidade de massa fresca
apenas no caso do somaclone S4 em relação ao S5. Na ausência de reguladores de
crescimento o único somaclone em que a razão foi promovida foi o S3. Quando se analisou o
crescimento do sistema radicular observou-se que o GA
3
inibiu o incremento em massa seca
do somaclone S2 em relação aos somaclones S5 e S1. O ANA inibiu o incremento do sistema
radicular do somaclone S2 em relação aos demais, mas apresentou efeito promotor para os
somaclones S1 e S4. Efeito semelhante foi observado com o 2iP, sendo que, neste caso, o
efeito promotor ocorreu para os somaclones S1 e S3. O BAP apenas inibiu o acúmulo em
massa seca do sistema radicular do somaclone S3 em relação ao S1, enquanto que o 2iP
apresentou efeito inibitório apenas no caso dos somaclones S2 e S5 em relação aos demais.
Na ausência de reguladores de crescimento os somaclones não apresentaram diferenças
quanto à massa seca do sistema radicular.
65
Tabela 8. Crescimento em massa seca da parte aérea e do sistema radicular de plantas dos diferentes
somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de plantas em
meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na ausência ou
presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones Reguladores de crescimento MSA (mg)
a
MSA/MFA
a
MSR (mg)
a
S1 82,4 a 0,19 ab 26,4 a
S2 80,8 a 0,16 b 13,2 c
S3 81,7 a 0,24 a 14,4 bc
S4 74,4 a 0,18 b 20,8 abc
S5
GA
3
64,5 a 0,17 b 22,9 ab
S1 155,9 a 0,15 ab 176,3 a
S2 76,8 c 0,13 b 48,8 c
S3 105,8 bc 0,15 ab 100,4 b
S4 147,1 a 0,18 a 160,1 a
S5
ANA
128,7 ab 0,13 b 126,7 b
S1 144,2 a 0,15 a 107,5 a
S2 54,0 b 0,13 a 38,0 c
S3 120,4 a 0,15 a 84,4 ab
S4 155,2 a 0,15 a 75,7 bc
S5
AIB
159,1 a 0,15 a 62,1 bc
S1 94,2 a 0,14 a 35,7 a
S2 49,1 b 0,10 b 16,4 ab
S3 68,8 ab 0,13 a 9,0 b
S4 74,0 ab 0,12 ab 29,2 ab
S5
BAP
77,8 ab 0,12 ab 16,7 ab
S1 107,8 ab 0,15 ab 73,1 a
S2 44,8 d 0,15 ab 22,0 b
S3 81,2 bc 0,17 ab 65,9 a
S4 117,7 a 0,14 b 84,7 a
S5
2iP
62,8 cd 0,17 a 32,4 b
S1 132,1a 0,16 b 31,2 a
S2 98,9 a 0,14 b 27,6 a
S3
105,0 a 0,19 a 35,0 a
S4 136,2 a 0,16 b 30,1 a
S5
Testemunha
125,6 a 0,15 b 42,8 a
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MF= massa fresca; MS= massa seca;
MSA= massa seca da parte aérea.
Os resultados da Tabela 9 indicam que na presença de ANA e BAP os somaclones não
diferiram quanto ao número de ramos produzidos. Contudo, na presença de GA
3
o número de
ramos do somaclone S5 foi menor em relação aos somaclones S1 e S2. Na presença de AIB o
menor número de ramos por planta foi apresentado pelo somaclone S3, enquanto que com o
2iP os maiores valores foram observados para o S1 e S4. Na ausência de reguladores de
66
crescimento o somaclone S3 foi o que apresentou o menor número de ramos, não havendo
diferença entre os demais.
Tabela 9. Influência dos reguladores de crescimento sobre o crescimento da parte aérea de plantas dos
diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de
plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na
ausência ou presença de 5 μM de GA
3
, ANA, AIB, BAP ou 2iP. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones
Reguladores de
crescimento
Nº de
ramos.planta
-1a
Comprimento do
maior ramo (cm)
a
Nº de
nós.planta
-1 a
Nº de
gemas.planta
-1 a
S1 3,2 ab 2,1 a 8,4 b 14,7 b
S2 3,7 a 1,3 ab 16,5 a 31,8 a
S3 2,4 bc 0,4 b 5,6 b 12,0 b
S4 2,2 bc 1,7 a 6,7 b 13,0 b
S5
GA
3
1,7 c 1,6 ab 7,0 b 12,9 b
S1 3,7 a 3,7 a 13,1 ab 25,2 ab
S2 4,1 a 0,8 b 17,5 a 34,1 a
S3 3,0 a 0,6 b 12,0 ab 26,3 ab
S4 3,2 a 3,8 a 11,2 ab 20,2 b
S5
ANA
3,2 a 4,6 a 9,8 b 17,0 b
S1 3,6 a 3,3 b 11,3 a 18,0 a
S2 2,5 ab 0,9 c 11,2 a 21,0 a
S3 2,2 b 0,6 c 13,7 a 24,0 a
S4 4,0 a 3,6 b 14,5 a 24,9 a
S5
AIB
3,2 ab 5,0 a 11,3 a 18,6 a
S1 1,9 a 2,0 a 8,3 a 13,0 b
S2 2,3 a 0,7 c 10,4 a 16,3 ab
S3 1,8 a 0,8 bc 14,3 a 23,4 a
S4 2,3 a 2,0 a 10,8 a 15,5 ab
S5
BAP
1,6 a 1,9 ab 8,3 a 12,0 b
S1 3,1 a 2,5 a 9,4 ab 21,1 a
S2 1,9 b 0,4 b 5,0 b 8,3 b
S3 1,4 b 0,2 b 6,2 b 11,7 b
S4 3,0 a 3,4 a 12,4 a 21,9 a
S5
2iP
1,8 b 1,0 b 5,6 b 10,2 b
S1 3,7 ab 3,0 a 13,7 b 28,2 b
S2 5,3 a 1,2 bc 23,1 a 47,4 a
S3
1,3 c 0,3 c 8,6 b 18,7 b
S4 4,6 ab 3,1 a 14,6 ab 28,2 b
S5
Testemunha
3,3 b 2,4 ab 15,0 ab 30,3 ab
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05).
Quando se analisa o comprimento do maior ramo produzido por planta é possível
observar que, na presença de GA
3,
o somaclone que apresentou o ramo de menor
comprimento foi o S3. Com o ANA, AIB, BAP, 2iP e na ausência de reguladores de
67
crescimento os somaclones S2 e S3 apresentaram os menores ramos, onde, no caso do 2iP, o
mesmo resultado foi observado também para os somaclone S5.
Em termos do número de nós produzidos por planta é possível verificar que, com AIB
e BAP, não foram observadas diferenças entre os somaclones, mas na presença do GA
3
o
número de nós formados pelo somaclone S2 foi superior aos demais somaclones, da mesma
forma que o número de gemas formadas por planta. Com o ANA o número de nós
apresentados pelo somaclone S2 foi superior apenas ao do somaclone S5 e na ausência de
reguladores de crescimento foi superior apenas aos somaclones S1 e S3. Entretanto, na
presença de 2iP, o somaclone S4 apresentou o maior número de nós em relação aos
somaclones S2, S3 e S5. O número de gemas produzidas por planta não foi alterado para
nenhum dos somaclones na presença de AIB, enquanto que com o GA
3
e na ausência de
reguladores de crescimento o somaclone S2 apresentou o maior número de gemas em
comparação com os demais. Já na presença de ANA, o somaclone S2 foi superior apenas aos
somaclones S4 e S5. Com o BAP o somaclone S3 foi superior aos somaclones S1 e S5 e com
o 2iP os somaclones S1 e S4 foram superiores aos demais. O BAP induziu o desenvolvimento
anormal da parte aérea dos somaclones, originando caules atrofiados com tamanho de folhas
bastante reduzido (Figura 2).
Figura 2. Desenvolvimento anormal das plantas de diferentes somaclones de
Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de
plantas meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com
8% de sacarose e de 5 μM BAP. (barra =1cm)
S1 S2 S3 S4 S5
68
3.4. DISCUSSÃO
A utilização de reguladores de crescimento para potencializar a indução de
microtubérculos, tem sido relatada na literatura para diversas espécies do gênero
Dioscorea
(Sengupta
et al., 1984; Ng, 1988; Mantell & Hugo, 1989; John et al., 1993; Kohmura et al.,
1995; Alizadeh
et al., 1998; Chu, 1998), embora a atuação desses reguladores não siga uma
regra geral (Chu, 1998).
Na ausência de reguladores de crescimento, as plantas dos diferentes somaclones de
D.
composita produziram microtubérculos, mas, os reguladores de crescimento incrementaram
esta indução, na maioria das vezes. Alizadeh
et al. (1998), citam que em um grande número
de espécies de
Dioscorea cultivadas in vitro, os reguladores de crescimento da classe das
auxinas e das citocininas são efetivos na indução de microtubérculos, embora certos tipos de
reguladores sejam mais eficientes do que outros. Esses autores citam, porém, que a presença
de reguladores de crescimento no meio de cultura também pode inibir o processo de indução e
crescimento dos microtubérculos, conforme ocorrido com as plantas dos diferentes
somaclones de
D. composita quando na presença de BAP. Efeito semelhante foi relatado por
John
et al. (1993), que constataram que a percentagem de tuberização em plantas de D. alata
foi menor na presença BAP (2,5 µM). Estes autores obtiveram percentagem média de apenas
3% das plantas com microtubérculos. Alizadeh
et al. (1998), também observaram menor
capacidade de indução e crescimento de microtubérculos em plantas de
D. composita quando
inoculadas em meio de cultura suplementado com BAP (5,0 µM), alcançando percentagem
média de 47% de plantas com microtubérculos. Esses resultados são inferiores aos obtidos no
presente trabalho.
69
O BAP foi o único regulador de crescimento que não estimulou a indução dos
microtubérculos das plantas de qualquer dos 5 somaclones quando comparado com as plantas
inoculadas em meio sem reguladores. Contudo, estudos sobre a microtuberização de
D.
rotundata (Ng, 1988), D. alata e D. bulbifera (Mantell & Hugo, 1989) citam que as
citocininas têm papel importante no processo de tuberização. Além disso, Figueiredo-Ribeiro
et al. (2004), mencionam um possível envolvimento das citocininas na indução de tubérculos
através das divisões celulares, uma das primeiras alterações morfológicas do processo de
tuberização.
Estudos sobre a tuberização sugerem haver um controle hormonal endógeno deste
processo. As giberelinas, dentre os hormônios vegetais, estão relacionadas com o controle da
tuberização, sendo muitas vezes consideradas inibidoras da tuberização por apresentarem
respostas análogas aos efeitos ambientais não indutivos (Figueiredo-Ribeiro
et al., 2004). O
efeito inibitório das giberelinas, pelo contrário, não foi confirmado neste estudo para
D.
composita.
Para os diferentes somaclones de
D. composita, as auxinas desencadearam uma melhor
indução de tuberização, ao contrário do referido na literatura. Estes resultados podem ser
devido ao grande número de genes que participam do controle da tuberização, os quais
desencadeiam mudanças nas concentrações de vários compostos controladores deste processo.
Assim, de acordo com Figueiredo-Ribeiro
et al. (2004), apenas métodos analíticos podem
avaliar se as proteínas associadas aos genes controladores da tuberização correspondem a um
único composto ou a uma série de compostos que atuam convergentemente.
Bulbilhos aéreos também foram formados em
D. floribunda (Sengupta et al., 1984) na
presença de ANA (0,5 mg.L
-1
), desenvolvendo raízes e parte aérea dentro de 20 dias,
alcançando sobrevivência de 100% quando transferidos para o solo. Estas estruturas aéreas
70
podem ser mais uma fonte para a propagação vegetativa da espécie, juntamente com os
tubérculos.
É possível que as diferenças entre os resultados de indução e desenvolvimento de
microtubérculos deste trabalho e os apresentados na literatura sejam devidas a diferenças
entre os materiais vegetais estudados (John
et al., 1993; Ng, 1988), ao meio de cultura e aos
reguladores de crescimento utilizados. Além disso, uma possível variação entre os somaclones
pode ter acarretado as diferenças encontradas paras as plantas de
D. composita.
Uma das principais funções das citocininas é promover a divisão celular e, com isso,
favorecer o crescimento de gemas laterais, a expansão foliar e a morfogênese (Davies, 1995).
Entretanto, para as plantas dos diferentes somaclones de
D. composita, não foi observado um
aumento no potencial de indução de ramos, ou no número de gemas e de nós, em presença de
citocininas. Resultado semelhante foi observado em plantas de
D. alata (Borges et al., 2004),
em que não ocorreu incremento no número de nós quando o meio de cultura foi suplementado
com 0,1 e 1,0 mg.L
-1
de BAP, indicando não ser importante para a regeneração e
multiplicação da espécie. Contudo, o número de nós das plantas dos diferentes somaclones
neste experimento foi maior que os encontrados por Alizadeh
et al. (1998), quando plantas de
D. composita foram inoculadas em meio contendo 5 µM de BAP e 2iP. Estes autores também
detectaram o desenvolvimento anormal das plantas quando inoculadas em meio contendo
citocininas.
Os resultados obtidos no presente trabalho, para adição de citocininas ao meio de
cultura, podem ser devidos ao local de síntese destas substâncias, que são sintetizadas
especialmente nos meristemas dos ápices das raízes e transportadas para a parte aérea, através
dos vasos condutores, juntamente com a água e os nutrientes absorvidos pelas raízes. Como
pode ser observado, para
D. composita, houve uma correlação entre a menor massa seca das
raízes e a menor massa seca da parte aérea. Esta correlação mostrou-se evidente quando os
71
somaclones foram cultivados na presença de citocininas, especialmente o BAP. Isto sugere
que a adição de citocininas ao meio de cultura não foi eficiente para a promoção do
crescimento da parte aérea das plantas, nem para a quebra da dominância apical.
Possivelmente, fatores que regulam os níveis de citocinina (enzima citocinina oxidase,
citocinina conjugada) podem estar inativando irreversivelmente as citocininas, limitando os
efeitos deste regulador (Taiz & Zeiger, 2004). Além disso, o sítio de ligação para este
regulador pode estar já ocupado, tornando-se desnecessário o aporte de citocininas ao meio de
cultura. De acordo com Taiz & Zeiger (2004), a aplicação de citocininas inibe o processo de
alongamento de caules e raízes, e as concentrações fisiológicas normais de citocininas
endógenas podem inibir o crescimento das raízes, explicando, assim, o pequeno
desenvolvimento da parte aérea e do sistema radicular dos somaclones na presença destes
reguladores.
As auxinas afetam muitos processos do desenvolvimento do vegetal, especialmente o
alongamento celular, a dominância apical, o crescimento inicial das raízes e o fototropismo
(Davies, 1995; Arteca, 1996; Taiz & Zeiger, 2004). Esta característica de crescimento
radicular foi observada nas plantas dos diferentes somaclones de
D. composita, que
apresentaram maior massa seca das raízes quando inoculadas em meio contendo auxinas,
especialmente na presença de ANA. A ação de AIB sobre a sobrevivência do somaclone S2
pode ser resultado da alta concentração (5 µM) utilizada no meio de cultura, causando
toxicidade, uma vez que a concentração ótima de auxina está tipicamente entre 10
-6
e 10
-5
M
(Taiz & Zeiger, 2004). Os resultados relacionados ao número de nós foram maiores do que os
obtidos por Alizadeh
et al. (1998) para a mesma espécie. Na presença de 5 µM de ANA e
AIB, os autores obtiveram média máxima de 7 nós por planta, ao contrário do resultado
obtido no presente trabalho onde o maior número médio foi 17,5 nós por planta. A ausência
de diferenças entre os somaclones e a testemunha, com exceção do somaclone S2, para a
72
variável de número de ramos, na presença de auxinas, sugere que o efeito de dominância
apical não é mais intensificado quando há a suplementação do meio de cultura com auxinas.
Subentende-se então, que a presença conjunta destes reguladores, e não isolada, no meio de
cultura poderia potencializar o crescimento das plantas dos diferentes somaclones de
D.
composita.
Isoladas primeiramente de um fungo (
Gibberella fujikuroi), que deu origem ao nome
deste regulador de crescimento, as giberelinas influenciam o alongamento do caule, controlam
vários aspectos da germinação da semente e também a indução da floração (Davies, 1995;
Arteca, 1996; Taiz & Zeiger, 2004). Com relação ao alongamento dos entrenós de muitas
espécies, esta característica é mais evidenciada em plantas anãs ou rosetas (Taiz & Zeiger,
2004), especialmente quando há giberelina exógena, que provoca aumento no caule
semelhante às variedades mais altas da espécie. Este estímulo, mais pronunciado em plantas
anãs e rosetas, fundamenta os resultados obtidos com relação a variável de comprimento do
maior ramo, para as plantas dos diferentes somaclones de
D. composita, que foram iguais a
testemunha, provavelmente porque apresentavam padrão normal de crescimento antes da
inoculação em meio contendo GA
3
. Além disso, as giberelinas regulam seu próprio
metabolismo, inibindo a transcrição de genes codificadores das enzimas responsáveis pela sua
biossíntese ou degradação. A aplicação de giberelinas provoca a diminuição da expressão dos
genes da biossíntese e aumento na transcrição de genes de degradação (Taiz & Zeiger, 2004).
A atuação dos reguladores de crescimento sobre o desenvolvimento das plantas,
indução e desenvolvimento dos microtubérculos dos diferentes somaclones de
D. composita
não segue uma regra geral. Entretanto, pode-se inferir que essas características são resultantes
da combinação de vários fatores, especialmente da atuação conjunta dos reguladores de
crescimento, uma vez que um regulador pode influenciar a biossíntese de outro, de modo que
os efeitos produzidos por um podem ser mediados por outro. Por isso, a verificação da
73
influência dos reguladores de crescimento, quando adicionados concomitantemente ao meio
de cultura, foi posteriormente estudada.
3.5. CONCLUSÕES
1. As respostas de morfogênese, concernentes à formação de ramos e raízes, não
variam entre os somaclones, na ausência ou presença de reguladores de crescimento, mas a
percentagem de tuberização, senescência e formação de bulbilhos aéreos variam entre os
somaclones e para um mesmo somaclone variam com o tipo de regulador de crescimento.
2. Os microtubérculos são induzidos também na ausência de reguladores de
crescimento, porém a presença de reguladores de crescimento no meio de cultura incrementa,
na maioria das vezes, essa indução.
3. Bulbilhos aéreos são produzidos na presença de GA
3
, ANA e/ou AIB pelos
somaclones S1, S2, S3, S4 e S5 e na ausência de reguladores de crescimento pelos
somaclones S2, S4 e S5.
4. Cada somaclone requer diferentes reguladores de crescimento para que sejam
produzidos microtubérculos com maior massa seca. Recomendam-se os seguintes reguladores
de crescimento: GA
3
e ANA (para o somaclone S1); ANA (para o S2); ANA, AIB ou 2iP
(para o S3); ANA e AIB (para o S4) e GA
3
(para o S5).
74
5. Os melhores somaclones para a produção de microtubérculos com maior massa seca
são: na presença de GA
3
(todos exceto o S3); de ANA (o S2); de AIB (todos exceto o S3 e o
S5); de 2iP (o S2); na ausência de reguladores (o S2).
6. Microtubérculos não têm maior indução, na presença de BAP, para nenhum dos
somaclones quando comparado com as plantas inoculadas em meio sem reguladores de
crescimento.
7. Ao contrário do referido na literatura, as auxinas desencadeiam melhor indução de
tuberização nos somaclones.
8. Para produzir o maior número de segmentos nodais para a multiplicação vegetativa
não se recomenda os seguintes reguladores de crescimento: GA
3
e BAP (para o somaclone
S1); o 2iP (para o S2); o GA
3
e 2iP (para o S3); o GA
3
(para o S4) e GA
3
, BAP e 2iP (para o
S5).
9. Os somaclones que garantem a melhor produção de segmentos nodais para a
multiplicação vegetativa são: na presença de GA
3
(o somaclone S2); de ANA (o S2); de AIB e
de BAP (todos os somaclones); de 2iP (o S4) e na ausência de reguladores de crescimento (o
S2).
10. As diferentes respostas de crescimento dos somaclones, na ausência e na presença
de reguladores de crescimento, indicam a existência de variação somaclonal.
75
CAPÍTULO 4
EFEITO DO ÁCIDO GIBERÉLICO, ÁCIDO NAFTALENOACÉTICO E
GLUTAMINA SOBRE A MORFOGÊNESE E CRESCIMENTO IN VITRO DE
SOMACLONES DE D. composita Hemsl.
4.1. INTRODUÇÃO
O crescimento vegetal é conseqüência da interação de muitos processos tais como a
fotossíntese, o transporte a longa distância, a respiração, as relações hídricas e a nutrição
mineral (Lambers
et al., 1998). Estes processos são responsáveis pelo incremento em massa
seca dos órgãos vegetais bem como do número ou do tamanho das células, envolvendo
principalmente divisão, expansão e diferenciação. O crescimento dos tecidos não é nem
uniforme nem aleatório, podendo o crescimento total das plantas ser considerado como a
soma de padrões locais de crescimento (Taiz & Zeiger, 2004). Sendo assim, o crescimento em
plantas é definido como um aumento irreversível de volume.
Muitos aspectos de crescimento e desenvolvimento dos vegetais são controlados pelos
reguladores de crescimento, os quais afetam de forma positiva e negativa os padrões de
crescimento (Lambers
et al., 1998). Giberelinas e auxinas são duas classes de reguladores de
crescimento importantes para o crescimento e desenvolvimento vegetal, especialmente no que
diz respeito ao crescimento da parte aérea e do sistema radicular.
76
O nitrogênio é de importância indiscutível em qualquer fase do desenvolvimento
vegetal, especialmente porque é responsável pela formação de compostos vitais, tais como
aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos. Pode ser fornecido ao vegetal na forma inorgânica
ou orgânica. Quando fornecido na forma inorgânica, é imediatamente transformado em
glutamina, sendo esta molécula doadora de nitrogênio para uma série de reações biossintéticas
(Cánovas
et al., 1998; Leningher, 2000). Da amida glutamina o nitrogênio é transferido para a
maioria dos compostos nitrogenados presentes nos vegetais, tais como os aminoácidos,
nucleotídeos, as clorofilas, as poliaminas e os alcalóides. Assume, também, um papel
essencial na biossíntese de hormônios vegetais, tais como as auxinas, citocininas e o etileno,
pois estas classes hormonais possuem, como precursores aminoácidos ou moléculas contendo
átomos de nitrogênio na formulação química. Desta forma, o metabolismo do nitrogênio e a
disponibilidade deste mineral interfere diretamente na biossíntese hormonal (Taiz & Zeiger,
2004).
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de ácido
giberélico (GA
3
), aplicado isoladamente ou em combinação com diferentes concentrações de
ácido naftaleno acético (ANA) ou glutamina sobre o crescimento
in vitro de plantas dos
diferentes somaclones de
D. composita.
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
77
4.2.1. Origem do material vegetal e manutenção dos estoques dos diferentes
somaclones de D. composita
Foram utilizadas plantas de
Dioscorea composita regeneradas de um único calo e
multiplicadas conforme metodologia já descrita no item 3.2.1. do capítulo 3. As condições de
manutenção dos diferentes somaclones em sala de crescimento também estão descritas no
item referido anteriormente.
4.2.2. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a morfogênese
e o crescimento in vitro
Plantas inteiras dos somaclones S1, S2, S3, S4 e S5 com idades entre 95 e 99 dias,
cultivadas nas condições descritas no item 4.2.1., foram utilizadas. As plantas foram
inoculadas em tubos de ensaio (25 mm x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS
suplementado com 8% de sacarose e 0,2% de Phytagel e com concentrações de 2,5; 5,0 e 7,5
µM de GA
3
. O meio de cultura testemunha não continha reguladores de crescimento.
Após 4 meses, as culturas foram avaliadas quanto à percentagem de formação de
ramos, de raízes, de microtubérculos e de bulbilhos aéreos. O crescimento das culturas foi
avaliado através da determinação da massa seca da parte aérea, das raízes e dos
microtubérculos, número de nós, de gemas e de folhas. A partir destes dados foram calculados
os teores de água dos microtubérculos, assim como os valores da razão massa seca/massa
fresca da parte aérea, dos microtubérculos e da razão massa seca do tubérculo/massa seca da
parte aérea. Foram utilizadas 12 repetições de cada somaclone por tratamento.
78
4.2.3. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo
ácido giberélico sobre a morfogênese e o crescimento in vitro
Foram utilizadas plantas dos somaclones S1 e S4 com idade de 126 dias, cultivadas
nas condições descritas no item 4.2.1. As plantas foram inoculadas em tubos de ensaio (25
mm x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS suplementado com 8% de sacarose e
0,2% de Phytagel e com 5,0 µM de GA
3
. Após períodos de 15, 30 e 45 dias as plantas foram
transferidas para meio de cultura contendo os mesmos constituintes acima mencionados, mas
sem a presença de GA
3
. Foram também conduzidos os tratamentos em que as plantas foram
mantidas, durante todo o período do experimento, em meio de cultura descrito acima, sem
GA
3
e em meio de cultura com GA
3
.
Após 4 meses, as culturas foram avaliadas quanto à percentagem de formação de
ramos, de raízes, de microtubérculos e de bulbilhos aéreos. O crescimento das culturas foi
avaliado através da determinação da massa seca da parte aérea, das raízes e dos
microtubérculos, número de nós, de gemas e de folhas. A partir destes dados, o teor de água
dos microtubérculos, os valores da razão massa seca/massa fresca da parte aérea, dos
microtubérculos e a razão massa seca do tubérculo/massa seca da parte aérea foram
calculados. Foram utilizadas 12 repetições de cada somaclone por tratamento.
4.2.4. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
ácido naftaleno acético sobre a morfogênese e o crescimento in vitro
Foram utilizadas plantas dos somaclones S1 e S4 com idade entre 124 e 173 dias,
cultivadas nas condições descritas no item 4.2.1. As plantas foram inoculadas em tubos de
79
ensaio (25 mm x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS suplementado com 8% de
sacarose e 0,2% de Phytagel, 5,0 µM de GA
3
e concentrações de 2,5 µM e 5,0 µM de ANA.
Ao meio de cultura do controle não foi adicionado o ANA. Após 4 meses, as culturas foram
avaliadas quanto à percentagem de formação de ramos, de raízes, de microtubérculos e de
bulbilhos aéreos. O crescimento das culturas foi avaliado através da determinação da massa
seca da parte aérea, das raízes e dos microtubérculos, número de nós, de gemas e de folhas. A
partir destes dados foram calculados o teor de água dos microtubérculos, os valores da razão
massa seca/massa fresca da parte aérea, dos microtubérculos e a razão massa seca do
tubérculo/massa seca da parte aérea. Foram utilizadas 12 repetições de cada somaclone por
tratamento.
4.2.5. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
glutamina sobre a morfogênese e o crescimento in vitro
Foram utilizadas plantas dos somaclones S1 e S4 com idade de 124 dias, cultivadas
nas condições descritas no item 4.2.1. As plantas foram inoculadas em tubos de ensaio (25
mm x 150 mm) contendo 10 mL de meio de cultura MS suplementado com 8% de sacarose e
0,2% de Phytagel, 5,0 µM de GA
3
e concentrações de 2,73 mM e 4,10 mM de glutamina. Ao
meio de cultura da testemunha não foi adicionada glutamina. As culturas foram avaliadas,
após 4 meses quanto à percentagem de formação de ramos, de raízes, de microtubérculos e de
bulbilhos aéreos. O crescimento das culturas foi avaliado através da determinação da massa
seca da parte aérea, das raízes, e dos microtubérculos, número de nós, de gemas e de folhas. A
partir destes dados foram calculados o teor de água dos microtubérculos, os valores da razão
massa seca/massa fresca da parte aérea, dos microtubérculos e da razão massa seca do
80
tubérculo/massa seca da parte aérea. Foram utilizadas 12 repetições de cada somaclone por
tratamento.
4.2.6. Determinação da massa seca das plantas
Após a determinação da massa fresca foi determinada a massa seca das plantas
produzidas em cada tratamento conforme a metodologia descrita no item 3.2.3. do capitulo 3.
4.2.7. Análise estatística
Em todos os experimentos foi utilizado o delineamento completamente casualizado.
Os resultados foram analisados estatisticamente através do teste
t de Student, ao nível de 5%
de probabilidade, quando a comparação se restringiu a apenas dois tratamentos, ou de análise
de variância simples ou multifatorial, com separação de médias pelo teste de Tukey, ao nível
de 5% de probabilidade, quando mais de dois tratamentos foram comparados (Gomez &
Gomez, 1984). Quando pertinente os dados em porcentagem foram transformados em arco
seno da raiz quadrada da porcentagem antes da realização da análise estatística.
4.3. RESULTADOS
81
4.3.1. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a morfogênese
e o crescimento in vitro
4.3.1.1. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre a
morfogênese das plantas
Ramos, raízes e microtubérculos foram induzidos em todas as plantas submetidas aos
vários tratamentos (Tabela 1). As plantas de todos os somaclones, exceto o S4, apresentaram
maior percentagem de senescência na presença do regulador de crescimento, variando de
16,7% para o somaclone S3 a 41,7% para o somaclone S2, na presença de 7,5 µM de GA
3
. O
somaclone que apresentou a maior percentagem de senescência, em todos os tratamentos,
inclusive na ausência do GA
3
, foi o S2.
A presença de GA
3
foi fundamental para a indução de bulbilhos aéreos em todos os
somaclones exceto o S3, que não apresentou formação de bulbilhos aéreos em nenhum
tratamento. Entretanto, a indução de bulbilhos aéreos ocorreu em diferentes concentrações de
GA
3
, visto que em todas as concentrações, pelo menos dois somaclones formaram bulbilhos
aéreos. Em termos de massa seca dos bulbilhos aéreos, as maiores médias foram observadas
para as plantas do somaclone S4, na presença de 5 µM e 7,5 µM de GA
3
(78 mg e 35 mg,
respectivamente). As plantas do somaclone S1 apresentaram valores de massas secas de 19
mg e 7 mg, na presença de 2,5 µM e 7,5 µM de GA
3
, respectivamente. Os bulbilhos aéreos
das plantas do somaclone S2 tiveram massas secas médias de 8,3 mg e 16 mg, quando na
presença de 2,5 µM e 5 µM de GA
3
, respectivamente. Já para as plantas do somaclone S5, que
produziram bulbilhos aéreos apenas na presença de 7,5 µM de GA
3
, o valor de massa seca dos
mesmos foi de 19 mg.
82
Tabela 1. Influência de diferentes concentrações de GA
3
sobre a morfogênese e senescência de
diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de
plantas com 95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado
com 8% de sacarose. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones GA
3
(µM)
Ramos
a
(%)
Raízes
a
(%)
Microtubérculos
a
(%)
Bulbilhos
Aéreos
a
(%)
Senescência
a
(%)
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 8,3 0
5,0 100 100 100 0 0
S1
7,5 100 100 100 8,3 33,3
0 100 100 100 0 8,3
2,5 100 100 100 25 16,7
5,0 100 100 100 25 33,3
S2
7,5 100 100 100 0 41,7
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 0 8,3
5,0 100 100 100 0 8,3
S3
7,5 100 100 100 0 16,7
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 0 8,3
5,0 100 100 100 8,3 0
S4
7,5 100 100 100 8,3 0
0 100 100 100 0 9,1
2,5 100 100 100 0 0
5,0 100 100 100 0 8,3
S5
7,5 100 100 100 16,7 25
a
Valores são proporções calculadas com base em doze repetições por tratamento.
4.3.1.2. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre o crescimento
dos microtubérculos
Os resultados da Tabela 2 indicam, para cada somaclone, os efeitos das diferentes
concentrações de GA
3
sobre o crescimento dos microtubérculos. Para todos os somaclones, as
diferentes concentrações testadas não contribuíram para o aumento da massa seca dos
microtubérculos em relação a testemunha. Observa-se que, para todos os somaclones, exceto
o S2, não houve diferença entre os tratamentos com relação aos valores da razão entre as
massas seca e fresca dos microtubérculos e, conseqüentemente, para os teores de água dos
mesmos. Entretanto, para as plantas do somaclone S2, a adição de 7,5 µM de GA
3
promoveu
83
o acúmulo de massa seca do microtubérculo por unidade de massa fresca, o que, por
conseguinte, provocou a diminuição significativa no teor de água em relação ao tratamento
sem GA
3
. As demais concentrações provocaram respostas semelhantes a testemunha.
Com relação aos valores de razão entre massa seca do microtubérculo e massa seca da
parte aérea, diferenças entre os tratamentos foram observadas para todos os somaclones, com
exceção do S2. Assim, para o somaclone S1, os maiores valores foram observados na
presença de 5,0 e 7,5 µM de GA
3
e diferiram da testemunha. Esta mesma resposta ocorreu nas
plantas dos somaclones S3, S4 e S5. Todavia, para o somaclone S5 apenas o GA
3
na
concentração de 7,5 µM teve efeito promotor.
Tabela 2. Influência de diferentes concentrações de GA
3
sobre o crescimento e teor de água de
microtubérculos de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a
partir do cultivo de plantas com 95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones GA
3
(µM) MST (mg)
a
MST/MFT
a
MST/MSA
a
Teor de água (% MFT)
a
0 130,6 a 0,26 a 0,8 b 73,5 a
2,5 186,2 a 0,27 a 1,9 ab 72,5 a
5,0 162,3 a 0,26 a 2,4 a 73,4 a
S1
7,5 192,9 a 0,27 a 2,6 a 73,4 a
0 209,4 a 0,20 b 3,1 a 79,9 a
2,5 174,8 a 0,24 ab 1,9 a 76,0 ab
5,0 193,5 a 0,24 ab 3,1 a 76,4 ab
S2
7,5* 153,9 a 0,26 a 5,2 a 73,5 b
0 134,6 a 0,25 a 1,0 b 74,7 a
2,5 120,4 a 0,25 a 1,5 ab 74,7 a
5,0 161,5 a 0,27 a 2,2 a 73,2 a
S3
7,5 103,0
a 0,27
a 1,6 ab 73,1 a
0 132,7 a 0,26 a 0,8 b 74,3 a
2,5 164,5 a 0,27 a 1,4 b 72,9 a
5,0 174,1 a 0,28 a 2,4 a 71,5 a
S4
7,5 192,9 a 0,27 a 2,6 a 73,4 a
0 127,3 a 0,27 a 0,7 b 73,1 a
2,5 136,4 a 0,27 a 1,3 b 73,1 a
5,0 154,4 a 0,28 a 1,6 b 71,9 a
S5
7,5 202,9 a 0,27 a 2,8 a 73,3 a
a
Médias de pelo menos 7 repetições (*) seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MST= massa seca do microtubérculo;
MFT= massa fresca do microtubérculo; MSA= massa seca da parte aérea.
84
Apesar das diferentes concentrações de GA
3
não terem provocado diferenças nas
massas secas dos microtubérculos, em relação a testemunha, provocaram diferenças quanto à
distribuição das classes de massa seca dos mesmos, como pode ser observado na Tabela 3.
Verifica-se que, para os somaclones S1 e S4, as maiores proporções de microtubérculos
menores que 100 mg de massa seca ocorreram na ausência de GA
3
. Para o somaclone S1 é
possível observar que houve tendência, na presença de GA
3
, de aumento da percentagem de
culturas que apresentaram microtubérculos maiores que 201 mg em relação ao tratamento sem
este regulador de crescimento. As percentagens foram de 41%, 33% e 52% para os
tratamentos com 2,5 µM, 5,0 µM e 7,5 µM de GA
3
, respectivamente. Também para o
somaclone S4, nestas mesmas concentrações de GA
3
, as percentagens de culturas que
formaram microtubérculos maiores que 201 mg foram de 18%, 33% e 50%, respectivamente,
não tendo sido observada a formação de microtubérculos, nesta classe de massa seca, na
ausência do regulador.
Observa-se, para o somaclone S2, que na ausência de GA
3
, 54% dos microtubérculos
foram maiores que 201 mg e apenas 9% das culturas apresentaram valores menores que 100
mg. Nas concentrações de 2,5 µM e 5,0 µM de GA
3
, as percentagens de plantas que formaram
microtubérculos nesta classe de massa seca foram, respectivamente, de 30% e 51%, sendo que
na concentração de 7,5 µM de GA
3
não foi observada a formação de microtubérculos maiores
que 201 mg de massa seca. Outra resposta importante foi que, tanto na concentração de 2,5
µM quanto na concentração de 5,0 µM de GA
3
, não foi formado microtubérculo menor que
100 mg. Na ausência de GA
3
, foi verificada, para o somaclone S5, que 56% dos
microtubérculos tiveram massa seca superior a 201 mg e, nos demais tratamentos, estas
percentagens variaram entre 10% e 27%. As percentagens de microtubérculos menores que
100 mg tenderam a aumentar em relação a testemunha, para 50%, 36% e 27%,
respectivamente nas concentrações de 2,5 µM, 5,0 µM e 7,5 µM de GA
3
.
85
Para o somaclone S3 não foram formados microtubérculos maiores que 201 mg de
massa seca, na ausência de GA
3
. O valor máximo obtido de microtubérculos com massas
secas maiores que 201 mg foi 36%, na concentração de 5,0 µM de GA
3
. Entretanto, na
ausência ou na presença deste regulador, as percentagens de microtubérculos menores que
150 mg variaram entre 54% com 5,0 µM de GA
3
e 80% com 7,5 µM de GA
3
.
Tabela 3. Distribuição por freqüência (%) de intervalos de classes de massa seca de microtubérculos e
número total de microtubérculos formados por tratamento (valores entre parênteses) por diferentes
somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com
95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de
sacarose, na ausência ou presença de diferentes concentrações de GA
3
. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones
a
GA
3
(µM)
Classes de MST
(mg)
S1 S2 S3 S4 S5
≤ 100 42 (12) 9 (11) 17 (12) 33 (12) 11 (9)
101-150 25 18 50 17 22
151-200 33 18 33 50 11
201-300 0 45 0 0 56
0
> 300 0 9 0 0 0
≤ 100 25 (12) 0 (10) 25 (12) 9 (11) 50 (10)
101-150 0 30 50 36 10
151-200 25 40 8 45 30
201-300 33 30 8 18 10
2,5
> 300 8 0 0 0 0
≤ 100 25 (12) 0 (8) 18 (11) 17 (12) 36 (11)
101-150 33 38 36 17 9
151-200 8 13 8 33 36
201-300 25 38 36 33 18
5,0
> 300 8 13 0 0 0
≤ 100 38 (8) 14 (7) 50 (10) 0 (12) 27 (11)
101-150 13 0 30 25 18
151-200 0 86 10 33 27
201-300 26 0 10 50 27
7,5
> 300 26 0 0 0 0
a
Valores são proporções calculadas com base no número total de microtubérculos formados de pelo menos sete
repetições por tratamento. MST= massa seca dos microtubérculos.
86
4.3.1.3. Efeito de diferentes concentrações de ácido giberélico sobre o crescimento
da parte aérea e do sistema radicular das plantas
Os resultados sobre o crescimento da parte aérea e das raízes das plantas dos diferentes
somaclones, quando cultivadas nos meios contendo diferentes concentrações de GA
3
, são
mostrados na Tabela 4. Verifica-se que, para o somaclone S2 não houve diferença entre os
tratamentos com relação à massa seca da parte aérea, os números de folhas, de nós, de gemas
e de ramos produzidos por planta. Para todos os demais somaclones, a presença do regulador
de crescimento, nas diferentes concentrações, não promoveu o crescimento em relação a
testemunha, quando se analisa as variáveis consideradas anteriormente, apresentando, em
vários casos, efeito inibitório. O mesmo tipo de resposta foi obtido para todos os somaclones,
com relação aos valores de massa seca das raízes. Apenas os somaclones S1, S2 e S3 (Figura
1A, 1B e 1C) apresentaram valores de razão entre as massas seca e fresca da parte aérea
diferentes da testemunha. Para S1, o efeito promotor do GA
3
, em relação a testemunha,
ocorreu com a presença de 5,0 µM, para o S2 com 7,5 µM e para o S3 com 5,0 µM e 7,5 µM.
O comprimento do maior ramo não foi afetado, pela presença do GA
3,
apenas para S4 (Figura
1D) e S5 (Figura 1E). Para os demais somaclones, a presença deste regulador de crescimento
não apresentou efeito promotor, chegando mesmo a inibir o crescimento, em alguns casos.
87
Tabela 4. Influência de diferentes concentrações de GA
3
sobre o crescimento da parte aérea e do
sistema radicular de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a
partir do cultivo de plantas com 95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
GA
3
(µM)
MSA
(mg)
a
MSA/
MFA
a
MSR
(mg)
a
Nº de
folhas
a
Nº de
nós
a
Nº de
gemas
a
Nº de
ramos
a
Compr. do >
ramo (cm)
a
0
161,2 a 0,14 b 76,7 a 18,8 a 18,6 a 29,6 a 4,9 a 3,9 a
2,5 100,0 b 0,16 ab 57,3 ab 12,8 b 10,3 b 17,5 b 2,7 b 2,5 ab
5,0
83,6 b 0,18 a 41,3 b 10,0 b 8,8 b 14,6 b 2,3 b 2,5 ab
S1
7,5 75,4 b 0,17 ab 45,3 ab 11,3 b 8,5 b 15,2 b 2,3 b 1,8 b
0 93,3 a 0,12 b 32,3 a 27,5 a 20,7 a 34,6 a 5,1 a 0,9 b
2,5 95,6 a 0,13 ab 23,5 ab 26,6 a 21,9 a 5,9 a 4,7 a 1,6 a
5,0
88,5 a 0,14 ab 28,1 a 30,6 a 25,3 a 43,4 a 4,1 a 1,1 ab
S2
7,5* 58,8 a 0,16 a 13,1 b 17,0 a 15,3 a 27,1 a 2,7 a 1,0 ab
0 142,6 a 0,14 b 48,8 a 24,3 a 20,5 a 34,8 a 2,9 a 0,9 a
2,5 85,0 b 0,15 ab 43,6 ab 14,4 b 13,5 b 22,7 b 2,3 ab 0,5 ab
5,0
78,2 b 0,17 a 39,6 ab 14,6 b 11,5 b 19,8 b 1,8 ab 0,5 ab
S3
7,5 68,9 b 0,17 a 25,0 b 11,4 b 7,1 b 12,3 b 1,3 b 0,4 b
0 171,7 a 0,15 a 77,6 a 21,5 a 19,6 a 29,4 a 4,8 a 3,9 a
2,5 120,5 b 0,17 a 54,6 ab 14,9 b 13,7 b 22,5 b 3,5 b 3,8 a
5,0 77,6 c 0,16 a 41,4 b 10,5 bc 9,6 bc 15,1 c 2,3 c 2,4 a
S4
7,5 75,1 c 0,16 a 41,3 b 9,2 c 7,7 c 12,9 c 1,9 c 3,0 a
0 181,6 a 0,17 a 52,3 a 17,8 a 16,3 a 24,5 a 4,1 a 4,0 a
2,5 111,7 b 0,17 a 31,9 b 14,3 ab 11,6 b 19,4 ab 2,8 ab 3,2 a
5,0 100,3 b 0,17 a 26,7 b 12,9 bc 9,5 bc 14,5 bc 2,7 ab 3,1 a
S5
7,5 80,6 b 0,17 a 39,1 ab 9,2 c 6,4 c 11,2 c 1,9 b 2,4 a
a
Médias de pelo menos 7 repetições (*) seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MSA= massa seca da parte aérea; MFA=
massa fresca da parte aérea; MSR= massa seca da raiz.
88
Figura 1. Plantas dos somaclones S1 (A), S2 (B), S3 (C), S4 (D) e S5 (E) de
D
ioscorea
composita produzidas, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 95-99 dias de idade
em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na
ausência (a) ou na presença de 2,5 μM (b), 5,0 µM (c) e 7,5 µM de GA
3
(d). (barra= 1cm)
A
a b c d
B
a b c d
a b c d
a b c d
a b c d
C
D
E
89
Quando se compara o crescimento dos somaclones, para cada concentração de GA
3
utilizada (Tabela 5), observa-se que não foram detectadas diferenças entre os somaclones,
com relação à massa seca da parte aérea, apenas nas concentrações de 5,0 µM e 7,5 µM de
GA
3
. Na ausência deste regulador, os somaclones S1, S4 e S5 apresentaram os maiores
valores de massa seca da parte aérea em relação ao S2, enquanto que, na concentração de 2,5
µM o maior valor foi observado para o somaclone S4, que diferiu apenas do S3.
Tabela 5. Influência de diferentes concentrações de GA
3
sobre o crescimento e teor de água de
microtubérculos de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a
partir do cultivo de plantas com 95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
GA
3
(µM)
Somaclones MSA (mg)
a
MST (mg)
a
MST/MFT
a
MST/MSA
a
Teor de água
(% MFT)
a
S1 161,2 ab 130,2 b 0,26 a 0,81 b 73,6 b
S2 93,3 c 209,4 a 0,20 b 3,00 a 79,9 a
S3 142,3 b 134,6 b 0,25 a 0,97 b 74,7 b
S4 171,8 ab 132,7 b 0,26 a 0,83 b 74,3 b
0
S5 181,6 a 127,3 b 0,27 a 0,69 b 73,1 b
S1 100,0 ab 186,2 a 0,27 a 1,9 a 71,7 b
S2 95,6 ab 174,8 a 0,24 b 1,9 a 76,0 a
S3 85,0 b 120,4 a 0,25 ab 1,5 a 74,7 ab
S4 120,6 a 164,5 a 0,27 a 1,4 a 73,0 b
2,5
S5 111,7 ab 136,4 a 0,27 a 1,3 a 73,1 b
S1 83,8 a 163,2 a 0,27 ab 2,3 a 73,3 ab
S2 88,5 a 193,5 a 0,24 b 3,1 a 76,4 a
S3 76,2 a 161,5 a 0,27 ab 2,2 a 73,2 ab
S4 77,8 a 174,1 a 0,28 a 2,4 a 71,7 b
5,0
S5 100,3 a 154,4 a 0,28 a 1,6 a 71,9 b
S1 75,4 a 192,9 a 0,27 a 2,6 a 73,4 a
S2* 58,9 a 153,9 a 0,26 a 5,2 a 73,6 a
S3 68,9 a 103,0 a 0,27 a 1,6 a 73,1 a
S4 75,1 a 192,9 a 0,27 a 2,6 a 73,4 a
7,5
S5 80,6 a 202,9 a 0,27 a 2,9 a 73,3 a
a
Médias de pelo menos 7 repetições (*) seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MSA= massa seca da parte aérea; MST=
massa seca do microtubérculo; MFT= massa fresca do microtubérculo.
Não foram verificadas diferenças entre os somaclones, com relação à massa seca dos
microtubérculos, na presença de GA
3
(Figura 2)
.
Porém, na ausência deste regulador, os
microtubérculos do somaclone S2 apresentaram valores superiores em relação aos demais
somaclones. O mesmo tipo de resposta foi obtido para os valores da razão entre a massa seca
90
do microtubérculo e a massa seca da parte aérea. Apenas na concentração de 7,5 µM de GA
3
não foram detectadas diferenças entre os somaclones, já nas concentrações de 2,5 µM e 5,0
µM de GA
3
os valores de S4 e S5 foram maiores dos que os obtidos para o S2 e na ausência
do regulador os valores observados para os somaclones S3, S4 e S5 foram superiores ao S1 e
S2. Como decorrência, os teores de água foram os menores nos tratamentos acima
mencionados.
Figura 2. Microtubérculos dos somaclones S1 (A), S2 (B), S3 (C), S4 (D) e
S5 (E) de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do
cultivo de plantas com 95-99 dias de idade em meio de cultura Murashige &
Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na ausência (a) ou na
presença de 2,5 μM (b), 5,0 µM (c) e 7,5 µM de GA
3
(d). (barra= 1cm).
A
a b c d
a b c d
a b c d
a b c d
a b c d
B
C
D
E
91
4.3.2. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura contendo ácido
giberélico sobre a morfogênese e o crescimento in vitro
4.3.2.1. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura
contendo ácido giberélico sobre a morfogênese das plantas
Os dados da Tabela 6 indicam que ramos, raízes e microtubérculos foram induzidos
(Figura 3) em 100% das plantas dos somaclones S1 e S4 submetidas, durante diferentes
períodos de tempo, em meio de cultura contendo GA
3
. A percentagem de senescência das
plantas do somaclone S1 foi maior quando mantidas por 30 ou 45 dias em contato com o
regulador, enquanto que para o somaclone S4, quando expostas por 15 e 45 dias.
Tabela 6. Influência do tempo de permanência de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, com 126 dias de idade, em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
sobre a morfogênese e senescência. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones Tempo
(dias) Ramos
a
(%) Raízes
a
(%) Microtubérculos
a
(%) Senescência
a
(%)
0 100 100 100 0
15 100 100 100 0
30 100 100 100 33
45 100 100 100 25
S1
122 100 100 100 0
0 100 100 100 0
15 100 100 100 25
30 100 100 100 0
45 100 100 100 17
S4
122 100 100 100 0
a
Valores são proporções calculadas com base em doze repetições por tratamento. MST= massa seca dos
microtubérculos.
92
4.3.2.2. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura
contendo ácido giberélico sobre a o crescimento dos microtubérculos
A análise de variância multifatorial, realizada para avaliar os efeitos do tempo de
permanência em GA
3
e dos somaclones, indicou interação apenas para a variável massa seca
do microtubérculo, não sendo significativa para as variáveis de razão entre as massas seca e
fresca dos microtubérculo, teor de água em percentagem da massa fresca do microtubérculo,
massa seca da parte aérea e razão entre as massas secas do microtubérculo e da parte aérea da
planta. Verifica-se, pela Tabela 7, que os valores de massa seca obtidos para os tempos de
permanência de 15 e 30 dias para o somaclone S1, e de 15 dias para o somaclone S4 foram
superiores apenas ao valor observado para o tempo de permanência de 30 dias das plantas do
somaclone S4, não diferindo dos demais tratamentos (Figura 4).
A B
a b c a b c
Figura 3. Plantas dos somaclones S1 (A) e S4 (B) de Dioscorea composita
produzidas, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 126 dias de
idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com
8% de sacarose. As plantas permaneceram por 15 (a); 30 (b) e 45(c) dias em
meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de
sacarose
,
na
p
resen
ç
a de 5
,
0
µ
M de GA
3
.
(
barra=1 cm
)
.
93
Tabela 7. Influência do tempo de permanência de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, com 126 dias de idade, em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
sobre o crescimento em massa seca de
microtubérculos e da parte aérea. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones Tempo (dias)
MST (mg)
a
0 130,2 ab
15 202,3 a
30 198,3 a
45* 130,2 ab
S1
112 162,3 ab
0 132,7 ab
15* 209,8 a
30 105,1 b
45 137,4 ab
S4
112 175,7 ab
a
Médias de no mínimo 9 (*) repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤ 0,05). MST= massa seca do microtubérculo.
Porém, quando se analisa o dado de percentagem de microtubérculos formados por
classes de valores de massa seca, verifica-se que, tanto para o somaclone S1 quanto para o S4,
não foram formados microtubérculos com massas secas superiores a 201 mg, quando as
plantas não ficaram expostas ao GA
3
(Tabela 8). Para o somaclone S1, a exposição das
plantas ao regulador de crescimento, durante 15 e 30 dias, elevou para 50% e 54%,
respectivamente, a percentagem de microtubérculos maiores que 201 mg. Quando inoculadas
por 45 dias com GA
3
, as plantas não formaram microtubérculos nesta classe de massa seca e,
quando permaneceram todo o tempo em contato com o regulador, o valor caiu para 33%.
A B
a b c a b c
Figura 3. Microtubérculos dos somaclones S1 (A) e S4 (B) de Dioscorea composita
produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 126 dias de idade em meio
de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose. As plantas
permaneceram por 15 (a); 30 (b) e 45(c) dias em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose, na presença de 5,0 µM de GA
3
. (barra=1 cm).
94
Verifica-se ainda que, no tratamento de exposição por 30 dias, apenas 9% dos
microtubérculos tiveram massa seca inferior a 100 mg.
Para o somaclone S4, a exposição das plantas, por apenas 15 dias no meio de cultura
contendo GA
3
, fez com que 44% dos microtubérculos produzidos tivessem massa seca
superior a 201 mg e com que nenhum microtubérculo, com massa seca menor que 100 mg,
fosse formado. Contudo, as exposições por 30 e 45 dias, respectivamente, pareceram inibir
totalmente ou reduzir a percentagem de microtubérculos formados nesta classe de massa seca.
Observa-se que, no tempo de exposição por 30 dias, 42% dos microtubérculos produzidos
foram menores que 100 mg de massa seca. De forma semelhante ao somaclone S1, apenas
33% dos microtubérculos foram produzidos com massa seca superior a 201 mg, quando as
plantas permaneceram 122 dias em contato com o regulador de crescimento.
95
Tabela 8. Distribuição por freqüência (%) de intervalos de classes de massa seca de microtubérculos e
número total de microtubérculos formados por tratamento (entre parênteses) por diferentes somaclones
de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 126 dias, que
permaneceram em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de
sacarose e 5 μM de GA
3
, por diferentes períodos de tempo.Universidade Federal de Santa Catarina,
2006.
Somaclones
Tempo (dias) Classes de MST (mg)
S1
a
S4
a
≤ 100 42 (12) 33 (12)
101-150 8 17
151-200 50 50
201-300 0 0
0
> 300 0 0
≤ 100 25 (12) 0 (9)
101-150 0 33
151-200 25 22
201-300 33 33
15
> 300 17 11
≤ 100 9 (11) 42 (12)
101-150 18 50
151-200 18 8
201-300 45 0
30
> 300 9 0
≤ 100 22 (9) 20 (10)
101-150 44 50
151-200 33 20
201-300 0 10
45
> 300 0 0
≤ 100 25 (12) 17 (12)
101-150 33 17
151-200 8 33
201-300 25 33
122
> 300 8 0
a
Valores de proporções calculadas com base no número total de microtubérculos formados de pelo menos nove
repetições por tratamento. MST= massa seca dos microtubérculos.
Os dados da Tabela 9 indicam que, tanto para o somaclone S1 quanto para o S4, os
diferentes tempos de permanência das plantas, em meio de cultura contendo GA
3
, não
provocou diferenças nos valores de razão entre as massas seca e fresca dos microtubérculos e,
conseqüentemente, no teor de água. Observa-se também que, para cada tempo de exposição
ao regulador, não foram detectadas diferenças entre os somaclones. Contudo, para o
somaclone S1, os valores de massa seca da parte aérea das plantas, que não foram expostas ao
GA
3
ou que foram expostas por 30 e 45 dias, foram superiores aos obtidos nos tempos de
exposição de 15 e 112 dias. Já para S4, a não exposição ao regulador provou o maior
96
incremento na massa seca da parte aérea. Também neste caso, não foram observadas
diferenças entre os somaclones em nenhum dos tempos de exposição estudados.
Com relação aos valores de razão entre as massas secas do microtubérculo e da parte
aérea, verifica-se que, para o somaclone S1, o maior valor foi obtido no tempo de exposição
de 15 dias, diferindo dos tratamentos em que as plantas não foram expostas ao GA
3
ou
permaneceram em meio de cultura contendo esse regulador por 30 e 45 dias. Para o
somaclone S4, os maiores valores foram obtidos nos tempos de exposição de 15 e 112,
diferindo dos obtidos quando as plantas não foram expostas ao GA
3
ou quando expostas por
30 dias. Apenas no tempo de exposição de 30 dias o valor apresentado pelo somaclone S1 foi
superior ao do S4.
Tabela 9. Influência do tempo de permanência de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, com 126 dias de idade, em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
sobre as razões entre massa seca e massa fresca dos
microtubérculos e entre massa seca do microtubérculo e massa seca da parte aérea. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Tempo (dias)
Somaclone
0 15 30 45 112
MST/MFT
a
S1 0,26 Aa 0,29 Aa 0,25 Aa 0,30 Aa 0,27 Aa
S4 0,26 Aa 0,27 Aa 0,27 Aa 0,28 Aa 0,29 Aa
Teor de água (% MF)
a
S1 74 Aa 71 Aa 75 Aa 71 Aa 73 Aa
S4 74 Aa 73 Aa 73 Aa 72 Aa 72 Aa
MSA (mg)
a
S1 161,2 Aa 85,8 Ab 151,4 Aa 128,8 Aa 83,8 Ab
S4 171,8 Aa 86,1 Acd 156,8 Aab 126,2 Abc 77,8 Ad
MST/MSA
a
S1 0,8 Ac 2,7 Aa 1,3 Abc 1,2 Abc 2,4 Aab
S4 0,8 Ab 2,5 Aa 0,7 Bb 1,5 Aab 2,4 Aa
a
Médias de no mínimo 9 repetições seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não
diferem significativamente entre si de acordo, respectivamente, com o teste t de Student (p≤ 0,05) e com teste de
Tukey (p≤ 0,05). MF = massa fresca. MFT= massa fresca do microtubérculo; MST= massa seca do
microtubérculo; MSA= massa seca da parte aérea.
97
4.3.2.3. Efeito do período de permanência das plantas em meio de cultura
contendo ácido giberélico sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das
plantas
A análise de variância multifatorial, realizada para avaliar os efeitos do tempo de
permanência em GA
3
e dos somaclones sobre o crescimento da parte aérea e do sistema
radicular das plantas, indicou interação significativa entre estes fatores apenas para a variável
massa seca das raízes, não sendo significativa para as variáveis de números de folhas, de nós,
de gemas e de ramos e comprimento do maior ramo por planta. Verifica-se, pela Tabela 10,
que os menores valores de massa seca das raízes foram observados, para ambos os
somaclones, no tratamento em que as plantas permaneceram 112 dias em contato com o meio
de cultura contendo GA
3
. Esses valores diferiram dos tratamentos de não exposição das
plantas ao regulador de crescimento, tanto para S1 quanto para S4 e do tratamento com o
somaclone S1 em que as plantas foram expostas por 30 dias ao GA
3.
Tabela 10. Influência do tempo de permanência de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, com 126 dias de idade, em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
sobre o crescimento em massa seca do sistema
radicular das plantas. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones Tempo (dias) MSR
a
* (mg)
0 76,7 ab
15 46,9 bc
30 95,6 a
45 66,8 abc
S1
112 42,3 c
0 77,6 a
15 47,8 bc
30 45,3 bc
45 48,0 bc
S4
112 41,4 c
a
Médias de no mínimo 9 repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤ 0,05).* = interação significativa; MSR= massa
seca do sistema radicular.
98
Na Tabela 11 são apresentados os dados dos números de folhas, de nós, de gemas e de
ramos, produzidos por planta, e do comprimento do maior ramo observados após os diferentes
tempos de permanência das plantas em meio de cultura contendo GA
3
.
Tabela 11. Influência do tempo de permanência de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea
composita, com 126 dias de idade, em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
sobre o crescimento da parte aérea. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Tempo (dias)
0 15 30 45 112
Somaclone
Nº de folhas
a
S1 18,8 Aab 12,9 Abc 20,3 Aa 17,0 Aabc 10,0 Ac
S4 21,5 Aa 13,7 Aa 21,3 Aa 15,1 Ab 10,5 Ab
Nº de nós
a
S1 18,8 Aa 10,6 Ab 19,7 Aa 15,0 Aab 9,0 Ab
S4 19,6 Aa 11,3 Ab 19,4 Aa 15,1 Aab 9,7 Ab
Nº de gemas
a
S1 29,8 Aa 17,5 Ab 31,5 Aa 24, 3 Aab 14,8 Ab
S4 29,4 Aa 18,6 Ab 30,7 Aa 22,8 Aab 15,1 Ab
Nº de ramos
a
S1 4,9 Aa 2,4 Ab 4,2 Aa 3,4 Aab 2,3 Ab
S4 4,8 Aa 2,7 Ab 5,3 Aa 4,0 Aab 2,3 Ab
Comprimento do maior ramo (cm)
a
S1 3,9 Aa 2,3 Aa 3,0 Aa 2,3 Ba 2,6 Aa
S4 3,9 Aa 2,3 Aa 2,9 Aa 4,1 Aa 2,4 Aa
a
Médias de no mínimo 9 repetições seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não
diferem significativamente entre si de acordo, respectivamente, com o teste t de Student (p≤ 0,05) e com teste de
Tukey (p≤ 0,05).
Verifica-se que, o número de folhas produzidas por planta do somaclone S1 foi maior
com 30 dias de exposição e não diferiu dos tratamentos com 45 dias de exposição e daquele
em que as plantas não foram expostas ao regulador de crescimento. O somaclone S4
apresentou respostas semelhantes, sendo os maiores valores dos números de folhas
observados na ausência de exposição ou na exposição por 30 dias. Não foram detectadas
diferenças entre os somaclones em nenhum dos tempos de exposição estudados (Figura 4).
Com relação aos números de nós, de gemas e de ramos observa-se que as respostas
dos somaclones S1 e S4 foram idênticas, indicando que os tratamentos promotores foram a
99
não exposição ao GA
3
ou a exposição por 30 dias. Novamente, não foram observadas
diferenças entre os somaclones em nenhum dos tempos de exposição ao regulador (Figura 4).
Para ambos os somaclones, o comprimento do maior ramo não foi influenciado por
nenhum dos períodos de permanência das plantas em meio de cultura contendo GA
3
. Não
houve diferença entre os somaclones em nenhum dos tempos de exposição testados, exceto no
de 45 dias, em que o somaclone S4 apresentou maior comprimento de ramo em relação a S1
(Figura 4).
4.3.3. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
ácido naftaleno acético sobre a morfogênese e o crescimento in vitro
4.3.3.1. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações
de ácido naftaleno acético sobre a morfogênese das plantas
Os resultados da Tabela 12 indicam que as plantas dos diferentes somaclones,
dependendo da concentração de ANA, apresentaram quatro diferentes respostas de
A
B
a b c a b c
Figura 4. Plantas dos somaclones S1 (A) e S4 (B) de Dioscorea composita
produzidas a partir do cultivo de plantas, com 126 dias de idade, em meio de
cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose. As
plantas permaneceram por 15 (a); 30 (b) e 45(c) dias em meio de cultura
Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na presença
de 5,0 µM de GA
3
. (barra=1 cm).
100
morfogênese: formação de ramos, de raízes, de bulbilhos aéreos e/ou microtubérculos. Em
todos os tratamentos, 100% das plantas desenvolveram novos ramos, raízes e
microtubérculos.
Tabela 12. Influência de diferentes concentrações de ANA sobre a morfogênese e senescência de
diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de
plantas com 124-173 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
ANA
(µM)
Ramos
a
(%)
Raízes
a
(%)
Microtubérculos
a
(%)
Bulbilhos
Aéreos
a
(%)
Senescência
a
(%)
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 0 0
S1
5,0 100 100 100 0 33,3
0 100 100 100 16,7 0
2,5 100 100 100 0 41,7
S2
5,0 100 100 100 0 33,3
0 100 100 100 0 8
2,5 100 100 100 0 16,7
S3
5,0 100 100 100 0 8,3
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 0 0
S4
5,0 100 100 100 0 16,7
0 100 100 100 0 0
2,5 100 100 100 16,7 0
S5
5,0 100 100 100 0 66,7
a
Valores são proporções calculadas com base em doze repetições por tratamento.
Não houve relação entre a concentração de ANA e a formação de bulbilhos aéreos, já
que os somaclones S2 e S5 foram os únicos que formaram estes órgãos O somaclone S2
formou bulbilhos aéreos com massa seca média de 31 mg na ausência de ANA e as plantas do
somaclone S5 formaram bulbilhos aéreos com massa seca média de 28 mg em meio de cultura
contendo 2,5 µM de ANA.
A presença de ANA no meio de cultura influenciou a percentagem de senescência das
plantas, uma vez que na ausência deste regulador, todas as plantas, de todos os somaclones,
sobreviveram, exceto para o somaclone S3. Na presença de 2,5 µM de ANA os somaclones
S2 e S3 apresentaram senescência, tendo S2 a maior percentagem observada (42%). Quando
101
na presença de 5 µM de ANA, ocorreu senescência em todos os somaclones, onde S3
apresentou a menor percentagem (8%) e o S5 a maior (66,7%).
4.3.3.2. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações
de ácido naftaleno acético sobre o crescimento dos microtubérculos
Os resultados da Tabela 13 indicam que, para todos os somaclones, o crescimento em
massa seca dos microtubérculos (Figura 5) e a razão entre as massas secas do microtubérculo
e da parte aérea da planta não diferiram na ausência ou na presença de ANA. Contudo, para
todos os somaclones, exceto o S2, foram detectadas diferenças entre os tratamentos com
relação à razão entre as massas seca e fresca do microtubérculo e conseqüentemente, com
relação ao teor de água. Verifica-se que, os menores valores de massa seca do microtubérculo
por unidade de massa fresca foram observados, em todos os somaclones, nas concentrações de
2,5 µM e 5,0 µM de ANA. No caso dos somaclones S4 e S5 os valores observados nestas
concentrações diferiram do tratamento em que o ANA não foi adicionado ao meio de cultura
enquanto que, no caso dos somaclones S1 e S3 apenas os valores obtidos na concentração de
5,0 µM de ANA diferiram do tratamento sem o regulador. Por conseguinte, as mesmas
diferenças foram observadas em relação às variações no teor de água dos microtubérculos,
sendo maiores na presença de ANA.
102
Tabela 13. Influência de diferentes concentrações de ANA sobre o crescimento e teor de água de
microtubérculos de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a
partir do cultivo de plantas com 124-173 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
. Universidade Federal de Santa Catarina,
2006.
Somaclones
ANA
(µM)
MST
(mg)
a
MST/MFT
a
MST/MSA
a
Teor de água
(% MF)
a
0 204,7 a 0,30 a 2,4 a 69,5 b
2,5 200,9 a 0,27 ab 2,4 a 73,1 ab
S1
5,0 248,3 a 0,22 b 3,1 a 77,9 a
0 174,7 a 0,23 a 2,4 a 76,7 a
2,5 208,6 a 0,22 a 2,7 a 78,5 a
S2
5,0 206,1 a 0,21 a 5,2 a 78,9 a
0 185,9 a 0,26 a 2,0 a 74,2 b
2,5 147,7 a 0,25 ab 2,1 a 74,7 ab
S3
5,0 154,6 a 0,23 b 2,6 a 76,9 a
0 175,7 a 0,28 a 2,0 a 71,2 b
2,5 218,3 a 0,23 b 2,0 a 76,8 a
S4
5,0 194,4 a 0,22 b 2,8 a 77,9 a
0 179,1 a 0,29 a 1,6 a 71,1 b
2,5 176,2 a 0,25 b 1,7 a 74,6 a
S5
5,0* 144,0 a 0,23 b 1,8 a 77,0 a
a
Médias de pelo menos 4 repetições (*) seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MST= massa seca do microtubérculo;
MFT= massa fresca do microtubérculo; MSA= massa seca da parte aérea.
Quando se analisa a distribuição da percentagem de microtubérculos produzidos por
classes de intervalos de massa seca verifica-se, pela Tabela 14, que para o somaclone S1 a
Figura 5. Microtubérculos dos somaclones S1 (A),
S2 (B), S3 (C), S4 (D) e S5 (E) de Dioscorea
composita produzidos, após 16 semanas, a partir
do cultivo de plantas com 124-173 dias de idade
em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-
sólido, suplementado com 8% de sacarose e 5,0
µM de GA
3
, na ausência (a) ou presença de 2,5 μM
(
b
)
e 5,0
µ
M de ANA
(
c
)
.
(
barra=1cm
)
.
A B
C D
E
a b c a b c
a b c a b c
a b c
103
maior percentagem de microtubérculos com massa seca superior a 201 mg foi formada na
ausência de ANA (50%) ou na concentração de 5,0 μM de ANA (63%), e nesta concentração
não houve a formação de microtubérculos com massa seca inferior a 100 mg. O somaclone S2
não formou microtubérculos menores que 100 mg de massa seca, em nenhum dos
tratamentos, porém nos tratamentos com 2,5 μM e 5,0 μM de ANA a percentagem de
formação de microtubérculos maiores que 201 mg foi, respectivamente, de 71% e 50% contra
apenas 33% formados na ausência de ANA. O somaclone S3 formou 46% e 42% de
microtubérculos maiores que 201 mg nos tratamentos sem ANA e na presença de 2,5 μM de
ANA, respectivamente, mas nesta última concentração 17% dos microtubérculos tinham
massa seca superior a 300 mg. Contudo, com 5,0 μM de ANA apenas 9% deles tiveram massa
seca maior que 201 mg. Um aspecto importante é que na ausência de ANA não foram
formados microtubérculos menores que 100 mg, enquanto que com 2,5 μM foram formados
17%.
Os resultados obtidos para o somaclone S4 indicam que em todos os tratamentos
foram produzidos de 50% a 58% de microtubérculos com massa seca entre 201-300 mg, mas
não foram formados microtubérculos com massa seca maior que 300 mg. Entretanto, no
tratamento com 2,5 μM de ANA não foram produzidos microtubérculos com massa seca
menor que 100 mg e no tratamento com 5,0 μM a percentagem observada de microtubérculos
nesta categoria foi de apenas 10%. O somaclone S5 produziu 50% e 33% de microtubérculos
maiores que 201 mg de massa seca na ausência de ANA e na presença de 2,5 μM de ANA%,
respectivamente. Embora, nesta última concentração não foram formados microtubérculos
com massa seca menor que 100 mg enquanto que, na ausência de ANA, 33% dos mesmos
tiveram essa massa seca. Na concentração de 5,0 μM de ANA não foi observada a formação
de microtubérculos maiores que 151 mg.
104
Tabela 14. Distribuição por freqüência (%) de classes de intervalos de massa seca de microtubérculos
e número total de microtubérculos formados por tratamento (valores entre parênteses) nos diferentes
somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas de
124-173 dias de idade em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de
sacarose, 5 μM de GA
3,
na ausência ou presença de diferentes concentrações de ANA. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
a
ANA
(µM)
Classes de
MST (mg)
S1 S2 S3 S4 S5
≤ 100 8 (12) 0 (12) 0 (11) 17 (12) 33 (12)
101-150 8 42 18 17 17
151-200 33 25 36 17 0
201-300 50 33 46 50 33
0
> 300 0 0 0 0 17
≤ 100 20 (10) 0 (7) 17 (12) 0 (12) 0 (12)
101-150 40 14 25 0 25
151-200 30 14 17 42 42
201-300 10 71 25 58 33
2,5
> 300 0 0 17 0 0
≤ 100 0 (8) 0(8) 9 (11) 10 (10) 25 (4)
101-150 13 0 27 0 75
151-200 25 50 56 50 0
201-300 38 50 9 50 0
5,0
> 300 25 0 0 0 0
a
Valores são proporções calculadas com base no número total de microtubérculos formados de pelo menos sete
repetições por tratamento. MST= massa seca dos microtubérculos.
4.3.3.3. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações
de ácido naftaleno acético sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das
plantas
Os resultados sobre o crescimento da parte aérea e das raízes das plantas dos diferentes
somaclones, quando cultivadas em meio de cultura contendo 5 µM de GA
3
e diferentes
concentrações de ANA, são mostrados na Tabela 15 e na Figura 6.
Para o somaclone S1, a presença de ANA no meio de cultura não promoveu diferenças
entre os tratamentos com relação as variáveis de massa seca da parte aérea e números de nós,
de gemas e de ramos. Entretanto, diferenças entre os tratamentos foram detectadas com
relação as demais variáveis, onde para as variáveis número de folhas e razão entre a massa
105
seca e a massa fresca da parte aérea, os resultados na presença de ANA foram inferiores aos
obtidos na testemunha, caracterizado pela ausência de ANA. Ao contrário, a massa seca das
raízes foi promovida na presença de ANA. Além disso, as plantas apresentaram, quando na
presença de 2,5 µM de ANA, maior comprimento do ramo. A interação entre diferentes
concentrações de ANA com GA
3
não manifestou diferenças para o somaclone S2, visto que,
em nenhuma das variáveis analisadas os resultados obtidos na presença de ANA foram
superiores a testemunha.
Resultados semelhantes ao S1 foram observados para as plantas do somaclone S3,
exceto para as variáveis de massa seca das raízes, número de folhas e comprimento do maior
ramo, que não diferiram entre os tratamentos. As respostas das plantas dos somaclones S4 e
S5 diferiram das do somaclone S3 apenas com relação ao efeito promotor da massa seca das
raízes quando na presença de ANA. Com relação ao comprimento do maior ramo não houve
diferença entre os tratamentos para o somaclone S5 e a presença de 5,0 µM de ANA inibiu o
crescimento do ramo das plantas do somaclone S4 e também o número de ramos.
106
Tabela 15. Influência de diferentes concentrações de ANA sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular de diferentes somaclones de
Dioscorea composita produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 124-173 dias de idade em meio de cultura Murashige &
Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
a
Médias de pelo menos quatro repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey
(p≤0,05). MSA= massa seca da parte aérea; MFA= massa fresca da parte aérea; MSR= massa seca da raiz.
Somaclones
ANA
(µM)
MSA (mg)
a
MSA/
MFA
a
MSR (mg)
a
Nº de folhas
a
Nº de nós
a
Nº de gemas
a
Nº de ramos
a
Comprimento do
> ramo (cm)
a
0
91,4 a 0,17 a 47,4 b 10,8 a 11,0 a 16,2 a 3,0 a 2,8 b
2,5 107,3 a 0,16 ab 107,4 a 7,5 b 8,4 a 13,1 a 3,0 a 4,8 a
S1
5,0
90,7 a 0,14 b 94,2 a 9,7 ab 10,6 a 16,4 a 2,4 a 4,0 ab
0 92,2 a 0,14 a 25,2 a 29,1 a 24,5 a 41,8 a 5,6 a 1,3 a
2,5 94,3 a 0,13 a 29,3 a 22,6 ab 19,6 ab 34,3 ab 3,7 ab 1,5 a
S2
5,0
56,6 a 0,12 a 26,7 a 15,7 b 10,9 b 17,2 b 2,9 b 1,0 a
0 94,5 a 0,16 a 63,2 a 15,7 a 14,5 a 23,8 a 2,6 a 0,7 a
2,5 93,4 a 0,15 ab 66,4 a 17,4 a 16,6 a 27,5 a 3,5 a 0,9 a
S3
5,0
68,2 a 0,14 b 56,4 a 13,5 a 11,4 a 17,4 a 2,5 a 0,8 a
0 99,0 a 0,18 a 47,2 b 13,0 a 12,2 a 19,2 a 2,8 ab 3,1 ab
2,5 115,2 a 0,15 b 95,0 a 10,2 a 11,0 a 16,7 a 3,2 a 4,6 a
S4
5,0
87,2 a 0,16 ab 81,1 a 8,9 a 8,8 a 12,3 a 1,9 b 2,4 b
0 113,1 a 0,17 a 64,4 b 13,2 a 13,1 a 19,2 a 2,7 a 3,1 a
2,5 106,5 a 0,15 b 100,6 a 10,5 a 10,6 a 16,0 a 2,6 a 3,6 a
S5
5,0 88,2 a 0,15 b 81,5 ab 10,8 a 9,3 a 14,3 a 3,3 a 3,6 a
107
4.3.4. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações de
glutamina sobre a morfogênese das plantas e o crescimento in vitro
4.3.4.1. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações
de glutamina sobre a morfogênese das plantas e o crescimento dos microtubérculos
Em todos os tratamentos todas as plantas apresentaram, ao final do experimento,
ramos, raízes e microtubérculos. A percentagem de senescência foi de 17% para o somaclone
Figura 6. Plantas dos somaclones S1 (A), S2 (B),
S3 (C), S4 (D) e S5 (E) de Dioscorea composita
produzidas, após 16 semanas, a partir do cultivo
de plantas com 124-173 dias de idade em meio
de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido,
suplementado com 8% de sacarose e 5,0 µM de
GA
3
, na ausência (a) ou na presença de 2,5 μM
(
b
)
e 5,0
µ
M de ANA
(
c
)
.
(
barra= 1cm
)
.
A
B
C D
E
a b c
a b c
a b c a b c
a b c
108
S1 e de 8% para o S2, ocorrendo, em ambos os casos nos tratamentos com 2,73 mM de
glutamina. Não foi observada a formação de bulbilhos aéreos em nenhum dos tratamentos.
A análise de variância multifatorial realizada para avaliar os efeitos da concentração
de glutamina e dos somaclones indicou interação significativa entre estes fatores apenas para
as variáveis razão entre as massas seca e fresca dos microtubérculos e o teor de água em
percentagem de massa fresca dos microtubérculos, não sendo significativa para as variáveis
massa seca dos microtubérculos e da parte aérea e razão entre as massas secas do
microtubérculo e da parte aérea. Observa-se, pela Tabela 16, que o maior valor de razão entre
as massas seca e fresca dos microtubérculos, e conseqüentemente, o menor teor de água, foi
obtido para as plantas do somaclone S4, na presença de 2,73 mM de glutamina. Esse resultado
diferiu de todos os demais tratamentos exceto do somaclone S1, com 4,10 mM de glutamina.
Tabela 16. Efeito de diferentes concentrações de glutamina sobre os teores massa seca por unidade de
massa fresca e de água de microtubérculos de diferentes somaclones de Dioscorea composita
produzidos, após 16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 124 dias de idade em meio de cultura
Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3
. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
Glutamina
(mM)
MST/MFT
a *
Teor de água
(% MFT)
a *
0 0,27 ab 73,0 a
2,73 0,27 ab 72,7 a
S1
4,10 0,29 a 70,9 ab
0 0,27 b 72,8 a
2,73 0,31 a 69,2 b
S4
4,10 0,27 b 73,5 a
a
Médias de no mínimo 10 repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤ 0,05).* = interação significativa; MFT= massa
fresca do microtubérculo, MST= massa seca do microtubérculo.
Os resultados da Tabela 17 indicam que, para cada somaclone, as concentrações de
glutamina não provocaram diferenças em relação a testemunha, caracterizada pela ausência de
glutamina, para as variáveis de valores de massa seca da parte aérea, massa seca do
microtubérculo e razão entre as massas secas do microtubérculos e da parte aérea das plantas.
109
Também não foram detectadas diferenças, entre os somaclones, em nenhuma das
concentrações de glutamina testadas.
Tabela 17. Efeito de diferentes concentrações de glutamina sobre o crescimento em massa seca da
parte aérea e de microtubérculos de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após
16 semanas, a partir do cultivo de plantas com 124 dias de idade em meio de cultura Murashige &
Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose e 5 µM de GA
3.
Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Glutamina (mM)
0
2,73
4,10
Somaclones
MSA
a
S1 76,6 Aa 88,4 Aa 78,6 Aa
S4
93,8 Aa
74,6 Aa
82,1 Aa
MST
a
S1 178,4 Aa 158,4 Aa 144,5 Aa
S4
174,3 Aa
156,7 Aa
187,3 Aa
MST/MSA
a
S1 2,6 Aa 1,9 Aa 1,8 Aa
S4 2,2 Aa 2,2 Aa 2,5 Aa
a
Médias de no mínimo 10 repetições seguidas pela mesma letra, maiúscula na coluna e minúscula na linha, não
diferem significativamente entre si de acordo, respectivamente, com o teste t de Student (p≤ 0,05) e com teste de
Tukey (p≤ 0,05). MST= massa seca do microtubérculo; MSA= massa seca da parte aérea.
Os resultados da Tabela 18 parecem indicar que, na presença de glutamina, houve
tendência de aumentar a proporção de microtubérculos com massas secas menores que 100
mg em relação ao tratamento testemunha (17%). Para o somaclone S1 os valores foram de
30% e 33% e para o somaclone S4 de 36% e 25%, nas concentrações de 2,73 mM e 4,10 mM
de glutamina, respectivamente. Por outro lado, estes tratamentos pareceram não favorecer o
aumento da proporção de microtubérculos com massas secas maiores que 301 mg.
110
Tabela 18. Distribuição por freqüência (%) de classes de intervalos de massa seca de microtubérculos
e número total de microtubérculos formados por tratamento (entre parênteses) por diferentes
somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 12 semanas, a partir do cultivo de plantas em
meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, 5 μM de GA
3
na
ausência ou presença de diferentes concentrações de glutamina. Universidade Federal de Santa
Catarina, 2006.
Somaclones
Glutamina (Mm) Classes de MST (mg)
a
S1 S4
≤ 100 17 (12) 17 (12)
101-150 33 17
151-200 8 33
201-300 33 33
0
> 300 8 0
≤ 100 30 (10) 36 (11)
101-150 10 18
151-200 20 27
201-300 30 18
2,73
> 300 0 0
≤ 100 33 (12) 25 (12)
101-150 25 17
151-200 17 17
201-300 17 33
4,10
> 300 8 8
a
Valores de proporções calculadas com base no número total de microtubérculos formados de pelo menos dez
repetições por tratamento. MST= massa seca dos microtubérculos.
4.3.4.2. Efeito do ácido giberélico em combinação com diferentes concentrações
de glutamina sobre o crescimento da parte aérea e do sistema radicular das plantas
As diferentes concentrações de glutamina não induziram diferenças na razão entre as
massas seca e fresca da parte aérea, nos números de folhas, de nós, de gemas e de ramos e no
comprimento do maior ramo das plantas dos somaclones S1 e S4 em relação a testemunha
(Tabela 19). Verifica-se que, para o somaclone S1, não houve diferença entre os tratamentos
com relação à massa seca das raízes, contudo para o somaclone S4 foi verificada diminuição
da massa seca das raízes quando as plantas foram cultivadas na presença de 2,73 mM de
glutamina.
111
Tabela 19. Influência de diferentes concentrações de glutamina sobre o crescimento da parte aérea e
do sistema radicular de plantas de diferentes somaclones de Dioscorea composita produzidos, após 16
semanas, a partir do cultivo de segmentos nodais caulinares contendo gema axilar foliar em meio de
cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose, na presença de 5 μM de
GA
3
. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Somaclones
Glutamina
(mM)
MSA/
MFA
a
MSR
(mg)
a
Nº de
folhas
a
Nº de
nós
a
Nº de
gemas
a
Nº de
ramos
a
Comprimento do
> ramo (cm)
a
0
0,16 a 44,7 a 11,3 a 9,4 a 14,1 a 2,7 a 3,1 a
2,73 0,17 a 39,0 a 13,1 a 12,5 a 20,0 a 2,9 a 2,9 a
S1
4,10
0,16 a 28,5 a 12,6 a 10,2 a 17,3 a 2,8 a 2,2 a
0 0,17 a 47,8 a 12,3 a 12,4 a 18,6 a 3,0 a 3,0 a
2,73 0,18 a 24,3 b 13,5 a 9,7 a 15,8 a 2,8 a 2,8 a
S4
4,10 0,17 a 41,9 a 10,7 a 9,3 a 14,9 a 2,5 a 2,5 a
a
Médias de pelo menos dez repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p≤0,05). MSA= massa seca da parte aérea; MFA=
massa fresca da parte aérea; MSR= massa seca da raiz.
4.4. DISCUSSÃO
Raras são as informações na literatura sobre o potencial do ácido giberélico na
morfogênese, crescimento e tuberização de plantas do gênero
Dioscorea. As giberelinas
pertencem a uma grande família de compostos diterpênicos, onde o ácido giberélico apresenta
função de controle de muitos processos do desenvolvimento vegetal (Davies, 1995).
A formação de bulbilhos aéreos, na presença de diferentes concentrações de GA
3,
proporciona mais uma fonte de propagação vegetativa de
Dioscorea composita, juntamente
com os microtubérculos que foram induzidos na presença deste regulador de crescimento.
O GA
3
é considerado um inibidor do processo de tuberização em vários sistemas
(Figueiredo-Ribeiro
et al., 2004), mesmo quando outras condições são indutoras deste
processo (Vreugdenhil
et al., 1998). De acordo com Figueiredo-Ribeiro et al. (2004),
aplicações de GA
3
mimetizam os efeitos de condições ambientais não indutivas da
tuberização, por isso, esse regulador de crescimento pode ser considerado controlador do
processo de tuberização. A presença de GA
3
no meio de cultura também não se mostrou
112
eficiente na indução de microtubérculos em explantes de Solanum tuberosum, sendo
raramente observada, mesmo em alta concentração de sacarose (Vreugdenhil
et al., 1998), um
dos requisitos para indução de tuberização nessa espécie (Figueiredo-Ribeiro
et al., 2004).
Entretanto, nos experimentos conduzidos no presente trabalho, esse regulador de crescimento
não inibiu a indução dos microtubérculos e nem o acúmulo de massa seca pelos mesmos, em
nenhuma das concentrações estudadas, mas alterou a morfologia dos mesmos em relação aos
tratamentos com ausência desse regulador, indicando uma possível atuação do regulador de
crescimento na direção dos eixos de divisão e/ou expansão celular propiciando a formação de
microtubérculos alongados.
O fato de o GA
3
não promover o aumento da massa seca dos microtubérculos, em
comparação com o tratamento sem este regulador de crescimento, poderia ser explicado por
um efeito promotor, similar ao que ocorre em sementes de cevada, sobre a ativação das
amilases, que poderiam reduzir o acúmulo de amido pelas células (Taiz & Zeiger, 2004). Isto
explicaria também os resultados obtidos para os experimentos sobre os efeitos dos diferentes
tempos de permanência em meio contendo GA
3
, que indicaram que a permanência das plantas
por um período prolongado, na presença desse regulador de crescimento, não favoreceu o
incremento em massa seca dos microtubérculos.
A constatação de 15 dias ser o tempo mínimo suficiente de exposição das plantas ao
GA
3
para garantir maior massa seca, maior proporção de microtubérculos com massa seca
maior que 201 mg e menor proporção de microtubérculos menores que 100 mg de massa seca
é um resultado relevante para otimizar a produção de biomassa para produção de metabólitos
secundários. Esse resultado, também confirmado nos experimentos sobre o efeito de
diferentes concentrações desse regulador, demonstra que, exceto para o somaclone S5, a
presença de GA
3
no meio de cultura foi necessária para aumentar a proporção de
microtubérculos com massas secas maiores que 201 mg e diminuir a proporção daqueles com
113
massas secas menores que 100 mg, sendo que a concentração ótima desse regulador, para
assegurar esta condição, variou para cada somaclone. Entretanto, estas concentrações ótimas
de GA
3
(2,5 µM, para o somaclone S1, 5,0 µM para o S2 e S3, 7,5 µM para o S4 e ausência
de GA
3
para o S5) não coincidiram com aquelas em que foi observada a maior percentagem
de senescência das plantas. Desta forma, apesar de o GA
3
não ter contribuído para aumentar a
massa seca dos microtubérculos, em relação a testemunha, na ausência deste regulador de
crescimento como mencionado acima, a possibilidade de se produzir, na presença do mesmo,
percentagem maior de microtubérculos com maiores massas secas é vantajosa, pois implicaria
na diminuição nos custos de produção.
A constatação de que as plantas dos diferentes somaclones de
D. composita também
apresentaram menor percentagem de sobrevivência no meio de cultura com a adição GA
3
,
especialmente quando na sua maior concentração, poderia estar relacionada com toxicidade.
A maior razão entre a massa seca dos microtubérculos e da parte aérea das plantas em meio de
cultura contendo GA
3
, especialmente nas maiores concentrações, em comparação com as
plantas inoculadas na ausência do regulador, exceto para o somaclone S2, é devido também
ao não incremento do crescimento da parte aérea das plantas, observado na presença desse
regulador de crescimento.
Os resultados de redução do crescimento da parte aérea das plantas cultivadas na
presença do GA
3
no meio de cultura deve-se principalmente por uma das suas características:
alongamento do caule de plantas anãs (Taiz & Zeiger, 2004), característica de crescimento
anormal não observada nas plantas dos diferentes somaclones. Além disso, as giberelinas
regulam seu próprio metabolismo (Olszewski
et al., 2002; Taiz & Zeiger, 2004), cuja
transcrição de genes codificadores de enzimas responsáveis pela sua biossíntese ou
degradação pode ser inibida. Sendo assim, giberelinas exógenas provocam a diminuição da
expressão dos genes da biossíntese e o aumento da transcrição de genes de degradação (Taiz
114
& Zeiger, 2004). O fato de os resultados demonstrarem não haver necessidade de se manter as
plantas por mais de 30 dias em meio de cultura com GA
3,
para que o ótimo crescimento da
parte aérea seja atingido, com relação aos números de folhas, de nós, de gemas e de ramos, é
interessante, pois aponta para mais um detalhe que deve ser levado em consideração na
otimização dos protocolos de produção de plantas. Isto porque, um tempo de permanência
maior em contato com esse regulador de crescimento pode passar a inibir o crescimento das
mesmas, incluindo o do sistema radicular e interferir na capacidade de aclimatização, o que
pode influenciar a viabilidade econômica da cultura de tecidos vegetais, caso o objetivo seja
comercial.
Diferenças nas respostas de crescimento da parte aérea das plantas, sob diferentes
concentrações de GA
3,
foram observadas por Schoene & Yeager (2005) estudando Viburnum
odoratissimum. Os autores verificaram relação direta entre o aumento do número de nós e o
aumento da concentração do regulador de crescimento. A mesma relação foi observada para a
variável de comprimento do ramo, principalmente quando os autores utilizaram concentração
de GA
3
de 2,8 µM. A resposta encontrada para a referida espécie foi inferior a todas as
respostas observadas para
Dioscorea composita.
Tais respostas encontradas para os experimentos de utilização isolada de giberelina
aliada ao fato de que, segundo Caldas
et al. (1998), poucas culturas in vitro mostram respostas
a essa classe de reguladores de crescimento, estimulou a realização dos experimentos para
testar o efeito da aplicação do GA
3
em combinação com o ANA. A explicação para o
incremento da massa seca das raízes, e não da parte aérea das plantas inoculadas na presença
de ANA, se deve à característica das auxinas em promover o crescimento do sistema radicular
(Davies, 1995; Arteca, 1996; Taiz & Zeiger, 2004). A ineficiência da interação ANA e GA
3
em promover aumento das variáveis avaliadas para a parte aérea e radicular em
D. composita
não foi observada nos experimentos de Schoene & Yeager (2005) com
Viburnum
115
odoratissimum. Neste caso, a presença de auxina incrementou a parte aérea, além do sistema
radicular. Entretanto, do mesmo modo que com
D. composita, a presença de ANA no meio de
cultura não evidenciou diferenças quanto ao número de nós e comprimento do ramo em
D.
zingiberensis (Chen et al., 2003). A partir desses resultados pode-se inferir que a presença de
reguladores de crescimento de forma isolada bem como de forma conjunta não interfere no
crescimento das plantas de
Dioscorea, nem tão pouco nas plantas dos diferentes somaclones
de
D. composita.
A única resposta de incremento dos microtubérculos das plantas dos diferentes
somaclones na presença de ANA foi relacionada ao teor de água. Esta resposta está
diretamente relacionada a menor massa seca dos mesmos, em relação à massa fresca. Esse
regulador não se mostrou favorável para aumentar a massa seca dos microtubérculos, porém o
fato de aumentar a percentagem de microtubérculos com massas secas entre 151 mg e 300 mg
para os somaclones S2, S4 e S5, maiores que 301 mg para o somaclone S1 e inibir a formação
de microtubérculos com massas secas menores que 100 mg, indica que ainda ANA poderia
ser utilizado para otimizar a produção de microtubérculos. A constatação de que ótima
concentração de ANA, para se obter tais tipos de respostas variou, para cada somaclone,
sendo de 5,0 µM para S1 e S2, de 2,5 µM para S4 e S5 e ausência de ANA para S3, deve ser
avaliada com precaução, uma vez que para os somaclones S1 e S2 a percentagem de
senescência das plantas foi de 33%. Talvez a resposta do ANA de não ocasionar o aumento
em massa seca dos microtubérculos possa ser devido ao fato de ter estimulado o crescimento
do sistema radicular, pelo menos nos casos dos somaclones S1, S4 e S5. Assim as raízes
funcionariam como órgão dreno, devido ao aumento em massa seca, impedindo que houvesse
um aumento na massa seca dos microtubérculos.
A complementação do meio de cultura com glutamina foi mais uma alternativa para
induzir a formação de microtubérculos e incrementar a parte aérea e o sistema radicular das
116
plantas dos diferentes somaclones de D. composita. Contudo, esta complementação, utilizada
com muito sucesso na cultura de tecidos vegetais, estimulando o crescimento (Caldas
et al.,
1998) não resultou em diferenças no crescimento das plantas dos diferentes somaclones,
quando comparadas com as plantas inoculadas em meio de cultura sem glutamina.
Essa resposta pode estar relacionada com a degradação da glutamina e
conseqüentemente a produção de um composto inibitório do alongamento do sistema
radicular e do crescimento da parte aérea, denominado 5-oxoprolina. De acordo com Pedrotti
et al. (1994) citando Archibald (1945), a glutamina é instável a pH elevado e a altas
temperaturas, tal como a temperatura da autoclave, ocorrendo assim a sua degradação e a
produção de 5-oxoprolina. A degradação deste aminoácido foi verificada por Pedrotti
et al.,
(1994) em estudo sobre o efeito da autoclavagem de aminoácidos no enraizamento
in vitro de
Prunus avium L. Os mesmos autores verificaram que a massa seca do sistema radicular e da
parte aérea foi fortemente reduzida quando as plantas foram inoculadas em meio cuja adição
de glutamina foi realizada antes do processo de autoclavagem, comparando-se com os
tratamentos onde as plantas foram inoculadas em meio sem a presença desse aminoácido.
A presença do composto inibidor pode ser a causa da diminuição da massa seca do
sistema radicular das plantas do somaclone S4 inoculadas na presença de 2,73 mM de
glutamina bem como da inibição do crescimento dos microtubérculos, fazendo com que
grande percentagem deles permanecessem com massa seca inferior a 100 mg. Entretanto,
resultados opostos aos observados no presente trabalho, relacionados ao efeito da fonte de
nitrogênio sobre o crescimento, foram obtidos por Tsai & Saunders (1999) estudando
beterrabas. Os autores verificaram que o crescimento das plantas de beterraba foi superior na
presença de glutamina do que na ausência desta fonte de nitrogênio. Além disso, outras fontes
foram testadas, tais como prolina e glutamato, porém diante destas fontes, a resposta das
plantas de beterraba não foi positiva. Segundo Pedralli
et al. (1994), os mecanismos
117
bioquímicos envolvidos nos efeitos inibitórios do produto da degradação da glutamina são
ainda desconhecidos.
4.5. CONCLUSÕES
1. As plantas dos diferentes somaclones crescem e desenvolvem suas partes aéreas e
sistemas radiculares bem como produzem microtubérculos na ausência de GA
3
, mas nessa
condição não são produzidos microtubérculos maiores que 201 mg, exceto para os
somaclones S2 e S5.
2. Para os somaclones S1, S2, S3 e S4 a presença de GA
3
ao meio de cultura é
necessária para promover a formação de microtubérculos alongados, propiciar a redução da
percentagem de formação de microtubérculos menores que 100 mg e o aumento da
percentagem de microtubérculos maiores que 201 mg de massa seca. Para o somaclone S5
isto é conseguido na ausência de GA
3
.
3. O tempo ótimo de permanência das plantas em meio de cultura contendo GA
3
para a
obtenção de microtubérculos com maior massa seca, maior proporção de microtubérculos
com massa seca superior a 201 mg e menor proporção de microtubérculos menores é de 15 e
30 dias para os somaclones S1 e 15 dias para o somaclone S4.
118
4. Diferentes períodos de permanência das plantas dos somaclones em meio contendo
GA
3
não influenciam no desenvolvimento da parte aérea dos mesmos, observado pelo menor
comprimento do maior ramo.
5. Na presença de 5 µM de GA
3
e ANA, a massa seca dos microtubérculos não é
promovida, mas o teor de água dos mesmos aumenta, para todos os somaclones exceto o S2,
assim como aumenta a proporção de microtubérculos com massa seca maior e diminui a
proporção de microtubérculos menores que 100 mg, exceto para o somaclone S3.
6. A complementação do meio de cultura com ANA, na presença de GA
3,
provoca o
aumento da massa seca do sistema radicular, exceto para os somaclones S2 e S3, mas não
provoca o aumento do desenvolvimento da parte aérea das plantas dos diferentes somaclones.
7. A suplementação do meio de cultura com glutamina não provoca o aumento no
crescimento e desenvolvimento da parte aérea, do sistema radicular das plantas e nem dos
microtubérculos.
119
CAPÍTULO 5
ANÁLISE BIOQUÍMICA E QUANTIFICAÇÃO DE DIOSGENINA DOS
SOMACLONES DE D. composita
5.1. INTRODUÇÃO
Os tubérculos das plantas de Dioscorea têm como principais funções o acúmulo de
substâncias de reservas e a propagação, funcionando também como órgãos de resistência a
períodos adversos (Ammirato, 1984). Dentre os diversos carboidratos, o amido é o principal
composto dos órgãos de reserva (Raven, 2001), correspondendo a 70% da massa seca dos
tubérculos de
Dioscorea (Onwueme, 1978). A síntese do amido inicia-se com a degradação da
sacarose, proveniente da fotossíntese ou do meio de cultura, em glucose e frutose, as quais,
através de reações mediadas por enzimas, formam os grãos de amido nos amiloplastos. Este
amido é armazenado nos tubérculos por longos períodos, apresentando baixa ciclagem,
podendo ser rapidamente mobilizado e metabolizado em período de brotação (Avigad & Dey,
1997).
A sacarose, principal produto da fixação do carbono pela fotossíntese, é também o
principal carboidrato solúvel dos tubérculos de
Dioscorea, cuja percentagem pode se
apresentar superior a 60% (Ketibu & Oyenuga, 1973), sendo também o principal carboidrato
solúvel de 5 espécies nativas do gênero (Chu & Figueiredo-Ribeiro, 1991).
120
As plantas produzem uma diversidade de compostos que, ao contrário dos
carboidratos, não participam diretamente do crescimento e desenvolvimento do vegetal. Tais
compostos são conhecidos como metabólitos secundários e possuem diferentes funções para o
vegetal, além do interesse econômico por esses compostos, especialmente pela sua grande
utilidade como fibras, polímeros, tinturas, condimentos e drogas para a indústria farmacêutica
(Croteau
et al., 2000). Há muito se sabe que os metabólitos secundários da classe das
sapogeninas são compostos possivelmente produzidos pela parte aérea das plantas, utilizados
para defesa contra patógenos (Hammond-Kosack & Jones, 2000) e herbívoros (Francis
et al.,
2002). Experimentos demonstrando as propriedades fisiológicas, imunológicas e
farmacológicas das sapogeninas têm provocado considerado interesse nessas substâncias
(Francis
et al., 2002). Diosgenina é um metabólito secundário da classe das sapogeninas
esteroidais cuja utilização pela indústria farmacêutica deve-se, especialmente, à sua utilidade
como fonte alternativa de matéria-prima para a síntese de hormônios esteroidais e
corticosteróides (Oashi, 1999).
A diosgenina presente nos extratos vegetais pode ser isolada através da cromatografia.
A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura,
realizado através da distribuição destes componentes entre duas fases, que estão em contato
íntimo. A cromatografia em camada delgada (TLC) consiste na separação dos componentes
de uma dada mistura, sobre uma camada delgada de adsorvente retido sobre uma superfície
plana, através da migração diferencial (Collins & Braga, 1988). Esta técnica foi bastante
utilizada para determinação de sapogeninas esteroidais (Hara, 1963; Blunden & Hardman,
1964; Elmunajjed
et al., 1965; Brain & Hardman, 1968; Sánchez et al., 1972; Aminuddin &
Chowdhury, 1983). De acordo com Sánchez
et al. (1972), a cromatografia em camada
delgada pode ser recomendada para análise rotineira de determinação de diosgenina em
Dioscorea devido a sua precisão e especialmente à economia e facilidade de operação.
121
Sendo assim, os objetivos desse trabalho foram a quantificação de açúcares solúveis,
de amido e de diosgenina nas plantas dos diferentes somaclones aclimatizados, visando
selecionar o melhor somaclone, e nas plantas do somaclone S5 inoculadas em meio de cultura
suplementado com ácido giberélico, ácido naftalenoacético e ácido indolbutírico, além da
padronização das metodologias de dosagens de açúcares solúveis totais, amido e diosgenina.
5.2. MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1. Condições de cultivo
Foram utilizados parte aérea e tubérculos de plantas dos diferentes somaclones de
Dioscorea composita Hemsl mantidas, durante 4 meses, em vasos de 2,5 L, contendo
substrato composto de areia e terra, na proporção de 1:1. cobertas com sombrite 50%, sendo
regadas, com água potável, uma vez por semana, em casa de vegetação. Microtubérculos e
parte aérea das plantas do somaclone S5 inoculadas, durante 5 meses, em meio de cultura MS
(Sigma, Co.) (Murashige & Skoog, 1962), suplementado com sacarose 2% (p/v), Phytagel
®
(Sigma, Co.) a 0,2% (p/v) e 5 µM dos reguladores de crescimento ANA, AIB e GA
3
, sendo
mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada (25ºC ± 2ºC), sob fotoperíodo
de 16 horas fornecido por lâmpadas fluorescentes Phillips TDL, com fluxo de fótons de 22,3
µmol.m
-2
.s
-1
e umidade relativa de 70% também foram avaliados.
122
5.2.2. Análise bioquímica de carboidratos solúveis e amido
Tubérculos e microtubérculos foram pesados, colocados em embalagens de papel e
mantidos em estufa por pelo menos 48 horas a 85ºC até obter-se peso seco constante e
pesados novamente, sendo triturados em micromoinho de malha de 0,17 mm. Foram
utilizados de 1,0 a 6,0 g de material vegetal em pó para a extração, na proporção de 3 mL de
solvente (etanol 80%) para cada 1 g de amostra seca, que foram extraídos durante 15 minutos
e centrifugados em 2000
g por 10 minutos, com três repetições. Em seguida, as frações
sobrenadantes foram reunidas, mensuradas, uma parte reservada para análise de saponinas e
outra parte para ser analisada quanto aos carboidratos solúveis. A dosagem bioquímica dos
açúcares solúveis foi realizada pelo método fenol-sulfúrico (Dubois
et al., 1956, modificado).
A leitura de absorbância em espectrofotômetro foi feita a 490 nm, tendo como carboidrato
padrão D-glucose e a curva padrão y = 99,03x + 2,7177 (R
2
= 0,9703).
O precipitado da extração foi seco em aparelho HetoVac VR-I, até peso seco
constante, para a extração de amido. Do material seco (0,5 g), o amido foi extraído com o uso
do ácido perclórico 52%, a 4ºC, por 30 minutos com eventuais agitações (McCready
et al.,
1950). Após este período, o material foi transferido para tubos de centrífuga fechados e
centrifugado a 2300
g por 15 minutos, com mais uma repetição da extração com ácido
perclórico. Os sobrenadantes foram reunidos, mensurados os volumes finais e estimado-se os
teores de amido através da dosagem por carboidrato total (Dubois
et al., 1956), multiplicado
pelo fator de correção 0,9.
123
5.2.3. Quantificação de diosgenina
Foram utilizadas amostras dos tubérculos das plantas aclimatizadas com exceção do
somaclone S1 que teve também a parte aérea analisada. Para as plantas cultivadas
in vitro,
microtubérculos e parte aérea tiveram seu conteúdo de diosgenina analisado. Amostra de 1
mL do sobrenadante da extração etanólica da análise bioquímica foi utilizada para a
quantificação de diosgenina, sendo colocada no HetoVac VR-I para retirada do solvente. A
hidrólise das amostras foi realizada em frascos de vidro com 200 µL de HCl 4N, em autoclave
a 1,1 Kgf.cm
-2
, com temperatura de 121ºC, durante 1 hora. Em seguida, foram realizadas as
cinco extrações com 2 mL de clorofórmio. As fases orgânicas foram reunidas, o solvente foi
removido por evaporação e o extrato foi novamente dissolvido em 200 µL de solução
clorofórmio:metanol:etanol 96% (5:4:1).
A análise de cromatografia em camada delgada foi realizada em placas de sílica-gel
GF 200
μm de espessura (20 cm x 20 cm, partículas de 2-25 μm), utilizando o sistema de
solvente hexano-etanol absoluto (10:1). O percurso das amostras foi de aproximadamente 15
cm na placa de cromatografia, sendo utilizado reagente de Liebermann-Buchard (Wagner &
Bladt, 2001) para a revelação, seguida de aquecimento (110-120ºC) durante 5 a 10 minutos. A
estimativa bioquímica foi realizada em fotografia digital, com auxílio do equipamento
fotográfico Camag Reprostar 3 e câmara digital Epson PhotoPC 3000Z, sob iluminação UV a
366 nm, tendo diosgenina e colesterol como padrão (Barroso
et al., 1974; Rishi et al., 1976
modificados) e a curva padrão de diosgenina y = (0,0072)*x
2,3759
(R
2
= 0,8781). As
fotografias digitais foram modificadas através do programa Photo Studio 2.0 SE, sendo
passadas para efeito negativo, convertidas em escala de cinza com ajuste do contraste para 48
e posteriormente foram analisadas no programa computacional Image Tool 3.0 (University of
Texas, Health Science Center, San Antonio – Texas) para a densitometria das manchas
124
obtidas na revelação e estimativa de teores de substâncias através da triangulação dos
resultados obtidos, estimativa da respectiva área e correlação direta com a concentração
aplicada de diosgenina.
5.3. RESULTADOS
5.3.1. Análises bioquímicas de carboidratos solúveis e amido
Os resultados sobre a quantificação de açúcares solúveis e amido, nos tubérculos das
plantas aclimatizadas dos diferentes somaclone, são mostrados na Tabela 1.
Como se pode observar, a concentração de açúcares solúveis e de amido difere entre as
plantas dos somaclones. O somaclone S3 apresentou maior teor dos compostos de reserva
(acima de 18 mg.g
-1
de MS para açúcares solúveis e acima de 16 mg.g
-1
de MS para amido).
Resposta contrária foi observada nos tubérculos dos somaclones S1 (3,65 mg.g
-1
de MS para
açúcares solúveis e 3,28 mg.g
-1
de MS para amido) e S4 (3,77 mg.g
-1
de MS para açúcares
solúveis e 3,39 mg.g
-1
de MS para amido), que apresentaram os menores teores desses
compostos.
125
Tabela 1. Teores de alguns compostos de reserva presentes nos tubérculos das plantas dos diferentes
somaclones de Dioscorea composita produzidos em meio de cultura Murashige & Skoog, na ausência
de reguladores de crescimento e aclimatizados em casa de vegetação durante 4 meses. Universidade
Federal de Santa Catarina, 2006.
Açúcares Solúveis (mg.g
-1
) Amido (mg.g
-1
)
Somaclones
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
S1 1,35 ± 0,1 c 3,65 ± 0,2 c 1,22 ± 0,1 c 3,28 ± 0,2 c
S2 4,13 ± 0,5 b 12,7 ± 1,5 b 3,72 ± 0,4 b 11,43 ± 1,3 b
S3 5,76 ± 0,2 a 18,24 ± 0,7 a 5,18 ± 0,2 a 16,42 ± 0,6 a
S4 1,43 ± 0,2 c 3,77 ± 0,6 c 1,28 ± 0,2 c 3,39 ± 0,5 c
a
Médias ± desvio padrão de três repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si, de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0,05). MF= massa fresca; MS= massa seca.
A presença das classes de reguladores de crescimento no meio de cultura influenciou
os teores de açúcares solúveis e amido nos microtubérculos do somaclone S5 (Tabela 2) na
estimativa em massa seca. As auxinas proporcionaram maior concentração dos compostos de
reserva nos microtubérculos das plantas, ao contrário de GA
3
.
Tabela 2. Efeito da presença de 5 μM de ANA, AIB e GA
3
sobre os teores de alguns compostos de
reserva dos microtubérculos do somaclone S5 de Dioscorea composita produzidos a partir do cultivo
de plantas em meio de cultura Murashige & Skoog, semi-sólido, suplementado com 8% de sacarose,
após 5 meses. Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Açúcares Solúveis (mg.g
-1
) Amido (mg.g
-1
)
Reguladores
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
ANA 7,85 ± 0,9 a 43,89 ± 5,2 a 7,06 ± 0,8 a 39,50 ± 4,7 a
AIB 9,55 ± 0,4 a 46,39 ± 1,8 a 8,59 ± 0,3 a 41,75 ± 1,6 a
GA
3
9,27 ± 0,7 a 32,56 ± 2,4 b 8,34 ± 0,6 a 29,30 ± 2,1 b
a
Médias ± desvio padrão de três repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem
significativamente entre si, de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0,05). MF= massa fresca; MS= massa seca.
5.3.2. Quantificação de diosgenina
A análise da cromatoplaca apresentou vários compostos, sendo nove manchas
distintas, diosgenina e colesterol nos tubérculos e na parte aérea das plantas aclimatizadas
bem como nos microtubérculos e na parte aérea das plantas do somaclone S5 cultivado
in
126
vitro (Tabela 3). O tempo de retenção das substâncias teve diosgenina, a principal sapogenina
descrita na literatura, e colesterol, o precursor deste composto secundário, como padrões.
Tabela 3. Distribuição, de acordo com o tempo de retenção em cromatoplaca (placa de sílica-gel GF,
200 μm de espessura, 20 cm x 20 cm, partículas de 2-25 μm)
no sistema de solventes hexano-etanol
absoluto (10:1), das amostras (30 µL do extrato bruto) de plantas de Dioscorea composita
aclimatizadas durante 4 meses em casa de vegetação e cultivadas in vitro durante 5 meses.
Universidade Federal de Santa Catarina, 2006.
Aclimatizadas In vitro – somaclone S5
Parte
Aérea
Tubérculos Parte Aérea Microtubérculos
Substâncias
Tempo
de
retenção
S1 S1 S2 S3 S4 ANA AIB GA
3
ANA AIB GA
3
A 2,64 traço 0,03 0,07 0,01 0,01 0,33 1,43
B 3,34 0,10 0,33
C 4,37 0,05 0,02 0,08 1,96
D 5,73 0,15 0,02 0,72 1,21 0,28 1,02 0,26 0,38 0,58 0,62 0,33
Diosgenina 6,83 0,22 0,02 0,02 0,12 0,07 0,96 0,25 0,27 0,25 0,33 0,51
Colesterol 7,77 0,29 0,02 0,07 0,25 0,05 0,97 0,39 0,80 0,30 0,27 0,27
E 9,54 0,03 0,01 0,06 0,03 0,28 0,02 0,02 0,01 0,02 0,09
F 12,37 0,60 5,74 4,49 1,65 2,83 0,68 0,11 2,85 2,82 1,68
G 13,60 0,13 0,21 4,56 4,10 0,50 1,90 0,44 0,47 1,89 1,76 1,48
H 18,11 0,30 traço traço 0,01 0,56 0,13 0,54 0,03 0,03 0,17
I 19,28 0,04 0,01 0,03 0,04 0,17 0,89 0,02 0,10 0,07 0,02 0,05
Total de fitoesteróis 1,16 0,89 11,17 10,34 2,77 9,41 2,24 2,82 6,72 9,26 4,58
Valores de área corrigidos pela fórmula da diosgenina e expressos em mg.g
-1
de massa seca.
Diosgenina e colesterol estiveram presentes em todas as plantas dos diferentes
somaclones. Foi observada quantidade máxima de diosgenina na parte aérea das plantas do
somaclone S5 inoculadas em meio contendo ANA (0,96 mg.g
-1
MS). Os tubérculos dos
somaclones S1 e S2 tiveram o menor teor de diosgenina (0,02 mg.g
-1
MS, cada). Da mesma
maneira, colesterol foi observado em maior teor na parte aérea das plantas de S5 (0,97 mg.g
-1
MS), em meio suplementado com ANA, e em menor teor nos tubérculos do somaclone S1
(0,02 mg.g
-1
MS). Além dessas substâncias, todas as plantas dos diferentes somaclones
aclimatizados ou cultivados
in vitro, apresentaram outras três substâncias (D, G e I). A
substância G, cujo teor máximo (4,56 mg.g
-1
MS) foi observado nos tubérculos das plantas do
somaclone S2, esteve presente em quantidade superior (cerca de 220 vezes mais) a quantidade
de diosgenina.
127
De uma maneira geral, a maioria das substâncias detectadas através das placas de TLC
pôde ser observada em todos os tubérculos dos somaclones aclimatizados, com exceção do
somaclone S2 que não apresentou 4 substâncias (B, C, E e H) das 11 detectadas. Para a parte
aérea do somaclone S1, não foram observadas substâncias com menor tempo de retenção
(substâncias A, B e C).
As plantas do somaclone S5, cultivadas
in vitro, apresentaram padrões diferenciados
de resposta para as substâncias de menor tempo de retenção, dependendo do regulador de
crescimento acrescentado no meio de cultura. Substâncias com tempo de retenção próximo ou
superior ao da diosgenina, foram detectadas tanto na parte aérea quanto nos microtubérculos
das plantas na presença de todos os reguladores de crescimento.
A estimativa dos teores de diosgenina obtida na revelação das manchas nas placas de
TLC e o rendimento, em percentagem de diosgenina, das plantas dos diferentes somaclones
aclimatizados e do efeito dos diferentes reguladores de crescimento são mostrados na Tabela
4. A curva padrão, utilizada no cálculo, é mostrada na Figura 1.
Tabela 4. Quantificação de diosgenina presente nas plantas de Dioscorea composita aclimatizadas
durante 4 meses em casa de vegetação e cultivadas in vitro durante 5 meses. Universidade Federal de
Santa Catarina, 2006.
Diosgenina (mg.g
-1
) Diosgenina (%)
Tubérculo Parte Aérea Tubérculo Parte Aérea
Aclimatizadas
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
S1 0,008 c 0,021 c 0,056 0,22 0,001 0,002 0,006 0,022
S2 0,005 c 0,015 c - - 0 0,002 - -
S3 0,037 a 0,117 a - - 0,004 0,012 - -
S4 0,026 b 0,069 b - - 0,003 0,007 - -
Microtubérculos Parte Aérea Microtubérculos Parte Aérea
In vitro
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
MF
a
MS
a
ANA 0,045 b 0,251 b 0,123 a 0,963 a 0,004 0,025 0,012 0,096
AIB 0,068 b 0,338 ab 0,037 b 0,249 b 0,007 0,033 0,004 0,025
GA
3
0,146 a 0,512 a 0,051 b 0,272 b 0,015 0,051 0,005 0,027
a
Médias de quatro repetições seguidas pela mesma letra, na mesma coluna, não diferem significativamente entre
si de acordo com o teste de Tukey (p ≤ 0,05). MF= massa fresca; MS= massa seca.
128
Apenas para o somaclone S1 foi observado o teor de diosgenina também na parte
aérea e o resultado mostra um rendimento, em percentagem de diosgenina, de
aproximadamente 11 vezes mais diosgenina na parte aérea com relação ao rendimento
encontrado nos tubérculos. O somaclone S3 apresentou maior teor de diosgenina nos
tubérculos aclimatizados (0,117 mg.g
-1
MS). Este teor foi cerca de 5,5 vezes maior que os
observados nos tubérculos dos somaclones S1 e S2, os quais apresentaram os menores teores
de diosgenina (0,021 mg.g
-1
MS e 0,015 mg.g
-1
MS, respectivamente).
Não houve uma relação direta entre os reguladores de crescimento e suas classes com
seus efeitos sobre o teor de diosgenina das plantas do somaclone S5. As auxinas apresentaram
efeito diferente sobre a parte aérea. Apenas na presença de ANA o teor de diosgenina foi
maior na parte aérea do que nos microtubérculos. Na presença de GA
3
ocorreu o inverso. O
maior teor de diosgenina, nos microtubérculos, foi observado nas plantas inoculadas na
presença de GA
3
(0,146 mg.g
-1
MS). Na presença de ANA e AIB, os microtubérculos de S5
apresentaram teor cerca de 2 vezes menos diosgenina. Para a parte aérea, o maior teor de
diosgenina foi proporcionado com ANA no meio de cultura (acima de 0,1 mg.g
-1
MS).
y = 0,0072x
2,3759
R
2
= 0,8781
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30
área
diosgenina (ug)
Figura 1. Curva padrão exponencial obtida em placa de TLC relacionando a área de cada mancha
com a concentração de diosgenina padrão.
129
5.4. DISCUSSÃO
As respostas diferenciadas entre os somaclones com relação aos teores dos compostos
de reserva presentes nos tubérculos das plantas aclimatizadas e nos microtubérculos do
somaclone S5, ao rendimento de diosgenina, tendo S3 apresentado o maior rendimento e à
detecção das substâncias através de TLC, podem ser conseqüências da variação somaclonal já
observada nos experimentos que precedem o atual.
Além disso, as diferenças nos compostos de reserva podem estar relacionadas com o
metabolismo de amido. A síntese e acúmulo de amido são provenientes da degradação da
sacarose via sacarose sintase, resultando na formação de frutose e glucose, as quais são
convertidas em hexoses fosfato, importadas para os plastídeos, acumulando-se na forma de
grãos de amido (Fernie
et al., 2001) tanto nas folhas quanto nos tubérculos (amiloplasto). De
acordo com Cruz
et al. (2003), o maior acúmulo de compostos de reserva nos tubérculos pode
significar que a assimilação de carbono está excedendo o uso deste, o que deve estar
acontecendo nos tubérculos das plantas do somaclone S3. Em contrapartida, pode-se inferir
que os somaclones S1 e S4 não apresentam mobilização de sacarose da parte aérea para o
tubérculo, possivelmente utilizando o carbono para o seu crescimento, uma vez que há um
menor acúmulo de compostos de reservas nos tubérculos.
O menor desenvolvimento da parte aérea das plantas do somaclone S3, em casa de
vegetação, também pode estar interferindo nas respostas observadas na Tabela 1. O ambiente
da casa de vegetação pode ter sido fator de estresse para as plantas do somaclone S3. Em
situações de estresse, as plantas tentam evitar danos alterando o seu metabolismo (Yordanov
et al., 2000), e, diante das respostas das plantas deste somaclone à aclimatização em casa de
vegetação, estas podem estar alocando energia para sintetizar e acumular compostos de
130
reserva nos tubérculos, órgão resistente em condições desfavoráveis, no lugar de utilizar o
carbono para o desenvolvimento da parte aérea. Chu (1989), estudando
D. delicata, também
observou relação entre o menor desenvolvimento da parte aérea e o maior teor de amido.
O resultado da quantificação de amido no somaclone S3 (5,18 mg.g
-1
MF) foi similar
ao encontrado por Selvaraj
et al. (1982), em tubérculos de D. composita de 1 ano de idade,
cujo teor foi de 4,2 mg.g
-1
MF. Além dessa espécie, os autores também quantificaram amido
de tubérculos de 1 ano de idade de outras 2 espécies produtoras de sapogeninas,
D. deltoidea
(7,8 mg.g
-1
MF) e D. floribunda (6,5 mg.g
-1
MF), cujos resultados observados também foram
semelhantes ao encontrado nos tubérculos do somaclone S3.
Estudos das análises bioquímicas dos compostos de reserva de tubérculos de outras
espécies demonstraram grande variação nos teores desses compostos. Martin (1974),
estudando
D. bulbifera observou teor de amido acima de 16% da massa fresca do tubérculo e
teor de açúcares solúveis acima de 0,4%.
D. alata e suas variedades também foram estudadas
por Martin (1976) e Bradbury & Holloway (1988), onde os teores de amido variaram de
15,6% a 23,87% da massa fresca dos tubérculos e os teores de açúcares solúveis de 0,5% a
1,39%.
D. trifida (Martin & Degras, 1978; Bradbury & Holloway, 1988) alternou os teores de
amido entre 14,2% e 38% da massa fresca dos tubérculos. Degras (1986) quantificou amido
de
D. rotundata, verificando a presença do composto de reserva em tubérculos com diferentes
idades, tendo maior rendimento tubérculos de 6 meses de idade (84% da massa seca).
D.
delicata
, D. olfersiana, D. laxiflora, D. subhastata e D. sanpaulensis (Chu, 1989)
demonstraram variação nos teores dos compostos de reserva. O maior teor de açúcares
solúveis (acima de 27% da massa seca do tubérculo) e de amido (49,5%) foi observado em
D.
laxiflora. Entretanto, em D. delicata foi quantificado o menor teor de açúcares solúveis
(11,24% da massa seca do tubérculo) e em
D. olfersiana o menor teor de amido (3,52%).
131
Os resultados obtidos para D. composita foram inferiores quando comparados com as
espécies supracitadas. Esse resultado pode estar relacionado com o ciclo de vida das plantas
do gênero
Dioscorea e também com as condições de aclimatização. Plantas do gênero
Dioscorea possuem um ciclo de crescimento anual, onde as espécies utilizadas
comercialmente são caracterizadas pela formação de um novo tubérculo a cada ciclo de
desenvolvimento enquanto que as espécies produtoras de sapogeninas apresentam
crescimento contínuo de seus tubérculos (Chu & Figueiredo-Ribeiro, 1991), tornando-se cada
vez mais lignificados e ricos em metabólitos secundários, enquanto que a parte aérea é
renovada anualmente. O curto tempo que os somaclones permaneceram em casa de vegetação
pode ter sido o fator do baixo desenvolvimento dos tubérculos e, conseqüentemente, a baixa
acumulação de compostos de reserva. Além disso, a baixa intensidade luminosa da sala de
crescimento e da casa de vegetação podem ter acarretado nos resultados obtidos, já que as
espécies comerciais são cultivadas a pleno sol com o auxílio de tutores.
Kouassi
et al., (1990) analisaram os açúcares solúveis presentes em tubérculos de D.
esculenta após período de estocagem e verificaram aumento no conteúdo de sacarose de 56%
em tubérculos estocados durante 1 mês. Os autores relacionam este aumento com estudos
enzimáticos que mostram a atividade de amilases ocorrendo em tubérculos estocados de
Dioscorea.
Para as plantas do somaclone S5 cultivadas
in vitro, os teores dos compostos de
reserva dos microtubérculos indicam a ocorrência de variações desses compostos de acordo
com o regulador de crescimento utilizado no meio de cultura. Os teores de açúcares solúveis e
amido, nos microtubérculos, podem estar embasados em algumas características dos
reguladores de crescimento sobre o desenvolvimento vegetal e também relacionados com as
respostas do crescimento e desenvolvimento
in vitro das plantas desse somaclone.
132
As características das auxinas em promover a formação de raízes laterais e adventícias
(Taiz & Zeiger, 2004) juntamente com a maior massa seca das raízes observada nas plantas de
S5 quando na presença de ANA e AIB, podem ter favorecido as plantas na melhor absorção
dos constituintes do meio de cultura, inclusive da sacarose, fonte de carbono disponível no
meio e, conseqüentemente, na utilização deste açúcar para a formação e acúmulo dos
compostos de reserva nos microtubérculos.
Em contrapartida, a presença de GA
3,
no meio de cultura, não incrementou
eficientemente a formação de raízes nas plantas do somaclone S5, o que pode ter acarretado
deficiência na absorção de sacarose do meio de cultura para utilização na síntese de amido nos
microtubérculos. Além disso, as plantas de S5 podem estar utilizando os produtos da
fotossíntese para seu desenvolvimento ao invés de acumulá-los nos tubérculos.
Uma das características fisiológicas das giberelinas também pode ter influenciado a
resposta de menor teor de compostos de reservas nos microtubérculos. As giberelinas,
especialmente GA
3
, promovem a produção e também a secreção de inúmeras enzimas
hidrolíticas envolvidas na solubilização de compostos de reserva e atuam induzindo a
expressão do gene da α- e β-amilase, enzimas hidrolíticas que têm função de degradação do
amido em algumas sementes (Taiz & Zeiger, 2004). Entretanto, Selvaraj
et al. (1982)
observaram que a atividade da enzima β-amilase foi maior nos tubérculos armazenados para
posterior comercialização das espécies de
Dioscorea produtoras de sapogeninas, inclusive em
D. composita, as quais acumularam menor teor de amido. Esta atividade enzimática também
pode estar ocorrendo nos tubérculos do somaclone S5 inoculado na presença de GA
3
.
A cromatografia em camada delgada é um método de separação, identificação e
quantificação de compostos químicos. A utilização da placa de sílica-gel GF deve-se
principalmente porque a sílica é empregada na separação de compostos lipofílicos, tais como
a diosgenina e os demais esteróides presentes nas plantas de
D. composita. O tempo de
133
retenção, ou seja, o tempo que os componentes das amostras ficam adsorvidos no sistema
cromatográfico com um fluxo contínuo de um determinado sistema de solventes é uma
medida de distância, usada para fins qualitativos, que serve para fracionar e identificar as
substâncias contidas nas amostras.
Para o presente trabalho, as únicas substâncias identificadas, através da densitometria
das manchas obtidas na revelação das placas de TLC, foram colesterol e diosgenina, as quais
foram aplicadas como padrões. Entretanto, apenas diosgenina foi quantificada nos tubérculos
e na parte aérea das plantas aclimatizadas e das cultivadas
in vitro, pois é descrita como a
principal sapogenina esteroidal acumulada no tubérculo desta espécie. As diferenças
individuais, encontradas no conteúdo de diosgenina dos tubérculos dos somaclones
aclimatizados, refletem uma certa variabilidade dentro das plantas clonadas. Edwards
et al.
(2002) também mencionam variação no conteúdo de diosgenina dentro de uma população de
D. villosa e, assim como Blunden et al. (1968), citam que esta variação é esperada para
metabólitos secundários caso as plantas sejam cultivadas em diferentes condições ambientais.
Além disso, outros fatores, tais como idade e estágio de desenvolvimento das plantas, também
influenciam na variação da quantidade de diosgenina e na aparição das sapogeninas
esteroidais (Preston,
et al., 1964; Blunden et al., 1968; Akahori, et al., 1969).
Estudos de Zullo
et al. (1987) sobre a extração e quantificação de diosgenina de D.
composita e D. floribunda também mostram que os teores de diosgenina são
significativamente dependentes do clone e da idade do cultivo. Esta variação, entre os clones
de uma mesma espécie, foi observada com as plantas aclimatizadas dos diferentes somaclones
de
D. composita, tendo o somaclone S3 o maior teor de diosgenina nos tubérculos quando
comparado com os demais somaclones. De acordo com Purseglove (1972), a exploração
comercial de diosgenina exige teores de, pelo menos, 3% da massa seca do tubérculo, o que
não foi observado nas plantas aclimatizadas. Zullo
et al. (1987) observaram teor médio de
134
diosgenina de 1% da massa seca dos tubérculos de D. composita aos 12 meses de plantio até
cerca de 3% aos 72 meses de plantio, destacando que os teores de diosgenina mostram-se
crescentes com a idade do cultivo, tendendo a um limite quando a cultura se torna perene e
apresentando um máximo ao redor dos 36 meses de cultivo. Estas observações podem
justificar o baixo rendimento de diosgenina nos tubérculos das plantas aclimatizadas, já que a
quantificação foi feita após 4 meses de plantio em condições de casa de vegetação, com baixa
luminosidade imposta também pelo sombrite 50%, em vasos com capacidade de 2,5 L,
contendo substrato composto de areia e terra, na proporção de 1:1.
Devido ao fato do tubérculo ser a parte da planta usada comercialmente, pouco tem
sido estudado sobre os compostos esteroidais da parte aérea de
Dioscorea. Blunden et al.
(1968) quantificaram constituintes esteroidais da parte aérea de várias espécies de
Dioscorea
de grande potencial econômico, entre elas
D. composita, pelo método de TLC, detectando
diosgenina nas folhas e nos caules de todas as espécies estudadas.
D. composita apresentou
rendimento de diosgenina de 0,28% da massa seca das folhas e 0,01% da massa seca dos
caules. No presente trabalho, folhas e pecíolos não foram separados do caule, e o rendimento
total de diosgenina observado na parte aérea foi de 0,022%, valor este cerca de 13 vezes
menor que o encontrado por Blunden
et al. (1968). Contudo, este valor é semelhante ao valor
encontrado por Datta & Datta (1984) em folhas de
D. composita, cujo rendimento foi de
0,030%. A variação no conteúdo de diosgenina na parte aérea de
Dioscorea também foi
estudada por Akahori
et al. (1969) em D. tokoro. Entretanto, embora a presença de diosgenina
tenha sido detectada, por TLC, a quantidade foi tão mínima, na parte aérea de
D. tokoro, que
uma estimação da concentração foi impossível de ser feita. O maior teor de diosgenina
encontrado na parte aérea (0,22 mg.g
-1
da massa seca) das plantas do somaclone S1, em
relação aos teores encontrados no tubérculo (0,021 mg.g
-1
da massa seca), pode ser explicado
135
pelo fato de que a diosgenina é sintetizada possivelmente na parte aérea e posteriormente
transportada para os tubérculos.
Assim como no teor dos compostos de reserva dos microtubérculos, os resultados
obtidos na quantificação de diosgenina nas plantas do somaclone S5, na presença de
diferentes reguladores de crescimento, pode ser devido às características específicas de cada
regulador e o efeito desses sobre o crescimento de
D. composita. As giberelinas possuem
característica de retardar a senescência foliar. Se as folhas ficam viáveis por um longo período
de tempo, isso implica numa maior produção de fotoassimilados, de produtos de reserva e de
sapogeninas, o que pode ter resultado no maior rendimento de diosgenina observado nos
microtubérculos das plantas de S5 quando na presença de GA
3
.
Em contra partida, o efeito de ANA sobre o crescimento da parte aérea das plantas de
S5, proporcionando maior massa seca, aliado ao local de síntese de diosgenina, sugere que o
maior rendimento de diosgenina, observado na parte aérea das plantas inoculadas em meio de
cultura contendo ANA, tenha sido acarretado pelo maior desenvolvimento da planta,
evidenciado pela maior massa seca. Entretanto, mesmo a massa seca da parte aérea das
plantas inoculadas com AIB não tendo diferido das inoculadas com ANA, o teor de
diosgenina nas plantas com AIB foi o menor observado. Conforme Blunden
et al. (1968), a
falta de compostos pode ser devido a ausência de sistemas enzimáticos ou ausência de
precursores necessários para a biossíntese do composto.
O efeito da presença de auxina no meio de cultura, para quantificação de diosgenina,
também foi observado por Chaturvedi & Chowdhury (1980) em calos de
D. deltoidea
originados de tubérculos, onde o maior rendimento (1,6%) foi observado quando utilizado
AIA e 2,4-D. Os autores citam a importância do sinergismo entre essas duas auxinas para a
síntese de diosgenina. Aminuddin & Chowdhury (1983) também verificaram o rendimento de
diosgenina em calos originados de tubérculos de
D. floribunda, na presença da auxina 2,4-D,
136
cujo rendimento alcançou 1,1% de diosgenina da massa seca dos calos. Narula et al. (2003)
observaram que a utilização de AIA, juntamente com cinetina, proporcionou maior teor de
diosgenina em plantas de
D. bulbifera (12,3 mg.g
-1
massa seca do tubérculo). Os autores
salientam que a espécie, pouco explorada como fonte de diosgenina, pode ser usada para obter
elevados níveis desse metabólito secundário.
Diante dos resultados obtidos para
D. composita e considerando-a produtora potencial
de diosgenina, maiores estudos relacionados às análises bioquímicas e quantificação de
diosgenina em plantas completas devem ser efetuados, visto que há carência de informação
quando se compara com os estudos realizados com cultura de células. Além disso,
experimentos em longo prazo devem ser realizados, já que dados de rendimento confiáveis
são obtidos somente após 3 a 5 anos de crescimento da planta.
5.5. CONCLUSÕES
1. As características individuais dos somaclones influenciam os teores dos compostos
de reserva, das plantas aclimatizadas em casa de vegetação, indicando uma possível existência
de variação somaclonal.
2. Diosgenina é sintetizada em todos os somaclones aclimatizados, sendo o somaclone
S3 o que apresenta maior teor deste metabólito secundário nos tubérculos, porém em
quantidade insuficiente para produção comercial, recomendando-se uma otimização de pelo
menos 10 vezes, aproximando-se de 1% da massa seca já obtido de outras espécies em
137
culturas de células em suspensão e o prolongamento, em maior período de tempo, do cultivo
em casa de vegetação.
3. Os microtubérculos das plantas do somaclone S5, cultivadas
in vitro em meio de
cultura suplementado com diferentes reguladores de crescimento, apresentam diferenças nos
teores dos compostos de reserva. As características inerentes às auxinas combinadas com os
resultados de crescimento
in vitro observados durante a permanência das plantas em meio de
cultivo suplementado com ANA e AIB acarretam a promoção de maior teor de amido e
açúcares solúveis nos microtubérculos.
4. Os teores de diosgenina na parte aérea e nos microtubérculos das plantas de S5,
cultivadas
in vitro, diferem em resposta ao regulador de crescimento utilizado. Para maior
acúmulo de diosgenina nos microtubérculos recomenda-se a presença de GA
3
, em contra
partida, o teor de diosgenina na parte aérea é maior na presença de ANA.
5. A metodologia de dosagem de diosgenina, nesse estudo preliminar, e a curva padrão
obtida com diosgenina, mostram-se eficientes e aplicáveis para a identificação e quantificação
desse composto na parte aérea, nos tubérculos e nos microtubérculos das plantas
aclimatizadas dos diferentes somaclones e do S5 cultivado
in vitro. Estudos posteriores, com
identificação dos demais compostos esteroidais presentes nas plantas aclimatizadas e
cultivadas
in vitro, são sugeridos para abranger todos os metabólitos secundários presentes
nas estruturas supracitadas.
138
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados apresentados no presente trabalho abrem novas perspectivas para a
viabilização da obtenção de plantas de
Dioscorea composita cultivadas in vitro e para a
identificação e quantificação de diosgenina.
As plantas dos diferentes somaclones de
D. composita apresentam grande capacidade
de morfogênese e crescimento
in vitro em meio de cultura sem a adição de reguladores de
crescimento, sendo aclimatizadas com sucesso. Entretanto, o uso de diferentes reguladores de
crescimento e as variadas combinações realizadas entre os mesmos, proporcionam uma maior
taxa de multiplicação, o que implica em uma considerável redução de tempo necessário para a
multiplicação das plantas e favorece a transferência das mesmas, em um período curto de
tempo, para a casa de vegetação. Outro ponto favorável da utilização de diferentes
reguladores de crescimento no meio de cultivo é a maior proporção de microtubérculos com
maior massa seca. Além desse fato viabilizar a cultura de tecidos, já que os microtubérculos
são considerados fontes de propagação, também favorece a quantificação de diosgenina, pois
esse metabólito secundário é sintetizado nas folhas e acumulado nos microtubérculos de
D.
composita
.
A análise bioquímica dos compostos de reserva dos microtubérculos das plantas
cultivadas
in vitro e dos tubérculos das plantas aclimatizadas mostra variação entre os
somaclones de
D. composita. Contudo, essa variação está diretamente relacionada com os
resultados obtidos no crescimento
in vitro dos somaclones. Já com relação à quantificação de
diosgenina, o teor desse metabólito, nos microtubérculos e tubérculos, é inferior ao referido
na literatura. Porém, as metodologias de identificação e dosagem de diosgenina apresentam-se
eficientes e aplicáveis.
139
Estudos posteriores, com identificação dos demais compostos esteroidais presentes nas
plantas dos diferentes somaclones de
D. composita são sugeridos, além disso, estudos a longo
prazo devem ser realizados. Isso favoreceria o melhor entendimento da síntese e acumulação
de diosgenina em microtubérculos de plantas cultivadas
in vitro e colocaria a cultura de
tecidos como uma ferramenta para a obtenção desse metabólito secundário.
140
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AKAHORI, A.; YASUDA, F.; TOGAMI, M.; KAGAWA, K. & OKANISHI, T. Variation in
isodiotigenin and diosgenin content in aerial parts of Dioscorea tokoro. Phytochemistry, 8:
2213-2217, 1969.
ALIZADEH, S., MANTELL, S. H. & VIANA, A. M. In vitro shoot culture and microtuber induction
in the steroid yam Dioscorea composita Hemsl. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 53: 107-
112, 1998.
AMINUDDIN & CHOWDHURY, A. R. Production of diosgenin in somatic callus tissues of
Dioscorea floribunda. Planta Medica, 48: 92-93, 1983.
AMMIRATO, P. V. Yams. In: AMMIRATO, P. V.; EVANS, D. A.; SHARP, N. R. & YAMADA, Y.
Handbook of plant cell culture: Crop species. Vol. 3. New York: MACMILLAN, 1984. p. 327-
354.
ARTECA, R. N. Plant growth substances: principles and applications. Chapman & Hall, 331 p.
1996.
AVIGAD, G. & DEY, P. M. Carbohydrate metabolism: storage carbohydrates. In: DEY, P. M. &
HARBONE, J. B. Plant Biochemistry. San Diego and London: Academic Press, 554 p., 1997.
AZCÓN-AGUILAR, C.; CANTOS, M.; TRONCOSO, A. & BAREA, J. M. Benefecial effect of
arbuscular mycorrhizas on acclimatization of micropropagated cassava plantlets. Scientia
Horticulturae, 72: 63-71, 1997.
BARROSO, G. M., J. B. SILVA, D. SUCRE, E. F. GUIMARÃES, L. F. CARVALHO, F. R.
ROSENTHAL, A. N. ROSEIRA, O. M. BARTH & A. F. BARBOSA. Flora Guanabara. Família
Dioscoreaceae. Sellowia, 25: 9-256, 1974.
BLUNDEN, G. & HARDMAN, R. Thin-layer chromatography of Dioscorea sapogenins. Journal
Chromatography, 15: 273-276, 1964.
BLUNDEN, G.; BRIGGS, C. J. & HARDMAN, R. Steroidal constituents of the aerial parts of
Dioscorea e Tamus species. Phytochemistry, 7: 453-458, 1968.
BORGES, M.; CEIRO, W.; MENESES, S.; AGUILERA, N.; VÁZQUEZ, J.; INFANTE, Z. &
FONSECA, M. Regeneration and multiplication of Dioscorea alata germplasm maintained in
vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 76: 87–90, 2004.
141
BOUMAN, H. & DE KLERK, G. J. Measurement of the extent of somaclonal variation in begonia
plants regenerated under various conditions: Comparison of three assays. Theoretical and
Applied Genetics, 102: 111-117, 2001.
BRADBURY, J. H. & HOLLOWAY, W. D. Chemistry of tropical root crops. Canaberra: Australian
Centre for International Research, 1988, 281p.
BRAIN, K. R. & HARDMAN, R. An improved method of densitometric thin-layer chromatography as
applied to the determination of sapogenin in Dioscorea tubers. Journal of Chromatography, 38:
355-363, 1968.
BRENAC, P. & SAUVAIRE, Y. Accumulation of sterols and steroidal sapogenins in developing
fenugreek pods: possible biosynthesis in situ. Phytochemistry, 29(2): 415-422, 1996.
CALDAS, L.S.; HARIDASAN, P. & PEREIRA, M. E. Meios nutritivos. In: TORRES, A. C.;
CALDAS, L. S. BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas.
Brasília: EMBRAPA/CNPH. v. 1. p. 87-132, 1998.
CÁNOVAS, F. M.; CANTÓN, F. R.; GARCÍA-GUTIÉRREZ, A.; GALLARDO, F. & CRESPILLO,
R. Molecular physiology of glutamine and glutamate biosynthesis in developing seedlings of
conifers. Physiologia Plantarum, 103: 287-294, 1998.
CAZÉ FILHO, J. Clonagem do Inhame (Dioscorea sp.) por Métodos Biotecnológicos. In: II
SIMPÓSIO NACIONAL SOBRE AS CULTURAS DO INHAME E DO TARO, 1., 2002, João
Pessoa, PB. Anais...João Pessoa, PB: EMEPA – PB, 2002. v.1, p. 113-123.
CHARLWOOD, B. V.; CHARLWOOD, K. A. & MOLINA-TORRES, J. Accumulation of secondary
compounds by organized plant cultures. In CHARLWOOD, B. V. & RHODES, M. J. C.
Secondary products from plant tissue culture. Oxford: CLARENDON PRESS, p. 167-200,
1990.
CHATURVEDI, H. C. & CHOWDHURY, A. R. Effect of growth hormones and some nitrogen
sources on diosgenin biosynthesis by tuber-callus of Dioscorea deltoidea. Indian Journal of
Experimental Biology, 18(8): 913-915, 1980.
CHEN, Y.; FAN, J.; YI, F.; LUO, Z. & FU, Y. Rapid clonal propagation of Dioscorea zingiberensis.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 73: 75–80, 2003.
CHU, E. P.Composição bioquímica de órgãos subterrâneos de reserva de espécies nativas de
Dioscorea e análise do desenvolvimento de Dioscorea delicata R. Knuth. 1989. 178 p.
Dissertação (Mestrado em Botânica) – Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, São Paulo.
142
CHU, E. P. & FIGUEIREDO-RIBEIRO, R. C. L. Native and exotic species of Dioscorea used as food
in Brazil. Economic Botany, 45(4): 467-479. 1991.
CHU, E. P. Cultivo in vitro, composição de carboidratos solúveis e isoperoxidases em espécies de
Dioscorea. 1998. 128 p. Tese (Doutorado em Ciências na área de Botânica) – Instituto de
Biociências da Universidade de São Paulo, São Paulo.
CHU, E. P. & FIGUEIREDO-RIBEIRO, R. C. L. Growth and carbohydrate changes in shoot cultures
of Dioscorea species as influenced by photoperiod, exogenous sucrose and cytokinin
concentrations. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70: 241-249, 2002.
COELHO, R. S. B. Resistência Genética a Doenças na Cultura do Inhame (Dioscorea spp.). In: II
SIMPÓSIO NACIONAL SOBRE AS CULTURAS DO INHAME E DO TARO, 2., 2002, João
Pessoa, PB. Anais...João Pessoa, PB: EMEPA – PB, 2002. v.2, p. 112-114.
COLLINS, C. H. & BRAGA, G. L. Introdução a métodos cromatográficos. 3 ed. Campinas:
UNICAMP, 298 p., 1988.
CONABIO. Disponível em <http://www.conabio.gob.mx>. Acesso em 14 jul. 2004.
COSTA, A. M. M. Fisiologia da Aclimatização. In: TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M.
Micropropagação de plantas ornamentais. Campinas, Instituto Agronômico, 1998, p. 63-67.
CROTEAU, R.; KUTCHAN, T. M. & LEWIS, N. G. Natural Products (Secondary Metabolites). In:
BUCHANAN, B. B.; GRUISSEM, W. & JONES, R. L. Biochemistry and molecular biology of
plants. American Society of Plant Physiologists, Maryland. 1367 p., 2000.
CRUZ, J. L.; MOSQUIN, P. R.; PELACANI, C. R.; ARAÚJO, W. L. & DaMATTA, F. M. Carbon
partitioning and assimilation as affected by nitrogen deficiency in cassava. Photosynthetica,
41(2): 201-207, 2003.
DAHLGREN, R. M. T. & CLIFFORD, H. T. The monocotyledons. A comparative study. Orlando:
Academic Press Inc. 1982. 378 p.
DATTA, S. K. & DATTA, K. Chemodifferentiation of diosgenin in Dioscorea composita.
Phytochemistry, 23(11): 2684-2685, 1984.
DAVIES, P. J. Plant hormones: physiology, biochemistry and molecular biology. 2 ed. Academic
Publishers, Netherlands. 831 p. 1995.
DEGRAS, L. L’Igname. Plante a Tubercule Tropicale. Techniques Agricoles et Productions
Tropicales XXXVI, Paris: G. P. Maisonneuve et Larose, 1986, 408p.
143
DE LA CRUZ, G.; LABRADA, M. & RODRÍGUEZ, O. Metodología de micropropagación del ñame
(Dioscorea alata L.) Informe Técnico. p. 6. IIA “Jorge Dimitrov”. Granma, ACC. 1992.
DRAPEAU, D., SAUVAIRE, Y., BLANCH, H. W., & WILKE, C. R. Improvement of diosgenin yield
from Dioscorea deltoidea Plant Cell Cultures by Use of Non-Traditional Hydrolysis Method.
Planta Medica, 474-478, 1986.
DUBOIS, M.; GILLES, K. A.; HAMILTON, J. K.; REBES, P. A. & SMITH, F. Colorimetric method
for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry, 28: 350-356, 1956.
EDWARDS, A. L., JENKINS, R. L. & DAVENPORT, L. J. Presence of diosgenin in Dioscorea
batatas (Dioscoreaceae). Economic Botany, 56(2): 204-206, 2002.
ELMUNAJJED, D. T.; FAYEZ, M. B. E. & RADWAN, A. S. Steroid sapogenins: thin-layer
chromatography. Phytochemistry, 4: 587-592, 1965.
ESTRADA-LUNA, A. A.; DAVIES JR, F. T. & EGILLA, J. N. Physiological changes and growth of
micropropagated chile ancho pepper plantlets during acclimatization and pos-acclimatization.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 66: 17-24, 2001.
FARRAR, J., POLLOCK, C. & GALLAGHER, J. Sucrose and the integration of metabolism in
vascular plants. Plant Science, 154: 1–11, 2000.
FERNIE, A. R.; ROESSNER, U. & GEIGENBERGER, P. The sucrose analog palatinose leads to a
stimulation of sucrose degradation and starch synthesis when supplied to discs of growing potato
tubers. Plant Physiology, 125: 1967-1977, 2001.
FIGUEIREDO-RIBEIRO, R. C. L.; CHU, E. P. & ALMEIDA, V. P. Tuberização. In: KERBAUY, G.
B. Fisiologia Vegetal. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan. 2004, p. 409-430.
FRANCIS, G.; KEREM, Z.; MAKKAR, H. P. S. & BECKER, K. The biological action of saponins in
animal system: a review. British Journal of Nutrition, 88: 587-605, 2002.
FURMANOWA, M. & GUZEWSKA, J. Dioscorea: In vitro culture and the micropropagation of
diosgenin-containing species. p. 161-184. In: BAJAJ, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture
and Forestry: Medicinal and Aromatic Plants II. vol. 7. Berlim: Springer-Verlag, 545 p.,
1989.
GOMEZ, K. A. & GOMEZ, A. A. Statistical procedures for agricultural research. 2 ed. Canada:
WILEY, 1984. 680 p.
144
GRATTAPAGLIA, D. & MACHADO, M. A. Micropropagação. p. 183-260. In: TORRES, A. C.;
CALDAS, L. S. & BUSO, J. A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas.
vol. 1. Brasília: Embrapa – SPI / Embrapa – CNPH, 510 p., 1998.
HAMMOND-KOSACK, K. & JONES, J. D. G. Responses to plant pathogens. In: BUCHANAN, B.
B.; GRUISSEM, W. & JONES, R. L. Biochemistry and molecular biology of plants. American
Society of Plant Physiologists, Maryland. 1367 p., 2000.
HARA, S. Analysis of steroid sapogenin by thin-layer chromatography. Chemical Pharmaceutical
Bulletin, 11: 1189-1192, 1963.
HEBLE, M. R. & STABA, E. J. Diosgenin synthesis in shoot cultures of Dioscorea composita. Planta
Medica, p. 120-123, 1980.
HOU, W. C., HSU, F. L., LEE, M. H. Yam (Dioscorea batatas) tuber mucilage exhibited antioxidant
activities in vitro. Planta Medica, 68: 1072-1076, 2002.
HU, K., DONG, A. J., YAO, X. S., KOBAYASHI, H., IWASAKI, S. A furostanol glycosides from
rhizomes of Dioscorea collettii var hypoglauca. Phytochemistry, 44(7): 1339-1342, 1997.
HU. K. & YAO, X. Protodioscin (NSC – 698 796): Its spectrum of cytotoxicity against sixty human
cancer cell lines in an anticancer drug screen panel. Planta Medica, 68: 297-301, 2002.
ITHARAT, A., HOUGHTON, P. J., ENO-AMOOQUAYE, E., BURKE, P. J., SAMPSON, J. H. &
RAMAN, A. In vitro cytotoxic activity of Thai medicinal plants used traditionally to treat cancer.
Journal of Ethnopharmacology, 90: 33-38, 2004.
JAIN, S. M. Mechanisms of spontaneous and induced mutations in plants. Radiation Review, 2: 255-
258, 2000.
JAIN, S. M. Tissue culture-derived variation in crop improvement. Euphytica, 118: 153-166, 2001.
JASIK, J. & MANTELL, S. H. Effects of jasmonic acid and its methylester on in vitro
microtuberization of three food yam (Dioscorea) species. Plant Cell Reports, 19: 863–867,
2000.
JEAN, M. & CAPPADOCIA, M. In vitro tuberization in Dioscorea alata L. “Brazo Forte” and
“Florido” and D. abyssinica Hoch. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 26: 147–152, 1991.
JOHN, J. L., COURTNEY, W. H. & DECOTEAU, D. R. The influence of plant growth regulators and
light on microtuber induction and formation in Dioscorea alata L. cultures. Plant Cell, Tissue
and Organ Culture, 34: 245-252,1993.
145
JOLY, A. B. Botânica: Introdução à Taxonomia Vegetal. Ed. 12. São Paulo: COMPANHIA
EDITORA NACIONAL, 1998.
KADLECEK, P.; TICHÁ, I.; HAISEL, D.; CAPKOVÁ, V. & SCHÄFER, C. Importance of in vitro
pretreatment for ex vitro acclimatization and growth. Plant Science, 161: 695-701, 2001.
KERBAUY, G. B. Competência e determinação celular em cultura de células e tecidos de plantas. p.
519-531. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S. & BUSO, J. A. Cultura de Tecidos e
Transformação Genética de Plantas. vol. 2. Brasília: Embrapa – SPI / Embrapa – CNPH, 345
p., 1999.
KETIBU, A. O. & OYENUGA, V. A. Changes in carbohydrate constituents of yam tuber (Dioscorea
rotundata Poir.) during growth. Journal Science Food Agriculture, 24: 367-373, 1973.
KOHMURA, H.; ARAKI, H. & IMOTO, M. Micropropagation of “yamatoimo” Chinese yam
(Dioscorea opposita) from immatures leaves. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 40: 271-
276, 1995.
KOUASSI B.; DIOPOH, J. & FOURNET, B. Soluble sugars from yam and changes during tuber
storage. Phytochemistry, 29: 1069-1072, 1990.
LAMBERS, H.; CHAPIN III, F. S. & PONS, T. L. Plant Physiological Ecology. New York:
SPRINGER-VERLAG, 1998. 540 p.
LARCHER, W. Ecofisiologia Vegetal. São Carlos: RIMA, 2000. 531 p.
LARKIN, P. J. & SCOWCROFT, W. R. Somaclonal variation: a novel source of variability from cell
cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics, 60: 197-214, 1981.
LAUZER, D., LAUBLIN, G., VINCENT, G. & CAPPADOCIA, M. In vitro propagation and cytology
of wild yams, Dioscorea abyssinica Hock. and D. mangenotiana Miège. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 28: 215–223, 1992.
LENINGHER, A. L. Princípios da Bioquímica. 2. ed. São Paulo: SARVIER, 2000.
MALMBERG, R.; MESSING, J. & SUSSEX, I. Molecular Biology of Plants. Cold Springer Harbor:
Cold Spring Harbor Laboratory, 150 p. 1985.
MANTELL, S. H. & HUGO, S. A. Effects of photoperiod, mineral medium strength, inorganic
ammonium, sucrose and cytokinin on root, shoot and microtuber development in shoot cultures
of Dioscorea alata L. and D. bulbifera L. yams. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 16: 23–
37, 1989.
146
MARCOTRIGIANO, M. Chimeras and Variegation: Patterns of Deceit. HortScience, 32(5): 773-784,
1997.
MARTIN, F. W. Tropical yams and their potential. Part 2. Dioscorea bulbifera. USDA Agriculture
Handbook. 466 p, 1974
MARTIN, F. W. Selected yam varieties for the tropics. In: COCKE, J.; MACINTIRE, R. &
GRAHAM, M. Proceedings of the fourth symposium of the international society for tropical
root crops. 278 p, 1976.
MARTIN, F. W. & DEGRAS, L. Tropical yams and their potential. Part 5. Dioscorea trifida. USDA
Agriculture Handbook, 522 p., 1978.
MASTERSON, J. Stomatal size in fossilplants: evidence for polyploidy in majority of angiosperms.
Science, 264: 421-424, 1994.
McCREADY, R. M.; GUGGOLZ, J.; SILVEIRA, S. & OWENS, H. G. Determination of starch and
amylase in vegetables. Application to peas. Analytical Chemistry, 22(9): 1156-1158, 1950.
MIYZAWA, M.; SHIMAMURA, H.; NAKAMURA, S. & KAMEOKA, H. Antimutagenic activity of
(+)-β-eudesmol and paenol from Dioscorea japonica. Journal of Agriculture Food Chemistry,
44: 1647-1650, 1996.
MUCHOW, R. C. & SINCLAIR, T. R. Epidermal conductance, stomatal density and stomatal size
among genotypes of Sorghum bicolor (L.) Moench. Plant, Cell and Environment, 12: 425-431,
1989.
MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue
cultures. Physiology Plantarum, 15: 473-497, 1962.
NARULA, A.; KUMAR, S.; BANSAL, K. C. & SRIVASTAVA, P. S. In vitro micropropagation,
differentiation of aerial bulbils and tubers and diosgenin content in Dioscorea bulbifera. Planta
Medica, 69: 778-779, 2003.
NG, S. Y. C. In vitro tuberization in white yam (Dioscorea rotundata Poir). Plant Cell, Tissue and
Organ Culture, 14: 121–128, 1988.
NUNES, E. C.; CASTILHO, C. V.; MORENO, F. N. & VIANA, A. M. In vitro culture of Cedrela
fissilis Vellozo (Meliaceae). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 70(1): 259-268, 2002.
147
OASHI, M. C. G. Estudo da cadeia produtiva como subsídio para pesquisa e desenvolvimento do
agronegócio do sisal na Paraíba. 1999. Tese (Doutorado). Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis. Disponível em <http://eps.ufsc.br/teses99/oashi>. Acesso em: 14 jul.
2004.
OLSZEWSKI, N.; SUN, T. & GLUBER, F. Gibberellin signaling: biosynthesis, catabolism, and
response pathway. The Plant Cell, supplement: 61-80, 2002.
ONWUEME, I. C. Influence of storage time on earliness of sprouting and tubering in Dioscorea
rotundata yams. Journal Agriculture Science, 84: 503-505, 1978.
PEDRALLI, G. Uso de nomes populares para as espécies de Araceae e Dioscoreaceae. In: II
SIMPÓSIO NACIONAL SOBRE AS CULTURAS DO INHAME E DO TARO, 1., 2002a, João
Pessoa, PB. Anais...João Pessoa, PB: EMEPA – PB, 2002a. v.1, p. 309-312.
PEDRALLI, G. Dioscoreaceae e Araceae: Aspectos taxonômicos, etnobotânicos e espécies nativas
com potencial para melhoramento genético. In: II SIMPÓSIO NACIONAL SOBRE AS
CULTURAS DO INHAME E DO TARO, 2., 2002b, João Pessoa, PB. Anais...João Pessoa, PB:
EMEPA – PB, 2002b. v.2, p. 39-53.
PEDRALLI, G. Flora Ilustrada Catarinense: Dioscoreaceas. Itajaí, SC, 2004. 84p.
PEDROTTI, E. L.; JAY-ALLEMAND, C.; DOUMAS, P. & CORNU, D. Effect of autoclaving amino
acids on in vitro rooting response of wild cherry shoot. Scientia Horticulturae, 57: 89-98, 1994.
PHILLIPSON, J. D. Plants as sources of valuable products. In: Secondary products from plant
tissue culture. Oxford: CLARENDON PRESS, p. 1-21, 1990.
PRESTON, W. H.; HAUN, J. R.; GARVIN, J. W. & DAUM, R. J. Several aspects of growth,
development and sapogenin yield of tubers of Dioscorea spiculiflora. Economic Botany, 18(4):
323-328, 1964.
PURSEGLOVE, J. W. Tropical crops: monocotyledons, New York: Jonhn Wiley & Sons, 1972. 130
p.
RAVEN, P. H.; EVERT, R. F. & EICHHORN, S. E. Biologia Vegetal. 6 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001. 906 p.
READ, P. E. & FELLMAN, C. D. Accelerating acclimation of in vitro propagated woody
ornamentals. Acta Horticulture, 166: 15-20, 1985.
148
RISHI, A. K.; KAPOOR, R. & VAKHLU, V. K. A rapid spectrophotometric method for the
quantitative determination of diosgenin in Dioscorea tuber. Current Science, 45(9): 327-328,
1976.
RIZZINI, C. T. & MORS, W. B. Botânica Econômica Brasileira. 2 ed. Revisada e Atualizada. Rio
de Janeiro: ÂMBITO CULTURAL, 1995. 248p.
ROMERO-ARANDA, R.; CANTO-GARAY, R. & MARTINEZ, P. F. Distribution and density of
stomata in two cultivars of Gerbera jamesonii and its relation to leaf conductance. Scientia
Horticulturae, 58: 167-173, 1994.
SÁNCHEZ, G. L.; ACEVEDO, J. C. M. & SOTO, R. R. Spectrophotometric determination of
diosgenin in Dioscorea composita following thin-layer chromatography. Analyst, 97: 973-976,
1972.
SCHOENE, G. & YEAGER, T. Micropropagation of sweet viburnum (Viburnum odoratissimum).
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 83: 271-277, 2005.
SCRAGG, A. H. Secondary products from cultured cells and organs: II. Large scale culture. In
DIXON, R. A. & GONZALES, R. A. Plant Cell Culture: A practical approach. 2nd ed.
Oklahoma: IRL Press, 1994. 230 p.
SELVARAJ, Y.; CHANDER, M. S.; BAMMI, R. K. & RANDHAWA, G. S. Comparative study of
the chemical constituents of edible and saponin bearing Dioscorea tubers. Indian Journal of
Horticulture, 198: 78-83, 1982.
SENGUPTA, J.; MITRA, G. C. & SHARMA, A. K. Organogenesis and tuberization in cultures of
Dioscorea floribunda. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 3: 325–331, 1984.
SICURARI, M.; PICCIONI, E. & STANDARDI, A. Micropropagation and preparation of synthetic
seed in M.26 apple rootstock I: Attempts towards saving labor in the production of adventitious
shoot tips suitable for encapsulation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 66: 207–216, 2001.
SOKAL, R. R. & ROHLF, F. J. 1969. Biometry. San Francisco, Freeman and Company. 776p
STAFFORD, A. Natural products and metabolites from plants and plant tissue cultures. In
STAFFORD, A. & WARREN, G. Plant Cell and Tissue Culture. England: WILEY, 1991. p.
124-162.
STAFFORD, A. & WARREN, G. Plant Cell and Tissue Culture. England: WILEY, 1991. 251 p.
SUPLEMENTOS ON LINE: Disponível em:
149
<http:
www.suplementosonline.com.br/produtos>. Acesso em 14 jul. 2004.
SUTTER, E. Morphological, Physical and Chemical Characteristics of Epicuticular Wax on
Ornamental Plants Regenerated in vitro. Annals of Botany, 55: 321-329, 1985.
TAIZ, L. & ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 3 ed. Porto Alegre: ARTMED, 2004. 719 p.
TAL, B., GRESSEL, J. & GOLDBERG, I. The Effect of Medium Constituents on Growth and
Diosgenin Production by Dioscorea deltoidea Cells Grown in Batch Cultures. Planta Medica,
44: 111-115, 1982.
TAL, B.; ROKEM, J. S. & GOLDBERG, I. Timing of Diosgenin Appearance in Suspension Cultures
of Dioscorea deltoidea. Planta Medica, p. 239-241, 1984.
TOMBOLATO, A. F. C. & COSTA, A. M. M. Micropropagação de plantas ornamentais.
Campinas, Instituto Agronômico, 1998, 72 p.
TORRES, A. C., CALDAS, L. S. & BUSO, J. A. Cultura de Tecidos e Transformação Genética de
Plantas. Brasília : EMBRAPA-SPI/EMBRAPA-CNPH, v. 1, 509 p, 1998.
TORRES, A. C.; FERREIRA, A. T.; SÁ, F. G. de.; BUSO, J. A.; CALDAS, L. S.; NASCIMENTO,
A. S.; BRÍGIDO, M. M. & ROMANO, E. Glossário de Biotecnologia Vegetal. Brasília:
EMBRAPA HORTALIÇAS, 2000. 128 p.
TSAI, C. & SAUNDERS, J. W. Evaluation of sole nitrogen sources fro shoot and leaf disc cultures of
sugarbeet. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 59: 47-56, 1999.
TWYFORD, C. T. & MANTELL, S. H. Production of somatic embryos and plantlets from root cells
of the Greater Yam. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 46: 17-26, 1996.
VAN HUYLENBROECK, J. M. & DEBERGH, P. C. Monitoring quality of micropropagated plants
during acclimatization. Acta Horticulture, 517: 65-72, 2000.
VERSPOHL. E. J. Recommended testing in diabetes research. Planta Medica, 68: 581 – 590, 2002.
VIANA, A. M. Crescimento e Reprodução de Dioscorea composita. 1985. 212 p. Tese (Doutorado
em Ciências) – Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, Campinas.
VIANA, A. M. & MANTELL, S. H. Callus induction and plant regeneration from excised zygotic
embryos of the seed-propagated yams Dioscorea composita Hemsl. and D. cayenensis Lam.
Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 16: 113-122, 1989.
150
VREUGDENHIL, D.; BOOGAARD, Y.; VISSER, R. G. F. & BRUJIN, S. M. Comparison of tuber
and shoot formation from in vitro cultured potato explants. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, 53: 197-204, 1998.
WEBERLING, F. & SCHWANTES, H.O. Taxonomia Vegetal. São Paulo: EPU, 1986. 314 p.
WAGNER, H. & BLADT, S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas, 2
nd
.
edition, Berlin: Springer-Verlag, 384pp, 2001.
YAMAMOTO, M. M., KAWANO, T.; YOUNG, M. C. M., CHU, E. P., HARAGUCHI, M., HIROKI,
K. Molluscicidal activity of three Brazilian plants species. Fitoterapia, LXVII (1): 59-62, 1996.
YANO-MELO, A. M.; SAGGIN JÚNIOR, O. J.; LIMA-FILHO, J. M.; MELO, N. F. & MAIA, L. C.
Effect of arbuscular mycorrhizal fungi on the acclimatization of micropropagated banana
plantlets. Mycorrhiza, 9: 119-123. 1999.
YORDANOV, I.; VELIKOVA, V. & TSONEV, T. Plant responses to drought, acclimations and stress
tolerance. Photosynthetica, 38(1): 171-186, 2000.
ZULLO, M. A. T.; RAMOS, M. T. B.; MONTEIRO, D. A. & GODOY JR, G. Extração e isolamento
de diosgenina de barbasco. Bragantina, 46(1): 9-15, 1987.
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