( PDF ) Estudo da atividade antioxidante do ácido caféico e da PIH: um polifenol natural e um quelante sintético

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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

Estudo da atividade antioxidante do ácido caféico e da PIH:

um polifenol natural e um quelante sintético

Angelo de Queiroz Mauricio

Dissertação apresentada como

requisito para a obtenção do título de

Mestre em Química Analítica pelo

Instituto de Química da Universidade

de Brasília

Orientador

Prof. Dr. Marcelo Hermes Lima

IB – UnB

Brasília – DF

Brasil

2006

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Livros Grátis

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folha aprovação

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III

Dedico este trabalho ao Senhor Jesus Cristo, o único que é

verdadeiramente digno de ser chamado de Mestre

A minha família, Cauê, Ana Terra e Dhyana, pelo

compromisso que representam com meu passado e meu

futuro

“Não estamos mais cansados por causa do ontem.

Somos outros, não mais quem

éramos antes.

As calamidades de ontem, as

dificuldades de ontem, eram válidas

para o dia de ontem.

Não para o dia de hoje!”

Cinema Uenebê

Agradecimentos

À Deus, por tudo.

À minha família, pelo alto preço que tem pago.

À todos meus amigos, pelas orações e apoio.

Em especial ao Nanshiu, Cézar, Rodrigo, Natacha, Janini, Ricardo, Thiago.

Ao Prof. Luis Carlos Behring Nasser.

Ao Prof. Marcelo Hermes-Lima, por confiar em mim todo este tempo

Resumo

As Éspécies Reativas de Oxigênio – EROs, dentre as quais se incluem os

radicais hidroxil e superóxido, têm participação crucial nas reações

bioquímicas de dano oxidativo à sistemas fisiológicos. A formação destas

espécies reativas depende em grande escala da presença de íons

metálicos, em especial íons do elemento químico ferro. Desta forma, a

caracterização de novas substâncias capazes de inibir a formação de

EROs ou mesmo minimizar as reações de dano oxidativo é de relevante

interesse bioquímico. O presente trabalho se propõe a estudar duas

substâncias com potencial antioxidante, o polifenol ácido caféico – AC, e

a piridoxal isonicotinoil hidrazona – PIH. Demonstramos que o mecanismo

de ação da PIH se deve à sua capacidade formar um complexo estável

com íons Fe(III), o qual seria menos suscetível a participar de reações

geradoras de radicais hidroxil. A PIH foi capaz de inibir a oxidação do

ascorbato, a formação do radical ascorbil (medido por RPE), e a

degradação oxidativa da deoxiribose (2-DR). Esta inibição é dependente

das concentrações de Fe(III), da natureza do quelante ao qual o Fe(III)

está previamente complexado e do tempo de pre-incubação da PIH com o

complexo Fe(III)-quelante. Com relação ao ácido caféico, este polifenol se

mostrou capaz de eficientemente inibir a formação de radicais hidroxil a

partir de íons Fe(II) e peróxido de hidrogênio, e o consequente dano

oxidativo à 2-DR. Verificou-se que esta inibição é dependente do pH do

meio reacional e da temperatura de incubação da reação. Propõem-se

que a ação antioxidante do AC está relacionada à habilidade deste

polifenol em quelar íons Fe(II), tendo sido observada a formação de um

complexo com íons ferrosos através do sítio catecol do AC. Curiosamente

incubando-se o meio reacional a 98ºC, foi verificado um efeito pró-

oxidante do AC, sendo este efeito correlacionado à interações deste

composto com íons ferro.

Palavras-chave : PIH, Cafeico, Polifenol, Fenton, Antioxidante, Quelante,

Ferro

VII

Abstract

Reactive Oxygen Species – ROS, including hydroxyl and superoxide

radicals, play a significant role in all biochemical reactions that cause

oxidative damage to phisiological systems. Formation of these species are

usually mediated by metal ions, specially iron ones. Thus, the

caracterization of new molecules capable of inhibiting oxyradical formation

are of relevant interest. This present work focuses on two compounds with

potential antioxidant activity : Cafeic Acid – CAF, and Pyridoxal

isonicotinoyl hydrazone – PIH. We demonstrate the PIH´s antioxidant

action is due to its ability to form an stable complex with iron(III), wich is

less suceptible to undergo reduction and consequently form oxyradicals by

Fenton reaction. PIH was able to inhibit iron-mediated ascorbate oxidation

and also ascorbil radical formation, as well as oxidative deoxyribose

damage. It was found that this inhibitory action of PIH was dose-

dependent and also depends on pre-incubation time (between PIH and

iron ions) and on the nature of a co-chelator previously complexing

iron(III). Relating to Cafeic Acid, it was observed that this polifenolic

compound was able to efficiently inhibit oxyradical formation by Fenton

reaction and consequent damage to deoxyribose. It was also found that

this inhibition was pH-dependent, as well as dependent of the incubation

temperature of the reaction systems. We propose that the antioxidant

activity showed by CAF is related to its ability to complex iron(II) ions,

being observed the formation of a complex with iron involving catechol

sites of CAF. Surprisingly, it was also observed that CAF presents a pro-

oxidant activity when reaction media is incubated at 98°C, being this

behaviour associated to temperature-mediated interactions between iron

and CAF.

Key words : PIH, Cafeic, poliphenol, antioxidant, Fenton, chelator, iron

VIII

Sumário

Objetivos .............................................................................................. 01

1. Introdução ....................................................................................... 02

1.1 Radicais Livres ............................................................................ 02

1.1.1 Conceitos ............................................................................... 02

1.1.2 Radicais livres e suas reações .............................................. 05

1.1.3 Técnicas analíticas de detecção ............................................ 07

1.1.4 Antioxidantes ......................................................................... 09

1.2 PIH .............................................................................................. 11

1.2.1 Histórico ................................................................................. 11

1.2.2 A ação antioxidante da PIH .................................................... 12

1.2.3 Fatos novos acerca da PIH .................................................... 14

1.3 Polifenóis ..................................................................................... 17

1.3.1 Dieta e biodisponibilidade ....................................................... 19

1.3.2 Ação antioxidante ................................................................... 22

1.3.3 Toxicidade .............................................................................. 26

1.3.4 Ácido Caféico ......................................................................... 27

1.3.4.1 Aspectos estruturais ......................................................... 28

2. Materiais e Métodos ....................................................................... 32

2.1 Oxidação do ascorbato ................................................................ 32

2.2 RPE do radical ascorbil ............................................................... 33

2.3 Dano oxidativo a 2-DR ................................................................ 33

2.4 Redução do complexo Fe(III)-(PIH)

promovida pelo ascorbato. 34

3. Resultados e Discussão ................................................................ 35

3.1 Estudos sobre a ação antioxidante da PIH .................................. 35

3.1.1 Influência da natureza do co-quelante na atividade

antioxidante da PIH ............................................................... 35

3.1.2 Influência do tempo de pré-incubação na atividade

antioxidante da PIH ................................................................ 41

3.1.3 Influência da concentração de PIH e da proporção

entre os Ligantes (PIH e co-quelantes) e o Fe ...................... 44

3.1.4 Efeito da ação redutora do ascorbato sobre o

complexo Fe(III)-(PIH)

.......................................................... 47

3.2 Estudo da ação do ácido caféico ................................................ 48

3.2.1 Atividade antioxidante do ácido caféico (AC) e efeito

do pH ..................................................................................... 48

3.2.2 Estudos espectrofotométricos da ligação de íons

Fe(II) ao AC ........................................................................... 51

3.2.3 Efeito da temperatura de incubação ...................................... 55

3.2.4 Efeito da pré-incubação ......................................................... 58

3.2.5 Efeito dos íons Fe(III) sobre a degradação da 2-DR

e sobre o AC .......................................................................... 60

3.2.6 Efeito da concentração de AC e 2-DR ................................... 65

4. Conclusão ...................................................................................... 69

5. Bibliografia ..................................................................................... 75

ANEXO I ........................................................................................... 83

Lista de abreviaturas e acrônimos

2-DR 2-deoxi-D-ribose

Abs Absorbância

AC Ácido caféico

AT Ácido Tânico

ATP Adenosina trifosfato

DFO Desferoxamina

DNA Ácido desoxiribonucléico

EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético

RPE Ressonância paramagnética eletrônica

EROs Éspécies Reativas de Oxigênio

HEPES Ácido N-(2-hidroxietil)piperazina-N-(2-etenosulfonico)

HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência

LDL Lipoproteínas de baixa densidade

MES Ácido 2-(N-morfolino)etanosulfonico

NTA Ácido nitrilo-acético

PIH Piridoxal isonicotinoil hidrazona

SOD Superoxido dismutase

TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

TEAC Capacidade antioxidante equivalente ao Trolox

Lista de tabelas

TABELA 1

Distribuição dos principais

polifenóis em alguns alimentos

Página 20

TABELA 2

Percentual de proteção da PIH

contra oxidação da 2-DR com

diferentes co-quelantes

Página 39

TABELA 3

Efeito da concentração de PIH na

formação do radical ascorbil

Página 45

XII

Lista de figuras

FIG. 1

Representação esquemática da Piridoxal

Isonicotinoil Hidrazona – PIH

Página 13

FIG. 2

Representação esquemática dos flavanóides

Página 18

FIG. 3

Representação esquemática dos ácidos

hidroxicinâmicos

Página 19

FIG. 4

Representação da estrutura básica dos

flavonóis

Página 23

FIG. 5

Precursores biosintéticos do ácido caféico

Página 28

FIG. 6 Mecanismo proposto para oxidação do AC

Página 29

FIG. 7 Mecanismo alternativo para oxidação do AC

Página 30

FIG. 8

Esquema da decomposição do AC mediada

por íons Fe(III)

Página 31

FIG. 9

Dependência da oxidação do ascorbato com

a concentração de Fe-NTA

Página 35

FIG. 10

Dependência da oxidação do ascorbato com

a concentração de Fe-EDTA

Página 36

FIG. 11

Dependência da formação do radical ascorbil

com a concentração de Fe-EDTA (dados de

RPE)

Página 37

FIG. 12

Efeito da PIH na redução do sinal do radical

ascorbil com diferentes co-quelantes

Página 39

FIG. 13

Efeito da pré-incubação de Fe(III)-EDTA e

PIH na oxidação do ascorbato

Página 41

FIG. 14

Efeito da pré-incubação de Fe(III)-EDTA e

PIH na formação do radical ascorbil

Página 42

FIG. 15

Efeito da pré-incubação de Fe(III)-EDTA e

PIH na degradação da 2-DR

Página 43

FIG. 16

Efeito da concentração de PIH na oxidação

do ascorbato em dois diferentes tempos de

pré-incubação

Página 45

FIG. 17

Efeito da concentração de PIH na oxidação

Página 46

XIII

do ascorbato em duas diferentes proporções

Fe-EDTA

FIG. 18

Efeito da presença de AC na degradação da

2-DR

Página 48

FIG. 19a

Perfil espectral do AC puro e do AC em

presença de Fe(II) em pH 4,0

Página 51

FIG. 19b

Perfil espectral do AC em presença de Fe(II)

em pH 7,2

Página 52

FIG. 19c

Perfil espectral do AC em presença de Fe(II)

em pH 5,6

Página 52

FIG. 19d

Reimpressão dos dados das figuras 17 a, b e

c em escala ampliada

Página 53

FIG. 20

Acompanhamento temporal da formação de

espécie química a 604 nm

Página 54

FIG. 21

Efeito da presença de AC na degradação da

2-DR a 98ºC

Página 55

FIG. 22

Efeito do tempo de pré-incubação sobre a

degradação da 2-DR

Página 58

FIG. 23a

Efeito do AC sobre a reação de degradação

da 2-DR promovida por Fe(III) e peróxido de

hidrogênio

Página 61

FIG. 23b

Comparação das reações de degradação da

2-DR promovidas por peróxido de hidrogênio

e Fe(II) (Reação de Fenton) ou por Fe(III)

Página 62

FIG. 24a

Comparação do perfil espectral de sistemas

contendo Fe(II) ou Fe(III)

Página 63

FIG. 24b

Reimpressão dos dados da figura 22a em

escala ampliada na região de comprimento

de onda de interesse

Página 63

FIG. 25a

Efeito da variação da concentração de 2-DR

Página 65

FIG. 25b

Percentual de proteção oferecido pelo AC

contra a degradação da 2-DR em diferentes

concentrações da molécula alvo

Página 66

FIG. 26

Efeito da variação da concentração de AC em

diferentes concentrações de 2-DR

Página 68

Objetivos

• Fornecer evidências adicionais de que o mecanismo antioxidante in

vitro demonstrado pela Piridoxal Isonicotinoil Hidrazona – PIH, se deve

principalmente à inibição da reação de redução do Fe(III), principal

contribuinte fisiológica das reações de Fenton que inevitavelmente

acompanham patologias relacionadas à superexposição férrica.

• Investigar o potencial antioxidante in vitro do polifenol Ácido Caféico,

verificando seu comportamento e mecanismo de ação face a presença

de íons ferrosos em solução aquosa a pH fisiológico, elementos

cruciais na geração de Espécies Reativas de Oxigênio – EROs, no

organismo.

1. Introdução

1.1 Radicais Livres

1.1.1. Conceitos

Em níveis fisiológicos de oxigênio, supõe-se que cerca de 0,1 % de todo o

reduzido na mitocôndria irá formar o radical livre superóxido [Hermes-

Lima 2004]. Esta afirmação abrange três aspectos importantes da

bioquímica de radicais livres, quais sejam: A relação dos radicais livres

com a presença do oxigênio, o paradoxo vida/morte inerente a este gás e

a inevitabilidade destes radicais já que neste caso, os mesmos estão

associados ao ato intrínseco de respirar.

Exatamente por ser imprescindível à maioria dos organismos (exceto no

caso daqueles anaeróbicos), se torna obscurecido o fato de que o

oxigênio é um gás tóxico e mutagênico, responsável por diversas

situações de severo stress fisiológico ao qual todos estamos

inevitavelmente submetidos. Neste sentido, é curioso observar que dado

às suas características, as quais serão abordadas adiante, o oxigênio é

indispensável para a produção de energia nas cadeias de transporte de

elétrons, mas leva também à oxidações celulares danosas e por vezes

letais.

Esta energia relacionada à presença de O

é derivada da oxidação dos

combustíveis metabólicos sendo convertida em ATP, uma solução

bioquímica para o “armazenamento” e rápida mobilização energética na

célula. Em organismos eucarióticos sob condições aeróbicas, o ATP é

gerado como resultado de um mecanismo conhecido como cadeia

transportadora de elétrons. Tal cadeia é constituída por quatro complexos

enzimáticos, que atuam em uma série de reações de oxidação e redução,

“conduzindo” os elétrons ao longo da membrana mitocondrial, de um

complexo para o outro, até estes alcançarem seu destino final: a

combinação com o oxigênio molecular, reduzindo-o a duas moléculas de

água.

Por outro lado, o O

exerce também um papel deletério em diversos

sistemas biológicos. Exposição ao oxigênio em altas pressões,

frequentemente causa toxicidade aguda do sistema nervoso central

produzindo convulsões, o que é de especial interesse em atividades como

mergulho e permanência em estações espaciais e submarinos. A

exposição de humanos ao oxigênio puro por 24 horas, leva em todos os

casos reportados ao dano alveolar nos pulmões e conseqüente edema,

em decorrência da morte de células epiteliais dos alvéolos, degradação

das barreiras capilares e vazamento do plasma para o espaço intersticial

[Halliwell e Gutteridge 2000]. A exposição prolongada também é

responsável pela denominada fibrose pulmonar, impedindo

permanentemente as trocas gasosas.

Assim, durante o processo evolutivo (acredita-se que inicialmente a

atmosfera continha pequena quantidade de O

), os organismos

desenvolveram complexos sistemas de defesa antioxidante, como forma

de proteção contra os efeitos tóxicos do O

. Por muito tempo esta

toxicidade estava apenas associada à capacidade de inibir a produção ou

a ação de enzimas celulares [Haugard 1968]. De fato, a perda da

atividade de enzimas tais como a nitrogenase em Clostridium

pasteurianum se deve, por exemplo, à ação direta do O

Porém Gilbert, traçando um paralelo entre os efeitos do oxigênio e

aqueles causados por radiações ionizantes, propôs que a maior parte da

atividade danosa deste gás podia ser atribuída à formação de espécies

denominadas radicais livres de oxigênio [Gilbert 1981]. Por exemplo, a

inibição do crescimento observada em E.coli exposta à O

em alta

pressão está associada à ação de uma espécie reativa de oxigênio, o

radical superóxido (O

•

), o qual neste caso inibe a síntese da valina [Flint

1993].

Espécies reativas de oxigênio (EROs) é um termo usado para designar

mais amplamente tanto radicais de oxigênio (como o superóxido ou o

hidroxil - HO

•

), quanto derivados não radicalares do oxigênio, tais como

peróxido de hidrogênio (H

), ácido hipocloroso (HClO) e ozônio (O

Segundo Halliwel, a expressão “reativo” é relativa, já que nem O

•

são particularmente reativos em solução aquosa [Halliwell 2000].

Já o termo radical livre é usado num sentido bastante abrangente e

simples, para designar qualquer espécie capaz de existência

independente (daí a palavra “livre”) e que possua em sua estrutura

eletrônica um ou mais elétrons desemparelhados. Um elétron

desemparelhado é aquele que ocupa sozinho um orbital atômico ou

molecular. A existência destes elétrons desemparelhados é justamente a

causa do principal interesse nestas espécies, já que os mesmos

usualmente conferem a estes radicais uma alta reatividade frente a outras

moléculas (apesar de a reatividade química dos radicais variar

enormemente).

Outra característica advinda do desemparelhamento eletrônico é a

capacidade que elétrons desemparelhados têm de interagir com campos

magnéticos. Esta característica, reportada como paramagnetismo,

propicia uma aplicação metodológica importante na detecção de radicais

livres: A técnica de Ressonância Paramagnética Eletrônica, RPE, a qual

será discutida adiante.

Deste modo, segundo o conceito supracitado, diversas espécies podem

ser classificadas como radicais livres, entre elas o hidrogênio atômico, o

cloro atômico gerado pela homólise do gás cloro e até mesmo metais de

transição como Ferro e Cobre [Halliwell e Gutteridge 2000]. No entanto,

dado o interesse eminentemente biológico deste trabalho, principal

atenção será dada aos radicais derivados do oxigênio, em especial o

radical hidroxil.

1.1.2. Radicais livres e suas reações

Apenas a título de ilustração, descreve-se a seguir esquemas que

representam tanto a geração de radicais quanto as reações das quais

estes tomam parte.

Formação de radicais

De um modo geral, radicais são formados pela cisão homolítica de uma

ligação covalente, normalmente sendo necessário para tanto, o

fornecimento de considerável quantidade de energia oriunda de processos

tais como aquecimento ou radiação eletromagnética. Um bom exemplo

são as reações iniciadas em câmaras de radiação UV ou mesmo as

reações de combustão. No entanto, dependendo das espécies presentes

no meio, processos catalíticos podem ocorrer, permitindo que a reação

ocorra por mecanismos outros, os quais possuam menor energia de

ativação.

Dentro deste contexto, de especial interesse é a reação de Fenton,

importante tributária da geração in vivo de espécies reativas de oxigênio

(esta reação é um bom exemplo de reações de formação de radicais livres

catalisadas por metais de transição). Um sistema contendo H

e um sal

de Fe(II) é capaz de oxidar diversas moléculas orgânicas, tendo sido

Henry Fenton o primeiro a reportar seu comportamento frente à amostras

de ácido tartárico [Fenton 1894]. Apesar de mais de 100 anos terem se

passado desde então, ainda há discussões sobre o mecanismo exato de

oxidação de moléculas orgânicas pelo sistema de Fenton . O mais

provável é que estejam envolvidas diversas espécies oxidantes, entre elas

o radical hidroxil, conforme a equação 1:

58int

−−−•++

=++→→+ sMkOHHOFesermediáriocomplexosOHFe

†

(equação 1)

†

Constante k

segundo Chen (Chen et al. 2002)

Esta reação é termodinamicamente favorecida uma vez que os potenciais

padrão de redução das semi-reações, corrigidos para pH 7, são

aproximadamente 0,32 V (H

/HO

•

) e 0,11 V (Fe

/Fe

) [Halliwell 2000].

Atuando paralelamente à reação de Fenton, traços de Fe(III) podem reagir

com peróxido de hidrogênio especialmente se estiverem ligados a certos

quelantes, embora esta seja uma reação mais lenta que aquela com

Fe(II), conforme a equação 2:

02,02int

−−+

−•

=++→→+ sMkHOFesermediáriocomplexosOHFe

(equação 2)

Gutteridge reporta que HO

•

pode ser formado a partir de sistemas

contendo certos quelatos de Fe(III) (por exemplo, EDTA férrico) e H

aparentemente envolvendo O

•

uma vez que esta reação é inibida pela

presença da enzima superóxido dismutase - SOD [Gutteridge 1990].

Desta forma, os sistemas de Fenton são especialmente relevantes em

patologias nas quais se verifica o acúmulo de ferro, como por exemplo a

hemocromatose e a beta-talassemia, já sendo bem conhecida a

correlação existente entre estas enfermidades e os efeitos oriundos de

danos oxidativos [Bacon e Britton 1990].

Reações de radicais

Caso duas espécies radicalares reajam entre si, como resultado obtém-se

a reação inversa daquela descrita como cisão homolítica. Ocorre neste

caso a formação de um novo orbital molecular no qual podem ser

encontrados ambos os elétrons anteriormente desemparelhados,

formando-se portanto uma nova ligação covalente e a conseqüente

extinção das espécies radicalares originais.

Constante k

segundo Chen (Chen et al. 2002)

No entanto, caso a espécie radicalar reaja com um não-radical, o produto

é um novo radical, e diferentemente da situação anterior, dá-se início a

uma série de reações em cadeia, que prosseguem até que seja alcançada

uma etapa usualmente descrita como terminação.

As equações de 3 a 6, representam como estas reações com espécies

não-radicalares podem ocorrer :

a) Adição de um radical a outra molécula

[

]

•

−→+ YXYX (equação 3)

b) Redução da espécie não-radicalar, por transferência de elétron

−•+•

+→+ YXYX (equação 4)

c) Oxidação da espécie não-radicalar por abstração de elétron

−+••

+→+ OHPRHOPR (equação 5)

d) Abstração de H de uma ligação R-H

OHRHORH

+→+

••

(equação 6)

Em células, as reações radicalares podem fornecer radicais livres do tipo

tio, oxigênio, carbono ou nitrogênio-centradas, devido à presença de

grupos SH, OH, NH e CH nas mais variadas estruturas químicas

encontradas nas proteínas [Hermes-Lima 2004]. Tem sido reportadas

como principais reações in vivo, as reações de peroxidação lipídica e de

degradação ao DNA.

1.1.3 Técnicas analíticas de detecção

As características físico-químicas das espécies radicais presentes no meio

reacional, podem ser utilizadas no desenvolvimento de técnicas analíticas

de detecção de radicais de oxigênio. No entanto, devido à sua reatividade

frente a outras moléculas e, por conseguinte a seu curto período de

existência, é difícil a medida direta destes radicais in vivo.

A espectroscopia da ressonância paramagnética eletrônica (por vezes

também chamada ressonância de spin eletrônico – RSE) permite a

detecção direta de radicais livres, baseada na interação existente entre

um campo magnético externo e o elétron desemparelhado do radical livre.

Se considerarmos que o elétron possui rotação em torno de seu próprio

eixo, pode-se atribuir à esta partícula um momento angular. Uma vez que

o elétron possui carga, o seu vetor momento angular ( ) está

necessariamente associado a um momento magnético ( ). Na presença

de um campo magnético externo, momentos magnéticos tendem a se

alinhar ao campo buscando atingir um estado de mínima energia.

Mediante a aplicação deste campo magnético, ocorre então uma

separação dos níveis de energia dos estados de spin, chamada de efeito

Zeeman. A condição de ressponância se dá quando a diferença de

energia ∆E entre os estados de spin é igual à energia do fóton da radiação

eletromagnática, ocorrendo assim a absorção de energia e o consequente

espectro de ressonância paramagnética eletrônica [Rettori 2000].

Esta técnica é geralmente pouco sensível para a medição direta de

radicais instáveis do tipo HO

•

e O

•

em sistemas vivos, sendo por outro

lado, suficientemente sensível para medir diretamente espécies mais

estáveis, como por exemplo o radical ascorbil. Um espectro típico do

radical ascorbil pode ser visto na Fig. 10. Contudo, esta dificuldade em

relação aos radicais hidroxil e superóxido pode ser contornada

empregando-se a estratégia chamada “spin-trapping”, na qual estes

radicais são capturados por certas moléculas diamagnéticas (por exemplo

o 5,5-dimetil-1-pirroline-n-oxido - DMPO), no intuito de formar espécies

radicalares mais estáveis chamadas de “spin adduct”, e portanto passíveis

de detecção por RPE [Rice-Evans 1991]. A técnica do spin-trapping pode

ser usado também para gerar produtos hidroxilados mensuráveis por

→

fluorescência, como por exemplo, o benzoato, cujo derivado hidroxilado

fornece um sinal característico a 512 nm [Gutteridge 1987].

Outra alternativa metodológica para a detecção de radicais é o uso de

técnicas de fingerprinting, cujo princípio se baseia na detecção de

produtos de degradação formados pela ação oxidativa das espécies

reativas de oxigênio, os quais são, em sua maioria, compostos

diamagnéticos. Esta é portanto uma detecção indireta, já que não se

mede a espécie radicalar propriamente dita, mas sim o dano por elas

causado. Como exemplo cite-se o ensaio das substâncias reativas ao

ácido tiobarbitúrico (conhecido como TBARS) empregado neste trabalho,

ensaio este que mede a degradação oxidativa do açúcar 2-deoxi-D-ribose

[Halliwell 1987 e Gutteridge 1981].

1.1.4 Antioxidantes

Considerando a toxicidade do O

e a extensão na qual o mesmo é

utilizado nos processos metabólicos, pode-se supor que os organismos

aeróbicos somente são capazes de sobreviver sob uma atmosfera rica em

, graças ao desenvolvimento de eficientes sistemas de defesa

antioxidante. A existência de substâncias capazes de minimizar os efeitos

oxidantes deste gás sobre os componentes celulares é portanto de crucial

importância para a manutenção da vida aeróbica na terra.

Por outro lado, há autores que mencionam que uma proteção demasiada

por parte destes antioxidantes pode ser conflituosa do ponto de vista

evolutivo, já que esta defesa excessiva poderia prevenir alterações

oxidativas do DNA as quais poderiam levar a mutações gênicas e

eventualmente à outras estruturas celulares [Harman 1981].

A definição exata de antioxidante é pouco clara, por ser este um termo

bastante abrangente e arraigado em diversas áreas do conhecimento, as

quais vão desde a curadoria de museus e restauração de obras de arte, à

indústria petroquímica, passando pela ciência de alimentos. Cada uma

destas áreas tem sua própria visão sobre o que seria um bom

antioxidante. Em termos biológicos, propõem-se comumente que um

antioxidante é “qualquer substância que, quando presente em baixas

concentrações comparadas àquelas de um substrato oxidável,

significativamente previne a oxidação deste substrato” [Halliwell e

Gutteridge 2000]. O termo “substrato oxidável” se refere a todo tipo de

molécula encontrada in vivo.

De qualquer modo, os sistemas de defesa antioxidante dos organismos

vivos podem ser divididos em quatro subclasses [Hermes-Lima 2004]:

i) Defesas antioxidantes primárias de natureza enzimática e não-

enzimática, que estão diretamente relacionadas às espécies reativas

de oxigênio. Como exemplo cite-se a atividade das enzimas catalase

(ação sobre H

), e superóxido dismutase – SOD, (ação sobre O

•

além das vitaminas E (alfa-tocoferol, com ação sobre radicais peroxil)

e C (ácido ascórbico, com ação sobre ozônio e hidroxil).

ii) Defesas auxiliares que dão suporte ao funcionamento das defesas

antioxidantes primárias, por exemplo, reciclando ou sintetizando

substratos de enzimas antioxidantes. É o caso também da vitamina C

a qual participa da reciclagem de alfa-tocoferol.

iii) Proteínas complexantes de metais (ferritina e transferrina) ou

compostos de baixa massa molar que previnem ou minimizam a

participação de metais na geração de radicais, devido a sua ação

quelante (Desferoxamina – DFO);

iv) Sistemas de reparo enzimático capazes de reconstituir biomoléculas

degradadas, especialmente DNA oxidado (endonucleases e DNA

glicosilases).

É importante ressaltar que a maioria das defesas antioxidantes não-

enzimáticas não são sintetizadas endogenamente por animais, devendo

ser obtidas a partir da dieta. Portanto verifica-se a existência de uma

relação íntima entre nutrição e defesa antioxidante. O reino vegetal dispõe

de uma imensa gama de compostos com potencial atividade antioxidante

in vivo (apesar de muitos outros compostos oriundos de plantas

apresentarem também atividade pró-oxidante in vitro). Estes compostos

vegetais têm em geral grande importância na dieta, como é o caso dos

polifenóis, discutidos ao longo deste trabalho.

1.2 PIH

1.2.1 Histórico

A piridoxal isonicotinoil hidrazona (PIH) foi descrita originalmente em 1954

por Sah, em estudos de síntese orgânica, sendo produto de uma reação

de condensação do piridoxal com a isoniazida [Sah 1954]. Porém

somente a partir de 1979 o interesse por esta substância cresceu

consideravelmente, quando Ponka e outros pesquisadores relataram a

capacidade da PIH em mobilizar ferro acumulado em reticulócitos e induzir

a excreção biliar deste metal em ratos [Ponka et al. 1979 e Cikrt et al.

1980]. Neste ponto é interessante mencionar que tal descoberta se deu

em grande parte graças a uma “serendipidade”, uma vez que Ponka

estudava o metabolismo de ferro em ratos tratados concomitantemente

com um co-fator da vitamina B6 (piridoxal-5-fosfato) e com ácido

isoniazídico, uma droga usada no tratamento da tuberculose.

A partir de então diversos estudos clínicos foram conduzidos com a PIH

numa tentativa de caracterizar seu potencial farmacológico como

alternativa eficiente no tratamento de doenças correlacionadas ao

acúmulo de ferro, tais como beta-talassemia e hemocromatose. Neste

contexto, apenas a substância Desferoxamina (DFO) era usada como

fármaco, em um processo terapêutico relativamente caro e de baixo

rendimento em termos de absorção intestinal [Pippard 1989]. Estudos

recentes apontam também para o uso clínico da substância Deferiprona

(DFP) combinada com o DFO no tratamento destas doenças [Kattamis

2005 e D´Angelo 2004]. Atualmente, novos modos de administração do

DFO foram desenvolvidos, o que propiciou um considerável incremento na

comodidade do tratamento [Yarali et al. 2006]. Porém o tratamento

continua tendo um alto custo, o que dificulta sua popularização.

A PIH revelou-se ser um potente ligante de ferro intracelular, com alta

afinidade e seletividade por este metal, além de possuir estabilidade em

condições fisiológicas e razoável permeabilidade à biomembranas,

facilitando sua absorção e excreção [Johnson et al. 1982 e Brittenham

1990]. Estas características, aliadas à inexistência de efeitos colaterais

em estudos toxicológicos, são extremamente desejáveis do ponto de vista

clínico.

Conforme já discutido anteriormente a respeito da reação de Fenton, a

habilidade de um composto em induzir balanço negativo de ferro no

organismo, é especialmente importante na prevenção de danos oxidativos

em estruturas celulares causados por EROs. Na medida em que o ferro

exerce papel preponderante na formação de oxi-radicais, estando

envolvido em diversas patologias de cunho oxidativo, um eficiente

quelante de ferro é um potencial agente antioxidante.

Diante deste cenário, Schulman e Hermes-Lima investigaram as

propriedades antioxidantes da PIH in vitro, correlacionando-as à sua

capacidade quelante [Schulman 1995 e Hermes-Lima et al. 1998].

Estudos com simulacros biológicos evidenciaram a habilidade da PIH em

prevenir danos ao DNA [Hermes-Lima et al. 1998] e inibir a peroxidação

lipídica em mitocôndrias [Santos 2001].

1.2.2 A ação antioxidante da PIH

A PIH é um ligante tridentado que forma um complexo bastante estável

com Fe(III) [Avramovich-Grisaru 1985] (Fig. 1).

Conforme o modelo de simulação, os seis sítios do cátion Fe(III) estão

coordenados formando um complexo [Fe(PIH)

]

, sendo o grupo

carbonila, o nitrogênio da hidrazona e a hidroxila fenólica, os principais

sítios ligantes (apesar do nitrogênio da piridina ser usualmente um bom

sítio complexante, supõem-se que devido a um impedimento estérico tal

não ocorra no caso da PIH).

Em meios aquosos com pH próximo de 7 a literatura relata que podem ser

encontradas coexistindo as seguintes substâncias : H

L (forma neutra) e

(forma monodesprotonada) [Murphy et al 1985]. Cada uma destas

espécies de PIH pode coordenar-se aos íons férricos gerando um

complexo numa proporção ligante:metal igual a 2:1. Gomes relata a

formação de pelo menos dois complexos diferentes a partir da oxidação

do complexo ferroso [Gomes 2005].

Baseado na comparação da PIH com outros ligantes metálicos e com

seqüestradores de oxi-radicais clássicos, Hermes-Lima e colaboradores

sugerem que o mecanismo de ação antioxidante da PIH se deve à sua

habilidade quelante, apesar de não excluir a possibilidade de reação

direta da PIH com o radical hidroxil via hidroxilação do anel aromático

[Hermes-Lima et al. 1998].

Fig. 1. Representação esquemática da Piridoxal Isonicotinoil Hidrazona –

PIH,

evidenciando os sítios ligantes de íons Fe.

Consideremos que sistemas contendo Fe(III)-EDTA, ascorbato e oxigênio

dissolvido são capazes de gerar radicais hidroxil, segundo as reações

descritas nas equações 7-10 :

ascorbilEDTAIIFeAscorbatoEDTAIIIFe +−→+− )()( (equação 7)

−•

+−→+−

)()( OEDTAIIIFeOEDTAIIFe (equação 8)

2222

22 OOHHO +→+

−•

(equação 9)

•−

++−→−+ HOOHEDTAIIIFeEDTAIIFeOH )()(

(equação10)

Foi então proposto que o PIH quebraria a cadeia de reações acima

descrita, removendo o íon férrico do co-quelante EDTA e formando o já

mencionado complexo mais estável [Fe(PIH)

]

conforme a equação 11 :

)(2)( PIHIIIFeEDTAPIHEDTAIIIFe −+→+− (equação11)

Tal complexo seria estável o suficiente para minimizar de forma relevante

a redução do Fe(III), suprimindo portanto a formação do radical hidroxil,

produto final das reações de 7 a 10.

1.2.3 Fatos novos acerca da PIH

As características ferro-mobilizadoras e antioxidantes relatadas acerca da

PIH desde a década de 80, aliadas à sua capacidade de se comportar

com desenvoltura em sistemas biológicos, sem dúvida nenhuma alçaram

este composto à condição de “bom mocinho” em avaliações clínicas para

fins terapêuticos. No entanto, diversos estudos recentes tem revelado que

os efeitos biológicos deste quelante, entre eles a sua toxicidade in vivo,

têm sido sistematicamente subestimada [Buss 2002]. Desta forma, um

lado menos benéfico da PIH tem ficado obscurecido desde a descoberta

de 1979.

Uma das principais causas desta avaliação inconsistente do

comportamento bioquímico da PIH se deve principalmente à capacidade

deste composto em sofrer reações de hidrólise, quer em meio ácido, quer

em meio básico. Estudos espectrofotométricos revelaram que os produtos

desta reação são na verdade os precursores sintéticos da PIH,

estebelecendo-se portanto um equilíbrio químico entre a hidrólise e a

condensação [Buss e Ponka 2002].

Buss descreve que em função desta reação, as concentrações efetivas de

PIH nos experimentos de mobilização de Fe provavelmente são bem

menores menores do que as originalmente relatadas, uma vez que estes

experimentos foram conduzidos em condições nas quais a hidrólise ocorre

em uma extensão significativa. Por outro lado, no caso dos estudos de

toxicidade, a concentração de PIH nos quais se verificou inibição do

crescimento celular foram subestimadas, já que as concentrações de PIH

remanescente no meio reacional são bem menores que as concentrações

iniciais. De qualquer forma, a hidrólise da PIH não tem significativo

impacto e relevância para fins deste presente trabalho, já que em pH

próximo do neutro, a reação de hidrólise ocorre muito mais

vagarosamente [Richardson et al. 1989].

Adicionalmente, em estudos subsequentes descreve-se a capacidade da

PIH e análogos em induzir a apoptose em células hematopoiéticas devido

à suas propriedades de quelante de ferro [Buss et al. 2003]. Nesse

referido estudo, é estabelecida uma relação entre a toxicidade celular da

PIH e a sua interação com o ferro intracelular, já que o tratamento de

linfócitos Jurkat T com complexos Fe(III)-(PIH)

, levou à morte celular.

Considerando que a PIH é capaz de mobilizar ferro de células, ocorre em

consequência uma acumulação do complexo Fe-quelante no citosol

(acumulação esta aumentada com a lipofilicidade do complexo). Desta

forma, presume-se que o estresse oxidativo causado pelo acúmulo

intracelular do complexo Fe-quelante seja o responsável pela toxicidade

verificada [Buss et al. 2004].

Somando-se aos efeitos indesejados da PIH, Gomes relata que apesar da

PIH ter apresentado eficiente ação antioxidante na autoxidação de Fe(II),

foi verificado um significativo efeito pró-oxidante em baixas

concentrações de tampão fosfato [Gomes 2005]. Sistemas contendo Fe(II)

e PIH promoveram uma maior degradação da 2-DR quando as

concentrações de tampão fosfato ficaram abaixo de 1 mmol/L.

Similarmente, em estudos de EPR Gomes e colaboradores verificaram

que em baixas concentrações de fosfato, ocorre a formação de espécies

radicalares quando em presença de PIH.

Outro fato observado por Gomes é que a PIH promove a oxidação do

Fe(II), na presença de tampão fosfato, sem permitir no entanto que esta

oxidação esteja envolvida em uma excessiva formação de EROs [Gomes

2005]. Esta oxidação do Fe(II) pode possivelmente ser causada pela

própria PIH, tendo sido observada a formação de um complexo ferroso

(na proporção 1:1) menos estável que o férrico. Foi então postulado que o

complexo Fe(II)-PIH é rapidamente oxidado a Fe(III)-(PIH)

, em

decorrência da PIH promover a diminuição do potencial redox do par

/Fe

. Assim, o Fe(II) presente no meio seria rapidamente convertido

ao complexo férrico de PIH. Eliminando-se o Fe(II) ou mesmo Fe(II)-PIH

presente para reagir com o peróxido de hidrogênio gerado in situ, a

produção de EROs ficaria desta forma inibida.

É interessante notar que em estudos espectrofotométricos, Gomes aponta

que o complexo formado entre Fe(III) e PIH a partir da oxidação de Fe(II)

é estruturalmente diferente daquele formado pela reação direta de Fe(III)

com a PIH.

1.3 Polifenóis

Os compostos polifenólicos, ou simplesmente polifenóis, são geralmente

descritos na literatura como aqueles pertencentes a um vasto grupo de

compostos encontrados na natureza, os quais possuem como

característica principal a presença de múltiplos grupos funcionais do tipo

fenol [Tuckmantel 1999]. Os polifenóis estão usualmente presentes em

plantas como produtos do metabolismo destas, exercendo papel

importante na morfologia e fisiologia vegetais, na medida em que estão

relacionados a diversos aspectos do crescimento e reprodução vegetal

[Bravo 1998]. Entre uma de suas funcionalidades mais interessantes está

a capacidade de proteger as plantas contra patógenos e predadores

herbívoros (alguns compostos podem atuar como toxinas naturais ou

conferir sabor indesejado ao alimento tornando-o menos palatável) [Bravo

1998] e principalmente contra estresse fotossintético e formação de

espécies reativas de oxigênio [Yang et al. 2001].

Baseado em sua estrutura química, os polifenóis podem ser divididos em

pelo menos dez diferentes classes, sendo que as principais são os

flavonóides, taninos e ácidos fenólicos e derivados.

Flavonóides

Classe com maior número de substâncias conhecidas e cuja estrutura

básica consiste de dois anéis aromáticos ligados entre si por três

carbonos os quais geralmente formam um heterociclo oxigenado.

Subdividem-se em flavonas, catequinas, isoflavonas, flavonóis e

antocianinas [Bravo 1998]. A Fig. 2 apresenta as fórmulas estruturais

básicas dos flavanóis, flavonóis e isoflavonas, principais subclasses dos

flavonóides.

Taninos

São compostos de massa molar relativamente alta e se apresentam

intensamente hidroxilados. Podem formar complexos insolúveis com

carboidratos e proteínas, inclusive as proteínas salivares, sendo esta a

razão de sua característica adstringente ao paladar. Um composto de

especial interesse no que diz respeito à capacidade antioxidante é o ácido

tânico - AT, que demonstrou possuir efeito em reações oxidativas

mediadas por íons metálicos [Lopes et al. 1999].

Ácidos Fenólicos

Classe subdivida em ácidos hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos. Nas

plantas usualmente ocorrem na forma de ésteres os quais podem ser

ambos solúveis (acumulando-se em vacúolos) ou insolúveis

(componentes da parede celular). Dentre os ácidos hidroxibenzóicos os

mais importantes são os ácidos elágico e gálico, os quais estão presentes

principalmente em frutas vermelhas e castanhas/nozes [Maas 1991].

Fig. 2. Representação esquemática dos flavanóis, flavonóis e isoflavonas, principais

subclasses dos flavonóides (Yang et al. 2001).

Os representantes mais importantes dos ácidos hidroxicinâmicos são o

ácido caféico (AC) e o ácido ferúlico presentes no café e em diversas

frutas.

Os derivados dos ácidos hidroxicinâmicos são também muito abundantes,

tais como o ácido clorogênico (originário da reação do ácido caféico com o

ácido quínico), o qual representa cerca de 7% do conteúdo dos grãos do

café e é um importante substrato na oxidação enzimática responsável

pelo escurecimento de frutas como maçã e pêra [Yang et al. 2001]. Este

derivado caféico está especialmente presente em grande quantidade nos

diversos grãos e sementes [Sondheimer 1958]. Os principais compostos

da sub-classe dos ácidos hidroxicinâmicos estão representados na Fig. 3

abaixo:

1.3.1 Dieta e biodisponibilidade

Por estarem amplamente distribuídos nas mais diversas espécies de

vegetais, os polifenóis constituem-se em um importante componente da

dieta humana. A tabela 1 a seguir, fornece dados quantitativos da

distribuição dos principais polifenóis em alguns alimentos selecionados

[King e Young 1999]. Salienta-se que enquanto a maioria dos compostos

descritos na tabela 1 têm suas quantidades expressas em partes por

milhão (ppm ou mg/kg), os ácidos hidroxicinâmicos quantificados no café

em grãos estão expressos em g/kg, evidenciando sua forte presença

neste fruto.

Fig. 3. Representação e

squemática do ácido caféico (1), ácido ferúlico (2) e ácido

clorogênico (3), principais componentes dos ácidos hidroxicinâmicos.

(1) (2) (3)

Classes e

Subclasses

Compostos Alimentos Quantidade

Flavonóides

Azeitona

270-830 mg/kg

Cebola

347 mg/kg

Alface

308 mg/kg

Tomate Cereja

17-203 mg/kg

Brócolis

102 mg/kg

Maçã

21-72 mg/kg

Feijão

49 mg/kg

Endívia

46 mg/kg

Chá (folhas)

30-45 g/kg

Flavonóis

Quercetina, kaempferol,

miricetina

Chá (preto)

20 mg/L

Aipo

130 mg/kg

Flavonas Apigenina, Luteolina

Azeitona

6-29 mg/kg

Pêra

70-420 mg/kg

Vinho tinto

274 mg/L

Chá (folhas)

128-226 g/kg

Vinho branco

35 mg/L

Flavanóis Catequina, Epicatequina

Maçã

23-30 mg/kg

Soja (grão seco)

888-2407 mg/kg

Tofu

280-499 mg/kg

Miso

256-540 mg/kg

Proteína Text.

Soja

1175-1191

mg/kg

Isoflavonas Genisteina, Daidzeina

Leite soja

105-251 mg/L

Ácidos Fenólicos

Mirtilo

1881-2112 mg/kg

Cereja

290-1280 mg/kg

Pêra

44-1270 mg/kg

Maçã

2-258 mg/kg

Laranja

21-182 mg/kg

Batata

100-190 mg/kg

Grapefruit

25-60 mg/kg

Ácidos

Hidroxicinâmicos

Caféico, Ferúlico,

Clorogênico,

Neoclorogênico

Café (grãos)

56 g/kg

Framboesa

19-102 mg/kg

Ácidos

Hidroxibenzóicos

Elágico, Gálico

Morango

21-89 mg/kg

Lentilha

3800 mg/kg

Vinho tinto

2567 mg/L

Vinho branco

239 mg/L

Taninos

Polímeros da Catequina

e Epicatequina

Suco maçã

8-87 mg/L

Tabela 1. Distribuição dos principais polifenóis em alguns alimentos

Por diversas razões, incluindo a grande diversidade estrutural, a ausência

de métodos analíticos devidamente validados e a significativa variação na

composição que ocorre em cada alimento, tem sido extremamente difícil

estimar a média de ingestão diária de polifenóis [Scalbert e Williamson

2000]. Grande parte dos autores se refere a dados publicados cerca de 30

anos atrás, quando foi estimada uma ingestão fenólica diária total de 1 g

em dietas ocidentais [Kuhnau 1976]. Tem sido relatado que frutas

geralmente são mais ricas em polifenóis que vegetais, razão pela qual

uma grande fonte alimentar de polifenóis é o consumo regular de bebidas

tais como café, vinho tinto e sucos de frutas, além de chás [Scalbert 2000

e Macheix et al. 1990]. Os ácidos fenólicos compreendem cerca de um

terço dos compostos fenólicos da dieta humana, sendo os outros dois

terços correspondentes à ingestão de flavonóides. Porém esta proporção

depende fortemente do consumo de café [Clifford 1999], uma vez que

consumidores inveterados desta bebida estarão ingerindo mais ácidos

fenólicos que flavonóides.

No entanto, independentemente da ingestão, as propriedades biológicas

dos polifenóis somente serão aproveitadas se a biodisponibilidade dos

mesmos for favorável. A estrutura química dos polifenóis e a composição

da microflora intestinal determinam a taxa e a extensão da absorção e a

natureza dos metabólitos circulantes no plasma [Scalbert 2000]. A medida

direta da concentração destes compostos no plasma e urina e a medida

do aumento da capacidade antioxidante do plasma após sua ingestão,

podem fornecer evidências de sua absorção no trato gastrointestinal.

Estudos apontam para o fato de que principalmente polifenóis de alta

massa molecular ou aqueles ligados a fibras alimentares e proteínas e

que permanecem insolúveis em solventes do tipo água, metanol ou

acetona aquosa, são menos biodisponíveis. Um exemplo é o caso de

taninos condensados, que normalmente se apresentam na forma de

oligômeros ou polímeros [Bravo 1998]. No entanto a enorme variedade de

compostos do grupo dos polifenóis, bem como a sua ocorrência natural

sob a forma de misturas complexas de compostos fenólicos em diversas

matrizes, tem sido uma dificuldade no estudo da biodisponibilidade destas

substâncias.

1.3.2 Ação antioxidante

Exatamente por se constituírem em fundamentais contribuintes da dieta,

os primeiros estudos dos polifenóis estavam em sua maioria relacionados

ao efeitos antinutricionais destes compostos, como por exemplo à

diminuição na absorção e digestibilidade de alimentos devido a

capacidade destes compostos de se ligar e precipitar minerais e

macromoléculas tais como proteínas e carboidratos [Yang et al. 2001].

Mais recentemente o interesse principal tem recaído sobre o fato de que

diversos compostos deste grupo revelaram possuir atividades

antioxidantes, antiinflamatória e anticarcinogênicas.

Diversos estudos epidemiológicos tem sugerido associações entre uma

dieta com alimentos ricos em polifenóis e a prevenção de doenças: O

consumo de chá pode evitar o câncer [Steinmetz 1996] e disfunções

cardíacas [Tjiburg 1997], assim como o consumo de uva e derivados

pode prevenir doenças cardiovasculares [Criqui 1994]; frutas e verduras

estão há muito associadas à prevenção de cânceres [Steinmetz 1996 e

Renaud et al. 1992] e a soja pode impedir o aparecimento de câncer de

mama e osteoporose [Adlercreutz et al.1997].

Muitos destes efeitos benéficos relacionados à prevenção de diversas

enfermidades estão associados à própria natureza química deste grupo

de compostos: devido à sua estrutura, polifenóis são em geral bons

agentes redutores e juntamente com outros agentes redutores

encontrados na dieta tais como vitamina C, vitamina E e carotenóides,

podem proteger tecidos e estruturas celulares contra danos oxidativos.

Deste modo, a habilidade destes compostos em prevenir doenças

conhecidamente associadas ao estresse oxidativo, tais como cardiopatias,

alguns tipos de câncer e processo inflamatórios podem estar vinculadas

às propriedades antioxidantes dos polifenóis reportadas recentemente.

Proteção contra a peroxidação de LDL pode ser útil no caso de doenças

cardíacas, enquanto que compostos com potencial de proteção contra

danos oxidativos ao DNA podem ser relacionados ao tratamento contra

cânceres ou disfunções genômicas.

Como já discutido, vários mecanismos antioxidantes responsáveis pelo

decréscimo da toxicidade de oxigênio celular podem estar operando em

sistemas biológicos. No entanto os principais contribuintes da ação

antioxidante total são i) à habilidade de moléculas em capturar espécies

radicalares e ii)habilidade em quelar íons metálicos envolvidos na geração

destas mesmas espécies radicalares.

Os compostos polifenólicos são reconhecidos por possuir atividade

antioxidante devido a sua habilidade em “seqüestrar” radicais livres,

interrompendo por exemplo a reação radicalar em cadeia da peroxidação

lipídica [Rice-Evans 1996]. Estes compostos interferem nas reações de

oxidação de lipídios e outras moléculas por meio de uma rápida

transferência de átomos de hidrogênio aos radicais como por exemplo

hidroxil e peroxil.

Em termos estruturais, os principais responsáveis por esta atividade são

os dois grupos hidroxila na posição 3´,4´ do anel B, a dupla ligação em

conjugação com um grupo cetônico no carbono 4 do anel C e os grupos

hidroxila dos carbonos 5 e 7 do anel A, no caso dos flavonóis (Fig. 4).

Fig.4. Representação dos anéis A, B e C e dos carbonos da estrutura básica dos flavonóis

Considerando o caso dos ácidos fenólicos, a estrutura hidroxifenólica

conjugada com a dupla ligação da cadeia de ramificação, tem sido

reportada como o principal componente da atividade antioxidante [Rice-

Evans 1996].

Segundo Rice-Evans et al. em ensaios de TEAC

‡

(capacidade

antioxidante equivalente ao Trolox) de modo geral, a inserção de um

grupo etilênico entre um anel fenólico contendo um grupo p-hidroxila e o

grupo carboxilato, tem um efeito fortemente favorável nas propriedades

redutoras do grupo OH e portanto na capacidade de estabilizar uma

espécie reativa de oxigênio. Curiosamente os mesmos estudos indicaram

também que a introdução de mais um grupo hidroxila em posição vicinal

ao grupo p-hidroxi diminui a atividade antioxidante em fase aquosa

segundo o ensaio da TEAC, porém aumenta a atividade antioxidante em

sistemas lipofílicos [Rice-Evans 1996]. Este fatos têm grande impacto no

mecanismo de ação do AC, conforme será discutido ao longo desta

seção.

Seja como for, nestes casos em que polifenóis tem sua capacidade

antioxidante devido a sua ação como seqüestradores de radicais, pode-se

dizer que em geral a eficiência dos mesmos em prevenir danos oxidativos

depende diretamente da sua habilidade em formar intermediários estáveis

após reação com os radicais.

Outro mecanismo de ação antioxidante dos compostos polifenólicos de

especial relevância é a sua capacidade de se ligar a metais tais como íons

ferro e cobre, impedindo ou minimizando a participação destes em

reações de Fenton. É o caso do AT, para o qual foi demonstrada sua

habilidade em inibir a formação de radicais hidroxil devido a sua ação

complexante de íons ferro [Lopes et al. 1999].

‡

O valor TEAC é definido como a concentração milimolar (mmol/L) de uma solução de Trolox, que

possua a mesma capacidade antioxidante de 1 mmol/L da solução da substância em estudo.

No entanto, dicotomicamente a interação dos polifenóis com metais pode

conferir aos mesmos uma característica pró-oxidante em alguns casos.

Compostos dos grupos dos flavonóides e ácidos fenólicos por exemplo,

demonstraram ser antioxidantes inibindo a formação de radicais peroxil e

hidroxil em diferentes sistemas oxidantes, porém na presença de Cu

mesmos se revelaram pró-oxidantes [Cao et al. 1997 e Yamanaka 1997],

provavelmente devido a reações de redução de Cu

a Cu

induzidas pelo

polifenol, abrindo caminho para reações do tipo Fenton. Andrade Jr, em

estudos sobre a capacidade do AT em prevenir danos oxidativos ao DNA

induzidos por íons cobre, verificou um efeito pró-oxidante deste polifenol e

também do complexo AT-Cu em presença de DNA [Andrade Jr 2004].

Esta atividade pró-oxidante induzida por metais, pode desempenhar um

papel central nas já referidas patologias metalo-acumuladoras.

No entanto é importante ressaltar que uma proteção contra a ação de

algumas espécies radicais in vitro, não necessariamente implica em

proteção contra danos oxidativos em células. Por exemplo, Pool-Zobel

descreve que tanto compostos isolados quanto amostras complexas de

plantas contendo várias antocianinas e antocianidinas se mostraram

potentes antioxidantes in vitro. Porém, pelo menos em células tumorais do

colon humano, este grupo de compostos não foi capaz de minimizar o

dano oxidativo endógeno ao DNA [Pool-Zobel 1999].

Da mesma forma, pequena atividade antioxidante in vitro, também não

necessariamente significa que um composto não seja responsável por

ação antioxidante in vivo. Cite-se o fato de que a interação de flavonóides

tais como quercetina e catequina, com espécies antioxidantes

intracelulares do tipo glutationa peroxidase (GPx) pode aumentar

significativamente a atividade antioxidante destas [Ferguson 2001 e

Nagata 1999]. Neste sentido, a indução de enzimas também pode ter

papel importante, como por exemplo no caso da genisteina que pode

induzir a expressão de metalotioneina (uma proteína ligante de metais

com propriedades antioxidantes) em células Caco-2 [Kuo et al. 1999 ].

1.3.3 Toxicidade

A despeito de diversos estudos revelarem uma gama de efeitos benéficos

dos polifenóis, principalmente relacionados às propriedades antioxidantes

destes compostos, cabe referenciar a antiga afirmação atribuída a

Paracelso a respeito do uso terapêutico de qualquer substância : “a

diferença entre o veneno e o remédio está na dose administrada”.

Infelizmente, os potenciais efeitos tóxicos decorrentes da excessiva

ingestão de flavonóides são comumente ignorados. Em doses altas,

flavonóides podem agir como mutagênicos, geradores de radicais livres, e

inibidores de enzimas chave do metabolismo de hormônios [Skibola et al.

2000].

Diversos estudos recentes tem revelado que além da atividade

antioxidante apresentada pelos polifenóis, estes compostos uma vez

presentes em sistema biológicos, podem possuir outros mecanismos de

ação. Galati relata toxicidade mitocondrial associada a uma capacidade

dos polifenóis em promover o colapso do potencial da membrana

mitocondrial [Galati et al. 2004]. Já Skibola, descreve a habilidade de

flavonóides em inibir enzimas associadas ao DNA, como por exemplo a

topoisomerase [Skibola 2000]. A síntese de tiroxina também é inibida por

certos polifenóis, os quais agem como substratos alternativos na

iodinação da tirosina, dando lugar a formação de mono, di ou tri-iodo-

isoflavonas [Divi et al. 1996]. Neste mesmo estudo, demonstrou-se que os

flavonóides podem inibir irreversivelmente a tireoide-peroxidase, a qual é

essencial para a síntese do hormônio da tireóide.

Apesar da toxicidade mitocondrial estar associada a uma atividade

anticarcinogênica (alterações na permeabilização da membrana

mitocondrial estão relacionadas à promoção de apoptose, sendo que a

indução da apoptose por sua vez, suprime o desenvolvimento do câncer),

os comportamentos acima descritos abrem espaço para uma melhor

avaliação do potencial tóxico dos mesmos.

Neste sentido, curiosamente compostos fenólicos podem ser ambos

antioxidantes ou pró-oxidantes, o que sugere que uma dieta rica em

flavonóides e outros polifenóis pode se constituir mais em um risco

oxidativo que em benefício [Decker 1997]

Tem sido verificado que compostos fenólicos presentes na dieta, podem

agir como pró-oxidantes em sistemas contendo metais com potencial

redox fisiologicamente relevante. Na presença de oxigênio, metais de

transição tais como cobre e ferro catalisam o ciclo redox de polifenóis,

levando a formação de EROs e radicais fenoxil que podem atacar o DNA,

lipídeos e outras moléculas biológicas [Galati 2004]. Em presença de

metais de transição, foi verificado que flavonois com grupos galoil ou

catecol também são capazes de se autoxidar levando à degradação de

LDL [Galati 2004]. No mesmo estudo, o composto epigalocatequin-galato,

se mostrou capaz de induzir a geração de H

e o subseqüente dano ao

DNA celular.

Tais comportamentos pró-oxidantes serão de relevante interesse na

discussão dos resultados obtidos neste trabalho.

1.3.4 Ácido caféico

Dentre os ácidos hidroxicinâmicos, aquele mais comumente encontrado e

de maior representatividade na dieta é o ácido caféico (AC), composto

sensível ao calor [Dimberg et al. 1996] e produzido a partir da L-

fenilalanina ou L-tirosina, conforme a Fig. 5.

Apesar do nome que o remete ao café, pode também ser encontrado em

frutas e vegetais como maçã, ameixa, uvas e tomates, sendo possível

isolá-lo das folhas de Alsophila spinulosa, uma pteridófita originária da

China, com propriedades já descritas para o tratamento de hepatite, gota

e reumatismo [Chiang et al. 1994].

Os estudos acerca dos efeitos fisiológicos do AC incluem relatos sobre a

sua capacidade de atuar como antiinflamatório [Chen et al. 1995], inibidor

da xantina-oxidase [Chiang 1994], ligante metálico [Nardini et al. 1995] e

como agente protetor contra citotoxicicidade induzida por peróxido de

hidrogênio [Nakayama 1994]. Estudos com AC em sistemas lipídicos

indicaram um potencial deste polifenol em atenuar a oxidação de

lipoproteínas de baixa densidade [Castellucio et al. 1996 e 1995] e mesmo

inibir a oxidação de LDL catalisada por íons metálicos [Nardini 1995].

1.3.4.1 Aspectos estruturais

No que diz respeito ao potencial antioxidante do AC, sua atividade anti-

radical está intrinsecamente correlacionada à sua estrutura molecular,

tanto em função de sua capacidade de estabilizar por ressonância o

radical fenoxil gerado pela doação do seu H fenólico, quanto em função

Fig.5. Precursores biosintéticos do ácido caféico (Rice-Evans 1996)

de sua capacidade de interagir com metais indutores de reações de dano

oxidativo.

Estudos de análise conformacional por métodos ab initio (otimização da

geometria da molécula e cálculo de suas freqüências vibracionais, por

meio de métodos computacionais), revelam que as energias calculadas

para o AC e moléculas similares sugerem uma clara preferência por uma

geometria planar em um sistema completamente conjugado [Fiúza et al.

2004 e VanBesien et al. 2003]. Segundo estes estudos, esta preferência

pela planaridade é previsível, uma vez que favorece a deslocalização de

elétrons através de um sistema π expandido, estabilizando a molécula e

fornecendo energias conformacionais mais baixas. Esta estabilidade

molecular por deslocalização de elétrons em sistemas π conjugados, está

fortemente correlacionada a capacidade antioxidante do AC,

principalmente no que diz respeito a estabilização de radicais fenoxil.

Hotta por meio de estudos eletroquímicos demonstrou que o número n de

elétrons envolvidos nas reações de oxidação do AC é igual a 2 em pH

menor do que 7, porém este número aumenta consideravelmente com o

aumento do pH [Hotta 2001]. O número de 2 elétrons obtido por ensaios

voltamétricos é consistente com o numero de hidroxilas fenólicas deste

composto e, portanto com o mecanismo proposto na Fig. 6 abaixo:

Os valores de n mais altos observados em pH maior que 7 sugerem que

em meio alcalino os polifenóis com grupos catecol estão sujeitos à alguma

reação química (a qual se revelou irreversível segundo os estudos

voltamétricos). Isto de algum modo altera sua estrutura, provavelmente

em termos do número de hidroxilas [Hotta 2001]. Foi então proposto uma

reação de dimerização como principal geradora dos produtos de oxidação

Fig.6. Mecanismo proposto para oxidação do AC (Hotta 2001)

do AC em pH alcalino. Esta reação está em concordância com dados de

espectroscopia Raman os quais confirmam a possibilidade da existência

de estruturas diméricas (também previstas nos cálculos ab initio)

[VanBesien 2003], corroborando o sugerido por Kokhar (diminuição no

efeito quelante com o aumento da concentração de polifenóis devido à

reações paralelas de dimerização) [Kokhar 2003].

Outra possível explicação para os elétrons adicionais envolvidos na

reação de oxidação do AC em pH maior que 7, é dada conforme o

mecanismo a seguir, expresso pela Fig. 7:

No entanto, como uma das espécies formadas nesta reação é o hidreto, a

energia dos produtos gerados seria bastante alta, o que torna improvável

que a oxidação do AC ocorra por meio deste mecanismo.

Apesar dos estudos iniciais sobre a relação estrutura/atividade de ácidos

fenólicos terem se concentrado na importância do grupo catecol [Chen

1997 e Moon 1998], indicando ser este um grupo importante tanto na

estabilização de radicais livres [Hotta 2001] quanto na complexação de

metais [Kokhar 2003, Hynes et al.2004 e Boilet et al. 2005], o papel do

grupo etilênico e do grupo carboxílico devem também ser avaliados.

Teoricamente a dupla ligação seria importante para a atividade

antioxidante na medida em que a mesma é imprescindível na

estabilização de radicais fenoxil por conjugação, conforme já discutido

[Rice-Evans 1996]. Porém no caso do AC, foi verificado que sua

habilidade antioxidante é relativamente menor que a de análogos sem a

presença da dupla ligação [Hotta 2001 e Rice-Evans 1996]. Esta

observação poderia estar relacionada a impossibilidade do grupo etilênico

Fig.7. Mecanismo alternativo para oxidação do AC

em efetuar rotações livremente, diminuindo assim a eficiência estérica da

molécula em formar quelatos metálicos [Fiúza et al. 2004].

Em relação ao grupo carboxílico, estudos tem demonstrado sua

participação central em algumas reações de complexação do AC com

metais [Boilet 2005 e Khvan 2001], uma vez que esta interação tende a

ser facilitada em meio neutro ou levemente alcalino. Adicionalmente,

estudos espectroscópicos por UV e IR, realizados por estes autores

confirmam a existência de estruturas metal:AC, nas proporções 1:1 (no

caso do metal Pb

) , 1:2 (no caso dos metais Cu

e Zn

), 2:1 (também

no caso dos metais Pb

e Cu

) e 1:3 (no caso de Al

Cabe no entanto salientar que os diversos estudos da interação do AC

com diferentes metais demonstram justamente que extrapolações de um

complexo para outro não podem ser utilizadas no que diz respeito ao sítio

ligante e aos mecanismos de complexação, posto que a natureza do

complexo varia com o íon considerado.

Por fim vale mencionar que a capacidade do AC em interagir com Fe(III)

depende da concentração deste metal. Conforme reportado por Deiana

[Deiana et al. 1995], o AC é capaz de reduzir Fe(III), formando o-quinona

ou decompondo-se completamente. A literatura relata ainda uma

decomposição gradual de complexos Fe(III)-AC [Hynes 2004], conforme o

mecanismo proposto na Fig. 8 a seguir :

Fig.8. Esquema da decomposição do AC mediada por íons Fe(III) (Hynes 2004)

Foi ainda verificada a pouca eficiência do AC em remover Fe(III) de outro

quelante típico, a Desferoxamina [Solinas et al. 1996]. Estas

características do AC podem ser de relevante interesse uma vez que

espécies férricas estão intimamente correlacionadas à presença de

EROS, e influem grandemente na capacidade antioxidante das

substâncias (vide item 1.2 a respeito da PIH).

2. Materiais e Métodos

2.1 Oxidação do Ascorbato

A taxa de oxidação do ascorbato induzida por íons férricos, fornece uma

avaliação indireta da extensão da redução de íons Fe(III) a Fe(II), redução

esta de relevante interesse bioquímico por gerar o reagente de Fenton e

permitir a posterior formação de EROs. As absorbâncias de sistemas

contendo Fe(III) previamente ligado à um co-quelante (EDTA, NTA ou

citrato conforme o caso), tampão Hepes a pH 7,2 e PIH seguido da adição

de ascorbato, foram medidas a 265 nm (comprimento de onda no qual

ocorre absorção de luz por parte do ascorbato) durante 3 minutos. As

respectivas inclinações da reta foram então calculadas, obtendo-se assim

a taxa de oxidação de ascorbato em Abs./min, sendo que os controles

correspondem a sistemas sem adição de PIH. A menos que

expressamente indicado nas figuras, o tempo entre a adição de PIH e

ascorbato foi de cerca de 8 minutos.

Neste ensaio foram utilizadas soluções estoque recém preparadas de PIH

(0,5 e 2 mmol/L) e cloreto férrico (1mmol/L em solução diluída de HCl),

além de soluções de tampão Hepes (20 mmol/L) e Fe(III)-co-quelantes

(EDTA, NTA e Citrato). Todas as medições foram realizadas em

espectrofotômetro Hitachi U-2001 a temperatura ambiente.

2.2 RPE do Radical ascorbil

A formação do radical ascorbil em sistemas reacionais tamponados por 20

mmol/L Hepes a pH 7,2, contendo Fe(III)-EDTA e PIH em diferentes

concentrações, seguidos da adição de ascorbato foi acompanhada por

meio de estudos de ressonância paramagnética eletrônica. A

quantificação do radical ascorbil formado em cada reação foi proporcional

à altura do pico obtido nos espectros, medido em unidades arbitrárias e já

considerada uma linha base do sinal igual a 0,5 unidades arbitrárias. As

medidas foram realizadas em um equipamento Bruker ESP 300 do

Instituto de Física da Universidade Federal de Goiás - UFG, nas seguintes

condições instrumentais: freqüência de microondas de 9,42 GHz,

freqüência de modulação igual a 100 kHz, potencia de microondas de 10

mW amplitude de modulação igual a 0,25 G e um ganho de 6,3.10

Todos os sistemas foram incubados à temperatura ambiente, sendo a

medição iniciada sempre 3,5 minutos após a adição de ascorbato e os

espectros obtidos por acumulação de duas varreduras.

2.3 Dano oxidativo a 2-DR

Utilizou-se o ensaio do TBARS que consiste na degradação oxidativa do

açúcar 2-Deoxi-D-ribose (2-DR) por espécies reativas de oxigênio,

formando entre outros produtos o malondialdeido (MDA), o qual reage em

meio ácido com o ácido tiobarbitúrico (TBA) na proporção de 2:1 formando

um éster com absorção característica a 532 nm [Halliwell 1987 e

Gutteridge 1981].

Neste ensaio utilizaram-se soluções estoque de 2-DR 125 mmol/L

mantidas sob refrigeração, solução de TBA 1% em NaOH 50 mmol/L

preparada a cada 5 dias e solução de ácido fosfórico a 4%. As soluções

estoque de AC 0,5 mmol/L foram preparadas diariamente por dissolução

do composto em água à 45º C. O dano oxidativo à 2-DR foi induzido por

um sistema gerador de radicais, do tipo Fenton, utilizando-se solução de

peróxido de hidrogênio preparada diariamente e solução de sulfato de

ferro (apenas nos experimentos descritos nas figuras 16 e 19, foi utilizado

sulfato de ferro amoniacal) preparada também diariamente.

No caso específico dos ensaios com PIH, não houve adição de reagentes

de Fenton (peróxido e Fe(II)) e sim os precursores, Fe(III) e ascorbato.

Como etapas do ensaio, o açúcar foi colocado no meio contendo a reação

de Fenton, incubando-se a reação a 37º C (ou 100º C) em banho-maria e

posteriormente adicionando-se 500 µL de TBA e ácido fosfórico. O meio

resultante foi levado a fervura por 15 minutos, ao final do qual se

obtiveram soluções cuja coloração é proporcional ao dano oxidativo

causado pelas espécies reativas geradas, podendo-se desta forma

mensurar suas absorbâncias a 532 nm em espectrofotômetros Hitachi U-

2001 e Milton Roy. Utilizaram-se como brancos, dois sistemas : um

contendo todos os reagentes exceto ferro e outro sem DR.

Nos ensaios do AC as reações foram pré-incubadas na presença de Fe(II)

por 15 minutos, exceto quando expressamente mencionado outros

tempos de pré-incubação. Nestes ensaios, todos os sistemas foram

tamponados utilizando-se soluções de uma mistura equimolar de Hepes e

MES com concentrações finais iguais a 20 mmol/L e 8 mmol/L (apenas

nos estudos espectrofotométricos) em dois diferentes pHs : 5,6 e 7,2.

Os dados correspondem à média de três experimentos independentes

(diferentes dias), cada um realizado em triplicata, a menos que

expressamente indicado.

2.4 Redução do complexo Fe(III)-(PIH)

promovida pelo ascorbato

A redução do complexo Fe(III)-(PIH)

promovida pelo ascorbato foi medida

espectrofotométricamente acompanhando-se durante 45 minutos a

diminuição da absorbância a 476 nm, de sistemas contendo Fe(III) e PIH

seguidos da adição de quantidades variáveis de ascorbato (0,1 a 50

mmol/L). A região de 476 nm corresponde ao pico de absorção do

complexo Fe(III)-(PIH)

, conforme descrito na literaura (Hermes-Lima et al.

2000). Os meios reacionais foram mantidos em pH 7,2 pela adição de 5

mmol/L de tampão fosfato. As soluções foram previamente borbulhadas

com gás nitrogênio de modo a prevenir a re-oxidação de íons Fe(II).

3. Resultados e Discussão

3.1 Estudos sobre a ação antioxidante da PIH

3.1.1 Influência da natureza do co-quelante na atividade antioxidante da

PIH

Sistemas contendo 20 mmol/L de tampão Hepes em pH 7,2 e 100 µmol/L

de ascorbato demonstram que 100 µmol/L da PIH conseguem inibir em

cerca de 100%, a oxidação de ascorbato causada por até 20 µmol/L de

Fe-NTA (Fig 9). Porém, a partir deste ponto esta inibição promovida pela

PIH decresce com o aumento da concentração de Fe-NTA, na medida em

que a taxa de oxidação do ascorbato aumenta proporcionalmente.

[Fe(III)-NTA] (µ

µµ

µM)

0 20 40 60 80 100

Oxidação do Ascorbato (A

265

x min

-1

)

0,00

0,05

0,10

0,15

[ Fe(III)-NTA ]

0 25 50 75 100

% Inibição pelo PIH

100

100 µ

µµ

µM PIH

controle

A B

Fig. 9. Dependência da oxidação do ascorbato com a concentração de Fe-

NTA

(Quadro A). Concentrações finais : ascorbato ( 100

µmol/L), Hepes 20 mmol/L pH

7,2), PIH (0 e 200 µmol/L ), Fe-

NTA (variáveis sempre na proporção 1:2). O quadro B

é uma reapresentação dos mesmos dados do quadro A, mostrando o percentual de

inibição da reação de oxidação do ascorbato pela PIH em relação aos controles (sem

PIH).

Comparando estes resultados com aqueles obtidos em sistemas contendo

Fe-EDTA (na proporção 1:1) (Fig 10), observa-se que a proteção da PIH

decresce abruptamente com aumento das concentrações de Fe, sendo

esta proteção diminuída para apenas 20% em concentrações iguais a 20

µmol/L .

% Inibição pelo PIH

0 20 40 60 80

100

0 15 30 45 60 75

0,00

0,03

0,06

0,09

0,12

Oxidação do Ascorbato (A

265

x min

-1

)

[ Fe(III)-EDTA ] (µM)

[ FeIII-EDTA ]

100 µM PIH

controle

Estes resultados são comparáveis àqueles obtidos em ensaios de RPE,

nos quais a extensão da reação de oxidação do ascorbato é

acompanhada por meio da medição do radical ascorbil gerado in situ. A

Fig. 11 , utilizando a técnica da RPE, demonstra que a eficiência da PIH

(200 µmol/L) em prevenir a formação de ascorbil é inversamente

proporcional à concentração de Fe-EDTA.

Fig. 10. Dependência da oxidação do ascorbato com a concentração de Fe-

EDTA

(Quadro A). Concentrações finais : ascorbato ( 100

µmol/L), Hepes 20 mmol/L pH

7,2), PIH (0 e 200 µmol/L ), Fe-

EDTA (variáveis sempre na proporção 1:1). O quadro

B é uma re

apresentação dos mesmos dados do quadro A, mostrando o percentual de

inibição da reação de oxidação do ascorbato pela PIH em relação aos controles (sem

PIH).

[Fe(III)-EDTA ] (µ

µµ

µM )

0 10 20 30 40 50

% inibição

ALTURA DO PICO (unids. arbitrárias)

controle

200 µM PIH

Conforme os resultados expressos nas figuras 9, 10 e 11 foi observado

que a presença da PIH de fato causou um efeito inibitório na oxidação do

ascorbato, porém a eficiência do PIH em prevenir esta oxidação é

dependente da concentração de Fe e principalmente da natureza da

substância co-quelante previamente ligada aos íons férricos. A presença

deste co-quelante de Fe(III) nos sistemas experimentais delineados para

este trabalho é importante pois além de íons Fe(III) serem insolúveis no

pH utilizado, pretendeu-se nestes experimentos simular condições

fisiológicas, nas quais estes íons também não são encontrados em sua

forma livre.

Propõem-se que as reações expressas nas equações 12-15 e 9

descritas a seguir estariam em curso no meio reacional utilizado :

Fig. 11. Dependência da formação do radical ascorbil com a concentração de Fe-

EDTA (dados de RPE). Concentrações finais : ascorbato ( 1mmol/L, adicionado após

30 minutos de pré-incubação), Hepes (20 mmol/L pH 7,2), PIH (0 e 200 µmol/L ), Fe-

EDTA (variáveis sempre na proporção 1:1). O “inset” é uma reapresentação dos

mesmos dados do quadro A, mostrando o percentual de inibição da reação de

oxidação do ascorbato pela PIH em relação aos controles (sem PIH). Dados obtidos

a partir de 4 experimentos independentes

ascorbilQuelanteIIFeAscorbatoQuelanteIIIFe +−→+− )()(

(equação 12)

orbatodehidroascAscorbatoAscorbil +→2 (equação 13)

−•

+−→+−

)()( OQuelanteIIIFeOQuelanteIIFe (equação 14)

2222

22 OOHHO +→+

−•

(equação 9)

•−

++−→−+ HOOHQuelanteIIIFeQuelanteIIFeOH )()(

(equação 15)

Dentro deste cenário, a PIH estaria formando um complexo estável com

os íons Fe(III), competindo pelo ferro com os co-quelantes. Este complexo

Fe-PIH de alguma maneira seria menos suscetível à sofrer redução do

que os complexos com EDTA e NTA, inibindo portanto a reação de

oxidação do ascorbato. No entanto, os resultados da Figura 9, 10

demonstram que a PIH não é capaz de remover Fe(III) do co-quelante

EDTA tão eficientemente como o faz quando o co-quelante é o NTA.

Adicionalmente, a influência do co-quelante também pode ser identificada

pelos espectros de RPE da Fig. 12, nos quais se verifica que na presença

de 5 µmol/L de Fe-NTA (na proporção 1:2) (A e B), a PIH foi capaz de

inibir drasticamente a formação da espécie ascorbil (0,9 Unidades

Arbitrárias – UA, contra 2,33 UA observados nos controles sem PIH, o que

significa cerca de 61% de inibição). Contrariamente, sistemas contendo

PIH em presença de 5µmol/L de Fe-EDTA (na proporção 1:1),

apresentaram apenas cerca de 25%de inibição (Fig 12, C e D).

Além disto, tanto os resultados das figura 9, 10 e 11 quanto aqueles da

figura 12, estão plenamente de acordo com os dados obtidos em ensaios

de dano oxidativo à 2-DR (utilizando-se o método do TBARS, no lugar

dos métodos de oxidação do ascorbato e RPE, percebe-se que a

complexação da PIH com Fe(III) também depende da natureza do co-

quelante). Estes dados estão expressos na tabela 2 a seguir :

Percentual de proteção contra oxidação da 2-

DR em relação aos controles

Concentração

PIH

Fe(III)-

EDTA

(10 µMol/L)

Fe(III)-NTA

(10 µMol/L)

Fe(III)-

Citrato

(10 µMol/L)

20 µMol/L 14% 48% 32%

100 µMol/L 32% 83% 93%

Tabela 2. Percentual de proteção da PIH contra oxidação da 2-DR com diferentes co-

quelantes. Concentrações finais : 2-

DR ( 5 mmol/L), ascorbato ( 0,7 mmol/L). As

reações foram tamponadas em pH 7,2 (10 mmol/L tampão fosfato) e pré-

incubadas

por 10 minutos antes da adição do ascorbato.

Fig. 12. Efeito da PIH na redução do sinal do radical ascorbil com diferentes co-

quelantes. Conc

entrações finais : ascorbato ( 1mmol/L), Hepes (20 mmol/L pH 7,2),

PIH (200 µmol/L ), Fe-NTA (5 µmol/L na proporção 1:2 – A e B), Fe-

EDTA (5 µmol/L

na proporção 1:1 –

C e D. Os espectros foram obtidos por acumulação de 2

varreduras. Os quadros A e C correspondem aos controles sem PIH.

Campo magnético (G)

Campo magnético (G) Campo magnético (G)

Nestes ensaios, em meios contendo tampão fosfato (pH 7,2) e 10 µmol/L

Fe-NTA (ou Fe-Citrato, sendo o citrato um ligante fisiológico de ferro,

encontrado em “pools” intracelulares deste metal [Britton et al. 1994], a

eficiência da PIH (20 µmol/L ) em prevenir a degradação da 2-DR foi cerca

de 2 a 3 vezes maior que em meios contendo igual concentração de Fe-

EDTA.

Estes resultados como um todo, sugerem que uma vez formado um

complexo de Fe com a substância co-quelante EDTA, NTA ou Citrato, a

PIH é capaz de remover o íon Fe deste complexo, formando um novo

complexo, possivelmente do tipo Fe-(PIH)

. Esta remoção é tanto mais

difícil ou demorada, quanto maior for a afinidade do co-quelante pelo

metal. De fato, avaliando-se as constantes de formação já reportadas na

literatura [Roche et al. 1990] para Fe(III)-EDTA (log β

= 25,5), Fe(III)-

NTA (log β

= 8,3) e Fe(III)-Citrato (log β

= 7,3) [Konigsberger et al.

2000], percebe-se que NTA e Citrato formam complexos de certa forma

mais “fracos”, dos quais é mais fácil a remoção do íon Fe para posterior

complexação com a PIH (log β

= 24,8) [Webb et al. 1988 e Vitolo et al.

1990]. Apenas a título de comparação, a constante de formação Fe(III)-

DFO foi calculada como log β

= 30,6 [Hou 1994].

Estes resultados, se encontram em harmônica associação com aqueles

descritos nas seções seguintes, como se verá, levando à uma evidência

experimental adicional de que o mecanismo de ação antioxidante da PIH

se deve a sua complexação com íons Fe(III). Neste sentido, a PIH ao

substituir o co-quelante no complexo com Fe(III), é capaz de formar uma

estrutura tal que o novo complexo Fe-(PIH)

apresenta capacidade menor

de promover a oxidação do ascorbato.

3.1.2 Influência do tempo de pré-incubação na atividade antioxidante da

PIH

A fim de investigar o comportamento da PIH ao longo do tempo nas

reações descritas pelas equações de 7 a 10, foi testado o efeito da pré-

incubação sobre : i) a oxidação do ascorbato; ii) a formação do radical

ascorbil e iii) degradação da 2-DR. O tempo de pré-incubação

corresponde ao intervalo antes da adição de ascorbato ao meio reacional

contendo o metal e o PIH, já que esta substância é responsável por iniciar

a reação.

Aumentando o tempo de pré-incubação de 0 para 85 minutos, de um

sistema contendo 100 µmol/L de PIH e 20 µmol/L de Fe-EDTA (na

proporção 1:1), observa-se um aumento de quase o dobro da inibição do

PIH sobre a oxidação do ascorbato (Fig. 13).

Tempo pré-incubação (min)

0 20 40 60 80

Oxidação do Ascorbato (A

265

x min)

0,025

0,030

0,035

0,040

0,045

0,050

0 20 40 60 80

% inibição pelo PIH

100 µ

µµ

µM PIH

Controle

Tempo pré-incubação (min)

Fig. 13. Efeito da pré-incubação de Fe(III)-

EDTA e PIH na oxidação do ascorbato

(Quadro A). Concentrações finais : ascorbato ( 100

µmol/L), Hepes (20 mmol/L pH

7,2), PIH (0 e 100 µmol/L ), Fe-EDTA (20 µmol/L na propor

ção 1:1). O ascorbato foi

adicionado após cada período de pré-

incubação à temperatura ambiente. O quadro B

é uma reapresentação dos mesmos dados do quadro A, mostrando o percentual de

inibição da reação de oxidação do ascorbato pela PI

H em relação aos controles (sem

PIH).

Empregando a RPE, foram obtidos os resultados da Fig. 14, os quais

corroboram os achados anteriores. Estes resultados mostram que

sistemas contendo PIH e Fe-EDTA pré-incubados por 90 minutos antes

da adição de ascorbato, apresentaram percentual de inibição sobre a

geração do radical ascorbil igual a 72%, contra apenas 8% de inibição de

sistemas sem pré-incubação.

T e m p o p ré -in c u b a ç ã o (m in )

0 3 0 6 0 9 0

ALTURA DO PICO (unids. arbitrárias)

2 0 0 µM P IH

C o n tro le

Apenas para confirmação foi utilizado o ensaio da 2-DR também em

sistemas contendo PIH e Fe-EDTA pré-incubados. Assim como nos

experimentos anteriores, a eficiência do PIH em prevenir a reação de

redução de Fe(III) ( e no caso deste ensaio, a eficiência em prevenir o

dano a 2-DR por espécies radicalares oriundas desta reação), aumenta

com o tempo. O dano à 2-DR decresce em mais de 50% após 2 horas de

pré-incubação (Fig. 15).

Fig. 14. Efeito da pré-incubação de Fe(III)-

EDTA e PIH na formação do radical

ascorbil. Concentrações finais : ascorbato ( 1 mmol/L), Hepes (20 mmol/L pH 7,2),

PIH (0 e 200 µmol/L ), Fe-EDTA (10 µmol/L na proporção 1

:1). O ascorbato foi

adicionado após cada período de pré-incubação à temperatura ambiente.

Degradação 2-Desoxi-ribose (A

532

)

Controle

Tempo pré-incubação (min)

As Figuras 13, 14 e 15 analisadas em conjunto demonstram que a

habilidade da PIH em prevenir tanto a oxidação do ascorbato, quanto o

dano à 2-DR ou a formação radical ascorbil, todos induzidos por espécies

férricas, é dependente do tempo de pré-incubação da PIH com o

complexo Fe-co-quelante. Quanto maior o tempo em a PIH permanece em

contato com o complexo Fe(III)-coquelante, maior a habilidade protetora

da PIH contra a oxidação do ascorbato.

Sugere-se portanto que a remoção de íons Fe(III) do co-quelante pela PIH

e a posterior formação do complexo Fe(III)-(PIH)

é um processo lento, e

tão mais lento o será, quanto maior for a afinidade do co-quelante pelo íon

metálico. Estudos de pré-incubação de PIH com Fe-NTA em condições

idênticas, revelaram que não houve alteração da oxidação do ascorbato

em função do tempo de pré-incubação, sugerindo que a remoção de Fe

Fig. 15. Efeito da pré-incubação de Fe(III)-EDTA e PIH na degradação da 2-

DR.

Concentrações finais : ascorbato ( 0,7 mmol/L), Hepes (10 mmol/L pH 7,2), PIH (0 e

200 µmol/L ), Fe-EDTA (10 µmol/L na proporção 1:1). O ascorbato e a 2-

DR foram

adicionados após cada período de pré-incubação à temperatura ambiente.

neste caso é bastante rápida, o que está em bom acordo com as

observações relatadas no item 3.1.1.

Desta forma, considera-se que tais resultados são explicáveis pelo fato de

estar em curso uma competição entre a PIH e o co-quelante pela

complexação com os íons Fe(III), em um sistema reacional onde co-

existam estes três componentes. É portanto esperado que seja mais

difícil (e por conseguinte mais demorado) para a PIH, remover íons Fe(III)

de co-quelantes com altas constantes de formação.

Neste sentido, Hermes Lima determinou as velocidades de remoção de

íons Fe(III) do EDTA e do NTA pela PIH e a conseqüente formação do

complexo Fe(III)-(PIH)

[Hermes Lima et al. 2000]. Acompanhando a

formação deste complexo a 476 nm, foi relatado que o mesmo é formado

em poucos segundos quando se utiliza NTA como co-quelante,

diferentemente do caso do EDTA, onde somente se observa formação do

complexo com PIH após cerca de 30 minutos nas condições

experimentais ali descritas. Estes resultados, em conjunto com aqueles

apresentados neste trabalho, explicam a diferença de comportamento da

PIH em ralação a sistemas contendo EDTA ou NTA ou mesmo outro

ligante de Fe(III) tal como Citrato.

3.1.3 Influência da concentração de PIH e da proporção entre os ligantes

PIH e co-quelantes) e o Fe.

Verificou-se que o efeito da PIH tanto na oxidação do ascorbato quanto

na formação do radical ascorbil dependem das concentrações deste

quelante, sendo a ação antioxidante da PIH, diretamente proporcional a

sua concentração.

A Fig. 16 demonstra o efeito da concentração de PIH sobre a taxa de

oxidação do ascorbato em dois diferentes tempos de pré-incubação

(círculos fechados = 8 minutos; círculos abertos = 2 horas). O valor do I

em soluções pré-incubadas por 2 horas é igual a 90 µmol/L de PIH, em

contraste com àquele obtido para soluções pré-incubadas por 8 minutos

igual a 500 µmol/L de PIH).

[P IH ] (µ M )

0 2 0 4 0 6 0 8 0 1 0 0

0 ,0 0 9

0 ,0 1 5

0 ,0 2 1

0 ,0 2 7

Oxidação Ascorbato (A

265

x min)

A tabela 3 a seguir, indica o mesmo perfil em relação à formação do

radical ascorbil, observando-se um I

igual a 375 µmol/L de PIH em

soluções contendo 5 µmol/L de Fe-EDTA e pré-incubadas por 30 minutos.

Concentração de PIH

(µmol/L)

Intensidade do sinal RPE

(unidades arbitrárias)

0 3,75 ± 0,41

100 3,11 ± 0,17

200 2,79 ± 0,36

300 2,21 ± 0,17

390 1,93 ± 0,15

Fig. 16

. Efeito da concentração de PIH na oxidação do ascorbato em dois diferentes

tempos de pré-incubação. Concentrações finais : ascorbato ( 100

µmol/L), Hepes (20

mmol/L pH 7,2), PIH (variáveis), Fe-EDTA (10 µmol/L na propor

ção 1:1). O ascorbato

foi adicionado após cada período de pré-

incubação à temperatura ambiente. Circulos

fechados = 8 minutos e círculos abertos = 2 horas pré-incubação.

Tabela 3. Efeito da concentração de PIH na formação do radical ascorbil.

Concentrações finais : ascorbato ( 1 mmol/L), Hepes (20 mmol/L pH 7,2), PIH

(variáveis), Fe-EDTA (5 µmol/L na proporção 1:1). O ascorbato foi adicionad

o após

30 minutos de pré-incubação à temperatura ambiente.

8 min

2 h

A necessidade de concentrações relativamente mais altas de PIH para

produzir um efeito antioxidante eficiente quando utilizadas soluções de Fe-

EDTA está em total conformidade com a discussão apresentada no item

3.1.1. a respeito da natureza do co-quelante e sua afinidade com os íons

de Fe(III). Teoricamente quanto mais forte for a interação entre os íons

ferro e o co-quelante, maior quantidade de PIH será necessária para a

produção de um efeito antioxidante.

Um fato de relevante interesse é o comportamento do PIH frente a

diferentes proporções entre os íons férricos e o EDTA. Conforme o

esperado, verificou-se que a habilidade da PIH em prevenir a oxidação do

ascorbato é significativamente menor quando a proporção Fe:EDTA

aumenta para 1:5 (Fig. 17).

[PIH] (µM)

0 20 40 60 80 100

Oxidação do Ascorbato (A

265

x min)

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

proporção 1:1

proporção 1:5

Fig. 17

. Efeito da concentração de PIH na oxidação do ascorbato em duas diferentes

proporções Fe-EDTA. Concentrações finais : ascorbato ( 100

µmol/L), Hepes (20

mmol/L pH 7,2), PIH (variáveis), EDTA (10 µmol/L na proporção

1:1 e 50 µmol/L na

proporção 1:5). O ascorbato foi adicionado após 2 horas de pré-

incubação à

temperatura ambiente.

Incrementos na concentração de PIH não alteram este comportamento,

pois mesmo em meios contendo 100 µmol/L de PIH e 50 µmol/L de EDTA

(na proporção 1:5 em relação ao Fe), a taxa de oxidação do ascorbato é

cerca de 40 % maior em relação à meios contendo Fe-EDTA na proporção

1:1. Semelhantemente ao já discutido para os resultados obtidos na pré-

incubação (figuras 13, 14 e 15) e na titulação de PIH (figura 16 e tabela 3),

percebe-se que quanto mais favorecida for a interação entre o co-quelante

o os íons férricos, menor será o efeito protetor da PIH. Obviamente o

favorecimento desta interação depende fortemente da concentração de

co-quelante no meio reacional. Assim, uma provável explicação para a

menor proteção da PIH quando se utiliza Fe-EDTA na proporção 1:5, é

que a presença de excesso de EDTA não complexado ao Fe tornaria a

formação do complexo Fe(III)-(PIH)

mais difícil devido a competições

mecanísticas.

3.1.4 Efeito da ação redutora do ascorbato sobre o complexo Fe(III)-(PIH)

Considerando que a presença de ascorbato é capaz de reduzir íons Fe(III)

mesmo estando estes complexados à moléculas quelantes do tipo EDTA

(vide resultados dos controles figura 10), o efeito da ação redutora do

ascorbato sobre o complexo Fe(III)-(PIH)

foi investigada. Com base na

afinidade da PIH por íons férricos e nos resultados já relatados, presume-

se que o Fe(III) complexado ao PIH é menos suscetível a sofrer redução.

À soluções contendo 50 µmol/L Fe(III) e 100 µmol/L da PIH, adicionaram-

se quantidades crescentes de ascorbato, acompanhando-se então

durante 30 minutos o comportamento do sistema a 476 nm (região do

espectro correspondente ao pico de absorção do complexo Fe(III)-(PIH)

Concentrações de ascorbato variando de 0,1 a 2,5 mM, não foram

capazes de reduzir em larga escala o ferro ligado. Na verdade, apenas

16% do ferro ligado foi reduzido por 2,5mM de ascorbato após 15 minutos

de reação. No entanto, 5, 10 e 50 mM de ascorbato provocaram

respectivamente 70%, 92% e 100 % de redução após 0,5 minuto.

Estes resultados parecem concordar com os anteriores, uma vez que a

julgar pelo comportamento do PIH em relação à taxa de oxidação do

ascorbato verificada nos experimentos já relatados, espera-se que a

redução do complexo Fe(III)-(PIH)

ocorra mais lentamente que no caso

dos complexos Fe-NTA, Fe-Citrato e mesmo Fe-EDTA.

3.2 Estudo da ação do ácido caféico

3.2.1 Atividade antioxidante do ácido caféico (AC) e efeito do pH

0,360

0,590

0,169

0,267

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

pH 5,6 pH 7,2

Abs. (532 nm)

0 AC

200 umol/L AC

A fim de caracterizar o potencial antioxidante do AC foi medida a

capacidade do mesmo em prevenir o dano oxidativo à 2-DR induzido por

Fig. 18. Efeito da presença de AC na degradação da 2-DR. Concentrações finais : 2-

DR (10 mmol/L), Tampão Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2 e 5,6), H

(100 µmol/L),

Fe(II) (30 µmol/L). O peróxido foi adicionado após 15 minutos de pré-i

ncubação de

AC e Fe(II) à temperatura ambiente. Após a adição de peróxido, todo o sistema foi

incubado à 37ºC por 20 minutos.

30 µmol/L de Fe(II) em uma típica reação de Fenton. Os meios reacionais

contendo 200 µmol/L de AC, incubados a 37º C apresentaram uma

proteção de cerca de 71% em relação ao controle sem AC em pH 7,2

(Fig. 18), evidenciando que este polifenol eficientemente inibe a

degradação oxidativa da 2-DR.

Já em sistemas tamponados em pH 5,6 observou-se que esta proteção

cai para cerca de 26% em relação ao controle sem AC. Estas

observações estão em bom acordo com os estudos relatados por Boilet,

onde nenhuma complexação de AC com Pb(II) ocorre quando a função

carboxílica e o grupo catecol estão totalmente protonados, como por

exemplo em metanol puro [Boilet 2005].

É interessante notar que a reação de Fenton sem a presença de AC,

propicia maior dano oxidativo à 2-DR em pH 7,2 que em pH 5,6.

Em estudos com o acido elágico (AE) foi verificado semelhantemente que

a habilidade antioxidante deste composto também depende do pH. Em

sistemas de Fenton, observou-se que o AE é mais eficiente em inibir

reações de degradação oxidativa em pHs mais altos, tendo sido este fato

correlacionado com a desprotonação deste polifenol [Ginani 2005].

Os resultados descritos na figura 18, em associação com aqueles

reportados por Boilet, demonstram que o pH exerce papel importante no

mecanismo de ação antioxidante do AC. Propõe-se aqui que este efeito

do pH seria devido ao favorecimento da formação de um complexo Fe(II)-

AC pela desprotonação do grupo carboxila e das hidroxilas fenólicas, em

meios alcalinos.

Considerando que o pKa

e pKa

do AC são iguais à 4,36 e 8,48

respectivamente [Silva et al. 2000], estima-se que em pH 7,2 já ocorra a

desprotonação de parte das hidroxilas fenólicas. Os estudos

espectrofotométricos descritos a seguir fornecem evidências adicionais de

que a complexação depende substantivamente do grupo catecol.

Uma vez que foi observado um incremento significativo na proteção

oferecida pelo AC em pH 7,2 , e considerando que tanto em pH 5,6

quanto em pH 7,2 o grupo carboxila já está quase que completamente

desprotonado, sugere-se que o grupo catecol do anel tenha grande

influência na ligação com íons Fe(II).

Na verdade, em face dos valores das constantes de dissociação ácida

medidos por potenciometria [Silva et al. 2000], é bem provável que a

complexação ocorra no grupo catecol, conforme a Fig. 8 descrita

anteriormente, especialmente em pH 7,2.

No entanto, não pode ser descartada a hipótese de que a complexação

com íons Fe(II) esteja ocorrendo também em função do grupo carboxila.

desprotonado. Analogamente ao reportado por Khvan em sistemas

contendo Cu

[Khvan 2001], é possível que a formação de um complexo

Fe(II)-AC esteja ocorrendo por meio de um mecanismo iônico de

complexação pelo grupo carboxila, acompanhado pela liberação de

prótons conforme a equação 16:

++−+

+→+ HFeACFeACH

(equação 16)

De qualquer forma, independentemente do grupo considerado, postula-se

que a desprotonação de um ou mais hidrogênios exerceria forte influência

na estabilização do complexo Fe(II)-AC, em função da deslocalização

eletrônica ao longo da molécula do AC. Esta deslocalização permitiria

escrever estruturas de ressonância envolvendo as hidroxilas fenólicas, o

anel aromático, o grupo etilênico e a carboxila, todos em conjugação.

No entanto, a identificação precisa dos sítios ligantes do AC em relação

aos íons Fe(II) carece ainda de aprofundamentos, devendo ser

empregadas outras técnicas analíticas tais como difração de raio-X,

espectroscopia de infra-vermelho, cromatografia, e ressonância magnética

nuclear.

3.2.2 Estudos espectrofotométricos da ligação de íons Fe(II) ao AC

Com o objetivo de investigar o efeito do pH sobre a habilidade

antioxidante do AC, foram conduzidos alguns estudos

espectrofotométricos na região do UV-VIS.

As Figuras 19 a,b,c representam o espectro de absorção típico das

espécies presentes no meio reacional. Considerando que o sistema tem

coloração azulada, supõem-se que o complexo formado tenha absorção

na região do visível. Por esta razão a Figura 19 d foi composta, sendo a

mesma apenas uma ampliação das escalas das figuras 19 a,b,c na região

de interesse.

-0,200

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

0 200 400 600 800 1000

Comprim. Onda (nm)

Abs.

AC + Fe

Fig. 19

a. Perfil espectral do AC puro e do AC em presença de Fe(II) em pH 4,0.

Concentrações finais : Fe(II) (8

µmol/L), AC (80 µmol/L). Os sistemas foram

incubados à temperatura ambiente por até 90 minutos.

-0,500

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 500 1000

Comprim. Onda (nm)

Abs.

Tampão+ Fe(II)

Tampão + AC

Tampão + AC + Fe(II)

-0,500

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 500 1000

Comprim. Onda (nm)

Abs.

Tampão+ Fe(II)

Tampão + AC

Tampão + AC + Fe(II)

Fig. 19

b. Perfil espectral do AC em presença de Fe(II) em pH 7,2. Concentrações

finais : Fe(II) (8 µmol/L), AC (80 µmol/L), Tampão Hepes/MES (8

mmol/L e pH 7,2).

Os sistemas foram incubados à temperatura ambiente por até 90 minutos.

Fig. 19c. Perfil espectral do AC em presença de Fe(II) em

pH 5,6. Concentrações

finais : Fe(II) (8 µmol/L), AC (80 µmol/L), Tamp

ão Hepes/MES (8 mmol/L e pH 5,6).

Os sistemas foram incubados à temperatura ambiente por até 90 minutos.

-0,010

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

400 500 600 700 800

Comprim. Onda (nm)

Abs.

pH 4

pH 5,6

pH 7,2

Segundo as figuras 19 a,b,c e d percebe-se que o perfil espectral das

espécies pode ser caracterizado por : i) AC (pico duplo bem definido na

região de 300-400 nm e nenhum pico observável na região de 600 nm); ii)

AC + Fe(II) em pH 7,2 (pico único com ombro discreto na região de 300-

400 nm e pico largo duplo na região de 600 nm); iii) AC + Fe(II) em pH 5,6

(pico duplo bem definido na região de 300-400 nm e pico único

extremamente discreto na região de 600 nm), sugerindo que em meios

mais ácidos a complexação é desfavorecida ou ocorre mais lentamente.

Conforme o observado por Garcia, o espectro de absorção de soluções de

AC não oxidado, às quais foi adicionado ferro, mostram um pico discreto

na região de 600 nm [Garcia et al. 1996]. Shindo também reportou nesta

mesma região, um pico largo correspondente ao complexo Fe-catecol

[Shindo e Huang 1984]. A figura 19 d revela claramente que tal pico

aparece principalmente em um sistema contendo AC e ferro cujo pH é 7,2,

Fig. 19

d. Reimpressão dos dados das figuras 17 a, b e c em escala ampliada. Os

dados correspondem aos sistemas contendo Fe(II) (8 µmol/L), AC (80 µmol/L), e

Tampão Hepes/MES (8 mmol/L) em diferentes pHs.

sendo observada apenas uma formação exrtremamente reduzida em pH

5,6 ou 4,06. Tal fato está consistente com a proposta de que a formação

do complexo Fe(II)-AC é favorecida pela desprotonação do grupo catecol

após a desprotonação da carboxila.

A Fig. 20 representa a formação ao longo do tempo (medida a 604 nm),

de uma espécie que originalmente não estava presente em solução

aquosa de AC, formação esta iniciada pela adição de Fe(II) (o tempo zero

corresponde a leituras realizadas imediatamente antes da adição de íons

ferrosos). Neste ensaio as concentrações de AC e Fe(II) foram as

mesmas já descritas para a figura 18.

-0,020

0,000

0,020

0,040

0,060

0,080

0,100

0,120

0,140

0,160

0,180

0 0,17 1 15 30 60 105

Tempo de pré-incubação (min.)

Abs. (604 nm)

pH 7,2

pH 5,6

pH 4,0

Considerando o resultado da Fig. 20 e as observações de Garcia e

Shindo, sugere-se que a absorbância medida a 604 nm corresponde à

formação de um complexo Fe-AC através do sítio ligante catecol.

Conforme anteriormente mencionado, é interessante reiterar que a

Fig. 20

. Acompanhamento temporal da formação de espécie química a 604 nm.

Concentrações finais : Tampão Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2 e 5,6), Fe(II) (30

µmol/L) e AC (200 µmo

l/L). O curso temporal da reação foi acompanhado à

temperatura ambiente.

formação deste complexo parece ocorrer mais rapidamente em pH

levemente alcalino, provavelmente porque a desprotonação do AC gera

cargas eletrônicas delocalizadas ao longo de sua estrutura, facilitando a

interação do sitio ligante com cátions Fe(II). A inexistência de absorção

em pH 4,0 (pH da solução de AC puro), também está consistente com a

proposta de que em pH levemente alcalino, a complexação com íons

ferrosos é facilitada. Desta forma, propõem-se que a complexação Fe-AC

ocorra preferencialmente quando o AC se encontrar em sua forma bi-

desprotonada.

3.2.3 Efeito da temperatura de incubação

Curiosamente, incubando-se a 98º C a mesma reação descrita na figura

18, foi verificado um efeito pro-oxidante do AC. A Fig. 21 revela que em

pH 7,2 a presença de AC promove um incremento na oxidação da 2-DR

de cerca de 176% em relação ao controle sem AC.

0,847

0,389

0,473

1,306

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1,600

pH 5,6 pH 7,2

Abs. (532 nm)

0 AC

200 umol/L AC

Fig. 21. Efeito da presença de AC na degradação da 2-

DR a 98ºC. Concentrações

finais : 2-DR (10 mmol/L), Tampão Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2 e 5,6), H

(100 µmol/L), Fe(II) (30 µmol/L). O peróxido foi adicionado após 15 minutos de pré-

incubação de AC e Fe(II) à temperatura ambiente. Após a adição de peróxido, todo

o sistema foi incubado à 98ºC por 20 minutos.

É notoriamente sabido que o aumento da temperatura favorece a

ocorrência de reações endotérmicas, podendo neste caso estar ocorrendo

paralelamente uma série de reações simultâneas responsáveis pelo

aumento da oxidação da 2-DR. Seria ainda possível a degradação térmica

da 2-DR, induzida por outras espécies geradas in situ. Entretanto, como

os sistemas controle sem AC forneceram valores consideravelmente

menores que aqueles com 200 µmol/L de AC, supõe-se de algum modo

ser o AC o responsável pelo “dano oxidativo extra”. Ressalta-se que os

controles utilizados foram iguais, tanto em reações à 37ºC quanto em

reações a 98ºC, em qualquer dos valores de pH.

Dimberg et al. utilizando ensaios de HPLC, relata que a quantidade de AC

presente em grãos de aveia decresce significativamente após

processamento térmico de grãos hidratados, por aquecimento em forno à

100º C por 10 minutos, processo este que simula o tratamento industrial

de aveia [Dimberg 1996]. Com base nestes resultados Dimberg e King

[King e Young 1999] propõem que o AC é sensível ao calor, podendo dar

lugar a produtos de sua decomposição térmica.

Hota et al, utilizando técnicas de eletrólise verificou que o número de

elétrons (n) envolvidos na oxidação de ácidos fenólicos aumenta

dramaticamente com o aumento do pH. Este resultado foi correlacionado

à possibilidade de formação de um radical semiquinona. Este radical, por

ser termodinamicamente estabilizado por estruturas de ressonância,

estaria em maior abundância, permitindo que reações de polimerização

envolvendo 4 elétrons, ocorressem preferencialmente [Hotta 2001].

Assim, é possível que o aumento da temperatura associado ao pH

alcalino, promova estas reações de dimerização ou polimerização. Porém

foi verificado em outros experimentos deste trabalho, que a presença de

ferro no sistema é de fundamental importância para o curso destas

prováveis reações e o conseqüente aparecimento do efeito pró-oxidante.

Neste sentido, duas soluções distintas de AC puro preparadas à 37ºC e à

98ºC, foram testadas em um ensaio de TBARS e em estudos

espectrofotométricos. As soluções de AC puro preparadas à 37º e a 98ºC

não apresentaram diferença significativa no espectro UV-VIS obtido.

Adicionalmente, ambas as soluções (AC preparado a 37º e a 98ºC),

quando utilizadas em um ensaio de TBARS à 37º C se mostraram

antioxidantes, não havendo diferença significativa entre os dois

resultados. Tais resultados indicam que não é a degradação térmica do

AC puro, a responsável pelo efeito pró-oxidante. Desta forma propõem-se

que AC e íons ferro a altas temperaturas sofram reações e modificações

estruturais tais que promovam o aparecimento do efeito pró-oxidante

observado.

Uma outra possível explicação para o comportamento pró-oxidante do AC

em altas temperaturas, além das reações de dimerização, é a ocorrência

de uma reação redox por meio de um mecanismo de esfera externa. O

Fe(II) presente no meio reacional ao ser oxidado pelo peróxido, produz

Fe(III) o qual se complexa com o AC. Neste mecanismo, ocorreria uma

transferência de elétrons aos íons férricos do complexo Fe(III)-AC,

formando-se então um complexo do tipo Fe(II)-AC. O Fe(II) presente

neste complexo, poderia de alguma forma participar da formação de

radicais hidroxil, embora em menor escala em relação à sua forma livre

(íons em solução).

A ocorrência desta reação redox por esfera externa, depende de uma

certa quantidade de energia requerida para levar os reagentes envolvidos

ao estado de transição (energia de ativação) [Mingos 1998]. Gerloch

menciona que esta energia de ativação está relacionada aos

comprimentos de ligação entre o metal e o ligante, sendo que geralmente

complexos de íons ferrosos tem ligações mais longas que àquelas de íons

férricos [Gerloch e Constable 1994]. Desta forma, estados de transição

onde os reagentes possuem comprimentos de ligação assimétricos

possuem energia de ativação mais alta, de modo que quanto maior a

diferença nestes comprimentos, maior a energia de ativação requerida

[Cotton e Wilkinson 1978].

Esta reação redox depende também de uma quantidade adicional de

energia requerida para rearranjar as esferas de solvatação dos

complexos, de modo a acomodar as novas dimensões dos mesmos

[Douglas et al. 1983] (a transferência de elétrons implica em mudança nas

dimensões dos íons envolvidos). Assim, quando se aquece o sistema

reacional a 98ºC, esta reação redox por esfera externa é grandemente

favorecida, justificando-se assim o grande efeito pró-oxidante verificado à

altas temperaturas.

3.2.4 Efeito da pré-incubação

A pré-incubação de AC com Fe(II) antes da adição de peróxido de

hidrogênio como iniciador da reação de Fenton, indica não haver variação

na habilidade protetora do AC com o tempo, a partir de 1 minuto (Fig. 22).

Neste estudo, foram utilizadas as mesmas condições relatadas na figura

16 e no ensaio de DR descrito no item materiais e métodos.

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0,800

1 30 105

Tempo de pré-incub. (min)

Abs. (532 nm)

pH 5,6 / AC 200

pH 7,2 / AC 200

pH 5,6 / AC zero

pH 7,2 / AC zero

Fig. 22. Efeito do tempo de pré-incubação sobre a degradação da 2-

DR.

Concentrações finais : 2-

DR (10 mmol/L), Tampão Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2 e

5,6), H

(100 µmol/L), Fe(II) (30 µmol/L). O per

óxido foi adicionado após cada

tempo de pré-incubação de AC e Fe(II) à temperatura ambiente. Após a ad

ição de

peróxido, todo o sistema foi incubado por 20minutos a 37ºC.

A pequena variação na proteção do AC observada com o incremento do

tempo de pré-incubação a partir de 1 minuto, pode sugerir que a reação

de complexação é bastante rápida em pH 7,2. Uma possível explicação

seria a de que todo o AC disponível para interagir com Fe(II) já teria se

complexado antes de 1 minuto.

Tais resultados estão consistentes com aqueles descritos na figura 20,

onde não mais se observa incrementos na absorbância em 604 nm

(formação do complexo Fe-catecol) a partir de 1 minuto. Entretanto,

segundo os resultados da figura 20, seria esperado pequeno aumento no

poder antioxidante do AC em pH 5,6 com até 30 minutos de pré-

incubação, o que não foi verificado.

Considerando os resultados obtidos com a pré-incubação do ácido tânico

– AT, [Lopes et al. 1999], observou-se aumento no poder antioxidante da

molécula estudada em função do tempo de pré-incubação na presença de

íons ferro. Este estudo revela que a reação de complexação deste ligante

com íons ferro é significativamente lenta.

É importante notar que estes resultados de pré-incubação podem apontar

para a possibilididade de que o AC também esteja agindo como

seqüestrador de radicais. Se hipotéticamente considerarmos que a

complexação do AC com íons ferrosos é bastante lenta ou mesmo

inexistente, a proteção observada seria exclusivamente devida a

habilidade seqüestradora do AC, sendo portanto justificável o efeito

protetor independente do tempo de pré-incubação.

Outro ponto de interesse é o fato de que em pH 7,2 parece haver grande

influência do tampão na inibição da degradação da 2-DR especialmente

se considerada uma reação de longo curso (após 1 hora e 45 minutos de

pré-incubação apenas com tampão, a absorbância relativa ao dano

oxidativo na 2-DR cai cerca de 30%).

Tal resultado pode ser explicado pela possibilidade de um dos

componentes do tampão estar ligando ferro, ou funcionando como

seqüestrador de oxi-radicais .

Outra possibilidade é a de que o tampão esteja promovendo a

autoxidação de Fe(II), fazendo com que menor quantidade de íons

ferrosos estejam presentes para reagir com o peróxido de hidrogênio

adicionado posteriormente. Este efeito do tampão sobre as taxas de

autoxidação de Fe(II) foram também relatadas por Aust num estudo onde

se demonstrou que em pHs mais altos, a autoxidação é favorecida ao

longo do tempo [Aust et al. 2002].

3.2.5 Efeito dos íons Fe(III) sobre a degradação da 2-DR e sobre o AC

Considerando que Fe(III) pode exercer papel importante na formação de

EROs conforme já discutido anteriormente, foi estudado o efeito destes

íons no sistema reacional e sua interação com o AC (Figuras 23a , b ).

Nas mesmas condições experimentais relatadas na figura 18, substituiu-

se o Fe(II) por cloreto férrico na concentração final de 30 µmol/L. Os

resultados revelam que :

a) Em sistemas contendo Fe(III) e peróxido de hidrogênio, a presença de

200 µmol/L de AC não demonstra proteção significativamente diferente

em relação aos controles sem AC (Fig. 23a). Cabe neste ponto

referenciar um estudo similar realizado com o composto polifenólico

verbascosídeo [Zhao et al. 2005]. Diferentemente do AC, o polifenol

verbascosideo foi capaz de inibir dano oxidativo ao DNA tanto em

presença de Fe(II) quanto Fe(III).

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

pH 7,2 pH 5,6

Abs. (532 nm)

0 AC

200 umol/L AC

b) O dano observado em sistemas contendo Fe(III) é significativamente

menor, quando comparado com sistemas clássicos de Fenton com

íons ferrosos nas mesmas condições experimentais (Fig. 23b). Tais

observações estão consistentes com a proposta das equações

anteriormente discutidas, que prevêem a geração de EROs a partir de

Fe(III), porém em escala menor que no sistema clássico de Fenton

com Fe(II).

Fig. 23a. Efeito do AC sobre a reação de degradação da 2-

DR promovida por Fe(III) e

peróxido de hidrogênio. Concentrações finais : 2-

DR (10 mmol/L), Tampão

Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2 e 5,6), H

(100 µmol/L), Fe(III) (30 µmol/L diluido

em 10mmol/L HCl). O peróxido foi adicionado após 15 minutos de pré-

incubação de

AC e Fe(III) à temperatura ambiente. Após a adição de peróxido a reação foi

incubada por 20minutos a 37ºC.

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

pH 7,2 pH 5,6

Abs. (532 nm)

Sistema Fe(II)

Sistema Fe(III)

A fim de investigar o comportamento do AC em presença de íons Fe(III),

foi realizada uma varredura na região de comprimento de onda de

interesse, de um sistema contendo 8 mmol/L de tampão (pH 7,2), 80

µmol/L de AC, 8 µmol/L de Fe(III) e 800 µmol/L de EDTA (Fig. 24a).

Considerando que o sistema contendo Fe(III) tem coloração esverdeada,

prevê-se a formação de um complexo, o qual tenha absorção na região do

visível. Por esta razão a Figura 24b foi composta, sendo a mesma apenas

uma ampliação na escala dos mesmos dados descritos na figura 24a.

Fig. 23b. Comparação das reações de degradação da 2-

DR promovidas por peróxido

de hidrogênio e Fe(II) (Reação de Fenton) ou por Fe(III). Condições experimentais

idênticas às das figuras 18 e 23a.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 200 400 600 800 1000

Comprim. Onda (nm)

Abs

Tampão + AC + FeIII

Tampão + AC + Fe(II)

Tampão + AC + FeIII +

EDTA

0,000

0,010

0,020

0,030

0,040

0,050

0,060

0,070

0,080

400 500 600 700 800

Comprim. Onda (nm)

Abs

Tampão + AC + FeIII

Tampão + AC + Fe(II)

Tampão + AC + FeIII +

EDTA

Fig. 24

a. Comparação do perfil espectral de sistemas contendo Fe(II) ou Fe(III).

Concentrações finais : Tampão Hepes/MES (8 mmol/L pH 7,2)

, Fe(III) (8 µmol/L

diluído em 10mmol/L HCl), AC (80 µmol/L), EDTA (800 µmol/L).

Fig. 24b. Reimpressão dos dados da figura 24

a em escala ampliada na região de

comprimento de onda de interesse.

Das figuras 24 a e b, observa-se que o espectro de soluções contendo AC

e Fe(III) é razoavelmente diferente daquele contendo Fe(II). Com base

nestes espectros, conclui-se que ocorre a formação tanto do complexo de

AC com Fe(II) quanto com Fe(III), sendo observados picos de absorção

dos complexos a 610 nm e 600 nm respectivamente. Cabe ressaltar que

apesar das concentrações de Fe(II) e Fe(III) serem idênticas nos dois

sistemas (8 µmol/L), as absorbâncias verificadas nos meios contendo

Fe(III) são cerca de metade daquelas referentes aos sistemas com Fe(II)

(Fig. 24b).

A comprovação da ocorrência do complexo com Fe(III) é fornecida

quando EDTA é adicionado ao meio reacional contendo Fe(III) e AC.

Neste caso, não se verifica o pico característico na região de 600 nm.

Estes dados demonstram que o EDTA é capaz de remover íons férricos

complexados previamente com AC, desfazendo o complexo originalmente

formado.

Das observações acima expostas, surgem duas possiveis explicações

para a ineficiência do AC em proteger a 2-DR contra danos oxidativos

quando em presença de íons Fe(III), quais sejam :

a) O AC reduz Fe(III), conforme já discutido no item 1.3.4.1 [ Deiana et al.

1995 ] e a forma oxidada deste polifenol não é capaz de complexar

eficientemente o Fe(II) gerado in situ, deixando-o livre para catalisar a

formação de oxiradicais. Neste caso haveria uma pequena atividade

pró-oxidante do AC quando em presença de íons férricos, já que o

Fe(II) gerado in situ poderia participar de reações de Fenton

subseqüentes;

b) Mesmo complexado ao AC, os íons ferro são capazes de catalisar a

formação de radicais hidroxil. O complexo Fe(III)-AC poderia de

alguma forma sofrer reações de esfera externa, nas quais o AC

funcionaria como uma espécie de ponte para a transferência de

elétrons ao Fe(III). Através de seu sistema π conjugado, o AC poderia

estar promovendo a transferência de elétrons aos íons férricos por

meio de um mecanismo de esfera externa, resultando em um

complexo do tipo Fe(II)-AC. O Fe(II) deste último complexo, apesar de

menos suscetível a participar de reações de Fenton do que o próprio

Fe(II) livre, poderia ainda assim catalisar o formação de radicais

hidroxil.

3.2.6 Efeito da concentração de 2-DR e AC

A Fig. 25a mostra a variação no perfil de proteção do AC em função das

diferentes concentrações de 2-DR, molécula alvo da ação oxidativa dos

radicais hidroxil gerados in situ.

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 5 10 25

[DR] mmol/L

Abs. (532 nm)

200 umol/L AC

0 AC

Fig. 25a. Efeito da variação da concentração de 2-

DR. Concentrações finais :

Tampão Hepes/MES (20 mmol/L pH 7,2), H

(100 µmol/L), Fe(II) (30 µmol/L). O

peróxido foi adicionado após 15 minutos de pré-

incubação de AC e Fe(II) à

temperatura ambiente. Após a adição de peróxido a reação foi incubada por

20minutos a 37ºC.

Como o esperado verifica-se um aumento na degradação da 2-DR,

proporcional ao aumento da concentração deste açúcar no meio

reacional. No entanto, verifica-se adicionalmente que para uma mesma

concentração de AC (200 µmol/L), o percentual de proteção deste

polifenol decresce proporcionalmente ao aumento da concentração de 2-

DR, verificando-se que meios contendo 25 mmol/L de 2-DR apresentaram

uma proteção cerca de 27% menor que meios contendo 5 mmol/L (Fig.

25b).

69,6

74,2

53,9

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

5 10 25

[DR] mmol/L

% de proteção pelo AC

Tais resultados sugerem que o AC pode apresentar em sua ação

antioxidante uma componente seqüestradora de oxi-radicais. Este

comportamento não seria de todo inesperado, já que a estrutura do AC,

conforme anteriormente discutido, é capaz de estabilizar por conjugação,

um possível radical fenoxil gerado pelo ataque de radicais hidroxil

diretamente ao AC.

Fig. 25b. Percentual de proteção oferecido pelo AC contra a degradação da 2-

DR em

diferentes concentrações da molécula alvo. Os dados correspondem àqueles

apresentados na figura 25a.

Se o AC funcionasse apenas como quelante de ferro, não haveria

diferença significativa no percentual de proteção em relação aos

controles, em diferentes concentrações da 2-DR. Neste caso, o AC não

estaria interferindo na reação entre oxiradicais e a 2-DR, e sim impedindo

a própria formação do radical e por conseguinte agindo antes da colisão

deste com a molécula alvo. Este é justamente o caso da PIH, conforme

verificado no já referido trabalho [Hermes-Lima et al. 2000].

Uma pequena ação seqüestradora do AC é relatada em ensaios da TEAC

[Rice-Evans et al. 1996]. Tal ensaio é comumente utilizado para medir a

capacidade de substâncias em seqüestrar oxi-radicais. Entretanto, neste

estudo observou-se que a atividade seqüestradora do AC, apesar de

existente, é significativamente menor que a de outras substâncias

análogas, como por exemplo ácido ferúlico, ácido p-cumárico, ácido 3,4-

dihidroxi-fenilacético. A atividade do AC também foi menor que a aquela

apresentada por flavonóides como catequina, quercetina, ácido gálico e

epigalocatequina galato (estes dois últimos, flavonóides

reconhecidamente seqüestradores de oxi-radicais). Neste sentido, em

outros estudos de TEAC [Kokhar et al 2003] sugere que características

estruturais de compostos com alta eficiência em ligar ferro são opostas às

características existentes em compostos com atividade seqüestradora de

radicais , exceto pela presença de grupos 3,4 dihidroxi, importantes tanto

para quelação quanto para a captura de radicais.

Considerando o exposto, sugere-se que o AC atue tanto como

seqüestrador de oxi-radicais quanto como quelante, sendo esta última no

entanto, a principal componente da atividade antioxidante do AC. Tal

observação está em bom acordo com as conclusões reportadas em

relação ao AT [Andrade et al 2005].

A Fig. 26 apresenta o comportamento do sistema em diferentes

concentrações de AC, mostrando que a eficiência deste polifenol em inibir

a degradação da 2-DR é dependente da concentração. Considerando três

diferentes meios reacionais contendo 5 mmol/L, 10 mmol/L e 25 mmol/L

de 2-DR, 100 µmol/L de AC foi capaz de inibir, respectivamente 57%, 54%

e 40% da reação de degradação em relação aos controles. Tais

resultados, corroborando aqueles descritos na figura 25b, demonstram

que quanto menor a concentração de 2-DR, maior a eficiência do AC em

inibir o dano oxidativo.

Com uma concentração apenas três vezes superior à concentração de

íons Fe(II) presentes no meio, o AC é capaz de reduzir o dano oxidativo à

2-DR em mais de 50% (considerando [PIH]=100 µmol/L, [Fe]= 30 µmol/L e

[DR]= 10 mmol/L). Comparando-se estes resultados com àqueles obtidos

em condições similares com um antioxidante clássico, a Desferoxamina

(DFO), percebe-se que a ação antioxidante do AC é também eficiente.

Em sistemas contendo concentrações idênticas de Fe(II) e peróxido de

hidrogênio, 100 µmol/L de DFO apresentou um percentual de inibição de

58% em relação aos controles [Hermes lima et al. 1999].

0,2

0,4

0,6

0,8

0 50 100 200

[AC] umol/L

Abs. (532 nm)

5 mM DR

10 mM DR

25 mM DR

Fig. 26

. Efeito da variação da concentração de AC em diferentes concentrações de

2-DR. Concentrações finais : 2-

DR (5,10 e 25 mmol/L), Tampão Hepes/MES (20

mmol/L pH 7,2 e 5,6), H

(100 µmol/L), Fe(II) (30 µmol/L). O per

óxido foi

adicionado após 15 minutos de pré-

incubação de AC e Fe(II) à temperatura

ambiente. Após a adição de peróxido

a reação foi incubada por 20minutos a 37ºC.

4. CONCLUSÃO

Em relação à atividade antioxidante da PIH, verificou-se que a mesma

está inequivocamente relacionada à capacidade deste composto em

prevenir a redução de íons férricos a ferrosos.

Com base nos resultados obtidos verificou-se que esta capacidade diz

respeito à habilidade da PIH em remover íons ferro previamente

complexados a outros quelantes (por exemplo citrato, em meio fisiológico).

Por conseguinte a atividade antioxidante da PIH depende fortemente de:

a) tempo de pré-incubação da PIH com os íons Fe(III), uma vez que

maiores tempos de pre-incubação fornecem menores taxas de

redução do Fe(III) e conferem maior proteção contra danos oxidativos;

b) natureza do co-quelante de ferro, já que foi verificado que esta

atividade antioxidante é tanto maior quanto menor for a afinidade do

co-quelante em relação à íons Fe(III);

c) concentração do co-quelante de ferro e sua proporção em relação aos

íons férricos, já que proporções mais baixas permitem maior proteção

contra danos oxidativos.

Com base nestas observações experimentais, demonstra-se que o

mecanismo de ação antioxidante da PIH in vitro, se deve à sua habilidade

em se ligar à íons Fe(III), segundo a equação 11 :

)(2)( PIHIIIFeEDTAPIHEDTAIIIFe −+→+− (equação11)

e consequentemente impedir que as reações descritas nas equações de

7 a 10 tomem parte em sistemas nos quais íons Fe(III) e ascorbato

estejam presentes.

ascorbilEDTAIIFeAscorbatoEDTAIIIFe +−→+− )()( (equação 7)

−

+−→+−

)()( OEDTAIIIFeOEDTAIIFe (equação 8)

2222

22 OOHHO +→+

−

(equação 9)

•−

++−→−+ OHOHEDTAIIIFeEDTAIIFeOH )()(

(equação10)

A similaridade e harmonicidade de comportamento da PIH quer seja como

inibidor da reação de oxidação do ascorbato, quer seja como inibidor da

formação de radical ascorbil ou da degradação da 2-DR, claramente

demonstram que a ação antioxidante da PIH se deve principalmente à

inibição da reação descrita na equação 7. Quanto menor taxa de

oxidação do ascorbato mediada por Fe(III), menor a concentração de

Fe(II) presente no meio reacional e por conseguinte, menor a extensão da

reação de Fenton e a conseqüente formação de radicais hidroxil.

Verifica-se que o complexo Fe(III)-(PIH)

formado é substancialmente

menos suscetível a sofrer redução, ou em outras palavras, a promover a

oxidação do ascorbato. Propõem-se então que tal característica se deve

ao fato de que ao ocupar todos os seis sítios ligantes do Fe(III) com

grupos funcionais de alta densidade eletrônica [Murphy 1985 e

Avramovici-Grisaru 1985], a PIH inibe a transferência de elétrons do

ascorbato para o íon férrico. Tal transferência somente ocorre a taxas

relevantes, em altas concentrações de acorbato.

No que diz respeito à atividade antioxidante do AC, verifica-se que este

composto é capaz de eficientemente inibir reações de degradação

oxidativa causada por espécies reativas de oxigênio, geradas via reações

de Fenton.

Em caráter hipotético propõe-se que tal atividade antioxidante possa ser

explicada pela capacidade do AC em complexar Fe(II), e

subsequentemente ser atacado pelo radical hidroxil antes que este ataque

a 2-DR ou qualquer outro substrato oxidável. Assim, as seguintes reações

descritas nas equações 17, 18 e 19 poderiam estar acontecendo :

Fe(II) + AC → Fe(II)-AC (equação 17)

Fe(II)-AC + H

→ Fe(III)-AC + HO

•

+ OH

(equação 18)

Fe(III)-AC + HO

•

→ Fe(III)-AC

•

+ OH

(equação 19)

Tal proposta encontra paralelo nas proposições de Andrade e Ginani, em

estudos com os polifenóis AT e AE respectivamente (Andrade et. al 2005

e Ginani 2005). Porém para o aprofundamento de tal proposta seria

necessário um estudo adicional envolvendo a caracterização do radical

AC em presença de 2-DR ou outro substrato oxidável alvo dos radicais

hidroxil.

Outra possível explicação para a atividade antioxidante do AC seria a de

que ela se deve em especial à capacidade deste composto em formar

complexos estáveis com cátions de ferro, os quais, semelhantemente ao

já discutido para a PIH, se tornam inaptos a participar da reação de

Fenton.

Adicionalmente, propõem-se que a complexação do AC com íons ferro é

fortemente influenciada pela desprotonação do grupo catecol e carboxila ,

uma vez que a eficiência do AC em inibir reações de degradação oxidativa

depende em grande escala do pH do meio reacional. O seguinte esquema

é então sugerido :

a) ACH

: não ocorre complexação;

b) ACH

: não ocorre complexação ou a mesma é lenta ou com

interações fracas;

c) AC

: ocorre complexação efetiva envolvendo o grupo catecol.

Com base no aparecimento de um pico na região de 604 nm para

sistemas ferro-AC, propõem-se que a complexação ocorra no sítio catecol.

No entanto não pode ser descartada a possibilidade de estar sendo

formado um quelato bidentado envolvendo uma hidroxila fenólica

desprotonada e o grupo carboxilato, ou mesmo um mecanismo de

complexação iônica envolvendo apenas a carboxila. Os resultados

apontam também para uma maior afinidade do AC por íons Fe(II), já que

nenhuma proteção significativa foi observada em reações de Fenton

induzidas por íons Fe(III) (em presença de íons Fe III, o AC não se

mostrou eficiente em prevenir danos oxidativos à 2-DR).

Verificou-se também um comportamento pro-oxidante do AC em altas

temperaturas de incubação da reação de Fenton (98º C), provavelmente

devido à degradação térmica do AC induzida por íons ferro. Tal fato

poderia ser também causado pela capacidade do AC em reduzir íons

férricos [Deiana et al. 1995] gerados in situ pela ação do peróxido de

hidrogênio, possibilitando assim a reciclagem de Fe(II) e conseqüente

dano adicional por reação de Fenton.

É possível que a reação de dimerização do AC anteriormente referida, em

função dos 4 elétrons envolvidos poderia de algum modo provocar a

redução de Fe(III), o qual em presença de H

poderia novamente gerar

radicais hidroxil via Fenton. Desta forma, em um meio reacional à altas

temperaturas, as seguintes reações poderiam estar ocorrendo

simultaneamente, levando a um ciclo redox, expresso pelas equações 20,

21, 22 e 9:

Fe(III) +AC → Fe

+ AC (forma oxidada inapta a ligar íons ferrosos) (equação 20)

Fe(II) + O

→ Fe(III) + O

•

(equação 21)

•

+ 2H

→ H

+ O

(equação 9)

Fe(II) + H

→ Fe(III) + HO

•

+ OH

(equação 22)

Além de das reações descritas nas equações 23 e 24 :

Fe(III) + H

→ Fe(II) + O

•

+ 2H

(dependente do ligante de ferro) (equação 23)

+ O

•

→ O

+ OH

+ HO

•

(equação 24)

Uma outra alternativa mais provável para explicar o comportamento pró-

oxidante do AC em altas temperaturas, é a ocorrência de uma reação

redox por meio de um mecanismo de esfera externa. Neste mecanismo,

ocorreria uma transferência de elétrons aos íons férricos, formando-se um

complexo do tipo Fe(II)-AC. O Fe(II) presente neste complexo, apesar de

menos suscetível a participar de reações de Fenton do que o próprio

Fe(II) livre, poderia ainda assim catalisar o formação de radicais hidroxil.

Considerando que a transferência de elétrons por meio de mecanismos de

esfera externa possuem uma consideravel energia de ativação, justifica-se

o grande efeito pró-oxidante quando o sistema é aquecido a 98ºC.

Este mecanismo explicaria inclusive o comportamento ineficiente do AC

em proteger a oxidação da 2-DR diante de íons Fe(III), já que o complexo

Fe(II)-AC formado nesta transferência de elétrons poderia propiciar uma

pequena formação de oxiradicias.

Por fim, propõe-se neste trabalho que as condições de preparo das

soluções estoque de AC bem como as condições reacionais, não são fator

trivial no que diz respeito ao estudo das propriedades deste polifenol. Na

literatura existente, a maior parte das referências bibliográficas sequer

menciona a forma e as condições de preparo de soluções de AC.

Considerando que o AC é :

a) razoavelmente insolúvel em água pura (solubilidade em etanol a

quente é de 50 mg/mL conforme Merck Index, 12th ed., #1673);

b) sensível a variações de pH (além do efeito do pH relatado neste

trabalho, estudos preliminares do AC em nosso laboratório revelam

que quando o mesmo é preparado em meio básico – adição de NaOH

1 mol/L para propiciar solubilização – a capacidade antioxidante é

bastante diminuída);

c) sensível a grandes variações de temperatura em presença de íons

ferro.

propomos que as propriedades deste polifenol é grandemente afetada

pela forma de preparo de suas soluções, sendo necessário um estudo

mais criterioso a respeito, especialmente no que concerne ao seu

comportamento frente a íons de ferro em altas temperaturas.

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