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RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA E
QUALIDADE DE EMBRIÕES DE NOVILHAS
E VACAS HOLANDESAS SUPLEMENTADAS
COM DUAS DOSES DE β-CAROTENO
ASSOCIADO AO TOCOFEROL
JOSÉ NÉLIO DE SOUSA SALES
2005
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JOSÉ NÉLIO DE SOUSA SALES
RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA E QUALIDADE DE EMBRIÕES DE
NOVILHAS E VACAS HOLANDESAS SUPLEMENTADAS COM DUAS
DOSES DE
β-CAROTENO ASSOCIADO AO TOCOFEROL
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Zootecnia, área de concentração em
Produção Animal, para a obtenção do título de
“Mestre”.
Orientador
Prof. José Camisão de Souza
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2005
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Sales, José Nélio de Sousa
Resposta superovulatória e qualidade de embriões de novilhas e vacas
holandesas suplementadas com duas doses de β–Caroteno associado ao
tocoferol / José Nélio de Sousa Sales. -- Lavras : UFLA, 2005.
69 p. : il.
Orientador: José Camisão de Souza.
Dissertação (Mestrado) – UFLA.
Bibliografia.
1. β–Caroteno. 2. Tocoferol. 3. Transferência de embrião. 4. Bovino. I. Universidade Federal de Lavras. II.
Título.
CDD-636.208245
JOSÉ NÉLIO DE SOUSA SALES
RESPOSTA SUPEROVULATÓRIA E QUALIDADE DE EMBRIÕES DE
NOVILHAS E VACAS HOLANDESAS SUPLEMENTADAS COM DUAS
DOSES DE
β-CAROTENO ASSOCIADO AO TOCOFEROL
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Zootecnia, área de concentração em
Produção Animal, para a obtenção do título de
“Mestre”.
APROVADA em 18 de fevereiro de 2005
Profa. Ana Tereza de Mendonça Viveiros UFLA
Prof. Hamilton Carmélio Machado da Silva UFMG
Prof. Marcos Neves Pereira UFLA
Prof. José Camisão de Souza
UFLA
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
A Deus, por eu ter a oportunidade
de estar aqui escrevendo esta
dissertação.
Aos meus pais, José Maria e Maura,
que, com muito carinho, amor e
atenção, mostraram-me o caminho
da verdade, justiça e paz.
DEDICO.
Aos meus irmãos, Christian, Sabrina
e Felipe, que muito torceram para
que eu alcançasse mais este objetivo.
À minha querida namorada, Fabíola,
por ser paciente, por ajudar na minha
formação acadêmica e profissional e
por oferecer muito carinho e
companheirismo.
OFEREÇO.
O Senhor é meu pastor nada me faltará.
(Salmo 23)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me criado e acompanhado por todos estes anos,
trazendo para mim pessoas de bom caráter e uma família muito especial.
Ao professor José Camisão de Souza, pela sua inteligência e
simplicidade, pela sua busca incansável de passar seus conhecimentos, por
ensinar me como ser bom profissional e pesquisador e, além disso, por ser um
grande amigo que confiou-me grande parte de seus trabalhos e vida.
À Universidade Federal de Lavras, por fornecer esta opção na minha
vida e à CAPES, pelo incentivo financeiro cedido durante o período do
mestrado.
A toda a minha família que, de uma forma ou de outra, fez parte da
minha vida, ajudando a formar meu caráter.
Aos professores Ana Tereza Mendonça Viveiros, Hamilton Carmélio
Machado da Silva e Marcos Neves Pereira, que prontamente aceitaram o convite
para fazer parte da banca de defesa e pelas contribuições a elaboração final desta
dissertação.
À Vallée S.A., em especial a Sérgio Cirillo, que conseguiu o
financiamento para o desenvolvimento do projeto junta a esta empresa
genuinamente brasileira.
À Fazenda Vista Alegre III, em especial ao Paulo Paiva e Carlos
Humberto por cederem seus animais para coleta de embriões e a todos os
funcionários desta fazenda que me auxiliaram na execução desse experimento,
em especial ao Vicente, Nerci (Preto) e João Lima que, além da ajuda durante
este período, demonstraram amizade e confiança.
Às outras fazendas onde foram coletados alguns animais, em especial
Dudu, Flávio, Gui, Carla, Marcos Brandão, Marcos Paulo, Adriano e Alvinho,
que permitiram a execução do experimento em suas propriedades.
Aos acadêmicos e amigos Ludmila, Lili, Leandro, Luthesco e Mariana,
que me auxiliaram na condução do meu experimento.
A Érika, do LDH da Escola de Veterinária da USP por realizar a análise
de progesterona e pela disponibilidade para solucionar dúvidas sobre
radioimunoensaio e à querida amiga Lílian, por conseguir que as análises de
progesterona fossem realizadas nesta instituição, além de estar sempre disposta a
ajudar seus amigos.
Aos professores da pós-graduação, por fazerem parte dessa nova
conquista.
Aos funcionários do Departamento de Zootecnia, Keila, Carlos e Pedro,
pelo auxílio e informações relevantes ao mestrado.
Aos novos amigos que obtive na pós-graduação e com quem passei
momentos agradáveis.
Aos meus verdadeiros e velhos amigos de Lavras, Quirino, Diovanni e
Pereira (in memorian), por momentos de muita felicidade que passamos juntos.
A todos os amigos que conquistei nesta vida.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS ..............................i
RESUMO ......................................................................................................ii
ABSTRACT ................................................................................................ iii
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................1
2 REFERENCIAL TEÓRICO......................................................................3
2.1 Transferência de embriões......................................................................3
2.1.1 Seleção de doadoras e receptoras...... ...................................................3
2.1.2 Sincronização do ciclo estral de doadoras ...........................................4
2.1.3 Superovulação ......................................................................................5
2.1.4 Coleta de embriões ...............................................................................6
2.1.5 Qualidade embrionária ........................................................................7
2.2 Antioxidantes, radicais livres e reações de oxidação ............................11
2.3
β-caroteno..............................................................................................14
2.3.1 Estrutura química e propriedades.....................................................14
2.3.2 Fontes naturais de carotenóides.........................................................16
2.3.3 Digestão dos carotenóides...................................................................17
2.3.4 Absorção e transporte dos carotenóides ............................................18
2.3.5 Armazenamento dos carotenóides .....................................................19
2.3.6 Funções do β-caroteno........................................................................19
2.3.6.1 Antioxidante.....................................................................................19
2.3.6.2 Precursor da vitamina A .................................................................20
2.3.6.3 Resposta imune................................................................................21
2.3.6.4 Reprodução......................................................................................21
2.3.6.5 Outras funções.................................................................................24
2.4 Vitamina E (Tocoferol)..........................................................................25
2.4.1 Definição.............................................................................................25
2.4.2 Estrutura química e propriedades.....................................................26
2.4.3 Fontes naturais de vitamina E............................................................28
2.4.4. Absorção e transporte da vitamina E................................................29
2.4.5 Armazenamento e excreção da vitamina E........................................29
2.4.6 Funções da vitamina E .......................................................................30
2.4.6.1 Coagulação sanguínea .....................................................................30
2.4.6.2 Resistência a doenças.......................................................................30
2.4.6.3 Ação antioxidante ............................................................................31
2.4.6.4 Ações na reprodução .......................................................................31
3 MATERIAL E MÉTODOS .....................................................................34
3.1 Localização e período experimental......................................................34
3.2 Animais..................................................................................................34
3.3 Sincronização, superovulação e inseminação artificial ........................34
3.4 Tratamentos ..........................................................................................36
3.5 Transferência de embriões....................................................................37
3.5.1 Coleta..................................................................................................37
3.5.2. Rastreamento dos embriões no laboratório......................................38
3.6 Coleta de sangue e análise de progesterona..........................................39
3.7 Delineamento experimental...................................................................40
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ..............................................................43
5 CONCLUSÕES........................................................................................50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................51
i
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
BSA albumina sérica bovina
cAMP adenosinmonofosfato cíclico
CSCCE enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol
DMPBS Dulbecco modificado de tampão salina-fosfato
DMSO dimetilsulfóxido
eCG gonadotrofina coriônica eqüina
FSH hormônio folículo estimulante
HDL lipoproteína de densidade alta
IA inseminação artificial
IM intramuscular
IQE índice de qualidade embrionária
LDL lipoproteína de densidade baixa
LH hormônio luteinizante
PMSG gonadotrofina sérica de égua prenhe
THF tetrahidrofurano
IU unidade internacional
VIAVP proporção de embriões viáveis
VLDL lipoproteína de densidade muito baixa
ii
RESUMO
SALES, José Nélio de Sousa. Resposta superovulatória e qualidade de
embriões de novilhas e vacas holandesas suplementadas com duas doses
de
β-caroteno associado ao tocoferol. 2005. 69p. Dissertação (Mestrado
em Zootecnia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
1
Avaliou-se o efeito da injeção intramuscular (IM) de β-caroteno e vitamina E na
produção e qualidade de embriões coletados vacas (n=86) e novilhas (n=91) que
foram sincronizadas (Crestar®) e superovuladas com 8 aplicações decrescentes
de FSH/LHp em intervalos de 12 horas. Os animais foram inseminados 12 e 24
horas após a observação do cio e a coleta realizada sete dias após a primeira
inseminação. Os animais foram alocados aleatoriamente para um dos três
tratamentos: 1) controle, 2) 800mg de β-caroteno e 500mg vitamina E e 3)
1.200mg de β-caroteno e 750mg de vitamina E. As injeções de suplementação
foram aplicadas no dia do implante e no início do protocolo superovulatório. A
qualidade embrionária foi estimada por um índice ou IQE (Excelentes*1 +
Bons*2 + Regulares*3 + Pobres*4 + Degenerados*5 + NF*5)/total de embriões
colhidos. Houve efeito de interação tipo de animal (novilha e vaca) vs
tratamento para o IQE (P=0,01) e para a proporção de embriões viáveis
(P=0,03), em que a qualidade embrionária foi melhorada em vacas
suplementadas com T1200, mas não em novilhas. Os IQE para novilhas e vacas
em controle, T800 e T1200 foram 2,64±0,29 e 3,59±0,29; 2,52±0,31 e
3,63±0,36; 2,91±0,28 e 2,69±0,31, respectivamente. A proporção de embriões
viáveis para novilhas e vacas nos tratamentos controle, T800 e T1200 foram
70±7 e 45±9; 74±8 e 45±11; 61±7,3 e 70±9, respectivamente. Houve efeito de
interação tratamento*tipo para o total de embriões viáveis (P=0,01). A
suplementação com β-caroteno e tocoferol aumentou o número de embriões
viáveis em vacas (3,50±1,12; 5,41±1,38 e 7,50±1,19 para controle, T800 e
T1200, respectivamente) mas diminuiu em novilhas (7,52±1,16; 5,60±1,23 e
3,94±1,12 para Controle, T800 e T1200, respectivamente). A aplicação de β-
caroteno associado ao tocoferol melhora a qualidade de embriões de vacas
holandesas superovuladas.
________________________________________________
1
Comitê orientador: José Camisão de Souza - UFLA (Orientador), Ana Tereza
Mendonça Viveiros - UFLA, Hamilton Carmélio Machado da Silva - UFMG e Marcos
Neves Pereira - UFLA.
iii
ABSTRACT
SALES, José Nélio de Sousa. Superovulatory response and embryo quality
of Holstein heifers and cows supplemented with two doses of
β-carotene
associate with tocopherol. 2005. 69p. Dissertation (Master in Animal
Science) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
1
To investigate the effect of betacarotene and vitamin E on bovine embryo
production and quality cows (n=86) and heifers (n=91) were synchronized
(Crestar®) and superovulated with 8 decreasing injections of FSH/LHp at 12h
intervals. Embryos were flushed seven days after the first AI on induce heat.
Animals were allocated randomly to one of three treatments: 1) control, 2)
800mg of β-carotene and 500mg of vitamin E (T800) and 3) 1,200mg of β-
carotene and 750mg of vitamin E (T1200). Supplemental injections were given
at implantion and first FSH injection. Embryo quality was measured by an index
or IQE (Excelent*1 + Good*2 + Regular*3 + Poor*4 + Degenerate*5 + NF*5) /
total embryo number. There was an interactive effect between animal type (cow
or heifer) and treatment for IQE (P=0.01) and for proportion of viable embryos
(P=0,03), where embryo quality was improved in cows supplemented with
T1200 but not in heifers. IQE for heifers and cows in control, T800 and T1200
were, 2.64±0.29 and 3.59±0.29; 2.52±0.31 and 3.63±0.36; 2.91±0.28 and
2.69±0.31 respectively. The proportion of viable embryos for heifers and cows
in control, T800 and T1200 were, 70±7 and 45±9; 74±8 and 45±11; 61±7.3 and
70±9, respectively. There was an interactive effect between animal type and
treatment for total viable embryos (P=0.01). Supplementation with β-carotene
and tocopherol increased the number of viable embryo in cows (3.50±1.12;
5.41±1.38 and 7.50±1.19 for control, T800 and T1200, respectively), but
decreased in heifers (7.52±1.16; 5.60±1.23 and 3.94±1.12 for control, T800 and
T1200, respectively). β-carotene and tocopherol supplementation is an
alternative to improve embryo quality in superovulated Holstein cows.
_________________________________________________
1
Guidance Committee: José Camisão de Souza - UFLA (Major Professor), Ana Tereza
Mendonça Viveiros - UFLA, Hamilton Carmélio Machado da Silva - UFMG and
Marcos Neves Pereira - UFLA.
1
1 INTRODUÇÃO
A transferência de embriões vem evoluindo desde sua origem, na década
de 1970, quando a coleta era realizada por método cirúrgico e a criopreservação
de embriões pouco eficiente, o que obrigava a realização de transferência de
embriões a fresco. Atualmente, mais de 100.000 coletas são realizadas por ano
no mundo, sendo feitas por método não cirúrgico e mais da metade dos embriões
colhidos são congelados.
Existem vários fatores que influenciam o sucesso da transferência de
embriões. Os principais são a superovulação, a qualidade do embrião coletado e
o estado geral da receptora. Em resposta à superovulação existe grande
variabilidade individual que limita sua utilização. Vários estudos da
foliculogênese, principalmente com o uso do ultra-som, vêm sendo realizados
para diminuir a variabilidade da resposta à superovulação entre as doadoras.
Dentre esses estudos, tem-se a formulação de protocolos para sincronizar o
início da onda folicular das doadoras com o momento de iniciar aplicação do
FSH para promover a superovulação.
A qualidade embrionária é muito importante em programas de
transferência de embriões, pois reflete diretamente na taxa de gestação após a
inovulação. Existem vários fatores que atuam na qualidade do embrião coletado.
Um deles seria o nutricional que ainda é pouco estudado tanto em doadoras
quanto em receptoras.
Dentre os fatores nutricionais que atuam na qualidade embrionária, têm-
se os antioxidantes, em especial o
β-caroteno associado ao tocoferol (vitamina
E). A utilização de β-caroteno e tocoferol melhora a eficiência reprodutiva em
várias espécies animais. No entanto, os efeitos desses antioxidantes ainda não
foram relacionados com a qualidade dos embriões em programas de
2
transferência. Outro fator que pode atuar na qualidade embrionária é a
concentração de progesterona, por aumentar a produção de fatores uterinos
responsáveis pela nutrição do embrião no período inicial de seu
desenvolvimento.
O objetivo deste experimento foi avaliar o efeito da injeção
intramuscular (IM) de
β-caroteno associado ao tocoferol na produção e
qualidade de embriões coletados de doadoras da raça holandesa.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Transferência de embriões
A transferência de embriões é uma biotécnica que permite recolher
embriões de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras, com a
finalidade de completarem o período de gestação. Sua importância básica para a
produção animal está na possibilidade da fêmea produzir número de
descendentes muito superior ao que seria possível obter fisiologicamente durante
sua vida reprodutiva (Reichenbach et al., 2002).
2.1.1 Seleção de doadoras e receptoras
Na maioria dos programas de transferência de embriões existem dois
critérios amplos para a seleção de doadoras: 1) superioridade genética, que
resulta no melhoramento das várias características produtivas como, por
exemplo, produção e composição de leite, taxa de crescimento, facilidade de
parto e resistência a doenças e 2) probabilidade de produzir grande número de
embriões viáveis (Seidel Junior & Seidel, 1991).
Após essa prévia seleção, realiza-se a avaliação do estado geral e
reprodutivo para determinar as possíveis alterações que comprometam a resposta
do animal ao processo de coleta de embriões. Para doadora no puerpério deve-se
observar um período mínimo de 60 dias após o parto para iniciar o programa de
transferência. Elas precisam estar ciclando normalmente e devem apresentar
histórico de pós-parto normal, sem distúrbios endócrinos e de infecções
inespecíficas do trato genital (Seidel Junior & Seidel, 1991; Reichenbach et al.,
2002).
4
As receptoras constituem parte fundamental no programa de
transferência de embriões porque precisam conceber e levar a gestação a termo.
A aquisição desses animais é de custo elevado e a manutenção é dispendiosa.
Novilhas, primíparas e pluríparas que apresentem ciclo estral regular, que
tenham parido há mais de 60 dias, em que o puerpério tenha decorrido
normalmente e que estejam livres de doenças ou anomalias do trato reprodutivo,
podem ser selecionadas como receptoras de embriões (Seidel Junior & Seidel,
1991).
As receptoras devem ter porte compatível com a raça do embrião a ser
transferido, para garantir gestação normal e parto livre de auxílio obstétrico, bem
como ser capaz de produzir leite suficiente para amamentar e permitir que a cria
se desenvolva normalmente. A seleção final da receptora de embriões somente
deve ocorrer no dia da transferência, em função dos sinais de estro evidenciados
após a sincronização e da avaliação do corpo lúteo (Reichenbach et al., 2002).
2.1.2 Sincronização do ciclo estral de doadoras
Em programas de transferência de embriões, a sincronização de doadoras
é indicada quando se pretende concentrar as coletas em um único dia. Esta
prática permite a racionalização dos procedimentos e melhor aproveitamento das
receptoras disponíveis (Reichenbach et al., 2002). A sincronização do ciclo
estral pode ser obtida por meio de uma ou duas injeções IM de prostaglandina.
No caso de duas aplicações, elas devem ser feitas em intervalos de 11-14 dias,
nos animais que apresentarem ciclo estral regular (Burfening et al., 1978). O
ciclo estral de um grupo de doadoras pode também ser sincronizado por
tratamento com progestágenos impregnados em dispositivos intravaginais
(Macmillan & Peterson, 1993; Mapletoft et al., 2003) ou implantes auriculares
(Tregaskes, et al., 1994).
5
2.1.3 Superovulação
Logo após o nascimento, os ovários de fêmeas bovinas contêm milhares
de folículos, entretanto, a minoria desenvolve, matura e ovula durante a vida
reprodutiva. No início da onda folicular, um grupo de folículos é recrutado para
iniciar o desenvolvimento por mecanismo ainda desconhecido, permanecendo o
restante em aquiescência (Hafez & Hafez, 2000).
No grupo de folículos que iniciam a emergência da onda, um deles é
selecionado, torna-se dominante e continua seu desenvolvimento à frente dos
demais. Este folículo começa a produzir grande quantidade de estradiol 17
β,
inibina e outros fatores hormonais (Bodensteiner et al., 1996; Ginther et al.,
1996) que induzem o restante dos folículos, chamados folículos subordinados, à
regressão e à atresia (Sunderland et al., 1994).
Aproximadamente 20 a 30 folículos emergem durante cada onda
folicular em raças taurinas e cerca de 45 pequenos folículos (<5mm) em
novilhas de raças zebuínas. A maioria deles tem potencial para alcançar o
estádio pré-ovulatório com estimulação do crescimento e ovulação por
administração de gonadotrofinas (Monniaux et al., 1983; Adams, 1994; Buratini
Júnior et al., 2000; Barros & Nogueira, 2001).
O aproveitamento mais racional dos folículos que se tornariam atrésicos
pode ser obtido por meio da superovulação. A superovulação pode ser definida
como o método hormonal de estimular diversos folículos terciários a se
desenvolverem até o estádio pré-ovulatório, com subseqüente ovulação e
formação do corpo lúteo. O tratamento superovulatório tem como objetivo suprir
a deficiência da concentração de FSH antes que o folículo dominante promova a
redução da concentração endógena dessa gonadotrofina (Reichenbach et al.,
2002).
6
Existem alguns tratamentos hormonais para induzir a superovulação. Um
deles seria a gonadotrofina sérica de égua prenhe (PMSG ou eCG), administrada
uma única vez no início do período superovulatório, associada (Alfuraiji et al.,
1993) ou não a anti-PMSG (Boland et al., 1978). O outro seria o FSH puro ou
associado ao LH. O FSH, extraído de pituitária de suínos, ovinos ou eqüinos, é o
mais utilizado em bovinos para promover a superovulação. As aplicações são
realizadas durante quatro dias, com duas aplicações intervaladas de 12 horas em
doses decrescentes (Donaldson, 1989).
2.1.4 Coleta de embriões
A coleta é realizada entre o sexto e oitavo dia após a primeira
inseminação artificial (IA) e normalmente é feita 12 horas após o início do cio.
Nesse período, os embriões encontram-se flutuando em um filme líquido no
lúmen da ponta dos cornos uterinos, o que permite sua captação mediante
técnica de lavagem dos mesmos (Reichenbach et al., 2002).
A coleta não cirúrgica pode ser realizada em sistema aberto ou fechado.
A lavagem uterina é realizada pela introdução transcervical de uma sonda
(Sonda Foley Siliconizada Rusch Gold
®
, Rusch, Kamunting, Malásia) em ambos
os sistemas (Reichenbach et al., 2002).
No sistema fechado não existe contato do meio de lavagem com o
ambiente exterior. Neste sistema, o meio de lavagem introduzido no corno
uterino é recolhido por um sistema composto de dois tubos de plástico flexíveis,
sendo um o recipiente contendo o meio de coleta e o outro um filtro para a
obtenção dos embriões. Logo após a lavagem do útero, o material é vertido em
placa de petri, onde, com o auxilio de um estereomicroscópio, são realizadas a
busca e a avaliação dos embriões (Wright, 1981).
7
2.1.5 Qualidade embrionária
A qualidade do embrião é importante para determinar o sucesso da
transferência (Abe et al., 2002). Existem vários métodos de avaliação dos
embriões, dentre eles a mensuração da atividade enzimática (Schilling et
al.,1979, citados por Abe et al., 2002) e o consumo de glicose (Renard et al.,
1980). Esses testes são úteis para predizer a sobrevivência embrionária após a
transferência, mas requerem complexo equipamento e prolongado período de
cultura dos embriões, inviabilizando sua utilização no campo. A avaliação
morfológica tem sido amplamente usada para determinar a qualidade
embrionária, útil para predizer uma possível taxa de gestação para determinado
grupo de embriões após a transferência (Shea, 1981; Lindner & Wright, 1983).
Os embriões foram classificados em cinco estádios de desenvolvimento,
segundo Lindner & Wright (1983): 1) mórula - quando as superfícies dos
blastômeros que formam a massa de células central podem ainda ser distinguidas
e existe estreito espaço entre a massa de blastômeros e a zona pelúcida; 2)
mórula compacta - quando não existe distinção entre as superfícies dos
blastômeros e o espaço entre a massa central e a zona pelúcida torna-se maior;
3) blastocisto inicial - quando pequena cavidade começa a se formar
(blastocele) e a massa de células interna adquire a forma; 4) blastocisto -
quando o embrião ocupa quase todo o espaço dentro da zona pelúcida, a massa
de células internas torna-se mais distinta, mas o diâmetro do embrião, incluindo
a zona pelúcida, continua inalterado; 5) blastocisto expandido - quando o
diâmetro do embrião aumenta e a espessura da zona pelúcida se reduz a
aproximadamente 1/3 da espessura original. Além desses estádios de
desenvolvimento do embrião, podem-se encontrar óvulos não fertilizados. Na
Figura 1 estão representados os estádios de desenvolvimento do embrião.
8
FIGURA 1 Estádios de desenvolvimento embrionário encontrados em coletas
realizadas entre o 6º e o 8º dias após a primeira inseminação
artificial. A- óvulo não fecundado, B- mórula, C- mórula
compacta, D- blastocisto inicial, E- blastocisto, F- blastocisto
expandido (Seidel Junior & Seidel, 1991).
9
Lindner & Wright (1983) descreveram a avaliação da qualidade de
embriões bovinos coletados de vacas superovuladas. Eles identificaram quatro
categorias com base nos parâmetros morfológicos, tais como forma, cor,
tamanho do espaço perivitelínico, número de blastômeros extrusos e
degenerados e número e tamanho de vesículas. A qualidade dos embriões pode
ser dividida em: Grau I - embriões excelentes, em estádio de desenvolvimento
que corresponde ao esperado no dia da coleta, zona pelúcida intacta e esférica,
massa de células homogêneas com células de tamanho uniforme, nenhum ou
poucos fragmentos de blastômeros no espaço perivitelínico; Grau II - embriões
bons, em estádio de desenvolvimento que corresponde ao esperado no dia da
coleta, pequeno desvio da forma e cor se comparado ao grau I, alguns
fragmentos ou debris celulares no espaço perivitelínico e ou formação de
pequenas vesículas nos blastômeros; Grau III - embriões regulares, em estádio
de desenvolvimento que corresponde ao esperado, irregularidades moderadas na
forma geral da massa embrionária ou tamanho, cor e densidade dos blastômeros,
maior quantidade de células e restos celulares no espaço perivitelínico, se
comparada ao grau II; Grau IV - embriões pobres, em estádio de
desenvolvimento que não corresponde ao esperado, muitos fragmentos e debris
celulares no espaço perivitelínico. Além disso, maiores e mais vesículas na
massa celular, claras mudanças degenerativas nos blastômeros, menos da metade
da massa celular está intacta. Os embriões que não se enquadraram em nenhum
desses graus foram classificados como degenerados.
O termo embriões viáveis designa as estruturas compreendidas entre os
graus I e IV e são os que, quando inovulados em receptoras, podem resultar em
prenhez. O restante das estruturas, os não viáveis, são os chamados degenerados
ou não fertilizados. Na Figura 2 estão apresentados os graus de qualidade. Após
a avaliação, os embriões foram transferidos a frescos para as receptoras
(inovulação) ou congelados.
10
FIGURA 2 Graus de qualidade dos embriões. 1- mórula de grau I, 2- mórula
de grau II, 3- mórula grau III, 4- mórula grau IV, 5- embriões
degenerados (Seidel Junior & Seidel, 1991).
11
Segundo Abe et al. (2002), a classificação proposta por Lindner &
Wright (1983), com base na morfologia, condiz com as alterações ultra-
estruturais observadas nos blastômeros. O número de junções do tipo gap foi
maior em embriões classificados como excelentes ou bons. As microvilosidades
projetadas dos blastômeros estavam menos desenvolvidas em embriões de baixa
qualidade e a quantidade de vesículas e gotículas de lipídios foi maior em
embriões classificados em grau III ou IV. Células ou fragmentos celulares foram
frequentemente encontrados em embriões de baixa qualidade e o complexo de
Golgi estava mais desenvovido em embriões de alta qualidade. Houve diferença
ultra-estrutural entre os embriões de grau I e II (alta qualidade) e entre os graus
III e IV (baixa qualidade).
2.2 Antioxidantes, radicais livres e reações de oxidação
Antioxidante é qualquer substância que, presente em baixas
concentrações quando comparada ao substrato oxidável, atrasa ou inibe a
oxidação deste substrato de maneira eficaz (Sies & Stahl, 1995). Eles podem ser
classificados em primários ou secundários, quanto ao modo de ação. Os
antioxidantes primários reagem com radicais lipídicos de alta energia, para
convertê-los a produtos termodinamicamente mais estáveis. Os antioxidantes
secundários, os preventivos, têm função de retardar a iniciação da reação em
cadeia (Arora et al., 1998).
Os agentes antioxidantes, que protegem as células contra os efeitos dos
radicais livres, podem ser classificados em antioxidantes enzimáticos ou não-
enzimáticos. Os enzimáticos podem ser superóxido desmutase, catalase, enzimas
de reparo e glutationa peroxidase. Os não enzimáticos podem ser β-caroteno,
tocoferol, vitamina C, flavonóides, glutationa e selênio (Sies, 1993).
12
Denomina-se radical livre toda molécula que possui um elétron ímpar
em sua órbita externa, fora de seu nível orbital, gravitando em sentido oposto
aos outros elétrons. Este elétron livre favorece a recepção de outras moléculas, o
que torna os radicais livres extremamente reativos, inclusive com moléculas
orgânicas. Essa configuração faz dos radicais livres moléculas altamente
instáveis, com meia-vida curtíssima e quimicamente muito reativas (Ashok &
Ali, 1999).
A atividade das células do sistema antioxidante e a concentração de
vitamina E diminuíram durante o envelhecimanto do animal, levando ao
aumento gradual dos danos oxidativos nas células (Rani e Panneerselvam,
2001). A presença dos radicais é crítica para a manutenção de muitas funções
fisiológicas normais (Pompella, 1997). Segundo Arechiga et al. (1998b), a
produção de radicais livres poderia representar uma fonte de infertilidade, em
razão do tecido ovariano esteroidogênico, o espermatozóide e o embrião pré-
implantação serem sensíveis a danos provocados por esses agentes oxidantes. O
oxigênio singleto, molécula reativa de oxigênio gerada por fotossensibilização
(
1
O
2
), o radical superóxido (O
2
-
) e a radical hidroxila (OH
·
) são alguns exemplos
de radicais livres.
A oxidação é o processo pelo qual a substância perde um ou mais
elétrons. A substância que recebe o eletro é conhecida como agente oxidante.
Nas células de mamíferos, os fosfolipídios contidos nas membranas celulares e
membrana de organelas contêm grande quantidade de ácidos graxos
poliinsaturados que podem sofrer a ação de agentes oxidantes, como os
peróxidos (Metre & Callan, 2001). As insaturações dos ácidos graxos são
susceptíveis à ação dos agentes oxidantes (peróxido de hidrogênio, radical
superóxido e íons hidroxila). Esses agentes são produzidos durante o
metabolismo aeróbico e 3% a 5% do oxigênio consumido são reduzidos a agente
oxidante na célula (Chance et al., 1979).
13
Durante o processo de oxidação celular pode ocorrer a reação em cadeia
que se inicia com ataque de um radical livre nos fosfolipídios da membrana,
levando à formação de um radical lipídio que reage com oxigênio da molécula
tornando-se radical peroxil. Este radical formado ataca outra ligação dupla do
fosfolipídio de membrana, que reage com oxigênio e assim propaga a reação de
destruição da membrana em cadeia (Porter et al., 1995). Um esquema dessas
reações é apresentado na Figura 3.
FIGURA 3 Representação esquemática da reação em cadeia em fosfolipídios
de membrana celular.
14
Os grupos sulfídricos (-SH) presentes nas membranas também são alvos
da oxidação. Eles são encontrados predominantemente nos aminoácidos que
contêm enxofre e servem para ligar os fosfolipídios da membrana às proteínas
associadas, tais como enzimas, receptores e canais iônicos. A oxidação destes
grupos pode resultar na alteração da conformação que, conseqüentemente, muda
a função dessas proteínas (Metre & Callan, 2001).
2.3
β-caroteno
Apesar de existir mais de 600 diferentes carotenóides, apenas 10% são
precursores da vitamina A, sendo o β-caroteno a forma mais ativa e disponível
na dieta (Bendich & Olson, 1989; Olson, 1989). As plantas não produzem
vitamina A, que é encontrada somente no reino animal, mas produzem grande
variedade de seu precursor, os carotenóides. Uma unidade internacional (IU) de
β-caroteno é definida como a atividade de 0,6µg de β-caroteno que corresponde
a 0,3µg de retinol (vitamina A) (Bendich & Olson, 1989; McDowell, 1989;
Olson, 1989).
Carotenóides são pigmentos lipossolúveis produzidos naturalmente pelas
plantas e organismos que realizam fotossíntese. Apresenta coloração variada,
devido a uma série de ligações duplas conjugadas (Bendich & Olson, 1989).
2.3.1 Estrutura química e propriedades
A maioria dos carotenóides pode ser descrita pela fórmula geral
C
40
H
56
O
n
, em que n varia de 0-6, formado por oito unidades isoprenóides,
organizadas de tal maneira que, no centro da molécula, ocorre reversão delas
(Castenmiller & West, 1998).
15
Os hidrocarbonetos (n=0) são chamados de carotenóides acíclicos
(licopeno) ou derivados cíclicos do licopeno (
α, β, γ, e δ-caroteno) e os
carotenóides oxigenados (astaxantina, cantaxantina, zeaxantina, criptoxantina e
lutein) são conhecidos como xantofilas (Castenmiller & West, 1998; Osterlie et
al., 2000). As estruturas químicas de alguns carotenóides estão representadas na
Figura 4.
FIGURA 4 Estrutura química de alguns carotenóides. β-caroteno (I),
astaxantina (II), cantaxantina (III), zeaxantina (IV).
16
β-caroteno (Figura 5) é uma molécula altamente lipofílica, sensível à
oxidação, às altas temperaturas e à luz solar, insolúvel em solventes com etanol
e acetona e solúvel em dimetilsulfóxido (DMSO) e tetrahidrofurano (THF). O β-
caroteno possui baixo potencial ionizante e ponto de fusão de 180°C
(McDowell, 1989).
β-caroteno
FIGURA 5 Estrutura química do β-caroteno.
2.3.2 Fontes naturais de carotenóides
Os carotenóides são encontrados em todas as partes verdes de plantas
em crescimento. Embora a cor amarela dos carotenóides seja mascarada pela
clorofila, todas as partes da planta em crescimento são ricas em carotenóides. Na
Tabela 1 apresenta-se a quantidade de β-caroteno em alguns alimentos para
animais. Feno de leguminosa é mais rico em carotenóides do que feno de
gramíneas. A planta pode perder 50% ou mais do seu valor máximo de
carotenóides durante o desenvolvimento (McDowell, 1989).
17
TABELA 1 Quantidade de
β-caroteno contidos em alguns alimentos em
miligramas por quilo (mg/kg).
Fonte mg/kg
Leguminosa e gramíneas verdes frescas 33-88
Feno de leguminosas (boa coloração verde) 40-59
Feno de leguminosas (sem cor, com traço verdes) 9-18
Feno de gramíneas 9-18
Silagem de milho ou sorgo 4-22
Adaptado de McDowell (1989).
O β-caroteno é uma molécula muito instável. No processo de ensilagem,
a concentração de β-caroteno diminui rapidamente e assim continua durante o
tempo de armazenamento. A degradação do β-caroteno é promovida por vários
fatores, como radiação ultravioleta da luz solar, oxigênio atmosférico (oxidação)
e enzimas (lipoxidase), que se tornam ativas pela decomposição das plantas
(McDowell, 1989).
2.3.3 Digestão dos carotenóides
Wing (1969) demonstrou que a digestibilidade aparente dos carotenos
em várias forragens para a alimentação de gado de leite é, em média, de 78%. As
variáveis que influenciam a digestibilidade dos carotenóides incluem mês de
colheita, tipo de forragem, espécie e matéria seca da planta. Em geral, a
digestibilidade dos carotenóides é maior nos meses quentes e menor nos meses
frios. Vários trabalhos indicam que quantidade apreciável de carotenóides pode
18
ser degradada no rúmen, isto é, 40% a 70% deles são degradados antes de chegar
ao intestino (McDowell, 1989).
2.3.4 Absorção e transporte dos carotenóides
O
β-caroteno não é assimilado da mesma forma pelas diversas espécies
animais, pois há considerável diferença na habilidade para absorvê-los da dieta.
Em algumas espécies, como ratos, suínos, ovinos, caprinos, coelhos e cães,
quase todo o caroteno se transforma em vitamina A no intestino. Em humanos,
bovinos e eqüinos, a absorção de carotenóides é expressiva (Parker, 1989).
O principal local de absorção de carotenóides é na mucosa do jejuno
proximal. Neste local, formam-se micelas de lipídios que servem como
carreadores dos carotenóides. Elas entram em contato com as células da mucosa,
nas quais os lipídios difundem da micela para a porção lipídica da membrana das
microvilosidades (McDowell, 1989). A absorção dos carotenóides ocorre por
difusão passiva, similar à do colesterol e dos produtos da lipólise de triglicérides
(Hollander & Ruble Júnior, 1978; Parker, 1996). Após a absorção na mucosa
intestinal, os carotenóides são transportados via vasos linfáticos pelos
quilomicrons até a corrente sanguínea (Parker, 1996).
Huang & Goodman (1965) relataram que, em ratos 3%-6%, dos
carotenóides absorvidos passam do intestino para a linfa. A quantidade de
caroteno no plasma representa 1% do total encontrado no animal, sendo a maior
concentração encontrada no fígado (Schmitz et al., 1991).
Os carotenóides são transportados no plasma de humanos e animais
exclusivamente por lipoproteínas. As principais lipoproteínas são de densidade
baixa (LDL), densidade muito baixa (VLDL) e densidade alta (HDL). A LDL
transporta 58%-73%, a HDL 17%-26% e a VLDL 10%-16% do β-caroteno no
sangue. Esse padrão de distribuição é similar ao do colesterol (Parker, 1996).
19
O
β-caroteno, normalmente transportado para os ovários é incorporado
aos componentes lipídicos do HDL em bovinos (O’Shaughnessy & Wathes,
1988). Em cães (Weng et al., 2000) e em gatos (Chew et al, 2001), após sua
absorção da dieta, é transportado para o corpo lúteo e endométrio uterino.
2.3.5 Armazenamento dos carotenóides
Os carotenóides são armazenados na forma de vitamina A. Mais de 90%
permanecem armazenado no fígado e o restante fica armazenado nos pulmões,
rins, adrenais e sangue. Pequena quantidade é encontrada nos órgãos e tecidos.
Os carotenóides armazenados em tecidos, geralmente permanecem alojados na
gordura corporal, evidenciado pela sua coloração amarelo-escuro (McDowell,
1989). Grande quantidade de β-caroteno está nos ovários, principalmente no
corpo lúteo, dando a essa estrutura a cor amarelo-brilhante (O’Fallon & Chew,
1984; Haliloglu et al., 2002). Segundo Chew et al. (1984), a concentração de β-
caroteno é maior no corpo lúteo ovariano do que em outros tecidos, como
fígado e tecido adiposo.
2.3.6 Funções do β-caroteno
O β-caroteno, além do papel de precursor de retinol (vitamina A), tem
outras funções biológicas, principlamente ligadas à reprodução (Bindas et al.,
1984a; Krinsky, 1993).
2.3.6.1 Antioxidante
Vários autores relatam os efeito antioxidante promovido pelos
carotenóides, sendo o β-caroteno o de maior ação. Alguns mostram a capacidade
20
dos antioxidantes em destruir radicais livres, potentes oxidantes (Krinsky, 1989;
Hill et al., 1995; Sies & Stahl, 1995; Everett et al., 1996) e outros relatam sua
eficiência em extinguir o oxigênio singleto (DiMascio et al., 1989; Conn et al.,
1991; Cantrell et al., 2003).
2.3.6.2 Precursor da vitamina A
Bioconversão é o método pelo qual os carotenóides são convertidos à
vitamina A na célula animal. Os carotenóides precursores de vitamina A são
convertidos a retinol pela ação da enzima 15-15’-carotenóide dioxigenase. Esse
processo ocorre primariamente nos enterócitos, embora a enzima ativada seja
encontrada em outros tecidos, como o fígado. Há controvérsias sobre o fato da
clivagem ser excêntrica ou central. Na clivagem excêntrica, somente uma
molécula de retinal é produzida (Castenmiller & West, 1998). Se ela for central,
cada molécula de
β-caroteno clivada origina duas moléculas de retinal que
podem ser reduzidas a retinol e, então, esterificadas (Mohamed et al., 2001).
Após a bioconversão, os carotenóides passam a ter função indireta
mediada pela vitamina A. São várias as funções da vitamina A, dentre elas a da
visão (Nelson & Cox, 2000), da resposta imune (Combs Junior, 1992), do
crescimento (Ganguly et al., 1980; Ross et al., 2000) e da reprodução (Chew &
Archer, 1983; Talavera & Chew, 1988; Chew, 1993; Besenfelder et al., 1996).
Na reprodução, a vitamina A participa da produção de progesterona por
meio de estimulação da síntese e ativação da enzima de clivagem da cadeia
lateral do colesterol que transforma o colesterol em pregnenolona (Jayaram et
al., 1973). Além disso, a vitamina A modula a atividade da enzima θ
5
-3β-
hidroxiesteróide desidrogenase que converte pregnenolona em progesterona
(Islabão, 1982). Além disso, a vitamina A reduz a incidência de cistos ovarianos
em vacas (Schweigert & Zucker, 1988), melhora o desenvolvimento do embrião
21
e, conseqüentemente, diminui a mortalidade embrionária em suínos (Chew et al.,
1982; Brief & Chew, 1985).
2.3.6.3 Resposta imune
Alguns estudos têm demonstrado que os carotenóides podem intensificar
a função do sistema imune por meio de sua capacidade de inibir a peroxidação
em cadeia e extinção do oxigênio singleto (Bendich, 1991). O
β-caroteno eleva a
resposta proliferativa de linfócitos T e B, aumenta células T-citotóxicas e
estimula secreção de fator de necrose tumoral alfa (Bendich & Shapiro, 1986).
2.3.6.4 Reprodução
Vários pesquisadores têm demonstrado tanto em condições de
laboratório (in vitro) quanto em animais (in vivo) que há uma relação ente o β-
caroteno e a fisiologia reprodutiva. O efeito da suplementação com β-caroteno
na fertilidade é um tópico muito controverso. Alguns pesquisadores
encontraram respostas benéficas com a suplementação com β-caroteno em
vacas leiteiras (Bindas et al., 1984a; Ascarrelli et al., 1985; Iwanska &
Strusinska, 1997), outros não observaram benefícios (Bindas et al., 1984b;
Akordor et al., 1986). Apenas um trabalho observou que a suplementação com
β-caroteno teve efeito adverso à fertilidade (Folman et al., 1987). As causas
para tal discrepância podem decorrer de variação no número de animais, da
quantidade e da duração da suplementação com β-caroteno, do ambiente onde
foram realizados os experimentos e do manejo (Arechiga et al., 1998a).
O β-caroteno pode ser necessário para adequada esteroidogênese,
possivelmente pela sua ação como antioxidante (Young et al., 1995). Ele pode
influenciar a função reprodutiva por aumentar a secreção de progesterona.
22
Vários trabalhos relatam que o
β-caroteno estimula a produção de progesterona,
tanto in vitro (Talavera & Chew, 1987; Graves-Hoagland et al., 1988;
O’Shaughnessy & Wathes, 1988; Arikan & Rodway, 1997) quanto in vivo
(Weng et al., 2000; Chew et al., 2001).
A ação na esteroidogêneses pode ser explicada pelo fato do β-caroteno
ser conhecido como agente antioxidante e destruir radicais livres. O processo de
esteroidogênese resulta na formação de grande quantidade de radicais livres e a
alta concentração de β-caroteno nos ovários e adrenal pode proteger as células
de tal dano oxidativo (Arikan & Rodway, 2000). A primeira evidência do efeito
antioxidante do β-caroteno na célula luteínica, relatada por Yong et al. (1995),
mostrou que a suplementação com β-caroteno na cultura de células luteínicas
reduziu a quantidade de ligações entre a enzima de clivagem da cadeia lateral do
colesterol e os doadores de elétrons, a andrenodoxina. Esse resultados foram
confirmados por Rapoport et al. (1998), quando determinaram as concentrações
de β-caroteno e o citocromo esteroidogênico P450 em diferentes estádios de
desenvolvimento do corpo lúteo de bovinos, para estimar sua correlação com o
perfil esteroidogênico. Para os autores, a correlação foi significativa entre as
concentrações de citocromo P450 luteais, β-caroteno e progesterona plasmática.
Há evidências do controle da esteroidogêneses por radicais livres,
principalmente o radical superóxido. A fosfolipase C do mecanismo de
transdução pode estimular a produção de radicais superoxidos que inibem a
síntese de progesterona no ovário de ratas (Bilska et al., 1991). Assim, o β-
caroteno age dentro da membrana celular dos lipídios, destruindo os radicais
livres, impedindo sua ação. Isto pode estar envolvido na habilidade do β-
caroteno em manter a síntese de progesterona nas células luteínicas (Arikan &
Rodway, 2000). Além disso, o útero secreta um grupo de proteínas que são
críticas para o desenvolvimento do embrião e do feto. Em cães, essas proteínas
específicas do útero são estimuladas pela progesterona ou requerem
23
progesterona para sua manutenção (Buhi et al., 1992). Porém, efeito adverso foi
observado por Pusztai et al. (2000), segundo os quais a extrema
hipercarotenemia diminuiu a produção de progesterona nas células da granulosa.
Vitaminas, ácido retinóico, retinal e
β-caroteno podem estimular passos
da esteroidogênese que são normalmente regulados pelo LH. Estes passos
incluem: 1) degradação de proteínas ligantes, 2) indução da síntese da enzima de
clivagem da cadeia lateral do colesterol (CSCCE), 3) estimulação da atividade
da CSCCE, 4) aumento da concentração de cAMP e 5) ativação da proteína
quinase C dependente de cAMP (Talavera & Chew, 1988).
Além dessa ação na esteroidogênese, existem vários efeitos benéficos do
β-caroteno na reprodução. Durante a gestação, o útero passa por mudanças
drásticas para aumentar o sucesso da implantação e sobrevivência do concepto.
Durante esse estádio de alta atividade, o útero está, provavelmente, sobre alto
grau de estresse oxidativo. Portanto, o transporte de β-caroteno para o
endométrio poderia proteger o ambiente uterino contra danos oxidativos,
melhorando o local para o desenvolvimento do embrião (Weng et al., 2000).
Segundo Chew et al. (2001), o β-caroteno pode proteger o ovário e o ambiente
uterino dos danos oxidativos, tornando o ambiente mais favorável para o
desenvolvimento do embrião.
Vários estudos relatam o efeito benéfico do β-caroteno na reprodução em
diversas espécies. A administração parenteral de β-caroteno em camundongos
(Chew & Archer, 1983) e suínos (Brief & Chew, 1985; Kostoglou et al., 2000)
diminuiu a mortalidade embrionária e aumentou o tamanho da leitegada ao
nascimento. Em vacas de leite, a suplementação com β-caroteno na dieta
diminuiu a incidência de retenção de placenta e metrites quando comparadas
com vacas não suplementadas ou suplementadas somente com vitamina A
(Michal et al., 1994).
24
Em vacas alimentadas com dietas com baixa concentração de
β-caroteno
e adequada vitamina A, observaram-se diminuição da taxa de prenhez (Cooke &
Combden, 1978), atraso na ovulação, maior incidência de morte embrionária
(Wang et al., 1988b) e maior taxa de retenção de placenta (Michal et al., 1990)
quando comparada às vacas suplementadas com β-caroteno. A suplementação
com β-caroteno diminuiu o número de inseminações por concepção em vacas
(Snyder & Stuart, 1981).
Em suínos, injeções de β-caroteno aumentaram a concentração de
proteínas uterinas específicas (Chew et al., 1982) e diminuíram a mortalidade
embrionária (Brief & Chew, 1985). Essas observações sugererem que o β-
caroteno pode ser importante fisiologicamente para suínos. Segundo Murray et
al. (1985), glicoproteínas de alto peso molecular foram identificadas no lúmen
uterino de gatos domésticos. Esses autores afirmaram que a produção dessas
proteínas pode ser estimulada pela ação do β-caroteno. Chew et al. (1982)
demonstraram que injeções de β-caroteno em suínos aumentaram a produção de
proteínas específicas do útero.
Segundo Peltier et al. (1997), injeções diárias de β-caroteno em éguas
durante o pró-estro e estro não afetaram a secreção de estradiol. A administração
de β-caroteno também não afetou o tamanho do folículo, evidenciando que este
carotenóide não atua sobre as variáveis ligadas à foliculogênese.
2.3.6.5 Outras funções
Junções do tipo gap fazem ligações entre as células do organismo para
formar comunicação sinsicial, permitindo que pequenas moléculas passem de
uma célula para outra. O β-caroteno pode estimular a formação de junções do
tipo gap entre as células (Zhang et al., 1991; Zhang et al., 1992; Frommel et al.,
1994; Bertram & Bortkiewicz, 1995; Stahl et al., 1997). O mecanismo de ação
25
do
β-caroteno parece ser por estimulação da conexina 43, gene compilado para
produção de proteínas transmembranas. Seis destas proteínas formam um arranjo
hexamérico em volta da porção central hidrofílica. Dois dos arranjos formam a
unidade estrutural da junção do tipo gap. O β-caroteno, em concentrações
fisiológicas (média de 10
-6
M), aumenta as junções do tipo gap, permitindo
melhor comunicação entre as células (Burri, 1997). A formação dessas junções
gap pode ser importante na coordenação da função de células luteínicas (Redmer
et al., 1991; Bilska et al., 1996).
O β-caroteno inibe a ação das lipoxigenases que estão envolvidas no
metabolismo do ácido araquidônico e da 3-hidroxi-3-metilglutaril coezima A
redutase que atua na biossíntese de colesterol e isoprenóides não esteroidais
(Canfield et al., 1992).
2.4 Vitamina E (tocoferol)
2.4.1 Definição
A vitamina E é um álcool orgânico lipossolúvel isolado inicialmente
como α-tocoferol. Este isômero é o mais biologicamente ativo, representando a
maior parte da atividade da vitamina E nos alimentos. A atividade de outros
isômeros do α-tocoferol é limitada (Bregelius & Traber, 1999; Metre & Callan,
2001).
A palavra tocoferol deriva do grego “tokos”, que significa parto ou
progênie, “pherein”, que significa fazer nascer e “ol”, que designa álcool. Uma
unidade internacional (IU) de vitamina E é definida como a atividade de 1 mg de
acetato de α-tocoferol (Lal Thankur & Srivastava, 1996).
26
2.4.2 Estrutura química e propriedades
A vitamina E está distribuída na natureza como tocoferóis e tocotrienóis.
Oito formas químicas de vitamina E são encontradas: quatro tocoferóis (
α, β, γ, e
δ) e quatro tocotrienóis (α, β, γ, e δ) na natureza (Lal Thakur & Srivastava,
1996). A estrutura química do α-tocoferol e α-tocotrienol está representada na
Figura 6.
α-tocoferol
α-tocotrienol
FIGURA 6 Estrutura química do α-tocoferol e α-tocotrienol.
27
Segundo McDowell (1989), a diferença entre o tocoferol e tocotrienol
são as insaturações da cadeia lateral presentes no tocotrienol. Diferenças entre as
formas químicas da vitamina E (
α, β, γ e δ) são devido à posição e ao número de
grupo metil no anel aromático (Figura 7).
Formas químicas do tocoferol R1 R2 R3
α- TOCOFEROL CH3 CH3 CH3
β- TOCOFEROL CH3 H CH3
γ- TOCOFEROL H CH3 CH3
δ- TOCOFEROL H H CH3
FIGURA 7 Diferenças estruturais entre as formas de vitamina E, adaptado
McDowell (1989).
O α-tocoferol é um óleo amarelo insolúvel em água, mas solúvel em
solventes orgânicos. Os tocoferóis são extremamente resistentes ao calor, mas
prontamente oxidáveis. O α-tocoferol é um excelente antioxidante natural que
protege carotenóides e outros materiais oxidáveis nos alimentos e no corpo (Lal
Thakur & Srivastava, 1996).
28
2.4.3 Fontes naturais de vitamina E
Os ruminantes, como outros mamíferos, não sintetizam vitamina E. Por
isso, ela precisa ser fornecida ao animal pela dieta. Forragens verdes frescas são
as mais confiáveis e abundantes fontes de vitamina E para os ruminantes (Frye
et al., 1991; Herdt & Stowe, 1991).
A vitamina E está amplamente distribuída na natureza em óleos
vegetais, produtos cereais contendo óleos, ovos, fígado, legumes e, em geral,
plantas verdes. Está presente em abundância nos grãos de cereais,
particularmente na semente. Existe grande variação da quantidade de vitamina
E, que pode variar de 3 a 10 vezes o valor encontrado de
α-tocoferol em um
mesmo tipo de alimento. Por exemplo, pode haver diferença sazonal de até 5
vezes na quantidade de α-tocoferol no leite de vaca (Metre & Callan, 2001).
Os tocoferóis são naturalmente instáveis, por isso, perdas substanciais na
atividade da vitamina E ocorrem nos alimentos quando são processados e
armazenados. Quando os alimentos são peletizados, a destruição de vitamina E
pode ocorrer se a dieta não contiver antioxidantes suficientes para prevenir sua
acelerada oxidação em condições de umidade e alta temperatura. Sais de ferro
podem destruir completamente a vitamina E e a desidratação artificial ou o
processamento de forrageiras e grãos diminuem a disponibilidade de tocoferol.
(McDowell, 1989). A quantidade de vitamina E nas plantas diminuiu
marcadamente com a aproximação da maturidade e a fenação resultou em rápida
diminuição da atividade da vitamina E. Feno e silagem são geralmente pobres
em vitamina E, por causa do processo de oxidação (Metre & Callan, 2001).
Jukola et al. (1996) observaram que a concentração de vitamina E no
soro de novilhas e touros em crescimento é mantida quando a silagem de
gramínea de alta qualidade é fornecida. Excessiva suplementação com vitamina
A pode acelerar a degradação da vitamina E (Frye et al., 1991).
29
2.4.4 Absorção e transporte da vitamina E
A absorção intestinal de lipídios e vitaminas lipossolúveis, como a
vitamina E, é dependente da função pancreática, secreção biliar, formação da
micela e penetração através da membrana intestinal (Ullrey, 1981). Defeitos em
qualquer dessas etapas resultam em danos na absorção (Torres, 1970; Sokol et
al., 1983, 1989).
A maioria da vitamina E é absorvida no intestino como álcool livre e
pequena quantidade como éster. Os ésteres são largamente hidrolisados na
parede intestinal e os álcoois penetram na parede do intestino e são transportados
via vasos linfáticos até a circulação geral (McDowell, 1989).
Após a absorção no intestino delgado, a vitamina E é transportada até o
fígado onde é armazenada. Nos hepatócitos ela se liga a lipoproteínas de baixa
densidade, que a transportam através da corrente sanguínea até os tecidos (Frye
et al., 1991).
Segundo Bjorneboe et al. (1986), as lipoproteínas são os veículos de
transporte de lipídios no plasma. Esses carreadores são, principalmente,
sintetizados no intestino (quilomicrons e HDL) e no fígado (VLDL e HDL) ou
são formados no plasma (LDL e HDL). O
α-tocoferol é transportado no sangue
associado às lipoproteínas.
2.4.5 Armazenamento e excreção da vitamina E
A vitamina E é armazenada em todos os tecidos corporais, sendo a
maior parte no fígado. No entanto, a quantidade presente no fígado é uma
pequena fração do total armazenado no corpo, em contraste com a vitamina A,
cujas reservas corporais, 95%, estão no fígado (McDowell, 1989). O baixo
estoque de vitamina E no fígado pode ser explicado por sua baixa toxicidade
30
(Kappus & Diplock, 1992). A concentração de
α-tocoferol na membrana é,
aproximadamente, de uma molécula de α-tocoferol para 1000 moléculas de
lipídios de membrana (Kagan et al., 1990).
A vitamina E é excretada na forma livre na bile. A biotransformação do
α-tocoferol nos hepatócitos origina a α-tocoferil quinona. Este produto é
degradado nos rins a ácido α-tocoferônico, seguido por conjugação e eliminação
na urina (Lal Thakur & Srivastava, 1996; Metre & Callan, 2001).
2.4.6 Funções da vitamina E
A principal função da vitamina E em mamíferos é a função antioxidante,
pela ação no controle celular da peroxidação de lipídios, demosntrados pelos
efeitos na resposta inflamatória, sistema imune e reprodução (Metre & Callan,
2001).
2.4.6.1 Coagulação sanguínea
A vitamina E inibe a agregação plaquetária protegendo o ácido
araquidônico da peroxidação. Esse ácido é necessário para a formação de
prostaglandinas envolvidas na agregação plaquetária (Panganamala & Cornwell,
1982).
2.4.6.2 Resistência a doenças
Considerável atenção está direcionada no papel da vitamina E na
proteção de leucócitos e macrófagos durante a fagocitose. A vitamina E pode
ajudar estas células a sobreviverem a produtos tóxicos que são produzidos pelo
animal para destruir as bactérias da ingesta. Camundongos alimentados com
31
dieta deficiente em vitamina E foram incapazes de produzir resposta humoral
satisfatória e esta diminuição da reação imune contribuiu para aumentar a
susceptibilidade à infecção bacteriana (McDowell, 1989). Bezerros que
receberam 125 UI de vitamina E diariamente foram capazes de maximizar suas
respostas imunes, comparados com bezerros não suplementados (Reddy et al.,
1987).
2.4.6.3 Ação antioxidante
A vitamina E é o componente vital para a defesa celular contra
compostos que causam oxidação das moléculas celulares em mamíferos, agindo
como antioxidante (Bendich, 1993; Hogan et al., 1993; Miller et al., 1993;
Bregelius & Traber, 1999). A vitamina E pode prevenir a oxidação de várias
formas: a) destruindo os agentes oxidantes, b) diminuindo a conversão de
agentes oxidantes menos reativos a mais reativos, c) facilitando o reparo de
danos causados pelos agentes oxidantes, d) providenciando um ambiente
favorável para a atividade de outros antioxidantes (Miller et al., 1993; Zhang &
Omaye, 2001).
2.4.6.4 Ações na reprodução
Desde a década de 1920 já se têm relatos sobre a relação entre a vitamina
E e a reprodução. A aplicação de vitamina E preveniu a reabsorção embrionária
e a morte fetal em ratos (Evans & Bishop, 1922).
Segundo Das & Chowdhury (1999), dietas com deficiência de vitamina
E afetam a fisiologia uterina de ratas em crescimento, levando à significativa
diminuição do peso uterino. Esse fato pode estar relacionado à interrupção da
comunicação entre o hipotálamo-hipófise-gônadas. Martin & Moore, citados por
32
Das & Chowdhury (1999), demonstraram que, depois de prolongado período de
deficiência de vitamina E, o ciclo estral de ratas tornou-se anormal e
impossibilitou que elas ficassem prenhas. Estes efeitos deletérios na reprodução
podem ser explicados pela diminuição da concentração de estrógenos em
animais com deficiência de vitamina E (Das & Chowdhury, 1999), visto que a
vitamina E está concentrada em tecidos produtores de hormônios esteróides,
agindo na proteção da atividade esteroidogênica do citocromo P-450 contra a
peroxidação de lipídios (Takayanagi et al., 1986; Staats et al., 1988).
Segundo Wang et al. (2002) e Olson & Seidel (2000), a suplementação
com vitamina E melhorou o desenvolvimento embrionário “in vitro” após
aplicação de vitamina E no meio de cultura. O mesmo pode ser observado “in
vivo”, pelo fato de existir grande quantidade de vitamina E nos ovários e fluido
folicular (Attaran et al., 2000). Segundo Tao et al. (2004), a suplementação de
meio de cultura com vitamina E melhorou a maturação dos ovócitos e o
desenvolvimento dos embriões provenientes dessas culturas.
A administração de vitamina E pode aumentar a função neutrofílica
(Eicheir et al., 1994; Politis et al., 1995). Talvez o aumento da atividade
neutrofílica promova a remoção de microorganismos e auxilie os tecidos
uterinos na remodelação e involução. Por isso, muitos autores relatam efeitos
benéficos da aplicação de vitamina E na prevenção de doenças do pós-parto. A
aplicação de vitamina E acelera a involução uterina em vacas com metrite
(Harrison et al., 1984; Erskine et al., 1997) e no pré-parto, diminui a incidência
de retenção de membranas fetais, melhorando a reprodução de vacas leiteiras
(Trinder et al., 1969; Segerson et al., 1981; Eger et al., 1985; Mueller et al.,
1988; Olson, 1996; Erskine et al., 1997; LeBlanc et al., 2002, 2004). A vitamina
E melhorou a taxa de fertilização em vacas (Segerson Júnior et al., 1977) e em
ovelhas (Segerson & Ganapathy, 1981).
33
Outra explicação para os efeitos benéficos da vitamina E na reprodução
seria a manutenção da fluidez das membranas pela sua ação antioxidante. A
maioria das funções de proteção do sistema imune depende da fluidez das
membranas celulares que é mantida principalmente pela camada de lipídios. A
peroxidação de lipídios diminui a fluidez da membrana, afetando a ação do
sistema imune. A perda da fluidez da membrana está relacionada diretamente
com a diminuição da habilidade dos linfócitos em responder aos desafios
impostos ao sistema imune (Bendich, 1993).
Vários trabalhos relatam os efeitos benéficos promovidos pela
associação
β-caroteno e tocoferol na performace reprodutiva de várias espécies
animais. Mas, os efeitos dos antioxidantes ainda não foram relacionados com a
qualidade de embriões bovinos em programas de transferência, quando
produzidos in vivo. Além do efeito indireto mediado pela vitamina A, muitos
trabalhos demonstraram o efeito direto do β-caroteno na reprodução, relacionado
a diferentes mecanismos de atuação. Devido ao efeito direto, a utilização do β-
caroteno torna-se mais interessante do que a vitamina A. Por essas razãoes,
justifica-se realizar um experimento para avaliar o efeito destas vitaminas na
qualidade embrionária.
A hipótese levantada é de que a suplementação parenteral de β-caroteno
associado ao tocoferol melhora a qualidade embrionária e aumenta a produção
de embriões de doadoras superovuladas da raça holandesa.
34
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Localização e período experimental
O experimento foi realizado na Fazenda Vista Alegre III, no município
de Curvelo que localiza-se no centro-norte de Minas Gerais. Também foram
coletados embriões em outras fazendas na região sul de Minas Gerais. O
experimento foi conduzido de outubro de 2003 a setembro de 2004.
3.2 Animais
Foram utilizados 177 doadoras da raça holandesa, sendo 90 vacas e 87
novilhas com idade média de 38 meses, variando de 24 a 144. Para entrarem no
experimento, as doadoras não apresentavam anormalidades ginecológicas
detectadas por palapação retal e estavam, no mínimo, com 60 dias de parição e
com condição corporal acima 3 (na escala de 1 a 5). Para a análise dos dados
foram consideradas somente as doadoras que responderam à superovulação, ou
seja, as que obtiveram mais que duas estruturas após a lavagem uterina.
3.3 Sincronização, superovulação e inseminação artificial
No dia 1, após a avaliação ovariana por palpação retal nas doadoras que
estavam ciclando, fez-se o implante auricular subcutâneo de 3 mg de
norgestomet (CRESTAR
®
, Intervert International B.V., Boxmeer, Holanda),
associado à aplicação IM de 6 mg de norgestomet e 10 mg de valerato de
estradiol. No dia 6, ocorreu o início da superovulação das doadoras. No
protocolo superovulatório aplicaram-se 500 UI (vacas) e 400 UI (novilhas) de
35
hormônio folículo estimulante (FSH), originário de extrato pituitário suíno
(PLUSET
;
I.F. Serono, Roma, Itália), distribuído em dosagens decrescentes de
100, 100, 75, 75, 50, 50, 25, 25 UI (vacas) e 80, 80, 60, 60, 40, 40, 20, 20 UI
(novilhas) durante quatro dias, em duas aplicações diárias, intervaladas de 12
horas. A luteólise foi induzida com aplicação IM de 500 µg de DL cloprostenol
(SINCROSIN
, Vallee S.A., Montes Claros, Brasil) 60 horas após a aplicação
da primeira dose de FSH. Na sétima aplicação de FSH, retirou-se o implante
auricular subcutâneo e no dia 10, realizou-se a observação de cio das doadoras.
Os animais que apresentavam sinais de cio foram inseminados 12 e 24 horas
após a detecção por técnico experiente (Figura 8). No 17° dia, realizou-se a
coleta de embriões.
FIGURA 8 Esquema de sincronização, superovulação e inseminação artificial
das doadoras do experimento.
36
3.4 Tratamentos
As doadoras (n=177) receberam os tratamentos (suplementados ou não
com
β-caroteno e tocoferol) aleatoriamente, pela ordem de entrada no tronco
para avaliação reprodutiva, mantendo-se o número equilíbrio por tipo (novilhas
e vacas) e produção de leite (vacas). A suplementação por injeção intramuscular
ocorreu no momento do implante subcutâneo de norgestomet e no primeiro dia
da superovulação (Figura 9):
Controle = injeção IM de veículo (n=59, 29 vacas e 30 novilhas);
T800 = 800 mg de β-caroteno e 500 mg tocoferol aplicados por
injeção IM (n=59, 28 vacas e 31 novilhas);
T1200 = 1200 mg de β-caroteno e 750 mg de tocoferol aplicados por
injeção IM (n=59, 29 vacas e 30 novilhas).
FIGURA 9 Esquema de aplicação dos tratamentos durante o período
experimental.
37
A utilização dessas doses teve como base o trabalho realizado por
Arechiga et al. (1998b), com a aplicação de 800 mg de
β-caroteno ou 500 mg de
tocoferol; injeções nessas doses melhoraram a fertilidade de vacas. As
aplicações foram realizadas no início do experimento pelo fato do β-caroteno e
tocoferol poderem atuar no desenvolvimento dos ovócitos durante o crescimento
folicular (Haliloglu et al., 2002). Além disso, observaram que as concentrações
séricas de β-caroteno e tocoferol permaneceram elevadas por, no mínimo, 19
dias após a primeira aplicação IM (Arechiga et al., 1998b). Esse fato permite que
o β-caroteno e tocoferol atuem no desenvolvimento inicial do embrião (Weng et
al., 2000).
Outros autores (Shaw et al., 1995; Amaral, 2003) obtiveram melhora na
qualidade embrionária e no número de embriões viáveis quando injetaram
vitamina A, em dose única, no início do protocolo superovulatório. Utilizou-se
β-caroteno associado ao tocoferol em razão do α-tocoferol ser excelente
antioxidante natural que protege carotenóides no corpo do animal (Weiss et al.,
1994; Lal Thakur & Srivastava, 1996).
3.5 Transferência de embriões
3.5.1 Coleta
As coletas de embriões foram realizadas sete dias após a primeira
inseminação, por procedimento não cirúrgico, em sistema fechado (Wright,
1981). O primeiro passo para a realização da coleta não cirúrgica é a palpação
dos ovários por via retal para a avaliação da resposta superovulatória, mediante
contagem dos corpos lúteos. As doadoras que apresentavam resposta ao FSH, ou
seja, mais que dois corpos lúteos, recebiam anestesia epidural, 5 ml de lidocaína
(Anestésico L
, Eurofarma Laboratórios Ltda, São Paulo, Brasil). A coleta foi
realizada pelo método transcervical com o auxílio de sonda (Sonda Foley
38
Siliconizada Rusch Gold
®
, Rusch, Kamunting, Malásia) contendo balão inflável
na sua extremidade distal. Após a limpeza da genitália externa da doadora, esta
sonda, com mandril de metal em seu lúmen, foi introduzida até o corpo do útero
para a realização da lavagem dos cornos uterinos. Posteriormente, o balão foi
inflado com 3 a 7 ml de Dulbecco Modificado Phosphate Buffered Saline
(DMPBS-FLUSH, Nutricell, Campinas, Brasil) e, em seguida, retirou-se o
mandril do interior da sonda, acoplando-a ao equipo em forma de Y. Esse
equipo apresenta duas extremidades, uma para permitir a entrada do meio de
cultura no útero da doadora e outra para a sua saída. Na extremidade de entrada
encontra-se o meio de coleta (DMPBS) e, na de saída, um filtro coletor de 100
µm (figura 12). Para a coleta, foram utilizados cerca de 1000 ml de DMPBS em
temperatura variando de 20ºC a 30ºC. Ao final da coleta, o filtro foi desacoplado
do tubo e levado ao laboratório.
3.5.2 Rastreamento dos embriões no laboratório
No laboratório, o meio contido no filtro foi recolhido em placas de petri
com diâmetro de 100 mm. A busca dos embriões foi feita por
estereomicroscópio (Bausch & Lomb Sterozoom 4 microscope
®
, Baush &
Lomb, New York, USA) e os encontrados foram transferidos para placas de petri
com diâmetro de 35 mm contendo DMPBS acrescido de BSA 0,4% (Bovine
Serum Albumin, 200mg/50ml de PBS) com o auxílio de uma micropipeta de
vidro (tubo capilar microematócrito). A avaliação dos embriões foi realizada
segundo método proposto por Lindner & Wright (1983), mediante consenso de
dois avaliadores. Um índice de qualidade embrionária (IQE) foi proposto com
base nessa classificação [IQE = (excelentes*1 + bons*2 + regulares*3 +
pobres*4 + (degenerados + não fertilizados)*5] / total de embriões colhidos).
Valores mais próximos de 1 indicam melhor qualidade. Outra variável, com base
39
nessa classificação, foi a proporção de embriões viáveis (VIAVP), caracterizada
pela soma das estruturas viáveis (excelente + bons + regulares + pobres),
dividida pelo total de estruturas recuperadas.
3.6 Coleta de sangue e análise de progesterona
Amostras de sangue foram coletadas, de 43 novilhas, por venopunção de
vasos coccígeos para determinar a concentração plasmática de progesterona.
Segundo Adams et al. (1981) e Thomas et al. (1992), a progesterona aumenta a
produção de proteínas útero-específicas que são importantes para a nutrição dos
embriões no período de pré-implantação. Foram realizadas cinco coletas de
sangue, nos dias 1, 6, 10, 13 e 17, conforme conforme esquema na Figura 10.
FIGURA 10 Esquema da coleta de sangue de novilhas.
40
As coletas de sangue nos dias 1 e 6 foram realizadas para dosar a
concentração de progesterona antes da aplicação dos tratamentos. Realizou-se a
coleta de sangue no dia 10 para comprovar-se que os animais estavam em estro,
menos de 1 ng/ml de progesterona (Moffat et al., 1993); as coletas 13 e 17 foram
realizadas para avaliar o efeito do
β-caroteno e vitamina E na produção de
progesterona após a superovulação. Após a coleta, o sangue foi levado ao
laboratório, centrifugado (2000 xg) durante 10 minutos para separação do soro e
armazenado em freezer a -21ºC.
A concentração de progesterona no plasma foi analisada em duplicatas
por radioimunoensaio utilizando o Coat-A-Count Progesterone
®
(Diagnostic
Products Corporation, Los Angeles, EUA). Os coeficientes de variação intra-
ensaio alto e baixo foram de 2,60% e 1,96%, respectivamente. O Coat-A-Count
Progesterone é um radioimunoensaio de fase sólida, no qual a progesterona
marcada com o
125
I compete pelos sítios de ligação dos anticorpos por período
fixo de tempo com a progesterona da amostra a ser analisada. Pelo fato dos
anticorpos estarem imobilizados na parede do tubo de polipropileno, uma
simples decantação do sobrenadante é suficiente para terminar a competição e
isolar a fração de progesterona radiomarcada ligada ao anticorpo. A leitura da
progesterona marcada é realizada em um contador gama que gera um número, o
qual é convertido, pela curva de calibração, em medida de progesterona presente
na amostra.
3.7 Delineamento experimental
O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso, mantendo-se o
número de animais em equilíbrio por tipo (novilha e vacas). Os animais foram
sorteados segundo a ordem de entrada no tronco para avaliação reprodutiva. As
variáveis propostas foram IQE, VIAVP, total de estruturas recuperadas e
41
embriões viáveis e taxa de fecundação analisadas pelo procedimento GENMOD
do Statistical Analysis System-SAS
®
(SAS, 1995). As médias do quadrado
mínimo foram calculadas pelo procedimento GLM do SAS
®
(SAS, 1995). O
seguinte modelo foi utilizado para as variáveis citadas anteriormente:
Y
i j
= µ + P
i
+ T
j
+ P
*
T
i j
+ e
i j
µ = constante associada a todas as observações;
P
i
= efeito de tipo i ( i = novilha e vaca);
T
j
= efeito do tratamento j ( j = controle, T800 e T1200);
P
*
T
i j
= interação entre tipo e tratamento;
e
i j
= erro experimental associado a Y
i j
que, por hipótese, tem distribuição de
Poisson, em que a média é igual a variância.
A variável concentração de progesterona foi analisada como medida
repetida pelo procedimento MIXED do SAS
®
(SAS, 1995). A estrutura de
covariância utilizada foi aquela com maior valor para o critério de informação de
Akaike, considerando a estrutura simetria composta (CS). As médias do
42
quadrado mínimo foram calculadas pelo procedimento GLM do SAS
®
(SAS,
1995). O modelo abaixo foi utilizado para a variável concentração de
progesterona:
Y
i j
= µ + C
i
+ T
j
+ C
*
T
i j
+ e
i j
µ = constante associada a todas as observações;
C
i
= efeito dia da coleta de sangue i ( i = 1, 2, 3 ,4 e 5);
T
j
= efeito do tratamento j ( j = controle, T800 e T1200);
C
*
T
i j
= interação entre dia da coleta de sangue e tratamento;
e
i j
= erro experimental associado a Y
i j
que, por hipótese, é independente e
identicamente distribuído em normal, com média zero e variância σ
2
.
43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No experimento, foram utilizadas 177 doadoras. Desses animais,
somente 132 responderam ao tratamento superovulatório, sendo 65 vacas e 67
novilhas. Retirou-se do experimento por não responderem ao protocolo
superovulatório (n=34), 5 novilhas e 6 vacas do controle, 6 novilhas e 8 vacas do
T800 e 4 novilhas e 5 vacas do T1200. As outras doadoras (n=11) saíram do
experimento em razão de algumas não estarem aptas a serem inseminadas (muco
com presença de infecção) ou por problemas ocorridos durante o período
experimental, como a perda do implante auricular de progestágeno, o que
resultou em diferença no número de animais entre os tratamentos.
Não houve efeito da suplementação de
β-caroteno associado ao tocoferol
na qualidade embrionária, mas houve efeito de tipo e da interação tipo de animal
vs tratamento (Tabela 2). Os embriões coletados de novilhas apresentaram
melhor qualidade. A qualidade embrionária melhorou em vacas que receberam a
maior dose de β-caroteno e tocoferol (T1200), mas não em novilhas. A
proporção de embriões viáveis (VIAVP) também não apresentou efeito de
tratamento, mas houve efeito de tipo e da interação tratamento vs tipo (Tabela
2). As novilhas tiveram maior proporção de embriões viáveis que as vacas. As
doadoras (vacas) que receberam a maior dose de β-caroteno e tocoferol (T1200)
tiveram maior proporção de embriões viáveis que as doadoras (vacas)
suplementadas com menor dose (T800) e do controle. Em novilhas também não
se observou efeito dos antioxidantes para a variável VIAVP. A diferença na
resposta observada entre vacas e novilhas pode ser explicada pelo fato da
atividade das células do sistema antioxidante diminuir durante o envelhecimanto
do animal, levando ao aumento gradual dos danos oxidativos nas células (Rani e
Panneerselvam, 2001).
44
TABELA 2 - β-caroteno e tocoferol na produção e qualidade de embriões de novilhas e vacas superovuladas da raça
holandesa. Dados de doadoras suplementadas com controle (veículo das vitaminas, n=46), T800 (800 mg β-caroteno
associado a 500 mg tocoferol, n=40) e T1200 (1200 mg β-caroteno associado a 750 mg tocoferol, n=46). Os números são
médias do quadrado mínimo, calculados pelo procedimento GLM do sistema SAS
®
- Statistical Analysis System.
Novilhas Vacas Tipo vs.
controle T800 T1200 controle T800 T1200 EPM Tipo Trat. Trat.
_____________P_____________
IQE 2,63 2,52 2,91 3,59 3,63
2,69
1,21 0,02 0,54 0,01
VIAVP (%) 70,00
74,00
61,00 45,00
45,00
70,00
33,95 0,05 0,64 0,03
Total
estruturas
10,17 8,30 7,27 7,45 11,33 10,25 6,47 0,26 0,48 0,07
Total
embriões viáveis
7,52
5,60
3,94
3,50
5,41
7,50
4,78 0,78 0,99 0,01
Taxa fecundação (%) 89,86 88,38 78,06 77,70 72,09 80,19 26,73 0,12 0,76 0,37
IQE - Índice de qualidade embrionária. VIAVP - Proporção de embriões viáveis. Tipo – Vaca ou novilha. Trat. – controle, T800. T1200. EPM –
Erro Padrão da Média
45
Vários resultados anteriores, apesar de utilizar-se a vitamina A e não o β-
caroteno, mostraram resultados semelhantes, Elmarini et al. (1999) obtiveram
melhora na qualidade embrionária em ratas suplementadas com vitamina A.
Silveira et al. (1999) observaram incremento na freqüência de embriões mais
desenvolvidos quando marrãs foram suplementadas com vitamina A. Segundo
Shaw et al. (1995), a aplicação de vitamina A melhorou a qualidade embrionária
em vacas superovuladas, consistente com resultados encontrados em suínos
(Britt et al., 1992; Coffey & Britt, 1993), ratas (Chew & Archer, 1983) e coelhas
(Besenfelder et al., 1996). A vitamina E tem efeito benéfico no desenvolvimento
embrionário, conforme relataram Olson & Seidel Júnior (1995, 2000).
Várias hipóteses têm sido propostas para explicar o efeito do β-caroteno,
da vitamina A e do tocoferol no início da embriogênese, incluindo os efeitos na
esteroidogênese (Graves-Hoagland et al, 1988), no crescimento e maturação
folicular (Schweigert & Zucker, 1988), no embrião (Harney et al., 1990) e na
atividade secretora do útero (Chew et al., 1982).
Este efeito benéfico pode ser explicado pelo fato de a vitamina A
estimular a ação da enzima de clivagem da cadeia lateral do colesterol (Ganguly
et al., 1980). Esta enzima transforma o colesterol em pregnenolona que, sob ação
da ∆
5
-3β- hidroxiesteróide desidrogenase, é transformada em progesterona.
Além da vitamina A, segundo Weng et al. (2000), o β-caroteno eleva a
concentração de progesterona. A progesterona (Adams et al. 1981; Thomas et
al., 1992) e o β-caroteno (Schweigert et al., 2002) podem aumentar a produção
da proteína de ligação do retinol (RBP) que, provavelmente, age no mecanismo
de nutrição dos embriões. Este estímulo pode ser explicado pelo fato do mRNA
para a proteína de ligação do retinol estar presente no concepto e no endométrio
de suínos, ovinos e bovinos durante o período de pré-implantação da prenhez e
sua expressão ser modulada pela progesterona (Harney et al., 1993; McDowell
et al., 1995).
46
Várias proteínas secretadas pelo útero são importantes para a
sobrevivência dos embriões. Durante o período pré-implantação, o concepto
depende de proteínas secretadas pelo útero para nutrição e proteção imunológica
(Roberts & Bazer, 1988; Bazer et al., 1991). O β-caroteno age na formação da
composição do fluído uterino, aumentando a secreção de fatores intra-uterinos
de importância para o desenvolvimento inicial do embrião, como o retinol, que é
secretado no lúmen uterino por um carreador específico, a proteína carreadora de
retinol (Clawintter et al., 1990; Harney et al., 1990).
Outro fator que poderia estar promovendo melhora na qualidade
embrionária em vacas seria o efeito antioxidante dessas duas vitaminas. O β-
caroteno e o tocoferol são bem conhecidos por agirem como agentes
antioxidantes, destruindo radicais livres, em razão de sua estrutura molecular.
Durante o processo de esteroidogênese, ocorre a formação de radicais livres.
Segundo Scherek & Baeuerle (1991), há evidências do seu envolvimento no
controle da produção de esteróides. Em ovários de ratas foi demonstrado que
esses agentes oxidantes inibem a síntese de progesterona (Gatzuli et al., 1991).
Assim, o β-caroteno, associado ao tocoferol, age nas membranas lipídicas
destruindo os radicais livres. Essa ação pode estar envolvida na habilidade deles
de manterem adequada síntese de progesterona.
A ação antioxidante do β-caroteno e da vitamina E pode auxiliar na
manutenção da qualidade dos embriões ou óvulos no ambiente tubo-uterino e
durante o desenvolvimento dos óvulos no folículo (Wang et al., 2002), visto que
existe quantidade significativa de vitamina E e β-caroteno nos ovários (Haliloglu
et al., 2002) e no fluído folicular (Attaran et al., 2000).
Segundo Arechiga et al. (1994), a vitamina E,
in vitro
, protege os
embriões jovens do efeito do choque térmico, um evento citotóxico que,
provavelmente, é mediado por radicais livres (Loven, 1988). Este efeito benéfico
explica-se pela ação antioxidante da vitamina E, que protege o espermatozóide e
47
o óvulo do ataque de agentes oxidantes que provocariam danos ao
desenvolvimento do embrião.
Outra ação promovida pelo β-caroteno, que poderia melhorar a qualidade
do embrião, seria a formação de junções do tipo gap. O β-caroteno pode
estimular sua formação entre as células (Zhang et al., 1991; Zhang et al., 1992;
Frommel et al., 1994; Bertram & Bortkiewicz, 1995; Stahl et al., 1997). A
formação dessas junções gap pode ser importante na coordenação da função de
células luteínicas (Redmer et al., 1991; Bilska et al. 1996). Além disso, essas
comunicações podem melhorar a distribuição dos nutrientes captados pelo
embrião no útero, por meio da passagem entre os blastômeros. Esta ação pode
diminuir o número de blastômeros extrusos que estão diretamente relacionados à
qualidade do embrião.
O interesse de melhorar a qualidade embrionária mediante a aplicação de
β-caroteno e tocoferol é justificado pelo fato da qualidade embrionária estar
diretamente correlacionada com a taxa de gestação em programas de
transferência de embriões. Embriões de melhor qualidade apresentam
incremento na taxa de gestação (Lindner & Wright, 1983; Hasler et al., 1987).
O total de estruturas recuperadas das doadoras que receberam β-caroteno
e tocoferol não foi diferente do total das que receberam o tratamento controle e
não foi diferente entre vacas e novilhas (Tabela 2). Esses resultados foram
semelhantes aos encontrados por Amaral (2003) e Shaw et al. (1995), quando
aplicaram vitamina A em vacas. Os resultados sugerem que o β-caroteno e a
vitamina E não atuam no número de óvulos recrutados na onda ovulatória e nem
na resposta superovulatória.
Não houve diferença significativa no total de embriões viáveis entre os
tratamentos e tipo de animal. No entanto, houve efeito de interação
tratamento*tipo , isto é, a suplementação com β-caroteno e tocoferol aumentou o
número de embriões viáveis em vacas, mas diminuiu em novilhas (Tabela 2).
48
Amaral (2003) também encontrou aumento no número de embriões
viáveis quando doadoras (vacas) receberam injeção de vitamina A no início do
protocolo superovulatório. Os resultados obtidos em vacas podem ser
justificados pelos efeitos benéficos promovidos pelas vitaminas na
esteroidogênese, na formação de junções do tipo gap e como antioxidante. Em
novilhas, explica-se pelo possível efeito embriotóxico provocado pelas altas
doses das vitaminas, visto que as novilhas que receberam menor dose tiveram
maior número de embriões viáveis. Este efeito tóxico para os embriões foi
observado
in vitro
por Wang et al. (2002), quando altas doses de tocoferol
promoveram a morte e a redução do desenvolvimento de embriões de
camundongo.
A taxa de fecundação das doadoras que receberam β-caroteno e tocoferol
não foi significativamente diferente daquelas que receberam o tratamento
controle e não houve efeito de tipo de animal para essa variável (Tabela 2). A
taxa de fecundação média foi de 81,3%, semelhante à encontrada por Dalton et
al. (2000) e inferior à observada por Sartori et al. (2004), que obtiveram taxa de
fecundação de 90,9%.
A concentração plasmática média de progesterona não diferiu entre os
tratamentos (
P
=0,70). Resultados semelhantes foram encontrado por Wang et al.
(1982) em novilhas da raça holandesa suplementadas diariamente com 300 mg
de β-caroteno por 6 a 8 semanas e por Peltier et al. (1997), em éguas
suplementadas com 400 mg β-caroteno por injeção intramuscular em dose única.
O β-caroteno também não alterou a concentração de progesterona em vacas de
leite (Wang et al., 1988a; Wang et al., 1988b) e em suínos (Chew et al., 1982;
Coffey & Britt, 1993). Esse resultado difere do encontrado em outros trabalhos,
em que o β-caroteno teve efeito positivo na produção de progesterona
in vivo
(Weng et al., 2000; Chew et al., 2001) e
in vitro
(Graves-Hoagland et al., 1988;
O’Shaughnessy & Wathes, 1988; Talavera & Chew, 1988; Arikan & Rodway,
49
2000). O resultado pode ser explicado pelo fato da concentração basal de β-
caroteno nas novilhas estar elevado tanto em animais tratados quanto em não
tratados (controle).
Houve diferença significativa da concentração média de progesterona
entre os dias de coleta, tendo a menor média sido obtida na amostra de sangue
retitrada no dia 10, abaixo de 1 ng/ml de progesterona, e a maior média na
amostra de sangue retitrada no dia 17 (18,10 ng/ml). A concentração média de
progesterona das coletas 1 e 6, foram respectivamente, 4,03 e 1,50 ng/ml. Estes
resultados condizem com o previsto antes da execução do experimento, visto
que os animais estariam com o progestágeno (norgestomet) até a amostra de
sangue retirada no dia 6, o que manteria a concentração de progesterona acima
de 1 ng/ml (Moffat et al., 1993). A amostra de sangue retirada no dia 10, no
momento em que os animais estavam em estro, fase caracterizada por apresentar
concentração de progesterona menor que 1 ng/ml (Christensen et al., 1974;
Adeyemo & Health, 1980; Díaz et al., 1986). A média da concentração desse dia
de coleta foi 0,13 ng/ml. A maior concentração de progesterona nas amostras de
sangue retitradas no dia 13 (7,89 ng/ml) e 17 (18,10 ng/ml) pode ser explicada
em função do maior número de corpos lúteos produzidos pela superovulação. O
aumento da produção de progesterona também foi observado por Benyei et al.
(2004).
50
5 CONCLUSÕES
A aplicação dos antioxidantes β-caroteno e tocoferol foi uma alternativa
para melhorar a qualidade de embriões de vacas superovuladas, não sendo
indicados para novilhas.
Além disso, o β-caroteno e a vitamina E não atuam na taxa de fecundação
(novilhas e vacas) e na produção de progesterona (novilhas).
51
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