( PDF ) Estudos farmacocinéticos de inibidores bowman-byrk da macrotyloma axillare em camundongos swiss

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ALEXANDRE GONÇALVES SANTOS

ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS DE INIBIDORES BOWMAN-

BYRK DA Macrotyloma axillare EM CAMUNDONGOS SWISS

Ouro Preto, março de 2006

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS DE INIBIDORES BOWMAN-

BYRK DA Macrotyloma axillare EM CAMUNDONGOS SWISS

AUTOR: ALEXANDRE GONÇALVES SANTOS

ORIENTADOR: Prof. Dr. Milton Hércules Guerra de Andrade

Disssertação submetida ao programa de Pós-

Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Ouro

Preto, como parte integrante dos requisitos para

obtenção do título de Mestre em Ciências

Biológicas, área de concentração: Bioquímica

Estrutural e Fisiológica.

Ouro Preto, março de 2006

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Este trabalho foi realizado no LABORATÓRIO DE ENZIMOLOGIA E BIOFÍSICA–

ICEB/NUPEB/UFOP, com auxílio das seguintes instituições:

CAPES – Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

UFOP – Universidade Federal de Ouro Preto

iii

Trago sempre comigo a certeza de que tudo

que faço é pela busca de crescer cada vez mais,

já que a vida é um constante aprendizado e

esse aprender deve ser intenso e duradouro.

Dedico este trabalho à Flávia, todos meus

familiares e amigos, grandes responsáveis pelo

meu crescimento e por minha formação pessoal

e profissional.

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus, meu grande pai e porto seguro ao qual dedico toda

minha existência, gratidão e confiança de amparo e força nas horas mais difíceis.

A meus pais que em todos os momentos me incentivaram e me apoiaram em meus

estudos de forma incondicional.

A Flávia minha companheira de todos os momentos, sempre atenta, paciente e

tolerante às minhas incertezas, impaciência e fraquezas.

Aos meus irmãos, sobrinhos e cunhados que de uma forma muito carinhosa me

deram força para a realização não só deste trabalho, mas de todos os feitos importantes de

minha vida.

Aos meus grandes amigos e irmãos Juninho e Marquinho que também me deram

muito apoio em todas as minhas decisões.

A meus familiares pelo incentivo e orações.

A todos amigos de Sete Lagoas, grandes companheiros que fizeram e fazem parte

do meu crescimento pessoal.

Aos amigos de graduação que sempre muito presentes e unidos fizemos uma turma

diferente.

Aos amigos e irmãos, inclusive a Dona Neném, da minha segunda e acolhedora

casa, República Móicana, “a tribo na qual eu vivi”.

À família Rezende por toda atenção e receptividade.

Agradeço de uma forma muito especial ao Laboratório de Biofísica nas pessoas

muito especiais do meu orientador Milton Guerra, meus amigos Zé Henrique, Marcos

Aurélio, Marcelo, Célio, Jorgino, Zé Wilson, Daniela, Grazielly, Suedali, Bráulio, Milton

Filho, Thiago, Lucas, Karina e Bruna. Este laboratório não se resume apenas a bancadas

de pesquisa, mas a bancadas de amizade, companheirismo e compreensão.

Aos amigos de Ouro Preto que tornaram mais agradável minha estada nessa cidade

tão diferente.

Agradeço a todo o NUPEB por meio de seus laboratórios, orientadores, secretária e

principalmente colegas de pesquisa e pós-graduação. Vocês me ensinaram muito sobre a

ciência e sobre a vida.

Ao pessoal do CNEN/CDTN – UFMG que me acolheram com muita atenção

durante a realização dos estudos com radioisótopos de Iodo, principalmente à D

Raquel

Gouveia com sua paciência e atenção na orientação dos trabalhos com Iodo.

SUMÁRIO

São crescentes as evidências de que o fator alimentar tem forte correlação com o

desenvolvimento de diferentes tipos de câncer. Dentre os componentes da dieta que

apresentam propriedades relacionadas à prevenção do desenvolvimento do câncer,

encontram-se os Inibidores de Bowman-Birk. Isolamos em nosso laboratório preparações

de Inibidores de Bowman-Birk de Macrotyloma axillare dotadas de altas atividades

específicas para inibição sobre tripsina e quimotripsina bovina, principalmente a preparação

de sementes germinadas. Esses inibidores tiveram seus parâmetros farmacocinéticos

determinados e comparados aos de inibidores de sementes de soja, que são os inibidores

dessa classe mais estudados. Os inibidores de Macrotyloma axillare se distribuem

amplamente pelos diversos órgãos de camundongos, porém apresentam uma marcante

diferença, que é uma significativa maior afinidade pelo estômago em relação aos inibidores

de soja. Os inibidores da Macrotyloma axillare se distribuem rapidamente quando

aplicados por via intravenosa, com volumes de distribuição de cerca de quatro vezes o

volume plasmático, porém são eliminados lentamente, com meias-vidas plasmáticas entre 7

e 15 horas. Quando aplicado em alças intestinais isoladas de camundongos Swiss, o

inibidor de soja chega a uma biodisponibilidade de aproximadamente 50%, enquanto os

inibidores de Macrotyloma axillare de sementes e cotilédones chegam a cerca de 30 e 40%

respectivamente. Entretanto a maior potência do inibidor de cotilédones de Macrotyloma

faz com que a atividade disponibilizada seja muito superior (cerca de nove vezes) à

disponibilizada pelo inibidor da soja.

vii

ABSTRACT

There are crowing evidences that dietary factors have a tight correlation with different

kinds of cancer development. Among the compounds of the diet related with cancer

development prevention, we could mention the Bowman-Birk Inhibitors. We isolated in our

laboratory preparations of Bowman-Birk Inhibitors from Macrotyloma axillare showing

high specific inhibitory activities over bovine trypsin and chymotrypsin enzymes, specially

the germinated seeds preparation. These inhibitors had their pharmacokinetics parameters

determinated and compared with soybeans inhibitors parameters, which are by the way, the

most studied inhibitors of this class. Macrotyloma axillare inhibitors are widely distributed

over Swiss mice organs, but they show an important difference in comparison with soybean

inhibitor biodistribution, which is a meaning bigger affinity for the stomach. Macrotyloma

axillare inhibitors when injected intravenously have a fast distribution, with distribution

volumes of approximately four folds the plasmatic volume, but they are eliminated slowly,

with plasmatic half-lifes between 7 and 15 hours. When applied in isolated intestinal loops

of Swiss mice, soybean inhibitors get to almost 50% of bioavailability, while Macrotyloma

axillare inhibitors from seeds and cotyledons get to 30 and 40% respectively. Meanwhile,

the biggest potency of cotyledons inhibitors of Macrotyloma makes available a bigger

activity (approximately nine folds) then soybean inhibitors do.

viii

ÍNDICE

• SUMÁRIO vii

• ABSTRACT viii

• Lista de Abreviaturas xiii

• Lista de Figuras xv

• Lista de Tabelas xviii

• 1. INTRODUÇÃO 2

1.1. O câncer e alguns de seus dados estatísticos 2

1.1.1. Definição e alguns dados importantes sobre os estudos do câncer 2

1.1.2. Informações relevantes sobre o câncer segundo o INCA 3

1.1.3. Estimativas de incidência e mortalidade por câncer no Brasil 5

1.1.4. Estudos que apóiam a intervenção dietética no controle do câncer 7

1.2. O que são inibidores do tipo Bowman-Birk, suas características e suas estruturas? 8

1.3.Distribuição dos BBI em angiospermas 10

1.4. Mecanismos de ação antitumoral dos inibidores de Bowman-Birk 12

1.4.1. Atividade antiinflamatória 12

1.4.2. Modulação da produção e liberação de radicais-livres 13

1.4.3. Prevenção do processo de transformação induzida por carcinógenos químicos ou

radiação 13

1.4.4. Reversão da iniciação ou expressão de oncogenes induzida por carcinógenos

químicos ou radiação 14

1.4.5. Controle do processo de apoptose e divisão celular, via inibição do proteassoma

1.4.6. BBI como agente terapêutico a atuar nos níveis de expressão de biomarcadores

utilizados no monitoramento da atividade preventiva do câncer 18

1.5. Farmacocinética dos inibidores de Bowman-Birk 19

1.6. Possibilidade de grande absorção de BBI via mecanismo paracelular 20

1.7. Toxicidade dos inibidores de Bowman-Birk 21

1.8. Razões para a utilização de inibidores de Bowman-Birk como quimiopreventivos 23

1.9. A leguminosa Macrotyloma axillare 27

1.10. Classificação Sistemática da Macrotyloma axillare 28

• 2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 31

2.1. Justificativas 31

2.2. Objetivo Geral 32

2.3. Objetivos específicos 32

• 3. MATERIAIS E MÉTODOS 34

3.1. Delineamento Experimental 34

3.2. Isolamento e Purificação dos inibidores 35

3.2.1. Obtenção das Sementes da Macrotyloma axillare 35

3.2.2. Obtenção dos cotilédones da Macrotyloma axillare 35

3.2.3. Preparo do Extrato Bruto de Macrotyloma axillare sementes e cotilédones 35

3.2.4. Precipitação por Tratamento Térmico do EB 20% 36

3.2.5. Precipitação por Etanol a Frio 36

3.2.6. Obtenção do extrato enriquecido (BBIC) soja 37

3.2.7. Dosagem de proteínas 37

3.3. Caracterização do inibidor 37

3.3.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida a 12 e 18% 37

3.3.2. Coloração dos géis de poliacrilamida 39

3.4. Atividades Inibitórias 40

3.4.1. Tripsina Bovina 40

3.4.2. Quimotripsina Bovina 40

3.5. Ensaios Biológicos 41

3.5.1. Estudos farmacocinéticos de BBI-I

125

em camundongos Swiss 41

3.5.2. Estudo da cinética plasmática dos BBIC soja, sementes e cotilédones (Java) em

camundongos Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina 44

3.5.3. Medida da absorção in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones de Java em

alças intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina 46

3.6. Análise estatística 48

• 4. RESULTADOS 50

4.1. Obtenção dos extratos enriquecidos de BBI (BBIC) 50

4.1.1. BBIC sementes e cotilédones de Macrotyloma axillare e de soja 50

4.2. Caracterização das atividades inibitórias das preparações enriquecidas de BBI 52

4.2.1. Atividades específicas para inibição da hidrólise do

-BApNA pela tripsina e

pela hidrólise do

-BTpNA pela quimotripsina 52

4.2.3 Estimativa da massa aparente e do grau de enriquecimento das preparações de

inibidores 53

4.3 Ensaios Biológicos 56

4.3.1 Marcação dos BBI de Macrotyloma axillare com I

125

4.3.2 Biodistribuição dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

camundongos Swiss 57

4.3.3 Análise dos homogenatos dos principais órgãos de camundongos Swiss

administrados com BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

4.3.4 Cinética plasmática dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

administrados por via intravenosa e oral em camundongos Swiss 61

4.3.5 Estudo da cinética plasmática dos BBIC soja, sementes e cotilédones (Java) em

camundongos Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina 63

4.3.6. Medida da absorção in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones em alças

intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina 63

• 5. DISCUSSÃO 71

5.1. Obtenção dos extratos enriquecidos de BBI – BBIC de sementes, de cotilédones

(Macrotyloma axillare) e de soja 71

5.1.1.Obtenção dos BBIC de sementes e de cotilédones (Macrotyloma axillare) 71

5.1.2.Obtenção dos BBIC de soja 72

5.2. Caracterização dos BBIC obtidos 72

5.3. Ensaios biológicos 73

5.3.1.Marcação dos BBI de Macrotyloma axillare com I

125

5.3.2.Biodistribuição dos BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

camundongos Swiss 73

5.3.3 Análise dos homogenatos dos principais órgãos de camundongos Swiss

administrados com BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

5.3.3. Cinética plasmática dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

administrados por via intravenosa e oral em camundongos Swiss 77

Administração intravenosa 77

5.3.4. Estudo da cinética plasmática dos inibidores de sementes, cotilédones e soja via

atividade inibitória sobre tripsina em camundongos Swiss 78

5.3.5. Medida da absorção in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones em alças

intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina 78

• 6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 81

• 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84

• Apêndices 95

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

• α: constante de distribuição;

• β: constante de eliminação;

• aa(s): aminoácido(s);

• ARE: antioxidant response elements;

• AUC: area under curve (área sob a curva)

• BApNA: Nα-Benzoil-

Arginil-p-Nitroanilida;

• BBI: Bowman-Birk Inhibitors (Inibidores de Bowman-Birk);

• BBIC: BBI Concentrate (extrato enriquecido ou concentrado de inibidores de

Bowman-Birk);

• Boc-Val-Pro-Arg-MCA: N-tert-Butoxi-carbonil-Valil-Prolil-Arginil 7-Amido-4-

Metilcumarina;

• BSA: Soroalbumina Bovina;

• BTpNA: Nα-Benzoil-

Tirosil-p-Nitroanilida;

• CDKs: cyclin-dependent kinases;

• CKIs: ciclin-dependent kinase inhibitors;

• ConA: lectina da Concanavalina A;

• DMSO: dimetilsulfoxido;

• EB 20%: Extrato Bruto a 20 % p/v;

• ERK: extracellular signal-related kinases;

• FDA: Food and Drug Administratrion (USA);

• I

125

: radioisótopo de Iodo;

• JNK: c-Jun N terminal kinase;

• KEAP1: Kelch-like ECH-associating protein;

• MAPK: mitogen-activated protein kinase;

• mCi: MilliCurie;

xiii

• NRF2: nuclear factor E2-related factor 2;

• NT: Não Tratado Termicamente;

• PBBI: Purified BBI (Fração purificada de inibidores de Bowman-Birk por técnicas

cromatográficas);

• PGPH: peptidil-glutamil peptídeo hidrolítica;

• PKC: protein kinase C;

• PMN: leucócitos polimorfonucleares;

• SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de dodecilsulfato de

sódio (SDS);

• t

1/2:

: tempo de meia-vida plasmática;

• TGI: trato gastrointestinal;

• TPA: 12-O-tetradecanoyl-phorbol-13 acetate;

• TT: Tratado Termicamente;

• UAI: Unidade de Atividade Inibitória;

• VD: volume de distribuição.

xiv

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: ilustração do começo e progressão da neoplasia de uma fase intraepitelial até uma

fase invasiva (Go et al., 2001)........................................................................................4

Figura 2: Estimativas de Incidência e Mortalidade para o Câncer no Brasil em 2002 (INCA,

2005)...............................................................................................................................6

Figura 3 : A Estrutura do BBI de soja, como determinado por Odani e Ikeneka (1973). ......9

Figura 4: Modelo postulado para mostrar a interação entre a protease, o inibidor de protease

anticarcinogênico e a expressão de c-myc. ...................................................................15

Figura 5: Aumento do influxo de nutrientes nas células intestinais pela via paracelular

(Daughrty e Mrsny, 1999). ...........................................................................................21

Figura 6: Indutores naturais de enzimas desentoxicantes regulam a expressão de genes que

codificam para tais enzimas através da transcrição do fator NRF2 (nuclear factor E2-

related factor 2).............................................................................................................24

Figura 7: Agentes quimioprotetores geralmente induzem ao estresse oxidativo, com a

“down-regulation” de moléculas anti-apoptóticas como Bcl-2 ou Bcl-x e com a “up-

regulation” de moléculas pró-apoptóticas como Bax ou Bak.......................................25

Figura 8: Macrotyloma axillare............................................................................................28

Figura 9: Ilustração esquemática da Macrotyloma axillare. (1) ramos de folhas e caule, (2)

flor e (3) vagem com sementes (Better Pastures for the Tropics - Axillaris.htm, 2003).

......................................................................................................................................29

Figura 10: fluxograma do delineamento experimental (Kumar et al., 2002; Yavelow et al.,

1985).............................................................................................................................34

Figura 11: Banho de órgão contendo jejuno-íleo de camundongo Swiss aplicado de BBIC

imerso em solução de Tyrode a 37ºC com borbulhamento de ar. ................................47

Figura 12: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do BBIC

sementes (linha 1) e padrão de massa molecular (PMM) de ConA (linha 2)..............50

Figura 13: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do padrão de

massa molecular (PMM) de ConA (linha 1) e BBIC cotilédones (linha 2) ................51

Figura 14: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do padrão de

massa molecular (PMM) de ConA (linha 1) e BBIC soja (linha 2) . As setas

vermelhas correspondem a bandas de contaminantes e não de BBI.............................51

Figura 15: Razão das atividades específicas os BBI de cotilédones de Java e de sementes de

soja em relação ao BBI de sementes de Java pela inibição da hidrólise do

-BApNA

por tripsina e

-BTpNA por quimotripsina .................................................................52

Figura 16: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE de BBIP

sementes (linha 1); BBIP cotilédones (linh2); padrão de massa molecular (PMM) de

ConA (linha 3); BBIC sementes (linha 4); BBIC cotilédones (linha 5) e BBIC soja

(linha 6) César et al. (2006)..........................................................................................54

Figura 17: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 12% SDS-PAGE da fração 60-

80% proveniente de precipitação com etanol (60-80), frações purificadas em Q-

Sepharose (Q1-Q5) e padrão de massa molecular (PMM) de ConA; sem tratamento

com o agente redutor 2-mercaptoetanol (Oliveira, 2004).............................................56

Figura 18: Médias e desvios (n=5) da biodistribuição dos inibidores de cotilédones e

sementes marcados com I

125

por grama de órgão de camundongos Swiss em relação à

dose total aplicada.........................................................................................................57

Figura 19: Perfil de eluição do padrão de BBI e homogenatos dos principais órgãos após

três horas da administração oral do inibidor de sementes marcado com I

125

camundongos Swiss. Coluna de exclusão molecular Sephadex G-50. .........................59

Figura 20: Perfil de eluição do padrão de BBI e homogenatos dos principais órgãos após

três horas da administração oral do inibidor de cotilédones marcado com I

125

camundongos Swiss. Coluna de exclusão molecular Sephadex G-50. ........................60

Figura 21: Cinética plasmática do BBI de sementes marcado com I

125

administrado por via

intravenosa em camundongos Swiss (n = 5).................................................................61

Figura 22: Cinética plasmática do BBI de cotilédones marcado com I

125

administrado por

via intravenosa em camundongos Swiss (n = 5)...........................................................62

Figura 23: Níveis de biodisponibilidade em 7 horas de contato BBIC sementes, cotilédones

e soja com íleos isolados de camundongos Swiss.........................................................64

xvi

Figura 24: Absorção in vitro de BBI de sementes e de cotilédones de Macrotyloma axillare

e de soja na dosagem de 8mg, expressa em UAI em função do tempo em jejuno-íleos

isolados de camundongos Swiss. ..................................................................................65

Figura 25: Absorção in vitro do inibidor de sementes em função do tempo em jejuno-íleos

isolados de camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção............66

Figura 26: Absorção in vitro do inibidor de cotilédones em função do tempo em jejuno-

íleos isolados de camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção...67

Figura 27: Absorção in vitro do inibidor de soja em função do tempo em jejuno- íleos

isolados de camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção............68

Figura 28: Biodistribuição de BBI -I

125

soja em camundongos Swiss (Billings, et al. 1992).

......................................................................................................................................74

Figura 29: Seqüência dos inibidores DE-3 e DE-4 (isoformas) obtidos de sementes de

Macrotyloma axillare (Joubert et al., 1979).................................................................76

xvii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Plantas florescentes que apresentam inibidores de proteases BBI, suas famílias e

designação no banco de dados do GenBank (Mello et al., 2002).................................11

Tabela 2: Quadro de rendimento e enriquecimento dos BBIC de sementes, cotilédones

(Macrotyloma axillare) e soja - Inibição da hidrólise do

-BApNA pela tripsina (T) e

-BTpNA pela quimotripsina (Q)...........................................................................53

Tabela 3: Estimação da massa aparentes dos inibidores obtidos de sementes, de cotilédones

(Macrotyloma axillare) e de soja pelos deslocamentos das bandas de cada inibidor

substituídos na equação da reta.....................................................................................54

Tabela 4: Perda de atividade inibitória pelos inibidores após sua marcação com I

125

..........56

Tabela 5: Comparação entre as médias de acúmulo de inibidores de sementes e cotilédones

em cólon, rim e bexiga de camundongos Swiss (p < 0,05)...........................................58

Tabela 6: Percentagem de radiação presente em cada órgão processado a homogenato, após

3 horas da administração oral do inibidor marcado de sementes. ................................59

Tabela 7: Percentagem de radiação presente em cada órgão processado a homogenato, após

3 horas da administração oral do inibidor marcado de cotilédones..............................60

Tabela 8: Parâmetros farmacocinéticos determinados para BBI de M. axillare marcados

com I

125

administrado por via intravenosa em camundongos Swiss (n = 5).................63

Tabela 9: Comparação entre as médias de absorção dos BBI de Macrotyloma axillare e de

soja (n =5 e p < 0,05)................................................................................64

Tabela 10: Áreas sob as curvas de biodisponibilidade dos BBI de Java e de soja...............69

xviii

1. Introdução

Introdução

1. INTRODUÇÃO

1.1. O câncer e alguns de seus dados estatísticos

1.1.1. Definição e alguns dados importantes sobre os estudos do câncer

Câncer é resultado de um processo multi-eventos, no qual o acúmulo de sucessivas

modificações genéticas e moleculares leva a uma gradual transição, geralmente através de

décadas, de um grau normal a aumentados graus de displasia que culminam num fenótipo

invasivo e de metástase (Crowell, J.A., 2005).

Nos anos 60 do século passado e início dos 70

a maioria dos pesquisadores focou

suas pesquisas na hipótese viral para o desenvolvimento do câncer. Segundos eles, vírus e

outros agentes infecciosos como o HPV, poderiam alterar o metabolismo causando um

crescimento incontrolável de tumores que se espalhariam e causariam a metástase. Nas

duas últimas décadas, uma nova concepção sobre câncer vem sendo adotada: as células

cancerosas seriam então geradas por eventos genéticos sucessivos que resultam de

exposição a fatores ambientais, alimentares, sociais e agentes infecciosos; não só apenas

agentes infecciosos como se pensava anteriormente (Go et al., 2001).

O desenvolvimento do câncer tem forte correlação com danos e reparos do DNA

celular e um dos mais importantes mecanismos que contribui para tal desenvolvimento é o

dano oxidativo do DNA. Se uma célula contém um dano no seu DNA e se divide antes

desse dano ser reparado, se estabelece então uma alteração genética permanente que

consiste no primeiro passo para a carcinogênese (Reddy, L. et al., 2003).

Segundo o quadro de especialistas do American Institute for Cancer Research e do

World Cancer Research Fund, existe um consenso na hipótese de que os cânceres são

amplamente passíveis de prevenção. A maioria dos meios efetivos de redução dos riscos

compreende, evitar o tabaco, uma dieta apropriada e uma limitação à exposição a fatores

cancerígenos ambientais e ocupacionais. O mesmo quadro de especialistas estima que 30 a

40% dos casos de câncer ao redor do mundo são passíveis de prevenção, principalmente

com os hábitos alimentares.

Os dados a seguir (1.1.2 e 1.1.3) foram obtidos no site do Ministério de Saúde em

Introdução

parceria com o Instituto Nacional de Câncer (INCA, 2005); estes foram os dados mais

atuais encontrados.

1.1.2. Informações relevantes sobre o câncer segundo o INCA

Câncer é um conjunto doenças que têm em comum o crescimento desordenado ou

maligno de células que invadem tecidos e órgãos, podendo espalhar-se (metástase) para

outras regiões do corpo.

Os tipos de câncer correspondem aos vários tipos de células do corpo. Outras

características que os diferenciam entre si são a velocidade de multiplicação das células e a

capacidade invasiva sobre tecidos e órgãos vizinhos ou distantes (metástases).

Suas causas são variadas, externas ou internas ao organismo, estando ambas inter-

relacionadas. Causas externas relacionam-se ao meio ambiente e hábitos ou costumes

próprios de um ambiente social e cultural. Causas internas são, na maioria das vezes,

geneticamente pré-determinadas, ligadas à capacidade do organismo de se defender das

agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de várias formas, aumentando a

probabilidade de transformações malignas nas células normais.

A interação entre fatores de risco e de proteção a que as pessoas estão expostas pode

resultar, ou não, na redução da probabilidade delas adoecerem.

Nem sempre a relação entre a exposição a um fator de risco e o desenvolvimento de

uma doença é facilmente reconhecível, especialmente se presume que a relação se dê com

comportamentos sociais comuns (o tipo de alimentação, por exemplo).

Nas doenças crônicas, as primeiras manifestações podem surgir após muitos anos de

exposição única (a radiações ionizantes, por exemplo) ou contínua (radiação solar ou

tabagismo, por exemplo) aos fatores de risco. Por isso, é importante considerar-se o

conceito de período de latência, isto é, o período de tempo compreendido entre a exposição

ao fator de risco e o surgimento da doença.

As células alteradas multiplicam-se de maneira descontrolada e mais rapidamente

do que as células normais do tecido à sua volta, invadindo-o. Formam novos vasos

sanguíneos que as nutrirão e manterão as atividades de crescimento descontrolado e o

acúmulo dessas células forma os tumores malignos. Adquirem a capacidade de se

Introdução

desprender do tumor e de migrar. Invadem inicialmente os tecidos vizinhos, podendo

chegar ao interior de um vaso sangüíneo ou linfático e através desses disseminar-se,

chegando a órgãos distantes do local onde o tumor se iniciou formando as metástases

(fig.1).

Figura 1: ilustração do começo e progressão da neoplasia de uma fase intraepitelial até uma fase invasiva (Go

et al., 2001).

O processo de carcinogênese em geral se dá lentamente, pode levar vários anos para

que uma célula cancerosa prolifere e dê origem a um tumor visível. Para isso ela passa

pelos seguintes estágios:

Estágio de iniciação

É o primeiro estágio da carcinogênese. Nele as células sofrem o efeito de agentes

cancerígenos ou carcinógenos que provocam modificações em alguns de seus genes. Nesta

fase as células se encontram geneticamente alteradas, porém ainda não é possível se

detectar um tumor clinicamente.

Estágio de promoção

Segundo estágio da carcinogênese. Nele as células "iniciadas" sofrem o efeito dos

agentes cancerígenos classificados como oncopromotores. A célula iniciada é transformada

em célula maligna de forma lenta e gradual. Para que ocorra essa transformação é

Introdução

necessário um longo e continuado contato com o agente cancerígeno promotor. A

suspensão do contato com agentes promotores muitas vezes interrompe o processo nesse

estágio. Alguns componentes da alimentação e a exposição excessiva e prolongada a

hormônios são exemplos de fatores que promovem a transformação de células iniciadas em

malignas.

Estágio de progressão

Último estágio se caracteriza pela multiplicação descontrolada e irreversível das

células alteradas. Nesse estágio o câncer já está instalado e evolui até o surgimento das

primeiras manifestações clínicas da doença.

Os fatores que promovem a iniciação ou progressão da carcinogênese são chamados

agentes oncoaceleradores ou carcinógenos. O fumo é um carcinógeno completo, pois

possui componentes que atuam nos três estágios da carcinogênese.

A integridade do sistema imunológico, a capacidade de reparo do DNA danificado

por agentes cancerígenos e a ação de enzimas responsáveis pela transformação e eliminação

de substâncias cancerígenas introduzidas no corpo são exemplos de mecanismos de defesa.

Alterações podem ocorrer em genes especiais, denominados protooncogenes, que a

princípio são inativos em células normais. Quando ativados, os protooncogenes

transformam-se em oncogenes, responsáveis pela transformação maligna das células

normais. Essas células diferentes são denominadas cancerosas.

1.1.3. Estimativas de incidência e mortalidade por câncer no Brasil

As Estimativas da Incidência e Mortalidade por Câncer no Brasil em 2002,

elaboradas pelo Instituto Nacional de Câncer (INCA), indicam que neste ano deveriam ser

registrados no Brasil 337.535 casos novos de câncer, dos quais 165.895 entre homens e

171.640 entre mulheres. Espera-se que o câncer cause 122.600 mortes, sendo 66.060 em

homens e 56.540 em mulheres.

O câncer figura como a terceira principal causa de morte no Brasil (12,32 % do total

dos óbitos), superada apenas pelas doenças cardiovasculares e causas externas (acidentes de

trânsito somado à violência urbana). É importante registrar que muitos fatores contribuem

Introdução

para o crescimento do câncer no país, entre eles o envelhecimento da população, decorrente

das ações de saúde que evitam mortes prematuras por doenças infecciosas ou parasitárias.

O desenvolvimento socioeconômico, no entanto, modifica hábitos da população:

não existe sociedade sem câncer, mas os tipos de câncer mudam de acordo com o

desenvolvimento do país, e muitos deles podem ser evitados pela conscientização.

Estimativas de Incidência no Brasil em 2002

Estimativa de incidência - homens

cólon e reto 6%

esôfago 4%

leucemias 3%

pele melanoma

outros 31%

estômago

pulmão

10%

prostata

16%

pele não

melanoma 20%

Estimativas de incidência - mulheres

esôfago

leucemias 1%

pele melanoma

colo do útero

10%

cólon e

reto 6%

estômago 4%

pulmão 4%

mama feminina

22%

pele não

melanoma

18%

outros 33%

Estimativas de Mortalidade no Brasil em 2002

Estimativas de mortalidade - homens

outros 39%

pulmão

17%

boca 4%

esôfago 6%

cólon e reto

próstata

12%

estômago

11%

pele melanoma

leucemias 4%

pela não

melanoma 1%

Estimativas de mortalidade - mulheres

leucemias 4%

colo do útero

esôfago 2%

boca

pela não

melanoma

pele melanoma

outros 46%

cólon e reto

mama feminina

16%

estômago 7%

pulmão 8%

Figura 2: Estimativas de Incidência e Mortalidade para o Câncer no Brasil em 2002 (INCA, 2005).

Introdução

1.1.4. Estudos que apóiam a intervenção dietética no controle do câncer

A quimioprevenção é uma área inovadora na pesquisa do câncer que atua na

prevenção através de intervenções farmacológicas, biológicas e nutricionais (Sporn, M.B.,

1976; Watternberg L.W., 1985). Os obstáculos para os benefícios da quimioprevenção

chegarem à confiança plena, dependem da segurança da intervenção e do custo da mesma,

o que vem se tornando uma consideração de extrema importância para o desenvolvimento

de um agente como quimiopreventivo ou quimioprotetor (Crowell J.A., 2005). A

identificação de um agente potencial como quimioprotetor é conduzida por uma sistemática

revisão bibliográfica de dados epidemiológicos e experimentais em colaboração com

indústrias farmacêuticas, de nutrição e biotecnologia.

As taxas de morbidade e mortalidade pelo câncer variam muito ao redor do mundo e

acredita-se numa grande influência de fatores alimentares nessa variação (Grobstein et al.,

1982; Doll et al., 1981; Correa et al., 1981; Phillips et al., 1975). O site científico de busca

PubMed apresenta 6019 citações para: “diet cancer prevention”, mostrando a importância

científica dada ao fator alimentação e dieta na gênese do câncer.

Estudos epidemiológicos sugerem uma importante participação de componentes

vegetais, especialmente legumes (Correa et al., 1981), na redução de incidência de

diferentes tipos de câncer. Existem evidências para uma particular correlação entre a

ingestão de sojas e a baixa incidência e taxas de mortalidade por cânceres de mama, cólon e

próstata em países orientais (Tominaga et al., 1985). Ao passo que orientais migrantes para

o ocidente, principalmente para os Estados Unidos, passam a desenvolver cânceres comuns

em populações ocidentais e em taxas semelhantes às dos americanos (Dunn et al., 1975;

Haenszel e Kurihara, 1968; Buel et al., 1973). Essas observações sugerem que a

susceptibilidade a diferentes tipos de câncer, especialmente de próstata, mama e cólon, não

são devidas a diferenças genéticas, mas sim a modificações de hábitos alimentares.

As sojas são conhecidas por conterem altos níveis de inibidores de proteases e de

outros componentes com reconhecida ação anticarcinogênica, incluindo ácido fítico, esterol

β-sitosterol, saponinas e isoflavonóides (Messina e Barnes, 1991), porém os inibidores de

Bowman-Birk são de longe os mais potentes agentes antitumorais das sojas (Kennedy et

Introdução

al., 1995). A partir dessa observação surgiu a hipótese de uma baixa taxa de incidência de

câncer estar associada a uma alta ingestão de inibidores de proteases indiretamente, por

meio da ingestão de sojas.

1.2. O que são inibidores do tipo Bowman-Birk, suas características e suas

estruturas?

Os inibidores do tipo Bowman-Birk, comumente chamados de BBI, são inibidores

protéicos de serino-proteases. Apresentam estrutura em cadeia única, rica em resíduos de

cisteína que lhes confere uma estrutura rígida e bastante conservada nas diferentes espécies

do reino vegetal, cerca de 87% (Morh et al., 1987); do qual eles são exclusivos.

Os BBI foram descobertos por Bowman na década de 40 do século passado, e

purificados por Birk na década de 60 (Bowman, 1946; Birk et al 1963). Nesta ocasião eles

trabalharam com BBI de sementes de soja.

São proteínas de baixo peso molecular, aproximadamente 8KDa, possuem 14

resíduos de cisteína formando sete ligações dissulfeto em sua molécula (fig.3A, referente ao

BBI das sementes de soja).

Suas estruturas química e tridimensional lhes permitem interações com serino-

proteases tais que as atividades catalíticas dessas proteases ficam comprometidas na

presença dos mesmos; por isso a denominação de inibidores de proteases. As principais

enzimas inibidas por BBI são tripsina e quimotripsina, uma vez que sua estrutura possui

dois loops ou duas “cabeças de inibição”, sendo uma para tripsina e outra para

quimotripsina, respectivamente (fig.3B, referente ao BBI das sementes de soja). Mas além

dessas enzimas, BBI podem inibir ainda a catepsina G, elastase (Larionova et al., 1993) e

quimase (Ware et al., 1997).

Ao nível estrutural, molecular e de outras propriedades químicas e físicas o BBI de

soja (Glicine max)que é o mais bem estudado, se assemelha bastante ao BBI da

Macrotyloma axillare que apresenta uma seqüência de aminoácidos de elevado grau de

homologia.

Introdução

Figura 3 : A Estrutura do BBI de soja, como determinado por Odani e Ikeneka (1973).

Em tom de cinza do lado direito o sítio inibitório para quimotripsina e do lado esquerdo o sítio inibitório para

tripsina. B Simulação computacional da estrutura 3D do BBI em solução. O BBI é uma proteína de 71 aas. A

porção COOH-terminal em roxo representada pelo aa 71; ao passo que a porção N-terminal em amarelo é

representada pelo aa1. O sítio inibitório para quimiotripsina está representado em verde pelos aas 43 e 44;

enquanto o sítio inibitório para tripsina está representado em azul pelos aas 16 e 17 (Kennedy, A.R., 1998).

Ainda ao nível estrutural, estudos de cristalografia com raios-X e Ressonância

Magnética Nuclear demonstram que os BBI são formados de dois subdomínios simétricos,

Introdução

de alinhamento bem próximo, com uma homologia do tipo tandem que resulta no motivo

chamado “gravata-borboleta” (fig. 3A).

Suas estruturas secundárias são dominantemente aperiódicas, com um leve grau de

estruturas ordenadas na forma de duas regiões de folhas β-pregueadas, uma em cada

domínio.

A característica estrutural mais interessante dos BBI é a ausência de uma “cavidade

hidrofóbica”, marcante em proteínas globulares e maior responsável pelo arranjo e

estabilidade dessas proteínas. Os BBI têm essa estabilidade estrutural garantida

principalmente pelas suas sete pontes dissulfeto.

Dentre os diversos BBI estudados o primeiro e o melhor caracterizado é o BBI da

soja. Este inibidor teve toda sua estrutura resolvida por técnicas como a cristalografia de

difração de Raios-X e seqüenciamento de aminoácidos.

BBI tem sido utilizado em estudos na forma purificada (PBBI) ou na forma de um

extrato enriquecido ou concentrado de BBI (BBIC). Para preparações da soja, ambas as

formas apresentam atividades semelhantes em os processos carcinogênicos estudados em

sistemas in vitro e in vivo.

1.3.Distribuição dos BBI em angiospermas

As plantas contêm uma grande variedade de inibidores de serino-proteases divididos

em 16 classes (Ryan et al., 1990). Os inibidores do tipo Bowman-Birk são encontrados

principalmente em leguminosas e nessas assumem um papel fisiológico de regulação

endógena de proteinases de sementes, estoque de aminoácidos sulfurosos e defesa a ataques

de insetos e patógenos (Ryan et al., 1994).

A família de inibidores do tipo Bowman-Birk é largamente distribuída em plantas

angiospermas (tab.1) e estudos sugerem que eles derivaram de um ancestral dotado de uma

única cabeça de inibição e por duplicações e mutações genéticas surgiu então uma estrutura

com dupla cabeça de inibição para proteases (Tan et al., 1971).

Existem trabalhos que mostram uma diminuição na atividade inibitória de inibidores

das sementes durante seu desenvolvimento por ação de proteinases (Lorensen et al., 1981).

Introdução

A ação de proteinases leva ao aparecimento de novas espécies ativas de inibidores. Esses

novos inibidores possuem migrações eletroforéticas semelhantes aos BBI encontrados em

outras partes da planta, inclusive nos cotilédones, indicando que esse novos inibidores são

originados de transformações pós-traducionais e não pela síntese de novo (Sreerama et al.,

1998).

Tabela 1: Plantas florescentes que apresentam inibidores de proteases BBI, suas famílias e designação no

banco de dados do GenBank (Mello et al., 2002).

Espécie da planta Família Designação

Arachis hypogaea Fabaceae

ARAHY

Canavalia lineata Fabaceae

CANLI

Ciox lacryma-jobi Poaceae

COILA

Dioclea glabra Fabaceaea

DIOGL

Dipteryr alata Fabaceaea

DIPAL

Dolichos biflorus Fabaceaea

DOLBI

Dolichos lablab Fabaceaea

DOLLA

Erythrina variegata Fabaceaea

ERYVA

Glicine max Fabaceaea

SOYBN

Hordeum vulgare Poaceae

LONCA

Macrotyloma axillare Fabaceaea

DOLAX

Medicago sativa Fabaceaea

MEDSA

Medicago scutellata Fabaceaea

MEDSC

Oryza sativa Poaceae

ORYSA

Phaseolus lunatus Fabaceaea

PHALU

Phaseolus vulgaris Fabaceaea

PHAVU

Pisum sativum Fabaceaea

PEA

Saccharum officinarum Poaceae

SACOF

Setaria itálica Poaceae

SETIT

Torresea acreana Fabaceaea

TORAC

Torresea cearensis Fabaceaea

TORCE

Triticum aestivum Poaceae

WHEAT

Vicia faba Fabaceaea

VICFA

Vicia faba sativa sub. nigra Fabaceaea

VICAN

Vigna angulares Fabaceaea

PHAAN

Vigna mungo Fabaceaea

VIGMU

Vigna radiata Fabaceaea

PHAAV

Vigna unguiculata Fabaceaea

VIGUN

Zea mays Poaceae

MAIZE

Introdução

1.4. Mecanismos de ação antitumoral dos inibidores de Bowman-Birk

São encontradas na literatura várias citações sobre a atividade anti-tumoral dos

inibidores de Bowman-Birk. Entretanto, os mecanismos ainda não foram totalmente

elucidados.

Os efeitos em mecanismos relacionados aos processos tumorais são:

• Atividade antiinflamatória;

• Modulação da produção e liberação de radicais-livres;

• Prevenção do processo de transformação induzida por carcinógenos químicos ou

radiação;

• Reversão da iniciação ou expressão de oncogenes induzida por carcinógenos químicos

ou radiação;

• Controle do processo de apoptose e divisão celular, via inibição do proteassoma;

• Possibilidade de sua utilização como agente terapêutico a atuar no nível de expressão de

biomarcadores.

1.4.1. Atividade antiinflamatória

Relatos mostram ter BBI uma alta atividade antiinflamatória (St. Clair et al., 1990).

Em estudos com animais foi observado a redução dos níveis de agregados linfóides ou

infiltrados linfocíticos que estão diretamente correlacionados com um declínio na formação

de tumores (Von Hofe et al., 1991; St Clair et al., 1990a). O mecanismo preciso pelo qual

tal efeito é atingido ainda não é bem conhecido, apesar de inúmeras reações poderem estar

envolvidas. Um possível mecanismo é via da inibição da quimase de mastócitos por BBI,

uma vez que esta protease desempenha funções pró-inflamatórias como a ativação de pró-

colagenase (Saarinen et al., 1994) e a ativação de citocinas inativas a citocinas ativas

(Mizutani et al., 1991).

Os inibidores de proteases são capazes de prevenir o influxo de leucócitos

polimorfonucleares (PMN) a focos inflamatórios, bem como a liberação de espécies ativas

de oxigênio por estas células, contribuindo com a atividade antiinflamatória (Goldstein et

al. 1979).

Introdução

1.4.2. Modulação da produção e liberação de radicais-livres

Tem sido sugerido que inibidores de proteases são capazes de suprimir a

carcinogênese por prevenir modificações celulares induzidas por radicais-livres, assim

como o bloqueio da produção desses em ovos de ouriços-do-mar e células de mamíferos

(Coburn et al., 1981).

Alguns inibidores inibem o influxo de PMN a focos inflamatórios, bem como a

liberação de radicais-livres pelas PMN em resposta ao carcinógeno químico TPA

(Goldstein et al., 1979).

De forma geral o BBI tem apenas uma habilidade limitada para lidar com radicais-

livres e seus efeitos biológicos, agindo principalmente por meio de um decréscimo dos

danos oxidativos. O papel dos radicais-livres na carcinogênese permanece obscuro, mas

sabe-se que a inibição da liberação do ânion superóxido e de H

por PMN por inibidores

de proteases é bem correlacionado com a atividade anticarcinogênica (Frenkel et al., 1987).

1.4.3. Prevenção do processo de transformação induzida por carcinógenos químicos ou

radiação

A maioria dos dados sobre atividade anticarcinogênica de inibidores de proteases

vem de estudos da habilidade desses agentes em suprimir a transformação induzida por

carcinógenos in vitro. Os inibidores de proteases com atividade anticarcinogênica têm a

habilidade de prevenir ou suprimir completamente transformações morfológicas em

sistemas de células de roedores (Kennedy et al., 1993).

Inibidores de proteases com atividade anticarcinogênica podem suprimir a

transformação decorrente de radiação quando aplicados em culturas irradiadas até mesmo

após duas semanas da exposição à irradiação (Kennedy et al., 1985).

Alguns trabalhos utilizam a antipaína como inibidor de protease anticarcinogênico.

Esses trabalhos demonstram que a antipaína leva aos mesmos efeitos sobre o sistema de

transformação por radiação in vitro, apresentados pelos inibidores do tipo Bowman-Birk.

Porém a maior diferença reside no fato de BBI alcançar efeitos comparáreis em

Introdução

concentrações molares bem inferiores. O mecanismo exato de tal efeito ainda é

desconhecido. Experimentos mostram que células expostas a carcinógenos químicos e

radiação, apresentam um elevado grau de eventos de iniciação na expressão de genes. Essa

mudança na expressão gênica conferida à célula aumenta a probabilidade dessa mesma

célula passar para um estágio subseqüente, que é a transformação. Kennedy et al. (1982)

confirmaram a capacidade dos inibidores de protease em reverter essa mudança na

expressão gênica.

1.4.4. Reversão da iniciação ou expressão de oncogenes induzida por carcinógenos

químicos ou radiação

Pesquisadores comprovaram que os inibidores de proteases são potentes agentes

inibitórios na expressão oncogênica. Vários protooncogenes e oncogenes foram

pesquisados em relação à atividade antitumoral de inibidores de proteases: c-fos, c-myc, c-

erb B, c-H-ras, etc. Porém, apenas c-myc e c-fos foram estudados até o momento de forma

mais detalhada. BBI não alterou os níveis normais de c-myc em células, mas foi capaz de

retornar aos níveis normais a expressão de c-myc em células de expressão elevada. Em

cólon irradiado os níveis de c-myc RNA estavam aumentados.

Em sistemas cólons irradiados e expostos ao BBI, os níveis de c-myc RNA eram

comparáveis a sistemas não irradiados, assim como em sistemas expostos apenas ao BBI. A

expressão do oncogene c-myc pode ser controlada em células nas quais o processo de

transformação ainda não ocorreu, dessa forma parece que os inibidores de protease

anticarcinogênicos agem em um ou mais pontos centrais do processo de transformação

maligna (St. Clair et al., 1990).

Um importante modelo de como inibidores de proteases anticarcinogênicos podem

afetar a expressão de c-myc está ilustrado na figura 4.

Introdução

Figura 4: Modelo postulado para mostrar a interação entre a protease, o inibidor de protease

anticarcinogênico e a expressão de c-myc.

O modelo sugere a expressão de c-myc aumenta em tumores induzidos por radiação in vivo (Sawey et al.,

1987), os níveis de proteases aumentados em tecidos carcinogênicos tratados in vivo (Messadi et al., 1986) e

os inibidores de proteases anticarcinogênicos retornando as proteases a níveis normais (Messadi et al., 1986)

(Kennedy, A.R., 1998).

A protease na ausência do inibidor pode degradar a proteína regulatória envolvida

na expressão de c-myc, por se ligar à região promotora do gene. Os tratamentos com

carcinógenos levam a um aumento nos níveis de proteases, levando a um decréscimo nos

níveis da proteína regulatória, decréscimo da ligação dessa à região promotora e com

conseqüente aumento da expressão de c-myc. Alguns modelos evidenciam essa proposta:

• Carcinógenos induzem elevados níveis de atividade proteolítica (Kennedy et al., 1987);

• Radiação aumenta a expressão de c-myc (St. Clair et al., 1990);

• Expressão do gene c-myc em tumores irradiados em sistemas in vivo (Sawey et al.,

1987).

Estudos sugerem que a transformação maligna requer cooperação entre a

superexpressão do gene c-myc e outros oncogenes que é abolida na presença de inibidores

de proteases anticarcinogênicos pela regulação dos níveis anormais de expressão de c-myc.

A expressão de oncogenes pode ser inibida por inibidores de proteases, inclusive por BBI

através de interferência na amplificação gênica (Heilbronn et al., 1985).

Introdução

1.4.5. Controle do processo de apoptose e divisão celular, via inibição do proteassoma

O sistema ubiquitina-proteassoma é essencial para a manutenção da maquinaria

celular eucariota desempenhando um papel central na proteólise de proteínas intracelulares

(Bochtler et al., 1999).

O sistema proteassoma é conhecido por atuar na regulação de vários processos

fisiológicos e considerado um alvo emergente para a terapia do câncer (Dou et al., 1999).

O proteassoma possui três atividades proteolíticas (Loidl et al., 1999) chamadas:

• trypsin-like;

• chymotrypsin-like;

• peptidil-glutamil peptídeo hidrolítica (PGPH) .

A inibição da atividade proteassômica influencia em muitos processos celulares,

resultando em ação antiinflamatória, anticarcinogênica, antiproliferativa e apoptótica em

células cancerosas.

O bloqueio do sitio chymotrypsin-like do proteassoma causa uma grande redução na

taxa de quebra de proteínas e essa atividade está associada com a sobrevivência de tumores

e resistência a drogas (An et al., 1998).

Modelos experimentais mostraram que inibidores chymotrypsin-like do proteassoma

(Lopes et al., 1997) são responsáveis pela indução de apoptose de células cancerosas

diminuindo o crescimento de tumores (Lenz, H.J. 2003). Tais experimentos sugerem que a

inibição do sistema proteassoma pode prevenir o câncer.

A família das MAPKs tem papéis críticos para a conversão de diversos sinais

extracelulares em respostas biológicas e esses sinais modulam muitos processos celulares.

A dinâmica da modulação de três sub-famílias das MAPKs (p42/44 extracellular

signal-related kinases (ERK1/2), c-Jun N terminal kinase (JNK) e p38 quinase) é

responsável pelo destino da célula quando essas são submetidas a apoptose, diferenciação

ou proliferação (Jonhson et al., 2002).

O balanço entre as MAPKs e suas fosfatases têm importante função no controle de

sua ativação. A cascata de transdução de sinais mais estudada, que está relacionada com a

Introdução

proliferação celular, é a via da ERK e sua ativação pode estar fortemente correlacionada

com o aumento da morte celular (Ishikawa et al., 1999).

Existem especulações quanto à atividade do BBI na inibição da atividade

chymotrypsin-like do proteassoma 26S que pode estar relacionada a sua atividade na

carcinogênese. A inibição desse sítio do proteassoma 26S gera o acúmulo de substratos

proteassômicos seguido por uma diminuição da expressão de ciclinas regulatórias do ciclo

celular, como: p27

Kip1

e p21

Cip1/WAF1

(Chen et al., 2005).

O tratamento com BBI induz ao aumento de substratos proteassômicos poli-

ubiquitinados, o que implica em deflagração do processo de apoptose. O tratamento de

células cancerosas com BBI, como mostrado anteriormente leva a um acúmulo de

inibidores de kinases ciclina-dependentes (CKIs) e isso trás como conseqüência uma

diminuição de expressão de ciclinas, como a ciclina D1 e ciclina E. A down-regulation das

ciclinas D1 e E levam as células cancerosas a pararem seu processo de divisão na fase

G1/S após 24 horas de contato com BBI. BBI também suprimiu a expressão de ERK1/2,

que é uma via de transdução de sinais bem caracterizada e envolvida na proliferação

celular. Essa supressão se dá de forma dose-dependente e tempo-dependente (Jonhson et

al., 2002).

Pesquisadores sugerem a ativação das MAPKs estar correlacionada com o aumento

da expressão de moléculas de ciclina, como por exemplo a ciclina D1 (Blain et al., 1997;

Aktas et al., 1997). A inibição de MAPKs pode aumentar a susceptibilidade de células

cancerosas a citotoxicidade de drogas pela modulação do ciclo de progressão celular e/ou

pela interferência com eventos subseqüentes da cascata. Dessa forma, BBI certamente atua

atenuando a atividade ERK1/2, acompanhada de uma down-regulation da ciclina D1 e

possivelmente seguida por uma desregulação da progressão do ciclo celular (Chen et al.,

2005).

Introdução

1.4.6. BBI como agente terapêutico a atuar nos níveis de expressão de biomarcadores

utilizados no monitoramento da atividade preventiva do câncer

Os biomarcadores indicam a exposição a agentes carcinogênicos e podem ser

utilizados em estudos de prevenção e tratamento do câncer, demonstrando quando uma

intervenção levou a um decréscimo nos níveis de produtos associados a um risco

aumentado de desenvolvimento de câncer (Lippman et al., 1990).

Muitos biomarcadores são usados como indicadores de danos oxidativos ao DNA

(Frenkel et al., 1992). Inibidores de proteases como BBI, são conhecidos por levarem a

uma redução de danos oxidativos a células (Frenkel et al., 1987; Frenkel et al., 1992), daí a

possibilidade da aplicação de BBI como agente terapêutico a atuar no nível de expressão de

biomarcadores.

A utilização do BBI também foi sugerida por causa de um alto nível de atividade

proteolítica em tecidos humanos pré-malígnos (Billings et al., 1987; Manzone et al., 1995;

Kennedy et al., 1998). Essa atividade proteolítica se encontra elevada em vários tecidos

com risco aumentado de desenvolvimento de câncer (Kennedy et al., 1998). Uma serino-

endopeptidase de 70KDa é capaz de quebrar o substrato Boc-Val-Pro-Arg-MCA e essa

endopeptidase pode ser inibida por BBI. A endopeptidase de 70KDa pode ser considerada

um biomarcador e a atividade inibitória dos BBI está correlacionada com esse biomarcador.

BBI também está correlacionado com um outro biomarcador, o neu oncogene

(Kraus et al., 1985 e 1987; Slamon et al., 1989; Tandon et al., 1989; Brandt-Rauf et al.,

1995; Smit et al., 1996; Meden et al., 1997; Reese et al., 1997).

Elevados níveis da proteína neu, uma proteína de 185KDa chamada de p185, foram

detectados no soro de pacientes com vários tipos de câncer, dentre eles o de mama, ovário,

próstata, estômago, pâncreas, cólon, fígado e pulmão (Brandt-Rauf et al., 1995; Brandt-

Rauf et al., 1994; Tokunaga et al., 1995). Em alguns casos, altos níveis séricos dessa

proteína são detectados em pacientes cujo diagnóstico clínico ainda não foi realizado,

sugerindo o uso de tal proteína como um biomarcador. Os níveis séricos dessa proteína

estão correlacionados com a atividade inibitória dos BBI, o que marca a importância desses

inibidores em estudos com biomarcadores.

Introdução

Wan et al., (1999), observaram que os níveis séricos da proteína neu estavam

significativamente correlacionados com a modificação da atividade proteásica na mucosa

oral; uma vez que a proteólise do domínio extracelular da proteína neu leva a um aumento

nos níveis séricos dessa proteína. O tratamento com BBI e sua atividade antiproteásica

acarreta alterações nos níveis séricos e orais da proteína neu.

Portanto a atividade proteásica sobre a proteína neu pode ser utilizada com um

importante biomarcador para os estudos de câncer em humanos e BBI tem forte correlação

na utilização desse marcador.

1.5. Farmacocinética dos inibidores de Bowman-Birk

Acreditava-se que pequena quantidade dos inibidores de proteases da soja,

administrados via oral poderia chegar à corrente sangüínea e se distribuírem para os órgãos,

fora do TGI. Kennedy et al. (1993) mostraram que BBI administrado pela via oral pode sim

alcançar a corrente sangüínea em concentrações consideráveis, com a subseqüente

distribuição pelos órgãos fora do TGI, exceto cérebro (Billings et al., 1992).

Segundo Billings (1992) e Yavelow (1983) cerca de 50% do BBI administrado por

via oral alcançam a corrente sangüínea e se distribui pelo corpo, isso graças à habilidade do

BBI de resistir à ação de enzimas digestivas e chegar com mais de 90% na forma intacta ao

cólon.

Estudos com animais (Kennedy, 1998) indicam que aproximadamente metade do

BBI administrado por via oral é excretado de forma inalterada nas fezes, enquanto o resto

atravessa as células do epitélio intestinal (Billings et al., 1992) ou cruza o lúmen intestinal

via mecanismo paracelular (Billings et al., 1991).

Após 3 horas da administração oral de BBI-I

125

de soja, em camundongos, o mesmo

é largamente distribuído e encontrado na forma nativa na maioria dos órgãos internos,

exceto cérebro. Sabe-se que pequena parte do BBI administrado por via oral é excretado no

urina e ainda apresenta atividade inibitória sobre proteases (Billings et al., 1992; Yavelow

et al., 1983).

Introdução

Quando BBI de soja é administrado via oral, a meia-vida sérica é de 10 horas tanto

em ratos como em hamsters (Kennedy, 1998).

Cerca de 50 a 60% é absorvido, por via oral, entre 2 e 3 horas. Após 3 horas o

inibidor está amplamente distribuído pelo organismo alcançando 2 a 5% do BBI

administrado na circulação e 1 a 2% em órgãos como: esôfago, fígado, pulmão, rins e

estômago. A radioatividade medida nestes órgãos corresponde a moléculas de massa

molecular equivalente ao padrão do inibidor marcado determinada em filtração molecular

(Billings et al., 1992).

O tráfego do BBI no TGI, desde sua ingestão até excreção nas fezes, é de cerca de 5

horas. Uma vez na corrente sangüínea, ele passa rapidamente por um processo de

clearance. Quando administrado por via intravenosa, esse clearance é de apenas 30

minutos com total desaparecimento em 24 horas (Persiani et al., 1991).

Estudos têm sido realizados a fim de se estimar a relação entre a dose biodistribuída

e o potencial antitumoral do BBI (Kennedy, 1998).

1.6. Possibilidade de grande absorção de BBI via mecanismo paracelular

As duas principais funções do intestino são a digestão e absorção de alimentos,

nutrientes, vitaminas e co-fatores (Turner e Madara, 1995). Em geral, glicose e

aminoácidos, como o triptofano, são absorvidos do lúmem intestinal via transportadores

acoplados ao sódio. Porém macromoléculas não são facilmente absorvidas pela via

transcelular, mas podem ser absorvidas pela via paracelular.

Quando esses transportadores acoplados ao sódio estão funcionando na sua

capacidade máxima, como após a ingestão de alimentos, uma grande quantidade de sódio

penetra no citosol e ocorre um conseqüente influxo de água. Em seguida surgem eventos

celulares em resposta à penetração de sódio e água, dentre eles o efluxo de sódio via troca

por potássio, pela Na

/ K

ATPase, e por cálcio. Em resposta aos níveis aumentados de

cálcio no citosol, a quinase de cadeia leve da miosina é ativada resultando na contração do

anel apical de actina. Essa contração pode levar a uma leve abertura do espaço paracelular

Introdução

provocada pela tensão no citoesqueleto associado a tight-junctions, com conseqüente

aumento da absorção de moléculas maiores como os BBI (Daughrty e Mrsny, 1999),

conforme mostra a figura 5.

Figura 5: Aumento do influxo de nutrientes nas células intestinais pela via paracelular (Daughrty e Mrsny,

1999).

1.7. Toxicidade dos inibidores de Bowman-Birk

Os inibidores de proteases da soja foram considerados no passado como os agentes

responsáveis pela toxicidade pancreática e pelo efeito potencial de inibir o crescimento de

animais jovens (Kennedy, 1998). No entanto, esse efeito tem sido contestado por vários

pesquisadores. O efeito de promoção de crescimento atípico de pâncreas de ratos não é

esperado acontecer em humanos (Kennedy et al., 1993; Birk et al., 1993).

Introdução

Os efeitos tóxicos potenciais dos inibidores de proteases no pâncreas de ratos são

devidos à atividade inibitória sobre tripsina e não sobre quimotripsina (Birk et al., 1976,

1985, 1993). Já a atividade anticarcinogênica está mais fortemente associada com inibição

sobre quimotripsina (Yavelow et al., 1985; Kennedy et al., 1993).

Porém outros estudos mostraram que a atividade proteolítica da tripsina tem forte

correlação com a agressividade do tumor. Uma vez que ela pode aumentar os níveis de

crescimento de alguns tipos celulares ativando receptores de trombina e plasminogênio e

possivelmente receptores de crescimento e de integrinas (Miyata et al., 1998; Burger et al.,

1970), além de receptores ativados por proteinase (PAR-2) (Alm et al., 2000). PAR-2 está

correlacionado com a adesão e proliferação de carcinomas em células gástricas humanas

via indução pela tripsina (Miyata et al., 2000). Portanto a inibição da atividade proteásica

sobre tripsina pelos BBI também tem sua importância na carcinogênese.

A administração por via oral de BBIC não leva a efeitos patológicos em nenhum

órgão, incluindo pâncreas em três espécies animais: camundongos, ratos e hamsters

(Kennedy et al., 1993) e em duas espécies animais: ratos e cães, segundo Page e

colaboradores (dado não publicado).

Mesmo em doses elevadíssimas de BBIC nenhuma alteração histopatológica foi

observada em cães e ratos. Utilizando uma base de comparação por peso corporal, a dose

necessária para prevenção de desenvolvimento do câncer em humanos está muitas vezes

abaixo da dose que pode levar ao surgimento de anormalidades no pâncreas de ratos. BBIC

de soja quando utilizado em estudos de atividade em animais está em uma dosagem duas

vezes ou mais superior a dosagem utilizada em estudos com humanos (Kennedy, 1998).

Armstrong e colaboradores (2000) realizaram estudos com pacientes portadores de

leucoplasia oral e observaram que os pacientes submetidos ao tratamento com BBIC de

soja toleraram bem a administração oral do concentrado; não apresentando reações

alérgicas, sinais de toxicidade nem alterações significativas de exames laboratoriais.

Introdução

1.8. Razões para a utilização de inibidores de Bowman-Birk como

quimiopreventivos

O desenvolvimento do câncer é um processo demorado, depende de eventos

carcinogênicos que ocorrem passo a passo em uma determinada área do corpo, podendo se

disseminar durante o estágio de metástase.

Com as crescentes evidências epidemiológicas e patológicas sugerindo a

possibilidade de prevenção do câncer e desaceleração da sua progressão, existem então

possibilidades para uma intervenção e prevenção da progressão da carcinogênese nos seus

primeiros estágios (Weistein, I.B., 1991).

Pelo fato de existirem três estágios diferentes compreendidos na carcinogênese, a

iniciação, promoção e a progressão, muitos agentes potenciais protetores cancerígenos

(quimioprotetores) podem ser largamente caracterizados como agentes bloqueadores, que

impedem o estágio de iniciação, ou agentes supressores, que interrompem ou revertem a

promoção e progressão do câncer. Tais resultados se devem a perturbações em fatores

cruciais como o controle da proliferação celular, diferenciação, senescência ou apoptose

(Grupo de Trabalho de Quimioprevenção da American Association for Cancer Research,

1999).

Os efeitos antitumorais desses compostos podem ser atribuídos à combinação de

seus efeitos citoprotetores em células normais e citotóxicos em células pré-neoplásticas

e/ou neoplásticas.

O sistema de metabolismo de drogas compreende a ação de enzimas que atuam na

fase I (oxidação, redução e hidrólise) e a fase II (glucorunidação, sulfatação, acetilação,

metilação e conjugação com glutationa). Essas enzimas podem ser categorizadas como

enzimas ativadoras ou desentoxicantes, baseado nas suas atividades metabólicas que levam

à produção ou desintoxicação de carcinógenos. O balanço fisiológico entre essas enzimas,

incluindo seus níveis de expressão e potencial polimorfismo genético, pode ditar a

sensibilidade ou risco de um indivíduo exposto a uma espécie carcinogênica.

Introdução

Compostos fenólicos e sulfurados, que podem incluir os BBI, moléculas

extremamente ricas em enxofre, são os dois maiores grupos de agentes dietéticos que

induzem enzimas desintoxicantes (Kelloof et al., 2000) (fig. 6).

Figura 6: Indutores naturais de enzimas desentoxicantes regulam a expressão de genes que codificam para

tais enzimas através da transcrição do fator NRF2 (nuclear factor E2-related factor 2).

A função e localização de NRF2 é regulada por um via de quinases que é ativada por indutores de enzimas de

desentoxicação. A fosforilação de NRF2 por MAPKs e PKC (protein kinase C) levam à dissociação de NRF2

de KEAP1. NRF2 se desloca para o núcleo, interage com proteínas Maf e MafK e liga elementos de resposta

antioxidante (ARE) a regiões que codificam muitas proteínas citoprotetoras. Níveis elevados de enzimas

desentoxicantes facilitam a desintoxicação e eliminação de carcinógenos, reativos intermediários e protege as

células e o organismo de carcinógenos químicos (Chen e Kong, 2005).

Introdução

Outros compostos naturais, como indóis, diterpenos, cumarinas, lactonas e selênio

podem também levar a indução de enzimas desintoxicantes.

A indução de apoptose e parada do ciclo celular podem ser considerados excelentes

pontos de atuação para quimioprotetores vegetais pela inibição da promoção e progressão

da carcinogênese e ainda por remover das células os corpos danificados, pré-iniciados ou

neoplásticos (fig. 7).

Figura 7: Agentes quimioprotetores geralmente induzem ao estresse oxidativo, com a “down-regulation” de

moléculas anti-apoptóticas como Bcl-2 ou Bcl-x e com a “up-regulation” de moléculas pró-apoptóticas como

Bax ou Bak.

Agentes quimioprotetores podem causar um desbalanço entre as ciclinas, que são reguladoras do ciclo celular.

Um bom exemplo é a indução de expressão de p21 que é um inibidor de CDK, interrompendo o ciclo celular

em G1-S ou G2-M (Chen e Kong, 2005).

Introdução

Muitos agentes supressores da carcinogênese obtidos pela dieta parecem induzir

apoptose por uma via mediada pela mitocôndria. Sinais de estresse gerados por esses

compostos quimioprotetores regulam o tráfico de proteínas pró-apoptóticas ou anti-

apoptóticas (Li et al., 1997).

A citotoxicidade de agentes quimioprotetores pode ser então monitorada por seus

efeitos na mitocôndria, caspases e outras proteínas apoptóticas.

Muitos componentes alimentares considerados quimioprotetores, inclusive

compostos sulfurosos induzem seus efeitos antitumorais através da indução de apoptose, o

que possibilita uma possível inserção do BBI nesse grupo.

A transição entre as fases G1-S ou G2-M funciona como uma checagem para a

divisão celular. A perturbação das quinases e inibidores de quinases envolvidas na

progressão do ciclo celular por quimioprotetores encontrados na dieta, podem

potencialmente afetar e bloquear a proliferação contínua de células tumorais (Weinstein,

I.B., 2000).

É interessante ressaltar que a indução de apoptose in vivo e /ou a perturbação da

maquinaria do ciclo pelos quimioprotetores alimentares ocorre principalmente em células

pré-neoplásticas ou neoplásticas, mas não em células normais (Gupta et al., 2001; Perkins

et al., 2002). Isso poderia ser resultado de um mau funcionamento ou desregulação dos

eventos de transdução de sinais nas células neoplásticas em formação.

Baseado nestes aspectos existe a busca por agentes quimioprotetores, entretanto os

custos da síntese e produção de produtos farmacêuticos que possam atuar na

quimioprevenção, são sem dúvida um obstáculo. Porém, a indústria da biotecnologia pode,

através de suas pesquisas, alcançar produtos com atividade biológica desejada com menores

efeitos colaterais freqüentes na terapêutica atual.

Considerando que os BBI representam uma importante solução na prevenção do

câncer, tornam-se relevantes estudos que utilizam formas diferentes desses inibidores,

explorando as propriedades farmacocinéticas e especificidade da sua relação estrutura-

atividade.

Introdução

1.9. A leguminosa Macrotyloma axillare

A Macrotyloma axillare (figs.8 e 9) é uma leguminosa rasteira, perene, constituída

de caules pilosos e com folhas verdes brilhantes trifoliadas. Suas flores são amarelas

esverdeadas e as vagens pilosas são ligeiramente reclinadas, contendo de sete a oito

sementes por vagem. M. axillare é uma planta de origem africana, com distribuição

abundante na África Tropical, podendo assim, ser cultivada em países de clima tropical e

subtropical. (United States Department of Agriculture - Plants Database, 2003). Esta

leguminosa é utilizada normalmente como forragem, ou seja, como pastagem e alimentação

para o gado. Apresenta boa produtividade em solos argilosos ricos em fosfatos. A M.

axillare cresce vigorosamente no verão, continua crescendo durante o outono, suportando

bem as estações secas, como o inverno e continua crescer na primavera (Better Pastures for

the Tropics - Axillaris.htm, 2003).

Em função da facilidade de obtenção das sementes da Macrotyloma axillare em

grandes quantidades e da importância biotecnológica do BBI, torna-se evidente o interesse

em desenvolver metodologias de isolamento e caracterização do concentrado de BBI da

Macrotyloma axillare, para uma possível aplicação futura na quimioprevenção de tumores,

uma vez que BBI de soja é tratado como um fármaco pela FDA (Kennedy, A.R., 1998).

Introdução

Figura 8: Macrotyloma axillare.

Foto da planta adulta, foto das vagens à direita e à esquerda foto das sementes utilizadas nesse trabalho para a

produção do concentrado de BBI (FAO - FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE

UNITED NATIONS, 2003).

1.10. Classificação Sistemática da Macrotyloma axillare

• Sinonímia: Dolichos axillaris (E. Meyer); Clitoria vividiflora (Boulton);

• Nomes Comuns: Archer (Austrália), Grama de cavalo (Perenial horsegram);

• Informações Taxonômicas (United States Department of Agriculture - Plants

Database, 2003):

1. Reino: Plantae - Plantas

2. Sub-Reino: Tracheobionta - Traqueófita (plantas vasculares)

3. Superdivisão: Spermatophyta - Plantas com sementes

4. Divisão: Magnoliophyta - Plantas com Flores

5. Classe: Magnoliopsida - Dicotiledôneas

6. Sub-classe: Rosidae

Introdução

7. Ordem: Fabales

8. Família: Fabaceae - Família das ervilhas

9. Gênero: Macrotyloma (Wight & Arnott) Verdc.

10. Espécie: Macrotyloma axillare (E. Meyer) Verdc.

Figura 9: Ilustração esquemática da Macrotyloma axillare. (1) ramos de folhas e caule, (2) flor e (3) vagem

com sementes (Better Pastures for the Tropics - Axillaris.htm, 2003).

2. Justificativas e Objetivos

Justificativas e Objetivos

2. JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

2.1. Justificativas

Inibidores BBI obtidos de sementes de leguminosas apresentam-se como agregados,

geralmente diméricos. Cotilédones de brotos de cinco dias de plantas do gênero

Macrotyloma possuem BBI na forma monomérica e mais ativa que nas sementes (Sreerama

et al., 1998; César et al., 2006).

Conforme observado em trabalhos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa,

o inibidor de sementes germinadas de Macrotyloma axillare apresenta alta atividade

inibitória sobre serino-proteases, menor massa molecular e menor tamanho em relação ao

inibidor de sementes dormentes. Uma vez que são parcialmente hidrolisados nas suas

porções N e C terminais e se apresentam exclusivamente na forma de monômeros. Além

disso, foi confirmada por nosso grupo de pesquisa a menor carga líquida e maior

hidrofobicidade da molécula, tendo em vista que estes ficam mais retidos na fase

estacionária reversa (C18 de HPLC) em relação ao inibidor de sementes dormentes

(Oliveira, et al., 2005).

Essas características colocam os BBI de broto de Macrotyloma como inibidores de

absorção e distribuição favorecidas, que podem apresentar maior atividade farmacológica

no câncer. Além disso, a possibilidade de maior penetração no proteassoma 26S e a maior

atividade sobre a tripsina e quimotripsina justificam ainda mais a importância desses

estudos.

Assim sendo, baseado no fato de que os inibidores do tipo Bowman-Birk são

moléculas freqüentemente empregadas em estudos de prevenção do câncer e que sua ação

preventiva decorre principalmente da capacidade desses inibidores em inibir serino-

proteases; o presente trabalho tem como objetivo verificar as propriedades farmacocinéticas

de inibidores BBI da Macrotyloma axillare e compará-los com o BBI das sementes de soja.

Justificativas e Objetivos

2.2. Objetivo Geral

Estudar a farmacocinética de inibidores Bowman-Birk de sementes dormentes e

germinadas de Macrotyloma axillare em camundongos Swiss, comparando o perfil desses

inibidores aos inibidores de soja, tentando descobrir vantagens da sua utilização.

2.3. Objetivos específicos

1. Produzir BBIC de soja, de sementes e de cotilédones de Macrotyloma axillare em

quantidades preparativas para as determinações farmacocinéticas.

2. Estudar o perfil de biodistribuição dos BBI de sementes e cotilédones de

Macrotyloma axillare por meio de marcação com Iodo radioativo (I

125

3. Estudar a cinética plasmática dos inibidores radioativos de Macrotyloma axillare

administrados por via intravenosa.

4. Medir por meio da atividade inibitória sobre tripsina os níveis de absorção intestinal

in vitro dos BBIC de sementes de soja e de sementes e cotilédones de Macrotyloma

axillare.

3. Materiais e Métodos

Materiais e Metodologias

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Delineamento Experimental

Em nossos trabalhos utilizamos concentrados de BBI de soja, produzidos conforme

a metodologia proposta por Yavelow et al.(1985); extratos enriquecidos e frações

purificadas de sementes (dormentes e germinadas por 120 horas) da Macrotyloma axillare.

Os concentrados de soja e de Macrotyloma axillare, sementes e cotilédones,

apresentam atividade inibitória tanto sobre a tripsina e quimotripsina.

De posse dessas preparações, o presente trabalho foi realizado conforme

apresentado no seguinte delineamento experimental:

Figura 10: fluxograma do delineamento experimental (Kumar et al., 2002; Yavelow et al., 1985).

Materiais e Metodologias

3.2. Isolamento e Purificação dos inibidores

3.2.1. Obtenção das Sementes da Macrotyloma axillare

As sementes da Macrotyloma axillare foram gentilmente fornecidas pela empresa

Matsuda Sementes Ltda localizada na cidade de Álvares Machado, interior de São Paulo,

através do Dr. Alberto Takashi (Depto. Técnico).

Esse cultivar foi obtido do cruzamento artificial de dois cultivares comerciais da

Macrotyloma: Archer (Austrália) e Guatá (IZ). O nome comercial do cultivar lançado

comercialmente no ano de 2004 e por nós utilizado é Java.

3.2.2. Obtenção dos cotilédones da Macrotyloma axillare

As sementes foram selecionadas com o objetivo de descartar as danificadas. Em

seguida foram moderadamente escarificadas por meio de uma lixa d’água nº100 para

facilitar a penetração da água e deixá-las túrgidas para promover a quebra da dormência de

maneira homogênea. As sementes escarificadas foram imersas em água destilada por 24

horas, peneiradas e colocadas sobre papel de filtro à temperatura ambiente, e monitoradas

por 120 horas, mantendo-se a umidade sempre elevada pela pulverização periódica de água.

3.2.3. Preparo do Extrato Bruto de Macrotyloma axillare sementes e cotilédones

As melhores condições para extração protéica das sementes moídas e cotilédones

triturados em liquidificador foram determinadas a partir de provas preliminares para obter

de maneira otimizada o extrato rico em inibidores.

Dessa maneira, o extrato bruto foi preparado a partir de uma suspensão a 20% p/v

em tampão Glicina-HCl 0,1M pH 2,5 deixado em agitação overnight por 12 horas a 4°C.

Após o período de extração, a suspensão foi filtrada em gaze e o filtrado submetido à

centrifugação a 4724g por 30 minutos a 4°C para remoção de fibras insolúveis presentes.

Esse extrato foi denominado Extrato Bruto a 20 % p/v (EB 20%).

Materiais e Metodologias

3.2.4. Precipitação por Tratamento Térmico do EB 20%

A temperatura e o tempo de incubação foram testados de maneira que a perda de

atividade inibitória específica do EB 20% fosse a menor possível. Após várias tentativas, as

condições experimentais foram predefinidas como sendo 85 ºC por 30 minutos.

Decorrido esse tempo de incubação a suspensão era resfriada em banho de gelo e

submetida a uma nova centrifugação a 4724g por 30 minutos a 4 °C para remoção das

proteínas precipitadas pelo calor. O sobrenadante foi então denominado Extrato Bruto

Tratado Termicamente (EB TT).

3.2.5. Precipitação por Etanol a Frio

Aos volumes de EB TT de sementes e cotilédones foram acertados os pHs para 7,5

com hidróxido de amônio concentrado e adicionadas quantidades crescentes de etanol PA a

95,5 ºGL, resfriado a aproximadamente -20°C, para atingir concentrações finais de etanol

de 60 e 80%. Após a adição de cada volume de etanol, a suspensão era mantida em banho

de gelo e repouso por 15 minutos, centrifugada a 4°C por 30 minutos a 4724g.

Os volumes de etanol necessários para a precipitação de cada fração foram

calculados segundo a equação:

100

)(1000

)(

mlV

−

; onde:

V, é numericamente igual ao volume de etanol a ser adicionado a uma solução

líquida pronta contendo C

%v/v, para que a concentração se torne C

%v/v; para um litro de

solução inicial.

O precipitado obtido na concentração de 60%v/v era descartado. O sobrenadante era

submetido a uma nova etapa de precipitação para que a concentração final de etanol v/v

fosse de 80%. Com isso, o precipitado obtido se encontra numa faixa de concentração de

etanol entre 60 e 80%v/v. Para retirar possíveis proteínas insolúveis nesse concentrado, o

mesmo era ressuspenso em tampão NH

HCO

0,01M pH 8,5 e submetido a nova

centrifugação a 4724g por 30 minutos a 4°C. O material era isolado para posterior

liofilização e demais estudos com o então chamado Concentrado de BBI ou BBIC.

Materiais e Metodologias

Em alguns estudos foram utilizadas frações purificadas, ou seja, submetidas a

técnicas de cromatografia. Foram elas Q

NT sementes e BQ

NT cotilédones. Tais

frações foram obtidas no trabalho de César et al.,(2006).

3.2.6. Obtenção do extrato enriquecido (BBIC) soja

O pó de sementes trituradas de soja passou primeiramente por um processo de

delipidação com 10 volumes de acetona P.A. O pó remanescente do processo anterior foi

levado a extração em 10 volumes de etanol 60% a 55ºC com agitação constante por 1 hora.

O extrato foi filtrado em gaze e centrifugado 4724g por 30 minutos para remoção

das fibras insolúveis. Em seqüência o extrato foi acidificado ao pH 5,3 com HCl

concentrado e precipitado com 2 volumes de acetona P.A. e centrifugação a 4724g por 30

minutos, sendo que o precipitado obtido foi depois ressuspendido em água destilada,

dialisado e por fim liofilizado.

3.2.7. Dosagem de proteínas

As dosagens de proteínas foram determinadas pelos métodos colorimétricos

utilizando os reagentes de Folin-Ciocalteau (Lowry et al., 1951) e Biureto (Scopes, 1987).

O padrão de proteína utilizado como referência foi a soro albumina bovina (BSA) Merck,

em soluções de 20 a 100μg/mL para obtenção de retas-padrão, apresentadas no apêndice 3.

3.3. Caracterização do inibidor

3.3.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida a 12 e 18%

Preparação dos Géis de Separação e Concentração

Os suportes eletroforéticos utilizados eram géis de poliacrilamida de separação a 18

e 12% e de concentração a 5%, preparados em condições desnaturantes (com dodecilsulfato

de sódio ou SDS), segundo o método de Laemmli, 1970.

Assim, os géis foram preparados pela mistura dos seguintes reagentes:

•

solução tampão tris-hidroximetilamino-metano;

•

solução de acrilamida 30%p/v + bis-acrilamida 0,8%p/v;

Materiais e Metodologias

•

solução de SDS a 10%p/v;

•

solução de persulfato de amônio a 10% (preparo recente);

•

N,N,N’,N’- tetrametil-etilenodiamina a 99%;

•

água destilada q.s.p.

Utilizou-se tris-(hiroximetilamino)-metano 1,5M pH 8,8 no gel de separação e o

mesmo agente tamponante a 0,5M pH 6,8 no gel de concentração. Os volumes da mistura

acrilamida e bis-acrilamida eram alterados para obterem-se as diferentes concentrações

finais de acrilamida.

Preparo das Amostras para Eletroforese

As amostras provenientes das etapas de purificação foram preparadas em

concentrações finais de aproximadamente 1mg/mL em tampão NH

HCO

0,01M pH 8,3 e

diluídas no tampão da amostra 1:1, contendo tris-hidroximetilamino-metano 0,125M pH

6,8; azul de bromofenol 0,002%p/v, SDS 4%p/v e Glicerol 20%v/v e o agente redutor 2-

mercaptoetanol 10%v/v.

As amostras foram tratadas em banho de água fervente por cinco minutos para

desnaturação total das proteínas. O tampão de corrida eletroforética continha tris-

hidroximetilamino-metano 0,025M, Glicina 0,192M e SDS 0,1%p/v pH 8,2 e ainda

1,0%v/v de 2-Mercaptoetanol para evitar a reoxidação dos resíduos de cisteína, o que

implica em uma migração atípica das bandas de proteína, uma vez que essa reoxidação faz

com que o SDS não interaja adequadamente com as proteínas.

Utilizou-se uma mistura de isoformas de Concanavalina A (ConA) de massas

moleculares 30,0; 28,0; 23,0; 17,0 e 13,0KDa como padrão de massa molecular. As

eletroforeses foram realizadas em uma corrente elétrica de 20mA por placa, durante

aproximadamente 90 minutos.

Materiais e Metodologias

3.3.2. Coloração dos géis de poliacrilamida

Protocolo de Coloração pelo Nitrato de Prata

Foi procedida a coloração do gel de poliacrilamida após a corrida das amostras

primeiramente com a fixação do gel com Solução Fixadora contendo 50mL de metanol,

12mL de ácido acético, 40μL de formaldeído e água destilada q.s.p.100mL. Essa fixação

foi realizada por pelo menos uma hora de contato do gel com a solução fixadora.

Em seguida o gel foi lavado por três vezes com água destilada, sendo que as

lavagens duravam 7 minutos cada. Depois o gel foi imerso em Solução de Tiossulfato de

Sódio a 0,04%p/v, por um minuto, em seqüência era procedida uma nova lavagem como a

procedida anteriormente.

Após a lavagem o gel foi imerso por 20 minutos em Solução de Nitrato de Prata

contendo 0,1g de AgNO

, 75μL de formaldeído e água destilada q.s.p. 100mL. Para

finalizar essa etapa foi feita uma rápida lavagem com água destilada.

A revelação foi realizada na presença da Solução de Desenvolvimento na qual se

observava o aparecimento das bandas de proteínas. A solução era constituída de 6g de

50μL de formaldeído, 2mL de solução tiossulfato de sódio (mesma produzida

anteriormente) e água destilada q.s.p. 100mL.

Após o aparecimento das bandas o gel era colocado em contato com a solução de

parada, cuja composição era 50mL de metanol, 12mL de ácido acético e água destilada

q.s.p. 100mL.

Protocolo de Coloração pelo Comassie-Blue

Procedeu-se a coloração pelo tratamento do gel de eletroforese com uma solução de

Coomassie Blue R-250 a 0,025% em metanol 40% contendo 7% de ácido acético, por 3

horas. Os géis foram então descorados por meio de uma solução de metanol 40% contendo

7% de ácido acético até a visualização plena das bandas.

Materiais e Metodologias

3.4. Atividades Inibitórias

3.4.1. Tripsina Bovina

A determinação da atividade tripsínica foi feita de acordo adaptação do método

descrito por Erlanger et al. (1961). O substrato usado foi o cloridrato de N-α-benzoil-

arginil-p-nitroanilida (

-BApNA), que foi preparado dissolvendo-se 196 mg do composto

em 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) para obter 9 x 10

-2

M. Esta solução foi mantida no

congelador como solução estoque e diluída no momento do uso com tris-hidroximetil-

aminometano (Tris-HCl) 0,1M contendo CaCl

20mM pH 8,1 para a concentração de 9 x

-4

O tubo teste era constituído dos seguintes reagentes:

-BApNA 1000μL, tripsina

100μL a uma concentração de 0,05mg/mL e 20-100μL das frações de purificação do

inibidor, previamente diluídas em tampão NH

HCO

0,01M pH 8,5.

O tubo branco era constituído de 1000μL de substrato e 120-200μL de água,

enquanto que o tubo controle de atividade enzimática continha 1000μL de substrato, 100μL

de enzima e 20-100μL de água.

Os tubos de reação foram agitados em vortex e incubados em banho-maria a 37ºC

por aproximadamente 40 minutos. Após esse tempo, adicionaram-se 250μL de ácido

acético 60%v/v para paralisar a reação e posteriormente quantificar a atividade enzimática

pela medida da absorvância a 410nm.

Os dados obtidos com essas atividades inibitórias foram utilizados para a

determinação do rendimento e enriquecimento das preparações de Macrotyloma axillare e

soja.

As atividades inibitórias foram expressas em UAI: Unidade de Atividade Inibitória.

3.4.2. Quimotripsina Bovina

A determinação da atividade quimotripsínica foi feita de acordo adaptação do

método descrito por Erlanger et al (1961). O substrato usado foi o cloridrato de N-α-

benzoil-

-tirosil-p-nitroanilida (

-BTpNA) que foi preparado dissolvendo-se 182mg do

Materiais e Metodologias

composto em 5mL de DMSO para obter 9 x 10

-2

M. Esta solução foi mantida no congelador

como solução estoque e diluída no momento do uso com Tris-HCl 0,1M contendo CaCl

20mM pH 8,1 e DMSO na proporção de 80% e 20% respectivamente, para a concentração

de 9 x 10

-4

O tubo teste era constituído dos seguintes reagentes:

-BTpNA 1000μL,

quimotripsina 100μL a uma concentração de 0,05mg/mL e 20-100μL das frações de

purificação do inibidor, previamente diluídas em tampão NH

HCO

0,01M pH 8,5.

O tubo branco era constituído de 1000μL de substrato e 120-200μL de água,

enquanto que o tubo controle da atividade enzimática era constituído de 1000μL de

substrato, 100μL de enzima e 20-100μL de água.

Os tubos de reação foram homogeneizados e incubados em banho-maria a 37ºC por

aproximadamente 40 minutos. Após esse tempo, adicionaram-se 250μL de ácido acético

60%v/v para paralisar a reação e posteriormente quantificar a atividade enzimática pela

medida da absorvância a 410nm.

Os dados obtidos com essas atividades inibitórias foram utilizados para a

determinação do rendimento e enriquecimento das preparações de Macrotyloma axillare e

soja.

3.5. Ensaios Biológicos

3.5.1. Estudos farmacocinéticos de BBI-I

125

em camundongos Swiss

Os animais utilizados em todos ensaios biológicos pesavam entre 25 – 35 gramas.

Marcação dos BBI de sementes e cotilédones da

Macrotyloma axillare com NaI

125

O protocolo de marcação utilizava como princípio a atividade enzimática da

lactoperoxidase que gera espécies reativas de iodo no meio na presença de peróxido de

hidrogênio. Essas espécies reativas de iodo se ligam covalentemente aos anéis aromáticos

dos resíduos de tirosina (Morrison e Achonbaum, 1976).

Materiais e Metodologias

Protocolo de marcação

 30μg de PBBI de cotilédones e 30μg de PBBI purificado de sementes (previamente

obtidos em nosso laboratório) pela pipetagem de 30μL de soluções de BBI 1mg/mL

em tampão fosfato 0,1M pH 6,80 e dispensação em tubos eppendorf;

 0,2mCi de I

125

, obtidos pela pipetagem de 6μL de NaI

125

(Amersham Biosciences)

em capela com tijolos de chumbo com anteparo para a radiação emitida;

 5μL de lactoperoxidase (Sigma) 250μg/mL;

 adição de 5μL de H

1/50000 no tempo zero, quando se liga o motor de sucção da

capela;

 adição de 5μL de H

1/50000 no tempo um, (1 minuto);

 adição de 199μL de tampão fosfato 0,1M pH 6,80 adicionado de 0,1% de BSA no

tempo dois (2 minutos).

Separação da proteína marcada do I

125

-livre

A separação da proteína marcada do iodo livre se deu por aplicação dos 250μL dos

produtos reacionais em coluna de Sephadex G25

- Pharmacia LKB Biotechnology de

dimensões 0,7cm x 30cm equilibrada com tampão Fosfato 0,2M pH 6,80 adicionado de

0,1% de BSA, colhendo-se frações entre os volumes de 3 e 5mL, utilizando o mesmo

tampão como eluente.

Foram retiradas alíquotas de 5μL antes e depois da cromatografia tanto do inibidor

marcado de sementes como de cotilédones para a determinação da recuperação de proteínas

após a cromatografia, através da contagem da radiação em contador gama.

Após a cromatografia uma nova alíquota de 5μL era levada a cromatografia, em

papel Whatman n°1 de 20cm, com aplicação da amostra a 1,5cm da base inferior do papel e

eluição por 40 minutos em solução saturada de KI em metanol. O papel era recortado em

20 partes de 1cm e cada parte era contata em contador gama para determinação de iodo

radioativo incorporado e livre.

Materiais e Metodologias

Além disso, as atividades inibitórias sobre tripsina e quimotripsina foram

determinadas antes e depois da marcação dos BBI para precisar a influência da marcação na

funcionalidade das moléculas.

Biodistribuição dos inibidores marcados com I

125

Juntamente com os inibidores obtidos de sementes e de cotilédones marcados foram

utilizados inibidores não marcados, chamados proteínas frias, em uma dose considerada

terapêutica. Esses inibidores foram administrados por via oral pelo método de gavage em

cinco animais para cada inibidor. Passadas 3 horas da administração dos inibidores os

animais foram sacrificados por deslocamento cervical para retirada dos órgãos, lavagem,

secagem e pesagem dos mesmos, para posterior contagem da radiação em contador gama.

Foi montado um esquema de dose constituído de 8mg de BBI frio e BBI marcado

em quantidade suficiente para gerar uma contagem de aproximadamente 1x10

cpm. Como

a radiação total do material de sementes foi de 1,16x10

cpm em 2,0mL foi necessário um

volume de 17μL desse material para gerar a contagem desejada no material de partida. No

material de cotilédones a radiação total foi de 2,79x10

cpm em 2,0mL, necessitando então

de 72μL para atingir a contagem desejada e solução fisiológica de Tyrode (apêndice 1)

q.s.p 500μL para ambos.

Os órgãos analisados foram: intestino delgado, cólon, estômago, fígado, rim,

pulmão, bexiga e sangue.

Fígado e rim foram processados a homogenatos por meio de maceração com grau e

pistilo na presença de nitrogênio líquido e posteriormente homogeneizados em

homogeneizador de órgãos Potter (em tubos e pistilos esmerilhados Potter), com o aparelho

funcionado na velocidade mínima. Os homogenatos reunidos em pools, de cada órgão e do

plasma de todos os animais relativos aos inibidores de sementes e de cotilédones, foram

aplicados num volume de 200μL em uma coluna de Sephadex G50

- Pharmacia LKB

Biotechnology de dimensões de 0,9cm x 30cm. Um padrão de BBI-I

125

de sementes e outro

de cotilédones contendo 1mg de proteína fria e cerca de 4x10

cpm em solução fisiológica

de Tyrode q.s.p. 200μL também foram aplicados na coluna para observação e comparação

Materiais e Metodologias

do perfil cromatográfico do inibidor encontrado em cada um desses órgãos. Foram

recolhidas 40 frações de 1mL de cada órgão dos animais que foram administrados o

inibidor de sementes e o inibidor de cotilédones para contagem em contador gama.

Cinética plasmática dos inibidores de sementes e cotilédones

Foram administrados BBI-I

125

de sementes e cotilédones por via intravenosa para a

determinação da cinética plasmática dos inibidores.

Para a administração intravenosa foram preparadas doses contendo 1mg de BBI frio

de sementes para um grupo de três animais e também 1mg de BBI frio de cotilédones para

outro grupo de três animais, ambos adicionados de BBI marcado em quantidade suficiente

para gerar uma radiação de aproximadamente 3,5x10

cpm e solubilizados em tampão

Fosfato 0,2M pH 6,80 q.s.p. 25μL.

As aplicações dos 25μL preparados anteriormente se deram no plexo retroocular

dos camundongos, assim como as punções, porém no olho não aplicado. As punções eram

realizadas com o auxílio de tubos capilares heparinizados rendendo 15μL de plasma a cada

punção que era realizada intervalos de tempo pré-determinados, até 3 horas após a

administração. O plasma era obtido após a centrifugação dos tubos capilares cheios de

sangue em centrifuga para capilares por 6 minutos. Dessa forma, o plasma foi levado à

contagem da radiação em contador gama.

Os dados obtidos permitiram calcular os parâmetros farmacocinéticos: constante de

distribuição, constante de eliminação, meia-vida plasmática, volume de distribuição e área

sob a curva (Rowland e Tozer, 1995).

3.5.2. Estudo da cinética plasmática dos BBIC soja, sementes e cotilédones (

Java) em

camundongos

Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina

Foi feito um estudo piloto in vitro no qual BBIC de sementes e cotilédones de

Macrotyloma axillare e de sementes de soja, com atividades conhecidas foram adicionados

ao plasma de camundongos. Em seguida precipitaram-se os inibidores endógenos pelo

tratamento térmico a 85º por 15 minutos ou tratamento térmico e precipitação por etanol

Materiais e Metodologias

numa concentração final de 50%. Já se sabia que os BBIC são estáveis nessas condições, e

posteriormente foi feita a determinação da presença do inibidor pela atividade inibitória.

Utilizou-se nesse estudo sistemas formados por 100μL de BBIC na concentração de

2,0mg/mL em tampão acetato de amônio 0,01M pH 7,4 adicionados de 40μL de plasma.

Nesses sistemas foram procedidos os tratamentos térmicos ou tratamento térmico e

precipitação por etanol. O controle em vez de plasma possuía 40μL de água destilada. Após

os tratamentos o material foi precipitado em tubos eppendorf por centrifugação a 14000rpm

por 6 minutos. O sobrenadante foi submetido ao ensaio de inibição sobre tripsina.

No estudo in vivo utilizando camundongos, os animais sofreram injeções no plexo

retroocular de 25μL de solução salina contendo 5mg de BBIC.

Em seqüência, em intervalos de tempo pré-definidos, foram feitas punções no plexo

retroocular, dos olhos que ainda não tinham sofrido injeções, de 50μL de sangue em

capilares heparinizados. As punções rendiam, após centrifugação por 6 minutos em

centrifuga de capilar, 20μL de plasma. Procedida à precipitação dos possíveis inibidores de

proteases endógenos foram feitas determinações dos BBIC pela atividade inibitória sobre

tripsina. Neste caso o controle do ensaio em vez de 20μL de plasma possuía 20μL de água

destilada.

Para uma melhor precipitação dos inibidores de proteases endógenos foram tentados

outros métodos de precipitação dos inibidores endógenos utilizando ácido acético a 7,5%,

ácido tricloracético a 10% e ácido perclórico a 7% em relação aos volumes finais dos

sistemas das precipitações.

Foram realizadas ainda cromatografias de exclusão molecular. Após as

precipitações térmicas e precipitação térmica seguida de precipitação por etanol, os

sobrenadantes resultantes foram aplicados em colunas de filtração molecular de dimensões

6,0cm x 1,5cm de Sephadex G50

- Pharmacia LKB Biotechnology equilibrada com

tampão acetato de amônio 0,01M pH 7,4. O volume da coluna era de 3mL de resina, com

capacidade de aplicação de 0,5mL de amostra e com pico de proteína eluído no volume de

2mL após aplicação.

Materiais e Metodologias

O material recolhido da coluna era levado a secagem em Speed-Vac, em seguida

ressuspenso em 100μL de tampão acetato de amônio 0,01M pH 7,4, sendo que 20μL eram

levados para detecção dos BBIC via teste de inibição sobre tripsina.

3.5.3. Medida da absorção

in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones de Java em alças

intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos

Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina

Dissecação das alças intestinais

Para se proceder ao isolamento das alças intestinais de camundongos Swiss, os

animais eram deixados em jejum por pelo menos 16 horas e mortos por deslocamento

cervical. Em seqüência os animais eram fixados em suporte de isopor na posição de supino.

Eram feitas incisões abdominais no sentido caudal-cranial para exposição das vísceras. Os

jejuno-íleos eram isolados por cortes nas suas junções junto ao intestino grosso na porção

mais caudal e cortes nas junções ao duodeno na porção mais cranial dos animais. Na

medida em que as extensões dos órgãos eram obtidas pelo dissecamento, os mesmos eram

imersos em solução fisiológica de Tyrode, para a garantia a vitalidade dos órgãos. Os

jejuno-íleos isolados eram medidos para homogeneidade do experimento e cada órgão

apresentava 30cm de extensão.

Lavagem das alças de jejuno-íleo

As alças eram lavadas internamente e externamente, após seus isolamentos, com

solução fisiológica de Tyrode com o auxílio de uma piseta. Tais lavagens serviam para

garantir que nenhum resto alimentar fosse encontrado nos órgãos.

Preparação do BBI para determinação da absorção

in vitro nas alças jejuno-íleo isoladas

Os inibidores concentrados (BBIC) de sementes, cotilédones de Macrotyloma

axillare e de soja eram pesados de acordo com as dosagens pré-determinadas para os

experimentos. 2-20mg/mL de BBIC solubilizados em 1,10mL de solução de Tyrode; sendo

Materiais e Metodologias

que 1,0mL foi o volume aplicado em cada alça independentemente de sua concentração e

0,1mL restante foi utilizado para as determinações de atividades inibitórias sobre tripsina.

Experimentos de absorção dos BBIC

Os experimentos de absorção foram realizados em cubas de 50mL contendo

50,0mL de solução de Tyrode a 37ºC, temperatura alcançada com o auxílio de um banho-

maria. Era borbulhado ar no interior do béquer para oxigenação do órgão. Dentro das cubas

eram alojados os jejuno-íleos aplicados em seus interiores de 1,0mL de solução de BBIC,

por 7 horas. As extremidades dos órgãos eram fixadas nas bordas das cubas com a

colocação de pedaços de algodão embebidos em Tyrode.

Figura 11: Banho de órgão contendo jejuno-íleo de camundongo Swiss aplicado de BBIC imerso em solução

de Tyrode a 37ºC com borbulhamento de ar.

Bolhas brancas representam o ar e as vermelhas o BBIC que se exterioriza.

Em intervalos determinados de tempo, até 7 horas após a aplicação, foram retiradas

alíquotas de 500μL das soluções contidas nas cubas para determinação do BBIC absorvido,

pela atividade inibitória sobre tripsina. Essas alíquotas de 500μL foram repostas com mais

500μL de solução fresca de Tyrode para evitar uma concentração do possível BBIC

presente no lado externo do órgão.

Os órgãos eram observados ao longo das 7 horas de experimento para verificação da

vitalidade. Essa vitalidade era determinada pela coloração dos órgãos, motilidade ou

peristaltismo, cheiro e aspecto do banho de órgãos; sendo que após o término do

experimento era verificada ainda a integridade dos órgãos para garantir que não havia furos

o que poderia permitir a livre passagem de BBIC para o lado externo dos órgãos.

Materiais e Metodologias

Ao término do experimento as alíquotas retiradas dos banhos de órgãos tinham sua

atividade inibitória sobre tripsina determinada.

3.6. Análise estatística

Teste t-student para amostras independentes pequenas (Levin, J. Estatística Aplicada a

Ciências Humanas, 2ª edição – Harbra).

comb = (n

-1)S

+ (n

-1)S

/ n

+ n

– 2

comb(1/n

+1/n

)

T = X – Y /

T tabelado = T n

+ n

- 2 (GL) → p< 0,05

•

T observado > T tabelado → médias diferentes.

•

T observado < ou = T tabelado → médias iguais.

4. Resultados

Resultados

4. RESULTADOS

4.1. Obtenção dos extratos enriquecidos de BBI (BBIC)

4.1.1. BBIC sementes e cotilédones de Macrotyloma axillare e de soja

BBIC de sementes de

Macrotyloma axillare

A extração das sementes em pH ácido levou a obtenção de um material rico em

inibidores de massa molecular característica de BBI em SDS-PAGE a 18% na presença de

2-mercaptoetanol 1% v/v no tampão eletroforético. Foi então obtido uma preparação com

boa atividade específica (tab. 2) e satisfatório grau de pureza.

Figura 12: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do BBIC sementes (linha 1) e

padrão de massa molecular (PMM) de ConA (linha 2).

BBIC de cotilédones de

Macrotyloma axillare

A preparação obtida de cotilédones provenientes da germinação das sementes por

120 horas é um concentrado de BBI de baixa massa molecular bastante enriquecido, com

elevada atividade específica (tab. 2) e um bom nível de pureza.

Resultados

Figura 13: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do padrão de massa molecular

(PMM) de ConA (linha 1) e BBIC cotilédones (linha 2) .

BBIC de soja

O enriquecido de BBI de sementes de soja, obtido pelo método descrito por

Yavelow et al. (1985), rendeu um produto com boa atividade específica e baixa massa

molecular. Entretanto, o grau de pureza é menor do que aquele apresentado pelos inibidores

Macrotyloma axillare.

Figura 14: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE do padrão de massa molecular

(PMM) de ConA (linha 1) e BBIC soja (linha 2) . As setas vermelhas correspondem a bandas de

contaminantes e não de BBI.

Resultados

4.2. Caracterização das atividades inibitórias das preparações enriquecidas

de BBI

4.2.1. Atividades específicas para inibição da hidrólise do

-BApNA pela tripsina e pela

hidrólise do

-BTpNA pela quimotripsina

O concentrado de BBI de cotilédones apresentou uma atividade específica para

tripsina em torno de 40 vezes maior que o concentrado de sementes de Macrotyloma e de

20 vezes em relação ao concentrado de soja. Soja apresentou atividade sobre tripsina de

cerca de duas vezes superior ao inibidor de sementes, porém aproximadamente 30% menos

atividade inibitória sobre quimotripsina como pode ser visto na figura 15.

39,1

2,26

50,04

0,68

sementes cotilédones soja

razão UAI/UAI sementes

tripsina

quimotripsina

Figura 15: Razão das atividades específicas os BBI de cotilédones de Java e de sementes de soja em relação

ao BBI de sementes de Java pela inibição da hidrólise do

-BApNA por tripsina e

-BTpNA por

quimotripsina .

Esta figura deixa claro que soja e sementes de Java têm atividades inibitórias

específicas com valores próximos ao passo que cotilédones de Java têm atividades muito

superiores.

De acordo com o quadro de rendimento e enriquecimento (tab. 2) nota-se uma

ativação, com aumento do rendimento para 466% na atividade sobre a tripsina, da

Resultados

preparação submetida ao tratamento térmico e precipitada com etanol na faixa de 60-80%

(EB20% TT 60-80%). Observa-se também que amostras não tratadas termicamente

(EB20% NT 60-80%) possuem atividades específicas muito menores em decorrência de

não terem sido ativadas.

Tabela 2: Quadro de rendimento e enriquecimento dos BBIC de sementes, cotilédones (Macrotyloma

axillare) e soja - Inibição da hidrólise do

-BApNA pela tripsina (T) e do

-BTpNA pela quimotripsina (Q).

Inibidor Etapa

Enzima

Atividade

específica

(UAI/mg/mL)

Rendimento

(%)

Enriquecimento

EB20% T

4641,4

2169,6

100

Cotilédones

EB20%TT

60-80%

222829,0

± 25228,2

97046,9

466

131,6

48,01

44,73

EB20%NT

60-80%

15305,0

6861,1

---

7,05

1,47

EB20% T

2913,7

1239,5

100

Sementes

EB20%TT

60-80%

5689,4

±583,3

2866,4

17,1

20,2

1,95

2,31

Soja

concentrado

12962,8

± 3144,1

1939,4

---

4.2.3 Estimativa da massa aparente e do grau de enriquecimento das preparações de

inibidores

Utilizando padrões primários de massa molecular, determinamos as massas

aparentes das cinco bandas apresentadas nos géis de eletroforese pela ConA, que se tornou

um padrão secundário de peso molecular bastante confiável, uma vez que o perfil

eletroforético de tais bandas é bem reprodutível.

Resultados

De posse desse padrão, pôde se estimar as massas aparentes dos inibidores de

sementes, de cotilédones (Java) e de soja (tab. 3) por meio da substituição das medidas de

deslocamento das respectivas bandas na reta padrão determinada pela ConA (apêndice 2).

Tabela 3: Estimação da massa aparentes dos inibidores obtidos de sementes, de cotilédones (Macrotyloma

axillare) e de soja pelos deslocamentos das bandas de cada inibidor substituídos na equação da reta.

Inibidor

Massa Molecular Aparente

Sementes

∼13KDa

Cotilédones

∼10KDa

Soja

∼10KDa

Tais determinações podem ser observadas na figura que se segue, onde pode-se

notar o posicionamento mais abaixo da linha 5 correspondente ao BBIC de cotilédones.

Figura 16: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 18% SDS-PAGE de BBIP sementes (linha 1);

BBIP cotilédones (linh2); padrão de massa molecular (PMM) de ConA (linha 3); BBIC sementes (linha 4);

BBIC cotilédones (linha 5) e BBIC soja (linha 6) César et al. (2006).

Resultados

Essa observação da banda de BBIC de cotilédones (linha 5, fig. 16) na parte

correspondente a uma massa aparente inferior ao inibidor de sementes, foi confirmada por

determinação das massas moleculares desses inibidores por meio de espectrometria de

massas (César et al., 2006), que apresentam massas em torno de 8KDa para sementes e

entre 6 – 7KDa para cotilédones.

Quanto ao enriquecimento dos inibidores o inibidor de cotilédones é o que apresenta

uma maior riqueza de BBI com uma banda extremamente concentrada.

O inibidor obtido de sementes (linha 4, fig. 16) apresenta outras bandas menos

concentradas indicando que esse material não é tão enriquecido quanto o de cotilédones,

mas bem mais purificado que a preparação de soja (linha 6, fig. 16).

As linhas 1 e 2 (fig. 16) correspondem respectivamente aos inibidores purificados

(PBBI) de sementes e cotilédones de Java, e vêm a confirmar as observações sobre a massa

molecular e enriquecimento de ambos inibidores.

Anteriormente as SDS-PAGE às quais eram aplicadas amostras de BBI

apresentavam um perfil atípico de migração no qual as revelações dos géis mostravam

essas proteínas em regiões de massa molecular aparente correspondente a 30KDa (fig. 17)

inconsistente com a massa molecular em torno de 8KDa esperada para esses inibidores. Tal

problema foi solucionado pela adição de 1% do agente redutor 2-mercaptoetanol no tampão

de corrida dos géis para garantir a redução das sete pontes dissulfeto presentes na estrutura.

Resultados

30KDa

28KDa

23KDa

17KDa

Figura 17: Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida a 12% SDS-PAGE da fração 60-80% proveniente de

precipitação com etanol (60-80), frações purificadas em Q-Sepharose (Q1-Q5) e padrão de massa molecular

(PMM) de ConA; sem tratamento com o agente redutor 2-mercaptoetanol (Oliveira, 2004).

4.3 Ensaios Biológicos

4.3.1 Marcação dos BBI de Macrotyloma axillare com I

125

Para os estudos com I

125

foram utilizados frações purificadas (PBBI) de sementes e

de cotilédones de M. axillare. Esses materiais conforme mostrou a análise em SDS-PAGE

apresentaram-se satisfatoriamente enriquecidos e preparados para um bom procedimento de

marcação de proteínas com radioisótopos: 83% de rendimento para a marcação dos

inibidores de sementes e 70% de rendimento para a marcação dos inibidores de cotilédones

de Macrotyloma axillare.

Os procedimentos de marcação praticamente não influenciaram as atividades

inibitórias sobre tripsina e quimotripsina, conforme observado na tabela abaixo.

Tabela 4: Perda de atividade inibitória pelos inibidores após sua marcação com I

125

Enzima inibida Sementes Cotilédones

Tripsina 0,9% 0,8%

Quimotripsina 5% 10%

Resultados

O material marcado se mostrou bastante estável, pois 20 dias após a marcação, nova

determinação de proteína marcada e iodo livre, mostrou um perfil semelhante ao observado

logo após a marcação.

4.3.2 Biodistribuição dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

camundongos

Swiss

Após 3 horas da administração oral dos inibidores de sementes e cotilédones

marcados com I

125

observou-se o seguinte perfil de biodistribuição pelos principais órgãos

de camundongos Swiss.

sangue int.delgado cólon estômago fígado rim pulmão bexiga

órgãos

% rad. / g órgão / rad. dose

cotílédones sementes

Figura 18: Médias e desvios (n=5) da biodistribuição dos inibidores de cotilédones e sementes marcados com

125

por grama de órgão de camundongos Swiss em relação à dose total aplicada.

O sangue é o tecido no qual maior parte do material marcado se acumula, seguido

pelo estômago. Nos demais órgãos a distribuição é homogênea, com os valores de acúmulo

girando em torno de 1 a 2%. A comparação estatística (teste t-student n = 5 e p < 0,05)

entre as médias de biodistribuição dos inibidores pelos órgãos segue na tabela 5.

Resultados

Tabela 5: Comparação entre as médias de acúmulo de inibidores de sementes e cotilédones em cólon, rim e

bexiga de camundongos Swiss (p < 0,05).

Órgãos Médias

cólon

sementes > cotilédones

rim sementes = cotilédones

bexiga sementes = cotilédones

sangue sementes = cotilédones

int. delgado sementes = cotilédones

estômago sementes = cotilédones

pulmão sementes = cotilédones

fígado sementes = cotilédones

Dentre os órgãos cujos níveis de acúmulo de BBI marcado são próximos de 1 a 2%,

o único que apresentou diferença significativa entre as médias foi o cólon, sendo a média de

sementes superior à média de cotilédones.

4.3.3 Análise dos homogenatos dos principais órgãos de camundongos Swiss

administrados com BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

Os homogenatos dos principais órgãos mostraram volumes de eluição das proteínas

marcadas e iodo livre semelhantes para todos os órgãos analisados, tanto para inibidores de

sementes como de cotilédones.

A região de eluição da proteína marcada é em torno da fração 10 e a de eluição de

iodo livre em torno da fração 25.

Resultados

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

frações

cpm

plasma fígado rim BBI

BBI

Iodo livre

Figura 19: Perfil de eluição do padrão de BBI e homogenatos dos principais órgãos após três horas da

administração oral do inibidor de sementes marcado com I

125

em camundongos Swiss. Coluna de exclusão

molecular Sephadex G-50.

A análise dos homogenatos e da biodistribuição permitiu determinar as

porcentagens de radiação presentes no plasma, fígado e rim, conforme apresentado na

tabela 6 para BBI de sementes e tabela 7 para BBI de cotilédones de Java.

Tabela 6: Percentagem de radiação presente em cada órgão processado a homogenato, após 3 horas da

administração oral do inibidor marcado de sementes.

órgão (processado a homogenato após 3

horas da administração oral do BBI

% radioatividade (presente no órgão em

relação à radioatividade administrada)

plasma 14,5%

fígado 0,37%

rim 0,17%

Resultados

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

11000

12000

0 5 10 15 20 25 30 35 40

frações

cpm

plasma fígado rim BBI

BBI

Iodo livre

Figura 20: Perfil de eluição do padrão de BBI e homogenatos dos principais órgãos após três horas da

administração oral do inibidor de cotilédones marcado com I

125

em camundongos Swiss. Coluna de exclusão

molecular Sephadex G-50.

Tabela 7: Percentagem de radiação presente em cada órgão processado a homogenato, após 3 horas da

administração oral do inibidor marcado de cotilédones.

órgão (processado a homogenato após 3

horas da administração oral do BBI

% radioatividade (presente no órgão em

relação à radioatividade administrada)

plasma 18,9%

fígado 0,47%

rim 0,35%

Resultados

4.3.4 Cinética plasmática dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

administrados por via intravenosa e oral em camundongos

Swiss

Administração intravenosa

Após a administração intravenosa os inibidores marcados de sementes e cotilédones

decaem rapidamente do compartimento vascular (dados mostram um modelo de dois

compartimentos: central ou vascular e periférico).

Esse decaimento é bastante pronunciado até 30 minutos da administração para BBI

de sementes, quando apresenta uma constante de distribuição (α) de 4% min

-1

, ou seja, com

um minuto de administração 4% do inibidor tende a sair do compartimento vascular e ser

distribuído pelos diversos órgãos do animal. A constante de eliminação (β) é 0,08% min

-1

o tempo de meia vida plasmática (t

1/2

) de 14,4 horas.

Cinética - sementes

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

5,7

0 30 60 90 120 150 180

tempo (minutos)

log cpm

distribuição e

eliminação

distribuição

Figura 21: Cinética plasmática do BBI de sementes marcado com I

125

administrado por via intravenosa em

camundongos Swiss (n = 5).

O BBI de cotilédones decai mais rapidamente do compartimento vascular,

possuindo uma fase de distribuição mais rápida por esse inibidor com uma constante de

distribuição de 9% min

-1

e eliminação com uma constante de 0,16% min

-1

1/2

7,2 horas).

As curvas de distribuição e eliminação são apresentadas na figura 22.

Resultados

Cinética - cotilédones

4,5

4,7

4,9

5,1

5,3

5,5

5,7

0 30 60 90 120 150 180

tempo (minutos)

log cpm

distribuição e

eliminação

distribuição

Figura 22: Cinética plasmática do BBI de cotilédones marcado com I

125

administrado por via intravenosa em

camundongos Swiss (n = 5).

Os parâmetros farmacocinéticos foram calculados a partir dos dados acima e estão

apresentados na tabela 8.

Resultados

Tabela 8: Parâmetros farmacocinéticos determinados para BBI de M. axillare marcados com I

125

administrado por via intravenosa em camundongos Swiss (n = 5).

Parâmetro Farmacocinético Sementes Cotilédones

α (constante de distribuição)

4,05%/min. 9,38%/min.

β (constante de eliminação)

0,08%/min. 0,16%/min.

VD (volume de distribuição) *0,16mL/g *0,18mL/g

1/2

(meia vida plasmática) 14,4 horas 7,2 horas

AUC (área sob a curva) 36,29 34,25

* considerando que um camundongo pesa em média 30 gramas

4.3.5 Estudo da cinética plasmática dos BBIC soja, sementes e cotilédones (Java) em

camundongos

Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina

Não foi possível determinar a cinética plasmática dos BBIC sementes, cotilédones

de Macrotyloma axillare e soja através da atividade inibitória sobre tripsina dos inibidores

presentes no plasma devido a grande interferência de inibidores endógenos.

4.3.6. Medida da absorção

in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones em alças

intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos

Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina

Os experimentos de absorção in vitro apresentaram os seguintes níveis de

biodisponibilidade após as 7 horas de experimento (fig. 23).

Resultados

2 4 8 10 12 20

dosagem (mg)

biodisponibilidade (%)

sementes

cotilédones

soja

Figura 23: Níveis de biodisponibilidade em 7 horas de contato BBIC sementes, cotilédones e soja com íleos

isolados de camundongos Swiss.

Os inibidores de Macrotyloma axillare apresentam seus máximos de absorção em

dosagens entre 8 e 12mg, ao passo que o inibidor de soja com 2mg já apresenta altos níveis

de biodisponibilidade. Para soja a absorção decresce com o aumento das dosagens e torna a

aumentar em 20mg.

A tabela 9 mostra a comparação estatística entre as médias de absorção dos BBI de

Macrotyloma axillare e de soja.

Tabela 9: Comparação entre as médias de absorção dos BBI de Macrotyloma axillare e de soja

(n =5 e p < 0,05).

dosagem comparação entre as médias de absorção

2mg

soja > sementes > cotilédones

4mg

soja > cotilédones > sementes

8mg

soja > cotilédones = sementes

10mg

cotilédones > sementes > soja

12mg

cotilédones > sementes

20mg

soja > cotilédones > sementes

Resultados

Para evidenciar as diferenças de atividade disponibilizada, relacionada à potência de

inibição dos inibidores da soja e dos cotilédones de Macrotyloma, são apresentadas na

figura 26 as curvas de absorção dos dois inibidores em função das unidades de atividade.

Desta forma, pode ser observado que níveis muito maiores de atividade atingem o

organismo quando se administra BBI de cotilédones, uma vez que este possui atividade

específica 20 vezes maior que os inibidores da soja.

-15000

15000

45000

75000

105000

135000

165000

195000

225000

255000

285000

01234567

tempo (horas)

UAI

sementes

cotilédones

soja

Figura 24: Absorção in vitro de BBI de sementes e de cotilédones de Macrotyloma axillare e de soja na

dosagem de 8mg, expressa em UAI em função do tempo em jejuno-íleos isolados de camundongos Swiss.

Velocidade aparente de absorção do inibidor de sementes

As velocidades foram determinadas em porcentagem de absorção da dose do

inibidor aplicada ao jejuno-íleo em função do tempo em horas versus concentração.

Dentre os três inibidores pelos quais determinamos a absorção intestinal in vitro, o

BBIC sementes é o que apresenta a menor atividade específica para tripsina e tem

velocidade máxima de absorção de aproximadamente 6 % da dose / hora em concentrações

em torno de 8 a 10mg/mL.

Resultados

Biodisponibilidades - sementes

01234567

tempo (horas)

biodisponibilidade (%)

2mg

8mg

10mg

12mg

20mg

0 4 8 12 16 20

concentração (mg/mL)

velocidade (%/h)

Figura 25: Absorção in vitro do inibidor de sementes em função do tempo em jejuno-íleos isolados de

camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção.

Resultados

Absorção do inibidor de cotilédones

BBIC cotilédones é o que apresenta a maior atividade específica dos três inibidores

em estudo, tanto para tripsina como para quimotripsina. Sua velocidade máxima de

absorção é um pouco superior à apresentada pelo inibidor de sementes, cerca de 7% da dose

/ hora e também se dá em torno da concentração de 10mg/mL.

Assim como para as sementes, com 10mg/mL observa-se a absorção máxima de

BBIC de cotilédones, no intervalo entre 2 e 4 horas, quando se tem inclinações máximas

das curvas de absorção.

Biodisponibilidades - cotilédones

01234567

tempo (horas)

biodisponibilidade (%)

2mg

10mg

12mg

20mg

0 4 8 12 16 20

concentração (mg/mL)

velocidade (%/h)

Figura 26: Absorção in vitro do inibidor de cotilédones em função do tempo em jejuno-íleos isolados de

camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção.

Resultados

Absorção do inibidor de soja

BBIC soja apresentou os maiores níveis de absorção intestinal, isso pode ser

explicado pelo fato dele também apresentar as maiores velocidades de absorção em relação

aos BBIC de M. axillare (9% da dose / hora). É importante ressaltar que essas velocidades

se dão em concentrações mais baixas, próximas a 5mg/mL.

Biodisponibilidades - soja

01234567

tempo (horas)

bioisponibilidade (%)

2mg

4mg

8mg

10mg

20mg

0246810

concentração (mg/mL)

velocidade (%/h)

Figura 27: Absorção in vitro do inibidor de soja em função do tempo em jejuno- íleos isolados de

camundongos Swiss. Inserto das velocidades iniciais de absorção.

A tabela 10 mostra os valores das áreas sob as curvas de biodisponibilidade dos BBI

de sementes e cotilédones de Macrotyloma axillare e sementes de soja em função do

tempo.

Resultados

Tabela 10: Áreas sob as curvas de biodisponibilidade dos BBI de Java e de soja.

inibidor

dosagem

BBI de Sementes

(Java)

BBI de Cotilédones

(Java)

BBI de soja

2mg 445,6 445,6 397,6

4mg --- --- 724,9

8mg 473,4 --- 1318,7

10mg 283,3 1025,9 283,3

12mg 590,5 318,9 ---

20mg 101,7 251,7 661,2

As determinações das áreas sob as curvas confirmam que os BBI de soja são

realmente os inibidores de maior absorção, dentre os inibidores estudados. Em seguida vêm

os BBI de cotilédones e depois os BBI de sementes de Macrotyloma axillare.

5. Discussão

Discussão

5. DISCUSSÃO

5.1. Obtenção dos extratos enriquecidos de BBI – BBIC de sementes, de cotilédones

(Macrotyloma axillare) e de soja

5.1.1.Obtenção dos BBIC de sementes e de cotilédones (Macrotyloma axillare)

As extrações dos BBI de Macrotyloma axillare foram feitas em pH ácido com o

objetivo de preservar o inibidor de ataques de enzimas proteolíticas, uma vez que em

estudos prévios constatou-se que grande parte da atividade proteolítica é inativada em pH

2,5. Esse procedimento rendeu preparações com maiores atividades específicas como

mostrado nos resultados. A amostra foi submetida ao tratamento térmico no mesmo pH de

extração e nessa condição, ocorreu uma ativação da atividade inibitória, resultando e um

ganho típico de aproximadamente 4,5 vezes no rendimento da atividade inibitória da

tripsina nas preparações de cotilédones do broto. A análise das atividades específicas

mostra um ganho notável de atividade na preparação de broto que se mostrou até 50 vezes

maior que a atividade da preparação da semente e 20 vezes maior que a da soja. Esses

dados confrontam com resultados anteriores de preparações submetidas ao tratamento

térmico em pH 7,0 que possuíam atividades apenas de cinco vezes maior que o enriquecido

de semente. Esse dado equivale ao resultado encontrado para o broto não tratado

termicamente.

Ainda não é possível explicar claramente como ocorreu a ativação e o aumento

notável da atividade específica observada em cinco experimentos de extrações

independentes, mas considerou-se a possibilidade da ativação ser mediada por enzimas

ácidas presentes nos extratos de broto.

A germinação das sementes de Macrotyloma axillare leva ao surgimento de

espécies de inibidores de Bowman-Birk mais ativas. Essa ativação parece decorrer por

proteólises por proteases endógenas que hidrolisam porções ricas em aspartato e glutamato

das caudas C e N terminais (Sreerama et al., 1998). As espécies geradas não apresentam

diferenças apenas em suas atividades inibitórias sobre serino-proteases, mas também na

mobilidade em SDS-PAGE; onde suas bandas tendem a migrar para regiões de mais baixa

Discussão

massa molecular. Essa observação é justificada pela menor massa molecular apresentada

por esses inibidores, em decorrência de quebras das porções C e N terminais por ação de

proteinases, conforme comprova a determinação da massa real por espectrometria de

massas (César et al., 2006).

5.1.2.Obtenção dos BBIC de soja

BBIC soja foi obtido por técnica descrita por Yavelow et al. (1985) e rendeu um

material com boa atividade específica para a inibição de tripsina e quimotripsina (tab. 2) e

um bom rendimento em massa de proteínas. Porém essa técnica não garante uma

purificação tão refinada quanto à utilizada para a produção de extratos concentrados de BBI

de Macrotyloma axillare (fig. 14).

5.2. Caracterização dos BBIC obtidos

Os procedimentos de isolamento dos concentrados de BBI de Macrotyloma axillare

possibilitaram a obtenção de um material com maior teor de pureza em relação ao material

de soja conforme observado na figura 16. Esses resultados mostram um BBIC de

cotilédones praticamente puro e com uma banda dessa proteína altamente enriquecida na

região de menor massa molecular. O BBIC de sementes não mostra o mesmo grau de

pureza e enriquecimento, entretanto em relação à preparação de soja que foi amplamente

utilizada em muitos trabalhos da literatura pertinente (Kennedy, 1998; Yavelow et al.,

1985; etc) o enriquecido de semente é muito mais concentrado em BBI. Além disso, a

banda de soja apresenta bastantes sinais de impurezas em regiões de massas moleculares

superiores às dos BBI.

Quanto à caracterização pela massa aparente determinada em géis de SDS-PAGE,

BBIC de cotilédones (Java) e soja apresentam a mesma massa aparente que é de 10KDa e

sementes (Java) 13KDa. O valor inferior observado para BBIC cotilédones era esperado

pelo fato desse inibidor ser menor em função de sua degradação parcial durante a

germinação das sementes (Kumar et al., 2002).

Discussão

Massas moleculares superestimadas são artefatos de técnica muito freqüentes em

eletroforeses SDS-PAGE de amostras de BBI. As determinações de massa das amostras de

Macrotyloma em protocolos habituais geraram resultados de 30KDa, inconsistentes com a

expectativa de 8KDa calculada pela seqüência de aminoácidos ou pelos dados de

espectrometria de massa. A migração alterada das bandas pode ser explicada pelas

possibilidades de reoxidações das diversas pontes de dissulfeto presentes no BBI, mesmo

após tratar as amostras com agente redutor. As reoxidações podem não permitir a

associação integral do SDS com a cadeia peptídica do BBI gerando uma razão carga /

massa diferente dos padrões. A utilização do 2-mercaptoetanol no tampão de corrida

corrige a migração das bandas de BBI para posições próximas do esperado (fig. 16 e 17).

5.3. Ensaios biológicos

5.3.1.Marcação dos BBI de Macrotyloma axillare com I

125

Nossos procedimentos de marcação de PBBIC cotilédones e sementes de

Macrotyloma axillare com I

125

foram bem sucedidos, pois esses inibidores após as

marcações apresentaram praticamente as mesmas atividades inibitórias sobre tripsina e

quimotripsina de antes das marcações (tab.4).

5.3.2.Biodistribuição dos BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

camundongos

Swiss

Grande parte dos inibidores BBI de soja marcados administrados aos camundongos

por via oral se concentra no conteúdo luminal e o restante, cerca de 50%, cai na corrente

sangüínea e se distribui para os diversos órgãos (Billings et al., 1992).

Discussão

Figura 28: Biodistribuição de BBI -I

125

soja em camundongos Swiss (Billings, et al. 1992).

Para os BBI de Macrotyloma axillare administrados por via oral, observamos uma

concentração significativa de BBI marcado no sangue, que inclusive apresenta as maiores

médias seguido de estômago, os demais órgãos apresentaram níveis semelhantes de

acumulação (fig. 18). Entre sementes e cotilédones não foram constatadas diferenças

significativas de acúmulo de material marcado entre os diversos órgãos, exceto para cólon,

onde BBI de sementes apresentam uma média significativamente superior aos BBI de

cotilédones (tab. 5).

Billings et al., (1992) averiguou com seus experimentos de biodistribuição de BBI-

125

soja que o sangue foi o tecido de maior acúmulo de material marcado e os demais

órgãos apresentaram níveis bem mais baixos e semelhantes entre si.

Em nossos experimentos encontramos uma diferença marcante: além do alto

acúmulo no sangue encontramos uma significativa quantidade de material radioativo no

estômago, tanto para o BBI de sementes como de cotilédones (Java). Essa diferença é

muito interessante no que diz respeito a estudos de quimioprevenção, uma vez que

neoplasias de estômago figuram entre as mais importantes. O câncer de estômago segundo

Discussão

estimativa para 2002, feita pelo Ministério da Saúde Brasileiro é uma neoplasia que ocupa

primeiras posições nas taxas de incidência e mortalidade. Em todas regiões do Brasil o

câncer de estômago ocupa lugares entre as cinco primeiras posições de incidência de novos

casos e óbitos por câncer (INCA, 2005).

Estudos recentes mostram que a atividade tripsínica é responsável pela

agressividade de tumores de células gástricas (Miyata et al., 1998; Burger et al., 1970; Alm

et al., 2000; Miyata et al., 2000). Dessa forma, encontramos resultados que motivam a

realização de futuros experimentos com inibidores da Macrotyloma axillare em modelos de

estudos de câncer vislumbrando maior atividade de quimioprevenção.

Outra inferência que podemos fazer é a de que os BBI de Macrotyloma axillare se

distribuem bem por todo organismo. Todos os órgãos analisados apresentaram acúmulo de

material marcado, inclusive pulmão e cólon que também são órgãos importantes de

desenvolvimentos de câncer, cujas neoplasias resultam em alta mortalidade (INCA, 2005).

5.3.3 Análise dos homogenatos dos principais órgãos de camundongos

Swiss

administrados com BBI de sementes e cotilédones marcados com I

125

Após 3 horas da administração oral dos inibidores marcados, a analise de

cromatogramas de filtração molecular de homogenatos do rim e fígado e plasma, mostra as

frações metabolizadas e a radioatividade incorporada às proteínas. As percentagens de BBI

de broto e sementes Macrotyloma presentes nos órgãos puderam ser calculadas utilizando o

fator que converte radioatividade total em a radioatividade incorporada à proteína. Os BBI

de cotilédones de brotos apresentaram uma maior fração de radioatividade incorporada nos

órgãos citados acima.

BBI-I

125

sementes foi mais susceptível a metabolização: de 83% de iodo

incorporado ao BBI administrado aos animais, 45% foram recuperados nos órgãos cujos

homogenatos foram submetidos à cromatografia de filtração molecular (fig. 19 e tab. 6). A

alta taxa de perda de radioatividade pelo inibidor marcado de sementes pode ser explicada

por uma possível metabolização da porção N terminal da proteína, rica em resíduos de

Discussão

histidina que servem de base para uma incorporação secundária de I

125

(Morrison e

Schonbaum, 1976) em relação à tirosina que é o sítio preferencial de incorporação do iodo.

Para cotilédones a perda de radiação incorporada à proteína foi bem menor (fig. 20 e

tab. 7). O inibidor padrão marcado tinha em média 70% de radioatividade incorporada e os

homogenatos dos órgãos analisados mostraram em média 60% de radiação incorporada.

Essa observação vem fortalecer a hipótese levantada anteriormente sobre a metabolização

da porção N terminal do BBI de sementes, pois BBI de cotilédones por ação de proteases

endógenas das sementes tem partes de suas porções C e N terminais degradadas. Desta

maneira, espera-se que a marcação desse inibidor tenha ocorrido nos resíduos de tirosina

situados fora das regiões que sofrem degradação (fig. 29).

Figura 29: Seqüência dos inibidores DE-3 e DE-4 (isoformas) obtidos de sementes de Macrotyloma axillare

(Joubert et al., 1979).

Discussão

5.3.3. Cinética plasmática dos inibidores de sementes e cotilédones marcados com I

125

administrados por via intravenosa e oral em camundongos

Swiss

Administração intravenosa

A administração intravenosa dos inibidores marcados nos permitiu determinar

importantes parâmetros farmacocinéticos dos BBI de Macrotyloma axillare em

camundongos Swiss, como as constantes de distribuição e eliminação, tempo de meia-vida

plasmática, volume de distribuição e área sob a curva (tab.8).

Ambos inibidores tendem a se distribuir rapidamente pelo organismo, mas algumas

diferenças foram notadas: BBIC de cotilédones distribui-se com o dobro da velocidade em

relação ao BBIC de sementes. As constantes de eliminação são baixas, gerando valores

elevados de meias-vidas plasmáticas (14,4 horas para BBIC sementes e 7,2 horas para

BBIC cotilédones).

As diferenças entre os parâmetros dos BBI de sementes e cotilédones para a

distribuição e eliminação podem ser explicadas pela diferença de estrutura: o BBI de

cotilédones menor e mais hidrofóbico do que o BBI de sementes dormentes em decorrência

da remoção de aminoácidos carregados como aspartato e glutamato (Sreerama et al., 1998 e

Oliveira et al., 2005), com isso o BBIC cotilédones apresenta distribuição e eliminação

cerca de duas vezes mais rápidas.

O fato do BBIC de cotilédones ter uma maior difusibilidade pelo organismo não o

torna diferente do BBIC de semente quanto à distribuição global pelo organismo do

camundongo. Ambos apresentam volumes de distribuição bem próximos de quatro vezes o

volume plasmático de 1,25mL.

Discussão

5.3.4. Estudo da cinética plasmática dos inibidores de sementes, cotilédones e soja via

atividade inibitória sobre tripsina em camundongos

Swiss

A determinação da cinética plasmática dos diferentes inibidores de Bowman-Birk

em estudo, por meio de medidas das atividades inibitórias sobre tripsina geraria resultados

reais de farmacocinética, pois a presença da atividade é prova irrefutável da presença desse

inibidor. Entretanto, essa determinação não pôde de ser realizada, tendo em vista a presença

de inibidores endógenos de serino-proteases, como α

-macroglobulina e α

antiquimotripsina que interferiram nas medidas de fundo das nossas determinações,

prejudicando a análise majorando variações e erros analíticos.

5.3.5. Medida da absorção in vitro de BBIC soja, sementes e cotilédones em alças

intestinais inteiras compreendida pelo jejuno-íleo até a junção com o cólon de

camundongos

Swiss pela medida da atividade inibitória sobre tripsina

A atividade inibitória é prova cabal da presença do inibidor nos compartimentos de

análise, baseado nisso determinamos a absorção in vitro dos BBIC sementes, cotilédones

Java e soja em alças intestinais isoladas de camundongos Swiss.

Os estudos de absorção devem ser olhados de forma criteriosa, pois nem sempre

uma elevada biodisponibilidade corresponde aos maiores valores de atividade

farmacológica disponibilizada. Dessa forma, os estudos comparativos da absorção e

biodisponibilidade mostram que o inibidor de soja apresenta os maiores valores de

biodisponibilidade, cerca da 50%, seguido por cotilédones (Java) com 40% e sementes

(Java) com 30% (fig.23). Entretanto, em todas concentrações empregadas, BBIC

cotilédones disponibiliza os maiores valores de inibição sobre tripsina (fig. 24), mostrando

ser esta preparação aquela que disponibiliza, de maneira notável, a maior atividade para o

organismo.

Uma observação interessante é que todos inibidores em análise apresentaram um

decaimento nos valores de biodisponibilidade na concentração de 20mg, sugerindo alguma

intoxicação, forte interação BBIC-muco, agregação do lado externo ao íleo ou até mesmo

uma interação com a superfície externa do órgão (fig. 25, 26 e 27).

Discussão

Os dados mostram que as velocidades crescem até determinados valores de

concentração, mas apresentam uma fase de estabilização e de queda para concentrações

maiores (incertos fig. 25, 26 e 27). O formato da curva sugere uma difusão, provavelmente

por processo paracelular. Porém ocorre uma alteração do modelo cinético com saturação e

até mesmo quedas das velocidades para concentrações maiores dos inibidores por motivos

desconhecidos.

6. Conclusões e Perspectivas

Conclusões e Perspectivas

6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

Conclusões

•

A técnica de extração e tratamento térmico em pH ácido de extratos de

Macrotyloma axillare levou à obtenção de extratos enriquecidos de BBI

dotados de altas atividades inibitórias específicas sobre tripsina e

quimotripsina, principalmente as preparações de sementes germinadas.

•

Estudos farmacocinéticos de frações purificadas de BBI de Macrotyloma

axillare mostraram em comum com a preparação de soja (Billings et al.,

1992) uma vasta distribuição do inibidor marcado pelos diversos órgãos de

camundongos. Porém, os BBI de Java apresentam uma notável maior

afinidade pelo tecido estomacal.

•

Determinações de biodisponibilidade in vitro com diferentes concentrações

de inibidores de Macrotyloma axillare e soja mostraram que esses inibidores

sofrem boa absorção. A preparação enriquecida de cotilédones disponibiliza

ao organismo uma atividade até nove vezes superior à disponibilizada pelo

BBIC de soja

•

Os parâmetros farmacocinéticos determinados para os inibidores de

Macrotyloma revelaram que estes inibidores possuem boa difusibilidade

pelo organismo.

Conclusões e Perspectivas

Perspectivas

Os parâmetros farmacocinéticos determinados serão úteis na formulação de regimes

posológicos necessários para a manutenção de níveis corporais adequados de BBI Java a

fim de observar suas atividades quimiopreventivas.

Isso vem de encontro com a perspectiva deixada pela realização do presente

trabalho que é o desenho de um modelo experimental, no qual regimes posológicos e suas

respostas farmacológicas serão analisados em animais com tumores induzidos

quimicamente.

7. Referências Bibliográficas

Referências Bibliográficas

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. Apêndices

Apêndices

APÊNDICES

Apendice1

Solução fisiológica de Tyrode

NaCl 80g;

KCl 10% 20mL;

MgSO

.7H

O 5% 26mL;

NaH

.2H

0 5% 13mL;

glicose 10g;

NaHCO

10g;

CaCl

(Molar) 18mL;

água destilada q.s.p. 10,0L.

Apêndices

Apêndice 2

Determinação da equação da reta padrão de massa molecular de ConA

y = 0,0254x + 0,4921

= 0,9916

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

25 30 35 40

deslocamento (mm)

Log PM

Apêndices

Apêndice 3

Curvas padrão de BSA

Curva padrão de BSA - Biureto

y = 0,0501x - 0,0013

= 0,9885

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

concentração de proteína (mg/mL)

A540nm

Curva padrão de BSA - Lowry

y = 0,8213x + 0,0386

= 0,9607

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

concentração de proteína (mg/mL)

A660nm

Apêndices

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