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COMPROVAÇÃO DA VARIABILIDADE
PATOGÊNICA DENTRO DA RAÇA 65 DE
Colletotrichum lindemuthianum
LIVIA MARIA CHAMMA DAVIDE
2006
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LIVIA MARIA CHAMMA DAVIDE
COMPROVAÇÃO DA VARIABILIDADE PATOGÊNICA DENTRO DA
RAÇÃ 65 DE
Colletotrichum lindemuthianum
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração em Genética e Melhoramento de
Plantas, para obtenção do título de “Mestre”.
Orientadora
Prof. Dra. Elaine Aparecida de Souza
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2006
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Davide, Livia Maria Chamma
Comprovação da variabilidade patogênica dentro da raça 65 de
Colletotrichum lindemuthianum
/ Livia Maria Chamma Davide. -- Lavras :
UFLA, 2006.
59 p. : il.
Orientadora: Elaine Aparecida de Souza.
Dissertação (Mestrado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Variabilidade patogênica. 2.
Colletotrichum lindemuthianum
. 3. Cultivares
diferenciadoras. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD-589.24
LIVIA MARIA CHAMMA DAVIDE
COMPROVAÇÃODA VARIABILIDADE PATOGÊNICA DENTRO DA
RAÇA 65 DE
Colletotrichum lindemuthianum
Dissertação apresentada à Universidade Federal
de Lavras como parte das exigências do Programa
de Pós-Graduação em Agronomia, área de
concentração em Genética e Melhoramento de
Plantas, para obtenção do título de “Mestre”.
APROVADA em 08 de março de 2006.
Ph. Dr. Carlos Roberto Casela CPMS/EMBRAPA
Dr. Magno Antônio Patto Ramalho DBI/UFLA
Dra. Elaine Aparecida de Souza
UFLA/DBI
(Orientador)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
Aos meus pais, Cláudio e Lisete, por proporcionarem condições para chegar até
aqui, sempre me aconselhando e apoiando com muito amor;
A minha irmã, Helena, pela pessoa especial que alegra meus dias e me apóia
sempre que preciso;
DEDICO.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me fazer sentir sua presença em todos os momentos da
minha vida, guiando minhas decisões e encorajando-me sempre.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA) e ao Departamento de Biologia,
em especial ao setor de Genética e Melhoramento de Plantas, pela oportunidade de
realização do mestrado;
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior -
CAPES, pela concessão da bolsa de estudos;
À Embrapa Arroz e Feijão por ter cedido o material genético;
À professora e orientadora Dra. Elaine Aparecida de Souza pela
disponibilidade, dedicação e ensinamentos transmitidos ao longo do curso;
Aos membros da banca examinadora, Prof. Dr. Magno e Dr. Casela, por
contribuírem para o aperfeiçoamento deste trabalho.
Ao Professor Dr. Bosco pela disponibilidade e pelas valiosas sugestões que
contribuíram para a melhoria deste trabalho;
Aos Professores do Departamento de Biologia da Universidade Federal de
Lavras pela amizade e pelos conhecimentos transmitidos durante o curso;
A Dra. Maria Gabriela Roca por toda confiança, oportunidade,
ensinamentos e amizade, os quais facilitaram em muito minha caminhada até aqui;
Aos funcionários do Departamento de Biologia (Dona Erundina, Elaine,
Lamartine, Patrícia, Rafaela e Zélia) pelo auxílio na realização deste trabalho;
Aos colegas do Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Marciane,
Osnil e,Kaesel pelos conselhos e sugestões;
Aos estagiários Henrique, Fabíola e Cassius pela disponibilidade e
inestimável ajuda na condução dos experimentos.
Aos colegas Adriano, Rafael e Nádia pela colaboração para finalização
deste trabalho.
A todos os colegas do GEN pela excelente convivência;
Aos amigos Alex, Flávio, Francine, Helton, Juliana Érica, Leonardo,
Marcelo (Jacaré), Marcus, Paula, Quélen e Tathiana por fazerem parte de
momentos inesquecíveis que guardarei com muito carinho por toda a minha
história;
Às amigas Fernanda e Josy por todos estes anos de amizade sincera;
Ao Rafael por estar ao meu lado, mesmo apesar da distância, me dando
carinho, apoio e incentivo, demonstrando ser um grande companheiro nos bons e
maus momentos.
SUMÁRIO
Página
RESUMO................................................................................................................
i
ABSTRACT............................................................................................................
ii
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................
01
2 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................................
03
2.1 Antracnose do feijoeiro......................................................................................
03
2.2 Variabilidade patogênica em isolados de Colletotrichum
lindemuthianum......................................................................................................
05
2.3 Resistência Horizontal e Vertical......................................................................
14
3 MATERIAL E MÉTODOS..................................................................................
19
3.1 Origem e manutenção do isolados.....................................................................
19
3.2 Preparo das suspensões......................................................................................
20
3.3 Inoculação dos isolados.....................................................................................
20
3.4 Análises estatísticas...........................................................................................
22
3.5 Avaliação da resistência genética de Phaseolus vulgaris a C
lindemuthianum.......................................................................................................
23
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................
26
4.1 Avaliação da resistência genética das cultivares diferenciadoras de C
lindemuthianum.......................................................................................................
26
4.2 Avaliação da resistência genética das cultivares comerciais de P. vulgaris
ao C. lindemuthianum..............................................................................................
34
5 CONCLUSÕES....................................................................................................
45
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
46
ANEXOS..................................................................................................................
54
i
RESUMO
DAVIDE, Livia Maria Chamma.
Comprovação da variabilidade patogênica
dentro da raça 65 de
Colletotrichum lindemuthianum
.
2006. 59
p. Dissertação
(Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas)
∗
- Universidade Federal de
Lavras, Lavras.*
A ampla variabilidade patogênica e a dificuldade de discriminar
possíveis diferenças entre isolados de
C.lindemuthianum
têm causado problemas
aos produtores e melhoristas de feijão. Desta forma, os objetivos deste trabalho
foram estudar a variação dentro da raça 65 por meio da avaliação da agressividade
entre os diferentes isolados e analisar a resistência genética (resistência vertical e
horizontal) de cultivares do feijoeiro ao
C. lindemuthianum.
Para isto, foram
utilizados seis isolados coletados em diferentes locais, cultivares hospedeiras e
anos. As inoculações foram efetuadas no conjunto de doze cultivares
diferenciadoras e em sete cultivares comerciais, de acordo com as normas
estabelecidas pelo CIAT (1990). Além da concentração normalmente utilizada para
inoculação, também foram avaliadas as concentrações de 10
2
, 10
3
, 10
4
e 10
5
esporos/mL. As análises estatísticas foram efetuadas por meio de uma adaptação do
método do dialelo proposto por Melo & Santos (1999), o qual permite obter
informações a respeito da resistência vertical e horizontal dos hospedeiros e
também sobre a agressividade dos patógenos. A partir das análises obtidas das
cultivares comerciais e diferenciadoras, constatou-se que não foi possível detectar a
resistência horizontal no patossistema
C. lindemuthianum
-feijoeiro devido à
presença de alelos de resistência vertical que inflacionaram as estimativas da
capacidade geral de reação (CGR). Verificaram-se diferenças na agressividade dos
isolados da raça 65, sendo os isolados CL 837 e CL 844 os mais agressivos. Fica
evidente que o conjunto de cultivares diferenciadoras para determinação de raças
de
C. lindemuthianum
foi ineficiente para detectar a diferença apresentada dentro
da raça 65, sugerindo que novas cultivares devam ser acrescentadas.
*
Orientador: Dra. Elaine Aparecida de Souza – UFLA (Orientadora).
ii
ABSTRACT
DAVIDE, Livia Maria Chamma.
Proof of pathogenic variability within race 65
of
Colletotrichum lindemuthianum
.
UFLA, 2006. 59p. Dissertation (Master in
Agronomy/ Plant Genetics and Breeding)
∗
Universidade Federal de Lavras,
Lavras.*
The wide pathogenic variation and the difficulty to distinguish possible
differences among C.
lindemuthianum
isolates have resulted in problems to
producers and commun breeders of beans. The aim of this work was to study the
variation within the race 65 through the aggressiveness among different isolates
and evaluate the genetic resistance (vertical and horizontal resistance) of
P.
vulgaris
to
C. lindemuthianum
. Six isolates collected from different counties, host
cultivars and years were used. The inoculations took place in the set of twelve
differential cultivars and in seven commercial cultivars, according to the rules
established by CIAT (1990).
Besides the regular concentration of 10
6
spores/mL,
the concentrations of 10
2
, 10
3
, 10
4
and 10
5
spores/mL have also been evaluated.
Statistical analyses were carried out using the
diallel
method proposed by Melo &
Santos (1999), which allowed getting information concerning the vertical and
horizontal resistance of hosts as well as the
aggressiveness of the pathogen. It was
not possible to detect horizontal resistance in the
C. lindemuthianum
- common
bean system, due to resistance alleles which increase the estimates of the general
ability of reaction
. Differences in the aggressiveness of isolates from race 65 were
observed, being the CL 837 and CL 844 isolates, the most aggressive. Thus it is
obvious that the set of differential cultivars to determine the
C. lindemuthianum
races was inefficient to detect differences within races 65, which suggests that new
cultivars should be added.
∗
Guidance Committee: Dra. Elaine Aparecida de Souza – UFLA.
1
1 INTRODUÇÃO
O feijoeiro comum é uma das culturas anuais de maior importância social e
econômica no Brasil. Entre os fatores que afetam a produtividade e a qualidade dos
grãos, a ocorrência de patógenos é o que mais se destaca. O fungo
Colletotrichum
lindemuthianum
, agente causal da antracnose, é um dos patógenos com maior
ocorrência e danos expressivos à cultura.
Entre as medidas de controle desse patógeno, a resistência genética é a
mais eficaz, tanto pela redução nos custos de produção como pela diminuição dos
danos causados ao ambiente. A obtenção de cultivares resistentes é dificultada pela
ocorrência de várias raças fisiológicas do patógeno (Abreu et al., 1993; Rava et al.,
1994; Sartorato, 2002; Ishikawa et al. 2005). Estas raças têm sido identificadas pelo
teste de patogenicidade realizado no conjunto de doze cultivares diferenciadoras
recomendadas pelo CIAT (1990). No Brasil, mais de cinqüenta raças de
C.
lindemuthianum
já foram identificadas, sendo as raças 65, 73 e 81 as mais
freqüentes nos últimos anos (Silva, 2004).
A raça 65 tem sido relatada como uma raça estável e amplamente
distribuída há mais de três décadas, possuindo grande importância para os
programas de melhoramento do feijoeiro visando resistência à antracnose.
Entretanto, deve-se mencionar que algumas cultivares mostram-se resistentes a
determinados isolados e suscetíveis a outros de mesma raça (Cintra, 2005a, Souza
et al., 2005). Este fato indica a existência de variabilidade dentro da raça 65, além
de sugerir que o conjunto de cultivares diferenciadoras atualmente utilizado não
consegue discriminar pequenas diferenças
.
Portanto, para que os programas de melhoramento tenham êxito na
obtenção de cultivares de feijoeiro com resistência mais duradoura é fundamental o
conhecimento da variabilidade dentro de raças para que novas estratégias sejam
adotadas. Diante do exposto, os objetivos deste trabalho foram estudar a variação
2
dentro da raça 65 por meio da avaliação da agressividade entre os diferentes
isolados e analisar a resistência genética (resistência vertical e horizontal) de
cultivares do feijoeiro ao
C. lindemuthianum
.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Antracnose do feijoeiro
A antracnose é uma das doenças de grande importância da cultura do
feijoeiro comum (
Phaseolus vulgaris
L.) pela sua ocorrência nas três épocas de
cultivo, causando perdas de até cem por cento na produção quando se utilizam
cultivar suscetível, sementes contaminadas e sob condições climáticas favoráveis
ao desenvolvimento do patógeno (Carbonell et al., 1999). Além de diminuir o
rendimento da cultura, a antracnose deprecia a qualidade do produto por ocasionar
manchas nos grãos, tornando-os indesejáveis ao consumo. Trata-se de uma doença
cosmopolita, ocorrendo em locais de baixa a moderada temperatura e alta umidade
relativa do ar (Kimati et al, 1997). Sua presença já foi constatada em vários países
da África, América, Ásia, Europa e na Austrália. No Brasil, a antracnose prevalece
nos principais Estados produtores, tais como Bahia, Minas Gerais, Paraná,
Pernambuco, Santa Catarina e São Paulo (Rava & Sartorato, 1994).
O
agente causal da antracnose do feijoeiro,
Colletotrichum lindemuthianum
(Sacc & Magnus) Briosi & Cav., foi descrito inicialmente por Saccaros & Magnus
como
Gloesporium lindemuthianum,
ao estudarem um material coletado por
Lindemuth, em Bonn, na Alemanha (Bailey & Jeger, 1992). Posteriormente,
Scribner, ao verificar a presença de setas, transferiu-o para o gênero
Colletotrichum
.
Este patógeno pertence à classe Deuteromicetos e à ordem Melanconiales
(Rava et al., 1994) e apresenta duas fases reprodutivas, uma assexuada ou
imperfeita e outra sexuada ou perfeita. Esta última somente foi encontrada sob
condições de laboratório (Roca, 1997).
4
Na fase assexuada, o
C. lindemuthianum
produz conídios num corpo de
frutificação denominado acérvulo (Sutton, 1992). As hifas no micélio apresentam-
se septadas e ramificadas, com coloração variando de hialina a quase negra
(Walker, 1959). Os conídios são hialinos, unicelulares, podendo ser oblongos,
circulares. Em condições favoráveis à ocorrência da doença a esporulação é
abundante, formando uma massa de conídios de coloração rosada (Chaves, 1980).
Por ocasião da germinação, um conídio pode emitir um ou mais tubos germinativos
ou continuar crescendo, proporcionando a formação de hifas e micélio (Roca,
2002).
Os conídios, quando em condições favoráveis, germinam seis a nove horas
após o contato inicial com o hospedeiro. Formam o tubo germinativo, em seguida o
apressório e, subseqüentemente, penetram mecanicamente pela cutícula e epiderme
do mesmo. O aparecimento de sintomas pode ser observado a partir do sexto dia
após o início da infecção (Kimati et al., 1997).
Na fase sexuada, o fungo
C. lindemuthianum
é conhecido como
Glomerella
cingulata
(Stonem Spaulde & V. Schrenk) f.sp.
phaseol
), pertencente à classe dos
Ascomicetos e à ordem Diaportales. Os esporos sexuais ou ascósporos são
resultantes dos processos de plasmogamia (fusão celular), seguido de cariogamia
(fusão nuclear) e divisão meiótica, os quais são produzidos dentro de uma estrutura
em forma de saco conhecida como asco. Os ascos localizam-se nos corpos de
frutificação denominados peritécios, os quais possuem formato aproximadamente
arredondado (Kimati et al., 1997).
Os sintomas causados pela antracnose podem ser visualizados em toda a
parte aérea da planta, sendo típicas as lesões necróticas de coloração marrom
escura, presentes na face inferior da folha. Nas vagens, apresentam-se como lesões
circulares, deprimidas, de coloração marrom, com as bordas escuras e salientes,
circundadas por um anel pardo-avermelhado. O hipocótilo pode apresentar lesões
alongadas, superficiais ou deprimidas, podendo até ocorrer o estrangulamento do
5
mesmo e morte da planta conforme a agressividade do patógeno. Quando afeta as
plântulas, lesões pequenas de coloração marrom ou preta podem ser observadas nos
cotilédones (Kimati et al., 1997).
O fungo
C. lindemuthianum
pode ser introduzido em áreas isentas da
doença, bem como incrementar seu inóculo em locais já contaminados (Vechiato et
al., 1997). A disseminação ocorre por meio de respingos de chuvas, ventos,
implementos agrícolas, homem, insetos e vários outros agentes, sendo que a maior
fonte de inóculo, do ponto de vista epidemiológico, é representada pelas sementes
infectadas. Essas são responsáveis pela disseminação da doença a longas distâncias.
Este patógeno possui a capacidade de sobreviver no solo associado a restos de
cultura por um a dois anos (Zaumeyer & Thomas, 1957).
A associação do patógeno com as sementes, por ocasião da semeadura,
nem sempre assegura a ocorrência de doença (Machado, 1994). Para que a doença
ocorra é necessária a perfeita interação entre patógeno, hospedeiro e ambiente. A
antracnose do feijoeiro pode ocorrer em qualquer estádio fenológico da planta,
porém as perdas serão maiores quanto mais precoce for o aparecimento da doença
na lavoura.
As principais estratégias recomendadas para o controle desta doença são o
uso de sementes sadias, de cultivares resistentes e a rotação de culturas,
principalmente com plantas não hospedeiras, como o milho, por dois a três anos.
Estas técnicas evitam a utilização de defensivos químicos, além de praticamente
não onerarem o custo de produção (Pio-Ribeiro & Chaves, 1975).
2.2 Variabilidade patogênica em isolados de
Colletotrichum lindemuthianum
A variabilidade patogênica ou capacidade do patógeno de causar doenças
em determinadas cultivares de um mesmo hospedeiro é definida como
6
raça (Rava et al., 1994; Sartorato, 2002). Isso constitui uma complicação nos
programas de melhoramento, pois as cultivares podem ser resistentes a certas raças
e suscetíveis a outras. Desta forma, a cada nova raça que surge, cultivares
resistentes podem tornar-se suscetíveis (Borém, 2005).
Este conceito foi observado pela primeira vez em 1911, nos EUA, quando
variedades de feijão diferiam quanto ao caráter reação quando inoculadas com
isolados de
C. lindemuthianum
obtidos
de diferentes origens, mostrando que o
fungo apresenta especialização fisiológica e variabilidade patogênica (Barrus,
1911). Neste trabalho, Barrus (1911, 1918) identificou duas raças distintas do
patógeno, as quais foram posteriormente denominadas Alfa e Beta, iniciando,
assim, a utilização das letras gregas para identificar as raças fisiológicas de
C.
lindemuthianum
.
Em todo o mundo várias raças foram identificadas, mostrando uma grande
variabilidade neste patógeno. Esta variabilidade patogênica era representada, até
pouco tempo, por grupos de raça denominados Alfa, Beta, Gama, Delta, Mexicano
I, Mexicano II, Brasileiro, Brasileiro II e raças fisiológicas pertencentes a estes
grupos (Carbonell et al., 1999). Porém, havia uma grande dificuldade na troca de
informações entre pesquisadores devido a diferenças nas metodologias e
nomenclaturas utilizadas para a caracterização do patógeno (Alzate-Marin et al.,
2001a). Desta forma, sentiu-se a necessidade de utilizar uma metodologia padrão
para a identificação e denominação das raças.
Assim foi aprovado, no
Primer Taller de Antracnosis del Frijol en América
Latina
, no CIAT (Pastor-Corrales, 1992), um sistema binário proposto por
Habgood (1970) para determinação de raças de
C. lindemuthianum
. Este consiste
na utilização de um conjunto de doze cultivares diferenciadoras em ordem pré-
estabelecida (Tabela1). Cada uma delas possui um valor binário e, por meio da
expansão binomial e da soma destes valores, é determinada a raça. Tal sistema tem
sido utilizado em todo o mundo até os dias atuais.
A Tabela 1 mostra um exemplo de como identificar uma raça por meio do
conjunto das doze cultivares diferenciadoras. Neste exemplo, foi considerado um
7
TABELA 1 Conjunto de cultivares diferenciadoras de feijoeiro para caracterização
de raças fisiológicas de
C. lindemuthianum
, com seus respectivos alelos
de resistência.
isolado classificado como pertencente à raça 65, a qual corresponde ao somatório
dos valores binários referentes às cultivares com as quais o isolado apresentou
reação de compatibilidade (1 + 64).
No Brasil, o primeiro estudo de identificação de raças foi realizado por
Kimati em 1966, utilizando isolados coletados no Estado de São Paulo, onde foram
caracterizadas raças pertencentes aos grupos Alfa Mexicano II e Delta (Augustin &
Costa, 1971).
Até o ano de 2004 foram identificadas mais de 50 raças fisiológicas de
C.
lindemuthianum
nas diversas regiões produtoras de feijão do Brasil (Rava et al.,
1994; Balardin et al., 1997; Somavilla & Preste, 1999; Carbonell et al., 1999;
Thomazella et al., 2002; Talamini et al., 2002; Alzate-Marin & Sartorato, 2004;
Cultivares
diferenciadores
Série
binomial
Valor
binário
Reação
Alelos de
resistência
Michelite
2
0
1
S
-
MDRK
2
1
2
R
Co
-1
Perry Marrow
2
2
4
R
Co
-1
3
Cornell 49-242
2
3
8
R
Co
-2
Widusa
2
4
16
R
Co
-1
5
Kaboon
2
5
32
R
Co
-1
2
Mexico 222
2
6
64
S
Co
-3
PI 207262
2
7
128
R
Co
-4
3
TO
2
8
256
R
Co
-4
TU
2
9
512
R
Co
-5
AB 136
2
10
1024
R
Co
-6,
co-
8
G 2333
2
11
2048
R
Co
-4
2
,
Co
-5,
Co
-7
Raça
-
65
-
-
8
Sartorato et al., 2004; Silva, 2004; Gonçalves-Vidigal et al., 2004; Ishikawa et al.,
2005), sendo as raças 64, 65, 73, 81, 87, 89 as de maior freqüência no país. No
Estado de Minas Gerais prevalecem as raças 65, 73, 81 e 89 (Silva, 2004).
Cultivares como Carioca, Pérola e Rudá, plantadas no Estado, são suscetíveis à
maioria das raças (Lanza et al., 1997).
A raça 65, anteriormente identificada como Epsilon (grupo Alfa), vem se
destacando como uma das mais freqüentes e de ampla distribuição geográfica,
como mostram vários trabalhos há mais de três décadas (Rava et al., 1994; Balardin
et al, 1997; Somavilla & Prestes, 1999; Carbonell et al., 1999; Talamini et al.,
2002; Sartorato, 2002 ; Alzate-Marin & Sartorato, 2004; Sartorato et al, 2004;
Silva, 2004, Ishikawa et al., 2005).
Comparando as raças brasileiras mais freqüentes com as de outros países,
como, por exemplo, Nicarágua, México e EUA, é possível verificar uma grande
diferença entre as freqüências das raças identificadas. No Brasil, há um predomínio
de raças mais simples. Nos países citados, são freqüentemente encontradas raças
mais complexas, como, por exemplo, 264, 320, 1608, 1545. Estas diferenças entre
as populações dos patógenos nas diversas regiões afetadas pelo
C. lindemuthianum
provavelmente refletem as diferenças nos germoplasmas utilizados e também nas
práticas agrícolas de cada região (González et al., 1998).
Apesar de o atual sistema de determinação de raças ter facilitado muito a
troca de informações, além da identificação de fontes de resistência de cultivares de
diferentes regiões e da dinâmica populacional do patógeno, este ainda não é o
sistema ideal, pois algumas cultivares possuem os mesmos alelos de resistência,
como pode ser observado na Tabela 1 (Young et al., 1997; Nietsche et al., 2000).
Assim, as cultivares diferenciadoras dificilmente representam todos os genes do
hospedeiro, dificultando a classificação precisa das raças (Alzate-Marin et al.,
2001a) e podendo levar a problemas de variação dentro das raças.
A associação de diferentes alelos de resistência em uma mesma variedade
tem sido proposta como uma estratégia para desenvolver resistência ampla e
durável à doença. Porém, o uso desta estratégia, principalmente pelos programas de
melhoramento convencionais, tem sido difícil devido à necessidade de inoculações
9
múltiplas e seqüenciais, as quais podem não ser eficientes para a detecção precisa
dos genótipos de feijoeiro portadores de diferentes alelos de resistência (Faleiro et
al., 2003).
Outro agravante é a ausência de cultivares originadas em um dos possíveis
centros de origem do feijão, a região do Norte dos Andes. Hoje, o conjunto de
cultivares diferenciadoras é representado por três isolados do centro de origem do
Sul dos Andes (MDRK, Perry Marrow, Kaboon) e nove isolados do centro
Mesoamericano (Michelite, Cornell 49-242, Widusa, Mexico 222, PI 207262, TO,
TU, AB 136, G 2333) (Sicard et al., 1997a).
Ao estudarem a diversidade de virulência em 128 isolados de
C.
lindemuthianum
originados de material selvagem dos três centros de diversidade de
P. vulgaris,
Sicard et al. (1997a)
identificaram 25 raças distintas. Na Argentina e
no México, as cultivares diferenciadoras mais suscetíveis foram as de origem
Andina (Perry Marrow e MDRK) e Mesoamericana (Cornell, Mexico 222, TO),
respectivamente. Foram encontradas dez raças especificamente no México e treze
na Argentina. Já a região do Equador foi diferente das anteriores devido à alta
freqüência da raça zero (96,55%), sugerindo que as cultivares diferenciadoras não
permitiram uma descrição apropriada da diversidade de virulência neste local.
A diversidade genética entre isolados de
C. lindemuthianum
foi
caracterizada por Sicard et al. (1997b) com auxílio de marcadores moleculares e de
virulência. Foram utilizados 45 isolados, coletados em cinco populações selvagens
de feijão, localizadas no centro de origem do Sul dos Andes. Nestas populações
foram identificadas 45 marcas polimórficas usando marcador RAPD. Entre estas,
35 apresentam alelos raros observados em apenas um ou dois isolados. A
variabilidade dentro de cada população foi alta, visto que todas as populações
apresentaram um grande número de raças. Variações moleculares também foram
encontradas entre isolados que tiveram raças idênticas classificadas por meio do
conjunto de cultivares diferenciadoras. Os resultados sugerem que os isolados
selvagens originados nos Andes não refletem toda a diversidade encontrada em
isolados cultivados de feijão comum.
10
Estudos realizados por Balardin & Kelly (1998) em países da América do
Sul, Central e do Norte permitiram identificar 41 raças entre 138 isolados
avaliados. Os isolados foram divididos em dois grupos, aqueles encontrados em
ampla área geográfica e aqueles restritos a um único país. As raças 7, 65 e 73
apresentaram ampla distribuição. Embora as raças 65 e 73 tenham sido freqüentes e
amplamente distribuídas, estas foram somente isoladas de hospedeiros com
genótipos Mesoamericanos. O polimorfismo molecular confirmou uma extensiva
variabilidade de virulência no fungo
C. lindemuthianum
. Foram formados 15
grupos e os dois maiores continham isolados de todas as regiões geográficas.
Isolados de uma mesma raça foram freqüentemente dissimilares para os
marcadores RAPD. Análises de vários isolados das raças 65 e 73 mostraram
polimorfismo entre e dentro de países, com exceção entre isolados da raça 65 do
Brasil. Isolados da raça 65 caracterizados nos EUA mostraram um diferente padrão
de resistência, enquanto isolados originados no Brasil foram monomórficos.
Balardin et al. (1999) estudaram a divergência genética entre 57 isolados de
C .lindemuthianum
coletados em onze países localizados na Europa, América
Norte, Central e do Sul, por meio de análises baseadas em PCR-RFLP e
seqüenciamento de regiões de ITS de rRNA (ITS1 and ITS2). A análise em sete
raças (7, 17, 23, 31, 65, 73 e 130) coletadas nos diferentes países permitiu
identificar diferenças dentro das raças 7, 17, 31 e 73. A distância genética calculada
mostrou que a raça 73 dos EUA possuía maior distância genética da raça 73 do
México do que de uma raça altamente virulenta, a 2047, coletada na Costa Rica, ou
da raça 89 do Brasil. Estes resultados sustentam que o nível de variabilidade
molecular dentro dos isolados de
C. lindemuthianum
é maior do que a variabilidade
caracterizada anteriormente pela análise de virulência e sugerem a evolução
independente de padrões específicos de virulência.
Carbonell et al. (1999), ao inocularem dois isolados da raça 31, dois da raça
65 e três da raça 81, em cultivares recomendados para o plantio no Estado de São
Paulo, verificaram diferenças dentro de raças, sugerindo que o conjunto de
cultivares diferenciadores de
C. lindemuthianum
não era suficiente para a
diferenciação da diversidade de patogenicidade dos isolados avaliados devido a
11
possíveis interações e combinações gênicas existentes entre os genes para
resistência ao patógeno.
Com o objetivo de desenvolver uma metodologia que permitisse a
identificação rápida e precisa de raças de
C. lindemuthianum
, Vilarinhos et al
(1995) utilizaram marcadores moleculares RAPD para caracterizar as raças Alfa-
Brasil, Alfa-Brasil Widusa resistente/Tu suscetível (raça 585), Zeta, Capa e Delta.
Os produtos das amplificações polimórficas produziram um padrão característico
para cada uma das raças estudadas e permitiram estimar a distância genética entre
elas. Foi verificada alta similaridade genética entre a raça 585 e as demais. As raças
Alfa-Brasil, Delta, Capa e Zeta, por sua vez, apresentaram baixa similaridade
genética entre si. Os resultados obtidos permitiram alocar as raças em grupos que
diferem daqueles definidos pelo uso de cultivares diferenciadoras. Segundo estes
autores, a técnica de RAPD poderia ser utilizada para a classificação mais rápida e
precisa das raças de
C..lindemuthianum,
já que a definição da raça por meio das
cultivares diferenciadoras envolvem poucos locos no genoma do fungo e a técnica
de RAPD permite comparações simultâneas em um grande número de locos.
Mesquita et al. (1998) utilizaram amostras de DNA de isolados das raças
64, 65, 73 e 89, procedentes de diversas regiões brasileiras, a fim de identificar
bandas de DNA raças-específicas em
C. lindemuthianum
. Com auxílio da técnica
de RAPD, os
primers
OPAR09, APAT18, OPAT09 evidenciaram bandas de 900,
1500 e 780 pb características das raças 64, 65 e 73, respectivamente. Uma banda de
1300 pb, gerada pelo
prime
r OPO07, foi monomórfica para todos os isolados da
raça 89 de
C. lindemuthianum
.
Posteriormente, Alzate-Marin et al. (2001) realizaram um estudo com o
objetivo de verificar a presença ou ausência de bandas patótipo-específicas às raças
64, 65, 73 e 89. Para isto, amplificaram amostras do DNA de 41 isolados de 20
raças de
C. lindemuthianum
com os
primers
OPA09, OPAT18, APAT09,
APAO07, os quais seriam relativos às raças 64, 65, 73 e 89, respectivamente. A
banda de 900 pb estava presente nos isolados da raça 64, mas também em isolados
da raça 23. A banda de 1500 pb foi observada na raça 65 e na maioria das raças,
com exceção de alguns da raça 89. A banda de 780 pb apareceu nos isolados da
12
raça 73, 65, 67, 72, 102 e 585. Estes resultados comprovam a não ligação exclusiva
entre os marcadores gerados pelos
primers
citados e as raças correspondentes.
Neste mesmo estudo, uma análise da variabilidade genética foi realizada a
partir de 19 bandas polimórficas. Como resultado, foram observados dois
agrupamentos, sendo o primeiro formado por um isolado das raças 55, 69, 81, 83,
87, 89, 95, 102, 117, 339, dois isolados da raça 23 e quatro das raças 64 e 65. O
segundo agrupamento foi formado por um isolado de cada uma das raças 64, 65,
67, 72, 97, 343, 453, e 585, três isolados das raças 81 e 89 e sete isolados da raça
73. Desta forma, pode-se ressaltar que a análise molecular de poucos isolados
pertencentes a poucas raças pode evidenciar resultados diferentes quando
comparados às análises resultantes de um maior número de isolados por raças.
Também resultados com base em análise molecular de várias raças, representados
por um único isolado, podem sofrer mudanças quanto maior for o número de
isolados da mesma raça.
Otoya et al. (1995), estudando a variabilidade genética em 168 isolados dos
mais importantes Estados produtores de feijão da Colômbia, observaram que a
diversidade entre e dentro de raças foi elevada. As raças de
C. lindemuthianum
não
constituíram grupos geneticamente homogêneos, sugerindo que os diferentes
isolados pertencentes a uma mesma raça submeteram-se a um processo de evolução
convergente, ou seja, isolados com background genéticos diferentes teriam
adquirido um mesmo fenótipo de virulência. Neste trabalho não foi observada
correlação entre os marcadores moleculares e o teste de patogenicidade. Assim, o
polimorfismo do DNA observado foi independente da virulência, ou seja, dois
isolados podem ser da mesma raça, mas com contextos genéticos diferentes
(pertencentes a grupos de RAPD
distintos) e terem adquirido a mesma virulência
pela evolução convergente, por terem enfrentado a mesma pressão de seleção.
Além disso, a inoculação dos isolados no conjunto de cultivares diferenciadoras
não permitiu informação sobre o background genético de uma raça; um grande
número de biótipos pode ser agrupado em uma mesma raça (Zadok, 1959 citado
por Otoya et al.,1995).
13
Ao realizarem um levantamento em 200 isolados de vários países do
mundo, Mahuku & Riascos (2004) identificaram 90 raças e verificaram que todas
as cultivares diferenciadoras já tiveram sua resistência quebrada por isolados de
C.
lindemuthianum
. Este fato evidencia que o uso do conjunto de diferenciadores não
é suficiente para a determinação da variabilidade patogênica.
Silva (2004) utilizou cultivares diferenciadoras e marcadores RAPD a fim
de estudar a distribuição de isolados de
C. lindemuthianum
oriundos de diferentes
regiões produtoras de feijão do Brasil
e verificar se a maior variabilidade do
patógeno é devida a diferenças entre ou dentro de raças. Foram identificadas 19
raças, incluindo duas (337 e 593) até então não detectadas no Brasil, entre os 88
isolados estudados. A raça 65, seguida das raças 81 e 73, foram as mais freqüentes
devido, principalmente, ao uso de cultivares suscetíveis a estas raças, como Pérola
e Carioca, nos Estados produtores. O número de isolados infectando cada cultivar
diferenciadora foi determinado e observou-se que tanto nos dados avaliados quanto
nos dados compilados de estudos realizados nos últimos 10 anos no Brasil houve
uma maior freqüência de reações compatíveis com as cultivares Michelite e
México 222. A partir de dados obtidos por meio de um dendrograma, pode-se
verificar isolados pertencentes à mesma raça classificados em grupos diferentes,
como no caso dos isolados da raça 65, encontrados nos grupos I e II. O mesmo
ocorreu quando os isolados agrupados pertenciam apenas ao Estado de Minas
Gerais. Uma alta similaridade foi verificada entre isolados de raças distintas (85*1
e 93*2, 65*2 e 81*6). O autor também realizou uma hierarquização quanto a raças,
em que cada raça foi considerada uma população e, posteriormente, feita uma
análise de variância molecular. A maior parte da variação foi encontrada dentro de
raças (80,85%), sendo a maior parte desta foi oriunda de isolados da raça 65 do
Estado de Minas Gerais. Desta forma, fica evidente que a maior parte da variação,
neste trabalho, está contida dentro de raças.
Desta maneira, fica evidente que o estudo da variabilidade entre e dentro de
raças fisiológicas deste patógeno torna-se importante tanto para estudos genéticos
como para facilitar a condução de trabalhos de melhoramento visando resistência a
14
doenças, sendo um pré-requisito para o desenvolvimento de cultivares resistentes
mais duradouras (Rava et al., 1993).
2.3 Resistência Horizontal e Vertical
A interação patógeno-hospedeiro é considerada compatível quando a planta
não consegue se defender do ataque de patógenos, manifestando sintomas típicos
da doença. Nesse caso, o patógeno é considerado virulento e a planta, suscetível.
Numa interação incompatível, o patógeno não consegue se instalar na planta
hospedeira e provocar doença. Assim, a planta é considerada suscetível e o
patógeno, avirulento, ocorrendo um rápido reconhecimento molecular, seguido de
várias reações de defesa do hospedeiro a tempo de impedir que o patógeno se
estabeleça (Hammomd-Kosack & Jones, 2000).
Desta forma, a diferença entre resistência e suscetibilidade está na
capacidade da planta de reconhecer o patógeno invasor e ativar de maneira rápida
seus mecanismos de defesa (Guzzo, 2004). Este reconhecimento se dá pelo contato
físico por meio da interação entre um receptor (moléculas codificadas por alelos de
resistência) da planta e um elicitor (moléculas codificadas por alelos de
avirulência) do patógeno, de forma direta ou indireta (Hammomd-Kosack &
Parker, 2003).
A reação entre o elicitor e o receptor desencadearia uma reação complexa
no sítio de infecção, resultando em uma reação incompatível (ausência de doença),
em que a infecção e a colonização do tecido do hospedeiro pelo patógeno seriam
grandemente limitadas. Por outro lado, se o patógeno possuir um alelo de
virulência, este produzirá uma molécula que não será reconhecida pela molécula
receptora da planta hospedeira, a qual, conseqüentemente, não reagirá à infecção,
dando origem a uma reação compatível (presença de doença)
(Bergamin Filho et
al., 1995). Assim, uma raça contendo tanto o alelo de avirulência como o de
virulência é capaz de causar doença em uma planta que contenha o alelo de
15
suscetibilidade, pois esta não produz moléculas receptoras que acusam a presença
do patógeno (Bergamin Filho et al., 1995).
Segundo Vanderplanck (1963), a resistência pode ser classificada, de
acordo com sua efetividade contra raças do patógeno, em resistência vertical e
horizontal. A resistência vertical é específica às raças do patógeno, já a resistência
horizontal, além de não ser específica às raças do patógeno, é durável.
Vanderplanck (1963) também observou que é possível identificar o tipo de
resistência por meio da significância da interação cultivares por raças. Isto pode ser
verificado quando uma série de diferentes isolados de um patôgeno é inoculada em
diferentes cultivares de um hospedeiro. Neste caso, a interação cultivares x raças
altamente significativas sugere que a reação de cada cultivar é específica a uma
raça particular, indicando que a resistência é do tipo vertical e que os patógenos
diferem quanto à virulência. Para interações não significativas, as cultivares reagem
de forma semelhante a todas as raças; neste caso infere-se que a resistência é do
tipo horizontal e que os isolados diferem quanto à agressividade.
A resistência vertical envolve mecanismos cuja herança é governada por
poucos genes, sendo os alelos responsáveis pela expressão do caráter (resistência)
geralmente dominantes (Robinson, 1971). Esta resistência é dita qualitativa devido
à fácil visualização das diferenças entre plantas suscetíveis e resistentes,
inexistindo reações intermediárias na ausência de outras fontes de variação que não
a genética, o que gera uma distribuição fenotípica descontínua (Bergamin Filho et
al., 1995). Alguns autores consideram que além da resistência vertical completa,
citada acima, também ocorra a resistência vertical parcial, a qual é caracterizada
por reações intermediárias.
A resistência vertical parcial é comumente confundida com a resistência
horizontal, governada na maioria das vezes por muitos genes de difícil
identificação individual, uma vez que nenhum deles possui um efeito tão grande
que possa ser seguido e localizado, conhecendo-se apenas o efeito combinado de
genes como um todo (Vanderplank, 1968). Nelson (1978) considerou que a
resistência horizontal é controlada por alguns genes de efeito principal, os quais
possuem seus efeitos modificados por vários outros genes de efeito menor,
16
denominados modificadores. É considerada quantitativa devido à presença de uma
variação contínua de graus de resistência, variando da extrema suscetibilidade até a
extrema resistência (Bergamin Filho et al., 1995).
O fato de uma cultivar apresentar resistência vertical não exclui a
possibilidade da resistência horizontal estar presente ou vice-versa (Bergamin Filho
et al., 1995). Um estudo de simulação do controle genético envolvendo as duas
resistências foi realizado por Melo & Santos (1999) com o objetivo principal de
testar uma metodologia que conseguisse, de maneira simples, informar sobre a
resistência vertical e horizontal do hospedeiro e também sobre a agressividade e
virulência dos patógenos. Para isto, foi realizada uma simulação contendo 20, 10 e
5 hospedeiros. Foram considerados 10 genes com três tipos de efeitos, principal,
médio e pequeno, os quais equivaliam à ocorrência conjunta da RV e RH. A
simulação teve como base a severidade da doença esperada com a inoculação de
vinte hospedeiros com vinte raças do patógeno. Os autores puderam observar uma
alta correlação entre a capacidade geral de reação e a resistência horizontal e entre
a capacidade geral de agressividade e a patogenicidade da raça. A capacidade
específica da interação revelou ser um indicador da resistência vertical do
hospedeiro e da virulência do patógeno.
Essa metodologia foi empregada por Cornélio (2001) no patossistema
Pyricularia grisea
-arroz. Os resultados indicaram a predominância de resistência
vertical nas cultivares diferenciadoras e resistência horizontal nas cultivares
comerciais.
Segundo Zaumeyer & Meiners (1975), o primeiro trabalho a contribuir
para o estudo da herança da resistência de algumas doenças do feijão foi realizado
por Burkholder, em 1918
. Este autor estudou a resistência à antracnose ao realizar
cruzamentos entre Wells Red Kidney, resistentes às raças Alfa e Beta de
antracnose, e Perry Marrow, resistente apenas à raça Alfa. As plantas da geração F
2
foram inoculadas com apenas uma raça do patógeno e a resistência pareceu ser
governada por um único alelo dominante.
Posteriormente, Schreiber (1932) complementou os estudos citados acima
utilizando 37 isolados do patógeno, os quais dividiu dentro de três grupos
17
principais correspondentes às raças Alfa, Beta e Gamma. Cruzamentos recíprocos
entre Dry Shell No.22 e Konserva e entre Dry Shell No.22 e Wachs Best von Allen
mostraram uma razão de 3:1, com resistência condicionada pelo alelo dominante
quando inoculados na geração F
2
com somente uma raça do patógeno. Quando as
progênies do mesmo cruzamento foram inoculadas com duas raças ao mesmo
tempo, uma razão de 9 resistentes para 7 suscetíveis foi notada, indicando ocorrer
interação gênica do tipo epistasia recessiva dupla.
No mesmo trabalho, quando a inoculação foi feita com todos os 37 isolados
juntos, um terceiro gene diferente foi indicado. Quando as raças usadas para
inoculação foram selecionadas de dois destes grupos, os híbridos F
2
sempre
mostraram uma razão de 9:7, mas quando as duas linhagens foram escolhidas do
mesmo grupo, a razão sempre foi de 3:1. O autor conclui que cada um dos três
genes para a resistência está em cromossomos diferentes citado por Zaumeyer &
Meiners (1975).
Hoje, é notório que os mecanismos de resistência a
C. lindemuthianum
têm
sido identificados em feijoeiro comum, demonstrando que níveis de resistência
genética extremamente altos estão sob o controle de um ou poucos genes maiores
(Pastor-Corrales, et al., 1994).
No passado, a identificação destes genes era realizada utilizando vários
símbolos distintos; porém, visando simplificar esta situação, uma nova
nomenclatura foi proposta por Kelly & Young (1996). A partir de então, o símbolo
Co
, de
Colletotrichum
, vem sendo utilizado para a identificação dos genes de
resistência do feijoeiro.
Até o momento, os seguintes alelos de resistência do feijoeiro foram
identificados:
Co
-1 (A), encontrado na cultivar Andina Michigan Dark Red
Kidney;
Co
-1
2
, presente na cultivar Kaboon;
Co
-1
3
, encontrado na Perry Marrow;
Co
-1
4
, presente em AND 277;
Co
-1
5
, presente em Widusa;
Co
-2 (Are), encontrado
nas diferenciadoras mesoamericanas, como a Cornell 49242;
Co
-3 (Mexique-1),
encontrado na cultivar Mexico 222;
Co
-3
4
, presente na cultivar México 227;
Co
-4
(Mexique-2), presente na cultivar TO;
Co
-4
2
, encontrado na cultivar G233 e em
SEL 1308;
Co
-4
3
, encontrado na cultivar PI 207262;
Co
-5 (Mexique-3), encontrado
18
nas cultivares TU, G2333 e Seleção 1360;
Co
-6, encontrado na cultivar AB 136;
Co
-
7
, encontrado na G2333;
c-
8, encontrado em AB 136;
Co
-9 presente na BAT; e
c-
10 encontrado na cultivar da Ouro Negro.
Segundo Arruda (1998), a resistência conferida pela cultivar TO à raça 65
se deve a um único alelo dominante. O mesmo foi observado em relação à
resistência da cultivar AB 136 às raças 64 e 89 de
C. lindemuthianum
(Alzate-
Marin et al., 1997). No caso da resistência conferida pela cultivar G2333, verificou-
se que dois genes independentes com alelos dominantes são responsáveis pela
resistência conferida às raças 73 e 89 (Alzate-Marin et al., 2001b).
Muitos alelos de resistência à antracnose já foram identificados e alguns até
mapeados. A identificação destes genes comprova a presença marcante de
resistência vertical no patossistema
C. lindemuthianum-
feijoeiro. Desta forma,
espera-se que estas informações venham a contribuir com o melhoramento de
plantas visando resistência à antracnose do feijoeiro.
19
3 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Resistência de Plantas a
Doenças e em casa de vegetação, localizados na área experimental do
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Lavras (UFLA).
3.1 Origem e manutenção dos isolados
Foram utilizados
seis isolados provenientes da micoteca do Laboratório de
Resistência de Plantas a Doenças da UFLA e dois da micoteca do
CNPAF/EMBRAPA (TABELA 2).
Os isolados foram selecionados de acordo com o local de origem, a cultivar
hospedeira e o ano de coleta. Foram utilizados os isolados da raça 65 devido à
ampla distribuição e à alta freqüência observada nos levantamentos de raças de
C.
lindemuthianum
nas últimas décadas.
O isolamento do patógeno e a obtenção de culturas monospóricas foram
realizados conforme a metodologia descrita por Mendes-Costa & Mendonça
(1996).
TABELA 2 Descrição das isolados da raça 65 de
C .lindemuthianum
utilizados
.
Identificação
Isolados
Procedência
Cultivar
Ano
1
LV 29
Lavras/MG
-
2001
2
LV 57
Lambari/MG
Talismã
2004
3
LV 58
Nepomuceno/MG
-
2004
4
LV 61
Ijaci/MG
Olath Pinto
2004
5
Cl 837
Buritis/MG
Pérola
2000
6
Cl 844
Buritis/MG
Pérola
2000
Cada isolado foi repicado para uma placa de Petri contento meio de cultura
M3S (Tu, 1981) e, em seguida, colocado em câmara de crescimento tipo B.O.D.,
20
sob temperatura de 22 + 2
o
C e fotoperíodo de 12 horas. Após a colonização total
das placas foram armazenados em geladeira.
O número de repicagens dos isolados em uso foi controlado visando evitar
uma possível perda de patogeneicidade em função de sucessivas repicagens. Cada
isolado foi repicado por no máximo duas gerações. Após estas, retornou-se aos
isolados da micoteca.
3.2 Preparo das suspensões
Para a esporulação, tubos de ensaio contendo vagens de feijão comum
parcialmente submersas em meio ágar-água foram autoclavados por duas horas não
consecutivas. Os isolados foram repicados para os tubos de ensaio e mantidos à
temperatura de 22 +
2
o
C na incubadora (B.O.D), por um período de 10 a 15 dias.
A partir destas vagens, foram preparadas suspensões de esporos em água
destilada com auxílio de uma alça de Drigalski. As suspensões foram quantificadas
em câmara de Newbawer e diluídas nas concentrações de 10
2
, 10
3
, 10
4
, 10
5
, 10
6
esporos/mL. Em cada bandeja de isopor foram aplicados 200-250mL de suspensão.
3.3 Inoculação dos isolados
As inoculações foram efetuadas no conjunto de doze cultivares
diferenciadoras e em sete cultivares comerciais (Tabela 3), de acordo com as
normas estabelecidas pelo Centro Internacional de Agropecuária Tropical (CIAT,
1990).
As cultivares comerciais escolhidas são recomendadas para o cultivo no
Estado de Minas Gerais ou, como no caso das cultivares OPNS-331 e VC-3, estão
21
em fase de avaliação. A maioria das cultivares pertencem ao grupo do tipo Carioca,
ainda preferido na grande maioria dos Estados brasileiros.
Para cada isolado e em cada uma das cinco concentrações, foi conduzido
um experimento em blocos ao acaso (DBC), com 12 tratamentos para as cultivares
diferenciadoras e 7 tratamentos para as cultivares comerciais. Em ambos os casos,
utilizaram-se duas repetições. Para cada repetição foi utilizada uma badeja de
isopor com 128 células, contendo o substrato Plantmax®. A parcela foi constituída
por 8 células, nas quais foram semeadas 8 sementes. Em todas as bandejas utilizou-
se como testemunha a cultivar Pérola.
As suspensões de esporos foram inoculadas após a expansão completa das
folhas primárias das plântulas (estádio fenológico V2), sendo pulverizadas em
ambas as faces das folhas e nos caules até o ponto de escorrimento. Após as
inoculações, as plantas foram mantidas em câmara úmida, com umidade relativa de
95%, temperatura em torno de 20
o
C e fotoperíodo de 12 horas, por
aproximadamente 72 horas. Em seguida, as plantas foram transferidas para casa de
vegetação, onde permaneceram por mais sete dias até o momento da avaliação,
quando se utilizou uma escala descritiva de notas variando de um a nove, proposta
por Rava et al. (1993):
1 - ausência de sintomas;
2 - até 1% da nervura apresentando manchas necróticas, perceptíveis somente na
face inferior das folhas;
3 – maior freqüência de sintomas foliares descrita no grau anterior, até 3% das
nervuras afetadas;
4 – até 1% das nervuras apresentando manchas necróticas, perceptíveis em ambas
as faces das folhas;
5 – maior freqüência dos sintomas foliares descrita no grau anterior, até 3% das
nervuras afetadas;
6 – manchas necróticas nas nervuras, perceptíveis em ambas as faces das folhas, e
presença de algumas lesões em talos, ramos e pecíolos;
22
7 – manchas necróticas na maioria das nervuras e em grande parte do tecido
mesofílico adjacente, que se rompe. Presença de abundantes lesões no talo, ramos e
pecíolos;
TABELA 3
Principais características das cultivares comercias de feijão utilizadas.
Cultivares
comerciais
Porte
Ciclo
(dias)
Tipo de
grão
Peso médio de
100 sementes (g)
Ouro Negro
prostrado
80-100
Preto
25-27
OPNS-331
prostrado
87
Carioca
-
Pérola
semi-ereto a
prostrado
95
Carioca
23-25
Rosinha
ereto
93
Rosinha
23
Talismã
prostrado
75-85
Carioca
26-27
Valente
ereto
80-94
Preto
21- 22
VC-3
prostrado
85
Carioca
-
8 – manchas necróticas em quase todas as nervuras, muito abundante em talos,
ramos, pecíolos, ocasionando rupturas, desfolhação e redução do crescimento das
plantas;
9 – a maioria das plantas mortas.
As plantas que receberam notas de 1 a 3 foram consideradas resistentes,
enquanto plantas com notas de 4 a 9 foram suscetíveis.
3.4 Análises estatísticas
As notas médias dos isolados inoculados nas cultivares diferenciadoras e
comerciais foram transformadas por meio de raiz quadrada para melhor atender as
pressuposições da análise de variância.
As análises de variância individuais das notas médias de todas as cultivares
foram realizadas com auxílio do programa estatístico MSTAT e obtidas
separadamente para cada concentração e isolado, tanto para as cultivares
diferenciadoras como para as cultivares comerciais. O modelo estatístico utilizado
foi:
23
Y
ij
= µ + b
i
+ c
j
+ e
ij
em que:
Y
ij:
observação referente ao bloco i, com a cultivar j;
b
i:
efeito de bloco,
sendo i = 2 ;
c
j:
efeito da cultivar, sendo j = 1, 2 3, ..., w;
e
ij
: erro experimental associado à observação Y
ij
, com e
ij
2
).
Posteriormente, foram realizadas análises conjuntas utilizando as médias
obtidas nas análises de variância individuais, para cada uma das cinco
concentrações avaliadas. Neste caso, o modelo estatístico utilizado foi:
Y
(ij)k
= µ + b
i(q)
+ c
j
+ r
q
+(cr)
jq
+ e
ij
em que:
Y
(ij)k:
observação referente ao bloco i, com a cultivar j, dento do isolado q;
b
i(q):
efeito de bloco i dentro do isolado q;
c
j:
efeito da cultivar, sendo j = 1, 2 3, ..., w;
r
q:
efeito do isolado, sendo q = 6;
(cr)
jq:
efeito da interação entre a cultivar j e o isolado q;
e
ij
: erro experimental médio.
3.5 Avaliação da resistência genética de
P. vulgaris
a
C. lindemuthianum
Foi utilizada uma adaptação do método do dialelo proposto por Melo &
Santos (1999), o qual permite obter informações a respeito da resistência vertical e
horizontal dos hospedeiros e também sobre a agressividade e virulência dos
patógeno.
Para isto, utilizaram-se as médias, os graus de liberdade e os quadrados
médios dos erros fornecidas pelos resultados obtidos das análises conjuntas, as
24
quais permitiram a obtenção do dialelo parcial e, conseqüentemente, das
estimativas da capacidade geral de resistência (CGR), da capacidade geral de
agressividade (CGA) e da capacidade específica de interação (CEI), por meio do
modelo IV de Griffing (1956) realizado no programa estatístico MAPGEN. Cada
tratamento é uma combinação dos diferentes isolados e cultivares, conforme o
modelo da Tabela 4.
As análises dialélicas foram realizadas conforme o seguinte modelo
estatístico:
Y
ij
= µ + r
i
+ a
j
+ s
ij
+ e
ij
em que:
Y
ij :
severidade da doença exibida pelo ith hospedeiro quando inoculado com o jth
isolado;
r
i:
efeito da capacidade geral de reação do ith hospedeiro (RH);
a
j :
efeito da capacidade geral de agressividade do jth isolado (AH);
s
ij
: efeito da capacidade específica de reação do ith hospedeiro inoculado com o jth
isolado (RV);
e
ij:
erro experimental
médio.
A análise de variância para o modelo de dialelo parcial, envolvendo as
combinações isolados x hospedeiro, é apresentada na Tabela 5.
As estimativas da capacidade geral de reação, da capacidade geral de
agressividade e da capacidade específica da interação foram testadas pelo teste de t
Student ao nível de 5% de probabilidade, segundo as expressões apresentadas por
Still e Torrie (1980).
25
TABELA 4 Modelo do dialelo parcial proposto por Melo & Santos (1999).
Cultivares
Isolados
Cultivar 1
Cultivar 2
Cultivar i
Média
Isolado1
Y11
Y12
...
Y1i
Y1.
Isolado2
Y21
Y22
...
Y2i
Y2.
.
.
.
.
.
.
.
.
.
...
.
.
.
.
.
.
Isolado j
Y.j1
Y.j2
...
Yji
Yj.
Média
Y.1
Y.2
...
Y.i
Y..
TABELA 5 Análise de variância para o modelo de dialelo parcial proposto por
Melo & Santos.
F.V
GL
QM
F
Tratamentos
(cn – 1)
Q1
CGR (RH)
c-1
Q2
Q2/Q5
CGA (AH)
n-1
Q3
Q3/Q5
CEI (RV)
(c-1)(n-1)
Q4
Q4/Q5
Erro Médio
Q5
26
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Avaliação da resistência genética das cultivares diferenciadoras de
P.
vulgaris
ao
C. lindemuthianum
Na Tabela 6 são apresentados os resultados obtidos na concentração de 10
6
esporos/mL, sendo esta semelhante à concentração normalmente utilizada para
determinação de raças em
C. lindemuthianum
, comprovando que todos os isolados
pertencem à raça 65 (2
0
+ 2
6
).
O resumo das análises de variância individuais e conjunta para a severidade da
antracnose nas cultivares diferenciadoras inoculadas com seis isolados da raça 65 e
em cinco concentrações está apresentado nas Tabelas 7 e 8, respectivamente.
Nas análises individuais observa-se que houve diferença significativa (P
0,05) entre as cultivares diferenciadoras para severidade da doença em todos os
isolados e concentrações avaliadas, exceto na concentração 10
2
; no entanto, para os
isolados LV 58 e Cl 837, foi detectada diferença mesmo nesta concentração
(Tabela 7).
A partir dos resultados obtidos das análises individuais foram realizadas
análises conjuntas envolvendo todos os isolados nas concentrações de 10
5
e 10
6
esporos/mL. Nas demais concentrações foram excluídos os dados dos isolados que
apresentaram a estimativa do quadrado médio do erro nula nas análises individuais
(Tabela 8).
As estimativas dos coeficientes de variação (CV’s) obtidas na análise conjunta em
todas as concentrações foram semelhantes às estimativas obtidas por Marques
Júnior (1997) para nota de antracnose (Tabela 8). Constatou-se que todas as fontes
de variação foram estatisticamente significativas (P
concentrações mais baixas. Para a interação diferenciadoras x isolados, observa-se
que as cultivares diferenciadoras apresentaram
comportamentos não coincidentes
quando inoculadas com os diferentes isolados da raça 65 de C. lindemuthianum, em
27
todas as concentrações testadas. Este resultado pode ser explicado pelos diferentes
alelos de resistência presentes em cada uma destas cultivares e indica que a reação
de cada cultivar diferenciadora é específica a uma raça (isolado) particular, ou seja,
a resistência é do tipo vertical e os isolados diferem quanto à virulência
(Vanderplanck,1963). A diferença significativa entre os isolados da raça 65 sugeriu
a ocorrência de diferentes graus de severidade quando estes foram inoculados no
conjunto de cultivares diferenciadoras. No entanto, considerando o critério adotado
para determinação de raças de
C. lindemuthianum,
todos os isolados foram
classificados como pertencentes à raça 65, como já mencionado.
TABELA 6 Notas médias dos isolados de
C. lindemuthianum
inoculados no
conjunto de cultivares diferenciadoras.
Isolados
Cultivares
LV 29
LV 57
LV 58
LV 61
Cl 837
Cl 844
Reação
Michelite (2
0
)
7,31
8,3
9,00
9,00
6,20
6,74
S
MDRK (2
1
)
1,5
1,5
1,00
2,07
1,50
1,06
R
Perry Marrow (2
2
)
1,31
1,13
1,07
1,76
1,63
1,61
R
Cornell 49242 (2
3
)
1,14
1,65
1,07
1,00
1,67
1,08
R
Widusa (2
4
)
2,5
2,5
2,19
1,33
2,65
1,63
R
Kaboon (2
5
)
1,44
1,67
1,00
2,05
1,6
1,69
R
Mexico 222 (2
6
)
7,14
8,91
9,00
9,00
7,9
8,12
S
PI 207262 (2
7
)
1,81
1,14
1,00
1,63
2,16
1,08
R
TO (2
8
)
1,00
1,21
1,69
2,28
1,60
1,12
R
TU (2
9
)
1,00
1,21
1,00
1,00
1,90
1,00
R
AB 136 (2
10
)
1,36
1,13
1,08
1,88
1,87
1,17
R
G2333 (2
11
)
1,32
1,17
1,06
1,00
1,48
1,15
R
28
A partir das médias obtidas nas análises de variância para cada concentração do
inóculo, foram realizadas análises dialélicas por meio do modelo IV de Griffing
(1956), de acordo com a metodologia proposta por Melo & Santos (1999). Segundo
estes autores, este método permite, de maneira simples, informar sobre a resistência
vertical e horizontal dos hospedeiros e também sobre a agressividade e virulência
dos patógenos
.
TABELA 7 Resumo da análise individual para os dados de severidade da
antracnose do feijoeiro das cultivares diferenciadoras, inoculadas
com diferentes isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
em cinco
concentrações (esporos/mL).
QM
Isolados
FV
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
LV 29
Diferenc.
0,01
0,05**
0,07**
0,14**
0,74**
Erro
0,00
0,00
0,00
0,03
0,02
LV 57
Diferenc.
0,02
0,21**
0,82**
0,92**
0,97**
Erro
0,03
0,01
0,02
0,01
0,05
LV 58
Diferenc.
0,50**
0,34
1,00**
1,04**
1,15**
Erro
0,01
0,17
0,02
0,02
0,01
LV 61
Diferenc.
0,00
0,89**
0,88**
1,22**
1,07**
Erro
0,00
0,07
0,03
0,01
0,019
Cl 837
Diferenc.
0,09**
0,39**
0,24**
0,54**
0,57**
Erro
0,01
0,09
0,02
0,02
0,04
Cl 844
Diferenc.
0,05
0,15*
0,44*
0,68**
0,80**
Erro
0,06
0,05
0,16
0,05
0,02
** e * significativo a 1e 5 % de probabilidade, respectivamente, pelo teste de F.
29
O resumo dos resultados da análise dialélica envolvendo as cultivares
diferenciadoras e os isolados da raça 65 de C
. lindemuthianum
é apresentado na
Tabela 9. Verifica-se que todas as fontes de variação foram significativas em todas
as concentrações (P < 0,05). Analisando os desdobramentos para a fonte de
variação cruzamento, observa-se que 92,6% da soma de quadrados totais da
variação observada foram devidos à capacidade geral de reação (CGR) na
concentração de 10
6
, o que indica a predominância da resistência horizontal
.
Resultados semelhantes foram obtidos nas concentrações 10
5
e 10
4
.
TABELA 8 Resumo da análise conjunta para os dados de severidade da antracnose
do feijoeiro das cultivares diferenciadoras, inoculadas com diferentes
isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
em cinco concentrações
(esporos/mL).
QM
FV
GL
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Diferenc. (D)
11
0,32**
1,47**
2,88**
3,99**
5,30**
Isolados (I)
5
0,94**
0,71**
0,14*
0,38*
0,22**
D X I
55
0,11**
0,13*
0,13**
0,11**
0,05**
Erro
66
0,03
1
0,08
2
0,05
2
0,03
0,03
Média
1,23
1,33
1,42
1,40
1,48
C.V (%)
14,08
21,27
15,75
12,37
11,70
1
Grau de liberdade de isolados, da interação e do erro igual 3, 33 e 44,
respectivamente.
2
Grau de liberdade de isolados, da interação e do erro igual 4, 44 e 55,
respectivamente
.
** e * significativo a 1e 5 % de probabilidade, respectivamente, pelo teste de F.
30
TABELA 9 Resumo da análise de variância do esquema de dialelo parcial para
severidade das cultivares diferenciadoras, inoculadas em quatro
concentrações (esporos/mL).
QM
FV
GL
10
3
10
4
10
5
10
6
Cruzamento
71
0,28**
0,33**
0,37**
0,42**
CGR (RH)
11
0,47**
0,89**
1,99**
2,51**
CGA (AH)
5
0,37**
0,10**
0,19**
0,10**
CEI (RV)
55
0,22**
0,22**
0,06**
0,03*
Erro
66
0,04
1
0,03
1
0,02
0,02
Média
1,33
1,37
1,39
1,48
1
Grau de liberdade de isolados, da interação e do erro igual 4, 44 e 55,
respectivamente.
** e * significativo a 1e 5 % de probabilidade, respectivamente, pelo teste de F.
No entanto, estes resultados devem ser considerados com cautela, pois, na
realidade, os alelos de resistência vertical (RV) presentes nas cultivares
diferenciadoras poderiam estar inflacionando as estimativas da CGR, já que estes
se expressam principalmente nas concentrações mais elevadas. Esta observação
torna-se evidente ao analisarmos os resultados obtidos na concentração mais baixa,
10
3
esporos/mL. Neste caso, a maior parte da variação observada (58,6%) foi
devida à capacidade específica de interação (CEI) que reflete a resistência vertical,
indicando, provavelmente, que a estimativa da CGR não está inflacionada.
Possivelmente, esse fato ocorreu devido a falhas na expressão dos sintomas da
doença nas cultivares suscetíveis
. A partir destas informações, depreende-se que
uso do termo resistência horizontal não é apropriado para esta situação e sugere-se
que o modelo utilizado sofra algumas alterações a fim de evitar o inflacionamento
da RH.
As cultivares diferenciadoras diferiram quanto às estimativas da capacidade
geral reação (CGR), como pode ser visto na Tabela 10. As cultivares TU, AB 136 e
G2333 apresentaram-se entre as mais resistentes. Este resultado coincide com o
encontrado na literatura, em que estas são freqüentemente citadas como possíveis
31
fontes de resistência a ser utilizadas em programas de melhoramento visando
resistência à antracnose, devido à baixa freqüência de isolados capazes de quebrar a
resistência destas cultivares (Abreu et al., 1993; Pastor-Corrales et al., 1994;
Balardin et al, 1997; González et al., 1998; Carbonell et al., 1999; Talamini et al.,
2002; Talamini et al., 2004).
Como já esperado para a raça 65 de
C. lindemuthianum
, as cultivares
Michelite e Mexico 222 foram as mais suscetíveis, ou seja, apresentaram as
maiores estimativas para a capacidade geral de reação (g
i
).
Estes resultados demonstram a sensibilidade do modelo, já que para um
isolado ser identificado como pertencente à raça 65, deve causar reação de
suscetibilidade, após a inoculação com uma alta concentração de esporos (10
6
esporos/mL), nas cultivares Michelite e Mexico 222 (2
0
+ 2
6
= 65). Desta forma,
constata-se que o uso da análise dialélica possibilitou confirmar os resultados
TABELA 10
Estimativas da capacidade geral de reação (g
i
) para severidade das
cultivares diferenciadoras, inoculadas com diferentes isolados da
raça 65 de
C. lindemuthianum
.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
COMERCIAIS
10
3
10
4
10
5
10
6
MICHELITE
0,44*
0,70*
1,13*
1,30*
MDRK
-0,16
-0,13
-0,31*
-0,30*
PERRY MARROW
-0,18*
-0,24*
-0,19*
-0,30*
CORNELL 49242
-0,16
-0,25*
-0,34*
-0,37*
WIDUSA
0,11
-0,12*
0,07
0,16*
KABOON
-0,13
-0,18
-0,16*
-0,24*
MÉXICO 222
0,73*
1,01*
1,28*
1,40*
PI 207262
0,13
0,15*
-0,24*
-0,29*
TO
-0,08
-0,25*
-0,30*
-0,28*
TU
-0,26*
-0,17*
-0,25*
-0,40*
AB 136
-0,25*
-0,27*
-0,37*
-0,30*
G 2333
-0,20*
-0,27*
-0,32*
-0,37*
Significativo a 5 % de probabilidade, pelo teste de t.
32
obtidos pela avaliação convencional, inclusive em concentrações bastante abaixo
da recomendada.
É interessante salientar que a cultivar G2333 é uma importante fonte de
resistência paras as raças 73, 81, 89, encontradas com grande freqüência no Estado
de Minas Gerais, além de outras raças relevantes para o Brasil (Rava et al., 1994).
O isolado G2333 possui o alelo de resistência
Co
-4
2
, além dos alelos
Co
-5
, Co
-
7
,
sendo vencido apenas por raças superiores a 2047, felizmente ainda não
identificada no Brasil (Pereira, 2003).
As estimativas da capacidade geral de agressividade (CGA), as quais
informam sobre a agressividade dos isolados, estão exibidas na Tabela 11.
Verifica-se que os isolados Cl 844, Cl 837 e LV 61 foram os mais agressivos,
respectivamente. O isolado LV 29 foi o que demonstrou menor agressividade entre
os isolados da raça 65 avaliados. É necessário ressaltar que este não foi avaliado
nas concentrações de 10
3
e 10
4
devido aos resultados obtidos nas análises de
variância individuais.
Outro fator importante a ser considerado é a condição ambiental em que o
isolado LV 29 foi avaliado. Após a retirada das bandejas da câmara úmida para a
avaliação em casa de vegetação, houve predomínio de temperaturas amenas,
próximas a 21
o
C, e umidade variando de 53,6 a 82,1% para os demais isolados.
Apenas para o isolado LV 29, as bandejas permaneceram sob temperatura mais
elevada (24
o
C) e baixa umidade relativa (54%) na casa de vegetação, após a saída
da câmara de nebulização. É importante relembrar que este isolado apresentou-se
como um dos menos agressivos, indicando que a temperatura elevada, associada à
baixa umidade, podem ter influenciado na redução do progresso da doença.
As estimativas da capacidade específica da interação (CEI), ou seja, o nível
de resistência vertical das cultivares diferenciadoras em relação à agressividade dos
isolados em diferentes concentrações, estão apresentadas na Tabela 1A. A
significância da CEI não indica, necessariamente, que todos os efeitos (s
ij
) foram
significativos.
33
TABELA 11 Estimativas da capacidade geral de agressividade, para severidade das
cultivares diferenciadoras inoculadas com diferentes isolados da raça
65 de
C. lindemuthianum
, em quatro concentrações.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
ISOLADOS
10
3
10
4
10
5
10
6
LV 29
-
-
-0,24*
-0,05
LV 57
-0,13*
-0,12*
-0,02
-0,01
LV 58
-0,15*
-0,03
0,03
-0,07*
LV 61
-0,05*
-0,02
0,07*
0,16*
Cl 837
0,10*
0,03
0,09*
0,06
Cl 844
0,26*
0,13*
0,08*
-0,09*
*Significativo a 5 % de probabilidade, pelo teste de t.
Nas Tabelas 12 e 13 são apresentados os isolados capazes e incapazes de
quebrar a resistência vertical das cultivares diferenciadoras; ou seja, foram
consideradas apenas estimativas de s
ij
que diferiram de zero estatisticamente pelo
de teste de t. Observa-se que apenas as cultivares Michelite, Cornell 49242,
Widusa, TU e G2333 apresentaram resistência vertical na concentração de 10
6
e
somente paras os isolados LV 61, Cl 837 e Cl 844. É importante salientar que as
cultivares Cornell 49242, TU e G2333 devem possuir os mesmos alelos de
resistência vertical, pois o mesmo isolado (LV 61) quebrou a resistência destas
cultivares na concentração de 10
6
. Nota-se que não houve uma boa concordância
entre os resultados obtidos para s
ij
nas diferentes concentrações.
34
TABELA 12 Isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
capazes de quebrar a
resistência vertical das cultivares quando inoculados em quatro
concentrações distintas.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)*
CULTIVARES
10
3
10
4
10
5
10
6
MICHELITE
LV 57
LV 57, Cl 844
LV 29, Cl 837, Cl 844
Cl 837
MDRK
-
-
Cl 844
-
PERRY
MARROW
-
-
LV 61
-
CORNELL 49242
-
-
-
LV 61
WIDUSA
-
-
LV 57, Cl 844
Cl 844
KABOON
-
-
-
-
MEXICO 222
LV 57
LV 57
LV 29
-
PI 207262
LV 61, 837, Cl 844
LV 58, LV 61
LV 61
-
TO
-
-
-
-
TU
-
-
-
LV 61
AB 136
-
-
-
-
G 2333
-
-
-
LV 61
TABELA 13 Isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
incapazes de quebrar a
resistência vertical das cultivares quando inoculados em quatro
concentrações distintas
.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARES
10
3
10
4
10
5
10
6
MICHELITE
Cl 837, Cl 844
LV 58, LV 61, Cl 837
LV57, LV 58, LV 61
LV 58
MDRK
-
LV 57
-
-
PERRY
MARROW
-
-
LV 29, Cl 844
-
CORNELL 49242
-
-
-
-
WIDUSA
Cl 844
LV 58
LV 61
LV 61
KABOON
-
-
-
-
MEXICO 222
Cl 837
LV 58, Cl 837
LV 61
-
PI 207262
LV 57
LV 57
LV 29
-
TO
-
-
-
-
TU
LV 57
LV 57
Cl 844
-
AB 136
-
-
-
-
35
G 2333
-
-
-
-
4.2 Avaliação da resistência genética de cultivares comerciais de
P. vulgaris
ao
C. lindemuthianum
Os resumos das análises de variância individuais e conjuntas
para a
severidade da antracnose nas cultivares comerciais, inoculadas com seis isolados da
raça 65 de
C. lindemuthianum
, em cinco concentrações, estão apresentados nas
Tabelas 14 e 15. Constatou-se, nas análises individuais, que houve diferenças
significativas (P
em todos os isolados, nas concentrações de 10
5
e 10
6
esporos/mL.
TABELA 14 Resumo da análise de variância individual para os dados de severidade
da antracnose do feijoeiro das cultivares comerciais inoculadas em
cinco concentrações (esporos/mL).
QM
Isolados
FV
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
LV 29
Comerciais
0,06*
0,04
0,07
0,54**
0,52*
Erro
0,01
0,01
0,02
0,03
0,1
LV 57
Comerciais
0,01
0,15
1,38**
1,57**
1,37**
Erro
0,01
0,05
0,02
0,01
0,02
LV 58
Comerciais
0,02
0,02
0,59*
1,01**
1,05**
Erro
0,01
0,01
0,15
0,05
0,01
LV 61
Comerciais
0,00
0,19
1,58**
1,64**
1,69**
Erro
0,00
0,11
0,04
0,01
0,01
Cl 837
Comerciais
0,56*
0,92**
0,89*
0,51*
0,36**
Erro
0,05
0,00
0,18
0,04
0,01
Cl 844
Comerciais
0,04
0,42**
0,77**
0,07**
0,64**
Erro
0,03
0,01
0,03
0,01
0,01
** e * significativo a 1e 5 % de probabilidade, respectivamente, pelo teste de F.
36
36
Apenas para o isolado LV 29 não foi detectada diferença na concentração
de 10
4
esporos/mL. Entretanto, para o isolado Cl 837 foi detectada diferença
significativa, inclusive na concentração de 10
2
esporos/mL.
Assim como para as cultivares diferenciadoras, as análises conjuntas das
cultivares comerciais foram realizadas a partir das estimativas obtidas das análises
individuais, abrangendo todos os isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
, nas
concentrações 10
4
,
10
5
e
10
6
. Nas concentrações de 10
2
e
10
3
foram eliminados os
dados dos isolados que apresentaram estimativa do quadrado médio do erro nula
nas análises individuais (Tabela 15).
Verificou-se que os efeitos das cultivares comerciais, dos isolados, com
exceção na concentração de 10
2
esporos/mL, e da interação cultivares comerciais x
isolados foram estatisticamente significativos (P
TABELA 15 Resumo da análise conjuntas para os dados de severidade da antracnose
do feijoeiro das cultivares comerciais inoculadas em cinco
concentrações (esporos/mL).
QM
FV
GL
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Cultivares (C)
6
0,23**
1,03**
3,28**
4,90**
4,70**
Isolados (I)
5
0,08
0,33**
1,41**
1,40**
1,73**
C X I
30
0,09**
0,14*
0,029**
0,21**
0,19**
Erro
36
0,02
1
0,04
1
0,07
0,02
0,01
Média
1,24
1,20
1,63
1,80
1,79
C.V (%)
11,40
16,66
16,23
7,86
5,59
1
Grau de liberdade de isolado, da interação e do erro igual 4, 24 e 30,
respectivamente.
** e * significativo a 1e 5 %, respectivamente, pelo teste de F.
37
A diferença significativa entre os isolados de mesma raça propõe que
ocorreram diferentes graus de severidade quando estes foram inoculados nas
cultivares comerciais avaliadas. Já a interação cultivares comerciais x isolados
indica que as cultivares apresentaram comportamentos não coincidentes quando
inoculadas com os diferentes isolados testados, sugerindo haver predominância da
resistência vertical, como relatado por Vanderplanck (1963).
As análises dialélicas foram efetuadas conforme a metodologia proposta
por Melo & Santos (1999), a qual utiliza o modelo IV de Griffing (1956). Para isso,
foram utilizadas as médias das análises de variância conjunta em todas as
concentrações avaliadas (Tabela 16).
A partir dos resultados obtidos na análise dialélica, detectou-se que todas as
fontes de variação, em todas as concentrações do inóculo, foram estatisticamente
significativas (P
TABELA 16 Resumo da análise de variância do esquema de dialelo parcial para
severidade das cultivares comerciais, inoculadas com diferentes
isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
em cinco concentrações
(esporos/mL).
QM
FV
GL
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
Cruzamento
41
0,11**
0,29**
0,47**
0,52**
0,52**
CGR
6
0,14**
0,25**
1,91**
2,45**
2,35**
CGA (AH)
5
0,40**
1,79**
0,71**
0,70**
0,86**
CEI (RV)
30
0,05**
0,05*
0,15**
0,10**
0,09*
Erro
36
0,01
1
0,02
1
0,035
0,01
0,005
Média
1,20
1,25
1,63
1,79
1,79
1
Grau de liberdade de isolados, da interação e do erro igual 4, 24 e 34,
respectivamente.
** e * significativo a 1e 5 %, respectivamente, pelo teste de F.
38
Verifica-se que houve predomínio da capacidade geral de reação (CGR), na
concentração de 10
6
esporos/mL, correspondendo a 66,54% da soma de quadrados
total da variação observada nos cruzamentos. Resultado semelhante foi obtido para
as cultivares diferenciadoras e, da mesma forma como ocorreu nestas, é
conveniente mencionar que os efeitos da RV estão inflacionando as estimativas
obtidas da CGR.
Como pode ser verificado na Tabela 17, as cultivares comerciais diferiram
quanto às estimativas da capacidade geral de reação (CGR). As cultivares Ouro
Negro, Valente e OPNS-331 apresentaram-se entre as mais resistentes, enquanto
Pérola e Rosinha foram as mais suscetíveis, em todas as concentrações avaliadas.
A capacidade geral de agressividade (CGA) revelou que o comportamento
médio de cada isolado foi estatisticamente diferente quando estes foram inoculados
nas cultivares comerciais. Chama a atenção o fato de este comportamento ter sido
observado em todas as concentrações do inóculo (Tabela 18).
TABELA 17 Estimativas da capacidade geral de reação (gi) para severidade das
cultivares comerciais, inoculadas com diferentes isolados da raça 65
de
C. lindemuthianum
.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARES
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
PÉROLA
0,25*
0,31*
0,75*
0,86*
0,78*
VALENTE
-0,17*
-0,20*
-0,34*
-0,45*
-0,47*
TALISMÃ
-0,08
-0,11
-0,22*
-0,19*
-0,17*
OURO NEGRO
-0,11*
-0,18*
-0,54*
-0,64*
-0,56*
ROSINHA
0,21*
0,40*
0,87*
0,96*
1,00*
OPNS-331
-0,01
-0,12
-0,28*
-0,32*
-0,38*
VC-3
-0,10*
-0,09
-0,25*
-0,22*
-0,20*
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste de t.
39
Da mesma forma como ocorreu para as cultivares diferenciadoras, os
isolados Cl 844 e Cl 837 foram considerados os mais agressivos. As menores
estimativas para a agressividade foram obtidas para os isolados LV 58 e LV 57,
respectivamente. É conveniente salientar que o isolado LV 61 não foi avaliado na
concentração 10
2
, enquanto o Cl 837 não foi avaliado na concentração de 10
3
esporos/mL.
Torna-se necessário registrar a influência da interação patógeno-hospedeiro
nestes resultados. Os isolados Cl 837 e Cl 844 foram coletados na cultivar Pérola,
no ano 2000, em Buritis, Minas Gerais, sugerindo que esta diferença de
agressividade se deve ao fato de este ser oriundo de uma região diferente região dos
demais isolados. A cidade de Buritis está localizada no Alto Paranaíba de Minas,
enquanto a maioria dos outros isolados foram coletados na região Sul do Estado.
Dentro da casa de vegetação, a umidade foi fornecida por meio de
irrigação; porém, esta pode ter variado entre as inoculações de acordo com a
temperatura e umidade externas.
TABELA 18 Estimativas da capacidade geral de agressividade (gj) para severidade
das cultivares comerciais, inoculadas com diferentes isolados da raça
65 de
C. lindemuthianum
em cinco concentrações.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARES
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
LV 29
-0,4*
0,00
-0,37*
0,00
-0,23*
LV 57
-0,19*
-0,04
-0,03
-0,16*
-0,26*
LV 58
-0,18*
-0,16*
-0,26*
-0,34*
-0,17*
LV 61
-
0,07
-0,06
-0,25*
-0,25*
Cl 837
0,40*
-
0,24*
0,30*
0,45*
Cl 844
0,01
-0,13*
0,48*
0,45*
0,46*
* significativo a 5 % de probabilidade pelo teste de t.
40
As maiores umidades verificadas fora da casa de vegetação foram
observadas para os isolados CL 844 (82,1%), LV 57 (82,1%) e Cl 837 (68,4%) nas
cultivares diferenciadoras e CL 844 (78,1%) e Cl 837 (61,8%) nas cultivares
comercias. Este resultado sugere que além da interação patógeno--hospedeiro, a
umidade pode ter influenciado na classificação dos isolados quanto à agressividade.
Segundo Chaves (1980), a temperatura e umidade relativa ideais para o
progresso da doença ocorrem entre 17 a 20
o
C e acima de 91%, respectivamente. A
partir desta afirmação, depreende-se que as cultivares permaneceram sob condições
próximas às idéias para a manifestação da antracnose do feijoeiro nas cultivares
avaliadas.
Os isolados capazes e incapazes de quebrar a resistência vertical das
cultivares comerciais estão apresentados nas Tabelas 19 e 20, respectivamente.
Todas as sete cultivares comerciais avaliadas apresentaram sua resistência
quebrada na concentração de 10
6
esporos/mL. As cultivares Pérola e Rosinha
tiveram sua resistência quebrada em todas as concentrações. Cultivares como VC-3
e Talismã devem possuir os mesmos alelos de resistência, já que o isolado LV 61
foi capaz de quebrar a resistência destas cultivares na concentração de 10
6
esporos/mL. O mesmo ocorreu com outras cultivares na mesma concentração.
41
TABELA 19 Isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
capazes de quebrar a
resistência vertical das cultivares quando inoculados em cinco
concentrações distintas.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARE
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
PÉROLA
LV 29, LV 57
LV 29
LV 29
LV 58
LV 58
VALENTE
Cl 837
-
Cl 844
Cl 844
Cl 844
TALISMÃ
Cl 844
-
-
LV 57, LV 61
LV 57, LV 61
OURO
NEGRO
-
-
-
-
Cl 844
ROSINHA
LV 58, Cl 844
LV 29
LV 29,Cl 844
LV 29, Cl 837,
Cl 844
LV 29, Cl 837,
Cl 844
OPNS-331
-
-
-
-
LV 29
VC-3
Cl 837
-
-
LV 57, LV 61
LV 58, LV 61
TABELA 20 Isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum
incapazes de quebrar a
resistência vertical das cultivares quando inoculados em cinco
concentrações distintas.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARES
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
PÉROLA
Cl 837
Cl 844
LV 61
LV 57, LV 61
LV 61
VALENTE
-
-
Cl 837
Cl 837
Cl 837
TALISMÃ
LV 29
-
Cl 844
LV 29, Cl 844
LV 29, Cl 844
OURO
NEGRO
-
-
-
-
-
ROSINHA
Cl 837
LV 29
LV 57, LV 61
LV 57, LV 58, LV
61
LV 57, LV 58,
LV 61
OPNS-331
-
-
LV 29
Cl 837, Cl 844
VC-3
Cl 844
LV 29
LV 29, Cl 844
Cl 844
LV 2 9, Cl 844
Na Tabela 21 é apresentada a reação das cultivares comerciais aos isolados
da raça 65 utilizando o sistema tradicional de avaliação em
C. lindemuthianum
.
42
Fica evidente que as cultivares Pérola e Rosinha foram as mais suscetíveis em
todas as concentrações, sendo que, na concentração de 10
6
esporos/mL, foi
detectada a suscetibilidade destas cultivares a todos os isolados testados. Estes
resultados confirmam a suscetibilidade já conhecida destas cultivares e
demonstram o potencial para a utilização como testemunhas nos experimentos
realizados com a raça 65. É de fundamental importância evitar o plantio das
cultivares Pérola e Rosinha em áreas com ambiente favorável à disseminação do
patógeno e/ou com histórico de antracnose.
Apenas o isolado Cl 837, na concentração de 10
2
esporos/mL, foi capaz de
causar reação de suscetibilidade nas cultivares Pérola e Rosinha. Além das
cultivares mencionadas acima, o isolado em questão também causou reação de
suscetibilidade na concentração 10
6
nas cultivares Valente, Talismã, OPNS-331 e
VC-3. Apenas a cultivar Ouro Negro foi resistente a este isolado.
TABELA 21 Cultivares comerciais que apresentaram reação de suscetibilidade
após inoculação com os isolados da raça 65 de
C.lindemuthianum
em
cinco concentrações distintas.
CONCENTRAÇÕES (ESPOROS/ML)
CULTIVARES
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
PÉROLA
837
837, 844
57, 61, 837, 844
29, 57, 61, 837
844
29, 57, 58, 61,
837, 844
VALENTE
-
-
-
-
837
TALISMÃ
-
-
-
29, 844
837, 844
OURO NEGRO
-
-
-
-
-
ROSINHA
837
837, 844
57, 61, 837, 844
29, 57, 58, 61,
837, 844
29, 57, 58, 61,
837, 844
OPNS-331
-
-
837
837, 844
837, 844
VC-3
-
-
-
844
837, 844
* os números apresentados na Tabela referem-se aos isolados utilizados neste
experimento.
43
A resistência da cultivar Valente a diferentes raças de
C. lindemuthianum
foi testada por Sartorato et al. (2004). Entre as 19 raças avaliadas, esta cultivar foi
resistente a 17 (incluindo a raça 65) e suscetível a apenas duas.
A cultivar Talismã, recomendada para o Estado de Minas Gerais, foi
lançada como resistente às raças 65, 81 e 89 de
C. lindemuthianum
, freqüentes no
Estado de Minas Gerais. Porém, no presente trabalho, foi possível observar que
esta apresentou reação de suscetibilidade aos isolados Cl 844 e Cl 837 na
concentração de 10
6
e aos isolados LV 29 e Cl 844 na concentração de 10
5
esporos/mL. É interessante considerar que os isolados Cl 837 e Cl 844 foram
obtidos em região geográfica diferente das regiões em que foram feitas as
avaliações para a obtenção da cultivar Talismã, além de ser um isolado
relativamente antigo. Estes fatos poderiam explicar a maior virulência destes
isolados na cultivar Talismã.
A reação da cultivar Talismã a isolados da raça 65 foi avaliada em outras
oportunidades. Cintra et al. (2005a) observaram reação de suscetibilidade, enquanto
Souza et al. (2005) verificaram que esta cultivar apresentou comportamento de
resistência.
As cultivares OPNS-331 e VC-3 tiveram reações semelhantes aos isolados
da raça 65, diferindo apenas quanto ao isolado Cl 837 nas concentrações de 10
5
e
10
6
esporos/mL. Para a maioria dos isolados, estas cultivares apresentaram reações
de resistência. Estas cultivares também foram avaliadas quanto à resistência às
raças 65, 81 e 2047 por Cintra et al. (2005b). O melhor comportamento em termos
de resistência aos três isolados testados foi obtido pela linhagem OPNS-331.
Porém, esta apresentou reação suscetível à raça 65. Ao contrário, a linhagem VC-3
foi resistente à raça 65, concordando com as nossas avaliações.
No presente trabalho, entre todas as cultivares comerciais avaliadas, a Ouro
Negro foi a única a apresentar reação de resistência a todos os isolados da raça 65
de
C. lindemuthianum
. Estes dados discordam dos resultados comumente
encontrados na literatura. Lanza et al. (1997) avaliaram as principais cultivares de
feijoeiro comum recomendadas para o Estado de Minas Gerais quanto à resistência
44
à antracnose. A cultivar Ouro Negro foi resistente a seis das oito raças testadas,
sendo apenas suscetível à raça 65 de
C. lindemuthianum
. Alzate-Marin et al. (2004)
inocularam, na cultivar Ouro Negro, 19 raças de
C. lindemuthianum
, incluindo um
isolado da raça 65, e este se apresentou suscetível.
Já Arruda et al. (2005) avaliaram 30 linhagens de feijão do tipo carioca
quanto ao caráter reação à antracnose. Os autores puderam verificar que as
linhagens VC-2, VC-3 e Talismã apresentaram comportamento resistente, enquanto
as cultivares Ouro Negro e Pérola foram suscetíveis à raça 65 de
C.
lindemuthianum
.
Em um estudo realizado por Souza et al. (2005) também pôde ser
observada a segregação da reação à raça 65. Neste trabalho, isolados de diferentes
raças de
C. lindemuthianum
foram avaliados fenotipicamente e por meio de
marcadores moleculares. Cada isolado foi inoculado em 10 plantas da cultivar
Talismã. A reação de resistência foi observada em oito (62%) das treze raças
testadas. Especificamente para a raça 65, foram observadas reações de resistência e
suscetibilidade de acordo com a cultivar inoculada. Em média, as cultivares
Talismã e G2333 foram resistentes aos isolados da raça 65, enquanto a cultivar
Rosinha foi suscetível.
A variabilidade genética dentro da raça 65 em âmbito molecular ficou
evidente no trabalho conduzido por Silva (2004). A partir da análise de
agrupamento obtida com marcadores RAPD para diferentes isolados pertencentes a
diferentes raças de
C. lindemuthianum,
os isolados da raça 65 foram agrupados em
dois grupos divergentes. É importante salientar que isto ocorreu tanto quando
foram considerados os isolados de todo o Brasil, quanto na avaliação dos isolados
apenas do Estado de Minas Gerais.
Alzate-Marin et al. (2001a) também
constataram variabilidade dentro da raça 65 utilizando marcadores de RAPD.
Pelos resultados obtidos no presente trabalho e pelos relatos da literatura,
fica comprovada a existência de variabilidade dentro da raça 65. Isto pode ser
constatado tanto pelos testes de patogenicidade considerando o sistema de
determinação de raças de
C. lindemuthianum,
ou seja, com base na reação do
45
conjunto de 12 cultivares diferenciadoras recomendadas pelo CIAT (1990), como
também em âmbito molecular. É importante enfatizar que a raça 65 é a mais
amplamente distribuída no Brasil e a que apresenta maior estabilidade ao longo dos
últimos 30 anos. Estes resultados têm implicações diretas nas estratégias a serem
utilizadas nos programas de melhoramento visando a obtenção de cultivares com
resistência duradoura à antracnose do feijoeiro. Com a existência de variabilidade
dentro de raças será difícil obter linhagens com pirâmide de genes de resistência
que sejam duradouras. Isto porque, no processo de obtenção destas linhagens, são
realizadas inoculações artificiais que normalmente utilizam apenas um isolado por
raça de
C. lindemuthianum
, e havendo variação dentro da raça os alelos de
resistência incorporados não terão um espectro de resistência que cobrirá toda a
variabilidade existente dentro das raças. Desta forma, uma alternativa viável seria a
obtenção de multilinhas, a partir de linhagens com diferentes alelos de resistência,
que possivelmente permitiriam uma resistência mais duradoura à antracnose do
feijoeiro.
Fica também evidente que há necessidade da incorporação de novas
cultivares diferenciadoras para melhor discriminação da variabilidade detectada
dentro das raças de
Colletotrichum lindemuthianum
, principalmente no Brasil.
46
5 CONCLUSÕES
1. Não foi possível detectar a resistência horizontal no patossistema
C.
lindemuthianum
-feijoeiro devido à presença de alelos de resistência vertical
que inflacionaram as estimativas da CGR.
2. Constatou-se diferença na agressividade dos isolados da raça 65.
3. O conjunto de cultivares diferenciadoras para determinação de raças de
C.
lindemuthianum
foi ineficiente para detectar a diferença apresentada dentro da
raça 65; portanto, torna-se necessária a adição novas cultivares diferenciadoras.
47
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55
ANEXOS
ANEXOS A
Página
TABELA 1A Estimativas da capacidade específica de interação
(resistência vertical) resultante da interação entre cultivares
diferenciadoras e diferentes isolados da raça 65 de
C
lindemuthianum
..............................................................................
55
TABELA 2A Estimativas da capacidade específica de interação
(resistência vertical) para severidade das cultivares comerciais
inoculadas com diferentes isolados da raça 65 de
C
lindemuthianum......................................
....................................
57
Páginas
56
TABELA 1A Estimativas da capacidade específica de interação (resistência
vertical) resultante da interação entre cultivares diferenciadoras e
diferentes isolados da raça 65 de
C. lindemuthianum.
D/I
LV 29
LV 57
LV 58
LV 61
Cl 837
Cl 844
Concentração 10
3
Michelite
-
-1,64*
-0,16
0,19
1,04*
0,56*
MDRK
-
0,07
0,19
-0,03
-0,18
-0,05
Perry
Marrow
-
0,30
0,01
-0,07
-0,20
-0,04
Cornell
49242
-
0,05
-0,01
0,28
-0,26
-0,05
Widusa
-
-0,31
-0,16
-0,10
0,19
0,38*
Kaboon
-
0,25
-0,05
0,00
-0,13
-0,07
Mexico 222
-
-0,84*
0,19
0,29
0,50*
-0,15
PI 207262
-
1,63*
-0,28
-0,38*
-0,48*
-0,49*
TO
-
0,24
0,03
-0,14
-0,02
-0,07
TU
-
0,06
0,08
0,01
-0,17
0,03
AB 136
-
0,05
0,14
0,03
-0,05
-0,17
G 2333
-
0,14
0,02
-0,05
-0,22
0,12
Concentração 10
4
Michelite
-
-1,96*
0,50*
0,94*
0,67*
-0,16
MDRK
-
0,58*
-0,21
-0,23
-0,08
-0,06
Perry
Marrow
-
-0,05
-010
-0,11
0,03
0,13
Cornell
49242
-
0,18
-0,10
-0,11
-0,15
0,17
57
Widusa
-
-0,03
0,35*
-0,04
-0,23
-0,04
Kaboon
-
0,02
-0,10
-0,06
0,06
0,09
Mexico 222
-
-0,78*
0,43*
0,14
0,37*
-0,15
PI 207262
-
1,25*
-0,49*
-0,20
-0,46*
-0,09
TO
-
0,20
-0,09
-0,10
0,01
-0,02
TU
-
0,33*
-0,17
-0,12
-0,16
0,11
AB 136
-
0,01
-0,08
-0,02
0,02
0,06
G 2333
-
0,13
0,06
-0,09
-0,07
-0,04
Concentração 10
5
Michelite
-0,64*
0,29*
0,44*
0,40*
-0,25*
-0,24*
MDRK
0,15
0,20
-0,12
-0,07
0,00
-0,17*
Perry
Marrow
0,36*
0,06
-0,21
-0,25*
0,09
0,27*
Cornell
49242
0,19
-0,01
-0,05
-0,13
0,14
-0,13
Widusa
-0,11
-0,24*
0,09
0,64*
-0,11
-0,26*
Kaboon
0,15
-0,16
-0,03
-0,08
-0,05
0,17
Mexico 222
-0,66*
0,17
0,14
0,22*
-0,01
0,14
PI 207262
0,25*
-0,14
0,07
-0,23*
-0,03
0,07
TO
0,15
0,00
-0,01
-0,11
0,02
-0,04
TU
0,10
-0,13
-0,18
-0,22
0,20
0,23*
AB 136
0,22
-0,01
-0,05
-0,10
0,00
-0,07
G 2333
0,17
-0,02
-0,1
-0,08
0,01
0,02
Concentração 10
6
Michelite
-0,03
0,11
0,30*
0,06
-0,35*
-0,10
MDRK
0,07
0,04
-0,11
0,09
-0,04
-0,07
Perry
Marrow
0,01
-0,11
-0,07
-0,01
0,01
0,17
“...continua...”
“
TABELA 1A, Cont.”
58
Marrow
Cornell
49242
0,00
0,18
-0,01
-0,28*
0,09
0,01
Widusa
-0,01
-0,12
-0,08
0,58*
-0,08
-0,29*
Kaboon
0,01
0,07
-0,17
0,01
-0,06
0,14
Mexico 222
-0,16
0,11
0,19
-0,05
-0,14
0,05
PI 207262
0,17
-0,11
-0,12
-0,08
-0,21
-0,07
TO
-0,15
-0,09
0,15
0,15
-0,01
-0,05
TU
-0,02
0,04
0,00
-0,23*
0,20
0,01
AB 136
0,03
0,12
-0,01
0,08
-0,02
-0,01
G 2333
0,08
-0,02
-0,01
-0,27*
0,04
0,19
* Significativo a 5 % de probabilidade pelo teste de t.
TABELA 2A Estimativas da capacidade específica de interação (resistência
vertical) resultante da interação entre cultivares comerciais
inoculadas com diferentes isolados da raça 65 de
C.
lindemuthianum
.
C/I
LV 29
LV 57
LV 58
LV 61
Cl 837
Cl 844
Concentração 10
2
Pérola
-0,26*
-0,18*
-0,04
-
0,53*
-0,05
Valente
0,02
0,12
-0,12
-
-0,20*
-0,02
Talismã
0,32*
0,03
0,03
-
0,03
-0,44*
Ouro
negro
-0,08
0,07
0,06
-
0,01
-0,06
Rosinha
-0,04
-0,10
-0,18*
-
0,49*
-0,17*
OPNS-
331
0,17
0,00
-0,04
-
-0,16
0,03
“...
continua
...”
“TABELA 1A,
Cont
. “
59
331
VC-3
-0,08
0,06
0,06
-
-0,23*
0,19*
Concentração 10
3
Pérola
-0,30*
-0,11
-0,25
0,19
-
0,46*
Valente
0,02
0,03
0,15
-0,08
-
-0,11
Talismã
0,19
0,01
0,09
-0,17
-
-0,11
Ouro
negro
-0,03
0,01
0,13
0,02
-
-0,13
Rosinha
-0,39*
0,14
-0,22
0,31*
-
0,15
OPNS-
331
0,23
0,01
0,07
-0,16
-
-0,14
VC-3
0,28*
-0,08
0,04
-0,10
-
-0,13
Concentração 10
4
Pérola
-0,84*
0,35
-0,19
0,39*
0,15
0,13
Valente
0,14
-0,12
0,05
0,03
0,47*
-0,58*
Talismã
0,17
-0,23
-0,09
-0,35
0,09
0,41*
Ouro
negro
0,28
-0,06
0,20
-0,03
-0,23
-0,12
Rosinha
-0,64*
0,44*
0,11
0,56*
-0,01
-0,46*
OPNS-
331
0,43*
-0,10
0,02
-0,29
-0,22
0,16
VC-3
0,45*
-0,28
-0,06
-0,31
-0,26
0,46*
Concentração 10
5
Pérola
-0,10
0,40*
-0,33*
0,33*
-0,08
-0,22
Valente
0,10
-0,08
0,08
-0,10
0,30*
-0,31*
Talismã
0,44*
-0,31*
-0,17
-0,36*
-0,03
0,42*
Ouro
negro
-0,16
0,00
0,18
0,09
0,00
-0,11
“...
continua
...”
“TABELA 2A, Cont”
60
negro
Rosinha
-0,56*
0,37*
0,45*
0,50*
-0,36*
-0,40*
OPNS-
331
0,05
-0,09
-0,13
-0,19
0,17
0,20
VC-3
0,23
-0,29*
-0,08
-0,27*
-0,01
0,41*
Concentração 10
6
Pérola
-0,14
0,11
-0,16*
0,45*
-0,12
-0,14
Valente
0,11
-0,06
0,10
-0,08
0,23*
-0,30*
Talismã
0,38*
-0,35*
-0,12
-0,37*
0,06
0,40*
Ouro
negro
0,00
0,04
-0,02
0,02
0,13
-0,16*
Rosinha
-0,40*
0,47*
0,38*
0,46*
-0,46*
-0,45*
OPNS-
331
-0,18*
-0,08
-0,01
-0,14
0,17*
0,25*
VC-3
0,23*
-0,12
-0,16*
-0,34*
0,00
0,39*
* Significativo a 5 % de probabilidade pelo teste de t.
“TABELA 2A, Cont.”
“...
continua
...”
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