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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE
PÚBLICA
Aline Aguiar de Araújo
Avaliação dos produtos finais do metabolismo de Leishmania spp in
vitro sob ação de drogas e em distintas tensões de oxigênio
Orientador:
Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado
Goiânia - Goiás, 2006.
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
Aline Aguiar de Araújo
Avaliação dos produtos finais do metabolismo de Leishmania spp in vitro sob ação
de drogas e em distintas tensões de oxigênio
Orientador:
Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra
Dissertação de Mestrado
submetida ao PPGMT/IPTSP/UFG
como requisito parcial para obtenção
do Grau de Mestre na área de
concentração de Parasitologia.
Goiânia - Goiás, 2006.
ii
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Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Araújo, Aline Aguiar de.
A658e Avaliação dos produtos finais do metabolismo de
Leishmania spp in vitro sob ação de drogas e em distintas
tensões de oxigênio / Aline Aguiar de Araújo. - Goiânia,
2006.
ix, 105 f. : il., color., figrs., tabs.
Orientador: José Clecildo Barreto Bezerra.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de
Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública,
2006.
Bibliografia: f.75-82.
Inclui listas de figuras, tabelas e de abreviaturas.
Anexos.
1. Leishmania spp 2. Leishmaniose 3. Ácido orgâni-
cos I. Bezerra, José Clecildo Barreto II. Universidade Fe-
deral de Goiás. Instituto de Patologia Tropical e Saúde
Pública. III . Título.
CDU: 616.993.161
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar presente em todos os momentos importantes de minha vida e por
permitir a realização deste mestrado;
A meus pais, Rubens Pereira de Araújo e Valdeina Barbosa Aguiar de Araújo, por
acreditarem em mim e por todo carinho. A meu irmão Arpuim Aguiar de Araújo por todo o
apoio. A minha irmã e grande colaboradora na realização dos experimentos desta
dissertação, Carolina Aguiar de Araújo;
Ao meu orientador, Prof. Dr. José Clecildo Barreto Bezerra, pela confiança e meu
co-orientador Prof. Dr. Milton André de Oliveira pela possibilidade dos meios de cultura e
sugestões ao projeto;
Às minhas amigas e colaboradoras Marina Clare Vinaud e Josyrene Mariano
Mendes.
As colegas de laboratório Cirlane Silva Ferreira e Marinês Cortes Rieth e aos
demais colegas e técnicos do IPTSP/UFG.
Aos meus colegas do LACEN-TO pela compreensão nos momentos de ausência,
pela amizade e pelo carinho.
Aos meus colegas de iniciação científica e amigos Flavia Ikeda, Karla Carvalho
Miranda e Péricles Lopes Dourado.
A meus amigos e companheiros de todas horas Luana Neres de
Sousa e Djones da Silva Ribeiro pelo carinho.
iv
Sumário
RESUMO..................................................................................................... - v -
ABSTRACT.................................................................................................. - vi -
LISTA DE FIGURAS..................................................................................... - vii –
LISTA DE TABELAS................................................................. - viii -
LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................... - ix -
INTRODUÇÃO ............................................................................................. 1
1. Leishmania spp e leishmanioses ..................................................... 1
2. Tratamento das leishmanioses........................................................ 6
3. Metabolismo de Leishmania spp ..................................................... 12
JUSTIFICATIVA........................................................................................... 21
OBJETIVOS ................................................................................................ 23
ARTIGO 1 – Bioensaio e dosagem de ácidos orgânicos de formas
promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis com azitromicina e
antimoniato de meglumina sob tensões de oxigênio distintas. .......................
24
ARTIGO 2 – Excreção e consumo de ácidos orgânicos de formas promastigotas
de Leishmania (L.) amazonensis sob tensões de oxigênio distintas. .............
44
CONCLUSÕES ........................................................................................... 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75
ANEXOS...................................................................................................... 83
v
Resumo
As leishmanioses são doenças provocadas por protozoários do gênero Leishmania,
apresentando manifestações clínicas que variam desde uma úlcera crônica a uma
infecção sistêmica. O parasito apresenta formas promatigota, infectante, e uma forma
intracelular, a amastigota. Com o estudo de características bioquímicas de Leishmania
sp, podemos conhecer novos pontos de ação de drogas e, conseqüentemente, ao
desenvolvimento de medicamentos alternativos, pois por mais de 50 anos o tratamento da
leishmaniose é baseado no uso de compostos tóxicos como o antimoniato de meglumina.
A presente proposta apresentou a caracterização de ácidos orgânicos de formas
promastigotas de Leishmania spp in vitro de acordo com sua adaptação metabólica e
crescimento conforme a disponibilidade de substratos e oxigênio, bem como a ação de
azitromicina e antimoniato de meglumina, o que pode demonstrar locais e efeitos do
controle metabólico. Piruvato, citrato e lactato foram os ácidos orgânicos consumidos em
baixa tensão de oxigênio. Sob a ação da azitromicina, piruvato, citrato, lactato e
propionato foram os ácidos orgânicos consumidos. Isso provavelmente ocorreu por
utilização de via metabólica que pode ser ativada em situações de hipóxia. Também foi
observada excreção de succinato e fumarato em condições de tensão baixa de oxigênio e
na fase estacionária, bem como sob a ação dos dois fármacos. O succinato pode ser
acumulado e reduzido a fumarato. sugerindo a ação da enzima NADH-fumarato redutase,
presente em Leishmania spp e ausente no hospedeiro mamífero Este fato é conhecido
como inversão metabólica e ocorre quando há uma redução ou inibição da respiração.
Dessa forma revelaram-se locais metabólicos onde fármacos, possivelmente mais efetivos
e elucidativos, poderão subsidiar caminhos para ações menos agressivas ao paciente.
vi
Abstract
Leishmaniasis are diseases caused by protozoan of Leishmania genus showing
different clinical features. Due the great variability of reservoirs, vectors, Leishmania
species and imunological condition of the host, clinical manifestations of disease can
differ since a cronical ulcer to a sistemic infection.
Parasite shows infective promastigotes forms and a smaller form, intracelular and non
flagelated, the amastigote. The study of biochemicals features of the different evolutive
forms of Leishmania sp gets the knowledge about new targets for action of drugs and so to
the development of alternative drugs.
The organic acids caracterization is so importante, in special because demonstrates
the points and effects of metabolic control. Describe these unique biochemichal
processes, differing of those in the host, is a hope of therapeutic intervention in human
leishmaniasis. These is specially important due the great incidence of the disease and the
fact that more of 50 years the treatment have been restricted by the use of toxical
compuonds like meglumine antimoniate. This propose reveals important aspects of
physiology and metabolism of Leishmania spp in vitro according the metabolical
modifications and adaptations according the substrate and oxygen avaibility, as drug
mode of action on sites of intermediary metabolism of this parasite.
vii
Lista de Figuras
Figura 1 Ciclo biológico de Leishmania spp............................................................
.
4
Figura 2 Esquema da glicólise no metabolismo aeróbio de Leishmania spp............
.
16
Figura 3
Esquema do ciclo do ácido tricarboxílico no metabolismo
aeróbio de Leishmania spp ..................................................
18
Figura 4
Esquema da cadeia respiratória no metabolismo aeróbio de
Leishmania spp....................................................................
20
Figura 5
Curva de crescimento de formas promastigotas de
Leishmania amazonensis
em meio de cultura sob tensão
normal e tensão baixa de oxigênio........................................
33
Figura 6
Cromatograma dos ácidos orgânicos detectados por CLAE
(Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) em formas
promastigotas de Leishmania amazonensis em meio de
cultura sob tensão baixa de oxigênio....................................
35
Figura 7
Curva de crescimento das formas promastigotas em meio
de cultura contendo azitromicina e antimoniato de
meglumina sob tensão normal de oxigênio ..........................
55
Figura 8 Curva de crescimento das formas promastigotas em meio de cultura
contendo azitromicina e antimoniato de meglumina sob tensão baixa de
oxigênio.................................................................................................
56
Figura 9
Cromatograma dos ácidos orgânicos detectados por CLAE
(
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
)
em formas
promastigotas de Leishmania amazonensis em meio de
cultura sob tensão normal e ação de
azitromicina.........................................................................
59
viii
Lista de Tabelas
Tabela I Principais fármacos utilizados no tratamento das leishmanioses e suas
respectivas dosagens, administração e tempo de
tratamento.................................................................................................
8
Tabela II Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos presentes em
meio de cultura contendo formas promastigotas de L. amazonensis, sob
condições de tensão normal e tensão baixa de oxigênio .............................
36
Tabela III
Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos
presentes em meio de cultura contendo formas promastigotas
de L. amazonensis, em diferentes fases de crescimento ...........
37
Tabela IV.
Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos
presentes em meio de cultura contendo formas promastigotas
de L. amazonensis, sob ação de azitromicina nas
concentrações de 10 μg . mL
-1
, 50 μg . mL
-1
e 100 μg . mL
-1
e
sob tensão normal e/ou tensão baixa de oxigênio....................
63
Tabela V
Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos
presentes em meio de cultura contendo formas promastigotas
de L. amazonensis, sob ação de antimoniato de meglumina
nas concentrações de 10 μg.mL
-1
, 50 μg.mL
-1
e 100μg.mL
-1
e
sob tensão normal e/ou tensão baixa de oxigênio..................
66
ix
Lista de Abreviaturas
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
LV Leishmaniose visceral
LC Leishmaniose cutânea
LCD Leishmaniose cutâneo-difusa
LMC Leishmaniose muco-cutânea
PEPCK Fosfoenolpiruvato carboxiquinase
ADP Adenosina difosfato
ATP Adenosina trifosfato
NAD Nicotinamida dinucleotídeo
NAD
+
Nicotinamida dinucleotídeo oxidada
NADH Nicotinamida dinucleotídeo reduzida
NADP Nicotinamida dinucleotídeo fosfato
NAPD
+
Nicotinamida dinucleotídeo fosfato oxidada
NADPH Nicotinamida dinucleotídeo fosfato reduzida
Acetil-CoA Acetil Coenzima A
Succinil-CoA Succinil Coenzima A
O
2
Oxigênio
CO
2
Gás carbônico
H
2
O Água
e
-
Elétrons
x
Introdução
1. Leishmania spp e leishmanioses
As leishmanioses são doenças de distribuição mundial, atingindo 85
países, dos quais 72 são países em desenvolvimento e 13 países
desenvolvidos. A LV (leishmaniose visceral) está principalmente na zona
rural e suburbana. Bangladesh, Índia, Nepal e Sudão possuem 90% dos
casos de LV. A LC (leishmaniose cutânea) ocorre principalmente no
Afeganistão, Nigéria, Brasil, Irã, Peru, Arábia Saudita e Síria (Guerin et al,
2002; Desjeux, 2004).
Os parasitos do gênero Leishmania pertencem ao filo
Sarcomastigophora, ordem Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae na
qual também estão incluídos parasitos do gênero Trypanosoma. As formas
clínicas da leishmaniose são consideradas um complexo de doenças cujo
espectro clínico e a resposta ao tratamento irão variar de acordo com a
espécie do parasito, por isso características espécie-especificas devem ser
consideradas (Blum et al, 2004). Dentre as formas clínicas podemos
apresentar as seguintes (Herwaldt, 1999; Guerin et al, 2002; Desjeux,
2004):
- Leishmaniose Cutânea (LC): As espécies relacionadas com a
forma LC no Novo Mundo são principalmente do complexo L.
(Leishmania) mexicana (L. amazonensis, L. mexicana e L.
1
venezuelensis) e do subgênero Viannia (L. (V.) braziliensis, L.
(V.) panamensis, L. (V.) peruviana e L. (V.) guyanensis). É
geralmente auto-resolutiva, porém, quando há lesões
múltiplas e agravadas pela desfiguração, pode dificultar o
tratamento e levar a uma forma desfigurante.
- Leishmaniose Cutâneo-Difusa (LCD): Pode ser causada pelo
complexo L. mexicana, no Novo Mundo. É caracterizada como
uma doença crônica e poliparasitária, por lesões não
ulcerativas e anergia. Não possui cura espontânea como a LC
e pode ocorrer a reativação após o tratamento. As lesões
disseminadas lembram a forma lepromatosa da lepra;
- Leishmaniose Muco-Cutânea (LMC): Causada pelo subgênero
Viannia, sendo L. (V.) braziliensis a principal espécie e ainda
por L. amazonensis. Causa a destruição das cartilagens oro-
nasal e faríngea, apresentando lesões desfigurantes e
mutilantes;
- Leishmaniose Visceral (LV): também conhecida como calazar.
A L. chagasi é a principal espécie causadora de LV no Novo
Mundo, sendo os cães os principais reservatórios desta
espécie. As principais manifestações clínicas são picos febris,
hepato-esplenomegalia, perda de peso, linfadenopatia e
anemia. É geralmente uma forma fatal quando não tratada.
Após a recuperação, os pacientes podem desenvolver uma
2
forma crônica da LC denominada Leishmaniose Dérmica Pós-
Calazar.
A espécie L. (L.) amazonensis, é um dos principais agentes etiológicos
da leishmaniose cutânea no Brasil (Dorval et al, 2000). Estudos realizados
em hamsters infectados por L. amazonensis demonstram que as lesões
orais e nasais apresentam reação inflamatoria com grande quantidade de
parasitos no interior dos macrófagos (Cupolilo et al, 2003).
O gênero Leishmania tem como vetores mosquitos da subfamília
Phlebotominae, gêneros Lutzomyia e Phlebotomus. A forma promastigota
metacíclica transmitida pelo mosquito é rapidamente fagocitada pelos
monócitos macrófagos presentes no hospedeiro mamífero (Burchmore e
Barrett, 2001). As formas promastigotas chegam ao sistema fagocítico
mononuclear e então se diferenciam em formas intracelulares conhecidas
como amastigotas. Estes parasitos irão sofrer divisão binaria, até romper
o macrófago e atingir células vizinhas. A organela em que esta
multiplicação ocorre é conhecido como vacúolo parasitóforo. Este vacúolo
se funde aos lisossomos, contendo enzimas como proteases e hidrolases, e
endossomos, dando origem ao fagolisossomo. Entretanto, as formas
promastigotas conseguem permanecer neste local e se transformam nas
formas amastigotas capazes de sobrevier no vacúolo parasitóforo
(Burchmore e Barrett, 2001; CDC, 2005) (Figura 1).
3
Figura 1. Ciclo biológico de Leishmania spp
(Fonte:http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/images/ParasiteImages/G-
L/Leishmaniasis/ Leishmania_LifeCycle.gif)
Em muitas áreas do mundo ocorre um aumento significativo do
número de casos. Alguns fatores elevaram a prevalência das leishmanioses
nos últimos anos, como a rápida migração; movimento sazonal de
trabalhadores; urbanização rápida e não planejada; migrações para áreas
endêmicas; mudanças ambientais provocadas pelo homem e casos de
desnutrição (Klaus et al, 1999; Oumeish, 1999).
4
No Brasil, em 1998 foi registrado 21.800 casos de LC e 1.840 casos
de LV na região Nordeste. Em 2002, estes números aumentaram para
40.000 casos de LC e 6.000 de LV. O Nordeste do Brasil tem apresentado
um aumento do número de casos de leishmaniose na zona urbana. A LV é
causada principalmente por L. chagasi, tendo o cão doméstico como
reservatório principal (Guerin et al, 2002).
O diagnóstico laboratorial pode ser realizado pelo método direto e é
baseado na visualização do parasito sob a forma amastigota nos tecidos.
(Herwaldt, 1999, Vega-López, 2003). O diagnóstico imunológico inclui
testes que detectam antígenos ou anticorpos, como ensaios
imunoenzimáticos e imunofluorescência. Há ainda ensaios que detectam a
imunidade celular específica para Leishmania sp, como os testes
intradérmicos para a LC ou a detecção de respostas proliferativas de
linfócitos circulantes aos antígenos. Na LC, o diagnóstico sorológico pode
não ser eficaz, pois em grande parte dos casos o anticorpo está em baixos
títulos (Herwaldt, 1999).
Outros métodos diagnósticos são a cultura de tecido infectado ou
ainda a inoculação em animais. Para a identificação das espécies, pode-se
realizar análise isoenzimática de cultura de promastigotas ou ainda
utilizar métodos moleculares e anticorpos monoclonais que também
podem ser usados para o diagnóstico in situ (Vega-López, 2003).
5
2. Tratamento das leishmanioses
O tratamento usual para todas as formas de leishmaniose (visceral e
cutânea) é baseado no uso dos antimoniais pentavalentes. Os principais
representantes destes antimoniais são o estibogluconato de sódio e o
antimoniato de meglumina (Berman, 2003). O mecanismo de ação destes
fármacos é pouco conhecido, pois suas bases bioquímicas não estão
estabelecidas. Estes medicamentos, embora façam parte do tratamento de
escolha, apresentam elevada toxicidade e dificuldade de administração
(Blum et al, 2004) (Tabela. I).
A anfotericina B tem apresentado bons resultados no tratamento das
leishmanioses. A forma lipossomal da anfotericina B foi relatada como um
agente eficaz contra Leishmania sp, principalmente nos casos de LV. É o
fármaco de escolha nos casos de resistência aos antimoniais pentavalentes
(Gontijo e Carvalho, 2003; Ouellette et al, 2004; Murray, 2005)(Tabela I).
A aminosidina (paramomicina) é relatada como um agente
antiparasitário, em especial contra protozoários. Apesar disso, ainda é
desconhecido o motivo de sua eficácia sobre os parasitos (Croft, 1997;
Armijos et al, 2004). É um fármaco de uso parenteral, podendo ser
administrado em associação com os antimoniais, porém não apresenta
testes conclusivos (Guerin et al, 2002) (Tabela I).
A azitromicina foi desenvolvida no final dos anos 80 e utilizada no
tratamento de infecções bacterianas como uretrites não-gonocócicas,
6
tracomas, ateroescleroses, úlcera péptica, infecções gastro-intestinais e
infecções do trato respiratório. Além disso, tem sido usada sobre
protozoários como Leishmania sp, Plasmodium sp e Toxoplasma gondii
(Pechère, 2001). É um fármaco que atinge altas concentrações
intracelulares quando comparada a outros antibióticos como a penicilina e
possui fatores moduladores que podem regular esta concentração no
interior das células (Van Bambeke e Tulkens, 2001; Prata et al, 2003;
Silva-Vergara et al, 2004). É um fármaco que possui uma boa capacidade
de penetração nos tecidos. Por isso, o tratamento deve ser limitado na sua
duração que é de 3 a 5 dias (Van Bambeke e Tulkens, 2001) (Tabela I).
7
Tabela I. Principais fármacos utilizados no tratamento das leishmanioses e
suas respectivas dosagens, administração e tempo de tratamento (Dorval
et al, 2000; Gontijo e Carvalho, 2003; Silva-Vergara et al, 2004; Agrawal et
al, 2005)
Fármaco
Nome Comercial
Dosagem Administração
Tempo de
tratamento
Antimoniais
pentavalentes
(Antimoniato
de
meglumina/
Estiboglucona
to de sódio)
Glucantime
(Aventis)
20mg
/kg/dia
Via
endovenosa
com soro
glicosado
30 dias
Anfotericina B
Fungizon
(Bristol-Meyers
Squibb)
Abelcet (Bagó);
Amphocil (Zodiac);
Anforicin B
(Cristalia); Fungi
B (Eurofarma)
0,5
mg/kg/dia
com
aumento
gradativo até
1 mg/kg/dia,
conforme
tolerância do
paciente.
Via
endovenosa
com soro
glicosado
dias
alternados,
respeitando-
se o limite
máximo de
50mg por
aplicação até
a dose total
de 1 a 1,5g
para LC e de
2,5 a 3g para
LMC.
Aminosidina
12, 16 ou 20
mg/kg
Via
intramuscular
(podendo ser
associada ao
antimonial
pentavalente)
21 dias
Mitelfosina
50 a 100 mg
via oral
28 dias
Azitromicina
Atromicin (Teuto);
AZI (Sigma
Pharma); Azitrax
(Farmoquímica);
Azitrocin (Cibran);
Azitromicil
(Greenpharma);
(Sigma Pharma);
Novatrex (Aché);
Selimax (Libbs);
Zitromax (Pfizer)
500mg/dia
via oral
3 a 10 dias
8
A terapia oral é um dos principais avanços no tratamento das
leishmanioses. O uso de miltefosina tem apresentado resultados positivos
na Índia. Entretanto, é um fármaco de alto custo, teratogênica e que
apresenta restrições para seu uso. (Jha et al, 1999; Guerin et al, 2002,
Agrawal et al, 2005) (Tabela I).
Para o tratamento local da lesão podem ser usados métodos físicos
como a cauterização, excisão cirúrgica, crioterapia e laser. Além disso,
para o tratamento tópico pode-se usar paromomicina a 15% sob forma de
pomada e ainda realizar infiltração com antimoniais pentavalentes (Blum
et al, 2004).
Nos esquemas terapêuticos utilizados para LC, encontram-se
dificuldades para a avaliação dos estudos a respeito do tratamento. A
doença geralmente tem início com uma úlcera, podendo evoluir para uma
doença mucosa (em 2% dos casos na América), para uma forma benigna
ou para a auto-resolução (Murray, 2005). Geralmente, os estudos não
incluem grupos que usam placebo, com tratamento aleatório ou utilizam
um universo de pacientes muito reduzido (Berman, 2003).
Os medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento das
doenças parasitárias, como a tripanosomíase africana, Doença de Chagas,
leishmanioses e filarioses, apresentam grande toxicidade. Além disso,
possuem uma eficácia variável e administração é feita por via parenteral e
o tempo de tratamento é prolongado , levando o paciente, muitas vezes, a
não completar o esquema terapêutico (Croft, 1997).
9
As formas amastigotas do gênero Leishmania são obrigatoriamente
intracelulares de macrófagos. Dessa forma, a terapia imunológica,
adjuvante da quimioterápica, utiliza interferon γ associado a antimoniais
para a ativação da célula hospedeira, nos casos em que o tratamento com
uso de antimoniais não é responsivo (Croft e Coombs, 2003).
Os avanços na bioinformática, associados ao seqüenciamento do
genoma dos parasitos, permitem identificar novas moléculas e vias
bioquímicas e distinguir diferenças moleculares entre parasito e
hospedeiro (Croft, 1997, Davis et al, 2004).
Um dos grandes problemas para o desenvolvimento de novos
fármacos ocorre no momento da interpretação das diferenças e
identificação do alvo que se tornará válido para a ação do fármaco (Croft,
1997). Por exemplo, os estudos têm atentado para fármacos de ação
antiparasitária que possam se acumular no interior das células. Além
disso, deve ser dada atenção às características físico-químicas do fármaco,
pois são estas que irão interferir diretamente na sua biodisponibilidade
(Croft, 1997).
A atividade de fármacos que se acumulam nos fagossomos têm
ganhado destaque em especial aquelas que possuem tropismo por
lisossomos como aminoácidos, ésteres e dipeptídeos análogos do bis-benzil
poliamino (Rabinovitch, 1989). Há ainda moléculas carreadoras que podem
ser incorporadas à droga, auxiliando na ação de receptores de superfície
de células infectadas ou de superfície do parasito, como observado em
10
receptores de manose e fucose em macrófagos infectados por Leishmania
permitindo a ação do alopurinol (Negre et al, 1992).
Os mecanismos de interação do fármaco com seu alvo podem ser
visualizados por modelos computacionais. Além disso, deve-se levar em
consideração os testes de biodisponibilidade, processamento metabólico,
toxicidade e interação com outros fármacos e medicamentos (Davis et al,
2004).
As espécies de Leishmania apresentam diferentes adaptações não
apenas ao que se refere ao tropismo por macrófagos de diferentes órgãos,
mas também adaptações para sua sobrevivência intracelular, o que
contribui para diferente comportamento quanto à susceptibilidade a
drogas (Croft e Coombs, 2003).
A cura da leishmaniose durante a quimioterapia parece depender do
desenvolvimento de uma resposta imune que ativa macrófagos para que
estas células possam produzir óxido nítrico, causando uma explosão
respiratória e a produção de ânions e superânions, capaz de matar as
formas amastigotas (Bogdan e Röllinghoff, 1998).
Vários ensaios são realizados para a avaliação da susceptibilidade de
formas promastigotas e amastigotas de Leishmania sp a fármacos. Os dois
estágios possuem diferenças bioquímicas causando diferentes resultados
nestes testes. No geral, promastigotas são menos susceptíveis a fármacos
que amastigotas. Os experimentos realizados com amastigotas
intracelulares se correlacionam melhor com a resposta in vivo. Isso ocorre
11
devido ao fato da forma amastigota ser aquela encontrada no hospedeiro
(Fumarola et al, 2004).
3. Metabolismo intermediário de Leishmania sp
Com o desenvolvimento de novas metodologias para cultura, foi
possível estudar importantes parasitos por técnicas semelhantes àquelas
utilizadas para nematódeos, fungos e bactérias, como a Biologia Molecular,
Bioquímica, Biologia Celular e Biologia Evolutiva (Wang, 1997).
Uma questão importante é o estudo de enzimas e receptores
essenciais à sobrevivência do parasito. Alguns habitam ambientes ricos em
substratos necessários à sua sobrevivência, quando comparados a
organismos de vida livre (Wang, 1997).
Os principais substratos energéticos dos parasitos do gênero
Leishmania são os carboidratos e os aminoácidos (Cazzulo et al, 1985). A
glicose é a principal fonte de energia, entretanto o catabolismo de
aminoácidos é mais utilizado pelas formas intracelulares (Tielens e Van
Hellemond, 1998). Em L. mexicana a utilização de glicose é baixa e a
oxidação de ácidos graxos é maior em amastigotas que promastigotas, o
que significa um favorecimento da glicólise nestas últimas (Cazzulo, 1992).
O consumo de glicose por Leishmania sp é relativamente baixo se
comparado a outros tripanossomatideos, sendo maior em aerobiose que
anaerobiose (Cazzulo, 1992).
12
Martin et al (1976) demonstraram que L. mexicana possui todas as
enzimas da via glicolítica e do ciclo do ácido tricarboxílico. Uma menor
parte dos carboidratos que participam do metabolismo energético é
completamente oxidada a dióxido de carbono. A maioria dos produtos é
parcialmente oxidada, como o acetato, piruvato e succinato. Estes também
são produtos finais do metabolismo da glicose. O piruvato é degradado na
mitocôndria (Tielens e van Hellemond, 1998). A este processo deu-se o
nome de “fermentação aeróbia” (Cazzulo, 1992).
Durante a fermentação aeróbia ocorre a excreção de ácidos
orgânicos no meio de cultura, levando a uma diminuição no pH do meio de
cultura em todos os tripanossomatideos, principalmente nos casos em que
há alto consumo de glicose (Louassini et al, 1999).
A composição do meio de crescimento dos parasitos pode influenciar
diretamente na análise das vias bioquímicas em estudo. Um exemplo disto
é a transformação de L. mexicana de amastigota para promastigota
influenciada por fatores exógenos como a presença de ácidos graxos não-
esterificados ou a tensão de oxigênio no meio (Galbraith, 1991).
As principais enzimas encontradas no glicossomo, uma organela
específica dos tripanossomatideos, são a hexoquinase, fosfofrutoquinase,
frutose-1,6-bifosfatase, glicerol-3-fosfato-desidrogenase, glicerol-3-fosfato
desidrogenase e gliceroquinase. No citosol podem ser encontradas enzimas
como a piruvato quinase e a glicose-6-fosfato desidrogenase. Enquanto na
mitocôndria encontra-se a citrato sintase, a α-cetoglutarato desidrogenase,
13
succinato desidrogenase e a piruvato carboxilase (Galbraith, 1991). Os
níveis de algumas enzimas glicolíticas são maiores em promastigotas,
entretanto a PEPCK (foesfoenol piruvato carboxiquinase) e a malato
desidrogenase são mais elevados em amastigotas (Cazzulo, 1992).
Os tripanossomatídeos possuem metabolismo intermediário em que
ocorre a glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico e cadeia respitarória, com
características peculiares a esta família.
3.1. Glicólise:
A glicose penetra o glicossomo e é convertida em glicose-6-fosfato,
com gasto de energia, ou seja, a conversão de uma molécula de ATP
(adenosina trifosfato) em ADP (adenosina difosfato). A glicose-6-fosfato é
então convertida à frutose-6-fosfato e, com gasto de energia, transformada
em frutose-2,6-bifosfato. A frutose-2,6-bifosfato gera então dois produtos:
a gliceraldeído-3-fosfato e a di-hidroxiacetona fosfato. A di-hidroxiacetona
fosfato gera glicerol-3-fosfato, que atravessa a membrana do glicossomo e
sofre ação da glicerol-3-fosfato-desidrogenase presente na mebrana
mitocondrial, formando mais di-hidroxiacetona fosfato que penetra
novamente o glicossomo e é então convertido a gliceraldeído-3-fosfato. O
gliceraldeído-3-fosfato, com redução do NAD+ (nicotinamida dinucleotídeo),
é oxidado a 1,3-bifosfoglicerato. Este por sua vez libera um fosfato gerando
ATP e é convertido a 3-fosfoglicerato que pode ser formado tanto dentro
14
como fora do glicossomo. O 3-fosfoglicerato é convertido a 2-fosfoglicerato
e este a fosfoenolpiruvato (Blum, 1993; Tielens e van Hellemond, 1998)
(Figura 2).
O fosfoenolpiruvato pode ser convertido a piruvato, gerando ATP,
porém esta via é menos usual. Geralmente o fosfoenolpiruvato retorna ao
interior do glicossomo e é convertido a oxaloacetato, gerando ATP. O
oxaloacetato, convertido a malato, gera NAD+ a partir da oxidação do
NADH. O malato, no citosol gera piruvato e reduz NADP (nicotinamida
dinucleotídeo fosfato oxidada) a NADPH (nicotinamida dinucleotídeo
fosfato reduzida) (Tielens e Van Hellemond, 1998).
A atividade de enzimas como a succinato desidrogenase, glicose-6-
fosfatase, frutose-1,6-bifosfatase e a glicose-6-fosfato desidrogenase é
maior em promastigotas que amastigotas (Coombs et al, 1982). Em
tripanossomatideos, a atividade das enzimas glicolíticas como a
hexoquinase e a fosfofrutoquinase, bem como a da glicose-6-fosfato
desidrogenase não está regulada como nos demais organismos.
Entretanto, estas enzimas estão presentes em uma organela específica
conhecida como glicossomo que permite a manutenção da glicólise
(Louassini et al, 1999; Bakker et al, 2000).
15
Figura 2. Esquema da glicólise no metabolismo aeróbio de Leishmania spp.
Abreviações: ADP: adenosina difosfato; ATP: adenosina trifosfato; NAD+:
nicotinamida dinucleotídeo oxidada; NADH: nicotinamida dinucleotídeo
reduzida; NADP+: nicotinamida dinucleotídeo fosfato oxidada; NADPH:
nicotinamida dinucleotídeo fosfato reduzida. (modificado de: Tielens e Van
Hellemond, 1998).
16
3.2. Ciclo do ácido tricarboxílico (Ciclo de Krebs):
O piruvato penetra a mitocôndria, reduz NAD+ a NADH e é convertido a
acetil-Coenzima A (acetil-CoA). A acetil-CoA, na presença de succinato,
converte-se em acetato, gerando succinil-CoA e ATP. O piruvato gerado
pela glicólise pode também, no interior da mitocôndria gerar NADH
fumarato redutase. As fumarato redutases solúveis parecem não estar
presentes na família Trypanosomatidae. Nestes organismos a fumarato
redutase e a succinato desidrogenase estão ligadas à membrana
mitocondrial. O succinato produzido pelos tripanossomatideos através do
ciclo de Krebs, via citrato e α-cetoglutarato. Não existem evidências, até o
momento, de que o succinato seja produzido por redução do fumarato
(Blum, 1994; Tielens e van Hellemond, 1998) (Figura 3).
A produção de succinato provavelmente aumenta com o início da
redução na tensão de oxigênio. Entretanto, vale lembrar que esta produção
ocorre via ciclo do ácido tricarboxílico, que termina com a formação de
succinato e NADH, pois não há presença de oxigênio para a oxidação
(Tielens e Van Hellemond, 1998). Esta capacidade de adaptação da cadeia
respiratória é provavelmente a razão pela qual a produção de succinato
ocorra por esta via, mesmo nos casos em que a tensão de oxigênio é
normal (Blum, 1994; Tielens e Van Hellemond, 1998).
17
Figura 3. Esquema do ciclo dos ácidos tricarboxílicos no metabolismo
aeróbio de Leishmania spp. Abreviações: Acetil-CoA: acetil coenzima A;
Succinil-CoA: succicil Coenzima A; ADP: adenosina difosfato; ATP:
adenosina trifosfato; NAD: nicotinamida dinucleotídeo; NAD+:
nicotinamida dinucleotídeo oxidada; NADH: nicotinamida dinucleotídeo
reduzida; CO
2
: gás carbônico (modificado de: Tielens e Van Hellemond,
1998)
18
3.3. Cadeia respiratória
A cadeia respiratória está presente em uma membrana interna da
crista mitocondrial (Hart et al, 1981). O NADH é oxidado a NAD+ pelo
complexo I formado por enzimas similares a NADH desidrogenase, gerando
ATP. O elétrons é transportado para a fonte de ubiquinona/ubiquinol e
depois para o complexo III, formando ATP, passa pelo citocrmo c e então
para o complexo IV, gerando ATP. O oxigênio é seu aceptor final, por
último gera H
2
O (Tielens e Van Hellemond, 1998) (Figura 4).
A cadeia respiratória de Leishmania spp apresenta oxigênio como
aceptor final de elétrons. Inicialmente os elétrons são doados ao conjunto
ubiquinona/ubiquinol, através do complexo I e então os elétrons são
transferidos para o oxigênio através de oxidases terminais (Tielens e Van
Hellemond, 1998).
As formas promastigotas de Leishmania possuem uma cadeia
respiratória clássica, mas não apresentam oxidase alternativa como nos
demais tripanossomatideos. São dependentes da cadeia respiratória
clássica para a geração de energia (Tielens e Van Hellemond, 1998).
O NADH, produzido juntamente com a produção de ácidos
orgânicos, é reoxidado pela cadeia respiratória (Blum, 1993).
19
Figura 4. Esquema da cadeia respiratória no metabolismo aeróbio de
Leishmania spp. Abreviações: ADP: adenosina difosfato; ATP: adenosina
trifosfato; NAD: nicotinamida dinucleotídeo; NAD+: nicotinamida
dinucleotídeo oxidada; NADH: nicotinamida dinucleotídeo reduzida; O
2
:
gás oxigênio; H
2
O: e
-
: elétrons;. (modificado de: Tielens e Van Hellemond,
1998).
20
Justificativa
O estudo do mecanismo de ação de inibidores enzimáticos leva ao
conhecimento de novos pontos de ação de fármacos e, conseqüentemente,
ao desenvolvimento de fármacos alternativos.
A caracterização de ácidos orgânicos é de grande importância
especialmente porque demonstra os locais e efeitos do controle metabólico.
A descrição de processos bioquímicos únicos, que são diferentes
daqueles que ocorrem no hospedeiro, é umas das maiores esperanças para
a intervenção terapêutica nas leishmanioses humanas. Isto é
especialmente importante devido a grande incidência da doença e ao fato
de que, por mais de 50 anos, o tratamento das leishmanioses se restringe
ao uso de compostos altamente tóxicos como os antimoniais
pentavalentes.
O presente estudo busca investigar aspectos do metabolismo de
Leishmania sp in vitro. Este protozoário é capaz de modificar suas
características metabólicas de acordo com a disponibilidade de substrato
presente em seu meio, a concentração de oxigênio no ambiente e ainda de
acordo com a ação de fármacos sobre determinados sítios do metabolismo
intermediário do parasito.
Com o propósito de aplicar e aprimorar técnicas em estudos de
doenças parasitárias escolheu-se o método de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), por sua ampla possibilidade de uso em diversos estudos
21
de bioquímica e metabolismo de parasitos, em especial na detecção de
ácidos orgânicos. Para a Parasitologia, a utilização desta metodologia
permite a melhor compreensão da relação parasito-hospedeiro,
estabelecendo-se fontes de energia e seus caminhos metabólicos que
poderão permitir o desenvolvimento do parasitismo.
22
Objetivos
- Avaliar o consumo ou excreção de ácidos orgânicos em
cultura de formas promastigotas de L. (l.) amazonensis em
tensão baixa e/ou tensão normal de oxigênio, por meio da
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).
- Avaliar a eficácia da azitromicina e do antimoniato de
meglumina contra formas promastigotas de L. (L.)
amazonensis, a fim de acompanhar a curva de crescimento
do parasito e a influência destes fármacos sob condições de
tensão baixa e/ou normal de oxigênio.
- Comparar a eficácia da azitromicina e antimoniato de
meglumina contra formas promastigotas de L. (l.)
amazonensis e a influência destes fármacos sob condições de
tensão baixa e tensão normal de oxigênio.
- Avaliar o consumo ou excreção de ácidos orgânicos) em
cultura de formas promastigotas L. (l.) amazonensis com
diferentes concentrações de azitromicina e antimoniato de
meglumina por meio da técnica de cromatografia líquida de
alta eficiência (CLAE).
23
Artigo 1
Excreção e consumo de ácidos orgânicos de formas promastigotas de
Leishmania (L.) amazonensis sob distintas tensões de oxigênio.
24
Resumo
O estudo do metabolismo de parasitos permite que sejam
encontrados novos pontos de ação de fármacos, uma vez que estes
organismos possuem vias bioquímicas diferenciadas de seus hospedeiros.
Leishmania spp degradam parcialmente a glicose a CO
2
, liberando ácidos
orgânicos como produtos finais do seu metabolismo. Este mecanismo é
denominado de fermentação aeróbia. Este trabalho avaliou as diferenças
metabólicas em condições sob tensão normal e/ou tensão baixa de
oxigênio em cultura de formas promastigotas de L. amazonensis de acordo
com o consumo e excreção de ácidos orgânicos. Piruvato, citrato e lactato
foram os ácidos orgânicos consumidos em baixa tensão de oxigênio,
provavelmente por utilização de via metabólica que pode ser ativada em
situações de hipóxia. Também foi observada excreção de succinato e
fumarato em condições de tensão baixa de oxigênio e na fase estacionária.
O succinato pode ser acumulado e reduzido a fumarato. Este fato é
conhecido como inversão metabólica e ocorre quando há uma redução ou
inibição da respiração. Dessa forma revelaram-se locais metabólicos onde
fármacos, possivelmente mais efetivos e elucidativos, poderão subsidiar
caminhos para ações menos agressivas ao paciente.
Palavras-chave: Leishmania amazonensis, oxigênio, ácidos orgânicos.
25
Abstract
The report about parasites metabolism allows that have been found
new drug targets, as this organisms shows different biochemical pathways
of them hosts. Leishmania spp partially degrades the glucose to CO
2
,
releasing organic acids as end products of the metabolism. This
mechanism is named aerobic fermentation. This study evaluated the
metabolic differences under normal tension and low tension of oxygen in
culture of L. amazonensis promastigote forms by the consumption and
excretion of organic acids. Pyruvate, citrate and lactate had been
consumed under oxygen low tension probably due the utilization of
metabolic pathway that can be activated under hypoxia situations. So we
had observed the excretion of succinate and fumarate under oxygen low
tension and stationary phase. It had been observed an increase in the
excretion of succinate and fumarate under low tension and stationary
phase. The succinate can be accumulated and reduced to fumarate. This
fact is known as metabolic inversion and occurs when the respiration is
reduced or inhibited. So, we can discover new drugs targets more effective
and less aggressive to the patient.
Key words: Leishmania amazonensis, oxygen, organic acids.
26
Introdução
Os tripanossomatideos, dentre eles Leishmania sp e Trypanosoma
sp, são células eucarióticas, com vias metabólicas muito semelhantes às
de seu hospedeiro (Turrens, 2004). Os estudos do metabolismo de
parasitos permitem que sejam encontradas vias metabólicas diferenciadas
de seus hospedeiros e novos pontos de ação de drogas. Entre estas
diferenciações destacam-se algumas enzimas da via de Embden-Meyerhof,
também conhecida por via glicolítica ou glicólise, que estão armazenadas
em uma organela específica conhecida como glicossomo de onde os
produtos finais são levados para um complexo mitocôndria-cinetoplasto
para a oxidação terminal (Cazzulo et al, 1985). Os parasitos do gênero
Leishmania são capazes de se adaptar metabolicamente de acordo com a
disponibilidade de substratos energéticos e seu ciclo de vida. Para estes
organismos a glicose é a principal fonte energética, mesmo nos casos em
que os aminoácidos são substratos essenciais (Tielens e Van Hellemond,
1998).
Os protozoários da família Trypanosomatidae degradam
parcialmente a glicose a CO
2
, liberando ácidos orgânicos como produtos
finais do seu metabolismo. Este mecanismo é denominado de fermentação
aeróbia, devido à liberação dos mesmos produtos finais tanto sob
condições aeróbias como anaeróbias (Cazzulo, 1992). Nos membros do
complexo L. donovani ocorre oxidação incompleta do substrato energético
27
havendo liberação de uma grande quantidade de ácidos orgânicos, em
especial succinato, no meio de cultura como produto final do metabolismo
(Santhamma e Bhaduri, 1995).
Na maioria dos organismos, quando ocorre a transição de
anaerobiose para aerobiose, há uma rápida inibição da glicólise, reduzindo
assim a taxa de utilização da glicose. Este mecanismo de regulação da via
glicolítica é conhecido como Efeito Pasteur. Entretanto, em
Trypanosomatidae parece não ocorrer este mecanismo (Cazzulo, 1992).
Este trabalho tem por objetivo avaliar as diferenças metabólicas em
condições sob tensão normal e tensão baixa de oxigênio em cultura de
formas promastigotas de L. amazonensis observando-se a excreção e
consumo de ácidos orgânicos pela técnica de Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE) (Bezerra et al,1999).
Material e Métodos
Cultivo das formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis
O Laboratório de Imunologia Celular do Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás cedeu
gentilmente as formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis
(IFLA/BR/1967/PH8) para o cultivo destes parasitos realizado em meio
liquido Grace (Grace’s Insect Medium – Gibco®) acrescido de soro fetal
28
bovino estéril na diluição de 1/5 em meio de cultura, L-glutamina na
diluição de 1/100 e de antibióticos na diluição de 1/200 e mantidos em
placas de acrílico com 24 poços e estufa de 26ºC. Dessa forma, estas
amostras serviram para avaliar as formas promastigotas sob tensão
normal de O
2
.
Avaliação do metabolismo intermediário em meio de cultura com
tensão baixa de oxigênio
Após a proliferação das formas promastigotas em meio de cultura em
tensão normal de oxigênio, aproximadamente no segundo dia da curva de
crescimento dos parasitos, foram retiradas 2,O X 10
7
Leishmania/mL do
meio de cultura sob tensão normal, colocadas em tubos de criopreservação
e vedadas hermeticamente por 24 horas. Com isso, o grande número de
parasitos consumiu o oxigênio do meio, promovendo uma situação em que
há tensão baixa de oxigênio.
Padronização da Curva de Crescimento
A amostra de parasitos foi diluída em formaldeído a 10% e então a
contagem foi realizada em câmara de Newbauer. A curva teve início com
5,0 X 10
5
Leishmania/mL e realizada em triplicata. O crescimento das
formas promastigotas foi acompanhada por 7 dias.
29
Extração e análise da concentração de ácidos orgânicos
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) foi realizada para
avaliar a concentração dos ácidos orgânicos excretados ou consumidos no
cultivo das formas promastigotas de L. amazonensis.
As amostras do meio de cultura foram coletadas com pipetas
automáticas no volume de 1 mL, congeladas em microtubos a -20ºC, para
posterior análise cromatográfica. A extração dos ácidos orgânicos foi
realizada através de uma coluna de troca aniônica Bond Elut® (SAX-
Varian) para a separação da fase sólida. A ativação da coluna foi auxiliada
por uma bomba de vácuo, com 0,5M de HCl, 1mL de metanol e 2mL de
água destilada. Adicionou-se 250μl da amostra e então se retirou a coluna
da sucção por vácuo. Acrescentou-se 1mL de ácido sulfúrico a 0,5M e foi
centrifugada a 520g por 5 minutos para a formação das amostras
contendo os ácidos orgânicos extraídos.
Utilizou-se o sistema cromatográfico ProStar Varian®, calibrado para
determinação de piruvato, citrato, α-cetoglutarato, fumarato, acetato,
succinato, lactato, malato, propionato e oxalato. O sistema de CLAE,
utilizado neste estudo, foi composto por uma fase móvel (eluente), um
sistema de distribuição de solvente (bomba de alta pressão), um injetor,
uma pré coluna para proteção da coluna (Aminex HPX-85, Fa. BIORAD),
uma coluna preparada com material específico para a separação de ácidos
orgânicos (BIORAD–Aminex Íon Exclusion HPX-87H 30 x 7,8mm), detector
ultravioleta e um sistema de dados (computador e impressora).
30
A análise cromatografica foi iniciada com a injeção de 20 μL da
amostra extraída. Os ácidos orgânicos foram separados a medida em que a
amostra e a fase móvel ou eluente (H
2
SO
4
0,5mM) foram bombeadas
através da coluna. O fluxo deste eluente foi de 0,8mL/minuto e a absorção
do detector ultravioleta foi feita em um comprimento de onda de 210nm.
Os ácidos orgânicos que eluem da coluna são demonstrados por
picos no programa de análise e seu tempo de retenção e área do pico
destas substâncias foram calculados pelo programa StarToolBar®, que
plotou os resultados em um gráfico (cromatograma) de acordo com a
concentração dos ácidos na amostra. Após estes resultados foram
realizados os cálculos das concentrações dos ácidos orgânicos detectados
pelo sistema CLAE (Anexo B).
Cálculo do consumo e excreção dos ácidos orgânicos no meio de
cultura
O consumo e excreção de ácidos orgânicos foi calculado a partir da
taxa de concentração destes ácidos presentes no meio de cultura sem a
presença das formas promastigotas subtraindo a taxa de concentração em
presença destas formas promastigotas.
31
Análise estatística
O teste de t foi utilizado na comparação dos resultados entre os
grupos em estudo e Análise de Variância para avaliar a significância
estatística dos resultados. Considerou-se estatisticamente significativo o
valor de p < 0,05.
Resultados
Curva de crescimento
Com o acompanhamento do crescimento das formas promastigotas
durante os 7 dias de observação, ficou estabelecido que a fase log ou fase
de crescimento ocorre entre o 1° e o 4° dias e a fase estacionária a partir
do 5° dia e declina a partir do 7° dia.
Durante o acompanhamento desta curva de crescimento, observou-
se diferença estatisticamente significativa entre as curvas de crescimento
entre os grupos sob tensão normal e tensão baixa de oxigênio. O grupo sob
tensão baixa apresentou um menor crescimento que o grupo em tensão
normal (Figura 5).
32
Figura 5. Curva de crescimento de formas promastigotas de Leishmania
amazonensis em meio de cultura sob tensão normal e tensão baixa de
oxigênio.
Detecção, consumo e excreção de ácidos orgânicos
Nas duas fases de crescimento do parasito em meio de cultura (fase
log e fase estacionária), foram detectados piruvato, citrato, succinato,
fumarato, malato, lactato e propionato (Figura 6).
Dentre estes ácidos detectados, foi observado um consumo
significativo (ANOVA, p<0,05) de piruvato, citrato, lactato, quando
comparados os grupos sob tensão baixa com a tensão normal de oxigênio
(Tabela II).
O consumo de citrato, comparando as fases log e estacionária de
crescimento das formas promastigotas, não foi significativo (ANOVA,
p>0,05) (Tabela III).
O consumo de malato foi significativo entre as diferentes fases de
crescimento (ANOVA, p<0,05) (Tabela III).
Houve excreção significativa (ANOVA, p<0,05) na concentração de
succinato e propionato quando comparados os grupos em tensão normal e
tensão baixa de oxigênio (Tabela II).
Comparando as duas fases de crescimento, houve diferença
significativa (ANOVA, p<0,05) na excreção de succinato, fumarato e
propionato (Tabela III).
33
Não houve excreção ou consumo significativo (ANOVA, p>0,05) de
fumarato e malato (Tabela II) na comparação entre os grupos sob tensão
normal e tensão baixa de oxigênio.
Na comparação entre as fases log e estacionária a diferença na
excreção e consumo de piruvato não foi significativa (ANOVA, p>0,05)
(Tabela III).
34
Figura 6. Cromatograma dos ácidos orgânicos detectados por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
em formas promastigotas de Leishmania amazonensis em meio de cultura sob tensão normal (em preto) e
tensão baixa de oxigênio (emvermelho).
35
Tabela II. Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos
presentes em meio de cultura contendo formas promastigotas de L.
amazonensis, sob condições de tensão normal e tensão baixa de oxigênio
(n=3).
ÁCIDO
ORGÂNICO
Concentração (x 10
-7
μM.ml
-1
) sob tensão
normal de oxigênio
Concentração (x 10
-7
μM.ml
-1
) sob tensão
baixa de oxigênio
Concentração (x 10
-7
μM.ml
-1
) no controle
de meio de cultura
Piruvato* -1,24 -28,06 28,06
Citrato* -36,82 -89,07 111,69
Succinato 34,20 59,99 14,86
Fumarato -0,26 -0,25 42,24
Malato -294,38 -125,84 1328,14
Lactato* -0,57 -2,92 9,01
Propionato 94,85 12,44 20,64
* significativo (ANOVA, p<0,05)
36
Tabela III. Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos
presentes em meio de cultura contendo formas promastigotas de L.
amazonensis, em diferentes fases de crescimento (fase log e estacionária)
(n=3).
ÁCIDO
ORGÂNICO
Concentração
(x 10
-7
μM.ml
-1
)
na fase log
Concentração
(x 10
-7
μM.ml
-1
) na
fase estacionária
Concentração (x 10
-7
μM.ml
-1
) no meio de
cultura (controle
Piruvato -9,49 -19,81 28,06
Citrato -53,05 -72,84 111,69
Succinato* 8,55 85,64 14,86
Fumarato* -1,63 1,11 42,24
Malato* -341,17 -79,06 1328,14
Lactato -2,30 -1,19 9,019
Propionato* 56,28 51,01 20,64
* significativo (ANOVA, p<0,05)
37
Discussão
As formas amastigotas de Leishmania spp são as responsáveis pelos
quadros clínicos registrados nas leishmanioses em vertebrados. A
adaptação metabólica das formas amastigotas a um ambiente ácido nos
fagolisossomos pode permitir a sobrevivência e multiplicação deste
parasito (Mukkada et al, 1985).
As formas promastigotas de Leishmania não são resistentes à
anóxia. Quando ocorre uma redução na tensão de oxigênio, estes parasitos
reduzem seu metabolismo e sua proliferação. Resultados in vitro
demonstram que estas formas toleram a tensão baixa de O
2
até certo
ponto e inibem a cadeia respiratória reduzido a níveis mínimos sua
atividade metabólica (Tielens e Van Hellemond, 1998). A redução da taxa
de prolifereção do parasito, em condição de baixa tensão de oxigênio, pôde
ser observada neste trabalho através da curva de crescimento (Figura 5).
Os ácidos graxos não-esterificados e a glicose são substratos
fundamentais para a respiração de promastigotas e a transformação de
amastigotas para promastigotas (Hart et al, 1981). A utilização destes
substratos pôde ser observada através dos ácidos orgânicos detectatos
pela técnica de CLAE que foram piruvato, citrato, succinato, fumarato,
malato e lactato, representando a utilização de glicose como substrato e o
propionato, sugerindo o uso de ácidos graxos. Como observado neste
estudo, os produtos finais do metabolismo de Leishmania sp são os
38
mesmos, tanto em tensão normal, como baixa tensão de oxigênio, porém
em concentrações diferentes. Este fato é conhecido como fermentação
aeróbia (Cazzullo, 1992).
Em baixa tensão de oxigênio, houve consumo de piruvato, citrato e
lactato, entretanto, comparando as fases log e estacionária de crescimento
destes grupos, não houve diferença na excreção ou consumo de piruvato e
citrato (Anexo C).
O piruvato foi consumido tanto sob tensão baixa como normal de
oxigênio, entretanto foi excretado, na fase log sob tensão normal (Anexo C).
É um ácido orgânico resultante da glicólise e entra na mitocôndria. Com a
ação da piruvato desidrogenase, este ácido é convertido a acetil CoA dando
início ao ciclo do ácido tricarboxílico (Tielens e Van Hellemond, 1998). Nas
formas promastigotas, o piruvato, juntamente com o succinato, é oxidado
parcialmente e representa um dos principais produtos finais do
metabolismo de tripanossomatideos (Cazzullo, 1992).
A diferença significativa no consumo e excreção de lactato (Anexo C )
foi observada na fase estacionária: o grupo em tensão normal excretou este
ácido orgânico no meio, enquanto o grupo em baixa tensão consumiu este
ácido orgânico. A diminuição da taxa de concentração de lactato sob baixa
tensão de oxigênio revela um não direcionamento do metabolismo de
“hipoxia” para via de produção deste ácido, indicador de situações de
ausência de oxigênio em vertebrados e diversos invertebrados (Bezerra et
al, 1999).
39
A excreção de succinato ocorreu tanto em tensão baixa como em
tensão normal de oxigênio, porém houve uma maior taxa de concentração
deste ácido orgânico na fase estacionária (Anexo C). Os tripanossomatideos
possuem um metabolismo dependente do succinato, o que significa que
qualquer alteração na produção deste ácido orgânico seria fatal para estes
parasitos (Denicola-Seoane et al, 1992). Nas formas promastigotas de
Leishmania spp, o succinato é um produto do ciclo do ácido tricarboxílico,
gerado pela oxidação do NADH, sendo o substrato da cadeia respiratória
(Tielens e Van Hellemond, 1998). A produção de succinato pode aumentar
quando o aceptor de elétrons, no caso o oxigênio, não estiver presente ou
sob hipóxia (Tielens e Van Hellemond, 1998).
Sob condições anaeróbias, o succinato produzido tanto na crista
interna como na crista externa da mitocôndria pode ser transportado
através da crista interna para que seja oxidado através da cadeia
respiratória (Denicola et al., 2002). Os estudos realizados com cristas
mitocondriais isoladas demonstram que embora o transporte de elétrons
entre succinato e citocromo c seja inibido pela antimicina, a NADH-
citocromo c redutase não é sensível à antimicina. Isto provavelmente
ocorre devido ao fato de que a via da NADH ubiquinona da cadeia
respiratória seja substituída pela NADH-fumarato redutase, a qual reoxida
o NADH mitocondrial, gerando mais succinato para a cadeia respiratória.
Desse modo, os elétrons provenientes do NADH não chegam ao citocromo c
pelo complexo III o que significa que o complexo I é ausente ou sua ação
40
acontece em uma via diferente (Turrens, 1989; Denicola-Seoane et al,
1992; Turrens, 2004). Na cadeia respiratória de mamíferos, a maioria dos
elétrons que reduzem o oxigênio vem da oxidação do NADH através da
seqüência complexo I, complexo III, complexo IV e oxigênio (Turrens,
2004).
Esta situação na qual o succinato pode ser acumulado e ser
reduzido a fumarato é conhecido como inversão metabólica parcial no ciclo
de Krebs. Isto ocorre quando há uma redução ou inibição da respiração.
Um exemplo disto é quando as formas promastigotas de Leishmania spp
permanecem no intestino médio do mosquito e proliferam até o momento
de serem liberadas e inoculadas no hospedeiro. Este fato leva a uma
aglomeração de parasitos e, dessa forma, o ambiente sofre uma queda na
tensão de oxigênio e, algumas vezes, anóxia. Após o repasto sangüíneo em
um indivíduo infectado, os nutrientes estão em abundância no intestino
médio do mosquito, porém a quantidade reduz drasticamente devido a
grande proliferação dos parasitos (Van Hellemond e Tielens, 1997). Se as
formas promastigotas gerassem energia sob metabolismo anaeróbio em
quantidade semelhante à produzida por metabolismo aeróbio, os
nutrientes existentes no meio se esgotariam rapidamente. Os mosquitos
são hospedeiros relativamente pequenos, logo uma grande quantidade de
parasitos poderia provocar uma redução na viabilidade deste hospedeiro
invertebrado, pois também reduziria a chance destas formas
promastigotas infectarem um novo hospedeiro vertebrado. Por isso, esta
41
inversão metabólica pode ser considerada uma adaptação dos parasitos no
microhabitat (Walsh e Blum, 1992).
O fumarato, neste estudo, não apresentou diferenças entre tensão
normal e tensão baixa de oxigênio, entretanto foi consumido na fase log e
excretado na fase estacionária. Este ácido pode ser reduzido através da
enzima fumarato redutase, conhecida por sua presença em bactérias e
helmintos, onde esta enzima funciona como um carreador de elétrons em
condições anaeróbias (Tielens e Van Hellemond, 1998).
O aumento no consumo de fumarato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis durante a fase log e a excreção deste ácido
orgânico durante a fase estacionária pode significar alterações nos níveis
de enzimas como a NADH-fumarato redutase e a succinato desidrogenase,
de acordo com as diferentes fases de crescimento do parasito. A NADH-
fumarato redutase é uma enzima diferente da succinato desidrogenase
(Christmas e Turrens, 2000). Ela realiza a reoxidação do NADH
intracelular e pode transferir elétrons diretamente para o oxigênio na
ausência de outros aceptores de elétrons (Turrens, 2004). A forma solúvel
da fumarato redutase foi avaliada em formas promastigotas de L. major e
L. donovani, demonstrando que a concentração de succinato foi
dependente do efeito inibitório da fumarato redutase, uma vez que o
fumarato também apresentou concentrações dependentes do efeito
inibitório da succinato desidrogenase. Estes resultados demonstram que a
42
fumarato redutase é uma enzima essencial à adaptação metabólica
presente na cadeia respiratória do parasito (Chen et al, 2001).
O propionato foi excretado na fase log, porém em uma maior taxa de
concentração sob tensão normal que sob tensão baixa de oxigênio. Na fase
estácionária, este ácido orgânico foi excretado sob tensão normal e
consumido sob tensão baixa de oxigênio. Este ácido participa do
metabolismo de ácidos graxos e seu principal substrato é a succinil CoA
que dará origem ao succinato (Hugler e Fuchs, 2005).
Neste trabalho, a excreção e consumo de ácidos orgânicos entre o
grupo sob baixa e tensão normal de oxigênio apresentaram diferenças
significativas, em especial com aumento na concentração de succinato no
meio, sugerindo que este ácido orgânico é um dos principais produtos
finais em condições de fermentação aeróbia.
Diferenças metabólicas entre o parasito e seu hospedeiro podem
sugerir novos pontos de ação de fármacos mais efetivos e menos agressivas
ao paciente (Turrens, 2004).
43
Artigo 2
Avaliação da eficácia leishmanicida da azitromicina e antimoniato de
meglumina e dosagem de ácidos orgânicos em cultura de formas
promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis com em tensões de
oxigênio distintas e sob ação destes fármacos.
44
Resumo
O tratamento usual das leishmanioses consiste na administração de
antimoniais pentavalentes, como o antimoniato de meglumina, porém o
mecanismo de ação destes fármacos não é bem elucidado. Além disso, são
fármacos tóxicos e de difícil administração. Com isso, novos esquemas
terapêuticos têm sido aplicados, dentre estes o uso da azitromicina, que
possui fácil administração e distribuição no organismo. Entretanto, não se
sabe onde este fármaco influencia no metabolismo de Leishmania spp.
Este trabalho tem por objetivo avaliar a eficácia de grupos tratados com
azitromicina e antimoniato de meglumina e a ação destes fármacos sobre
consumo e excreção de ácidos orgânicos no parasito, sob tensões normal e
baixa de oxigênio. A azitromicina se mostrou eficaz na redução no número
de parasitos durante a curva de crescimento, entretanto o antimoniato de
meglumina apresentou uma redução na quantidade de promastigotas no
meio em menor tempo. Com relação à excreção e consumo de ácidos
orgânicos, foram detectados piruvato, citrato, succinato, fumarato, malato,
lactato e propionato. Sob a ação da azitromicina, piruvato, citrato, lactato
e propionato foram os ácidos orgânicos consumidos, provavelmente por
utilização de via metabólica que pode ser ativada em situações de hipóxia.
Sob a ação dos dois fármacos, o succinato e o fumarato foram excretados,
sugerindo a ação da enzima NADH-fumarato redutase, presente em
Leishmania spp e ausente no hospedeiro mamífero. Desta forma, esta
enzima é um importante alvo de ação de drogas.
Palavras-chave: Leishmania amazonensis, promastigotas, azitromicia,
antimoniato de meglumina, ácidos orgânicos.
45
Abstract
The usual treatment of leishmaniasis consists in administration of
pentavalents antimonials, like meglumine antimoniate, but the mode of
action of these drugs has not yet been elucidated. Moreover, these drugs
are toxic and the administration is very hard. Thus, new therapeutic
schemes have been used, as the use of azitrhomycin, that posses easy
administration and distribution in the organism. However, it’s unknown
where this drug affects in the Leishmania spp metabolism. These report
aims to evaluate the efficacy of azitrhomycin and meglumine antimoniate
and the action of these drugs on the consumption and excretion of organic
acids, by normal and low tension of oxygen. Azithromycin had been
efficient in the reduction of parasites number, but the meglumine
antimoniate had showed a reduction in the number of promastigotes in the
medium on less time. About the excretion and consumption of organic
acids, it had been detected pyruvate, citrate, succinate, fumarate, malate,
lactate e propionate. Under the azithromycin action, pyruvate, citrate,
lactate and propionate had been the organic acids consumed, probably
due the utilization of a metabolic pathway that can be activated from
hypoxia situations. Under the action of the two drugs, the succinate and
the fumarate had been excreted, suggesting the NADH-fumarate reductase
action, that is present in Leishmania spp and lacks in mammalian host.
Thus, this enzyme is an important target for the action of drugs.
Key words: Leishmania amazonensis, promastigotes, azitrhomycin,
meglumine antimoniate, organic acids.
46
Introdução
As leishmanioses são doenças causadas por parasitos do gênero
Leishmania e apresentam formas clínicas diversas como cutânea, muco-
cutânea e visceral. Os aspectos clínicos variam de acordo com a espécie do
parasito e os tecidos por ele atingidos (Desjeux, 2004).
O tratamento usual das leishmanioses consiste na administração de
antimoniais pentavalentes, como o antimoniato de meglumina, porém o
mecanismo de ação destes fármacos não é bem elucidado (Berman, 2003).
Assim, nos últimos 20 anos, observou-se uma necessidade de mudança no
tratamento das leishmanioses, pois os antimoniais pentavelentes são
administrados por via parenteral e por períodos prolongados. Esses
esquemas terapêuticos levam muitas vezes o paciente a abandonar o
tratamento (Blum et al, 2004). Dessa forma, a terapia oral representa um
dos principais avanços no tratamento das leishmanioses.
A azitromicina apresentou-se como uma boa opção terapêutica no
tratamento das leishmanioses por apresentar rápida distribuição tecidual,
ser bem tolerada pelos pacientes, de baixo custo e simples administração
(Prata et al, 2003). É um fármaco utilizado em outras infecções por
protozoários como giardíase, malária e toxoplasmose (Perchère, 2001).
As avalições da eficácia leishmanicida realizadas como teste para
suceptibilidade às drogas são realizados tanto nas formas amastigotas
(presente no hospedeiro vertebrado) como promastigotas (presente no
47
hospedeiro invertebrado) de Leishmania spp. As duas formas evolutivas
deste parasito apresentam diferenças bioquímicas, sendo que
promastigotas possuem menor suceptibilidade as drogas que amastigotas
(Fumarola et al, 2004).
O bloqueio de vias metabólicas essenciais ao parasito pode gerar
novas oportunidades terapêuticas, pois vias bioquímicas ausentes em
humanos podem ser aquelas que controlam a virulência do parasito (Davis
et al, 2004).
Neste estudo, realizou-se estudo da eficácia do antimoniato de
meglumina e azitromicina sobre formas promastigotas de Leishmania (L.)
amazonensis com o objetivo de avaliar a ação destes fármacos sobre o
crescimento e metabolismo do parasito, através do estudo das curvas de
crescimento e concentração de ácidos orgânicos excretados e consumidos
em meio de cultura. Com isso, pode-se encontrar alguns subsídios sobre
pontos de ações de drogas sobre o metabolismo do parasito.
48
Material e Métodos
Cultivo das formas promastigotas de L. amazonensis
As formas promastigotas de L. amazonensis (IFLA/BR/1967/PH8)
foram cedidas pelo Laboratório de Imunologia Celular do Instituto de
Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás. Os
parasitos foram mantidos em cultura em meio Grace’s (Grace’s Insect
Medium – Sigma®) com 20% de soro fetal bovino estéril, acrescido de 1%
de L-glutamina e 0,5% de antibióticos (estreptomicina e penicilina). A cada
dois dias foram realizados repiques contendo aproximadamente 5,0 X 10
6
Leishmania/mL para manutenção da cultura. Estas amostras de L.
amazonensis foram mantidas em estufa a 26ºC e serviram como o controle
em tensão normal de oxigênio.
Padronização da Curva de Crescimento
Para a padronização da curva de crescimento dos parasitos, a evolução
da cultura foi acompanhada por 7 dias. A contagem foi realizada em
câmara de Newbauer, diluído em formaldeído a 10%. A curva foi elaborada
a partir do repique contendo 5,0 X 10
5
Leishmania/mL e serviu como
controle dos testes para avaliação da ação bioquímica de substâncias
químicas e de tensão baixa de oxigênio. A curva foi realizada em triplicata.
49
Avaliação do crescimento de formas promastigotas em meio com
tensão baixa de oxigênio
Amostras para as análises metabólicas foram provenientes de
cultura contendo 2,0 X 10
7
Leishmania/mL colocadas em tubos de
criopreservação e vedada hermeticamente por 24 horas. Com isso, o
grande número de parasitos consumiram o oxigênio do meio e promovendo
um meio com tensão baixa de oxigênio.
Avaliação da eficácia da azitromicina
Utilizou-se azitromicina (Novartis®) sob a forma di-hidratada, na
apresentação de comprimidos (500mg), macerada, calculada seu peso
anidro e pesada para a realização dos testes. A ação de azitromicina sobre
formas promastigotas foi testada nas concentrações de 100µg, 50µg e
10µg, de acordo com Krolewiecki et al (2002). As substâncias foram
adicionadas ao meio Grace’s modificado e então foram colocados 5 X 10
5
leishmania/mL, , tanto no grupo sob tensão normal como no grupo sob
tensão baixa de oxigênio. A contagem dos parasitos foi realizada durante
7dias, a 24 horas. No primeiro, terceiro (fase log) e quinto (fase
estacionária) dias, foram coletados 1000µL do cultivo por dia e congelados
a -20°C para posterior análise dos ácidos orgânicos em cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE). Os testes foram realizados em triplicata e
os resultados comparados com a curva controle.
50
Avaliação da eficácia do antimoniato de meglumina
Utilizou-se o antimoniato de meglumina (Glucantime–Aventis®) em
ampolas (1,5 g. 5 mL
-1
). A ação do antimoniato de meglumina sobre as
formas promastigotas foi testada nas concentrações de 100µg, 50µg e 10µg
de acordo com o descrito por Carrio et al (2001). As substâncias foram
adicionadas ao meio Grace’s modificado e então foram colocados 5 X 10
5
Leishmania/mL, , tanto no grupo sob tensão normal como no grupo sob
tensão baixa de oxigênio. A contagem dos parasitos foi realizada durante
7dias. No primeiro, terceiro (fase log) e quinto (fase estacionária) dias,
foram coletados 1000µL do cultivo por dia e congelados a -20°C para
posterior análise dos ácidos orgânicos em CLAE. Os testes foram
realizados em triplicata e os resultados comparados com a curva controle.
Extração e análise de ácidos orgânicos
A extração e análise dos ácidos orgânicos excretados ou consumidos
no cultivo das formas promastigotas de L. amazonensis foi feita por meio
da técnica de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
As amostras do meio de cultura foram coletadas com pipetas
automáticas no volume de 1 mL, congeladas em microtubos a 2ºC, para
posterior análise cromatográfica. A extração dos ácidos orgânicos foi
realizada através de uma coluna de troca aniônica Bond Elut® (SAX-
Varian) para a separação da fase sólida. A ativação da coluna foi auxiliada
por uma bomba de vácuo, com 0,5 M de HCl, 1 mL de metanol e 2mL de
51
água destilada. Adicionou-se 250μL da amostra e então retirou-se a
coluna da sucção por vácuo. Acrescentou-se 1mL de ácido sulfúrico a
0,5M e foi centrifugada a 520g por 5 minutos para a formação das
amostras contendo os ácidos orgânicos extraídos.
A análise cromatografica iniciou-se com a injeção de 20 μL da
amostra extraída. Os ácidos orgânicos foram separados a medida em que a
amostra e a fase móvel (eluente) foram bombeadas através da coluna. O
fluxo deste eluente foi de 0,8mL por minuto e a absorção do detector
ultravioleta foi feita em um comprimento de onda de 210nm.
O CLAE é composto por uma bomba, um injetor, uma coluna de
separação (BIORAD–Aminex Íon Exclusion HPX-87H 30 x 7,8mm), um
detector ultravioleta e um sistema de dados (computador e impressora).
Esta coluna é preparada com material específico para a separação de
ácidos orgânicos e protegida por uma pré-coluna (Aminex HPX-85, Fa.
BIORAD). A bomba de alta pressão permite que a fase móvel (H
2
SO
4
0,5mM) passe através da coluna.
Os ácidos orgânicos que eluem da coluna são demonstrados por
picos no programa de análise e seu tempo de retenção e área do pico
destas substâncias são calculados pelo programa StarToolBar®, que
plotou os resultados em um gráfico (cromatograma) de acordo com a
concentração dos ácidos na amostra.
52
Utilizou-se o Cromatógrafo ProStar Varian®, calibrado para
determinação de piruvato, citrato, α-cetoglutarato, fumarato, acetato,
succinato, lactato, malato, propionato e oxalato.
Análise estatística
Foram realizados os testes de t pareados para comparação dos
resultados entre os grupos em estudo e Análise de Variância para avaliar a
significância estatística dos resultados. Considerou-se estatisticamente
significativo o valor de p < 0,05.
Resultados
Curvas de Crescimento
De acordo com esta padronização, ficou estabelecido que a fase log
ou fase de crescimento ocorre entre o 1° e o 4° dias. A fase estacionária e
mais infectante ocorre a partir do 5° dia e declina a partir do 6° dia,
quando os parasitos começam a morrer.
Avaliação da eficácia da azitromicina e do antimoniato de meglumina.
De acordo com a curva de crescimento estabelecida ao longo dos sete
dias, os grupos tratados com azitromicina apresentaram um maior
crescimento que os grupos tratados com antimoniato de meglumina sob
53
tensão normal de oxigênio (Figura 5). As diferenças significativas (ANOVA,
p< 0,05) ocorreram na comparação entre os grupos tratados com
50μg.mL
-1
de azitromicina e 100μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina,
10μg.mL
-1
de azitromicina e 100μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina,
10μg.mL
-1
de azitromicina e 50μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina,
10μg.mL
-1
de azitromicina e 10μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina.
Realizou-se a comparação entre as curvas de crescimento dos
grupos tratados com azitromicina e os grupos tratados com antimoniato de
meglumina sob tensão baixa de oxigênio. As curvas de crescimento das
amostras tratadas com azitromicina apresentaram maior quantidade de
parasitos quando comparada com as curvas de crescimento dos grupos
tratados com antimoniato de meglumina (Figuras 7 e 8).
As diferenças significativas (ANOVA, p< 0,05) foram encontradas na
comparação dos grupos tratados com 100μg.mL
-1
de azitromicina e
10μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina, 10 μg.mL
-1
de azitromicina e
100μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina, 10μg.mL
-1
de azitromicina e
50μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina, 10μg.mL
-1
de azitromicina e
10μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina.
54
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
01234567
Crescimento (em dias)
Número de formas promastigotas (x
10
5
parasitos/mL)
tratamento com 100µg/mL de azitromicina sob tensão normal de oxigênio
tratamento com 50µg/mL de azitromicina sob tensão normal de oxigênio
tratamento com 10µg/mL de azitromicina sob tensão normal de oxigênio
tratamento com 100µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão normal de oxigênio
tratamento com 50µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão normal de oxigênio
tratamento com 10µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão normal de oxigênio
sem tratamento (controle) sob tensão normal de oxigênio
Figura 7. Curva de crescimento das formas promastigotas de Leishmania
amazonensis em meio de cultura contendo azitromicina e antimoniato de
meglumina sob tensão normal de oxigênio .
55
0
50
100
150
200
250
300
350
400
01234567
Crescimento (em dias)
Número de formas promastigotas (x 10
5
parasitos/mL)
tratamento com 10µg/mL de azitromicina sob tensão baixa de oxigênio
tratamento com 50µg/mL de azitromicina sob tensão baixa de oxigênio
tratamento com 100µg/mL de azitromicina sob tensão baixa de oxigênio
tratamento com 10µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão baixa de oxigênio
tratamento com 50µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão baixa de oxigênio
tratamento com 100µg/mL de antimoniato de meglumina sob tensão baixa de oxigênio
sem tratamento (controle) sob tensão baixa de oxigênio
Figura 8. Curva de crescimento das formas promastigotas de Leishmania
amazonensis em meio de cultura contendo azitromicina e antimoniato de
meglumina sob tensão baixa de oxigênio.
56
Identificação de Ácidos Orgânicos por CLAE
Em todos os grupos estudados, os ácidos orgânicos, em
concentrações significativas, detectados no meio de cultura contendo as
formas promastigotas foram piruvato, citrato, succinato, fumarato, malato,
lactato e propionato. Os resultados positivos significaram a excreção
destes ácidos orgânicos no meio de cultura, enquanto os resultados
negativos representaram um consumo. Estes resultados foram calculados
subtraindo-se a concentração do ácido orgânico das amostras contendo as
formas promastigotas da concentração deste mesmo ácido no grupo
controle, ou seja, no grupo contendo apenas o meio de cultura e o fármaco
na mesma concentração da amostra (Figura 9).
57
Figura 9. Cromatograma dos ácidos orgânicos detectados por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência)
em formas promastigotas de Leishmania amazonensis em meio de cultura sob tensão normal e ação de
azitromicina.
59
Excreção e consumo de ácidos orgânicos em meio de cultura
contendo azitromicina
A excreção e consumo de ácidos orgânicos nos meios de cultura
tratados com azitromicina, não apresentaram diferenças significativas
quando comparados os grupos sob tensão normal e baixa de oxigênio
(ANOVA, p<0,05).
Nos grupos estudados e no grupo controle com concentração de
100μg.mL
-1
, não foi observada excreção ou consumo de piruvato.
Entretanto houve diferença significativa (ANOVA, p<0,05) nos grupos
tratados com 10μg.mL
-1
e 50μg.mL
-1
, representando o consumo deste
ácido no meio nestas concentrações do fármaco (Tabela IV).
Com relação à taxa de concentração de citrato no meio, foi
observada um consumo significativo (ANOVA, p<0,05) deste ácido nos
grupo com concentração de 10μg.mL
-1
e 100 μg.mL
-1
de azitromicina
comparados com o controle deste fármaco (Tabela IV).
A taxa de concentração de succinato apresentou uma excreção
significativa (ANOVA, p<0,05), em especial entre os grupos com 10μg.mL
-1
e 100μg.mL
-1
quando comparado aos seus respectivos grupos controle
(Tabela IV).
Observou-se excreção significativa (ANOVA, p<0,05) de fumarato no
grupo tratado com 10μg.mL
-1
do fármaco comparado ao seu respectivo
controle, não apresentando diferença na concentração deste ácido nos
60
grupos tratados com 50μg.mL
-1
e 100μg.mL
-1
comparados aos seus
controles (ANOVA, p>0,05) (Tabela IV).
A excreção ou consumo de malato nos grupos estudados não foram
significativos (ANOVA, p>0,05) nos grupos sob tensão normal, entretando
foi significativa nos grupos sob tensão baixa de oxigênio (Tabela IV).
O consumo de lactato foi significativo (ANOVA, p<0,05) no grupo
tratado com 100μg.mL
-1
comparado ao seu respectivo controle, não
havendo diferença significativa (ANOVA, p>0,05)nos grupos tratados com
10 μg.mL
-1
e 50 μg.mL
-1
e seus respectivos grupos controle (Tabela IV).
Ocorreu um consumo significativo (ANOVA, p<0,05) na concentração
de propionato no grupo tratado com 100μg.mL
-1
do fármaco comparado
com seu respectivo grupo controle e não houve diferença (ANOVA,
p>0,05)nos grupos tratados com 10 e 50 μg.mL
-1
comparados a seus
controles (Tabela IV).
61
Tabela IV. Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos presentes em meio de cultura contendo
formas promastigotas de L. amazonensis, sob ação de azitromicina nas concentrações de 10 μg . mL
-1
, 50 μg .
mL
-1
e 100 μg . mL
-1
e sob tensão normal e/ou tensão baixa de oxigênio.
Azitromicina
0 μg . mL
-1
(Controle)
10 μg . mL
-1
50 μg . mL
-1
100 μg . mL
-1
Ácido Orgânico
(x10
-7
μM . mL
-1
)
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Piruvato -1,24
-28,06
-41,67*
-41,67 -25,14* -32,32 0 0
Citrato -36,82 -89,07 -134,06* -180,07* -6,66 -136,28 -97,28* -122,39*
Succinato 34,20 59,99 178,03* 110,05* 125,93* 51,03 55,39 105,70*
Fumarato -0,27 -0,25 19,74* 17,75* 9,57 6,78 3,64 1,99
Malato -294,38 -125,84 -483,16 232,21* -16,65 245,62* -317,10 103,63*
Lactato -0,57 -2,92 0,67 0,98 1,48* 0,52 -2,69* -2,15
Propionato 94,85 12,44 33,30 28,99 -21,79 -29,29 -152,59* -145,20*
*significativo (ANOVA, p<0,05)
63
Excreção e consumo de ácidos orgânicos em meio de cultura
contendo antimoniato de meglumina
O piruvato apresentou excreção significativa (ANOVA, p<0,05) nos
grupos tratados com 10 e 50μg.mL
-1
sob tensão normal de oxigênio
(Tabela V).
A comparação entre os grupos tratados com antimoniato de
meglumina e o controle deste fármaco, demonstrou um consumo
significativo de citrato (ANOVA, p<0,05) no meio de cultura no grupo com
concentração de 50μg.mL
-1
(Tabela V).
Os grupos tratados com 10μg.mL
-1
e 50μg.mL
-1
de antimoniato de
meglumina, quando comparados com seus respectivos grupos controle,
apresentaram excreção significativa (ANOVA, p<0,05) na taxa de
concentração de succinato no meio e consumo significativo deste mesmo
ácido nos grupos tratados com 100μg.mL
-1
(Tabela V).
A excreção de fumarato foi significativa (ANOVA, p<0,05) nos grupos
tratados com 10μg.mL
-1
e 50 μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina
comparados aos seus respectivos controles, não demonstrando diferenças
significativas (ANOVA, p>0,05) no grupo tratado com 100μg.mL
-1
deste
fármaco, comparada ao seu respectivo grupo controle (Tabela V).
A excreção de malato foi significativa (ANOVA, p<0,05) apenas no
grupo tratado com 10μg.mL
-1
e sob tensão normal de oxigênio (Tabela V).
A excreção de lactato apresentou-se significativa (ANOVA, p<0,05) no
grupo tratado com 50μg.mL
-1
e no grupo tratado com 10μg.mL
-1
sob
64
tensão normal de oxigênio e não houve diferença (ANOVA, p>0,05) nos
grupos tratados com 100μg.mL
-1
, quando comparados aos seus
respectivos grupos controle (Tabela V).
No que se refere a taxa de concentração de propionato, observou-se
diferente consumo entre os grupos tratado com 10μg.mL
-1
e 100 μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina e seu respectivo controle (ANOVA, p<0,05),
porém não houve diferença no consumo significativa (ANOVA, p>0,05) nos
grupo com 50 μg.mL
-1
de antimoniato de meglumina comparados aos
seus respectivos grupos controle (Tabela V).
65
Tabela V. Comparação do consumo e excreção de ácidos orgânicos presentes em meio de cultura contendo
formas promastigotas de L. amazonensis, sob ação de antimoniato de meglumina nas concentrações de 10
μg.mL
-1
, 50 μg.mL
-1
e 100μg.mL
-1
e sob tensão normal e/ou tensão baixa de oxigênio.
Antimoniato de Meglumina
0 μg . mL
-1
(Controle)
10 μg . mL
-1
50 μg . mL
-1
100 μg . mL
-1
Ácido Orgânico
( x10
-7
μM . mL
-1
)
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Tensão
normal
Tensão
baixa
Piruvato -1,24 -28,03 23,54* -40,97 29,03* -38,74 -6,83 0,03
Citrato -36,82 -89,07 -58,15 -222,34* -134,05* -248,79* -54,69 -0,07*
Succinato 34,20 59,99 181,06* 156,87* 110,57* 110,71* 10,55* -0,01*
Fumarato -0,27 -0,25 22,55* 8,53* 14,26* 9,61* -2,13 -0,01
Malato -294,38 -125,84 195,16* -216,61 -101,63 -379,44 -106,99 -0,22
Lactato -0,57 -2,92 3,11* 1,91 2,09* 3,48* -0,08 0,00
Propionato 94,85 12,44 -46,67* -33,62* 21,66 23,63 -9,77* 0,01*
*significativo (ANOVA, p<0,05)
66
Comparação entre excreção e consumo de ácidos orgânicos em meio
contendo azitromicina e antimoniato de meglumina
Houve diferença estatisticamente significativa (ANOVA, p<0,05) na
concentração de lactato entre o grupo tratado com azitromicina comparado
ao grupo tratado com antimoniato de meglumina. Não houve diferenças na
concentração de piruvato, citrato, succinato, fumarato, malato e
propionato quando comparados ambos os grupos avaliados (Anexo C).
Discussão
O mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes, entre eles o
antimoniato de meglumina, ainda é pouco conhecido. Acredita-se que
ocorra uma conversão do antimonial pentavalente (SbV) em antimonial
trivalente (SbIII) no interior do macrófago (Ephros et al, 1999). Na verdade
o SbV funciona como uma prodroga do SbIII que é geralmente mais tóxico
(Roberts et al, 1995). O antimônio se liga ao carboidrato formando um
complexo solúvel capaz de penetrar a célula hospedeira (Sereno et al,
1998). O tratamento com o antimoniato de meglumina, também conhecido
como antimoniato de N-metilglucamina, tem apresentado resistência
provavelmente devido à alteração na estrutura química e redução no
acúmulo no meio intracelular (Arana et al, 2001; Ouellette et al, 2004).
Observou-se nas avaliações com antimoniato de meglumina, que o declinío
da curva de crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis em
67
meio de cultura contendo este fármaco começa a ocorrer logo no início da
fase log e que, com o aumento das concentrações, este declínio ocorre mais
rapidamente (Figura 7).
No estudo realizado com azitromicina, as concentrações de
100μg.mL
-1
e 50μg.mL
-1
, apresentaram sua ação mais eficaz sobre as
formas promastigotas (Figura 8). O mesmo é observado por Krowelwcki et
al (2002), nos ensaios in vitro e in vivo. Este fármaco é um agente
antimicrobiano cuja ação consiste na inibição da síntese de proteínas, com
uma meia vida sérica de 11 a 14 horas, devido sua elevada distribuição
(Carlier et al, 1994). É utilizada no tratamento de infecções bacterianas,
fúngicas e ainda sobre protozoários como Leishmania sp, Plasmodium sp,
Toxoplasma gondii, Entamoeba sp e Giargia lamblia (Pechère, 2001; Degerli
et al, 2003). Atinge altas concentrações intracelulares quando comparada
a outros antibióticos como a penicilina e possui fatores moduladores que
podem regular esta concentração no interior das células, sendo geralmente
de dose única (Van Bambeke e Tulkens, 2001; Prata et al, 2003).
A azitromicina é uma boa opção terapêutica no tratamento das
leishmanioses, pois é bem tolerada pelos pacientes, de baixo custo e
simples administração, entretanto sua resposta é mais lenta que nos
antimoniais pentavalentes (Prata et al, 2003). Isto foi observado nas
avalições da eficácia leishmanicida realizadas quando comparadas às
curvas de crescimento entre os grupos tratados com azitromicina e
antimoniato de meglumina (Figura 8).
68
Além de processos patológicos, como a inflamação, fatores como a
diminuição do pH, podem interferir na ação da azitromicina (Bambeke e
Tulkens, 2001). A produção destes ácidos orgânicos, neste estudo sugere
que estes foram utilizados como substâncias para acidificar o meio e
permitir o crescimento e sobrevivência do parasito.
Com relação ao consumo e excreção de ácidos orgânicos, no grupo
tratado com azitromicina não houve excreção de piruvato, porém nenhuma
alteração na taxa de concentração deste ácido orgânico foi observada no
grupo tratado por antimoniato de meglumina. Este ácido participa da via
das pentoses e é clivado pela enzima piruvato quinase, uma enzima
regulatória em tripanossomatideos (Louassini et al, 1999). Esta enzima
participa do metabolismo de carboidratos destes parasitos (Cazzulo, 1992).
O consumo de piruvato nas avaliações de eficácia com azitromicina pode
significar um aumento na clivagem deste ácido, a fim de gerar mais
energia ao parasito e permitir sua sobrevivência sob essa condição
adversa.
Nas avalições da eficácia leishmanicida realizadas tanto com
azitromicina como com antimoniato de meglumina, ocorreu consumo de
citrato. Este é um ácido orgânico gerado a partir da reação de condensação
do oxaloacetato com a Acetil CoA, catalisada pela enzima citrato sintase.
Este ácido orgânico é o principal quanto a sua disponibilidade e volume de
produção durante o ciclo do ácido tricarboxílico. O citrato possui
propriedades como capacidade de acidificar o meio, funcionado como
69
tampão e ainda pode funcionar como quelante de íons metálicos, gerando
uma ação anti-oxidante e preservante (Karaffa et al, 2001).
A diminuição na taxa de concentração de malato significa que este
foi um substrato para o sistema fumarato redutase, transformado em
piruvato por ação da enzima málica e reduzido assim à fumarato e
posteriormente a succinato. A excreção deste ácido está diretamente
relacionada ao consumo de glicose e irá depender da espécie de
Leishmania e as condições do meio de cultura. Entretanto, a excreção ou
consumo de malato nas avaliações com azitromicina e com antimoniato de
meglumina não foi significativo, não havendo efetivamente uma
participação da enzima málica nesta via metabólica (Mottram e Coombs,
1985).
No grupo tratado com azitromicina houve excreção de lactato apenas
na concentração de 100μg.mL
-1
, porém não foi observado aumento na taxa
de concentração deste ácido no grupo tratado com antimoniato de
meglumina, exceto no grupo com concentração de 50μg.mL
-1
deste
fármaco. O lactato é um ácido orgânico formado a partir da
desidrogenação da molécula de glicose e dará origem dessa forma ao
piruvato (Tielens e van Hellemond, 1998). Provavelmente nos grupos
estudados a via metabólica utilizada em casos de hipóxia (Bezerra et al,
1999) não foi utlizada na presença das drogas em estudo.
O propionato foi consumido no grupo tratado com 100μg.mL
-1
de
azitromicina, porém foi excretado no grupo tratado com 10μg.mL
-1
de
70
antimoniato de meglumina. Este ácido orgânico é resultante do
metabolismo de ácidos graxos e ainda um dos principais produtos do
metabolismo do lactato (Marounek et al, 1989). Entretanto, não há relatos
na literatura sobre seu consumo ou excreção no metabolismo de
Leishmania sp.
Nas avaliações realixadas com azitromicina e antimoniato de
meglumina as maiores taxas de concentração foram observadas na
excreção de fumarato e succinato. O fumarato é um ácido orgânico gerado
pela ação da enzima succinato desidrogenase nos hospedeiros vertebrado e
invertebrado de Leishmania spp. Entretanto, no parasito a NADH
fumarato-redutase age sobre o fumarato gerando succinato, revertendo
dessa forma um ponto no ciclo do ácido tricarboxílico (Urbina, 1994;
Turrens, 2004). Nas formas promastigotas de Leishmania spp, o succinato
é um dos principais produtos gerado pelo ciclo do ácido tricarboxílico e
pela oxidação do NADH através da cadeia respiratória (Tielens e Van
Hellemond, 1998). A produção de succinato, na familia Trypanosomatidae
é realizada pela fumarato redutase. Esta enzima é homologa a succinato
desidrogenase que catalisa a reação reversa, ou seja, a oxidação do
succinato (Tielens e Van Hellemond, 1998). Os parasitos da família
Kinetoplastidae possuem uma inversão no metabolismo intermediário, ou
seja, no ciclo de ácidos tricarboxílicos, no qual há um acúmulo de
succinato, em especial nos casos onde há redução da tensão de oxigênio
(Walsh e Blum, 1992; Urbina, 1997).
71
A ação da azitromicina proporcinou uma redução no número de
formas promastigotas, em especial na concentração de 100μg.mL
-1
e
50μg.mL
-1
. Nos testes realizados com antimoniato de meglumina,
observou-se uma redução do número de parasitos logo no início da fase
estacionária, em especial nas conventrações de 100μg.mL
-1
e 50 μg.mL
-1
. A
ação da azitromicina sobre a redução do número de parasitos foi eficaz,
entretanto mais lenta que o antimoniato de meglumina.
Na detecção dos ácidos orgânicos nas amostras contendo antimoniato
de meglumina e aquelas tratadas com azitromicina, houve consumo de
citrato em ambas e de piruvato e propionato apenas nas tratadas com
azitromicina. Isto ocorreu provavelmente como uma forma do parasito dar
início ao ciclo do ácido tricarboxílico.A utilização do propionato parece
representar o metabolismo de ácidos graxos.
Ocorreu aumento nos níveis de succinato e fumarato, provavelmente
devido à inversão metabólica, sugerindo a ação da fumarato redutase, uma
enzima que catalisa a conversão de fumarato a succinato, presente nos
mebros da família Trypanosomatidae.
Hospedeiros vertebrado e invertebrado não possuem tal inversão de
metabolismo. Isso leva a indicação de um sítio metabólico com potencial
bloqueio do desenvolvimento deste parasito (Tielens e Van Hellemond,
1998).
72
Conclusões
1- A excreção e consumo de ácidos orgânicos entre o grupo sob
baixa e tensão normal de oxigênio apresentou diferenças
significativas, em especial com aumento na concentração de
succinato no meio, sugerindo que este ácido orgânico é um dos
principais produtos finais em condições de fermentação aeróbia.
2- A ação da azitromicina proporcinou uma redução no número de
formas promastigotas, em especial na concentração de 100
μg.mL
-1
e 50 μg.mL
-1
.
3- Na avaliação da eficácia realizada com antimoniato de
meglumina, observou-se uma redução do número de parasitos
logo no início da fase estacionária, em especial nas conventrações
de 100μg.mL
-1
e 50 μg.mL
-1
.
4- A ação da azitromicina foi eficaz, entretanto a curva de
crescimento da formas promastigotas de L. amazonensis declinou
mais lentamente que a curva do antimoniato de meglumina.
5- Na detecção dos ácidos orgânicos nas amostras contendo
antimoniato de meglumina e aquelas tratadas com azitromicina,
houve consumo de citrato em ambas e de piruvato e propionato
apenas nas tratadas com azitromicina. Isto ocorreu
provavelmente como uma forma do parasito utilizar estes ácidos
oegânicos como substratos para dar início ao ciclo do ácido
73
tricarboxílico e ainda participação do propionato no metabolismo
de ácidos graxos.
6- Ocorreu aumento nos níveis de succinato e fumarato,
provavelmente devido à inversão metabólica, sugerindo a ação da
fumarato redutase, uma enzima que catalisa a conversão de
fumarato a succinato, presente nos mebros da família
Trypanosomatidae.
74
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82
ANEXO A
Reagentes e substâncias usadas para análises no CLAE.
Substâncias Fabricante
Piruvato Sigma P2256
Lactato Sigma L1750
Oxalato ECIBRA 76508720/001
Citrato Dinâmica L15460
-cetoglutarato Sigma K1128
Succinato Casa Americana
Fumarato MERCK 800269
Malato Sigma 202-601-5
Propionato VETEC L048050
Ácido sulfúrico 0,5mMol/L MERCK 9072
Ácido clorídrico MERCK 9058
83
ANEXO B
Fórmulas utilizadas para o cálculo das concentrações dos ácidos orgânicos
detectados pelo cromatógrafo.
Fator de capacidade– valor de K (Wert) (caracterização do pico)
K = Tempo de retenção da amostra -1
Tempo de retenção do eluente
Fator de referência ou fator de resposta – FR
FR = Concentração (mMol/L)
[ ] absoluta = FR x Área
Área (mvolts x segundos)
Fator de correção do Recovery (recuperação no bond elut)
Fator de correção = Concentração bond elut
do Recovery Concentração sem bond elut
Fator de diluição
1º. Passo: proporção → Volume amostra (extração) x volume injetado
Volume do H
2
SO
4
(extração)
2º. Passo: [ ] absoluta (mMol/L) em proporção
3º. Passo: fator de diluição = K total
K calculado
K calculado = [ ] absoluta (FR x área)
K total =
[ ] absoluta mMol/L x 1 1
1000 mL proporção mL
Concentração final
[ ] final = área do pico x FR x fator de diluição x fator de correção do
recovery
84
ANEXO C
Excreção e consumo de ácidos orgânicos em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob distintas tensões de oxigênio.
-30
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
Fases de cresimento e Tensões de oxigênio
Piruvato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 1. Excreção e consumo de piruvato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa
de oxigênio no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase
log e estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
85
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
Fases de crescimento e Tensões de oxigênio
Citrato (X10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 2. Consumo de citrato em formas promastigotas de Leishmania
amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa de oxigênio
no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase log e
estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
86
0
20
40
60
80
100
120
Fases de crescimento e Tensões de oxigênio
Succinato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 3. Excreção de succinato em formas promastigotas de Leishmania
amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa de oxigênio
no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase log e
estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
87
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
Fases de Crescimento e Tensões de Oxigênio
Fumarato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 4. Excreção e consumo de fumarato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa
de oxigênio no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase
log e estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
88
-400
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
100
Fases de Crescimento e Tensões de oxigênio
Malato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 5. Excreção e consumo de malato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa
de oxigênio no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase
log e estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
89
-4
-3
-2
-1
0
1
2
Fases de Crescimento e Tensões de oxigênio
Lactato (x10-7mMol.mL
-1
)
Figura 6. Excreção e consumo de lactato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa
de oxigênio no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase
log e estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
90
-20
0
20
40
60
80
100
120
Fases de Crescimento e Tensão de oxigênio
Propionato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
Figura 7. Excreção e consumo de propionato em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob condições em tensão normal e tensão baixa
de oxigênio no meio de cultura, em diferentes fases de crescimento (fase
log e estacionária) (p<0,05). Legenda: A- fase log e sob tensão normal de
oxigênio; B- fase estacionária e sob tensão normal de oxigênio; C- fase log
e sob tensão baixa de oxigênio; D- fase estacionária e sob tensão baixa de
oxigênio (n=3).
91
ANEXO D
Excreção e consumo de ácidos orgânicos em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação de azitromicina e distintas tensões de
oxigênio.
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Piruvato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 1. Excreção e consumo de piruvato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
92
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Citrato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 2. Excreção e consumo de citrato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
93
0
50
100
150
200
250
300
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Succinato (x10
-7
mMol.mL
-1
)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 3. Excreção de succinato em diferentes estágios de crescimento das
formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase log e estacionária),
tensões de oxigênio distintas e sob diferentes concentrações de
azitromicina (p<0,05).
94
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Fumarato (x10-7mMol.mL
-1
)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 4. Excreção e consumo de fumarato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
95
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Citrato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 5. Excreção e consumo de malato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
96
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Lactato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 6. Excreção e consumo de lactato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
97
-200
-150
-100
-50
0
50
100
150
200
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de azitromicina
Propionato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 7. Excreção e consumo de propionato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), tensões de oxigênio distintas e sob diferentes
concentrações de azitromicina (p<0,05).
98
ANEXO E
Excreção e consumo de ácidos orgânicos em formas promastigotas de
Leishmania amazonensis sob ação de antimoniato de meglumina e
distintas tensões de oxigênio.
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Piruvato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 1. Excreção e consumo de piruvato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
99
-350
-300
-250
-200
-150
-100
-50
0
50
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Citrato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 2. Excreção e consumo de citrato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
100
-50
0
50
100
150
200
250
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Succinato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 3. Excreção de succinato em diferentes estágios de crescimento das
formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase log e estacionária),
em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes concentrações de
antimoniato de meglumina (p<0,05).
101
-10
0
10
20
30
40
50
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Fumarato (x10-7mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 4. Excreção e consumo de fumarato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
102
-500
-400
-300
-200
-100
0
100
200
300
400
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Malato(x10-7mMol/mL)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 5. Excreção e consumo de malato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
103
-50
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Piruvato (x10
-7
mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 6. Excreção e consumo de lactato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
104
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
100
120
0ug/mL 10 ug/mL 50ug/mL 100ug/mL
Concentração de antimoniato de meglumina
Propionato(x10-7mMol/ml)
fase log sob tensão normal de oxigênio fase estacionária sob tensão normal de oxigênio
fase log sob tensão baixa de oxigênio fase estacionária sob tensão baixa de oxigênio
Figura 7. Excreção e consumo de propionato em diferentes estágios de
crescimento das formas promastigotas de Leishmania amazonensis (fase
log e estacionária), em diferentes tensões de oxigênio e sob diferentes
concentrações de antimoniato de meglumina (p<0,05).
105
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
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