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Ligia Buloto Schmitd
Dissertação apresentada à Faculdade
de Odontologia de Bauru da
Universidade de São Paulo como
parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Odontologia, área
de Estomatologia.
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA
REABSORÇÃO ÓSSEA PERIODONTAL
POR MEIO DE VALOR DE PIXEL E
COMPARAÇÃO COM ANÁLISE
HISTOPATOLÓGICA
BAURU
2005
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Ligia Buloto Schmitd
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru da Universidade de
São Paulo como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Odontologia, área de Estomatologia.
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA REABSORÇÃO ÓSSEA
PERIODONTAL POR MEIO DE VALOR DE PIXEL E
COMPARAÇÃO COM ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA
Orientadora: Profa. Dra. Izabel Regina
Fischer Rubira-Bullen
BAURU
2005
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Schmitd, Ligia Buloto
Sc56a Avaliação radiográfica da reabsorção óssea
periodontal por meio de valor de pixel e comparação com
análise histopatológica / Liga Buoto Schmitd. – Bauru, 2005.
98p.: il.; 30cm
Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Odontologia de
Bauru, USP
Orientadora: Profa. Dra. Izabel Regina Fischer Rubira -
Bullen
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a
reprodução total ou parcial desta dissertação, por processos
fotocopiadores e outros meios eletrônicos.
Assinatura:
Comissão de Ética no Ensino e Pesquisa com Animais da FOB
Protocolo nº 01/2004
Data: 04 de fevereiro de 2004.
ii
iii
Ligia Buloto Schmitd
24 de setembro de 1979
Cachoeiro de Itapemirim - ES
Nascimento
1997 - 2000
Curso de Odontologia -
Faculdade de Odontologia de
Bauru, USP
2001 - 2003
Curso de Aprimoramento em
Câncer Bucal no Centro de
Tratamento e Pesquisa
Hospital do Câncer A. C.
Camargo, São Paulo, SP
2003 - 2005
Mestrado em Estomatologia na
Faculdade de Odontologia de
Bauru, USP
Associações
Sociedade Brasileira de
Estomatologia – SOBE
Sociedade Brasileira de
Pesquisa Odontológica –
SBPqO
Associação Paulista de
Cirurgiões-Dentistas - APCD
iv
Dedicatória
Ao meu pai e à minha mãe
Dedico esta dissertação às pessoas
que me ensinaram, com seus exemplos,
o valor do trabalho.
v
"Sinto-me nascido a cada momento para a eterna novidade do mundo..."
"Porque conhecer é como nunca ter visto pela primeira vez,
E nunca ter visto pela primeira vez é só ter ouvido contar"
(...)
"Porque eu sou do tamanho do que vejo
E não do tamanho da minha altura ...
...porque a nossa única riqueza é ver."
( Alberto Caeiro – heterônimo de Fernando Pessoa)
vi
Agradecimentos
A Deus, agradeço por ter saúde, e por ter sempre colocado pessoas
maravilhosas em meu caminho.
Agradeço à minha família, pelo apoio incondicional. Ao meu pai e à minha
mãe, por nunca dizerem não aos meus sonhos e por todo o investimento pessoal que
fizeram durante os vários anos de distanciamento. Ao meu irmão, pelo exemplo e
companheirismo.
Ao meu amor Rodrigo, por ser essa pessoa especial, a quem confio minha
vida e com quem compartilho minhas angústias, meus anseios e os momentos mais
felizes de uma vida que passarei ao seu lado.
Aos amigos Ana Raquel Benetti, Carla Ruffeil Moreira, Angélica
Hannas, pela ajuda sem questionamentos, pela compreensão nos momentos difíceis.
À minha orientadora, por me incentivar e ensinar, na vida acadêmica e na
vida pessoal. Por confiar e apoiar minhas idéias desde o nosso primeiro contato.
Aos amigos que estão distantes, em especial ao Felipe Ladeira Pereira,
pela amizade incondicional e ao Ricardo H. Suzuki, por ter sido amigo e
“professor”.
Aos meus colegas de Pós-graduação. A todos eles, pelo companheirismo no
trabalho e também pelos momentos de descontração e boa convivência. Em especial,
à Carla, à Etiene, ao Renato, ao Augusto, à Ana Raquel, ao Adilson, à Angélica, à
Cássia, ao Marcelo Zanda, à Márcia, pela participação direta e indireta neste
trabalho.
vii
À Camila de Oliveira Rodini, pela ajuda incomensurável na metodologia
deste trabalho. Sua prestatividade e desprendimento em ensinar o que batalhou para
aprender sozinha demonstram a grande pessoa que você é. Obrigada.
Ao Professor Gerson Francisco de Assis pela valiosa orientação.
Aos professores do Departamento de Estomatologia. Dr José Humberto
Damante. Dr Luiz Eduardo M. Chinellato, Dra Ana Lúcia A. Capelozza, Dr Osny
Ferreira Júnior, Dr. Eduardo Sant’Ana, e a todos os outros que durante toda a
minha vida contribuíram para minha formação com seus ensinamentos preciosos. Ao
Marcos Martins Curi, pelos valiosos ensinamentos e amizade.
Ao Professor Roberto Pereira Lauris, pelo grande auxílio na estatística
deste trabalho.
Aos funcionários do Departamento de Estomatologia: Marília Gião,
Fernanda Aparecida Daniel Cavalari, Josieli Aparecida Tripodi Farinha, Roberto
Ponce Salles, Camila Medina, aos mirins Tânia, David e Reinaldo, e a todos os
outros funcionários da FOB, que, sempre tão prestativos e amigos, engrandecem
nossos dias nesta casa.
À Daniele Santin Ceolin, à Tânia Mary Cestari e demais funcionários do
Departamento de Histologia. A seriedade, competência e amizade destas pessoas
faz do departamento de Histologia da FOB um lugar especial. Meu muito obrigado
pelos momentos agradáveis de convivência.
Aos funcionários do Biotério da Faculdade de Odontologia de Bauru,
pela cooperação e prestatividade.
À equipe do LAPIMO, da USP de São Carlos, em especial ao aluno de
pós-graduação Maurício Escarpinati, por estar sempre disposto a ajudar e
esclarecer.
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................ x
1 INTRODUÇÃO.................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 5
2.1 Imagem digital.................................................................................. 6
2.2 Radiografia digital – placa fotoestimulável (fósforo)........................ 8
2.3 Radiografia digital indireta – scanner a laser................................... 10
2.4 A utilização do valor de pixel como ferramenta diagnóstica............ 12
2.5 Indução de doença periodontal em ratos......................................... 22
3 PROPOSIÇÃO.................................................................................... 26
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 28
4.1 Grupos experimentais...................................................................... 29
4.2 Material............................................................................................ 30
4.3 Preparo dos animais / indução de doença periodontal.................... 31
4.4 Obtenção das peças cirúrgicas........................................................ 32
4.5 Obtenção das imagens radiográficas............................................... 34
4.6 Procedimentos histotécnicos........................................................... 37
4.7 Análise dos valores dos pixels......................................................... 38
4.8 Análise histopatológica.................................................................... 41
4.9 Análise estatística............................................................................ 45
5 RESULTADOS.................................................................................... 47
5.1 Análise das imagens obtidas no sistema Digora............................. 50
5.2 Análise das imagens digitais indiretas............................................. 55
5.3 Análise histopatológica.................................................................... 58
6 DISCUSSÃO....................................................................................... 70
6.1 Análise radiográfica.......................................................................... 71
6.2 Análise histopatológica.................................................................... 78
6.3 Novas pesquisas.............................................................................. 82
7 CONCLUSÕES................................................................................... 83
ANEXOS................................................................................................ 85
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................... 86
ABSTRACT............................................................................................ 98
RESUMO
Avaliar radiograficamente a reabsorção óssea periodontal por meio do
valor de pixel e sua comparação com o exame histopatológico foi o objetivo
deste trabalho. Trinta ratos Wistar foram submetidos à indução de doença
periodontal com fio de seda 3-0 ao redor do primeiro molar inferior direito e o
lado esquerdo foi deixado como controle. O grupo 1 foi sacrificado após
passados 7 dias, o grupo 2, após 14 dias e o grupo 3 após 28 dias. As
hemimandíbulas dos 30 animais foram radiografadas em filmes radiográficos
tamanho 2 e na placa fotoestimulável de fósforo do sistema Digora®. As
radiografias convencionais foram digitalizadas em um scanner a laser. As
peças foram processadas para cortes microscópicos e coradas em HE para
análise. As médias dos valores dos pixels das áreas de doença e das áreas
controle foram aferidos no programa ImageJ®. O teste ANOVA a dois
critérios mostrou que os valores dos pixels das áreas de doença periodontal
foram significantemente menores do ponto de vista estatístico, quando
comparados às áreas de controle, tanto para as radiografias obtidas com o
sistema Digora®, quanto para as digitalizadas. No entanto, a ANOVA a um
critério das médias dos valores dos pixels das áreas de doença periodontal
não mostrou diferença estatisticamente significante entre os diferentes
períodos experimentais. A análise microscópica evidenciou perda óssea,
com aumento de osteoclastos e diminuição da altura da crista óssea alveolar
com o passar do período experimental. Como conclusão, a análise do valor
de pixel de uma radiografia digital foi capaz de evidenciar perda óssea
quando comparada com seus controles, mas falhou ao detectar as
alterações ósseas progressivas que foram visualizadas microscopicamente.
x
Introdução
2
1 INTRODUÇÃO
A avaliação de pequenas alterações de mineralização no osso de
suporte alveolar é importante para o diagnóstico precoce da doença
periodontal, para o planejamento, direcionamento e acompanhamento das
terapias empregadas. O método diagnóstico preconizado na prática
periodontal seria a sondagem do sulco gengival com sonda milimetrada
associada ao exame radiográfico. A radiografia é indispensável no exame
periodontal, por fornecer informações essenciais sobre o tecido ósseo, que
não pode ser avaliado de maneira clínica
67
.
Apesar de o exame radiográfico convencional ser a principal
ferramenta para a avaliação da destruição óssea periodontal, ainda deixa a
desejar por causa de sua baixa sensibilidade e alta discordância inter-
examinadores. ORTMAN, McHENRY, HAUSMANN
53
, em 1982,
demonstraram que seria necessária uma perda óssea de 30 a 60% para que
esta fosse detectada radiograficamente. Outros estudos demonstraram que
a radiografia convencional seria incapaz de detectar perdas de osso
3
medular. A destruição óssea só seria detectada quando a espessura da
cortical ou ao menos a junção entre osso medular e cortical fosse afetada
5, 6,
13, 61
.
Um procedimento radiográfico ideal deveria proporcionar a coleta de
informações quantitativas sobre uma alteração óssea. A obtenção de dados
radiográficos objetivos torna-se ainda mais importante em periodontia,
porque a progressão da doença periodontal é lenta e as diferenças de
mineralização óssea visualizadas em duas radiografias subseqüentes
poderiam ser muito sutis
28
.
Com os avanços na radiologia médica e odontológica, imagens
puderam ser transformadas do formato analógico para o digital, permitindo
uma gama enorme de ferramentas de manipulação e quantificação,
armazenamento e transmissão digital de imagens. Esta evolução aproximou
o exame radiográfico do que seria considerado ideal, no qual imagens
podem ser manipuladas para melhorar a aparência, diminuindo a
necessidade de repetições. Ainda, podem ser submetidas a operações
matemáticas, como mensuração de distâncias lineares, de ângulos, cálculo
de volume e determinação do valor de pixel, na tentativa de tornar objetiva a
análise
45, 47
.
A mensuração do valor de pixel em radiografias digitais poderia
contribuir na detecção de alterações ósseas, mesmo que estas sejam
bastante sutis. Os estudos clínicos sobre a avaliação dos valores de pixel
são em sua maioria na área de endodontia, e as diferentes metodologias
4
empregadas dificultam um parecer conclusivo sobre a utilização deste
método na clínica diária. O assunto está ainda aberto para novas
investigações, e há fortes indícios de que esta ferramenta de análise seja
bastante útil na detecção radiográfica de alterações periapicais, mesmo nos
casos de pulpites
57
.
Na doença periodontal, espera-se que ocorram pequenas mudanças ósseas
na crista alveolar em períodos de acompanhamento curtos
29, 44
. Seria óbvia,
portanto, a importância de se obter uma forma de avaliação bastante
sensível em periodontia. A necessidade de meios diagnósticos cada vez
mais acurados e sensíveis se faz presente pela constante busca por
mecanismos preventivos ou curativos cada vez menos invasivos, no intuito
de minimizar o impacto do tratamento empregado.
Revisão de
Literatura
6
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Imagem digital
Enquanto a radiografia convencional é formada por um arranjo de
cristais de prata sobre uma emulsão, a imagem digital é formada por pixels,
que são os pontos da imagem. Cada pixel contém uma informação sobre a
cor ou nível de cinza ao qual corresponde para formar a imagem
3, 21
(figura
2.1).
Os computadores trabalham com sistemas de dois dígitos, ou seja,
sistema binário (binary digits = bits), no qual os elementos gráficos são
representados pelos algarismos 0 (zero) ou 1. Texto, imagem e som são
escritos como elementos binários e cada pixel recebe uma determinada
seqüência de zero e “1”, correspondente à cor, intensidade do brilho ou
luminescência do sinal captado. Em um sistema que trabalha com 8 bits,
cada pixel corresponde a uma combinação de oito algarismos, chegando a
256 possíveis combinações de 0 e 1. Essas 256 combinações, em uma
imagem não colorida, correspondem a 256 níveis de cinza, onde zero seria o
7
preto e 255 representaria o branco
69, 73
. Em radiologia, então, zonas mais
radiolúcidas teriam valor de pixel mais próximo de zero e zonas mais
radiopacas estariam localizadas numa faixa mais próxima ao 255.
FIGURA 2.1: A: Imagem radiográfica digital. B: Subseção da imagem A. C:
Valores dos pixels correspondentes da imagem B. A imagem B foi ampliada
para evidenciar as diferenças de tons de cinza entre os pixels (fonte:
ANALOUI, M.
3
, 2001)
Em sistemas de 12 bits, esse número de combinações de 0 e 1 sobe
para 4096, representando uma maior variação de tons de cinza. Isso
8
significa que o sistema consegue discriminar mais tons de cinza entre o
preto e o branco. As imagens com finalidades odontológicas normalmente
trabalham com 8 bits, mas as imagens de ressonância magnética são
obtidas em sistemas de 12 bits
21, 39
.
2.2. Radiografia digital – placa fotoestimulável de fósforo
As placas fotoestimuláveis de fósforo estão disponíveis para aquisição
de imagens radiográficas digitais diretas na radiologia médica há cerca de 2
décadas e foram originalmente desenvolvidas por Fuji Photo Film (Tokyo,
Japan). Essas placas de fósforo são sensíveis à luz e funcionam como uma
espécie de “filme reutilizável”. Quando a placa é exposta, os fótons de
energia da radiação X absorvida ficam armazenados em uma camada
halogenada da placa, formando a imagem latente. Quando a placa é
descarregada no sistema, ou seja, escaneada por um laser de hélio e neônio
(He-Ne), os dados são emitidos em forma de luz. Essa luz é captada por
sensores do scanner e convertida para o modo digital, então a informação é
armazenada na forma digital
21, 30, 69, 70
.
A placa é formada por uma base de poliéster impregnada por flúor,
bário e európio ativado (BaFBr:Eu
2+
), revestida por halógenos cristalinos.
Esses componentes são sensíveis à luz, e quando um fóton de radiação
incide sobre eles, elétrons excitados são aprisionados na camada de cristais
9
de fósforo, formando íons. Quando os cristais de fósforo são irradiados por
uma segunda fonte, os elétrons aprisionados são liberados e recombinados.
É a energia dessa recombinação que emite a luz que é posteriormente
convertida para sinal elétrico
35
.
A placa de fósforo é sensível à luz visível e deve ser protegida até a
sua leitura. Após a leitura, uma pequena quantidade de energia residual
permanece depositada sobre a placa. Essa energia é removida pela
exposição a uma luz halógena intensa, preparando a placa para uma nova
exposição à radiação.
O primeiro sistema odontológico de radiografia digital direta utilizando
placas de fósforo foi o Digora (Orion / Soredex, Helsinki, Finland), presente
até hoje no mercado, com atualizações desde o seu lançamento
66, 74
. Esse
sistema possui placa de fósforo nos tamanhos 22 x 31 mm; 24 x 40 mm; 31
x 40 mm e 27 x 54 mm. Suas características de imagem e sua utilização
clínica foram bem descritas na literatura
66
.
No sistema Digora mais atual, as imagens são armazenadas em 14
bits, com dói diferentes tamanhos de pixel disponíveis: 40 e 64µm
17
. O
tamanho do pixel das imagens obtidas na versão do Digora utilizada neste
trabalho é de 70 µm e a obtenção é de 8 bits
4
. Sua resolução espacial foi
menor quando comparada aos sistemas digitais RVG-4®, CDR® e Dixel®,
todos com captura por meio de CCD (Charge Coupled Device), por ARAKI,
ENDO, OKANO
4
, em 2000. Neste mesmo estudo, o Digora demonstrou
possuir a latitude mais ampla entre os 4 sistemas avaliados.
10
Por causa da ampla latitude que as placas de fósforo
apresentam, podem promover imagens de qualidade com uma grande
variação de tempos de exposição
30
. Em imagens odontológicas não há
necessidade de uma latitude muito grande e uma adaptação foi feita
calibrando o sistema baseando-se na maior dose de radiação a ser utilizada.
O objetivo da calibração é fazer com que as imagens obtidas no Digora
tenham um equilíbrio na escala de cinza e brilho
30, 66
.
A calibração deve ser realizada sempre antes da primeira tomada
radiográfica, para adaptar o scanner ao nível de exposição, ajustando o seu
mecanismo de leitura
30
. Além disso, o scanner deve estar calibrado para o
nível de exposição mais alto a ser utilizado, permitindo uma exposição
efetiva de 10% a 100% da exposição da calibração
66
. No entanto as doses
muito baixas de radiação podem causar aumento de ruído, independente da
dose utilizada na calibração
30
.
2.3. Radiografia digital indireta – scanner a laser
O uso dos scanners em radiologia odontológica tem crescido
principalmente por ser uma opção de digitalização radiográfica de menor
custo que os sistemas para radiografia digital direta.
Os scanners possuem uma fonte de luz em forma de linha que varre
o objeto a ser digitalizado e mede a quantidade de luz refletida ou
11
transmitida em cada ponto. A luz captada é convertida em um sinal elétrico e
este sinal é posteriormente digitalizado
20
. Esses equipamentos podem
utilizar basicamente três tecnologias de imagem: CCD (charge coupled
device), PMT (tubos fotomultiplicadores) ou laser
14
.
HANGIANDEROU, O’CONNOR, FELMLEE
27
, em 1998, relataram que
os scanners a laser sempre produziram imagens de melhor qualidade que os
com CCD. DAVIDSON et al.
14
, no ano de 2001, avaliaram um scanner à
laser (Lumisys 75), um scanner CCD e duas câmeras digitais em relação à
qualidade da imagem original e da imagem corrigida por 10 radiologistas. As
imagens obtidas pelos dois scanners foram preferidas pelos radiologistas.
Analisando o contraste obtido pelos quatro equipamentos, o scanner a laser
obteve a curva sensitométrica mais perfeita, mas forneceu valores maiores
aos ideais nas regiões de maior densidade.
ESCARPINATI, VIEIRA, SCHIABEL
20
, em 2002, compararam a curva
característica de filmes convencionais mamográficos em dois scanners a
laser. Esses equipamentos calcularam o nível de cinza de cada ponto,
multiplicando a sua densidade óptica por 1000. Para os dois scanners houve
diferença em relação à curva ideal, e os autores propuseram um algorítimo
de correção para calibração dos scanners.
OHKI, OKANO, NAKAMURA
50
, em 1994, relataram que o processo
de digitalização seria muito importante para que não houvesse perda de
informação nas densidades maiores, como a radiolucidez discreta das cáries
proximais incipientes. Segundo FULTON
22
, a escolha da dpi a ser utilizada é
12
o fator mais crítico no uso do scanner. Em um scanner com especificação
de, por exemplo, 1200x2400 dpi, o menor número corresponde à resolução
óptica. Uma resolução maior que a óptica pode ser obtida pelo scanner,
porém esta será sempre interpolada, ou seja, feita pelo programa. A
interpolação significa calcular valores que ocorrem entre dois valores
conhecidos, acrescentando assim nova informação à imagem.
2.4. A utilização do valor de pixel como ferramenta diagnóstica
Alcance dinâmico (dynamic range) é o termo que define a quantidade
possível de tons de cinza que um pixel poderia exibir
59
. O filme radiográfico
convencional apresenta alcance dinâmico maior que o das radiografias
digitais com aquisição em 8 bits, ou seja, maior que 256. No entanto, o olho
humano tem uma capacidade pequena de distinção entre essas nuances de
cinza.
O olho humano conseguiria discriminar cerca de 16 a 24 tons de
cinza, segundo FARMAN, SCARFE
21
, em 1994. Portanto, as imagens
obtidas em 8 ou 12 bits ultrapassam a capacidade de detecção visual
humana.
Discute-se na literatura qual seria a utilidade de sistemas com
alcance dinâmico que ultrapassa a capacidade visual humana. A obtenção
de imagens com grande distinção de níveis de cinza poderia ser útil por três
13
motivos: 1 - transformar as nuances de cinza em cores, pois o olho humano
pode distinguir cerca de duas mil cores diferentes; 2 - mensurar tons de
cinza, determinando um valor numérico que expresse, no caso de
radiografias, perda ou ganho ósseo; 3 - realçar determinada faixa de tons de
cinza em detrimento de outra (janelas)
59
.
A mensuração de tons de cinza seria mais sensível que a análise
visual, pois no momento em que se determina a correspondência numérica
dos pixels, diferenças mais sutis poderiam ser percebidas, antes mesmo que
fossem perceptíveis aos olhos
58, 59
. Na tentativa de validar essa hipótese,
diferentes trabalhos foram realizados com diferentes metodologias, descritos
nesta revisão.
No ano de 1990, ØRSTAVIK et al.
51
avaliaram a eficácia de um
sistema computadorizado de análise de imagem existente no mercado
(Kontrom IBAS 2000®). Dentre outros fatores, avaliaram eficácia na análise
automatizada do valor de pixel na diferenciação entre áreas saudáveis e
áreas de lesão periapical em radiografias de tratamentos endodônticos em
humanos. Para tal, utilizaram digitalização de radiografias convencionais. As
áreas de lesão periapical foram delimitadas e uma área de osso saudável de
tamanho semelhante ao redor de cada lesão foi igualmente marcada. Os
resultados foram expressos pela razão entre as médias dos valores dos
pixels das duas áreas. Nos casos em que houve cicatrização da lesão,
houve aumento da razão, o que significou, segundo os autores, uma
14
deposição de material mineral. De forma semelhante, as lesões que não
tiveram melhora não mostraram mudanças nesta razão ao logo do tempo.
YOSHIURA, OHKI, YAMADA
78
, em 1991, analisaram sialografias de
ratos portadores de sialoadenite na tentativa de avaliar a eficácia da
medição do valor de pixel no diagnóstico da doença glandular. O histograma
na escala de 8 bits foi obtido, com valores variando entre 0 e 255 para cada
sialografia. Esses valores foram divididos em 5 faixas para análise: 0-15; 16-
31; 32-79; 80-127 e 128-255. Seus resultados justificaram a utilização futura
do histograma como ferramenta diagnóstica em avaliação de sialoadenite,
por encontrar diferenças de histograma entre glândulas saudáveis e
doentes.
DUBREZ et al.
18
, em 1992, compararam a densidade óssea medida
por dois métodos: fotodensitometria e análise do valor de pixel. Utilizaram
radiografias padronizadas obtidas antes e depois de tratamentos
periodontais em 8 pacientes. Após a fotodensitometria, as radiografias foram
digitalizadas em um sistema de aquisição de 12 bits (4096 valores de pixel).
Um penetrômetro de alumínio foi utilizado para correção do valor de pixel.
Os autores concluíram que as duas técnicas são equivalentes na
evidençiação de evolução de patologias periodontais.
A diferenciação entre cistos e granulomas pela análise do valor de
pixel da imagem radiográfica foi proposta por SHROUT, HALL,
HILDEBOLT
63
, em 1993. Radiografias de arquivo de 10 lesões com
diagnósticos histopatológicos de cistos e granulomas foram digitalizadas em
15
um sistema de aquisição de 8 bits. As regiões de interesse foram
demarcadas nas áreas de lesão, e os histogramas destas áreas foram
analisados. Uma região de controle na área e dentina foi demarcada, para
corrigir as diferenças de tempo de exposição e processamento radiográfico
que ocorreram devido à não padronização das radiografias. Os resultados
comprovaram a melhora na discriminação entre cistos e granulomas pelo
histograma, e os autores sugerem que a análise por ferramentas digitais
pode ser útil em diferenciar lesões que visualmente são indistinguíveis.
No ano seguinte, WHITE et al.
75
encontraram ausência de
diferenciação radiográfica entre cistos e granulomas, quando realizada
análise do valor de pixel destas lesões. Num estudo semelhante ao de
SHROUT, HALL, HILDEBOLT
63
, os autores coletaram 55 lesões periapicais,
num total de 15 cistos e 40 granulomas com confirmação histopatológica. As
radiografias foram digitalizadas em 8 bits e submetidas ao algorítimo de
correção de RUTTIMANN, WEBBER, SCHMIDT
56
para minimizar as
diferenças de processamento radiográfico. O histograma das áreas de lesão
foi obtido pelo software NIH Image®. A mediana dos valores dos pixels foi
utilizada para comparação e não houve diferença estatisticamente
significativa entre os cistos e granulomas. Da mesma maneira, o valor de
pixel não teve correlação com o tamanho das lesões.
Em 1997, KEROSUO, ØRSTAVIK
38
avaliaram a reprodutibilidade da
análise do valor de pixel em lesões periapicais, em comparação a um
método visual, utilizando como padrão ouro o Índice Periapical
52
. Para tal, 62
16
pacientes foram avaliados radiograficamente no começo do tratamento
endodôntico e consecutivamente nos períodos experimentais de 1, 3, 6, 12 e
24 meses. A primeira radiografia da série foi utilizada para delimitar a lesão e
uma área de osso normal ao redor da lesão, para comparação com as
radiografias subseqüentes. A metodologia utilizada para avaliação do valor
de pixel foi a mesma utilizada em estudo anterior de ØRSTAVIK et al.
51
. O
método se mostrou reproduzível intra-examinador, mas a correlação inter-
examinadores variou de pobre a moderada. Para as lesões mais avançadas,
a sensibilidade do método foi de 61% e a especificidade 79%. No entanto,
para as lesões menos severas, a especificidade foi menor, na ordem de
55%. Os autores concluíram que o método de análise de imagem descrito
parece ser uma ferramenta apropriada na detecção de alterações ósseas em
radiografias odontológicas.
DELANO et al.
15
, em 1998, estudando métodos objetivos de avaliação
radiográfica do tratamento de periapicopatias, induziram e trataram lesões
periapicais em cachorros. Foram analisadas 33 raízes tratadas,
comparando-se o aspecto inicial ao acompanhamento de 6 meses. As
radiografias foram digitalizadas em 8 bits. As imagens obtidas foram
submetidas à subtração radiográfica digital após a correção gama e
analisadas por oito métodos de radiometria. Alguns destes métodos levaram
em consideração a radiografia original, sem correção. O padrão-ouro foi
obtido pela morfometria dos tecidos após 6 meses. Dentre os métodos de
radiometria por valor de pixel nas imagens originais, os autores avaliaram a
mudança na razão entre as médias dos valores dos pixels de periapicopatias
17
e regiões de osso normal, comparando o inicial e o controle de 6 meses
(CH-R) . Seus resultados mostraram que a CH-R não se correlacionou
positivamente com a morfometria, mas teve correlação com um dos índices
(AP-SUB) obtidos pela subtração digital. A AP-SUB, por sua vez, teve
correlação com a morfometria. Com base nestes resultados, os autores
concluíram que a avaliação do valor de pixel em radiografias originais, sem
métodos de correção pode ser um indicador de densidade eficaz e
reproduzível, assim como as medidas de valor de pixel obtidas em imagens
subtraídas que passaram por correção gama.
Um estudo realizado por SARMENTO, RUBIRA
60
, em 1998, avaliou
289 radiografias periapicais de arquivo, de dentes com diagnóstico clínico de
pulpite, necrose ou considerados sadios. As radiografias foram digitalizadas
pelo sistema DentScan DentView® e as médias dos valores dos pixels das
regiões apicais foram medidas. Os resultados evidenciaram que os dentes
normais apresentavam valores superiores quando comparados aos dentes
com pulpite, e estes, por sua vez, apresentavam valores superiores aos
dentes com necrose pulpar. Isso poderia ser explicado pelo fato de
alterações teciduais já estarem presentes no tecido periapical antes da
completa mortificação pulpar, e a ferramenta de análise ter sido capaz de
captar essas alterações mesmo antes que a percepção visual pudesse
detectá-las.
A diferenciação entre materiais restauradores resinosos pela medida
de valor de pixel foi tentada por GÜRDAL, AKDENIZ
26
, em 1998.
18
Radiografaram, na mesma película, discos construídos com 9 materiais
resinosos diferentes, amálgama, tecido dentário humano cariado e hígido e
um penetrômetro de alumínio. As radiografias foram digitalizadas em 8 bits e
salvas no formato TIFF. As densidades ópticas dos materiais foram medidas
nas radiografias convencionais e as médias dos valores dos pixels nas
radiografias após digitalização. Os resultados evidenciaram maior eficácia do
sistema digital em avaliar as diferentes radiopacidades dos materiais. A
análise por valor de pixel melhorou a discriminação entre os materiais e a
dentina, sugerindo que este método deva ser utilizado na prática clínica para
diferenciação entre pequenas radiopacidades.
A qualidade da obturação do canal radicular por meio da análise do
valor de pixel foi estudada por SARMENTO et al.
58
, em 1998. Sessenta
caninos superiores foram obturados por três técnicas diferentes e
radiografados no sistema Digora. As médias dos valores dos pixels dos
materiais endodônticos foram mensuradas. Os resultados mostraram haver
diferenças nos padrões dos valores dos pixels dos métodos de obturação
estudados, avaliando assim a qualidade do tratamento endodôntico
empregado.
Em 2000, SOUTHARD et al.
64
estudaram a relação entre a densidade
dos processos alveolares maxilar e mandibular e a densidade do esqueleto
sistêmico. Realizaram radiografias periapicais de 41 mulheres com idades
entre 20 e 78 anos e avaliação por densitometria óssea de seus esqueletos
sistêmicos. As radiografias foram escaneadas em 8 bits e um algorítimo de
19
correão de densidade baseado em um penetrômetro de alumínio foi utilizado
para corrigir variações de exposição e processamento radiográfico. Esse
algorítimo já havia sido previamente testado pelos próprios autores no ano
anterior
65
. As regiões de interesse foram demarcadas no osso alveolar e a
densidade do local, baseada no valor de pixel do alumínio, foi aferida. Os
autores encontraram correlação entre a densidade do osso alveolar e a
densidade do esqueleto medida por densitometria óssea.
O valor de pixel periapical de molares de rato com pulpite e necrose
pulpar foi avaliado por SARMENTO
57
em 2000. Para confirmar o estado
pulpar e avaliar a reabsorção de osso periapical, foi realizada análise
microscópica. As mandíbulas de rato foram radiografadas no sistema
digital direto Digora após 2 e 30 dias do procedimento de abertura pulpar
no primeiro molar inferior direito dos animais. O grupo controle consistiu
da análise do periápice de dentes sadios dos mesmos animais. As regiões
de intesesse foram demarcadas no periápice dos dentes sadios e dentes
testados e o valor de pixel foi solicitado no programa IP Tooth® (LISA,
CPE, UCB, Lyon, França). Os resultados evidenciaram uma menor média
e maior coeficiente de variação dos valores dos pixels apicais dos dentes
com pulpite e com necrose pulpar quando comparados aos dentes sadios,
indicando a possibilidade de detectar alterações ósseas precoces com o
uso desta ferramenta de análise.
DELANO et al.
16
, no ano de 2001, compararam um índice subjetivo
(Índice periapical
52
) à densidade radiográfica por valor de pixel no
20
acompanhamento de patologias periapicais tratadas em humanos. Foram
feitas radiografias de 103 dentes antes do tratamento e após 1, 4, 12, 26 e
52 semanas. O índice periapical foi utilizado como padrão de comparação, e
para tal, foi obtido por consenso entre 7 observadores calibrados. As
radiografias foram digitalizadas em um sistema de aquisição de 8 bits. A
avaliação de densidade periapical foi obtida pela razão entre as médias dos
valores dos pixels das áreas de periapicopatias e de áreas normais de
tamanho semelhante. Os resultados mostraram eficácia da medida de
densidade por valor de pixel em evidenciar alterações ao longo do tempo,
sendo semelhante aos resultados do índice periapical.
SHROUT et al.
62
, em 2003, investigaram a imagem radiográfica de
osso medular através de quatro métodos de análise de imagem digital.
Removeram gradativamente o osso medular de mandíbulas de cadáver e
radiografaram as peças com um sistema digital direto (CDR®) de 8 bits. As
regiões de interesse foram demarcadas nas imagens obtidas e a média dos
valores dos pixels da região foi solicitada no software NIH Image®. O uso do
valor de pixel evidenciou mudanças significativas à medida que o osso
medular foi removido, até mesmo para pequenas mudanças na quantidade
de osso medular removido.
O mesmo grupo de autores publicou, em 2004, um trabalho bastante
semelhante, com a mesma metodologia, porém, acrescentando uma análise
visual das imagens. Observaram que as diferenças visuais nem sempre são
21
aparentes, mas que os métodos digitais de medição evidenciaram as
mudanças no conteúdo ósseo
33
.
CAMPS, POMMEL, BUKIET
9
, em 2004, compararam dois métodos de
avaliação radiográfica de tratamento endodôntico em humanos: o índice
periapical
52
e a medida do valor de pixel. Cinqüenta dentes com
periapicopatias foram tratados e acompanhados por até 6 meses. As
radiografias foram realizadas no início do tratamento e nos controles,
sempre com penetrômetro de alumínio. Antes, os autores fizeram várias
tomadas radiográficas do penetrômetro isoladamente, com tempos de
exposição e condições de processamento diversas, para calcular o fator de
correção que deveria ser utilizado no estudo in vivo. Para cada período de
avaliação, foram avaliados o índice periapical e o valor de pixel das áreas de
lesão, com a correção aplicada. Este estudo demonstrou que é possível
evidenciar alterações ósseas em lesões periapicais pela medida de valor de
pixel entre a radiografia inicial e seus controles, mesmo quando o índice
periapical não sofre mudança.
Em periodontia, a imagem digital tem sido utilizada para
acompanhamento de alterações ósseas por meio da subtração radiográfica
digital (SRD)
68
. A SRD é uma possibilidade de manipulação digital, na qual
duas imagens perfeitamente alinhadas obtidas com um intervalo de tempo
são subtraídas matematicamente. Regiões onde não houvesse mudanças
seriam eliminadas da imagem subtraída de forma a ressaltar visualmente as
diferenças entre as imagens. Desta forma, pequenas mudanças nos tecidos
22
seriam prontamente visualizadas nas imagens subtraídas. Além de ser
expressa de forma visual (subjetiva ou qualitativa), a SRD pode ainda ser
expressa de forma numérica (objetiva ou quantitativa). A SRD quantitativa
expressa em unidades relativas aos valores dos pixels é denominada CADIA
(Computed Assisted Densitometric Image Analysis – análise densitométrica
assistida por computador)
7, 8, 28, 70
.
No CADIA, a área ou região de interesse selecionada tem a média
dos valores dos pixels medida e multiplicada pelo número de pixels da área
onde ocorreu a mudança, na imagem subtraída, dando como resultado um
valor numérico que pode ser positivo ou negativo. Valores negativos indicam
diminuição de densidade óssea e valores positivos o aumento desta
7
.
A análise densitométrica assistida por computador pode ser útil na
avaliação da mudança no conteúdo mineral ao longo do tempo, mas não
permite comparações quantitativas entre diferentes áreas de interesse. Esta
comparação necessitaria de um mecanismo de referência interna, como um
penetrômetro, e o sistema que opera o CADIA não processa tal ferramenta
para calibração
28
.
2.5. Indução de doença periodontal em ratos
A doença periodontal em humanos é difícil de ser estudada devido às
grandes variações de resposta individual. Um modelo animal ideal para o
23
estudo de periodontite parece ser o uso de primatas, mas as limitações de
custo impedem o uso desses animais em estudos maiores. O rato (Rattus
norvegicus) é, portanto o animal mais indicado para os estudos
periodontais
41
.
Uma das principais vantagens do uso de ratos nestes estudos é o
custo. No entanto, seu uso é justificado principalmente pela grande
semelhança dos tecidos periodontais dos molares com os tecidos humanos,
tanto em situação de normalidade quanto em situação de doença
petriodontal
32, 37, 72
.
A indução de doença periodontal em ratos foi realizada em vários
estudos, com diferentes finalidades
10, 11, 23, 24, 25, 34, 37, 42, 48, 72
. Diferentes
mecanismos são utilizados para este fim, sendo mais comum o uso de uma
ligadura ou fio atado ao redor da porção cervical do dente no qual se deseja
induzir doença. Fios de algodão, seda e nylon foram utilizados, sendo
relatada reabsorção óssea em alguns estudos
10, 11, 55
.
Em 1975, JOHNSON
34
estudou os efeitos de injeções de dextran-
sulfato em periodontite de ratos albinos. Induziu doença periodontal nos
animais por meio da colocação de fio de seda ao redor do primeiro molar
inferior direito, com o auxílio de uma mesa operatória própria
12
. Nos grupos
que sofreram influência apenas do fio de seda, o autor notou que a
reabsorção óssea da crista alveolar mesial ocorria principalmente por volta
do 17º dia e se tornava estável após o 27º dia.
24
KOIDE et al.
42
, em 1995, utilizou fio de seda 5-0 ao redor do segundo
molar superior de ratos Wistar e encontrou reabsorção óssea inicial da crista
alveolar após 3 dias, com pouca atividade osteoclástica até 14 dias.
Dois estudos utilizaram ligaduras de algodão por 30 dias em ratos
Wistar adultos, encontrando destruição periodontal na região de furca
23, 48
.
No entanto, NOCITI Jr et al.
48
não evidenciaram perda óssea significativa
após 30 dias quando a análise foi quantificada por morfometria.
GONÇALVES et al.
25
, em 2003, em trabalho bastante semelhante ao
de NOCITI Jr et al.
48
, em 2000, utilizou período experimental de 45 dias, e
encontrou diferença morfométrica significativa no volume de perda óssea
entre o lado controle e o lado com ligadura de algodão.
Os achados microscópicos de doença periodontal induzida em ratos
são vários e dependem do período experimental e do tipo de indução.
Normalmente, com indução por ligadura, encontra-se epitélio juncional
longo, abundância de células do tecido conjuntivo e vasos sangüíneos,
perda das fibras do ligamento e fibras conjuntivas acima da crista óssea,
infiltrado inflamatório, crista óssea irregular e reabsorvida, abundância de
células do ligamento periodontal, presença de lacunas de Howship no
cemento, seqüestro ósseo
23, 34
.
A idade dos ratos para estudos periodontais é muito importante porque os
molares estão completamente irrompidos a partir da 5ª semana de vida
46
.
Outro fator importante é que com a idade, ocorre migração distal dos
molares e a distância entre a junção amelo-cementária e o topo da crista
25
alveolar aumenta em algumas áreas linguais e palatais
32, 34
. Por isso, a
literatura recomenda utilizar animais de mesma idade para não alterar os
resultados
2, 41
.
Proposição
27
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho teve como objetivos:
Verificar as diferenças entre as médias dos valores dos pixels obtidas por
meio de radiografias obtidas no sistema Digora e digitalizadas, feitas das
áreas de indução de doença periodontal e áreas controles, nos períodos
experimentais de 7, 14 e 28 dias, em ratos Wistar.
Comparar os resultados obtidos baseados nos valores dos pixels com uma
análise histopatológica das mesmas áreas.
27
Material e
Métodos
29
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Grupos experimentais
O protocolo de pesquisa foi analisado pelo CEEPA (Comitê de Ética
em Ensino e Pesquisa com Animais) da FOB e foi considerado aprovado em
04 de fevereiro de 2004 (anexo 1).
Um total de 30 ratos Wistar (Rattus norvegicus), fêmeas adultas, com
60 dias de idade, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de
Odontologia de Bauru, USP, foram divididos em três grupos, segundo a data
de sacrifício:
Grupo 1: 10 animais, sacrificados aos 7 dias.
Grupo 2: 10 animais, sacrificados aos 14 dias.
Grupo 3: 10 animais, sacrificados aos 28 dias.
Os animais foram mantidos durante o período experimental em boas
condições de higiene e alimentação, com ração e água ad libitum.
30
4.2 Material
1. Dopalen injetável (Cloridrato de ketamina) e Anasedan injetável
(Cloridrato de xilazina) fabricados por Agribrands do Brasil Ltda.
2. Pinças porta-agulhas.
3. Fios de sutura 3.0 (Ethicom®).
4. Formol a 10% tamponado.
5. Solução de EDTA pH 7,2 (4,13% de Titriplex III Merck® e 0,44% de
hidróxido de sódio).
6. Álcool absoluto, xilol, corantes hematoxilina e eosina.
7. Lâminas de vidro e navalhas para micrótomo.
8. Filmes radiográficos tamanho 2 IP-21 Insight – Eastman Kodak®.
9. Aparelho radiográfico X-707, 70KVp e 7mA (Yoshida Dental MFC Co.
Ltd., Tókio, Japão).
10. Luz de segurança com filtro GBX-2 (Kodak Company, New York, USA).
11. Soluções reveladora e fixadora de filmes radiográficos (Kodak Company,
New York, USA).
12. Scanner a laser de 12 bits/pixel Lumiscan 50 (Lumisys Inc.) – LAPIMO –
E.E. – USP Campus de São Carlos.
13. Software ImageJ 1.29x (NIH – USA).
31
14. Computador compatível com sistema Windows® (monitor de 17
polegadas, tela plana).
15. Sistema Digora®, com placa de fósforo tamanho periapical, 40 X 30 mm
e software Digora for Windows® versão 1.50 (Orion / Soredex, Helsinki,
Finland).
16. Microscópio óptico binocular Olympus CH2.
4.3 Preparo dos animais / indução de doença periodontal
Nos 30 animais (Grupos 1, 2 e 3), sob anestesia geral intramuscular,
com Dopalen e relaxante muscular e sedativo de uso animal Anasedan, foi
colocado um fio de sutura de seda 3-0 na cervical do primeiro molar inferior
do lado direito (lado teste), para que houvesse acúmulo de placa e
desenvolvimento de doença periodontal. O lado esquerdo foi deixado sem
ligadura (lado controle). Os animais foram posicionados em uma mesa
operatória própria para manter a boca aberta durante os procedimentos
(figura 4.1). Esta mesa não é produzida em escala industrial e o exemplar
utilizado pertence ao Departamento de Estomatologia da FOB - USP. Um
aparato semelhante a este foi descrito por COSTICH, AVERY, HOEK
12
em
1962.
32
Utilizando pinças hemostáticas, as ligaduras foram introduzidas na
face distal do primeiro molar inferior e um nó cirúrgico feito na face mesial,
conforme ilustrado na figura 4.2.
4.4 Obtenção das peças cirúrgicas
As ligaduras foram mantidas até a data do sacrifício. Na ocasião do
sacrifício, com os animais ainda vivos, foram observados os aspectos
clínicos a seguir, referentes ao primeiro molar que recebeu o fio de seda:
Aspectos clínicos Condição
Placa bacteriana Ausente Presente
Sangramento ao toque Ausente Presente
Edema gengival Ausente Presente
Os Grupos 1, 2 e 3 foram sacrificados ao término de períodos de 7, 14
e 28 dias, respectivamente, por dose excessiva de anestésico. Em seguida,
as mandíbulas foram removidas por dissecção e corte com tesoura e
divididas em duas partes (hemimandíbulas direita e esquerda). Os tecidos
moles não foram completamente removidos, no intuito de simular uma
imagem radiográfica das peças mais próxima de uma situação real. Os fios
de seda foram removidos cuidadosamente com o uso de uma sonda
exploradora e as peças submetidas então ao processo de fixação em formol
10% tamponado, durante uma semana.
33
FIGURA 4.1: Posicionamento do rato na mesa operatória, com o dispositivo
de abertura bucal.
FIGURA 4.2: A: Colocação do fio de seda ao redor do primeiro molar inferior
direito do rato. B: Aspecto final do fio de seda em posição.
34
FIGURA 4.3: A: Mandíbula do rato removida. B: Detalhe do lado
experimental ainda com o fio de seda em posição.
4.5 Obtenção das imagens radiográficas
Após a fixação das peças, foi realizado um teste piloto para ajuste do
tempo de exposição correto para as tomadas radiográficas, no qual se
estabeleceram tempos de exposição de 0,1 e 0,17 segundos para a placa de
fósforo “blue” (Digora) e o filme radiográfico Insight (Kodak®),
respectivamente. O sistema Digora foi calibrado previamente com um tempo
de exposição de 0,5 segundo.
35
As hemimandíbulas foram então radiografadas utilizando filmes
radiográficos tamanho 2 (Kodak Insight), expostos segundo os parâmetros:
70 kVp, 10 mA, distância foco-filme de 30 cm e tempo de exposição de
0,17s, com o feixe de raios-x direcionado perpendicularmente às peças
cirúrgicas. O aparelho de raios-X utilizado foi o X-707 (Yoshida Dental MFC
Co. Ltd., Tókio, Japão)
As hemimandíbulas direita e esquerda pertencentes ao mesmo animal
foram posicionadas sobre o filme radiográfico, o lado teste na esquerda e o
lado controle na direita, de forma que a face lingual da peça ficasse em
contato com a superfície do filme
34, 57
. Um penetrômetro construído com 4
degraus de chumbo de películas radiográficas, segundo os parâmetros
estabelecidos por WHITE, PHAROAH
76
, foi posicionado na porção do filme
próxima ao picote, adjacente à hemimandíbula correspondente ao lado teste.
Próximo ao penetrômetro, foi colocado um número de chumbo para
identificação da radiografia, de 1 a 10 para cada grupo, de modo que as
imagens obtidas seguiram o esquema ilustrado na figura 4.4.
As radiografias foram processadas obedecendo aos princípios do
método manual (temperatura-tempo), com soluções novas.
Para a obtenção das radiografias digitais diretas, foi utilizado um
sistema de obtenção por placa de fósforo “blue” (Digora), sendo a mesma
placa utilizada para todas as aquisições, com tempo de exposição de 0,1
segundo. O posicionamento das peças sobre a placa e do aparelho
36
radiográfico foram os mesmos utilizados na obtenção das radiografias
convencionais.
FIGURA 4.4: Esquema do posicionamento das peças cirúrgicas sobre o
filme radiográfico e sobre a placa de fósforo para obtenção das imagens
radiográficas.
Cada aquisição na placa de fósforo foi descarregada no sistema
Digora por um escaneamento a laser, sempre no prazo máximo de 5
minutos após a exposição. As imagens armazenadas no software do Digora
for Windows®, versão 1.50, foram em seguida salvas no formato TIFF para
possibilitar o processamento em outros softwares. Esses procedimentos
forneceram imagens de 8 bits, com uma matriz de pixel de 560 x 416 e o
37
tamanho do arquivo correspondente de 227 kbytes para cada imagem
(figura4.5).
FIGURA 4.5: Imagem radiográfica digital obtida com a placa de fósforo do
sistema Digora.
4.6 Procedimentos histotécnicos
Em seguida à obtenção e armazenamento das imagens radiográficas,
procedeu-se à desmineralização das peças em solução de EDTA pH 7,2,
preconizada por WARSHAWSKY, MOORE
71
, por um período de sessenta
dias, com trocas semanais da solução.
38
Após desmineralização comprovada por radiografias das peças, foi
iniciado o procedimento histotécnico padrão do laboratório de Histologia da
Faculdade de Odontologia de Bauru. As peças foram desidratadas,
diafanizadas e incluídas em Paraplast. Cortes semi-seriados de 5µm de
espessura foram obtidos no sentido mésio-distal das peças (micrótomo
Jung-Leica RM2045) e corados pela técnica da Hematoxilina-Eosina.
Procurou-se aproveitar as secções mais internas das peças, desprezando-se
as porções mais linguais ou vestibulares.
4.7 Análise dos valores dos pixels
As radiografias obtidas pelo sistema digital direto Digora foram
abertas no software ImageJ em um computador que opera com plataforma
Windows, com monitor de 17 polegadas e tela plana. A sala foi escurecida
durante a análise das radiografias para melhorar sua visualização. Uma área
de medição de 30 pixels foi aberta no formato de um retângulo. Esta área
correspondente à região de interesse (RI) foi salva para que seu tamanho e
formato pudessem ser mantidos em todas as medições. Uma outra área de
medição de 3536 pixels foi igualmente criada e salva. Esta segunda área
corresponde à região de controle (RC), cujo objetivo foi medir as diferenças
de histograma entre as tomadas radiográficas.
39
Cada imagem foi aberta, ampliada duas vezes na tela, e a RI
posicionada na crista alveolar mesial do primeiro molar, abaixo da junção
amelo-cementária, no lado controle e no lado teste (figura 4.6), nessa
mesma ordem. Foram solicitados os histogramas das RIs e os dados
relativos às médias dos valores dos pixels foram tabulados. O histograma do
software ImageJ forneceu os dados sobre média dos valores dos pixels
numa escala de 8 bits (figura 4.7).
FIGURA 4.6: Posicionamento das regiões de interesse nas imagens
radiográficas para medição do valor de pixel. A: lado controle. B: lado onde
foi induzida doença periodontal.
Em cada radiografia, a RC foi posicionada na faixa mais central do
penetrômetro, nas imagens sem aumento, e um novo histograma foi
soliciado (figura 4.8).
A B
40
FIGURA 4.7: Medida do valor de pixel da região de interesse (RI) do sítio
com doença periodontal de um rato do grupo 1.
FIGURA 4.8: Medida do valor de pixel da região de controle (RC) da
radiografia do rato 3 do grupo 1.
41
As medidas das RIs foram obtidas pelo mesmo examinador e
obedecendo à mesma técnica uma segunda vez após passados 15 dias,
para a avaliação da concordância intra-examinador e obtenção da
reprodutibilidade do método de medida de valor de pixel por meio do
histograma.
As radiografias convencionais foram montadas em cartelas
específicas para identificação e digitalizadas em um scanner a laser (12
bits). As imagens das cartelas de radiografias foram abertas no programa
ImageJ, convertidas para 8 bits e cada radiografia foi recortada e
transformada em um arquivo separado. Desta maneira, obtivemos 30 novas
imagens. A medida dos valores dos pixels das RCs e das RIs foi realizada
da mesma maneira que para as imagens digitais diretas, em uma área de
medida fixa com tamanho de 5 pixels. Também foi feita uma segunda
medida de todas as RIs para obtenção da concordância intra-examinador.
4.8 Análise histopatológica
Os cortes microscópicos obtidos foram observados em um
microscópio binocular Olympus CH2, pelo mesmo examinador que trabalhou
com as imagens digitais. O examinador foi previamente treinado para os
parâmetros a serem analisados, observando e classificando cortes
microscópicos aleatórios.
42
Para cada hemimandíbula a ser analisada, foram escolhidos 5 cortes
que melhor representassem a região de interesse. Para isso, procurou-se
escolher cortes microscópicos que contivessem toda a raiz mesial do
primeiro molar inferior e principalmente sua porção mais central, pois isto
seria importante para a análise de altura da crista óssea. As lâminas foram
identificadas novamente com uma seqüência numérica aleatória,
mascarando a informação sobre quais seriam os períodos experimentais e
sobre quais seriam os cortes do lado controle e lado teste. Os parâmetros
microscópicos analisados tanto no lado teste quanto no lado controle estão
listados na tabela 4.1 e detalhados abaixo.
TABELA 4.1: Características histopatológicas avaliadas nos sítios de doença
periodontal e nos sítios controles.
Característica histopatológicas Condição histopatológica
1 Altura da crista óssea alveolar
1/3 cervical / 1/3 médio / 1/3 apical
2 Crista óssea alveolar
Presença / Ausência de lacunas de Howship
3 Crista óssea alveolar
Presença / Ausência de osteoclastos
4 Seqüestro ósseo
Presença / Ausência
5 Fibras do tecido conjuntivo (acima da crista óssea)
Esparsas / Quantidade moderada / Densas
6 Vasos do tecido conjuntivo (acima da crista óssea)
Esparsos / Quantidade padrão / Abundância
7 Intensidade do infiltrado inflamatório
Ausente / Leve / Moderado / Intenso
8 Qualidade do infiltrado inflamatório
Polimorfonuclear / Misto / Mononuclear
43
1. Altura da crista óssea alveolar: os cortes foram observados em aumento
de 4 vezes e a raiz foi dividida visualmente em 3 terços, com o tamanho total
da raiz indo da junção amelo-cementária (JAC) ao ápice. Para localização da
JAC, o lado controle foi usado como parâmetro, uma vez que em condições
normais, torna-se mais fácil a visualização do limite entre esmalte e cemento
(figura 4.8). No lado doença, a JAC foi localizada pela presença de
constrição na região. A altura da crista óssea foi classificada em terço
cervical se o topo da crista estivesse no perímetro do terço cervical e assim
por diante.
2 e 3. Lacunas de Howship na crista óssea e osteoclastos: esses dados
foram analisados separadamente, pois poderiam existir lacunas vazias.
Esses dois fatores foram analisados somente na porção mais cervical da
crista óssea, tanto em sua porção mesial quanto na distal, em aumento de
10x e 40x.
4. Sequestro ósseo: foi considerado seqüestro ósseo da crista alveolar
quando se observou, em aumento de 10X e 40X, fragmentos de tecido
ósseo desconectados da crista óssea.
5. Fibras do tecido conjuntivo: foi avaliada a concentração de fibras na
porção de tecido conjuntivo acima da crista óssea, em aumento de 10x, e os
dados foram divididos em: 1 – esparsas, 2 – quantidade moderada, 3 –
densas
44
6. Vasos do tecido conjuntivo: foi avaliada a concentração de vasos
sangüíneos na porção de tecido conjuntivo acima da crista óssea, em
aumento de 10x, e os dados foram ranqueados em: 1 – esparsos, 2-
quantidade padrão, 3 – abundância.
FIGURA 4.8: Diagrama da relação entre gengiva e junção amelo-cementária
(JAC) na mesial do primeiro molar mandibular do rato. Epitélio não
estratificado começa na JAC e vai até o ponto A. No ponto B inicia-se o
epitélio queratinizado. Adaptado de JOHNSON
34
, 1975.
7. Intensidade do infiltrado inflamatório: foi avaliada, em aumento de 10x, a
concentração de células inflamatórias na porção de tecido conjuntivo acima
da crista óssea e adentrando o espaço do ligamento periodontal. Os dados
45
foram ranqueados em: 1 – ausente (quantidade histologicamente normal de
células), 2 – leve (células inflamatórias em pouca quantidade e restritas à
região subepitelial), 3 – moderado (quantidade moderada de células
inflamatórias espalhadas pelo tecido conjuntivo acima da crista óssea) , 4 –
intenso (grande quantidade de células inflamatórias espalhadas pelo tecido
conjuntivo acima da crista óssea e no espaço do ligamento periodontal)
8. Tipo de infiltrado inflamatório: o infiltrado avaliado em aumento de 40x foi
dividido em 0 (zero) – infiltrado inflamatório ausente; 1 – polimorfonuclear
(quando a quantidade de polimorfonucleares superava bastante a
quantidade de mononucleares), 2 – misto (quando as quantidades de
polimorfonucleares e mononucleares eram semelhantes), 3 – Mononuclear
(quando a quantidade de mononucleares superava bastante a quantidade de
polimorfonucleares).
4.9 Análise estatística
As médias dos valores dos pixels das radiografias digitais diretas e
indiretas foram submetidas à ANOVA a dois critérios, sendo os critérios o
tempo e a condição de doença periodontal. A ANOVA a um critério foi
utilizada para avaliar as diferenças entre as médias dos valores dos pixels
das áreas de doença periodontal entre os grupos. A correlação intra-
46
examinador foi avaliada pela medida do erro casual e do erro sistemático,
com o uso dos testes de Dahlberg, “t” pareado e correlação de Pearson
31
.
Os resultados microscópicos dicotômicos foram expressos descritivamente e
os resultados das medidas por escores submetidos ao teste não-paramétrico
de Wilcoxon (grupos pareados).
29
Resultados
48
5 RESULTADOS
Dos 30 ratos inicialmente na amostra, foram perdidos apenas 3, por
morte prematura e por deslocamento do fio de seda. Esses 3 animais foram
substituídos por outros de mesma idade, sem perdas para o experimento. O
método de indução de doença periodontal foi eficaz no acúmulo de placa e
restos alimentares (figuras 5.1 a 5.3), causando edema e sangramento
(tabela 5.1).
TABELA 5.1: Presença de placa bacteriana, edema e sangramento gengival
na região do fio de sutura posicionado no lado experimental. Valores
expressos em porcentagens de ratos que apresentavam as características
observadas.
Grupo Placa bacteriana Edema gengival Sangramento gengival
1 90% 90% 40%
2 100% 50% 50%
3 100% 30% 40%
49
FIGURA 5.1: Sítio controle de um rato do grupo 1 (7 dias). Nota-se ausência
de sinais inflamatórios na região do primeiro molar inferior.
FIGURA 5.2: Região onde foi induzida doença periodontal no mesmo rato
mostrado na figura 5.1. Acúmulo de restos alimentares no primeiro molar.
50
FIGURA 5.3: Sítio onde houve indução de doença periodontal em um rato do
grupo 3 (28 dias de indução). Nota-se grande acúmulo de restos alimentares
junto ao fio de sutura.
5.1 Análise das imagens obtidas no sistema Digora
Depois de radiografadas as peças, as regiões de controle (RCs) foram
analisadas conforme descrito na metodologia. Foram medidas 30 RCs, uma
para cada radiografia, ou seja, a mesma RC se aplicava para o lado controle
e o lado doença de cada animal. As médias das regiões de controle em cada
grupo estão descritas na tabela 5.2.
51
TABELA 5.2 – Médias e desvios-padrão dos valores dos pixels das regiões
de controle das radiografias obtidas no sistema Digora, discriminados por
grupo.
Grupo Média dos valores dos pixels dp
1 208,90
2,48
2 210,20 1,09
3 212,98 1,68
Uma vez que a média dos valores dos pixels das regiões de controle
foram bastante semelhantes entre si, dentro de cada grupo, optamos por
não utilizar nenhum fator de correção baseado nessa variabilidade. Esse
fator de correção, se empregado, seria aplicado igualmente para corrigir o
valor do lado controle e do lado teste na mesma magnitude, pois ambos
estão localizados na mesma radiografia. As regiões de controle foram úteis
para nos indicar que as radiografias feitas no sistema Digora foram bastante
semelhantes entre si, e, portanto, possíveis de serem analisadas em
conjunto.
O valor de pixel das cristas ósseas foi obtido da mesma maneira que
para as regiões de controle, ou seja, confeccionando-se uma área de
seleção e aplicando-a nas áreas de interesse no lado controle e no lado
experimental. As médias dos valores dos pixels obtidas para cada grupo
estão descritos na tabela 5.3.
52
TABELA 5.3 – Médias e desvios-padrão (dp) dos valores dos pixels das
regiões de interesse das radiografias obtidas com o sistema Digora,
distribuídas entre os grupos e condição periodontal.
Grupo Condição Média (pixels) dp (pixels) n
1 C 67,5 12,9 10
1 DP 61,2 12,3 10
2 C 73,1 11,5 10
2 DP 51,9 6,4 10
3 C 85,3 7,6 10
3 DP 69.8 7,5 10
C – controle; DP – doença periodontal
A análise das médias de cada grupo mostrou que os valores dos
pixels nos lados onde a doença periodontal foi induzida diminuíram,
indicando perda óssea. A comparação das médias dos valores dos pixels
entre grupos pela ANOVA (análise de variância) a dois critérios mostrou que
esta diminuiçao do valor de pixel nos lados doença periodontal foi
estatisticamente significante (p=0,000001) para todos os intervalos de
tempo, ou seja, para todos os grupos.
Para analisar a influência da variável tempo na condição de doença
periodontal apenas, a ANOVA a um critério e teste de Tukey foram
aplicados, demonstrando haver um aumento estatisticamente significativo
(p=0,00069) na média dos valores dos pixels do grupo de 14 dias para o
grupo de 28 dias, nas regiões de doença periodontal (tabela 5.4).
53
A influência da variável tempo sobre as regiões periodontais de
controle foi avaliada por meio da ANOVA a um critério e teste de Tukey,
demonstrando haver aumento do valor de pixel do grupo 1 para o grupo 3 e
do grupo 2 para o grupo 3, este aumento foi estatisticamente significante
(p=0,00069), conforme a tabela 5.5.
TABELA 5.4 – Teste de Tukey para a variável tempo: significância estatística
entre as médias dos valores dos pixels dos diferentes intervalos de tempo
(grupos 1, 2 e 3 ), para medidas obtidas nas áreas de doença periodontal em
radiografias obtidas no sistema Digora.
Comparação Diferença Interpretação
Grupo 1 x Grupo 2 9,2 não significante
Grupo 1 x Grupo 3 -8,7 não significante
Grupo 2 x Grupo 3 -17,9
significante
Nível de significância = 5%, Valor crítico = 10,11
TABELA 5.5 – Teste de Tukey para a variável tempo: significância estatística
entre as médias dos valores dos pixels dos diferentes intervalos de tempo
(grupos 1, 2 e 3 ), para medidas obtidas nas áreas de controle periodontal
em radiografias obtidas no sistema Digora®.
Comparação Diferença Interpretação
Grupo 1 x Grupo 2 -5,6 não significante
Grupo 1 x Grupo 3 -17,7
significante
Grupo 2 x Grupo 3 -12,1
significante
Nível de significância = 5%, Valor crítico = 12,08
54
Para obtenção da concordância intra-examinador, as medidas de
valor de pixel foram repetidas pelo mesmo examinador após 15 dias. A
concordância entre a primeira e a segunda medidas foi obtida pela avaliação
do erro sistemático e do erro casual.
O erro sistemático foi medido através do teste “t” pareado (t) e do
coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as 60 primeiras medidas
(somando-se as medidas de controle e doença periodontal) e as 60 medidas
consecutivas, o que resultou em um valor de t = 3,246 (p=0,002) e valor de
r = 0,87. O teste “t” pareado foi estatisticamente significativo em demonstrar
diferenças entre a primeira e a segunda medidas, no entanto, esta diferença
foi bastante pequena, sendo a primeira medida menor que a segunda em
2,22 pixels em média, valor não importante do ponto de vista prático. O
coeficiente de correlação de Pearson foi considerado forte, pois quanto mais
próximo de 1 for o valor de r, mais forte é a concordância entre as variáveis.
O erro casual foi medido pelo Teste de Dahlberg, que forneceu
um valor de erro correspondente a 5,63 pixels. Este erro foi pequeno, se
levarmos em consideração que as médias dos valores dos pixels variaram
entre 51,9 e 85,3.
55
5.2 Análise das imagens digitais indiretas
A mesma forma de análise estatística foi aplicada para as imagens
obtidas por digitalização indireta das radiografias convencionais. As medidas
dos valores dos pixels nas regiões de controle evidenciaram pequena
variação entre as imagens, como pode ser visto na tabela 5.6.
Os valores dos pixels das cristas ósseas foram obtidos da mesma
maneira que para as radiografias digitais diretas. As médias dos valores dos
pixels obtidas para cada grupo estão descritos na tabela 5.7.
A comparação das médias dos valores dos pixels pela ANOVA
(análise de variância) a dois critérios, sendo eles o tempo experimental (7,
14 ou 28 dias) e a condição (controle ou doença periodontal) evidenciou
diferença estatisticamente significativa (p=0,000000) entre as médias do lado
controle e as médias do lado experimental para os três grupos, um resultado
bastante semelhante ao encontrado para as medidas obtidas por
radiografias digitais diretas. Essas diferenças também corresponderam a
uma diminuição no valor de pixel nos lados de doença para todos os grupos.
Para analisar a influência da variável tempo na condição de doença
periodontal apenas, a ANOVA a um critério e o teste de Tukey foram
aplicados, demonstrando não haver diferença estatisticamente significante
na média dos valores dos pixels entre os três grupos (tabela 5.8).
56
TABELA 5.6 – Médias e desvios-padrão dos valores dos pixels das regiões
de controle das radiografias digitais indiretas, discriminados por grupo.
Grupo Média valor pixel dp
1 209,66 pixels 1,86
2 210,52 pixels 1,62
3 209,96 pixels 1,18
TABELA 5.7 – Médias e desvios-padrão (dp) dos valores dos pixels das
regiões de interesse das radiografias convencionais, distribuídas entre os
grupos e condição periodontal.
Grupo Condição Média (pixels) dp (pixels) n
1 C 112,4 6,9 10
1 DP 107,4 4,8 10
2 C 115,7 2,9 10
2 DP 106,9 3,7 10
3 C 120,6 4,1 10
3 DP 109,1 2,0 10
C – controle; DP – doença periodontal
A ANOVA a um critério e teste de Tukey demonstraram haver
aumento estatisticamente significante do valor de pixel do grupo 1 para o
grupo 3 e do grupo 2 para o grupo 3 (p=0,00069) para as regiões de controle
periodontal (tabela 5.9).
57
TABELA 5.8 – Teste de Tukey para a variável tempo: significância estatística
entre as médias dos valores dos pixels dos diferentes intervalos de tempo
(grupos 1, 2 e 3 ), para medidas obtidas nas áreas de doença periodontal em
radiografias digitais indiretas.
Comparação Diferença Interpretação
Grupo 1 x Grupo 2 0,4 não significante
Grupo 1 x Grupo 3 -1,7 não significante
Grupo 2 x Grupo 3 -2,1 não significante
Nível de significância = 5%, Valor crítico = 4,09
TABELA 5.9 – Teste de Tukey para a variável tempo: significância estatística
entre as médias dos valores dos pixels dos diferentes intervalos de tempo
(grupos 1, 2 e 3 ), para medidas obtidas nas áreas de controle periodontal
em radiografias digitais indiretas.
Comparação Diferença Interpretação
Grupo 1 x Grupo 2 -2,2 não significante
Grupo 1 x Grupo 3 -7,2
significante
Grupo 2 x Grupo 3 -4,9 não significante
Nível de significância = 5%, Valor crítico = 5,85
Assim como para as radiografias digitais diretas, a concordância intra-
examinador das medidas das radiografias digitais indiretas foi obtida,
utilizando-se os mesmos meios de análise. O erro sistemático medido por
58
meio do teste “t” pareado foi estatisticamente significativo ao demonstrar
diferenças entre a primeira e a segunda medidas (“t”=3,31, p= 0,002). No
entanto, esta diferença foi bastante pequena, sendo a primeira medida
menor que a segunda em 1,34 pixels em média. O coeficiente de correlação
de Pearson foi considerado forte (r= 0,88).
O erro casual, medido pelo Teste de Dahlberg, foi de 2,39 pixels. Este
erro foi pequeno, ainda menor que o encontrado para as radiografias digitais
diretas.
5.3 Análise histopatológica
Para os 10 ratos de cada grupo, foram obtidas 20 peças cirúrgicas.
Para cada peça, foram analisados 5 cortes microscópicos semi-seriados, o
que soma 100 cortes em cada grupo.
As lâminas foram re-identificadas aleatoriamente para diminuir o erro
na análise. Mesmo com esse procedimento, foi fácil durante a análise supor
qual seria o lado controle e o lado doença, pois as diferenças microscópicas
eram bastante óbvias. No entanto, a re-identificação das lâminas foi útil no
mascaramento entre os grupos, pois era especialmente difícil supor qual
seria o grupo 2 e qual seria o grupo 3, nos lado doença.
59
Para a análise estatística, foi preciso obter novamente um único
resultado para cada peça analisada. Para tal, foram agrupados os resultados
dos cinco cortes analisados em cada peça. Para os critérios com resultados
fornecidos em escores, foi obtida a média dos escores dos cinco cortes.
Para os demais critérios, foi considerada a ocorrência mais freqüente como
sendo o resultado.
Os resultados serão descritos para cada parâmetro microscópico
analisado, nas tabelas 5.10 a 5.16.
A altura da crista óssea mostrou diminuição do grupo 1 para o grupo
3, migrando cada vez mais para apical e tornando-se cada vez mais
diferente de seus controles com o passar do tempo experimental (tabela
5.10 e figura 5.4).
A atividade reabsortiva do osso foi analisada verificando a quantidade
de osteoclastos e lacunas de Howship na crista óssea, conforme observado
na tabela 5.11. Foi observada maior presença de osteoclastos nos lados de
doença que nos seus controles e esta quantidade diminuiu com o passar do
tempo, ou seja, houve maior presença de clastos no grupo de 7 dias do que
no grupo de 28 dias (figura 5.5). Esse resultado se repete quando
analisamos a presença de lacunas de Howship na crista óssea.
60
TABELA 5.10 – Altura da crista óssea, avaliada histologicamente, separada
por grupo e condição. Valores expressos em números absolutos de áreas
observadas.
Altura da crista óssea
Grupo Condição
1/3 cervical (n) 1/3 médio (n) 1/3 apical (n)
1 C 10 0 0
1 DP 2 8 0
2 C 10 0 0
2 DP 0 6 4
3 C 10 0 0
3 DP 0 4 6
C – lado controle, DP – lado doença periodontal
TABELA 5.11 - Classificação microscópica da presença de lacunas de
Howship e osteoclastos. Valores expressos em números absolutos de áreas
observadas e separados por grupo e condição.
Lacuna de Howship osso Osteoclastos
Grupo Condição
Presente
(n)
Ausente
(n)
Presente
(n)
Ausente
(n)
1 C 3 7 0 10
1 DP 10 0 10 0
2 C 4 6 0 10
2 DP 7 3 4 6
3 C 0 10 0 10
3 DP 2 8 1 9
C – lado controle, DP – lado doença periodontal
61
FIGURA 5.4: Altura da crista óssea. A: Sítio controle, rato do grupo 1. B:
Sítio doença periodontal, rato do grupo 1 (crista óssea no terço cervical da
raiz). C: Sítio doença periodontal, rato do grupo 2 (crista óssea no terço
médio da raiz). D: Sítio doença periodontal, rato do grupo 3 (crista óssea no
terço apical da raiz). HE, 30x.
A
B
C
D
62
FIGURA 5.5: Presença de osteoclastos (setas) e lacunas de Howship
(pontilhado) na crista óssea alveolar em sítio de doença periodontal de um
rato do grupo de 7 dias. HE, 475x.
Houve ausência de seqüestros ósseos nos lados controle e sua
presença decresceu do grupo de 7 dias para o grupo de 28 dias (tabela 5.12
e figura 5.6).
Para comparação das quantidades de fibras, vasos e infiltrado
inflamatório no tecido conjuntivo entre os lados controle e experimental, foi
utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxon para grupos pareados.
Com relação à quantidade de fibras do tecido conjuntivo, não foi
evidenciada diferença estatisticamente significativa entre os lados
experimentais e seus controles (tabela 5.13).
63
TABELA 5.12 – Classificação microscópica da presença de seqüestros
ósseos. Valores expressos em números absolutos de áreas observadas e
separados por grupo e condição.
Seqüestro ósseo
Grupo Condição
Presente (n) Ausente (n)
1 C 0 10
1 DP 6 4
2 C 0 10
2 DP 5 5
3 C 0 10
3 DP 1 9
C – lado controle, DP – lado doença periodontal
FIGURA 5.6: A: Seqüestro ósseo em sítio de doença periodontal de um rato
do grupo de 7 dias. HE, 30x. B: Mesma região em aumento de 120x.
Seqüestro ósseo indicado pelas setas.
A
B
64
TABELA 5.13: Teste não-paramétrico de Wilcoxon para dois grupos
pareados. Médias dos escores de avaliação da quantidade de fibras no
tecido conjuntivo para os lados experimental e controle nos três grupos.
Grupo Condição Média dos escores p da diferença
1 C 2,10
1 DP 2,06
0,785
2 C 2,28
2 DP 2,10
0,246
3 C 2,06
3 DP 2,30
0,211
C – lado controle; DP – lado doença periodontal
A quantidade de vasos sanguíneos no tecido conjuntivo foi maior no
lado experimental que nos controles para os grupos de 7 e de 14 dias
(p=0,007 e p=0,01, respectivamente). Para o grupo de 28 dias, também
encontramos maior número de vasos no lado experimental, porém o
resultado não foi estatisticamente significante (tabela 5.14 e figura 5.7).
A quantidade de infiltrado inflamatório foi sempre maior no lado
experimental que no controle, os resultados foram estatisticamente
significativos para os três grupos (tabela 5.15 e figuras 5.8 a 5.11).
O infiltrado inflamatório foi ainda dividido em quatro tipos: ausente,
polimorfonuclear, mononuclear e misto. Os resultados mostraram que os
lados controle não apresentavam infiltrado inflamatório e que este era
principalmente polimorfonuclear nos grupos 1 e 2 e predominantemente
mononuclear no grupo 3 (tabela 5.16 e figuras 5.12 e 5.13)
65
TABELA 5.14: Teste não-paramétrico de Wilcoxon para dois grupos
pareados. Médias dos escores de avaliação da quantidade de vasos
sangüíneos no tecido conjuntivo para os lados experimental e controle nos
três grupos.
Grupo Condição Média dos escores p da diferença
1 C 1,94
1 DP 2,46
0,007*
2 C 1,74
2 DP 2,34
0,014*
3 C 2,02
3 DP 2,22
0,095
C – lado controle; DP – lado doença periodontal
* - resultado estatisticamente significante
FIGURA 5.7: Intensa quantidade de vasos sangüíneos (setas) em sítio de
doença periodontal em rato do grupo de 14 dias. HE, 475x.
66
TABELA 5.15: Teste não-paramétrico de Wilcoxon para dois grupos
pareados. Médias dos escores de avaliação da quantidade de infiltrado
inflamatório no tecido conjuntivo para os lados experimental e controle nos
três grupos.
Grupo Condição Média dos escores p da diferença
1 C 0,14
1 DP 2,62
0,004*
2 C 0,10
2 DP 2,30
0,005*
3 C 0,06
3 DP 1,46
0,004*
C – lado controle; DP – lado doença periodontal
* - resultado estatisticamente significante
TABELA 5.16 – Tipos microscópicos de infiltrado inflamatório, separados por
grupo e condição. Valores expressos em números absolutos de áreas
observadas e separados por grupo e condição.
Tipo de infiltrado inflamatório
Grupo Condição
Ausente
(n)
Polimorfonuclear
(n)
Misto
(n)
Mononuclear
(n)
1 C 10 0 0 0
1 DP 0 7 2 1
2 C 9 1 0 0
2 DP 0 8 2 0
3 C 10 0 0 0
3 DP 0 0 4 6
C – lado controle, DP – lado doença periodontal
67
FIGURA 5.8: Ausência de infiltrado inflamatório no sítio controle de um rato
do grupo 1. HE, 475x.
FIGURA 5.9: Infiltrado inflamatório leve em sítio de doença periodontal. HE,
475x.
68
FIGURA 5.10: Infiltrado inflamatório moderado em área de doença
periodontal. HE, 475x.
FIGURA 5.11: Infiltrado inflamatório intenso em área de doença periodontal.
HE, 475x.
69
FIGURA 5.12: Infiltrado inflamatório intenso, composto predominantemente
de células polimorfonucleares (setas). HE, 1190x.
FIGURA 5.11: Infiltrado inflamatório composto por quantidade predominante
de células mononucleares (setas). HE, 1190x
48
Discussão
71
6 DISCUSSÃO
6.1 Análise radiográfica
Os resultados da mensuração do valor de pixel mostraram um padrão
similar para todos os grupos, tanto para as imagens digitais obtidas no
Digora, quanto para as digitalizadas pelo scanner a laser, no sentido de que
os valores dos pixels das áreas de doença periodontal foram
significantemente menores, do ponto de vista estatístico, que os valores das
áreas de controle periodontal, indicando que o método foi eficaz em
diferenciar áreas de perda óssea, mesmo para um período curto de 7 dias.
Alguns fatores externos poderiam interferir negativamente, alterando
esses resultados, sendo o principal deles a inserção de ruído, proveniente
da não-padronização das tomadas radiográficas, do processamento
radiográfico, do escaneamento das radiografias convencionais e do erro de
calibração do sistema Digora. A metodologia deste trabalho minimizou ao
máximo essas interferências na qualidade das imagens obtidas. Para isso, a
posição da fonte de raios-x foi mantida estável durante todas as radiografias,
72
todas as radiografias convencionais de cada grupo foram processadas em
conjunto, a mesma placa de fósforo foi utilizada para todas as radiografias
digitais diretas, o sistema Digora foi calibrado previamente e as radiografias
convencionais de cada grupo foram escaneadas em conjunto no scanner a
laser.
Mesmo com todos esses cuidados, foi ainda inserido em cada
radiografia, um penetrômetro construído com lâminas de chumbo de
películas radiográficas, para, se necessário, corrigir as imagens
discrepantes. O uso desta ferramenta de correção é bem descrito na
litaratura, mas os cálculos matemáticos de correção variam de um trabalho
para o outro
9, 26, 33, 64, 65
. O valor de pixel foi medido neste penetrômetro para
cada imagem, demonstrando bastante similaridade entre as radiografias de
cada grupo, razão pela qual nenhum fator de correção baseado nessas
medidas foi aplicado.
As medidas das áreas de doença periodontal e áreas de controle
foram de fácil obtenção com a utilização do software ImageJ. A ferramenta
de seleção de área deste programa permite manter o tamanho e forma da
área selecionada totalmente padronizados, oferecendo maior confiabilidade
ao método de medida. A padronização da área de medida logo abaixo da
junção amelo-cementária foi apenas visual, o que não se tornou um
problema para a padronização, pois os resultados mostraram um erro
sistemático e erro casual pequenos entre duas medidas repetidas em
intervalos de 15 dias.
73
Os resultados obtidos para as medidas de valor de pixel nas áreas de
doença periodontal evidenciaram ausência de diferenciação destes valores
entre os grupos, demonstrando que a metodologia empregada não foi eficaz
em avaliar diferenças de valor de pixel entre os períodos experimentais. Isto
ocorreu nas comparações entre os grupos para as radiografias obtidas no
sistema Digora (exceto grupos 2 e 3) e para as radiografias digitalizadas.
Embora os sítios de doença periodontal do grupo 3 revelassem perda óssea
histologicamente, a média dos valores dos pixels foi maior que a do grupo 2.
Essa inversão de grandeza de valor de pixel entre os grupos 3 e 2 não
possui explicação histológica. Poderia ter ocorrido por adição de ruído ao
exame de imagem porque o mesmo não ocorreu com a radiografia
convencional.
O crescimento fisiológico dos animais poderia ter influenciado os
resultados no lado controle, uma vez que houve diferença estatisticamente
significante entre os grupos 1 e 3 (nas radiografias obtidas no Digora e nas
radiografias digitalizadas) e entre os grupos 2 e 3 (nas radiografais do Digora
apenas). O quanto o crescimento dos animais afetou os resultados no lado
doente não é fácil de deduzir, uma vez que histologicamente havia perda
óssea.
A comparação destes resultados com os resultados de outros
trabalhos publicados é dificultada pelas grandes diferenças metodológicas.
Poucos estudos em animais, com metodologia semelhante, foram
publicados em literatura inglesa, nenhum deles avaliou doença periodontal.
74
YOSHUIRA, OHKI, YAMADA
78
, em 1990, encorajaram o estudo do
valor de pixel como método de quantificação radiográfica. Seus resultados
de avaliação de histograma em sialografias de ratos mostraram diferenças
entre os grupos com sialoadenite aguda e seus controles, com os padrões
de histograma correlacionando-se com as diferenças microscópicas. Este
estudo, da mesma forma que o trabalho realizado, foi capaz de evidenciar
alteração do valor de pixel de áreas doentes, quando comparadas aos seus
controles.
Mais recentemente, no ano de 2000, SARMENTO
57
avaliou
alterações periapicais em dentes de rato com pulpite, mostrando haver
diferença no valor de pixel entre os grupos experimentais e seus controles.
Demonstrou que, em dentes com pulpite, já se pode ter alterações no
periápice, nem sempre observadas da maneira convencional. Este estudo foi
bastante importante por encontrar alteração do valor de pixel em áreas onde
alterações visuais não são notadas habitualmente. A metodologia
empregada por SARMENTO
57
serviu como base para o desenvolvimento da
metodologia deste trabalho, o que torna possível estabelecer um paralelo
entre os dois estudos, reforçando que, do ponto de vista experimental, a
avaliação do valor de pixel teria importância diagnóstica na Odontologia, em
duas grandes áreas de interesse: Endodontia e Periodontia, devendo ser
levado em consideração o fator padronização da imagem, bem empregado
neste trabalho e por SARMENTO
57
em 2000.
75
O trabalho desenvolvido por DELANO et al.
15
, em 1998 foi eficaz em
encontrar concordância entre a histopatologia da doença periapical e seu
valor de pixel medido em radiografias digitais. Induziram e trataram lesões
periapicais em cachorros beagle, obtiveram radiografias padronizadas e a
forma de análise microscópica foi por meio de morfometria das áreas de
lesão. Demonstraram que a medida de densidade por valor de pixel é um
bom indicador de cicatrização de patologias apicais, podendo ser utilizado
no acompanhamento destas lesões. Estes resultados diferem dos
encontrados neste trabalho, pois foi possível evidenciar alteração do valor de
pixel com o passar do tempo. Por ter trabalhado com cachorros, foi possível
fazer radiografias iniciais e de acompanhamento bem padronizadas no
mesmo animal, o que não seria viável em um estudo com ratos, pelas
próprias limitações de tamanho.
Extrapolar os resultados obtidos em modelos animais para humanos
pode ser especialmente difícil pelas dificuldades na obtenção de um bom
padrão-ouro, pois a análise microscópica de tecidos humanos sadios é difícil
de ser obtida por causa de limitações éticas. No intuito de comprovar
experimentalmente que a avaliação do valor de pixel indica perda mineral
em mandíbulas humanas, SHROUT et al.
62
, em 2003 e JETT et al.
33
, em
2004 publicaram trabalhos semelhantes, onde removeram osso medular de
fragmentos de mandíbulas de cadáveres e radiografaram as peças para
medir o valor de pixel das áreas de osso removido. Ambos comprovaram,
com essa metodologia, que foi possível detectar perda de osso medular e
cortical, mesmo quando essa perda não era ainda visível.
76
Algumas pesquisas in vivo em humanos publicadas até o momento
são baseadas em radiografias de arquivo
58, 60, 63, 75
. Mesmo que os
resultados tenham demonstrado eficácia da medida do valor de pixel, restam
dúvidas sobre a acurácia do método, por não haver, nesses estudos, um
padrão-ouro confiável. Radiografias de arquivo podem apresentar uma série
de erros inerentes à sua obtenção e processamento químico, assim como a
falta de padronização de posicionamento.
Outros trabalhos em humanos utilizaram radiografias padronizadas na
avaliação do valor de pixel em lesões periapicais. Para tal, utilizaram como
padrão-ouro o índice periapical desenvolvido por ØRSTAVIK, KEREKES,
ERIKSEN
52
, em 1986
9, 16, 18, 38, 51
. Como esse índice foi previamente
validado por meio de análise microscópica, poderia funcionar como um bom
padrão de comparação. Esses trabalhos obtiveram resultados que
confirmam a similaridade entre o índice periapical e a medida do valor de
pixel. CAMPS, POMMEL, BUKIET
9
mostraram, em 2004, que é possível
evidenciar alterações ósseas em lesões periapicais pela medida de valor de
pixel entre a radiografia inicial e seus controles, mesmo quando o índice
periapical não sofre mudança.
Entre as muitas áreas de utilização do valor de pixel em Odontologia
existentes na literatura, parece ser a Periodontia a menos estudada, talvez
pelas dificuldades de obtenção de um padrão-ouro adequado. Em
periodontia, o padrão ideal para pesquisa em humanos seria a realização
das medidas do nível ósseo depois de rebatido um retalho e com total
77
visualização da crista alveolar
19, 40
. No entanto, as implicações éticas desta
prática não permitem que isto seja realizado rotineiramente. Por esse
motivo, poderia ser aceito como padrão-ouro a medida de profundidade de
sondagem e nível de inserção clínica sob anestesia local
19, 77
.
O tempo de monitoramento da doença periodontal seria outro fator
que dificultaria os estudos em periodontia. Em um trabalho com
acompanhamento de 1 ano, a correlação foi 0,07 entre medidas
radiográficas lineares da JAC à crista alveolar e nível de inserção clínica
29,
44
, enquanto o acompanhamento de 10 anos mostrou correlação de 0,8
54
,
demonstrando que quanto maior o tempo de acompanhamento maior a
relação entre análise radiográfica e nível de inserção clínica.
Os resultados encontrados neste trabalho indicaram uma similaridade
entre os dados obtidos para as radiografias do sistema Digora e radiografias
digitalizadas. Isto indicaria que o valor de pixel poderia ser eficaz em
distinguir alterações entre áreas saudáveis e com perda óssea, mas a
metodologia empregada não foi capaz de evidenciar diferenças nos valores
dos pixels entre os diferentes períodos da doença instalada.
Os resultados da concordância intra-examinador mostraram diferença
estatisticamente significante entre as primeiras medidas e as medidas
subseqüentes. Esta diferença foi muito pequena e possivelmente detectada
porque o teste matemático empregado é muito robusto e o valor de pixel
muito exato. Dificilmente os valores seriam exatamente iguais nas duas
medidas. Por estes motivos, foi possível considerar que a ausência de
78
concordância intra-examinador seria insignificante do ponto de vista prático,
pela pequena magnitude das diferenças encontradas nos valores dos pixels
entre as duas medidas subseqüentes.
6.2 Análise histopatológica
Os roedores são amplamente utilizados nos estudos de doença
periodontal pelo baixo custo e facilidade de manejo, assim como pela grande
semelhança tecidual e de respostas periodontais com os humanos
32, 37, 72
.
A forma de indução de doença periodontal utilizada neste trabalho foi
bastante empregada na literatura. Em todos os casos onde a colocação da
ligadura esteve associada à placa bacteriana, houve indução de doença em
vários graus de severidade, podendo haver perda óssea dependendo do
tempo experimental e do tipo de ligadura e de animal empregados
1, 10, 11, 23,
24, 25, 34, 36, 37, 42, 43, 48, 49, 72
.
No trabalho apresentado, a metodologia foi capaz de induzir
inflamação e perda óssea nos tecidos periodontais com o uso de ligadura de
seda 3-0, na região mesial do primeiro molar inferior do lado direito. A perda
óssea foi visível microscopicamente a nos três grupos e houve um padrão de
diminuição da altura da crista óssea alveolar com o passar do tempo.
79
Os resultados deste trabalho mostraram aumento da severidade da
perda óssea com o passar do tempo, no entanto, houve diminuição do
infiltrado inflamatório, com cronificação da resposta inflamatória no grupo de
28 dias. KUHR et al.
43
, em 2004, avaliou a destruição dos tecidos
periodontais em ratos por um período de 60 dias, induzindo doença com
ligadura de seda 5-0 no segundo molar superior. Estes resultados
evidenciaram uma redução no efeito da ligadura de seda sobre os tecidos
com o passar do tempo, devido ao processo de remodelação óssea. Outros
trabalhos com diferentes espécies animais concordam com esta afirmação,
ao encontrar como resultados uma diminuição do potencial de reabsorção
óssea com o passar do tempo, sugerindo um rápido processo inflamatório
agudo inicial, que declina posteriormente
1, 36, 49
.
A menor presença de osteoclastos e lacunas de Howship aos 28 dias
indicam uma diminuição do processo de remodelação óssea, conforme
observado por NYMAN, SCHROEDER, LINDHE
49
, em 1979, em cachorros
beagle, no mesmo período experimental.
A presença de seqüestros ósseos neste trabalho, principalmente aos
7 e 14 dias, foi também evidenciada no experimento de JOHNSON
34
, em
1975, no qual foi utilizada ligadura de seda em ratos albinos por no mínimo
17 dias. GALVÃO et al.
23
, em 2003, evidenciaram em sua amostra, presença
de seqüestros ósseos em ratos Wistar com ligaduras de algodão mantidas
por 30 dias no segundo molar superior.
80
A quantidade de fibras no tecido conjuntivo periodontal foi avaliada
neste trabalho, não sendo encontrada diferença significante entre o lado
doença periodontal e controle para nenhum dos períodos experimentais.
Galvão et al, 2003 relatou perda de fibras acima da crista óssea alveolar em
áreas de doença periodontal induzida. ROVIN, COSTICH, GORDON
55
, em
1966, evidenciaram aumento da proliferação e atividade de fibroblastos após
2 e 4 semanas de indução de doença.
A evolução da resposta inflamatória encontrada neste trabalho foi
bastante semelhante aos relatos da literatura. Foi evidenciada maior
quantidade de infiltrado inflamatório nos lados experimentais, quando
comparados aos seus controles, para todos os grupos, assim como a
quantidade de vasos sangüíneos para os períodos de 7 e 14 dias.
GASPERSIC, STIBLAR-MARTINCIC, SKALERIC
24
, em 2002, ao induzir
doença periodontal em ratos Wistar com fio de seda 4-0 por 4 semanas,
encontraram marcante vasodilatação e infiltrado inflamatório. O infiltrado era
predominantemente composto por células mononucleares, com poucos
polimorfonucleares, indicando uma reação crônica. Abundância de vasos
sangüíneos foi relatada por GALVÃO et al.
23
, 2003, em período experimental
de 30 dias. Vasodilatação e aumento de infiltrado inflamatório foram
encontrados por KENWORTHY, BAVEREL
37
, em 1981, após 15 semanas de
indução de doença periodontal com fio de seda.
Os dentes que não receberam fio de seda (dentes sem ligadura)
mostraram, neste trabalho, ausência de sinais inflamatórios e de reabsorção
81
óssea na crista alveolar. A ausência de sinais inflamatórios em dentes sem
ligadura foi descrita por NOCITI Jr et al.
48
, em 2000 e por AMSTAD-JOSSI,
SCHROEDER
2
, em 1978. Estes últimos mostraram ainda que o tecido
conjuntivo apresenta densa quantidade de fibras colágenas. Com relação à
reabsorção óssea em dentes de ratos sem ligadura, estudos comprovam
uma ação reabsortiva relacionada à idade
2, 43
. Há aumento da distância
entre a JAC e o topo da crista óssea com o passar do tempo na região
lingual do primeiro molar inferior. KUHR et al.
43
, em 2004, mostraram perda
óssea fisiológica em ratos avaliados por um período curto, de 60 dias,
utilizando uma ferramenta de análise sensível que mediu a perda óssea em
décimos de milímetros. Um achado semelhante a este, de perda óssea
fisiológica, não foi evidenciado neste trabalho, provavelmente pelo curto
período experimental, pelo fato de os cortes microscópicos terem sido
posicionados na região mais central do alvéolo dentário e por não ser
utilizada uma ferramenta de medida objetiva da altura da crista óssea.
Em resumo, a metodologia de indução de doença periodontal
empregada foi eficaz em produzir perda óssea na crista alveolar e a análise
histopatológica empregada evidenciou um padrão de doença periodontal
descrito anteriormente e semelhante ao encontrado em humanos. Por meio
desta metodologia, foi possível avaliar a perda óssea na crista alveolar e
comprovar que a alteração radiográfica medida por meio do valor de pixel da
imagem foi condizente com as diferenças histopatológicas entre as áreas de
doença periodontal e seus controles.
82
6.3 Novas pesquisas
Pesquisas futuras são necessárias para validar clinicamente o uso do
valor de pixel como ferramenta diagnóstica. Há evidências experimentais
suficientes, baseadas em estudos em animais, de que esta ferramenta
mereça ser melhor pesquisada em humanos.
Um estudo de valor de pixel em doença periodontal em humanos
deveria ser prospectivo, com radiografias iniciais e controles seguindo um
mesmo padrão, com radiografias digitais diretas ou convencionais bem
padronizadas, e com pacientes que necessitassem de cirurgia periodontal,
uma maneira de propiciar o acesso direto à crista óssea alveolar para
realizar medições.
A eliminação de variáveis externas nestes trabalhos é extremamente
importante, mas difícil de ser obtida. A inserção de ruído é um dos principais
fatores que interfere negativamente nos resultados dos trabalhos que
avaliam densidade óssea por meio de radiografias. Portanto, seria
importante minimizar alterações de posicionamento, de processamento
radiográfico, de escaneamento e avaliar previamente, sempre que possível,
se o sistema digital utilizado possui algum erro inerente ao processo de
digitalização.
71
Conclusões
84
7 CONCLUSÕES
Baseando-se na proposição e nas limitações da metodologia
empregada, foi possível concluir, por meio deste trabalho, que:
1. Os valores dos pixels dos sítios de doença periodontal
experimentalmente induzida em ratos Wistar foram menores que os
valores dos sítios de controle, para os 3 grupos estudados em ambos
os métodos: radiografia convencional digitalizada e radiografia digital
obtida no sistema Digora.
2. A altura da crista óssea avaliada histologicamente foi menor para os
sítios de doença periodontal que para os sítios controles,
comprovando a perda óssea das áreas de doença em relação aos
seus controles.
3. Não foi possível detectar diminuição dos valores dos pixels conforme
o período experimental aumentou, a despeito de ter sido possível
evidenciar histologicamente a diminuição da altura da crista óssea
com o aumento do tempo experimental.
85
ANEXOS
ANEXO 1
87
Referências
Bibliográficas
87
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98
ABSTRACT
RADIOGRAPHIC EVALUATION OF PERIODONTAL BONE RESORPTION
WITH PIXEL VALUE AND HISTOPATOLOGICAL ANALYSIS.
The aim of this research was to evaluate the pixel value modification in
periodontal disease sites using direct digital radiography and digitalized
radiography. Periodontal disease was induced by a 3-0 silk ligature in the
inferior right first molars of thirty Wistar rats. The inferior left first molar was
the control. The animals were divided into groups: 1- seven days; 2- fourteen
days and 3- twenty eight days. The mandibles were removed and
radiographed with film size 2 and in a photoestimulable phosphor plate
(Digora®). Conventional radiographs were digitized in a laser scanner. The
mandibles were processed and HE stained for histological analysis. The
mean pixel values from the periodontal disease sites were measured by
histogram analysis by the software ImageJ®. There was an ANOVA test
statistic significant difference among the pixel values for disease sites when
compared to the control sites in the three groups for Digora® and digitized
images. However, there was no significant difference for the disease sites
regardind the pixel values among experimental periods. The longer the
experimental period, more severe was the bone loss visualized histologically.
In conclusion, pixel value analysis in a digital radiographic image may
evidence bone loss when compared to the controls, but failed in detecting the
progressive bone loss microscopically visualized.
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